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Grundlagen der Chromatographie

(Additional Reading)

Astrid Zuern, Reiner Salzer Steffen Thiele

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Inhaltsverzeichnis

• 1) Trennvorgang • 2) Geschichte

– 2.1) M. S. Tswett – 2.2) Erste Techniken – 2.3) Entwicklungsrichtungen

• 3) Säulenchromatographie – 3.1) Vorgang der

Stofftrennung• 4) Van-Deemter-Gleichung

– 4.1) Peakverbreiterung - Animation

• 5) Der Chromatograph • 6) Das Chromatogramm

• 7) Chromatographie-Kenngrößen – 7.1) Charakterisierung - Stoffe – 7.2) Charakterisierung -

Trennung – 7.3) Charakterisierung -Säule – 7.4) Optimierung einer

Trennung – 7.5) Beispielrechnung – 7.6) Übungsaufgabe

• 8) Die Totzeit • 9)

Säulenchromatographiearten • 10) Silbenrätsel

Chromatographie

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Chromatographische Methoden im Überblick

• Mit Chromatographie werden alle die physikalisch-chemischen Trennverfahren bezeichnet, bei denen der Trennvorgang auf der Verteilung eines Stoffes zwischen einer mobilen und einer stationären Phase beruht. Verschiedene Stoffe einer Probe werden unterschiedlich stark von der stationären Phase zurückgehalten, während die mobile Phase den Transport übernimmt. Chromatographie wird präparativ und analytisch genutzt.

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Lernziele• Grundlegende Begriffe zur

Chromatographie • Historischer Überblick zur Entwicklung der

Chromatographie • Vorgänge und Begriffe in der

Säulenchromatographie

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Einstufung

• Fachgebiet: Chemie  / Analytische Chemie / Chromatographie

• Bearbeitungszeit: 30 min • Schwierigkeitsgrad: leicht• Vorkenntnisse, keine

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ein historischer Überblick• In diesem Abschnitt wird ein historischer

Überblick über die Entwicklung der Chromatographie zur leistungsfähigen Analysenmethode gegeben. Außerdem werden die grundlegenden Begriffe, Kenngrößen und Vorgänge in der Säulenchromatographie beschrieben. Ergänzt wird der Abschnitt durch eine Übungsaufgabe zu den Chromatographiegrößen, durch Animationen zur Van-Deemter-Gleichung und durch ein Silbenrätsel zur Chromatographie, mit dem man seinen Begriffswissenstand testen kann.

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PC: Papierchromatographie DC: Dünnschichtchromatographie GC: Gaschromatographie HPLC: Hochdruckflüssigchromatographie (high pressure liquid chromatography) NP-LC: Normalphasen-Flüssigchromatographie (normal phase liquid chromatography) RP-LC: Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (reversed phase liquid chromatography

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HPLC• HPLC wird nicht nur

als Hochdruckflüssigchromatographie (high pressure liquid chromatography) bezeichnet, sondern auch als Hochleistungsflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography), was aber eine sehr positivistische Interpretation oder Namensgebung der Chromatographie-Firmen ist - im Vergleich zur vorher üblichen Säulenchromatographie.

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• Die Leistungsfähigkeit ist eigentlich eher eine Minimierung der HPLC-Gerätebestandteile mit den damit verbundenen neuen technischen Erfordernissen (hoher Druck) und der Möglichkeit sehr geringer Probemengen, gleichbleibend guter Trennleistung und einer Beschleunigung der Analyse. Die absolute Zahl möglicher trennbarer Verbindungen ist normalerweise weiter auf ca. 25 beschränkt.

• Das P in der Abkürzung HPLC wurde aber auch noch mit anderen (humoristischen) Interpretationen belegt, z.B mit "price" wegen der anfangs hohen Anschaffungskosten.

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• Antike: schon Nutzung des Prinzips (Aristoteles verwendete einige Tonerden zum Reinigen von Meerwasser)

• 1859 Runge: Kapillarbilder - Urform der Papier-Chromatographie

• Aber bis dahin alles ohne das Verständnis für die Vorgänge

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• 1903 Tswett: Arbeiten zur Trennung von Chlorophyll mittels Adsorptionschromatographie - Namensgebung für die Methode

• Anfang der 30er Jahre Gruppe um Kuhn: neue Versuche zu Pflanzenfarbstoffen und Chromatographie

• 1938 Kuhn: Nobel-Preis für seine Anwendung der Tswett'schen Adsorptionschromatographie an Carotinoiden und Vitaminen

• 1938 Iszmailov und Schraiber: Grundlagen der Dünnschichtchromatographie

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• 1940 Martin und Synge: Arbeiten zur Verteilungschromatographie, theoretische Grundlagen durch Analogieerklärungen zur Extraktion, Einführung der HETP als chromatographische Kenngröße - Nobel-Preis 1952

• 1951 erster Gaschromatograph von Martin und James• 1956 Van-Deemter-Gleichung von der Gruppe um

Klingenberg (Shell)• 1965 Stahl: Einzug der Dünnschichtchromatographie in

die chemische Analytik• zwischen 1937 und 1972 12 Nobel-Preise für Arbeiten, in

denen die Chromatographie eine entscheidende Rolle spielte

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Michail Semjonowitsch

Tswett

• russischer Botaniker• 19. 5. 1872 - 26. 6. 1919 • Vater Russe, Mutter Italienerin• Studium in Genf

(Naturwissenschaften)• 1896 Promotion (Zellphysiologie)• ab 1897 Dozent für

Pflanzenanatomie und -physiologie in St. Petersburg

• ab 1907 Professuren in Warschau• ab 1915 Flucht vor deutschen

Truppen nach Moskau, Nisnij Novgorod, Jurev und Voronesch

• große Anerkennung für seine Forschung über Blattpigmente

• Buch: (1910) Die Farbstoffe im Tier- und Pflanzenreich

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Verdienst für Chromatographie

• 21. 3.1903 Vortrag auf einer Tagung der Biologischen Sektion der Warschauer Gesellschaft der Naturwissenschaften

• Titel: "...über eine neue Kategorie von Adsorptionsphänomenen und ihre Anwendung auf die biochemische Analyse"

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Sein Experiment: • Tswett hatte ein Glasrohr mit Inulin gefüllt und ein Chlorophyll-Extrakt in Ligroin darauf gegeben. Er goss weiter Ligroin darüber.

• Zuerst kam eine farblose Flüssigkeit, dann wurde ein gelber Ring (Carotin) vor einem grünen Ring am oberen Ende der Säule sichtbar, der sich während des Laufes in einen grünen und einen gelben teilte. grün: Chlorophyll a , gelb: Chlorophyll b

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Tswett nannte seine Methode Chromatographie (Farbschreibung)

Seine Arbeiten zur Chromatographie wurden ca. 30 Jahre lang nicht beachtet.

.

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Die Entwicklung der Technik für die Chromatographie

• Die meisten in der Natur und Produktion vorkommenden Stoffe liegen in Gemischen vor. Der Bedarf an gezielten Informationen zu Art und Menge eines bestimmten Stoffes ist sehr hoch und weiter steigend.

• Daher ist es verständlich, dass mit der Entdeckung der Möglichkeiten des chromatographischen Prinzips eine rasante Entwicklung einsetzte. Heute ist es undenkbar, ein chemisches Labor ohne Chromatographie zu betreiben.

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• Die Reinheitskontrolle im Pharmabereich, die Schadstoffanalytik im Umweltbereich und die Produktkontrolle in der chemischen Industrie sind durch die Chromatographie zu heute selbstverständlichen Möglichkeiten geworden.

• Dementsprechend groß ist die Umsatzmenge an chromatographischen Produkten auf dem Weltmarkt (viele Millionen Dollar).

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Eddy-Diffusion A• Dieser Term beschreibt den Einfluss der Packung in der

Säule auf die Verbreiterung der Probenzone, allein durch die mechanischen Widerstände, die die Teilchen der Packung der mobilen Phase und damit den einzelnen Probenbestandteilen entgegensetzen.

• Die Analytmoleküle legen zwischen den Teilchen unterschiedlich lange Wege zurück, so dass sie auch schon ohne Wechselwirkungen mit der Teilchenoberfläche zu unterschiedlichen Zeiten aus der Säule austreten.

• Das bewirkt eine Peakverbreiterung. Die Eddy-Diffusion ist praktisch unabhängig von der Fließgeschwindigkeit.

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Eddy-Diffusion

Abb.13. Peakform kurz nach der Injektion

Abb.14. Peakform nach Passieren des Säulenbettes

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Diffusion B

• Mit Diffusion werden die Teilchenbewegungen beschrieben, die infolge eines Konzentrationsgefälles auftreten. Dieser Vorgang findet sowohl in gepackten als auch ungepackten Säulen statt.

• Durch einen schnellen Fluss der mobilen Phase kann dieser Einfluss gering gehalten werden, da es sich um einen zeitabhängigen Prozess handelt

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Diffusion

Abb.15. Peakform kurz nach der Injektion

Abb.16. Peakform nach Passieren der Säule

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Stoffaustausch C• Dieser Term der Van-Deemter-Gleichung beschreibt den

eigentlichen chromatographischen Effekt. Durch die Zahl und Intensität der Wechselwirkungen der verschiedenen Probenbestandteile mit der stationären Phase kommt es zu einer Verzögerung der Bewegung der Stoffteilchen. Bei geeigneteten Verhältnissen kann so eine vollständige Peaktrennung erreicht werden. Gegen diesen Trenneffekt wirken die beiden zuerst beschriebenen Terme, die zu einer teilweisen Rückvermischung führen.

• Der Stoffaustausch benötigt eine gewisse Zeit, so dass geringe Flussraten den Stoffaustausch begünstigen, aber den gegenläufigen Prozess der Diffusion verstärken

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Abb.17 Veränderung der Peakform durch den Stoffaustausch-Prozess

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Abb.7Technische Entwicklung der Chromatographie

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Säulenchromatographie

• Eine Form der technischen Ausführung der Chromatographie ist die Säulenchromatographie. Den dazu zählenden Methoden ist gemeinsam, dass die stationäre Phase in eine Röhre gefüllt ist, durch die die mobile Phase geführt wird. Die Inhaltsstoffe der Probe werden bei ihrem Weg durch die Säule aufgetrennt und verlassen sie nacheinander.

• Die Substanzen werden in der Regel nach dem Verlassen der Säule detektiert. Dies wird äußeres Chromatogramm genannt (im Gegensatz z.B. Dünnschichtchromatographie - inneres Chromatogramm).

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Die entscheidenden Vorgänge, die die Form und Lage der Substanzpeaks bestimmen, sind die durch den Strömungswiderstand entstehenden Vermischungen, die Diffusion auf Grund von Konzentrationsunterschieden innerhalb einer Phase und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Phasen

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• Dabei sind die ersten beiden Vorgänge größtenteils unspezifisch für die eigentliche Chromatographie. Sie treten in jedem (mit inertem Material) gefüllten Rohr auf. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Einzelsubstanzen einer Probe hängt praktisch ausschließlich von den Wechselwirkungen zwischen den beiden Phasen ab, die auf den Vorgängen Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch, Ausschluss oder Affinität beruhen.

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Prozesse der Bandenverbreiterung - Die Van-Deemter-Gleichung

• Durch die Prozesse der Chromatographie werden unterschiedliche Stoffe voneinander getrennt. Die Effizienz der Trennung gehorcht in erster Linie den Gesetzen der Verteilung (siehe Chromatographie-Kenngrößen).

• Die Trennung wird aber außerdem von anderen Prozessen überlagert, die die Peakform und die Effizienz der Trennung beeinflussen. Diese Prozesse hängen alle von der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase ab. Dieser Zusammenhang wird in der so genannten Van-Deemter-Gleichung ausgedrückt.

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Prozesse der Bandenverbreiterung - Die Van-Deemter-Gleichung

• Durch die Prozesse der Chromatographie werden unterschiedliche Stoffe voneinander getrennt. Die Effizienz der Trennung gehorcht in erster Linie den Gesetzen der Verteilung (siehe Chromatographie-Kenngrößen).

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Abb.12Terme der Van-Deemter-Gleichung

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• Die resultierende H--Funktion zeigt ein Minimum bei einer bestimmten Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase. In diesem Minimum ist die Höhe der theoretischen Böden am kleinsten, die Anzahl der Böden in einer stets gleichlangen Säule am größten. In diesem Minimum sind also die größte Trennstärke der Säule und die schmalsten Peaks zu erreichen

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Eddy-Diffusion A• Dieser Term beschreibt den Einfluss der Packung in der

Säule auf die Verbreiterung der Probenzone, allein durch die mechanischen Widerstände, die die Teilchen der Packung der mobilen Phase und damit den einzelnen Probenbestandteilen entgegensetzen.

• Die Analytmoleküle legen zwischen den Teilchen unterschiedlich lange Wege zurück, so dass sie auch schon ohne Wechselwirkungen mit der Teilchenoberfläche zu unterschiedlichen Zeiten aus der Säule austreten. Das bewirkt eine Peakverbreiterung. Die Eddy-Diffusion ist praktisch unabhängig von der Fließgeschwindigkeit.

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Der Chromatograph• Um die Vorgänge in der chromatographischen

Säule analytisch nutzen zu können, wird ein Chromatograph benötigt. Er ermöglicht den Transport der mobilen Phase, das Aufbringen der Probe und die Detektion der eluierten Substanzen.

• Mit einem guten Chromatographen soll es möglich sein, die experimentellen Bedingungen konstant und reproduzierbar zu halten. Dies ist Voraussetzung für die Identifikation der Substanzen und ihre quantitative Erfassung.

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Abb.21 Prinzip des Chromatographen • Vorrat an mobiler Phase kontinuierliche Nachlieferung

für konstanten Fluss z.B. Eluentenflasche, Gasflasche • Fördersystem reproduzierbarer Transport der mobilen

Phase, variabel einstellbar z.B. Kolbenpumpe, Druckgasflasche

• Probenaufgabe Einbringen der Probe in den strömenden Fluss der mobilen Phase, Reproduzierbarkeit ist entscheidend für Quantifizierung z.B. Eindrehschleife, Injektor, Ventil

• Säule chromatographische Säule und ihre Halterung, u.U. Thermostatierung, totvolumenarme Anschlüsse der Fließwege z.B. Kapillarsäule im Säulenofen

• Detektor Umwandlung konzentrationsproportionaler chemischer oder physikalischer Substanzeigenschaften in elektrische Signale z.B. UV/VIS-Detektor, Wärmeleitfähigkeitsdetektor

• Auswerteeinheit Visualisierung der elektrischen Signale des Detektors, Analogsignal-Ausgabe z.B. Schreiber Analog/Digitalwandlung und Digitalsignal-Ausgabe z.B. Integrator, Computer

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Das Chromatogramm• Die Substanzen, die von der

chromatographischen Säule eluiert werden, erzeugen im Detektor elektrische Signale. Bei entsprechender Visualisierung über Schreiber, Integrator oder PC beschreiben sie die Form eines Peaks.

• Der Peak verkörpert die Konzentration der Komponente in Abhängigkeit von der Zeit. Zwischen zwei Peaks erzeugt die mobile Phase das Basisliniensignal.

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Abb.22. Peaks als Aufzeichnungen des Messsignalverlaufs in der Chromatographie

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Abb.23. Ein Chromatogramm

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Parameter, die aus einem Chromatogramm erhalten werden:

• Die Brutto-Retentionszeit tR • Die Totzeit t0 • Die Netto-Retentionszeit tR ' • Verteilungskoeffizient K • Phasenverhältnis β

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Die Brutto-Retentionszeit tR • Die Brutto-Retentionszeit tR ist die Zeit, die von

der Probenaufgabe bis zum Erreichen des Peakmaximums einer Komponente vergeht. Sie kann eine qualitative Aussage über die enthaltenen Komponenten liefern. Die Retentionszeit einer Verbindung ist nämlich charakteristisch, wenn die chromatographischen Bedingungen streng konstant gehalten werden. Dazu werden die vermutete Substanz als Standard ebenfalls injiziert und die Retentionszeiten verglichen.

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Die Totzeit t0 • Die Totzeit t0 ist die Zeit, die eine nichtretardierte

Komponente von der Probenaufgabe bis zum Erscheinen im Detektor benötigt.

• Sie zeigt, wie lange eine Substanz mindestens in einer chromatographischen Anlage verweilt, auch wenn sie keine Wechselwirkungen mit der stationären Phase hat.

• In der Praxis wird angestrebt, diese Zeit so klein wie möglich zu halten, da der lange Aufenthalt zur Rückvermischung (Diffusion) der Komponenten führt und damit zu flacheren Peaks.

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Die Netto-Retentionszeit tR ' • Die Netto-Retentionszeit tR ' ist die Differenz aus

Bruttoretentions- und Totzeit. Sie zeigt die Aufenthaltszeit der Komponenten ausschließlich innerhalb der stationären Phase an.

• tR ' = tR − t0• Während die Peakbreiten (Peak-Halbwertsbreite w ½ ,

Basispeakbreite w ) der Berechnung von Chromatographiekenngrößen wie Auflösung und Bodenzahl dienen, werden Höhe h und Fläche A zum Quantifizieren der Komponenten benötigt.

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Kenngrößen zur modellhaften Beschreibung eines

säulenchromatographischen Systems• Mathematische Modellgrößen dienen in der

Chromatographie dazu, ein chromatographisches System zu beschreiben und seine Veränderung zu erfassen. Außerdem lassen sich verschiedene Anlagen oder einzelne Säulen über rechnerische Parameter vergleichen und optimieren. Dabei muss man sich bewusst sein, dass die meisten Parameter auf Modellen basieren. Das hat wie bei allen Modellen den Nachteil, dass sie nur in gewissen Grenzen gelten und nur Teile der Wirklichkeit beschreiben.

• Andererseits sind sie natürlich wichtige Hilfsmittel, um diese komplexen Systeme zu erfassen und Einflüsse und Wirkungen vorhersagen zu können.

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Die chromatographischen Größen lassen sich einordnen nach ihrer Funktion:

• zur Charakterisierung eines Stoffes (Analyten) in einem chromatographischen System

• zur Charakterisierung von zwei getrennten Analyten in einem chromatographischen System

• zur Charakterisierung einer chromatographischen Säule

• zur Optimierung einer Trennung

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Chromatographie-Kenngrößen zur Charakterisierung eines Stoffes (Analyt)

• Verteilungskoeffizient K• Phasenverhältnis β • Kapazitätsfaktor (Retentionsfaktor) k '

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Verteilungskoeffizient K

• K = cs cm cs - Konzentration des Analyten in der stationären Phase cm - Konzentration des Analyten in der mobilen Phase Konzentration des Analyten in der stationären und in der mobilen Phase

• beschreibt den theoretischen Gleichgewichtszustand

• gleiche Volumina der Phasen vorausgesetzt

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Chromatographie-Kenngrößen zur Charakterisierung eines Stoffes (Analyt)

• Verteilungskoeffizient K • K = cs cm cs - Konzentration des Analyten in der

stationären Phase cm - Konzentration des Analyten in der mobilen Phase Konzentration des Analyten in der stationären und in der mobilen Phase

• beschreibt den theoretischen Gleichgewichtszustand

• gleiche Volumina der Phasen vorausgesetzt

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Phasenverhältnis β

• β = Vm Vs Vm - Volumen der mobilen Phase Vs - Volumen der stationären Phase Volumenverhältnis der Phasen

• dient der Korrektur des Verteilungskoeffizienten• wenn groß, dann ist die Säule relativ

durchgängig und eine große Menge an mobiler Phase liegt vor

• übliche Werte: 5 bis 35 für die HPLC, 50 -1000 für die GC

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Kapazitätsfaktor (Retentionsfaktor) k '

• k ' = K β = cs Vs cm Vm K - ⋅ ⋅Verteilungskoeffizient β - Phasenverhältnis cs - Konzentration des Analyten in der stationären Phase cm - Konzentration des Analyten in der mobilen Phase Vm - Volumen der mobilen Phase Vs - Volumen der stationären Phase Wenn die Konzentration c in gL-1 angegeben wird, ist der Kapazitätsfaktor auch

• (5) • k ' = mS mm mm - Masse des Analyten in der

mobilen Phase ms - Masse des Analyten in der stationären Phase

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Wenn die Konzentration c in molL-1 angegeben wird, ist der Kapazitätsfaktor auch

• k ' = ns nm nm - Molzahl des Analyten in der mobilen Phase ns - Molzahl des Analyten in der stationären Phase Soll der Kapazitätsfaktor eines Analyten experimentell bestimmt werden, nutzt man folgenden Zusammenhang:

• k ' = tR ' − t0 t0 tR ' - Nettoretentionszeit t0 - Totzeit Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit in einem chromatographischen System

• ist als Parameter günstiger zu verwenden als die Nettoretentionszeit, weil unabhängig von Säulenlänge und Fließgeschwindigkeit

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Hinweis: • Die Bestimmung der wahren Nettoretentionszeit

ist in der Realität nicht so einfach möglich, da sie auf der exakten Bestimmung der Totzeit basiert. Diese ist aber nur sehr aufwendig bestimmbar (Chromatographieren einer homologen Reihe, lineare Regression). In der Praxis verwendet man Hilfsverbindungen zur Bestimmung der "experimentellen" Totzeit. Die wahre Totzeit des Systems ist so nicht zugänglich und ist kleiner als die experimentelle. Dadurch ist der Kapazitätsfaktor nur wenig aussagekräftig.

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Chromatographie-Kenngrößen zur Charakterisierung von zwei getrennten

Analyten• Auflösung R • Selektivitätsfaktor (Trennfaktor) α

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Auflösung R

• R = 2 (t r 2 − t r 1)/ (w 1 + w 2) = 1,18 (t r 2 − t r 1 )/ (w 0,5 1 + w 0,5 2).

• tR - (Brutto-)Retentionszeit ; w – Basispeakbreite; w 0,5 - Peakbreite in halber Höhe Maß für die Fähigkeit des Systems, mit den gewählten chromatographischen Bedingungen zwei Analyten zu trennen

• ausreichend ist eine Auflösung größer 1,5 (bei 1,5 überlappen nur noch 0,3 % der Peakflächen)

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Selektivitätsfaktor (Trennfaktor) α

• α = K 2 K 1 = k 2 ' k 1 ' K - Verteilungskoeffizient k ' - Kapazitätskoeffizient Maß für die Trennbarkeit von zwei Analyten

• Je größer die Differenz der Verteilungskoeffizienten, desto einfacher gelingt die Trennung.

• Da später eluierter Stoff immer im Quotient oben steht, ist Selektivitätsfaktor stets größer als eins.

• optimal sind Werte von 1-10

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Chromatographie-Kenngrößen zur Charakterisierung einer chromatographischen

Säule

• Bodenzahl N • Bodenhöhe H

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Bodenzahl N • N = 16 tR w 2 = 5,54 tR w 0,5 2 tR -

(Brutto-)Retentionszeit w - Basispeakbreite w 0,5 - Peakbreite in halber Höhe abhängig von der Retentionszeit einer Substanz, also abhängig von der Testsubstanz und dem Gerät (von Injektion bis Detektion)

• zum Vergleich zweier Säulen nur mit der gleichen Testsubstanz im selben Gerät geeignet

• übliche Werte: HPLC 1000 - 8000, GC 10 000• Hinweis: Eine säulenspezifische, nicht

substanzabhängige Trennstufen-(Boden-)zahl erhält man durch ein aufwendigeres Verfahren (Chromatographieren einer homologen Reihe, lineare Regression der Wertepaare Halbwertsbreite und Retentionszeit).

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Bodenhöhe H • H = L N L - Säulenlänge N - Bodenzahl je

kleiner der Wert, umso mehr Böden (mit resultierender besserer Auflösung) befinden sich in einer Säule gleicher Länge

• übliche Werte: HPLC [INVALID] The content of "number" must match "unit?" 0.1, GC [INVALID] The content of "number" must match "unit?" 1

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Chromatographie-Kenngrößen zur Optimierung einer Trennung

Ziel: kleine Analysenzeit bei ausreichender Trennung !! gewünschte Änderung Mittel / Weg

Erhöhung der Bodenzahl N längere Säule

Verkleinerung der Bodenhöhe H kleinere Teilchen, Viskosität der mobilen Phase verringern

Änderung des Kapazitätskoeffizienten k´ der Analyten

effektivste Methode, Temperaturerhöhung in der GC, Eluentenzusammensetzung in der HPLC

Einstellen des Selektivitätsfaktors von zwei Analyten auf Werte zwischen 1-10 (darf nicht 1 sein, sonst keine Trennung)

Zusammensetzung der mobilen Phase, Temperatur (besonders bei Ionen), stationäre Phase ändern, chemische Effekte nutzen

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Zur Abschätzung der Optimierungserfolge geeignete Beziehungen (für annähernd ähnliche Kapazitätsfaktoren

von zwei Analyten) :

• R neu R vorher = N neu N vorher = tR neu tR vorher R - Auflösung N - Bodenzahl tR - (Brutto-)Retentionszeit Die besten Trennerfolge sind dann möglich, wenn man den Selektivitätsfaktor für jedes Analytenpaar anpassen kann. In der HPLC nutzt man dazu die Gradientenelution (Lösungsmittelgradient), in der GC die Temperaturprogrammierung (Temperaturgradient).