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Naturwissenschaftliche Fakultät

Institut für Lebensmittelchemie Prof. Dr. R. G. Berger/Dr. Katerina Zelena

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Praktikum Biochemie Bachelor Life Science

Zeitraum 24. 10.13 bis 16.01.2014

Ort: Praktikumsraum N1, 1. OG

Vorbesprechung: Walsroder Hörsaal 22.10.2013 um 10.15 Uhr

(Die Teilnahme an der Vorbesprechung ist

Zulassungsvoraussetzung für das Praktikum!)

Inhalt I. Enzymaktivität und Inhibitoren I.1 Regulation der Glykose bei Hefe I.2 Bestimmung der Ethanolkonzentration I.3 Auswertung und Fragen

II. Substratspezifität enzymatischer Reaktionen II.1 Substratspezifität der Laccase C aus Trametes versicolor II.2. Proteinbestimmung der Laccase C nach Lowry und Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität II.3 Auswertung und Fragen

III. Kinetik enzymatischer Reaktionen Bestimmung der Michaeliskonstanten der Laktatdehydrogenase

III.1 Bestimmung der Pyruvat-Konzentration

III.2 Bestimmung der Umsatzgeschwindigkeit (enzymatische Volumenaktivität) III.3 Auswertung und Fragen (Bestimmung der Michaelis-Konstanten) IV. Aminosäuren und DNA IV.1 Nachweis von Aminosäuren mit Ninhydrin IV.2 DNA-Isolierung aus Früchten IV.3 Auswertung und Fragen

V. Vergleich der enzymatischen und nicht enzymatischen Reaktionen V.1 Saure Stärke-Hydrolyse V.2 Enzymatische Stärke-Hydrolyse V.3 Glucose Kalibrierkurve V.4 Auswertung und Fragen

Vorgaben zur Anfertigung der Protokolle

Institut für Lebensmittelchemie

Dr. Kateryna Zelena

Callinstr. 5

30 167 Hannover

Tel.0511-762-17256 +49 511 762 5356

Fax 0511-762-4547 +49 511 762 5391

[email protected]

02.10.13

Zentrale:

Tel 0511-762-4581 +49 511 762 0

Fax 0511-762-4547 +49 511 762 3456

www.lci.uni-hannover.de



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Literatur:

1) Holtzhauer, M. Biochemische Labormethoden, Springer-Verlag, 2004 2) Rehm, H. Der Experimentator: Proteinbiochemie, Spektrum Verlag, 2002 3) Bisswanger, H. Practical Enzymology, Wiley-VCh, 2004 4) Kleber, H.-P., Schlee, D., Schöpp, W., „Biochemisches Praktikum“, Gustav Fischer Verlag, 1997 5) Voet, D., Voet, J.G., Pratt, C.W., Beck-Sickinger, A.G. Lehrbuch der Biochemie. Wiley-VCH, 2002. 6) Koolman, J., Röhm, K.-H., Wirth, J. Taschenatlas der Biochemie. Thieme,1994 7) Richter, G. Praktische Biochemie : Grundlagen und Techniken. Thieme, 2003 8) Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L., Häcker, B. Biochemie. Elsevier Spektrum Verlag, 2007.



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I. Enzymaktivität und Inhibitoren I.1 Regulation der Glykose bei Hefe Stoffwechselwege sind hoch regulierte Fließgleichgewichte. Als Beispiel dient hier die alkoholische Gärung bei Hefe. Einzelne Reaktionsschritte der Glykolyse können durch Hemmung der betreffenden Enzyme blockiert werden. So z. B. blockiert Jodacetat die Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase. Als weiterer Hemmstoff wird Fluorid eingesetzt, das in Gegenwart von Phosphat Magnesium Ionen komplexiert und damit der Enolase entzieht. Ethanol verursacht eine Inaktivierung der Proteine durch Denaturierung. Material und Chemikalien: Bäckerhefe, Na-Phosphatpuffer 50mM, pH 6,8, NAD+ 30 mM, Puffer ADH, pH 8,7, ADH 1 mg/mL, Jodacetatlösung 100 mM, NaF-Lösung 10 mM Glucose 450 mM + MgCl2 5 mM Eis, Photometer, Zentrifuge, Schüttelwasserbad, Rührer, Halbmikroküvetten, Eppendorfgefäße, Styroporkiste, Stoppuhr, Falcontubes 15 mL, Pipetten, Messzylinder, 200 mL Bechergläser. Inkubation der Hefe Durchführung 500 mg der bereitgestellten Hefe werden in 50 mL 50 mM Phosphatpuffer pH 6,3 gut gelöst. In Falcontubes (15 mL) werden nach dem Pipettierschema die Lösungen pipettiert und die Reaktion durch Zugabe der Hefesuspension gestartet.

Probe, mL 1 2 3 4

Wasser 1,0 0,5 - -

NaF - - 0,5 -

Jodacetat - - - 0,5

Glucose - 0,5 0,5 0,5

Hefe 5,0 5,0 5,0 5,0

Die Proben werden gemischt, sofort (t=0) werden 500 µL entnommen, in ein Eppendorf Gefäß überführt und eisgekühlt. Die Falcontubes werden verschlossen und während des ganzen Versuchs bei 30 °C im Schüttelwasserbad inkubiert. Je 200 µL Probe werden nach 30min und 60 min entnommen und auf Eis gekühlt. Nach mindestens 10 min Stehen im Eisbad wird die Hefe in den Eppendorfgefäßen 3 min bei 15.000 x g abzentrifugiert und in das Eisbad zurückgestellt. Es ergeben sich somit 12 Messungen. I.2 Bestimmung der Ethanolkonzentration In diesem enzymatisch-optischen Test nach Warburg ist die Zunahme des NADH die Messgröße.



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Die genaue Messung der Extinktion bei 366 nm vor der Enzymzugabe und nach Ende der Reaktion ist wichtig! Für jede Probe werden in eine Halbmikroküvette folgende Lösungen pipettiert:

Lösungen mL

ADH Puffer mit Semicarbazid pH 8,7 1,0

NAD+ 0,05

Probe 0,10

Der Inhalt der Küvetten wird gemischt und die Ausgangsextinktion der einzelnen Küvetten gemessen. Die Reaktion wird unter rühren durch Zugabe von 0,02 mL Alkoholdehydrogenase (ADH) zu jeder Küvette gestartet. Nach 60 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird wie oben gegen Luft am gleichen Photometer die Extinktion bei 366 nm gemessen. Berechnung der Ethanolkonzentration in den Inkubationsansätzen:

d = 1 cm 366 nm = 3,4 x 103 M-1 cm-1 I.3 Auswertung und Fragen 1. Beschreiben Sie den Pasteureffekt und erklären Sie die Regulationsphänomene, die zu diesem Effekt führen. 2. Welche Reaktionen der Glykolyse sind reguliert und welche Effektoren beeinflussen die jeweiligen Enzyme?

II. Substratspezifität enzymatischer Reaktionen Die Aktivität von Enzymen ist abhängig von verschiedenen Faktoren. So spielen unter anderem der pH-Wert, die Temperatur, die Salzkonzentration sowie die Substrat- und Enzymkonzentration eine Rolle für die Entwicklung der Enzymaktivität. Die Substratspezifität von Enzymen ergibt sich aus ihrem chemischen Aufbau und ihrer Raumstruktur. Überlegen Sie, wodurch die pH-Abhängigkeit von enzymatischen Reaktionen gegeben ist. Erklären sie warum Enzyme substratspezifisch sind. II. 1 Substratspezifität der Laccase C aus Trametes versicolor Material und Chemikalien: 7x50mL Bechergläser, Falcontubes, Rührer, Magnetfische, Halbmikroküvetten, Photometer, pH-Meter, Ständer für Halbmikroküvetten, Pipetten, Enzymspatel



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Citratpuffer 100 mM, Laccase C aus Trametes versicolor 0,1 mg/mL in 10 mM Citratpuffer, ABTS 5 mM, DMP 5 mM, Tyrosin 1 mM, L-DOPA 1 mM, MBTH in DMF. Durchführung Die Komponenten der Assays werden wie folgt in Halbmikroküvetten pipettiert. ABTS-Assay Citratpuffer 10 mM pH = 5,0 500 µL H2O 350 µL Laccase C 50 µL Extinktionskoeffizient: 36000 M-1* cm-1

Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 µL 5 mM Abts gestartet und die Änderung der Extinktion bei 420 nm für 2 min. am Photometer verfolgt. DMP-Assay Citratpuffer 100 mM pH=5,0 500 µL H2O 350 µL Laccase C 50 µL Extinktionskoeffizienten: 27500 M-1 * cm-1 Die Proben werden für 10 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 µl 5mM DMP gestartet, und die Änderung der Extinktion bei 469 nm für 2 min. am Photometer verfolgt. Tyrosin-Assay Citratpuffer 100 mM pH=5,0 380 µL MBTH 70 µL Laccase 50 µL Extinktionskoeffizienten: 20000 M-1 * cm-1 Die Proben werden für 10 min bei RT inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 µL 1 mM Tyrosin Lösung gestartet, und die Änderung der Extinktion bei 475 nm für 2 min. am Photometer verfolgt. L-DOPA-Assay: Citratpuffer 100 mM pH=5,0 380 µL MBTH 70 µL Laccase 50 µL Extinktionskoeffizienten: 20000 M-1 * cm-1 Die Proben werden für 10 min bei RT inkubiert.



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Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 µL 1mM L-DOPA gestartet, und die Änderung der Extinktion bei 475 nm für 2 min. am Photometer verfolgt. II.2. Proteinbestimmung der Laccase C nach Lowry und Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität Die Proteinbestimmung nach Lowry ist eine Methode zur quantitativen Proteinbestimmung. Im aktuellen Versuch muss die Konzentration der ausgegebenen Laccase C Probe bestimmt werden. Die Proteinprobe wird in einem 10 mL Messkolben ausgegeben. Dieser muss vor den Bestimmungen mit dest. Wasser auf 10 mL aufgefüllt werden. Chemikalien: Die Reagenzlösungen A und B und die Proteinstammlösung für den BioRad Protein Assay sind bereits fertig und stehen im Kühlschrank aus. Durchführung: Diese Vorschrift ist gegenüber der Originalarbeit von Lowry u. Mitarb. etwas modifiziert, um mit geringeren Volumina arbeiten zu können. Es ist zu beachten, dass diese Proteinbestimmungsmethode, die die Oxidierbarkeit aromatischer Aminosäuren ausnutzt, sehr leicht von im Probenpuffer enthaltenen Substanzen gestört werden kann. Es empfiehlt sich daher, als Kontroll-(Blind-) Wert proteinfreien Puffer im gleichen Volumen (hier dest. Wasser) wie die Analysenprobe mitzuführen. Da die Reaktionsbedingungen von Bestimmung zu Bestimmung geringfügig schwanken können, und die Kalibrierkurve nicht linear verläuft, sollte bei jeder Analyse eine Standardproteinreihe im Bereich von 30-300 µg mL-1 gemessen werden. Als Bezugslösung hat sich eine Stammlösung von Ovalbumin oder BSA mit 0,1 % SDS (w/v) in dest. Wasser bewährt. Diese Lösung ist im Kühlschrank über Monate stabil und steht aus. Herstellen der Kalibriergeraden Für die Kalibrierkurve sind 6 adäquate (s.o.) Verdünnungen aus der Proteinstammlösung in Wasser herzustellen. (Bevor die Verdünnungsreihe angefertigt wird, müssen die Werte von der Assistentin bzw. dem Assistenten abgezeichnet werden.) 200 µL der Proben- bzw. Standardlösung sind in eine trockene Einwegküvette zu pipettieren. Zugabe von 100 µL der Lösung A. Zugabe von 800 µL der Reagenzlösung B. Gründlich mit einem Rührstab vermischen und nach exakt 15 min die Absorption bei 750 nm gegen Wasser messen. (Für die Messungen sind Einwegküvetten mit gleicher Eigenabsorption zu verwenden.) Die ausgegebene Laccase Probe wird analog behandelt.

http://de.wikipedia.org/wiki/Protein



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Anschließend wird die spezifische Aktivität der Laccase C für das jeweilige Substrat in U (mU) mg-1 Protein berechnet. II.3 Auswertung und Fragen 1. Beschreiben Sie die Substratspezifität der Laccase C anhand der erzielten Ergebnisse. Skizzieren Sie die für die Umsetzung der jeweiligen Substrate verantwortlichen Reaktionen. 2. Berechnen Sie die Enzymaktivität der Laccase C für jedes der Substrate in U (mU) mL-1. 3. Formulieren Sie die Einzelschritte der Proteinnachweisreaktion. 4. Bestimmen Sie die Konzentration der ausgegebenen Probe und die spezifische Aktivität.

III. Kinetik enzymatischer Reaktionen Bestimmung der Michaeliskonstanten der Laktatdehydrogenase Um eine Michaeliskonstante zu bestimmen, muss man die Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Substratkonzentration messen. Das Substrat Pyruvat ist eine instabile 2-Oxosäure. Daher muss im ersten Teil des Versuchs die enzymatisch umsetzbare Konzentration des Substrats bestimmt werden. Nach dem Ansetzen der Küvetten, vor der Enzymzugabe, erfolgt die Einweisung für das Photometer vom Assistenten. Material und Chemikalien: Pipetten, Falcontubes, Halbmiroküvetten, Enzymspatel, Photometer, 10 mL Messkolben, Stoppuhr. 10 mg/mL NADH, Pyruvat-Stammlösung, TRA-Puffer, 50 mM, pH 7,5, LDH. Extinktionskoeffizient bei 340 nm: 6,3 x 103 M-1 x cm-1

III.1 Bestimmung der Pyruvat-Konzentration Formulieren Sie vor Versuchsbeginn die Reaktionsgleichung. Daraus erkennen Sie ob sie eine Extinktionszunahme oder Extinktionsabnahme erwarten. Zur Bestimmung der Pyruvat-Konzentration ist die ausgegebene Pyruvatlösung 1:100 zu verdünnen! (0,1 mL Pyruvat-Lösung + 9,9 mL Wasser). Die Lösungen werden wie im Pipettierschema angegeben in Halbmikroküvetten pipettiert (noch keine Enzymzugabe!), mit dem Enzymspatel gut gemischt. In das Photometer wird die Probenküvette gestellt, die Anfangsextinktion wird notiert. Ändert sich die Extinktion nicht, so wird das Enzym in die Küvette pipettiert (erneut gut mischen mit dem Enzymspatel), die Extinktionsänderung wird verfolgt bis sie sich nicht mehr verändert (mind. 5min.), dann ist die Reaktion beendet. Der Anfangswert sollte etwa bei 1 liegen. Die Messung erfolgt bei 340 nm.



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Pipettierschema 1 2 3 4

TRA-Puffer pH 7,5, mL 1,50 1,55 1,60 1,65

Pyruvat-Lösung (1:100), mL 0,2 0,15 0,1 0,05

NADH-Lösung, mL 0,02 0,02 0,02 0,02

Die Reaktion wird nacheinander durch Zugabe von LDH gestartet:

LDH* x* mL x* mL x* mL x* mL

*Die Menge an Enzym ist vor Beginn des Versuches beim Assistenten zu erfragen.

Aus der Extinktionsdifferenz (ΔE) wird die Pyruvat-Konzentration mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes errechnet. Beachten sie die Verdünnungsfaktoren! III.2 Bestimmung der Umsatzgeschwindigkeit (enzymatische Volumenaktivität) Von der Pyruvat-Stammlösung muss zusätzlich eine 1:20 und eine 1:50 Verdünnung hergestellt werden. Verdünnung 1:20 ( 0,1 mL Pyruvat-Lösung + 1,9 mL H2O) Verdünnung 1:50 ( 0,1 mL Pyruvat-Lösung + 4,9 mL H2O) Verdünnung 1:100 siehe oben Teil 1 Die Lösungen werden ohne das Enzym LDH (Pipettierschema) in Halbmikroküvetten pipettiert und gut durchmischt. Die Reaktion wird am Photometer durch Zugabe von LDH gestartet. In diesem Fall wird die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit gemessen. Auch hier ist es vorteilhaft die Reaktionsgleichung zu formulieren, um den Extinktionsverlauf vor der Messung (340 nm) zu bestimmen.

Pipettierschema 1 2 3 4

TRA-Puffer pH 7,5, mL 1,85 1,80 1,75 1,70

Pyruvat-Lösung (1:100), mL 0,05 0,10 0,15 0,20

NADH-Lösung, mL 0,02 0,02 0,02 0,02

Die Reaktion nacheinander wird gestartet starten mit:

LDH* x* mL x* mL x* mL x* mL

*Die Menge an Enzym ist vor Beginn des Versuches beim Assistenten zu erfragen.

Diese Messreihe ist mit den 1:20, 1:50 und 1:100 verdünnten Pyruvat-Lösungen zu wiederholen. Da Pyruvat leicht „ausflockt“ immer nur ein Pipettierschema vorbereiten und am Photometer durchmessen. Es wird die Umsatzgeschwindigkeit bei den verschiedenen Substratkonzentrationen bestimmt. Die lineare Anfangssteigung wird grafisch ermittelt, indem man im linearen



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die Tangente anlegt und die Geschwindigkeit in ΔE min-1 entnimmt. Daraus lässt sich die Umsatzgeschwindigkeit berechnen (in U mL-1) unter Verwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes. III.3 Auswertung und Fragen (Bestimmung der Michaelis-Konstanten) Mit Hilfe der durchgeführten Pyruvat-Bestimmung wird die Pyruvat-Konzentration aller 12 verdünnten Proben des zweiten Teils in mol L-1 berechnet. Aus diesen Werten werden zwei Grafiken gezeichnet, in denen die Substratkonzentration S gegen die Umsatzgeschwindigkeit v des Enzyms und deren Kehrwerte 1 / v und 1 / S (Lineweaver-Burk-Darstellung) dargestellt werden. Aus beiden Grafiken sind die Michaeliskonstante und die Maximalgeschwindigkeit zu bestimmen. Fragen 1. Sind Unterschiede in den Graphiken der Michaeliskonstanten KM und in der

Maximalgeschwindigkeit vmax vorhanden und weshalb? 2. Warum benutzt man unterschiedliche Substratkonzentrationen zur Bestimmung der Pyruvat-Konzentration und Michaelis-Konstanten? 3. Welche Möglichkeiten zur Bestimmung der Michaelis-Konstanten existieren? IV. Aminosäuren und DNA IV.1 Nachweis von Aminosäuren mit Ninhydrin Die Aminosäureanalyse wird zur Ermittlung der relativen Aminosäurezusammensetzung von Peptiden und Proteinen, zur Bestimmung des Proteingehalts sowie zur Bestimmung von freien Aminosäuren z. B. in Zellkulturmedium angewendet. Aminosäuregemische können mittels Dünnschichtchromatographie und Papierelektrophorese aufgetrennt werden. Beide Methoden dienen in erster Linie zur qualitativen Trennung und Identifizierung der Aminosäuren. Bei der Dünnschichtchromatographie beruht das Trennprinzip auf der unterschiedlichen Verteilung der einzelnen Aminosäuren zwischen einer mobilen und einer stationären Phase. Als stationäre Phase werden Kieselgele, Aluminiumoxid oder Chromatographiepapier verwendet. Der Nachweis der Aminosäuren ist problematisch, da sie keinen Chromophor enthalten, der Licht im UV oder sichtbaren Spektralbereich absorbiert. Zum Nachweis ist deshalb eine Derivatisierung nötig. Die Derivatisierung wird dabei entweder vor oder nach der chromatographischen Trennung durchgeführt. Zum Nachweis der Aminosäuren nach erfolgter chromatographischer wird Auftrennung wird Ninhydrin eingesetzt, was mit primären und sekundären Aminen reagiert. Geräte und Glasgeräte: DC -Kammer, Fön, Auftragepipetten, Chemikalien: n-Butanol (n-BuOH), Essigsäure ( 96%ig (Eisessig)), Aceton, Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindan-1,3-dion), Aminosäurestandards.



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Ethanol. - für DC: DC-Platten: Kieselgel-Fertigplatten Laufmittel: System 1: n-BuOH/Eisessig/H2O 70:20:30 (v/v/v) System 2: Pyridin/Essigester/Eisessig/Wasser 5/5/1/3 (v/v) Sprühreagenz: 0,2 g Ninhydrin in 50 mL Aceton lösen. Untersuchungsmaterial: Aminosäuretestlösung, Möhren Durchführung 30g geraspelte Möhren mit Glasperlen im Mörser gut verreiben. Mit 5 mL Ethanol versetzen, kurz ausschütteln und abzentrifugieren. Die so erhaltene Lösung kann für die DC-Trennung genutzt werden. DC-Trennung: 5 bis 10 µL der Aminosäuretestlösung (bei unbekannten Konzentrationen am besten verschiedene Volumina) und die Referenzaminosäure-Lösungen werden mit Hilfe von Kapillarröhrchen auf eine Kieselgel-Fertigplatte aufgetragen und die Platte in dem Laufmittel entwickelt. Die Laufzeit (Lösungsmittelfront erreicht 3/4 der Plattenhöhe) beträgt ca. 3,5 h. Detektion: Die gut getrocknete Platte wird gleichmäßig mit dem Sprühreagenz besprüht und im Trockenschrank zur Sichtbarmachung der Flecken erhitzt (103 °C). IV.2 DNA-Isolierung aus Früchten Materialien: Spülmittel, Natriumchlorid, Fleckenteufel „ Blut, Milch, Eiweiß“, Ethanol, NaOH, SDS (Natriumdodecylsulfat) Bechergläser, Mörser und Pistille, Faltenfilter, Trichter, Falcontube, Tomatenmark Durchführung Jede Gruppe stellt einen der beiden Lysepuffer her. Herstellen des Lysepuffers 1 : 15 mL Spülmittel und 3 g Natriumchlorid in einem 200 mL Becherglas mischen. Mit 10 Tropfen Fleckenteufel und 100 mL Wasser versetzten und vorsichtig umrühren bis das Salz gelöst ist. Herstellen des Lysepuffers 2: 1 g SDS und 0,8 g Natriumhydroxid in 100 mL dest. Wasser vorsichtig lösen.



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30 g Tomatenmark werden mit 10 mL Lysepuffer versetzt und im Mörser verrieben. Während des Vorgangs werden die Zellwände aufgelöst, wobei die DNA in Lösung geht. Das Gemisch wird in einem 50 mL Falcontube abzentrifugiert. 5 mL des Überstandes werden in ein 15 mL Falcontube überführt und 10 mL eisgekühltes Ethanol vorsichtig am Rand entlang dazugegeben. An der entstandenen Grenzfläche bilden sich gräuliche-weiße Schlieren, die allmählich verklumpen. Diesen Feststoff vorsichtig mit einem Holzspieß aufwickeln. Die DNA kann nun betrachtet werden. IV.3 Auswertung und Fragen

1. Anzahl und Identität der Aminosäuren werden durch Farbe und Rf-Werte der Substanzflecken bestimmt und durch Chromatographie der Referenzaminosäuren bestätigt.

2. Erklären Sie das Prinzip der Ninhydrin-Reaktion, geben Sie den Reaktionsmechanismus an. Kennen Sie eine berühmte analoge Reaktion? #

3. Vergleichen Sie anhand der allgemeinen Strukturformel einer Aminosäure deren unterschiedliche Ladungszustände ab. Leiten Sie anhand der allgemeinen Strukturformel einer Aminosäure deren unterschiedliche Ladungszustände ab. Schätzen Sie ein, welche Aminosäuren in der Elektrophorese und Dünnschichtchromatographie in einem sauren System schnell und welche langsam laufen

4. Recherchieren Sie, wie ein Spülmittel und ein Fleckenteufel zusammengesetzt sind und erklären Sie warum die Mischung als Lysepuffer fungiert. Vergleichen Sie ihr Ergebnis bei der DNA Isolierung mit dem Ergebnis der anderen Gruppe.

V. Vergleich der enzymatischen und nicht enzymatischen Reaktionen Stärke-Hydrolyse

Stärke ist ein Gemisch aus 20–30% Amylose und 70–80% α-Amylopektin. Abhängig von der Herkunft der jeweiligen Stärke sind die Anteile der beiden Komponenten unterschiedlich. Die Amylose besteht aus langen unverzweigten Ketten α-glycosidisch gebundener Glucose mit helikaler Struktur. Im Amylopektin sind zusätzlich 1,6-glykosidisch verknüpfte Glucosemoleküle enthalten. Amylopektin ist also im Gegensatz zu Amylose verzweigt. Die α-Amylase des Speichels, eine Endoglycosidase ist in der Lage, das Stärkemolekül zu spalten. Die glykosidische Bindung ist außerdem säureinstabil und wird bei der Inkubation durch Salzsäure bei höheren Temperaturen gespalten. Im aktuellen Versuch werden die beiden bereitgestellten Stärken ebenfalls mit eigenem Speichel und einer α-Amylase hydrolysiert. Die enzymatische Hydrolyse wird mit salzsauerer Hydrolyse verglichen. Material und Chemikalien: Bechergläser, 100 mL Messkolben, 50 mL Messkolben, 15 mL Falcontubes, Halbmikroküvetten, Photometer, Pipetten, Heizrührer, Magnetfische, Thermoshaker.



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Phosphatpuffer pH 6,9, DNSA-Lösung (1% 3,5-Dinitrosalicylat, 2% NaOH/ 20% Na/K-Tartrat (w/v)), Salzsäure 4N, Natronlauge 4N, D-Glucose-Monohydrat, Speichel, α- Amylase. Gruppe A: Kartoffelstärke und Tapioka Gruppe B: Maizena (Maisstärke) und Tapioka V.1 Saure Stärke-Hydrolyse (Die enzymatische Hydrolyse sollte aus zeitlichen Gründen zeitgleich mit der sauren Hydrolyse angesetzt werden.) In einem Becherglas werden ca. 40 mg Stärke genau eingewogen und mit 25 mL dest. Wasser versetzt. Durch Aufkochen wird die Stärke in Lösung gebracht und in einen 100 mL Messkolben überführt. Nach dem Abkühlen bis zur Marke auffüllen. Es werden für jede Stärke 7 x 2 mL Eppendorf Reagiergefäße (Eppis) und je ein 15ml Falcontube beschriftet. Nach folgendem Pipettierschema werden die Gefäße befüllt.

Gefäß 1(BW)

(2 mL Eppi) 2 (t=0) (Eppi)

3 15 mL Falcon tube

H2O, mL 0,2 - -

Stärke, mL - 0,2 4,0

4N NaOH, mL 0,5 0,5 -

4N HCl, mL 0,3 0,3 6,0

X/min 0 0 10, 20, 30, 45, 60

je 0,5 mL entnehmen

Das Falcontube wird im Thermoshaker bei 95 °C erhitzt und dem Zeitplan entsprechend 0,5 mL Probe entnommen. Die entnommen Proben werden in das entsprechende 2 mL Eppendorfgefäß pipettiert. Die Reaktion wird mit 0,5 mL 4N Natronlauge sofort gestoppt. Die Proben werden nach Entnahme der letzten Probe (t= 60 min) mit 0,5 mL DNSA-Lösung versetzt. Die Gefäße im Thermoshaker bei 95 °C 5 min. reagieren lassen. Nach dem Abkühlen werden die Lösungen in eine Halbmikroküvette überführt und bei einer Wellenlänge von 546 nm am Photometer gegen den Blindwert gemessen V.2 Enzymatische Hydrolyse Die unter V.1 angesetzte Stärke wird

a) mit eigenem Speichel und



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b) mit der fertigen α-Amylase-Lösung versetzt und enzymatisch hydrolysiert. Um die Speichelproduktion anzuregen kann zuvor etwas Weißbrot gekaut werden. Bitte eigenes Brot mitbringen und außerhalb des Labors kauen! Vor dem Versuch wird 1 mL Speichel in einem Falcontube gesammelt. Der Speichel wird direkt vor dem Gebrauch 1:40 verdünnt (0,2 mL Speichel + 7,8 mL Phosphatpuffer). Es werden für jede Stärke 7 Eppis und ein Falcontube (15 mL) beschriftet. Nach folgenden Pipettierschemata werden die Gefäße befüllt. Speichel:

Gefäß 1(BW) (Eppi)

2 (Eppi)

3 15 mL Falcon tube

H2O, mL 0,2 - -

Stärke, mL 0,2 4,0

DNSA-Lösung, mL 0,5 0,5 -

Speichel 1:40, mL 0,3 0,3 6,0

Stoppen nach X min 0 0 10, 20, 30, 45, 60

je 0,5 mL entnehmen

α-Amylase:

Gefäß 1(BW) (Eppi)

2 (Eppi)

3 15 mL Falcon tube

H2O, mL 0,2 - -

Stärke, mL 0,2 4,0

DNSA-Lösung, mL 0,5 0,5 -

α- Amylase 0,3 0,3 6,0

Stoppen nach X min 0 0 10, 20, 30, 45, 60

je 0,5 mL entnehmen

Das Falcontube wird bei Raumtemperatur inkubiert und dem Zeitplan entsprechend 0,5 mL Probe entnommen. Die entnommen Proben werden in das entsprechende 2 mL Eppendorfgefäß pipettiert. Die Reaktion wird mit 0,5 mL 4N Natronlauge sofort gestoppt. Die Proben werden gesammelt und nach Entnahme der letzten Probe (t= 60 min) mit 0,5 mL DNSA-Lösung versetzt. Die Gefäße im Thermoshaker bei 95°C 5 min inkubieren lassen. Nach dem Abkühlen werden die Lösungen in eine Halbmikroküvette überführt und bei einer Wellenlänge von 546 nm am Photometer gegen den Blindwert gemessen V.3 Glucose Kalibrierkurve Ungefähr 50 mg D-Glucose-Monohydrat werden in 25 mL Messkolben genau eingewogen. In 6 Eppis wird nach folgendem Pipettierschema eine Kalibriergerade erstellt.



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Gefäß 1 (BW) 2 3 4 5 6

Glucose,mL 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

H2O, mL 1,0 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75

DNSA-Lösung, mL 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Die Lösungen im Thermoshaker bei 95 °C 5 min inkubieren lassen. Nach dem Abkühlen werden die Lösungen in Halbmikroküvette überführt und bei einer Wellenlänge von 546 nm am Photometer gegen den Blindwert gemessen. V.4 Auswertung und Fragen Die Extinktion bei 546 nm ist proportional der Anzahl der gebildeten, reduzierenden Endgruppen. Die Ergebnisse der Glucose Kalibriergerade werden mittels eines geeigneten Programms (z.B. Excel) ausgewertet. Bewerten Sie mit Hilfe der Kalibriergerade die Ergebnisse der sauren sowie der enzymatischen Hydrolyse. Bestimmung des Polymerisationsgrades Ein Maß für die Anzahl der Monomeren in einem Poly- oder Oligosaccharid ist der sogenannte Polymerisationsgrad (DP, degree of polymerisation). Um den Polymerisationsgrad zu bestimmen, entnehmen Sie aus den Kurven für die enzymatische und saure Spaltung zu den einzelnen Messzeiten (t=0, 3, 6, etc.) die Extinktion und bestimmen Sie aus der Glucose Kalibriergerade die dazugehörigen Glucosekonzentrationen, die den reduzierenden Gruppen entsprechen. Die Glucose Gesamtkonzentration (saure Totalhydrolyse) dividiert durch die Glucosekonzentration zu den einzelnen Zeiten ergibt den Polymerisationsgrad (DP). Tragen Sie den DP gegen die Zeit auf. Diskutieren Sie die Ergebnisse. 1. Worin unterscheiden sich saure und enzymatische Hydrolyse? 2. Vergleichen Sie den Citratzyclus und die Glykolyse im Bezug auf ihre Bedeutung für den Energiegewinn beim Abbau der Glukose.



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Vorgaben zur Anfertigung der Protokolle

Protokolle müssen spätestens eine Woche nach Abschluss des jeweiligen Versuchs abgegeben werden. E-mailadressen der verantwortlichen Betreuer werden zu Beginn des Praktikums ausgehängt!

Es werden nur .doc/.docx-Files akzeptiert, da Korrekturen der Betreuer direkt über die „Änderungen nachverfolgen“-Funktion vorgenommen werden.

Spätestens nach der 2. Korrektur (ergo Version 3 des Protokolls) sollten schwerwiegenden Fehler behoben sein.

Dateinamen sollten dabei nach folgendem Muster angelegt werden: Gruppe_ Datum des Versuchs_Versuchsnummer_ Abgabe1 (2 o.3)

Protokolle zur Überarbeitung sollten ebenfalls spätestens eine Woche nach Erhalt der Korrektur wieder vorgelegt werden.

Es werden Protokolle mit max. 5! Seiten akzeptiert.

Inhalt und Form o kurze theoretische Einleitung, keine Wiederholung des Skripts,

keine Kopien aus Wikipedia etc., keine Abschrift der Durchführung!

o Ergebnisse Darstellung der Original-Daten Zusammenfassung der Ergebnisse in Tabellen, Grafiken etc.

Grafiken sollten aussagekräftig und anschaulich sein Grafiken haben Bildunterschriften, Tabellen stets eine

Überschrift Rechenwege sollten für uns nachvollziehbar sein

einsetzen in Gleichungen, beachten von Einheiten etc. Angaben von Ergebnissen nur in sinnvollen Einheiten

(keine µmol/m³ o.ä.) o Ergebnisse sollten mit Literaturangaben verglichen werden – sind

sie realistisch? Wenn nicht: Fehlerdiskussion – Aussage „falsch pipettiert“ reicht nicht aus.

Quellen müssen immer angegeben werden

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