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Protein-Gelelektrophorese 1
Biologie in bersichten Protein-Gelelektrophorese. Copyright 2004-11 by Marcus Krger. Alle Rechte vorbehalten. Letzte nderung: 10.04.2011 www.natur-und-technik.com
Probleme bei der Protein-Gelelektrophorese
Bei der elektrophoretischen Auftrennung spielen drei Eigenschaften der Proteine eine Rolle:
die Gre: groe Molekle wandern wegen des hheren Widerstandes langsamer durch das Gel als kleine Molekle
die berstruktur (Faltung): kompakt gefaltete Molekle mogeln sich schneller durch die engen Gelporen als lange Proteinfden oder zusammen-gesetzte Proteine
die Ladung: Molekle mit einer negativen Nettoladung wandern zur Anode (Pluspol), Molekle mit einer positiven Ladung wandern zur Kathode (Minuspol)
Im Gegensatz zu Nukleinsuren, die proportional zu ihrer Gre negativ geladen sind (jedes Nukleotid trgt eine negative Phosphatgruppe), knnen Proteine unabhngig von ihrer Gre ganz unterschiedlich geladen sein.
Desweiten liegen die meisten Proteine in unterschiedlichen Faltungen vor (Sekundr-, Tertir- und Quartrstrukturen). Beides (Ladung + Faltung) wrde die Grenauftrennung natrlich stren.
kontinuierliche, native PAGE
Auftrennung nach Gre (Molekulargewicht), Faltung und Ladung
Das blaue und das orangefarbene Molekl sind gleich gro, haben aber unterschiedliche Nettoladungen. Das blaue (3fach negative) wird natrlich schneller zur Anode wandern als das orangefarbene (insgesamt 1fach negative).
Das blaue und das lilafarbene Molekl sind ebenfalls gleich gro, aber unterschiedlich gefaltet. Das kompakt gefaltete blaue Protein mogelt sich natrlich schneller durch die Gelporen als das lange lilafarbene, das berall anstt.
+
+
kleiner
grer
PAA-GelFrbelsung
(z.B. Coomassie)
Stromquelle
untere
Pufferkammer
obere
Pufferkammer
Kathode
Anode
Pufferfront
Proben werden in
Taschen gefllt
PAA-Gel zwischen
zwei Glasplatten
Front zeigt Fortschritt der PAGE
+
Laufpuffer (Tris/Glycin)
Laufpuffer (Tris/Glycin)
Elektrophorese was ist das?
Der Begriff Elektrophorese beschreibt die Wanderung von geladenen Makromoleklen (DNA, RNA oder Proteine) in einem elektrischen Feld.
Sie wird eingesetzt, um Makromolekl-Gemische in einer Gelmatrix (Agarose oder PolyAcrylAmid) in ihre Bestandteile aufzutrennen = Gel-Elektrophorese.
Wir betrachten uns zur Proteinauftrennung die PolyAcrylamid-GelElektophorese (PAGE).
Ablauf einer PAGE
+ +
+
+
+
native Proteine

Lsung der Probleme: die SDS-PAGE
Aufgrund der vorhin beschriebenen Probleme, wre es schn, wenn man alle zu untersuchende Proteine entfalten (=denaturieren) und proportional zu ihrer Gre laden knnte (Gleichberechtigung, so wie bei den Nukleinsuren). Und das schafft man durch die Behandlung (5 min bei 95C) mit dem Detergenz SDS (Natrium-Dodecyl-Sulfat). Durch das Kochen werden nicht-kovalente Proteinaggregate (z.B. Wasserstoffbrckenbindungen) aufgelst*. SDS lagert sich dann an die gestreckten Proteine an und besetzt die Oberflche gleichmig mit negativen Ladungen.
* Kovalente Bindungen (z.B. Disulfidbrcken zwischen Cysteinen) knnen durch Zugabe von reduzierenden Thiolverbindungen wie -Mercaptoethanol oder DTT (Dithiothreitol) ebenfalls zerstrt werden.
Nach dieser Behandlung sind alle Proteine entfaltet und haben eine Nettoladung, die proportional zur Moleklgre (und damit proportional zum Molekulargewicht) ist. SDS-beladene Molekle lassen sich dann hnlich trennen wie Nukleinsuren.
kontinuierliche, denaturierende PAGE
Auftrennung nach Gre (Molekulargewicht)
Durch unterschiedliche Taschentiefe, Ungleichmigkeiten bei der Befllung der Taschen bzw. beim Einlaufen der Proteine in das Gel, sind die Proteinbanden meist unscharf. Dasselbe Problem ergibt sich bei groen Probenvolumina.
Abhilfe schafft die Verwendung einer diskontinuierlichen PAGE mit Sammelgel und Trenngel (nach LAEMMLI).
+
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Kochen mit SDS und DTT/-Mecaptoethanol
+
Auftrennung der Proteine im Gel
Die Wanderung der Proteine ist abhngig von:
Moleklgre (Molekulargewicht)
berstruktur (Faltung)
Nettoladung
Damit die Proteine nur nach Gre aufgetrennt werden, mssen die anderen beiden Kriterien ausschaltet werden.
Ladungsmaskierung durch SDS
Zusammenhang zwischen Laufstrecke und Molekulargewicht
+
+
native Proteine
+ SDS
+
+
denaturierte
Proteine in negativ
geladenen Mizellen
95C
Laufstrecke
log
(Mole
ku
larg
ew
ich
t)

(DISK-)SDS-PAGE nach LAEMMLI
Hierbei handelt es sich um ein diskontinuierliches System aus zwei Gelen, einem Trenngel (feinporig, unten) und einem Sammelgel (grobporig, oben), die sich beide im Hinblick auf den pH, die Ionenstrke und die Porengre unterscheiden.
Die Proben werden im Sammelgel zunchst konzentriert, bevor sie im Trenngel aufgetrennt werden. Dieses fhrt zu schrferen Banden und erlaubt grere Probenvolumina als in Gelen ohne Sammelgel.
diskontinuierliche, denaturierende PAGE
Auftrennung nach Gre (Molekulargewicht); scharfe Banden, grere Probenvolumina mglich
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+
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Kochen mit SDS und DTT/-Mecaptoethanol
Sammelgel pH 6,8
Trenngel pH 8,8
+
Chlorid (Leitionen)
Glycin (Folgeionen)
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Chlorid (Leitionen)
+ Glycin (Folgeionen)
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Beschleunigung
erh
h
te F
eld
st
rke Mangel
an Ionen
Was passiert im Sammelgel?
Beim Anlegen einer Spannung wandern die kleinen Chlorid-Ionen aus dem Gel mit hoher Mobilitt zur Anode.
Die aus dem Laufpuffer in das Sammelgel eindringenden groen Glycin-Ionen liegen bei dem neutralen pH-Wert des Sammelgels (pH 6,8) als Zwitterionen vor und haben damit im Vergleich zu den Chlorid-Ionen eine geringe Nettoladung und damit auch eine geringe Mobilitt.
Die schnell wandernden Chlorid-Ionen bilden somit die Leitionen, die sehr langsam wandernden Glycin-Ionen wirken als Folgeionen.
Die Proteine der Probe werden zwischen den schnellen Leitionen und langsamen Folgeionen laufen.
Da sich zwischen dem Leit- und Folgeionen ein Spannungsgradient aufbaut (und damit eine hhere Feldstrke wirksam wird), werden die langsam laufenden Proteine der Probe beschleunigt bis sie kurz hinter den Leitionen in einer eng begrenzten Zone laufen. Die schnell laufenden Proteine werden kurz vor den Leitionen durch deren negative Ladung abgebremst.
Alle Proteine kommen gemeinsam an der Grenze zum Trenngel an und werden dort in einer eng begrenzten Zone konzentriert.
Was passiert im Trenngel?
Wenn die Ionenfront das Trenngel erreicht hat, wird das Glycin durch den erhhten pH-Wert des Gels vollstndig dissoziiert vorliegen.
Durch die daraus resultierende deutlich erhhte negative Nettoladung steigt die elektrische Mobilitt der Glycin-Ionen drastisch an, sie berholen die Proteine, die damit aus der Konzentrierungszone der erhhten Feldstrke entlassen werden.
Durch die engen Maschen des Trenngels kommt es jetzt zur Auftrennung der Proteine nach dem Molekulargewicht.

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