Heterotrimere G-Proteine in Pilzen · G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten Gα, Gβ und Gγ...

Heterotrimere G-Proteine in Pilzen:

Die Funktion der Gα-Untereinheit GSA1 in der Entwicklung

des Modellorganismus Sordaria macrospora

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik

vorgelegt von Christian Schäfers

aus Witten

Bochum Februar, 2011

Heterotrimeric G proteins in fungi:

The function of the Gα subunit GSA1 in the development

of the model organism Sordaria macrospora

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) Submitted to the International Graduate School of Biosciences,

Faculty of Biology and Biotechnology at the Ruhr University Bochum, Germany

Thesis performed at the Department of General and Molecular Botany

Submitted by Christian Schäfers

from Witten

Bochum February, 2011

Theresa

Everything has a purpose; it’s for you to make the best use of it. (Dan Millman)

Danksagung Ich danke vor allem meinem akademischen Lehrer und Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Ulrich

Kück für die interessante und aktuelle Themenstellung, das mir entgegengebrachte

Vertrauen, die geistige und materielle Unterstützung sowie die konstruktiven Diskussionen

und sein großes Interesse an der Fortführung dieser Arbeit.

Herrn PD Dr. Markus Piotrowski danke ich für die freundliche Übernahme des

Korreferats.

Bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Lehrstuhls für Allgemeine und Molekulare

Botanik möchte ich mich herzlich für die nette Atmosphäre bedanken. Ein besonderer

Dank gilt dabei Frau Regina Ricke und Frau Katja Schmitt, die mir seit Beginn meiner

Laborarbeit fachlich und freundschaftlich zur Seite stehen. Des Weiteren möchte ich mich

bei Frau Ingeborg Godehardt für die Konstruktion einiger Plasmide, Frau Susanne

Schlewinski für die Durchführung genetischer Arbeiten und Frau Elke Adolph als

unverzichtbare Hilfe durch ihre Autoklaven-Arbeit bedanken. Frau Gabriele Frenßen-

Schenkel danke ich für die Mitarbeit bei einigen Abbildungen. Bei Frau Gianna Triller und

Frau Nicole Schnaß bedanke ich mich für die Mithilfe bei dieser Arbeit während ihrer

Bachelorarbeit bzw. ihres Praktikums. Meinen Doktorschwestern und Doktorbrüdern

danke ich für die schöne Zeit und den regen Gedankenaustausch. Besonders bei Frau Dr.

Sandra Bloemendal möchte ich mich für die schöne Zeit im gemeinsamen Labor und bei

Herrn Dr. David Löper für viele unvergessliche Momente während dieser Zeit bedanken.

Für die immerwährende Unterstützung möchte ich mich bei Frau Dr. Ines Teichert, Frau

Dr. Birgit Hoff und Herrn Dr. Jens Kamerewerd bedanken, die viel zum Erfolg dieser

Arbeit beigetragen haben. Weiterhin möchte ich einen besonderen Dank an Frau Dr.

Nicole Nolting und Herrn Dr. Skander Elleuche senden, die mich wissenschaftlich geprägt

haben und darüber hinaus einen besonderen Platz in meinem Leben einnehmen.

Für die Liebe und Anerkennung meiner Familie in Börger und Bochum bin ich unendlich

dankbar. Aus tiefstem Herzen geht dabei ein Dank an meine Frau Theresa, die jeden Tag

meines Lebens zu einem Geschenk macht und die ein großes Vorbild für mich darstellt das

eigene Schicksal anzuerkennen und das Beste daraus zu erschaffen.

Diese Arbeit wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 480: „Molekulare Biologie

komplexer Leistungen von botanischen Systemen“, durch die DFG gefördert.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

I EINLEITUNG ............................................................................................................ 1

1. Einführung ............................................................................................................................................ 1

2. G-Protein-vermittelte Signaltransduktion in Mensch und Hefe ...................................................... 2 2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion im Menschen .......................................... 3

2.1.1. Struktur der humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Beschreibung der Signalaufnahme ....................................................................................................................... 5

2.1.2. Struktur der G-Protein-Untereinheiten und deren Schalterfunktion in Signalwegen .............. 6 2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Prozesse in Saccharomyces cerevisiae .................................. 8

2.2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Pheromonantwort in S. cerevisiae ................................. 8 2.2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Glukosewahrnehmung in S. cerevisiae ....................... 10

3. Regulation von G-Protein-vermittelter Signaltransduktion ........................................................... 11 3.1. Negative Regulation durch Hemmung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors .............................. 11 3.2. Negative Regulation durch Hemmung der G-Protein-Aktivierung ................................................ 12

3.2.1. GAP - GTPase aktivierende Proteine .................................................................................... 12 3.2.2. GDI - Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren .......................................................... 16 3.2.3. Positive Regulation durch Guanosin-Austauschfaktoren - GEF ........................................... 16

4. Zusammenfassung: ............................................................................................................................ 17

II PROBLEMSTELLUNG .......................................................................................... 18

III MATERIAL UND METHODEN ........................................................................... 22

1. Material ............................................................................................................................................... 22 1.1. Stämme .......................................................................................................................................... 22 1.2. Plasmide ......................................................................................................................................... 25 1.3. Verwendete Starteroligonukleotide ................................................................................................ 26 1.4. Chemikalien ................................................................................................................................... 27 1.5. Enzyme .......................................................................................................................................... 28 1.6. Antikörper ...................................................................................................................................... 28 1.7. Kits ................................................................................................................................................. 28 1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen....................................................................................... 28 1.9. Nährmedien .................................................................................................................................... 30 1.10. Software ......................................................................................................................................... 31

2. Methoden ............................................................................................................................................ 32 2.1. Kulturbedingungen ........................................................................................................................ 32 2.2. Transformationsverfahren .............................................................................................................. 32 2.3. Isolierung von Nukleinsäuren ........................................................................................................ 33

2.3.1. Plasmid-DNA-Isolierung aus E. coli ..................................................................................... 33 2.3.2. Plasmid-DNA-Isolierung aus S. cerevisiae ........................................................................... 33

2.4. Gesamt-DNA-Isolierung aus S. macrospora ................................................................................. 33 2.5. Gelelektrophoretische Auftrennungsverfahren .............................................................................. 34 2.6. DNA-Isolierung aus Agarosegelen ................................................................................................ 34 2.7. DNA-Sequenzierung und Oligonukleotidsynthese ........................................................................ 34

2.7.1. Radioaktive Markierung von DNA ....................................................................................... 34 2.8. Southern-Blot-Hybridisierungen .................................................................................................... 34 2.9. cDNA Synthese mittels reverser Transkriptase ............................................................................. 35 2.10. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................................. 35 2.11. Gesamtproteinextraktion aus S. cerevisiae ..................................................................................... 35 2.12. Proteinbiochemische Verfahren ..................................................................................................... 36

2.12.1. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................................ 36 2.12.2. Immunologischer Nachweis von Proteinen (Western Blot-Analyse) .................................... 36

Inhaltsverzeichnis

2.13. Interaktionsstudien ......................................................................................................................... 36 2.13.1. β-Galaktosidase-Tests: ONPG und Filter-LacZ-Test ............................................................ 36 2.13.2. Ko-Immunopräzipitation in S. cerevisiae .............................................................................. 37

2.14. Aufreinigung von Fusionsproteinen in E. coli aus „Inclusion bodies“ .......................................... 37 2.15. Messung der GTPase Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora ............................ 38 2.16. Bioinformatorische Methoden ....................................................................................................... 38 2.17. Sicherheitsbestimmungen .............................................................................................................. 38

IV ERGEBNISSE .......................................................................................................... 39

1. Herstellung konstitutiver GSA1-Varianten aus Sordaria macrospora ........................................... 39

2. Funktionsanalysen mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GSA1-Derivaten .............. 42 2.1. Herstellung von Komplementationsstämmen ................................................................................ 42 2.2. Charakterisierung des vegetativen Wachstums von Komplementationsstämmen ......................... 43 2.3. Charakterisierung der sexuellen Entwicklung von Komplementationsstämmen ........................... 45

3. Interaktionsstudien mit GSA1-Varianten aus S. macrospora ........................................................ 47 3.1. Hefe-2-Hybrid-Analysen zur Identifikation von GSA1-Interaktionspartnern ............................... 47 3.2. Charakterisierung des RGS-Proteins ROG1 (Regulator of GSA1) als Interaktionspartner der

konstitutiv aktiven Gα-Form aus S. macrospora ........................................................................... 52 3.3. Interaktionsstudien mit GSA1 und der Phosphoinositol-3-Kinase SmVPS34 ............................... 57

4. Messung der GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora ........................... 61

V DISKUSSION ........................................................................................................... 66

1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signalwege in Hyphenpilzen .............................................. 66

2. Die sexuelle Entwicklung des Hyphenpilzes Sordaria macrospora ist abhängig vom Aktivitätszustand der Gα-Untereinheit GSA1 ................................................................................. 67

3. Das GSA1 bindende RGS-Protein ROG1 ist ein putativer negativer Regulator des G-Protein-Signalweges in Sordaria macrospora ............................................................................... 71

4. Die Gα-Untereinheit GSA1 interagiert mit Phospholipid-assoziierten Proteinen ........................ 77

5. Interaktionsnetzwerk der Gα-Untereinheit GSA1 in Sordaria macrospora .................................. 81

VI ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................................... 86

VII SUMMARY .............................................................................................................. 87

VIII LITERATUR ............................................................................................................ 88

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

AD Aktivierungsdomäne des Gal4-Transkriptionsfaktors in S. cerevisiae AS Aminosäure BD Bindedomäne des Gal4-Transkriptionsfaktors in S. cerevisiae cDNA zur mRNA komplementäre DNA („complementary DNA“) bp Basenpaare cAMP zyklisches Adenosintriphosphat (cyclic adenosine monophosphate) C-Terminus Carboxy-Terminus DNA Desoxyribonukleinsäure GAP GTPase aktivierendes Protein GDI Guanosin-Dissoziations-Inhibitor gDNA genomische DNA GDP Guanosindiphosphat GEF Guanosin-Austauschfaktor GPCR G-Protein-gekoppelter Rezeptor (G protein-coupled receptor) GRK G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase GTP Guanosintriphosphat kb Kilobasen kDa Kilodalton N-Terminus Amino-Terminus OD optische Dichte PCR Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction) Pi anorganisches Phosphat PtdIns3P Phosphoinositoltriphosphat rpm Umdrehung pro Minute (revolts per minute) RGS Regulator des G-Protein-Signalweges RT Raumtemperatur Allgemein gebräuchliche Abkürzungen sowie Maßeinheiten sind nicht gesondert aufgeführt. Aminosäuren sind anhand des üblichen Einbuchstaben-Codes abgekürzt.

Häufig verwendete Abkürzungen von Genen und Genprodukten

gsa1 Gen für die Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora gsa1_ca Gen für die konstitutiv aktive GSA1-Variante GSA1_CA aus S. macrospora gsa1_ci Gen für die dominant negative GSA1-Variante GSA1_CI aus S. macrospora gsa2 Gen für die Gα-Untereinheit GSA2 aus S. macrospora gsa3 Gen für die Gα-Untereinheit GSA3 aus S. macrospora Smvps34 Gen für die Phosphoinositol-3-Kinase SmVPS34 aus S. macrospora rog1 Gen für das RGS-Protein ROG1 aus S. macrospora pre1 Gen für den Pheromonrezeptor PRE1 aus S. macrospora pre2 Gen für den Pheromonrezeptor PRE2 aus S. macrospora ste12 Gen für den Transkriptionsfaktor STE12 aus S. macrospora

I Einleitung 1

I Einleitung

1. Einführung Eine Zelle überlebt, in dem sie in ständigem Kontakt mit ihrer Umwelt steht. Diese

Kommunikation umfasst eine Wahrnehmung und Aufnahme exogener Signale, so

genannter Stimuli, deren Verarbeitung und die anschließende Weiterleitung in andere

Kompartimente. Ein breites Spektrum von Stimuli aus physikalischen und chemischen

Anreizen, Nährstoffen, Hormonen oder Stress, veranlasst die Zelle zu einer entsprechend

weitgefächerten Reizantwort. Dabei stellen ein Signalempfänger, ein Schalter sowie

weiterleitende Komponenten (Effektoren) die für die Zellantwort essentiellen Elemente

dar. Der Empfänger ist ein Rezeptor, der in der Membran verankert (membranständig) oder

in der Zelle (intrazellulär) vorliegen kann. Die am weitesten verbreiteten Rezeptoren sind

dabei membranständig und besitzen eine extrazelluläre Domäne, über die sie Liganden

binden, sowie eine intrazelluläre Domäne, die zur Signalweiterleitung ins Zellinnere dient.

Aufgrund ihrer Struktur und des damit verbundenen Wirkmechanismus sind

membranständige Rezeptoren in zwei Klassen unterteilt, den ionotropen und metabotropen

Rezeptoren. Innerhalb der metabotropen Klasse bilden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

(GPCR für G protein-coupled receptor) die größte Gruppe, bei denen die

Signalweiterleitung über so genannte G-Proteine vollzogen wird. G-Proteine können dabei

zytosolisch monomer oder membranständig heterotrimer vorliegen. Heterotrimere

G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten Gα, Gβ und Gγ und befinden sich im Fokus

der vorliegenden Arbeit.

Monomere G-Proteine besitzen eine molekulare Masse zwischen 20-29 kDa, weshalb sie auch als kleine GTPasen bezeichnet werden. Sie wirken als Schalter in Signaltransduktionen, da sie zwischen einer inaktiven GDP-gebundenen und einer aktivierten GTP-gebundenen Form wechseln und nur im aktivierten Zustand das Signal an ihre Effektoren weiterleiten (Valencia et al. 1991). Monomere G-Proteine werden anhand ihrer Struktur in 5 Klassen, Ras, Rac/Rho, Ran, Arf und Raf eingeordnet (Macara et al. 1996). Ihr regulatorischer Einfluss ist für Prozesse des Zellwachstums, der Proteinsekretion und der intrazellulären Interaktion von Vesikeln beschrieben (Ellis et al. 1981; Hall 1990).

In dieser Arbeit wurde die Gα-Untereinheit eines heterotrimeren G-Proteins und die

darüber vermittelte Signaltransduktion im Hyphenpilz Sordaria macrospora untersucht.

Daher werden im Folgenden G-Protein-vermittelte Signalwege ohne Berücksichtigung der

monomeren Vertreter allgemein vorgestellt und anschließend anhand der beiden

eukaryotischen Modellsysteme im Menschen sowie in der Hefe detaillierter beschrieben.

I Einleitung 2

2. G-Protein-vermittelte Signaltransduktion in Mensch und Hefe Heterotrimere G-Proteine und ihre vermittelten Signalwege sind seit ihrer Entdeckung

durch Ross und Gilman (1977) vermehrt untersucht worden, wodurch der Großteil der zu

Grunde liegenden Prozesse innerhalb der Signaltransduktion identifiziert wurden (Bourne

1997; Gilman 1987; Oldham und Hamm 2006; Siderovski und Willard 2005). In der

Membran verankert wirken G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als

Signalempfänger, die spezifische Liganden binden können. Durch die Ligandenbindung

ausgelöste Konformationsänderungen initiieren den Übergang vom inaktiven Rezeptor in

seine aktivierte Form (Ballesteros et al. 2001; Farahbakhsh et al. 1995; Farrens et al. 1996).

Ein angeregter GPCR wirkt als Guanosin-Austauschfaktor (GEF für Guanine exchange

factor) aktivierend auf das nachgeschaltete heterotrimere G-Protein. Diese besitzen eine

durchschnittliche molekulare Masse von 100 kDa und bestehen wie oben bereits

beschrieben aus drei Untereinheiten, Gα, Gβ und Gγ. Heterotrimere G-Proteine wirken als

Schalter in der Signaltransduktion, da die Gα-Untereinheiten innerhalb ihres

Aktivierungszyklus nur im GTP-gebundenen Zustand eine Signaltransduktion über

spezifische Effektoren ermöglichen (Abb. 1).

Abbildung 1: Standard-Modell der heterotrimeren G-Protein-vermittelten Signaltransduktion. Der Zyklus der GPCR-vermittelten G-Protein-Aktivierung mit Signalweiterleitung über Gα bzw. Gβγ ist dargestellt. Regulatorische Aktivitäten, wie die GEF-, GAP- und GDI-Aktivität sind rot markiert, die entsprechenden Regulatoren sind mit roten Pfeile verbunden. Abkürzungen: GPCR: G-Protein-gekoppelter Rezeptor, GDP: Guanosindiphosphat, GTP: Guanosintriphosphat, GEF: Guanosin-Austauschfaktor, GAP: GTPase aktivierendes Protein, GDI: Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitor, Pi: anorganisches Phosphat, RGS: Regulator des G-Protein-Signalweges, α, β, γ: Untereinheiten des heterotrimeren G-Proteins. Nähere Erläuterungen siehe Text (nach Neubig und Siderovski 2001).

I Einleitung 3

In Abbildung 1 ist der Aktivierungszyklus einer Gα-Untereinheit dargestellt, der im

Folgenden beschrieben wird. In der Rezeptor-assoziierten, inaktiven Form bildet das

heterotrimere G-Protein einen Komplex mit GDP, welches an Gα gebunden vorliegt

(Gilman 1987; Spiegel 1987). Zu diesem Zeitpunkt erfüllt das Gβγ-Dimer zwei Funktionen

für Gα, zum einen die Anbindung an den GPCR und zum anderen die eines Guanosin-

Nukleotid-Dissoziations-Inhibitors (GDI), wodurch der spontane Austausch von GDP zu

GTP unterbunden wird (Bourne 1997; Brandt und Ross 1985; Gilman 1984; Higashijima et

al. 1987; Siderovski und Willard 2005).

Die GEF-Aktivität des GPCR ersetzt das an Gα gebundene Nukleotid Guanosindiphosphat

(GDP) durch ein Guanosintriphosphat (GTP) und aktiviert Gα (Siderovski und Willard

2005). Aktiviert und GTP-gebunden dissoziiert Gα vom Gβγ-Dimer was in der Bildung

von zwei Komplexen resultiert, Gα und das Gβγ-Dimer. Beide aktivieren spezifische

Effektoren wie z.B. die Adenylatzyklasen oder PI3-Kinasen (weitere humane Effektoren

sind in Tab. 1 aufgeführt) und leiten das Signal ins Innere der Zelle weiter (Oldham und

Hamm 2008). Nur aktiviert, d.h. GTP-gebunden, leitet Gα Signale weiter, weshalb die

Lebensdauer von Gα-GTP die Länge der aktivierten Phase des Signalweges bestimmt

(Sprang 1997). Bei vollständiger Hydrolyse des GTP zu GDP wird die Gα-Untereinheit

inaktiviert und reassoziiert mit Gβγ, um erneut als heterotrimeres G-Protein am GPCR zu

binden, wodurch auch der Signalweg abgeschaltet wird (Spiegel 1987).

Die GTP-Hydrolyse von Gα wird von RGS-Proteinen (Regulatoren des G-Protein-

Signalweges) als GAP (GTPase aktivierendes Protein) beschleunigt, wodurch eine

Inaktivierung von Gα vorangetrieben wird (Übersicht bei Ross und Wilkie 2000). Die

Schnelligkeit des Wechsels zwischen GDP- und GTP-gebundener Gα-Form ist durch

verschiedene regulatorische Faktoren beeinflussbar, die im späteren Verlauf dieser

Einleitung beschrieben werden. Im Folgenden soll zunächst beispielhaft die sehr gut

untersuchte heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion beim Menschen und in

dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae vorgestellt werden.

2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion im Menschen Nachfolgend soll die heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion im Menschen

vorgestellt werden, da eine breit gefächerte Auswahl an Prozessen durch diese gesteuert

wird. Dazu gehören neben der Wahrnehmung und Verarbeitung von Reizen wie Licht,

Gerüchen und Geschmacksrichtungen, die Steuerung der Chemotaxis, der Zellproliferation

I Einleitung 4

und der Zelldifferenzierung (Adler et al. 2000; Buck und Axel 1991; Drucker 2003;

Verghese et al. 1987; Wheeler et al. 1977). Um auf die vielen extrazellulären Signale mit

einer spezifischen Antwort reagieren zu können, ist das humane

Signalweiterleitungssystem komplex aufgebaut. Das Genom von H. sapiens weist mit 33

Genen für G-Protein Untereinheiten (16 Gα, 5 Gβ, 12 Gγ) bzw. 802 Genen für G-Protein-

gekoppelte Rezeptoren (GPCR) eine extrem hohe Anzahl von Genen auf, die für Faktoren

der G-Protein-gekoppelten Signaltransduktion kodieren (Downes und Gautam 1999;

Fredriksson et al. 2003; Venter et al. 2001). Die Spezifität im humanen System wird neben

der hohen Genanzahl von der Kombination der jeweiligen Faktoren bestimmt. Dabei wird

ein striktes System von spezifischen Paarungen aus GPCR, G-Protein und jeweiligen

Effektoren verfolgt, um spezifische Prozesse einzuleiten (Tab. 1).

Daten aus der „Human-gpDB“-Datenbank, die Interaktionen humaner G-Proteine mit

humanen GPCR und Effektoren beinhaltet, zeigen, dass 88 % der GPCR-Unterfamilien

(708) spezifisch mit nur einer Gα-Familie wechselwirken (623/708) bzw. nur die TSH

(Thyroid stimulierendes Hormon)-Rezeptorfamilie mit allen Gα-Familien interagiert

(Satagopam et al. 2010). Durch diese strikte Zuteilung auf exklusive Signalwege können

spezifische Antworten auf Reize erfolgen. Leider entstehen durch diese strenge Einteilung

bei Mutationen in GPCRs bzw. G-Proteinen schwer zu kompensierende Störungen, die zu

Krankheitsbildern beim Menschen führen (Übersicht bei Spiegel und Weinstein 2004).

Bei GPCR- oder G-Protein-assoziierten Krankheiten wird unterschieden, ob die vorherrschende Mutation einen Verlust der Funktion des Gens (loss of function) oder einen Gewinn der Genfunktion (gain of function) nach sich zieht. Beispielhafte Krankheitsbilder für „loss of function“-Muationen sind Netzhautdegeneration (Retinitis pigmentosa) durch mutierte Rhodopsin-Rezeptoren oder eine Schilddrüsenunterfunktion bei Mutationen in TSH-Rezeptoren. Die „gain of function“-Mutation bei Rhodopsin-Rezeptoren resultiert im Gegensatz dazu in einer angeborenen Nachtblindheit oder kann bei Störung der TSH-Rezeptoren zu Tumoren in der Schilddrüse führen, die durch deren Überfunktion initiiert werden (Berson et al. 2002; Corvilain et al. 2001; Spiegel und Weinstein 2004).

In diesem Kontext ist zu erwähnen, dass 30 % aller Arzneimittel direkt auf GPCRs wirken

und einen jährlichen Umsatz von USD 50 Milliarden auf dem Weltmarkt erzielen (Hopkins

und Groom 2002; Jacoby et al. 2006). Studien zur Aufklärung der humanen

G-Protein-gekoppelten Signaltransduktion dienen daher, neben der Grundlagenforschung,

vor allem der Suche nach neuen Wirkstoffen sowie der Aufklärung des Wirkorts und der

Wirkmechanismen. Dabei wurden große Erfolge anhand von Strukturanalysen der GPCR

sowie der G-Protein-Untereinheiten erzielt, auf die im Folgenden näher eingegangen wird

(Übersicht bei Kristiansen 2004 sowie Oldham und Hamm 2006).

I Einleitung 5

2.1.1. Struktur der humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Beschreibung der

Signalaufnahme Alle humanen GPCRs besitzen eine konservierte Struktur aus

sieben Transmembrandomänen (TM1-TM7), die als α-Helices ausgebildet sind. Dabei

liegen der N-Terminus immer extrazellulär und der C-Terminus intrazellulär vor, die

jeweils drei interhelikale Schleifen beidseitig der Membranen ausbilden. Die Struktur

variiert N-terminal in der Länge oder in den ausgebildeten Domänen, so dass

Sequenzanalysen eine Einteilung der humanen GPCRs in fünf Familien ermöglichen. Die

GRAFS-Klassifizierung bezeichnet sie als Glutamat (G)-, Rhodopsin (R)-, Adhesion (A)-,

Frizzled/Taste2 (F)- und Secretin (S)-Familien, von denen die R-Familie die größte und die

am besten beschriebene Familie ist (Fredriksson et al. 2003). Eine Einteilung von GPCRs

in sechs Klassen, in denen auch die pilzlichen Vertreter berücksichtigt werden, ist ebenfalls

beschrieben (Kolakowski 1994).

Die N-terminalen Unterschiede der GPCRs untereinander sind ausschlaggebend für die

Wahl des Liganden. Eine darüber hinaus gehende Spezifität ergibt sich durch das „Ligand

directed signalling“, bei dem die Bindung verschiedener Liganden am gleichen Rezeptor

zu Interaktionen mit unterschiedlichen Gα-Untereinheiten führt (Kenakin 2003; Perez und

Karnik 2005). Eine Liganden-abhängige Strukturveränderung am C-Terminus hat die

Aktivierung des heterotrimeren G-Proteins, welches an der dritten helikalen Schleife

gebunden ist, zur Folge.

Studien am Photorezeptor Rhoidopsin und dessen assoziiertem G-Protein, Transducin (Gt),

in der visuellen Signaltransduktion des Menschen, führten zu einem besseren Verständnis

bei der Anregung des G-Proteins, die im Folgenden beschrieben wird. Eine Aktivierung

von Transducin wurde in diesem Zusammenhang nur nach einer Auflockerung der

Rezeptorstruktur durch Auflösen von Salzbrücken, des sogenannten „ionic-locks“,

zwischen Transmembrandomäne TM3 und TM6 beobachtet (Farrens et al. 1996; Sheikh et

al. 1996). Weiterhin wird diese Veränderung sehr schnell vollzogen (~ 6 ms), so dass eine

nachfolgende Aktivierung des G-Proteins nur durch eine schnelle Komplexbildung mit

dem GPCR möglich ist (Palczewski 2006). Bisher sind zwei Theorien über die Entstehung

der Komplexbildung beschrieben. Das bereits 1978 dokumentierte „Collision coupling“-

Modell postuliert eine Interaktion des Rezeptors mit dem G-Protein nach seiner

Aktivierung, da er erst zu diesem Zeitpunkt durch laterale Diffusion in die

Plasmamembran zum G-Protein gelangt (Tolkovsky und Levitzki 1978). Das zweite

System beschreibt eine Interaktion des G-Proteins mit dem inaktiven GPCR, so dass ein

I Einleitung 6

Komplex vor der Aktivierung entsteht (Gales et al. 2006). Die Aktivierung des G-Proteins

wird über GEF-Aktivität des angeregten GPCRs bewirkt, wodurch eine Freilassung des an

die Gα-Untereinheit gebundenen GDPs und dann eine Bindung des GTP erreicht wird. Ein

nukleotidfreies Gα besitzt sowohl eine Affinität zu GTP als auch zu GDP, so dass die

Bindung zu GTP durch einen Überschuss von diesen im umgebenden Milieu erreicht wird

(Oldham und Hamm 2008). Nach Aktivierung durch den GPCR trennt sich Gα von dem

Gβγ-Dimer und beide Komplexe setzen durch die nachfolgende Aktivierung ihrer

Effektoren die Signaltransduktion fort, die im Folgenden beschrieben wird.

2.1.2. Struktur der G-Protein-Untereinheiten und deren Schalterfunktion in Signalwegen Im humanen Genom kodieren durch alternatives Spleißen 16 Gene für 23

Gα-Untereinheiten, 5 Gene für 6 Gβ-Untereinheiten und 12 Gene für 12

Gγ-Untereinheiten (Downes und Gautam 1999; Venter et al. 2001). Heterotrimere

G-Proteine sind durch eine individuelle Gα-Untereinheit geprägt und in vier Klassen, Gαs,

Gαi, Gαq und Gα12/13, eingeordnet (Downes und Gautam 1999; Simon et al. 1991). Des

Weiteren wurde 2009 mit Gv eine fünfte Klasse identifiziert (Oka et al. 2009).

Die Funktion von Gα als GTP-gebundener Schalter in der Signaltransduktion ist strukturell

determiniert. Gα weist eine konservierte GTPase- und eine individuelle, helikale Domäne

auf. Die GTPase-Domäne besteht aus drei Switch-Regionen, die als Schlaufen ausgebildet

sind und eine Nukleotid-Bindetasche formen. Sie vermittelt darüber hinaus die intrinsische

GTPase-Aktivität um GTP zu GDP zu spalten, wodurch Gα sich selbst und den Signalweg

inaktiviert. Bindungen mit dem GPCR, dem Gβγ-Dimer sowie mit Effektoren werden

ebenfalls in dieser Domäne strukturell determiniert. Die individuelle Struktur der

Gα-Untereinheit legt hingegen die helikale Domäne fest, die aus einem Bündel von sechs

α-Helices aufgebaut ist. Anhand ihrer Struktur ermöglicht sie den Verschluss der

Nukleotid-Bindetasche, wodurch ein gebundenes Nukleotid festgehalten werden kann

(Oldham und Hamm 2008; Sprang 1997).

Die Struktur der ersten Gβ-Untereinheit wurde 1996 von Sondek und Mitarbeitern gelöst.

Sie besteht aus sieben β-Faltblättern, die WD40 besitzen und die Form eines Propellers

ausbilden. Durch eine Konformationsänderung von Gβ, die in einer α-helikalen Struktur

resultiert, wird die Bindung an eine N-terminale „coiled-coil“-Struktur in Gγ ermöglicht,

was zur Bildung des Gβγ-Dimers führt (Sondek et al. 1996; Wall et al. 1995). Von diesem

Dimer trennt sich Gα-GTP durch Konformationsänderung der Switch-Regionen, so dass

I Einleitung 7

beide Komponenten ein Signal auf ihre jeweiligen Effektoren übertragen, die es über

sekundäre Botenstoffe weiterleiten.

Einer dieser Botenstoffe ist das zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP für cyclic adenosine monophosphate), welches durch Adenylatzyklasen produziert wird, die von G-Proteinen der Klasse Gs aktiviert bzw. durch die der Klasse Gi gehemmt werden (Hildebrandt et al. 1983; Ross et al. 1977). Vertreter der Klasse Gq aktivieren die Phospholipase C, welche die sekundären Botenstoffe Diazylglyzerol (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) produziert (Rhee 2001). Die Klasse G12/13 interagiert mit RhoGEFs und aktiviert darüber die kleine GTPase RhoA (Ras homolog gene family, member A) (Worthylake et al. 2000).

Ein Überblick über diese humanen Effektoren ist der Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1: Auflistung von spezifischen Effektoren der G-Protein-Untereinheiten. Eine Stimulation durch das G-Protein wird mit einem (+), eine Hemmung mit einem (-) gekennzeichnet. ACTH: Adrenokortikotropes Hormon, GABA: γ-Aminobuttersäure, EDG: Endotheliales Differenzierungsgen, PAR: Protease-aktivierte Rezeptoren.

G-Protein GPCR (Auswahl) Effektor (Auswahl)

Gsα ACTH-Rezeptor

Olfaktorische Retzeptoren β-Adrenorezeptoren1

Adenylatzyklasen (+) Kaliumkanäle (+)

Tyrosinkinasen (+)2

Gi/oα

Adenosinrezeptoren (A1) α2-Adrenorezeptoren

m2/4-Acetylcholinrezeptoren Dopamin D2-Rezeptor

GABAB3

Adenylatzyklase (-) MAP-Kinase (+) Kaliumkanäle (-)

Tyrosinkinasen (+) Kalziumkanäle (+)

Cdc42 (GTPase) (+) cGMP-PDE (+)2

Gqα

Adenosinrezeptoren (A3) α1-Adrenorezeptoren

m3-Acetylcholinrezeptoren Neurokinin-Rezeptor4

Phospholipase C (+)2

G12/13α EDG-Rezeptoren (1-7)

Thromboxan A2-Rezeptor PAR-1, 2, 34

Phospholipase D (+) RhoGEFs von RhoA (+)2

Gβ/γ (β1-5 /γ1-12) /

Phospholipase Cβs (+) Adenylatzyklase I (+)

Adenylatzyklase II, IV, VII (-) PI3-Kinasen (+)

Kaliumkanäle (+) Kalziumkanäle (-) Tyrosinkinasen (+)

Proteinkinase D (+) 2

1Spiegel (1987); 2Milligan und Kostenis (2006); 3Selbie und Hill (1998); 4Billington und Penn (2003)

I Einleitung 8

Neben dem bislang beschriebenen humanen System werden heterotrimere G-Protein-

vermittelte Signaltransduktionen vor allem in der Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund

der geringeren Komplexität der Signalwege untersucht. Im nachfolgenden Abschnitt wird

diese näher erläutert.

2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Prozesse in Saccharomyces cerevisiae Das Genom der einzelligen Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae weist zwei Gα-, eine

Gβ- und eine Gγ-Untereinheit sowie drei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) auf. In

diesem Zusammenhang wurden die beiden Gα-Untereinheiten GPA1 und GPA2 anhand

von cDNA-Klonen der humanen Vertreter Giα2 und Goα identifiziert, aufgrund derer eine

entsprechende Homologie zum Menschen beschrieben werden kann (Nakafuku et al. 1987;

Nakafuku et al. 1988; Nakayama et al. 1985; Whiteway et al. 1989). Von G-Proteinen

werden in der Hefe mit der Pheromonantwort und der Wahrnehmung von Glukose zwei

Prozesse vermittelt, auf die im Folgenden detaillierter eingegangen wird (Dohlman und

Thorner 2001; Versele et al. 2001).

2.2.1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Pheromonantwort in S. cerevisiae Eine Zelle der Bäckerhefe S. cerevisiae vollzieht den größten Teil ihres Daseins im

diploiden Stadium. In Abhängigkeit des vorherrschenden Nährstoffangebots wird zwischen

der vegetativen und der sexuellen Vermehrung gewechselt. Vegetativ vermehrt sich die

Hefe bei ausreichender Nährstoffversorgung durch Knospung, in deren Verlauf sie

Tochter- und Mutterzellen ausbildet. Bei Nährstoffmangel hingegen wird der sexuelle

Zyklus gewählt, aus dem vier haploide Ascosporen entstehen, von denen jeweils zwei den

MATα- und zwei den MATa-Kreuzungstypen aufweisen. Sobald die Ascosporen den

Ascus (Meiosporangium) verlassen, fusionieren sie wieder mit anderen, um die bevorzugte

diploide Lebensform auszubilden. Diese Fusion bzw. Paarung kann nur von Zellen

eingegangen werden, die einen unterschiedlichen Kreuzungstyp, also MATa und MATα,

aufweisen. Daher ist es für jede Hefezelle essentiell den Kreuzungstyp von anderen

Hefezellen in der Umgebung wahrnehmen zu können. Dieser Prozess wird durch die

G-Protein-vermittelte Pheromonantwort vollzogen, die in haploiden Hefezellen die

Wahrnehmung, den Kontakt und die Fusion mit anderen Zellen steuert, was zur Bildung

von diploiden Zellen führt. (Blumer und Thorner 1991).

I Einleitung 9

Zu Beginn jeder Fusion sekretieren Hefezellen Kreuzungstyp-spezifische Pheromone, die

vom jeweilig anderen Kreuzungstyp durch Bindung an spezifische GPCR, den

Pheromonrezeptoren, wahrgenommen werden. Der MATα-Typ setzt den α-Faktor frei, der

an STE2, dem α-Faktor-spezifischen Pheromonrezeptor bindet, der an der Oberfläche von

Zellen des MATa-Typs lokalisiert ist. Analog dazu bindet das MATa-Typ-Pheromon, der

a-Faktor, an STE3 auf der Oberfläche von MATα-Zellen. Die Aktivierung des G-Proteins

aus GPA1 (Gα), STE4 (Gβ) und STE18 (Gγ) erfolgt analog zum humanen System über

Konformationsänderung der STE3- bzw. STE2-Rezeptorstruktur (Dohlman 2002).

Während im humanen System die Signaltransduktion vor allem über Gα-Effektoren

abläuft, wird die Pheromonantwort in S. cerevisiae über das Gβγ-Dimer auf die Effektoren

übertragen (Dohlman und Thorner 2001). Einer der Effektoren, STE20, aktiviert durch

Interaktion mit der MAP (Mitogen-activated protein)-Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK)

STE11, die MAP-Kinase Kaskade, in deren Verlauf die MAPK-Kinase STE7 und die

MAP-Kinase FUS3 durch Phosphorylierung aktiviert werden. FUS3 reguliert Prozesse des

Zellzyklus über das FAR1-Protein, um diesen in der G1-Phase zu stoppen. So wird

gewährleistet, dass sich beide Zellen in der gleichen Phase befinden, bevor sie fusionieren

(Peter et al. 1993).

Weiterhin reguliert FUS3 durch Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor STE12 die

Transkription von Genen, die an Prozessen wie dem Zellzyklus-Arrest, der Konjugation

oder an morphologischen Veränderungen beteiligt sind (Song et al. 1991). Die gegenteilige

Wirkung der Transkriptionshemmung wird durch Interaktion mit den Faktoren DIG1 und

DIG2 vollzogen, die als Inhibitoren an STE12 binden können (Cook et al. 1996). FUS3

reguliert ebenfalls den Regulator des G-Protein Signalweges (RGS-Protein) SST2, das als

GTPase aktivierendes Protein (GAP) die intrinsische GTPase-Aktivität der

Gα-Untereinheit GPA1 beschleunigt und die Termination des Signalweges herbeiführt

(Garrison et al. 1999). Die Inaktivierung des Signalweges bewirkt FUS3 ebenfalls über

einen Rückkopplungseffekt als negativer Regulator auf den Pheromonrezeptor STE3, den

es phosphoryliert (Feng und Davis 2000b; Lefkowitz 1998). Eine weitere Komponente

dieses Rückkopplungsprozesses ist das „Scaffold“-Protein STE5, ebenfalls ein

Gβγ-Effektor, der eine Translokalisation des STE5-assoziierten STE11-STE7-FUS3-

Komplexes zur Plasmamembran ermöglicht, wodurch FUS3 in räumliche Nähe des

Rezeptors STE3 gelangt (Feng und Davis 2000b; Pryciak und Huntress 1998). Analog zu

anderen „Scaffold“-Proteinen fungiert STE5 als Bindeglied der einzelnen Komponenten

der MAP-Kinase-Kaskade und gewährleistet somit die STE11-vermittelte Aktivierung des

I Einleitung 10

Gβγ-Dimers (Burack und Shaw 2000; Elion 1998; Feng et al. 1998). Darüber hinaus bindet

STE5 an den N-Terminus der MAPKK-Kinase STE11, um eine Selbstinhibierung von

STE11 zu verhindern. MAPKK-Kinasen hemmen ihre eigene Kinase-Aktivität, in dem der

N-Terminus an den katalytisch aktiven C-Terminus des Proteins bindet (Choi et al. 1994;

Marcus et al. 1994).

Neben der Steuerung von Transkription und Signalaufnahme über STE20 und STE5

regulieren Gβγ-Effektoren ebenfalls das polare Wachstum, um eine Zellfusion zu

ermöglichen. Das Gβγ-Dimer interagiert zu diesem Zweck mit FAR1 und CDC24, welches

als Guanosin-Austauschfaktor aktivierend auf die kleine GTPase CDC42 wirkt. Während

der Zellteilung reguliert das aktive CDC42 die Knospung und während der

Pheromonantwort das polare Wachstum (Simon et al. 1995; Zhao et al. 1995). Die Zelle

wächst am Pheromongradienten ausgerichtet, chemotropisch zur zweiten Zelle und bildet

eine so genannte „Shmoo“-Form aus, um mit der anderen Zelle zu fusionieren (Segall

1993; Valtz et al. 1995). Fehlt dieser Gradient, wechseln die Hefezellen zurück zur

Knospung. Neben Gβγ-Effektoren sind einzelne Gα-Effektoren wie das RNA-bindende

Protein SCP160 oder die Phosphoinositol-3-Kinase VPS34 bekannt, deren Einfluss auf die

Pheromonantwort bisher jedoch ungeklärt ist (Guo et al. 2003; Slessareva et al. 2006).

Neben der Pheromonantwort steuern G-Proteine mit der Wahrnehmung von Glukose einen

zweiten Prozess in S. cerevisiae, der im nächsten Abschnitt beschrieben wird.

2.2.2. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Glukosewahrnehmung in S. cerevisiae Zellen der Bäckerhefe können sowohl mit Sauerstoff (aerobe Bedingung) als auch ohne

Sauerstoff (anaerob) wachsen, obwohl das aerobe Wachstum bevorzugt wird, da in diesem

Fall mehr Energie in Form von ATP gewonnen wird. In beiden Fällen kann die Hefe den

Einfachzucker Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle verwenden, wobei unter anaeroben

Bedingungen durch Fermentation Ethanol entsteht. Durch eine hohe Verträglichkeit

gegenüber Ethanol besitzen Hefezellen einen Wachstumsvorteil gegenüber

konkurrierenden Organismen in ihrer Umgebung, deren Wachstum durch Ethanol

gehemmt wird (Versele et al. 2001). Die Prozesse, die es der Hefezelle ermöglichen

Glukose wahrzunehmen, sind noch nicht so detailliert beschrieben wie die Prozesse,

welche die Pheromonantwort ermöglichen. Bekannt ist jedoch, dass das fermentative

Wachstum durch Bindung von Glukose an GPR1, der dritte GPCR neben STE2 und STE3,

eingeleitet wird, der daraufhin die gebundene Gα-Untereinheit GPA2 aktiviert (Colombo et

al. 1998; Kraakman et al. 1999). Es ist bisher kein GPA2-assoziiertes Gβγ-Dimer

I Einleitung 11

beschrieben worden, welches an der Wahrnehmung von Glukose beteiligt ist. Vielmehr

erfolgt die Signaltransduktion über die Gα-Untereinheit, da GPA2, analog zu den humanen

Vertretern Gsα, die Adenylatzyklase (CDC35/CYR1) aktiviert. Dadurch wird nachfolgend

cAMP produziert, wodurch wiederum die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA)

angeregt wird (Colombo et al. 1998). Über diesen G-Protein-vermittelten Signalweg

innerhalb der Glukosewahrnehmung wird letztlich das Wachstum stimuliert und die

Stressresistenz gehemmt (Fabrizio et al. 2001; Kraakman et al. 1999; Kubler et al. 1997).

Nachdem in den vorherigen Kapiteln die G-Proteine sowie die über sie vermittelte

Signaltransduktion anhand der beiden Modellsysteme im Menschen und in der Hefe

vorgestellt wurden, befassen sich die nächsten Abschnitte mit Faktoren, die regulatorisch

auf diese Signalweiterleitung einwirken.

3. Regulation von G-Protein-vermittelter Signaltransduktion Die Dauer einer G-Protein-vermittelten Signaltransduktion hängt vom Nukleotidaustausch,

der GTP-Hydrolyse sowie der Reassoziation des heterotrimeren G-Proteins ab (Sprang et

al. 2007). Jeder einzelne Prozess wird durch regulatorische Faktoren beeinflusst, die darin

unterschieden werden, ob sie einen positiven oder einen negativen Effekt ausüben und ob

der GPCR oder das G-Protein reguliert werden. Im Folgenden werden zuerst mit den G-

Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinasen (GRKs), den Regulatoren des G-Protein-

Signalweges (RGS-Proteine) und den Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren

(GDIs) die negativen Faktoren vorgestellt, um danach mit den positiven Regulatoren, den

Guanosin-Austauschfaktoren (GEF für Guanine exchange factor) diese Einleitung zu

beenden.

3.1. Negative Regulation durch Hemmung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors Um Ligandengradienten wahrzunehmen oder eine kontinuierlich andauernde Stimulation

des Signalweges zu vermeiden, werden G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vom Stimulus

getrennt. Der Rezeptor wird dazu zuerst sensitiviert, dann internalisiert, um letztlich

degradiert oder resensitiviert zu werden. Diese Prozesse sind sowohl in der Hefe als auch

beim Menschen beschrieben (Feng und Davis 2000a; Hicke et al. 1998; Reiter und

Lefkowitz 2006). Beim Menschen wird die Desensitivierung durch G-Protein-gekoppelte

Rezeptor-Kinasen (GRKs) durchgeführt, die exklusiv an aktivierte GPCR binden und

deren C-Terminus phosphorylieren (Palczewski und Benovic 1991). Die nachfolgende

I Einleitung 12

Assoziation von Arrestinen blockiert die Bindestelle zum G-Protein, wodurch der GPCR

vom G-Protein entkoppelt wird. Darauf folgt die Internalisierung des GPCR durch eine

Clathrin vermittelte Endozytose, die durch eine Interaktion von Arrestin mit Clathrin

gestartet wird (Claing et al. 2001; Shenoy und Lefkowitz 2003). Nun wird der GPCR

entweder über Lysosome degradiert oder über „Recycling“-Endosome resensitiviert und

zurück zur Plasmamembran rekrutiert (Moore et al. 2007). Sieben humane GRK sind bei

der Sensitivierung von GPCR beschrieben, die in visuelle GRK (GRK1, GRK7), in

β-Adrenorezeptor-Kinasen (GRK2, GRK3) und in GRK4 (GRK4, GRK5, GRK6)

unterteilt werden (Penela et al. 2010).

In S. cerevisiae phosphorylieren Caseinkinasen (YCK1 YCK2, YCK3) den GPCR und

anstelle von Arrestin vermittelt Ubiquitin die Internalisierung des Rezeptors ins Zellinnere

sowie die Degradation des Rezeptors (Hicke et al. 1998; Panek et al. 1997). Eine

Resensitivierung des Rezeptors fehlt in der Hefe, da immer ein kompletter Abbau erfolgt.

Das Signal wird an der Plasmamembran wieder durch kontrolliert neu synthetisierte GPCR

aufgenommen (Jenness und Spatrick 1986).

3.2. Negative Regulation durch Hemmung der G-Protein-Aktivierung Ein weiterer Weg der negativen Regulation erfolgt über die Hemmung des G-Proteins, bei

der die Gruppe der Regulatoren des G-Protein-Signalweges (RGS-Proteine) eine wichtige

Rolle spielt und die im Folgenden beschrieben wird.

3.2.1. GAP - GTPase aktivierende Proteine GTPase aktivierende Proteine (GAPs) fungieren als negative Regulatoren im

Aktivierungszyklus von G-Proteinen. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde ein

RGS-Protein mit putativer GAP-Aktivität in S. macrospora identifiziert, weshalb auf diese

Gruppe von Regulatoren in diesem Kapitel detaillierter eingegangen wird, die GAPs der

monomeren G-Proteine werden jedoch nicht berücksichtigt (Übersicht bei Scheffzek und

Ahmadian 2005). GTPase aktivierende Proteine binden exklusiv an aktiviertes Gα-GTP

und wirken direkt auf die Inaktivierung des G-Proteins, in dem sie die intrinsische

GTPase-Aktivität um den Faktor 100 beschleunigen (Berman et al. 1996). Aufgrund

dessen werden sie als RGS-Proteine (Regulatoren des G-Protein-Signalweges) bezeichnet

und ihre Existenz konnte die Diskrepanz zwischen niedrigen GTPase-Aktivitäten, die bei

in vitro aufgereinigten Gα-Untereinheiten ermittelt werden, und den Messungen einer

I Einleitung 13

schnellen Inaktivierung der GPCR-vermittelten Signaltransduktionen in vivo aufklären

(Arshavsky und Pugh 1998; Zerangue und Jan 1998). Die ersten RGS-Proteine wurden

1996 in Saccharomyces cerevisiae (SST2 für super sensitive to pheromone 2) und

Caenorhabditis elegans (EGL-10 für EGg laying defective) beschrieben.

Das RGS-Protein SST2 aus S. cerevisiae wurde anhand einer Deletionsmutante identifiziert, die im Pheromon-induzierten Zellzyklus-Arrest verharrte. Die fehlende Adaption entstand durch Verlust der GAP-Aktivität (Chan und Otte 1982a, b; Dohlman et al. 1996). Das RGS-Protein EGL-10 aus C. elegans wurde ebenfalls durch die Generierung einer Deletionsmutante identifiziert, deren Phänotyp sich in einer veränderten Frequenz der abgelegten Eier zeigt, die bei C. elegans G-Protein-vermittelt wird und EGL-10 somit als GAP für die Gα-Untereinheit GOA-1 wirkt (Koelle und Horvitz 1996).

Anhand von Sequenzvergleichen mit SST2 und EGL-10 konnte ebenfalls das erste humane

RGS-Protein, GAIP (G alpha interagierendes Protein) identifiziert werden (De Vries et al.

1995). Die folgende Tabelle 2 zeigt alle bislang identifizierten RGS-Proteine im Menschen

und in der Hefe. Ihre Domänenstruktur und speziell die Homologie in der ungefähr 120

Aminosäuren großen RGS-Domäne stellt die Grundlage dieser Klassifizierung dar (nach

Neubig und Siderovski 2002; Siderovski und Willard 2005). Die neun Familien A-H

werden oft nochmals in zwei Gruppen unterteilt, A-D mit RGS-Domäne und E-H mit einer

RGS-homologen Domäne (RH). Die RGS-Box, die aus neun α-Helices aufgebaut ist,

bindet innerhalb der Switch-Regionen der Gα-Untereinheit und ist essentiell für die

GAP-Aktivität von RGS-Proteinen (Berman et al. 1996; de Alba et al. 1999; Popov et al.

1997; Tesmer et al. 1997; Watson et al. 1996). Alle G-Proteine werden von RGS-Proteinen

mit starker Spezifität zu den jeweiligen Unterfamilien reguliert. Die meisten RGS-Proteine

(Familie A-D) wirken auf Gi/o (Cowan et al. 1998; De Vries et al. 1996; Zhou et al. 2001).

G-Proteine der Gq-Familie werden sowohl von Familie B als auch von GRK2 aus Familie

G inaktiviert (Carman et al. 1999; Druey et al. 1999). Familie F wirkt als GAP auf G12α

und SNX13 (Familie H) ist das erste GAP, welches auf Gsα wirkt (Kozasa et al. 1998;

Zheng et al. 2001). Neben der RGS-Box weisen die RGS-Proteine weitere konservierte

Domänen auf, die Funktionen vermitteln, die ihre GAP-Aktivität modulieren oder von

dieser unabhängig sind (Siderovski und Willard 2005). So wird beispielsweise die

membranassoziierte Lokalisation vermittelt, um in die Nähe der Zielproteine zu gelangen,

wie es für DEP-Domänen aus Familie C, PX und PXA-Domänen aus Familie H oder die

PH-Domäne der RGS-Proteine aus den Familien F und G der Fall ist (Hu und Wensel

2002; Kozasa et al. 1998; Zheng et al. 2001).

I Einleitung 14

Tabelle 2: RGS-Proteine mit Domänenstruktur bei H. sapiens und S. cerevisiae1. Angegeben sind der Organismus, die RGS-Familie, das RGS-Protein, die beschriebene GAP-Aktivität und die jeweilige Domänenstruktur des repräsentativen Vertreters jeder Familie, der fett markiert dargestellt ist. Abk.: Cys: poly-Cystein, RGS: Regulatoren des G-Protein-Signalweges, DEP: Dishevelled, EGL-10 und Pleckstrin, GGL: G-Protein Gamma ähnlich, PDZ: PSD95/Dlg/ZO-1-Homologie, PTB: Phosphotyrosin-Bindedomäne, RBD: Ras-Bindedomäne, GoLoco: Gαi/o-Loco Interaktion, βCat: β-Catenin, GSK3β: Glukogen Synthase-Kinase 3β, PP2A: Protein Phosphatase 2A, DIX: Dishevelled, DH: Dbl-Homologie, PH: Pleckstrin-Homologie, TM: Transmembrandomäne, PXA: Phox-assoziiert, PX: Phox, H.s.: Homo sapiens, S.c.: Saccharomyces cerevisiae

RGS- Familie

RGS- Protein

GAP- Aktivität Domänenstruktur (schematisch)2

H.s.

A/RZ RGS17

Gi RGS19 RGS20

B/R4

RGS1

Gi, Gq

RGS2 RGS3 RGS4 RGS5 RGS8 RGS13 RGS16 RGS18 RGS21

C/R7

RGS6

Gi RGS7 RGS9

RGS11

D/R12 RGS10

Gi RGS12 RGS14

E/RA Axin, Axin2 /

F/GEF

p115-Rho-GEF

G12 LARG PDZ-

RhoGEF G/GRK GRK1,2-7 Gq

H/SNX SNX13

Gs SNX14 SNX25

D-AKAP2 / RGS22 G12/13, Gq

S.c.

RGS2 / RAX1 GPA2 SST2 / MDM1 GPA1

1nach Neubig und Siderovski 2002, 2nach Siderovski und Willard 2005

I Einleitung 15

RGS-Proteine können auch unabhängig von ihrer GAP-Funktion auf die

Signaltransduktion wirken, wie bei Vertretern aus Familie C beschrieben wurde. Diese

binden über ihre GGL–Domäne an Gβ und blockieren somit eine Gγ-Anbindung, was eine

Reassoziation des heterotrimeren G-Proteins durch Gα verhindert (Posner et al. 1999;

Snow et al. 1998). Auch RGS-Proteine der Familie D (RGS 12/14) wirken neben ihrer

GAP-Funktion, über die GoLoco-Domäne als GDIs hemmend auf die G-Proteine (Kimple

et al. 2001; Siderovski et al. 1999). Die G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinasen aus der

Familie G und ihre negative Regulation auf Rezeptoren wurden oben bereits beschrieben.

Ihre GAP-Aktivität auf Gqα-Untereinheiten ist sehr gering, so dass ihre Regulation stärker

über die GPCRs als über die G-Proteine erfolgt (Carman et al. 1999). GAP-Aktivität bei

Vertretern der Familie E konnte bisher noch nicht ermittelt werden, sondern wird nur durch

ihre homologe Domänenstruktur postuliert. Die RhoGEFs, die als Gα-Effektoren bekannt

sind, gehören zur Familie F und besitzen GEF- und GAP-Aktivität. Sie aktivieren Ras-

Homologe und hemmen G12/13 (Hart et al. 1998; Kozasa et al. 1998). Eines der letzten

beschriebenen RGS-Proteine, RGS22, interagiert mit G12/13 und Gq in der Spermiogenese

bei Säugetieren (Hu et al. 2008b).

In S. cerevisiae sind vier RGS-Proteine beschrieben worden (Chasse et al. 2006). Diese

weisen analog zu ihren humanen Verwandten unterschiedliche Domänenarchitekturen auf

(Tab. 2). RGS2 und RAX1 besitzen, wie die Vertreter der humanen RGS-Familien A und

B, nur eine RGS-Box als funktionelle Domäne. Bei RAX1 deuten putative

Transmembrandomänen auf eine Membranintegration hin. SST2 besitzt neben der

RGS-Domäne noch zwei DEP-Domänen, wodurch es Vertretern der humanen C-Familie

gleicht. Für RGS2 und SST2 sind GAP-Aktivitäten in unabhängigen Signaltransduktionen

beschrieben. RGS2 inaktiviert die Gα-Untereinheit GPA2 und den darüber vermittelten

cAMP-Signalweg innerhalb der Wahrnehmung von Glukose (Kap. 2.2.2.) (Versele et al.

1999). SST2 reguliert die Pheromonantwort durch seine GAP-Aktivität auf die involvierte

Gα-Untereinheit GPA1 (Ballon et al. 2006). Das vierte Protein MDM1 ist ein Sonderfall

innerhalb der RGS-Proteine, da die Zugehörigkeit zu den RGS-Proteinen nicht eindeutig

geklärt ist. Chasse und Mitarbeiter bezeichnen es als RGS-Protein, obwohl ihm eine

klassische RGS-Domäne fehlt (Zheng et al. 2004). RAX1 und MDM1 interagieren mit

GPA1, jedoch viel schwächer als SST2 (Chasse et al. 2006). Zusammenfassend zeigt sich

in S. cerevisiae analog zum Menschen eine Spezifität von RGS-Proteinen zu einzelnen

Gα-Untereinheiten (Tab. 2). Mit den beiden Paaren aus GPA1 und SST2 bzw. GPA2 und

RGS2 bildet die Hefe für jedes G-Protein einen prozessspezifischen GAP aus.

I Einleitung 16

3.2.2. GDI - Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren Im Gegensatz zu RGS-Proteinen oder G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Kinasen (GRKs)

inaktivieren Guanosin-Nukleotid Dissoziations-Inhibitoren (GDIs) nicht direkt das G-

Protein bzw. den GPCR, sondern blockieren durch Bindung an Gα die Reassoziation mit

Gβγ und die Bildung des heterotrimeren G-Proteins am GPCR. In diesem Zusammenhang

wird von einem „ungekoppelten“ Rezeptor gesprochen, da Gβγ von Gα ungebunden

vorliegen und die Aktivierung der Gβγ- Effektoren unabhängig von Gα verlängert wird

(De Vries et al. 2000; Kimple et al. 2001; Peterson et al. 2000; Takesono et al. 1999). Das

für GDI charakteristische 19 Aminosäuren große GoLoco-Motiv bildet strukturell eine

α-Helix aus, die bei Bindung von Gα im Bereich der Switch II-Region und der dritten

α-Helix, die Struktur derart modifiziert, dass eine Gβ-Bindung nicht mehr vollzogen

werden kann (Kimple et al. 2002). Die bislang beschriebenen Vertreter der GDIs aus

Säugern weisen entweder ein einziges GoLoco-Motiv (RGS12, RGS14, RAP1GAP) oder

mehrere GoLoco-Motive auf (GPSM1-4 für G-protein modulator protein) und wirken

exklusiv auf G-Proteine der Klasse Gi/o (Übersicht bei Siderovski und Willard 2005). In

Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans interagieren Proteine mit GoLoco-

Motiven mit Gα-Untereinheiten und üben eine essentielle Funktion für die Ausbildung von

asymmetrischen Zellteilungen aus (Gonczy et al. 2000; Schaefer et al. 2000). Kürzlich

wurde in S. cerevisiae mit dem eukaryotischen Translations-Initiationsfaktor, eIF5 der

erste GDI beschrieben, der auf das G-Protein eIF2 wirkt und an der Proteinsynthese

beteiligt ist (Jennings und Pavitt 2010). Nachdem mit den RGS-Proteinen, den GRKs und

den GDIs, negative Regulatoren der Signaltransduktion beschrieben wurden, wird zum

Ende der Einleitung mit Guanosin-Austauschfaktoren die positive Regulation vorgestellt.

3.2.3. Positive Regulation durch Guanosin-Austauschfaktoren - GEF Die bekanntesten Vertreter der Guanosin-Austauschfaktoren (GEF für Guanine exchange

factor) sind membranständige GPCR, die durch Konformationsänderung das

Gα-gebundene GDP durch ein GTP ersetzen, wodurch Gα aktiviert wird. Neben diesen

Rezeptor-GEFs konnte in C. elegans mit RIC-8, der erste „non-receptor“-GEF beschrieben

werden, der unabhängig von Rezeptoren eine GEF-Aktivität auf Gα-Untereinheiten ausübt

(Miller et al. 1996). Homologe von RIC-8 konnten in D. melanogaster und in Säugern

identifiziert werden, in denen sie ebenfalls GEF-Aktivität aufweisen (Tall et al. 2003;

Wang et al. 2005). Bei Säugern gibt es RIC-8 in zwei Isoformen RIC-8A (Synembryn) und

I Einleitung 17

RIC-8B, von denen RIC-8A eine GEF-Aktivität auf G-Proteine der Klassen Giα, Goα und

Gqα und RIC-8B auf Gqα und Gsα ausübt (Tall et al. 2003). Die Vermutung, dass RIC-8 als

Rezeptor-unabhängiger GEF eine Strukturähnlichkeit zu heptahelikalen Rezeptoren

aufweist, konnte durch biophysikalische Strukturberechnungen des RIC-8-Homologs in

Xenopus laevis, xRIC-8, gestützt werden (Figueroa et al. 2009). Ein Unterschied zu einem

Rezeptor-GEF besteht darin, dass RIC-8 nur mit Gα interagiert, wenn dieses frei, d.h. vom

Gβγ-Dimer gelöst, vorliegt (Tall et al. 2003). Die Funktionen von RIC-8 sind in der

Ausbildung der asymmetrischen Zellteilung bei C. elegans und D. melanogaster sowie

innerhalb eines Signalkomplexes beim Menschen, zur Orientierung des Spindelapparates

während der Mitose beschrieben (Afshar et al. 2004; Wang et al. 2005; Woodard et al.

2010). In S. cerevisiae konnten Lee und Dohlman mit ARR4 ebenfalls einen Rezeptor-

unabhängigen Guanosin-Austauschfaktor identifizieren, der analog zu RIC-8, nur freies Gα

bindet. Die GEF-Funktion von ARR4 ist abhängig von Kupfer und kann funktionell der

Pheromonantwort zugeordnet werden. Diese Beobachtung zeigt, dass ARR4 nicht

essentiell für die Pheromonantwort ist, aber eine unterstützende Rolle für den

Pheromonrezeptor übernimmt (Lee und Dohlman 2008). Zum Abschluss der Einleitung

sind die wichtigsten Aspekte der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und ihrer

Regulation kurz zusammengefasst.

4. Zusammenfassung: G-Protein-vermittelte Signaltransduktionen steuern ein großes Spektrum an Prozessen bei

höheren Eukaryoten wie dem Menschen und niederen Eukaryoten wie der Hefe. Dabei

besteht das System stets aus einem konserviert vorliegenden Kernkomplex aus G-Protein-

gekoppelten Rezeptoren und G-Proteinen. Die Auswahl der GPCR-G-Protein-Paare und

die Aktivierung sind dabei sehr strikt und prozessspezifisch festgelegt. In den letzten

Jahren wurde das Modell der Signaltransduktion aus GPCR, G-Protein und Effektoren

durch Identifikation regulatorischer Faktoren weiter vervollständigt. Die Existenz von

RGS-Proteinen, GDIs und GEFs mit ihren spezifischen Wirkmechanismen, deutet dabei

auf einen weitaus komplexeren Aufbau von G-Protein-vermittelten Signalwegen hin, als es

anhand vorheriger Beschreibungen vermuten ließ. Erkenntnisse über diese Regulation

werden dazu beitragen, dass das Verständnis der G-Protein-vermittelten

Signaltransduktionen verbessert wird.

II Problemstellung 18

II Problemstellung

Studien von durch heterotrimere G-Proteine vermittelten Signaltransduktionen sind seit der

Entdeckung von Rodbell und Kollegen Anfang der 1970er Jahre bis heute Gegenstand

aktueller Forschung (Rodbell et al. 1971). In diesem Kontext wurden insbesondere Säuger

mit ihrem komplex aufgebauten System als auch die Hefe Saccharomyces cerevisiae mit

einer weniger komplex aufgebauten Signaltransduktion, als Modellorganismen verwendet.

Dabei konnte ein Kernkomplex aus G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und

G-Proteinen identifiziert werden, der die Weiterleitung der Signale steuert und der in allen

bislang beschriebenen Systemen vorliegt. Die Homologie im Aufbau der

Signaltransduktion wurde bereits für Studien genutzt, in denen mittels chimärer

Gα-Strukturen vertebrale GPCR mit der Pheromonantwort in der Hefe verknüpft wurden,

um bis dahin unbekannte Faktoren aus dem vertebralen System identifizieren zu können

(Cismowski et al. 1999). Nachteilig an diesen Studien ist der Kompromiss, der

eingegangen werden muss, da Prozesse eines mehrzelligen Organismus (Säuger), in einem

Organismus rekapituliert werden, der stets in einer einzelligen Lebensform vorliegt und

geringere Zelldifferenzierungsstrukturen aufweist.

Vor diesem Hintergrund betrachtet, stellt die Gruppe der filamentösen Pilze eine

ausgezeichnete Möglichkeit dar, Studien der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion an

mehrzelligen Organismen mit einer großen Anzahl unterschiedlicher

Zelldifferenzierungsstadien zu untersuchen (Engh et al. 2010). Aus diesem Grund wurden

vermehrt Studien in filamentösen Pilzen durchgeführt, in deren Verlauf G-Protein-

gekoppelte Rezeptoren und G-Proteine identifiziert wurden (Hicks et al. 1997;

Kamerewerd et al. 2008; Mayrhofer und Pöggeler 2005; Turner und Borkovich 1993).

In der vorliegenden Arbeit wurde der Schlauchpilz Sordaria macrospora für Studien der

G-Protein-vermittelten Signaltransduktion verwendet. Als homothallischer Ascomycet ist

S. macrospora zur Selbstung befähigt, so dass er ohne Anwesenheit eines

Kreuzungspartners seinen Lebenszyklus im Labor innerhalb von sieben Tagen vollzieht

(Esser und Straub 1958). Der Lebenszyklus beginnt damit, dass sich ausgehend von einer

Ascospore ein weit verzweigtes vegetatives Myzel bildet, an dem sich Ascogone

abschnüren und diese über das Stadium der Protoperithezien (Vorfruchtkörper) zu reifen

Fruchtkörpern, den Perithezien, heranreifen. Innerhalb dieser Perithezien entwickeln sich

Asci mit jeweils acht linear angeordneten Ascosporen, die durch Meiose I, Meiose II und

postmeiotischer Mitose entstehen. Im reifen Zustand werden die Sporen aus dem


Perithezium herausgeschleudert. Nach der Keimung der Sporen beginnt ein neuer Zyklus

(Esser und Straub 1958). Ein weiterer Vorteil dieser Lebensweise ist, dass rezessive

Mutationen ohne nachfolgende Kreuzung direkt im Phänotyp detektierbar sind, wodurch in

den letzten Jahren eine Reihe von Entwicklungsmutanten analysiert und so Faktoren

identifiziert werden konnten, die an der Fruchtkörperentwicklung beteiligt sind

(Bloemendal et al. 2010; Engh et al. 2007; Masloff et al. 1999; Nowrousian et al. 2007;

Nowrousian et al. 1999; Pöggeler et al. 2006). Die essentielle Funktion einer G-Protein-

vermittelten Signaltransduktion innerhalb dieser Fruchtkörperentwicklung konnte anhand

genetischer Studien beschrieben werden (Kamerewerd et al. 2008; Mayrhofer et al. 2006).

In S. macrospora wurden zwei Gene für Pheromonrezeptoren, pre1 und pre2 (pheromone

receptor), mit hoher Homologie zu ste2 und ste3 aus S. cerevisiae mitsamt ihrer Liganden

ppg1 und ppg2 (pheromone precursor gene) identifiziert und ihre Notwendigkeit für die

sexuelle Entwicklung beschrieben (Mayrhofer und Pöggeler 2005; Mayrhofer et al. 2006;

Pöggeler 2000; Pöggeler und Kück 2001). Die G-Protein-vermittelte Signaltransduktion

wurde darüber hinaus durch Identifikationen dreier Gα-Untereinheiten, gsa1-3 (G-Protein

Sordaria alpha subunit) sowie einer Adenylatzyklase, sac1 (Sordaria adenylyl cyclase 1),

ergänzt (Kamerewerd et al. 2008). Eine Übersicht identifizierter Gene für GPCR und

G-Proteine aus S. macrospora, Homo sapiens und S. cerevisiae zeigt Tabelle 3.

Tabelle 3: Aufstellung identifizierter Gene für GPCR und G-Protein-Untereinheiten

H. sapiens S. cerevisiae S. macrospora

Gα 16 Gene/ 21 Proteine

unterteilt in 4 Klassen: Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13

1/2

Gpa1p (Gi)4 Gpa2p (Gi/s)5

GSA1 (Gi)9 GSA29/11

GSA3 (Gi/s)9

Gβ 5 Gene/ 6 Proteine1/2 Ste4p6 GSB11

Gγ 12 Gene1/2 Ste18p6 GSG11

GPCR

802 Gene in 5 Klassen2/3: G: 15 GPCR R: 701 GPCR A: 24 GPCR F: 24 GPCR S: 15 GPCR

Ste2p7 Ste3p7 Gpr1p8

PRE110 PRE210 GPR-111

(GPR-2)11 (GPR-3)11 (GPR-4)11 (GPR-5)11 (GPR-6)11 (NOP-1)11 (ORP-1)11

1Simon et al. (1991); 2Venter et al. (2001); 3Fredriksson et al. (2003); 4Nakafuku et al. (1987); 5Nakafuku et al. (1988); 6Whiteway et al. (1989); 7Nakayama et al. (1985); 8Yun et al. (1997); 9Kamerewerd et al. (2008); 10Pöggeler und Kück (2001), 11 Nowrousian et al. (2010)


Aktuell konnten im Zuge der Genomsequenzierung von S. macrospora acht weitere

putative GPCR sowie jeweils eine Gβ- und eine Gγ-Untereinheit identifiziert werden

(Tab. 3) (Nowrousian et al. 2010). Zur Charakterisierung der G-Protein-vermittelten

Signaltransduktion und ihren Einfluss auf die Fruchtkörperentwicklung in S. macrospora

erzeugten Kamerewerd et al. Deletionsmutanten der drei Gα-Untereinheiten sowie der

Adenylatzyklase und kreuzten diese untereinander und mit Deletionsmutanten von pre1,

pre2 sowie dem Transkriptionsfaktor ste12. Die daraus resultierenden Ergebnisse wurden

zu einem Modell zusammengefasst, das in Abbildung 2 dargestellt ist. Innerhalb dieser

Signaltransduktion laufen zwei Signalwege parallel voneinander ab, von denen die

Pheromonantwort über die beiden Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 initiiert wird, die

daraufhin das Signal nach Bindung von PPG1 bzw. PPG2 über die Gα-Untereinheiten

GSA1 und GSA2 an den Transkriptionsfaktor STE12 weiterleiten, der anschließend

vielfältige Prozesse in der Fruchtkörperentwicklung reguliert. Bei der Pheromonantwort ist

GSA1 der Hauptfaktor, da GSA2 bei Verlust von GSA1 diesen funktionell nicht ersetzen

kann. Der parallel verlaufende cAMP-Signalweg beginnt über einen bislang nicht

identifizierten Rezeptor, der GSA3 aktiviert. GSA3 wiederum regt die Adenylatzyklase

SAC1 an, wodurch Prozesse in der Ascosporenkeimung bei S. macrospora gesteuert

werden. Beide Signalwege sind über die Interaktion von GSA1 und SAC1 miteinander

verbunden.

Abbildung 2: Modell der durch heterotrimere G-Proteine vermittelten Signaltransduktion in S. macrospora (nach Kamerewerd et al. 2008). Innerhalb der Pheromonantwort leiten die beiden Gα-Untereinheiten GSA1 und GSA2 das Signal von PRE1 und PRE2 an STE12 weiter, um Prozesse in der Fruchtkörperentwicklung zu steuern. GSA3 hingegen ist im parallel verlaufenden cAMP-Signalweg involviert und steuert über Interaktion mit der Adenylatzyklase SAC1 die Ascosporenkeimung. Prozesse von denen nicht geklärt ist, ob sie direkt oder indirekt über bislang ungeklärte Faktoren ablaufen, sind in den jeweiligen Formen der Faktor mit einem (?) gekennzeichnet.


Neben den beschriebenen Faktoren fehlen aber noch zahlreiche interagierende

Komponenten, so dass das Ziel der vorliegenden Arbeit die Identifikation und

Charakterisierung weiterer Faktoren war, die über das bekannte Modell hinaus, an der

G-Protein-vermittelten Signalweiterleitung beteiligt sind. Die zentrale Rolle von GSA1

innerhalb dieser Signaltransduktion, die Verbindung zu beiden Signalwegen und die damit

assoziierte Funktion während der Fruchtkörperentwicklung prädestinierten GSA1 in

diesem Zusammenhang als Ausgangspunkt bei der Suche nach neuen Faktoren. Dabei

sollten konstitutive Formen von GSA1 mittels direkter Mutagenese des Gens gsa1

hergestellt und als Beute innerhalb eines Hefe-2-Hybrid-Systems verwendet werden, um

vom Aktivierungsstatus der Gα-Untereinheit abhängige Interaktionspartner identifizieren

zu können. Mögliche Zielproteine waren Regulatoren oder Effektoren, für die eine

Spezifität zu Gα-Untereinheiten, in Abhängigkeit von ihrem Aktivitätszustand, d.h. von

ihrem gebundenen Nukleotid, beschrieben ist (Berman et al. 1996; Tall et al. 2003). Die

einzelnen Aminosäuren, die zur Herstellung konstitutiver Formen der Gα-Untereinheiten

zu modifizieren waren, sind bekannt gewesen und analoge konstitutive Varianten in Pilzen

beschrieben worden (Apanovitch et al. 1998; Coca et al. 2000; Coleman et al. 1994;

Regenfelder et al. 1997; Yang und Borkovich 1999). Zur Bestätigung der identifizierten

Interaktionen sollten Ko-Immunopräzipitationsanalysen durchgeführt werden.

Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit sollte die physiologische Charakterisierung von

S. macrospora-Stämmen sein, die mit DNA dieser konstitutiven GSA1-Formen

transformiert werden sollten. Die Möglichkeit für diese Untersuchung einen

Deletionsstamm von gsa1 zu verwenden, schließt einen Effekt der Wildtyp-Kopie von

gsa1 aus. Für die vorliegende Arbeit sollte in diesem Zusammenhang die ∆gsa1/∆gsa2-

Deletionsmutante als Rezipient verwendet werden. Aus vorherigen Studien war bekannt,

dass eine Transformation mit gsa1 ausreicht, um den sterilen Phänotyp der Doppelmutante

zu komplementieren, so dass dieser Stamm wieder eine vollständige Fertilität aufwies

(Kamerewerd et al. 2008).

Ziel war es hierbei anhand von Transformanten einen Effekt der jeweiligen konstitutiven

Form der Gα-Untereinheit GSA1 in S. macrospora beschreiben zu können, der auf die

Entwicklung des Hyphenpilzes ausgeübt wird.

III Material und Methoden 22

III Material und Methoden 1. Material 1.1. Stämme Escherichia coli XL1-Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac-, [F',

proAB, lacIq ZΔM15, Tn10(tetr)]; Rezipientenstamm zur schnellen und umfangreichen Replikation von Plasmiden (Bullock et al. 1987).

BL21-Gold (DE3) E. coli B F- ampT hsdS(rB-mB-) dcm+ Tet’, galλ(DE3) endA The. Rezipientenstamm zur Expression heterologer Gene (Weiner et al. 1994)

Sordaria macrospora In Tabelle 4 befinden sich alle in dieser Arbeit verwendeten Stämme von S. macrospora, die mit ihrem Genotyp und der jeweiligen Referenz aufgeführt sind. Tabelle 4: Verwendete Stämme von Sordaria macrospora

Stamm Genotyp Referenz

S91327 Wildtyp Stammsammlung AMB

S96888 ∆ku70::nat, natR (Pöggeler und Kück 2006)

S93465 ∆gsa1::hph/∆gsa2::hph, hygR (Kamerewerd et al. 2008)

CA_3 ∆gsa1::hph/∆gsa2::hph, mit pCA_nat, hygR, natR diese Arbeit

CI_7 ∆gsa1::hph/∆gsa2::hph, mit pCI_nat, hygR, natR diese Arbeit


Saccharomyces cerevisiae In Tabelle 5 sind alle in dieser Arbeit verwendeten Stämme von S. cerevisiae mit ihrem Genotyp und der jeweiligen Referenz aufgelistet. Zur besseren Übersicht wurden die Stämme anhand ihres Verwendungszwecks unterteilt. Tabelle 5: Verwendete S. cerevisiae-Stämme

Stamm Genotyp Referenz Rezipientenstämme

AH109

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ, MEL1

(James et al. 1996) Clontech, Heidelberg

Y187

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4∆, met-, gal80∆, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1

(Harper et al. 1993)

PJ69-4a

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3- 200, gal4Δ, gal80Δ, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, MET2::GAL7UAS-GAL7TATA-lacZ

(James et al. 1996)

Hefestämme für die Verwendung innerhalb des Y2H-Screens AH109 + pGADT7-Rec + cDNA Bank

AH109, transformiert mit Expressionsplasmid pGADT7 + cDNA Bank, leu+

Teichert, persönliche Mitteilung

Y187+pB1_CA Y187, transformiert mit Expressionsplasmid pB1_CA, trp+ diese Arbeit

Y187+pB1_CI Y187, transformiert mit Expressionsplasmid pB1_CI, trp+ diese Arbeit

Hefestämme für die Verwendung in direkten Interaktionsstudien Interaktionsstudien mit VPS34 und GSA1-3, GSA1_CA, GSA1_CI

PJ69-4a+pA1_CA +pBV34

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1_CA +pBV34n

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1_CA +pBV34c

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1_CI +pBV34

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit



PJ69-4a+pA1_CI +pBV34n

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1_CI +pBV34c

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1 +pBV34

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pBV34, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1 +pBV34n

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pBV34n, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1 +pBV34c

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pBV34c, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA2 +pBV34


PJ69-4a+pA2 +pBV34n


PJ69-4a+pA2 +pBV34c


PJ69-4a+pA3 +pBV34


PJ69-4a+pA3 +pBV34n


PJ69-4a+pA3 +pBV34c


Interaktionsstudien mit ROG1 und GSA1_CA

PJ69-4a+pA1_CA +pBROG1

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pBROG1, trp+, leu+ diese Arbeit

Kontrollen innerhalb der Interaktionsstudien

PJ69-4a+pA1_CA +pGBKT7

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CA und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1_CI +pGBKT7

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1_CI und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit

PJ69-4a+pA1 +pGBKT7

PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pA1 und pGBKT7, trp+, leu+ diese Arbeit



PJ69-4a+pA2 +pGBKT7


PJ69-4a+pA3 +pGBKT7


PJ69-4a+pGBKT7 PJ69-4a, transformiert mit Expressionsplasmid pGBKT7, trp+

diese Arbeit

1.2. Plasmide Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide sind in Tabelle 6 aufgelistet. Zur besseren Übersicht sind sie anhand ihres Verwendungszwecks eingeteilt. Tabelle 6: Auflistung der verwendeten Plasmide

Plasmid Rezipient Charakteristika Referenz Ausgangsplasmide

pGBKT7 Expressionsvektor zur Herstellung von Fusionsproteinen mit GAL4-Bindedomäne und cMYC-Tag für Y2H-Studien

Clontech, Heidelberg

pGAD7

Expressionsvektor zur Herstellung von Fusionsproteinen mit GAL4- Aktivierungsdomäne und HA-tag für Y2H-Studien

Clontech, Heidelberg

pG-Nat1 In vitro Transpositionsvektor (Dreyer et al. 2007)

pGADT7-Derivate für Interaktionsstudien

pA1CA pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit Q204L Mutation diese Arbeit

pA1CI pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit G203R Mutation diese Arbeit

pA1 pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 aus S. macrospora diese Arbeit

pA2 pGADT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa2 aus S. macrospora diese Arbeit

pA3 pGADT7 1,1 kb NdeI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa3 aus S. macrospora diese Arbeit

pGBKT7-Derivate für Interaktionsstudien

pBROG1 pGBKT7 3,8 kb NdeI/PstI cDNA-Volllänge von smrog1aus S. macrospora diese Arbeit


Plasmid Rezipient Charakteristika Referenz

pB1CA pGBKT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit Q204L Mutation diese Arbeit

pB1CI pGBKT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 mit G203R Mutation diese Arbeit

pB1 pGBKT7 1,1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 aus S. macrospora diese Arbeit

pBV34 pGBKT7 2,7 kb NdeI/PstI cDNA-Volllänge von smvps34 aus S. macrospora diese Arbeit

pBV34n pGBKT7 1 kb NdeI/EcoRI cDNA Fragment des N-Terminus (1-1014 bp) von smvps34 aus S. macrospora

diese Arbeit

pBV34c pGBKT7 1,7 kb EcoRI/PstI cDNA Fragment des C-Terminus (1015-2753 bp) von smvps34 aus S. macrospora

diese Arbeit

Komplementationsvektoren für Transformation in ∆gsa1/∆gsa2

pCA_nat pDCA

1 kb EcoRI/SmaI cDNA-Volllänge von gsa1 aus S. macrospora mit Q204L- Mutation, nat1 Resistenzgen mittels in vitro-Transposition durch pG-Nat1 eingebracht

diese Arbeit

pCI_nat pDCI

1 kb EcoRI/SmaI cDNA Fragment des gsa1-Gens aus S. macrospora mit G203R- Mutation, nat1 Resistenzgen mittels in vitro-Transposition durch pG-Nat1 eingebracht

diese Arbeit

Überexpressionsstudien in E.coli

pSG3-3 E. coli-Überexpressionsvektor, mit cDNA-Volllänge von gsa1, C-terminaler StrEP-tag-Sequenz,

diese Arbeit

1.3. Verwendete Starteroligonukleotide Nachfolgend zeigt Tabelle 7 alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide aufgelistet. Die für Klonierungen relevanten Schnittstellen sind unterstrichen dargestellt. Zur Ausgangssequenz veränderte Basen, die für eine direkte Mutagenese eingesetzt wurden, sind durch fettgedruckte kleine Buchstaben gekennzeichnet. Die Synthese der Oligonukleotide erfolgte durch die Firmen Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) und Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland).


Tabelle 7: Verwendete Oligonukleotide

Oligonukleotid Sequenz (5' - 3') Spezifität

gsa1_f GAATTCATGGGTTGCGGAATGAGTAC gsa1 (1-20 nt)

gsa1_r CCCGGGTCAGATCAAACCGCAGAGA gsa1( 1062-1044 nt)

gsa2_f GAATTCATGTGTTTCGGGGGTCGTGG gsa2 (1-20 nt)

gsa2_r CCCGGGTTACAGGATAAGTTGTTTGA gsa2 (1068-1049 nt)

gsa3_f CATATGGGCGCATGCATGAGCACG gsa3 (1-21 nt)

gsa3_r CCCGGGTCAGATTCCGGAGTCTTTAAG gsa3 (1068-1048 nt)

q204l_f CGACGTCGGTGGACtGCGTAGCG gsa1 (597-619 nt) Q204L-Mutation

g203r_f CGACGTCGGTcGACAGCGTAGCG gsa1 (597-619 nt) G203R-Mutation

h1m1_f CATATGGCTCTTCGAGGGAGAG Smrog1 (1-19 nt)

h1m1_r CGAGGCGACGCAAGTAAACC Smrog1 (1129-1110 nt)

h2m1_f GCAGGAGAATGTCGACCAGG Smrog1 (1092-1111 nt)

h2m1_r CTGCAGTTACGCCTCTGGCTGCTGC Smrog1 (3789-3771 nt) 1.4. Chemikalien Acrylamid (AppliChem), Agar-Agar (Kobe), Agarose (Lonza), Ameisensäure (Riedel de Haën), Ammoniumsulfat (Baker), Ampicillin hydrochlorid (Serva), APS = Ammoniumperoxidsulfat (Baker), Bactotrypton (Difco), „Bacto“ Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids (Difco), β-Mercaptoethanol (Roth), Biomalz (Dachser), Borsäure (AppliCem), Bromphenolblau (Merck), Bradford-Reagens (Biorad), BSA = Rinderserumalbumin (Serva), Calciumchlorid (Riedel de Haën), Chloroform (VWR-International), Coomassie Brilliant Blue R 250 (Serva), D(+)-Glucose-Monohydrat (AppliChem), Desoxynukleosid-5’-Trisphosphate (Roth), DTT = Dithiothreitol (AppliChem), EDTA = Ethylendianitrilotetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat (Boehringer), Essigsäure (Riedel de Haën), Ethanol (VWR-International), Ethidiumbromid (AppliChem), Formaldehyd (VWR International), Formamid (VWR Interantional), Gene Ruler DNA Ladder Mix (Fermentas), Glycin (Riedel de Haën), Glycerin (Riedel de Haën), Hefeextrakt (Difco), Hygromycin B (Calbiochem), Isopropanol (VWR International), Isoamylalkohol (Riedel de Haën), IPTG = Isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranosid (Roth), Kaliumchlorid (Riedel de Haën) Kanamycin (AppliChem), Maismehl (Mühle Levers, Bochum), Methanol (VWR International), Natriumhydrogencarbonat (Roth), Natriumchlorid (VWR International), Natriumhydroxid (Baker), Natriumacetat (Baker), Nourseothricin (WERNER BioAgents), ONPG = 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (AppliChem), PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas), PEG 6000 = Polyethylenglykol 6000 (Fluka), Phenol (Baker), PVDF Western Blotting Membranes (Roche), Röntgenfilme (Fuji Medical X-Ray-Film), Saccharose (Baker), Salzsäure (VWR


International), Sterilfilter (Milipor), SDS = Natriumdodecylsulfat (AppliChem), Serva Agar (Serva), TEMED = N, N, N’, N’,-Tetramethylethylendiamin (Merck), Tetrazyklin (Serva), Tris = Tris(hydroxylmethyl)-aminomethan (AppliChem), Triton X (Roche), Trypton (Roth), Tween®20 = Polyoxyethylenesorbitanmonolaurate (Serva), X-Gal = 5-Bromo-5-chloro-3-indoyl-beta-D-galactopyranosid (AppliChem) Radiochemikalien: [α32P]-dCTP, Aktivität 110 TBq/mmol (Hartmann Analytik) Feinchemikalien, die nicht angegeben sind, wurden in Analyse-Qualität verwendet und von den oben aufgelisteten Firmen erworben. 1.5. Enzyme DNase A (Fermentas), Glucanex 200G (Novozymes), Go-Taq-Polymerase (Promega), Klenow Polymerase (Promega), Phusion Polymerase (Finnzymes), verschiedene Restriktionsendonukleasen Typ II (Fermentas, Roche, New England Biolabs), RNase A (Fermentas), Superscript II Reverse Transkriptase (Invitrogen), T4 DNA-Ligase (Roche) 1.6. Antikörper c-Myc Monoklonaler Antikörper (1:3000) (Clontech), HA-Antikörper (1:200) (Santa Cruz), anti-Maus IgG Peroxidase gekoppelter Antikörper (1:3000) (Cell Signaling Technology), anti-Kaninchen IgG Peroxidase gekoppelter Antikörper (1:3000) (Cell Signaling Technology) 1.7. Kits DECAprime™ II Kit (Ambion), DNase A (Fermentas), E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I (Omega), GTPase assay kit (high sensitivity) (Innova Biosciences), In-Fusion® Advantage PCR Cloning Kit (Clontech), Nucleobond® AX (Macherey & Nagel), Nucleo-Spin Extract II (Macherey & Nagel), PCR-Cloning Kit (Qiagen), Yeast Buster Kit (Novagen) 1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen Tabelle 8 zeigt die in dieser Arbeit häufig verwendeten Puffer und Lösungen.


Tabelle 8: Verwendete Puffer und Lösungen

Puffer Zusammensetzung Blocking-Lösung 5 % Magermilchpulver in PBS-T Puffer Blotpuffer (10x) 3 % Tris

14,41 % Glycin 0,2 % SDS

PBSKMT-Puffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 100 mM NaCl 5 mM EDTA 10 % (v/v) Glycerol 0,1 % (v/v) Triton X-100

Coomassie Färbelösung 0,2 % (w/v) Coomassie 7 % (v/v) Eisessig 50 % (v/v) Methanol

Elektrophorese-Puffer (10x) 3 % Tris 18,8 % Glycin 1 % SDS

Elutionspuffer für Streptag- Aufreinigung

Puffer W + 2,5 mM Desthiobiotin

Lysepuffer für Inclusion body- Aufreinigung

50 mM Tris-HCl, pH 8,0 100 mM NaCl 5 mM EDTA

Protoplasten Puffer 13 mM Na2HPO4 x 2 H2O

45 mM KH2PO4 600 mM KCl pH 6,0

Refolding Puffer für Inclusion body-Aufreinigung

50 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,4 M L-Arginin 1 µg/ml Leupeptin und Pepstatin 0,2 mM PMSF 0,5 mM GSSG Glutathion oxidiert 5 mM GSSH Glutathion reduziert

Regenerationspuffer für Streptag-Aufreinigung (Puffer R)

Puffer W + 1 mM HABA

Sammelgelpuffer (4x) 0,5 mM Tris/HCl 0,1 % (w/v) SDS pH 6,8


STET-Puffer 50 mM EDTA 10 mM Tris 8 % Sucrose 0,5 % Triton X-100 pH 8,0

TBE Puffer 100 mM Tris/HCl 100 mM Borsäure 2 mM EDTA, pH 8,3

Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris/HCl 0,1 % (w/v) SDS pH 8,8

Tris-Glycin-Urea-Puffer 100 mM Tris/HCl, pH 8,0 50 mM Glycin 8 M Urea

Waschpuffer für Streptag- Aufreinigung (Puffer W)

100 mM Tris-HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 1 mM EDTA 1mM PMSF

1.9. Nährmedien Escherichia coli Luria Bertani (LB)- Medium

1 % (w/v) Bacto-Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) NaCl, pH 7,2 Transformanten wurden durch Selektion auf Ampicillin oder (60 µg/ml), Kanamycin (30 µg/ml), isoliert, Festmedien mit 1,5 % (w/v) Agar-Agar; „Blau-Weiß-Selektion“ nach Zugabe von 0,004 % X-Gal sowie 0,2 mM IPTG (Ausubel et al. 1995; Ullmann et al. 1967)

SOB-Medium 2 % (w/v) Bacto Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, pH 7,5

SOC-Medium SOB-Medium + 20 mM Glukose


Saccharomyces cerevisiae SD-Medium

0,67 % Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 2 % Glukose, 10 % Aminosäure-Stocklösung (10x) pH 5,8

YEPD-Medium 1 % (w/v) Hefeextrakt, 2 % (w/v) Trypton, 2 % (w/v) Glukose, pH 5,8

YPDA-Medium YEPD + 0,003 % (w/v) Adeninhemisulfat Sordaria macrospora

BMM

0,8 % Biomalz in Maisextrakt, pH 6,5 Festmedien mit 1,5 % (w/v) Agar-Agar, Transformanten wurden durch Selektion auf Hygromycin B (80 U/ml), Nourseothricin (50 µg/ml) isoliert, Keimung von Einzelsporisolaten mit 0,5 % (w/v) NaAc

CM 0,15 % (w/v) KH2PO4, 0,05 % (w/v) KCl 0,05 % (w/v) MgSO4 0,37 % (w/v) NH4Cl 1 % (w/v) Glukose 0,2 % (w/v) Trypton 0,2 % (w/v) Hefeextrakt Spurenelemente pH 6,5

CMS CM-Medium + 10,8 % (w/v) Saccharose 2 % (w/v) Agar-Agar; Transformanten wurden nach Überschichtung mit NaCl Topagar (0,8 M NaCl, 0,8 % (w/v) Agar, 80 U/ml Hygromycin B, Nourseothricin (50 µg/ml)) isoliert.

1.10. Software Sequenzierungen wurden mit dem Programm „Sequence Scanner“ (Applied Biosystems) bearbeitet. Das Programm „Clone-Manager 9“ wurde innerhalb dieser Arbeit zur Ausarbeitung von Klonierungsstrategien und Sequenzvergleichen verwendet (SciEd Software). Für Bildbearbeitungen wurde die „Adobe Creative Suite 4“ von Adobe Systems Incorporated verwendet und Textverarbeitungen, Präsentationen und Tabellenkalkulationen wurden mittels Microsoft Office 2007 angefertigt. Als Geldokumentationssoftware wurde BioDoc-Analyze von Biometra verwendet.


2. Methoden

Alle Standardmethoden, die innerhalb des Kapitels nicht beschrieben wurden, sind nach Sambrook et al. (2001) durchgeführt worden. 2.1. Kulturbedingungen Escherichia coli E. coli-Bakterien wurden in LB-Flüssigkulturen über Nacht (ü.N.) bei 300 rpm und 37 °C sowie auf LB-Festmedium bei 37 °C ü.N. inkubiert. Sordaria macrospora Die Anzucht von S. macrospora erfolgte in Flüssigmedium (BMM oder CM) oder auf Festmedium (BMM oder CMS) bei 27 °C und Dauerlicht. Im Falle von Einzelsporisolaten wurden die Perithezien auf Präparationsagar (6 % Agar in H2O) geöffnet und die einzelnen Sporen aus den Asci isoliert. Diese Isolate wurden auf BMM-Platten mit 0,5 % NaAc überimpft und nach der Keimung zur Selektion auf BMM-Platten angezogen, die zusätzlich mit Hygromycin B, Nourseothricin oder mit beiden Antibiotika versetzt wurden. Saccharomyces cerevisiae Die Anzucht von S. cerevisiae erfolgte auf YEPD- und auf SD-Medium. Flüssigkulturen wurden bei 200 rpm und 30 °C über Nacht inkubiert. Bei Kulturen auf Festmedien (SD, YEPD) wurde eine Inkubation bei 30 °C über mehrere Tage gewählt. Transformanten wurden aufgrund einer erworbenen Prototrophie auf Selektionsmedien identifiziert. Auf die Expression der Reportergene ade2 und his3 wurde selektioniert, um Protein-Protein-Interaktionen im Hefe-2-Hybrid-System zu identifizieren. 2.2. Transformationsverfahren Escherichia coli Transformationen in E. coli wurden entweder in elektrokompetenten Zellen durch Elektroporation in einem Multiporator (Eppendorf) vorgenommen oder in chemischkompetenten Zellen mittels Hitzeschock durchgeführt (Dower et al. 1988; Hanahan 1983). Saccharomyces cerevisiae Bei S. cerevisiae wurde in dieser Arbeit die Transformation mittels Elektroporation durchgeführt, bei der ein Stromfluss von 1,5 kV in einem Multiporator (Eppendorf) verwendet wurde (Becker und Lundblad 2001).


Sordaria macrospora Der Hyphenpilz S. macrospora wurde über 2-3 Tage in Flüssigmedium angezogen. Die Transformation wurde mit der Protoplastierungsmethode verändert nach Skatrud et al. (1987) durchgeführt. Dazu wurde das Myzel abgenutscht und in einer Glucanex-Lösung (40 mg/ml) bis zu einer vollständigen Protoplastierung bei 27 °C inkubiert. Die gewonnenen Protoplasten wurden mit Hilfe einer Fritte (Porengröße 1, Schott) vom Myzel isoliert und nach mehrmaligen Waschschritten mit Protoplastenpuffer in Transformationspuffer aufgenommen. Dieses Volumen wurde je nach Gebrauch aliquotiert und 20 µg DNA dazugegeben. Es folgte ein 10-minütiger Inkubationsschritt auf Eis, wonach die Zellen mit 200 µl PEG 6000 vermischt wurden. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 20 Minuten (min) bei RT wurden die Protoplasten auf CMS-Medium ausgestrichen. Die Selektion erfolgte nach einem Tag Inkubation bei 27 °C durch das Überschichten der CMS-Platten mit einem NaCl-Topagar, der die Antibiotika Hygromycin B und/oder Nourseothricin beinhaltete. 2.3. Isolierung von Nukleinsäuren 2.3.1. Plasmid-DNA-Isolierung aus E. coli Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte anhand eines modifizierten Protokolls nach Holmes und Quigley (1981). Darüber hinaus wurde für Aufarbeitungen im Mini-Maßstab das E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I (Omega) und für Maxi-Präparationen das Nucleobond®AX Kit (Macherey & Nagel) verwendet. Diese Kits wurden nach den Vorgaben der Hersteller verwendet. 2.3.2. Plasmid-DNA-Isolierung aus S. cerevisiae Das E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I (Omega) wurde in modifizierter Ausführung ebenfalls für die Isolierung von Plasmid-DNA aus S. cerevisiae verwendet. Dazu wurde eine 20 ml Flüssigkultur über Nacht bei 30 °C inkubiert und bei 12000 rpm und 4 °C geerntet. Die Lyse der Zellen erfolgte mittels S1-Puffer (mit RNase) und 250 µl Glasperlen (0,25 mm). Anschließendes Vortexen unterstützte eine vollständige Lyse und Resuspendierung der Zellen. Die nachfolgenden Schritte wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 2.4. Gesamt-DNA-Isolierung aus S. macrospora Bei S. macrospora wurde genomische DNA mittels eines abgeleiteten Protokolls nach Lecellier und Silar (1994) isoliert. Dabei wurde als erstes das Myzel nach Anzucht in CM-Medium geerntet und mit Lysepuffer versetzt. Anschließend wurden die Zellen abwechselnd gevortext, in flüssigen Stickstoff eingefroren und bei 70 °C wieder aufgetaut, um die Lyse der Zellen zu gewährleisten. Danach wurde der Ansatz pelletiert und durch eine Phenol-Chloroform-Behandlung extrahiert. Die Fällung wurde durch Zugabe von Isopropanol durchgeführt. Die isolierte DNA wurde für 3-4 Stunden (h) getrocknet und in 30 µl A. dest aufgenommen.


2.5. Gelelektrophoretische Auftrennungsverfahren Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten wurde bei einer Spannung von 5-15 V/cm in horizontalen Gelelektrophoreseapparaturen der Firma Eurogentec, Gibco oder Biorad durchgeführt. Bei Mupid-Kammern wurde 0,5x TBE-Puffer sowie bei Gibco-Kammern und Biorad-Subcell-Systemen 1x TBE-Puffer als Elektrophorese-Puffer verwendet. Weiterhin wurde ein parallel mitlaufender DNA-Marker (Gene-Ruler, DNA-Ladder Mix, MBI Fermentas) als Größenstandard mitgeführt. Die genaue Detektion der einzeln aufgetrennten DNA-Fragmente erfolgte nach Behandlung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht mittels BioDoc-Analyze von Biometra. 2.6. DNA-Isolierung aus Agarosegelen Die durch Gelelektrophorese aufgetrennte DNA wurde mit dem Kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel GmbH & CoKG, Düren) isoliert. Dabei wurde sich an die Angaben des Herstellers gehalten. Dieses Kit wurde ebenfalls für die Aufreinigung von Amplifikaten aus PCR-Reaktionen verwendet. Auch hier wurde den Angaben des Herstellers Folge geleistet. 2.7. DNA-Sequenzierung und Oligonukleotidsynthese Die Synthese von Oligonukleotiden und die Sequenzierung von DNA wurden von der Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) und vom Sequenzierservice des Lehrstuhls für Neurobiochemie an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt. 2.7.1. Radioaktive Markierung von DNA

Die radioaktive Markierung von immobilisierter DNA erfolgte immer mit dem Phosphorisotop 32P und wurde anhand des DECAprime™ II Kits (Ambion) und den Herstellerangaben Folge leistend durchgeführt. Durch Dextranblau-Lösung wurde die Reaktion terminiert und nicht gebundene radioaktiv markierte Nukleotide mittels Sephadex G50-Säulen vom Ansatz getrennt. 2.8. Southern-Blot-Hybridisierungen Innerhalb dieser Arbeit wurden Southern-Blot-Hybridisierungen sowohl von genomischer DNA aus S. macrospora als auch von PCR-Fragmenten aus S. cerevisiae mit Hilfe von radioaktiv markierter DNA (Kap. 2.7.1.) durchgeführt. Genomische DNA von S. macrospora wurde mittels geeigneter Restriktionsendonuklasen hydrolisiert und wie unter 2.5. beschrieben, gelelektrophoretisch aufgetrennt, bevor der Transfer auf die Nylonmembran vollzogen wurde. PCR-Fragmente aus S. cerevisiae wurden ebenfalls mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, bevor ihre DNA auf eine Nylonmembran übertragen wurde (verändert nach Southern 1975). Dazu wurde das Gel zuerst für 30 min in


Denaturierungspuffer und danach für weitere 30 min in Neutralisierungspuffer geschwenkt. Durch Anwendung eines Kapillarblots, der in 20x SSPE-Puffer getränkt vorlag, wurde die DNA auf die Nylonmembran übertragen. Eine anschließende Quervernetzung mit der Membran erfolgte im UV-Stratalinker™ 1800 (Stratagene, Modus „AUTO“) mittels UV-Licht. Die darauf folgende Vorhybridisierung wurde für mindestens 1 h bei 37 °C im Hybridisierungspuffer (50 % Formamid, 5x SSPE, 0,2 % SDS, 5x Denhardt’s, 200 µg/ml Heringssperma-DNA) durchgeführt. Zu diesem Ansatz wurde anschließend das 32P-markierte DNA-Fragment (Sonde) hinzugegeben, nachdem diese im Vorfeld für 5 min bei 100 °C denaturiert wurde. Danach wurde der Ansatz ü.N. bei 37 °C inkubiert und unspezifische Bindungen der Sonde wurden mittels Waschpuffer (5x SSPE, 0,2 % SDS) bei Temperaturen zwischen 55 °C und 70 °C abgewaschen. Die Signale wurden nach einer Expositionzeit von 2-3 Tagen durch Autoradiografie detektiert. 2.9. cDNA Synthese mittels reverser Transkriptase Die Herstellung von cDNA wurde nach Nowrousian und Cebula (2005) durchgeführt. Dabei wurde DNA-freie RNA als Template verwendet, welche durch DNase I-Behandlung einer Gesamtnukleinsäurelösung gewonnen wurde. Als Enzym wurde die „Superscript II Reverse Transkriptase“ von Invitrogen verwendet, wobei sich an die Angaben des Herstellers gehalten wurde. Die Aufreinigung der Ansätze erfolgte über Amicon YM-30-Säulen von Milipore. Nach anschließendem Trocknen der Proben wurden sie in 20 µl A. dest aufgenommen. 2.10. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bei jedem PCR-Ansatz wurde je nach Taq-Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers verfahren. Die Go-Taq-(Promega) oder die Phusion-Polymerase (Finnzymes) wurden verwendet. Dem Standard-PCR-Ansatz wurde neben der Template-DNA und der Taq-Polymerase, 10x PCR-Puffer, Starteroligonukleotide und dNTPs zugegeben und auf ein Volumen zwischen 25 und 50 µl mit A. dest aufgefüllt. Das Standard-Programm beinhaltete den ersten Denaturierungschritt von 2 min bei 94 °C, auf den eine 40-fache Wiederholung der einzelnen Denaturierungs-, Hybridisierungs- und Elongations-Schritte folgte. Die Parameter der einzelnen Schritte variierten je nach Schmelztemperatur der Oligonukleotide und der Länge des Amplifikats. Es wurden als PCR-Gerät MyCycler (Biorad) oder „GeneAmp PCR System 9700“ (Applied Biosystems) verwendet. 2.11. Gesamtproteinextraktion aus S. cerevisiae Kulturen der Bäckerhefe S. cerevisiae wurden bei einer OD600 von 0,8 – 1,0 geerntet. Nach Sedimentierung des Ansatzes wurden die Zellen gewaschen und mittels Stickstoff eingefroren. Das Pellet wurde danach auf Eis in äquivalentem Volumen PBSKMT-Puffer (zzgl. Proteaseinhibitoren 0,5 µl/ml Leupeptin und Pepstatin) resuspendiert. Zur Lyse der Zellen wurde das gleiche Volumen an Glasperlen hinzugegeben und der Ansatz 5 Zyklen lang, 3 min mit jeweils 1 min Pause, auf Eis gevortext. Der aus der folgenden Zentrifugation (10 min, 13000 rpm, 4 °C) gewonnene Überstand enthielt die


Gesamtproteinfraktion aus S. cerevisiae und wurde für weitere Untersuchungen wie beispielsweise die Ko-Immunopräzipitation verwendet. 2.12. Proteinbiochemische Verfahren 2.12.1. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Um Proteine innerhalb einer Gelelektrophorese nach ihrer molekularen Größe aufzutrennen, wurde eine SDS-PAGE durchgeführt. Die Sekundär- und Tertiärstruktur der Proteine wurde egalisiert, indem die Ansätze in der Probenvorbereitung mit einem Überschuss an SDS bei 95 °C für 10 min denaturiert wurden. Die nachfolgend durchgeführte diskontinuierliche Elektrophorese nach Laemmli (1970) verhinderte die Aggregation der Proteine beim Eintritt in das Gel durch Trennung der Gelmatrix in zwei Bereiche mit unterschiedlicher Zusammensetzung und pH-Bereichen (Davis 1964; Ornstein 1964). Die SDS-PAGE wurde bei konstanten 40 mA durchgeführt. Als Größenreferenz wurde der PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas) verwendet. Das SDS-Gel diente weiterführenden Western-Blot Analysen oder wurde mit Coomassie-Blau-Färbelösung für 20 min gefärbt und mit 10 % Essigsäure entfärbt. 2.12.2. Immunologischer Nachweis von Proteinen (Western Blot-Analyse) Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Western Blot-Analysen wurden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine aus der Polyacrylamidmatrix auf eine PVDF-Membran übertragen (Renart et al. 1979; Towbin et al. 1979). Der Blotvorgang wurde mit einer Wetblot Apparatur (Biorad) für 1 h bei konstanten 100 V oder ü.N. bei konstanten 30 V durchgeführt. Anschließend wurde die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit Blocking-Lösung inkubiert. Darauf folgte in Abhängigkeit des verwendeten Antikörpers eine spezifische Proteinmarkierung, die entsprechend nach den jeweiligen Angaben des Herstellers durchgeführt wurde. Die abschließende Detektion der Proteine wurde mit Hilfe des BM Chemiluminescence Western Blotting Kit (Roche) und durch Exposition spezieller Röntgenfilme (Fujifilm Super RX) durchgeführt. 2.13. Interaktionsstudien 2.13.1. β-Galaktosidase-Tests: ONPG und Filter-LacZ-Test Um eine Protein-Protein-Interaktionen im Hefe-2-Hybrid-System identifizieren zu können, wurde in dieser Arbeit sowohl ein quantitativer LacZ-Test mit O-nitrophenyl-β-D-galaktosid (ONPG) als auch ein qualitativer Filter-LacZ-Test mit X-Gal durchgeführt (Rose und Botstein 1983). Durch die Interaktion zweier Fusionsproteine wird das Reportergen lacZ exprimiert, wodurch das Enzym β-Galaktosidase gebildet wird, welches entweder das farblose ONPG in das gelb gefärbte Reaktionsprodukt O-Nitrophenol (ONP) und Galaktose spaltet oder innerhalb des Filter-LacZ-Test das im Puffer verwendete 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) in Galaktose und ein Nebenprodukt spaltet, das zum blauen Farbstoff 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo oxidiert. Der Umsatz des gebildeten ONP kann anhand einer photometrischen Messung quantitativ


bestimmt werden. Dafür wurden die S. cerevisiae-Kulturen über Nacht bei 30 °C in 20 ml SD-Flüssigmedium angezogen und bei einer OD600 = 1,6 geerntet (Rose und Botstein 1983). Die Kulturen wurden pelletiert und in 400 µl 250 mM Tris, 20 µl PMSF und 0,3 g Glasperlen resuspendiert. Zum Aufschluss der Zellen wurden sie 2 min gevortext, pelletiert und der Überstand weiter verwendet. Es wurden für eine Proteinbestimmung nach Bradford 5 µl der Proteinprobe eingesetzt und 100 µl der Proteinprobe mit 900µl LacZ-Puffer (+27 µl/10 ml β-Mercaptoethanol) für den eigentlichen ONPG-Test gemischt. Beim ONPG-Test und der Bradford-Bestimmung wurden drei Ansätze pro Probe gemessen. Im ONPG-Test wurde den Ansätzen nach 5 min Inkubationszeit bei 28 °C in einem Thermomixer (Eppendorf) ONPG zugegeben und weiter inkubiert, bis sich eine deutliche Gelbfärbung der Proben ergab. Die Reaktion wurde mit 1 M Na2CO3 gestoppt. Danach folgte die quantitative photometrische Messung bei OD417. Die Formel anhand derer die β-Galaktosidase-Aktivität, die zur Quantifizierung der Protein-Protein-Interaktion genutzt wurde, berechnet wird, lautet: U/mG-Protein = OD417*1,7/(0,0047*t*mG-Protein*0,001). Dabei gilt: OD417=0,0047≙1 nmol/ml ONP, Probenvolumen ist 1,7 und (t) ist Zeit in min. Für den Filter-LacZ-Test werden Hefekulturen von einer Platte auf einen sterilen Filter überimpft und durch Stickstoff lysiert. Danach werden die Filter in LacZ-Puffer für 2-5 h bei 27 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Inkubation für 30 min bei 60 °C gestoppt. Hefezellen, mit einer Protein-Protein-Interaktion zweier Fusionsproteine, können anhand einer Blaufärbung identifiziert werden. 2.13.2. Ko-Immunopräzipitation in S. cerevisiae Nach der unter 2.11. beschriebenen Gesamtproteinextraktion aus S. cerevisiae wurde die Proteinlösung mit c-MYC Antikörper konjugierten „beads“ (Clontech) für 2 h bei 4 °C rotierend inkubiert. Nach mehrmaligen Waschschritten mit PBSKMT-Puffer (1 ml PBSKMT-Puffer, 2000 rpm, 5 min) wurden die „beads“ mit Laemmli-Probenpuffer versetzt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western Blot-Analysen und dem jeweiligen Antikörper (c-MYC- bzw. HA-Antikörper) detektiert. c-MYC-Antikörper wurde 1:3000 und HA-Antikörper 1:200 verdünnt. Die entsprechenden Zweitantikörper wurden 1:3000 verdünnt. 2.14. Aufreinigung von Fusionsproteinen in E. coli aus „Inclusion bodies“ E. coli-Zellen wurden in einer 5 ml-LB-Vorkultur ü.N. angezogen und dienten der Anzucht einer entsprechenden Hauptkultur am darauffolgenden Tag. Diese wurde bei einer OD600= 0,4 - 0,6 mit 200 ng Anhydrotetrazyklin induziert und über einen Zeitraum von 3 h inkubiert. Die Zellen wurden anschließend pelletiert, mit Stickstoff eingefroren und bei -70 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Das Pellet wurde in einem äquivalenten Volumen Lysepuffer (zzgl. 0,5 % (v/v) Triton X-100; 0,1 mM PMSF; 1 mM DTT) resuspendiert und per Ultraschall (6 x 30 sec; 30 sec Pause auf Eis) aufgeschlossen. Es folgte eine Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur nach Zugabe von 10 mM MgSO4 mit anschließender Pelletierung des Ansatzes. Es folgten mehrere Zyklen aus Ultraschall- und Zentrifugationsschritten mit einer abschließenden denaturierenden Harnstoffbehandlung (Tris-Glycin-Urea-Puffer) für 2 h bei 4 °C. Nach erneuter Pelletierung des Ansatzes wurden die aus den „Inclusion bodies“ freigelösten Proteine im Überstand zur Renaturierung tröpfchenweise in Puffer R gegeben und ü.N. bei 4 °C inkubiert. Die Aufreinigung des Strep tag-Fusionproteins wurde über die Strep-Tactin®


Superflow® Säule durchgeführt. Nach Äquilibrierung des Säulenmaterials mit Puffer W (6-fache Menge des Säulenmaterials) wurde der Ansatz im Refolding Puffer auf die Strep-Tactin® Superflow® Säule gegeben. Nach mehrmaligem Waschen mit Puffer W (6-fache Menge des Säulenmaterials) wurde mit Puffer E (6-fachen Menge des Säulenmaterials) eluiert. Von jedem Schritt wurden Aliquots zur Überprüfung der Aufreinigung genommen. Die Proteinkonzentration der einzelnen Elutionen wurde mittels Bradford-Messung bestimmt und ausgewertet. Die eluierten Proteine wurden bis zur weiteren Verwendung bei -70 °C gelagert. 2.15. Messung der GTPase Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora Bei der Messung der GTPase-Aktivität wurden die aus „Inclusion bodies“ aufgereinigten GSA1-Proteine eingesetzt. Es wurde das Kit „GTPase assay kit (high Sensitivity)“ von Innova Biosciences nach Angaben des Herstellers verwendet. Die Messung erfolgte photometrisch bei einer Wellenlänge von 635 nm. Die gemessene GTPase-Aktivität wurde anhand einer vorher durchgeführten Eichgerade aus freiem Phosphat Pi, das in Lösung übergeht, ermittelt. 2.16. Bioinformatorische Methoden Reverse komplementäre Sequenzen wurden durch Verwendung des Programms „Reverse Complement“ auf der Internetseite http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html hergestellt. Sequenzvergleiche wurden stets mit dem Programm „LALIGN“ auf der Internetseite http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html durchgeführt (Huang und Miller 1991; Pearson 2000). Multiple Alignments wurden durch das Programm „ClustalW“ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ errechnet (Chenna et al. 2003) und mit „GeneDoc“ auf http://www.psc.edu/biomed/genedoc weiterverarbeitet (Nicholas et al. 1997). Lokale Alignments wurden mit BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool) unter http://0-www.ncbi.nlm.nih.gov.library.vu.edu.au/BLAST/ angefertigt (Altschul et al. 1990). Zur Bestimmung der Schmelztemperatur von Starteroligonukleotiden wurde die Internetseite http://www.iit-biotech.de/iit-cgi/oligo-tm.pl verwendet. Bei Analysen im Kontext der Proteinanalytik wurde der Expasy Proteomics Server unter http://expasy.org/ und den darauf angebotenen Programmen verwendet (Gasteiger et al. 2003). 2.17. Sicherheitsbestimmungen Gentechnische Experimente der Sicherheitsstufe SI wurden nach den Richtlinien des Gentechnikgesetzes (GenTG) vom 16.12.1993 (zuletzt geändert durch das zweite Gesetz zur Änderung des Gentechnikgesetzes vom 16.08.2002) durchgeführt.

IV Ergebnisse 39

IV Ergebnisse

1. Herstellung konstitutiver GSA1-Varianten aus Sordaria macrospora Einen zentralen Punkt dieser Arbeit stellte die Herstellung konstitutiver Varianten der

Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora mittels direkter Mutagenese des Gens gsa1 dar.

Die dabei enstandenen konstitutiv aktiven und dominant negativen GSA1-Formen wurden

als Beute innerhalb eines Hefe-2-Hybrid-Systems eingesetzt, um vom Aktivierungsstatus

der Gα-Untereinheit abhängige Interaktionspartner identifizieren zu können. Weiterhin

wurden sie für die Komplementation der ∆gsa1/∆gsa2-Mutante verwendet, um einen

Einfluss des Gα-Aktivitätszustandes auf die Entwicklung von S. macrospora zu

untersuchen. Im Folgenden wird die Herstellung der konstitutiven GSA1-Formen

beschrieben, bei der die Aminosäuren innerhalb der hochkonservierten Switch II-Region

verändert wurden (Abbildung 3, rot umrandet), die durch publizierte Beispiele bekannt

waren (Freissmuth und Gilman 1989; Yu et al. 1996). Die Switch II-Region ist anhand des

Sequenzvergleichs in Abbildung 3 dargestellt, bei dem Aminosäuresequenzen von

Gα-Vertretern aus H. sapiens (Go, Gi, Gz, Gs, Gq, G13), der Hefe S. cerevisiae (GPA1), der

Pflanze Arabidopsis thaliana (Arab1) und der beiden Hyphenpilze N. crassa (GNA1) und

S. macrospora (GSA1) verglichen werden.

Abbildung 3: Sequenzvergleich der Switch II-Region von Gα-Untereinheiten verschiedener Spezies sowie der hergestellten konstitutiven GSA1-Formen (GSA1_CA, GSA1_CI) aus S. macrospora. Schwarz dargestellte Aminosäuren sind in allen 12 Sequenzen und grau dargestellte Aminosäuren in mindestens 9 Sequenzen identisch. Es wurden Gα-Sequenzen aus S. macrospora (GSA1, (gi|193227759|)), N. crassa (GNA1, (gi|1698500|)), S. cerevisiae (GPA1, (gi|6321792|)), H. sapiens (Gi (gi|33946324|), Go (gi|162461738|), Gz, (gi|4504051|), Gq (gi|40254462|), G13 (gi|24111250|), Gs (gi|4504047|)) und A. thaliana (Arab1, gi|15225278|) verwendet. Durchgeführte DNA-Modifikationen zur Herstellung konstitutiver GSA1-Formen sind rot umrandet dargestellt. GTP2 und GTP3: GTP-Bindedomänen, EBD1: Effektor-Bindedomäne.

IV Ergebnisse 40

Bei der konstitutiv aktiven GSA1-Form GSA1_CA und der dominant negativen

GSA1-Form GSA1_CI aus S. macrospora wurden im Sequenzvergleich in Abbildung 3 die

Aminosäuren 204 (rot) und 203 (grün) farbig hervorgehoben, da diese bei der Herstellung

der jeweiligen Variante durch Modifikationen auf DNA-Ebene verändert wurden. Bei der

Herstellung von GSA1_CA wurde in der gsa1-Sequenz durch Austausch von Adenin zu

Thymidin an Position 611 die betreffende Aminosäure 204 im Protein GSA1 von Glutamin

zu Leucin verändert. Diese Mutation resultiert laut zahlreicher Publikationen in einem

drastischen Rückgang der intrinsischen GTPase-Aktivität bei Gα-Untereinheiten

(Freissmuth und Gilman 1989; Graziano et al. 1989; Segers und Nuss 2003). Zur

Herstellung der GSA1_CI-Form wurde an Position 607 von gsa1 ein Guanin durch ein

Cytosin ausgetauscht, wodurch bei GSA1 im Zuge der Translation die Aminosäure 203,

Glycin, durch ein Arginin ersetzt wurde. Durch diese G203R-Modifikation wird die

Dissoziation der Gα-Untereinheit vom Gβγ-Dimer geblockt, so dass eine dominant

negative Gα-Form vorliegt (Coca et al. 2000; Fang und Dean 2000; Yu et al. 1996). Um

die jeweilige beschriebene Punktmutation in die Sequenz von gsa1 einzufügen wurde eine

direkte PCR-Mutagenese durchgeführt, deren Vorgehensweise in Abbildung 4 schematisch

dargestellt ist. Als Matrize diente das in dieser Arbeit klonierte Plasmid pB1, das die

komplette cDNA-Sequenz von gsa1 aufweist und für ein Fusionsprotein aus GSA1,

c-MYC-Tag und GAL4-Bindedomäne (BD) kodiert.

Abbildung 4: Herstellung konstitutiver GSA1-Formen aus S. macrospora mittels direkter Mutagenese. Dargestellt sind gsa1-Kopien vor der Insertion der Punktmutation im Plasmid pB1 (A) und nach der Modifikation mit den Sequenzen gsa1_ca und gsa1_ci, die jeweils für konstitutive GSA1-Formen kodieren (B). Graue Pfeile stellen Oligonukleotide dar, die zur Herstellung des modifizierten gsa1-Amplifikats (graues Liniensegment in pB1CA und pB1CI unter B) verwendet wurden. Ihre Sequenzen sind im Vergleich zur Ausgangssequenz unter dem Schema aufgelistet. Klonierungsrelevante Restriktionsschnittstellen (AatII und SmaI) sind unterstrichen dargestellt.

IV Ergebnisse 41

In Abbildung 4 wird das Gen gsa1 vor der durchgeführten Modifikation und nach

Integration der Punktmutationen innerhalb des Plasmids pB1 dargestellt. Durch

Verwendung des Plasmids pB1 als Matrize sowie der Oligonukleotidpaare q204l_f und

gsa1_r bzw. g203r_f und gsa1_r (graue Pfeile in Abb. 4) wurden mittels PCR 472 bp große

Fragmente des 3‘-Endes von gsa1 amplifiziert, in denen die jeweilige Punktmutation

(Q204L: A-T, G203: G-C) über die Oligonukleotide q204l_f bzw. g203r_f eingefügt

wurde. Weiterhin wurden über diese Oligonukleotide Erkennungssequenzen der

Restriktionsenzyme AatII und SmaI an das jeweilige Amplifikat gehängt. Aufgrund dieser

ebenfalls singulär im Plasmid pB1 vorkommenden Restriktionsschnittstellen, wurden sie

verwendet, um die nicht modifizierte Sequenz aus pB1 herauszuschneiden und das

jeweilige modifizierte Amplifikat (als graue Linie in Abb. 4 dargestellt) mit pB1 zu

ligieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden modifizierten gsa1-Sequenzen,

gsa1_ca (pB1CA) und gsa1_ci (pB1CI) erfolgreich ins Rückgrat von pB1 ligiert und zur

Bestätigung über Restriktionen und Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft.

Die Plasmide pB1CA und pB1CI kodieren jeweils für ein Fusionsprotein aus konstitutiv

aktivem GSA1_CA, c-MYC-Tag und GAL4-Bindedomäne (pB1CA) oder für ein

dementsprechendes Protein mit dominant negativem GSA1_CI (pB1CI). Die

Fusionsproteine, welche in pB1CA bzw. pB1CI kodiert vorliegen, wurden nachfolgend für

Komplementations- und Interaktionsstudien verwendet. Die in diesen Studien erzielten

Ergebnisse werden in den nächsten beiden Kapiteln beschrieben.

Mittels direkter Mutagenese wurden in der vorliegenden Arbeit mit GSA1_CA

(konstitutiv aktives GSA1 mit Q204L-Mutation) und GSA_CI (dominant negatives

GSA1 mit G203R-Mutation) zwei konstitutive Formen der Gα-Untereinheit GSA1

aus S. macrospora hergestellt.

IV Ergebnisse 42

2. Funktionsanalysen mit konstitutiv aktiven und dominant negativen

GSA1-Derivaten

2.1. Herstellung von Komplementationsstämmen Zur funktionellen Analyse der konstitutiven GSA1-Formen GSA1_CA und GSA1_CI

wurden die in dieser Arbeit hergestellten Plasmide pCA_nat und pCI_nat in die bereits

vorhandene Deletionsmutante ∆gsa1/∆gsa2 transformiert (Kamerewerd et al. 2008). Diese

Doppelmutante bot sich anhand ihres sterilen Phänotyps für die vorliegende funktionelle

Analyse der konstitutiven GSA1-Formen an, da diese Ausprägung durch gsa1 allein

komplementiert werden kann (Kamerewerd et al. 2008). Die Plasmide pCA_nat bzw.

pCI_nat kodieren neben den modifizierten gsa1-Sequenzen gsa1_ca bzw. gsa1_ci für das

Resistenzgen nat1, das Transformanten eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum

Nourseothricin verleiht. S. macrospora-Transformanten des Hygromycin-B resistenten

Stammes ∆gsa1/∆gsa2, mit ektopischer Integration des Plasmids pCA_nat bzw. pCI_nat

wurden demzufolge über eine Resistenz gegenüber Nourseothricin und Hygromycin B

identifiziert. Transformanten, die über mehrere Wochen eine Resistenz aufwiesen, werden

in der vorliegenden Arbeit als stabil bezeichnet. Demnach wurden in dieser Arbeit zwei

stabile pCA_nat- und drei stabile pCI_nat-Transformanten erzeugt und mittels Southern-

Analyse charakterisiert (Abb. 5). Bei der Southern-Hybridisierung wurde ein 472 bp

großes radioaktiv markiertes Amplifikat von gsa1 als Sonde eingesetzt.

Abbildung 5: Southern-Analyse von ∆gsa1/∆gsa2-Komplementationstransformanten. Für den Southern-Blot wurde ein 472 bp großes radioaktiv markiertes Amplifikat von gsa1 als Sonde verwendet, um ektopische Integrationen der gsa1-Sequenz im jeweiligen Stamm nachzuweisen. In den Spuren wurde genomische DNA von den Transformanten ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt (CA_1 und CA_3), ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt (CI_1, CI_7 und CI_11) sowie die des Rezipienten (∆gsa1/∆gsa2) und des Wildtyps von S. macrospora (WT) nach SacI-Verdau aufgetragen.

IV Ergebnisse 43

Die Ansätze unter Verwendung der genomischen DNA der stabilen

pCA_nat-Transformanten CA_1 und CA_3, auch ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt genannt, weisen

aufgrund einer einzelnen ektopischen Integration der gsa1_ca-Sequenz ein singuläres

Signal im Autoradiogramm auf. Bei den beiden pCI_nat-Transformanten, CI_7 und CI_11,

auch ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt genannt, wurde eine einzelne ektopische Integration der

gsa1_ci-Sequenz nachgewiesen. Die Transformante CI_1 ist dagegen eine „multicopy“-

Transformante und weist durch zahlreiche Integrationen der gsa1_ci-Sequenz mehrere

Signale im Autoradiogramm auf. Als Kontrollen wurden zwei Ansätze genomischer DNA

des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 und ein Ansatz des Wildtyps von S. macrospora verwendet.

Beim Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 wurde erwartungsgemäß durch vorhandene Deletion der

beiden Gene gsa1 und gsa2 keine gsa1-Kopie nachgewiesen (Abb. 5). Der Wildtyp zeigt

ein schwaches Signal bei etwa 10000 bp, was auf die genomische gsa1-Kopie, die nach

SacI-Verdau der genomischen DNA auf einem 10384 bp großen Fragment liegt,

zurückzuführen ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwei stabile

∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt-Transformanten, CA_1 und CA_3, und drei stabile

∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt -Transformanten, CI_1, CI_7 und CI_11, in S. macrospora erzeugt

und nachfolgend in detaillierten Analysen in Hinblick auf die sexuelle und vegetative

Entwicklung untersucht wurden.

2.2. Charakterisierung des vegetativen Wachstums von Komplementationsstämmen

Nach erfolgreicher Transformation der modifizierten gsa1-Sequenzen in die

∆gsa1/∆gsa2-Mutante wurde das vegetative Wachstum der gsa1_ca-Transformanten CA_1

und CA_3 (konstitutiv aktives GSA1-Derivat) sowie der gsa1_ci-Transformanten CI_1,

CI_7 und CI_11 (dominant negative GSA1-Derivat) im Vergleich zum Wildtyp und dem

Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 in Rennrohrtests auf Vollmedium untersucht (Abb. 6). Für jeden

untersuchten Stamm wurden die zurückgelegte Strecke pro Tag sowie die Gesamtstrecke

nach acht Tagen gemessen und für das in Abbildung 6 dargestellte Liniendiagramm

verwendet. In den nachfolgenden Beschreibungen werden Daten der Transformanten

CA_3 und CI_7 stellvertretend für alle in dieser Arbeit hergestellten und untersuchten

Komplementationstransformanten verwendet, da die Daten übereinstimmend ausfielen.

IV Ergebnisse 44

Abbildung 6: Vegetatives Wachstum der erzeugten Transformanten CA_3 und CI_7 im Vergleich zum Wildtyp und ∆gsa1/∆gsa2. Das vegetative Wachstum der einzelnen Transformanten CA_3 und CI_7, des Wildtyps und des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 wurde auf Vollmedium in doppelten Ausführungen über eine Dauer von acht Tagen gemessen. Der jeweilige Mittelwert ist als Punkt innerhalb des Diagramms dargestellt. Die jeweilige Standardabweichung ist für jeden Punkt ermittelt worden und im Diagramm angegeben. Dabei wurden z.T. marginale Standardabweichungen ermittelt, so dass nicht in allen Punkten Abweichungen sichtbar sind.

Bei der in dieser Arbeit erstellten Transfomante CA_3 mit ektopischer Integration von

gsa1_ca wurde mit 23,4 cm der Wachstumsdefekt der Ausgangsmutante ∆gsa1/∆gsa2

(16,7 cm) behoben (Kamerewerd et al. 2008). Nach acht Tagen zeigte CA_3 damit ein

20 % stärkeres vegetatives Wachstum als der Wildtyp (19,2 cm). Im Gegensatz dazu

konnte bei der Transformante CI_7 nach Integration der gsa1_ci-Sequenz kein

signifikanter Unterschied im vegetativen Wachstum zum Rezipienten beschrieben werden,

da dieser Stamm mit 17,1 cm ein ähnliches Wachstum wie die ∆gsa1/∆gsa2-Mutante mit

16,7 cm aufwies. Ein weiterer Unterschied des vegetativen Wachstums zwischen CA- und

CI-Stämmen besteht darin, dass sich nach dem vierten Tag sowohl beim Stamm CA_3 als

auch beim Wildtyp die zurückgelegte Strecke pro Tag verringert, was anhand eines

„Knicks“ (Abb. 6, Pfeil) zu erkennen ist, der beim Stamm CI_7 und ∆gsa1/∆gsa2 nicht

nachzuweisen ist. Eine Erklärung dafür könnte die zu diesem Zeitpunkt einsetzende

sexuelle Entwicklung des Pilzes sein, die den Großteil der Energie verbraucht. Die sich

hier andeutende unterschiedliche Ausprägung in der sexuellen Entwicklung bei CA- und

CI-Stämmen wurde in dieser Arbeit untersucht und wird im Folgenden beschrieben.

IV Ergebnisse 45

2.3. Charakterisierung der sexuellen Entwicklung von Komplementationsstämmen

Die beiden Transformanten CA_3 und CI_7 wurden über einen Zeitraum von 16 Wochen

neben ihrem vegetativen Wachstum in Bezug auf ihre sexuelle Entwicklung untersucht.

Der Rezipient ∆gsa1/∆gsa2 besitzt einen sterilen Phänotyp. Dieser Stamm durchläuft die

sexuelle Entwicklung nur bis zum Stadium der Protoperithezien und bildet keine

Perithezien mehr aus. Vor diesem Hintergrund wurden die Transformanten CA_3 und

CI_7 auf Vollmedium angeimpft und ihre sexuelle Entwicklung, insbesondere ihre

Fruchtkörperbildung untersucht. Abbildung 7 stellt die ermittelten Phänotypen innerhalb

der sexuellen Entwicklung bei den drei untersuchten Stämmen CA_3, CI_7 und

∆gsa1/∆gsa2 gegenüber.

Abbildung 7: Charakterisierung der sexuellen Entwicklung bei den Komplementanten CA_3 und CI_7 im Vergleich zum Rezipienten. Abgebildet sind die Phänotypen während der sexuellen Entwicklung von CA_3, CI_7 und dem Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 in Bezug auf das Wachstum auf Vollmedium (A), ihrer Fruchtkörperbildung (B) und, sofern Perithezien und Ascosporen ausgebildet wurden in Bezug auf die Ascosporogenese (C). Der Maßstabbalken symbolisiert 100 µm.

IV Ergebnisse 46

Bei einer makroskopischen Beschreibung der Fruchtkörperbildung der Transformanten

CA_3, CI_7 und des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 wurde bei CA_3 bereits nach 5 Tagen eine

Bildung von Perithezien beobachtet, während die Transformante CI_7 und der Rezipient

nach 16 Wochen Protoperithezien, aber keine Perithezien ausbilden (Abb. 7A, B). Die

gebildeten Perithezien der CA_3-Transformante wurden isoliert, aufgebrochen und anhand

der Ascosporogenese untersucht. Dabei konnten Asci mit acht linear angeordneten, reifen

Ascosporen analog zum Wildtyp identifiziert werden (Abb. 7C). Diese Ascosporen wurden

wie beim Wildtyp nach ca. 8-10 Tagen aus den Perithezien herausgeschleudert und zeigten

eine wildtypische Keimungsaktivität (Daten nicht gezeigt). Demnach konnte nur bei

gsa1_ca-Transformanten durch Integration einer gsa1_ca-Sequenz (kodiert für konstitutiv

aktive GSA1-Form) eine vollständige Fertilität beobachtet werden, wohingegen der sterile

Phänotyp des Rezipienten ∆gsa1/∆gsa2 durch Integration von gsa1_ci nicht behoben

werden konnte. Tabelle 9 fasst abschließend die ermittelten Phänotypen der

Transformanten zusammen, von denen stellvertretend CA_3 und CI_7 an dieser Stelle

beschrieben wurden. Die Phänotypen sind repräsentativ für alle in Tabelle 9 aufgelisteten

und innerhalb dieser Arbeit erzeugten stabilen Transformanten.

Tabelle 9: Komplementationsstämme und deren sexuelle und vegetative Entwicklung

∆gsa1/∆gsa2:gsa1_ciekt (CI_7) ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt (CA_3) stabile

Transformanten 3 2

Effekt auf die veg. Entwicklung

analog zum Rezipienten: 10 % geringeres Wachstum

als der WT

Wiederherstellung des veg. Wachstumsdefekts:

>20 % mehr Wachstum als WT >30 % mehr als Rezipient

Effekt auf die sex. Entwicklung

steril, Bildung von Protoperithezien;

keine Perithezien nach 16 Wochen

fertil, Perithezien nach 5 Tagen;

wildtypische Ascosporogenese

Die kodierenden Sequenzen gsa1_ca und gsa1_ci konnten erfolgreich in die sterile

Mutante ∆gsa1/∆gsa2 integriert werden. Bei gsa1_ca-Transformanten wurde in

dieser Arbeit ein stärkeres vegetatives Wachstum als bei dem Wildtyp und eine

komplette Fertilität beobachtet. Bei den untersuchten gsa1_ci-Transformanten

konnten dagegen keine signifikanten Unterschiede in der sexuellen und vegetativen

Entwicklung zum Rezipienten beobachtet werden, was darauf hinweist, dass ein

inaktives GSA1 keine entscheidende Funktion in der Entwicklung des Pilzes spielt.

IV Ergebnisse 47

3. Interaktionsstudien mit GSA1-Varianten aus S. macrospora

3.1. Hefe-2-Hybrid-Analysen zur Identifikation von GSA1-Interaktionspartnern Zur Identifikation von GSA1 interagierenden Proteinen, die in Abhängigkeit vom

vorherrschenden Aktivitätszustand der Gα-Untereinheit an diese binden, wurde das

„Matchmaker™ cDNA library Kit“ (Clontech) verwendet und eine cDNA-Bank aus

S. macrospora nach Interaktionspartnern durchmustert. Die Vorgehensweise bei dieser

Methode wird in Abbildung 8A gezeigt. Für die Synthese der Köderproteine wurden die in

der vorliegenden Arbeit klonierten Plasmide pB1CA und pB1CI (siehe Kap. 2.1.)

verwendet. Das Plasmid pB1CA kodiert für ein 62 kDa großes Fusionsprotein aus der

konstitutiv aktiven GSA1-Form, GSA1_CA, in Fusion mit einem c-MYC-Tag und der

GAL4-Bindedomäne (BD). Analog dazu kodiert pB1CI für ein Fusionsprotein aus

dominant negativer GSA_CI-Form in Fusion mit der GAL4-BD und dem c-MYC-Tag.

Nach erfolgreicher Transformation in den Hefestamm Y187 (MATα) und Selektion auf

Tryptophan-Prototrophie wurde die Synthese der Köderproteine mittels Western-Blot

überprüft (Abb. 8B).

Abbildung 8: Methode des verwendeten Hefe-2-Hybrid-Systems und Nachweis der Köderproteine. Schematische Darstellung der Vorgehensweise des verwendeten Hehe-2-Hybrid_Systems (A) und Nachweis der Synthese der 62 kDa großen Köderproteine GSA1_CA und GSA1_CI mittels Western-Blot-Analyse (B).

IV Ergebnisse 48

Beide Fusionsproteine konnten in den entsprechenden Hefestämmen mit Hilfe eines

c-MYC-Antikörpers bei ~ 62 kDa detektiert werden. Dabei zeigt sich eine distinkte Bande

des jeweiligen Köderproteins im Western-Blot ohne einen Hinweis auf möglichen Abbau

der Proteine durch Proteaseaktivität aufzuzeigen (Abb. 8B). Durch den erfolgreichen

Nachweis der synthetisierten Fusionsproteine in der Hefe konnten sie als Köderproteine

innerhalb des Hefe-2-Hybrid-Systems eingesetzt werden.

Die Stämme Y187 + pB1CA sowie Y187 + pB1CI wurden anschließend gegen eine

cDNA-Bank aus S. macrospora im Hefestamm AH109 (MATa) gekreuzt, in der die

Beuteproteine auf Plasmiden kodiert vorlagen, die cDNA-Fragmente in Fusion mit einem

HA-Tag und der GAL4-Aktivierungsdomäne (AD) aufwiesen. Aus dieser Kreuzung sind

diploide Hefezellen hervorgegangen, in denen sowohl Köder- als auch Beuteplasmide

vorlagen. Durch diese Methode wurden in den durchgeführten Ansätzen mit GSA1_CA

bzw. GSA1_CI als Köderprotein, Kreuzungseffizienzen von 48 % erreicht, so dass 4 x 107-

(GSA1_CA-Ansatz) bzw. 5 x 107-Zellen (GSA1_CI-Ansatz) nach Interaktionspartnern von

GSA1 durchmustert werden konnten. Nach Kreuzung der Stämme wurden die Ansätze auf

Mangelmedien ohne Adenin und Histidin ausgestrichen, um auf Transformanten zu

selektionieren, bei denen durch Expression der beiden Reportergene his3 und ade2, ein

prototrophes Wachstum der Hefezellen ermöglicht wurde (Abb. 8A). In den beiden parallel

durchgeführten Ansätzen wurden jeweils 1500 selektionierte Transformanten mit putativen

Interaktionspartnern anhand von β-Galaktosidase-Tests überprüft und die

Interaktionsstärke durch ihre Blaufärbung quantifiziert. Bei 350 Transformanten (225 bei

GSA1_CA und 125 bei GSA1_CI), die eine starke Blaufärbung aufwiesen, wurde mittels

PCR das cDNA-Fragment des jeweiligen Beuteplasmids amplifiziert und anschließend bei

192 Klonen sequenziert. Kodierte Proteine wurden mittels „BLAST“-Sequenzvergleichs

identifiziert (Altschul et al. 1990). Für die weitere Charakterisierung von GSA1-

Interaktionspartnern konzentriert sich diese Arbeit auf die 22 Proteine, die mehr als einmal

beschrieben werden konnten und läßt die restlichen 15 Proteine als Einzeltreffer

unberücksichtigt. Diese 22 Proteine wurden spezifisch für den jeweiligen Hefe-2-Hybrid-

Ansatz als Tortendiagramm in Abbildung 9 dargestellt. In den Tortendiagrammen grau

dargestellte Proteine binden aktivitätsunabhängig an der Gα-Untereinheit GSA1, da sie

sowohl mit GSA1_CI (Abb. 9A) als auch mit GSA1_CA (Abb. 9B) als Köder interagieren.

Blau markierte Proteine sind exklusive Interaktionspartner der jeweiligen GSA1-Form und

weisen damit eine vom Gα-Aktivitätszustand abhängige Bindung an GSA1 auf.

IV Ergebnisse 49

Abbildung 9: Auswahl von Beuteproteinen der beiden konstitutiven GSA1-Formen. Abbildung 9A zeigt eine Auflistung möglicher Interaktionspartner der dominant negativen GSA1-Form und Abbildung 9B dementsprechend interagierende Proteine aus dem GSA1_CA-Ansatz. Für diese Tortendiagramme wurden nur die Beuteproteine berücksichtigt, die häufiger als einmal als Interaktionspartner identifiziert werden konnten. Die Zahl zeigt dabei die Anzahl von Identifikationen des Proteins als Interaktionspartner an. Die Größe der Tortenstücke stellt den Anteil der Identifikationen in Relation zur Gesamtanzahl der identifizierten Interaktionspartner dar. Grau dargestellte Proteine wurden mit beiden Ködern identifiziert, blau gefärbte Proteine sind spezifisch für den jeweiligen Köder. Ausgestellte Tortenstücke stehen für Proteine, deren Interaktion mit GSA1 im Text eingehender beschrieben wird. EF1α: Elongationsfaktor 1α.

IV Ergebnisse 50

Innerhalb der in dieser Arbeit durchgeführten Hefe-2-Hybrid-Analysen konnten

zusammenfassend 16 vom Gα-Aktivitätszustand abhängige (Abb. 9, blau markiert) und 6

vom Gα-Aktivitätszustand unabhängige Interaktionspartner (Abb. 9 grau markiert) der

Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora identifiziert werden. Unter diesen

aktivitätsunabhängigen Interaktionspartnern befinden sich eine α-Amylase, der

Elongationsfaktor EF-1α, Proteine mit Funktion in der Deubiquitinierung sowie

verschiedene vorhergesagte Proteine, deren Funktion noch nicht beschrieben ist. Eines

dieser bisher nicht charakterisierten Proteine stellte den am häufigsten identifizierten

Interaktionspartner von GSA1 dar, da es 59-mal identifiziert wurde, jedoch keine

Homologie zu bereits beschriebenen Proteinen aufweist.

Bei den aktivitätsabhängigen Beuteproteinen des dominant negativen GSA1_CI-Köders,

die exklusiv an der GDP-gebundenen Form der Gα-Untereinheit GSA1 binden, wurde der

Transkriptionsfaktor STE12 beschrieben, dessen genetische Assoziation mit GSA1 bereits

aus vorherigen genetischen Studien bekannt war (Kamerewerd et al. 2008). Somit konnte

in der vorliegenden Arbeit STE12 aufgrund seiner physikalischen Interaktion mit GSA1

erfolgreich als Interaktionspartner bestätigt werden. Bei den beiden weiteren spezifischen

Interaktionspartnern der GDP-gebundenen GSA1-Form handelt es sich um vorhergesagte

Proteine mit fehlender Funktionsbeschreibung, durch die keine weiteren Hinweise auf

mögliche Funktionen von GSA1 in S. macrospora gewonnen werden konnten (Abb. 9A).

In der Hefe-2-Hybrid-Analyse mit der konstitutiv aktiven Gα-Form GSA1_CA als

Köderprotein (Abb. 9B) konnten neben den sechs bereits erwähnten

Gα-aktivitätsunabhängigen bindenden Proteinen 13 exklusive Interaktionspartner

identifiziert werden. Diese Interaktionspartner lassen sich erfolgreich Proteingruppen

zuordnen, von denen Assoziationen mit G-Proteinen im Speziellen oder mit Signalwegen

im Allgemeinen beschrieben vorlagen. Unter anderem handelt es sich bei einem dieser

identifizierten Faktoren um ein RGS-Protein (Regulator des G-Protein-Signalweges), also

einen putativen regulatorischen Faktor innerhalb der G-Protein-vermittelten

Signaltransduktion (vgl. Kap. 3.2.1.). Darüber hinaus konnte mit einer Phosphoinositol-

Phosphatase (PIPase) ein spezifischer Effektor von GTP-GSA1 identifiziert werden,

wodurch GSA1 mit Phospholipid-assoziierten Prozessen in Verbindung gebracht wird.

Weitere GTP-GSA1-interagierende Proteine waren aufgrund ihrer

Funktionsbeschreibungen aus anderen Organismen als Faktoren innerhalb der De- und

Ubiquitinierung von Proteinen bekannt.

IV Ergebnisse 51

Bei der Identifikation der oben beschriebenen Bindeproteine wurden unter anderem mit der

Gruppe der RGS-Proteine und den Proteinen, die eine mögliche Ubiquitinierung von

GSA1 vermitteln, spezifische, in der Literatur beschriebene, Interaktionspartner von

Gα-Untereinheiten identifiziert, wodurch die Aussagekraft der in dieser Arbeit ermittelten

Daten bekräftigt wird (Torres et al. 2009; Watson et al. 1996). Die Identifizierung einer

Phosphoinositol-Phosphatase als exklusiver Interaktionspartner einer GTP-gebundenen

Gα-Untereinheit war allerding bislang nicht beschrieben. Vor dem Hintergrund, dass

Gα-Untereinheiten nur GTP-gebunden mit ihren Effektoren interagieren und

Phospholipide ihrerseits Signalwege vermitteln, stellte diese Interaktion für die vorliegende

Arbeit eine interessante Entdeckung dar. Eine mögliche Aktivierung der Phosphatase als

Effektor durch GSA1 könnte demnach eine mögliche Verbindung der beiden Signalwege

darstellen. Diese Verbindung wurde für S. cerevisiae bereits beschrieben, da die für die

Pheromonantwort wichtige Gα-Untereinheit GPA1 mit der Phosphoinositol-3-Kinase

VPS34, dem Gegenspieler der Phosphatase, am Endosom interagiert (Slessareva et al.

2006). VPS34 synthetisiert das Phosphoinositoltrisphosphat (PtdIns3P), welches als

Substrat von der oben identifizierten Phosphoinositol-Phosphatase verwendet wird.

Insgesamt konnten innerhalb der vorliegenden Arbeit mittels Hefe-2-Hybrid-Analysen

sowohl 16 Gα-aktivitätsabhängige als auch sechs Gα-aktivitätsunabhängige

Interaktionspartner identifiziert werden. Anhand der beschriebenen physikalischen

Interaktion der dominant negativen GDP-gebundenen Gα-Untereinheit GSA1_CI mit dem

Transkriptionsfaktor STE12 wurde eine genetische Interaktion der beiden Proteine aus

vorherigen Studien bestätigt (Kamerewerd et al. 2008). Da sowohl STE12 als auch GSA1

einen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung von S. macrospora ausüben, stellt die

Aufschlüsselung einer möglichen Funktion dieser Interaktion eine interessante

Fragestellung für weitergehende Studien dar. Allerdings wurde diese Interaktion in der

vorliegenden Arbeit nicht weiter untersucht, da STE12 mit der dominant negativen

GDP-gebundenen Gα-Untereinheit interagiert und somit als klassischer Effektor im

G-Protein-vermittelten Signalweg ausscheidet, da Effektoren nur mit GTP-GSA1

wechselwirken. Deshalb liegt der Fokus dieser Arbeit auf den spezifischen

Interaktionspartnern der GTP-gebundenen Gα-Form GSA1_CA, bei denen es sich sowohl

um Effektoren als auch um Regulatoren handeln könnte. Zu diesen interagierenden

Proteinen gehören ein RGS-Protein, eine Phosphoinositol-Phospatase und Proteine, die

eine mögliche Ubiquitinierung von GSA1 bewirken. Basierend auf diesen Ergebnissen

IV Ergebnisse 52

wurden nachfolgend die Interaktionen von GSA1 mit einem RGS-Protein und mit

phospholipid-assoziierten Proteinen untersucht.

3.2. Charakterisierung des RGS-Proteins ROG1 (Regulator of GSA1) als

Interaktionspartner der konstitutiv aktiven Gα-Form aus S. macrospora Das innerhalb der im vorangegangenen Kapitel beschriebenen Hefe-2-Hybrid-Analyse mit

der konstitutiv aktiven Gα-Form als Köder identifizierte RGS-Protein wird im weiteren

Verlauf dieser Arbeit als ROG1 (Regulator of GSA1) bezeichnet. Die in der vorliegenden

Arbeit durchgeführte Charakterisierung des ROG1-Proteins als GSA1-Interaktionspartner

wird im Anschluss beschrieben. Dabei sollte mittels Ko-Immunopräzipitationsanalysen die

Bindung von ROG1 an GTP-GSA1 durch eine vom Hefe-2-Hybrid-System-unabhängigen

Methode bestätigt werden.

In den Hefe-2-Hybrid-Analysen wurden nur cDNA-Fragmente des rog1-Gens, aber nie das

gesamte Gen identifiziert, so dass zur Aufklärung der Genstruktur das komplette rog1-Gen

aus genomischer und cDNA amplifiziert, sequenziert und anschließend für das Genom von

S. macrospora annotiert werden musste. Das rog1-Gen („Locus tag“-Nr. SMAC_06353)

umfasst 3865 bp und enthält ein 76 bp großes Intron im Bereich der Basen 3693 und 3768.

Das Gen kodiert für ein 140 kDa großes Protein aus 1262 Aminosäuren, das neben der für

RGS-Proteine charakteristischen RGS-Box in seiner Domänenstruktur weitere konservierte

Regionen aufweist. Die Domänenarchitekturen von ROG1 und dessen homologen

Proteinen aus ausgewählten pilzlichen Organismen sowie aus dem Menschen sind in

Abbildung 10 schematisch dargestellt. Die dargestellte Proteinstruktur von ROG1 zeigt

deutlich, dass mit diesem Protein ein Vertreter der RGS-Proteine identifiziert wurde, da es

eine zentrale, 139 Aminosäuren umfassende RGS-Box aufweist, die charakteristisch für

die RGS-Proteinfamilie ist. Über diese Domäne üben RGS-Proteine eine GAP-Aktivität

(GTPase aktivierendes Protein) auf Gα-Untereinheiten aus und stimulieren deren

Inaktivierung, wodurch sie als negative Regulatoren G-Protein-vermittelte Signalwege

steuern (Hepler 1999).

IV Ergebnisse 53

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Domänenstruktur des RGS-Proteins ROG1 aus S. macrospora und seiner Homologen. Es sind neben der Proteinstruktur von ROG1 aus S. macrospora (Sm_ROG1, gi|289615465|) pilzliche Homologe aus N. crassa (Nc_NCU03739, gi|40882341|), Magnaporthe grisea (Mg_MGG_00990, gi|145018055|), Penicillium chrysogenum (Pc_MDM1, gi|211585205|), Aspergillus fumigatus (Af_MDM1, gi|70995010|) und S. cerevisiae (Sc_MDM1, gi|6323532|) sowie das Homolog aus Homo sapiens (Hs_SNX13, gi|17864088|) dargestellt. Die fehlende RGS-Domäne von Sc_MDM1 wurde durch ein durchgestrichenes rotes Oval dargestellt. Die Domänenarchitektur von ROG1 wurde durch eine rote Umrandung hervorgehoben. Die Domänenstrukturen basieren auf in silico-Vorhersagen, die mit dem Programm „inter pro scan“ durchgeführt wurden (Hunter et al. 2009). Verwendete Abkürzungen: S: Signalpeptid, T: Transmembrandomäne, PXA: Phox-assoziierte-Domäne, CC: Coiled-Coil-Domäne, PX: Phox-Domäne. Die angegebenen Zahlen repräsentieren die entsprechenden Aminosäurebereiche der Domänen und die jeweilige Größe des Proteins.

Bei ROG1 handelt es sich um ein RGS-Protein, das unter den Ascomyceten weit verbreitet

ist und Homologe in den beiden Modellorganismen für G-Protein-vermittelte

Signaltransduktionen, dem Menschen (HsSNX13, Sorting Nexin 13) und der Hefe

(ScMDM1, Mitochondrial, distribution and morphology 1), aufweist (Abb. 10). Neben

seiner zentral positionierten RGS-Domäne besitzt ROG1 eine PX-Domäne (Phox-Domäne)

am C-Terminus und eine N-terminale PXA-Domäne (Phox-assoziierte Domäne), über die

das Protein eine Bindung an Phospholipiden eingehen könnte. PX- und PXA-Domäne

binden spezifisch an Phospholipide und bewirken eine Rekrutierung der entsprechenden

Proteine an Orten mit hohen Phospholipidkonzentrationen. Durch die Identifikation einer

Phosphoinositol-Phosphatase als GSA1-Interaktionspartner wurde darüber hinaus im

vorherigen Hefe-2-Hybrid-Ansatz ein möglicher Effektor von GSA1 identifiziert, der eine

Verbindung zu Phospholipiden aufweist. Diese Kombination von RGS-, PXA- und

IV Ergebnisse 54

PX-Domäne findet sich innerhalb der RGS-Proteine in Familie H (Kap. 3.2.1.), in denen

die „Sorting-Nexin“-Proteine eingeteilt sind. Eine für diese Proteinklasse charakteristische

C-terminale Nexin-Domäne (Nexin C) weisen ROG1 und alle ROG1-homologen Proteine

auf (Abb. 10). „Sorting Nexine“ sind an der zielgerichteten Translokalisation von

Proteinen beteiligt und ein Beispiel aus dieser Familie ist das Protein SNX13, das als

humanes ROG1-Homolog in Abbildung 10 dargestellt ist. Dieses Protein wird auch als

RGS-PX1 bezeichnet und besitzt neben der Proteintranslokalisation eine beschriebene

GAP-Aktivität für Gα-Untereinheiten (Zheng et al. 2001). Neben diesen Domänen wurde

bei ROG1 eine C-terminale „Coiled-Coil“-Region identifiziert, über die Protein-Protein-

Interaktionen vermittelt werden. Am N-Terminus weist ROG1 ein Signalpeptid sowie eine

Transmembrandomäne auf, wodurch eine membranassoziierte Lokalisation für ROG1

festgelegt werden könnte. Neben den humanen „Sorting-Nexin“-Proteinen zeigt ROG1

eine starke Homologie zu pilzlichen MDM1-Homologen, deren Bezeichnung sich vom

Homolog aus S. cerevisiae, MDM1 ableitet. MDM1 steht für „Mitochondrial Distribution

and Morphology 1“ und leitet sich von der Funktion des Proteins in der Hefe ab. Es regelt

die mitochondriale und nukleäre Vererbung an die Tochterzelle während der Zellteilung

(McConnell und Yaffe 1993). Eine Besonderheit des ROG1-Homologs MDM1 aus

S. cerevisae ist die Einteilung in die Klasse der RGS-Proteine, obwohl die charakteristische

RGS-Domäne nicht in der Proteinstruktur nachgewiesen werden kann. Bis zum jetzigen

Zeitpunkt wurden mit MDM1 aus S. cerevisiae und SNX13 (RGS-PX1) aus H. sapiens

zwei ROG1-Homologe als Interaktionspartner von Gα-Untereinheiten beschrieben (Chasse

et al. 2006). Bei SNX13 wurde darüber hinaus eine GAP-Funktion auf Gα-Untereinheiten

der Klasse Gs ermittelt (siehe Kap. 3.2.1) (Zheng et al. 2001).

Um eine Interaktion des identifizierten RGS-Proteins ROG1 aus S. macrospora mit der

Gα-Untereinheit GSA1 über das Ergebnis des Hefe-2-Hybrid-Systems hinaus zu

bestätigen, wurden Ko-Immunopräzipitationsanalysen mit GSA1 und ROG1 durchgeführt.

In der vorliegenden Arbeit wurden für die durchgeführten Ko-Immunopräzipitationen der

c-MYC-Tag und der HA-Tag verwendet, um die Interaktion zwischen HA-GSA1_CA und

c-MYC-ROG1 zu untersuchen. Das in dieser Arbeit klonierte Plasmid pBROG1

synthetisiert ein Fusionsprotein aus ROG1 mit GAL4-Bindedomäne und c-MYC-Tag

(c-MYC-ROG1). Das ebenfalls in dieser Arbeit hergestellte Plasmid pA1CA kodiert für

ein Fusionsprotein aus der konstitutiv aktiven Gα-Untereinheit GSA1_CA fusioniert mit

GAL4-Aktivierungsdomäne und einem HA-Tag (HA-GSA1_CA).

IV Ergebnisse 55

Die Plasmide wurden in den Hefestamm PJ69-4a ko-tranformiert, anschließend auf

Selektionsmedien ausplattiert und auf eine ausreichende Synthese beider Fusionsproteine

hin untersucht. Nach Auswahl eines Hefestammes, der die beiden Fusionsproteine c-

MYC-ROG1 und HA-GSA1_CA in ausreichender Menge produzierte, wurde dieser

Stamm für die Durchführung von Ko-Immunopräzipitationen verwendet. Ein

Gesamtproteinextrakt des Hefestammes, wurde für 2 Stunden mit einer c-MYC-Matrix

inkubiert. Über mehrere Waschschritte wurden unspezifisch bindende Proteine entfernt

und spezifisch gebundene Proteine über Zugabe von SDS-Probenpuffer in einer

gemeinsamen Fraktion eluiert. Aliquots vom Gesamtproteinextrakt (Abb. 11, „Input“) und

das Eluat (Abb. 11, „IP:c-MYC“) wurden auf ein SDS-Gel aufgetragen und für Western-

Blot-Analysen verwendet. Abbildung 11 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer in dieser

Arbeit durchgeführten Ko-Immunopräzipitation mit c-MYC-ROG1 und HA-GSA1_CA.

Die Identifikation von ROG1 erfolgte über Western-Blot-Analysen mit c-MYC- und die

Identifikation des untersuchten Bindungspartner, GSA1_CA mittels

HA-Antikörperdetektionen. In diesen Ansätzen wurde als Kontrolle zum Ausschluss

unspezifischer Bindungen über den c-MYC-Tag oder der beiden GAL4-Domänen, ein

Kombination von Fusionsproteinen aus GAL4-BD mit c-MYC-Tag sowie GSA1_CA mit

HA-Tag und GAL4-AD durchgeführt. Anhand der in Abbildung 11 dargestellten

Ko-Immunopräzipitation wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion des RGS-

Proteins ROG1 mit der konstitutiv aktiven Gα-Form GSA1_CA aus S. macrospora

bestätigt. Beide Proteine wurden in der eluierten Fraktion anhand ihrer extrapolierten

Größen von 160 kDa für c-MYC-ROG1 und 62 kDa für HA-GSA1_CA detektiert

(Abb. 11, IP:c-MYC).

Abbildung 11: Bestätigung der ROG1-Bindung an GSA1_CA über Ko-Immunopräzipitation. Die Zeichen über den einzelnen Proteinnachweisen zeigen die Existenz (+) oder das Fehlen des Proteins (-) an. Als Ladekontrolle wurden die äquivalenten Mengen von GSA1_CA in den Ansätzen verwendet. Die Western-Blot-Analysen wurden zur Detektion von ROG1 mit c-MYC-Antikörper und bei GSA1_CA mit einem HA-Antikörper durchgeführt. Die Mengen von c-MYC-ROG1 und HA-GSA1_CA im eingesetzten Gesamtproteinextrakt sind im Input und die Elution der Ko-Immunopräzipitation ist unter IP:c-MYC dargestellt.

IV Ergebnisse 56

Der Nachweis der beiden Proteine in der eluierten Fraktion bestätigt eine Assoziation von

GSA1_CA und ROG1, die dabei so stark ausgeprägt ist, dass beide Proteine nach sechs

Waschschritten noch ko-immunopräzipitiert werden. Darüber hinaus wurde GSA1_CA

nicht in Waschschritten detektiert, wodurch eine spezifische Bindung an ROG1

nachgewiesen wird (Daten nicht gezeigt). Eine unspezifische Bindung der beiden Proteine

über den jeweiligen „Tag“ oder über Interaktion der beiden GAL4-Domänen

untereinander, konnte darüber hinaus durch die eingesetzte Kontrolle ausgeschlossen

werden, da HA-GSA1_CA obwohl es im Kontrollansatz im Input nachgewiesen wird,

nicht in der Elution der Kontrolle detektierbar war (Abb. 11). Demnach bindet GSA1_CA

nicht an den alleinigen c-MYC-Tag und es findet auch keine Interaktion der beiden

GAL4-Domänen statt, so dass GSA1_CA nur durch Interaktion mit c-MYC-ROG1

ko-immunopräzipitiert werden kann.

Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit ROG1 das erste RGS-Protein in

S. macrospora beschrieben und dessen Interaktion mit GSA1 über zwei unabhängige

Interaktionsstudien (Hefe-2-Hybrid-Analysen und Ko-Immunopräzipitationen) bestätigt

werden. Aussagen über eine mögliche GAP-Aktivität von ROG1 können aufgrund der in

dieser Arbeit durchgeführten Experimente nicht gemacht werden, doch ist die exklusive

Identifizierung von ROG1 mit dem konstitutiv aktiven, GTP-gebundenen GSA1_CA ein

Hinweis darauf. ROG1 ist in Ascomyceten weit verbreitet und besitzt darüber hinaus mit

SNX13 (RGS-PX1) ein Homolog im Menschen, bei dem eine GAP-Aktivität auf

Gα-Untereinheiten beschrieben ist. Weiterhin konnte ROG1 anhand seiner

Domänenarchitektur und seiner zentralen RGS-Box in die Familie H der

RGS-Superfamilie eingeteilt werden. Seine Proteinstruktur gibt darüber hinaus Hinweise

auf eine mögliche Assoziation zu Phospholipiden. Bei GSA1 kann in diesem

Zusammenhang durch Interaktion mit der Phosphoinositol-3-Kinase VPS34 ebenfalls eine

mögliche phospholipid-assoziierte Funktion beschrieben werden die im weiteren Verlauf

dieser Arbeit untersucht wurde und im nächsten Abschnitt beschrieben wird.

IV Ergebnisse 57

3.3. Interaktionsstudien mit GSA1 und der Phosphoinositol-3-Kinase SmVPS34 Die Identifikation einer Phosphoinositol-Phosphatase (PIPase) als exklusiven

Interaktionspartner der konstitutiv aktiven Gα-Untereinheit GSA1_CA in

Hefe-2-Hybrid-Analysen zeigte einen ersten Hinweis auf eine Verbindung von GSA1 und

Phospholipiden. Die zweite Verbindung zu Phospholipiden wurde durch die Identifikation

des RGS-Proteins ROG1 und dessen Proteinstruktur gelegt. ROG1 besitzt PXA- und

PX-Domänen, die spezifisch an Phospholipide binden. Eine dritte Verknüpfung mit

Phospholipiden war aus der Hefe bekannt, in der die Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K)

VPS34 mit der Gα-Untereinheit GPA1 am Endosom interagiert (Slessareva et al. 2006).

Diese Hinweise gaben den Anstoß in der vorliegenden Arbeit dieser Verbindung

nachzugehen und sie weiter zu entschlüsseln.

In dieser Arbeit konnte mittels Hefe-2-Hybrid-Analysen die Phosphoinositol-Phosphatase

als GSA1-Interaktionspartner identifiziert werden. Es wurde im weiteren Verlauf auf eine

Bestätigung dieser Interaktion verzichtet, da bereits mit STE12 und ROG1, zwei weitere

Interaktionspartner aus diesem Ansatz durch verschiedene Ergebnisse (genetische

Analysen, Ko-Immunopräzipitation) als interagierende Proteine bestätigt werden konnten.

Daher ist davon auszugehen, dass es sich auch bei der Phosphoinositol-Phosphatase um ein

spezifisch bindendes Protein handelt. Darüber hinaus ist aus der Hefe mit der

Phosphoinositol-3-Kinase VPS34, der Gegenspieler der Phosphoinositol-Phosphatase

bekannt, der ebenfalls als Interaktionspartner einer Gα-Untereinheit (GPA1) beschrieben

werden konnte (Slessareva et al. 2006).

Da ein cDNA-Klon des VPS34-Homologs SmVPS34 in S. macrospora bereits vorhanden

war, wurde in der vorliegenden Arbeit daraufhin eine möglichen Interaktion mit GSA1

über Hefe-2-Hybrid- und Ko-Immunopräzipitationsanalysen untersucht, die nachfolgend

beschrieben werden (Pöggeler, persönliche Mitteilung). Das Alignment in Abbildung 12

zeigt SmVPS34 mit anderen Klasse III-PI3-Kinasen im Bereich der katalytischen Domäne

PI3Kc, die zur Klassifizierung der Kinasen verwendet wird. Der Sequenzvergleich der PI3-

Kinasen wurde in der vorliegenden Arbeit dazu verwendet im Vorfeld der

Interaktionsstudien SmVPS34 als Klasse III-PI3-Kinase analog zu den VPS34-Vertretern

im Menschen und in der Hefe einzuordnen. Diese Klassifizierung als Vertreter der Klasse

III-PI3-Kinasen ist anhand der hohen Homologie innerhalb des Sequenzvergleichs in

Abbildung 12 deutlich abzulesen.

IV Ergebnisse 58

Abbildung 12: Alignment der PI3-Kinase SmVPS34 mit Vertretern aus Mensch und Hefe. Der Sequenzvergleich zeigt die Klasse III-PI-3-Kinase SmVPS34 mit Homologen aus H. sapiens (Hs_VPS34, gi|34761064|) und S. cerevisiae (ScVPS34, gi|6323269|) im Bereich der katalytischen Untereinheit PI3Kc, die zur Klassifizierung der Kinasen herangezogen wird. Konservierte Aminosäuren sind in Schwarz und Identitätsgleichheit in 2 von 3 Sequenzen in Grau dargestellt.

Nach der Bestätigung von SmVPS34 als PI3-Kinase wurde das Protein in direkten Hefe-

2-Hybrid-Analysen eingesetzt, um eine Interaktion mit Gα-Untereinheiten zu untersuchen.

Neben den drei Gα-Untereinheiten GSA1, GSA2 und GSA3 wurden die beiden

konstitutiven GSA1-Formen GSA1_CA und GSA1_CI eingesetzt, um eine mögliche

Spezifität von SmVPS34 zur GTP- (GSA1_CA) oder GDP-gebundenen Gα-Untereinheiten

(GSA1_CI) beschreiben zu können.

Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit Plasmide hergestellt, die für Fusionsproteine der

drei Gα-Untereinheiten mit Gal4-Aktivierungsdomäne (AD) und HA-Tag kodieren (pA1,

pA2, pA3). Darüber hinaus wurden das bereits im Kapitel 3.2. beschriebene Plasmid

pA1_CA (GSA1_CA mit Gal4-AD und HA-Tag) und das dementsprechende pA1_CI

(GSA1_CI mit Gal4-AD mit HA-Tag) verwendet. Im Fall von SmVPS34 wurden Plasmide

in dieser Arbeit kloniert, die entweder für das gesamte Protein SmVPS34 in Fusion mit

c-MYC-Tag und der Gal4-Bindedomäne (pBV34) oder für entsprechende Fusionsproteine

des N-Terminus (pBV34n) bzw. C-Terminus (pBV34c) des VPS34-Proteins kodierten.

Das zu untersuchende Interaktionspaar wurde in den Hefestamm PJ69-4a transformiert und

anhand von Wachstumstests und β-Galaktosidase-Tests auf eine mögliche Interaktionen

hin untersucht. Tabelle 10 zeigt zusammengefasst die Ergebnisse aus den durchgeführten

Hefe-2-Hybrid-Analysen.

IV Ergebnisse 59

Tabelle 10: Ergebnisse der Hefe-2-Hybrid-Analysen mit SmVPS34 und GSA1-3. Die Daten basieren auf β-Galaktosidase-Tests und Wachstumsanalysen auf Selektionsmedium. Die angegebenen Zahlen zeigen die Enzymaktivität in β-Galaktosidase-Tests an. Nur wenn in beiden Fällen eine Interaktion detektiert wurde sind die entsprechenden Felder der Proteinkombination farbig hervorgehoben. Eine Interaktion innerhalb der Wachstumstests wurde durch Reportergenexpression (ade2, his3) bzw. beim β-Galaktosidase-Test über die Aktivität des durch Expression des Reportergens lacZ synthetisierten Enzyms β-Galaktosidase beschrieben, falls diese höher ausfiel als der dreifache Wert der Negativkontrolle (AD). Alle Werte stammen aus Dreifachbestimmungen.

SmVPS34

BD-VPS34_FL (AS 1-916)

BD-VPS34_N (AS 1-338)

BD-VPS34_C (AS 339- 916)

GSA

AD-GSA1_CA 24,59 ± 3,2 22,07 ± 2,56 3,75 ± 0,99

AD-GSA1_CI 22 ± 0,54 19,3 ± 0,04 2,78 ± 0,09

AD-GSA1 27,78 ± 0,75 24,57 ± 2,25 3,22 ± 0,44

AD-GSA2 17,31 ± 0,63 n.d. n.d.

AD-GSA3 9,2 ± 0,86 n.d. n.d.

AD 4,5 ± 0,02 2,79 ± 0,44 n.d.

Nur Interaktionen, die anhand von Reportergenexpression bei Wachstumstests auf

Selektionsmedien als auch durch β-Galaktosidase-Tests beschrieben wurden, sind in

Tabelle 10 farbig hervorgehoben. Eine β-Galaktosidase-Aktivität ist nur bei Interaktion der

beiden Fusionsproteine durch Expression des Reportergens lacZ und der Bildung des

Enzyms β-Galaktosidase messbar. Bezugnehmend darauf interagiert das SmVPS34-

Volllängenprotein (BD-VPS34_FL) nur mit der Gα-Untereinheit GSA1 und unabhängig

von der Aktivitätsform, da die ermittelten β-Galaktosidase-Aktivitäten mit 24,59 U/mg-

Protein für GSA1_CA, 22 U/mg-Protein für GSA1_CI und 27,78 U/mg-Protein keine

signifikanten Unterschiede aufwiesen. Eine Interaktion von SmVPS34 mit den beiden Gα-

Untereinheiten GSA2 oder GSA3 konnte nicht nachgewiesen werden. Obwohl mittels

β-Galaktosidase-Tests mit 17,31 U/mg-Protein eine Enzymaktivität bei dem Ansatz aus

BD-VPS34_FL und AD-GSA2 nachgewiesen wurde, zeigten die entsprechenden

Hefeklone auf Selektionsmedien kein Wachstum, so dass diese Interaktion nicht eindeutig

geklärt werden konnte.

IV Ergebnisse 60

Neben der exklusiven Interaktion von SmVPS34 zur Gα-Untereinheit GSA1 wurde in

dieser Arbeit festgestellt, dass die Kinase über ihren N-Terminus (AS 1-338) die

Interaktion mit GSA1 eingeht. Diese Kombinationen zeigten Wachstum auf

Selektionsmedien und Enzymaktivitäten in β -Galaktosidase-Tests von 22,07 U/mg-Protein

(GSA1_CA + VPS34_N), 19,3 U/mg-Protein (GSA1_CI + VPS34_N) und 24,57 U/mg-

Protein, die den dreifachen Wert der Negativkontrolle übertrafen und somit als signifikante

Interaktion beschrieben wurden. Im Gegensatz dazu zeigten Ansätze mit dem C-Terminus

von SmVPS34 (AS 339-916) und GSA1 keine Enzymaktivitäten. Demnach liegt der mit

GSA1 interagierende Bereich des Proteins SmVPS34 innerhalb der N-terminalen

Aminosäuren 1 bis 338.

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Hefe-2-Hybrid-Analyse eine Interaktion der

Klasse III-PI3-Kinase SmVPS34 mit der Gα-Untereinheit GSA1 sowie den beiden

konstitutiven Formen GSA1_CA und GSA1_CI in S. macrospora nachgewiesen. Zur

Bestätigung dieser Interaktionen wurden analog zu den Analysen mit dem RGS-Protein

ROG1 Ko-Immunopräzipitationen durchgeführt, bei denen die Bindung von SmVPS34 an

GSA1, GSA1_CA und GSA1_CI untersucht wurde. Für diese Studien wurden die in den

oben beschriebenen Hefe-2-Hybrid-Analysen eingesetzten Plasmide pBV34, pA1,

pA1_CA und pA1_CI verwendet. Die Durchführung der Ko-Immunopräzipitationen

erfolgte analog zu den in Kapitel 3.2. beschriebenen ROG1-Studien. Die Ergebnisse der

Ko-Immunopräzipitationen mit SmVPS34 sind in Abbildung 13 dargestellt, wodurch eine

exklusive Interaktion der PI3-Kinase SmVPS34 mit der konstitutiv aktiven

Gα-Untereinheit GSA1_CA nachgewiesen werden konnte.

Abbildung 13: Nachweis einer Bindung von SmVPS34 an GSA1_CA mittels Ko-Immunopräzipitationsanalysen. Die Darstellung und Beschriftung wurde analog zu Abbildung 10 durchgeführt. Im Gegensatz dazu wurden bei diesen Ansätzen die äquivalenten Mengen von SmVPS34 als Ladekontrolle verwendet. Die Western-Blot-Analysen wurden zur Detektion von SmVPS34 mit c-MYC-Antikörper und bei GSA1_CA, GSA1_CI und GSA1 mit einem HA-Antikörper durchgeführt.

IV Ergebnisse 61

GSA1_CA bindet an SmVPS34 und wurde über SmVPS34 assoziiert aufgereinigt, so dass

beide Proteine in der Elution mit Hilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden

konnten. Im Gegensatz dazu wurden in den Ansätzen mit SmVPS34 und der dominant

negativen GSA1-Form GSA1_CI sowie im Ansatz mit SmVPS34 und der wildtypischen

GSA1-Form nur sehr schwache Signale des HA-GSA1_CI- bzw. des HA-

GSA1-Fusionproteins in der Elution nachgewiesen (Abb. 13). Die schwachen Signale der

dominant negativen und wildtypischen GSA1-Form sind unabhängig von der eingesetzten

Menge des jeweiligen Fusionsproteins, da diese sich nicht von der Menge des

Fusionsprotein GSA1_CA unterscheidet, mit der SmVPS34 deutlich

ko-immunopräzipitiert werden konnte (Abb. 13, Input). Ein Vergleich der drei Ansätze

untereinander deutet auf eine bevorzugte Interaktion von SmVPS34 mit der konstitutiv

aktiven GSA1-Form GSA1_CA hin, die spezifisch eingegangen wird, da keine Proteine im

Kontrollansatz detektiert werden konnten. Anhand von Ko-Immunopräzipitationsstudien

konnte eine Spezifität in der Interaktion von SmVPS34 mit GSA1 beschrieben werden, die

über die ermittelten Daten der durchgeführten Hefe-2-Hybrid-Analysen hinaus gehen.

Durch Interaktionsstudien mit konstitutiven GSA1-Formen konnte in der

vorliegenden Arbeit mit ROG1 das erste RGS-Protein aus S. macrospora identifiziert

und als Interaktionspartner der konstitutiv aktiven GSA1-Form mittels

Hefe-2-Hybrid- und Ko-Immunopräzipitationsanalysen bestätigt werden. Mit der

PI3-Kinase SmVPS34 und der Phosphoinositol-Phosphatase wurden zwei Proteine

des Phospholipid-Signalweges als GSA1-Interaktionspartner beschrieben, so dass

eine Assoziation dieses Signalweges mit G-Proteinen in S. macrospora möglich ist.

Darüber hinaus wurde mit der physikalischen Interaktion der dominant negativen

GSA1-Form und STE12 eine genetische Interaktion aus vorangegangenen Studien

bestätigt.

4. Messung der GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit GSA1 aus

S. macrospora

Aufgrund der Identifikation eines RGS-Proteins und dessen möglicher GAP-(GTPase

aktivierendes Protein) Aktivität auf die Gα-Untereinheit GSA1 in S. macrospora wurde

zum Abschluss dieser Arbeit die intrinsische GTPase-Aktivität von GSA1 gemessen. Diese

IV Ergebnisse 62

Messungen stellen vorbereitende Arbeiten für eine Charakterisierung der GAP-Aktivität

des RGS-Proteins ROG1 dar, die in nachfolgenden Studien der funktionellen Analyse von

ROG1 dienen soll, die mit der Identifikation, Annotation und den Interaktionsstudien in

dieser Arbeit begonnen wurde.

Für die Messung der GTPase-Aktivität wurden große Mengen des Proteins GSA1 benötigt,

die in der vorliegenden Arbeit durch Verwendung des One-STrEP™-Systems (IBA) und

Überexpressionsstudien im Bakterium E. coli hergestellt wurden (Schmidt und Skerra

2007). Für diese Studien wurde das in dieser Arbeit hergestellte Plasmid pSG3-3

verwendet, das für ein Fusionsprotein aus GSA1 und C-terminalem STrEP-Tag

(GSA1_CSTREP) kodiert. pSG3-3 wurde in BL21-Zellen transformiert und die Synthese

des Fusionsproteins über Zugabe von Anhydrotetrazyklin (AHT) induziert. Nach Zugabe

von AHT wird die Expression des Gens durch den TetA-Promotor eingeleitet. In

Abbildung 14 ist das Ergebnis einer durchgeführten Überexpressionsstudie mit pSG3-3

dargestellt, mit Hilfe derer das 43,9 kDa große Fusionsprotein aus GSA1 mit C-terminalem

STrEP-Tag hergestellt werden konnte.

Abbildung 14: Induktionsreihe zur Synthese des Fusionsproteins aus GSA1 und einem C-terminalen STrEP-Tag in E. coli. Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden aus E. coli-Kulturen gewonnen, die 1 h, 2 h oder 3 h nach Induktion mit 200 µg/L Anhydrotetrazyklin geerntet wurden. Die Bande des synthetisierten GSA1_CSTREP wurde durch einen Pfeil auf der vorhergesagten Höhe von 43,9 kDa markiert.

IV Ergebnisse 63

In der vorliegenden Arbeit wurden nach einer Induktionszeit von drei Stunden und unter

Verwendung von 200 µg/l Anhydrotetrazyklin detektierbare Mengen von GSA1_CSTREP

als Bande anhand der extrapolierten Größe von 43,9 kDa in SDS-Gelen nachgewiesen

(Abb. 14, Pfeil). Das Protein GSA1_CSTREP befand sich nach kürzester Induktionszeit in

Einschlusskörperchen (Inclusion bodies), wodurch die Menge des GSA1_CSTREP

Proteins in der für eine Aufreinigung des Proteins relevanten löslichen Fraktion sehr gering

ausfiel und der Großteil des Proteins im Sediment verblieb. Durch Erhöhung des

Harnstoffanteils während der Aufarbeitung der E. coli-Kulturen wurde GSA1_CSTREP

erfolgreich aus diesen Einschlusskörperchen extrahiert und der Großteil des Proteins in die

lösliche Form übertragen, um es aufzureinigen. Aufgrund der denaturierenden

Bedingungen wurde bei der Aufarbeitung eine Renaturierung von 24-48 Stunden des

GSA1_CSTREP durchgeführt. Ein repräsentatives Ergebnis einer durchgeführten

Aufreinigung von GSA1_CSTREP wird in Abbildung 15 dargestellt.

Abbildung 15: Aufreinigung des GSA1_CSTREP-Proteins über eine Strep-Tactin®-Säule. Die verwendeten Proteine wurden aus einer 1 L umfassenden E. coli-Kultur aufgearbeitet, die mit Ausnahme der Induktionskontrolle (Induktion 0 h) nach 3 h geerntet wurden. Die Proben „Pellet IB“ und „Überstand IB“ stellen die Proteinansätze nach der Behandlung mit 8 M Harnstoff dar, die zum Auflösen der Einschlusskörperchen durchgeführt wurde und das Protein zum Großteil in die lösliche Fraktion brachte („Überstand IB“). Nach Rückfaltung des Proteins wurde der Ansatz „Überstand IB“ über eine Säule mit 2 ml Strep-Tactin®-Superflow®-Säulenmaterial aufgereinigt. Aliquots des Durchlaufs, des ersten und letzten Waschschritts sowie zwei der zwölf Elutionen wurden ebenfalls auf das Gel aufgetragen. Die Bande des synthetisierten Fusionsproteins GSA1_CSTREP wurde durch einen Pfeil auf der vorhergesagten Größe von 43,9 kDa markiert.

IV Ergebnisse 64

Das Fusionprotein GSA1_CSTREP wurde über eine 2 ml-Strep-Tactin®-Superflow®-Säule

aus E. coli-Kulturen aufgereinigt. Auf Höhe von 43,9 kDa ist das Protein anhand einer

ausgeprägten Bande im SDS-Gel von Beginn der Aufarbeitung an im Ansatz

„Induktion 3 h“ bis zum Endpunkt der Aufreinigung in den beiden Elutionen nachzuweisen

(Abbildung 15, Pfeil). Ein Aliquot der Kultur vor Induktion (Induktion 0 h) beweist eine

spezifische Induktion von GSA1_CSTREP. Die in Abbildung 15 dargestellte Aufreinigung

ergab eine eluierte GSA1_CSTREP-Proteinmenge von 6,9 mg (0,58 µg/ml). Da die

Bindungskapazität des Strep-Tactin®-Superflow®-Säulenmaterials bei 8,78 mg Protein

lag und ein Proteinverlust über die Dauer der Aufreinigung stattfindet, sind Mengen an

GSA1_CSTREP im Durchlauf und im ersten Waschschritt durch eine aufgearbeitete

Proteinmenge zu erklären, welche die Bindungskapazität der Säule überschritten hat. Eine

spezifische Elution des GSA1_CSTREP-Proteins zeigt sich daran, dass kein Protein in

Waschritt 6 detektiert und GSA1_CSTREP erst durch Zugabe von Desthiobiotin eluiert

wird (Abb. 15 Elution 1 und 2). Das aufgereinigte GSA1_CSTREP wurde für Messungen

der GTPase-Aktivität von GSA1 eingesetzt, wie in Abbildung 16 dargestellt.

Abbildung 16: Konzentrationsabhängige GTPase-Aktivitätsmessungen mit der Gα-Untereinheit GSA1. Unterschiedliche Konzentrationen des Fusionsproteins GSA1_CSTREP wurden für 60 Minuten mit GTP inkubiert. Durch GTPase-Aktivität frei werdendes anorganisches Phosphat Pi führt zu Farbveränderungen des Ansatzes, die photometrisch bei einer Wellenlänge von A635 gemessen wurden. Die Daten beruhen auf Mittelwerten aus einer Dreifach-Messung. Die Mittelwerte sind mit Standardabweichungen angegeben. Die Nullkontrolle wurde über eine gestrichelte Linie mit dem nächsten Messpunkt verbunden, da sie keine Aktivität aufweist und zum Ausschluß einer Verunreinigung von freiem Pi in der Probe diente.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0 0,0025 0,005 0,0075 0,01

GT

Pase

-Akt

ivitä

t(A

635 nm

)

GSA1_CSTREP [µM]

IV Ergebnisse 65

Insgesamt wurde in der vorliegenden Arbeit ca. 20 mg GSA1_CSTREP aus E. coli-

Kulturen aufgereinigt, einkonzentriert und in verschiedenen Konzentrationen für

GTPase-Aktivitäts-Messungen eingesetzt. Alle GTPase-Aktivitäts-Messungen wurden mit

dem GTPase Assay Kit (Innova Biosciences) durchgeführt, mit dem eine GTPase-Aktivität

photometrisch ermittelt wird (Garcia-Regalado et al. 2008). Nach Hydrolyse des

Nukleotids GTP zu GDP durch GSA1_CSTREP wird ein anorganisches Phosphat Pi

freigesetzt, das einen Komplex mit dem im Ansatz beigefügten Farbstoff Malachitgrün

bildet, wodurch ein Farbumschlag entsteht, der photometrisch quantifiziert wird.

Die ermittelten GTPase-Aktivitätswerte der Gα-Untereinheit GSA1 anhand des

eingesetzten Proteins GSA1_CSTREP sind in Abbildung 16 durch Absorptionswerte bei

einer Wellenlänge von 635 nm angegeben. Bei der gemessenen Aktivität von GSA1

konnte eine Konzentrationsabhängigkeit beobachtet werden, die deutlich an den

unterschiedlich hohen Absorptionswerten der eingesetzten Konzentrationen von

GSA1_CSTREP abzulesen ist (Abb. 16). Die höchste GTPase-Aktivität wurde mit

10 nM GSA1_CSTREP und die geringste mit 2,5 nM GSA1_CSTREP ermittelt. Eine

Sättigung der GTPase-Aktivität wurde anhand der in dieser Arbeit eingesetzten

Enzymmengen nicht beobachtet. Eine mögliche Verunreinigung der Probe mit Pi wurde

durch die Null-Probe ausgeschlossen, bei der die maximale GSA1_CSTREP-

Konzentration (10 nM) zum Messansatz hinzugegeben wurde nachdem die GTPase-

Reaktion bereits gestoppt wurde. Da dieser Ansatz keine Absorption aufweist, kann eine

Kontamination durch Pi in der aufgereinigten Proteinprobe ausgeschlossen werden. In

weiterführenden Studien wäre eine Erhöhung der eingesetzten Menge an GSA1_CSTREP

zur Identifikation einer möglichen Sättigung ratsam. Die Identifizierung einer intrinsischen

GTPase-Aktivität von GSA1 diente als Abschluss der funktionellen Analyse als Vertreter

einer Gα-Untereinheit aus S. macrospora und als vorbereitendes Experiment für eine

mögliche Stimulation der GTPase-Aktivität durch das in dieser Arbeit identifizierte

RGS-Protein ROG1.

Die Gα-Untereinheit GSA1 besitzt eine messbare konzentrationsabhängige

GTPase-Aktivität. Anhand dieser konnte in der vorliegenden Arbeit ein weiteres

Charakteristikum einer Gα-Untereinheit beschrieben werden. Durch Identifizierung

der GTPase-Aktivität ist weiterhin eine Voraussetzung geschaffen worden, um eine

mögliche GAP-Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten RGS-Proteins ROG1

identifizieren und charakterisieren zu können.

V Diskussion 66

V Diskussion

1. Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signalwege in Hyphenpilzen Heterotrimere G-Protein-vermittelte Signalwege werden seit den 1990er Jahren vermehrt

in Hyphenpilzen untersucht, bei denen sie essentielle Funktionen während verschiedener

Entwicklungsprozesse regulieren (Bölker 1998; Turner und Borkovich 1993). Neben den

beiden gut untersuchten Systemen beim Menschen und in der Bäckerhefe S. cerevisiae

eignen sich Hyphenpilze für Studien der Signaltransduktion vor allem durch ihren

mehrzelligen Habitus und der ausgeprägten Zelldifferenzierung in der

Fruchtkörperentwicklung, die im Gegensatz zur einzelligen Lebensweise der Hefe als

Modell für die eukaryotische Zelldifferenzierung in vielzelligen Organismen verwendet

werden kann (Pöggeler und Kück 2004). Bei Hyphenpilzen, für die ein filamentöses

Wachstum mit tubulärem Spitzenwachstum namensgebend ist, sind analog zu den

beschriebenen Modellen im Menschen und in der Hefe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

(GPCR) und heterotrimere G-Proteine identifiziert worden (Übersicht bei Li et al. 2007).

Sie besitzen in der Regel drei Gα-Untereinheiten, die in drei Klassen eingeteilt werden,

sowie eine Gβ- und eine Gγ-Untereinheit.

Bei Pilzen werden Gα-Untereinheiten in drei Klassen unterteilt (Klasse I, II, III). Gα-Untereinheiten der Klasse I sind homolog zu Giα- und der Klasse III zu Gsα-Untereinheiten, deren charakteristische Funktion die Hemmung (Gi für Inhibitor) bzw. die Stimulation (Gs für Stimulator) von Adenylatzyklasen darstellt (Simon et al. 1991). Zu Gα-Untereinheiten der Klasse II sind bislang keine Homologe zu Vertretern in Säugetieren identifiziert worden (Bölker 1998).

Durch Gα-Untereinheiten der Klasse I besitzen Hyphenpilze Homologe zur humanen

Klasse Gi und ermöglichen in Kombination mit den oben erwähnten Charakteristika

Studien über G-Protein-vermittelte Signaltransduktionen, die Rückschlüsse auf das

komplexe humane System zulassen. Bei Hyphenpilzen wurden unter anderem die sexuelle

und vegetative Entwicklung, die Pathogenität sowie der Sekundärmetabolismus als durch

heterotrimere G-Protein-vermittelte Prozesse beschrieben (Übersicht bei Li et al . 2007).

Auch bei dem in dieser Arbeit verwendeten Hyphenpilz S. macrospora konnte durch

vorherige Studien gezeigt werden, dass die Fruchtkörperentwicklung über eine

heterotrimere G-Protein-vermittelte Signaltransduktion induziert wird (Kamerewerd et al.

2008). Diese Ergebnisse wurden in der vorliegenden Arbeit durch eine detaillierte

Charakterisierung der Gα-Untereinheit GSA1 als zentraler Regulator auf die Entwicklung

des Hyphenpilzes S. macrospora erweitert.

V Diskussion 67

2. Die sexuelle Entwicklung des Hyphenpilzes Sordaria macrospora ist

abhängig vom Aktivitätszustand der Gα-Untereinheit GSA1 In der vorliegenden Arbeit wurden erfolgreich konstitutive Formen der Gα-Untereinheit

GSA1 aus S. macrospora durch direkte Mutagenese hergestellt. Dabei wurde für eine

konstitutiv aktive GSA1-Variante der aus anderen Organismen bekannte

Aminosäureaustausch Q204L innerhalb der Switch II-Region durchgeführt, der eine

drastische Reduktion der intrinsischen GTPase-Aktivität bei Gα-Untereinheiten auslöst

und zu einer konstanten Signalweiterleitung führt (Coleman et al. 1994). Zur Herstellung

einer dominant negativen GSA1-Form wurde die G203R-Modifikation eingefügt, wodurch

die Dissoziation von Gα-Untereinheiten vom Gβγ-Dimer verhindert wird und der

Signalweg kontinuierlich ausgeschaltet bleibt (Yu et al. 1996). Der Einsatz analoger

Gα-Formen in Kombination mit assoziierten Knockoutmutanten führte in den letzten

Jahren zu einer Charakterisierung einer Vielzahl von Prozessen, an denen G-Protein-

Untereinheiten beteiligt sind (Fang und Dean 2000; Ivey et al. 2010; Segers und Nuss

2003; Yang und Borkovich 1999). Dazu gehört neben dem Einfluss auf die vegetative und

sexuelle Entwicklung bei Hyphenpilzen, die Regulation des Sekundärmetabolismus sowie

der Pathogenität. Bezüglich des Sekundärmetabolismus werden Beispiele für positive und

auch negative Regulationen durch Gα-Untereinheiten beschrieben. Die Gα-Untereinheit

PGA1 in Penicillium chrysogenum, beispielsweise, wird als positiver Regulator des

Sekundärmetabolismus beschrieben, da eine konstitutive Aktivierung von PGA1 die

Produktion der drei Sekundärmetaboliten Penicillin, Chrysogenin und Roquefortin, einem

Mykotoxin, stimuliert (Garcia-Rico et al. 2008). Die Funktion als negativer Faktor

bezüglich des Sekundärmetabolismus wurde stattdessen der Gα-Untereinheit FADA in

Aspergillus nidulans zugeschrieben, deren konstitutive Aktivierung die Produktion des

Mykotoxins Sterigmatocystin hemmt (Hicks et al. 1997; Wieser et al. 1997). Beim

pathogenen Pilz Cryphonectria parasitica wurde durch konstitutive Aktivierung der

Gα-Untereinheit CPG-1 eine Funktion als negativer Regulator in der Virulenz des Pilzes

beschrieben (Segers und Nuss 2003).

An der Vielzahl der identifizierten Funktionen von Gα-Untereinheiten zeigt sich deren

Vielseitigkeit bei der Regulation von Prozessen innerhalb der Hyphenpilze und die

Effizienz von Funktionsanalysen, die anhand von konstitutiven Gα-Formen in

Kombination mit Knockoutmutanten erreicht werden kann. Aus diesem Grund wurden in

der vorliegenden Arbeit ebenfalls konstitutive Formen zur funktionellen Charakterisierung

von GSA1 eingesetzt. Dafür wurden die modifizierten gsa1-Sequenzen in einen

V Diskussion 68

Doppel-Knockoutstamm der Gα-Untereinheiten gsa1 und gsa2 transformiert

(∆gsa1/∆gsa2), wodurch gewährleistet werden konnte, dass nur mutierte gsa1-Transkripte

produziert wurden. In der vorliegenden Arbeit konnte in S. macrospora anhand von

Charakterisierungen der hergestellten Stämme mit konstitutiv aktiver bzw. dominant

negativer Form der Gα-Untereinheit GSA1 eine vom Gα-Aktivitätsstatus abhängige

Funktion auf die sexuelle und vegetative Entwicklung beschrieben werden.

Bei der sexuellen Entwicklung zeigte der verwendete sterile Rezipient ∆gsa1/∆gsa2 nur

nach Transformation des modifizierten Gens gsa1_ca, das für eine konstitutiv aktive

GSA1-Form kodiert, eine vollständige Fertilität in Form von reifen Perithezien mit reifen

Ascosporen. Die verwendete dominant negative Form der Gα-Untereinheit zeigte hingegen

keinen positiven Einfluss auf die sexuelle Entwicklung, da in diesem Fall der sterile

Phänotyp von ∆gsa1/∆gsa2 nach Transformation von gsa1_ci in der entsprechenden

Transformante konstant vorherrschte (Abb. 7). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die

Fruchtkörperbildung bei S. macrospora ausschließlich über die GTP-gebundene Form der

Gα-Untereinheit GSA1 abläuft und anhand von GSA1-Effektoren ausgeführt wird. Eine

wahrscheinliche Erklärung für das Ausbleiben der Fruchtkörperentwicklung bei Ansätzen

mit der dominant negativen GSA1-Form ist, dass ein inaktives GSA1 GDP-gebunden mit

dem Gβγ-Dimer assoziiert vorliegt, wodurch Gα-Effektoren nicht aktiviert werden und

eine nachfolgende Signaltransduktion ausbleibt. Hierdurch werden Prozesse der

Fruchtkörperentwicklung und auch der vegetativen Entwicklung (siehe unten) nicht

eingeleitet.

In dem zu S. macrospora nahe verwandten heterothallischen Ascomyceten Neurospora

crassa wird die sexuelle Entwicklung ebenfalls über Gα reguliert. Das GSA1-Homolog

GNA-1 steuert in diesem Fall die weibliche Fertilität, da Knockoutmutanten von gna-1

weiblich steril sind und eine konstitutive Aktivierung von GNA-1 zur Wiederherstellung

der weiblichen Fertilität in den Knockoutstämmen führt (Yang und Borkovich 1999).

Der Begriff „weibliche Fertilität“ leitet sich aus dem Lebenszyklus von N. crassa ab. Für eine sexuelle Reproduktion ist in diesem Fall die Anwesenheit eines Kreuzungspartners mit entgegengesetztem Kreuzungstyp notwendig. Die Kreuzungstypen werden bei N. crassa mit A und a bezeichnet. Während des sexuellen Zyklus bilden sich sowohl weibliche Gametangien (Ascogone), als auch männliche Gameten (Makro- bzw. Mikrokonidien) an einem zweidimensional wachsenden Myzel aus. Sobald sich zwei Stämme mit unterschiedlichem Kreuzungstyp wahrnehmen, bildet das weibliche Gametangium, das nun Protoperithezium benannt wird, eine spezialisierte Hyphe (Trychogyne) aus, um durch Hyphenanastomose einen Kern aus einem männlichen Gameten aufzunehmen. Dies führt zur Bildung von ascogenen Hyphen, die zu Hakenzellen und Asci ausdifferenzieren, in denen durch Karyogamie, Meiose und postmeiotischer Mitose acht haploide Ascosporen entstehen (Kück 2005). Durch diesen Lebenszyklus bedingt wird bei N. crassa unterschieden, welcher

V Diskussion 69

Stamm die Protoperithezien bildet (weiblich) und welcher die Konidien spendet (männlich). Daraus ergeben sich die Bezeichnungen weiblich fertil/steril bzw. männlich steril/fertil.

Im Gegensatz zu der in dieser Arbeit beschriebenen Gα-GTP-abhängigen Regulation der

Fruchtkörperbildung bei S. macrospora ist die Steuerung der weiblichen Fertilität bei

N. crassa jedoch vom GNA-1-Aktivitätsstaus unabhängig. Stämme mit konstitutiv aktiver

Form werden als ebenso weiblich fertil beschrieben wie Stämme mit dominant negativem

GNA-1 (Yang und Borkovich 1999). In diesem Zusammenhang wird die Regulation der

sexuellen Entwicklung bei N. crassa - anders als es für S. macrospora in der vorliegenden

Arbeit ermittelt wurde - nicht allein durch Gα-Effektoren gefördert. Vielmehr wird

zusätzlich eine indirekte Regulation der Fruchtkörperbildung über die Gβ-Untereinheit,

gnb-1, und die Gγ-Untereinheit, gng-1, beschrieben, welche die vorherrschende Menge des

GNA-1-Proteins in der Zelle regulieren (Krystofova und Borkovich 2005; Yang et al.

2002).

Darüber hinaus liegen bei Pilzen neben der für S. macrospora und N. crassa beschriebenen

positiven Regulation der sexuellen Entwicklung auch Beschreibungen von negativen

Einflüssen oder einer Kombination aus positiver und negativer Regulation über

Gα-Untereinheiten vor, wodurch die Vielseitigkeit der durch Gα-Untereinheiten

vermittelten Regulationen deutlich wird. In der Pheromonantwort bei S. cerevisiae wird

beispielsweise eine negative Regulation über Gα (GPA1) beschrieben, da in diesem

speziellen Fall die Signaltransduktion über das Gβγ-Dimer (STE4/STE18) gesteuert wird

und durch Reassoziation von GPA1 mit STE4/STE18 die Aktivierung der Gβγ-Effektoren

gestoppt wird (Kap. 2.2.1.) (Dohlman und Thorner 2001). Eine Kombination aus positiver

und negativer Regulation der sexuellen Entwicklung mittels zweier Gα zeigt sich auch in

dem humanpathogenen Basidiomyceten Cryptococcus neoformans, bei dem die eine

Gα-Untereinheit GPA2 stimulierend und die GPA3-Untereinheit hemmend wirkt (Hsueh et

al. 2007). Bei S. macrospora sind neben GSA1 mit GSA2 und GSA3 ebenfalls weitere

Gα-Untereinheiten an der sexuellen Entwicklung beteiligt. GSA3 aktiviert die

Adenylatzyklase SAC1 und steuert über den cAMP-vermittelten Signalweg Prozesse

während der Ascosporogenese, wohingegen GSA2 nur eine GSA1-untergeordnete und

nicht essentielle Funktion bei der Pheromonantwort in S. macrospora ausübt (Kamerewerd

et al. 2008).

Neben der positiven Regulation der sexuellen Entwicklung wirkt die aktivierte

Gα-Untereinheit GSA1 in S. macrospora ebenfalls stimulierend auf das vegetative

Wachstum: Nach Transformation der modifizierten Sequenz gsa1_ca in die

V Diskussion 70

Ausgangsmutante ∆gsa1/∆gsa2 konnte in der vorliegenden Arbeit ein gesteigertes

vegetatives Wachstum beobachtet werden. Dabei wird durch die vorherrschende

konstitutive Aktivierung der Gα-Untereinheit GSA1 nicht nur der Wachstumsdefekt des

Rezipienten komplementiert, sondern das Wachstum über den Level des Wildtyps hinaus

stimuliert. Dahingegen wurde bei Transformanten mit dominant negativer Gα-Untereinheit

keine signifikante Änderung des vegetativen Wachstums beobachtet und der

Wachstumsdefekt der Ausgangsmutante war weiterhin vorhanden (Abb. 6). Ein

vergleichbarer Effekt einer Gα-Untereinheit auf Prozesse der vegetativen Entwicklung

konnte auch bei dem GSA1-Homolog GNA-1 aus N. crassa beobachtet werden, da die

konstitutive Aktivierung von GNA-1 in einer 60 %igen Steigerung der produzierten

Biomasse im Vergleich zum Wildtyp resultierte (Yang und Borkovich 1999).

Für die Diskussion der Auswirkungen von konstitutiv aktiven GSA1-Formen muss

berücksichtigt werden, dass die beschriebenen Effekte auch durch einen frei vorliegendes

Gβγ-Dimer ausgelöst werden könnten, der zu einer kontinuierlichen Aktivierung von

Gβγ-Effektoren führt (Birnbaumer 1992). Deshalb wurden analog zur Vorgehensweise

anderer Studien, die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Phänotypen der Stämme von

konstitutiv aktiven und dominant negativen Gα-Untereinheiten zum einen untereinander

und zum anderen mit dem Phänotyp der Knockoutmutante ∆gsa1/∆gsa2 verglichen. Bei

einer Übereinstimmung des Phänotyps der Knockoutmutante und des Stammes mit

konstitutiv aktiver GSA1-Variante kann dieser dem Gβγ zugeschrieben werden, da in

beiden Fällen das Gβγ-Dimer frei vorliegt und eine Signalweiterleitung über

Gβγ-Effektoren erfolgt. Bei einem phänotypischen Unterschied hingegen ist ausschließlich

die Gα-Untereinheit der für den Phänotyp verantwortliche Faktor (Yang und Borkovich

1999). Bei S. macrospora unterscheidet sich der Stamm ∆gsa1/∆gsa2:gsa1_caekt (CA_3),

bei dem GSA1 konstitutiv aktiviert vorliegt, anhand seiner Fertilität und seines vegetativen

Wachstums, sowohl von der sterilen Ausgangsmutante ∆gsa1/∆gsa2 als auch von sterilen

Stämmen mit dominant negativer GSA1-Form. Bei beiden wurde ein Defekt im

vegetativen Wachstum beobachtet. Der beschriebene Effekt auf die sexuelle und vegetative

Entwicklung in S. macrospora lässt sich somit eindeutig auf die Gα-Untereinheit GSA1

zurückführen. Eine darüber hinaus mögliche indirekte regulatorische Funktion des

Gβγ-Dimers in S. macrospora kann an dieser Stelle aufgrund fehlender Daten nicht

vollständig ausgeschlossen werden und sollte somit das Ziel nachfolgender Studien sein. In

diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass im Genom von S. macrospora jeweils ein

V Diskussion 71

Gen für eine Gβ- und ein Gen für eine Gγ-Untereinheit identifiziert wurden, wie es für

Hyphenpilze charakteristisch ist (Nowrousian et al. 2010).

3. Das GSA1 bindende RGS-Protein ROG1 ist ein putativer negativer

Regulator des G-Protein-Signalweges in Sordaria macrospora Durch Komplementationsstudien mit konstitutiven GSA1-Formen konnte eine zentrale

Rolle der aktiven Gα-Untereinheit GSA1 in der Fruchtkörperentwicklung von

S. macrospora beschrieben werden, so dass mögliche Effektoren oder Regulatoren von

GSA1 im Fokus der weiteren Aufklärung dieser spezifischen Funktion stehen. In diesem

Zusammenhang konnten in der vorliegenden Arbeit durch in vivo-Interaktionsstudien mit

der konstitutiv aktiven Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora exklusive

Interaktionspartner der aktiven, GTP-gebundenen Gα-Form beschrieben werden. Als

möglicher negativer Regulator des G-Protein-vermittelten Signalweges in S. macrospora

wurde mit ROG1 (Regulator of GSA1), ein spezifischer GSA1-GTP Interaktionspartner

identifiziert, der aufgrund seiner RGS-Domäne zur Familie der Regulatoren des G-Protein-

Signalweges (RGS-Proteine) gezählt werden kann.

Die Entdeckung von RGS-Proteinen als assoziierte Bindepartner von Gα-Untereinheiten

begann 1996 mit der parallel beschriebenen Identifikation der Proteine SST2 in

S. cerevisiae, EGL-10 aus C. elegans und GAIP aus H. sapiens (De Vries et al. 1996;

Dohlman et al. 1996; Koelle und Horvitz 1996). Ausgehend von diesen Studien ist die Zahl

der identifizierten RGS-Proteine stetig gewachsen, und führte bis zum jetzigen Zeitpunkt

zu einer Vielzahl von Charakterisierungen in Säugetieren, Pflanzen und Pilzen (Johnston et

al. 2008; Willars 2006; Xue et al. 2008; Yu et al. 1996). Eine umfassende Beschreibung

der RGS-Proteine und den unterschiedlichen Vertretern wurde bereits in der Einleitung in

Kapitel 3.2.1. vorgenommen, weshalb an dieser Stelle nur diskussionsrelevante Eckpunkte

beschrieben werden.

RGS-Proteine wirken über eine negative Regulation auf Gα-Untereinheiten und

inaktivieren dadurch den vermittelten Signalweg. Ihre Entdeckung führte zur Erklärung der

in vivo beobachteten schnellen Abfolge von Signaleinleitung und Signalbeendigung durch

heterotrimere G-Proteine, obwohl in vitro nur gering gemessene intrinsische

GTPase-Aktivitäten von Gα-Untereinheiten beschrieben werden konnten (Arshavsky und

Pugh 1998; Chen et al. 2000). RGS-Proteine wirken entgegengesetzt zu positiven

Regulatoren wie den Guanosin-Austauschfaktoren (GEF für Guanine exchange factor) die

V Diskussion 72

das an Gα-gebundene Guanosindiphosphat (GDP) durch ein Guanosintriphosphat (GTP)

ersetzen und eine Aktivierung der Gα-Untereinheit bewirken. Somit komplementiert die

Funktion der RGS-Proteine durch Stimulation der GTP-Hydrolyse den Aktivierungszyklus

einer Gα-Untereinheit, wie er in Abbildung 1 dieser Arbeit dargestellt ist. Ihre negative

Regulation auf die Signaltransduktion üben RGS-Proteine durch eine charakteristische 120

Aminosäure große RGS-Domäne aus, über die sie als GAP (GTPase aktivierendes Protein)

stimulierend auf die intrinsische GTPase-Aktivität von Gα-Untereinheiten wirken und ihre

Inaktivierung beschleunigen (Siderovski und Willard 2005). Strukturell betrachtet bindet

die aus neun α-Helices bestehende RGS-Domäne innerhalb der Switch-Regionen von

Gα-Untereinheiten, wodurch der „Transition-State“ während der GTPase-Reaktion

stabilisiert wird und die Beschleunigung der Hydrolyse von GTP zu GDP ausgeführt

werden kann.

Als charakteristisches Merkmal der RGS-Proteine wird eine exklusive Bindung an

aktivierte GTP-gebundene Gα-Untereinheiten beschrieben (Popov et al. 1997; Tesmer et

al. 1997), wie sie ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bei dem identifizierten RGS-Protein

ROG1 aus S. macrospora bobachtet werden konnte. In Hefe-2-Hybrid-Analysen konnte

ROG1 nur mit dem konstitutiv aktiven Köder GSA1_CA als GTP-GSA1-bindendes

Protein identifiziert werden, was darüber hinaus mittels Ko-Immunopräzipitationsstudien

in vitro bestätigt wurde (Abb. 9 und Abb. 11). Diese Interaktion des RGS-Proteins ROG1

mit GTP-GSA1 sowie die charakteristische RGS-Domäne sind deutliche Hinweise auf eine

GAP-Aktivität von ROG1, wodurch eine negative Regulation auf die G-Protein-vermittelte

Signaltransduktion in S. macrospora angenommen werden kann. Als Grundlage für

nachfolgende Studien zur Charakterisierung einer GAP-Aktivität von ROG1 konnte in der

vorliegenden Arbeit bereits die intrinsische GTPase-Aktivität von GSA1 anhand eines

aufgereinigten Proteins aus E. coli ermittelt werden (Abb. 16).

Die GAP-Aktivität und die damit verbundene Inaktivierung der Gα-Untereinheit macht

RGS-Proteine zu entscheidenden Regulatoren für die Festlegung der Dauer, in der eine

Signalantwort ausbleibt, da eine schnelle Inaktivierung von Gα auch eine schnelle

Reaktivierung ermöglicht. In diesem Kontext wird eine Funktion von RGS-Proteinen als

Gerüstproteine („Scaffold“-Proteine) beschrieben, welche Gα-Untereinheiten zur schnellen

Reaktivierung in räumliche Nähe zum Rezeptor bringen (Smith et al. 2009; Zhong et al.

2003). In S. macrospora stellen zwei Pheromonrezeptoren, PRE1 und PRE2, welche in der

Fruchtkörperbildung involviert sind, in diesem Kontext mögliche Bindepartner des

RGS-Proteins ROG1 und der Gα-Untereinheit GSA1 dar (Mayrhofer und Pöggeler 2005;

V Diskussion 73

Mayrhofer et al. 2006; Pöggeler 2000; Pöggeler und Kück 2001). Da es sich bei diesen

Rezeptoren um membranständige Proteine handelt, kann eine ausbleibende Identifikation

von PRE1 und PRE2 als GSA1-Interaktionspartner in den durchgeführten

Hefe-2-Hybrid-Analysen aufgrund einer fehlenden nukleären Lokalisation erklären. Die

Interaktionsnetzwerke von PRE1 und PRE2 sind Bestandteil in von dieser Arbeit

unabhängigen Studien und sollen zu einer weiteren Aufklärung der G-Protein-vermittelten

Signaltransduktion beitragen (Teichert und Güttel, persönliche Mitteilung). Eine direkte

Bindung des RGS-Proteins an Rezeptor und G-Protein wird über zusätzliche Domänen

vermittelt, die sie neben der RGS-Domäne aufweisen. Als Beispiel kann das humane

RGS11 genannt werden, das eine GGL-Domäne (G-Protein gamma like) und eine DEP-

Domäne (Dishevelled/EGL-10/Pleckstrin-Homologie) besitzt. Über die GGL-Domäne

bindet RGS11 an eine Gβ-Untereinheit (Gβ5), wodurch beide Proteine einen Gβγ-Dimer-

ähnlichen Komplex bilden. Dieser interagiert mit Gα und bewirkt nachfolgend eine

Bindung an einen membranständigen GPCR, da RGS11 über die DEP-Domäne

membran-assoziiert in räumlicher Nähe zum Rezeptor lokalisiert wird (Ballon et al. 2006;

Jones et al. 2004; Siderovski und Willard 2005; Sondek und Siderovski 2001).

Ein solcher Multidomänencharakter wie bei RGS11 ist charakteristisch für viele

RGS-Proteine und wird dazu verwendet die humanen Vertreter anhand ihrer

Domänenstruktur zu klassifizieren (Ross und Wilkie 2000). Die Klassifizierung der

RGS-Proteine mit entsprechend dargestellter Domänenstruktur ist in Tabelle 2 dieser

Arbeit dargestellt. Bei dem in dieser Arbeit identifizierten RGS-Protein ROG1 aus

S. macrospora handelt es sich ebenfalls um ein Multidomänenprotein, bei dem neben der

zentralen RGS-Box eine Phox-Domäne (PX), eine Phox-assoziierte-Domäne (PXA) sowie

eine C-terminale Nexin-Domäne (Nexin-C) identifiziert werden konnten (Abb. 10).

Aufgrund dieser Domänenarchitektur besitzt ROG1 die größte Homologie zu Proteinen der

humanen RGS-Familie H. Diese besteht aus drei Vertretern der sogenannten „Sorting

Nexine“ und in dieser Proteinfamilie sind mögliche Hinweise auf eine Funktion des

ROG1-Proteins zu finden. Die Bezeichnung der PX-Domäne leitet sich von den

Untereinheiten p40phox und p47phox der NADPH-Oxidase ab, bei denen diese Domäne das

erste Mal beschrieben wurde, und sie gehören zu den Phospholipid-bindenden Motiven,

die eine Lokalisation der Proteine an Phospholipid-angereicherten Membranen

ermöglichen (Ponting 1996; Xu et al. 2001). Die weiteren Domänen (PXA und Nexin C)

des ROG1-Proteins sind in Bezug auf ihre Funktion nicht weiter beschrieben, aber wie die

PX-Domäne charakteristisch für die Proteinfamilie der „Sorting Nexine“, die im Menschen

V Diskussion 74

an der Endozytose und Translokalisation von Proteinen in Abhängigkeit ihrer

Bindungsspezifität an Phospholipide beteiligt sind (Worby und Dixon 2002). Für die

vorliegende Charakterisierung von ROG1 aus S. macrospora und seiner möglichen

GAP-Aktivität ist die beschriebene Beteiligung von „Sorting Nexinen“ an

Signaltransduktionen besonders interessant. So ist bekannt, dass sie sowohl die

Lokalisation von Signalkomplexen gewährleisten als auch direkt mit endozytierten

Rezeptoren interagieren und deren Lokalisation und Transport während des

„Turnover“-Prozesses koordinieren (Cullen 2008; Sorkin und von Zastrow 2009; Worby

und Dixon 2002).

Nach der Endozytose eines Membran-assoziierten Rezeptors über Clathrin-Vesikel und deren Fusion mit frühen Endosomen führen „Sorting Nexine“ die weitere Lokalisation des Rezeptors durch. Es gibt dabei zwei Möglichkeiten. (1) Der Rezeptor wird zu späten Endosomen geleitet, die sich zu Lysosomen ausdifferenzieren und die Degradierung des Rezeptors einleiten. In diesem Fall wird ein Rezeptor neu synthetisiert und an die Plasmamembran translokalisiert, um das Signal aufzunehmen. (2) Der Rezeptor gelangt über Recycling-Endosomen zurück an die Plasmamembran, wobei ebenfalls „Sorting Nexine“ diese Transportwege steuern. Dieser Ablauf von Degradierung, Neusynthese bzw. Recycling, Transport und Rekrutierung des Rezeptors an die Membran wird als „Turnover“ des Rezeptors bezeichnet (Worby und Dixon 2002).

Besonders interessant in Bezug auf die Funktion von ROG1 ist, dass innerhalb der

„Sorting Nexin“-Familie mit SNX13, SNX14 und SNX25 drei Proteine mit

RGS-Domänen beschrieben sind, von denen ROG1 aus S. macrospora die größte

Homologie zu SNX13 aufweist, das nach der Identifikation seiner RGS-Domäne in

RGS-PX1 umbenannt wurde (Abb. 10).

Während die meisten RGS-Proteine auf Gαi-Untereinheiten wirken, handelt es sich bei

RGS-PX1 um das erste und bislang einzige RGS-Protein, für das eine GAP-Aktivität auf

Gα-Untereinheiten der Klasse Gs beschrieben wurde (Neubig und Siderovski 2002; Zheng

et al. 2001). Hierdurch wirkt es als negativer Regulator auf cAMP-Signalwege. ROG1 aus

S. macrospora würde im Gegensatz dazu als positiver Regulator der cAMP-Signalwege

fungieren, da es als GAP für GSA1, eine Gα-Untereinheit aus der Klasse Gi inaktiviert,

deren Vertreter hemmend auf die Adenylatzyklase und somit auf den cAMP-Weg wirken

(Simon et al. 1991). Trotz dieser unterschiedlichen Spezifität in Bezug auf die

Gα-Untereinheit ist RGS-PX1 für die vorliegende Arbeit und eine mögliche

Funktionsbeschreibung von ROG1 sehr interessant, da beide Faktoren eine Kombination

von „Sorting Nexin“ und RGS-Protein darstellen.

Eine mögliche Rezeptorregulation von ROG-Homologen zeigte eine Überexpression von

RGS-PX1, die zur Degradation des EGF (Epidermal Growth Factor)-Rezeptors führte.

V Diskussion 75

Darüber hinaus wiesen Knockoutmutanten bei Mäusen dramatische Defekte in der

Endozytose und Translokalisation von Proteinen auf, die zu einer embryonalen Letalität

führten (Zheng et al. 2001; Zheng et al. 2006). Bezugnehmend auf diese Beschreibung von

RGS-PX1 könnte ROG1 ebenfalls an Prozessen der Translokalisation von Proteinen oder

an der Endozytose der beiden Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 beteiligt sein. Um dies

zu bestätigen sind Knockoutstudien von ROG1 nötig, um einen möglichen Defekt in

diesen Prozessen untersuchen zu können. Da die PX-Domäne bei RGS-PX1 eine für

„Sorting Nexine“ typische Lokalisation am Phospholipid-angereicherten Endosom bewirkt,

ergeben sich zum wiederholten Mal Hinweise auf eine endosomale Assoziation von ROG1

in der Literatur. In Säugern interagiert RGS-PX1 am Endosom mit Gαs, wodurch eine

räumliche Nähe zu internalisierten Rezeptoren geschaffen wird und eine

Signalweiterleitung am Endosom vermutet werden kann (von Zastrow und Mostov 2001).

Diese im Jahr 2001 bei Säugetieren publizierte endosomale Translokalisation eines

Signalkomplexes konnte 2006 von Slessareva und Mitarbeitern ebenfalls in der

Pheromonantwort der Hefe S. cerevisiae beschrieben werden.

In der Hefe wird die GTP-gebundene Gα-Untereinheit GPA1 an das Endosom

translokalisiert und interagiert dort mit der katalytischen Untereinheit der

Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K) VPS34 (Slessareva et al. 2006). Da mittels dieser

Interaktion Phosphoinositol-3-Phosphat (PtdIns3P) hergestellt wird und eine Rekrutierung

von Proteinen mit PX-Domänen an das Endosom bewiesen werden konnte, ergibt sich

anhand dieses Signalkomplexes aus der Hefe eine Verbindung zu ROG1 als GAP eines

analogen Komplexes in S. macrospora. Diese hypothetische ROG1-Funktion ist darüber

hinaus sehr interessant, da Slessareva und Mitarbeiter eine Beteiligung eines RGS-Proteins

zwecks Inaktivierung der Gα-Untereinheit GPA1 vermuten, aber bislang keines der aus der

Hefe bekannten RGS-Proteine mit diesem Komplex in Verbindung bringen konnten. Dies

kann dadurch begründet sein, dass in der Hefe kein RGS-Protein mit der Domänenstruktur

von ROG1 oder RGS-PX1 identifiziert worden ist.

In S. cerevisiae gibt es vier RGS-Proteine, SST2, RGS2, RAX1 und MDM1, von denen MDM1 das ROG1-Homolog in der Hefe ist. Das Protein SST2 aus S. cerevisiae war eines der ersten identifizierten RGS-Proteine, die 1996 beschrieben wurden und übt eine GAP-Aktivität auf GPA1 aus, wodurch es als negativer Regulator die Pheromonantwort steuert (Apanovitch et al. 1998). RGS2 wirkt als GAP auf die Gα-Untereinheit GPA2 und reguliert den cAMP-Signalweg in der Glukose-Wahrnehmung (Versele et al. 1999). Für RAX1 und MDM1 sind bislang keine GAP-Aktivität beschrieben worden (Chasse et al. 2006).

V Diskussion 76

Das S. cerevisiae-Protein MDM1 (Mitochondrial distribution and morphology 1) besitzt

die Domänen PXA, PX und Nexin C als Charakteristika der „Sorting Nexine“, wodurch es

mittels in silico-Analysen als ROG1-Homolog identifiziert werden kann. Darüber hinaus

unterscheidet sich das Protein MDM1 aus der Hefe jedoch deutlich von ROG1 aus

S. macrospora und dem humanen RGS-PX1, da es keine RGS-Domäne aufweist

(Abb. 10). Des Weiteren reguliert MDM1 mit der Vererbung der Organellen von der

Tochter- zur Mutterzelle während der Zellteilung einen Prozess, bei dem bislang kein

Einfluss von G-Proteinen beschrieben werden konnte (Fisk und Yaffe 1997). Aufgrund

seiner Funktion und der fehlenden RGS-Domäne ist eine GAP-Aktivität des

MDM1-Proteins aus S. cerevisiae sehr unwahrscheinlich und liefert für die vorliegende

Arbeit keine weiteren Hinweise auf eine mögliche Funktion von ROG1 als negativer

Regulator der Fruchtkörperentwicklung in S. macrospora. Die Hypothese einer

endosomalen Rekrutierung des ROG1-Proteins über seine PX-Domäne wird in diesem

Zusammenhang hingegen angesichts einer beschriebenen Bindung von MDM1 an

PtdIns3P bekräftigt (Yu und Lemmon 2001).

Weitere ROG1-Homologe konnten in Genomen von Hyphenpilzen wie Magnaporthe

grisea, P. chrysogenum, Aspergillus fumigatus, C. neoformans und N. crassa identifiziert

werden (Abb. 10). Obwohl diese Proteine noch nicht funktionell beschrieben sind, könnte

die gleiche Domänenstruktur aus PXA-, PX- und RGS-Domäne auf eine ROG1-ähnliche

Funktion hinweisen, die in weiteren Studien untersucht werden sollte.

Für ROG1 aus S. macrospora ergibt sich resultierend aus der Beschreibung des humanen

ROG1-Homologs, RGS-PX1, und der Verwandtschaft zu „Sorting Nexinen“ eine

hypothetische endosomal-assoziierte GAP-Funktion für die Gα-Untereinheit GSA1. Die

identifizierte RGS-Domäne des ROG1-Proteins sowie die bestätigte, spezifische Bindung

an GTP-GSA1 bekräftigen diese Hypothese, da sie charakteristische Eigenschaften der

GAP-Proteine darstellen. Die Translokalisation des ROG1-Proteins zum Endosom könnte

diesbezüglich über die identifizierte PX-Domäne vermittelt werden, die als

Phospholipid-bindendes Motiv in der Literatur beschrieben wird. Weitere Hinweise auf

einen endosomal-assoziierten Signalkomplex in S. macrospora werden im nächsten

Kapitel hinsichtlich einer Interaktion der Gα-Untereinheit GSA1 mit der PI3-Kinase

SmVPS34 diskutiert, deren Lokalisation am Endosom aufgrund des Hefe-Homologs,

VPS34 bekannt ist (Herman et al. 1991; Huh et al. 2003).

V Diskussion 77

4. Die Gα-Untereinheit GSA1 interagiert mit Phospholipid-assoziierten

Proteinen Die im vorherigen Kapitel beschriebene Phospholipid-assoziierte Lokalisation von

ROG1-Homologen im Menschen und in der Hefe sowie die putative GAP-Funktion des

ROG1-Proteins für die Gα-Untereinheit GSA1 deuten auf eine mögliche Funktion von

GSA1 am phospholipidreichen Endosom hin. Diese These wird im Folgenden durch

Ergebnisse aus in dieser Arbeit durchgeführten in vivo-Interaktionsstudien bestärkt,

demzufolge eine Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-Kinase) und deren Gegenspieler, eine

Phosphoinositol-Phosphatase (PIPase) als weitere spezifische Interaktionspartner der

GTP-gebundenen Gα-Untereinheit GSA1 identifiziert werden konnten.

Die Funktion von Phosphoinositol-Phosphatasen besteht in der Dephosphorylierung von

Phosphoinositolen (PtdIns), bei der jede Phosphatase eine eigene Substratspezifität besitzt

(Strahl und Thorner 2007). Bei Sequenzvergleichen mit der PIPase konnten homologe

Proteine in N. crassa, Chaematomium globosum. M. oryzeae, Podospora anserina und

S. cerevisiae identifiziert werden. In Bezug auf die Bestimmung einer Substratspezifität

der identifizierten PIPase konnte anhand des bereits charakterisierten Hefe-Homologs

INP52 eine Spezifität in der Dephosphorylierung von Phosphoinositoltriphosphat

(PtdIns3P) zu Phosphoinositol (PtdIns) und von Phosphoinositoldiphosphat (PtdIns[3,5]P2)

zu Phosphoinositol ermittelt werden (Strahl und Thorner 2007). Mit der

Dephosphorylierung von PtdIns3P zu PtdIns wirkt die PIPase entgegengesetzt zu

Phosphoinsoitol-3-Kinasen (PI3-Kinasen), die PtdIns zu PtdIns3P phosphorylieren.

PtdIns3P wirkt im Zusammenhang mit Signaltransduktionen als sekundärer Botenstoff,

über den das primäre Signal von der Plasmamembran ausgehend intrazellulär weiterleitet

wird.

Das Spektrum der Prozesse, die durch Phospholipide vermittelt werden ist breitgefächert

und umfasst den vesikulären Transport, das Zellwachstum und die Regulation der

Apoptose (Damilano et al. 2010; Engelman et al. 2006; Khwaja et al. 1997; Leevers et al.

1996; Rapoport et al. 1997; Wurmser und Emr 1998). Für die als

GSA1-Interaktionspartner identifizierte PIPase konnte zwar bislang keine Funktion im

Bereich der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion in der Literatur gefunden werden,

doch ergibt sich anhand des entgegengesetzt wirkenden Enzyms, der PI3-Kinase VPS34

und ihrer Beschreibung als spezifischer Effektor der Gα-Untereinheit GPA1 in der Hefe,

eine weitere Verbindung von Gα-Untereinheiten zu Phospholipiden (Slessareva et al.

2006). PI3-Kinasen werden aufgrund ihrer katalytischen Domäne und ihrer

V Diskussion 78

Substratspezifität in drei Klassen unterteilt, von denen in Pflanzen, der Hefe S. cerevisiae

und dem Hyphenpilz S. macrospora mit VPS34 nur der Vertreter aus Klasse III

identifiziert wurde (Nowrousian et al. 2010; Vanhaesebroeck et al. 2001). PI3-Kinasen

stellen einen häufigen Interaktionspartner von G-Proteinen dar. Neben VPS34 in der Hefe

sind z.B. auch PI3-Kinasen aus Klasse I in Säugetieren als Effektoren des G-Protein-

Signalweges bekannt (Leopoldt et al. 1998; Stoyanov et al. 1995; Yeung und Wong 2010).

Der Aufbau der PI3-Kinase aus einer katalytische Untereinheit, VPS34 und einer

regulatorischen Untereinheit VPS15 ist in allen Eukaryoten konserviert und ist neben dem

vesikulären Transport, der Proteinsynthese und der Regulation des mTOR-Signalweges vor

allem aufgrund ihrer Beteiligung an einem endosomalen Signalweg in S. cerevisiae für

diese Arbeit interessant (Burda et al. 2002; Nobukuni et al. 2005; Schu et al. 1993;

Slessareva et al. 2006). In der Literatur wird darin eine Aktivierung der PI3-Kinase VPS34

am Endosom durch die Gα-Untereinheit GPA1 beschrieben, wodurch der sekundäre

Botenstoff PtdIns3P hergestellt und über die Aktivierung der MAP-Kinase FUS3 die

bevorstehende Paarung der Hefezellen eingeleitet wird (Pheromonantwort in der Hefe,

siehe Kap. 2.2.1.). Die GDP-gebundene Form von GPA1 interagiert ebenfalls am Endosom

mit der regulatorischen Untereinheit der PI3-Kinase, VPS15, die hinsichtlich eines WD40-

Motivs die analoge Struktur einer Gβ-Untereinheit ausbildet. Für VPS15 wurde darüber

hinaus die Funktion eines Gerüstproteins für einen Signalkomplex aus GPA1 (Gα) und

ATG14 (putative Gγ-Untereinheit) beschrieben, wodurch wahrscheinlich ein komplettes

heterotrimeres G-Protein am Endosom vorliegt (Dohlman und Slessareva 2006; Heenan et

al. 2009). Obwohl die Daten aus der Hefe darauf hindeuten, dass die Gα-Untereinheit

GPA1 in beiden Aktivitätszuständen endosomal lokalisiert ist, konnte bislang keine

Reaktivierung nötiger Regulatoren wie eines Guanosin-Austauschfaktors oder eine

Inaktivierung über ein GTPase-aktivierendes Protein beschrieben werden. Eine

diesbezüglich diskutierte Rekrutierung solcher Faktoren über Phospholipid-bindende

Motive wie eine FYVE- oder PX-Domäne durch die Produktion von PtdIns3P deutet auf

eine mögliche Beteiligung des in dieser Arbeit identifizierten RGS-Proteins ROG1 hin

(Slessareva et al. 2006). ROG1 ist aufgrund seiner Domänenstruktur und seiner putativen

Funktion als GAP prädestiniert für die Regulation eines dementsprechenden Komplexes in

S. macrospora, weshalb in der vorliegenden Arbeit eine mögliche Interaktion von GSA1

und dem VPS34-Homolog aus S. macrospora SmVPS34 untersucht wurde. Bei

S. macrospora ist SmVPS34 analog zur Hefe die einzige PI3-Kinase, die ebenfalls anhand

ihrer katalytischen Domäne PI3-Kc als Klasse III-PI3-Kinase eingeordnet werden kann

V Diskussion 79

(Abb. 12). Die annotierte Sequenz von SmVPS34 lag bereits vor, da es auch in Studien zur

Aufklärung der Autophagie bei S. macrospora untersucht wird (Pöggeler, persönliche

Mitteilung). VPS34-Homologe sind in vielen eukaryotischen Organismen als wichtiger

Bestandteil eines regulatorischen Multiproteinkomplexes während der Autophagie

beschrieben, deren Einfluss auch im Hinblick auf die sexuelle Entwicklung untersucht wird

(Hu et al. 2008a; Juhasz et al. 2008; Kihara et al. 2001; Zhong et al. 2009; Zhou und Wang

2010). In diesem Kontext konnte in VPS34-unabhängigen Studien die Notwendigkeit der

Autophagie für die Fruchtkörperentwicklung bei S. macrospora beschrieben werden

(Nolting et al. 2009).

Als Autophagie wird ein katabolischer Prozess bezeichnet, in dessen Verlauf eine Zelle ihre Makromoleküle und Organellen über spezielle Vesikeltransporte ins Lumen der Vakuole bei der Hefe bzw. bei Säugern ins Lysosom transportiert, diese dort degradiert und für den Metabolismus wiederverwertet. Bei Säugern wird die Autophagie im Verlauf der Erneuerung alter Proteine und Organellen angewendet, wohingegen in der Hefe die Autophagie durch Nährstoffmangel induziert wird (Funderburk et al. 2010; He und Klionsky 2009).

Eine mögliche Assoziation von SmVPS34 mit G-Protein-vermittelten Signalwegen wurde

in der vorliegenden Arbeit mittels in vivo-Interaktionsstudien mit den drei

Gα-Untereinheiten GSA1, GSA2 und GSA3 sowie der beiden konstitutiven Formen

GSA1_CA (konstitutiv aktiv) und GSA1_CI (dominant negativ) in S. macrospora

untersucht. Dabei konnte eine spezifische Interaktion von SmVPS34 mit der

Gα-Untereinheit GSA1 nachgewiesen werden. Aufgrund der in dieser Arbeit

durchgeführten Ko-Immunopräzipitationsanalysen bestätigte sich die Bindung von

SmVPS34 an GSA1 in vitro, die darüber hinaus in Abhängigkeit vom Aktivitätszustand

der Gα-Untereinheit ausgebildet wurde. SmVPS34 bindet präferiert an die GTP-gebundene

Form von GSA1, da nur die konstitutiv aktive Form GSA1_CA mit SmVPS34 in

aussagekräftigen Mengen ko-immunopräzipitiert werden konnte. Zwar sind innerhalb der

Ansätze mit dem wildtypischen GSA1 und der dominant negativen Form schwache

Banden der Gα-Untereinheit in der Elution zu erkennen, doch zeigen diese im Vergleich zu

den Ansätzen des konstitutiv aktiven GSA1_CA eine dominante Bindungsaffinität von

SmVPS34 zu der aktiven GSA1-Form GSA1_CA (Abb. 13). Darüber hinaus konnte in der

vorliegenden Arbeit erfolgreich der mit GSA1 interagierende Bereich von SmVPS34

innerhalb des N-terminalen Bereichs (AS 1-337) eingegrenzt werden (Tab. 10). Dieser

trägt die C2-Domäne, deren Funktion bei Protein-Protein-Interaktionen bereits für das

humane VPS34-Homolog hVPS34 beschrieben wurde. In diesem Fall bindet das Protein

Beclin1 (VPS30 in der Hefe) über die C2-Domäne an hVPS34, um die Autophagie

V Diskussion 80

einzuleiten (Liang et al. 2006). Eine weitere Bestätigung ergibt sich darüber hinaus für das

Hefe-Homolog VPS34, dessen C-Terminus durch die regulatorische Untereinheit VPS15

gebunden vorliegen muss, da eine Assoziation dieser beiden Proteine die Rekrutierung von

GPA1 zum Endosom gewährleistet (Heenan et al. 2009; Slessareva und Dohlman 2006;

Strahl und Thorner 2007).

Durch die Identifizierung einer exklusiven Interaktion der GTP-gebundenen GSA1-Form

mit der PI3-Kinase, SmVPS34, und der entgegengesetzt wirkenden

Phosphoinsoitol-Phosphatase konnten in der vorliegenden Arbeit zwei neue Gα-Effektoren

in S. macrospora beschrieben werden, die eine Spekulation über eine Phospholipid-

vermittelte Signalweiterleitung ermöglichen. In diesem Zusammenhang wurde aktuell die

Notwendigkeit eines anderen Phospholipids, Phosphoinositoldiphosphat (PtdIns[4,5]P2) für

die MAP-Kinase-vermittelte Pheromonantwort in der Hefe beschrieben, in der über das

Phospholipid die Rekrutierung eines Signalkomplexes in Richtung der

Pheromonprojektion eingeleitet wird (Garrenton et al. 2010). In S. macrospora könnte die

Interaktion von GSA1 mit der PI3-Kinase SmVPS34, analog zu Daten aus der Hefe, die

Produktion von PtdIns3P einleiten. Nachfolgend könnte dieses Phospholipid als mögliches

Signal für die Phosphorylierung einer MAP-Kinase-Kaskade wirken, wie es für die

MAP-Kinase FUS3 in S. cerevisiae vermutet wird (Slessareva et al. 2006). Eine mögliche

Funktion einer MAP-Kinase innerhalb von Entwicklungsprozessen bei Hyphenpilzen

wurde diesbezüglich in N. crassa für das FUS3-Homolog MAK2 in der Regulation des

vegetativen und sexuellen Wachstums beschrieben (Li et al. 2005; Slessareva et al. 2006).

Ergänzend dazu wird bei N. crassa aufgrund einer Überschneidung der weiblich sterilen

Phänotypen der MAP-Kinase MAK2 und der Gα-Untereinheit GNA1 eine Regulation des

MAP-Kinase-Kaskade-Weges über Gα spekuliert, wofür der in dieser Arbeit identifizierte

Signalweg über den sekundären Botenstoff PtdIns3P ein möglicher Kandidat sein könnte

(Li et al. 2005). In S. macrospora könnte GSA1 bei Regulation über PtdIns3P sowohl die

Aktivierung eines entsprechenden Signalweges (Interaktion mit VPS34 und anschließender

Produktion von PtdIns3P) als auch dessen Beendigung (Aktivierung der

Phosphoinositol-Phosphatase und anschließender Dephosphorylierung von PtdIns3P) über

die Konzentration des sekundären Botenstoffes PtdIns3P steuern. Eine Voraussetzung für

diese Regulation ist, dass die Interaktion von GSA1 mit beiden Proteinen zu einer

Aktivierung ihrer Funktion führt, was in nachfolgenden Studien detaillierter untersucht

werden sollte.

V Diskussion 81

Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit zwei Effektoren der

Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora beschrieben werden, was auf eine mögliche

Signaltransduktion über Phospholipide hindeutet, die am Endosom lokalisiert sein könnte.

Das identifizierte RGS-Protein ROG1 stellt in diesem Zusammenhang einen möglichen

negativen Regulator des Signalweges dar. Im nächsten Kapitel wird abschließend ein

zusammenfassendes Arbeitsmodell der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion in

S. macrospora dargestellt, wie es sich anhand der erzielten Ergebnisse dieser Arbeit

ableiten lässt.

5. Interaktionsnetzwerk der Gα-Untereinheit GSA1 in Sordaria

macrospora In der vorliegenden Arbeit konnte für die Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora durch

Einsatz von konstitutiven Formen sowie die Identifikation von interagierenden Proteinen

eine Rolle für GSA1 als zentraler Regulator in der sexuellen und vegetativen Entwicklung

beschrieben werden. Für beide Funktionen ist die Aktivierung von GSA1 durch GTP

notwendig, wodurch GSA1-GTP-interagierende Proteine als mögliche Effektoren eine

wichtige Rolle einnehmen. Darauf bezugnehmend stellt Abbildung 17 ein aktuelles

Arbeitsmodell der über GSA1 vermittelten Signaltransduktion in S. macrospora dar. Es

basiert auf den in dieser Arbeit identifizierten Effektoren und Regulatoren der aktiven

Gα-Untereinheit GSA1 und beinhaltet bis auf VPS15 und dem Gβγ-Dimer nur Proteine,

die innerhalb dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert wurden. Bei VPS15 wurden

Daten aus dem homologen Modell des endosomalen Signalkomplexes von S. cerevisiae

zur Darstellung herangezogen (Slessareva et al. 2006). Das Arbeitsmodell in Abbildung 17

wurde für eine übersichtlichere Beschreibung in drei Abschnitte untergliedert, die im

Folgenden nacheinander beschrieben werden.

(1) Zu Beginn der Signaltransduktion durchläuft GSA1 den allgemein bekannten

Aktivierungszyklus einer Gα-Untereinheit, der in S. macrospora durch Bindung eines

Pheromonvorläufers (PPG1 bzw. PPG2) an den jeweiligen Pheromonrezeptor (PRE1 bzw.

PRE2) initiiert wird (Mayrhofer et al. 2006; Pöggeler 2000). Durch Bindung des

Pheromons wirkt der Rezeptor als Guanosin-Austauschfaktor (GEF) und ersetzt das an

GSA1 gebundene Nukleotid Guanosindiphosphat (GDP) durch ein Guanosintriphosphat

(GTP). GTP-gebunden dissoziiert GSA1 vom Gβγ-Dimer und aktiviert stromabwärts

liegende Effektoren. Diese Aktivierung von GSA1, die zur GTP-gebundenen GSA1-Form

V Diskussion 82

führt, ist essentiell für die Fruchtkörperentwicklung bei S. macrospora, wie es in der

vorliegenden Arbeit anhand von konstitutiven Varianten gezeigt werden konnte.

(2) Die GTP-gebundene Form von GSA1 wird vermutlich zum Endosom translokalisiert

und aktiviert dort die PI3-Kinase SmVPS34 (VPS34 in Abb. 17). Eine endosomale

Lokalisation der Kinase könnte in diesem Fall wie bei S. cerevisiae über die regulatorische

Untereinheit SmVPS15 (VPS15 in Abb. 17) eingeleitet werden (Slessareva et al. 2006).

Die Endozytose von GSA1 und daher eine endosomale Lokalisation könnte über Ubiquitin

vermittelt werden. Hinweise darauf ergeben sich aus in vivo-Interaktionsstudien, bei denen

Proteine der Ubiquitinierung und Deubiquitinierung als mögliche Interaktionspartner von

GSA1 in dieser Arbeit identifiziert werden und diese spezifische Assoziation in der

Literatur bekräftigt wird (Terrell et al. 1998; Torres et al. 2009). Durch eine GSA1-

vermittelte Aktivierung der PI3-Kinase am Endosom wird der sekundäre Botenstoff, das

Phosphoinositol-3-Phosphat (PtdIns3P), gebildet, über das die intrazelluläre

Signalweiterleitung erfolgt. Darüber hinaus bewirkt PtdIns3P vermutlich die endosomale

Rekrutierung des in dieser Arbeit identifizierten RGS-Proteins ROG1 über dessen

PX-Domäne. In räumlicher Nähe zur Gα-Untereinheit GSA1 wird für ROG1 aufgrund

seiner RGS-Domäne eine Funktion als GAP postuliert, so dass GSA1 inaktiviert und der

Signalweg ausgeschaltet wird. Dementsprechend wird ein endosomal lokalisierter

Signalkomplex aus Gα-Untereinheit und RGS-Protein analog zum ROG1-Homolog

RGS-PX1 in Säugetieren postuliert (von Zastrow und Mostov 2001; Zheng et al. 2001).

Inaktiviert könnte das GDP-gebundene GSA1 entweder an die regulatorische Untereinheit

VPS15 binden, da für das VPS15-Homolog in der Hefe eine Gβ-Untereinheit-ähnliche

Struktur beschrieben wurde, oder mit Gβγ reassoziieren, wodurch der

Gα-Aktivierungszyklus abgeschlossen wäre und ein am GPCR gebundenes, inaktives

heterotrimeres G-Protein vorliegen würde, das durch erneute Ligandenbindung reaktiviert

werden kann und den Signalweg erneut anschaltet.

V Diskussion 83

Abbildung 17: Modell der heterotrimeren G-Protein-vermittelten Signaltransduktion in S. macrospora mit Fokus auf den zentralen Regulator GSA1. Durch Bindung des Liganden am Pheromonrezeptor wird durch GEF-Aktivität des GPCR das GDP der Gα-Untereinheit durch ein GTP ersetzt und Gα-GTP dissoziiert vom Gβγ-Dimer (1). Die Weiterleitung über Gβγ ist in dieser Arbeit nicht berücksichtigt worden, weshalb dieser Bereich verblasst dargestellt ist. GSA1 ist der zentrale Regulator innerhalb der Signaltransduktion und aktiviert nach Dissoziation von Gβγ die katalytische Untereinheit der Phosphoinositol-3-Kinase (PI3-K) VPS34 am Endosom, wodurch der sekundäre Botenstoff PtdIns3P hergestellt wird, über den das Signal weitergeleitet wird. Durch PtdIns3P wird der negative Regulator ROG1 über die PX-Domäne zum Endosom rekrutiert und inaktiviert GSA1 als GAP (GTPase aktivierendes Protein), wodurch der Signalweg beendet wird und GSA1 entweder an die Plasmamembran zurückkehrt oder eine Bindung mit der regulatorischen Untereinheit der PI3-Kinase VPS15 aufgrund ihrer Gβ-ähnlichen Struktur eingeht. Zur negativen Steuerung des PtdIns3P-Spiegels wird eine Phosphoinositol-Phosphatase (PIPase) als GSA1-Effektor aktiviert, wodurch PtdIns3P dephosphoryliert wird und die Signalweiterleitung über PtdIns3P gestoppt wird (2). Zur erneuten Aktivierung des Signalweges muss GSA1 über einen GEF reaktiviert oder durch GTP-GSA1 ersetzt werden. Die Funktion der Bindung von GSA1 und dem Transkriptionsfaktor STE12 wird aufgrund seiner Funktion in S. macrospora als mögliche Verbindung zur Ascosporogenese spekuliert (3).

An dem beschriebenen endosomalen Signalkomplex wird darüber hinaus in dieser Arbeit

die Beteiligung eines zweiten identifizierten GSA1-Effektors, der Phosphoinositol-

Phosphatase (PIPase), beschrieben, die durch Dephosphorylierung von PtdIns3P zu PtdIns,

die entgegengesetzte Funktion von VPS34 durchführt. In diesem Zusammenhang kann

eine GSA1-vermittelte Regulation über die vorherrschende Menge des sekundären

Botenstoffes PtdIns3P durch Bindung des jeweiligen Effektors (PIPase oder VPS34)

V Diskussion 84

vermutet werden, da eine steigende Konzentration von PtdIns3P die Rekrutierung von

ROG1 einleitet und den Signalweg beendet. Durch diese Rekrutierung des negativen

Regulators ROG1 könnte zudem ein möglicher Rückkopplungseffekt über PtdIns3P

bestehen, wodurch sich der Signalweg selbst steuert. Diese Selbstregulation kann aufgrund

einer Beschreibung aus Hefe dem eigenem Überleben dienen, da PtdIns3P in zu hoher

Konzentration toxisch auf den Organismus wirkt (Parrish et al. 2004, 2005).

Bei einer möglichen Funktion des in dieser Arbeit postulierten endosomalen Signalweges

innerhalb der Fruchtkörperentwicklung ist auch die Möglichkeit der Aktivierung eines

MAP-Kinase-Signalweges analog zu Beschreibungen in der Hefe zu bedenken. Dort wird

in der Pheromonantwort parallel zum an der Plasmamembran lokalisierten Gβγ-Signalweg

durch das produzierte PtdIns3P am Endosom ebenfalls die MAP-Kinase FUS3 aktiviert.

Anschließend wird durch Regulation des Zellzyklus über das Protein FAR1 und durch

Steuerung der Transkription über den Transkriptionsfaktor STE12 die Fusion der

Hefezellen eingeleitet (Dohlman und Thorner 2001; Slessareva et al. 2006).

(3) Eine weitere Regulation von GSA1 könnte durch die in dieser Arbeit identifizierte

Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor STE12 möglich sein, da für diesen in

S. macrospora eine Funktion bei der Ascosporogenese beschrieben werden konnte

(Nolting und Pöggeler 2006). Als Hypothese wäre in diesem Zusammenhang eine

zeitversetzte Regulation denkbar, in der GSA1 über den endosomalen Signalweg die

Fruchtkörperbildung einleitet, um nachfolgend für die Ascosporogenese mit STE12 zu

interagieren. Diese Hypothese wird durch den Phänotyp des im Vorfeld dieser Arbeit

generierten Doppelknockoutstammes ∆gsa1/∆ste12 unterstützt, bei der sowohl ein Defekt

in der Ascosporogenese als auch in der Bildung von Fruchtkörpern beobachtet werden

konnte. Entsprechende Einzelmutanten zeigten hingegen nur einen Phänotyp in der

Fruchtkörperentwicklung (∆gsa1) oder in der Ascosporogenese (∆ste12) (Kamerewerd et

al. 2008; Nolting und Pöggeler 2006). Für eine weitere Klärung dieser Interaktion, z.B. in

Bezug auf Ort und Zeit der Wechselwirkung bieten sich Lokalisationsstudien zu

verschiedenen Entwicklungsstadien des Pilzes an.

In der vorliegenden Arbeit wurde bei S. macrospora ein Signalkomplex identifiziert, der

möglicherweise analog zu Beschreibungen in Säugern und der Hefe am Endosom

lokalisiert ist. Durch weiterführende Analysen und die Lokalisation der einzelnen

Komponenten sowie die Untersuchung der möglichen negativen Regulation über das

identifizierte RGS-Protein ROG1, könnte diese Hypothese in folgenden Studien näher

untersucht werden. Für eine Bestätigung der Assoziation mit dem Endosom würden sich in

V Diskussion 85

diesem Zusammenhang Ko-Lokalisationsstudien durch Fluoreszenzmarkierung der

einzelnen involvierten Faktoren anbieten, die in Kombination mit einem für Endosomen

spezifischen Fluoreszenzprotein durchgeführt werden könnten. Zur Beschreibung

möglicher Querverbindungen und um mögliche Gerüstproteine innerhalb des

Signalkomplexes identifizieren zu können, bieten sich weiterführende Interaktionsstudien

der einzelnen Faktoren an. Zur zusätzlichen Aufklärung der Funktion der einzelnen

Komponenten und des gesamten Signalkomplexes könnten funktionelle Analysen mit

Deletionsmutanten durchgeführt werden, um die grundlegende Funktion des endosomalen

Signalkomplexes an der Fruchtkörperentwicklung zu bestätigen. Des Weiteren kann die

putative GAP-Aktivität des RGS-Proteins ROG1 in nachfolgenden Studien in

Kombination mit der in dieser Arbeit aufgereinigten aktiven Gα-Untereinheit GSA1

anhand von GTPase-Messungen ermittelt werden.

Es ist davon auszugehen, dass weiterführende Studien der in dieser Arbeit identifizierten

Interaktionspartner der Gα-Untereinheit GSA1 sowie des beschriebenen Signalkomplexes

zur weiteren Aufklärung von Entwicklungsprozessen in S. macrospora führen werden.

VI Zusammenfassung 86

VI Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der durch heterotrimere

G-Proteine vermittelten Signaltransduktion im Modellorganismus Sordaria macrospora

anhand einer Charakterisierung der Gα-Untereinheit GSA1 und deren Einfluss auf die

Fruchtkörperentwicklung. Durch direkte Mutagenese von gsa1 konnte eine konstitutiv

aktive und einer dominant negative Variante der Gα-Untereinheit GSA1 hergestellt

werden. Komplementationsstudien ergaben eine essentielle Rolle der aktivierten

GSA1-Form als positiven Regulator während der Fruchtkörperentwicklung des

Hyphenpilzes.

Die Verwendung der konstitutiven GSA1-Formen bei in vivo-Interaktionsstudien

ermöglichte darüber hinaus die Identifikation von Aktivitätsstatus-abhängigen

Interaktionspartnern der Gα-Untereinheit. Als möglicher negativer Regulator wurde mit

ROG1 in der vorliegenden Arbeit das erste Protein in S. macrospora identifiziert, das in

die Familie der Regulatoren des G-Protein-Signalweges (RGS-Proteine) eingeteilt werden

kann. Aufgrund homologer Proteine kann eine Funktion als GTPase aktivierendes Protein

(GAP) auf die Gα-Untereinheit GSA1 angenommen werden. Für nachfolgende Studien

dieser GAP-Aktivität bei ROG1 wurde durch Ko-Immunopräzipitationsanalysen die

Bindung an die aktive GSA1-Form bestätigt und bereits die intrinsische GTPase-Aktivität

der Gα-Untereinheit GSA1 ermittelt.

Als GSA1-Interaktionspartner wurde darüber hinaus die als Gα-Effektor aus der Hefe

bekannte endosomal lokalisierte Phosphoinositol-3-Kinase VPS34 durch Hefe-2-Hybrid-

und Ko-Immunopräzipitationsanalysen bei S. macrospora charakterisiert. Mit der

Phosphoinositol-Phosphatase als GSA1-Effektor, interagiert GSA1 in diesem Kontext

ebenfalls mit dem direkten Gegenspieler von VPS34 bei der Synthese des sekundären

Botenstoffes Phosphoinositoltriphosphat, wodurch eine Phosphoinositol-vermittelte

Regulation bestimmter Prozesse der Fruchtkörperentwicklung über GSA1 denkbar ist.

Zusammenfassend kann in S. macrospora anhand des identifizierten Interaktionsnetzwerks

der Gα-Untereinheit GSA1 von einem möglichen endosomaler Signalkomplex

ausgegangen werden, dessen Existenz aufgrund von Literaturdaten über die

Pheromonantwort in der Hefe bekräftigt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das

Wissen über den Einfluss G-Protein-vermittelter Signalwege auf eukaryotische

Zelldifferenzierungsprozesse und können zum weiteren Verständnis komplexer

Regulationen auf andere Organismen übertragen werden.

VII Summary 87

VII Summary

The aim of this study was to analyse signal transduction mediated by heterotrimeric

G proteins in the model organism Sordaria macrospora by means of characterizing the Gα

subunit GSA1 and its influence on fruiting body morphogenesis. Direct mutagenesis of

gsa1 led to the successful construction of a constitutively active as well as a dominant

negative variant of the Gα subunit GSA1. Complementation studies show that the activated

GSA1 variant is a positive regulator of GSA1 and essential for fruiting body development

in S. macrospora. Constitutive GSA1 derivates were further used in in vivo interaction

studies. Hereby, interaction partners of the Gα subunit were identified that bind

specifically to the active or the negative form of GSA1. One of these, ROG1, is the first

characterised RGS-protein in S. macrospora, ROG1 and could serve as a negative

regulator. Orthologues of ROG1 have been described to function as GTPase activating

proteins (GAPs) and thus, this could be presumed for ROG1 also. To further characterise a

putative GAP-activity of ROG1 for GSA1, exclusive binding of ROG1 to the

constitutively active GSA1 form was confirmed by co-immunoprecipitation and the

intrinsic GTPase activity of GSA1 was measured.

In further analysis, the endosomal localised phosphoinositol-3-kinase VPS34, known as a

Gα effector from yeast, could be confirmed as a GSA1 interaction partner as well by

in vivo as in vitro interaction studies in S. macrospora. Interestingly, GSA1 further binds to

the phosphoinositide phosphatase, the direct antagonist of VPS34 during the synthesis of

the second messenger Phosphoinositol triphosphate, which indicates a phosphoinositide-

mediated regulation by GSA1.

In summary the identified interaction network of the Gα subunit GSA1hints to a putative

endosomal signaling complex in S. macrospora involved in signal transduction mediated

by G proteins during fruiting body development of filamentous fungi. Since fruiting body

morphogenesis is used as a model for eukaryotic cell differentiation in general, aspects of

this study can be applied to a further understanding of complex regulations of G protein

mediated signal transduction.

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VIII Literatur

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Curriculum vitae

Christian Schäfers,

Geboren am 20.03.1978 in Witten

1985-1988 Breddeschule (Grundschule), Witten

1988-1992 Ruhr-Gymnasium, Witten

1992-1996 Otto-Schott-Realschule, Witten

1996-1999 Gymnasiale Oberstufe des Cuno II Berufskollegs, Hagen

2001-2002 Biologie (Lehramt, Sek. II) / Universität Essen

2002-2007 Diplom-Studiengang Biologie, Diplomarbeit am Lehrstuhl für

Allgemeine und Molekulare Botanik, Ruhr-Universität Bochum

Diplomarbeit mit dem Thema: „Funktionelle Analyse von Interaktionspartnern des Transkriptionsfaktors Ste12 aus Sordaria macrospora“

Seit Dez. 2007 Promotions-Studiengang Biologie, Anfertigung der Dissertation am

Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik, Ruhr-Universität

Bochum

Dissertation mit dem Thema: „Heterotrimere G-Proteine in Pilzen: Die Funktion der Gα-Untereinheit GSA1 in der Entwicklung des Modellorganismus Sordaria macrospora“

Publikationen: Elleuche S, Bernhards Y, Schäfers C, Varghese JM, Nolting N, Pöggeler S (2010) The small

serine-threonine protein SIP2 interacts with STE12 and is involved in ascospore germination in Sordaria macrospora. Eur J Cell Biol 89:873-887

Kongressbeiträge:

Vorträge:

Schäfers C, Kück U (2009) Heterotrimeric G protein in Sordaria macrospora: Interaction partners

of the G protein alpha subunit GSA1. In: 9th VAAM Symposium "Molecular Biology of Fungi", Münster, Germany

Poster:

Schäfers C, Kück U (2009) G-Protein mediated signal transduction in a filamentous fungus: Use of the yeast-two-hybrid-system to identify interaction partners of the alpha subunit GSA1. In: VAAM Annual Meeting, Bochum, Germany

Kamerewerd J, Schäfers C, Jansson M, Nowrousian M, Pöggeler S, Kück U (2009) Distinct

roles of three G protein a-subunits and an adenylyl cyclase in fruiting body development of the homothallic fungus Sordaria macrospora. In: 25th Fungal Genetics Conference, Asilomar, Pacific Grove, USA

Schäfers C, Kück U (2010) Activation state-dependent interaction partners of the G protein alpha

subunit GSA1 in Sordaria macrospora. In: 9th International Mycological Congress, Edinburgh, UK

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht habe und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet

habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort

und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 01.02.2011

(Christian Schäfers)

Heterotrimere G-Proteine in Pilzen · G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten Gα, Gβ und Gγ...

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