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0.1

Physiologie der Mikroorganismen

Zusammenfassung

Aufbau von BakterienBakterien sind einzellige Lebewesen. Sie bilden eine der drei Domänen des Lebens. Die anderen beiden sind die Archaea und die Eukarya. Die Größe von Bakterienzellen bewegt sich im Mikrometerbereich.

• Bakterien haben eine Zellhülle

• haben keine Organellen (können intracytoplasmatische Membranen haben)

• keinen Zellkern

ZellhülleDie Zellhülle bildet bei den meisten Bakterien die Zellwand. Es gibt dabei grundsätzlich zwei Typen von Zellwänden. Die Gram+ und die Gram-.

• sorgt für zusätzliche Stabilität

• bei Gram+ eine dicke Mureinwand um Cytoplasmamembran

• bei Gram- dünne Mureinschicht + äußere Membran

Gram positiveBei Grampositiven besteht die Zellwand aus einer dicken Mureinschicht, die sich an die Cytoplasmamebran anschließt.

1. Cytoplasmamembran

2. Peptidoglykan (Murein)

• Teichon- und Lipoteichonsäuren

• Polysaccharide

3. S-layer Glycoproteine

Gram negativeGram negative haben nur eine dünne Mureinschicht, aber eine weitere Lipidmembran auf der Außenseite.

1. Cytoplasmamembran

2. Peptidoglykan

3. äußere Membran

• Porine erleichtern Metaboliteintritt (MalB - Maltose)

• Lipopolysaccharide nur auf der Außenseite

• wird von Murein-Lipoprotein und OmpA auf Murein gehalten

• Lipoprotein N-Terminus (Cystein) in äußerer Membran

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• C-Terminus (Lysin) kovalent an Murein (m-DAP) verknüpft

Bestandteile der ZellhülleLipopolysaccharid• Lipid A + Core (Oligosaccharid) + O-Kette (Polysaccharid)

• 2 Glucosaminphosphate bilden Kopf des Lipid A (β1-6)

• kein Glycerin

• 6 Fettsäuren verestert

• Core aus verschiedenen Zuckern

• KDO - 2-Keto-3-Desoxyoctonsäure

• + Heptosen, Galactose, Glucose, NAG usw.

• zum Teil phosphoryliert

• O-Kette

• 4-5 Zucker wiederholt

• Didesoxyzucker häufig

• bildet Serotypus des Keims

• Lipid A schützt Periplasma

• O-Kette weist hydrophoge Substanzen ab

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MureinMurein ist ein Peptidoglykan. Es besteht aus einem Zucker und einem Peptidanteil.

• nicht semipermeabel sondern voll durchlässig

• sehr stabile Außenhülle formt und verhindert osmotisches Platzen

• Alternierend NAG und NAM β-1-4 verknüpft

• N-Acetyl-Glucosamin

• N-Acetyl-Muraminsäure

• an C3 des NAM sind Peptide verknüpft

• ungewöhnliche Aminosäuren

• meso-Diaminopimelinsäure (m-DAP)

• Quervernetzung der Peptidreste bildet Struktur

• m-DAP mit benachbartem D-Ala verknäpft

• durch Transpeptidase katalysiert (Penicillinbindeprotein)

• bei Gram+ oft Lysin oder Ornithin statt m-DAP

Teichonsäuren• Polymere aus Zuckeralkoholen und Phosphatgruppen (Teichonsäuren)

• Zuckersäuren (Teichuronsäure)

• Lipoteichonsäuren sind kovalent an Phospholipide gebunden

• Zellwand durch viele Phopho- und Carboxygruppen negativ geladen

• bindet zweiwertige Kationen

Gram- Gram+

1-3 Schichten Murein 25-60 Schichten Murein

Mureinanteil der Zellhülle 5-20% Mureinanteil bis zu 90%

geringer Verknüpfungsgrad hoher Verknüpfungsgrad

m-DAP m-DAP oder Lysin + Brückenpeptid

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ZellmembranDie Zellmembran (Cytoplasmamembran) besteht aus einer Lipidoppelschicht von Phospholipiden.

• Lipiddoppelschicht

• selektive semipermeable Membran

• kann Ionendurchtritt regulieren für Membranpotential

• Phosphodiester (Fettsäuren, Glycerin, Phosphat, Alkohol)

• kleine polare Moleküle oder Ionen können durchtreten (z.B Wasser, EtOH, Na+, etc.)

• beim Gram- zusätzliche äußere Membran

Fettsäuren• ungesättigte Fettsäuren (mit Doppelbindungen) machen Membranen fluider

• Anpassungen psychrophiler Bakterien

• Cyclopropansäuren machen Membranen säureresistenter

• Hopanoide (statt Cholesterin) machen Membran stabiler

• Anpassungen thermophiler Bakterien

• Cholesterin nur bei Mycoplasma und Methanotrophe

ProteineIntegrale und periphere Proteine auf den Oberflächen der Membran nehmen verschiedene Aufgaben wahr. Der Proteinanteil macht zwischen 50-70% aus.

• Transporter für Ionen

• Atmungskettenproteine

• Rezeptoren, Lokomotion, etc.

Intracytoplasmatische MembranenManche Bakterien haben Membransysteme im Cytoplasma, obwohl sie keine Organellen im klassischen Sinne haben.

• Elektronentransportsysteme

• chemolithotrophe Bakterien

• Methanoxidierer, Nitrifizierende Bakterien

• Photosythetische Bakterien

• Lichtsammenkomplexe + Reaktionszentren

• Intrazellularmembranen in Stapeln (wie bei Chloroplast)

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ZellwandsyntheseDer Vermehrungszyklus von Bakterien ist unter Umständen sehr kurz. Daher muss die Zellwand stetig erweitert werden.

• kontinuierliche Synthese neuer Zellwand

• Zellen wachsen in Längsrichtung

• Crosslinks zwischen Peptidoglykanen liegenparallel zur Zellachse

• Zusammenspiel von synthetisierenden und hydrolysierenden Enzymen

• Murein wird an definierten Stellen gebrochen

• neues Murein wird eingebaut

Gene• Mureingencluster B (mreBCD Operon)

• MreB ist Aktin ähnliches Skelettprotein

• bildet bewegliche Patches zum Mureineinbau

• wenn MreB fehlt ist Zellform irregulär

Synthese• beginnt im Cytoplasma mit UDP-NAM

• NAM hat 5 Aminosäuren (5te ist D-Ala und wird bei Transpeptidierung abgespalten)

• Dann an Bactoprenol (hydrophob) gebunden und über CM transportiert

• C55 Kette aus Iospreneinheiten

• Membrancarrier

• wird nach Transport regeneriert

AntibiotikaAntibiotika können die Zellwand erheblich stören. Dadurch platzen die Zellen.

• Penicilline hemmen Transpeptidase (fehlende Verknüpfung)

• natürliche P sind säureempfindlich

• Strukturähnlich zu D-Ala-D-Ala und wird deswegen von Transpeptidase erkannt aber nicht umgesetzt

• β-Lactamase kann β-Lactamring des Penicillins spalten

• Bacitracin hemmt Bactoprenol Regeneration

• Vancomycin bildet Komplex mit D-Ala

• verhindert Verknüpfung von Murein

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Lysozym• Lysozym kann β-1-4 Bindung von NAG-NAM spalten

• Zellwand wird schwach

• Platzen im hypotonen Medium

• nur Zellwandlos im isotonen Medium

• Laboranwendung von Lysozym

• Kommt in Tränen, Eiweiß, Blut etc. als Schutz vor Pathogenen vor

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ArchaeaArchaea bilden die zweite Domäne des Lebens. Zusammen mit den Bacteria gehören sie zu den prkaryotischen Lebensformen. Sie haben sowohl Ähnlichkeiten mit Bakterien als auch mir eukaryotischen Zellen. Sie wurden Vvon Carl Woese durch 16S rRNA Fingerprinting entdeckt.

RNAPDie RNA Polymerase weißt Ähnlichkeiten zur RNAP II der Eukarya auf.

• 12 UE

• Transkriptionsfaktoren weniger als bei Eukarya

• TBP, TFB, TFE

1. TBP bindet TATA

2. TFB bindet TATA-TBP

3. RNAP bindet an TATA-TBP-TFP

4. TFE bindet zusätzlich

PromotorDer Promotor bei den Archeaen ist der gleiche wie der eukaryotischer Zellen.

• TATA-Box (etwa bei -25)

• BRE-Region kurz vor TATA Box (Reaktion mit TFB)

LipideArchaea nutzen andere Lipide als Bakterien.

Phytanyletherlipide• verzweigte Kohlenwassertsoffketten aus Isopreneinheiten

• Etherbindung zu Glycerin (kein Ester)

• Spiegelbildlich zu Bakteriellen Fettsäureesterlipiden

Tetraetherlipide• lange KW Ketten

• an beiden Enden mit Glycerin verethert

• keine Double Layer notwendig → Monolayer

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ZellwandGlykoproteine (S-Layer)Häufigste archaeale Zellwandform (Sulfolobus, Halobacterium etc.)

• auch bei Bakterien verbreitet

• Glykoproteine bilden Kristallstruktur (Selbstorganisation)

• regelmäßige Muster bei Aufsicht

• Poren

• Sieb der Nanotechnologie

Heteropolysaccharid

Pseudomurein• β-1,3 Verknüpfung von NAG und NAT

Proteine

ZellanhängeArchaellum• archeales Flagellum

• Aufbau ähnlich zu Typ IV Pilus

• keine Kontraktion sondern Rotation → wie Flagellum

• ATP getrieben

Hami• bilden Netz zwischen Zellen

• viele Zellen zusammen bilden ein makroskopisch sichtbares Gebilde

• Stacheldrahtartig mit „Enterhaken“ ab Ende

• Extrem Umweltstabil (nahezug alle pH und bis 70°)

Bacteria Archaea Eukarya

Zellkern — — +

Ribosomen 70S 70S 80S

rRNA 16S + 23S 16S + 23S 18S + 28S

RNAP 1 (5 UE + σ) 1 (12 UE + 2 TF) 3 (12 UE + viele TF)

Promotor -10 und -35-Region TATA-Box TATA-Box

Gene Operons Operons einzeln

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Phylogenetische GruppenHyperthermophile• Stabilisierung von Molekülen in Zellen für hohe Temperaturen

• Tetraetherlipide sind temperaturstabiler

• DNA Bindeproteine und Basenmodifikation

• kompakte Proteine

• interessant für Biotechnische Anwendung temperaturstabilder Enzyme

Haloarchaeaz.B Halobacterium, Haloferax, Haloquadratum

• in extrem salzigen Habitaten

• Salz entzieht Wasser

• Proteine aggregieren

• extrem Strahlungsresistent

• bis 5 M NaCl

• bei Magnesium ist Wasseraktivität zu gering → toxisch

• Anpassung über compatible solutes (2 mol kosten aber bis zu 218 mol ATP)

• Anpassung über salt in Strategie (2 mol kosten nur 1-2 mol ATP)

• zum Teil mit Bakterienrhodopsin

Methanogene• nutzen Pseudomurein als Zellwand

• kommen in Sümpfen aber auch Verdauungstrakten vor

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Flagellen und Pili – LokomotionMit Flagellen (Geißeln) können sich Bakterien bewegen. Sie sind im Lichtmikroskop nicht sichtbar, aber vielfach länger als die Zelle selbst.

Flagellen• Filament an Rotor

• 5-20 μm lang

• 20 nm Durchmesser

• Durch Proton motive force angetrieben (Protonengradient)

• ca. 1000 Protone pro Turn

• etwa 12.000 rpm

• 25 μm/sec

• 2 Drehrichtungen möglich (Clockwise/Counterclockwise)

• monotriche oder polytriche Begeißelung (eine oder mehrer)

• monopolar oder bipolar oder peritrich begeißelt

• etwa 20 Proteine beteiligt

Flagellenmotor (Basalkörper)• Zentraler Stift (an diesem ist über den Haken das Filament angebracht)

• mehrere Ringe führen den Stift in Zellhülle

• P und L Ring betten Stift in Peptidoglykan bzw. äußere Membran ein (Gram-)

• MS-Ring in CM

• MotA und MotB als Stator

• FliG Proteinring als Rotor

• C-Ring unterhalb des FliG als Schalter für Drehrichtung

Filament• FliC Proteine

• 11 pro Helixwindung

• innen hohl

• Am Ende eine Kappe

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PiliTyp IV• etwa 5 um lang

• 9nm Durchmesser

• nicht hohl

• PilA bildet Filament

• Energie aus ATP Hydrolyse

• Bewegung durch Kontraktion und Extension

• Oberflächenkontakt der Spitze löst Depolymerisation aus

• Monomere werden in CM eingelagert

ChemotaxisWahrnehmung von Umweltreizen lässt das Bakterium gerichtete Bewegungen ausführen.

• Rezeptoren nehmen Umweltreize wahr

• Che Proteine werden entsprechend modifiziert

MCP Rezeptoren• sehr regelmäßige Anordnung in CM

• vor allem an Zellpolen

• an cytoplasmatischer Seite mit CheW und CheA verbunden

1. Lockstoff/Schreckstoff bindet an MCP

2. im Cytoplasma wird Aktivität von CheA und CheW verändert

1. Lockstoffe hemmen

2. Schreckstoffe aktivieren CheA

3. An Methylierungsdomäne kann Sensitivität durch Methylierungen angepasst werden

4. CheA phosphoryliert CheY

5. CheY-P verursacht taumeln durch Umschalten auf CW Drehung

6. CheZ dephosphoryliert CheA wieder

Konzentrationsänderungen• durch Methylierungen kann Sensitivität des MCP angepasst werden

• Bei Schreckstoff wird MCP stetig durch CheR metyhliert

• CheY wird letzlich wenigiger aktiviert, dadurch wird mehr geschwimmen als getaumelt

• CheA aktiviert auch CheB welches Demythyliert und Sensitiviät wieder herstellt

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• Bei Lockstoff

• CheA nicht aktiv → CheY und CheB nicht phosphoryliert

• Schwimmen

• Nur wenn Konzentrationen weiter steigen wird weiter geschwommen

• Sonst taumeln

GleitproteineMycoplasma mobilis hat Gleitapparat

• Gli123 + Gli521 + Gli349 bilden flexible Beinchen auf Zelloberfläche

• PA42 ATPase als Motor kann diese Beinchen bewegen

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Kultivierung von MikroorganismenArten der KultivierungFlüssigkulturen• Bakterien frei im Nährmedium

• in Kolben (Fernbach-, Erlenmeyer- oder Schikanekolben)

Festkulturen• Nährmedium verfestigt (Agar)

• Agar geliert bei geringen Konzentrationen

• Schmilzt bei 95° und verfestigt sich bei 45° (Thermostabil)

• ist von Mikroben kaum abbaubar

• Bakterien wachsen auf verfestigtem Medium

• in Petrischale

NährmedienDas Nährmedium muss alle Stoffe zur Verfügung stellen, die ein Mikroorganismus zum leben und Vermehren braucht. Hauptlösungsmittel der Zellen ist Wasser.

• Makroelemente: CHNOPS + K + Mg + Ca + Na + Cl + Fe

• Spurenelemente: Se, Zn, Cu, Ni, Co, Mn, Mo, W, V (alle unter 0,3%)

• C-Quellen: Zucker, Aminosäuren etc.

• N/S-Quellen: Nitrat, Sulfat, Thiosulfat

• P-Quelle: Phopshat

• Prototrophe wachsen auf Minimalmedium, Auxotrophe nicht

Minimalmedien• chemisch definierte Inhaltsstoffe

• Prototrophe können im Minimalmedium wachsen

• MO müssen alles selbst aus Quellen synthetisieren

Komplexmedien• chemisch kaum definierte Stoffe

• organische Komponenten

• auch Auxotrophe wachsen

• Bakterien wachsen schneller

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m LB-Medium

10 g Trypton

5,0 g Hefeextrakt

10,0 g NaCl

m

5 g Glucose

1 g NH4Cl

0,2 g MgSO4 x 7H2O

0,5 g K2HPO4

0,01 g FeSO4 x 7H2O

0,01 g CaCl2 x 2H2O

1 ml Spurenelemente

Selektiv- und Diagnosemedien• zeigen Unterschiede im Metabolismus der MO

• lassen Klassifikation zu

• z.B mit Antibiotika oder Gallensalzen

• Stickstofffreie Medien ohne chemisch gebundenn Stickstoff (Organostickstoff)

• kein Nitrat, Nitrit

• keine Komplexmedien

Isolierung von BakterienNur etwa 0,1% der Bakterien konnten bisher im Labor kultiviert werden.

Reinkulturen• Abnahme von Zellmaterial

• Verdünnungssausstrich

• Animpfen von Flüssigmedium mit Einzelkolonie (Klone)

Konservierung von Bakterien• bei -80° im Medium mit 10% Glycerin oder DMSO

• verhindet Frieren des Wasser

• Wasserkristalle würden Zellen platzen lassen

• Gefrieren bedeutet kein Absterben

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Bakterienwachstum• Bakterien vermehren sich durch Zweiteilung

• Kultur wächst exponentiell

• Nt = No · 2n

• Generationszeit: Verdopplung der Zellzahl

• Stark von Umgebung und Stamm abhängig

• Verdopplungszeit tD: Verdopplung der Zellmasse (gemessen über OD)

• μ = spezifische Wachstumskonstante = ln(2) / tD

• Wachstum ist nicht unendlich (in begrenzter Kultur)

Zellzahlbestimmung• Direktes Zählen per Zählkammer im Mikroskop

• Coulter Counter (misst Durchlass + elektrischen Widerstand)

• Fluoreszenz Zähler (misst markierte Zellen)

• Lebendkeimzahl durch Verdünnungsreihe und Ausplattieren zählbar

• Trübungsmesseung mit Spektralphotometer

• Bestimmung der optischen Dichte (Suspension, nicht Lösung)

• A = ε x L x C

• halblogarithmische Aftragung (Zellzahl als ln) ergibt Gerade

• Generationszeit bzw. Verdopplungszeit ablesbar

Wachstumsphasenlag• Reparatur von Zellen

• Synthese neuer Proteine

• hängt von Stadium der Vorkultur ab

exponentielle Phase• maximale Wachstumsrate (μ [1/t])

• minmale Verdoppelungszeit

stationäre Phase• hohe Zelldichte

• Nährstoffe gehen zur Neige

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• Abfallprodukte reichern sich in Kultur an

• keine Zunahme der Zellzahl (Absterben und Teilen genau gleich)

• Wachstumsrate geht gegen 0

• sehr hohe Verdoppelungszeit gg. ∞

E.coli• im Vollmedium Teilung alle 20 Minuten

• im Minimalmedium alle 40 Minuten

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WachstumsansprücheVerschiedene Arten stellen unterschiedliche Ansprüche an ihre Umgebung. Die optimalen Bedingungen enstprechen meist den Bedingungen an ihrem Wachstumsort.

Temperatur• wichtigster Umweltfaktor

• optimal meist die Temperaturspanne des Lebensraumes

• Erhöhung der Temperatur bewirkt beschleunigung des Stoffwechsels

• 3 Kardinaltemperaturen:

1. Minimum (kein Stoffwechsel)

2. Optimum

3. Maximum (thermische Lyse, Denaturierung von Proteinen)

Anpassungen der Psychrophilen• viele ungesättigte Fettsäuren in Lipiden für Fluidität

• flexiblere kälteaktive Enzyme durch mehr α-Helices, denaturieren leichter

• Frostschutz durch Trehalose und Glycerin

• Kälteschockproteine

Sauerstoff• kann in Weichagar im Reagenzglas getestet werden anhand des Wachstumsorts (OF-Test)

Anaerobe• Nasse Erde, Moor, Grundwasser, Darm

• obligat anaerobe wachsen nicht unter O2

• können reaktiven Sauerstoff nicht unschädlich machen

Typ Bereich Optimum

Psychrophile -4° - 15° 4°

Mesophile 15° - 45° 39°

Thermophile 42 - 72° 60°

Extrem Thermophile 65° - 90° 88°

Hyperthermophile 85° - 110° 106°

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Aerobe• Luft, Boden und Wasser

• strikt aerobe wachsen nur mit O2 für Atmungskette

• können reaktive Sauerstoffspezies unschädlich machen

• Radikale

• Singulettsauerstoff

• Peroxid (Peroxidase und Katalase)

Katalasetest: Zellen + H2O2, Sauerstoffentwicklung bei +Katalase

Reaktive Sauerstoffspezies• Im Grundzustand Triplettsauerstoff

• Singulettsauerstoff wirkt toxisch

• Schutz durch Carotinoide

• Außerdem Superoxidradikal, Peroxid, Hydroxylradikal

• Superoxiddismutase

• Katalase (bildet Wasser und Sauerstoff)

• Peroxidase (bildet Wasser und NADH)

pH-WertIn natürlicher Umgebung ist der pH meist zwischen 5-8,5. MO wachsen in Bereichen von 0,5-11.

• Zellen halten Cytoplasma nahe dem neutralen Bereich

• Protonen können über die Membran fließen

• können Enzyme protonieren etc.

• pH Wert des Cytoplasma auf 6-7 eingestellt

• Puffer durch DNA, Phosphate, Glutaminsäure, Ionenkanäle

Acidophile• wachsen bei pH < 4

• oftmals Schwefel- oder Eisenoxidierer

• oft mesophil bis hyperthermophil

• Sulfolobus, Picrophilus, Acidothiobacillus

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Neutrophile• pH 6-7

• normalfall

Alkaliphile • wachsen bei pH >9

• oftmals halophil

• innere Enzyme für pH 6-7, Exoenzyme alkaliphil

• Schutz der Zelle durch saure Polymere auf der Außenseite und Dietherlipide etc.

SalzKonzentrationen von Salzen wechseln durch Regen und Austrocknung. (Regenschauer senken Konzentration).

• Wasseraktivität von Osmolarität abhängig

• aW = Dampfdruck der Lösung / Dampfdruck Wasser

• daher aW von reinem Wasser = 1,00

• Wasseraktivität in Salzseen etwa 0,75

compatible solutesZellen können bei Hochsalzbedingungen Stoffe einlagern die durch ihre osmotische Aktivität das Wasser in den Zellen halten. Diese Produkte sind energetisch sehr teuer.

• Glycerin, Saccharose, Trehalose, Ectoin, Glycinbetain

• verhindert den Ausstrom von Wasser bei hypertoner Umgebung

salt-inEine andere Möglichkeit ist es, die Salzkonzentration des Cytoplasmas dem Außenmedium anzupassen. Energetisch ist das günstiger.

• Haloarchaea passen Salzkonzentration dem Außenmedium an

• gleiche Osmolarität verhindert Wasserausstrom

• Anpassung bis 5 M NaCl

• innen 4 M KCl, 1 M NaCl

• Proteine sind durch saure Oberflächen AS angepasst

• Haloquadratum, Halobacterium, Haloferax

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Zellteilung der BakterienBakterien vermehren sich durch einfache Zweiteilung. DNA-Replikation ist mit Teilung der Zelle koodiniert.

• DNA liegt frei im Cytoplasma vor

• SMC-Proteine kompaktieren DNA (Structural maintenance of chromosomes)

• DNA bildet mit assoziierten Proteinen das Nukleoid

Replikation der DNADie DNA muss vor der Teilung reepliziert werden, damit jede Tochterzelle ein vollständiges Chromosom hat.

• Ringförmiges Genom mit ori (Origin of Replication)

• Untersucht durch Insertion von LacI nach ori und Fusion mit GFP

• Nach Replikation wandern die ori jeweils zu einem Zellpol

• durch MreB

• Aktin ähnliches Cytoskelettprotein

• trennt Chromosomen durch Umwindung

• bestimmt Zellform

Zellteilung• Bildung eines Septums in Zellmitte

• FtsZ bildet kontraktilen Ring in Zellmitte

• ähnlich zu Tubulin

• bildet Z-Ring bei Teilung

• Kontraktion durch GTP Spaltung

• filamentös und temperatursensitiv

7. Aggregation in Zellmitte

8. Bilden eines Rings

9. Kontraktion des Ring

10. Abschnüren der Zellteile

• an FtsZ sind weitere Fts und ZipA und AmiC uvm. assoziert

• bilden Divisom

MreB Protein• Aktin ähnlich

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• windet sich schraubenförmig an CM

• Teilt Chromosomen auf

Lage des FtsZ Rings• wird durch MinC, MinD und MinE bestimmt

• bilden Ringe im Inneren der Zelle

• verhindern FtsZ Bildung

• oszillieren zwischen den Polen

• in Zellmitte ist deren Konzentration am geringsten

• dort bildet sich FtsZ Ring

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Überleben von BakterienEndosporen sind Dauerform von manchen Bakterien. Im Gegensatz zu Exosporen von Pilzen, die der Vermehrung dienen. Sie Können Jahrhrunderte überdauern. In Salzkristallen auch Millionen Jahre. Sie sind gegenüber Chemikalien, Strahlung und Hitze resistent.

Sporenbildung• Pilze und Streptomyceten bilden Exosporen für Vermehrung

• manche Bakterien bilden Endosporen zum Überleben (nicht für Vermehrung)

• Gram+ Bakterien

• z.B Bacillus (anthracis) und Clostridium (botulinum und tetani)

• Bakterien mit Sporen sind Sporangien

• Bildung bei Hungerstress

• Signale wie cAMP oder ppGpp

• Veränderung der Genexpression

Endosporen• austrocknungsresistent

• extrem niedriger Wassergehalt

• Ca2+-Dipicolinsäure

• SASPs stabilisieren die DNA

• sehr lange haltbar (bis 250 Mio. Jahren im Salzkristall)

• resistent gegen Hitze, Strahlung und Chemikalien

AufbauVon innen nach Außen

Core (Sporenprotoblast):

1. Genom

2. Cytoplasma

3. Cytoplasmamembran

4. Zellwand

Hülle:

5. Sporenrinde (Cortex)

• spezielles Murein

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6. innere Sporenhülle

7. äußere Sporenhülle

8. Exosporangium

Bildung• 200 spo Gene werden Gruppenweise transkribiert

• Nährstoffarmut und Zelldichte stimulieren Sporenbildung

• Spore und Mutterzelle enthalten am Ende Kopie des Genoms

• durch inäquale Zellteilung gebildet

• Bildung dauert 8 Stunden

• 7 Pahsen der Entwicklung

1. Replikation des Genoms und Kondensation der DNA

2. Entwicklung der Endospore durch Bildung eines Septums

• Cytoplasma umfließt das Kompartiment

3. Vorspore ist gebildet und liegt im Cytoplasma

• Vorspore wird dehydriert

4. Cortex wird gebildet

5. Sporenhülle wird gebildet

6. Ca2+ Dipicolinsäure und SASPs werden eingelagert

7. Maturation und Freisetzung der Spore

Genregulation• verschiedene Gene der verschiedenen Stadien

• Sigmafaktoren steuern Genexpression

σG

• steuert SASP Synthese

σK

• cot Gene für Sporenhülle

• dpa für Dipicolinsäure

Auskeimen von Sporen1. Hydratisierung und Hitze

2. Germinationsgene und Endopetidasen für SASP Abbau (10 Minuten nach Hydratisierung)

3. Nach 3h wird neue Zelle freigelassen

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Mutterzelle Sporenkompartiment

Stadium 0 (Normalzustand) σA und σH

Stadium II σE σF

Stadium III σG

Stadium IV σK

Abtöten von BakterienSterilisation• vollständiges Abtöten von Bakterien, Pilzen und Viren

• physikalisches Verfahren

Sterbekurve• Zellen sterben exponentiell

• D-Wert: Zeit bei der 90% der Bakterien tot sind (Dezimale Rediktionszeit)

• für Sterilisation etwa 12x D-Wert

feuchte Hitze• für Laborgeräte (außer Glas) und hitzestabile Produkte

• Abtöten von Kulturen

• 121 °C, 2 bar

• 20-30 min

trockene Hitze• Glasgeräte

• 160 °C 2-4 h

• 180 °C 30 min

Pasteurisierung

Filtration• Membran mit feinen Poren (Nylon oder PC)

• können keine Viren zurückhalten

• für hitzelabile Produkte (Medien etc.)

Strahlung• UV Licht nur für Oberflächen (dringt nicht ein)

• Röntgen oder Gamma Strahlung für

Kaltplasma• Plasma durch Radiofeld

• Argon:N2:O2

• D-Wert 0,03 min

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Desinfektion• Bakterien und Pilze werden chemisch getötet

• vor allem gegen Pathogene

Membranschädigung• Toluol, Phenol, Chloroform

Proteindenaturierung• Alkohole, Phenol, Halogene, Formaldehyd, Ethylenoxid

DesinfektionsmittelEpoxide• alkliert

• Anwendung als Gas oder alk. Lösung

Aldehyde• Reagiert mit Carboxy-, Amino- und Thiogruppen

• wässrige Lösung oder wässrige alk. Lösung

Halogene• bildet Hypochlorsäure

• denaturiert Proteine

Alkohole• denaturiert

• solubilisiert Lipide

Trinkwassergrenzwerte• in 100ml keine E. coli

• in 200ml 1 E. coli

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BiofilmeBakterien können sich auf Oberflächen anhaften und mit Schleimen umgeben. Dadurch können sie Nährstoffe untereinander austauschen und sind besser geschützt.

Bildung• bilden sich an Grenzflächen

1. reversible Bindung mit Pili etc. an Oberfläche

2. intensivierte Bindung durch Anpassung der Oberfläche an Bindung

3. Durch Zellteilung und weitere Zellen entsteht ein dichter Bakterienrasen

4. Zellen sondern Polysaccharide und Proteine ab, die den Biofilm stabilisieren

5. ausgewachsener Biofilm sondert regelmäßig Teile ab

Adhäsion• Flagellen oder Pili für Anheftung

• Zusammenhalt zunächst über Pili dann über EPS

Organisation• verschiedene Bereiche können unterschiedliche Physiologien aufweisen

• verschiedene Mikroorganismen mit verschiedenen Aufgaben

• Austausch von Genen (horizontaler Transfer)

• über Konjugation

• über Viren

Kapseln und Schleim• helfen in Biofilmen bei Adhäsion und bilden die Matrix

• binden viel Wasser und schützen vor Austrocknung

• Schützen vor Phagozytose und Pathogenen

• auch medizinische und technische Bedeutung

Kapsel• Aus Zuckern oder Proteinen

• dicht gepackt

• unflexibel

• Nachweis über Tuschefärbung

• Bacillus anthracis (Polyglutamat), Streptococcus salivarium (Levan), Pseudomonas aeruginosa (Alginat), Azotobacter (Alginat)

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Stoffwechsel der BakterienBakterien können verschiedene Wege der Energiegewinning nutzen um sich der Umgebung anzupassen. Höheren Organismen fehlen diese Möglichkeiten oft. Der Mensch ist Chemoorganoheterotroph.

ElektronendonatorenPrinzipiell kann alles ein Donator sein, solange es weiter oxidierbar ist.

• Nitrit (N +III) sowohl Donator/Akzeptor (Nitrat +V nur als Akzeptor)

• Sulfit sowohl Donator/Akzeptor

• H2S und S

• H2

• Fe +II

Kreislauf• C wechselt Redoxzustände zwischen +IV (als CO2) und 0 (in Zuckern etc.)

Thermodynamik• Zellen wandeln Energie

• können Wärme nicht in freie Energie wandeln (nur umgekehrt)

• Zellen arbeiten irreversibel (kein Gleichgewichtszustand, Wärmefreisetzung, Wirkungsgrad <100%)

• Katabolismus: freie Energie wird verlustbehaftet (Wärme) gebunden

• Anabolismus: gebundene Energie wird verlustbehaftet (Wärme) genutzt

ATP als zentrales Element• zentraler Energiespeicher der Zelle

• verschiedene Bildungswege (SSP oder ETP)

• Konservierung von freier Engerie in ATP

• Katalyse von Redoxreaktionen

• Potentialbildung an Membranen

• alle Reaktionen haben dasselbe Grundprinzip

Energiestoffwechsel (Quelle) Elektronendonor Kohlenstoffquelle

Phototroph Lithotroph (anorganisch) Autotroph (CO2 Fixierer)

Chemotroph Organotroph Heterotroph

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ATP• zwei Säureanhydridbindungen speichern

Energie

• ATP Bildung ist endergon, Spaktung exergon

• unter Cytoplasmabedingungen -44 kJ/mol

Substratstufenphosphorylierung• phosphorylierung von ADP durch

cytoplasmatische Kinasen

• Reaktion muss exergoner als -30,5 kJ/mol sein (freie Enthalpie von ATP)

• nur wenige haben ausreichend hohes Phosphorylgruppenübertragungspotential

• z.B Phosphoenolpyruvat

Elektronentransportphosphorylierung• ATP Bildung durch ATP-Synthase-Komplex

• nutzt Elektrochemisches Potential als Energiequelle

• Gradient wird durch Redox Reaktion aufgebaut

• sowohl aerob (O2 als e--Akzeptor) als auch anaerob (Nitrat, Nitrit etc. als Akzeptor)

• viele verschiedene Reaktionen nutzbar

• auch Reaktionen mit wenig Energiegewinn sind nutzbar

Stoffwechseltypen• Mensch z.B chemo-organo-heterotroph

Chemoorganotrophie• organische Substanzen (va. Zucker, Lipide, etc.) als Ausgangsstoff

• übertragung der Elektronen auf O2 (aerob) oder Schwefel, Nitrat etc. (anaerob)

• Energie der Elektronen wird für ATP Bildung genutzt

• Gärung ohne externe Akzeptoren, dann nur SSP möglich

Reduktionsäquivalente• NAD+ und NADP+ nehmen Elektronen auf

• können Elektron dann an Akzeptor abgeben

Phototrophie• Licht dient als Energiequelle

• treibt Elektronentransport

• treibt ATP-Synthese (ETP)

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Aerobe Chemoorganotrophie• Glucose Oxidation zu CO2

• verschiedene Wege möglich

C6H12O6 + 6 O2 + 38 ADP + 38 Pi → 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP

∆G = –2830 kJ/mol

1. Glykolyse

2. Pyruvat-Oxidation

3. Citrat-Zyklus

4. Aerobe Atmungskette

Glucose-AbbauEmbden-Meyerhof-Parnas-Weg = Glykolyse

• Bilanz: 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH

KDPG-WegBilanz: 2 Pyruvat + 1 ATP + 1 NADH + 1 NADPH

Pentosephosphat-WegBilanz: 1 CO2 + 1 Pentose + 2 NADPH

PyruvatdehydrogenasePyruvat + CoA + NAD+ → Acetyl-CoA + CO2 + NADH

• Durch Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex

Citrat-ZyklusAcetyl-CoA+ 3 NAD+ +UQ + GDP + Pi + 2 H2O → 2CO2 + CoA + 3 NADH+ + UQH2 + GTP+ 2 H+

• gebildetes Acetyl CoA wird abgebaut

• 2 CO2 + 3 NADH + UQH2 + GTP + 2 H+

• NADH und UQH2 werden in Atmungskette oxidiert

• ATP Bildung durch ETP

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Atmungskette• ETP

• ATP Bildung durch ATPase mit Protonengradient

in Mitochondrien und Oxidase-positiven2,5 – 3 ATP pro NADH

1. NADH überträgt Elektronen und Protonen auf Komplex I

1. diese Energie transportiert 4 H+ nach außen

2. Protonen und Elektronen werden auf UQ Übertragen zu UQH2

2. Succinat-Dehydrogenase des Citratzyklus

3. UQH2 gibt Protonen und Elektronen an Komplex III ab

1. dieser Transportiert 2 H+ nach außen

2. 2 Protonen des UQH2 werden nach außen abgegeben

3. Elektronen werden auf Cytochrom c übertragen

4. Cytochrom entlädt Elektronen auf Komplex IV

1. 2 H+ nach Außen

2. Elektronen mit 2 H+ auf O2 übertragen zu H2O

5. Protonen strömen durch ATPase (Komplex V) nach innen

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Chinone• Ubichinon (UQ, Q-10), Menachinon etc.

• nehmen 2 Elektronen mit 2 Protonen auf

ATP-Synthase• Rotor (F0) und Stator (F1)

• F0 in Membran

• F1 Innen bzw. im Stroma

• c-UE = Zahl der H+ pro 3 ATP

• in Mitochondrien 10 c-UE

• in Bakterien 10-15 c-UE

ATP Bilanz• bei 10 c-UE → 3,3 H+ pro ATP = 34 ATP pro Glcuose

• bei 14 c-UE → 22,4 ATP

Oxidase-negative• z.B E. coli

• Komplex III und IV fehlt

• ersetzt durch Chinol Oxidase

• UQH2 wird direkt oxidiert

• eine Kopplungsstelle entfällt

• weniger ATP Ausbeute, da weniger Protonen

Verzweigte Atmungsketten• bei Bakterien normal

• andere Endakzeptoren als Sauerstoff

• Chinonpool dient als Verzweigungspunkt

• Aerobe und Anaerobe Atmungsketten

• Geringere Ausbeute als bei aerober Atmung

• Reaktionen sind weniger Exergon

• proprtional zu Redoxpotential

• ∆G0 = - n F ∆E0

Alternativen

Nitrat/Nitrit/N2O → N2 / NH4+

C6H12O6 + 3 NO3- + 6 H+ → 6 CO2 + 3 NH4+ + 3 H2O

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5 C6H12O6 + 24 NO3- + 24 H+ → 30 CO2 + 12 N2 + 42 H2O

Fumarat → Succinat

Oxidierte Metallionen → Reduzierte Metallionen

Sulfat/Schwefel → Sulfid

CO2 → CH4 / Acetat

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PhototrophiePhototrophe nutzen die Energie von Licht um die endergonen Reaktionen der ATP Synthese anzutreiben.

CO2 + H2A → [CH2O]n + H2O + 2 A H2O oder H2S

• wenn λ < 1μm, dann kann 1 ATP/Quant gebildet werden

• Bildung von ATP durch Elektronentransportphosphorylierung (ATP-Synthase)

• bei Chemotrophen wird Energie aus Oxidation gewonnen

• bei Phototrophen aus Licht

Allgemeine Funktion1. Lichtreaktion

• Elektronendonoren geben ihre Elektronen ab

• Elektronen werden genutzt für elektrischen Gradienten

• Bildung von NADH und ATP

2. Dunkelreaktion

• NADH und ATP werden genutzt um Speicherstoffe wie Glucose aufzubauen

Ablauf1. Lichtenergie trifft ein

2. Absorption und Transfer zum photochemischen Reaktionszentrum

3. Anregung von Valenzelektronen

4. Nutzung der Energie als freie Energie

5. Konservierung der freien Energie (Membranpotential)

6. ATP Synthese

Anoxygene PhotosyntheseAnoxygene Photosynthese setzt keinen Sauerstoff frei. 1 Photosystem.

• Schwefelfreie Purpurbakterien (Rhodospirillum), Schwefel Purpurbakterien (Chromation), Grüne Schwefelbakterien (Chlorobium)

Oxygene PhotosyntheseBei der Oxygenen Photosynthese wird Sauerstoff produziert. 2 Photosysteme.

• Cyanobakterien, Pflanzen

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LichtsammelapparatPigmente• Chlorophyll A absorbiert Blau und Rot

• Bakteriochlorophyll a absorbiert Blau und nahes Infrarot

Aufbau• Reaktionszentrum mit Pigmenten (Chlorophylle, Carotinoide) umgeben

• Pigmente bilden Ring

• Flächenvergrößerung durch intracytoplasmatische Membranen

ElektronentransportChloroflexus, Purpurbakterien1. P870 PS wird angeregt

2. Elektron wird auf Chinon übertragen (NADH-Bildung)

3. Elektron wird über Cytochrom bc und Cytochrom c auf P870 zurückgeführt (Oxidase bildet Wasser)

Chlorobium, Heliobacterium1. P840 wird angeregt

2. Elektronübertragung auf Fe/S Komplex

3. auf Ferredoxin (NADH Bildung)

4. Chinon

5. Cytochrom bc und Cytochrom c

6. P840

Cyanobacterien, Chloroplasten1. Wasser wird an P680 gespalten für Elektron (O2 Produktion)

2. P680 wird angeregt

3. Übertragung des Elektron auf Chinon

4. Über Cytochrim bc und Plastocyanin auf P700

5. P700 wird angeregt

6. Übertragung auf Fe/S Komplex

7. Übertragung auf Ferredoxin (bildung von NADPH)

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Cyanobakterienz.B Nostoc

• können Heterocysten haben die keine Photosystem II haben

• diese fixieren Stickstoff mit Nitrogenase (sehr O2 empfindlich)

• werden von benachbarten Zellen gefüttert

• können Phycobiline haben

• diese absorbieren im grünen Breich

• füllen grüne Lücke des Chlorophyll

• assembliert zu Phycobilisomen

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Chemolithotrophie

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Gärungen• unter anaeroben Bedingungen

• Meist steht nur SSP zur ATP Bildung zur Verfügung

• Reduktive Schritte zur Regeneration von NADH

• dabei entstehen die charakteristischen Gärprodukte

• Enstehung von Acetat + CO2 + H2 → Verwendung der methanogenen Archaea

Gärer mit menschlicher Bedeutung• Bacteroides spp., Enterococcus faecalis, Escherichia coli in allen Menschen

Gärung im Pansen• Abgabe von Acetat, Propionat und Butyrat in Blutstrom

• Bildung von CO2 und H2 → Verwertung zu Methan der Methanogenen

MilchsäuregärungHomofermentativ• Glucose wird nach EMP Weg abgebaut

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• von Lactatdehydrogenase wird Pyruvat zu Lactat umgebaut

• Stereospezifisch

• L- oder D-Lactat (Racemat durch Racemasen möglich)

• durch Lactobacillen, Streptococcen

Heterofermentativ• Glucoseabbau über PPP Weg

• Bildung von Lactat + Ethanol oder Lactat + Acetat

• Ausbeute bei Glucose 1 ATP, bei Ribose 2 ATP

Alkoholische Gärung (Ethanolgärung)Glucose → 2 EtOH + 2 CO2

2 ATP/Glucose bei Hefe (EMP)

1 ATP/Glucose bei Zymomonas (ED)

• Pyruvat zu Acetaldehyd (Pyruvatdecarboxylase)

• Acetaldehyd zu EtOH (Alkoholdehydrogenae) regeneriert 2 NADH der Glykolyse

Zymomonas mobilis• strikt fermentativ

• Proteobacteria (Alpha-Proteobacteria)

• Verwandt mit Essigsäurebakterien

Bierherstelleung1. Gerste quellen (Amylase Aktivität bildet Maltose)

2. Würzeherstellung (weitere Umsetzung zu Maltose)

3. Gärung (Hefe bildet Ethanol aus Maltose)

• Obergärige (S. cerevisiae)

• Untergärige (S. carlbergensis)

ButtersäuregärungC6H12O6 → C4H7O2- + H+ + 2 CO2 + 2 H2

3 ATP/Glucose

• Glucose Abbau (EMP)

• Glc → 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH

• Pyruvat Oxidation zu Acetyl-CoA (mit Ferredoxin)

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• 2 Pyruvat → 2 Ac-CoA + 2 CO2 + 4 Fdred

• Bildung von Buttersäure aus Acetyl-CoA

• 2 Ac-CoA + 2 NADH → C4H7O2- + H+ + 2 CoA

• liefert weiteres ATP

• typisch für Clostridien

• saccharolytische bauen KH ab (alle pathogen)

• Peptolytische bauen Peptide ab (viele pathogen, tetani und botulinum)

Pyruavtoxidation mit PORPyruvat → Acetyl-CoA + CO2

• wie durch Pyruvatdehydrogenase

• mit Ferredoxin statt NADH

• Pyruvat-Ferredoxin Oxidoreduktase

• reversibel durch Konservierung der Energie im Ferredoxin

Ferredoxin• Fe/S-Zentren

• cytoplasmatische Elektronenüberträger

• niedrige Redoxpotentiale (ca. -0,4 V)

• bei Clostridien meist 2 e-

Bildung von H2

• Nur möglich wenn Elektronendonor niedriges Redoxpotential hat

• weniger NADH muss teuer (mit energiereichen Intermediaten) regeneriert werden

• größere Energieausbeute

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Gemischte SäuregärungAcetylphosphat + ADP → Acetat + ATP (Acetatkinase)

• Pyruvat-Formiat-Lyase bildet Acetyl-CoA

• in E. aerogenes wird Pyruvat auch von Alpha-Acetolactat-Synthase umgesetzt

Gemischte SäuregärungE. coli TypProdukte: Acetat, Formiat, Lactat, Succinat, Ethanol, H2/CO2

Glucose + CO2 → Acetat + Formiat + Succinat + H+

Glucose + H2O → Acetat + 2 Formiat + Ethanol + H+

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2-3 ATP

• Pyruvat als Ausgangssubstanz

• Lactatbildung

• Acetyl-CoA + Formiat durch Pyruvat-Formiat-Lyase

• Ethanol regeneriert 2 NADH

• Acetat bildet ATP

• aus Formiat wird CO2 + H2 gebildet

• Phosphoenolpyruvat

• Oxalacetat → Malat → Fumarat → Succinat regeneriert 2 NADH und bildet ATP

Methylrotprobe postiv (rot, pH unter 4,5)

Pyruvat-Formiat-Lyase• Abspaltung von Formiat aus Pyruvat ist chemisch „unmöglich“

• Katalyse dieser Abspaltung als Radikal

Enterobacter Typ2 ATP

• fast keine sauren Endprodukte

• Ethanol, Butandiol und CO2

• Methylrotprobe negativ (geld, kein Umschlag → nicht unter pH 4,5)

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PropionsäuregärungPropionibactericeae (Actinobacteria)

• Glucose, Lactose, Saccharose als Substrate

• Lactat, Malat, Glycerin als Gärprodukte

3 Laktat → 1 Acetat + 1 CO2 + 2 Propionat + H2O

• Käsereifung

HomoacetatgärungGram+ (Acetobacterium)

4 ATP

Glucose + 2 H2O → 2 Acetat + 2 H+ + 2 CO2 + 8 [H+]

2 CO2 + 8[H+] → Acetat + H+ + 2 H2O

Glucose → 3 Acetat + 3 H+

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Phylogenie der BakterienDomänen des Lebens1. Bacteria

2. Archaea

3. Eukarya

Prokaryoten sind eine Form, kein Taxon

Einteilung1. Domäne

2. Reich (nur bei Eukarya)

3. SKOFGA

4. ggf. Stamm

Bacteria Archaea Eukarya

Organellen selten - +

Innere Membranen selten selten +

Gewebe nur Aggregate - + und -

Größe bis 5 μm bis 5 μm 5-100 μm

Zellwand Peptidoglykan, oft Muraminsäure

variabel, keine Muraminsäure

Cellulose, Chitin

Membranlipide Fettsäure-ester Isoprenether Fettsäure-ester

Chromosom meist 1 Ring 1 Ring mehrere lineare

Größe

Plasmide + + -

Mitose/Meiose - - +

Histone - + +

Bewegung Flagellen/Geißeln Flagellen Geißeln, Amöboid

Vesikeltransport - - +

Wachstumsrate hoch hoch niedrig

RNA-Polymerase eine mit 5 UE mehrere mit 12 UE 3 mit 12-14 UE

Initiator tRNA Formyl-Met Met Met

Ribosomen 70S 70S 80S

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Die Einteilungen sollen die (wahrscheinlichste) historische Entwicklung abbilden.

• konventionelle Einteilung nach phänotypischen Merkmalen

• moderne Einteilung nach genotypischen Merkmalen

Einteilung nach Morphologie• Coccen (Kugelform)

• einzelne Coccen

• Diplococcen (hängen zu zweit)

• Streptococcen (bilden Fäden)

• tetrade

• Staphylococcen (bilden Haufen)

• Stäbchen

• Bacillus

• Streptobacillus (bilden Fäden)

• Coccobacillus (ovale Formen)

• andere Formen

• Vibrio (Nierenförmig)

• Spirillum (wellenförmig)

• Spirochete (Wellenfäden)

• Seleno (Mondsichelförmig)

Einteilung nach Stoffwechsel• Phototroph, Chemotroph

• Lithotroph, Organotroph

• Autotroph, Heterotroph

Einteilung nach Lebensbedingungen• Psychrophil, Mesophil, Thermophil, Hyperthermophil (Temperatur)

• Acidophil, Neutralophil, Alkaliphil (pH)

• Halophil (Salz)

• Barophil (Druck)

• Aerob, Mikroaerob, Anaerob (O2)

• Gärung, Atmung (Stoffwechsel)

• Charakteristische Substrate und Produkte

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Chemotaxonomische Bestimmungen• Färbungen (z.B Gramfärbung)

• Zellwandbestandteile

• Enzymbildung (z.B Stärkespaltung, Lipide)

• Immunologische Reaktionen

• Fingerprints von Proteinen, Genen und Fettsäuren

• GC-Gehalt durch Schmelzkurven

• DNA-DNA Hybridisierung

DNA-DNA Hybridisierung• zwei Organismen vergleichen

• Präparation der DNA

• Markieren von DNA des einen Organismus

• Denaturieren der DNA und Scheren

• Hybridisierung und Bestimmung nicht hybridisierten DNA

• bei mehr als 25% hybridisiert = Gattung

• bei mehr als 75% hybridisiert = Art

Molekulare Chronometer• Stammesgeschichtliche Entwicklung soll dargestellt werden

• Beziehung zwischen DNA-Sequenzen verschiedener Arten kann Aufschluss über Entwicklungsverlauf geben

• Anforderungen an diese Abschnitte

• Universell vorhanden

• Funktionell Homolog

• genügend konserviert aber genügend variabel

• ausreichend lang

• z.B 16S rRNA, Ribosomale Proteine, ATPasen, RNA-Polymerasen

• Signatursequenzen sind Abschnitte in diesen Chronometern die für Gruppen einzigartig sind

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FISH• Einbringen von markierten DNA Sonden bekannter Seuqenz in Zellen

• Beobachten der Hybridisierung durch Fluoreszenz

• Bestimmung von Organismen oder Expressionsorten

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Metagenomik• Sequenzierung des Gesamtgenoms eines Biotops

• unabhängih von Reinkulturen, da gesamtes Biotop Seuqenziert wird

• Restriktionsverdau aller DNA und Schrottschusssequenzierung

• keine bekannten Abschnitte nötig (neue Gene können entdeckt werden)

• Suchen bekannter Muster kann Stammbaum einer Lebensgemeinschaft darstellen

• Human Microbiom Project

Biologischer Artbegriff• bei Tieren durch Fortpflanzungsgemeinschaft

• fruchtbare Nachkommen

• reproduktive Isolation

• bei Prokaryoten gibt es keine Fortpflanzung in diesem Sinne

• asexuelle Vermehrung

• klonal

• horizontaler Gentransfer

→ bei Bakterien werden Gattungen und Arten an ihrer Übereinstimmung von DNA und 16S rRNA eingeteilt

• Obwohl 16S rRNA oft ähnlich ist, können sich Genome deutlich unterscheiden

• Ähnlichkeiten in beiden lassen auf Verwandtschaft schließen

Bestimmungsmerkmale• 16S rRNA bis zur Art

• Unterscheidung in Sämme und Typen durch Immunologie und Fingerprints

• molekulare Bestimmungsmethoden führen zur Zunahme von Erstbeschreibungen und Umklassifizierungen

genetische Diversität• am Beispiel E. coli

• 3 Stämme, 2 pathogen

• gemeinsam nur etwa 40% des Erbgutes

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16S rRNA Fingerprinting• 16S rRNA mit RNAsen verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt

Vorteile• universell vorhanden

• nicht identisch, charakteristische Merkmale

• geringe Mutationsrate daher gutes Chronometer

Verwandtschaftsbeziehungen• Vergleich mehrerer rRNAs

• gleiche Art bei >97% Übereinstimmung

• Menge der Unterschiede gibt wahrscheinlichste Entwicklungsreihenfolge vor (ED)

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Wichtige Hauptgruppen• Aquificae

• Thermodesulfobacteria

• Thermotogae

• Chloroflexi (grüne Nichtschwefelbakterien)

• Chlorobi (grüne Schwefelbakterien)

• Planctomycetes

• Cyanobacteria

• Firmicutes (Gram+ mit niedrigem GC)

• Actinobacteria (Gram+ mit hohem GC)

• Proteobacteria

Aquificae• tief verzweigtes Phylum

• Temperaturen um 85°

• obligat chemolithoautotroph

Planctomycetes• Chemoorganotroph

• Proteinzellwand (Penicillinresistent)

• Knospenbildung „Zellkern“

Firmicutes• Lactobacillus

• Staphylococcus

• Streptococcus

• Listeria

• Bacillus und Clostridium (bilden Endosporen)

• Mycoplasma und Spiroplasma (bilden keine Zellwand, Färbung Gram-)

Actinobacteria• Micrococcus

• Bifidobacterium

• Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium (CMN-Gruppe)

• Streptomyces

• Actinomyces

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BakteriengenetikGenome• liegen meist zirkular vor

• in Streptomyceten und Borrelia manchmal lineare Moleküle

• 0,5 - 5 MBp (bei Hefe 10 MBp, bei Mensch 3 GBp)

• meist haploid

• manche diploid (Azotobacter 20-25n , Halobacterium 15-25n)

• Histonähnliche Proteine kompaktieren DNA

• Genom = Chromosom + Plasmide

Chromosomen• Protein codierende Gene 95%

• keine Introns

• kaum Intergensequenzen

• rRNA und tRNA Gene

• intergenische Regioenn mit regulatorischen RNAs

• haben einen Ori und terminal

GC-Skew

Open Reading Frame• beginnt mit Startcodon (oft ATG)

• endet mit Stoppcodon (UAG)

• erstes Startcodon muss nicht unbedingt Start der Translation sein

• beide Stränge können codieren

Gene und Operons• bei Gen folgt nach Operon der Transkriptionsstart

• mRNA enthält dann RBS aka Shine-Dalgarno Sequenz (Ribosomen Bindestelle)

• auf RBS folgt Startcodon ORF und Stoppcodon mit Terminationssignal

• bei Operon folgen auf erste RBS mehrere ORFs die jeweils wieder mit RBS beginnen

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Plasmide• zusätzlich zum Chromosom

• bis 500KBp

• als Episom können sie in Chromosom integriert werden

• können als F-Plasmide transferiert werden (Konjugation)

• besitzen einen Ori

• werden autonom repliziert

• start der Replikation

• Kontrolle über Kopienzahl

• außerdem können weitere Gene eingefügt sein

• Blue/White Screening durch lacZ Gen welches bei Insertion zertört wird

• unter X-Gal bilden Zellen mit intaktem LacZ (keine Insertion) blaue Kolonien

1. tra-Gene für Konjugation (bilden Pili) auf F-Plasmiden (Fertilität)

2. Resistenzgene auf R-Plasmiden

3. Gene für KW Abbau (Zucker)

4. Pathogenitätsfaktoren (Kapselbildung B. anthracis, Hämolyse bei E. coli)

5. Tumor DNA (A. tumefaciens)

6. Bakteriophagen DNA

in MolekularbiologieVektorplasmide werden genutzt für

• Klonierung

• Genverstärkung

• Sequenzierung

• Proteinherstellung

Veränderungen des Erbgutskönnen hervorgerufen werden durch

1. Replikationsfehler (Punktm.)

2. Basenschaden (Punktm.)

3. Rekombination (Inversion etc.)

4. DNA Aufnahme (Insertion)

• E.coli Polymerase nur 0,5 × 10-7 Fehler

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Horizontaler Gentransfer• zwischen Individuen, nicht zwischen Generationen

• durch natürliche Kompetenz, Bakteriophagen, F-Plasmide, IS/Transposons (innerhalb der Zelle)

Transformation• Griffith/Avery Experiment mit S. pneumoniae Transformation zwischen S/R Stamm

• natürliche Kompetenz

• E. coli sind nicht natürlich kompetent

• können durch Ca2+, Mg2+ oder Rb2+ chemisch kompetent gemacht werden

• Transformation durch Hitzeschock

• dann z.B Blue/White screening

• B. subtilis sind teilweise natürlich kompetent

• 20% werden in stationärer Phase kompetent

• in Biofilmen

• Binden von dsDNA, Spaltung zu ssDNA, Transport der ssDNA über die Membran in Cytoplasma, Verdopplung und Einbau

Konjugation• direkte DNA Übertragung von Zelle zu Zelle

• Gene für Konjugation liegen auf F-Plasmid (tra Gene)

• traA für Pilin

• traD für Transfer etc.

• Übertragung von F- oder R-Plasmiden

• Copy/Paste

• Relaxosom sorgt für Einzelstrangübertrahung durch rolling circle replication

1. F-Pilus bindet an andere Zellen

2. Kontraktion des Pilus schafft Zell-Zell-Kontakt

3. Kontakt über LPS + OmpA (Surface exclusion verhindert Donor/Donor)

4. tra Protein bindet an Plasmid Ori

5. TraI spaltet Einzelstrang

6. TraI ist fest gebunden und schleust ssDNA über Kontakt in zweite Zelle

7. Rezirkularisierung und Replikation in beiden Zellen

Hfr Stämme

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• enthalten F-Plasmid als episomale Kopie

• transferieren F-Plamid und chromosomale DNA

Insertionselemente• Genabschnitte die 1-2 Proteine (Transposasen) kodieren die für eigenes Springen im Genom

verantwortlich sind

• 800-200 Bp

• Tnp inhibieren vermehrtes Springen

• Transposons sind flankiert durch zwei IS und enthalten mittig weitere mitspringende DNA

• Klasse I: zwei IS, Cut/Paste

• Klasse II: Transposase mittig codiert, Replikativ

1. Transposase wird an beiden enden transkribiert und translatiert

2. Dimerisiert und bildet Ring mit genetischem Material

3. Schneidet aus und bindet an neue Stelle

4. Fügt sich in DNA ein

ReplikationRolling Circlebei F-Plasmiden und manchen Plasmiden

• Nick in einem Strang des Zirkels

• abspalten eines Stücks und gleichzeitiges Neusynthetisieren

• Fortschreiten der Synthese spaltet einen Strang weiter ab

Theta Replicationbei meisten Plasmiden und Chromosomen

• von ori aus wird in beide Richtungen synthetisiert

GenaktivitätPromotor• Bindestelle für Polymerase + Sigma-Faktor

• -35 Region und Pribnow-Bow (-10)

• Promotor liegt vor dem Startpuntk der mRNA

RNA-Polymerase• bei Bakterien eine RNAP vorhanden

• 5 Untereinheiten

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• α2, β, β’, ω + σ Faktor

• σ Faktor erkennt die Promotorsequenz

Ribosomen• 70S Ribosomen

• 2/3 des Ribosoms sind RNA

• Ribozym

• 30S UE bindet mRNA

• 16S rRNA (erkennt Shine-Dalgarno-Sequenz)

• rProteine

• 50S UE hat Peptidyltransferasezentrum

• 23S rRNA (katalytische Aktivität)

• 5S rRNA (Mittelhöcker des Ribosoms)

• rProteine

Translation• Ribosom + mRNA

• + 60 tRNA + 20 AS

1. Peptidkette wird mit tRNA in A-Stelle verlängert

2. mRNA wird 3 nt weitergeschoben

1. tRNA wandert von A- in P-Stelle

2. alte tRNA wandert von P- in E-Stelle (wid freigesetzt)

3. neue tRNA kann an freigewordene A-Stelle binden

AntiobiotikaManche Antibiotika können die Translation behindern

• Streptomycin u. Tetracyclin behindert tRNA Wechselwirkung (16S rRNA)

• Neomycin, Gentamycin, Kanamycin verursachen miscoding (16S rRNA)

• Chloramphenicol, Erythromycin, Anisomycin blockieren Peptidyltransferase (23S rRNA)

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PathogenitätKoch’sche Postulate• Krankheitserreger muss relmäßig in Krankheitsfällen isoliert werden können

• muss in Reinkultur gezüchtet werden können

• löst in Versuchen das typische Krankheitsbild aus

• Aus erkrankten Versuchen reisolierbar

• Patientenserum agglutiniert den Erreger

Manche Erreger sind nicht kultivierbar.

Neuere Versionen• Ein bestimmtes Gen kommt nur bei Pathogenen Stämmen vor

• Inaktivierung des Gens muss zu Virulenzminderung führen

• Komplementation mit Wildtypgen führt wieder zu Virulenz

Pathogenitätsfaktoren bestimmen die Pathogenität

Infektionskrankheiten

Opportunistische Infektionen• einige Bakterien der normalen Flora sind potentiell pathogen

• Endogene

Normale Bakterienflora• helfen bei Nahrungsaufnahme

Krankheit Erreger

Pest Yersinia pestis

Cholera Vibrio cholerae

Tuberkulose Mycobacterium tuberculosis

Lyme Borreliose Borrelia burgdorferi

Lungenentzündung Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophilia, Pseudomonas aeruginosa

Bakt. Gastroenteritis V. cholerae, Shigella, Salmonella, E. coli, Yersinia

Endokarditis Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus

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• verhindern Infektionen

• Vitaminsynthese

Bedingungen für Infektionskrankheiten• Immunsystem

• Verletzungen

• Besiedlungsart (lokal/systemisch)

• Infektionsdosis

• Virulenz

Pathogenität• Vermögen des Erregers Schaden zu Verursachen und Krankheit hervorzurufen

• von Eigenschaften des MO abhängig

• Pathogenese ist multifaktoriell und hängt von Pathogenitätsfaktoren, dem Immunstatus und der Zahl der der MO bei der Infektion ab

Virulenz• Anhaftung

• Vermehrung

• Abwehrüberwindung

• Eindringen

• Schädigung der Zellen

ToxizitätToxinbildung

• Escherichia coli, Staphylococcus aureus und andere Enterobacteriacaen

• Endotoxin (Lipopolysaccharid)

• Tel der äußeren Membran ( außerhalb der Cytoplasmamembran)

• Lipid A + Pentasccharidketten, Ethanolamin, Acetylglucosamin, etc.

• Nur bei Gram-

• Hitzsestabil

• Chromosomal codiert

• Fieberauslösend (Pyrogen)

• auch durch tote Bakterien, keine Infektion erforderlich, eher Vergiftung

1. LPS wird von LPS-binding-Protein gebunden

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2. komplexiert mut CD14

3. zusammen aktiviert es Toll-like-Receptor

4. dieser sorgt für stimulierendes Signal

5. Makrophagen und Cytokine sorgen für Blutdruckabfall und Fieber

Nachweisbar mit LAL-Test, Lysat aus Amöbozyten gerinnt durch LPS

• Exotoxin (z.B Hämolysin)

• sekretiere Proteine

• Bei beiden Gram Typen

• Hitzelabil (Proteine)

• andere Enzymaktivitäten (Proteasen etc.)

BesiedlungsfähigkeitOberflächenbesiedlung

• Adhäsion an Wirtszellen

• Mycoplasmen, S. pneumoniae

InvasivitätFähigkeit in den Wirt einzudringen und sich in ihm zu verbreiten

• Eindringen in Zellen des Wirtes

• Salmonella enterides

PersistenzÜberlebensfähigkeit im Wirt

• Verstecken vor dem Immunsysytem

• Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen

Defensive Pathogenitätsfaktoren• Kapsel und Schleimbildung

• Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis

• Veränderungen von Oberflächen Antigenen

• Enzymaktivitäten (Antibiotika Resistenzen)

• 95% der Staphylococcus aureus sind Penicillin/Methicillin resistent (MRSA)

Antigene• O-Antigene (1-137): Kohlenhydratseitenketten (LPS)

• H Antigene (1-57): Adhäsine (Pili und Flagellen)

• K-Antigene (1-80): Kapseln

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z.B Ecoli O157:H7 EHEC

Cholera• Choleratoxin betrifft Darmepithelzellen

• ADP-Ribosylierung des Gs-Proteins führt zu Überproduktion cAMP

• AB5-Toxin

• AB5-Ring bindet an Oberflächenrezeptoren (Internalisiwrung des A-Fragment)

• cAMP Spiegel erhöht durch Andenylatcyclase-Aktivierung

• Wasserverlust durch Blockade des Na+ Einstroms (Na/H-Antiporter)

• Erhöhung Cl- und HCO3- Ausstrom (CFTR)

Bacillus anthracis• Milzbrand

• Milz verfärbt sich schwarz

• Biowaffenfähig durch Sporenbildung

• Toxine erzeugen Blutungen

• Kapsel als Virulenzfaktor

• verursacht keine Immunreaktion

• verhindert Phagozytose

• verhindert Phageninfektion

• Plasmid codierte Kapsel

Streptococcus salivarium• Levankapsel aus Saccharose

• Glucose + Levan (Fructose Polymer)

• haftet auf Zahnschmelz

• produziert Milchsäure die Zahnschmelz angreift (Karies)

Pseudomonas aeruginosa• bildet Alginatkapsel

• schützt vor Antibiotika

• Begleitkeim bei Mukoviszidose

Viren• keine Lebewesen

• kein eigener Stoffwechsel

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• keine selbstständige Vermehrung

• intrazelluläre Parasiten

• keine Kompartimentierung

• infektiöse mobile genetische Elemente

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Viren

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BakteriophagenAllgemeines• Viren die Bakterien befallen (phagein = fressen)

• 20-30 nm groß

• infektiöse nicht zellulare Einheiten

• ohne eigenen Stoffwechsel auf Wirtszellen zur Vermehrung angewiesen

• Parasiten

→ mobile Geneinheiten in einer Schutzhülle

Aufbau• Nukleinsäuren (DNA oder RNA)

• Proteine (z.B als Hülle)

• z.T zusätzlich Lipide

genetischer Aufbau• kleine einfache aufgebaute Genome

• leicht veränderbar

• etwa bis 60 kBp (Phage T4)

TypenVirulent1. Adsorption

2. Penetration

3. Replikation

4. Morphogenese

5. Freisetzung

Temperent1. Adsorption

2. Penetration

3. (Integration)

1. Prophage oder Induktion

2. Excision

4. Replikation

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5. Morphogenese

6. Freisetzung

Phage T4• Kopf-Schwanz Phage

• Kopf und Kragen

• Schwanz

• Basalplatte mit Schwanzfasern

• virulent und lytisch

• keine Integrations ins Chromosom

• Zyklus 25 minuten

• 50 Phagen/Zelle „burst size“

• Bindet mit Schwanzfasern und dann Basalplatte und injiziert DNA durch Kontraktion des Schwanzes

• bindet an OmpC

Genetisches Schema• Frühe Replikation mit Wirts-RNAP + eigenem σ-Faktor

• mittlere Phase modifiziert RNAP

• späte Phase mit modifizierter RNAP + neuem σ Faktor

Phage λ• temperent

• 50 KBp (komplexe Regulation)

• bindet an Maltoporin (LamB)

• lytischer Zyklus ohne Integration

• 45 min Replikationszeit

• 100 Phagen burst size

• lysogener Zyklus

• Integration (ortspezifisch ins Genom)

• Weitergabe bei Teilung

• Immun gegen Neuinfektion

• Lamda Repressor für Aufrechterhaltung des Lysogenen Zyklus

• nach Integragtion kann durch UV-Strahlung induziert werden

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Phagentherapie• Interessant für Einsatz gegen Multiresistene Keime (z.B MRSA)

• Phagenlysine als hochspezifische Wirkstoffe

• hauptsächlich gegen Gram+

• mit Antibiotika anwendbar

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PraktikumKoagulasetest• Prothrombin → Thrombin (durch Thrombokinase + Ca2+)

• Fibrinogen → Fibrin durch Thrombin

• ohen Ca2+ kann Prothrombin nicht aktiviert werden

• manche Bakterien können ohne Ca2+ Prothrombin aktivieren (Koagulase) → Blutgerinnung

• Test mit Blutplasma

• typ. Staph. aureus

IMViC Test• Test auf

• Indolbildung (Tryptophanase)

• Methyrotprobe (Säurebildung aus Zucker)

• Voges-Proskauer (Acetoin)

• Citrat-Verwertung (Citratpermease Citrattransporter)

• Teil des api 20 Testsystems

E. coli = I+ M+ V- C-

Enterobacter = I- M- V+ C+

Gram-Färbung1. Kristallviolett (Gentia~)

2. Lugol

3. 96% EtOH

4. Safranin

→ Gram- werden rot, Gram+ bleiben violett

Katalasetest• 3% KOH auf Zellkultur

• bei Bläschen (Sauerstoffentwicklung Katalase positiv)

Reinigungsausstrich1. Ausglühen der Impföse

2. Eintauchen in Kolonie und Aufbringen auf Platte (2-3 Striche)

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3. erneutes Ausglühen

4. Durchfahren der Striche durch 2 weitere Striche

5. ernuetes Ausglühen

6. Durchfahres des Strichs

7. erneutes Ausglühen

8. Verteileung in ZickZick Zack

Köhlern• Leuchtfeldblende öffnen

• Kondensor nach oben Stellen

• kleines Objektiv ohne Phasenkontrast

• Objekt scharf stellen

• Leuchtfeldblende schließen bis Rand sichtbar

• Kondensor senken bis der Rand scharf ist

• Leuchtfeldblende öffnen bis Rand nichtmehr sichtbar ist

Liste von relevanten Organismen

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Übungen

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AnhangLiteraturverzeichnisI. Prof. Dr. Felicitas Pfeifer, Prof. Dr. Jörg Simon, Dr. rer. nat. Arnulf Kletzin; BB06 Physiologie der Mikroorganismen, TU DarmstadtII. Fuchs, Georg; Allgemeine Mikrobiologie, 8. Auflage, 2007, Stuttgart, Georg Thieme VerlagIII. Cypionka, Heribert; Grundlagen der Mikrobiologie, 4. Auflage, 2010, Heidelberg, Springer Verlag

BildnachweiseTitelblatt: Klebsiella pneumoniae von NIAID, Flickr, https://flic.kr/p/mWsNFo (CC BY 2.0)Seite 2:I. By BakteriumSchema.png: Brudersohn. The original uploader was Brudersohn at German Wikipedia derivative work: Mortalmoth

(BakteriumSchema.png) [CC BY-SA 3.0 de (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/de/deed.en)], via Wikimedia CommonsSeite 3:I. By Gram_negative_cell_wall.svg: Jeff Dahl derivative work: Matthias M. [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) or GFDL

(http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html)], via Wikimedia CommonsSeite 4:I. By Yikrazuul (Own work) [Public domain], via Wikimedia CommonsSeite 29:I. By NEUROtiker (Own work) [Public domain], via Wikimedia CommonsII. By NEUROtiker (Own work) [Public domain], via Wikimedia CommonsSeite 31:I. By Klaus Hoffmeier [Public domain], via Wikimedia CommonsSeite 32:I. By Sponk (Own work) [Public domain or Public domain], via Wikimedia CommonsSeite 38:I. By Yikrazuul (Own work) [Public domain], via Wikimedia CommonsII. By No machine-readable author provided. Norro assumed (based on copyright claims). [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html), CC-BY-

SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/) or CC BY-SA 2.5-2.0-1.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5-2.0-1.0)], via Wikimedia Commons

Seite 39:I. By Yikrazuul (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia CommonsSeite 41:I. By Yikrazuul (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia CommonsII. By Yikrazuul (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia CommonsSeite 46:I. By translated by Yikrazuul, based on image by Mariana Ruiz LadyofHats (Image:Bacterial morphology diagram.svg) [Public domain], via

Wikimedia CommonsSeite 42:I. By Ayacop (+ Yikrazuul) (Own work) [Public domain], via Wikimedia CommonsSeite 43:I. By Conjugation.svg: Adenosine derivative work: Matthias M. (This file was derived from  Conjugation.svg:) [CC BY-SA 3.0 (http://

creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia CommonsSeite 54:I. By Madprime (Own work) [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC BY-SA 4.0-3.0-2.5-2.0-1.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-

sa/4.0-3.0-2.5-2.0-1.0)], via Wikimedia Commons

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Informationen zur Klausur46% Bestehensgrenze

etwa 60P

60min Zeit

• z.T Strukturformel der Gärungen

• Pyruvat

• Acetyl-CoA

• Acetoin

• etc.

• immer eine Virologie Frage

• z.B Besonderheites von RNA Viren

• keine Vermehrungszyklen besondere MO

• Bakterien des Praktikums wichtig

• Bakterien die in VL detailiert behandelt wurden

• Gärungsbilanzen

• evtl. Taschenrechner

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