Proteine in wässriger Lösung

Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“

Proteine in wässriger Lösung

Hydrathülle

hydrophileOberfläche

hydrophoberKern

++

+ +

--

-

H-Brücken, ionische Wechselwirkungen

H-Brücken, hydrohobe Wechselwirkungen

(fest gebunden)

entfaltete Peptidkette:

hydrophobe Bereiche exponiert

gefaltete Peptidkette:

hydrophobe Bereiche im Inneren

hydrophobe Region

Dispersion von Lipiden in Wasser

jedes Lipid-Molekül zwingt die Wassermoleküle,einen höheren Ordnungszustand einzunehmen

Clustering

Nur die Lipidmoleküle an der Seiteerzwingen eine höhere Ordnung

Proteine in wässriger Lösung

Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“

Denaturieren

Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten

Denaturieren von Proteinen

entfalten

hydrophobe und hydrophile Bereiche exponiert

Aggregationüber hydrophobe Bereiche

Stabilisierung von Monomerendurch Lösungsmittel/ Zusatz von Additiven,

die mit hydrophoben Oberflächenenergetisch günstige

Wechelwirkungen eingehen können

random coil

entfaltete Peptidkette:hydrophobe Bereiche exponiert

gefaltete Peptidkette:

hydrophobe Bereiche im Innerenhydrophobe

Region

Aggregation überhydrophobe Bereiche

Bereich mit einergeordneten Wasserstruktur

Denaturieren von Proteinen

Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten

Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche:

• Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) • Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) • Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten

Membranproteine geeignet

• Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( → Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat

S

O

O

O O CH2CH

2 CH2 CH

2CH

2CH

2 CH2

CH2

CH2CH

2CH

2CH

3

CH2

CH2

OCH2

CH2

OOH CH2

CH2 O C

CH3

CH3

CH2 C CH

3

CH3

CH3

n

wichtige Detergenzien

SDS (Natrium-dodecylsulfat)

Triton X-100

Na

Denaturieren von Proteinen

Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten

Methoden zur Stabilisierung der hydrophoben Bereiche:

• Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) • Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) • Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten

Membranproteine geeignet

• Bei extrazellulären Proteinen müssen Disulfidbrücken reduziert werden, damit eine vollständige Denaturierung möglich ist (gängige Reduktionsmittel: Mercaptoethanol, DTT); Die SH-Gruppen müssen blockiert werden, um zu verhindern, dass bei der Reoxidation mit O2 intermolekulare Disulfidbrücken ausgebildet werden ( → Aggregation); gängige Blockierungsagenzien: Iodacetamid, Iodacetat

Harnstoff,Mercapto-ethanol

Proteine in wässriger Lösung

Struktur von Proteinen in wässriger Lösung: außen hydrophobe Bereiche, im Inneren hydrophobe Bereiche, „hydrophobic collapse“

Denaturieren

Übergang zur „random coil“ Problem: Stabilisierung der hydrophoben Bereiche, ansonsten Bildung von Aggregaten

Methoden: Hitze, Säure (führt meist zur Aggregation) Harnstoff, Guanidin-Hydrochlorid (für wasserlösliche Proteine) Detergenzien, vor allem SDS (auch für die meisten

Membranproteine geeignet Aussalzen:

Konkurrenz von Proteinen und Salzen um Wasser, nicht alle Salze sind gleich gut geeignet (Hofmeister Serie)

Einsalzen durch niedrigere Salzkonzentrationen

Hofmeister-Serie

Klassifizierung von Ionen in der Reihenfolge ihrer Fähigkeit,Proteine auszusalzen (bzw. in Lösung zu halten)

SO > H PO > CH COO > Cl > Br > I > ClO > SCN4 2 4-

3- - - -

4- -2-

NH > K > Na > Li > Mg > Ca > Guanidinium4+ + + + 2+ 2+

Löslichkeit

Destabilisierung der Tertiärstruktur

Aussalzen

Wirkung von Additiven auf die Hydrathülle von Proteinen

Eindringen in die HydrathülleWechselwirkung mit Proteinen

Aussschluss aus Hydrathülleungestörte Wechselwirkung zwischenProtein und Hydrathülle

nach Creighton

Wasser

Additiv