PCR

• von Kary B. Mullis entwickelt (1985)

• eigentlich im Mai 1983 bei einer nächtlichen

Autofahrt

• erstes erfolgreiches Experiment am 16.12.1983

• Nobelpreis für Chemie 1993

„Genisolierung in 2 Stunden“:

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Kary B. Mullis

Nobelpreis 1993

„...surfer and scientist...“

Kleppe et al. (1971) J. Mol. Biol. 56:341

Prinzip der PCR

Vervielfältigung der DNA-Abschnitte nach dem Prinzip der

Replikation

Der PCR-Zyklus

1. Denaturierung (94-98°C, 1-60 sec)

2. Primerbindung (50-65°C, 1-60 sec), ca. 5°C unter Tm der Primer

3. DNA-Synthese (72°C, 1 sec bis 12 min u.mehr)

Minimale Sequenzinformation für die PCR:

Beiderseits des zu amplifizierenden Abschnitts

müssen kurze Sequenzabschnitte bereits bekannt

sein, um dort die Bindung definierter Primer

zu ermöglichen!

PCR

Polymerase Kettenreaktion

3‘-GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5‘

5‘-CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3‘

3‘-GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5‘

TTCGA

GATCG

5‘-CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3‘

PCR

Polymerase Kettenreaktion

3‘-GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5‘

TTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT

GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCG

5‘-CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3‘

Exponentielle Vermehrung der Zielsequenz

• 35-40 Zyklen sinnvoll

Praktische Hinweise zum Primerdesign

• 18-25mere, 40-60% GC, „gut gemischte“ Sequenz

• keine Teile von Repeats: Spezifität über Datenbank-

suchen überprüfen

• 3‘Ende bevorzugt ein G od. C

• keine 3‘ End-Komplementarität der zwei Primer!

(sonst u.U. Primer-Dimer-Bildung)

• keine internen Homopolymer-Runs (>4) oder

„simple sequences“

• keine internen Inverted repeats (>3 Nt im Stamm)

Schmelztemperatur von Primer

• Tm = 4 * ( Anzahl G+C) + 2 * ( Anzahl A+T)

Polymerase

Zunächst: Klenow-Fragment der DNA-

Polymerase aus E. coli

thermolabil, d.h. Zugabe nach jedem Zyklus

Reaktion sehr aufwendig und teuer

Hybridisierung und Polymerisation bei 37°C

Folge: durch Fehlhybridisierung der Primer viele Nebenprodukte

Produktlänge auf 200 Bp beschränkt

Taq DNA Polymerase

aus Thermus aquaticus

T. aquaticus Stamm YT-1,

gesammelt von T. Brock 1967

im Yellowstone Natl. Park

• 892 As, 94 kD

• pH opt. 8,3-8,8

• prozessiv : 60 Nt/sec bei 72°C; 1,5Nt/sec bei 37°C

> 1kb pro Minute synthetisiert

• keine proofreading Aktivität!

Eigenschaften thermostabiler Polymerasen

Mutationsraten verschiedener hitzestabiler

DNA-Polymerasen

1,6 8 20 x 10-6

Pfu

Vent

Taq

Ca. 1 Fehler pro

1 kb - Molekül nach

35 Zyklen

...weitere experimentelle Bedingungen

• Primerkonzentration: ca. 0,5µM; d.h. bis 1013 Moleküle

• Matrize: 0,1-1 µg Genom-DNA; 10 ng Plasmid

• dNTPs: 200 µM Endkonz. (genug für 6 µg DNA)

• Denaturierung: 94-98°C (abhängig von Matrize+Enzym)

• Annealing: 5 bis 10°C niedriger als Tm des Templates

(meist: 52-68°C)

• Extension: ca. 1 min pro kb

Spielarten der PCR

• XL-PCR

• Nested-PCR

• RT-PCR (Reverse Transkriptase + PCR)

• Quantitative PCR

– klassisch oder real-time RT-PCR

• Quantitative PCR

• RACE (rapid amplification of cDNA ends)

• inverse PCR (PCR von flankierenden Regionen)

• In situ PCR

• Mutagenese und Nachweis von bekannter Punktmutationen

• Sondenherstellung

RT-PCR

1. Schritt: Reverse Transkription von mRNA, es entsteht

sogenannte cDNA (complementary DNA)

2. Schritt: PCR

Zielsetzung: welches Gen ist in einer bestimmten Zelle

aktiv

Quantitative PCR

• eine Methode zur Quantifizierung der

Ausgangsmenge an Template in einer Lösung

Voraussetzung : während der exponentiellen Phase der

Amplifikation verläuft die DNA-

Vermehrung linear

Exponentielle Vermehrung der Zielsequenz

• 35-40 Zyklen sinnvoll

Quantitative PCR

• Prinzip: Vergleich zu

einem Standard-DNA-

Molekül

Real-Time PCR

Quantitative PCR

• Hauptanwendung: Quantifizierung von mRNA z.B.

zum Vergleich von Genexpressionsraten in

verschiedenen Geweben (z.B. zwischen gesunden und

pathogenen Gewebeproben)

Race - rapid amplification of cDNA ends

• Ziel: Vervollständigung

der 5´ bzw. 3´ Ende von

cDNA-Klonen

Inverse PCR

„Long range“ / XL - PCR

• herkömmliche Taq Pol amplifiziert nur ineffizient

Moleküle größer 5-6 kb

• Grund: sich akkumulierende Fehleinbauten am 3‘OH-

Ende können nicht entfernt werden und verhindern

weitere Polymerisierung

• Lösung: Kombination einer prozessiven Taq Pol mit

anderer thermostabiler Pol mit proof-reading-Funktion

> ermöglicht Amplifikation von bis zu > 20 kb

weitere PCR- basierende Methoden

• LM-PCR (Ligation-mediated PCR unter Verwendung

anligierter Linker)

• multiplex PCR (mehrere Amplikons parallel)

• Nested PCR

• hotstart PCR (verbessert Spezifität)

• ...und sehr viele mehr...

Anwendungen der PCR

• Medizinische und mikrobiol. Diagnostik

• Herstellung von Genbanken aus limitierendem Material

• Isolierung von Transkripten (RT-PCR)

• Bestimmung von Transkriptionsstart/endpunkten

• Isolierung von DNA-Abschnitten

• Quantifizierung von DNA und RNA

• „ancient DNA“

• Mutagenese von DNA-Molekülen

• Markierung von Sonden für die Hybridisierung

• Etc...

PCR in der Nahrungsmitteldiagnostik

Rin

d B

4

Mar

ker

Lyo

ner

281 Bp

257 Bp

226 Bp

910 Bp

659 Bp

521 Bp

403 Bp

Rin

d-D

NA

Sch

wei

n-D

NA

Neg

ativ

-K.

PCR-Ansatz

• auf Eis pipettieren!:

• 1 µl genomische DNA (ca. 10-100ng)

• 5 µl 10x PCR-Puffer

• 1 µl 10 mM dNTP-Mix (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)

• 1 µl Primer 1 (10 pmol/µl)

• 1 µl Primer 2 (10 pmol/µl)

• 40 µl A. bidest

• 1 µl Taq-(DNA)-Polymerase (1-2,5 U)

• 50 µl Gesamtvolumen

• mischen, kurz anzentrifugieren, zurück auf Eis

• 1. Denaturierung 94°C 120 sec 1x

• 2. Denaturierung 94°C 30 sec

• 3. “Annealing” 55°C 30 sec 35x

• 4. Elongation 72°C 90 sec

• 5. finale Elongation72°C 6 min 1x

• 4°C ∞

PCR-Programm