1

Aus dem Pathologischen Institut

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann

Prognostische Bedeutung von Lymphfollikeln und

tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten

beim Hodgkin Lymphom

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Stefanie Tegtmeier

aus Neustadt a. Rbge.

2

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Gerald Niedobitek

Korreferent: Prof. Dr. med. Arndt Hartmann

Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2009

3

meinen Eltern

und meinem Bruder

4

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung und Abstract 5

2 Einleitung 9

2.1 Das Hodgkin Lymphom 9

2.2 Prognostische Bedeutung tumorinfiltrierender

Lymphozyten 11

3 Methoden 13

3.1 Patientenauswahl 13

3.2 Histologie und Immunhistochemie 13

3.2.1 Biotin-Streptavidin-Komplex Methode 14

3.3 Auswertungsmethode 15

3.4 Statistik 17

4 Ergebnisse 17

5 Diskussion 27

6 Literaturverzeichnis 29

7 Abkürzungsverzeichnis 32

8 Danksagung 33

9 Lebenslauf 34

5

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Da das Immunsystem nach neueren Erkenntnissen mittels einer

Lymphozyteninfiltration auf Tumore reagiert, ist es ein Ziel gegenwärtiger

Forschung, tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) als prognostische Faktoren zu

identifizieren. Diese Studie hat sich zum Ziel gesetzt, den Einfluss von

Lymphfollikeln (LF) und tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten auf die Prognose

von bestrahlten und/oder chemotherapeutisch behandelten Patienten mit Hodgkin-

Lymphom (HL) zu untersuchen.

1.2 Methoden

Tumorbiopsien von 89 Patienten mit HL wurden immunhistochemisch gefärbt und

mit Hilfe eines Bildanalyseprogramms ausgewertet. Hierfür wurden B-

Lymphozyten in allen 89 Fällen mit einem monoklonalen Antikörper spezifisch für

CD20 markiert.

Zusätzlich wurden von allen Biopsien mit genügend Paraffinmaterial (74 Fälle)

immunhistochemische Untersuchungen mit einem CD21-spezifischen Antikörper

zur Detektion von B-Lymphozyten und follikulären dendritischen Zellen

durchgeführt.

Die Zahl der interfollikulären CD20+ Lymphozyten wurde ins Verhältnis zur

ausgewerteten Fläche gesetzt. Außerdem wurde in einer zweiten Auswertungsreihe

die Zahl der CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel pro Fläche mittels Diascanner

ausgewertet.

Da die Verteilungskurven für CD20+ Zellen, CD20+ und CD21+ LF keiner

Gausschen Verteilungskurve glichen, wurden die Schwellenwerte zur

Unterscheidung zweier Subgruppen nicht am Median, sondern nach rein optischen

Gesichtspunkten sowie in Abhängigkeit vom besten p-Wert festgelegt. Daraus ergab

sich je eine Gruppe mit vielen oder wenigen B-Lymphozyten bzw. mit vielen oder

wenigen Lymphfollikeln. Nach der Kaplan-Meier-Methode wurde dazu jeweils das

Gesamtüberleben, das rezidivfreie, das zweittumorfreie und das ereignisfreie

Überleben berechnet und mit Hilfe des Logrank-Tests verglichen.

6

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

In Bezug auf Gesamtüberleben (GSÜ), rezidivfreies Überleben (RÜ),

zweittumorfreies Überleben (2TÜ) sowie ereignisfreies Überleben (EÜ) zeigten

CD20+ B-Lymphozyten keinen prognostischen Einfluss (siehe Abb. 5-8).

Als prognostisch einflussreich stellte sich dagegen die Dichte von CD20+

Lymphfollikeln dar: Eine hohe Anzahl an CD20+ LF korrelierte im HL tendenziell

mit einem verbesserten GSÜ (p=0,065), RÜ (p=0,125), 2TÜ (p=0,155) und EÜ

(p=0,064), wie in Abb. 10-13 dargestellt.

Zur Validierung der Ergebnisse wurden mittels CD21+ Immunhistochemie ebenso

LF im HL detektiert. Die Auswertungsergebnisse für CD20+ LF konnten bei den

untersuchten Parametern GSÜ (p=0,110), RÜ (p=0,253), 2TÜ (p=0,125) und EÜ

(p=0,086) bestätigt werden, wie in Abb. 15-18 gezeigt.

1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Lymphfollikel im HL sind möglicherweise nicht nur Relikte der ursprünglichen

Lymphknoten-Struktur, sondern können Komponenten einer tumorspezifischen

Immunreaktion darstellen. Die günstige Wirkung der LF basiert vermutlich auf den

darin durch Antigenkontakt ausgelösten Keimzentrumsreaktionen. Dabei kommt es

im Zusammenspiel von follikulären dendritischen Zellen, B-Zellen und T-

Helferzellen über mehrere Reaktionsschritte zur Umwandlung von B-Zellen in

Plasmazellen (PZ), die in der Lage sind, Antikörper gegen Oberflächenantigene von

Zielzellen zu bilden.

Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb eines Tumors ist von Bedeutung,

da sie nicht nur Rückschlüsse auf die Prognose der Patienten liefern, sondern auch

eine Basis für die Entwicklung immunologischer Therapieverfahren darstellen kann.

7

Abstract

Background and objective

Tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) are generally considered to represent a host

immune response directed against tumor antigens. This notion is underlined by the

prognostic relevance of certain T-cell subsets in various human malignancies. B-

cells, by contrast have received little attention. Therefore, this study aims at the

analysis of the prognostic relevance of tumor-infiltrating B-cells in patients with

classical Hodgkin lymphoma (cHL).

Methods

Formalin-fixed and paraffin-embedded tumor biopsies from 89 patients diagnosed

with cHL were available. Paraffin sections were immunostained using a CD20

monoclonal antibody (mAb) for the detection of B-cells (89 cases) and a CD21 mAb

for the identification of follicular dendritic cell meshworks (74 cases).

The number of interfollicular CD20+ cells was evaluated in relation to the area using

a computer-assisted image analysis program. Moreover the numbers of CD20+

and/or CD21+ B-cell follicles were analysed.

Overall survival, disease-free survival, second-tumor-free survival, and event-free

survival were analysed using Kaplan and Mayer statistics, and the curves were

compared by the log-rank test.

Results

Concerning overall survival, disease-free, second-tumor-free and eventfree survival

CD20+ B-cells did not show any prognostic relevance.

By contrast, the density of CD20+ lymph follicles turned out to be prognostically

influential: Large numbers of CD20+ B-cell follicles tended to correlate with a better

orverall survival, disease-free, second-tumor-free and event-free survival. This

result was confirmed by CD21+ immunohistochemistry.

8

Conclusions

These results suggest that in cHL B-cell follicles are not only remnants of the pre-

exisiting lymph nodes, but possibly components of an immune response which is

specific to the tumor.

Thus, in addition to T-cell immunitiy, the humoral immune system may play a more

important role in anti-tumour immunity than hitherto recognised. Knowledge about

local immune responses within a tumor is important as a means to assess patients’

prognoses as well as the basis for the development of immunological therapies.

9

2 Einleitung

2.1 Das Hodgkin Lymphom

Das Hodgkin Lymphom (HL), auch als Morbus Hodgkin oder

Lymphogranulomatose bezeichnet, wurde erstmals 1832 vom britischen Arzt

Thomas Hodgkin beschrieben und gehört – zusammen mit der großen Gruppe der

Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) – zu den malignen Lymphomen. Die Gesamtzahl

der Neuerkrankungen liegt in Deutschland bei etwa 2000 pro Jahr. Die Inzidenz

beträgt 2,5 pro 100 000 Einwohner jährlich. Das mittlere Erkrankungsalter liegt um

das 4. Lebensjahrzehnt, wobei Männer und Frauen annähernd gleichmäßig betroffen

sind (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., in

Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut: www.rki.de). Ein erster Altersgipfel

findet sich bei jungen Erwachsenen im 3. Lebensjahrzehnt, ein zweiter im 7.

Lebensjahrzehnt.

In frühen Stadien ist das HL auf die Lymphknoten (LK) begrenzt, breitet sich aber

im Verlauf auch hämatogen extralymphatisch aus.

Diagnostiziert wird die Erkrankung laut WHO-Klassifikation histopathologisch

anhand der typischen Hodgkin-/Reed-Sternberg- (HRS-) Tumorzellen, die sich in

geringer Anzahl zwischen vielen nicht-neoplastischen Zellen finden (Küppers et al.,

1998). HRS-Zellen sind oft mehrkernig und entstehen vermutlich durch

Transformation von Keimzentrums-B-Zellen. Aufgrund dessen kann auf HRS-

Zellen die Expression bestimmter Antigene nachgewiesen werden, wobei zu 80%

mehr als ein B-Zellmarker auf der Zelloberfläche anzutreffen ist (Watanabe et al.,

2000).

In diesem Zusammenhang konnten Janz et al. ein gewisses

Transdifferenzierungspotential auch reifer lymphatischer Zellen nachweisen: So

kommt es in HRS-Zellen zur Hemmung des Transkriptionsfaktors E2A durch eine

überschießende Expression des aktivierten B-Zell-Faktors 1 und von inhibitor of

differentiation 2 (Id2), was eine Veränderung der Genexpression und einen Verlust

der Expression B-Zell-spezifischer Gene zur Folge hat (Janz et al., 2006).

B-Lymphozyten sind eine Untergruppe der Leukozyten und leiten sich über mehrere

Zwischenstufen von pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks ab. Sie sind als

10

einzige Zellen in der Lage Antikörper zu bilden und stellen neben dem 2. Subtyp

von T-Helferzellen (Th2) Bestandteile der humoralen Immunantwort dar. Reife B-

Zellen exprimieren oberflächlich IgM-Rezeptoren für Antigene und zirkulieren im

Blut und den lymphatischen Organen. Beim ersten Antigen-Kontakt und

gleichzeitigem ko-stimulierendem Signal von Th2-Zellen, wandert die B-Zelle in

ein Keimzentrum von Lymphknoten oder Milz, wo sie proliferiert und nach

Differenzierung zur Plasmazelle Antikörper sezerniert. Alternativ kann es auch zu

einer Differenzierung zu Gedächtnis-B-Zellen kommen. Dieser Prozess wird

begleitet von einem Wechsel der Immunglobulin-Klasse und der somatischen

Hypermutation der Immunglobulin-Gene.

Neben den membranständigen Immunglobulinen tragen B-Zellen im Verlauf ihrer

Reifung auf der Oberfläche weitere verschiedene Eiweißstrukturen, die als

Oberflächenmarker für deren Identifizierung von Bedeutung sind. Dazu zählen unter

anderem CD20 und CD21. CD21 markiert neben B-Zellen auch follikuläre

dendritische Zellen (FDZ).

Das histologische Bild des HL variiert aufgrund der Zusammensetzung des Infiltrats

von Tumorzellen, reaktiven Lymphozyten, Histiozyten, Granulozyten und

Fibroblasten und lässt eine Einteilung in zwei große Subtypen zu: nach der WHO-

Klassifikation von 1997 unterscheidet man das klassische vom nodulären

lymphozytenprädominanten (nlp) HL. Das klassische HL tritt in vier

Erscheinungsformen auf: lymphozytenreich (lr), nodulär sklerosierend (ns),

gemischt zellulär (mc, mixed cellularity) oder lymphozytenarm (ld, lymphocyte

depletion).

In Abhängigkeit vom Erkrankungsstadium, Blutbild, Alter und Geschlecht des

Patienten finden sich nach durchgeführter Chemotherapie und/oder Radiatio

progressionsfreie Überlebensraten zwischen 42% und 84% (Hasenclever et al.,

1998). Die Mortalität liegt in Deutschland bei 0,5 Personen pro 100 000 Einwohner

im Jahr (Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V., in

Zusammenarbeit mit dem Robert Koch-Institut: www.rki.de). Zu den unabhängigen

Faktoren, die die Prognose des Patienten negativ beeinflussen, zählen neben einem

hohen Alter und einem schlechten Allgemeinzustand das Vorhandensein

extranodaler Manifestationen, die in der Ann Arbor-Klassifikation von 1971 erfasst

11

und in Abhängigkeit vom Befallsmuster der Lymphknoten in vier

Ausbreitungsstadien unterteilt wurden. Unter B-Symptomatik versteht man das

zusätzliche Vorhandensein der Trias Fieber, Nachtschweiß und Gewichtsverlust.

2.2 Prognostische Bedeutung tumorinfiltrierender Lymphozyten

Im Hinblick auf die Prognose verschiedener Tumorerkrankungen wurde der Einfluss

tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) bereits vielfach untersucht: Als

prognostisch einflussreich erwiesen sich diverse TILs beim Ovarial-Karzinom: Hier

korrelierte eine geringe Zahl CD8+ T-Lymphozyten sowie niedrige Quotienten von

CD8+/CD4+ bzw. CD8+/Treg mit einem reduzierten Gesamtüberleben (GSÜ) (Sato

et al., 2005). Auch beim Kolorektalen Karzinom war eine geringe Anzahl CD8+ T-

Lymphozyten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert (Prall et al., 2004). Beim

Pankreas-Karzinom korrelierte eine starke Infiltration zytotoxischer T-Zellen mit

verlängerten Überlebensraten (Ryschich et al., 2005). Wie Ryschich aber weiter

feststellte, geht die Expression vom humanen Leukozyten-Antigen-System-I (HLA-

I) im Pankreas-Karzinom allerdings oft verloren, was die Umgehung der

zytotoxischen T-Zell-Infiltration nach sich zieht (Ryschich et al., 2005). Insgesamt

betonen diese Untersuchungen einen prognostisch günstigen Effekt von

zytotoxischen T-Zellen und einen ungünstigen Effekt regulatorischer T-Zellen.

Demgegenüber finden sich nur vergleichsweise wenige Arbeiten, die die Bedeutung

von tumorinfiltrierenden B-Zellen zum Gegenstand haben. So korreliert die

Infiltration von B-Lymphozyten beim medullären Mamma-Karzinom (Kotlan et al.,

2003 + 2005) und beim großzelligen Lungen-Karzinom (Eerola et al., 1999) mit

einer günstigen Prognose. In diesem Zusammenhang hat Hansen anhand des

medullären Mamma-Karzinoms nachgewiesen, dass B-Lymphozyten als Reaktion

auf ein auf der Oberfläche von Tumorzellen präsentiertes Antigen eine humorale

Immunantwort auslösen, was möglicherweise die Elimination von Tumorzellen

nach sich zieht (Hansen et al., 2002). Nzula konnte beim duktalen Mamma-

Karzinom zahlreiche Mutationen der Immunglobulingene in den infiltrierenden B-

Zellen nachweisen, woraus er ebenfalls auf antigenabhängige Proliferationen und

somatische Hypermutationen der B-Zellen schloss (Nzula et al., 2003).

12

Beim HL dominieren histologisch Th2- und regulatorische T- (Treg-) Zellen. Von

Schreck konnte kürzlich der Zusammenhang zwischen einer Tumorinfiltration mit

Th2-Zellen und einer günstigen Prognose nachgewiesen werden (Schreck et al.,

Hematol Oncol, im Druck: Sabine Schreck, Daniela Friebel, Maike Buettner,

Luitpold Distel, Gerhard Grabenbauer, Lawrence S. Young, Gerald Niedobitek.

Prognostic impact of tumour-infiltrating Th2 and regulatory T cells in classical

Hodgkin lymphoma). Vermutlich wird die für das HL charakteristische

inflammatorische Tumorinfiltration durch die von HRS-Zellen produzierten Chemo-

und Zytokine ausgelöst (Poppema et al., 2000). Diese führen neben einer Th2-Zell-

Infitration zur Unterdrückung der Th1-Zell-Reaktion. Somit wird die zytotoxische

Immunantwort nicht unterstützt (Poppema et al., 2000).

Des Weiteren konnte beim HL nachgewiesen werden, dass eine geringe Zahl von

Th2-Zellen sowie eine gleichzeitig hohe Zahl regulatorischer T-Zellen (Tregs) mit

einem signifikant reduzierten RÜ korreliert (Schreck et al., submitted, s.o.). Die

lokale Akkumulation von immunsuppressiven Tregs im HL-Gewebe führt zur

Hemmung von Th-Zellen und könnte somit eine mögliche Erklärung dafür sein,

warum HRS-Zellen der antitumoralen Immunität entgehen (Marshall et al., 2004).

Die prognostische Bedeutsamkeit der Th2-Zellen beim HL legt die Vermutung

nahe, dass die humorale Immunität wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit werden

daher die Effektoren der humoralen Immunität, d.h. B-Zellen und B-Zell-Follikel,

untersucht.

Im Gegensatz zum HL wies Carreras bei Follikulären Lymphomen (FL), die zur

großen Gruppe der NHL gehören, einen prognostisch günstigen Einfluss

tumorinfiltrierender Tregs nach (Carreras et al., 2006).

Die lokale Immunantwort bei malignen Tumoren ist somit von Bedeutung für die

Prognostik von Tumorerkrankungen und könnte zukünftig auch als Grundlage für

die Entwicklung immunologischer Therapieverfahren genutzt werden. Vor diesem

Hintergrund wurde in der vorliegenden Studie der Einfluss tumorinfiltrierender

interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten sowie CD20+ bzw. CD21+ Lymphfollikel

auf die Prognose von Patienten mit Hodgkin-Lymphom untersucht.

13

3 Methoden

3.1 Patientenauswahl

Für die vorliegende Studie standen insgesamt 89 in Paraffin eingebettete Biopsien

von Patienten mit der histopathologischen Diagnose HL zur Verfügung. Die

Diagnose war zwischen 1991 und 2004 gestellt worden. Die Patienten wurden mit

Chemotherapie, Radiatio oder einer Kombination aus beiden behandelt.

Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung betrug das Patienten-Alter zwischen vier und

78 Jahren: Dabei waren 18 Patienten unter 20, 39 zwischen 20 und 40, 16 zwischen

40 und 60 und 15 über 60 Jahre alt.

Bei den 51 männlichen und 38 weiblichen Patienten wurde vor Therapiebeginn das

Stadium der Erkrankung anhand der Ann Arbour-Klassifikation bestimmt: Dem

Stadium 1 mit Befall einer einzigen Lymphknotenregion konnten 18 Patienten

zugeordnet werden, davon zwei mit B-Symptomatik (s.o.). Dem Stadium 2 mit einer

oder mehreren unilateral befallenen Lymphknotenregionen wurden 36 Patienten

zugeordnet, davon 13 mit B-Symptomatik. Bei 20 Patienten hatte die Erkrankung

Stadium 3 mit bilateral befallenen Lymphknotenregionen erreicht, davon sieben mit

B-Symptomatik. Dem Stadium 4 mit diffusem Organbefall wurden 12 Patienten

zugeordnet, die alle B-Symptome zeigten.

Zweittumore entwickelten neun der 89 Patienten.

Für die Auswertung der CD20+ B-Lymphozyten und CD20+ Lymphfollikel wurden

alle 89 Biopsien untersucht. In die Auswertung der CD21+ Lymphfollikel konnten

wegen Materialmangels nur 74 Fälle einbezogen werden.

3.2 Histologie und Immunhistochemie

In Paraffin eingebettete Biopsien wurden nach Herstellung histologischer Schnitte

mit der Biotin-Streptavidin-Komplex Methode immunhistochemisch gefärbt.

Dabei fanden folgende monoklonale Antikörper Verwendung: CD20 (Klon L26,

DakoCytomation, Hamburg, Deutschland) und CD21 (Klon 1F8, DakoCytomation,

14

Hamburg, Deutschland). Der Ablauf der immunhistochemischen Färbungen soll im

Folgenden erläutert werden.

3.2.1 Biotin-Streptavidin-Komplex Methode

Nach Entparaffinieren in absteigender Alkoholreihe – zwei mal für jeweils 10

Minuten im Xylolbad, danach jeweils für weitere 2 Minuten in 100%, 90%, 80%

und 70% Alkohol, wurden die Schnitte in Tris-Puffer gestellt und thermisch mittels

Mikrowelle - für jeweils 1 Minute in Citratpuffer (pH 6,0) – vorbehandelt. Nach

nochmaligem Spülen in Tris-Puffer wurden die Schnitte für 1 Stunde mit den

Primärantikörpern inkubiert. Dabei kamen folgende Verdünnungen zur Anwendung:

1:500 (CD20) und 1:100 (CD21). Nach Spülen mit Tris-Puffer und einem Tropfen

Brij wurden die Schnitte für 30 Minuten mit dem Sekundärantikörper (biotinylierter

anti Maus IgG) in der Verdünnung 1:50 und - nach erneutem Spülen mit Tris-Puffer

- für weitere 30 Minuten mit dem Strept-AB-Komplex Dako K 391 inkubiert. Nach

erneuter Tris-Puffer-Spülung wurden die Schnitte schließlich in der Fast-Red-

Farbreaktion in 20 Minuten gefärbt. Zur Herstellung des Fast-Red-Gemisches

musste die Reihenfolge der zugegebenen Substanzen genau eingehalten und die

Lösung anschließend filtriert werden: Zu 0,0020g Naphthol-As-Mx-Phosphat

wurden in der nachfolgend genannten Reihenfolge und frühestens 10 Minuten vor

Verwendung gegeben:

N,N Dimethylformamid 0,2ml

0,1m Tris-HCl-Puffer pH 8,6 9,8ml

1m Levamisol 10µl

Fast Red 0,01g

Im Anschluss daran wurden die Schnitte fließend gewässert, in destilliertes Wasser

gestellt und für einige Sekunden mit Hämalaun (VWR) gegengefärbt. Nach

Einstellen in Leitungswasser erfolgte die Eindeckung mit Aquatex (Merck,

Darmstadt, Deutschland).

15

3.3 Auswertungsmethode

Die Auszählung der B-Lymphozyten erfolgte für diese Studie mit Hilfe eines

Standardlichtmikroskops, von dem aus die Bilder durch eine Digitalkamera auf

einen PC übertragen und unter Verwendung eines Bildanalysepogramms (COUNT,

Biomas, Erlangen, Germany) ausgewertet wurden. Für die Auswertung der

Lymphfollikel wurden die Objektträger mittels eines Diascanners eingescannt

(Coolscan 5 ED, Nicon) und ebenfalls unter Verwendung des oben genannten

Bildanalyseprogramms ausgezählt. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen exemplarisch

die unterschiedlichen Konzentrationen von CD20+ interfollikulären B-Zellen, die

mittels Standardlichtmikroskop ausgewertet wurden. In Abbildung 3 sind CD20+ LF

dargestellt, die von interfollikulären B-Zellen umgeben sind. Alle Bilder wurden mit

Vergrößerung aufgenommen.

Abb. 1: hohe Zahl CD20+ interfollikulärer B-Lymphozyten bei

63facher Vergrößerung

16

Abb. 2: geringe Zahl CD20+ interfollikulärer B-Lymphozyten

bei 63facher Vergrößerung

Abb. 3: Darstellung zweier CD20+ Lymphfollikel bei 40facher

Vergrößerung

Pro Patient wurden für CD20 und CD21 je ein bis zwei exemplarische Ausschnitte

eines histologischen Schnittes ausgewertet. Die durchschnittliche Abweichung

wurde quantitativ erfasst. Zunächst wurde das Verhältnis der untersuchten

Lymphozyten-Subgruppe (CD20) zur Fläche (28,5 mm²) berechnet. Anschließend

17

wurde für CD20 und CD21 die Follikeldichte, d.h. die Anzahl der Lymphfollikel

bezogen auf die individuelle Lymphknotenfläche berechnet.

3.4 Statistik

Mit Hilfe der Kaplan-Meier-Analyse wurden verschiedene Überlebensparameter

untersucht.

Das Gesamtüberleben (GSÜ) errechnete sich aus dem Zeitintervall zwischen der

Diagnosestellung des HL und dem Tod am HL. Das RÜ wurde definiert als das

Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Rezidivs. Das

zweittumorfreie Überleben (2TÜ) wurde definiert als das Zeitintervall zwischen der

Diagnosestellung und dem Auftreten eines Zweittumors. Das EÜ beschrieb das

Zeitintervall zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten eines Zweittumors

oder Rezidivs. Dabei erfolgte die Unterteilung der Patienten in Gruppen mit vielen

oder wenigen CD20+ B-Lymphozyten, vielen oder wenigen CD20+ LF und vielen

oder wenigen CD21+ LF. Da es sich nicht um Gaussche Verteilungskurven handelte,

wurde die Teilung unabhängig vom Median festgelegt. Der Logrank-Test diente

dem Vergleich der jeweiligen Untergruppen.

4 Ergebnisse

Die Auswertung der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten sowie der CD20+

bzw. CD21+ LF zeigte bezüglich der ausgewerteten Fläche folgende Ergebnisse:

Die Anzahl der CD20+ B-Lymphozyten lag zwischen 17,6 und 2619,25 pro mm². In

der zweiten Auswertung wurden zwischen 0,0 und 1,69 CD20+ LF pro mm²

ausgezählt. Die Anzahl der CD21+ LF lag im Bereich zwischen 0,0 und 1,43 LF pro

mm².

Für die Dichte der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten ergab sich daraus der im

Folgenden dargestellte Kurvenverlauf. Der Cut-off für die anschließenden Kaplan-

Meier-Analysen wurde nach bestem p-Wert bei 283 Zellen/mm² gezogen (Pfeil).

18

Daraus ergaben sich zwei Patienten-Gruppen mit vielen (n=44) bzw. wenigen

(n=44) CD20+ B-Lymphozyten.

Abb. 4: Dichte-Verteilung der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten

Die Infiltrationsdichte interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten zeigte im Hinblick

auf die Überlebensparameter GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ keinen prognostischen

Einfluss (Abb. 5-8).

Interfollikuläre CD20+ Zellen pro mm² 4000 3000 2000 1000 0

Häu

figke

it 12

10

8

6

4

2

0

19

Abb. 5: Gesamtüberlebenskurven bezogen auf tumorinfiltrierende

CD20+ B-Lymphozyten

Abb. 6: Rezidivfreies Überleben bezogen auf tumorinfiltrierende

CD20+ B-Lymphozyten

CD20+ < 283 (n=44): 81%

CD20+ > 283 (n=44): 89%

p = 0.173

Jahre

Ges

amtü

berle

ben

CD20+ < 283 (n=44): 79%

CD20+ > 283 (n=44): 87%

p = 0.518

Rez

idiv

frei

es Ü

ber

leb

en

Jahre

20

Abb. 7: Zweittumorfreie Überlebenskurven bezogen auf tumor-

infiltrierende CD20+ B-Lymphozyten

Abb. 8: Ereignisfreie Überlebenskurven bezogen auf tumorinfil-

trierende CD20+ B-Lymphozyten

CD20+ < 283 (n=44): 68%

CD20+ > 283 (n=44): 76%

p = 0.577

Jahre

Ere

igni

sfre

ies

Übe

rleb

en

CD20+ < 283 (n=44): 73%

CD20+ > 283 (n=44): 88%

p = 0.297 Zw

eitt

umor

frei

es Ü

ber

lebe

n

Jahre

21

Das nachfolgende Histogramm stellt die Dichteverteilung der CD20+ Lymphfollikel

dar und wurde bei 0,55 Follikeln/mm² in je eine Untergruppe mit vielen (n=24) bzw.

wenigen (n=65) Lymphfollikeln aufgeteilt (Pfeil).

Abb. 9: Dichte-Verteilung der CD20+ Lymphfollikel

Bezüglich der Anzahl CD20+ Lymphfollikel korrelierte eine hohe Follikeldichte bei

allen vier Parametern (GSÜ, RÜ, 2TÜ, EÜ) tendenziell mit einer günstigen

Prognose (Abb. 10-13). Die Ergebnisse waren allerdings statistisch nicht signifikant.

2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

12

10

8

6

4

2

0

Häu

figke

it

CD20+ Lymphfollikel pro mm²

22

Abb. 10: Gesamtüberleben bezogen auf die Dichte CD20+

Lymphfollikel

Abb. 11: Rezidivfreies Überleben bezogen auf die Dichte

CD20+ Lymphfollikel

CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 95%

CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 80%

p = 0.125

Jahre

Rez

idiv

frei

es Ü

ber

leb

en CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 82%

CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 100%

p = 0.065

Jahre

Ges

amtü

berle

ben

23

Abb. 12: Zweittumorfreies Überleben bezogen auf die Dichte

CD20+ Lymphfollikel

Abb. 13: Ereignisfreies Überleben bezogen auf die Dichte

CD20+ Lymphfollikel

CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 90%

CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 66%

p = 0.064

Jahre

Ere

igni

sfre

ies

Übe

rleb

en

p = 0.155

CD20+ Follikel > 0.55 (n=24): 94%

CD20+ Follikel < 0.55 (n=65): 77%

Jahre

Zw

eitt

umor

frei

es Ü

ber

lebe

n

24

Das Histogramm in Abb. 14 zeigt die Dichte-Verteilung der CD21+ Lymphfollikel.

CD21 gilt als Marker für B-Lymphozyten und follikuläre dendritische Zellen und

wurde zur Validierung der CD20-Daten verwendet. Der Cut-off in je eine

Subgruppe mit vielen (n=16) bzw. wenigen (n=58) Follikeln erfolgte für die

folgenden Kaplan-Meier-Analysen bei 0,6 Lymphfollikeln/mm² (Pfeil).

Abb. 14: Dichte-Verteilung der CD21+ Lymphfollikel

Eine hohe Dichte an CD21+ LF zeigte tendenziell einen günstigen Einfluss auf die

Prognose von HL-Patienten bezogen auf die Überlebensparameter GSÜ, RÜ, 2TÜ

und EÜ (Abb. 15-18). Allerdings waren die Ergebnisse statistisch nicht signifikant.

CD21+ Lymphfollikel pro mm²

1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

Häu

figke

it

8

6

4

2

0

25

Abb.15: Gesamtüberleben bezogen auf die Dichte CD21+

Lymphfollikel

Abb.16: Rezidivfreies Überleben bezogen auf die Dichte

CD21+ Lymphfollikel

CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 93%

CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 76%

p = 0.253

Rez

idiv

frei

es Ü

ber

leb

en

Jahre

p = 0.110

CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 100%

CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 83%

Jahre

Ges

amtü

berle

ben

26

Abb.17: Zweittumorfreies Überleben bezogen auf die Dichte

CD21+ Lymphfollikel

Abb. 18: Ereignisfreies Überleben bezogen auf die Dichte

CD21+ Lymphfollikel

p = 0.086

CD21+ Follikel > 0.6 (n=16): 93%

CD21+ Follikel < 0.6 (n=58): 67%

Jahre

Ere

igni

sfre

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rleb

en

Zw

eitt

umor

frei

es Ü

ber

lebe

n

27

5 Diskussion

In der vorliegenden Studie wurde bezüglich der TIL gezeigt, dass CD20+ bzw.

CD21+ Lymphfollikel möglicherweise günstige Prognosefaktoren bei Patienten mit

HL darstellen. Eine hohe Dichte von LF korrelierte tendenziell mit einem

verlängerten GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ. Für die Anzahl tumorinfiltrierender

interfollikulärer CD20+ B-Lymphozyten konnte kein prognostischer Einfluss

nachgewiesen werden.

In vorangegangenen Studien wurde bereits mehrfach der Einfluss verschiedener

tumorinfiltrierender Lymphozyten-Subgruppen untersucht:

Alvaro-Naranjo hat zytotoxische T-Zellen auf deren prognostische Bedeutsamkeit

hin beim HL analysiert: Hier war eine hohe Zahl tumorinfiltrierender TIA-1+

zytotoxischer T-Lymphozyten mit einer ungünstigen Prognose assoziiert (Alvaro-

Naranjo et al., 2005). Auch Oudejans konnte eine starke Infiltration aktivierter

zytotoxischer T-Zellen, die als Haupteffektorzellen in der Elimination

neoplastischer Zellen gelten, als deutlichen Indikator für einen klinisch ungünstigen

Krankheitsverlauf nachweisen (Oudejans et al., 1997). Als Ursache für die

Unfähigkeit aktivierter zytotoxischer T-Zellen, HRS-Zellen zu lysieren, vermutet

Oudejans die Herabregulation der Haupthistokompatibilitäts-Komplexe-I (MHC-I)

auf der Oberfläche von HRS-Zellen. Somit kann möglicherweise eine Erkennung

der Tumorantigene durch zytotoxische T-Zellen umgangen werden (Oudejans et al.,

1997).

Bezüglich des Einflusses tumorinfiltrierender B-Lymphozyten sind ebenfalls bereits

einige Untersuchungen bei verschiedenen Malignomen durchgeführt worden: Das

medulläre Mammakarzinom zeichnet sich im Vergleich zu den anderen Subtypen

des Mammakarzinoms durch eine größere Zahl tumorinfiltrierender B-Zellen sowie

durch eine bessere Prognose aus. Kotlan erklärte diesen Zusammenhang mit der

spezifischen Tumorantigen-Bindungskapazität der Antikörper von infiltrierenden B-

Zellen (Kotlan et al., 2003).

Die Tatsache, dass der Anzahl der interfollikulären CD20+ B-Lymphozyten in der

vorliegenden Studie kein Einfluss auf die Prognose des HL nachgewiesen werden

konnte, könnte auf eine geringere Fallzahl zurückgeführt werden, insbesondere da

beim HL ohnehin wenige Todesfälle, Rezidive und Zweittumore auftreten. Daher

28

müssen weitere Studien mit höheren Fallzahlen durchgeführt werden, um gesicherte

Aussagen bezüglich des prognostischen Einflusses treffen zu können.

Um die Rolle der LF im Rahmen der humoralen Immunabwehr genauer zu

definieren, wurde in der hier vorliegenden Studie der Einfluss von CD20+ und

CD21+ LF untersucht. Die hierbei gezeigte Tendenz eines verlängerten GSÜ, RÜ,

2TÜ und EÜ derjenigen Patienten, die eine höhere Dichte an CD20+ bzw. CD21+ LF

aufwiesen, kann im Zusammenhang mit den in den LF stattfindenden

Immunreaktionen gesehen werden: Bezüglich der dort vorhandenen follikulären

dendritischen Zellen (FDZ) stellte Alavaikko als erster die Korrelation zwischen

einem positiven FDZ-Status und einer günstigen Prognose dar (Alavaikko et al.,

1994). Baur konnte dieses Ergebnis bestätigen und führte dies auf die Antigen-

präsentierenden Eigenschaften der FDZ und die damit verbundene Rolle in der

Aufrechterhaltung der B- und T-Zell-Immunantworten zurück (Baur et al., 1998).

Die Interaktionen zwischen FDZ und Keimzentrums-B-Zellen wurden bereits in

diversen Studien untersucht. Dabei stellte sich das Netzwerk aus FDZ als

Schlüsselstruktur des Keimzentrums dar (Baur et al., 1998).

In der hier vorliegenden Studie konnte bezüglich GSÜ, RÜ, 2TÜ und EÜ eine

prognostisch günstige Wirkung von CD20+ LF für HL-Patienten gezeigt werden.

Die Daten wurden anhand CD21+ LF validiert. Dies stützt die Annahme, dass eine

humorale Immunreaktion bei der immunologischen Kontrolle des HL wichtig sein

könnte.

Die Kenntnis der lokalen Immunantwort innerhalb solider Tumoren ist von

Bedeutung, da sie sowohl Rückschlüsse auf die Prognose zulässt als auch eine

Grundlage für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Verfahren darstellt. Die

Rolle von LF und interfollikulären B-Zellen in der humoralen Immunreaktion des

HL bleibt weiter zu erforschen. Insbesondere der prognostische Einfluss CD20+ B-

Lymphozyten wurde bisher nur in wenigen Tumormodellen untersucht.

29

6 Literaturverzeichnis

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32

7 Abkürzungsverzeichnis

CD Cluster Domain

cHL klassisches Hodgkin Lymphom

cHLld lymphozytenarmes cHL

cHLlr lymphozytenreiches cHL

cHLmc gemischt-zelluläres cHL

cHLns nodulär-sklerosierendes cHL

DZ Dendritische Zellen

EÜ ereignisfreies Überleben

EZ Effektorzellen

FDZ follikuläre dendritische Zellen

FL Follikuläre Lymphome

GSÜ Gesamtüberleben

HLA Humane Leukozyten-Antigene

HRS Hodgkin-/Reed-Sternberg (-Zellen)

Id2 inhibitor of differentiation 2

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

LF Lymphfollikel

LK Lymphknoten

mAB monoclonal antibody

MHC-Komplex Haupthistokompatibiltäts-Komplex

NHL Non-Hodgkin-Lymphom

nlpHL noduläres lymphozytenprädominantes HL

p Signifikanz

PZ Plasmazelle

RÜ rezidivfreies Überleben

Th T-Helferzellen

TIL Tumorinfiltrierende Lymphozyten

Treg regulatorische T-Lymphozyten

2TÜ zweittumorfreies Überleben

33

8 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner

Arbeit beigetragen haben.

Hierbei ist an erster Stelle mein Betreuer Prof. Dr. G. Niedobitek zu nennen, der die

Anregung zu dieser Arbeit gegeben hat. Seine fachkundige Unterstützung hat einen

entscheidenden Anteil am erfolgreichen Abschluss dieser Arbeit.

Ein besonderer Dank gilt Herrn Dr. L. Distel sowohl für die Hilfestellung bei der

Planung dieser Arbeit als auch für die wertvollen Ratschläge während ihrer

Durchführung. Besonders hervorzuheben ist hier seine Bereitschaft zu fachkundigen

Diskussionen.

Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. R. Fietkau, Direktor der Strahlenklinik der

Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, diese Arbeit an der

Strahlenklinik anzufertigen.

Des Weiteren danke ich Frau Dr. S. Schreck für ihr beständiges Engagement, sowie

den Mitarbeiterinnen des immunhistochemischen Labors, insbesondere Frau Christa

Winkelmann und Frau Alexandra Schindler, die mir mit ihrer praktischen Erfahrung

stets zur Seite gestanden haben.

Den größten Dank möchte ich meinen Eltern aussprechen, die mich stets unterstützt

haben und ohne die mein Studium in dieser Form nicht möglich gewesen wäre.

34

9 Lebenslauf

Persönliche Daten Name: Tegtmeier, Stefanie Geburtsdatum: 03.09.1981 Geburtsort: D – Neustadt am Rübenberge Eltern: Hans Joachim Tegtmeier

Marion Lorenz-Tegtmeier. Geschwister: Kai Tegtmeier Familienstand: ledig Schulausbildung 1988-1992 Grundschule Bad Nenndorf 1992-1994 Orientierungsstufe Bad Nenndorf 1994-2001 Gymnasium Bad Nenndorf 2001 Abitur Hochschulausbildung 2001-2003 Zahnmedizinstudium an der Albertus-Magnus Universität zu

Köln 2003-2007 Fortsetzung des Zahnmedizinstudiums an der Friedrich- Alexander Universität Erlangen-Nürnberg 23.07.–13.12.2007 Zahnärztliche Prüfung Beschäftigung Seit 01.04.2008 Assistenzzahnärztin bei Dr. med. dent. Chr. Pscherer, 91227 Leinburg