Quo vadis GBF? - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung€¦ · Die GBF entwickelt sich zu...

Quo vadis GBF?

Brennpunkt1

Für die GBF ist das Jahr 2001 mit einer Neuausrichtung ihrer Forschungsaktivitäten ver-bunden. Die GBF entwickelt sich zu einem Forschungszentrum für Infektionskrankheiten.Im Mittelpunkt steht die Analyse bakterieller Infektionsprozesse und deren Abwehr durchden Wirt, mit dem Ziel, wichtige Beiträge in der Prophylaxe, Diagnose und Therapie vonInfektionskrankheiten zu leisten. Mit der Entscheidung, sich erheblich stärker in derGesundheitsforschung zu positionieren und das Thema der Infektionskrankheiten zurWidmungsaufgabe zu machen, geht die GBF neue Wege. Warum gerade dieses Thema, undwohin soll die Reise gehen?

Infektionskrankheiten als globale Her-ausforderung

Infektionen sind für ein Drittel allerTodesfälle verantwortlich. Malaria,Tuberkulose und HIV wurden von derWorld Health Organization (WHO) alsdie Krankheiten identifiziert, die höchstePriorität in der globalen Krankheitsbe-kämpfung erhalten sollten. Aber auchandere wiederkehrende und neuauft-retende Infektionserkrankungen stellendie nationalen Gesundheitssysteme immerhäufiger vor kaum zu bewältigendeProbleme. Während man noch vorwenigen Jahren dachte, Infektionskrank-heiten gehörten in den entwickeltenLändern der Vergangenheit an, erkenntman jetzt, dass durch zunehmendeAntibiotika-Resistenzen, durch demo-graphische Veränderungen in Richtungälter werdende Gesellschaft sowie durchwachsende Mobilität Infektionskrank-heiten eine immer größere Bedeutungerlangen. Mit der Erforschung vonInfektionskrankheiten widmet sich dieGBF damit einem Forschungsgebiet, dasauf Grund der medizinischen Relevanzund des großen wissenschaftlichenPotenzials eine außerordentliche Bedeu-tung für die deutsche Gesundheitsfor-schung hat.

Neuausrichtung der GBF erhöht die Wett-bewerbsfähigkeit

Die GBF ist die einzige Einrichtunginnerhalb der Helmholtz-Gemeinschaft,die sich auf Infektionskrankheitenfokussiert. Zwar wird am DeutschenKrebsforschungszentrum (DKFZ) anviralen Infektionen gearbeitet, derSchwerpunkt liegt aber auf denEntstehungsmechanismen von Krebs.Auch am Max-Delbrück-Centrum fürMolekulare Medizin (MDC) und am GSF-

Forschungszentrum für Umwelt undGesundheit spielen Infektionserkrankun-gen hauptsächlich als Pathogenesefaktoranderer Erkrankungen eine Rolle. Ausdiesem Grunde nimmt die GBF durch ihreEntscheidung, sich schwerpunktmäßig derErforschung von Infektionskrankheiten zuwidmen, eine wichtige Alleinstellunginnerhalb der Helmholtz-Gemeinschaftein.

Entwicklungsgeschichte der GBFDie Konzeption der GBF als „NationalesZentrum für Biotechnologie“ erfolgte zueinem Zeitpunkt, als die technologischenVoraussetzungen für eine groß angelegteFermentierung und Aufarbeitung vonbiologischen Substanzen und Wirkstoffensowie das gesamte Methodenspektrum derrekombinanten DNA-Technologie erstnoch geschaffen werden mussten. Hierinlagen die Schwerpunkte der GBF-Forschungsaktivitäten von den 70ern bisin die 90er Jahre. Auch wenn Fragen derProzessentwicklung heute noch wichtigsind, hat sich das Forschungsinteresse inder Biotechnologie sehr viel stärker bio-logischen als technologischen Aspektenzugewandt.

Der Triumphzug der modernen Bio-technologie

Kaum ein anderes Forschungsgebiet hat inden letzten Jahren eine derart stürmischeEntwicklung erlebt wie die moderneBiotechnologie. Es gibt nur wenigeFachgebiete, in die biotechnologischeFragestellungen nicht eingezogen sind.Zusätzlich ist ein völlig neuartigerIndustriezweig – die Biotech-Industrie –entstanden, unbestritten eine derSchlüsseltechnologien dieses Jahrhun-derts. Neue biochemische, zell- undmolekularbiologische Methoden erlauben

Prof. Dr. Rudi Balling ❘Wissenschaftlicher Geschäfts-führer der GBF ❘ ScientificManaging Director of GBF

Focus 2

Quo vadis GBF?

For the GBF the year 2001 is associated with a reorientation of its research activities. The GBF isdeveloping into a research centre for infectious diseases. At the focus of research is the analysis ofbacterial infection processes and their combating by the host with the aim of furnishing importantcontributions in the prophylaxis, diagnosis and therapy of infectious diseases. With the decision toposition itself much more in health research and devote its efforts to infectious diseases the GBF isbreaking new ground. Why did we choose this topic and where are we going?

Infectious diseases as a global challengeInfections are responsible for one third of alldeaths. Malaria, tuberculosis and HIV havebeen identified by the World HealthOrganization (WHO) as those diseases whichshould be given the highest priority in theglobal fight against disease. But recurring andnewly occurring infectious diseases alsoconfront the national health systems more andmore frequently with problems that can hardlybe coped with. Whereas it was thought just afew years ago that infectious diseases were aproblem of the past in the developed countries,it is now recognized that they are gainingincreasing significance due to rising antibioticresistances, demographic changes towards anageing society as well as growing mobility.With research into infectious diseases the GBFdevotes itself to a field of study which is ofexceptional significance for German healthresearch on account of its medical relevanceand great scientific potential.

GBF’s new orientation increases itscompetitiveness

The GBF is the only institution within theHelmholtz Association which focuses its effortson infectious diseases. Although the GermanCancer Research Centre (DKFZ) is concernedwith viral infections, the focus there is on themechanisms of carcinogenesis. Infectiousdiseases also play a role mainly as apathogenesis factor of other diseases at theMax Delbrück Centre for Molecular Medicine(MDC) and the GSF Research Centre forEnvironment and Health. For this reason, theGBF occupies an exclusive position within theHelmholtz Association with its decision to givepriority to research into infectious diseases.

GBF development historyThe concept of the GBF as a “GermanResearch Centre for Biotechnology” wasdeveloped at a time when the technologicalprerequisites for a large-scale fermentationand processing of biological substances and

bioactive compounds as well as the wholerange of methods of recombinant DNAtechnology still had to be created. This was themain task of GBF research activities from the70s to 90s. Even if issues of processdevelopment are still of current interest today,research in biotechnology has turned muchmore strongly to biological rather thantechnological aspects.

The triumphal procession of modernbiotechnology

Hardly any other field of research hasexperienced such rapid development in recentyears as modern biotechnology. There are onlya few subject areas into which biotechno-logical issues have not been incorporated. Inaddition, a completely novel branch ofindustry – the biotech industry – has emerged,indisputably one of the key technologies of thiscentury. New biochemical, cytobiological andmolecular biological methods allow us tobetter understand the basic mechanisms ofgene expression, cell division, celldifferentiation and metabolic activities todayand are an indispensable prerequisite forderiving optimum benefit from biotechnology.However, the research topics have become sodiverse and complex here that one singleresearch centre can no longer cover manydifferent topics of biotechnology. This makes itnecessary to focus on just a few issues which,however, can then be dealt with in greaterdepth. Only in this way will it be possible tomaintain GBF’s competitiveness inbioscientific research and to attain aninternational top position.

Expertise and future specializationof GBF

The GBF therefore concentrates on a broad-based functional analysis of bacterial genes,because an understanding of infectionprocesses presupposes basic insights intospecific microbiological processes. Thiscomprises investigations to elucidate

Brennpunkt3

uns heute ein tieferes Verständnis dergrundlegenden Mechanismen vonGenexpression, Zellteilung, Zelldifferen-zierung und Stoffwechselleistungen undsind unabdingbare Voraussetzung dafür,den optimalen Nutzen aus derBiotechnologie zu ziehen. Hier sind aberdie Forschungsthemen so divers undkomplex geworden, dass ein einzelnesForschungszentrum nicht mehr vieleunterschiedliche Themenfelder derBiotechnologie abdecken kann. Diesmacht eine Fokussierung auf einigewenige Fragestellungen erforderlich, diedann allerdings vertieft angegangenwerden. Nur so kann die Wettbewerbs-fähigkeit der GBF in der biowissen-schaftlichen Forschung aufrechterhaltenund eine internationale Spitzenpositionerreicht werden.

Expertise und zukünftige Spezialisierungder GBF

Die GBF konzentriert sich deshalb aufeine breit angelegte Funktionsanalysebakterieller Gene, denn ein Verständnisvon Infektionsprozessen setzt grund-legende Einblicke in bestimmte mikro-biologische Prozesse voraus. Diesbeinhaltet Untersuchungen zur Aufklä-rung von Mechanismen des Zusammen-lebens von Bakterien als Gemeinschaften,zum Beispiel in Biofilmen, der Unter-suchung von Naturstoffen aus Bakteriensowie der Analyse von Mechanismen, diefür die Virulenz und Pathogenität von

Bakterien verantwortlich sind.Schon in den vergangenen Jahren hat

die GBF zunehmend ihre Forschungs-aktivitäten auf biologische Fragestellungenin der Gesundheitsforschung erweitert. Inder Mikrobiologie wurde ein Programmzu den Mechanismen der Pathogenitätvon Bakterien aufgenommen. In derZellbiologie wurde der Schwerpunkt aufFragen der zellulären Mikrobiologie gelegtund beispielsweise Themen aufgegriffen,wie sich Bakterien nach einer Infektioninnerhalb einer Wirtszelle fortbewegenund inwieweit bakterielle Proteine undProteine des Wirts dabei zusammenwir-ken. Auch in der Molekularen Biotechno-logie, der Naturstoffforschung und derBioverfahrenstechnik arbeiten bereits jetzteine Reihe von GBF-Wissenschaftlern aninfektionsrelevanten Fragen, wie der Iso-lierung von antibakteriellen Substanzen,der Expression und Bedeutung einzelnerInterferongene in Signaltransduktions-prozessen nach Infektionen oder der Pro-duktion von Impfstoffen und anderenbiopharmazeutischen Wirkstoffen nacharzneimittelrechtlichen Standards (GMP).

Ausgebaut werden an der GBFForschungsaktivitäten über grundlegendemolekulare, zellbiologische, immuno-logische und genetische Mechanismen,die an bakteriellen Infektionsprozessenbeteiligt sind. Dazu gehören dieAufklärung von Interaktionen zwischenPathogen und Wirtszellen, Untersuchun-gen über Invasionsmechanismen vonBakterien, die Identifizierung undCharakterisierung von Genen und Gen-produkten, die an Abwehrreaktionengegenüber Infektionen beteiligt sind,sowie die Aufklärung der räumlichenStruktur von Virulenzfaktoren und damitinteragierenden Wirtszellproteinen bis hinzur Identifizierung von Impfstoffkandi-daten und der Entwicklung vonImpfstoffen.

Titelbild der ZeitschriftNature vom 15. Februar2001 anläßlich derVeröffentlichung der erstenArbeitsversion des mensch-lichen Genoms. Das Bildsymbolisiert, worum es denWissenschaftlern desinternationalen Konsortiumsgeht: Einerseits die Chemi-kalie DNA, andererseits umdie Menschen aller Konti-nente, aller Hautfarben undjeglicher ethnischenGruppen. Alle Ergebnissedes InternationalenSequenzanalyse-Konsorti-ums sind frei verfügbar fürjeden Interessenten.Mit freundlicher Genehmi-gung von Nature undMacmillan Magazine Ltd.

Cover picture of the 15February 2001 issue ofNature on the occasion ofthe publication of the first„working draft“ of thehuman genome. The picturesymbolizes what the work ofthe scientists of theinternational consortium isrelated to: On the one handit is the chemical DNA, onthe other hand it ismankind, no matter fromwhich continent, of whichcolour or from whichethnicity. All results of theInternational SequenceAnalysis Consortium arefreely available to anybody.Permission kindly granted byNature and MacmillanMagazine Ltd.

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mechanisms of bacterial cohabitations ascommunities, for example, in biofilms, theinvestigation of natural products from bacteriaas well as the analysis of mechanismsresponsible for the virulence and pathogenicityof bacteria.

In recent years the GBF has alreadyincreasingly extended its research activities tocover biological issues in health research. Inmicrobiology, a programme on themechanisms of bacterial pathogenicity hasbeen included. In cytobiology, priority hasbeen given to issues of cellular microbiologyaddressing questions, for example, of howbacteria move after an infection inside a hostcell and to what extent bacterial proteinsinteract with proteins of the host. In molecularbiotechnology, natural product research andbiochemical engineering, too, a number ofGBF scientists are already concerned withinfection-relevant questions, such as theisolation of antibacterial substances, theexpression and significance of individualinterferongenes in signal transductionprocesses after infections or the production ofvaccines and other biopharmaceuticalsubstances according to drug legislationstandards (GMP).

Research activities concerning basicmolecular, cytobiological, immunological andgenetic mechanisms involved in bacterialinfection processes are being extended at theGBF. This includes the elucidation ofinteractions between pathogen and host cells,the study of bacterial invasion mechanisms,the identification and characterization ofgenes and gene products involved in defencereactions to infections as well as theelucidation of the spatial structure of virulencefactors and host cell proteins interacting withthem up to the identification of candidatevaccines and the development of vaccines.

Expertise and extension of GBF genomeresearch

Of particular importance in this field isbacterial and human genome research. TheGBF already participated in the GermanHuman Genome Project at an early stage, forexample, with its contribution to the sequenceanalysis of chromosome 21 as well asfunctional analyses on chromosome 9. In the

recently established National GenomeResearch Network, the GBF is involved with anumber of projects. This includes theconstruction of an “Infection Challenge”platform, which should help to identifyhuman genes involved in a genetic dispositionto infections via the model system of mice.Within the framework of the NationalGenome Research Network, a bioinformaticscentre is also being established together withthe TU Braunschweig, which will beconcerned with the knowledge-basedmodelling of regulatory networks and thedevelopment of algorithms for the computer-assisted simulation of infection processes. Thesequence analysis platform of GBF participatesin the sequence analysis of the MHC complexof rats and rhesus monkeys, projects which areimplemented jointly with the German PrimateCenter in Göttingen and institutes in Berlinand Jena.

Extension of mouse genetics for thefunctional elucidation of genes

One of the most successful approaches to thefunctional elucidation of genes is genetics. Forthis reason, the extension of mouse geneticsand the genetics of other model organisms willbe given particular priority at the GBF. Thecompletion of the new animal house and theplanned construction of an infection unit willcreate the necessary infrastructureprerequisites. It is planned to set up furtherworking groups who will be concerned withexperimental methods of mouse genetics suchas conditional gene targeting, RNAinterference, the establishment of infectionmodels in model organisms or the study ofgenetic susceptibility to infections.

Mäuse, wichtiges Tiermodellfür die Genetik bei derInfektionsbiologie

Mice, an important animalmodel for genome researchin infectious biology

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Expertise und Ausbau der GBF-Genom-forschung

Eine besondere Rolle kommt dabei derbakteriellen und der Humangenomfor-schung zu. Die GBF hat sich bereits früham Deutschen Humangenomprojektbeteiligt, wie ihre Beiträge zurSequenzanalyse von Chromosom 21 sowieFunktionsanalysen am Chromosom 9belegen. Im dem vor kurzem etabliertenNationalen Genomforschungsnetz ist dieGBF mit einer Reihe von Projektenbeteiligt. Dazu gehört der Aufbau einer„Infektions-Challenge“-Plattform. Diesesoll über das Modellsystem Maus helfen,menschliche Gene zu identifizieren, diean einer genetischen Disposition gegen-über Infektionen beteiligt sind. Ebenfallsim Rahmen des Nationalen Genomfor-schungsnetzes wird zusammen mit der TUBraunschweig ein Bioinformatik-Zentrumeingerichtet, das sich mit der wissens-basierten Modellierung regulatorischerNetzwerke und der Entwicklung vonAlgorithmen zur computergestütztenSimulation von Infektionsprozessenbefasst. Die Sequenzanalyseplattform derGBF beteiligt sich an der Sequenzanalysedes MHC-Komplexes aus Ratte undRhesusaffe, Projekte, die gemeinsam mitdem Primatenzentrum in Göttingen undInstituten in Berlin und Jena durchgeführtwerden.

Ausbau der Mausgenetik zur Funktions-aufklärung von Genen

Einer der erfolgreichsten Ansatzpunkte zurFunktionsaufklärung von Genen ist dieGenetik. Aus diesem Grund wird der Aus-bau der Genetik von Mäusen und andererModellorganismen an der GBF eine be-sondere Priorität erhalten. Durch die Fer-tigstellung des neuen Tierhauses und dergeplanten Errichtung einer Infektions-einheit werden dazu die notwendigeninfrastrukturellen Voraussetzungen ge-schaffen. Es ist geplant, weitere Arbeits-gruppen einzurichten, die sich mit experi-mentellen Methoden der Mausgenetik,wie des konditionalen Gentargeting, derRNA-Interferenz, der Etablierung vonInfektionsmodellen in Modellorganismenoder der Untersuchung der genetischenSuszeptibilität gegenüber Infektionen be-fassen.

Vom isolierten Gen zur komplexenAnalyse aller Gene

Die Entwicklungen in der Genom-forschung haben deutlich gemacht, dasshäufig nicht mehr das isolierte Gen imMittelpunkt experimenteller Untersuchun-gen steht, sondern idealerweise alle Genegleichzeitig im Hinblick auf ihredifferenzielle Regulation und die darausfolgenden Expressionsänderungen undweitere Parameter analysiert werden müs-sen. Expression-Profiling mit DNA- oderOligonukleotidchips ist ein Weg, um dasganze Transkriptom zu untersuchen. Ander GBF wurde Anfang des Jahres eineDNA-Array Expression Profiling Stationaufgebaut. In vielen Experimenten istallerdings kein globaler genomweiterExpressions-Chip notwendig, sondern esgenügen „Custom-made-Expression-Chips“, wie ein Immuno- oder Infektions-chip. Dieser besteht aus einigen hundertgezielt für das jeweilige Experiment ausge-suchten Genen, die im Labor selbst ampli-fiziert und gespottet werden. Auch dieseTechnologie wird an der GBF etabliert undsoll damit sowohl GBF-Arbeitsgruppen alsauch für Kooperationsvorhaben zur Verfü-gung stehen.

Proteinforschung zur Target Identifizie-rung in Infektionsprozessen

Einen besonderen Stellenwert an der GBFsollen in den nächsten Jahren die Protein-forschung und moderne Proteomics-Technologien erhalten. Neben derStrukturaufklärung von Proteinen, die anInfektionsprozessen beteiligt sind, verfügtdie GBF auch über ein beträchtlichesKnow-how auf dem Gebiet der Protein-analytik. Wenn es gelingt, dieses Know-how und die Ressourcen für die Unter-suchung von Proteinen und ganzenProteomen einzusetzen, besitzt die GBFdamit einen Wettbewerbsvorsprung, wie erin der europäischen Wissenschafts-landschaft einmalig ist. Dazu gehörenu. a. die Expertise auf dem Gebiet derAuftrennung von Proteinen, der Analysevon Glycoproteinen und der Identifizie-rung und Charakterisierung von Proteinen

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From isolated gene to complex analysisof all genes

The developments in genome research haveclearly shown that the isolated gene isfrequently no longer at the centre of experi-mental investigations, but that ideally allgenes must be analysed simultaneously with aview to their differential regulation and theresulting expression changes and that furtherparameters need to be analysed. Expressionprofiling with DNA or oligonucleotide chips isone approach to investigating the wholetranscriptone in 2001. At the GBF, a DNAarray expression profiling station was set upearly this year. In many experiments, however,a global genome-wide expression chip is notnecessary but rather custom-made expressionchips, such as an immuno or infection chip,are sufficient. The latter consists of a fewhundred genes selectively chosen for therespective experiment, which are amplifiedand spotted in an in-house laboratory. Thistechnology will also be established at the GBFand will thus be available both to GBFworking groups and for cooperation projects.

Protein research for target identificationin infection processes

Protein research and modern proteomicstechnologies will be given special significanceat GBF in the next years. In addition to thestructure elucidation of proteins involved in

infection processes, the GBF also hasconsiderable know-how in the field of proteinanalysis. If this know-how and the resourcescan be used to investigate proteins and wholeproteomes, the GBF will have a competitiveleading position unique in the Europeanscience scene. This includes e.g. expertise inthe isolation of proteins, in the analysis ofglycoproteins and the identification andcharacterization of proteins by massspectrometry and protein sequencing. Methodsof combinatorial chemistry developed at GBFwill help to systematically search for proteinssuitable for the diagnosis and/or therapy ofinfectious diseases using the geneticallyderived model systems in automated high-throughput processes.

Construction of an antibody libraryAntibodies will be among the most importanttools of future functional genome research. Atthe GBF, therefore, the capacity of theantibody laboratory will be expanded with theaim of selectively producing new antibodies forproteins involved in infection processes.Biochemical engineering will integrate theproduction of preparative quantities ofmonoclonal antibodies into its researchactivities. In this field, too, the GBF hasfacilities unique in Germany, which can beexcellently used for dealing with questions ofinfection, genome and proteome research.

Strukturen derRezeptorbildungsdomänevom Internalin B (links) undInternalin H (rechts) vonListeria monocytogenes.

Structures of the receptor-binding domain if internalinB (left picture) and thehomologous domain ofinternalin H (right picture)from L. monocytogenes.

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durch Massenspektrometrie und Protein-sequenzierung. An der GBF entwickelteMethoden der kombinatorischen Chemiewerden helfen, mit den genetisch erarbei-teten Modellsystemen in automatisiertenHochdurchsatzverfahren systematischnach solchen Proteinen zu suchen, die zurDiagnose und/oder Therapie von Infekti-onskrankheiten geeignet sind.

Aufbau einer AntikörperbibliothekZu den wichtigsten Werkzeugen der zu-künftigen funktionellen Genomforschungwerden Antikörper gehören. An der GBFwird deshalb die Kapazität des Antikörper-labors ausgebaut mit dem Ziel, gezieltneue Antikörper für Proteine, die anInfektionsprozessen beteiligt sind, herzu-stellen. Die Bioverfahrenstechnik wird dieHerstellung präparativer Mengen anmonoklonalen Antikörpern in ihreForschungsaktivitäten integrieren. Auchhier verfügt die GBF über in Deutschlandeinmalige Möglichkeiten, die für die Bear-beitung von Fragen der Infektions-, Ge-nom- und Proteomforschung hervorra-gend genutzt werden können.

Neue Strategien für die Entwicklung vonImpfstoffen

Keine Entwicklung in der Medizin war soerfolgreich wie die Einführung der Vakzi-nierung. Impfstoffe werden auch in Zu-kunft zu den wichtigsten Präventivmaß-nahmen gehören. In letzter Zeit werdenauch starke Anstrengungen unternom-men, Impfstoffe für therapeutische Zwek-ke nutzbar zu machen. Die Forschungs-anstrengungen der GBF sind darauf ausge-richtet, neue Strategien für die Entwick-lung von Impfstoffen zu entwickeln. DieAnwendung am Menschen steht damiteindeutig im Blickfeld der GBF-Forschung,auch wenn direkt an der GBF keine Klinikangesiedelt ist. Die GBF wird sich aus die-sem Grund mit verschiedenen Klinikenüber enge Kooperationen in klinisch ori-entierte Projekte einbringen. Dazu zähltdie Produktion von Impfstoffen nachGMP-Standards. Zu unseren klinischenPartnern gehören bereits jetzt die Medizi-nische Hochschule in Hannover und dasStädtische Klinikum in Braunschweig.

Expertise GMP – ein Wettbewerbsvorteilfür die GBF

Die GBF ist die einzige nichtindustrielleEinrichtung in Deutschland, die eine Zu-lassung nach §13 Arzneimittelgesetz be-sitzt, um medizinische Wirkstoffe für denEinsatz am Menschen nach arzneimittel-rechtlichen Regeln – den Vorschriften fürdie Gute Herstellungspraxis (GoodManufacturing Practice – GMP) herzustel-len. Auf Grund ihrer langjährigen Erfah-rung ist die GBF auch in der Lage, die derProduktion vorausgehende Prozessent-wicklung bis in einen halbindustriellenMaßstab selbst durchzuführen. Hier liegtein Wettbewerbsvorteil, der eine wichtigeSchnittstelle zwischen Grundlagenfor-schung und klinischer Forschung darstellt.Nach einem Papillomavirenvakzin unddiversen DNA-Tumorvakzinen wurde zuBeginn dieses Jahres ein weiteres Projektzu dieser Thematik begonnen, das sichmit der Prozessentwicklung und der Her-stellung von Malaria-Vakzinen befasst.

Probenahme bei einem 50 LBioreaktor.

Taking a sample of a 50 Lbioreactor.

Focus 8

New strategies for the development ofvaccines

No development in medicine has been assuccessful as the introduction of vaccination.Vaccines will also be among the mostimportant preventive measures in future.Recently, great efforts have also been made toharness vaccines for therapeutic purposes. TheGBF’s research efforts are aimed at developingnew strategies for the development of vaccines.Application in man is thus clearly the focus ofGBF research, even though there is no clinicaffiliated directly to GBF. For this reason,GBF will take part in clinically orientedprojects through close cooperations withvarious clinics. This will include theproduction of vaccines according to GMPstandards. The Medical University in Hanoverand the clinical centre of the city ofBraunschweig are already among the clinicalpartners at present.

GMP expertise – a competitive advantagefor GBF

GBF is the only non-industrial institution inGermany with a licence pursuant to § 13 ofthe Pharmaceuticals Act for the productionaccording to good manufacturing practice(GMP) of medical substances for applicationin man, as stipulated by drug legislation. Dueto many years of experience GBF is also in aposition to perform process development priorto production up to a semi-industrial scale.This is a competitive advantage representingan important interface between basic andclinical research. After a papilloma virusvaccine and various DNA tumour vaccines, afurther project on this topic was started earlythis year concerning the process developmentand production of new malaria vaccines.

The GBF as a regional resource centreIn order to help solve such enumeratedscientific problems, the GBF has close contactswith other research institutes. Combinedknow-how and existing manpower can thus beoptimally used. Moreover, many “platform”technologies established in the GBF requireconsiderable investment and highly qualifiedpersonnel. Often it is the case thatuniversities are not in a position to build upsuch resources because of the high costsinvolved and because such resources requirecontinual upkeep. The GBF thus sees itself as

a resource centre which makes its key facilitiesavailable as bases – “platforms” – for processdevelopment.

The Technical University of Braunschweigis an excellent partner both in research andfurther education. Cooperation will beconsiderably intensified in the future, forexample, in the recently approved “specialresearch area” as well as in new proteomicsand bio-informatics projects. There is closecooperation with the Medical University ofHanover, Max Planck Institutes, FraunhoferInstitutes and the Veterinary University ofHanover.

Changes at the Helmholtz AssociationApart from the scientific reorientationdescribed above, the GBF will also be facedwith a number of organizational andstructural changes. Early in 2003,programme-oriented funding will replacecurrent institutional funding in the HelmholtzAssociation. The individual Helmholtz centreswill participate in research programmes in theissue area between cooperation andcompetition. Within the field of healthresearch GBF takes part in the programmes“Infection and Immunity” as well as“Genome Research”. Within the field ofenvironmental research it participates in the“Biodiversity” programme. Programme-oriented funding implies a steering of theresearch centres according to considerations inwhich cost transparency and scientificcontrolling will play an important role. It isnot yet clear, however, to what extent publicresearch institutions constrained by staffingschedules, government accounting andcollective salary structures can cope with theserequirements. The instruments required forthe implemen-tation of programme-orientedfunding still have to be created. In any case,by positioning itself in health research and byits clear decision to focus its activities on theresearch of infectious diseases, the GBF hascreated the prerequisites for its competitivenessin the national and international researchscene.

Brennpunkt9

Die GBF als regionales Ressourcen-zentrum

Um die aufgeführten wissenschaftlichenFragestellungen zu lösen, ist die GBF engmit anderen Forschungseinrichtungenvernetzt. So kann das gemeinsame Know-how und das vorhandene Potenzialoptimal genutzt werden. Viele der in derGBF etablierten Plattformtechnologienerfordern zudem hohe Investitionen undqualifiziertes Personal. Aus Kosten-gründen, aber auch aus Gründen dererforderlichen Kontinuität, sind universi-täre Institute oft nicht in der Lage,entsprechende Ressourcen aufzubauen.Die GBF versteht sich daher alsRessourcenzentrum, das seine Kernein-richtungen als Plattformen übergreifendzur Verfügung stellt.

Mit der Technischen Universität Braun-schweig hat die GBF einen hervorragendenPartner in Forschung und Ausbildung. DieZusammenarbeit beispielsweise in einemkürzlich bewilligten Sonderforschungs-bereich sowie neuer Proteomics- undBioinformatikprojekte soll in dennächsten Jahren noch erheblich intensi-viert werden. Sehr eng ist auch dieZusammenarbeit mit der MedizinischenHochschule Hannover, Max-Planck-Instituten, Fraunhofer-Instituten sowie derTierärztlichen Hochschule Hannover.

Wandel der Helmholtz-GemeinschaftNeben der genannten wissenschaftlichenNeuausrichtung werden auch eine Reihevon organisatorischen und strukturellenÄnderungen auf die GBF zukommen. An-fang 2003 wird die programmorientierteFörderung die bisherige institutionelleFörderung in der Helmholtz-Gemein-schaft ablösen. Im Spannungsfeld zwi-schen Kooperation und Wettbewerb wer-den sich die einzelnen Helmholtz-Zentrenan Forschungsprogrammen beteiligen. DieGBF nimmt innerhalb des Forschungsbe-reiches Gesundheit an den Programmen„Infektion und Immunität“ sowie„Genomforschung“ teil. Innerhalb desForschungsbereichs Umwelt beteiligt siesich an dem Programm „Biodiversität“.Programmorientierte Förderung beinhal-tet eine Steuerung der Forschungszentrennach Gesichtspunkten, in denen Kosten-transparenz und wissenschaftlichesControlling eine bedeutende Rolle spielenwerden. Noch ist offen, inwieweit öffentli-che Forschungseinrichtungen im Korsettvon Stellenplan, Kameralistik und BAT-Gehaltsstrukturen diesen Anforderungengewachsen sein können. Die notwendigenInstrumente für die Umsetzung derprogrammorientierten Förderung müssenerst noch geschaffen werden. Die GBF hatjedenfalls durch ihre Positionierung in derGesundheitsforschung und die klare Ent-scheidung, den Schwerpunkt ihrer Aktivi-täten auf die Erforschung von Infektions-krankheiten zu legen, die Voraussetzungenfür ihre Wettbewerbsfähigkeit in der natio-nalen und internationalen Forschungs-landschaft geschaffen.

Mit Genomforschung gegen Infektionskrankheiten

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GBF übernimmt eine Schlüsselrolle imNationalen Genomforschungsnetz

Bundesforschungsministerin EdelgardBulmahn hat die GBF im März 2001 zueiner von fünf Einrichtungen im Kern-bereich des Nationalen Genom-forschungsnetz erklärt. Mit der vorhandenExpertise und der Fokussierung auf die

Gebiete Infektions- und Genomforschungist die GBF prädestiniert, eine wichtigeRolle im Netzwerk zu übernehmen. In denkommenden drei Jahren sollen mitProjektmitteln von 9,4 Mio. DM etabliertePlattformen aus- und neue aufgebaut wer-den. Für die Entwicklung von Plattform-technologien werden weitere 5,4 Mio. DMan das von der GBF koordinierteKompetenzzentrum Bioinformatik verge-ben. Braunschweig bekommt somit in dennächsten drei Jahren einen kräftigenSchub als Standort der Genomforschungfür Infektionskrankheiten. Infektions-krankheiten sind weltweit für ein Drittelaller Todesfälle verantwortlich. Sie gehö-ren zu den großen Volkskrankheiten wieKrebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen oderAllergien.

Das nationale GenomforschungsnetzDas nationale Genomforschungsnetz wirdsich auf fünf Krankheitsbereiche konzen-trieren: Herz-Kreislauferkrankungen,Krebs, Erkrankungen des Nervensystems,Infektionskrankheiten sowie umwelt-bedingte Erkrankungen. Es besteht auseinem Kernbereich, der von fünf Institu-ten gebildet wird: dem DeutschenKrebsforschungszentrum (DKFZ), der Ge-sellschaft für Biotechnologische Forschung(GBF), dem GSF-Forschungszentrum fürUmwelt und Gesundheit, dem MaxDelbrück Centrum für molekulare Medi-zin (MDC) sowie dem Max-Plank-Institutfür Molekulare Genetik (MPIMG). Außer-dem werden fünf krankheitsspezifischemedizinische Netzwerke aufgebaut,in denen die Erkenntnisse der Genom-forschung zu einem umfassenden Ver-ständnis der betrachteten Krankheitenführen sollen. Ferner werden zweiTechnologieplattformen Bioinformatikund Proteomforschung gebildet, die alsQuerschnittstechnologien wichtigeAufgaben und Funktionen im Genom-forschungsnetz abdecken.

Übersicht des NationalenGenomforschungsnetzes:der Kernbereich und diefünf medizinischenNetzwerke.

Seite 13Titelbild der ZeitschriftMolecular Microbiology,Vol. 40 (1), 2001, anläßlichder Veröffentlichung desAufsatzes “The role playedby the group A streptococcalnegative regulator Nra onbacterial interactions withepithelial cells” von MolinariG, Rohde M, Talay SR,Chhatwal GS, Beckert S,Podbielski A, S. 1-17. Mitfreundlicher Genehmigungdes Blackwell PublishingVerlages.

Page 13Cover picture of theMolecular Microbiology, Vol.40 (1), 2001, on the occasionof the publication of thearticle “The role played bythe group A streptococcalnegative regulator Nra onbacterial interactions withepithelial cells” fromMolinari G, Rohde M, TalaySR, Chhatwal GS, Beckert S,Podbielski A, pp. 1-17. Thepermission of BlackwellPublishing is gratefullyacknowledged.

Herz-Kreislauf

NeurologischeErkrankungen Krebs

InfektionenUmwelt-

erkrankungen

MDC

MPI-MG DKFZ

GSF GBF

Kernbereich

Focus 12

Genome Research Against Infectious Diseases

GBF takes on a key role in the NationalGenome Research Network

In March 2001 German federal researchminister Edelgard Bulmahn declared the GBFto be one of five core institutions of theNational Genome Research Network. With itsexpertise and focus on the fields of infectionand genome research the GBF is destined totake on an important role in the network. Inthe coming three years, established platformsare to be expanded and new ones built upwith project funds of DM 9.4 million. For thedevelopment of platform technologies, anotherDM 5.4 million will be allocated to the centreof competence for bioinformatics coordinatedby GBF. Braunschweig will thus be given avigorous impetus in the next three years as asite of genome research for infectious diseases.Infectious diseases are responsible for onethird of all cases of death worldwide. Theyrank among the major widespread diseasessuch as cancer, cardiovascular diseases orallergies.

The National Genome Research NetworkThe National Genome Research Network willconcentrate on five fields of diseases:cardiovascular diseases, cancer, diseases of thenervous system, infectious diseases as well asenvironmentally induced diseases. It consistsof a core unit formed by five institutes: theGerman Cancer Research Centre (DKFZ),the German Research Centre forBiotechnology (GBF), the Research Centre forEnvironment and Health (GSF), the MaxDelbrück Centre for Molecular Medicine(MDC) and the Max Planck Institute forMolecular Genetics (MPIMG). Moreover, fivedisease-specific medical networks will be builtup, in which the findings of genome researchare intended to lead to a comprehensiveunderstanding of the diseases underconsideration. Furthermore, two technologyplatforms for bioinformatics and proteomeresearch will be established to cover importanttasks and functions in the genome researchnetwork in their capacity as cross-sectionaltechnologies.

Overview of the NationalGenome Research Network:core and five medicalnetworks.

Dr. Helmut Blöcker, Leiterder Genomforschung an derGBF, im Gespräch mitasiatischen Journalisten.

Dr. Helmut Blöcker, head ofgenome research at the GBF,talking with journalists fromAsia.

Seite 14Titelbild der ZeitschriftCellular Microbiology, Vol. 2(2), 2000, anläßlich derVeröffentlichung desAufsatzes “Two distinctpathways for the invasion ofStreptococcus pyonenes innon-phagocytic cells” vonMolinari G, Rohde M,Guzmán CA, Chhatwal GS, S.145-154. Mit freundlicherGenehmigung des BlackwellPublishing Verlages.

Page 14Cover picture of the CellularMicrobiology, Vol. 2 (2),2000, on the occasion of thepublication of the article“Two distinct pathways forthe invasion of Strepto-coccus pyonenes in non-phagocytic cells” fromMolinari G, Rohde M,Guzmán CA, Chhatwal GS,pp. 145-154. The permissionof Blackwell Publishing isgratefully acknowledged.

Heart andcirculatory

diseases

Neurologicaldiseases

Cancer

InfectionsEnvironmentaldiseases

MDC

MPIMG DKFZ

GSF GBF

Core centres

Streptokokken – Krankheitserreger mit verblüffenderPathogenese

Berichte aus der Forschung15

Prof. Dr. G. S. ChhatwalAbt. Mikrobielle Pathogenitätund Impfstoffforschung ❘ Dept.of Microbial Pathogenicity andVaccine

1994 starben in der Grafschaft Gloucester-shire viele Menschen innerhalb kurzer Zeitan nekrotisierender Fasziitis als Folgeeiner Infektion. Die verursachendenBakterien wurden dann von Seiten derMedien als „Killerbakterien” oder„fleischfressende Bakterien” bezeichnet.Meldungen über gefräßige Bakterienhaben die ganz Welt in Schrecken versetzt.Bei diesen Bakterien handelte es sichweder um ein neues Phänomen noch umeinen neuen Erreger, sondern um GruppeA Streptokokken, die seit vielen Jahrzehn-ten bekannt sind. Die Streptokokkenbleiben immer noch ein Rätsel fürMediziner, Gesundheitsexperten und dieWissenschaft. Streptokokken sind in derLage, viele verschiedene Krankheiten beiMensch und Tier zu verursachen. DiePathogenese von Streptokokken ist soverblüffend, dass die Infektion durchStreptokokken bis heute nicht richtigerklärt werden kann. Die Strategien derStreptokokken, den Wirt auszutricksen,sind sehr raffiniert. Um die spezifischeImmunabwehr zu umgehen, kommen siein Hunderten verschiedener Typen vor; siebinden Wirtsproteine zum eigenen Vorteil,um dadurch im Wirt Fuß zu fassen; siezwingen die Wirtszellen, sie aufzuneh-men, um dadurch persistieren zu könnenund die Wirkung der Antibiotika zuumgehen; sie besitzen Oberflächen-proteine, die denen einiger Wirtsproteineso ähnlich sind, dass es zu einer Auto-immunreaktion kommt; sie sind in derLage, genetisches Material horizontal anandere Streptokokkenserotypen und -spezies zu transferieren, um epidemiologi-sche Erfassung zu erschweren; einige vonihnen sind Künstler darin, Resistenzengegen Antibiotika zu entwickeln. Allediese Eigenschaften machen Streptokok-ken zu einem großen Gesundheits-problem und zu einer Herausforderungfür Wissenschaftler und Kliniker.

Streptokokken sind kugelartigeBakterien, die in Ketten wachsen. Erstma-lig wurden sie 1874 durch Billrothbeschrieben, der auch den NamenStreptococcus (aus zwei griechischen

Wörtern: streptos = Kette und kokhos =Beere) prägte. Am Anfang wurden dieStreptokokken entsprechend der durch sieverursachten Krankheiten klassifiziert, bisdie große alte Dame der Streptokokken,Rebecca Lancefield, in den dreißigerJahren die Klassifizierung der Streptokok-ken anhand gruppenspezifischer Polysac-charide einführte. Bis jetzt sind 13verschiedene serologische Gruppen vonStreptokokken identifiziert, davon sindStreptokokken der Gruppe A, B, C, G undS. pneumoniae von großer gesundheitlicherBedeutung. Gruppe A Streptokokken(Streptococcus pyogenes) sind ausschließlichin menschliche Erkrankungen involviert.Gruppe B Streptokokken (S. agalatiae)sind für schwerwiegende Erkrankungenbei Neugeborenen verantwortlich. GruppeC und G Streptokokken, die häufig beiTierinfektionen vorkommen, gewinnenzunehmend auch für menschliche Erkran-kungen an Bedeutung. S. pneumoniaezählen wegen der sich rasch entwickelnderAntibiotikaresistenzen zu den wichtigenhumanpathogenen Bakterien.

Gruppe A Streptokokken (GAS)GAS sind die Hauptverursacher vonStreptokokkeninfektionen beim Men-schen. Die Erreger siedeln sich in derMundschleimhaut, im Atmungstrakt, inder Schleimhaut der Rachenmandelnsowie auf der Haut an und rufen eineVielzahl fieberhafter Krankheiten hervor,wie z.B. Tonsillitis, Pharyngitis, Scharlachund eiternde Hautentzündungen. Obwohlbekannt ist, dass GAS diese Krankheitenverursachen können, sind die schwerwie-genden Folgen dieser Infektionen nichtsehr bekannt. Rheumatisches Fieber unddarauf folgend rheumatische Krankheitsind die Folgeerkrankungen, bei deneneine Entzündung der Herzklappen zurZerstörung derselben führt und den Ersatzdurch künstliche Herzklappen erforderlichmacht. Zur Zeit leiden ca. 15 Mio.zwischen 5 und 15 Jahren an diesenNachfolgeerkrankungen, dazu kommen1 Mio. neue Fälle pro Jahr, was dieBedeutung der Streptokokkeninfektionen

Research Reports 16

In 1994, many people died in the county ofGloucestershire within a short period of timedue to necrotizing fasciitis, resulting from aninfection. The causative bacteria were thenlabelled by the media as “killer bacteria”. Thewhole world was shocked to read about theflesh-eating bacteria. These bacteria wereneither a new phenomenon nor an emergingpathogen. The infections were caused by groupA streptococci, which had been identifiedmany decades before. The streptococci havecontinued to be a puzzle for clinicians,scientists and the public health personnel.Streptococci can cause a wide spectrum ofdiseases in humans and animals. Thepathogenesis of streptococci is so perplexingthat the infections caused by these organismshave never been completely understood. Thestrategy of streptococci to outwit their host isabsolutely genial. They evade host immunedefence by appearing in hundreds of differentserotypes; they bind and exploit host proteinsfor their own advantage and for establishingthemselves in the host; they trigger their owninternalization by host cells so that they canpersist and evade the antibiotic reaction; theyexpress surface proteins with similarity to hostprotein, which leads to autoimmune reactions;they are capable of transferring the geneticmaterial horizontally to other streptococcalserotypes and species, making theepidemiological analysis very difficult; some ofthem are real artists in developing antibioticresistance. And this list of perplexingproperties is far from complete. Streptococcitherefore remain a big health hazard and achallenge for scientists and clinicians.

Streptococci are global organisms growing inchains. They were first described in 1874 byBillroth, who also used the term streptococcus(from two Greek words: streptos = chain,kokhos = berry). In the beginning, thestreptococci were classified according to thedisease they caused, until the grand lady ofstreptococci, Rebecca Lancefield, introducedthe classification of streptococci in the 30ties.This classification was based on the presenceof group specific polysaccharides. 13 differentserological groups have so far been identified,out of which group A, B, C and G and S.pneumoniae are most important. Group Astreptococci (Streptococcus pyogenes) arethe major human pathogen, causing a widespectrum of diseases. Group B streptococci(S. agalactiae) are responsible for diseases ofnew-born. Group C and group G streptococci,which very often cause diseases in animals,are gaining importance for human health. S.pneumoniae, because of increasing antibioticresistance, is becoming more and more of ahealth hazard.

Group A streptococci (GAS)Group A streptococci are the major cause ofstreptococcal infections in human beings. Theorganisms colonize oral mucosa and skin andcause a wide spectrum of pyogenic infections,such as tonsilitis, pharyngitis, scarlet fever,and skin inflammation. Although it is wellknown that GAS can cause these infections,not many people know about the serious postinfection complications. Rheumatic fever andsubsequent rheumatic heart disease are poststreptococcal infection complications whichinvolve inflammation of and damage to heartvalves, requiring their replacement. About 15million children between the age of 5 and 15are suffering from rheumatic heart disease,approximately 1 million new cases areregistered every year, which underlines theimportance of streptococci as a serious healthproblem. Another complication of streptococcalinfection is glomerulonephritis, which veryoften leads to kidney failure.

Streptococci – persistent pathogens with perplexing properties


als ein großes Gesundheitsproblembestätigt. Darüber hinaus kann es nacheiner Streptokokkeninfektion zur Entzün-dung der Nieren und damit verbundenemNierenversagen kommen.

Bis 1980 wurden GAS-Infektionennicht als ernstes Gesundheitsproblemgesehen. Bis auf wenige Ausnahmenwurden sie als unangenehme Kinder-krankheiten eingestuft. Seit 1980 jedochsind GAS-Infektionen zu einer großenBedrohung geworden. Aus allen Teilen derWelt mehren sich die Meldungen übereine steigende Zahl von Krankheitsfällen.Dieser Anstieg ist auch bei Bevölkerungs-schichten zu beobachten, die medizinischausreichend versorgt werden. DasWiederaufleben von Streptokokkeninfek-tionen wurde von zunehmenden Berich-ten über schwere und lebensbedrohlicheInfektionen begleitet. Viele dieser Berichtebeschreiben Patienten mit nekrotisieren-der Fasziitis. Diese Krankheit, die mitkleinen Hautverletzungen beginnt, kannsich jedoch schnell ausbreiten undumliegendes Gewebe zerstören. Trotzintensiver Behandlung mit Antibiotikaentwickelt sich die Infektion sehr schnellund kann zu systemischen Erkrankungenbis hin zum Tod führen. Eine anderedurch GAS verursachte lebensbedrohlicheKomplikation ist das toxic shock-likeSyndrom. Diese Krankheit beginnt häufigmit Fieber und starken Schmerzen undkann rasch zu multiplem Organversagen,Schock und Tod führen. DieSterblichkeitsrate bei derartig schweren

Fällen liegt über 30 %, weshalb es zu derBezeichnung “Killerbakterien” kam. DieGründe für das Wiederaufleben derStreptokokkeninfektion sind noch nichtklar, sie kann jedoch nicht nur als eineepidemiologische Kuriosität abgetanwerden. Es erfordert vielmehr die Beach-tung sowohl durch Mediziner undGesundheitsbehörden als auch durchPersonen, die in der klinischen Grundla-genforschung tätig sind. Das Gesamt-spektrum der Krankheiten durch GruppeA Streptokokken ist in Abbildung 1beschrieben.

Zelluläre Struktur der Gruppe AStreptokokken

Die wichtigen strukturellen Komponentender Gruppe A Streptokokken können grobin drei Kategorien eingeteilt werden(Abb. 2):• Kapsel, gruppenspezifische Kohlenhy-

drate, Peptidoglykan und Lipoteichon-säure

• an Zelloberflächen verankerte Proteine• sezernierende Faktoren

Einige dieser Komponenten, insbeson-dere die Zelloberflächenproteine, sindwichtige Pathogenitätsfaktoren undbestimmen maßgeblich den Infektions-verlauf. Die Streptokokken sind mit einerHyaluronsäurekapsel umhüllt, was bei derPathogenität eine Rolle durch Resistenzgegen Phagozytose spielt. Die Streptokok-ken besitzen auch gruppenspezifischePolysaccharide. Diese Kohlenhydratespielen keiner Rolle bei der Infektion, aberdie Antikörper gegen diese Polysaccharidefinden eine Anwendung bei der Diagnoseund Klassifizierung der Streptokokken.Die Streptokokken haben auch Peptido-glycan und Lipoteichonsäure als Struktur-bestandteile, deren Rolle bei Infektionunklar ist. Neben der Kapsel spielen dieOberflächenproteine eine wichtige Rollebei der Infektion. Zu diesen Proteinengehören u.a. M-, T- und R-Proteine,Fibronektin bindende und andere Matrixbindende Proteine, Immunglobulinbindende Proteine, Opazitätsfaktor, C5a-Peptidase usw. Diese Proteine sind durcheinen Membrananker im C-Terminal-bereich auf der Oberfläche verankert.Dieser Membrananker hat eine Anord-nung von hydrophoben und geladenenAminosäuren, wobei der hydrophoben

Abb. 1. Krankheitsspektrumder Gruppe A Streptokok-ken-Infektionen

Fig. 1. Disease spectrum ofgroup A streptococcalinfections

MucosalTonsilitis, Pharyngitis,Otitis media, Sinusitis

Skin Skin lesions, Impetigo,Scarlet fever

TissueNecrotizing fasciitis, Cellulits,Osteomalitis, Septic arthritis,Pneumoniae, Meningitis

Blood Septicemia,Toxic shock syndrome

Invasive

Rheumatic fever,Reumetic heart disease,Acute glomerulonephritis

Sequelae

Non-invasive

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Until 1980, GAS infections were notconsidered a serious health problem and, withfew exceptions, were regarded as an irritationby the pediatricians. Since 1980, group Astreptococcal infections have re-emerged as aserious health problem. From all parts of theworld increased numbers of streptococcaldiseases were registered. The increase instreptococcal infections was also observed inpopulations with access to excellent medicalfacilities. The resurgence of these infectionswas accompanied by reports of serious andlife-threatening diseases. Many of thesereports described patients with necrotizingfasciitis, a streptococcal disease which startswith a small skin wound and can spread veryfast, and leads to the extensive damage of thetissue. In spite of antibiotic treatment theinfection develops rapidly and can lead tosystemic disease and even death. Onecomplication of invasive streptococcalinfection is toxic shock syndrome. The diseaseoften starts with fever and intensive pain andcan rapidly lead to multiple organ failure,shock and death. The mortality rate in thesecases is about 30 %, which explains thedesignation of “killer bacteria” for group Astreptococci. The reasons for the resurgence ofstreptococcal infections are not completelyunderstood, but it cannot be taken as anepidemiologic curiosity. The attention ofclinicians, public health people and the basicscientists is required to understand thisphenomenon and define the strategies for thecontrol and management of these infections.The spectrum of the diseases caused by groupA streptococci is illustrated in Fig. 1.

Cell structure of group A streptococciGroup A streptococci have been extensivelystudied and several structural components andtheir biological functions have been identified(Fig. 2). These components can roughly bedivided into three categories:• capsule, group specific carbohydrates,

peptidoglycan and lipoteichoic acid• proteins anchored on the cell surface• secreted factors.

Many of these components, especially the cellsurface proteins, are important pathogenicityfactors, which determine the progress of theinfection. The streptococci are covered with ahyaluronic acid capsule, which plays a role asantiphagocytic factor. The group specificpolysaccharides of streptococci do not play arole in the infection, but antibodies againstthese polysaccharides are extensively used forthe diagnosis and classification. Thestreptococci also possess peptidoglycan andlipoteichoic acid as a part of their structure,whose role in the pathogenesis is not yet clear.Beside capsule, the surface proteins areconsidered as important pathogenicity factors.These proteins include M, T and R proteins,fibronectin and other matrix binding proteins,immuno-globulin binding proteins, opacityfactors, C5a peptidase etc. These proteins areanchored on the surface by their C-terminalend at which the membrane anchor is located.The membrane anchor consists of hydrophobicand charged amino acid sequences, with ahighly conserved 6 amino acid sequence. Mprotein and fibronectin binding proteins arethe most important virulence factors of groupA streptococci.

Abb. 2. StrukturelleKomponenten der Gruppe AStreptokokken und ihrebiologische Funktion

Fig. 2. Structuralcomponents of group Astreptococci and theirbiological functions

Fibrocetin binding

Opacity factor

Plasminogen/α2Macro-Globulinbinding

Antiphagocitic activityFibrinogen binding

evasion of hostdefences

Non-immune bindingto IgG or IgA

Adhesin,InvasinFibronectin binding

Aderence, invasion,colonization

Tissue invasion

Cell Wall

Group APolysaccharide

M-Protein

SibA

ARPFCR

SfbI-Protein

C5a-Peptidase

PAM

GRAB

SfbII

FBP54

Other proteins

LTA

Cell Membrane


Region immer eine kurze, evolutiv kaumveränderte Sequenz von sechs Aminosäu-ren vorgelagert ist. M-Protein undFibronektin bindende Proteine sindjedoch die wichtigsten Virulenzfaktorenbei Gruppe A Streptokokken.

Verlauf der Gruppe A Streptokokken-Infektion

Die Infektion beginnt mit dem Kontakt,entweder in der Mundhöhle oder durchWunden auf der Haut. Danach erfolgenAnheftung und Kolonisierung. Im Mund-höhlenbereich findet die Anheftung anSchleimhaut und in Wunden meist anFibringerinnseln statt. Die weitereVermehrung ist abhängig von der anti-phagozytischen Wirkung der Isolate. Dieinvasiven Eigenschaften der Streptokok-ken sowie die genetische Suszeptibilitätdes Wirtes bestimmen den weiterenVerlauf der Infektion, und es kann zu ver-schiedenen Krankheitsformen kommen.Drei bis sechs Monate nach der primärenInfektion können dann bei anfälligenPersonen Nachfolgeerkrankungen wierheumatisches Fieber oder Nierenentzün-dung auftreten. Der Verlauf der Gruppe AStreptokokkeninfektionen ist in Abb. 3dargestellt.

Das M-ProteinM-Protein stellt das Hauptoberflächen-protein der Streptokokken dar undverleiht den Streptokokken Resistenzgegenüber Phagozytose. M-Protein hat dieFähigkeit, an Wirtsproteine wie Fibrino-gen oder den Komplementfaktor H zubinden und damit in die Aktivierung desalternativen Komplementsystemwegeseinzugreifen. Aufgrund ihrer unterschied-lichen Antigenreaktivität sind ca. 100verschiedene Serotypen des M-Proteinsbekannt. Bis auf wenige Ausnahmen wirdpro Stamm nur ein Serotyp gebildet. DieAntikörper gegen M-Protein bieten eineneffektiven Schutz vor nachfolgenden

Infektionen, aber nur mit dem homolo-gen M-Typ. Aufgrund dieser Eigenschaftenstellte das M-Protein das schützendeAntigen der Wahl dar. Daher stand M-Protein für zwei Jahrzehnte im Mittel-punkt der Streptokokkenforschung. Sogewann man zahlreiche Erkenntnisse überdie Struktur und Funktion des M-Proteins.Die komplette Sequenz verschiedener M-Protein-Serotypen ist bekannt, und B- undT-Zell-Epitope wurden identifiziert. DieStruktur des M-Proteins beinhaltetrepetitive Sequenzen und einen konser-vierten Anker. Die vier Repeat-Blöcke desM-Proteins, A, B, C und D, unterscheidensich hinsichtlich Größe und Sequenz.Beim Sequenzvergleich zwischen M-Protein und verschiedenen Wirtsproteinenzeigt sich eine große Übereinstimmungmit menschlichem Myosin undTropomyosin. Diese Ähnlichkeit kannimmunologische Konsequenzen haben,wenn auch die genaue Rolle des M-Proteins bei der Entstehung rheumatischerHerzerkrankung noch nicht geklärt ist.

Anheftung der Streptokokken an dieWirtszelle

Die Anheftung der Streptokokken an eineWirtszelle ist ein essentieller Schritt für dieEntstehung einer Infektion. Für die Anhef-tung sind die Adhäsine auf der Bakterien-oberfläche und spezifische Rezeptoren aufder Wirtszelle notwendig. Im Falle derGruppe A Streptokokken handelt es sichum einen besonders interessantenAnheftungsmechanismus. Die Anheftunggeschieht nicht direkt über die Bindungs-adhäsine an die Zellwand der Wirtszelle,sondern wird über ein weiteres Wirts-protein, das Fibronektin, vermittelt. Fibro-nektin ist ein hochmolekulares Glyko-protein, das in löslicher Form in Plasmaund verschiedenen anderen Körper-flüssigkeiten und in nichtlöslicher Form inder extrazellulären Matrix vorkommt. Esist ein multifunktionales Protein, das einewichtige Rolle bei der Wechselwirkungvon Zellen mit extrazellulären Bestandtei-len spielt. Aufgrund seiner Fähigkeit, anEpithelzellen des Wirtes und auch anStreptokokken zu binden, wird es alswichtiges Bindeglied bei der Anheftungvon Streptokokken angesehen.

Research Reports 20

Course of group A streptococcalinfections

The infection begins with the contact, eitherin the oral cavity, or to a skin wound. This isfollowed by adherence and colonization ofbacteria in the oral mucosa or at the fibrinclots of the wound. The further progression ofthe disease depends on the antiphagocyticcapability of the isolates. The form of thedisease which develops is determined by theinvasive capabilities of the isolates and thegenetic susceptibility of the host. Three to sixmonths after the primary infection, postinfection complications such as rheumaticfever or glumeronephritis are induced inpredisposed individuals. The course of group Astreptococcal infections is illustrated in Fig. 3.

M protein of group A streptococciM protein is a major surface protein ofstreptococci, which enables the organism toresist phagocytosis. M protein is capable ofbinding to fibrinogen and complement factorH leading to the activation of alternatecomplement pathway. Because of antigenvariation, M protein exists as approximately100 different serotypes. With a few exceptions,one strain expresses only one type of protein.Anti M protein antibodies provide a type-specific protection against infection in animalmodels. Because of these properties, M proteinhas been regarded as a choice protectiveantigen. M protein, therefore, has been a focusof interest for the last two decades. Thesestudies led to the structure and functionelucidation of M protein. The completesequence of various M serotypes is known, andB and T cell epitopes have been identified.The structural features of M protein includerepetitive sequences and a conserved anchor.The four repeat blocks of M protein, A, B, Cand D, differ from each other in their sizeand sequence. A comparative sequenceanalysis between M protein and differenthuman proteins showed a significanthomology with myosin and tropomyosin.These similarities can have immunologicalconsequences, although the exact role of Mprotein in the induction of rheumatic heartdisease has not yet been elucidated.

Adherence of streptococci to host cellsThe adherence of streptococci to host cells isan essential step for the initiation of aninfection. The adhesins on the bacterialsurface and the specific receptor in the hostcells are involved in the adherence. In the caseof group A streptococci, the adherencemechanism is interesting in the sense that theadherence does not take place directly withadhesins and host cell, but is mediatedthrough a host protein, fibronectin. Fibro-nectin is a high molecular glycoprotein, whichis present in soluble form in plasma and otherbody fluids, and in insoluble form in theextracellular matrix. It is a multifunctionalprotein and plays an important role in theinteractions of cells with extracellular matrix.Because of its capability of binding to bothhost cells and streptococci it is considered asan essential bridging molecule in streptococcaladherence.

Abb. 3. SchematischeDarstellung des Verlaufs vonGruppe A Streptokokken-Infektionen

Fig. 3. Course of group Astreptococcal infections

Mouth cavity

Contact

Skin wound

Adherence/colonization

Binding to fibronectinand other extracellular

matrix components

Invasion inhost cells

Persistence,Antibiotics evasion

Infection Wide disease spectrum

Post infectionautoimmunecomplications

Genetic predisposition


SfbI-Protein als Hauptadhäsin der GruppeA Streptokokken

Die Fibronektinbindungsstelle wurdeerstmals in der GBF als ein Oberflächen-protein identifiziert und als SfbI-Proteinbezeichnet. Durch Sequenzanalyse wurdedie Fibronektinbindungsdomäne bis aufein 37 Aminosäuren umfassendes Epitopeingeschränkt, das als repetitiver Bereichauf dem SfbI-Protein vorliegt. Protein-strukturanalysen erlaubten die Zuordnungweiterer funktioneller Bereiche, wie z.B.der Signalsequenz des Membranankerssowie Membran- und Zellwand-assoziier-ter Epitope. SfbI-Protein spielt eine wich-tige Rolle bei Pathogenität und hemmtkompetitiv die Bindung der Streptokok-ken an Fibronectin und deren Adhärenzan kultivierte menschliche Epithelzellen.Poly- und monoklonale Antikörper gegendas gereinigte SfbI-Protein blockieren dieFibronektin-Bindung der Streptokokkenund reagieren mit Oberflächenkom-ponenten verschiedener Gruppe AStreptokokken. Das Auftreten des SfbI-Protein-Gens korreliert sehr gut mit demFibronektin-Bindungsvermögen und derEpithelzell-Adhärenz der Streptokokken.

SfbI-Protein besitzt eine zusätzlicheBindungsdomäne, die strukturell anders-artig ist als die bisher charakterisiertenFibronektinbindungsrepeats. Die zweiteBindungsdomäne, Spacer genannt, kannfunktionell auf 30 Aminosäuren einge-schränkt werden. Diese beiden Domäneninteragieren mit drei verschiedenen Be-reichen des Fibronektins. Die SfbI RepeatRegion zeigt eine hoch affine Bindung zu

dem 30 kD N-terminalen Fibronektin-fragment und eine niedrig affine Bindungzu dem 120 kD C-terminalen Fibronektin-fragment. Darüber hinaus kann dieBindungsregion der SfbI Spacer Region aufeinem 45 kD Fibronektinfragmentlokalisiert werden, welches sich zwischendem 30 kD und 120 kD Fragment desFibronektins befindet. Die Bindung derSpacer Region ist ebenfalls hoch affin.

Gruppe A Streptokokken-InvasionGruppe A Streptokokken werden traditio-nell als extrazelluläre Pathogene einge-stuft. Sie sind in der Lage, verschiedeneWirtsgewebe zu kolonisieren undextrazelluläre Infektionen zu verursachen.Da sie auch invasive Infektionen verursa-chen können, liegt die Vermutung nahe,dass Streptokokken auch als intrazellulärePathogene fungieren können. DieseEigenschaften kommen in einer Großzahlvon Gruppe A Streptokokken-Isolaten vor(Abb. 4). Es gibt einen Zusammenhangzwischen Invasion und Herkunft desIsolates. Die Isolate aus Hals- undHautinfektionen sind nicht nur sehrinvasiv, sondern sind auch in der Lage,intrazellulär zu überleben. Eine Vielzahlinvasiver Streptokokkenisolate zeigen einestarke, durch SfbI vermittelteFibronektinbindung. SfbI spielt nicht nurin der Anheftung, sondern auch bei derInvasion eine entscheidende Rolle.Latexkugeln, die mit SfbI-Protein umman-telt sind, können sehr schnell von HEP2-Zellen aufgenommen werden, so daß SfbIdie Internalisierung von Streptokokkenallein auslösen kann. Die Fibronektinbindende Spacerdomäne spielt eineentscheidende Rolle bei der Invasion. Diesgeschieht durch kooperative Bindung vonFibronektin an beide bindende Domänendes SfbI-Proteins. Die Bindung des 30 kDaFibronektinfragments an die Repeatregiondes SfbI-Proteins aktiviert die Bindungvon 45 kDa an die Spacerregion. DieseAktivierung führt dann zur Invasion derStreptokokken in eukaryontische Zellen.Die Mechanismen der SfbI-vermitteltenAnheftung und Invasion sind in Abb. 5dargestellt.

Abb. 4. Rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmender Streptokokkenan-heftung und -invasion inEpithelzellen

Fig. 4. Scanning electronmicroscopic image ofstreptococcal adherence andinvasion in epithelial cells

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SfbI protein, a major adhesin of group Astreptococci

The fibronectin binding site of streptococciwas identified as a surface protein for the firsttime in the GBF and was designated SfbIprotein. The sequence analysis shows that thefibronectin binding domain consists of 37amino acids, which occurs as repetitivedomain in SfbI protein. Other functionalepitopes, such as signal sequence, membraneanchor, etc., were similar to many other Grampositive surface proteins. SfbI proteins plays animportant role in the pathogenesis and iscapable of competitively inhibiting the bindingof streptococci to fibronectin and theiradherence to human epithelial cells. Anti SfbIantibodies can also block the fibronectinbinding to streptococci and react with manydifferent group A streptococcal strains. Thepresence of SfbI gene corelates very well withthe fibronectin binding capacity and theepithelial cell adherence of streptococci. SfbIprotein also has an additional binding domainfor fibronectin, which is structurally differentfrom the fibronectin binding repeats. Thisbinding domain, designated spacer domain,consists of 30 amino acids. Both bindingdomains of SfbI protein interact with threedifferent domains of fibronectin. The repeatregion has a high affinity for 30 kD N-terminal fibronectin fragment, and a lowaffinity for 120 kD C-terminal fragment. Thespacer region binds to 45 kD fibronectinfragment, which is located between 30 kDand 120 kD fragment. The binding of spacerregion to fibronectin is also a high affinitybinding.

Group A streptococcal invasionGroup A streptococci are traditionallyconsidered as extracellular pathogens. Theycan colonize different tissues to causeextracellular infections. Because group Astreptococci can also cause invasive infections,it is assumed that they might also act asintracellular pathogens. These properties havenow been described for a large number ofgroup A streptococcal isolates (Fig. 4). Theinvasion of streptococci is correlated to thesource of the isolate. The isolates from throatand skin infections are not only very invasivebut are also capable of surviving intra-cellularly. A number of invasive streptococcalisolates show a strong SfbI mediatedfibronectin binding. SfbI therefore plays notonly a role in the adherence, but also in the

invasion of streptococci. Latex beads, coatedwith purified SfbI proteins, are rapidlyinternalized by epithelial cells, indicating thatSfbI per se is sufficient for the invasion. Inthis process the fibronectin binding spacerdomain plays a decisive role. This happensthrough a cooperative binding of both bindingdomains of SfbI protein to fibronectin. Thebinding of 30 kD fibronectin domain to therepeat region of SfbI protein activates thebinding of 45 kD to spacer region. Thisactivation is a prerequisite for the invasion ofstreptococci in eukaryotic cells. Themechanisms of SfbI mediated adherence andinvasion are depicted in Fig. 5.

Sequelae of streptococcal infectionsRheumatic fever and glomerulonephritis areimportant sequelae of group A streptococcalinfections. Although the exact mechanisms ofrheumatic fever are not yet elucidated it isassumed that this disease results from anabnormal immune response to an untreated ornot fully treated streptococcal pharyngitis. Themanifestations of rheumatic fever, such asarthritis, chorea and carditis, are observed inall parts of the world, although in somecountries the incidence rate is quite high.Approximately half of all children with heartdisease suffer from rheumatic fever andrheumatic heart disease. A uniqueepidemiological observation is the highincidence of rheumatic heart disease inAboriginal population in Australia and inMaoris in New Zealand. The reasons for thisare not yet known, but it seems that the

Fibronectin

fibronectin-bindingrepeats

fibronact-bindingspacer

NH2 Sfbl protein

NH2

RGD

INVASION

BINDING

ADHESION

UNFOLDING

strepto-coccal cell

eucaryoticcell

α5β1integrin

Abb. 5. Mechanismen derSfbI-vermittelten Anheftungund Invasion der Gruppe AStreptokokken

Fig. 5. Mechanism of SfbImediated adherence andinvasion of group Astreptococci

Nachfolgeerkrankungen der Streptokok-keninfektionen

Rheumatisches Fieber und Glomerulo-nephritis sind die wichtigsten Nachfolge-erkrankungen der Streptokokkeninfektio-nen. Obwohl die genauen Mechanismendes rheumatischen Fiebers noch nichtaufgeklärt sind, ist es anzunehmen, dassrheumatisches Fieber eine abnormaleImmunantwort als Folge einer Strepto-kokkenpharyngitis darstellt. Die Manifes-tierung des rheumatischen Fiebers, u.a. inArthritis, Chorea und Karditis, kommt inallen Teilen der Welt vor, obwohl ineinigen Ländern eine sehr hohe Ratedieser Krankheit festzustellen ist. Über dieHälfte aller Kinder mit Herzkrankheitenleiden an rheumatischem Fieber undrheumatischer Herzkrankheit(RHD). Eineeinzigartige epidemiologische Beobach-tung ist die sehr hohe Rate an rheumati-schem Fieber bei den Aborigines inAustralien und Maoris in Neuseeland. DieGründe hierfür sind immer noch nicht be-kannt. Wahrscheinlich spielt hier die gene-tische Suszeptibilität eine wichtige Rolle.

Obwohl seit langem bekannt ist, dasseine enge Beziehung zwischen Gruppe AStreptokokken und akutem rheumati-schem Fieber (ARF) besteht, blieb diegenaue Pathogenese von ARF und RHDtrotz intensiver Studien bisher unbekannt.Es wird angenommen, dass die Wirts-faktoren, Bakterienfaktoren und eine nichtnormale Immunantwort bei der Entste-hung von ARF beteiligt sind. Die familiärePrädisposition für ARF wird seit mehrerenJahrzehnten diskutiert. Obwohl diesesThema zur Zeit auch sehr kontroversdiskutiert wird, weisen viele Studien aufeine genetische Anfälligkeit für ARF hin.Personen mit ARF und deren Familienmit-glieder exprimieren bestimmte Antigenean der Oberfläche einiger Immunzellen.Der Zusammenhang zwischen ARF undHLA-Antigenen ist häufig beschriebenworden, wobei HLA-DR-Locus beteiligt ist.Einige B-Zell-Antigene sind auch mit ARFin Verbindung gebracht worden. Mono-klonale Antikörper, die durch Immunisie-rung von Mäusen mit B-Zellen eines ARF-Patienten gewonnen wurden, haben mitB-Zellen von 100 % der Patienten mit ARFund nur mit 10 % der Kontrollgruppereagiert. Die Proportion der Bevölkerung,die für ARF anfällig ist, ist nicht bekannt.

Die mutmaßlichen genetischen Markerkommen häufig in 15-20 % der Kontroll-gruppe vor, aber ein Ausbrechen vonPharyngitis führt nur in 2-3 % der Fälle ineiner heterologen Bevölkerung zu ARF.Die Inzidenzrate von ARF nach sporadi-scher Gruppe A Streptokokken Pharyngitisist viel niedriger als nach verbreitetemAuftreten. In Bevölkerungsgruppen, diehäufig Gruppe A Streptokokkeninfektio-nen ausgesetzt sind, liegt das Vorkommenvon RHD zwischen 2 und 5 %.

Im Gegensatz zu Wirtsfaktoren ist dieBeteiligung von Bakterienfaktoren bei derEntstehung von ARF wenig kontrovers.Das Konzept der Rheumatogenität, dassnur einige bestimmte Stämme in der Lagesind, ARF zu verursachen, existiert seit den30er Jahren. Seit dem haben viele Studienauf einen Zusammenhang zwischen ARFund bestimmten M-Typen der Gruppe AStreptokokken hingewiesen. Die M-Typen1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24, 27 und 29 sindhäufig mit ARF assoziiert. Die Vermutungder Beteiligung von M-Protein wurdedurch die Beobachtung verstärkt, dassARF-assoziierte Stämme M-Protein mitbestimmten Epitopen exprimieren, starkeM-Protein-spezifische Immunantwortinduzieren und Homologie zwischen M-Epitopen und Wirtsproteinen zeigen. Eswurde auch berichtet, dass ARF-assoziierteStämme stark gekapselt sind und keinenOpazitätsfaktor exprimieren. Trotz dieserStudien wird die Assoziation von ARF undM-Serotyp sehr kontrovers diskutiert. Invielen Endemie-Gebieten mit höherer Ratevon ARF sind die Stämme entweder nichttypisierbar oder exprimieren M-Typen, dietraditionell mit Hautkrankheit assoziiertsind. In den letzten Jahren neigt manmehr und mehr zu der Auffassung, dassRheumatogenität eher stammspezifisch istund nicht M-Typ-spezifisch. Gruppe AStreptokokken sind in der Lage, geneti-sches Material horizontal zu transferieren.Dadurch können die Rheumatogen-faktoren zwischen verschiedenen Stäm-men transferieren, so dass fast jeder M-Serotyp mit ARF assoziieren kann. AußerM-Protein wurden auch andere Strepto-kokkenkomponenten mit ARF in Verbin-dung gebracht. Dazu zählen Kapsel,zellwandassoziierte Kohlenhydrate, undZellmembran. Diese Komponentenzeigten Kreuzreaktivität mit Wirtsgewebe


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environmental factors and geneticsusceptibility might be responsible for the highincidence.

The relationship between group Astreptococci and rheumatic fever has beenestablished for many decades, but the exactpathogenesis, in spite of intensive studies,remains unknown. The host factors, thebacterial factors and an abnormal immuneresponse may all contribute towards inductionof rheumatic fever. The family predispositionhas been a topic of discussion since long. Inspite of controversies there is an evidence thatgenetic predisposition plays an important role.Individuals with rheumatic fever and theirfamily members express certain antigens onthe surface of the immune cells. A correlationbetween rheumatic fever and HLA-antigenshas often been reported, where HLA-DR locusis involved. Some B-cell antigens have alsobeen implicated in rheumatic fever. Mono-clonal antibodies which were raised in miceagainst B-cells from rheumatic fever patientsreact with B-cells of 100 % of the patients,but only with 10 % of the control group. Theproportion of the population which ispredisposed to rheumatic fever is not yetknown. Putative genetic markers are oftenfound in 15 to 20 % of control, but theoutbreaks of pharyngitis result inapproximately 3 % of the cases in aheterogenous population. The incidence rate ofrheumatic fever following sporadic group Astreptococcal pharyngitis is generally muchlower than the outbreaks. In populationswhich are exposed to group A streptococcalinfection the prevalence of rheumatic heartdisease is between 2 and 5 %.

In contrast to the host factors, theinvolvement of bacterial factors in theinduction of rheumatic fever is less contro-versial. The concept of rheumatogenicity thatonly some definite strains are capable ofcausing rheumatic fever has existed for manydecades. Many studies have shown theassociation of certain M types, such as 1,3,5,6,14,18,19,24,27 and 29 with rheumaticfever. The involvement of M protein wasunderlined by the fact that the strainsassociated with rheumatic fever expressdefinite epitopes, induce a strong M protein-specific immune response and showhomologies between M epitopes and the hostproteins. The strains associated withrheumatic fever have a thick capsule andgenerally do not express opacity factor. In spite

of these studies the role of M serotypesremains a matter of controversy. In manyendemic areas with high incidence ofrheumatic fever, the strains are either non-typable or express M types which aretraditionally associated with skin infections.In the last few years, there is a growing beliefthat rheumatogenicity is rather strain-specificthan M type-specific. Group A streptococci arevery efficient in transferring their geneticmaterial horizontally, so that theoreticallyevery strain can be associated with rheumaticfever. Besides M protein also otherstreptococcal components have been associatedwith rheumatic fever including capsule, cellwall associated carbohydrates and cellmembrane. These components show crossreactivity with host proteins such as cardiacmyosin, heart valve glycoproteins andsarcolemmal membrane.

Besides host and bacterial factors anabnormal immune response plays animportant role in the induction of rheumaticfever. Immunological cross-reactivity betweencertain streptococcal antigens and the hosttissue leads to the damage of heart, joint andbrain. The cross-reactive antibodies are oftenfound in the sera of rheumatic fever patients.Although humoral immunity is presumed tobe an important component of immuneresponse in rheumatic fever there is anincreasing evidence that the primary damageis caused by cellular immunity. The cellinfiltrates from the heart tissue of rheumaticfever patients show a predominance of Tlymphocytes. Furthermore, very oftenmacrophages are found in the myocardiallesions. Both cell types are components ofcellular immunity. Moreover, in rheumaticfever lots of markers are observed that activatethe cellular immune system. Increasednumbers of circulating CD4 lymphocytes,interleukins such as IL-1 and IL-2, IL-2receptor positive T cells, TNF-α receptors etc.are observed in rheumatic fever. Most probablythe normal mechanism for suppressing thecellular immunity is not functioning inrheumatic fever patients, which leads to anuncontrolled activation and tissue damage.The induction of rheumatic fever andrheumatic heart disease is illustrated as asimple schematic diagram in Fig. 6.

Other immune mechanisms have also beenimplicated in the pathogenesis of rheumaticfever. Some streptococcal antigens, such asexotoxins, act as super antigens and can


wie z.B. mit Herzmyosin, Herzklappen-glykoproteinen, und Sarkolemmembran.

Neben Wirts- und Bakterienfaktorenspielt die Immunantwort auch einewichtige Rolle bei ARF. ImmunologischeKreuzreaktivität zwischen bestimmtenStreptokokkenantigenen und Wirtsgewebeführt zu Schäden bei Herz, Gelenk undHirn. Die kreuzreaktiven Antikörperkommen sehr häufig in Seren von ARF-Patienten vor. Obwohl humoraleImmunität eine wichtige Komponente derARF-Immunantwort zu sein scheint, gibtes zunehmend Hinweise, dass primäreSchäden durch zelluläre Immunitätzustandekommen. Das Zellulärinfiltratvon Herzgewebe der ARF-Patienten zeigteprädominante T-Lymphozyten. Darüberhinaus beinhalten die Myokardlesionenhäufig Makrophagen. Beide Zelltypen sindan der Zellulärimmunantwort beteiligt.Außerdem kommen viele Marker, die dasZellulärimmunsystem aktivieren, in ARFvor. Erhöhte Werte von zirkulierendenCD4 Lymphozyten, Interleukinen IL-1

und IL-2, IL-2-rezeptorpositiven T-Zellen,TNF-alpha-Rezeptoren etc. sind bei ARF zuverzeichnen. Wahrscheinlich sind dienormalen Mechanismen der Unterdrük-kung von zellulärer Immunität in ARFnicht funktionsfähig, was zu einerunkontrollierten Aktivierung undGewebeschädigung führt. Die Entstehungder rheumatischen Herzkrankheit ist alseinfaches Schema in Abb. 6 dargestellt.

Andere Immunmechanismen sind auchin der ARF-Pathogenese impliziert. VieleStreptokokkenkomponenten, wie z.B.pyogene Exotoxine, verhalten sich alsSuperantigene und können die ARF-Pathogenese beeinflussen. Es ist auchmöglich, dass Gruppe A Streptokokkennicht die einzigen Verursacher von ARFsind. Co-Pathogene, wie z.B. derCoxsackie-Virus, können mit Streptokok-ken zusammenwirken, um ARF zuinduzieren.

Glomerulonephritis ist eine andereNachfolgeerkrankung der Streptokokken-infektion, die aber im Vergleich zurheumatischem Fieber nicht sehr häufigvorkommt. Obwohl die genauen Mecha-nismen noch nicht bekannt sind, ist esklar, dass nur bestimmte Streptokokken-stämme nephretogen sind und wie beirheumatischem Fieber nur die genetischanfälligen Personen hieran erkranken.Eine Hypothese ist, dass die nephreto-genen Streptokokken Pathogenitäts-faktoren exprimieren, die eine großeAffinität zu Nierenzellen besitzen unddurch Bildung von ImmunkomplexenNierenentzündungen verursachen.

Lebensbedrohliche Streptokokkeninfek-tionen

Gruppe A Streptokokken sind in der Lage,lebensbedrohliche Infektionen wie z.B.nekrotisierende Fasziitis, Septikämie undStreptokokken Toxic Shock-Syndromauszulösen. Der Verlauf dieser Infektionenist unheimlich schnell und kann mitkeiner anderen Infektionskrankheitverglichen werden. NekrotisierendeFasziitis ist eine tiefsitzende Infektionsubkutanen Gewebes, was zur Zerstörungder Faszies führt (Abb. 7). Nach Auftretender initialen Infektzeichen entwickelt sich

Abb. 6. Stufen für die Ent-stehung des rheumatischenFiebers und der rheumati-schen Herzkrankheit.

Fig. 6. Steps involved in theinduction of rheumaticheart disease

S. pytogenes

Rheumatic factors

Host

Genitic susceptibility

Abnormal immune response

Inflammation of tissue

Rheumatic fever

Rheumatic heart disease

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Abb. 7. NekrotisierendeFasziitis durch Gruppe AStreptokokken im Hals-bereich ( Bild Dr. Werkmei-ster, Uniklinikum Münster)und des Beines (BildDr. Currie, Royal DarwinHospital, Australien)

Fig. 7. Group A streptococcalnecrotizing fasciitis of neck(photo: Dr. Werkmeister,University Hospital Münster)and of the leg (photo:Dr. Currie, Royal DarwinHospital, Australia)

influence the disease pathogenesis. It is alsopossible that some co-pathogens, e.g. coxsackievirus, may cause rheumatic fever togetherwith the streptococci.

Glomerulonephritis is another sequelae ofstreptococcal infection, which has a muchlower incidence than rheumatic fever.Although for glomerulonephritis the exactmechanisms are not known, it is clear thatsome definite streptococcal strains arenephretogenic and, like in rheumatic fever,only the genetically predisposed people sufferfrom this disease. One hypothesis is that thenephretogenic streptococci expresspathogenicity factors that have high affinityfor kidney cells and can cause inflammationby forming immune complexes.

Life-threatening streptococcal infectionsGroup A streptococci are also capable ofcausing life-threatening infections such asnecrotizing fasciitis, septicemia andstreptococcal toxic shock syndrome. Theprogression of these diseases is extremly fastand cannot be compared with any otherinfectious diseases. Necrotizing fasciitis is adeep infection of the subcutaneous tissuewhich leads to the destruction of fascia (Fig.7). After the initial indication of infection thedisease develops at a very high speed. At thispoint of time in general the systemic infectionalso occurs, which leads to multiple organfailure and death. Even with aggressivetherapy the mortality rate is about 50 %.Cellulitis and myositis can also be caused byinvasive streptococci. These infections can leadto a serious complication, the streptococcaltoxic shock syndrome, often found in youngadults. Typical symptoms of this syndrome areextreme pain, high fever and finally the septicshock. The secreted components ofstreptococci, such as erythrogenic toxins, andsuper antigens, which influence the immunecells to secrete a large amount of IL-1α/β, IL-8 and TNFα, are mainly involved in thedevelopment of toxic shock. As with thestreptococcal sequelae, also in invasiveinfection the host genetic susceptibility playsan important role.

Genetic susceptibility of invasivestreptococcal infections

As with rheumatic fever, the geneticsusceptibility is also an important factor ininvasive infections. This susceptibility can alsobe observed in mice. Different inbred strains

of mice show different sensitivity to group Astreptococci. BALB/c, C57BL/c, DBA/2 mousestrains are highly resistant whereas C3H/HeNand CBA/j are highly susceptible. Innateimmunity plays a major role in thesusceptibility. The progression of disease insusceptible mice is quite similar to the invasivestreptococcal disease in human beings, whichunderlines the importance of this mousemodel. The identification of the genesresponsible for resistence or susceptibility cancontribute towards the development ofstrategies to fight and control invasivestreptococcal diseases.

Therapy and prophylaxisPenicillin has been mostly used to treatdifferent streptococcal infections. It is not onlyused to treat streptococcal pharyngitis, but alsoin the secondary prophylaxis of acuterheumatic fever. In spite of the fact that groupA streptococci have not yet developedresistance to penicillin this therapy has notbeen successful in controlling streptococcalinfection and the sequelae. Development of avaccine against group A streptococci isurgently needed and is a great challenge instreptococcal research. In the last few years,many potential vaccine candidates have beenidentified. Because of the protective action ofanti M protein antibodies many groups havetried to develop M protein based vaccines.


sehr rasch das Vollbild der Erkrankung. Zudiesem Zeitpunkt bestehen in der Regelauch systemische Infektzeichen, was zueinem multiplen Organversagen und Todführen kann. Selbst bei aggressiverTherapie liegen die Mortalitätsraten umdie 50 Prozent. Zellulitis und Myositiskönnen auch durch invasive Streptokok-ken entstehen. Diese Infektionen könnenzu einer schwerwiegenden Komplikation,dem Streptokokken Toxic Shock-Syndrom,führen, was bei jungen Erwachsenenvorkommt. Typische Symptome diesesSyndroms sind starke Schmerzen, hohesFieber und schließlich der septischeSchock. Für die Entstehung des ToxicShock sind hauptsächlich die sezerniertenFaktoren der Streptokokken verantwort-lich, wie z.B. erytrogene Toxine und Super-antigen, deren Einfluß auf Immunzelleneine massiv verstärkte IL-1α/β-, IL-8- undTNFα-Ausschüttung bewirkt. Wie beiNachfolgeerkrankungen spielt auch beiinvasiven Faktoren die Wirtssuszeptibilitäteine große Rolle.

Genetische Suszeptiblität bei invasivenStreptokokkeninfektionen

Wie bei ARF ist die genetischeSuszeptibilität auch bei invasiven Infektio-nen ein wichtiger Faktor. Die genetischeSuszeptibilität kann man auch bei Mäusenbeobachten. Verschiedene Inzuchtmaus-stämme zeigen unterschiedliche Empfind-lichkeit gegen Gruppe A Streptokokken.BALB/c, C57BL/10, DBA/2-Mausstämmesind sehr resistent, wogegen C3H/HeNund CBA/J sehr anfällig sind. AngeboreneImmunität spielt bei Suszeptibilität einewichtige Rolle. Der Verlauf der Krankheitbei anfälligen Mäusen ist sehr ähnlich wiebei invasiven Streptokokkenkrankheitenbeim Menschen, was die Bedeutung diesesTiermodells unterstreicht. Die Identifizie-rung der Gene, die für Resistenz oderSuszeptibilität verantwortlich sind, wirdzur Entwicklung von Bekämpfungs-strategien für invasive Streptokokkeninfek-tionen beitragen.

Therapie und VorbeugungDie häufigste Strategie zur Bekämpfungder Streptokokkeninfektionen und derNachfolgeerkrankungen ist die Verwen-dung von Penicillin. Penicillin wird nichtnur für die Behandlung von Streptoko-kkenpharyngitis, sondern auch alsSekundärprophylaxe für ARF angewandt.Trotz der Tatsache, dass bis jetzt keineResistenzen gegen Penicillin bei Gruppe AStreptokokken zu beobachten sind,konnte diese Therapie u.a. aufgrund unzu-reichender Befolgung nicht zur Bekämp-fung der Streptokokkenkrankheitenbeitragen. Die Entwicklung eines Impf-stoffes gegen Gruppe A Streptokokken istdringend notwendig und stellt eine großeHerausforderung dar. In den letztenJahren sind viele potentielle Impfstoff-kandidaten identifiziert worden. Da dieAntikörper gegen M-Protein Schutzwir-kung zeigen, haben viele Gruppen M-Protein als Impfstoffkandidaten unter-sucht. Trotz der Schutzwirkung der M-Protein-Antikörper wurden die Versuche,einen effektiven Impfstoff auf Grundlagedes M-Proteins zu entwickeln, durch zweigrundlegende Probleme behindert. Zumeinen scheint das M-Protein, wenigstenszum Teil, an Folgeerkrankungen, die eineStreptokokkenerkrankung nach sichziehen kann, beteiligt zu sein. M-Proteinbesitzt kreuzreaktive Epitope für einigeWirtsproteine, die für die Entstehung derNachfolgeerkrankungen verantwortlichsein können. Das zweite Problem liegtdarin, daß es eine große Anzahl von Sero-typen des M-Proteins gibt und die Immu-nität durch die Antikörper in der Regel M-Serotyp-spezifisch ist. Einige Fortschrittezur Lösung dieser Probleme sind in denletzten Jahren erzielt worden. Vakzin-prototypen, die C-Repeat-Peptide beinhal-ten, zeigten Schutzwirkung in einemMausmodell. Multivalente M-Protein-Vakzinprototypen, die Peptide verschiede-ner M-Serotypen beinhalten, haben auchermutigende Ergebnisse im Mausmodellgeliefert. Die auf M-Protein basierendenImpfstoffprototypen befinden sich zurZeit in der Optimierungsphase.

Eine alternative Strategie ist dieVerwendung von Streptokokkenadhäsinenals Impfstoffkandidaten. SfbI-Protein, dasHauptadhäsin der Gruppe A Streptokok-

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These efforts have not been very successfulbecause of two basic problems. Firstly, Mprotein, or at least a part of it, has beenassociated with the sequelae, because itpossesses cross-reactive epitope for certain hostproteins, and secondly, M protein occurs in alarge number of serotypes, and the protectionis generally M serotyp specific. Some progresshas been made to solve these problems.Vaccine prototypes containing C-repeatpeptides have shown protectivity in mousemodels. Multi-valent M protein vaccineconsisting of the peptides from variable regionsof M serotypes have also yielded promisingresults. M protein based vaccine prototypes arestill in the optimization phase.

An alternative strategy for the developmentof streptococcal vaccine is the use ofstreptococcal adhesins as candidates. SfbIprotein, the major adhesin of group Astreptococci, is capable of inducing protectiveimmune response against differentstreptococcal strains in a mouse lethalitymodel. The fibronectin binding domains ofSfbI proteins represent important protectiveantigens. There are many other advantages ofSfbI protein based vaccines, a) SfbI protein isexpressed by more than 70 % of the clinicalisolates belonging to different serotypes fromdifferent geographical areas, b) the fibronectinbinding domains of SfbI protein are highlyconserved, c) antibodies against SfbI proteindo not show any cross reactivity with cardiacproteins and d) SfbI protein acts as a strongmucosal adjuvant. Therefore, SfbI proteinseems to be a promising vaccine candidatethat should soon go to phase I trials. Beside Mprotein and SfbI protein, other vaccineprototypes based on FBP54 protein and C5apeptidase are also in a developing phase.

Group B streptococciGroup B streptococci, with the only speciesStreptococcus agalactiae, were described forthe first time in 1887 when they were isolatedfrom a case of bovine mastitis. Till 1937, theywere not regarded as human pathogens, butwere then identified as a causative for sepsisin the new-born. In the last couple of decades,they have become a serious health problemand a major cause of bacterial meningitis innew-borns. The infection of new-borns withgroup B streptococci is not only characterizedby high mortality rates, but also a largepercent of survivors suffer from subsequentneuronal damage. The infection of the new-

borns starts during delivery, when theyswallow the vaginal fluid of the mother, inwhich group B streptococci occur assymptomless flora. Because of the reducednumber of alveolar macrophages andincomplete immunity in the new-borns thesestreptococci can easily colonize the lungs.From here they invade the blood and form asystemic infection. The precise mechanismshow group B streptococci reach circulationfrom lung are not yet known. The infection ofthe new-born is divided into two differenttypes of disease. In “early-onset disease” thesymptoms appear between 24 and 72 hoursafter birth, the mortality in these cases is 89% with sepsis, and 62 % with meningitis.Early-onset disease is also characterised by ahigh rate of neurological damage in thesurvivors. In “late-onset disease” the symptomsappear many weeks after birth, andmeningitis is the major manifestation. Themortality with 10 to 20 % is much lower thanwith early-onset disease. Group B streptococcalinfections are also observed in adults, but theincidence is not as high as in the new-borns.

Group B streptococci are divided into ninedifferent serotypes, out of which serotype Ia,Ib, II and III are most common. Approxi-mately 40 % isolates from invasive diseasesare Ia type, and 27 % type III. The majorproblem with group B streptococcal infectionsis the fast and dramatic progression of thedisease, which cannot be sufficiently treatedwith antibiotics. As many women ofchildbearing age have been colonized withgroup B streptococci in vaginal area, everypregnant woman is tested for this organism.In case of positive results, they are normallytreated with antibiotics before delivery toreduce the risk of transferring the bacteria tothe new-born. Because of increasing resistanceof antibiotics against these bacteria and therisk of allergic reaction to the mother and thenew-born it is desirable to develop analternative to antibiotic therapy. Clinicalstudies have shown that the infants whosemothers have a high titer of anti group Bstreptococcal antibodies are rarely infected.Therefore, vaccination of women inchildbearing age to passively protect the new-born seems to be a promising strategy. Becausethe capsule of group B streptococci is animportant virulence factor, efforts have beenmade to use it as a vaccine candidate. Theseefforts were unsuccessful because of theantigen variation and the low immunogenicity


ken, ist in der Lage, eine Schutzimmun-antwort gegen verschiedene Strepto-kokkenstämme in einem Mausmodell zuerzeugen. Die Fibronektinbindungs-domänen spielen bei der Schutzwirkungeine entscheidende Rolle. Weitere Vorteilevon auf SfbI basierendem Impfstoff sinda) SfbI-Protein wird von mehr als 70 %der klinischen Isolate verschiedenerSerotypen exprimiert, b) die Fibronektin-bindungsdomänen des SfbI-Proteins sindhochkonserviert, c) Antikörper gegen SfbI-Protein zeigen keine Kreuzreaktivität mitHerzproteinen und d) SfbI-Protein wirktals mukosales Adjuvans. Daher ist SfbI-Protein ein vielversprechender Impfstoff-kandidat, der bald in Phase I gehen wird.Außer M-Protein und SfbI-Proteinbefinden sich auch FBP54 und C5A-Peptidase basierte Impfstoffprototypen inder Entwicklungsphase.

Gruppe B StreptokokkenDie Gruppe B Streptokokken (GBS) mitder Einzelart Streptococcus agalactiae fan-den erstmals 1887 als pathogene ErregerBeachtung, als sie in Verbindung mit einerRindermastitis isoliert wurden. Bis 1937galten Gruppe B Streptokokken nicht alshumanpathogen. Danach erfolgte erstmalsdie Identifizierung von Gruppe B Strepto-kokken als Verursacher einer Sepsis beiNeugeborenen. Inzwischen sind dieseStreptokokken als Erreger von Lungen-und Hirnhautentzündungen in Neugebo-renen von großer medizinischer Bedeu-tung. Sie gelten mittlerweile als Haupt-verursacher (>30 %) tödlich verlaufenderbakterieller Hirnhautentzündungen beiNeugeborenen mit Sterblichkeitsraten vonca. 6 % und neuronalen Folgeerscheinun-gen bei über 50 % der Überlebenden. DieInfektion des Neugeborenen erfolgt meistwährend der Geburt durch Verschluckenvon mütterlichem Vaginalschleim, in demGBS als symptomlose Besiedler vor-kommt. Da bei Neugeborenen die Anzahlan alveolären Makrophagen reduziert undzudem ihre antibakterielle Aktivität nochnicht vollends ausgebildet ist, wird durchGBS zunächst die Lunge des Neugebore-nen besiedelt. Anschließend erfolgt dasEindringen der Bakterien in den Blutkreis-lauf und die Ausbildung einersystemischen Infektion. Die genauenMechanismen, wie die Gruppe B Strepto-

kokken von der Lunge in den Blutkreislaufgelangen, sind noch nicht aufgeklärt. DieInfektionen von Neugeborenen sind inzwei getrennt voneinander vorkommendeKrankheitsbilder unterteilt. Im „early-onset-disease” treten die Krankheitssymp-tome innerhalb von 24 bis 72 Stundennach der Geburt auf. Die Mortalitätsratebei early-onset Fällen beläuft sich auf89 % bei auftretender Sepsis und 62 % beiauftretender Meningitis. Weiterhin tretenbei vielen überlebenden Neugeborenenneurologische Folgeschäden auf. In „late-onset” Fällen treten die Krankheitssympto-me bei Neugeborenen erst nach mehrerenWochen auf. Hierbei handelt es sichhauptsächlich um Meningitis, wobei dieMortalitätsrate mit 10 bis 20 % deutlichgeringer als bei early-onset Fällen liegt.Gruppe B Streptokokkeninfektionenkönnen auch bei Erwachsenen auftreten.Die Inzidenzrate aber ist viel niedriger alsbei Neugeborenen.

Die Gruppe B Streptokokken sind inneun Serotypen unterteilt. Davonkommen Serotypen Ia, Ib, II und III sehrhäufig vor. Ca. 40 % der Isolate voninvasiven Krankheiten haben Ia Polysac-charide, und 27 % Typ III Polysaccharide.Die besondere Problematik von GBS-Infektionen liegt insbesondere in demsehr schnellen und dramatischen Krank-heitsverlauf, dem nur ungenügend miteiner Antibiotikatherapie begegnet werdenkann. Da zahlreiche Frauen imgebärfähigen Alter durch GBS im Vaginal-bereich kolonisiert sind, werden daherschwangere Frauen auf eine Besiedlungdurch GBS getestet. Bei Nachweis dieserBakterien wird derzeit kurz vor derNiederkunft eine Antibiotika-Therapiedurchgeführt, um das Risiko einerInfektion durch GBS während der Geburtzu reduzieren. Aufgrund der zunehmen-den Resistenz dieser Bakterien gegenüberherkömmlichen Antibiotika und derGefahren einer allergischen Reaktion vonMutter und Neugeborenem auf dieverabreichten Antibiotika ist es wün-schenswert, Alternativen zur Antibiotika-therapie zu entwickeln. Klinische Studienhaben gezeigt, dass Kinder, deren Müttereinen hohen Antikörpertiter gegen GBSbesitzen, nur selten durch diese Bakterieninfiziert werden. Eine attraktive Alternativezur herkömmlichen Antibiotikatherapie

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of capsule polysaccharides. The interest hastherefore shifted towards the surface protein asvaccine candidate. Major surface proteins ofgroup B streptococci are α and β antigen of Cprotein complex and different R proteins. Inanimal model some of these proteins haveinduced protective immune response. Also thesecreted components of group B streptococcihave recently gained importance. A secretedprotein designated SibB is capable of bindingimmunoglobulins and can therefore play a rolein pathogenicity. In spite of the urgent need ofa group B streptococcal vaccine the develop-ment is still in an early phase. Promisingprototypes seem to be conjugate vaccinesconsisting of polysaccharides and proteinantigens.

Group C and group G streptococciGroup C and group G streptococci belong toheterogenous streptococcal species whichinclude commensals as well as serious diseasecausing bacteria. Group C streptococci can bedivided into two morphological groups, thelarge and the small colony variants. The smallcolony variants, which include Streptococcusmilleri group, form the normal flora in mouthcavity, gastro-intestinal and urinary tract ofhuman beings, but are also capable of causingserious infections. The large colony variants,which include species like Streptococcusequi and Streptococcus dysgalactiae aretraditionally considered as animal pathogens,although they can cause bacteremia, cellulitis,peritonitis, septic arthritis, pneumonia andendocarditis in human beings. Although theincidence rate of human infections by group Cstreptococci is much lower than those by groupA and group B streptococci, the mortality ofapproximately 25 % is very high. Group Gstreptococci were also initially not consideredas human pathogens and were regarded asnormal flora of human skin, throat andgastro-intestinal tract. In the last few years,however, the incidence of life-threateninghuman infections by group G streptococci havesubstantially increased.

As with group A streptococci, the adherenceand invasion also plays an important role inthe pathogenesis of group C and group Gstreptococci. They, too, are capable of bindingto many host proteins. Fibronectin bindingproteins, M-like proteins, as well as differentenzymes and toxins are the majorpathogenicity factors. The precise pathogenicmechanisms of these organisms have not yet

been fully understood.Group C and group G streptococci have

recently been associated with acute rheumaticfever. The Aboriginal population of Australia,where streptococcal pharyngitis is extremelyrare, shows the highest incidence worldwide ofrheumatic heart disease. The antibodiesagainst group C and group G streptococci,isolated from this population, show a strongcross-reactivity to cardiac myosin. Thisassociation between group C and G strepto-cocci and rheumatic fever might explain alarge number of rheumatic fever cases withouta known history of group A streptococcalinfections. If the studies in other endemicareas also confirm the involvement of group Cand group G streptococci in rheumatic fever, itwould then be essential to test for theirpresence in the throat cultures and to treataccordingly.

Streptococcus pneumoniaeAnother import species of genus Strepto-coccus is S. pneumoniae. These organismsare exclusively human pathogens and form thenormal flora in 10 % adults and about 40 %healthy children. The pneumococci can alsocause life-threatening diseases such asbacteremia, pneumonia and meningitis. Inthe USA alone, 7 million cases of otitis mediaand more than half a million cases ofpneumonia are registered every year, withabout 5 to 10 % mortality. Worldwide, morethan 20 million cases of pneumonia withabout 1 million deaths are registered everyyear.

Pneumococci are divided into 90 differentserotypes, depending on the composition oftheir capsules. The distribution of the serotypesis different in different geographical areas.The capsule polysaccharide is anantiphagocytic factor and plays an importantrole in pathogenesis. Other pathogenicityfactors are hyaluronatelyase, neurominidases,pneumolysin, autolysins, pneumococcalsurface antigen A and a family of cholinebinding proteins. Pneumolysin, a cytotoxicprotein, is present in cytoplasm and is secretedafter the action of autolysins. The cytotoxicactivity damages the bronchial epithelial cellsand can directly inhibit the phagocytosis andthe function of immune cells. The proteinswhich are anchored on a pneumococcalsurface through a choline mediatedmechanism also play a role in pathogenesis.Nine such proteins have so far been identified,


ist daher die Impfung von Frauen imgebärfähigen Alter, um damit passiv denNeugeborenen vor einer Infektion durchGBS zu schützen. Da die Kapsel von GBSwichtig für deren Virulenz ist, wurdenbereits Versuche unternommen, Kapsel-polysaccharide als Vakzin zu verwenden.Dies scheiterte jedoch an der Antigen-variabilität und der geringen Immuno-genität der Kapselpolysaccharide. In denletzten Jahren haben daher die Oberflä-chenproteine der Gruppe B Streptokokkenals Impfstoffkandidaten an Bedeutunggewonnen. Wichtige Oberflächenproteinesind α- und β-Antigen des C-Protein-Komplexes und verschiedene R-Proteine.In Tiermodellen können einige dieserProteine Schutzwirkung zeigen. Auch diesekretierten Komponenten der Gruppe BStreptokokken gewinnen zunehmend anBedeutung. Ein sekretiertes Protein,genannt SibB, ist in der Lage, Immun-globulin zu binden und dadurch eineRolle in der Pathogenität zu spielen. Trotzgroßen Bedarfs an Gruppe BStreptokokkenimpfstoff befindet sich dieEntwicklung immer noch in der Früh-phase. Vielversprechend scheint einKonjugatimpfstoff aus Polysaccharidenund Proteinantigen zu sein.

Gruppe C und Gruppe G StreptokokkenGruppe C und Gruppe G Streptokokkengehören zur heterogenen Streptokokken-spezies, die sowohl als Kommensale alsauch als ernst zu nehmende Krankheitser-reger bei Mensch und Tier vorkommen.Die C Streptokokken kann man in zweimorphologische Gruppen, Groß- undKleinkolonie-Varianten, unterteilen. DieKleinkolonievarianten, zu denen auch dieStreptococcus milleri-Gruppe gehört, bildennormale Flora in Mundhöhle, Darm undHarntrakt des Menschen, sind aber auchin der Lage, ernsthafte Infektionen zuverursachen. Die Großkolonie-Variantenmit Spezies wie Streptococcus equi undStreptococcus dysgalactiae sind traditionellals tierpathogen bekannt, obwohl sichbeim Menschen Bakteriämie, Zellulitis,Peritonitis, septische Arthritis, Pneumo-niae und Endokarditis verursachenkönnen. Wenn auch die Inzidenzrate dermenschlichen Infektionen durch GruppeC Streptokokken viel niedriger liegt als beiGruppe A und Gruppe B Streptokokken,

ist die Mortalitätsrate von ca. 25 % sehrhoch. Gruppe G Streptokokken wurdenam Anfang ebenfalls als nichtpathogenbezeichnet und galten als normale Floravon menschlicher Haut, Hals undDarmtrakt. In den letzten Jahren hat dieInzidenz von lebensbedrohlichenmenschlichen Infektionen durch GruppeG Streptokokken erheblich zugenommen.

Wie bei Gruppe A Streptokokken spieltdie Anheftung und Invasion bei C und GStreptokokken eine wesentliche Rolle.Gruppe C und G Streptokokken sind inder Lage, mit Wirtsproteinen zu inter-agieren. Fibronektinbindungsproteine,M-ähnliche Proteine sowie verschiedeneEnzyme und Toxine sind wichtigePathogenitätsfaktoren der Gruppe C undGruppe G Streptokokken. Die genauenMechanismen sowie Beteiligung dieserFaktoren in der Virulenz sind weitgehendungeklärt.

Streptokokken der Gruppe C und Gsind kürzlich auch mit ARF in Verbindunggebracht worden. Die Aborigines inAustralien, die kaum an Gruppe AStreptokokken-Pharyngitis erkranken,dagegen aber hohe Raten an Gruppe Cund G Streptokokken aufweisen, zeigenweltweit die höchste Rate an ARF. DieAntikörper gegen C und G Streptokokken-Isolate von Aborigines sind in der Lage,mit menschlichem Herzmyosin zureagieren. Dieser Zusammenhangzwischen Gruppe C und G Streptokokkenund ARF liefert einen möglichen Beweisdafür, dass manche ungeklärten Fälle vonARF durch Nicht-Gruppe A-Streptokokkenverursacht werden. Falls die weiterenUntersuchungen in endemischen Gebie-ten dies bestätigen, werden als Konse-quenz auch Gruppe C und G Streptokok-ken in Rachenuntersuchungen erfaßtwerden.

Streptococcus pneumoniaeEine andere wichtige Spezies der GattungStreptococcus ist S. pneumoniae. DiePneumokokken sind ausschließlichhumanpathogene Bakterien, die denAtmungstrakt in 10 % der gesundenErwachsenen und in mindestens 40 % dergesunden Kinder asymptomatisch alsNormalflora besiedeln. Auf der anderenSeite sind sie in der Lage, lebensgefährli-che Erkrankungen wie Lungenentzündun-

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including pneumococcal surface protein A(PspA) and secretory IgA binding proteinSpsA. PspA is a strongly immunogenic proteinwhich specifically binds human lactoferrin.PspA has been shown to be a protectiveantigen in animal models. SpsA, with aconserved functional domain for binding tosecretory IgA and secretory component, seemsto be a promising vaccine candidate, alsobecause it is expressed by all serotypes.

Beside proteins, with a membrane anchormechanism, pneumococci express and secreteproteins without such an anchor. One of theseproteins is Eno, an α-enolase of pneumococci,which is an important enzyme of glycolyticpathway. After secretion, Eno is capable of re-association to bacterial surface. An importantproperty of Eno is its binding to plasmin andplasminogen, which might allow the bacteriato invade into the tissues by the degradation ofextracellular matrix. This is a first example ofa metabolic enzyme which also acts as apossible pathogenicity factor.

The high mortality rate of the S.pneumoniae infection has remainedconstant in the last 30 years, in spite of theavailability of antibiotics. One of the reasonsis the dramatic spread of penicillin resistantpneumococci in the last few years. Theincrease in the antibiotic resistance incountries like Spain and South Africa, where60 % of the isolates are resistant, is a matterof serious concern. To stop the further spreadof resistant pneumococci, it is essential tounderstand the molecular events leading tothe development of resistance and theidentification of the factors that allow the fastspread of these strains.

Another problem to control S.pneumoniae infection is the sub-optimalefficacy of the current vaccine, which consistsof 23 polysaccharides. Although these 23polysaccharide types are present in 90 % ofthe isolates from Europe and USA, it does notoffer an effective protection in children andelderly persons, which are the main riskgroups. The immunogenicity of the capsuleantigens can be increased by their conjugationwith immunogenic proteins. One problem isthe high antigen variability of pneumococcalproteins. Therefore, the proteins or the peptideswhich are conserved in all serotypes will berequired for conjugation. PspA and SpsA,whose functional groups are highly conserved,are promising candidates for use as conjugatevaccine prototype.

PerspectivesStreptococcal infections remain a serioushealth problem worldwide. Since antibioticsalone have not been able to control theseinfections, the development of an effectivevaccine and other control strategies will be thefocus of the future research. A prerequisite isthe precise understanding of the pathogenesisof streptococcal infections. An importantstarting point is the understanding of thepathogenesis of rheumatic fever, themechanisms of the association of group C andgroup G streptococci in rheumatic heartdisease and the understanding of the processby which pneumococci convert themselvesfrom harmless commensals to highly virulentpathogens. These results can contributetowards the development of a suitable strepto-coccal vaccine and an improved pneumococcalvaccine. In the last few years, alternativetherapeutic strategies, which target the criticalinfections mechanisms, are gaining interest.To control the streptococcal infections, it willalso be essential to study the geneticsusceptibility and identify the genetic markers.The sequencing of human and streptococcalgenomes will make it easier to identify thegenes involved in pathogenesis and suscepti-bility as well as to study their regulation. Abottleneck will be the lack of suitable animalmodels. The use of susceptible mouse strainsmay solve the problem of invasive infectionsmodels, but the development of a model forrheumatic heart diseases remains a challenge.For this, transgenic and knock-out mice maybe helpful. In spite of great expectations, a lotmore research efforts will be required to developeffective vaccines and alternative control stra-tegies and to bring them into the clinical phases.

AcknowledgementI am grateful to Dr. Sven Hammerschmidt,Dr. Eva Medina, Dr. Manfred Rohde, Dr.Susanne Talay, Mrs. Helga Brink and othermembers of the Streptococcal team for theirhelp in the preparation of this article.

References ❘ LiteraturIn diesem Aufsatz sind die Arbeiten derGBF Gruppen und sehr vieler andererArbeitsgruppen zitiert, so dass es nichtmöglich ist, alle Zitate zu erwähnen. Imfolgenden sind ein paar wichtige Werkefür weitere Lektüre und einige Arbeitender GBF Streptokokken-Gruppe zusam-mengestellt.


gen, Hirnhautentzündungen und Bakteri-ämien zu versursachen. Allein in den USAwerden 7 Millionen Fälle von Mittelohr-entzündung und mehr als eine halbeMillion Lungenentzündungen pro Jahrregistriert, von denen 5 % bis 7 % einentödlichen Ausgang haben. Weltweitgesehen, sterben an den Folgen einerPneumokokken-Pneumonie bei 20Millionen Fällen pro Jahr ungefähr eineMillion Erkrankte und des weiterensterben ungefähr 75000 pro Jahr an denFolgen einer Pneumokokken-Meningitis.

Aufgrund der unterschiedlichenchemischen Zusammensetzung der Kapselwurden bereits 1932 die Pneumokokkenin 32 verschiedene Serotypen eingeteilt.Heute werden die Pneumokokken in über90 Serotypen unterteilt, deren Vorkom-men bei Erkrankungen durch Pneumo-kokken unterschiedlich häufig ist. DasKapselpolysaccharid schützt den Erregervor dem Immunsystem, indem es einenSchutz gegenüber der Phagozytose durchMakrophagen, Abwehrzellen des Immun-systems, darstellt. Weitere bakterielleFaktoren, die im Infektionsprozess einewichtige Funktion haben, sind eineHyaluronatlyase, das Pneumolysin, zweiNeuraminidasen (NanA und NanB),Autolysine, PsaA (pneumococcal surfaceantigen A) und die Familie der Cholin-bindenden Proteine. Pneumolysin, einzytotxisches Protein, kommt im Zytoplas-ma vor und wird durch Autolysinefreigesetzt. Die zytotoxische Aktivitätzerstört die bronchialen Epithelien undkann auch direkt die Phagozytose undFunktion der Immunzellen inhibieren.Die Proteine, die durch eine Cholinvermittelte Interaktion mit den Lipo-teichonsäuren auf der Bakterienoberflächelokalisiert sind, bilden bei Pneumokokkendie Familie der Cholin-bindendenProteine. Neun Cholin-bindende Proteinesind identifiziert, darunter das Pneumo-coccal Surface Protein A (PspA) und dassekretorische IgA bindende Protein SpsA.PspA ist ein stark immunogenesOberflächenprotein, das humanesLaktoferrin, ein Eisentransportprotein desWirtes, bindet. In Immunisierungsstudienmit PspA konnte das Protein als eingeeigneter Kandidat für einen Protein-basierten Impfstoff aufgezeigt werden. Einanderer wichtiger Pathogenitätsfaktor ist

das sekretorische IgA bindende ProteinSpsA. Funktionelle Studien bewiesen, dassdie Interaktion der Pneumokokken mitSIgA über die Bindung der sekretorischenKomponente an SpsA erfolgt. Diefunktionelle Domäne des SpsA Proteinsstellt somit einen vielversprechendenBestandteil eines neuen konjugatenImpfstoffkandidaten dar, da eine derwichtigsten Voraussetzungen, dieKonserviertheit der Peptidsequenz in allenSerotypen der Pneumokokken, erfüllt ist.

Neben Proteinen mit Motiven für eineVerankerung in der Zellwand, sind auchProteine vorhanden, die keine derartigenMotive besitzen. Eines dieser Proteine istEno, eine α-Enolase der Pneumokokken.Dieses Protein ist ein wichtiges Enzym derGlykolyse und vor allem auch im Zyto-plasma der Bakterien zu finden. NachSekretion ist Eno in der Lage, wieder anOberflächen der Bakterien zu binden. Einewichtige Eigenschaft der Eno ist dieBindung an Plasminogen und Plasmin.Die biologische Funktion dieser Interakti-on könnte die Förderung der Wanderungder Pneumokokken durch das Epitheldurch eine Plasmin-vermittelteDegradation der extrazellulären Matrixsein. Dies ist ein erstes Beispiel, wo einStoffwechselenzym der Bakterien aucheine Beteiligung an der Pathogenität zeigt.

Die hohe Sterblichkeitsrate infolgeeiner Infektion mit S. pneumoniae ist trotzder zur Verfügung stehenden Antbiotikaund eines Impfstoffes in den letzten 30Jahren konstant geblieben. Einer derGründe ist die dramatische Ausbreitungder Penicillin-resistenten Pneumokokkenin den letzten Jahrzehnten. Die Ausbrei-tung und der Anstieg der resistentenIsolate, der in Ländern wie Spanien undSüdafrika heutzutage einen Anteil von biszu 60 % ausmacht, ist besorgniserregend.Um die weitere Ausbreitung der resisten-ten Pneumokokken zu verhindern, istdaher ein besseres Verständnis dermolekularen Vorgänge, die zur Entwick-lung der Antibiotikaresistenz beitragen,sowie die Identifikation der Faktorennotwendig, die diese schnelle Ausbreitungermöglichen.

Ein weiteres Problem bei der Bekämp-fung von Infektionen durch S. pneumoniaeist die geringe Wirksamkeit des zurVerfügung stehenden Impfstoffes. Der 23-

Research Reports 34

In this article, lot of publications of the GBFand external groups have been used, and it isnot possible to cite all of them. The followinglist includes some important books for furtherreading and some selected publication of theGBF streptococcal group.

Stevens DL, EL Kaplan (2000) Streptococcalinfections. Clinical aspects, microbiology andmolecular pathogenesis. Oxford UniversityPress, New York.

Fischetti VA, RP Novick, JJ Ferretti, DAPortnoy, JI Rood (2000) Gram-positivepathogens. ASM Press, Washington, DC.

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Ausgewählte Veröffentlichungen der GBFüber Streptokokken

Selected publications from the GBF aboutstreptococci

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Haidan A, SR Talay, M Rohde, KSSriprakash, BJ Currie, GS Chhatwal (2000)Pharyngeal carriage of group C and Gstreptococci might be associated with acuterheumatic fever in the Aboriginal populationof the Northern Territory of Australia. TheLancet 356:1167-1169.

Hammerschmidt S, G Bethe, P Remane, GSChhatwal (1999) Identification ofpneumococcal surface protein A as alactoferrin-binding protein of Streptococcuspneumoniae. Infect Immun 67:1683-1687.

Hammerschmidt S, MP Tillig, S Wolff, J-PVaerman, GS Chhatwal (2000) Specie-specific binding of human secretorycomponent to SpsA protein of Streptococcuspneumoniae via a hexapeptide motif. MolMicrobiol 36:726-736.

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Jerlström PG, SR Talay, P Valentin-Weigand,KN Timmis, GS Chhatwal (1996)Identification of an immunoglobulin Abinding motif located in the ß-antigen of the cprotein complex of group B streptococci. InfectImmun 64:2787-2793.


valente PneumokokkenimpfstoffPneumovax®, der aus den aufgereinigtenund konjugierten Polysacchariden der 23Serotypen besteht, die in Europa und denUSA mehr als 90 % der Infektionenverursachen, vermittelt bei den Haupt-risikogruppen keinen ausreichendenSchutz. Eine Strategie, die geringeImmunogenität der Kapselantigene zusteigern, ist die Konjugation mit einemimmunogenen Protein. Ein Problem beider Nutzung von immunogenen Protei-nen von S. pneumoniae ist die antigeneVariabilität der Primärstrukturen. Daherkönnen als Träger nur Peptide dieserProteine verwendet werden, die in allenSerotypen hochkonserviert sind. Dieskönnen wie bei PspA und SpsA funktio-nelle Gruppen sein, deren Konserviertheitin epidemiologischen Studien gezeigtwerden konnte.

PerspektivenStreptokokken-Infektionen sind eingroßes Gesundheitsproblem weltweit. Dadie Antibiotika allein zur Bekämpfungdieser Infektionen nicht ausreichendwaren, steht die Entwicklung von Impf-stoffen und anderen Bekämpfungs-strategien im Vordergrund. Eine Vorausset-zung ist die genaue Aufklärung derPathogenese von Streptokokken-Infektio-

nen. Wichtige Ansatzpunkte sind Ver-ständnis über Entstehung des rheumati-schen Fiebers, die Mechanismen derBeteiligung von Gruppe C und G Strepto-kokken an der rheumatischen Herzkrank-heit, die Aufklärung der Prozesse wiePneumokokken sich vom harmlosenKommensal zum hochvirulenten Erregerverwandeln. Diese Ergebnisse können zurEntwicklung neuer Impfstoffe gegenStreptokokken und eines besseresImpfstoffes gegen Pneumokokken führen.Darüber hinaus gewinnen zunehmendalternative therapeutische Strategien, diegezielt in verschiedene Infektionsprozesseeingreifen, an Bedeutung. Zur Bekämp-fung der Streptokokkeninfektion wirdauch das Verständnis über genetischeSuszeptibilität des Wirtes eine große Rollespielen. Die Entschlüsselung des mensch-lichen sowie des Streptokokken-Genomswird sicherlich zur Identifizierung derbeteiligten Gene, ihrer Regulation und zurAufklärung der pathogenen Mechanismenbeitragen. Ein Engpaß hierbei ist auch derMangel an geeigneten Tiermodellen. DieVerwendung von suszeptiblen Maus-stämmen hat wahrscheinlich das Probleminvasiver Infektionsmodelle gelöst, aberdie Entwicklung eines Modells fürrheumatische Herzkrankheit bleibt eineHerausforderung. Hierfür werdentransgene und knock-out-Mäuse eineAnwendung finden. Trotz großer Erwar-tungen bedarf es noch großer Forschungs-anstrengungen, um effektive Impfstoffeund alternative Bekämpfungsstrategien indie klinische Phase zu bringen.

AcknowledgementIch danke Dr. Sven Hammerschmidt, Dr.Eva Medina, Dr. Manfred Rohde, Dr.Susanne Talay, Helga Brink und anderenMitarbeitern des Streptokokken-Teams fürihre Hilfe bei der Anfertigung diesesAufsatzes.

Abb. 8. Das Streptokokken-Team der GBF

Fig. 8. The streptococci-teamof the GBF

Research Reports 36

Kreikemeyer B, SR Talay, GS Chhatwal(1995) Characterization of a novel fibronec-tin-binding surface protein among group Astreptococci. Mol Microbiol 17:137-145.

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2 fragment.

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Molinari G, SR Talay, P Valentin-Weigand,M Rohde, GS Chhatwal (1997) Thefibronectin-binding proteon of Streptococcuspyogenes, SfbI, is involved in theinternalization of group A streptococci byepithelial cells. Infect Immun 65:1357-1363.

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Das Portrait – Prof. Gursharan S. Chhatwal

Studium am G. S. Medical College in Bombay und Doktorarbeit am Haffkine Institute (ge-nannt nach dem russischen Impfstoffforscher). Danach verschiedene Forschungs-aufenthalte in Japan, Kanada und Indien. 1980 Humboldt-Stipendiat an der UniversitätGießen, dann Wissenschaftler an der Uni Gießen und der GBF. Seit 1994 Leiter der Abtei-lung Mikrobielle Pathogenität und Impfstoffforschung an der GBF. Gewinner der BNDGoldmedaille, Lotus Foundation Prize und Whitehall Fund Prize. Habilitation in Mikro-biologie, TU Braunschweig. International Advisor to Lancefield Society for Streptococciand Streptococcal Deseases. 7 Sprachen (Englisch, Deutsch, Japanisch, Hindi, Punjabi,Urdu, Marathi). Hobby: Magie (wenn neben der Wissenschaft etwas Zeit übrig bleibt).

Was steht zurzeit im Focus Ihrer For-schungsarbeit?

Streptokokken und Pneumokokken. Beidestellen ein großes Gesundheitsproblemdar. Infektionen mit Streptokokken kön-nen rheumatische Herzkrankheiten zurFolge haben, wovon 15 Millionen Kinderauf der Welt betroffen sind. Bisher gibt esauch keinen Impfstoff. Unser Schwer-punkt ist die Grundlagenforschung. Wirwollen die Mechanismen dieser Krankhei-ten verstehen, um neue Bekämpfungs-strategien zu entwickeln.

Wissenschaftlich gesehen sind dieStreptokokken hochinteressant: Es gibtüber hundert verschiedene Serotypen, undsie haben geniale Mechanismen zur Um-gehung der menschlichen Immunabwehrentwickelt. An Pneumokokken sterben al-leine 40 000 Menschen pro Jahr in denUSA. Der Impfstoff ist nicht sehr effektiv,und Antibiotika wirken oft nicht mehr.

Was sind die Ziele Ihrer Arbeit?Ein Fernziel ist die Entwicklung einesStreptokokkenvakzins für das WHO-Kinderimpfprogramm. Ein Problem ist dieDiversität der Streptokokken. Durch dieEntzifferung des menschlichen und desStreptokokken-Genoms sind wir in derLage zu klären, ob die Unterschiede imKrankheitsbild durch die Bakterien, denWirt oder ihre Interaktionen verursachtwerden.

Kleine Kinder sind durch den vorhan-denen Impfstoff gegen Pneumokokkenbisher nicht geschützt. Hier suchen wirnach neuen Strategien. Zum Beispiel brau-chen die Pneumokokken zur Vermehrungim Körper Eisen, das sie sich von körper-eigenen Proteinen stehlen. Wenn wir dasverhindern könnten, würde die Krankheitnicht ausbrechen.

Wie wird sich die Infektionsbiologie inden nächsten Jahren entwickeln?

Bei der Bekämpfung von Infektionskrank-heiten wurden bisher vor allem Antibioti-ka und klassische Impfstoffe eingesetzt.Die Entwicklung geht zu gezielten prophy-laktischen und therapeutischen Maßnah-men. Durch die Identifizierung von Ge-nen von Wirt und Bakterien kann man diegenetisch anfällige Population und damitdie Zielgruppe für die neuen Impfstoffeidentifizieren. Zunehmend gewinnenauch alternative therapeutische Strategien,die gezielt in verschiedene Infektions-prozesse eingreifen, an Bedeutung. Diessind auch einige unserer Schwerpunkte.

Research Reports 38

The portrait – Prof. Gursharan S. Chhatwal

University studies at G. S. Medical College in Bombay and PhD thesis at Haffkine Institute(named after the Russian vaccine researcher). Subsequently, various research stays in Japan,Canada and India. In 1980, Humboldt fellow at the University of Gießen , then scientist atGießen University and GBF. Since 1994 head of the Department of Microbial Pathogenesis andVaccine Research at GBF. Winner of the BND gold medal, Lotus Foundation Prize and WhitehallFund Prize. Habilitation in Microbiology at TU Braunschweig. International Advisor to LancefieldSociety for Streptococci and Streptococcal Diseases. Seven languages (English, German, Japanese,Hindi, Punjabi, Urdu, Marathi). Hobby: conjuring (if there is time besides science).

What is currently in the focus of yourresearch activities?

Streptococci and pneumococci. Both representa great health problem. Infections withstreptococci can lead to rheumatic diseases ofthe heart affecting 15 million children all overthe world. Up to the present, there is novaccine. Our priority is basic research. Wewant to understand the mechanisms of thisdisease to develop new combating strategies.

From the scientific perspective, streptococciare highly interesting. There are over onehundred different serotypes, and they havedeveloped ingenious mechanisms tocircumvent human immune defence. About40,000 people die annually of pneumococci inthe USA alone. The vaccine is not veryeffective and antibiotics often do not act anymore.

What are the goals of your work?A long-term goal is the development of astreptococcal vaccine for the WHO children’svaccine programme. One problem is thediversity of streptococci. Due to thedeciphering of the human and of thestreptococcal genome we are in a position toclarify whether the differences in the clinicalpicture are caused by the bacteria, the host ortheir interactions.

Small children are so far not protectedagainst pneumococci by the existing vaccine.We are searching for new strategies here. Forexample, pneumococci need iron for theirmultiplication in the body, which they stealfrom the body’s own proteins. If we were ableto prevent this, the disease would not breakout.

How will infection biology develop in thenext few years?

In combating infectious diseases, above allantibiotics and classic vaccines have hithertobeen used. Development tends towardsselective prophylactic and therapeuticmeasures. By the identification of genes ofhost and bacteria it will be possible to identifythe genetically susceptible population and thusthe target group for new vaccines. Alternativetherapeutic strategies which selectivelyintervene in various infection processes arealso increasingly gaining significance. Theseare also some of our priorities.

Cytomics - Molekulare Analyse und Engineeringvon Zellen (SP 1)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Forschungsschwerpunkt: Cytomics53

Ein zentrales Thema des seit 1999laufenden Cytomics-Programms betrifftArbeiten zur Kultivierung und Charakteri-sierung von primären Zellen und ihregezielte genetische Veränderung, u.a. fürtherapeutische Anwendungen. Eine dieserEntwicklungen führte zu einem spezifi-schen Immuntherapieansatz von mali-gnen Tumoren. Mit Hilfe von Adenovirus-vektoren werden definierte Tumorantigenein primären dendritischen Zellen vonTumorpatienten exprimiert. Die so modi-fizierten Zellen sollten nach Rückgabe indie Patienten eine immunstimmulierende

Wirkung ausüben und durch Aktivierungvon T-Zellen die Tumorzellen angreifenund eliminieren (vgl. Abb.). Unterstütztdurch die bestehende GMP-Einheit wurdeein Labor für die Herstellung von viralenVektoren aufgebaut (GMPIII) und darindie Herstellung der tumorantigentragen-den Adenoviren unter GMP-Bedingungenetabliert. In Zusammenarbeit mit externenPartnern, insbesondere dem KlinikumBraunschweig (Prof. Wörmann), wurdendie Voraussetzungen für Phase I/IIUntersuchungen an Malignompatientengeschaffen.

Initiated in 1999, the Cytomics programme isdedicated to studies concerning the cultureand characterization of primary cells with thefinal goal of their application in therapyprotocols. One of our activities concerns thedevelopment of an immunotherapy ofmalignant tumors. The concept is based ongenetically modified dendritic cells. Adenoviralvectors have been developed to express definedtumor antigens in primary dendritic cellsrecovered from tumor patients. Cells thusmodified exert immunostimulatory actionssubsequent to their re-introduction into thedonor patient. Thereby tumor-specific T-cellsbecome activated to eliminate the tumorcells (s. Fig.). With the support of the existingGMP unit we established a laboratory for theproduction of viral vectors (GMPIII).Tumorantigen-expressing adenoviral vectorsare produced in this facility. These are theprerequisites for phase I/II studies onmelanoma patients (together with Prof.Wörmann, Klinikum Braunschweig).

Koordinator ❘ Coordinator:Dr. H. Hauser ❘ Abt. Genre-gulation und Differenzierung ❘Dept. of Gene Regulation andDifferentiation

Cytomics – Molecular Analysis and Engineering of CellularSystems (SP 1)

Genimmuntherapiemaligner Erkrankungen mitHilfe von genetisch-veränderten dendritischenZellen.

Gene immunotherapy ofmalignant tumors throughthe help of geneticallymodified dendritic cells.

KostimulatorenMHC I/II

Vektoren mitTumoranti-genen und/oder immun-stimulierendenGenen

Induktion einer effektivenImmunantwort

Gentechnisch modifiziertedendritische Zelle

Patient ohne effektive Immunantwort gegen Tumor

Gewinnung vondendritischen Zellen

Zellsysteme für Therapie und Diagnostik (SP 1.1)

Projektleiter ❘ Project leader: Dr. H.-S. Conradt ❘ Arb.Gr. Proteinglykosylierung ❘ Res. Groupof Protein Glycosylation

Projektmitarbeiter ❘ Project members: M. Barthold, T. Behn, H. Bertram, T. Böldicke, M. Brokelmann, H.S. Conradt,SZ. Czichos, E. Grabenhorst, K. Greger, G. Gross, E. Heil, A. Hoffmann, I. Hollatz-Rangosch, H. Mayer, M. Nimtz,B. A. Ojalvo, B. Pawletta, S. Pohl, D. Stellfeld, H. A. Weich, W. Westphal , A. Winkel

OsteogeneseDie Regeneration von Bindegewebe,insbesondere von Knochen, Knorpeln undBändern/Ligamenten werden durch G.Gross, H. Mayer und ihre Mitarbeiteruntersucht. Ziel ist hierbei die Aufklärungund gezielte Veränderung von Signal-kaskaden (Liganden, Rezeptoren, Signal-mediatoren, Transkriptionsfaktoren) inhumanen und murinen mesenchymalenStammzellen in vitro und in vivo in Maus-und Rattenmodellen. Mit klinischenPartnern arbeitet man an einer zell-vermittelten Therapie von degenerativenBindegewebserkrankungen wie z.B.Osteoporose, rheumatoide Arthritis undOsteoarthritis.

AngiogeneseInnerhalb dieses Projektes wird dieWechselwirkung angiogener Faktoren undderen korrespondierenden Rezeptorenuntersucht (H. A. Weich). Die Wechsel-wirkung rekombinanter und natürlichvorkommender löslicher Wachstums-faktor-Rezeptoren wird in zellulärenSystemen und in einem transgenenMausmodell untersucht. Dabei wird vonder Arbeitshypothese ausgegangen, dassnatürlich vorkommende löslicheRezeporen an der Feinregulation derVEGF-A Bioverfügbarkeit beteiligt sind.Weiterhin werden lösliche rekombinanteRezeptormoleküle aus der VEGF- undFGF-Rezeptorfamilie verwendet, um neuerekombinante Antikörper-Repertoiresmittels Phage-Display Technologie zuerzeugen. Sie werden zur Erkennung und

Blockierung spezifischer Zelloberflächen-rezeptoren eingesetzt. (T. Böldicke).

Posttranslationale Modifikation vonPolypeptiden im Golgi und in zelluärenMembranprotein-Transportkomparti-menten:

Die Arbeiten dieses Teilprojekteskonzentrieren sich auf die Aufklärung derRegulation der komplexen posttrans-lationalen Modifikationen von Proteinenim Sekretionsweg und Membran-protein-Transportweg tierischer Zellen(H.S.Conradt/M.Nimtz). Unter Einbe-ziehung neu entwickelter Mikroiso-lierungsverfahren sowie MS-Technikenwerden posttranslationalen Verände-rungen von Polypeptiden in definiertenDifferenzierungsstadien von Zellen undbei Erkrankungen identifiziert. Wir habengezeigt, dass der Turnover der in denverschiedenen Subkompartimenten desGolgi lokalisierten Glycosyltransferasendurch spezifische Proteolyse im Bereichder „stem region“ reguliert wird. DieCharakterisierung der Glycosylierung,Acylierung, Sulfatierung und Phosphory-lierung von Proteinen im sub pMolProbenbereich erlaubt eine Verfeinerungder Zellkompartimentierungsmodelle undermöglicht das Studium der Verände-rungen von Polypeptiden in Zellen undGeweben in pathophysiolgischen Situ-ationen sowie der Krankheits-Diagnostikin Körperflüssigkeiten.

Innerhalb dieses Projektes werden zelluläre Systeme untersucht, wobei zum Einen dieRolle von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie ihr Einfluß auf dieRezeptorsignal-wege zum Anderen die Organisation der intrazellulären Transportwege imVordergrund stehen. Zusätzlich zu diesen grundlegenden zellbiologischen Fragestellungenwerden Projekte bearbeitet, die zum besseren Verständnis des ex vivo Wachstums vonprimären sowie von genetisch veränderten Zellen für die Human-Therapie führen; diesgeschieht in enger Anbindung an klinische Einrichtungen.

Highlights from Research and Development Research Area: Cytomics 54


Abb.1. Ausschnitt aus einer2-D-PAGE Auftrennung vonProteinen aus Cerebro-spinal-Flüssigkeit einesGesunden und von 2Patienten mit angeborenenDefekten der Glycosylierung(CDGS-Syndrom). DieVeränderungen der MW undder IEP des Transferrins inProben aus Patientensind durch Pfeile gekenn-zeichnet (Trf).

Fig. 1. Section of a 2D-PAGE separation of proteinsfrom human cerebrospinalfluid obtained from ahealthy individual and from2 patients with congenitaldisease of glycosylation(CDG). The different MW´sand IEP´s of the patientstransferrin-forms (arrows:Trf) is shown.

Cellsystems for Therapy and Diagnostics (SP 1.1)

OsteogenesisThe regeneration of bone, cartilage andtendon/ligaments is investigated in this project(G. Gross, H. Mayer and coworkers). The aimis the elucidation and the intentionalmodification of signalling cascades (ligands,receptors, signalling mediators, transcriptionfactors) in human and murine mesenchymalstem cells in vitro and in vivo in animal,mouse, and rat models. Possibilities for a cell-mediated therapy of degenerative skeletaldiseases such as osteoporosis, rheumatoid- andosteoarthritis are assessed in collaborationwith clinical partners.

AngiogenesisIn this project the interaction of angiogenicfactors and their receptors is investigated (H.Weich). Thereby, the recombinant and natu-rally occuring soluble growth factor receptorswith their ligand family is analyzed in cellularsystems and a transgenic mouse model.Furthermore, native soluble receptor moleculesare produced and applied for the generation ofrecombinant antibody repertoires recognizingspecific cell surface receptors by the phagedisplay technology (T. Böldicke). These noveltools will be used for primary cell sorting,staining and isolation of progenitor cells.

The molecular understanding of cells and the architecture of healty tissues is a prerequisite for thetreatment of diseases and the monitoring of clinical therapy. Multidisciplinary approaches arerequired to generate sufficiently detailed know-how which ultimately may lead to the identificationof new targets (diagnostics), the development of new drugs and novel successful therapeutic vectorsbased on molecular biology techniques. Within this project cellular models are being exploredwhere the role of growth and differentiation factors and their receptors, signalling cascades of cellsand the organization of intracellular transport compartments are investigated. This basic researchprogramme is flanked by investigations aiming at the understanding of reproducible ex vivogrowth of primary cells and genetically manipulated cells destined for clinical application and,therefore, is performed together with collaborators from clinical institutions. New micro analysistechniques for the identification of malformed polypeptides in diseases and ex vivo propagatedcells are implemented which are being used for the monitoring of alterations in differentiation andin pathophysiological situations of cells and tissues.


Posttranslational modifications ofpolypeptides in the Golgi and in cellularmembran protein transport compart-ments:

This project aims at the detailed under-standing of the regulation of the complexposttranslational polypeptide modificationwithin the transport pathway of animal cells.HS. Conradt and M. Nimtz describequalitatively and quantitatively the enzymeand accessory protein machinery involved.Technologies are generated allowing for theidentification of changed modificationpatterns in secretory and cell membrane pro-teins in diseases and defined differentiationstates by microisolation techniques andmodern MS/MS-MS technology.

Combined with micro-array technology thisshould enable us to identify further(membrane) protein components and theirmodification involved in maintaining theproper regulation/control of the posttrans-lational enzyme machinery. Additionally thesetechniques allow for large scale screening ofdefects of the modification pathways inpathological situations employing samples atthe sub pmol level.

Abb. 2. ImmunfluoreszenzDarstellung KDR/VEGFR-2positiver Zellen in Suspen-sion nach Dekorierung mitdem single chain AntikörperscFvA7. Die Immunfluores-zenz wurde mit einem Axio-vert 135TV Mikroskop (Zeiss)dokumentiert. In dem Aus-schnitt A werden positiveKDR/PAE Zellen inkubiertmit dem Antikörper scFvA7dargestellt. Doppel-Immun-fluoreszenz Färbung vonKDR-negativen Zellen mitdem Mitosefarbstoff Mito-tracker dye (B) und andMarkierung mit dem Anit-körper scFvA7 (C).

Fig. 2. Immunofluorescenceimages with human KDR/VEGFR-2 positive porcineendothelial cells insuspension incubated withsingle chain antibody scFvA7. Immunofluorescenceswere analyzed with anAxiovert 135TV (Zeiss).Figure A shows the positivePAE/KDR cells labeled withscFvA7. Double immuno-fluorescence staining of KDRnegative cells with FITC-labeled Mitotracker dye (B)and and scFvA7 (C).

Publications ❘ VeröffentlichungenBöldicke T, Tesar M, Griesel C, Rohde M,Gröne HJ, Waltenberger J, Kollet O, LapidotT, Yayon A, Weich HA (2001) Single chainantibodies recognizing the human vascularendothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2/flk-1) on the surface of primary endothelialcells and preselected CD344+ cells from cordblood. Stem Cells 19: 24-36.

Ju W, Hoffmann A, Verschueren K,Tylzanowski P, Kaps C, Gross G, HuylebroeckD (2000) The BMP2 Signaling MediatorSmad1 Participates Predominantly inOsteogenic and not in ChondrogenicDifferentiation in Mesenchymal ProgenitorsC3H10T1/2. J Bone Min Res 15: 1889-1899

Boehme C, Conradt HS, Nimtz M, Eckert R,Ragg H, .Strathmann A (2001) Glycosylationpattern of human cofactor II from plasma andfrom recombinant CHO cells. Eur J Biochem(in press )

Vektoren für die Gentherapie (SP 1.2)


Projektleiter ❘ Project leader: Prof. Dr. J. Bode ❘ Abt. Genregulation und Differenzierung ❘Dept. of Gene Regulation and Differentiation

Adenovirale Vektoren für die Genimmun-therapieW. Lindenmaier, K. E. J. Dittmar, L. Macke,C. Wiethe, D. Wirth, J. Unsinger, A.Kröger

Maßgebender Ausgangspunkt war dieHerstellung therapeutischer DC-Vakzine.In diesem Rahmen wurden Vektoren undZellkulturbedingungen weiterentwickelt.Zur Immuntherapie des malignen Mela-noms wurde ein tricistronischer adeno-viraler Vektor geschaffen. Zur Übertragungdieses Ansatzes auf die individualspezifischeTherapie von Lymphomen haben wir eineKlonierungsstrategie etabliert, die eineschnelle Herstellung patientenspezifischerAdenovirusvektoren ermöglicht. Für sechsLymphompatienten wurden die Genefür Fab-Fragmente des tumorspezifischenidiotypischen Immunglobulins in Adeno-viren kloniert. Darüberhinaus wurden

Vektoren für den zusätzlichen Transfer vonimmunmodulierenden Genen der TNF/TNF-Rezeptor-Familie mit der Aussichtetabliert, eine gezielte Verbesserung derimmunstimulatorischen Eigenschaftenvon dendritischen Zellen (Überwindungvon Toleranz/Anergie) zu erreichen.

In vielen Situationen erscheint einesteuerbare Veränderung von zellulärenFunktionen wünschenswert. Aus diesemGrunde wurden Tetrazyklin-abhängigeSysteme für adenovirale Vektoren entwik-kelt, die eine regulierte Expression in denZielzellen und damit auch die Expressioncytotoxischer Gene erlauben. Nach Einbauvon flankierenden, retroviralen LTRs (longterminal repeats) wird nicht nur einehomogene Regulierbarkeit der retro/adenoviralen Hybridvektoren erreicht. DieLTRs bewirken zusätzlich eine effektivestabile Integration der Transgene. Damit

Neuartige genbasierte Therapien erfordern ein vertieftes molekulares Verständnisregulatorischer Prinzipien und der entsprechenden Interventionsmöglichkeiten. UnsereArbeiten tragen zur Identifikation der beteiligten Faktoren bei, insbesondere solcher, diean endogenen Abwehrmechanismen des Wirtes beteiligt sind. Wir entwickeln geeigneteVektorsysteme, die auf die Bedürfnisse des Zelltyps zugeschnitten und für die Expressionder relevanten Faktoren geeignet sind. Außerdem gilt unser Interesse dem Kerntransportsund der Zellkern-Kompartmentalisierung.

Abb. 1. Fluoreszenzmikros-kopischer Nachweis derTetrazyklin-gesteuertenGenexpression in einerhumanen Zelllinie. Retro/adenovirale Hybridvektorenmit einer autoreguliertenTet-Transaktivator-abhängigenExpressionskassette wurdenbenutzt, um 293-Zellen zuinfizieren.A: Regulation der Gen-expression im retro/adeno-viralen Transgen (unten)und in einer LTR-freienKontrolle (oben); nur dasretro/adenovirale Konstruktermöglicht eine guteRegulation.B: Im induzierten Zustand(oben) ist eine deutlichegrüne Fluoreszenz zuerkennen. In Anwesenheitvon Tetrazyklin wird dieExpression des GFP-Fusions-proteins reprimiert. Gezeigtsind Zellen, die mit demretro/adenoviralenKonstrukt infiziert wurden.

Fig. 1. Fluorescencemicroscopic analysis oftetracycline dependent geneexpression in a human cellline. Retro/adenoviral hybridvectors containing anautoregulatory Tet-depen-dent expression cassettewere used for transfecting293 cells.A: Regulation of geneexpression within the retro/adenoviral transgene(bottom) and in an LTR-freecontrol (top); only the retro/adenoviral construct is seento switch on expression frombase level (broken and violettraces, resp). to full activity(green trace).B: The induced state (top) ismarked by a strong greenfluorescence. In thepresence of tetracyclineexpression of the GFP-fusionprotein is suppressed.Shown are cells which hadbeen infected with the LTR-flanked retro/adenoviralconstruct.

repressedinduced

100 101 102 103

repressed

induced

100 101 102 103

A B


läßt sich dieser neuartige Vektortyp auchfür die dauerhafte Modifikation vonZellen einsetzen.

Wirt-Pathogen-WechselwirkungenM. Wirth, C. Beer

Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen wurdenan einem einfachen Modellbeispiel, demMausretrovirus (MLV-A)/Maus-Systemuntersucht. MLV-A Infektion führt zurInduktion zahlreicher Reaktionswege inMaus-NIH3T3-Zellen und betrifft dieTranskription von ca 5% der Gene ineinem 1.2 k Mausarray. Zelluläre Antwor-ten auf die Virusattacke umfassen sowohlbekannte Faktoren des angeborenenImmunsystems, als auch weitere Gene, dieals Kandidaten in der Abwehr einer viralenInvasion gelten können.

Dieser Respons und der retroviralePhänotyp zeigten sich in hohem Gradeabhängig vom Zelltyp und den Zellkulti-vierungsbedingungen. So änderte einSenken der Kultivierungstemperatur von37°C auf 32°C die Expression von etwa10% der Gene in einem 1.2 k Mausarrays.Dabei sind insbesondere Mitglieder desLipid-Biosynthesewegs, sowie entwick-lungs- und tumorspezifische Genebetroffen. Gene des Cholesterintransport-und Biosynthesewegs werden signifikantaktiviert, was zu einem erhöhten Choles-terineinbau in die zelluläre Plasmamem-bran und damit in die Membranhülle desdaraus knospenden Virus führt. Entfernenvon Cholesterin aus der Membranhüllenach Produktion ergab Viren mit verbes-serter Thermostabilität und bessererEignung für Aufreinigungs- und Trans-port/Lagerungsprozesse.

Mechanismen der Signalweiterleitungdurch STAT-ProteineM. Köster

Interferone spielen nicht nur als Signal-moleküle bei der Virus-Abwehr einewichtige Rolle. Sie sind auch an derAktivierung des adaptiven Immunsystemsund an der Abwehr von Infektionen durchBakterien und Parasiten beteiligt. InZielzellen wirken sie über die Aktivierungspezifischer Gene. Verantwortlich hierfürsind latent im Zytoplasma vorliegendeTranskriptionsfaktoren, die aufgrund ihrerdualen Funktion als „Signal Transducerand Activator of Transcription“ (STAT)bezeichnet werden. Nach ihrer Aktivie-rung werden homo- oder heterodimereSTAT-Komplexe in den Zellkern transpor-tiert, wo sie die Transkription ihrerZielgene induzieren.

Ausgangspunkt unserer Arbeiten wardie Frage nach der Regulation desintrazellulären Transports von STAT-Proteinen und nach dessen Auswirkungenfür die spezifische Geninduktion. Wirkonnten zeigen, dass der Aufenthalt derSTAT-Proteine im Zellkern durchDeaktivierung und anschließenden Exportins Zytoplasma reguliert wird. Änderun-gen dieses Gleichgewichts von Import undExport können zu einer geändertenGenaktivierung führen. Um die Regulati-on des intrazellulären Transports besser zuverstehen, wurden die für den Exportverantwortlichen Domänen innerhalb vonSTAT1 und STAT2 charakterisiert. Ziellaufender Arbeiten ist ein besseresVerständnis des Zusammenhangeszwischen intrazellulärem Transport undmolekularen Interaktionen.

Abb. 2. NIH3T3-Zellen, dieein Fusionsprotein aus STAT1und eGFP exprimieren, wur-den mit IFN-γ bzw. IFN-γ +Leptomycin B (LMB) behan-delt. Während nach 24-stündiger IFN-γ-StimulationSTAT1-EGFP wieder imZytoplasma der Zellenlokalisiert ist, verhindertLMB den Rücktransport desProteins. Den gleichenEffekt einer anhaltendenKernakkumulation zeigteeine Mutante von STAT1(STAT1mu), ohne daß jedochLMB verwendet wurde.

Fig. 2. NIH3T3 cellsexpressing a fusion proteinfrom STAT1 and EGFP weretreated with IFN-γ or IFN-γ +Leptomycin B (LMB), respec-tively. Whereas STAT1-EGFPis present in the cytoplasmfollowing a 24 h IFN-γ treat-ment, LMB prevents theback-transport of theprotein. The same effect ofan extended nuclearaccumulation is reflected bya STAT1 mutant (STAT1mu)even in the absence ofadded LMB.


IRF-1 zum Einsatz zur TumorvakzinierungA. Kröger

Tumorartig veränderte Zellen werden imOrganismus durch das Immunsystemeliminiert. Zellen, die durch bestimmteMutationen dieser Kontrolle entkommen,können zur Entstehung von Krebs führen.Der Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1), ist ein Faktor, der sowohl tumorsuppri-mierende als auch immunmodulierendeEigenschaften aufweist. Wir konntenzeigen, dass durch die Integration vonIRF-1 in Zellen einer Leberzellkarzinom-linie die Tumorbildung in Mäusenverhindert werden kann. Die Experimentewurden mit einem Fusionsprotein durch-geführt, das es erlaubt, die Wirkung vonIRF-1 differentiell durch Östradiol zuaktivieren. In Abwesenheit von Östradiolführt die Injektion von Leberkarzinom-zellen in syngenen Mäusen zur Tumor-bildung. Im Gegensatz dazu verhindertdie initiale Behandlung mit Östrogen dieTumorbildung vollständig bzw. stoppt dasWachstum bereits etablierter Tumore.Werden in so vorbehandelte Mäuse erneutLeberkarzinomzellen injiziert, so führendiese nicht mehr zur Ausbildung vonTumoren. IRF-1 beeinflusst also dasTumorwachstum auf verschiedenenEbenen, zum einen durch einen direktenwachstumsinhibierenden Effekt auf dieTumorzellen und zum anderen durch dieStimulation des Immunsystems.

Carcinogene DeletionenJ. Bode, A. Knopp, S. Götze, K. Nehlsen,A. Baer, E. Ernst

Der humane Typ 1 Interferon-Genclusterüberdeckt 400 kb auf dem kurzen Arm desChromosoms 9. Wie auch der homologeBereich auf dem Maus-Chromosom 4kennzeichnet dieser Cluster eine der insta-bilsten genetischen Regionen des jeweiligenGenoms. Hier ansetzende Deletionen, dieTumorsuppressoren (Prototypen: p16/ARF) einbeziehen, sind eine der häufigstenUrsachen für die Immortalisierung vonZelllinien und die Entwicklung bestimmterKrebsarten (Leukämien, Gliome). Die Auf-klärung der Chromatinstruktur in dieserRegion des humanen Clusters (9p22),unterstützt durch Sequenzanalysen und -interpretationen, ermöglichte den Nach-weis, dass Bruchpunkte auf gesetzmäßigeWeise mit Domänengrenzen (scaffold/matrix-attached regions, S/MARs)zusammenfallen. Sie werden somit durchdie innere Struktur des Zellkernsdeterminiert. In Zusammenarbeitenwurden diese Untersuchungen auf die´breakpoint cluster region´ (BCR) des MLL(All-1) Gens und seiner Partnergene (AF4und AF9) ausgedehnt, wobei sich eineenge Korrelation mit DNA-Übergangs-strukturen, wie sie zwischen B-DNA undS/MAR-DNA auftreten, bestätigte. Ausge-dehnte S/MAR-freie Regionen enthaltenkeine ‘hotspots of recombination’.

Einige sekundäre Leukämien (tAML)entstehen offenbar als Folge von Therapienmit Topoisomerase II Inhibitoren. Dieentsprechenden Bruchpunkte korrelierenwie oben beschrieben mit S/MARs. DaTopoII eine Komponente der Kernmatrixdarstellt, scheinen diese Behandlungen dieangesprochenen Mechanismen zuverstärken. Es wurde ein Verfahrenentwickelt, mit dem ein schneller Test auf‘drug-related deletions’ durchgeführtwerden kann.

Abb 3. Injektion von Tumor-zellen führt in syngenenMäusen zur Tumorbildung.Im Gegensatz dazu kann dieTumorbildung in Anwesen-heit von Östradiol verhin-dert werden, wenn Zelleninjiziert werden, die dasÖstradiol- aktivierbareFusionsprotein IRF-1hERexprimieren. Die so immun-isierte Maus wehrt erfolg-reich die erneute Injektionvon Tumorzellen ab.

Fig. 3. In syngenic mice, theinjection of tumor cells leadsto tumor formation. If cellsexpress the estradiol-activateable IRF-1hER fusionprotein, tumor formation isprevented. A mouseimmunized by these modi-fied cells sucessfully resiststumor formation after yetanother injection of non-IRF-expressing tumor cells.


Vectors for Gene Therapy (SP 1.2)

Novel gene-based therapies require an indepth understanding of the molecular principles of generegulation and its intervention. We contribute to the identification of the central players whichgovern gene expression, in particular those which are involved in the endogenous defensemechanisms of the host. Appropriate vector systems were developed for the delivery of the relevantfactors and tailored to meet the requirements of the respective cell system. Further interest is on therole of nuclear transport and nuclear structure.

Adenoviral vectors for geneimmunotherapy

Initiated by the aim to develop a therapeuticDC-based vaccination a tricistronic adenoviralvector for immunotherapy of malignantmelanoma was developed. In order to applysuch a concept to the individual-specifictherapy of lymphomas, we have established acloning strategy enabling the fast generationof patient-specific adenoviral vectors. Alongthese lines we have cloned Fab fragments oftumor specific idiotypic immunoglobulins forsix lymphoma patients.We have alsoestablished vectors permitting the additionaltransfer of immunomodulatory genes,belonging to the TNF/TNF-R family, in orderto specifically improve the immunoregulatoryproperties of dendritic cells.For many applications it is desirable toregulate vector-driven expression. It is for thisreason that we developed tetracyclinedependent expression units for adenoviralvectors which permit the expression ofcytotoxic gene products. Upon addition ofretroviral LTRs (long terminal repeats), ahomogenous regulation of retro/adenoviralhybrid vectors could be achieved (Fig. 1). TheLTRs further enhance the stable integration ofadenoviral transgenes. Thus, this novel vectortype is well suited for the permanentmodification of target cells.

Host-pathogen interactionswere analyzed, by expression profiling usingthe infection of mouse 3T3c cells by murineleukemia virus (MLV-A)as a model: on a 1.2k mouse microarray, MLV-A was shown toinduce several pathways affecting thetranscription of about 5% of genes. Cellularresponses involved factors of the innateimmune system as well as new candidategenes with a possible role in pathogen defense.

These responses and the phenotype ofliberated retroviruses depended, to a largeextent, on cell type and cell cultivationconditions. A temperature shift from 37°C to

32°C affected 10 % of the genes incomparative mouse 1.2 k arrays. Among thesewere members of lipid biosynthetic, develop-mental and tumor induction pathways,involving central factors of the respectivesignal transduction routes. Notably, genesinvolved in cholesterol transport and bio-synthesis were activated leading to increasedcholesterol incorporation into cellular plasmamembranes as well as into the outer shell ofreleased MLV

Signal transduction pathways mediatedby STAT proteins

Interferons are signalling molecules which arefound to be involved in viral defense. Inaddition, they play a role in activating theadaptive immune system and in the defense ofinfections caused by all types of pathogenes.Within the target cell, interferons activateparticular sets of genes via ‘signal transducerand activator of transcription’ (STAT-) factors.STAT factors associate to form a variety ofhomo- and heterodimeric complexes wich aresubsequently transported to the nucleus wherethey induce a specific set of genes.

Our work was centered around theintracellular regulation of STAT transport andthe subsequent gene activation mechanisms.We could demonstrate that nuclear turnoverof STATs is mediated by dephosphorylationand subsequent export into the cytoplasm.Alterations of this intracellular equilibriumbetween import and export leads to alteredgene expression levels. We characterized theexport domains of STAT1 and STAT2. Ourgoal is an indepth understanding of theinterplay between molecular interactions andintracellular transport.

IRF-1 for tumor vaccinationTumorigenic cells are usually eliminated bythe immune system. Cells escaping thesecontrol mechanisms can lead to tumorformation. The Interferon Regulatory Factor-1(IRF-1) is a factor which mediates both tumor


suppressive and immune modulatory activities.We could show that the integration of IRF-1into a hepatocellular carcinoma cell lineprevents tumor formation in mice. Therespective experiments were performed on anestradiol reactive fusion protein, which isdifferentially activateable by estradiol: Whilein the absence of estradiol the injection ofhepatocellular carcinoma cells containing theIRF-1hER fusion protein mice leads to tumorformation in syngenic mice, an initialtreatment with estradiol prevents tumorformation or stops tumor growth of establishedtumors. If previously treated mice are injecteda second time with hepatocellular carcinomacells they are protected against tumorformation. This suggests that IRF-1 activity ismediated by different mechanisms: on the onehand by an antiproliferative effect directedtoward the tumor cells and on the other bystimulating the immune system.

Genomic instability: Carcinogenicdeletions

The human type 1 interferon gene clustercovers 400 kb on the short arm ofchromosome 9. Like the syntenic region onmouse chromosome 4, this cluster representsone of the most instable genomic regionswithin the respective genome. Deletions whichoriginate here and which involve tumorsuppressor genes (prototype: p16/ARF) giveraise to immortalization and are themolecular reason for certain forms of cancer(leukemias, gliomas). Sequence analysestogether with in vitro assays strongly suggestthat the chromatin structure in this region isdetermined by the presence of domain borders

(scaffold/matrix attached regions, S/MARs).Therefore, genome fragility is governed by theinternal organization of the cell nucleus. Invarious cooperations these studies wereextended to the breakpoint cluster region(BCR) of the MLL (All-1) gene and itspartner genes (AF4 and AF9) confirming atight correlation with DNA-transitionstructures as they arise between B-type and S/MAR-DNA. Extended S/MAR-free regions aredevoid of hotspots of recombination.

Certain secondary leukemias (tAML) arisesubsequent to therapies which are based ontopoisomerase II inhibitors. As above,breakpoints coincide with S/MARs. SinceTOPO II is an established component of thenuclear matrix, these treatments appear tofortify the mentioned reaction pathways. Wehave developed a protocol permitting the faciledetermination of ‘drug-related deletions’.

Publications ❘ VeröffentlichungenBaer A, Schübeler D, Bode J (2000)Transcriptional Properties of genomictransgene integration sites marked byelectroporation or retroviral infection.Biochemistry 39:7041-7049.

Bode J, Benham C, Ernst E, Knopp A,Marschalek R, Strick R, Strissel P (2001)Fatal Connections: When DNA Ends Meet onthe Nuclear Matrix. J Cell Biochem Suppl35:3-22.

Kröger A, Ortmann D, Krohne TU, Mohr L,Blum HE, Hauser H, Geissler M (2001)Growth suppression of the hepatocellularcarcinoma cell line Hepa1-6 by an activatableIRF-1 in mice. Cancer Res. 61:2609-2617.

Lillemeier BF, Köster M, Kerr IM (2001)STAT1 from the cell membrane to the DNA.EMBO J 20:2508-2517.

Fig. 4. The transitionbetween nuclear matrixattachment sites and normalnucleosomally organizedchromatin is marked bytopoisomerase II- sensitiveDNA structures. An error-prone Topo II mechanismcan lead to the deletion oftumor suppressor genesunder the influence ofcertain established thera-peutic drugs and therebycause secondary forms ofcancer.

Abb. 4. Am Übergang vonKernmatrix-Haftstellen zuChromatin normalernucleosomaler Organisationentstehen Topoisomerase II-sensitive DNA-Strukturen.Eine Fehlleitung desnormalen TOPO II Mechanis-mus kann, begünstigt durchin der Krebstherapieetablierte Therapeutika, zurDeletion von Tumor-suppressorgenen und damitzur Entstehung sekundärerKrebsarten führen.

HSTOP

TOPO IITOPO II

TOPO IITOPO II

Kultivierung und Differenzierung vonStammzellen

Ziel des Projektes ist das Verständnis desMechanismus der Proliferation undGewebe-spezifischen Differenzierung infötalen Stammzellen bei Leber, ZNS undHerz ausgehend von Progenitor- oderStammzellen aus Nagern. Zur Identifizie-rung der Expressions- und Differenzierun-gsmarker wurden entprechende Genexpres-sions-Microarrays entwickelt. Die Herstell-ungsprotokolle sowohl für neuronale undhepatische Progenitoren aus fötalemGewebe als auch ihre Expansion wurdenetabliert. Der Einfluss verschiedener Matricesund Kulturmedien wurde untersucht, wobeidie Viabilität und die Anheftung an dieSubstratoberfläche nach der Isolation undZellaussaat als der kritischste Schritt imHinblick auf die Proliferationskapazitätidentifiziert wurden. Die Zellen konntenunter definierten Kulturbedingungen nach7 Tagen bis zum 13-fachen expandiertwerden. Darüberhinaus wurde einMembran-Bioreaktor-Modell zur Standardi-sierung der Kulturbedingungen untersucht,das die Matrixgeometrie und die physiolo-gischen Sauerstoffgradienten rekonstruie-ren kann. Dieses Konzept wird derzeitigauf verschiedene Zelltypen adaptiert. DieDifferenzierungsparameter expandierterZellen werden durch verschiedene zellbio-logische und molekulare Methoden unter-sucht. Weiterhin wurde ein Leber- und einNerven-spezifischer DNA-Chip zurVerbesserung der Evaluierung von Leber-und Nerven-Progenitor-Zellen entwickelt.

Züchtung von KnochengewebeDie Isolierung, Vermehrung und Differen-zierung primärer osteogener Zellen für dieGenerierung hochvitaler Knochen-implantate in vitro ist Gegenstandintensiver Untersuchungen. Ein wichtigerTeilaspekt besteht in der Anheftung undAusspreitung der Zellen auf geeignetenGerüstmaterialien sowie der Zellvermeh-rung und gerichteten Differenzierungunter besser definierten Medienbeding-ungen um somit den Einsatz von auto-logen Seren oder FKS zu minimieren.Verschiedene serumfreie oder Serum-reduzierte Kulturmedien wurden entwik-kelt um die spezifischen Bedürfnisse derZellen während der verschiedenen Phasender Osteogenese in vitro zu decken. DieseStrategie erwies sich überlegen gegenüberder Verwendung nur eines einzigenMediums während Anheftung, Vermeh-rung und Differenzierung. Die initiale

Zell-, Gewebe- und Organkulturtechnik (SP 1.3)

Projektleiter ❘ Project leader: PD Dr. R. Wagner ❘ Arb. Gr. Zellkulturtechnik ❘ Res. Group ofCell Culture Technology

Projektmitarbeiter ❘ Project members: A. Bader, M. Barthold, U. Bilitewski, C. Fortmann, C. Griesel, F. Hesse, V.Jäger, L. Just, C. Priesner, E. Schmelzer, F. Stahl, R. Wagner, A.-P. Zeng

Das Projekt befasst sich seit 1999 mit der in vitro Rekonstitution von organotypischenGeweben aus Einzelzellen oder Zellverbänden. Der ex vivo-regenerierte bioartifizielleGewebeersatz soll zum therapeutischen Einsatz bei der Behandlung eines Organversagenssowie zur Reimplantierung eingesetzt werden. Darüber hinaus dienen die Arbeiten einerErweiterung des grundlegenden Verständnisses vom Zusammenspiel komplexerZellsysteme zur Generierung neuer Konzepte bei der Entwicklung von organotypischenGewebemodellen. Die Hauptaktivitäten fokussieren auf die folgenden Organsysteme:Leber (Organversagen, Pharmatests), Knochen (Reimplantation), Herz (Herzklappen) und Nervensystem (Reimplantation, Behandlung der Parkinson-Krankheit).

Abb.1. BrdU-markiertedopaminerge Neurone

Fig.1. BrdU-labelleddopaminergic neurones



Anheftung osteogener Zellen auf dreidi-mensionalen Trägergerüsten wurde durchdie Entwicklung eines neuartigen Halte-rahmens substantiell verbessert.

EU-Demostrationsprojekt „Protein-freeMedium”

Im Berichtszeitraum konnte das EU-Demonstrationsprojekt (BIO4-CT97-2140) erfolgreich abgeschlossen werden.Ziel dieses Projektes war es, die prinzipiel-le Anwendbarkeit proteinfreier undchemisch definierter Zellkulturmedien fürdie Herstellung biopharmazeutischerProdukte zu zeigen. Im Rahmen dieserArbeiten gelang es an der GBF in einemModellprozess die Kultivierung von BHK-Zellen zur Produktion von Interleukin-2im Pilot- (20 L) und Produktionsmaßstab(1000 L) in Airliftreaktoren zu etablieren.Weiterhin wurden im Rahmen desProjektes Untersuchungen zur Auswirkungvon proteinfreien Kultivierungs-bedingungen auf die Produktqualitätdurchgeführt. Zu diesem Zweck wurdendie Glykosylierungsmuster der mitproteinfreien Medien hergestelltenProdukte eines Projektpartners analysiertund mit den Mustern verglichen, die vonden selben Produkten erhalten wurden,wenn sie unter Einsatz serumhaltigerKulturmedien produziert wurden. DieseUntersuchungen zeigten, dass dieAnwendung proteinfreier Medien in derRegel nicht zu veränderten Glykosy-lierungsmustern führt. Manche Zellkloneverhalten sich unter diesen Bedingungenjedoch anders als in serumhaltigenKulturmedien, was dann zu unterschied-lichen Glykosylierungen der erzeugtenProteine führt.

EU-Projekt „BioNose”Die Mehrzahl von Produktionsprozessen,die tierische Zellkulturen anwenden,werden zur Herstellung von biopharma-zeutischen Produkten eingesetzt. Entspre-chend hoch sind die Anforderungen anSicherheit und Qualität, was eine extremleistungsfähige Prozesskontrolle erfordert.Auch heute sind die meisten dieserProzesse noch nicht voll optimiert, da eszur Zeit keine Möglichkeit gibt, allenotwendigen Prozessparameter online zuerfassen. Die Anwendung von “Elektroni-schen Nasen”, d.h. miniaturisierten Arraysrelativ unspezifischer Sensoren, diecharakteristische Signalmuster erzeugen,wenn sie mit gasförmigen Emissionen inKontakt gebracht werden, kann einKonzept zur Etablierung einer modernenProzesskontrolle sein, das den Anforde-rungen an biopharmazeutische Her-stellungsprozesse entspricht. Im Rahmeneines EU-Projektes untersucht die ZKT zurZeit zusammen mit anderen europäischenForschungsinstituten und Industrie-partnern, in wieweit “ElektronischeNasen” zur Erfassung charakteristischerund reproduzierbarer Signalmuster ausFermentationen von Säugerzelleneingesetzt werden können. Im Mittelpunktder hier durchgeführten Arbeiten stehtdabei die Optimierung transienterTransfektionssysteme auf der Basis derHEK 293 Zelllinie sowie die frühzeitigeDetektion von Kontaminationen mitMycoplasmen.

Metabolische NetzwerkeIn Zusammenarbeit mit Dr. M. Wirth(SP1.2) wurde ein auf dem „immediateearly gene“ c-fos basierendes GFP-Reportersystem zur dynamischen Untersu-chung von Stress-Reaktionen tierischerZellen in Kultur konstruiert und charakte-risiert. Die destabilisierte GFP-Variantepd2EGFP erwies sich aufgrund ihreshohen Expressionsniveaus und einerschnellen Antwort auf die Veränderungenvon Milieubedingungen als Modellsystembesonderes gut geeignet.


Cell, Tissue, and Organ Culture Technology (SP 1.3)

The project was initiated in 1999 and focuses on the reconstitution of organ-like tissues fromsingle cells or cell compositions. The ex vivo regenerated bioartificial tissue substitute shall be usedfor the treatment of organ failure as well as for reimplantation. Moreover, the activities serve toincrease the basic knowledge of the cooperation of complex cell systems to generate new conceptsfor the development of organ-like tissue models. The main activities focus on following organsystems: liver (organ failure, pharmatests), bone (reimplantation), heart (heart valves) andnervous system (reimplantion, treatment of Parkinson’s disease).

Cultivation and Differentiationof Stem Cells

Our aim is to understand the mechanisms ofproliferation and tissue specific differentiationin fetal stem cells including liver, CNS andheart originating from rodent progenitor orstem cells. In order to identify expressionand differentiation marker gene expressionmicroarrays for these tissues weredeveloped.The preparation protocol of neuraland hepatic progenitors from fetal tissue aswell as their expansion are alreadyestablished. We started by investigating theinfluence of different matrix and culturemedium components on the proliferation ofprogenitor cells. The viability and attachmenton the substrate surface of progenitors afterisolation and cell seeding are a very criticalstep with respect to the proliferation capacity.With defined culture conditions cells could beproliferated up to 13 fold after seven days inculture. Furthermore, we investigated amembrane bioreactor model that reconstructsmatrix geometry and physiologic oxygengradients of cultured cells to standardise theculture conditions. This concept will be nowadapted to different cell types. Thedifferentiation parameters of expanded cellsare monitored by different cell biological andmolecular methods. In addition, a liver andneural specific DNA chip is being developed toimprove the evaluation of liver and neuralprogenitor cells.

In vitro Generation of Bone TissueThe isolation, proliferation, and differentiationof primary osteogenic cells for the generationof highly viable bone implants in vitro is afield of intensive investigation. An importantissue within this topic is the attachment andspreading of cells onto suitable scaffoldmaterials as well as cell expansion anddirected differentiation under more definedmedium conditions thus minimizing the useof autologous sera or FBS. Different serum-free or serum-reduced culture media havebeen developed to meet the specific cellularrequirements for each of the different phasesof osteogenesis in vitro. This strategy provedto be superior to the use of the same mediaduring attachment, expansion anddifferentiation. The initial attachment ofosteogenic cells on three-dimensional scaffoldshas been substantially improved afterdevelopment of a novel support screen.

During the last year the EU-DemonstrationProject (BIO4-CT97-2140) was successfullycompleted. Main objective of this project wasto demonstrate the applicability of protein-freeand chemically defined cell culture media forthe manufacturing of biopharmaceuticals inprinciple. During the work for the project itwas possible to establish a model process atGBF for the cultivation of BHK cells for theproduction of Interleukin-2 on pilot (20 L)and production scale (1000 L) in airliftbioreactors. Furthermore, the effects of

Abb.2. 3-KomponentenMini-Festbett-Bioreaktor-Station für die Kultivierungmesenchymaler Stamm-zellen

Fig. 2. 3-Component mini-fixed-bed bioreactor systemfor the cultivation ofmesenchymal stem cells.


protein-free cultivation conditions on productquality was investigated. For this purpose, theglycosylation patterns of the products of oneproject partner that were produced usingprotein-free cell culture media were analysed.These patterns were compared to thoseobtained from the same products whenproduced with serum-containing media. Theseinvestigations demonstrated that protein-freecultivation conditions normally do not alterthe glycosylation patterns of the product.Nevertheless, some cell clones behavedifferently under these conditions than inserum-containing cell culture media leadingto different glycosylation patterns of theproteins produced.

EU-Project “BioNose”A majority of the animal cell culture processesis used for the production of biopharma-ceutical products. Accordingly, therequirements on quality and safety are high,demanding an extremely efficient processcontrol equipment. Even today most processesare sub-optimised since there currently existno means to monitor all important processparameters on-line. The application of“Electronic Noses”, i.e. miniaturised arrays ofrather unspecific sensors that generatecharacteristic signal patterns when exposed togaseous emissions, can provide a concept forthe establishment of modern process controlequipment that meets the requirements ofmanufacturing processes of biopharma-ceuticals. In the course of an EU-project ZKT,together with other European researchinstitutions and industrial partners, currentlyinvestigates the potential of “Electronic Noses”for the monitoring of characteristic andreproducible signal patterns fromfermentations with mammalian cell lines.This work is focussed on the optimisation oftransient transfection systems (based on theHEK 293 cell line) as well as the earlydetection of contaminations with mycoplasma.During the first year of the project thecultivation systems that are intended to beused were established successfully and theprototype of the “Electronic Nose” developedby other project partners was installed. Furtherwork will first concentrate on thedetermination of cell line specific signalpatterns and the influence of differentbioreactor configurations on these patterns.

Metabolic NetworksA GFP reporter system based on the“immediate early gene” c-fos for dynamicinvestigations of stress reactions of animalcells in culture was constructed andcharacterized in a collaboration with Dr. M.Wirth (SP1.2). The destabilizing GFP variantpd2EGFP showed high expression rates andwas selected as a suitable model responding tochanges in culture conditions.

Publications ❘ VeröffentlichungenHesse F, Wagner R (2000) Developments andimprovements in the manufacturing of humantherapeutics from mammalian cell culturesTibtech 18:173-180.

Chico E, Jäger V (2000) Perfusion culture ofbaculovirus-infected BTI-Tn-5B1-4 insectcells: A method to restore cell-specific $-traceglycoprotein productivity at high cell density.Biotechnol Bioeng 70: 574-586.

Böldicke T, Tesar M, Griesel C, Rohde M,Gröne H-J, Waltenberger J, Kollet O, LapidotT, Yavon A, Weich H (2001) Anti-VEGFR-2scFvs for Cell Isolation. Single ChainAntibodies Recognizing the Human VascularEndothelial Growth Factor Receptor-2(VEGFR-2/flk-1) on the Surface of PrimaryEndothelial Cells and preselected CD34+ Cellsfrom Cord Blood. Stem Cells 19:24-36.

Wagner R (2001) Process-orientatedmetabolic engineering: Cell lines with newproperties in nutrient exploitation and proteinglycosylation. In: Cole, J., Mattanovich, D.(eds.) Recombinant Protein Production withProkaryotic and Eukaryotic Cells. AComparative View on Host Physiology.Kluywer Academic Publisher, The Netherlands

Zell- und Gewebekulturen (SP 1.4)

Projektleiter ❘ Project leader: Dr. A. Bader ❘ Nachwuchsforschergruppe Organ- und Gewebe-kulturen ❘ Junior Research Group Organ- and Tissue Culturing

Projektmitarbeiter ❘ Project members: L. Just, F. Stahl, C. Mauth, E. Schmelzer

Expansion von neuronalen Vorläufer-zellen aus dem ventralen Mesencephalonder Ratte und ihre Differenzierung zudopaminergen Neuronen

Transplantationen von fötalen dopa-minergen Neuronen werden mittlerweileals eine therapeutische Möglichkeit beider Parkinson’schen Erkrankung ange-sehen. In diesem Projekt soll die in vitro-Expansion von neuronalen Vorläuferzellender Ratte und ihre anschließendeDifferenzierung zu Dopaminneuronenoptimiert werden. Weiterhin wollen wirdie individuellen Faktoren, welche dieDifferenzierung der expandiertenVorläuferzellen induzieren können,analysieren. Zunächst haben wirbegonnen, den Einfluß von verschiedenenMatrices und Zellkulturmedienkompo-nenten auf die Proliferation derVorläuferzellen zu untersuchen. DieÜberlebensrate und das Anheftungs-verhalten der Zellen ist in Bezug auf dieProliferationskapazität äußerst wichtig.Unter definierten Kulturbedingungenkonnten die Vorläuferzellen innerhalbeiner Woche bis zum 13fachen vermehrtwerden. Die Differenzierungsparameterder generierten Neurone wurden dabeimittels Immunzytochemie, in situ-Hybridisierung, RT-PCR, HPLC undMicroarray-Technik bestimmt. Dasphysiologische Potential der in vitro-generierten dopaminergen Neuronen undihre Fähigkeit, komplexe sensomotorischeVerhaltenweisen wiederherzustellen,

werden jetzt mittels Transplantationen imParkinson Rattenmodell durch dieForschergruppe von Herrn Guido Nikkhahan der Medizinischen HochschuleHannover untersucht.

Fötale Hepatozyten und embryonaleStammzellen – Optimierung derProliferation und Differenzierung

Fötale Hepatozytenkulturen stellen einoptimales System für Anwendungen indrug screening Modellen, für bioarti-fizielle Leberorgansysteme und nichtzuletzt für die Grundlagenforschung derEmbryonalentwicklung dar.Unser Ziel istdaher, fötale Hepatozyten am Modell derRatte in vitro zu proliferieren und zudifferenzieren, um einen Pool hochdifferenzierter Hepatozyten zu generieren,welche die komplexen metabolischenFunktionen adulter Hepatozyten in vivo

Unser Ziel ist es, die Mechanismen zur Proliferation und gewebespezifischenDifferenzierung von fötalen Vorläuferzellen und Stammzellen der Ratte aus der Leber unddem ZNS zu erforschen. Um die Expressions- und Differenzierungsmarker zuidentifizieren, werden dazu gewebespezifische Microarrays entwickelt. So könnenMicroarrays für Expressionsanalysen von neuralen und leberspezifischen Proteinen wieNeurofilamente, Rezeptoren oder Enzyme des Cytochrom P450 und Phase II-Systemsgenutzt werden, um Wachstums- und Differenzierungsphasen von neuralen Zellen undHepatozyten in Abhängigkeit von ihrer Umgebung bestimmen zu können. ZurOptimierung der Zellkulturbedingungen und zur Analyse der physiologischen Kapazitätdes generierten Gewebes ist es daher von Vorteil, die traditionellen molekularen undzellbiologischen Methoden zusammen mit der Microarray-Technologie einzusetzen.

Proliferierte Vorläuferzellendifferenzieren sich zudopaminergenNeuronen.Zellkerne der proliferiertenZellen: rot; Dopaminneu-rone: grün; Balken: 25 µm.

Proliferated precursorsdifferentiate into dopa-minergic neurones. Nucleiof proliferated cells: red;Dopamine neurones: green;bar: 25µm.



exprimieren. Aus diesem Grund isoliertenwir fötale Hepatozyten bestimmterEntwicklungsstadien und etabliertenoptimale Kulturbedingungen, wie zumBeispiel Kulturmatrix, Medien, Supple-mente und Wachstumsfaktoren. DerNachweis der komplexen metabolischenleberspezifischen Funktionen erfolgtedurch Messung der Albuminproduktion,der Cytochrom-P450-Aktivität, desGlukosegehalts und des Laktatumsatzes,sowie durch in situ Hybridisierung undImmunzytochemie. Wir sind auf Grundder optimierten Kulturbedingungen in derLage, große Zellmengen zu generieren,wobei die Hepatozyten die komplexenmetabolischen Funktionen vonLeberzellen in vivo exprimieren.

DNA ChiptechnologieSowohl durch Variationen in der Erb-substanz als auch durch Umweltfaktorenergeben sich die individuellenUnterschiede innerhalb einer Population.Diese Einflüsse können sowohl durch dieAnalyse von Sequenzvariationen(Mutationen und Polymorphismen) alsauch durch die Analyse der Genexpressionuntersucht werden. Zur Analyse von bio-logischen Systemen mit 100.000 Genenmuß die Genexpression quantitativ aufgenomischer Ebene erfaßt werden. Bisherhaben wir drei DNA Chips dafürentwickelt, einen humanen und einenRattenleberchip sowie einen neuralenChip der Ratte. Diese Chips enthieltenmehrere 100 Oligonukleotide und wurdenmit fluoreszenzmarkierter cDNAhybridisiert. Die Vorteile der Chiptechno-logie gegenüber den klassischenmolekular-biolgischen Methoden beruhenauf dem hohen Parallelisierungsgrad unddem miniaturisierten Format. Die DNAChiptechnologie eignet sich besonders fürschnelle und effiziente Analysen imMassenscreening.

Veröffentlichungen ❘ PublicationsBader A, Hansen T, Kirchner G, AllmelingC, Haverich A, Borlak JT (2000) Primaryporcine enterocyte spheroidal cultures tostudy drug oxidation. Brit J Pharmacol129:331-342.

Bader A, DeBartolo L, Haverich A (2000)High level benzodiazepine and ammoniaclearance by flat membrane bioreactorswith porcine liver cells. J Biotechnol25:95-105.

DeBartolo L, Jarosch v Schweder, G,Haverich A, Bader A (2000) A novel full-scale flat membrane bioreactor utilizingporcine hepatocytes: Cell viability andtissue-specific functions. Biotechnol Progr16:102-108.

Hansen T, Borlak J, Bader A (2000)Cytochrome P450 activity and proteinexpression in primary porcine enterocyteand hepatocyte cultures. Xenobiotica30:27-46.

Stahl F, Just L, Bader A (2000)Development of a liverspecific microarrayfor the prediction of drug metablisingenzyme induction. Biol Chem 381:221.


Cell and Organ Tissue Culturing (SP 1.4)

Expansion of neuronal progenitors fromventral mesencephalon of rats and theirdifferentiation into dopaminergicneurones

Transplantations of foetal dopaminergicneurones from ventral mesencephalon havebecome a therapeutic option for patients withsevere Parkinson’s disease. In this project weseek to optimise the in vitro expansion ofneuronal progenitors and their differentiationinto dopaminergic neurones in the rat animalmodel. Furthermore, we want to investigatethe individual factors which induce specificdifferentiation of expanded progenitors. Westarted by investigating the influence ofdifferent matrix and culture mediumcomponents on the proliferation of progenitorcells. The viability and attachment on thesubstrate surface of progenitors after isolationand cell seeding was a very critical step withrespect to the proliferation capacity. Withdefined culture conditions cells could beproliferated up to 13 fold after seven days inculture. The differentiation parameters ofgenerated neurones were monitored byimmunocytochemistry, in situ hybridisation,RT-PCR and HPLC analysis, and neuralspecific microarrays. The physiologicalpotential of in vitro generated dopaminergicneurones and their ability to restore complexsensorimotor behaviours is going to beanalysed in the rat Parkinson model by theresearch group of Guido Nikkhah at theMedical School Hannover.

Foetal hepatocytes and embryonic stemcells – optimisation of proliferationcapacity and differentiation

Foetal hepatocytes provide an optimal tool forresearch in drug screening models, bioartificialliver support systems and in basic investi-gations of embryonic development. Our goal isto proliferate and differentiate foetal rat

hepatocytes as a model for human cells invitro to generate a pool of highlydifferentiated hepatocytes with complexmetabolic functions of adult hepatocytes invivo. For this reason, we isolated stage specificfoetal hepatocytes and established optimalculture conditions including extracellularmatrix, culture media, supplements, andgrowth factors. Support of metabolic functionwas investigated by several liver specificfunctions: albumin production, cytochrome-P450-activity, glucose and lactic acid turn-over, in situ hybridisation and immuno-cytochemistry. By using our optimised cultureconditions and application of growth we couldgenerate great amounts of hepatocytes whichrepresent complex metabolic functions of livercells in vivo.

DNA chip technologyBiological differences among individuals in apopulation are due to both genetic andenviromental factors. These influences can beunderstood by studying variability in genomicsequence (mutations and polymorphisms) andin how much of each gene product is made ina given cell or tissue (gene expression). Forthe understanding of biological systems with100,000 genes the measurement of RNAlevels for a complete set of transcripts of anorganism is necessary. We have developedthree specific microarrays for human liver, ratliver and, rat neurons. These DNA chips,containing several hundred immobilised DNAsamples, were hybridised with fluorescentlabelled cDNA probes. The power of themicroarrays comes from the highly parallel,addressable, miniaturised format that providessignificant advantages over traditionalmolecular biological methods. Parallel geneanalysis with DNA chips provides a rapid andefficient method for large-scale and highthroughput applications.

This project aims to investigate the mechanisms of proliferation and tissue specific differentiationin progenitor or stem cells obtained from foetal liver and CNS of rat. In order to identifyexpression and differentiation marker we developed gene expression microarrays for theseparticular tissues. For example, microarrays for neural specific proteins, like neurofilaments,receptors, or neurotransmitter related enzymes as well as for cytochrome P450s and Phase IIenzymes can be used to evaluate neural cells and hepatocytes in different growth anddifferentiation phases. In order to optimise cell culture conditions, and analyse the physiologicalcapacity of engineered tissue it will be necessary to use traditional molecular and cell biologicalmethods in combination with microarray technology.

Pathogenitätsforschung und Vakzinentwicklung (SP 2)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Forschungsschwerpunkt: Pathogenitätsforschung69

Koordinator ❘ Coordinator:Prof. Dr. G. S. ChhatwalAbt. Mikrobielle Pathogenitätund Impfstoffforschung ❘ Dept.of Microbial Pathogenicity andVaccine Research

Infektionskrankheiten übertreffen sowohlan Häufigkeit als auch gemessen an derSterblichkeit alle anderen Arten vonKrankheiten. Weltweit finden pro Jahrüber 17 Millionen Menschen durch Infek-tionskrankheiten den Tod. Trotz Verfüg-barkeit einer großen Zahl verschiedenerAntibiotika sind die Infektionskrankheitenweiter auf dem Vormarsch. NebenAntibiotikaresistenz zählten hierzu in denletzten Jahren auch viele andere Faktorenals Ursache. Der Mensch versucht, durchneue Antibiotika, Vakzine und verbesserteHygiene die pathogenen Mikroben auszu-schalten. Die Mikroben reagieren hieraufmit der Entwicklung neuer Stoffwechsel-wege, neuer Proteine und andererStrategien, die nicht weniger genial sindals die, welche der Mensch zu ihrer Ver-nichtung entwickelt hat. Zieht man dieSterblichkeitszahlen in Betracht, sieht esso aus, als hätten die Mikroben in dieserAuseinandersetzung zur Zeit die Ober-hand. Das Problem wird dadurch ver-schärft, dass die Menschen immer älterwerden und durch Globalisierung dieweltweite Mobilität erhöht wird. Zusätz-lich gewinnen aufgrund der Veränderun-gen unseres heutigen Lebensstils, Sozial-lebens und kommerzieller Interessen vie-ler Lebensmittelproduzenten „neue“ Erre-ger und Epidemien, wie z.B. Prionen, HIV,MKS etc., an Bedeutung. Ein weiteres Pro-blem sind körpereigene Reaktionen aufdie Infektion, darunter Autoimmun-erkrankungen, die als Folge vieler Infektio-nen bei bestimmten genetisch dazu veran-lagten Personen vorkommen können. DieProbleme von Infektions- und Folge-erkrankungen sind also keineswegs gelöst.Daher gilt die Erforschung von Infektions-krankheiten und Immunität als eine dergroßen gesundheitspolitischen Herausfor-derungen dieses Jahrhunderts.

Die Präventivmedizin bietet angesichts dersteigenden Behandlungskosten vielver-sprechende Perspektiven für eine medizi-nisch und ökonomisch effektive Bekämp-fung von Infektionskrankheiten. Die Ent-wicklung neuer Impfstoffe setzt ein detail-liertes Verständnis der Abläufe von Infekti-onskrankheiten voraus. Dieses beinhaltetdie Natur und die Funktionen derVirulenzfaktoren, ihre Wechselwirkungenmit Wirtszellkomponenten, die Reaktio-nen des spezifischen und nicht spezifi-schen Immunsystems und die genetischeVeranlagung des Wirtes.

Das Ziel des Schwerpunktes ist es,Pathogenitätsmechanismen und Wirtsab-wehrreaktionen besser zu verstehen.Schwerpunktmäßig werden pathogeneKeime der Schleimhäute in Verbindungmit dem Schleimhautimmunsystem bear-beitet. Sechs Arbeitsgruppen und zweiNachwuchsgruppen der GBF arbeiten indiesem Schwerpunkt zusammen, um ver-schiedene Aspekte der Pathogenität undImmunabwehr zu untersuchen. Die ausdieser Forschung gewonnenen Ergebnissesollen dem besseren Verständnis derWechselwirkungen zwischen Erreger undWirt im Verlauf eines Infektionsprozessesdienen. Unter anderem dienen diese Er-kenntnisse der Entwicklung und Herstel-lung neuer effektiver Impfstoffe gegenInfektionskrankheiten. Darüber hinauswird die genetische Basis der Wirt-Patho-gen-Wechselwirkung genauer untersucht,um neue Strategien zur Bekämpfung derInfektionskrankheiten zu entwickeln.

Highlights from Research and Development Research Area: Pathogenicity Research 70

Pathogenicity and Vaccine Research (SP 2)

Infections are the major cause of disease anddeath, responsible for over 17 Million deathsper year worldwide. In spite of the availabilityof different antibiotics, infectious diseasesremain to be a serious health problem. Besideantibiotic resistence, many other factors makeit difficult to control the infections. Man triesto combat pathogens through new antibiotics,vaccines and better hygiene and sanitation.The microbes react to this by developing newmetabolic pathways, new pathogenicity factorsand other strategies, which are as sophisti-cated as those which Man has developed todestroy the microbes. Considering themortality rates it seems that the microbes havean advantage in this conflict. Anotherproblem is the increase in life expectancy andincreased mobility due to globalization.Furthermore, due to changes in our life style,social life and the commercial interests of foodproducers, new infectious agents andepidemics, e.g. prions, HIV, foot and mouthdisease, etc. are emerging. Another problemare autoimmune diseases, which are caused bycertain pathogenic bacteria and which affectespecially people who are geneticallypredisposed to these diseases. Therefore,infectious diseases and their sequelae remaina serious problem and a big burden for healthsystems worldwide. The research on infectiousdiseases and immunity is considered as a bigchallenge for this century.

As a result of increasing costs for thetreatment of infectious diseases, the preventivemedicine, i.e. vaccination, is an attractiveperspective to control infectious diseases bothefficiently and economically. The developmentof new vaccines however requires a detailedunderstanding of the processes that lead toinfection. This comprises the nature and thefunction of virulence factors, their interactionwith host cell components, the respectivehost immune response and the geneticpredisposition of the host.

The goal of this research area is a detailedunderstanding of pathogenic mechanisms aswell as the host defence system. Our researchis focussed on pathogens of mucosal surfaces(infections of the respiratory and the intestinaltract) and the response by the mucosalimmune system. Six research groups and twoyoung investigator groups working on differentaspects of pathogenicity and immune defenceare contributing to this research area. Theresults obtained by our research shall lead to abetter understanding of the interactionsbetween pathogen and host during theinfection process. This knowledge will be thebasis for the development and production ofnew effective vaccines against these infectiousdiseases. Furthermore, the genetic basis ofhost-pathogen-interaction will be studied indetail in this research area in order to developnew strategies for prevention and control ofinfectious diseases.


Projektleiter ❘ Project leader: Prof. Dr. G.S. Chhatwal ❘ Abt. Mikrobielle Pathogenität undImpfstoffforschung ❘ Dept. of Microbial Pathogenicity and Vaccine Research

Projektmitarbeiter ❘ Project members: S. Bergmann, K. Dinkla, P. Fagan, A. Haidan, S. Hammerschmidt, W. Jansen,E. Medina, G. Molinari, M. Rohde, S. Talay, R. Towers

Gruppe C und G Streptokokken alsmögliche Auslöser des rheumatischenFiebers

Das akute rheumatische Fieber (ARF) isteine Folgeerkrankung der unbehandeltenGruppe A Streptokokken-Pharyngitis beiKindern zwischen 5 und 15 Jahren. MitMillionen von neuen Fällen pro Jahr stelltARF auch heute noch ein großes Gesund-heitsproblem dar. Die Pathogenese desARF ist nicht geklärt, es ist aber anzuneh-men, daß es sich hierbei um eine abnor-male Immunantwort des Wirts handelt.Streptokokken der Gruppe C und G, diehauptsächlich bei Tierinfektionen vor-kommen, wurden bisher nicht mit ARF inVerbindung gebracht. Wir haben gezeigt,daß Gruppe C und G Streptokokken auchein Auslöser des rheumatischen Fieberssein könnten. Bei den Aborigines inAustralien, die kaum an Gruppe AStreptokokken-Pharyngitis erkranken,dagegen aber hohe Raten an Gruppe Cund G Streptokokken aufweisen, zeigenweltweit die höchste Rate an ARF. Wirkonnten zeigen, daß die Antikörper gegenC und G Streptokokken in der Lage waren,mit menschlichem Herzmyosin zureagieren. Die Antikörper gegen Gruppe AStreptokokken-Hautisolate waren dagegennegativ. Die Ergebnisse liefern einenmöglichen Beweis dafür, daß mancheungeklärten Fälle von ARF durch C und G

Infektionen sind weltweit die Ursache für die meisten Todesfälle. Trotz Verfügbarkeitverschiedener Antibiotika bleiben die Infektionen durch Streptokokken und Pneumokok-ken ein ernstes Gesundheitsproblem. Rheumatisches Fieber , an denen Millionen vonKindern leiden, stellt eine wichtige Nachfolgeerkrankung der Streptokokkeninfektionendar. Die genauen Mechanismen dieser Krankheit sind noch nicht bekannt. Eine Vorausset-zung zur Bekämpfung der Infektion ist die Aufklärung der Pathogenitätsmechanismenund Etablierung geeigneter Tiermodelle. Ziel dieses Projekts ist, die Infektionsmechanismender Krankheitserreger durch Struktur:Funktions-Analyse von Pathogenitätsfaktoren unddurch Untersuchungen der Wirt-Pathogen-Wechselswirkungen zu studieren und ein Maus-modell zu etablieren. Es wird auch angestrebt, den Fadenwurm C. elegans alsStreptokokkeninfektionsmodell einzusetzen.

Streptokokken verursacht werden. Falls dieweiteren Untersuchungen in endemischenGebieten dies bestätigen, ist als Konse-quenz auch auf Gruppe C und G Strepto-kokken im Rachenraum zu untersuchen.

Genetische Suszeptibilität der Gruppe AStreptokokken-Infektion

Gruppe A Streptokokken verursachen einbreites Spektrum an Krankheiten. Wegengenetischer Heterogenität der menschli-chen Bevölkerung ist es notwendig, Tier-modelle zu etablieren, um die Suszeptibilitäts-mechanismen genauer zu untersuchen.Wir haben gezeigt, daß unterschiedlicheMausstämme auch unterschiedlicheSuszeptibilität gegenüber Gruppe A Infek-tionen zeigen. Den resistenten Maus-stämmen gelang es, die Streptokokkenschnell zu beseitigen, wohingegen dieanfälligen Mäuse nicht in der Lage waren,das Wachstum der Bakterien zu bekämp-fen und die Infektion zu überleben. Dieresistenten Mäuse, die B- und T-Zellmangelaufwiesen, waren genauso resistent wieimmunkompetente Mäuse. Diese Ergeb-nisse deuten darauf hin, daß es sich beider Suszeptibilität hauptsächlich umangeborene Immunität handelt. Darüberhinaus wurde festgestellt, daß die männli-chen Tiere im Vergleich zu den weiblichenviel empfindlicher waren. Die Ergebnissezeigten erstmals den Einfluß des genetischen

Mechanismen pathogener Prozesse (SP 2.1)

Pathogenitätsfaktoren von Streptokokken und Pneumokokken


Hintergrunds auf Suszeptibilität gegen-über S. pyogenes-Infektion in der Maus.

Molekulare Mechanismen der Strepto-kokkeninvasion in eukaryontischenZellen

Pathogene Streptokokken adhärieren anhumane Epithelzellen und dringen in sieein. Mit Hilfe eines eleganten heterologenExpressionssystems gelang es, den mole-kularen Mechanismus des bislang wich-tigsten Adhäsins und Invasins, dem SfbIProtein, zu analysieren. Eines der Schlüssel-elemente dieses Proteins, der sogenannte„Spacer“, wurde durch Ligandeninteraktionals kooperativ aktivierbar identifiziert undist für die Invasion essentiell. Immunologischgesehen, spielt diese Eigenschaft einewichtige Rolle: die geschlossene Konfor-mation verhindert sowohl die Generie-rung spezifischer Antikörper, als auch dieErkennung durch künstlich erzeugte spezi-fische Antikörper. Neben dem Spacerwurde eine weitere Domäne des SfbIProteins identifiziert, die als „Enhancer“die Spacer-vermittelte Invasion unter-stützt. Diese Domäne wirkt als direkterEffektor auf die Organisation des Wirts-zytoskelettes und bewirkt lokalisierteVeränderungen der Wirtszellmembran(Lamelliopodia Formation). Dies zeigt,dass die Wirtszelle selbst den bakteriellenAufnahmeprozeß aktiv unterstützt.

Ein neuartiges Immunglobulinbindungs-protein von Gruppe A Streptokokkenund dessen mögliche Bedeutung beirheumatischem Fieber

Immunglobulin bindende Proteinekommen bei Streptokokken häufig vorund sind mit invasiven Krankheiten assoziiert.Ein neuartiges sekretiertes Immunglobulin-bindungsprotein, genannt SibA, wurde vonuns identifiziert und charakterisiert. SibAist in der Lage, alle IgG Subklassen, Fc- undFab-Fragmente als auch IgA und IgM zubinden. Diese Eigenschaften machen SibAeinzigartig unter den Immunglobulin-bindungsproteinen. SibA besitzt Regionen,die Ähnlichkeit zu Myosin schweren Kettenaufweisen. Da diese Regionen möglicher-weise an der Entstehung des rheumati-schen Fiebers beteiligt sind, ist zu erwarten,dass SibA eine Rolle bei dieser auto-immunen Nachfolgeerkrankung spielt.

Eno, ein Plasminogenbindungs-protein von Streptococcus pneumoniae

S. pneumoniae verursacht ernsthafteinvasive Infektionen wie Sepsis oderMeningitis. Eine Wechselwirkung zwi-schen Pneumokokken-Proteinen undWirtsproteinen führt zu einer Trans-migration der Bakterien durch Epithel-zellbarrieren. Kürzlich wurde berichtet,dass die Bindung von Plasminogen anPneumokokken an dieser Transmigrationmaßgeblich beteiligt ist. Wir haben einenbakteriellen Faktor, genannt Eno, identi-fiziert, der in der Lage ist, Plasminogenzu binden. Eno-Protein ist ein Enzym(α-Enolase), das für den Metabolismusvon Bakterien notwendig ist. DiesesProtein wird von Bakterien sekretiert, istaber in der Lage, gleichzeitig Bakterienund Plasminogen zu binden. Die Bindungvon Plasminogen an Eno und dienachfolgende Aktivierung stellt einenVirulenzmechanismus dar, der eine Rollebei invasiven Infektionen spielen könnte.Dies ist ein erstes Beispiel bei Pneumo-kokken, dass ein “housekeeping protein”als Virulenzfaktor identifiziert wurde.Immunelektronenmikroskopische Analysezeigte, dass Eno-Protein im Zytoplasmaund an Bakterienoberflächen beibekapselten und unbekapselten Pneumo-kokken ubiquitär vorkommt.

Immunelektronenmikroskopi-sche Lokalisierung des Eno-Proteins in Pneumokokken mitHilfe spezifischer polyklonalerAntikörper und kolloidalenGoldpartikeln A-C: Lokalisie-rung des Eno-Proteins auf derZelloberfläche mit Hilfe derFeldemissions-Rasterelektro-nenmikroskopie (weiße Parti-kel). In B wurden die Pneumo-kokken mit isoliertem Eno-Protein vorinkubiert und manerkennt die Bindung an diePneumokokken Zellober-fläche, da im Vergleich zu vor-her nicht mit Eno inkubiertenPneumokokken (A und C)wesentlich mehr Eno-Proteinnachweisbar ist. D: Lokalisie-rung des Eno-Proteins amUltradünnschnitt; Eno-Proteinist sowohl an der Zellober-fläche als auch im Zytoplasmanachweisbar.

Electron microscopiclocalization of Eno protein inpneumococci with specificpolyclonal antibodies andcolloidal gold particles A-C:Localization of eno proteinson the cell surface by fieldemission electron microscopy(white particles). In panel B,the pneumococci were pre-incubated with isolated enoprotein where a much higherbinding was observedcompared to the pneumococciwhich were not incubatedwith eno protein (panel A andC). In panel D, ultra thinsections show the localizationof eno protein in both cellsurface and in cytoplasm.

Mechanisms of Pathogenic Processes (SP 2.1)

Pathogenicity Factors of Streptococci and Pneumococci


The association of Group C and Group Gstreptococcal carriage with rheumaticfever

Acute rheumatic fever (ARF) is a sequelae ofan untreated group A pharyngitis. It mostlyaffects children between 5 and 15 years of ageand with millions of new cases registered everyyear it represents a big health problem.Although the pathogenesis of ARF is not yetfully known, there are evidences that anabnormal immune response of the host plays amajor role. Group C and group G streptococcimost of which are animal pathogens have notbeen associated with ARF. We have nowshown for the first time a correlation betweenthe carriage of group C and group Gstreptococci and ARF. The AustralianAboriginal population has the highest rate ofARF although the group A streptococcalpharyngitis is uncommon. The throat carriageof group C and group G streptococci amongAboriginal population, however, is widespread.We showed that antibodies against group Cand group G streptococcal isolated from anAboriginal community cross-react with humancardiac myosin. Antibodies against group Astreptococcal skin isolates from the samepopulation were negative. These resultsprovide for the first time an explanation forthe cases of ARF with no history of group Apharyngitis. If further studies in otherendemic areas confirm the role of group C andgroup G streptococci in the induction of ARF,it could have a consequence that throat swabsfrom pharyngitis patients should also be testedfor group C and group G streptococci andappropriate steps be taken for their erdication.

Microbial infections are one the major causes of human disease. In spite of the availability ofantibiotics the infections caused by streptococci and pneumococci remain a serious health problem.Millions of children worldwide are suffering from rheumatic fever and rheumatic heart disease,the sequelae of streptococcal infections. The exact mechanism for induction of rheumatic fever isnot yet known. A prerequisite for control of streptococcal infections is the elucidation ofpathogenicity mechanisms and the development of suitable animal models. The aim of this projectis the elucidation of infection mechanisms of these bacteria by structure:function analysis of theirpathogenicity factors and by studying host-pathogen interactions and to develop a mouse model.The nematode C. elegans will also be included as an additional model for streptococcal infections.

Influence of genetic background onsusceptibility to streptococcal infections

Clinical manifestation of infection caused bygroup A streptococci can take the form of aself-limiting pharyngitis or superficialimpetigo to more serious invasive diseases. Ithas been suggested that factors associated withintrinsic properties of the host are critical forthe severity of streptococcal infections. Themain focus of our studies is to investigate theinfluence of host genetic factors on severity ofinfection caused by S. pyogenes. To achievethis we undertook the development of asuitable mouse model of streptococcalinfection using genetically well-defined inbredstrains. With this infection model, we haveshown that different strains of mice exhibiteddifferent capacities to control infection with S.pyogenes. Resistant mouse strains were ableto clear and survive the infection. In contrast,susceptible mice were totally unable to controlbacterial growth resulting in progressivebacterial multiplication and death. In order todetermine mechanisms involved in bacterialclearance in the resistant mouse strains, wehave performed a set of experiments using Band T cells-deficient mice from the resistantbackground and found that immune-deficientmice were as resistant to infection as immune-competent mice. These results suggest that theeffector mechanisms against S. pyogenespresent on the resistant mouse strains areindependent of adaptive immunity. Resistancewas also influenced by sex with males beingmuch more susceptible than females. Theseresults demonstrate for the first time theinfluence of genetic background on suscepti-bility to infection with S. pyogenes in mice.


Molecular mechanisms of streptococcalinvasion in eukarytic cells.

Group A streptococci adhere and invadeepithelial cells. A fibronectin binding surfaceprotein, SfbI protein, has been identified as animportant adhesin and invasin of group Astreptococci. We analysed the molecularmechanisms of SfbI protein by using anelegant heterologous expression system. A keyelement of SfbI protein , the so called “spacer”that is activated by a cooperative bindingmechanism plays an essential role in theinvasion process. This feature has animportant immunologic role since the hiddenconformation prevents not only the generationof specific antibodies but also the recognitionby antibodies generated in rabbits. Besides“spacer” another SfbI domain was identifiedthat supports the spacer-mediated invasion.This domain has direct effect on theorganisation of host cytoskeleton leading tolocalized changes in host cell membrane.These results underline the role of host cells inuptake of pathogenic bacteria.

A novel immunoglobulin binding proteinfrom group A streptococci and itspossible involvment in rheumatic fever

Immunoglobulin binding proteins are wellcharacterized pathogenicity factors which havebeen associated with streptococcal invasivedisease. We have now identified andcharacterized a novel secreted immuno-globulin binding protein, designated, SibA.This streptococcal protein binds all IgGsubclasses, the Fc and Fab fragments but alsoIgA and IgM making it unique among otherimmunoglobulin binding proteins. SibA hasregions of local similarity with other coiledproteins such as human myosin heavy chainwhich are of potential significance in thedevelopment of the autoimmune sequelae ofstreptococcal disease.

Eno, a plasminogen binding protein fromStreptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae belongs to thenormal flora of the human respiratory tractbut is also able to cause serious invasiveinfections such as sepsis and meningitis. Theinteraction of pneumococcal proteins withhuman host proteins leads to transmigrationthrough the epithelial cell barrier. Recentstudies indicate that binding of humanplasminogen to the surface of pneumococciand its subsequent activation to plasmin

promote the penetration through reconstitutedbasement membranes. We have identified apneumococcal factor, designated Eno protein,which is capable of binding plasminogen. Enoprotein is an enzyme (α-enolase) required forviability and metabolism. Eno is secreted bythe bacteria but is capable of reassociation tothe bacterial surface. The binding of Eno toplasminogen and its subsequent activation toplasmin represents a virulence mechanismthat might play a role in invasive infections.This is a first example of a pneumococcalhouse keeping protein that also acts a avirulence factor. Immunoelectron microscopyindicated the presence of Eno protein in thecytoplasm as well as on the bacterial surface ofboth encapsulated and unencapsulatedpneumococci. Eno protein is ubiquitouslydistributed among pneumococcal serotypes.

Publications ❘ VeröffentlichungenHaidan A, Talay SR, Rohde M, SriprakashKS, Currie BJ, Chhatwal GS (2000)Pharyngeal carriage of group C and Gstreptococci might be associated with acuterheumatic fever in the Aboriginal populationof the Northern Territory of Australia. TheLancet 356:1167-1169.

Talay SR, Zock A, Rohde M, Molinari G,Oggioni M, Pozzi G, Guzmán CA, ChhatwalGS (2000) Co-operative binding of humanfibronectin to SfbI protein triggersstreptococcal invasion into respiratoryepithelial cells. Cell Microbiol 2:521-535.

Bergmann S, Rohde M, Chhatwal GS,Hammerschmidt S (2001) α-enolase ofSteptococcus pneumoniae is aplasmin(ogen)-binding protein displayed onthe bacterial cell surface. Mol Microbiol40:1273-1287.

Fagan PK, Reinscheid D, Gottschalk B,Chhatwal GS (2001) Identification andcharacterization of a novel secretedimmunoglobulin binding protein from group Astreptococcus. Infect Immun 69:4851-4857.

Medina E, Goldmann O, Rohde M, LengelingA, Chhatwal GS (2001) Genetic control ofsusceptibility to group A streptococcal infectionin mice. J Infect Dis 184:846-852.

Pathogen/Wirtszell-Interaktionen


Projektleiter ❘ Project leader: Prof. Dr. J. Wehland ❘ Abt. Zellbiologie ❘ Dept. of Cell Biology

Reorganisation des Aktinzytoskelettsdurch Listeria monocytogenes

Pathogene Listerien dringen in das Cyto-plasma der Wirtszelle ein und rekrutierendort Aktinfilamente in Form einesSchweifes an einem Bakterienpol, was denErregern eine beachtliche Motilitätverleiht. Das auf der Bakterienoberflächeexponierte listerielle ActA Protein isthierfür allein verantwortlich, und dieseAktivität konnte auf zwei essentielleDomänen im ActA eingegrenzt werden:ein vierfaches E/DFPPPPXDEE Motiv(ActA-”Repeats”) und eine N-terminalgelegene positiv geladene Region. DieActA-”Repeats” binden mit hoher AffinitätProteine der Ena/VASP Familie, die für dieeffiziente Listerienbewegung innerhalbder infizierten Wirtszelle ausschlaggebendsind. VASP ist in Zellen auch an derVorderfront sich ausbreitender

Lamellipodien lokalisierbar, Ena/VASPProteine sind darüber hinaus Ligandenvon Profilin, einem Aktinmonomer-bindenden Protein, das die Polymeri-sation von Aktin, d.h. die Bildung vonAktinfilamenten, stimulieren kann, unddessen Rekrutierung an die Listerienober-fläche direkt mit der intrazellulärenBewegung der Bakterien korrelierbar ist(Geese et al. 2000). Der Arp2/3 Komplex,der an die positiv geladene Region imActA bindet, ist der zweite bisheridentifizierte ActA-Ligand. Dieser Protein-komplex (7 Untereinheiten), der inLamellipodien kultivierter Zellen und imvon Listerien induzierten Aktinschweiflokalisierbar ist, ist für die aktinvermittelteBewegung von Listerien essentiell. DerArp2/3 Komplex initiiert die Nukleationvon Aktinfilamenten, ein Prozess, derdurch die Bindung an ActA gefördert wird

Die Abteilung Zellbiologie befasst sich schwerpunktmäßig mit Pathogen/Wirtszell-Interaktionen und bearbeitet primär folgende Teilgebiete: die Invasionsmechanismenbakterieller Erreger, die von ihnen ausgelösten bzw. modifizierten Signalprozesse inner-halb der Wirtszelle, und das Aktinzytoskelett als eine zentrale Zielstruktur vonPathogenen. Bisher haben wir uns auf Listeria monocoytogenes konzentriert, ein ubiquitärverbreitetes, Gram-positives Bakterium, das aufgrund seines intrazellulären Wachstums beiMensch und Tier ernsthafte Infektionen hervorrufen kann (s. auch QF2). Mit derAufklärung der bakteriellen Pathogenitätsmechanismen beabsichtigen wir längerfristig,spezifisch in den Infektionsverlauf eingreifen zu können. Andererseits ermöglichen dieBefunde detaillierte Einblicke in die Physiologie der Wirtszelle.

Projektmitarbeiter ❘ Project members: B. Behrendt, S. Benesch, M. Geese, D. Monner, S. Pust, K. Rottner, A. Sechi,T. Stradal

Die rasterelektronenmi-kroskopischen Aufnahmenzeigen frühe Phasen derPhagozytose von opso-nierten Erythrozyten durchMakrophagen. (a) nichttransfizierter Makrophage,in (b) wurden die Zellen miteinem Konstrukt transfiziert,das für die prolinreichenActA”Repeats” kodiert unddie Rekrutierung vonEna/VASP Proteinen“neutralisiert”. Wurde dieRekrutierung von Ena/VASPProteinen unterbunden (b),konnten die Makrophagenzwar noch opsonierteErythrozyten binden, aberkeine lamellipodialenAusläufer (Pfeilspitzen in a)mehr bilden, womit diePhagozytose blockiert war.

Scanning electronmicroscopy analysis of earlystages of phagocytosis ofopsonized erythrocytes bymacrophages. (a) untrans-fected macrophages, in(b) cells were previouslytransfected with a constructcoding for the proline-richActA repeats that”neutralize“ targeting ofEna/VASP proteins. Uponinterfering with recruit-ment, e.g. the targeting ofEna/VASP proteins in (b),macrophages were still ableto bind to opsinizederythrocytes but did notform lampellipodia-likeextensions (arrow heads ina). As a result the phagocyticprocess is blocked.


(Pistor et al., 2000). Diese Ergebnisse be-legen, dass die Ena/VASP Proteine und derArp 2/3 Komplex Schlüsselfunktionen inaktinvermittelten Prozessen einnehmen.

Mit einem breitangelegten Screen nachWirtszellproteinen, die ActA-Funktionensimulieren, identifizierten wir das Fyb/SLAP Protein, das nur in hämatopoeti-schen Zellen vorkommt. Fyb/SLAP ist einneuer Ena/VASP Ligand und akkumuliertmit T-Zell-Rezeptoren an der Kontaktstellezwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. Weiterhin zeigtenwir, dass Ena/VASP Proteine und der Arp2/3 Komplex in Form eines Proteinkom-plexes, der auch SLP-76, Nck und dasWiskott-Aldrich Syndrom Protein (WASP)enthält, an diese Kontaktstelle rekrutiertwerden, wodurch die Vorgänge initiiertwerden, die essentiell für die Reorgani-sation des Aktinzytoskeletts während derT-Zellaktivierung sind (Krause et al.,2000). Wir vermuten daher, dass Fyb/SLAP und die Ena/VASP Proteine auch inden aktinvermittelten Prozess derPhagozytose in Makrophagen involviert

a

b

sind, da die räumlich und zeitlichlimitierte Reorganisation des Aktinzyto-skeletts für die Partikelaufnahme ver-antwortlich ist. Unsere Versuche ergaben,dass Ena/VASP Proteine nicht nur inprimären und immortalisierten Makro-phagen an entstehenden Phagosomenrekrutiert werden, sondern dass ihreexperimentell induzierte “Neutralisation”auch den Phagozytoseprozess blockiert(s. Abb. 1). Die Induktion der Phago-zytose führt zur Bildung eines größerenProteinkomplexes, der neben Ena/VASPProteinen und Fyb/SLAP auch SLP-76,Nck und WASP enthält. Unsere Befundedeuten darauf hin, dass die Aktivierungdes Fcy-Rezeptors während derPhagozytose zwei Signalwege involviert:einen, der über Fyb/SLAP zur Rekrutierungvon Ena/VASP Proteinen und Profilinführt, während der andere über Nck dieRekrutierung von WASP fördert, wodurchwiederum der Arp 2/3 Komplex aktiviertwird. Beide Signalwege kontrollieren diefür den Phagozytoseprozess essentielleDynamik von Aktinfilamenten.

Crosstalk Between Bacterial Pathogens and Host Cells

Subversion of the actin cytoskeleton byListeria monocytogenes: lessons from thebacterial world.

L. monocytogenes invades mammalian cellsand enters their cytosol where it propels itselfby developing a comet-like actin-rich tail.Generation of the actin tail by Listeria isexclusively due to the expression of the ActAprotein on their surface. Two major domainsof ActA are essential for its function: a four-fold E/DFPPPPXDEE motif (ActA repeats)and an amino-terminal stretch of positively-charged amino acids. The ActA repeats bindwith high affinity to proteins of the Ena/VASPfamily, which are necessary for efficient

The Department of Cell Biology is focussing on the interactions between bacterial pathogens andhost cells, primarily concentrating on the following aspects: invasion mechanisms, signallingprocesses within host cells that are triggered and /or modified by pathogens, and the actincytoskeleton as a central target of pathogens. Until now we have mainly been working withListeria monocytogenes, a ubiquitous Gram-positive bacterium, that due to its intracellularlifestyle can cause serious infections in both man and animal (see also QF2). By decipheringbacterial pathogenicity mechanisms we intend not only to specifically interfere with the infectionprocesses, but also to gain detailed insights into the host cells’ physiology.

Listeria motility in infected cells. VASP alsolocalizes at the front of spreadinglamellipodia. Moreover, Ena/VASP proteinsare ligands for profilin, an actin monomerbinding protein that can stimulate thepolymerisation of actin and whose recruitmentto the Listeria surface directly correlates withthe motility state of this bacterium (Geese etal., 2000). Another cellular ligand of ActA isthe Arp2/3 complex that binds to thepositively charged cluster. This seven-proteincomplex localizes to lamellipodia of culturedcells and to the actin comet tails of Listeriamonocytogenes and is essential for the actin-based motility of this bacterium. The Arp2/3


complex promotes the nucleation of actinfilaments that is enhanced upon interactionwith ActA (Pistor et al., 2000). Thesefindings clearly indicate that Ena/VASPproteins and the Arp 2/3 complex are keyplayers in the actin-based processes.By screening for host cell proteins mimickingthe functions of ActA, we identified the Fyb/SLAP protein that is restricted to hematopoeticcells. We could demonstrate that Fyb/SLAP isa new ligand for Ena/VASP proteins and thatit localizes to the sites of T-cell receptor (TCR)clustering when T cells interact with antigen-presenting cells (APC). Based on these studieswe proposed a model in which Ena/VASPproteins and the Arp 2/3 complex are linkedto the T cell-APC interface via a molecularcomplex formed by SLP76, NcK and theWiskott-Aldrich syndrome protein (WASP).The formation of this molecular complex wasproposed to be essential for the targeting ofEna/VASP proteins and the Arp2/3 complexand thus for the initiation of early events thatare essential for the remodelling of the actincytoskeleton in T-cell activation (Krause et al.,2000).

Therefore, we anticipated that Fyb/SLAPand Ena/VASP proteins might also participatein the actin assembly process triggered by Fcγ-receptor cross-linking during phagocytosis inmacrophages. Phagocytosis involves the spatialand temporal reorganisation of the actin-based cytoskeleton at sites of the particleingestion. The local polymerisation of actinfilaments supports the protrusion ofpseudopodia that eventually engulf theparticle. We found that Ena/VASP proteins arerecruited to phagosomes forming aroundopsonised particles in both primary andimmortalised macrophages. Not only did thelocalisation of Ena/VASP proteins coincide,spatially and temporally, with thephagocytosis-induced reorganisation of actinfilaments, but their recruitment to thephagocytic cup was required for theremodelling of the actin cytoskeleton,extension of pseudopodia and efficient particleinternalisation (Fig. 1). Upon induction ofphagosytosis, a large molecular complexconsisting in part of Ena/VASP proteins, Fyb/SLAP, Nck, and WASP is formed. Ourfindings suggest that activation of Fcγ-receptors triggers two signalling events duringphagocytosis: one through Fyb/SLAP thatleads to recruitment of VASP and profilin, andanother one through Nck that promotes the

recruitment of WASP and the Arp2/3complex. These converge to regulate actinpolymerisation, controlling the assembly ofactin structures that are essential for theprocess of phagocytosis.

Publications ❘ VeröffentlichungenGeese M, Schlüter K, Rothkegel M, JockuschBM, Wehland J, Sechi AS (2000)Accumulation of porfilin II at the surface ofListeria is concomitant with the onset ofmotility and correlates with bacterial speed.J Cell Sci, 113:1415-1426.

Krause M, Sechi AS, Konradt M, Monner D,Gertler FB, Wehland J (2000) Fyn-bindingProtein (Fyb)/SLP-76-associated Protein(SLAP), Ena/Vasodilator-stimulatedPhosphoprotein (VASP) Proteins and theArp2/3 Complex Link T Cell Receptor (TCR)Singaling to the actin cytoskeleton. J Cell Biol,149:181-194.

Pistor S, Grobe L, Sechi AS, Domann E,Gerstel B, Machesky LM, Chakraborty T,Wehland J (2000) Mutations of arginineresidues within the 146-KKRRK-150 motif ofthe ActA protein of Listeria monocytogenesabolish intracellular motility by interferingwith the recruitment of the Arp2/3 complex.J Cell Sci 113:3277-3287.

Pathogenitätsfaktoren aus Mykoplasmen

Projektleiter ❘ Project leader: Prof. Dr. P. F. Mühlradt ❘ Arb. Gr. Immunbiologie ❘ Res. GroupImmun Biology

Projektmitarbeiter ❘ Project members: U. Deiters, K. Grote

Die Entstehung von trunkierten Lipopro-teinen bei Mykoplasma fermentans

In Zusammenarbeit mit der ArbeitsgruppeKim Wise konnte gezeigt werden, dass dasMakrophagen-aktivierende LipopeptidMALP-2 aus M. fermentans ebenso wie das41 kDa Lipoprotein MALP-404 Produkteeines Gens malp sind (Calcutt et al., 1999,Infect. Immun. 67:760).

In Zusammenarbeit mit der Arbeits-gruppe S. Akira wurde nachgewiesen, daßfür die Signaltransduktion von MALP-2das Zusammenwirken der zwei Toll-Re-zeptoren TLR-2 und TLR-6 notwendig ist.(Takeuchi et al., 2001, Int Immunol 13:933)

In vitro und in vivo Aktivitäten vonMALP-2

Das aktive Stereoisomer von MALP-2wurde an der GBF synthetisiert und gereinigt.MALP-2 zeigte in verschiedenen experi-mentellen Modellen starke in vivo Aktivität:sowohl nach intraperitonealer und intra-cutaner als auch nach intranasaler Appli-kation zeigten sich, ähnlich wie bei natür-lichen Mykoplasma-Infektionen, An-sammlungen von Leukozyten. Dies ist aufdie Freisetzung verschiedener leukotak-tisch wirkender Chemokine zurückzufüh-ren (Deiters & Mühlradt, 1999, Infect.Immun. 67: 3390).

MALP-2 Wirkung auf Knochenmeta-bolismus

In der klinischen Forschergruppe vonR. Felix wurde vor dem Hintergrund derarthritogenen Eigenschaften derMykoplasmen getestet, ob MALP-2 dieKnochenresorption beeinflusst. In einemin vitro System, das die Freisetzung vonKalzium aus Kalvarienhälften bestimmt,wurde gezeigt, dass MALP-2 in geringenKonzentrationen die Kalziumfreisetzungstimuliert. Dies ist wahrscheinlich auf eineStimulation von Osteoklasten zurückzu-führen. (Piec et al., 1999, Infec Immun67:6281)

MALP-2 induziert Kreuztoleranz gegen-über TNF und Endotoxin

Nach entscheidenden Vorarbeiten vonU. Deiters wurde in Zusammenarbeit mitAkira in vitro Kreuztoleranz gegenüberEndotoxin gezeigt (Sato et al., 2000). MitGalanos et al. (2001) wurde bewiesen,dass MALP-2 Mäuse vor TNF und z. T.auch vor Endotoxinschock schützen kann.

MALP-2 in der WundheilungDer Prozeß der Wundheilung lässt sich infünf Stadien unterteilen:1. Blutgerinnung, 2. Infiltration vonGranulozyten und Makrophagen,

Mykoplasmen sind kleine, mit einem minimalen Genom ausgestattete Bakterien, diekeine Zellwand besitzen und parasitär Epithelzellen besiedeln. Sie sind nicht nur einbekannter Störfaktor bei der Haltung von Zellkulturen, sondern oft übersehene Erregerverschiedener Krankheiten, wie z. B. Entzündungen des Urogenitalsystems, der Lungesowie der Gelenke. Diese Entzündungen sind primär auf Aktivierung von Makrophagenzurückzuführen, wobei die Identität des aktivierenden Stoffes bisher unbekannt war. DieStruktur des Makrophagen aktivierenden Mykoplasmawirkstoffs, des “Endotoxins” derMykoplasmen, wurde von uns aufgeklärt. Das Wirkprinzip sind Lipoproteine undLipopeptide, die am N-Terminus mit zwei Fettsäuren modifiziert sind (Mühlradt etal.,1997, J. Exp. Med. 185:1951). Eines dieser Lipopeptide, das MALP-2, wurde synthetischhergestellt und diente der Identifizierung der Rezeptoren und des Signalweges (Takeuchi etal., 2000). Die Arbeitsgruppe Immunbiologie beschäftigt sich mit der von Mykoplasmenausgelösten Makrophagenaktivierung und ihrer Bedeutung für Mykoplasmen-induzierteEntzündungen und Krankheiten sowie mit der Anwendung von MALP-2 in der Wund-heilung, bei der Prophylaxe von Peritonitis, als Adjuvans, zur Prävention vonEndotoxinschock und als Tumortherapeutikum.



3. Angiogenese, 4. Wundkontraktion undEpithelialisierung, 5. Umwandlung desNarbengewebes.

In vielen Fällen (wie z. B. bei Diabeti-kern) ist die normale Wundheilunggestört, so dass eine beschleunigteWundbehandlung von großer medizini-scher und auch finanzieller Bedeutung ist.Nach unserer Hypothese kann das zweiteund dritte Stadium des Wundheilungs-prozesses mit dem Makrophagen-stimulierenden Lipopeptid MALP-2beeinflusst und die Wundheilungbeschleunigt werden, da MALP-2 Makro-phagen und Hautfibroblasten aktiviertund diese zur Freisetzung von Mediatoren,u. a. von Chemokinen, stimuliert (s. o.).Die Chemokine induzieren dann dasEinwandern weiterer Makrophagen sowieGranulozyten, die beide im Fall einerWunde für deren schnelle und effizienteReinigung sorgen. Makrophagen sinddarüber hinaus vor allem eine wichtigeQuelle von Wundheilungsfaktoren undsomit für den Prozess der Wundheilungvon essentieller Bedeutung. Tatsächlich

Abb. 1. Kreisrunde Wundenwurden auf dem Rückenvon C57BLKS/J-m+/+Leprdb

Mäusen erzeugt. Diesewurden mit einem durch-sichtigen Pflaster bedeckt,durch das an fünf aufeinan-derfolgenden Tagen MALP-2 (5 µg pro Behandlung)bzw. Methylzellulose (Kon-trollen) appliziert wurde.Die Daten sind Mittelwerte± SD aus Gruppen vonjeweils 9-10 Tieren.

Fig. 1. Full excision woundswere applied to the dorsalskin of C57BLKS/J-m+/+Leprdb mice. Wounds werecovered with transparentdressing and 5 µg doses ofMALP-2 or control vehicles(methyl cellulose) wereadministered at the timesindicate by the arrows. Dataare means of determinationfrom groups of 9-0 mice.

konnte sowohl histologisch als auchdurch die Bestimmung des Nukleinsäure-gehalts nachgewiesen werden, dass MALP-2 nach intracutaner Injektion in Mäuseeine Infiltration von Zellen am Injektions-ort induziert. Bei diesen Zellen handeltees sich drei bzw. sechs Tage nach Appli-kation in erster Linie um Makrophagen.Eine entsprechende Einwanderung vonZellen wurde auch in zirkulären, MALP-behandelten Wunden (0,8 cm imDurchmesser) diabetischer Mäuse mittelsBestimmung des Nukleinsäure- und desHydroxyprolingehalts (letzteres als Maßfür die Kollagenbildung durch Fibro-blasten) ermittelt. Dass MALP-2 darüberhinaus tatsächlich die Fähigkeit besitzt,die Wundheilung diabetischer undWundheilungs-gestörter Mäuse zubeschleunigen, ist in Abb. 1 dargestellt.

KooperationenM. Kieß, M. Morr, W. Tegge, GBF; R. Felix,Forschungsgruppe Knochenbiologie, Dept.Klinische Forschung der Universität Bern;M. Calcutt, K. Wise, University ofMissouri-Columbia, USA, T. Tschernig,Anatomie der Med. HochschuleHannover; B. Holzmann, Klinikum rechtsder Isar, München; C. Galanos und M.Freudenberg, MPI für Immunbiologie inFreiburg; S. Akira, Osaka University, Japan.

Wo

un

d A

rea

(% O

rig

inal

)

Wound healing accelerating acitivity of MALP-2

Time (d)

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100

120

ControlMALP-2

Excised Skin Area: 1.3 cm2

*

*

*

*

MALP-Treatment


Pathogenicity Factors from Mycoplasmas

Mycoplasmas are small wall-less bacteria which reside on epithelial cells of the respiratory orurogenital tract possessing a minimal genome. They are not only a nuisance in cell culture workbut often overlooked pathogens causing inflammatory reactions of the urogenital tract, the lungor in the joints. These inflammations are primarily caused by activation of macrophages, theidentity of the macrophage activating agent being unknown until recently. The structure of themycoplasma-derived macrophage activator, the “endotoxin” of mycoplasmas was elucidated atthe GBF. The active agent are lipoproteins and -peptides which are N-terminally substituted bytwo ester-linked fatty acids (Mühlradt et al.,1997, J. Exp. Med. 185:1951). One of theselipopeptides, MALP-2, has now been synthesized and served to identify its receptors and signalpathways (Takeuchi et al., 2000). The Research Group Immunobiology studies themycoplasma-mediated macrophage activation and its role in mycoplasma-related inflammationsand diseases, as well as possibilities to use MALP-2 in wound healing, prophylaxis ofperitonitis, as adjuvans, and for preventing endotoxin shock and as an anti tumor agent.

Truncation of lipoproteins inMycoplasma fermentans

It was shown in collaboration with the groupof Kim Wise that the macrophage activatinglipopeptide MALP-2 from M. fermentans aswell as the 41 kDa lipoprotein MALP-404are products of one and the same gene malp(Calcutt et al. 1999, Infect. Immun.67:760).

In collaboration with S. Akira it was shownthat cooperation of the two toll-like receptors2 and 6 are required for signaling.

In vitro and in vivo activities of MALP-2The active stereoisomer of MALP-2 wassynthesized and purified at the GBF. MALP-2shows high in vivo activity in variousexperimental systems: leukocyte infiltrations,similar to those observed in naturalmycoplasma infections, were seen afterintraperitoneal, intracutaneous and intranasaladministration of MALP-2. This was due toliberation of leukotactically active chemokines(Deiters & Mühlradt, 1999, Infect. Immun.67:3390) .

MALP-2 effects on bone metabolismIn the context of the known arthritogenicproperties of mycoplasmas R. Felix and hisR&D group tested whether MALP-2 has aninfluence on bone resorption. It was shown inan in vitro system, where liberation ofcalcium from calvaria is determined, thatMALP-2 stimulates calcium release at verylow concentrations. This is likely due to stimu-lation of osteoclasts.

MALP-2 induces cross-tolerance to TNFand endotoxin

Following pilot experiments by U. Deiters itwas shown in collaboration with Akira thatMALP-2 induces in vitro cross tolerance toendotoxin (Sato et al., 2000). These datawere extended with C. Galanos et al. (2001)to in vivo experiments which indicated thatMALP-2 protects mice from lethal dosis ofTNF or endotoxin.

MALP-2 in wound healingWound healing proceeds in 5 stages: 1. bloodcoagulation, 2. infiltration of leukocytes, 3.angiogenesis, 4. wound contraction andepithelialization, 5. restructuring of thescarring tissue. In many cases wound healingis impaired, as e. g. in diabetic patients. It isthus of great medical and economicimportance to find means of acceleratingwound healing. According to our hypothesisthe second and third stage of wound healingmay be favorably influenced by the lipopeptideMALP-2, because it activates macrophagesand fibroblasts of the skin to liberatechemokines and other mediators. Thesechemokines lead to increased influx ofmacrophages and neutrophils. The leukocytesprovide rapid and effective cleaning of thewound. Moreover, macrophages are animportant source of growth factors essential forthe process of wound healing. It could beshown in experiments with mice by histologyand determination of nucleic acid contentthat MALP-2 induces after 3 to 6 days aninfiltration of cells at the site of injection.These cells were identified as macrophages.A corresponding cellular influx was alsoobserved when MALP-2 was applied to

circular wounds in diabetic mice. In thismodel there was also a significant increase ofhydroxyproline in the MALP-treated wounds,indicating an increase in collagen synthesis bywound fibroblasts. That MALP-2 actuallycauses an acceleration of wound closure inhealing-impaired diabetic mice is shown inFig. 1.


Publications ❘ VeröffentlichungenSato S, Nomura F, Takeuchi O, Mühlradt PF,Takeda K, Akira S (2000) Synergy and cross-tolerance between toll-like receptor (TLR)2-and TLR4-mediated signaling pathways. JImmunol 165:7096-7101.

Takeuchi A, Kaufmann A, Grote K, Kawai T,Hoshino K, Morr M, Mühlradt PF, Akira S(2000) Preferentially the R-stereoisomer ofthe mycoplasmal lipopeptide MALP-2activates immune cells through a TLR2- andMyD88-dependent signaling pathway. JImmunol 164:554-557. Erratum in Nov.Issue: It should read S–stereoisomer as theactive isomer!

Galanos C, Gumenscheimer M, Mühlradt PF,Jirillo E, Freudenberg M (2001) MALP-2, amycoplasma lipopeptidewith classicalendotoxic properties: end of an era of LPSmonopoly ? J Endotoxin Res. 6:471-476.

Takeuchi O, Kawai T, Mühlradt PF, Morr M,Radolf JD, Zychlinsky A, Takeda K, Akira S(2001) Discrimination of microbiallipoproteins by Toll-like receptor (TLR) 6. IntImmunol 13:933-940.

Impfstoffforschung (SP 2.2)

Projektleiter ❘ Project leader: PD Dr. Dr. C. A. Guzmán ❘ Arb.Gr. Impstoffforschung ❘Res. Group of Vaccine Research

Projekmitarbeiter ❘ Project members: S. Borsutzky, T. Ebensen, C. Link, F. Rharbaoui, K. Schulze, U. Winckler; inZusammenarbeit mit P. Paglia, Instituto Nazionale Tumori Milan, F. Ebel, MPI München

Identifikation der minimalen Domäne desFibronectin-Bindungsprotein I (Sfb I) vonStreptococcus pyogenes die benötigtwird, um eine schützende Immunantwortauszulösen

Frühere Studien unserer Arbeitsgruppeerlaubten die Feststellung, dass SfbI einsehr lohnendes Zielantigen für dieImpfstoffherstellung gegen S. pyogenes ist.Die Instabilität des nativen Proteins nahmbisher einen negativen Einfluss auf denweiterführenden Prozess der Vakzin-herstellung. Verkürzte Formen des SfbI-Proteins weisen dagegen eine verstärkteStabilität auf, folglich wurden Experimentedurchgeführt, die den minimalsten Anteildes SfbI-Proteins identifizieren sollten, derin der Lage ist, eine schützende Immunitätgegen S. pyogenes aufzubauen. Die erhal-tenen Resultate zeigten, dass die intranasaleImmunisierung mit einem 157 Amino-säuren großen SfbI-Fragment, welches dieWiederholungen der Fibronectin-Bindungs-stelle umfasste, einen mit den Wildtyp-Bakterien vergleichbaren Schutz gewährte(80% Überleben versus 0% der Kontroll-gruppe). Weitere Studien belegten darüberhinaus, dass die Vakzinierung mit diesemSfbI-Fragment zu einer effizienten Aus-bildung einer „Memory“-Immunantwortführte. Die zusätzliche Nutzung verstärk-ender mukosaler Adjuvantien war beiEinsatz des SfbI-Fragments überflüssig, dadessen spezifische Wirkung als Adjuvansvöllig ausreichte, um eine schützendeImmunität zu gewähren.

Rolle von SepL während der Pathogenesevon enterohämorrhagischen Escherichiacoli (EHEC)

Das sepL Gen wird vom Lokus derEnterozyten-Auslöschung von EHECkodiert. Daher ist dieses Gen sehrwahrscheinlich an den Prozessen derAnheftung und der Auslöschung beteiligt.Untersuchungen bezüglich derLokalisierung des SepL-Proteins zeigtenein Auftreten im Zytoplasma und darüberhinaus eine Assoziation mit bakteriellenMembranen. SepL wird dabei in Antwortauf Stimuli, die charakteristisch für dieintestinale Nische sind, monocistronischtranskribiert. Die Charakterisierung einerin-frame Deletion (∆sepL Mutante vonEHEC) zeigte, dass SepL essentiell für diebakterielle Anheftung an epitheliale Zellenund für die Rekrutierung und Reorgani-sation der zytoskeletalen Proteine in derZielzelle ist. Die ∆sepL Mutante zeigtezudem eine gestörte Sekretion der Esp-Proteine. Allerdings wurde die Biosynthesedieser Proteine nicht beeinflusst. DieseErgebnisse zeigen, dass SepL eine äußerstwichtige Rolle im biologischen Zyklus vonEHEC spielt.

In vivo Korrektur genetischer Defektevon Makrophagen mit Hilfe attenuierterSalmonellen als orale Vektoren

Makrophagen sind normale Zielzellen fürSalmonella während einer natürlichenInfektion. Unsere Arbeitsgruppe zeigtekürzlich, dass attenuierte Bakterien zurAnlieferung von Vakzinen (Nukleinsäure-konstrukte) an Makrophagen benutztwerden können. Daher untersuchte unsereArbeitsgruppe die Möglichkeit, mit Hilfe

Die Vakzinierung stellt eine äußerst kosteneffektive Strategie als Prophylaxe gegen eineVielzahl von Infektionskrankheiten dar. Dabei können Impfstoffe als wirkungsvollesHilfsmittel bei der Prävention bzw. bei der Behandlung gegen verschiedene Krankheitensinnvoll eingesetzt werden. Die Haupttätigkeit der Vakzin-Forschungsgruppe ist auf dieEntwicklung und die Validierung von Technologieplattformen für Antigen-Liefersystemeund Vakzin-Prototypen fokussiert.



von attenuierten Salmonella als Über-träger von Transgenen genetische Defektezu korrigieren, die mit Makrophagenassoziiert sind. Als Nachweisverfahrenwurden IFNγ-defiziente Mäuse (GKO)eingesetzt, die hoch empfänglich gegen-über bakteriellen Infektionen sind (d.h.sogar attenuierte Mutanten von Salmonellakönnen für diese Mäuse letal sein).Attenuierte Salmonella aroA wurden dabeials Träger eines eukaryotischen Expressions-vektor benutzt, der das murine IFNγ-Gentrug. Die Produktion dieses Zytokins inGKO Mäusen wurde nach Infektion mitSalmonella in vitro oder in vivo wiederher-gestellt. Die orale Gabe der rekombinantenBakterien an GKO Mäuse stellte zudemeine natürliche Resistenz gegenüber Infek-tionen in den immun-geschwächten Tieren

Abb. 1. Überleben vonintranasal mit Sfb I-Deriva-ten immunisierten Mäusennach Infektion mit einemheterologen S. pyogenesStamm.

Fig. 1. Survival of miceintranasally immunized withSfbI derivatives afterchallenge with a hetero-logous S. pyogenes strain.

Time (days)

100 2 4 6 80

20

40

60

80

100

% o

f su

rviv

al

H-2

H-8H-10

Control

SfbI

H2

NH2

Signalpeptide

aromaticdomain

spacer 1 prolinerepeats

fibronectin-bindingspacer2

fibronectin-binding-repeats

wall-membraneregion

COOH

H10

H8

wieder her (100 % gegenüber 0 % Über-leben). Diese Ergebnisse zeigten erstmalig,dass attenuierte Salmonella erfolgreich alsDNA Antigen-Liefersystem für dieKorrektur eines genetischen Defekts, dermit Makrophagen assoziiert ist, eingesetztwerden können.

Veröffentlichungen ❘ PublicationsKresse AU, Beltrametti F, Ebel F, GuzmánCA (2000) Characterization of the SepLof enterohemorrhagic Escherichia coli.J Bacteriol 182:6490-6498.

Paglia P, Terrazini N, Schulze K, GuzmanCA., Colombo MP (2000) In vivocorrection of genetic defects ofmonocytes/macrophages using attenuatedSalmonella as oral vectors for targetedgene delivery. Gene Therapy 7:1725-1730.

Medina E, Schulze K, Chhatwal GS,Guzmán CA (2000) Nonimmuneinteraction of the SfbI protein ofStreptococcus pyogenes with theimmunoglobulin G F(ab’)

2 fragment.

Infect Immun 68:4786-4788.

Medina E, Paglia P, Rohde M, ColomboMP, Guzmán CA (2000) Modulation ofhost immune responses stimulated bySalmonella vaccine carrier strains by usingdifferent promoters to drive the expressionof the recombinant antigen. Eur JImmunol 30:768-777.

Schulze K, Medina E, Talay SR, Towers RJ,Chhatwal GS, Guzmán CA (2001)Characterization of the domain offibronectin-binding protein I ofStreptococcus pyogenes responsible forthe elicitation of a protective immuneresponse. Infect Immun 69:622-625.


Identification of the minimal domain ofthe fibronectin-binding protein I (SfbI) ofStreptococcus pyogenes required for theelicitation of a protective response

Previous studies from our group allowed toestablish that SfbI represents a promisingantigen for vaccine formulations againstS. pyogenes. However, the instability of theprotein may constitute a problem for the scale-up process. Truncated forms of SfbI exhibitimproved stability, thus, experiments werecarried out to identify the minimal portion ofSfbI able to confer protective immunity. Theobtained results demonstrated that intranasalimmunisation with a fragment of only 157amino acids, which encompasses thefibronectin-binding repeats, confers efficientprotection against challenge with wild typebacteria (80% survival versus 0% in thecontrol group). Further studies proved thatvaccination with this fragment stimulatesefficient memory and that the use ofadditional mucosal adjuvants is renderedunnecessary due to the intrinsic adjuvanticityof this SfbI domain.

Role played by SepL in the pathogenesisprocess of enterohemorrhagic Escherichiacoli (EHEC)

The sepL gene is coded by the locus ofenterocyte effacement of EHEC. Thus, it islikely to be implicated in the attaching andeffacing process. Protein localization studiesshowed that SepL was present in thecytoplasm and associated with bacterialmembranes. SepL is monocystronicallytranscribed in response to stimuli that arecharacteristic for the intestinal niche. Thecharacterization of an in-frame deletionmutant (∆sepL) showed that SepL is essentialfor bacterial attachment to epithelial cells andfor the recruitment and reorganization ofcytoskeletal proteins on target cells. The ∆sepLmutant also exhibited an impaired secretionbut not biosynthesis of Esp proteins. Theseresults demonstrate the crucial role played bySepL in the biological cycle of EHEC.

Vaccine Research (SP 2.2)

Vaccination is the most cost-effective strategy for the prophylaxis of infectious diseases and it is alsobecoming a powerful tool to prevent or treat a broader range of diseases. The main activities of theVaccine Research Group focus on the development and validation of technology platforms forantigen delivery and vaccine prototypes.

In vivo correction of genetic defects ofmacrophages using attenuatedSalmonella as oral vector

Macrophages are normal targets forSalmonella during natural infections. Inaddition, we have previously demonstratedthat attenuated bacteria can be used to delivernucleic acid vaccine constructs to them.Thus, we assessed if attenuated Salmonellacan be used to deliver transgenes to correctgenetic defects associated with macrophages.The proof-of-principle for this strategy wasprovided using IFN-γ-deficient mice (GKO),which are highly susceptible to bacterialinfections (i.e. even attenuated mutants canbe lethal). Attenuated Salmonella aroA wasused as carrier for an eukaryotic expressionvector encoding the murine IFN-γ gene. Theproduction of this cytokine was restored inperitoneal macrophages from GKO mice,which were infected with Salmonella eitherin vitro or in vivo. Oral administration ofrecombinant bacteria to GKO mice alsoreestablished the natural resistance toinfections in these immunocompromisedanimals (100% versus 0% survival). Theseresults demonstrate, for the first time, thatattenuated Salmonella can be successfullyused as a DNA delivery system for thecorrection of genetic defects associated tomacrophages.

Immunantwort und Antigenpräsentation (SP 2.3)


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. S. Weiß ❘ Arb. Gr. Molekulare Immunologie ❘ Res. GroupMolecular Immunology

Projektmitarbeiter ❘ Project members: H. Bauer, S. Düber, H. Engel, A. Garbe, H. Herrmann, J. Jablonska, A.Jungebloud, T. Kleinke, K. Kretschmer, S. Krusch, S. zur Lage, R. Lesch, M. Probst-Kepper, J. Stopkopwicz, A.Zelmer

Die Zellen des Immunsystems, die Antigen-spezifische Reaktionen ausführen, lassen sichin B- und T-Zellen unterteilen. Dabei sind B-Zellen für die Produktion von Immunoglobulin(Ig) verantwortlich, während T-Zellen, die sich in zytotoxische CD8 und regulatorischeCD4 T-Zellen unterteilen lassen, ihre Funktion über Zell-Zellinteraktion oder Zytokin-sekretion ausüben. Auch bei B-Zellen kann man verschiedene Populationen unterscheiden,hauptsächlich B1- und B2-Zellen. Die B2-Zell Population ist für die hohe Spezifität vonAntikörpern verantwortlich, da sie die Fähigkeit zur Affinitätsreifung durch somatischeHypermutation ihrer Ig variablen Regionen und zum Ig-Klassenwechsel (Switch) besitzt.Diese Differenzierung nimmt jedoch Zeit in Anspruch, deshalb gewinnen sie bei einererstmalig auftretenden Infektion erst relativ spät an Bedeutung. Dagegen scheinen B1-Zellenbzw. das von ihnen produzierte Ig (B1-Zellen produzieren >50% des Serum IgM) eine ersteAntikörper-Barriere gegen Infektionen darzustellen. Welche Selektionskräfte auf das Antikör-perrepertoire von B1-Zellen wirkt, damit diese Barriere entsteht, ist jedoch noch unklar.

Im Gegensatz zu B-Zellen können T-Zellen mit ihrem Rezeptor Antigen nicht direkterkennen. Es muss zunächst prozessiert (proteolytisch gespalten) und anschließendgebunden an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf der Oberflächevon Zielzellen präsentiert werden. Dieser Vorgang ist essentiell für die T-Zellreaktion.Folgerichtig haben Pathogene Mechanismen entwickelt, die damit interferieren. So indu-ziert Listeria monocytogenes einen antagonistischen MHCII/Peptid Komplex, der zur zeit-weiligen partiellen Inaktivierung von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen führt. Inwieweitsich diese Inhibition in vivo auswirkt wird derzeit untersucht.

Ein transgenes B1-ZellmodellKürzlich konnten wir mehrere Mauslinienetablieren, die eine λ2 leichte (L) Ig-Ketteals Transgen besitzen. In einer dieserLinien wurde von den B-Zellen nur dietransgene und keine der endogenen L-Ketten exprimiert. Ferner waren in diesenMäusen die B-Zellen fast ausschließlichvom B1-Typ. Da durch die Vorgabe dertransgenen L-Kette das Repertoire dervariablen Regionen der schweren Ketten(VH) eingeschränkt ist, war es möglich,sinnvolle Sequenzvergleiche von VHs vonB1-Zellen verschiedenen Ursprungsdurchzuführen. Diese Analysen ergaben,dass im Peritoneum der transgenen Mäuseeinige wenige VH-Sequenzen dominieren,d.h. identische Sequenzen wurden wieder-holt aufgefunden, auch wenn unterschied-liche individuelle Tiere analysiert wurden.Bei der Analyse von B-Zellen aus derfötalen Leber, dem Organ in dem B1-Zellen entstehen, wurden ebenfallsSequenzen wiederholt aufgefunden. Sie

unterschieden sich aber von denen ausdem Peritoneum. Um auszuschließen,dass diese dominierenden Sequenzen aufGrund von präferentieller Paarung mit dertransgenen L-Kette selektioniert waren,wurden pre-B-Zellen in vitro ausdifferen-ziert und ihre VHs analysiert. Hier wurdenkeine wiederholten VH-Sequenzen aufge-funden, so dass ein Paarungseffekt durchdie transgene L-Kette als Erklärung aus-scheidet. Wir interpretieren diese Befundeso, dass in der fötalen Leber durch Selbst-Antigene und im Peritonem durch Selbst-Antigene möglicherweise zusammen mitAntigenen von Mikroorganismen aus demDarm das Antikörperrepertoire von B1-Zellen stark beeinflußt wird. VorläufigeErgebnisse zeigen, dass auch in der Milz,einem Organ in dem normalerweise nurwenige B1-Zellen vorkommen, die aber inunseren transgenen Mäuse die größte B-Zellpopulation darstellen, ebenfalls einstark selektioniertes VH-Repertoire vor-liegt. Überraschenderweise war die Archi-

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Abb.1. Histologische Analyseeiner Milz von einer mit L.monocytogenes infiziertenMaus am dritten Tag derInfektion. Paraffin-Schnittewurden einer Gram-Färbungunterzogen. Zur besserenÜbersicht wurde mitKernechtrot gegengefärbt.Abb. A zeigt einen primärenlymphoiden Follikel indessen Marginalzone infi-zierte Zellen zu finden sind.Die mit Pfeilen markiertenZellen repräsentieren Zellen,die mehrere Bakterienenthalten und durch dieGram-Färbung detektiertwerden können (B). Beihöherer Auflösung undweniger intensiver Färbung,lassen sich dabei einzelnegefärbte Stäbchen unter-scheiden (nicht gezeigt).

Fig.1. Histological analysis ofa spleen derived from amouse infected with L.monocytogenes for 3 days.Nuclear fast red and Gramstaining was carried out onparaffin sections. A primarylymphoid follicle is shown(A) in the marginal zone ofwhich infected cells arefound. Arrows mark cellsthat contain several bacteriadetected by the Gramstaining (B). Using a largermagnification and a lessintensive staining singularrods would becomedetectable (not shown).

tektur dieses lymphoiden Organs weitge-hend normal, obwohl die B-Zellzonen derprimären Follikel sonst mit B2-Zellenbevölkert sind. Offensichtlich besitzendiese B1-Zellen die Kapazität die entspre-chenden Strukturen zu organisieren.

Listerien-Wirt InteraktionAntigen präsentierende Zellen (APC), diemit L. monocytogenes infiziert oder mitListeriolysin, dem Hämolysin von L.monocytogenes, behandelt wurden, induzie-ren bei Antigen-spezifischen CD4 T-Zellenpartielle Anergie. Diese T-Zellen könnennicht mehr proliferieren und IL-2 produ-zieren, sekretieren aber weiterhin nochIFNγ und IL-3. Die parielle Anergieverschwindet nach etwa fünf Tagen unddie T-Zellen werden wieder voll reaktiv.Um zu untersuchen, ob dieses Phänomenauch in vivo Relevanz besitzt, wurdenMäuse mit einer niedrigen Dosis L.monocytogenes infiziert. Anschließendwurde ihnen an verschiedenen TagenAntigen verabreicht. Die Analyse der APCaus der Milz dieser Mäuse ergab, dassschon am ersten Tag die Präsentationdurch phagozytische Zellen beeinflusstwar, während nicht aufgetrennte Milz-zellen, in denen auch B-Zellen als APCfungieren können, erst am vierten Tag ihrestimulatorische Kapazität verloren. Andiesem Tag wandern die Listerien-spezifi-schen Killer-T-Zellen in die Milz ein undbeginnen infizierte Zellen zu lysieren.Dadurch wird vermutlich Listeriolysin voninfizierten phagozytischen Zellenfreigesetz, so dass dann alle Milzzellenmit Listeriolysin in Kontakt kommen.Histologische und zytologische Analyselieferte eine Erklärung, dafür warumphagozytische Zellen bereits am ersten Tagbetroffen sind. Listerien infizieren zu-nächst vornehmlich phagozytische Zellenin der Margialzone der lymphoidenFollikel (Abb. 1). Diese Zellen sindvermutlich auch diejenigen, die als erstemit Antigenen aus dem Blut in Berührungkommen, so dass auch ihre Präsentation-kapazität am stärksten betroffen sein sollte.

Listerien-vermittelte DNA-ÜbertragungListerien sind geeignet eukaryontischeExpressionsplasmide auf Wirtszellen zuübertragen. Sie können somit potentiellals Vektoren für die Gentherapie benutztwerden. Da sie auf Grund ihres Infektions-zyklus Möglichkeiten aufweisen, die nicht-replizierenden Vektoren (z.B. Retroviren)verschlossen bleiben (z.B. Zell zu Zell-Ausbreitung), stellen sie eine ernstzuneh-mende Alternative zu diesen Vektoren dar.

Zunächst wurden DNA Übertragungenmit Reportergenen durchgeführt. DieseÜbertragungen wurden dann optimiertund mit der Übertragung einer cDNA fürCFTR (cystic fibrosis transmembraneconductance regulator) erweitert. Funktio-nalität des übertragenen CFTR konntenach biochemischer Analyse elektro-physiologisch sichergestellt werden. Umdiese Transfers auf ein in vivo Modellübertragen zu können, wurde ein Fusions-protein zwischen CFTR und GFP herge-stellt, damit die CFTR Expression in vivoanhand der Fluoreszenz nachweisbar ist.Abb. 2 zeigt CHO Zellen, in die mit Hilfevon Listerien CFTR-GFP übertragen wurde.

Highlights from Research and Development Research Area: Pathogenic Processes


Immune Response and Antigen Presentation (SP 2.3)

The cells of the immune system that are able to react antigen specifically can be divided into B-and T-cells. B-cells are responsible for the production of immunoglobulin (Ig). T-cells which can befurther subdivided into cytotoxic CD8 and regulatory CD4 cells exhibit their function via cell-cellinteraction or cytokine secretion. Also B-cells can be subdivided into different subpopulations,mainly into B1- and B2-cells. B2-cells are responsible for the exquisite specificity of antibodiessince they are capable of affinity maturation by somatic hypermutation of their Ig variable regionsand to switch their Ig classes. Since this differentiation requires some time such antibodies canplay no role during the initial phase of a primary infection. In contrast, B1-cells or the Ig producedby them (B1-cells produce >50% of serum IgM) are considered a first antibody barrier againstinfections. The selective forces that act on the antibody repertoire of B1-cells to assure afunctioning barrier, however, are still unclear.

In contrast to B-cells, T-cells can not recognize antigen directly with their T-cell receptor.Antigen needs to be processed (proteolytic digested) and subsequently presented bound to amolecule of the major histocompatibility complex (MHC) on the surface of an antigen presentingcell (APC). This process is essential for the T-cell reaction. Consequently, pathogens havedeveloped mechanisms that interfere with these processes. E.g. Listeria monocytogenes inducesan antagonistic MHCII/peptide complex that results in transient partial inactivation of antigenspecific CD4 T-cells. Whether or not this inactivation is relevant during a listeria infection in vivois presently under study.

A transgenic B1-cell modelRecently we established several mouse strainsthat contain a λ2 light immunoglobulin (Ig)chain as transgene. In one of these lines B-cells expressed the transgenic light chain only.Hardly any of the endogenous light chainscould be found. In addition, most of the B-cells in such mice were of the B1 type. Sincethe presence of the transgenic light chainrestricts the repertoire of the variable regionsof the heavy chains (VH) to a large extend, asensible comparison of sequences of VH‘sderived from B1-cells was possible. Theseanalyses revealed that in the peritoneum ofthe transgenic mice a few VH-sequencesdominated, i.e. identical sequences were foundrepeatedly even when different individualanimals were analyzed. The analysis of VH‘sof B-cells from fetal liver, the organ where B1-cells originate from, also revealed severalidentical sequences. However, they weredistinct from the ones identified inperitoneum. To exclude that this finding wasdue to a preferential pairing of the transgeniclight chain with a restricted set of heavychains we differentiated fetal liver derivedpreB-cells in vitro and analyzed their VHrepertoire. Here we could not find identicalsequences. Thus a pairing effect is excluded asexplanation. We interpret our findings in sucha way that self-antigens in fetal liver and self-antigens together with exogenous antigenspossibly derived from microorganisms of the

gut in the peritonem are strongly influencingthe antibody repertoire of B1-cells.Preliminary data suggest that a similarmechanism also acts on B1-cells in spleen, anorgan in which B1-cells normally representonly a minor percentage, while in ourtransgenic mice they constitute the major B-cell population. Interestingly, the architectureof this organ was quite normal, although theB-cell zones of the primary follicles normallycontain B2-cells. Obviously, B1-cells have thecapacity to organize such structures.

Listeria-host interactionAntigen presenting cells (APC) that areinfected with L. monocytogenes or APC thatare treated with listeriolysin, the hemolysin ofL. monocytogenes, induce partial anergy inantigen specific CD4 T-cells, i.e. such T-cellsdo not longer proliferate and produce IL-2 butare still able to secrete IFNγ and IL-3. Anergyresolves after 5 days and the T-cells becomefully responsive. To find out whether thisphenomenon has also relevance in vivo weinfected mice with a low dose of L.monocytogenes. Subsequently antigen wasinjected at different days and antigenpresenting capacity of cells from spleen wasrevealed. Already at the first day isolatedphagocytic cells were affected while totalspleen cells in which B-cells also can act asAPC still could present antigen. These cellsonly lost their stimulatory capacity after 4

Highlights from Research and Development Research Area: Pathogenic Processes 88

Abb.2. Expression eines GFP-CFTR Fusionproteins in CHOZellen nach Listerien-vermittelter Transfektion.Die Zellkerne der Transfek-tanten wurden mit DAPIdetektiert, das hier mit roterFalschfarbe dargestellt ist.

Fig. 2. Expression of a GFP-CFTR fusion protein in CHOcells after listeria-mediatedDNA transfer. Nuclei wererevealed using DAPI wichhere is indicated in a redfalse color.

days. At this time listeria specific cytotoxiccells are known to migrate into the spleen andlyse infected cells. During this period mostlikely listeriolysin is liberated and all spleencells are exposed to it. Histological andcytological analysis suggested also anexplanation for the early effect on phagocyticcells. Listeria mainly infects phagocytic cells ofthe marginal zone of the lymphoid follicles(Fig. 1). Such cells are most likely alsoexposed first to antigens that are transportedvia the blood stream. Therefore, theirpresenting capacity should be affected first.

Listeria mediated DNA transferListeria are also capable of transferringeukaryotic expression plasmids to mammalianhost cells and can, therefore, potentially beused as vectors for gene therapy. Due to theirparticular infection cycle they posess features(like cell to cell spreading) that are notavailable to none-replicating vectors such asreplication defective retroviruses. Thus, theyrepresent a serious alternative to such vectors.

Initially DNA transfers were carried outwith reporter genes. An optimized system thenwas used to transfer a cDNA encoding CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator). Functionality of the transferredCFTR was analyzed biochemically and byelectrophysiology. To be able to use thistransfer system also in vivo, we established afusionprotein between CFTR and GFP whichshould allow the detection of a transferred andexpressed CFTR in vivo by its fluorescence.Fig. 2 shows CHO cells that were transfectedwith CFTR-GFP using L. monocytogenes.

Publications ❘ VeröffentlichungenDarji A, zur Lage S, Garbe AI, ChakrabortyT, Weiss S (2000) Oral delivery of DNAvaccines using attenuated Salmonellatyphimurium as carrier. FEMS ImmunolMed Microbiol 1190:341-349.

Paschen A, Dittmar KEJ, Grenningloh R,Rohde M, Schadendorf D, Domann E,Chakraborty T, Weiss S (2000) Humandendritic cells infected by Listeriamonocytogenes: induction of maturation,requirements for phagolysosomal excape andantigen presentation capacity. Eur J Immunol30:3447-3456.

Engel H, Rühl H, Benham CJ, Bode J, WeissS (2001) Germ-line transcripts of theimmunoglobulin λ J-C clusters in the mouse:Characterization of the initiation sites andregulatory elements. Mol Immunol 38:289-302.

Hense M, Domann E, Krusch S, Wachholz P,Dittmar KEJ, Rohde M, Wehland J,Chakraborty T, Weiss S (2001) Eukaryoticexpression plasmid transfer from the intra-cellular bacterium Listeria monocytogenesto host cells. Cell Microbiol 3:599-609.

Weiss S, Krusch S (2001) Bacteria-mediatedtransfer of eukaryotic expression plasmids tomammalian host cells. Biol Chem 382:533-541.

Experimentelle Immunologie (SP 2.4)


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. W. Müller ❘ Abt. Experimentelle Immunologie ❘ Dept. ofExperimental Immunology

Projektmitarbeiter ❘ Project members: S. Beissert, M.Hafner, A. Hollnagel, R. Hühne, C. Neffgen, A. Samuels, G. Wessel

Die Funktion von Zytokinnetzwerken inder Maus

Zytokine sind Botenstoffe des Immun-systems, die die Funktion und den Aktivier-ungszustand des Immunsystems sowohllokal als auch im ganzen Körper regulieren.Kontinuierliche Ausschüttung bestimmterZytokine führt zu chronischen Entzündun-gen mit zum Teil erheblichen Einbußender Lebensqualität. Wir beschäftigen unsmit zwei Klassen von Zytokinen: Zytokinen,die eine anti-entzündliche Wirkung haben,die also in der Lage sind, Entzündungenzu hemmen, und solchen, die eine entzün-dungsfördernde Wirkung haben, also einenEntzündungsprozess beginnen und aufrechterhalten können. Zytokine, die Entzün-dungen auslösen, haben Nebenwirkungen,z.B. Fieber oder Gelenkschmerzen. Warumschaltet man diese Zytokine nicht einfachaus und braucht Entzündungen nicht mehrzu fürchten? Fehlen nämlich diese Zytokine,so wird der Körper anfällig gegenüberErregern und kann selbst einfache bakteri-elle und virale Infekte nicht mehr abwehren.

Wanderung von LymphozytenDas Immunsystem ist gegliedert in einzel-ne abgeschlossene funktionelle Einheiten(Kompartimente), die durch Gefäßsystememiteinander verbunden sind. Lymphozy-ten wandern durch die verschiedenstenGefäßsysteme im Körper und gelangen soan fast jeden Ort. Die Wanderung derLymphozyten wird kontrolliert durch eineGruppe von Molekülen, die auf der Ober-fläche der Lymphozyten ausgeprägt werdenund die für die Einwanderung in die ver-schiedensten Kompartimente verantwortlichsind. Die Funktion dieser Moleküle unter-

suchen wir in Mausmutanten. Fehlen dieseMoleküle, so verändern sich die verschie-denen Kompartimente in der Größe undin der Zusammensetzung der unterschied-lichsten Zellarten. Die Kompartimente,wie die am Darm gelegenen lymphati-schen Strukturen, haben eine besondereBedeutung für die Abwehr von Bakterien.So ist das Darmsystem von einer Vielzahlvon Bakterien und Hefen besiedelt, die beider Verdauung mithelfen. Das Immun-system muss verhindern, dass dieseBakterien und Hefen eine Infektion imKörper auslösen. Andererseits werdenständig Nahrungsmittelbestandteile ausdem Darm in den Körper aufgenommen,und das Immunsystem muss dafür sorgen,dass gegen diese Nahrungsmittelbestand-teile keine Immunantworten erfolgen.

Gene des ImmunsystemsDie Methode der DNA-Sequenzierung vonGenen erlaubt es uns, die Abfolge dereinzelnen DNA-Basen der Gene zu bestim-men. Gene, die für die Funktion desImmunsystems wichtig sind, können wirin ihrer Struktur und Funktion beschrei-ben. Durch bioinformatische Methodenkönnen wir analysieren, wie während derEvolution einzelne Genfamilien entstan-den und wie sich diese Genfamilien weiterentwickelt haben. Die ständige Auseinan-dersetzung mit Krankheitserregern hat inder Vergangenheit zu einer sehr hohenSterblichkeit geführt, und nur die Perso-nen, deren Immunsystem die Krankheits-erreger bekämpfen konnten, pflanztensich fort. Wir sehen also in den Genen dasErgebnis einer sehr langen Auseinander-setzung zwischen Erreger und Wirt.

Die neu gegründete Abteilung für experimentelle Immunologie nahm ihre Aktivitäten imNovember 2000 auf. Thematisch befasst sich die Abteilung mit grundlegenden Mechanis-men des Immunsystems, die einerseits für eine Abwehr von Erregern notwendig sind,andererseits aber bei Fehlfunktionen zu Erkrankungen des Körpers in Form von Allergi-en, chronisch-entzündlichen Prozessen und Autoimmunität führen können. DieMechanismen werden in der Maus als Modellsystem analysiert. Durch gezielte Verände-rung von genetischer Information in der Maus, in sogenannten Mausmutanten, wirdeine ursachenorientierte Betrachtung von Krankheitsprozessen möglich.

Highlights from Research and Development Research Area: Pathogenic Processes 90

Experimental Immunology (SP 2.4)

The newly installed Department of Experimental Immunology started its activities in November2000. The Department studies fundamental mechanisms of the immune system, which on the onehand are necessary for the elimination of pathogens, but on the other hand, when not functioningaccordingly, can lead to diseases in the form of allergies, chronic inflammatory processes andautoimmunity. The mechanisms are analysed in mice which are used as a model system. The causeand the process of a disease can be examined by specifically modifying the genes in mice andgenerating so called mouse mutants.

The function of cytokine networks in miceCytokines are messengers of the immunesystem that regulate the function and theperformance of the immune system in theentire body and not just certain parts.Continuous production of a certain cytokinemay lead to chronic inflammation whichresults in a considerable loss in the quality oflife. We study two classes of cytokines:cytokines that have an anti-inflammatoryeffect, i.e. are capable of slowing down theinflammation, and those that aid theinflammatory effect, i.e. can trigger off andmaintain an inflammatory process. Cytokinethat cause inflammation have side effects, e.g.fever or pain in the joints. Why doesn’t onejust eliminate these cytokines and need notworry about inflammation? If these cytokinesare inactive then the metabolism becomessusceptible to pathogens and is unable to fendoff bacterial and virus infections.

The migration of lymphocytesThe immune system is divided into smallfunctional units (compartments), which areconnected by vascular systems. Lymphocytespass through the different vascular systemsand by doing this they reach almost every partof the body. The migration of lymphocytes iscontrolled by a group of molecules, which arepresent on the surface of the lymphocyte andare responsible for the immigration into thedifferent compartments. We study the functionof these molecules in the mouse mutants. Ifthe molecules are missing the differentcompartments change in size and in the makeup of the cellular composition. For example,the compartment containing the lymphaticstructures in the intestine are very importantfor fending off bacteria. A large number ofbacteria and yeasts are present in theintestinal system. The immune system has toprevent these bacteria and yeasts from causingan infection in the body. On the other hand,food ingredients in the intestines areconstantly being absorbed by the body and the

immune system has to ensure that these foodingredients do not cause an immune reaction.

Genes of the immune systemThe DNA-sequencing methods of genes allowus to determine the sequence of the individualDNA bases of the gene. We can describe thefunction and structure of genes which areimportant for the functioning of the immunesystem. With the help of bioinformaticalmethods we can analyse how in the process ofevolution single gene families originated, andhow they have continued to develop to thecurrent state. The constant fight of thepathogens responsible for infections led to ahigh mortality rate in the past and onlyindividuals capable of fighting off thesepathogens could reproduce. So in the genestoday we see the result of very long fightsbetween pathogen and hosts.

Publications ❘ VeröffentlichungenLeuker CE, Labow M, Müller W, Wagner N(2001) Neonatally induced inactivation ofthe vascular cell adhesion molecule 1 geneimpairs B cell localization and T cell-dependent humoral immune response. J ExpMed 193:755-768.

Kanwar JR, Harrison JE, Wang D, Leung E,W. Müller, N. Wagner, Krissansen GW(2000) Beta7 integrins contribute todemyelinating disease of the central nervoussystem. J Neuroimmunol 103:146-152.

Vosshenrich CA, Sharara LI, Guy-Grand D,Rajewsky K, Müller W, Di Santo JP (2000)Common cytokine receptor gamma chain(gamma c)-deficient B cells persist in T cell-deficient gammac-mice and respond to a T-independent antigen. Eur J Immunol30:1614-22.

Dr. W. Müller organisierteden EMBO-Kurs (s. S. 96)

Dr. W. Müller organized theEMBO course (see p. 96).


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. J. Buer ❘ Nachwuchsforschergruppe Mucosale Immunität ❘Junior Research Group Mucosal Immunity

Projektmitarbeiter ❘ Project members: S. Bayrak, D. Bruder, P. Gatzlaff, W. Hansen, J. Lauber, O. Lechner, A.Matussek, A. Schrader, B. Störmann, T. Töpfer, M. Templin, G. Tettweiler, A. Westendorf, Dr. rer. nat. U. Walter(Hôpital Necker Enfants Malades, Paris)

T-Zell-ToleranzWir konnten vor kurzem differentielleExpressionsprofile von „anergen“ CD4+ T-Zellen erstellen und hierbei eine Reihevon Genen identifizieren, die für dieAufrechterhaltung der peripheren Toleranzwesentlich sind (siehe auch F.A.Z. 20. Juni2001, Nr.140/Seite N2). Einige deridentifizierten Gene wurden bisher nichtmit T-Zellregulation in Verbindunggebracht und stellen völlig neue Ansatz-punkte für eine gezielte Beeinflussung derT-Zellfunktion in vivo dar.

Durch Einsatz einer Multiplex-Einzelzell-RT-PCR konnte erstmals derdirekte Einfluß von Rezeptoren der TNF-Rezeptor Familie auf die Entstehung desAutoimmundiabetes nachgewiesenwerden. Dieses in vivo Modell wird vonuns zur Zeit intensiv genutzt, um grundle-gende Fragestellungen der peripherenImmunregulation aufzuklären.

Weitere Forschungsarbeiten beschäfti-gen sich mit funktionellen und molekula-ren Analysen zur Entwicklung von prä-T-Zellen. Es konnten hierfür verschiedene„Knock-out”-Modelle und in vitroSysteme an der GBF etabliert werden, underste Ergebnisse zur prä-T-Zell-Rezeptor(prä-TCR) Signaltransduktion liegen vor.

Mucosale ImmunitätEine zentrale Aufgabe des intestinalenImmunsystems ist die Entwicklung undBeibehaltung einer immunologischenReaktionsunfähigkeit (Toleranz bzw.mucosale Anergie) gegenüber zahlreichenAntigenen. Dies drückt sich in derverminderten Stimulierbarkeit mucosalerT-Lymphozyten durch Antigene undMitogene aus, sowie in der Produktionvon Zytokinen mit Suppressoraktivitäten.Das Phänomen einer antigenspezifischenSuppression von systemischen Immun-antworten nach Applikation oralerAntigene wird als Induktion oralerToleranz bezeichnet. Systemische Toleranzwird hierbei entweder aktiv (Suppression)oder passiv (klonale Anergie oderDeletion) erreicht. Die Bedeutung lokalerimmunologischer Reaktionen in derDarmmucosa für die Pathogeneseverschiedener intestinaler Erkrankungenist erst in den letzten Jahren zunehmenderkannt worden. Untersuchungen anKnock-out-Mäusen haben gezeigt, dassinsbesondere eine gestörte Wechselwir-kung von mucosalen T-Zellen undmikrobieller Normalflora hierbei einebesondere Bedeutung zukommt. Diemolekularen Grundlagen diesermucosalen Dysregulation und ihregezielte Beeinflussung werden bisher nurunvollständig verstanden und sindGegenstand intensiver Forschungsbemü-hungen. Einen wichtigen Schwerpunktbildet hierbei die „TherapeutischeManipulation der Darmflora“.

Die Forschungsaktivitäten unserer Nachwuchsforschergruppe gliedern sich in die beidenTeilgebiete T-Zell-Toleranz und Mucosale Immunität. Im Mittelpunkt steht dabei diemolekulare Erforschung der reziproken Wechselwirkung von mucosalem Immunsystemund Bakterien („Flora“). Dies erfordert die Entwicklung und Anwendung von Methodenzur dynamischen Analyse der Genexpression in vivo. Ziel ist es, im Tiermodell und amPatienten völlig neue und hocheffektive Therapien für Erkrankungen mit gestörtermucosaler Immunfunktion zu entwickeln.

Mucosale Immunität (SP 2.5)


Aktuelle Ergebnisse zur MucosalenImmunität: Es konnte ein universellesbakterielles Antigen-Carriersystems zurmucosalen Immunmodulation unterVerwendung von E.coli Bakterien vomStamm NISSLE 1917 generiert werden.NISSLE Bakterien zeichnen sich durch ihreFähigkeit zur Kolonisierung aus und sindsowohl in der Maus als auch im Menschenapathogen. Als Antigenpräsentations-system wird ein AIDA Typ I Autotranspor-ter von uns eingesetzt. Erste in vivoVersuche wurden bereits gestartet.

Zusätzlich zur Etablierung von Model-len, die der Erforschung des mucosalenImmunsystems des Darms dienen, wirdein TCR transgenes Mausmodell zurUntersuchung von Störungen im Bereichdes Schleimhaut-assoziierten Immun-systems der Lunge entwickelt. In diesemProjekt wird Hemagglutinin als Antigenselektiv im Alveolarepithel von TCR-HAtransgenen Mäusen exprimiert unduntersucht, ob sich durch Bakterien-

vermittelte Antigenexpression im Gastro-intestinaltrakt eine Modulation desmucosalen T-Zellsystems der Lunge erzie-len lässt. Die Etablierung des Modell-systems konnte inzwischen von Frau Dr.Bruder weitgehend abgeschlossen werden.

Ein weiterer Schwerpunkt beschäftigtsich mit der molekularen Charakterisie-rung der komplexen Wechselwirkung vonChlamydia trachomatis mit Wirtszellen(„Cross-Talk“). In Kooperation mitAndreas Klos vom Institut für Medizini-sche Mikrobiologie der MHH wurdeuntersucht, wie Chlamydien Host-Zellen„umprogrammieren“.

Funktionelle ExpressionsanalyseUnter der Projektleitung von Jörg Lauberwird von unserer Nachwuchsforscher-gruppe zur Zeit eine Einheit zur funktio-nellen Expressionsanalyse für Infektions-biologie etabliert und bereits von vielenverschiedenen Arbeitsgruppen an der GBFund in der Region erfolgreich genutzt.

Mucosal Immunity (SP 2.5)

T-cell toleranceWe have recently been able to producedifferential expression profiles of “anergic”CD4+ T-cells, and thereby could identify anumber of genes essential for maintainingperipheral tolerance (see also F.A.Z 20June 2001, No. 140/Page N2). Several ofthe identified genes have not previouslybeen associated with T-cell regulation, andthus present the possibility of completelynovel approaches to influencing T-cellfunction in vivo.

Using a multiplex single-cell RT-PCR, itwas possible to demonstrate for the firsttime the direct influence of receptors of theTNF receptor family in causingautoimmune diabetes. Currently, this invivo model is being intensively used in ourlaboratories to elucidate fundamental

questions related to peripheral immuneregulation.

Other research involves functional andmolecular analysis of the development of pre-T-cells, for which various knock-out modelsand in vitro systems have been established atthe GBF. Investigations into pre-T-cell receptor(pre-TCR) signal transduction have alreadyyielded initial results.

Mucosal ImmunityA central task of the intestinal immune systemis to develop and maintain an immunologicalnon- response capability (tolerance, ormucosal anergy) towards numerous antigens,revealed in a reduced sensitivity to thestimulation of mucosal T-lymphocytes by anti-gens or mitogens, as well as in the productionof cytokines with suppresser activity. The

The research activities of our “Junior Research Group” are divided into two main areas, T-celltolerance and mucosal immunity. The emphasis is on molecular research into mutual interactionsbetween the mucosal immune system and bacteria (“flora”), which requires the development andapplication of methods of dynamic analysis of gene expression in vivo. The aim, with animalmodels and patients, is to develop completely new and highly effective therapies for diseasesinvolving disturbance of the mucosal immune function.


phenomenon of antigen-specific suppression ofsystemic immune responses followingapplication of oral antigens is referred to asthe induction of oral tolerance, whereby heresystemic tolerance is achieved either actively(by suppression) or passively (by clonal anergyor deletion). Only in recent years thesignificance of local immunological reactionsin the intestinal mucosa for the pathogenicityof various intestinal diseases has beenincreasingly recognised. Studies with knock-out mice have shown that disturbedinteraction between mucosal T-cells and thenormal microbial flora are particularlyimportant. The molecular basis of suchmucosal dysregulation and deliberate attemptsat influencing it are poorly understood atpresent, but they are the object of intensivecurrent research, whereby an important focusof attention involves “therapeuticmanipulation of the intestinal flora”.

Current results of mucosal immunityresearch: using E. coli bacteria (strainNISSLE 1917), it has been possible to createa universal bacterial antigen carrier system forthe purpose of mucosal immunomodulation.NISSLE bacteria are characterised by theirability to colonise and are non-pathogenic inboth mice and humans. We use an AIDA TypI autotransporter as antigen presentationsystem. Initial in vivo experiments havealready begun.

In addition to our work on establishingmodels for the study of the intestinal mucosalimmune system, we are also developing a TCRtransgenic mouse model for studyingdisturbances in the area of the pulmonary,mucosa-associated immune system. In thisproject, haemagglutinin as antigen isexpressed and studied selectively in thealveolar epithelium of TCR-HA transgenicmice, to see whether modulation of thepulmonary mucosal T-cell system throughbacteria-mediated antigen expression in theintestinal tract is possible. Dr. Bruder hasfinished to establish the model system and isnow focusing on its cellular and molecularcharacterisation.

Another focus of our research is themolecular characterisation of the complexinteractions between Chlamydiatrachomatis and the host (“cross talk”). Inco-operation with Andreas Klos from theinstitute for Medical Microbiology from theMedical University of Hannover we havestudied how Chlymdia reprograms the host.

Functional ExpressionprofilingUnder the project leadership of Joerg Lauberour group aims to established a unit forfunctional expressionprofiling for the biologyof infections. Several groups at the GBF andin the area are already successfully applyingthis system for the study of host-pathogeninteraction.

Publications ❘ VeröffentlichungenOevermann K, Buer J, Hoffmann R, FranzkeA, Schrader A, Patzelt T, Kirchner H,Atzpodien J (2000) Capecitabine in thetreatment of metastatic renal cell carcinoma.Br J Cancer 83:583-587.

Schrader AJ, Probst-Kepper M, Große J,Kunter U, Schenk F, Franzke A, Atzpodien J,Buer J (2000) Molecular and prognosticclassification of advanced melanoma: a multi-marker microcontamination assay ofperipheral blood stem cells. Melanoma Res10:355-362.

Schrader AJ, Probst-Kepper M, Große J,Kunter U, Franzke A., Sel S., Atzpodien J.,and Buer,J. (2000). Tumourmicrodissemination and survival in metastaticmelanoma. Anticancer Res 20:3619-3624.

Lechner O, Lauber J, Franzke A, Sarukhan A,von Boehmer H, Buer J (2001) Fingerprintsof anergic T cells. Curr Biol 11:587-595.

Identifizierung von Zellulose als einer extrazellulären Ma-trixkomponente von Biofilm bildenden Salmonellen (SP 2.6)

Projektleiter ❘ Project leader: Dr. U. Römling ❘ Nachwuchsforschergruppe Klonale Variabili-tät ❘ Junior Research Group Clonal Variability

Projekmitarbeiter ❘ Project members: W. Bokranz, D. Dinesh, J. Floßdorf, U. Gerstel, A. Kresse, X. ZogajKooperationen mit: M. Nimtz, M. Rohde

Besiedelung von Oberflächen durchBiofilm bildende Bakterien verursacht immedizinischen Bereich schwer zu bekämp-fende Infektionen sowie Kontaminationvon Produkten in industriellen Anlagen.Die Familie der Enterobacteriaceae gehörtzu den häufigsten Verursachern noso-komialer Infektionen (Krankenhaus-Infektionen), die in vielen Fällen, wie beider durch Katheter verursachten Zystitis,durch Biofilm bildende Bakterien ausge-löst werden. Eine Analyse der Biofilm-bildung auf regulatorischer und struktu-reller Ebene schafft die Voraussetzung fürrationale Strategien zur Bekämpfung vonBiofilm bildenden Bakterien. Ein Ziel derNachwuchsforschergruppe ist es, dieStrukturkomponenten von Biofilmbildenden Salmonella typhimurium undEscherichia coli aufzuklären.

Bakterien in Biofilmen sind in einerselbstproduzierten extrazellulären Matrixeingebettet, durch die sie an der Ober-fläche anheften sowie ihre eigene multi-zelluläre Gemeinschaft aufbauen. DieBildung von Matrixkomponenten vonBiofilm bildenden S. typhimurium kannman durch das Wachstum der Zellen aufeiner mit dem Farbstoff Kongorotversehenen Agarplatte über die Kolonie-morphologie kombiniert mit der unter-schiedlichen Farbgebung durch dieAbsorption von Kongorot leichtdetektieren. Genetische und phäno-typische Analysen hatten gezeigt, dass esmindestens zwei extrazelluläre Matrix-komponenten gibt, von denen die eine, diedünnen, aggregativen Fimbrien, schonbekannt war. Über Transposonmuta-genese wurden die Gene des bcsABZC(bacterial cellulose synthesis) Operons alsnotwendig für die Bildung der bislangunbekannten extrazellulären Matrix-komponente identifiziert. Ausgehend vonder Homologie mit dem Zelluloseoperon

in Acetobacter xylinus konnte mit geneti-schen und chemischen Analysen gezeigtwerden, dass Zellulose der zweite Bestand-teil der extrazellulären Matrix von Biofilmbildenden S. typhimurium ist (Abb. 1).Zelluloseproduktion konnte neben S.typhimurium auch für Biofilm bildendeSalmonella enteritidis, E. coli Stämmesowie Klebsiella pneumoniae nachgewiesenwerden.

Bisher war man der Meinung, dassZellulose nur von wenigen Boden-bakterien wie z.B. Agrobacterium tumefa-ciens und Rhizobien synthetisiert wird. Mitunserer Arbeit konnten wir zum erstenMal Zelluloseproduktion in pathogenenund kommensalen Mikroorganismennachweisen, die eine bedeutende Rolle inder Humanökologie spielen.

Abb.1. Salmonellatyphimurium MAE97exprimiert Zellulose. ImGegensatz zum Ausgangs-stamm MAE52 wurde inMAE97 die Biosynthese derdünnen, aggregativenFimbrien durch Inaktivie-rung der Strukturgeneausgeschaltet. Der FarbstoffCalcofluor bindet selektivan die Zellulosefibern.Vergrößerung x 600.

Fig.1. Salmonella typhimu-rium MAE97 expressescellulose. In contrast to thewild type MAE52 the bio-genesis of thin aggregativefimbriae had beeninactivated in MAE97. Thedye Calcofluor bindsselectively to cellulose fibers.Magnification x 600.ht).

94Highlights from Research and Development Research Area: Pathogenicity Research


Surface colonization by biofilm producingbacteria causes hard to fight infections inmedical settings as well as contamination ofproducts from industrial fermenters. Membersof the Enterobacteriaceae belong to themicroorganisms that frequently cause noso-comial infections. In many cases nosocomialinfections are caused by biofilm producingbacteria, for example, in catheter-relatedcystitis. The analysis of biofilm formation withrespect to regulation and structural compo-nents is a prerequisite to develop rationalstrategies against biofilm-forming bacteria. Itis one of our goals to elucidate the structuralcomponents of biofilm-forming Salmonellatyphimurium and Escherichia coli.

Bacteria in biofilms are embedded in a selfproduced extracellular matrix. The matrix isused by the bacteria for adherence on surfacesas well as a structural component in the ownmulticellular community. Production ofmatrix components by biofilm-forming S.typhimurium can be followed by the growthof the cells on agar plates containing the dyeCongo red. Colony morphology anddifferential absorption of Congo red detectsdifferent matrix components. Genetic andphenotypic analyses had already shown thatthere are at least two extracellular matrixcomponents, thin aggregative fimbriae beingone of them. Using transposon mutagenesisgenes of the bcsABZC (bacterial cellulosesynthesis) operon were identified to benecessary for the biogenesis of the so farunknown second extracellular matrixcomponent. Based on the homology with thecellulose biosynthesis operon in Acetobacterxylinus we could show by genetic andchemial analysis that cellulose is the secondcomponent of the extracellular matrix ofbiofilm-forming S. typhimurium (Fig. 1).Besides S. typhimurium we could show thatalso Salmonella enteritidis, E. coli as wellas Klebsiella pneumoniae produce cellulose.According to common knowledge, cellulosewas considered to be produced only by few soilbacteria such as Agrobacterium tumefaciensand rhizobia. We could show for the first timethat cellulose is also produced by pathogenicand commensal microorganisms playing animportant role in the ecology of human beings.

Identification of cellulose as an extracellular matrix componentof biofilm-forming Salmonella typhimurium

Publications ❘ VeröffentlichungenRömling U, Tümmler B (2000) Achieving100% typeability of Pseudomonasaeruginosa by pulsed-field gel electrophoresis.J Clin Microbiol 38:464-465.

Römling U, Rohde M, Olsen A, Normark S,Reinköster J (2000) AgfD, the checkpoint ofmulticellular and aggregative behaviour inSalmonella typhimurium regulates at leasttwo independent pathways. Mol Microbiol36:10-23.

Römling U (2001) Genetic and phenotypicanalysis of multicellular behaviour inSalmonella typhimurium. In: MethodsEnzymol 336:48-59.

Zogaj X, Nimtz M, Rohde M, Bokranz W,Römling U (2001) The multicellularmorphotypes of Salmonella typhimurium andEscherichia coli produce cellulose as thesecond component of the extracellular matrix.Mol Microbiol 39:1452-1463.

Neue Wirkstoffe (SP 3)

97

Koordinator ❘ Coordinator:Prof. Dr. G. Höfle ❘Abt. Natur-stoffchemie ❘ Dept. of NaturalProduct Chemistry

Für die Bekämpfung von Krankheiten undzum Schutz von Mensch, Tier und Nutz-pflanzen vor Mikroorganismen, Parasitenund anderen Schädlingen steht uns heuteeine Vielzahl von Wirkstoffen zur Verfügung.Dessen ungeachtet gibt es noch zahlreicheKrankheitsbilder, die nicht oder nur unzu-reichend behandelt werden können, wiez.B. Krebs oder bestimmte Trypanosomen-Infektionen. Die Antibiotikatherapie hatzunehmend mit Resistenzentwicklung zukämpfen, wie z.B. bei Tuberkulose undLungenentzündung. Ähnliches gilt für Proto-zoeninfektionen, vor allem Malaria. Auchim Pflanzenschutz ist diese Entwicklungzu beobachten, wo ebenfalls Pilze undInsekten zunehmend gegen etablierte Wirk-stoffe resistent werden. Dies und der gestei-gerte Anspruch an Effektivität und Sicher-heit von Medikamenten sowie Umweltver-träglichkeit von Pflanzenschutzmittelnerfordern eine ständige Suche nach undEntwicklung von neuen Wirkstoffen.

Viele der heute eingesetzten Wirkstoffe,besonders in der Humanmedizin, sindNaturstoffe, Derivate von Naturstoffenoder synthetische Analoga. Mikroorganis-men waren und sind eine reiche Quellefür Antibiotika, liefern aber auch mehrund mehr Substanzen mit pharmakologi-schem Potential. Deren Entdeckung wirddurch eine große Zahl inzwischen entwik-kelter biochemischer und molekularbiolo-gischer Tests ermöglicht. Im Projekt Biologie,Chemie und Genetik mikrobieller Wirkstof-fe werden neue Mikroorganismen als Pro-duzenten gesucht, Sekundärstoffe isoliert,ihre Struktur und ihr Wirkmechanismusaufgeklärt. Nach Entwicklung geeigneterProduktions- und Aufarbeitungsverfahrenwerden die Substanzen an Industriepartnerabgegeben, um dort auf Anwendung inMedizin und Pflanzenschutz geprüft zuwerden. Weitere Ziele sind die Aufklärungder Biosynthese sowie die chemische Modi-fikation und Synthese analoger Strukturenmit verbesserten Eigenschaften.

Durch die Verknüpfung genetischer undbiochemischer Ansätze soll der Zugang zuNaturstoffen bzw. „Quasi-Naturstoffen“ermöglicht werden. So sollen z. B. soge-nannte stille myxobakterielle Biosynthe-secluster aktiviert werden, indem Bakterien-stämme genetisch verändert werden.Alternativ können komplette Stoffwechsel-wege in andere Wirtsorganismen übertra-gen werden. Eine als Biokombinatorikbezeichnete Strategie soll ebenfalls zurBildung einer Vielzahl von neuartigen,möglicherweise biologisch aktivenSubstanzen führen.

Ganz andere Wege zu neuen Wirkstof-fen werden im Projekt KombinatorischeMolekülrepertoires beschritten. Grundlageist hier das biologische Prinzip der empi-rischen Suche in einer großen Vielfalt anmöglichen Wirkstoffstrukturen mit Hilfeevolutiver und kombinatorischer Verfah-ren. Auf molekularbiologischem Wegkönnen durch stochastische oder gezielteMutagenese sehr viele (um 109) Peptid-varianten erzeugt werden. Mittels der ander GBF weiterentwickelten Phagemid-Display-Genbanken lassen sich darausVarianten mit besonders fester Bindung anwichtige Zielstrukturen aussondern. Diekombinatorische chemische Synthese istebenso in der Lage sehr große Zahlen vonMolekülvarianten (insbesondere Peptideund Oligonucleotide) zu erzeugen. Indiesem Fall sind auch unnatürliche Vari-anten mit Bausteinen, die in der Naturnicht vorkommen, zugänglich. DieseMolekülsammlungen (Bibliotheken)werden auf biologische Aktivität hindurchsucht aber auch für systematischeStudien über die Gesetzmäßigkeitenmolekularer Wechselwirkungen und zurIdentifizierung unbekannter zellulärerZielmoleküle eingesetzt (funktionelleGenom- und Proteomanalyse). Diechemische Herstellung umfangreicherMolekülbibliotheken nutzt das Prinzipder Festphasensynthese und dafür werdenauch neue Verfahren und Trägermateriali-en entwickelt.

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Forschungsschwerpunkt: Neue Wirkstoffe

98

A large number of bioactive compounds areavailable today to combat diseases and for theprotection of man, animals and cultivatedplants from microorganisms, parasites andother pests. This notwithstanding, there arestill a very large number of diseases whicheither cannot or can only inadequately betreated, for example cancer and certaintrypanosome infections. Antibiotic therapy isincreasingly being hindered by the development ofresistance, such as in the case of tuberculosisand lung infections. The same problem effectsprotozoan infections, in particular malaria.A similar picture is apparent in agriculture,where fungi and insects are increasinglybecoming resistant to established activeingredients. This together with growingdemands on the effectivity and safety ofpharmaceuticals, as well as on the environ-mental compatibility of pesticides, drive thecontinuous search for and development of newactive substances.

Many of the active substances used today,in particular in human medicine, are naturalproducts or from these chemically synthesisedderivatives. Microorganisms have been andstill are a rich source of antibiotics, but arealso capable of delivering more and moresubstances with pharmacological potential.Their discovery is made possible by a largenumber of recently developed biochemical andmolecular-biological tests. The Project Biology,Chemistry and Genetics of New BioactiveCompounds from Microorganisms focuses onthe search for new microorganisms asproducers, as well as on the isolation ofsecondary metabolites and elucidating theirstructures and mechanisms of action.Following development of suitable productionand isolation methods the substances aretransferred to partners in industry in order tohave them tested for applications as medicinesand pesticides. Other objectives are theelucidation of the mode of action and thebiosynthesis including molecular genetics.Structure-acitivity relationships are investi-gated for compounds of practical interest bychemical modification and synthesis ofanalogs with the aim of optimisation of usefulproperties.

Bioactive Compounds (SP 3)

The employment of a combination of geneticand biochemical approaches raises the hope toincrease the availability of new naturalproducts and/or their derivatives. Onepossibility is to activate silent biosyntheticgene clusters of myxobacterial origin, either bygenetically engineering producer strains orby expressing biosynthetic pathways in foreignhosts. Another strategy, known ascombinatorial biosynthesis, should lead to theformation of a variety of new substances withmodified structures and possibly novelbiological activity.

Complementary to this classical approach,the project Combinatorial MolecularRepertoires is taking different paths to arriveat novel active substances. Based on thebiological principle of empirical search, alarge diversity of molecular structures isproduced and screened for biological activityusing evolutive and combinatorial procedures.In the molecular-biological approach, the useof stochastic and targeted mutagenesis is ableto generate plenty of (around 109) peptide/protein variants. By using phagemid-displaygene banks, further developed at the GBF,those variants with particularly high affinityof binding to important biological targetmolecules can be selected. Combinatorialchemical synthesis is also capable of producingvery large numbers of molecular variants (inparticular peptides and oligonucleotides). Inthis case, access is gained also to unnaturalstructures containing chemical componentswhich do not occur in nature. These molecularcollections (compound libraries) are tested fortheir biological activity and are also used insystematic investigations of the priniciples ofbiomolecular interactions as well as for theidentification of unknown cellular targetmolecules (functional genome- and proteome-analysis). The chemical generation of largemolecular libraries is based on solid phasesynthesis and in this regard new processes andcarrier materials have also been developed.

Highligts from Research and Development Research Area: Bioactive Compounds

Biologie, Chemie und Genetik mikrobieller Wirkstoffe(SP 3.1)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Forschungsschwerpunkt: Neue Wirkstoffe99

Projektleiter ❘ Project leader: Prof. Dr. H. Reichenbach ❘ Abt. Naturstoffbiologie ❘ Dept. ofNatural Product Biology

Projektmitarbeiter ❘ Project members: Y. Elnakady, E. Forche, K. Gerth, H. Irschik, B. Kunze, H. Reichenbach,F. Sasse

Neue VerbindungenWir konnten wieder eine Reihe neuerSubstanzen isolieren. Produzenten warenhauptsächlich Sorangium-, Cystobacter- undArchangium-Stämme, aber auch beiPolyangium und neuerdings beiNannocystis- und Corallococcus-Stämmentreten interessante Verbindungen auf. Dieletzten beiden Gattungen waren bishernicht sehr ergiebig, was insofern bedauer-lich war, als wir von beiden um 1500Stämme besitzen. Durch ein direktesScreening auf Apoptose-Inhibitorenwurden bei diesen Organismen einigeneue Aktivitäten gefunden, die aber nochgenauer charakterisiert werden müssen.Fertige Strukturen liegen vor vonChlotonil, einer extrem lipophilenchlorierten Verbindung aus einemSorangium; den Cyrmeninen aus einerneuen Cystobacter-Art, die Hefen undHyphenpilze hemmen sowie die Zellat-mung blockieren; der Ferruginsäure auseinem anderen Cystobacter. Tichunal auseinem Sorangium ist bemerkenswert durchseinen Aufbau aus Isopren-Einheiten, wasbei Bakterien selten vorkommt. DieAurofurone kommen bei Archangium undStigmatella vor. Aus der neuen Myxobak-terienart Byssophaga cruenta wurde nachCruentaren und Fulmenon noch eine dritteVerbindung, ein Peptolid isoliert. AusNannocystis wurden zwei Substanzen mit

Biologie mikrobieller Wirkstoffe

ungewöhnlichen Strukturelementenerhalten, aus Sorangium ein neues Disorazol(Z), ein Pyrazin-Derivat und eineMyxalamid-Variante. Letztes ist insofernbemerkenswert, als Myxalamide bishernur bei Stämmen der UnterordnungCystobacterineae gefunden wurden, undwir mit Ausnahme von Pyrrolnitrin nieeine Überlappung der Sekundärstoff-muster der beiden Unterordnungen beob-achtet haben. Bei einem Cystobacter wurdeein neues Rhizopodin entdeckt. InBearbeitung ist unter anderem eine hoch-aktive antibakterielle Substanz aus einemneuen Cystobacter, eine Aktivität gegenMycobacterium aus einem Sorangium, zweiKomplex I Inhibitoren aus Polyangium.

WirkmechanismenFür einige Myxobakteriensubstanzenkonnten sehr interessante Wirk-mechanismen nachgewiesen werden.Apicularen hemmt spezifisch die Wirbel-tier-V-ATPase, ebenso Archazolid; beideVerbindungen zeigen in Zellkulturen einidentisches Schadbild, so dass man diesenWirkmechanismus anscheinend daranerkennen kann (Abb. 1, A, B, C). Ratjadonblockiert wie das Leptomycin selektiv denCRM1-Proteintransporter, der für denExport aus dem Zellkern in dasCytoplasma verantwortlich ist. DieSubstanz ist extrem toxisch: Der IC

50-Wert

Im Berichtszeitraum wurden 600 Stämme von Myxobakterien für unser Screening neuisoliert. Außer Tests mit verschiedenen Bakterien, Pilzen und tierischen Zellen wurdenauch Enzym- und Rezeptortests durchgeführt. Die Tests mit lebenden Zellen haben denVorteil, dass sie die Wechselwirkungen mit tausenden von Enzymen und Zellstrukturenanzeigen. Außerdem wurden Kulturextrakte durch HPLC-Analysen charakterisiert undsolche Verbindungen isoliert, die durch neuartige Peaks auffielen. Alle neu gefundenenVerbindungen wurden in ausreichender Quantität isoliert und gingen in Sekundär-screenings bei Industriepartnern. In einigen Fällen führten positive Resultate zu einerweiteren Bearbeitung.

Highlights from Research and Development Research Area: Bioactive Compounds 100

in Zellkulturen liegt um 40 bis 100 pg/ml.Ratjadon führt in Zellkulturen zu einerstarken Vergrößerung der Zellkerne, einEffekt, der möglicherweise für diesenWirkmechanismus typisch ist underlauben würde, weitere solche Substan-zen zu entdecken (Abb. 2). Disorazolerwies sich als Hemmstoff der Tubulin-Polymerisation und führt auch zu einerDepolymerisation existierenderMikrotubuli.

Weitere AktivitätenDie Biosynthese von Epothilon wurde mitbiochemischen Methoden untersucht.Dabei wurde festgestellt, dass das inanderen Labors aus Sequenzanalysenabgeleitete Syntheseschema in die Irreführt. Details finden sich in zwei Publika-tionen (Gerth et al., 2000, 2001).

An Chemikalienfirmen wurden fürwissenschaftliche Zwecke Stigmatellin undMyxothiazol abgegeben. Wir sind dieeinzige Quelle für diese wichtigenForschungschemikalien. Hilfreich für dieProduktion von Myxobakteriensubstanzenerwies sich die Beobachtung, dass vieleStämme bei 25° besser produzieren alsbei 30° .

Abb. 1. A, B, C. Archazolid,eine Verbindung, die ausMyxobakterien isoliertwurde, führt bei Säuger-zellen zu den gleichen Verän-derungen wie Concanamycin,einem bekannten Inhibitorder V-ATPase. Nach Immun-fluoreszenzfärbung vonGRP-94, einem Markerpro-tein des EndoplasmatischenReticulums, erkennt man inden behandelten Beutel-rattenzellen Vesikel, die teil-weise runde Schollen diesesProteins enthalten. DieZellkerne wurden mit einemDNA-Farbstoff blau gefärbt.Abb. 1, A: Kontrolle;Abb. 1, B: Archazolid;Abb. 1, C: Concanamycin

Fig. 1. A, B, C. Themyxobacterial compoundarchazolid causes the samestructural changes inmammalian cells asconcanamycin known as aninhibitor of V-ATPase. Inpotoroo cells the markerprotein of the endoplasmaticreticulum, GRP-94, wasimmunofluorescence stained.Vesicles, which sometimescontain clods of that protein,can be seen in treated cellsbut not in the control. Thecell nuclei are stained bluewith a DNA stain.Fig. 1, A: control;Fig. 1, B: archazolid treated;Fig.1, C: concanamycintreated cells.

New compoundsAgain we were able to isolate a series of newsubstances. The producers were mainlySorangium, Cystobacter and Archangiumstrains, but also Polyangium and, since

Biology of Bioactive Compounds

recently, Nannocystis and Corallococcusstrains yielded interesting compounds. Thelatter two genera were not particularlyproductive so far, which was regrettablebecause we have 1500 strains of each. In a

Biology and Chemistry of Microbial Bioactive Compounds(SP 3.1)

Over the past 12 months 600 strains of myxobacteria have been isolated for our screening. Besidetests using various types of bacteria, fungi and animal cell lines, enzyme and receptor tests wereperformed. The use of living cells has the advantage that interactions with thousands of enzymesand cell components can be seen at the same time. Culture extracts were further characterized byHPLC analyses allowing to isolate compounds that produced new peaks. All new compoundsdiscovered by us were produced in sufficient quantities to be included in secondary screenings withindustry partners. In several cases positive results led to further research

Abb. 2. Ratjadon induziertbei Säugerzellen eineVergrößerung der Zellkerne.Mausfibroblasten (L929)wurden mit steigendenKonzentrationen vonRatjadon A inkubiert. NachFixierung der Zellen wurdendie Zellkerne mit DAPIangefärbt und über einedigitale Bildauswertungvermessen.

Fig. 2. Ratjadon induces inmammalian cells anenlargement of the cellnuclei. Mouse fibroblast-likecells (L929) were incubatedwith increasing concen-trations of ratjadon A. Afterfixation of the cells thenuclei were stained withDAPI and their size wasdetermined by digital imageanalysis.

direct screening for inducers of apoptosis wefound several new activities with thoseorganisms, which, however, are still to becharacterized. Established structures areavailable of chlotonil, an extremely lipophilic,chlorinated compound from a Sorangiumstrain; of the cyrmenins isolated from a newCystobacter: they inhibit yeasts and hyphalfungi and interfere with cellular respiration;ferruginic acid from another Cystobacterstrain. Tichunal, obtained from a Sorangium,is unusual by its composition of isoprene units,which is rare among bacteria. The aurofuronsare found in Archangium and Stigmatella.In addition to cruentaren and holmenon, athird new compound, a peptolide, was isolatedfrom one strain of the new myxobacterialspecies, Byssophaga cruenta. Two newsubstances with unusual structural elementswere obtained from Nannocystis; a newdisorazol (Z) from a Sorangium; a pyrazinecompound and a new myxalamid, again fromSorangium. The latter case is of interestbecause myxalamids up to now were alwaysfound only in strains of the suborderCystobacterineae and, with the exception ofpyrrolnitrin, we never observed an overlap ofthe patterns of secondary metabolites betweenthe suborders of myxobacteria. A newrhizopodin was discovered in a Cystobacter.Presently we work on a highly active anti-

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Forschungsschwerpunkt: Neue Wirkstoffe101Ze

llker

ng

röß

e (µ

m2 )

Konzentration (ng/ml)

Ratjadon A

0,1

0

50

1 10

100

150

200

250

bacterial substance from a new Cystobacter,an activity against Mycobacterium from aSorangium, and two complex I inhibitorsfrom a Polyangium.

Mechanisms of actionVery interesting mechanisms of action havebeen demonstrated for several myxobacterialcompounds. Apicularen blocks specifically V-ATPase of vertebrates, as does archazolid. Bothcompounds lead in cell cultures to an identicaldamage (see Fig. 1, A, B, C), so that thismechanism of action appears to be reliablyrecognizable by this phenotype. Ratjadon, likeleptomycin, blocks selectively the CRM1transporter, which is responsible for the exportof proteins from the nuclear space into thecytoplasm. The substance is extremely toxic,with IC

50 values in cell cultures between 40

and 100 pg/ml. Ratjadon results in cellcultures in a substantial increase in size of thecell nucleus (Fig. 2), which effect is possiblytypical for that mechanism of action andcould allow to discover more compounds ofthat type. Disorazol is a new inhibitor oftubulin polymerisation and also results indepolymerisation of microtubuli.

Other activitiesThe biosynthesis of epothilone was investi-gated by biochemical methods. It was foundthat the scheme of synthesis derived by otherpeople from sequence analyses of the gene waserroneous. Details can be found in twopublications (Gerth et al., 2000, 2001).

Stigmatellin and myxothiazol wereproduced for scientific purposes and suppliedto drug companies. We are the only source forthose important research tools. Theobservation that many myxobacterial strainssynthesize secondary metabolites better at25°C than at 30° may be helpful forproduction processes.

Publications ❘ VeröffentlichungenGerth K, Steinmetz H, Höfle G, ReichenbachH (2000) Studies on the biosynthesis ofepothilones. The biosynthetic origin of thecarbon skeleton. J Antibiot 53:1373-1377.

Gerth K, Steinmetz H, Höfle G, ReichenbachH (2001) Studies on the biosynthesis ofepothilones. The PKS and epothilone C/Dmonooxygenase. J Antibiot 54:144-148.


Projektleiter ❘ Project leader: Prof. Dr. G. Höfle ❘ Abt. Naturstoffbiologie ❘ Dept. of NaturalProduct Biology

Projektmitarbeiter ❘ Project members: H. Augustiniak, N. Glaser, R. Jansen, U. Karama, Th. Leibold, M. Schinner, U.Söker, H. Steinmetz, L. Vollbrecht, P. Washausen, S. Wassmann

ArgyrineDie im GBF-Jahresbericht 1996 erstmalsbeschriebenen Argyrine wurden kürzlichals Immunmodulatoren erkannt. Diesveranlaßte uns, Struktur, Stereochemieund chemische Reaktivität diesercyclischen Heptapeptide eingehender zuuntersuchen. Hochaufgelöste C,H-korrelierte NMR-Spektren, sowie Partial-hydrolyse und MS/MS-Sequenzierungergaben übereinstimmend, daß Methoxy-tryptophan in der Sequenz der Amino-säuren bisher falsch angeordnet war. Bei

der Ozonolyse der Argyrine undanschließenden Totalhydrolyse wurdendie beiden Tryptophanbausteine und dieAminoethylthiazolcarbonsäure zuAsparaginsäure bzw. Alanin abgebaut, sodaß ihre Konfiguration durch GC-Analyseleicht ermittelt werden konnte. NachNMR-Untersuchungen nimmt Argyrin Aeine bevorzugte Lösungskonformationein, in der die NH-Protonen von Ala, Trpund Thiaz stabil in Wasserstoffbrückeneingebunden und die beiden Indolrestegestapelt angeordnet sind. Neben den

Chemie mikrobieller Wirkstoffe

bereits früher isolierten HauptkomponentenArgyrin A und B wurden in größerenFermenteransätzen auch Strukturvariantengefunden, die an C-6 des Thiazolbausteinsstatt einer Methylgruppe Wasserstoff odereine Hydroxymethylgruppe tragen, denendie Methoxygruppe im Tryptophan fehltoder die eine zusätzliche Methylgruppe imangrenzenden Pyrrolring tragen. DieDerivatisierung der Argyrine mit nukleo-philen und elektrophilen Reagenziengreift erwartungsgemäß am Dehydro-alanin bzw. Methoxytryptophan an.

VarnalamideAus dem Archangium Stamm Ar 3468wurden zwei Haupt- und zwei Neben-metabolite isoliert, die aus biogenetischerSicht aus einem N-Acyldipeptid hervor-gehen. Während die HauptkomponentenA und B Alaninol bzw. 2-Aminobutanolam Carboxyterminus tragen, ist bei C undD in einer offenbar nachgeschaltetenReaktion die endständige Methylgruppehydroxyliert worden. Totalhydrolyse undGC-Analyse ergab für beide Amino-alkoholbausteine (S)-Konfiguration.

Die chemische Bearbeitung mikrobieller Wirkstoffe konzentrierte sich im Berichtsjahr2000/2001 auf die Tubulinhemmstoffe, Epothilon und Tubulysin, die Fungizide vomMelithiazoltyp und die immunsupressiv wirkenden Argyrine. Von den aus Myxobakterienneu isolierten Substanzen konnten sieben in der Struktur aufgeklärt werden. Cyrmenin,Haprolid, Pyrronazol und Salidien stellen neue Grundstrukturen dar, die Pyrazinone ausSo ce1052, die Aurafurone und Cyferinsäure neue Strukturvarianten bereits bekannterNaturstoffe.


MaltepolideDie Maltepolide A - E bilden eine aus demSorangium cellulosum Stamm So ce1485isolierte Gruppe von 20-gliedrigenMakroliden. Sie werden abhängig von denKulturbedingungen in unterschiedlichenVerhältnissen gebildet. Biogenetischer

Vorläufer für alle Maltepolide scheint dasBisepoxid E zu sein, das zum Haupt-produkt wird, wenn bei der Kultivierungund Isolierung schwach basischeBedingungen eingehalten werden. Bei derKultivierung des Organismus bei pH 6,5wird das C-11,C-12 Epoxid durch eineintramolekulare vinyloge Addition der 17-OH Gruppe geöffnet, wobei als Haupt-produkte Maltepolid A und B entstehen.

EpothilonderivateBei der semisynthetischen Abwandlungder Epothilone haben wir uns in denvergangenen Jahren zunehmend auf dieThiazolseitenkette konzentriert, in dereine Vielzahl von funktionellen Gruppenohne Aktivitätsverlust toleriert wird.Neben einer Verbesserung der pharma-

kologischen Eigenschaften, strebten wirauch Derivate als Sonden fürbiochemische Unterschungen, z. B. zurPhotoaffinitätsmarkierung derTubulinbindestelle an. Da die üblichenphotoreaktiven Gruppen einen zu hohenRaumanspruch haben, mußten wir denbereits vorhandenen Thiazolring zumAufbau eines geeigneten Chromophorsheranziehen. Ausgehend von Epothilon Bkonnten wir in fünf Stufen über EpothilonF das 21–Aldehydhydrazon erhalten.Dieses ergibt bei der Oxidation mitNickelperoxid 21-Diazoepothilon B (1),das zum Teil zum tautomeren Triazolo-thiazol 2 cyclisiert. Das Gleichgewichts-gemisch der beiden Verbindungen besitzteine hohe cytotoxische Aktivität, mit λmax

285 nm einen ausreichend langwelligenUV-Chromophor und zerfällt beimBelichten vermutlich über das C-21Carben.

KulkenonAus dem Sorangium cellulosum Stamm Soce1426 wurde eine mäßig toxische,Kulkenon genannte Substanz isoliert undals neuartiges 26-gliedriges Makrolididentifiziert. Nach Fütterungsexperi-menten mit 13C-angereicherten Vorläufernwird das Polyketid aus 7-Acetat- und 5-Propionateinheiten und einem vermutlichaus dem Leucinabbau stammenden 3-Methylbutyrat-Starter aufgebaut.Bemerkenswert ist, daß C-25 in diesemStarter auch signifikant durch [1,2-13C

2]

Acetat angereichert wird.


ArgyrinsThe argyrins described for the first time in theGBF Annual Report 1996 have recently beenidentified as immunomodulators. Thisinduced us to investigate the structure,stereochemistry and chemical reactivity ofthese cyclic heptapeptides more thoroughly.High-resolution C,H-correlated NMR spectraas well as partial hydrolysis and MS/MSsequencing unanimously showed thatmethoxytryptophane has been wronglyarranged in the sequence of the amino acidsin the past. In the ozonolysis of the argyrinsand subsequent total hydrolysis, the twotryptophane building blocks and theaminoethyl thiazole carboxylic acid aredegraded to aspartic acid and alanine, so thattheir configuration was easily determined byGC analysis. According to NMRinvestigations, argyrin A prefers a solutionconformation in which the NH protons of Ala,Trp and Thiaz are stably incorporated intohydrogen bonds and the two indole residuesare stacked. In addition to the majorcomponents, argyrin A and B, already isolatedearlier, structural variations were also foundin larger fermenter batches, which carryhydrogen or a hydroxymethyl group instead ofa methyl group at C-6 of the thiazole buildingblock. Others lack the methoxy group in thetryptophane or carry an additional methylgroup in the pyrrole ring of tryptophane. Asexpected, the derivatization of the argyrinswith nucleophilic and electrophilic reagentsattacks preferentially the dehydroanaline andmetoxytryptophane residues.

VarnalamidesFrom the Archangium strain 3468 two majorand two minor metabolites were isolatedwhich, from biogenetic considerations,originate from an N-acyl dipeptide. Whereasthe major components A and B carry alaninoland 2-aminobutanol at the carboxy terminus,respectively, the terminal methyl group hasbeen hydroxylated in C and D in an obviously

Chemistry of Bioactive Compounds from Microorganisms

subsequent step. Total hydrolysis and GCanalysis proved (S) configuration for bothamino alcohol building blocks.

MaltepolidesThe maltepolides A-E form a group of 20-membered macrolides isolated from theSorangium cellulosum strain So ce1485.They are formed in different proportionsdepending on the culture conditions. Thebiogenetic precursor of all maltepolides seemsto be bisepoxide E, which is predominantlyfound when weakly basic conditions aremaintained during cultivation and isolation.Cultivating the organism at pH 6.5, inducedring opening of the C-11,C-12 epoxide by anintramolecular vinylogous addition of the 17-OH group producing maltepolide A and B asthe main product.

Epothilone DerivativesIn the semi-synthetic modification of theepothilones, we have increasingly concentratedon the thiazole side chain in the past fewyears, in which a large number of functionalgroups are tolerated without loss of activity.Apart from an improvement of thepharmacological properties we also aimed atderivatives as probes for biochemicalinvestigations, e.g. for photoaffinity labellingof the tubulin binding site. Since the usualphotoreactive groups require to much space,we had to use the already existing thiazolering for construction of a suitablechromophore. Starting from epothilone B, weobtained the 21-aldehyde hydrazone in fivesteps via epothilone F. Oxidation of thehydrazone with nickel peroxide, produced 21-diazoepothilone B (1), which cyclizes intotautomeric triazolothiazol (2). Theequilibrium mixture of the two compoundsshows high cytotoxic activity, a sufficientlylong-wave UV chromophore of λ

max 285 nm,

and is degraded on irradiation presumablythrough the C-21 carbene.

In the research period 2000/2001, work focused on the chemistry of the tubulin inhibitors,epothilone and tubulysin, the fungicides of the melithiazol type and the immunosuppressivelyacting argyrins. In addition, we isolated and elucidated the structure of seven groups of secondarymetabolites from new strains of myxobacteria. Cyrmenin, haprolid, pyrronazol and salidienrepresent new basic structures, whereas the pyrazinones from So ce1052, the aurafurones andcyferinic acids are new structural variations of already known natural products.

KulkenonFrom the Sorangium cellulosum strain Soce1426 a moderately toxic substance namedkulkenon was isolated and identified as anovel 26-membered macrolide. After feedingexperiments with 13C-enriched precursors, thepolyketide is constructed of 7 acetate and 5propionate units and an isobutyrate starterpresumably originating from leucinedegradation. It is also remarkable to note thatC-25 in this starter unit is significantlyenriched by [1,2-13C

2]acetate.

Publications ❘ VeröffentlichungenJansen R, Kunze B, Reichenbach H, Höfle G(2000) Antibiotics from Gliding BacteriaLXXXVI, Apicularen A and B, Cytotoxic 10-membered Lactones with a Novel Mechanismof Action from Chondromyces Species(Myxobacteria): Isolation, StructureElucidation, and Biosynthesis. Eur J OrgChem 6:913-919.

Hardt IH, Steinmetz H, Gerth K, Sasse F,Reichenbach H, Höfle G (2001) NewNatural Epothilones from Sorangiumcellulosum, Strains So ce90/B2 and Soce90/D13: Isolation, Structure Elucidation,SAR-Studies. J Nat Prod 64:847-856.


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. R. Frank ❘ Arb.Gr. Molekulare Erkennung ❘ Res. GroupMolecular Recognition

Projekmitarbeiter ❘ Project members: K. Bialek, J. Butz, S. Daenicke, A. Dikmans, R.. Frank, C. Hultschig, B. Kornak,Y. Melberg, K. Michaelis, M. Morr, S. Pilawa, W. Tegge, N. Zander; J. Eichler, V. Klaukien, H. Overwin, G. Höfle, J.Niggemann, J. Collins, N. Horn, D. Stellfeld, W. Westphal

Ein neuentwickelter hochspezifischerInhibitor für das Enzym cGPK ist aktivin vivo

Der in der letzten Ausgabe vorgestelltepeptidische membrangängige Inhibitor fürdie cyclo-GMP-abhängige Proteinkinase I“(cGPK) wurde jetzt für die Untersuchungder physiologischen Bedeutung dieseswichtigen Enzyms eingesetzt. Das inhibi-torische Peptid unterdrückt zum Beispieldie durch cGPK bewirkte Relaxation vonglatten Muskelzellen, die aus der Harn-blasenwand einer Ratte präpariert wurden.

Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Methoden zur Bestimmung genomischerMethylierungsmuster

Die AG Molekulare Erkennung ist Partnerin einem mit 5,3 Mio. DM vom BMBFgeförderten Verbundprojekt mit der FirmaEpigenomics AG. In diesem Projekt solleine neue diagnostische Methode

Abb.1. Peptid-induzierteKontraktion einer glattenMuskelzelle: vor (A) und30 sec nach (B) Zugabe desPeptids.

Fig.1. Peptide-inducedcontraction of a smoothmuscle cell: prior to (A) and30 sec after (B) addition ofthe peptide

entwickelt werden, mit der das individuellspezifische Muster von Methylcytosinen(der „fünften DNA-Base“) kompletterhumaner Genome erfasst, dokumentiertund interpretiert werden kann. Eininternationales Konsortium, the HumanEpigenome Consortium, hat bereitsbegonnen die Methylierungsmuster vonDNA aus gesunden Gewebeproben zubestimmen. Wir werden unsere Erfahrun-gen in der miniaturisierten parallelenchemischen Synthese einbringen. Insbe-sondere wird ein neuentwickeltes, dasCompactDisc-Format nutzendes Synthese-gerät (s. Abb. 2) eingesetzt werden. Damitsollen systematische Anordnungen(Arrays) von so genannten Fän-germolekülen auf Basis von PNA (Poly-amid-Nucleinsäure) für den Analyse-prozess zur Verfügung gestellt werden.

Neue Nachwuchsgruppe „Konformatio-nelle Protein-Ligand-Interaktionen“

Protein-Ligand-Interaktionen sind diemolekulare Grundlage praktisch allerbiologischen Prozesse. Das Design unddie Herstellung synthetischer Moleküle,die aufgrund ihrer molekularen Architek-tur in der Lage sind, konformationelldefinierte Proteinbindungsstellennachzuahmen, ist eine aussichtsreicheStrategie für die Erforschung von Protein-struktur und -funktion. Mit diesemProjektkonzept hat Frau Dr. Jutta Eichlerden Zuschlag für eine der begehrtenBiofutur-Förderungen erhalten. Seit 1. Juli2001 wird dieses Projekt im Rahmen einereigenständigen Nachwuchsgruppe an derGBF durchgeführt.

Neben der grundlegenden Bedeutungfür das Verständnis von Protein-Ligand-Interaktionen sind die konzipiertensynthetischen Proteinmimetika auchKandidaten für neue therapeutische unddiagnostische Strategien und anderebiomedizinische Anwendungen.

A

B


Kombinatorische Molekülrepertoires (SP 3.2)


Abb. 2. CD-Scheibe mit 2500kleinen Reaktionstropfenfür die parallele chemischeSynthese.

Fig. 2. CD-body with 2500small droplets for theparallel chemical synthesis.

Publications ❘ VeröffentlichungenDostmann WRG, Taylor MS, Nickl CK,Brayden JE, Frank R, Tegge WJ (2000)Highly specific, membrane-permeant peptideblockers of cGMP- dependent protein kinase Ialpha inhibit NO-induced cerebral dilation.Proc Natl Acad Sci U S A 97:14772-14777.

Hawlisch H, Müller M, Frank R, Bautsch W,Klos A, Köhl J ((2001) Site-specific anti-C3areceptor single-chain antibodies selected bydifferential panning on cellulose sheets. AnalBiochem 293:142-145.

A novel highly specific peptidic inhibitorfor the enzyme cGPK is active in vivo

The last report presented a newly developedmembrane-permeable peptide which inhibitshighly specifically the cyclo-GMP dependantprotein kinase I“ (cGPK). This inhibitorypeptide was now utilized for the investigationof the physiological role of this importantenzyme. As shown in Figure 1, the peptidecan suppress the relaxation effect mediatedby the cGPK in smooth muscle cells from raturinary bladder, resulting in a rapid cellcontraction.

Development of a new high-throughputtechnology for mapping genomicmethylation patterns

GBF´s research group for MolecularRecognition is a partner in a new joint projecttogether with the company Epigenomics AG,funded with about 5.3 Mio. DM by theGerman ministry for science and education(BMBF). The project´s aim is to develop anovel medical diagnostic method which willenable to detect, document and interpret theindividual patterns of methylated cytosines(„DNA´s fifth base“) of complete humangenomes. An international consortium ofhigh-ranking scientists, the HumanEpigenome Consortium, has already started toreveal the methylation patterns of DNA fromhealthy tissues. To this project we willcontribute our expertise in the miniaturizedparallel chemical synthesis. In particular, anewly developed synthesizer will be utilized toprovide CompactDisc-formatted arrays of socalled capture molecules based on PNA(polyamide nucleic acids) (Fig. 2.).

New junior research group for „Con-formationally defined Protein-Ligand-Interactions“

Protein-ligand interactions are the molecularbasis for almost all biological prosesses inliving cells and organisms. Many of theseinteractions involve binding sites that aredefined by the three dimensional structure ofthe folded protein chain. The design andpreparation of synthetic molecules that areable to mimic such conformationally definedprotein binding sites through their specialarchitecture is a promising strategy for theinvestigation of protein structure andfunction. For this project concept, Dr. JuttaEichler recently received one of the veryprestigious and well funded Biofuture awards.Since 1st of July 2001, this project is the topicof an independent junior research group.

Besides the importance for the basicunderstanding of protein-ligand interactions,the conceptual synthetic protein mimics arevaluable candidates for the development ofnew diagnostic and therapeutic principles aswell as for other biomedical applications.

Combinatorial Molecular Repertoires (SP 3.2)


Molekularbiologie der Sekundärstoffbildung inMyxobakterien (SP 3.3)

Projektleiter ❘ Project leader: Dr. S. Beyer ❘ Priv. Doz. Dr. R. Müller ❘ Nachwuchsforscher-gruppe Molekularbiologie der Myxobakterien ❘ Junior Research Group Molecular Biology ofMyxobacteria

Projekmitarbeiter ❘ Project members: H. Blöcker, N. Gaitatzis, A. Hans, J. Knauber, B. Kunze, G. Nordsiek, A.Sandmann, B. Silakowski, S. Weinig

Werkzeuge für die Untersuchung desSekundärstoffwechsels

Mittlerweile konnten 8 potenzielleBiosynthesegencluster für Sekundärstoffein dem Genom von S. cellulosum So ce90identifiziert werden. Offensichtlichschöpft dieser Stamm nicht sein komplet-tes Potenzial zur Bildung von Sekundär-stoffen aus, denn bisher sind nur zweiSubstanzgruppen, die Epothilone und dieSpirangiene, beschrieben worden. Um dienicht exprimierten Sekundärstoffbiosyn-thesegencluster aus diesem Stamm sowieaus anderen Myxobakterien auf ihreFunktionalität hin überprüfen zu können,werden zur Zeit heterologe Systeme für dieExpression von Stoffwechselwegen inverschiedenen Wirtsstämmen entwickelt.Zum Beispiel lassen sich mit Hilfe einervon uns aus Stigmatella aurantiaca klonier-ten Phosphopantetheinyltransferase(MtaA) typische Sekundärstoffwechsel-enzyme wie Polyketidsynthasen (PKS)und Polypeptidsynthetasen (NRPS)posttranslational in ihre entsprechendenHolo-Formen überführen. Auf diese Weisekönnen PKSs und NRPSs verschiedenenUrsprungs auch in E. coli in enzymatischaktiver Form exprimiert werden. Darüberhinaus wurde St. aurantiaca DW4/3-1genetisch so verändert, dass das Einkreu-zen von Fremdgenen mit Hilfe gängigerPlasmidvektoren einfacher vonstatten

geht. Dieser Stamm wird nun u. a. fürPromotorstudien und für die Überprüfungneuer Resistenzgenkassetten fürMyxobakterien eingesetzt.

Molekulare Grundlagen des Eisen-transports in Myxobakterien

Die Verfügbarkeit von Eisen ist für ver-schiedene Stoffwechselprozesse in Mikro-organismen essentiell. Deshalb produzie-ren sie sogenannte Eisenchelatoren, dieals niedermolekulare Substanzen ausge-schieden werden, hochspezifischextrazelluläres Eisen (Fe3+) binden unddann als Komplex aktiv wieder in die Zelleaufgenommen werden. Die Biogenesenvon Eisenchelatoren werden häufig vontypischen Sekundärstoffenzymen (PKSund/oder NRPS) bewerkstelligt. Währendunseres genetischen Screenings aufsolche Enzyme in St. aurantiaca fanden wirein hypothetisches Eisentransport-Regulon. Anhand des Aufbaus der vonder DNA-Sequenz abgeleiteten Enzymekonnte ein Strukturvorschlag für dasdazugehörige Biosyntheseproduktvorgenommen werden. So wurde an-genommen, dass dieses Regulon für dieSynthese eines Siderophors vomCatecholtyp, wie z. B. Myxochelin, verant-wortlich ist. Diese Hypothese wurdenachfolgend in Kooperation mit der AGHöfle bestätigt. Mutanten des zugehörigen

Myxobakterien wurden an der GBF bereits über Jahre als effiziente Quelle für Naturstoffemit biologischer Aktivität etabliert. Darüber hinaus weist diese Bakteriengruppe einenkomplexen Lebenszyklus auf und besitzt eine Reihe von Eigenschaften, die sonst nurvielzelligen Organismen zugeschrieben werden. Wir befassen uns mit der Molekularbiolo-gie der Naturstoffbiosynthese sowie deren Regulation. Ferner stellt sich die Frage derFunktion solcher Sekundärstoffe innerhalb des Lebenszyklus von Myxobakterien. DieseSubstanzen spielen wahrscheinlich nicht nur als „biologische Abwehrstoffe“, sondernauch bei der Aufnahme von Spurenelementen und wahrscheinlich auch bei Kommuni-kationsprozessen eine Rolle. Durch ein Genomprojekt soll die Grundlage gelegt werden,um diese komplexen Netzwerke untersuchen zu können. Als Modellorganismus wurdedafür der Stamm Sorangium cellulosum So ce56 ausgewählt.


Biosynthese-Regulons verlieren dieFähigkeit, Myxochelin zu produzierenund müssen mit Eisen supplementiertwerden. Von besonderem Interesse bei derBiosynthese dieser Substanz ist hier einneuer, reduktiver Mechanismus zurAbtrennung des Syntheseprodukts vomEnzym MxcG. Zur biochemischenCharakterisierung der dafür verantwort-lichen Enzymdomäne wurde der ausinsgesamt sieben Modulen bestehendeMyxochelin-Synthetase-Multienzym-komplex zusammen mit MtaA heterologin E. coli exprimiert. Aktivitätstestszeigten, dass die drei Proteine MxcEFGausreichend sind, um auch in vitro dieseaufwendige Mehrstufensynthese aus-zuführen.

Biosynthese des Elektronentransport-Inhibitors Myxalamid

Eine ähnliche Reduktionsdomäne wie inMxcG fanden wir in der Hybrid-PKS/NRPS, die für die Biosynthese derMyxalamide verantwortlich ist. DiesesSystem repräsentiert eine der wenigenbislang charakterisierten Biogenesen, beidenen PKS und NRPS eng miteinanderwechselwirken müssen. Es stellt damiteinen idealen Kandidaten zum Studiumder Interaktion zwischen diesen beidenProteintypen dar. Zudem werden für denStart der Biosynthese ungewöhnlicheBausteine verwendet. Die dafür verant-wortlichen Enzymdomänen bzw. Genewerden nun für kombinatorische Ansätzemit Genen aus Actinomyceten verwendet.

Development of tools for the study ofsecondary metabolism

Eight different biosynthetic gene clusterspotentially encoding machineries forsecondary metabolite formation have beenfound in the genome of S. cellulosum So ce90.Obviously, this strain does not use its completepotential to produce natural products, becauseonly two substance groups (spirangiens andepothilons) have been described from S.cellulosum So ce90 so far. In order to test thefunctionality of non-expressed gene clusters,heterologous expression systems for differenthost strains are currently being developed. Forexample, the enzyme MtaA can be used toactivate secondary metabolic enzymes likepolyketide synthases (PKS) and non ribosomalpolypeptide synthetases (NRPS) viaphosphopantetheinyl transfer in E. coli. Thecorresponding gene mtaA was originally

cloned from Stigmatella aurantiaca.Additionally, St. aurantiaca DW4/3-1 wasgenetically altered in a way that facilitates theintroduction of foreign genes via cross-overusing standard cloning plasmids. Thegenerated strain is now being used forpromoter activity studies and to test newresistence markers for myxobacteria.

Molecular basis of iron transport inMyxobacteria

The availability of iron is essential for anumber of biochemical processes in micro-organisms. The need to secure a constant ironsupply makes the cells produce so called ironchelators. These are low molecular masssubstances, which are secreted and specificallybind extracellular iron. The chelator-Fe3+

complex is then actively transported back intothe cell. The biosynthesis of iron chelators is

Molecular Biology of Secondary Metabolites in Myxobacteria(SP 3.3)

Myxobacteria have been established as a valuable source for natural products with biologicalactivity at the GBF. In addition, these bacteria are characterised by a very complex life cycle andresemble multicellular organisms. We are working on the molecular biology of natural productbiosynthesis and its regulation. In many cases, the function of secondary metabolites in theirnatural context remains obscure. Some are obviously used as „biological protecting agents“, othersare needed for the uptake of essential nutrients. They might even play a role in communicationprocesses. A genome project has been started in the middle of 2001 in order to lay the groundworkto study such complex regulatory networks, which connect the various cellular processes inmyxobacteria. Sorangium cellulosum So ce56 is used as model organism.


Publications ❘ VeröffentlichungenSilakowski B, Kunze B, Nordsiek G, BlöckerH, Höfle G, Müller R (2000) Themyxochelin iron transport regulon of themyxobacterium Stigmatella aurantiaca Sga15. Eur J Biochem 267:6476-6485.

Gaitatzis N, Hans A, Müller R, Beyer S.(2001) The mtaA gene of the myxothiazolbiosynthetic gene clusterfrom Stigmatellaaurantiaca DW4/3-1 encodes aphosphopantetheinyl transferase that activatespolyketide synthases and polypeptidesynthetases. J Biochem 129:119-124.

Silakowski B, Nordsiek G, Kunze B, BlöckerH, Müller R (2001) Novel features in acombined polyketide synthase/non-ribosomalpeptide synthetase: The myxalamidbiosynthetic gene cluster of the myxobacteriumStigmatella aurantiaca Sg a15. Chem Biol8:59-69.

often achieved by proteins typical forsecondary metabolism (PKS; NRPS). Duringour genetic screening for such systems in St.aurantiaca, we isolated a hypothetical irontransport regulon, which was analysedbioinformatically resulting in a moleculestructure prediction for the chelator.Subsequently, the predicted myxochelin-typeiron chelator was identified from this strain ina collaboration with Drs. Kunze (NBI) andHöfle (NCH). Mutants of the gene clustercannot produce myxochelins and have to befed with iron or myxochelin in order to growunder iron limiting conditions. A new type ofreductive chain release from the NRPSinvolved is of special interest, because it seemsto be a general mechanism used in PKS andNRPS. In order to biochemically characterisethe responsible domain within themyxochelin-megasynthetase, the completecomplex, comprising seven active domains,was heterologously co-expressed with MtaA inE. coli (see above). Activity assays show thatthe three proteins MxcEFG alone are sufficientto produce myxochelin in vitro.

Biosynthesis of the electron transportinhibitor myxalamid

A comparable chain release mechanism isperformed during the biogenesis of themyxalamids. A reduction domain similar tothe one in MxcG was identified in the hybridPKS/NRPS responsible for myxalamidbiosynthesis. The system is one of the fewexamples known to date, in which PKS andNRPS interact to form a natural product,which makes it an ideal candidate to studycommunication between both protein types. Inaddition, unusual starter units are used formyxalamid biosynthesis, which are currentlyunder investigation for combinatorialbiosynthesis with genes from actinomycetes.

Umweltbiotechnologie (SP 4)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Forschungsschwerpunkt: Umweltbiotechnologie111

Koordinator ❘ Coordinator:Prof. Dr. K. N. Timmis ❘ Abt.Umweltmikrobio-logie ❘ Dept.of Environmental Microbiology

Mikroorganismen sind ubiquitär; indemsie Umweltbedingungen tolerieren, die fürhöhere Organismen viel zu extrem sind,definiert ihr Lebensraum die Biosphäre.Mikrobielle Aktivitäten beeinflussen inhohem Maße sowohl globale Prozesse(z.B. den Kohlenstoffkreislauf und dieglobale Erwärmung) als auch lokaleProzesse (z.B. verursachen sie Krankheitenbei Mensch und Tier; stellen essentielleNahrung für Pflanzen und Tiere zurVerfügung). Mikroben üben, positiv wienegativ, auf vielfältige Weise einenkritischen Einfluß auf den Menschen undseine Aktivitäten aus: einige von ihnensind verantwortlich für den Großteil dermenschlichen Krankheiten und Sterblich-keit, wohingegen andere uns wiederumAntibiotika zur Verfügung stellen umKrankheiten zu behandeln, wieder anderespielen eine wichtige Rolle bei derReinigung unserer Umwelt von organi-schen Abfallprodukten. Ein großer Teil derBiotechnologie basiert auf Mikroben undihren Produkten. Unsere Fähigkeit,mikrobielle Aktivitäten zu beeinflussen,um größeren Nutzen aus den positiven zuziehen und die Auswirkungen dernegativen zu verringern, setzt ein Ver-ständnis dafür voraus, wie Mikroben inihren Habitaten leben und funktionierenund wie ihre Aktivitäten gesteuert werden.

Die klassische Mikrobiologie befaßtsich mit dem Studium von Reinkulturen,die unter Laborbedingungen wachsen. Inder Natur jedoch wachsen Mikroben inkomplexen, diversen und dynamischenGemeinschaften, deren Mitgliederinteragieren und die verfügbaren Ressour-cen auf komplexe Weise teilen. Es sinddiese Interaktionen sowie die Interaktio-nen mit anderen biotischen undabiotischen Komponenten des Habitats,die die Aktivitäten der Gemeinschaftbestimmen. Zur Zeit haben wir keinallgemeines Verständnis dieser Interaktio-nen. Die Ziele des Forschungs-schwerpunktes Umweltbiotechnologiebestehen darin, mikrobielle Gemeinschaf-ten als funktionelle Einheiten zu verste-hen, kritische Interaktionen, die die

Aktivitäten von Gemeinschaften steuern,aufzudecken, Interventionen zu entwik-keln und zu validieren, die zu substantiel-len Erhöhungen von biotechnologischinteressanten Aktivitäten führen, sowie,durch Exploration der mikrobiellenDiversität, neue mikrobielle Produkte undStoffwechselaktivitäten zu entdecken.Multiskaliger (Gen, Organismus, Gemein-schaft; Reagenzglas, Chemostat, natürli-ches Habitat) und multidisziplinärerAnsatz (mikrobielle Ökologie, Physiolo-gie, Phylogenetik, Biochemie, analytischeChemie, Genetik/Genomik, Bioinformatikund Modellbildung) charakterisieren denForschungsschwerpunkt. Wenn diegewonnenen Erkenntnisse auch allgemeinfür die meisten Arten mikrobiellerGemeinschaften anwendbar werden, sofokussiert sich unsere Forschung aufmikrobielle Gemeinschaften, die Umwelt-schadstoffe verstoffwechseln können, sodaß ein wichtiges Ziel des Schwerpunktesdarin besteht, einen Schlüsselbeitrag zurnachhaltigen Entwicklung unsererGesellschaft zu leisten.

Highlights from Research and Development Research Area: Environmental Biotechnology 112

Enviromental Biotechnology (SP 4)

Microorganisms are ubiquitous and, becausethey can tolerate environmental conditions fartoo extreme for higher organisms, theirhabitats define the biosphere. Microbialactivities profoundly influence both globalprocesses (e.g. the carbon cycle and globalwarming) and local ones (e.g. they causediseases in plants and animals; provideessential nutrients for plants and animals).Microbes critically impact human beings andtheir activities positively and negatively in amultitude of ways: some are responsible forthe greater portion of human disease andmortality, whereas others provide us withantibiotics to treat disease, and yet others playa critical role in cleansing our environment oforganic wastes. Much of biotechnology isbased on microbes and their products. Ourability to influence microbial activities, inorder to obtain greater benefit from positiveones and to diminish the effects of negativeones, requires an understanding of howmicrobes live and function in their habitats,and how their activities are regulated.

Classical microbiology focusses on the studyof pure cultures growing under laboratoryconditions. However, microbes in nature growas complex, diverse and dynamiccommunities, the members of which interactand share available resources in complex ways.It is these interactions, and interactions withother biotic and abiotic components of their

environment, that determine communityactivities. At present we have no generalunderstanding of such interactions. The goalsof the Environmental Biotechnology researchprogramme are to understand microbialcommunities as functional units, to elucidatethe critical interactions that regulatecommunity activities, to develop and validateinterventions that result in substantiveincreases in activities of biotechnologicalinterest, and to discover new microbialproducts and metabolic activities by exploringmicrobial diversity. A multi-scale (gene,organism, community; test tube, chemostat,natural habitat) and multi-disciplinary(microbial ecology, physiology, phylogeny,biochemistry, analytical chemistry, genetics/genomics, bioinformatics, and modelling)approach characterises the researchprogramme. Though the results obtained willbe generally applicable to most types ofmicrobial community, our research focusses onmicrobial communities that metaboliseenvironmental pollutants, and an importantgoal of the programme is to make keycontributions to the sustainable developmentof our society.

Biodegradation organischer Schadstoffe (SP 4.1)


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. D. Pieper ❘ Arb. Gr. Biodegradation ❘ Res. Group ofBiodegradation

Projekmitarbeiter ❘ Project members: H.-A. Arfmann, H. Görres, I. Hinner, B. Hofer, P. Nikodem, K. Pollmann,P. Rapp, P. Rosenbrock, C. Strömpl,

Abbau von polychlorierten Biphenylen(PCBs)

Biphenyldioxygenasen (BDOs) sindSchlüsselenzyme des aeroben PCB-Abbaus. Wir konnten zeigen, dass dieBDO aus Burkholderia sp. LB400 verschie-dene 2,2’-substituierte Biphenyle (Fluor-,Chlor-, Brom-, Nitro-, Hydroxy-) bevor-zugt in den Positionen 2 und 3 angreift,welches zur Eliminierung jeweils einesdieser Substituenten führt (Seeger et al.,2001). Der elektronenziehende Effektdieser Substituenten scheint dieDioxygenierung zu begünstigen, was füreinen nucleophilen Charakter des Angriffsspricht. Die Ergebnisse stützen ferner dieAnsicht, dass die Oxidationen von Pheno-len durch aromatische Ringe hydroxy-lierende Dioxygenasen nicht das Resultateiner Mono-, sondern einerDioxygenierung sind. Ein von 2,2’-Dihydroxybiphenyl ableitbares Derivatstellt Dibenzofuran dar. Die anguläreDioxygenierung von Dibenzofuran, diezum weiteren Abbau dieses Schadstoffesführt, entspräche dem bei 2,2’-Dihydroxybiphenyl gefundenen 2,3-Angriff. Tatsächlich werden Dibenzofuransowie auch Dibenzodioxin von dieserBDO analog angegriffen. Dies zeigt, dassauch einige Biphenyl Dioxygenasen zurangulären Dioxygenierung fähig sind.

Abbau geringer Schadstoffkonzen-trationen

Schadstoffe sind in der Umwelt oft ingeringen aber ökologisch relevantenKonzentrationen vorhanden, und eswurde beschrieben, dass sogenannteGrenzkonzentrationen vorhanden sind,unterhalb derer oft kein mikrobiellerAbbau erfolgt. Wir charakterisierten nundetailliert den Abbau geringer Konzentra-tionen an 1,2,4-Trichlorbenzol durchBurkholderia sp. PS14, ein Stamm, dersogar nanomolare Konzentrationen diesesStoffes ohne signifikante Rest-konzentration verstoffwechseln kann. Beiso geringen Konzentrationen an 1,2,4-Trichlorbenzol wurde eine Beziehung1.Ordnung zwischen der Umsatzrate undder Substratkonzentration mit einerspezifischen Affinität von 0,32 l pro mgbakterieller Trockenmasse und Stundebeobachtet. Bei höheren Substrat-konzentrationen wurde eine Beziehungerster Ordnung mit höherer Affinitätermittelt. Dieses läßt vermuten, dassBurkholderia sp. PS14 zwei unterschiedli-che Aufnahme- oder Transformations-systeme für Chlorbenzole besitzt (Rapp,im Druck).

Ziel des Projektes ist die Aufklärung metabolischer Wege und Netzwerke und somit dermikrobiellen Diversität zum Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe. Das Verständnismikrobieller Fähigkeiten auf molekularer Ebene erlaubt die Identifizierung und experi-mentelle Überwindung von Engpässen des Abbaus und die Entwicklung molekularerWerkzeuge zur Bestimmung von metabolischem Potential und Aktivität in situ (Pieper undReineke, 2000).


Metabolische Netzwerke in Chloraroma-ten abbauenden Mikroorganismen

Es wird generell angenommen, dass dermikrobielle Abbau von Chloraromatendurch lineare Abbauwege erfolgt und nurwenige speziell angepasste katabolischeOperons für das Einschleusen dieserVerbindungen in zentrale Stoffwechsel-wege verantwortlich sind. Neue Untersu-chungen des pJP4-Plasmides des Chlor-aromaten verstoffwechselnden StammesRalstonia eutropha JMP134 zeigten, dassneben den dokumentierten Genen zumAbbau zentraler Chlorbrenzcatechine (tfdModul I), auf diesem Plasmid ein zweitesSet entsprechender Gene lokalisiert ist(tfd Modul II). Die von uns entwickeltenDerivative von JMP 134, die sich in dervorhandenen Anzahl an Modulen unter-schieden, wiesen deutlich verschiedenePhänotypen auf und differierten sogar imSpektrum an mineralisierbaren Substraten(Perez-Pantoja et al., 2000). Diesesverdeutlicht, dass für unterschiedlichsubstituierte Chloraromaten verschiedene„Gendosierungen” notwendig sind. BeiLokalisierung auf einem multi-copyPlasmid führte sowohl die Übertragungdes Moduls I als auch des Moduls II ingeeigneten Empfängerstämmen zu 3-Chlorbenzoat mineralisierenden Deriva-ten. Allerdings unterschieden sich, auf-grund der verschiedenen kinetischenParameter der kodierten Schlüsselenzyme,die Derivate signifkant hinsichtlichWachstumsgeschwindigkeit und Ausbeute.Die Akkumulation von Zwischenproduk-ten bewirkt die zusätzliche Induktionchromosomal lokalisierter Gene desAromatenstoffwechsels, so dass dieMineralisierung eines Teils des Substratesdurch ein Wechselspiel zwischen plasmid-und chromosomal kodierten Enzymenerfolgt. Dieses zeigt, dass ein komplexesmetabolisches Netzwerk für dieMineralisierung von Chloraromaten in R.eutropha JMP 134 verantwortlich ist.

Abb. 1. Abwasserkanal, dersowohl das Abwasser ausder Separation der Kaffee-bohnen von der Schale alsauch Fermentationsab-wasser erhält. Ein mehrereZentimeter dicker Biofilm,der Hefen und Bakterienenthält, ist zu erkennen.

Fig. 1. Wastewater channelreceiving both depulpingand fermentation wastewater during processing ofcoffee beans. A biofilm, afew centimeters thick andconsisting of yeasts andbacteria, is visible.

Biofilme in Abwässerkanälen der Kaffee-produktion

In Zusammenarbeit mit dem Colegio dela Frontera Sur, Mexico, untersuchten wirdie am in situ Abbau des Abwassers derKaffeeproduktion beteiligte mikrobielleGemeinschaft. Hierzu wurden Proben dessich in den Abwässerkanälen entwickeln-den Biofilms entnommen und Mikroorga-nismen, die zentrale Komponenten desAbwasser abbauen können, isoliert.Repräsentative Abbauer, von denen einigebisher unbeschriebene katabolischeFähigkeiten aufweisen, wurden durchSequenzierung der 16S rRNA Gene und“fingerprinting” (T-RFLP) charakterisiert.Nahezu alle Chlorogenat abbauendenOrganismen gehörten zum GenusAcinetobacter, und die meisten Proto-catechuat- und Gallat-Abbauer zum GenusKlebsiella. Von beiden Genera ist bekannt,dass sie pathogene Organismen beinhal-ten. T-RFLP-Analyse der direkt aus demBiofilm extrahierten 16S-rDNA zeigte,dass mit Klebsiellen verwandte Stämmegenerell in Biofilmen, die von verschiede-nen mit Abfall der Kaffeeproduktionbelasteten Standorten gewonnen wurden,dominant sind. Die unkontrollierteEntwicklung solcher Biofilme kann somitals Quelle potentiell pathogener Mikroor-ganismen betrachtet werden.


Degradation of polychloronatedbiphenyls (PCBs)

Biphenyl dioxygenases (BDOs) are keyenzymes of the aerobic degradation of PCBs.We have shown that the BDO ofBurkholderia sp. LB400 attacks various 2,2’-substituted biphenyls (fluoro-, chloro-, bromo-,nitro-, hydroxy-) preferentially at C-2 and C-3 (Seeger et al., 2001). This unusual attackresults in unstable intermediates, whichspontaneously rearomatize with concomitantelimination of the substituent. Obviously, theelectron withdrawing effect of the substituentsfavours this kind of dioxygenation, supportingthe notion of a nucleophilic dioxygenationmechanism. The results further indicate thatthe oxidation of phenols by dioxygenases isactually the result of a di- rather than amonooxygenation. The angular dioxygenationof dibenzofuran can be regarded to be similarto the dioxygenolytic attack at an unsubstitutedand a hydroxysubstituted neighboured carbonatom. Indeed, we could prove angular attackat dibenzofuran and dibenzo-p-dioxin byLB400 BDO, showing that members of thebiphenyl dioxygenases can perform such areaction.

Degradation of low concentrations ofpollutants

Pollutants in the environment are oftenpresent in low but ecologically relevantconcentrations and often threshold concen-trations, i.e. concentrations below which nodegradation occurs, have been described. Weanalyzed in detail the kinetics of degradationof low concentrations of 1,2,4-trichlorobenzeneby Burkholderia sp. PS14, a strain capable totransform even nanomolar concentrations ofthis pollutant. We could observe a first orderrelationship between transformation rate andthe substrate concentration with a specificaffinity of 0.32 l / mg (bacterial dryweight)/h at substrate concentrations in thenanomolar range. At higher substrateconcentrations we observed a first orderrelationship with a higher specific affinity.

This indicates the presence of two differentsubstrate uptake and/or transformation systemsin Burkholderia sp. PS12 (Rapp, in press).

Metabolic networks in pure cultures ofchloroaromatic degraders

Bacterial mineralization of chloroaromatics isusually assumed to be achieved by linearpathways where just a few adapted catabolicoperons are responsible for channeling thesubstrate into the central Krebs cycle. Recentanalysis of plasmid pJP4 of the chloroaromaticdegrading Ralstonia eutropha JMP134revealed, beside well described chlorocatecholgenes (tfd module I), the presence of a secondset of chlorocatechol genes (tfd module II).Derivatives of JMP 134 could be obtained,which differed in the amount of “modules”present and exhibited clearly distinctphenotypes, even in the range of substratesthat can be mineralized, evidencing thatdifferent “gene dosages” were necessary todegrade differently chlorosubstituted aromatics(Perez-Pantoja et al., 2000). Like module I,module II was capable to equip recipientorganisms with a 3-chlorobenzoatemineralizing phenotype when supplied inmulti-copy. However, growth yield and ratevaried significantly, which can be explained bythe different kinetic parameters of the keyenzymes encoded on the modules. Significantaccumulation of pathway intermediates, isassumed to trigger the induction ofchromosomal genes involved in aromaticdegradation. Mineralization of part of thesubstrate is then achieved by interplaybetween chromosomal and plasmid encodedenzymes. Those results evidence that acomplex metabolic network is responsible forchloroaromatic degradation in R. eutrophaJMP 134.

Biodegradation of organic pollutants (SP 4.1)

The goal of the project is to elucidate metabolic pathways and networks and thus the microbialdiversity for the degradation of aromatic hydrocarbons. Understanding microbial capabilities at themolecular level allows identification and experimental alleviation of bottlenecks and thedevelopment of molecular tools to assess metabolic activities and potential in situ (Pieper andReineke, 2000).


Publications ❘ VeröffentlichungenPerez-Pantoja D, Guzman L, Manzano M,Pieper DH, Gonzalez B (2000) Role oftfdCIDIEIFI and tfdDIICIIEIIFII gene modulesin catabolism of 3-chlorobenzoate byRalstonia eutropha JMP134(pJP4). ApplEnviron Microbiol 66:1602-1608

Pieper DH, Reineke, W (2000) Engineeringbacteria for bioremediation. Curr OpinionBiotechnol 11:262-270

Seeger M, Cámara B, Hofer B (2001)Dehalogenation, denitration, dehydroxylationand angular attack of substituted biphenylsand related compounds by a biphenyldioxygenase. J Bacteriol 183:3548-3555

Rapp P (2001) Multiphasic kinetics oftransformation of 1,2,4-trichlorobenzene atnano- and micromolar concentrations byBurkholderia sp. strain PS14. Appl EnvironMicrobiol, in press

Biofilms in channels receiving coffee-processing waste water

In collaboration with Colegio de la FronteraSur, Mexico, we analyzed the microbialcommunity involved in degradation of coffeewaste in situ. Samples of biofilms were takenfrom a waste channel and microorganismscapable to degrade central components of thewastewater were isolated by direct plating toavoid enrichment artifacts. Typicalrepresentatives, some of them exhibiting notyet described catabolic properties, werecharacterized by sequencing of the 16S rRNAgenes and fingerprinting (T-RFLP) based onanalysis of the intergenic 16S-23S-spacerregion. Nearly all chlorogenate degraderscould be shown to belong to the genusAcinetobacter, whereas most protocatechuateand gallate degraders belong to subgroups ofthe genus Klebsiella. Both genera are knownto comprise pathogenic organisms. T-RFLP-analysis of 16S-rDNA directly isolated fromthe biofilm showed, that Klebsiella relatedorganisms were generally dominant inbiofilms sampled from different coffee wastelocations. The uncontrolled development ofsuch biofilms could be thus a source ofpotentially pathogenic organisms.

Abb. 2. Produkte desUmsatzes von 2,2´-disubsti-tuierten Biphenylen und vonDibenzofuran durch dieBiphenyl Dioxygenase ausBurkholderia sp. LB400.

Fig. 2. Products formedduring transformationof 2,2´-disubstitutedbiphenyls and ofdibenzofuran byBurkholderia sp. LB400biphenyl dioxygenase.

OHOH

OH

O

OH

OH

OHOH

O

2,2-Dihydroxy-biphenyl

Dibenzo-furan

C1OH

OH

C1C1

2,2-Dichloro-biphenyl

-O2NOH

OH

-O2NNO2-

2,2-Dinitro-biphenyl

Mikrobielle Entsorgungsverfahren (SP 4.2)


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. V. Hecht ❘ Arb.Gr. Umweltbioverfahrenstechnik ❘ Res. GroupEnvironmental Biochemical Engineering

Projekmitarbeiter ❘ Project members: E. Belal, H. Biebl, L. Bischoff, T. Gäbel, R.-J. Müller, J. Nothnagel, S. Rühe,A. Samuels, H. Schrader, M. Shalaby, K. Welzel

Abbau von SchadstoffenDer Abbau aromatischer Verbindungenerfolgt oft über ein komplexes metaboli-sches Netzwerk, in dem Parallelreaktionen,Transportlimitierungen und verschiedeneInhibitionen (feed foreward, feed back) auf-treten können. Die Entwicklung effizienterAbbaustrategien für einzelne Kompo-nenten erfordert nicht nur die Kenntnisdes genauen Abbauweges, sondern auchder Dynamik aller die Geschwindigkeitder Gesamtreaktion bestimmenden Schritte.Neben experimentellen Techniken kommtder dynamischen Modellierung besondereBedeutung zu, um das komplexe System-verhalten beschreiben und vorhersagen zukönnen. Für den Chinolinabbau (Cuma-rin-Weg) durch Comamonas acidovoranskonnten wir ein mathematisches Modellentwickeln, dass den Abbau unter verschie-denen Kultivierungsbedingungen und -tech-niken einschließlich der unter bestimmtenBedingungen temporär auftretenden Abbau-wegintermediate gut beschreiben kann.Da hierzu eine Vielzahl von möglichenModellstrukturen zu prüfen waren, wurdeauf der Basis genetischer Programmierungein spezieller Algorithmus zur Strukturer-kennung und Datenanpassung entwickelt.

Weitere laufende Projekte umfassenUntersuchungen zum Einfluß leicht-verwertbarer Substrate auf die Effizienzund Vollständigkeit des Schadstoffabbaus.Als Modellsystem dient hier der simultaneAbbau von Phenol, Benzoat und Azetat.In Zusammenarbeit mit dem BereichMikrobiologie wird der Abbau von 4-Chlorsalicylsäure durch ein Konsortiumvon 4 Bakterienstämmen untersucht. Zielist die Erstellung eines mathematischenReaktionsmodells, um synergistische Wechsel-

wirkungen der beteiligten Stämme unddie Dynamik dieses Abbaus aufzuklären.

1,3-PropandiolAls Rohstoff für die 1,3-Propandiol-gewinnung wird zunehmend das bei derAlkoholgärung als Nebenprodukt anfal-lende Glycerin diskutiert. In Zusammenar-beit mit einem Industriepartner konntenwir verschiedene, z. T. stark verunreinigteRohglycerine aus der Ethanolproduktionmit hoher Ausbeute mikrobiell zuPropandiol umsetzen.

Bioabbau von KunststoffenGrundlagenuntersuchungen zum Mecha-nismus des biologischen Abbaus von Kunst-stoffen standen im Mittelpunkt der Unter-suchungen. Systematische Abbaustudienverschiedenster definierter Modell-Polyestermit Lipasen zeigten, dass noch vor struktur-spezifischen Aspekten der Esterbindungenselber die Mobilität und Flexibilität derPolymerketten eine ausschlaggebendeRolle hinsichtlich der Abbaubarkeit derMaterialien spielt.

Mit der Zielrichtung einer Optimierungvon Abbauuntersuchungen speziel fürlangsame Abbauprozesse war es möglichdurch Einsatz von Nanopartikeln (Durch-messer 100-200nm ) den Abbau vonPolyestern mittels Lipasen im Bereich vonMinuten und Sekunden zu bestimmen. ImBereich anaerober Mikroorganismen konnteeine Reihe polyesterabbauender Stämmeisoliert und identifiziert sowie in opti-mierten Abbautestverfahren eingesetztwerden. Weiterhin war es erstmals mög-lich, ein anaerobes, polyesterspaltendesEnzymsystem zu lokalisieren und in denGrundlagen zu charakterisieren.

Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung von Verfahrensstrategien für effektive biologischeAbbauprozesse. Dies beinhaltet auch die Entwicklung neuer bioabbaubarer Materialienund die Verwertung von Reststoffen. Im Schwerpunkt des Interesses stehen grundlegendeAspekte wie die Aufklärung von Abbaumechanismen, die Untersuchung der Substrat-struktur/Mikroorganismus-Wechselwirkung (bei Polymeren) sowie die Erkennunglimitierender Teilschritte des Gesamtabbaus.

Highli ghts from Research and Development Research Area: Environmental Biotechnology 118

Degradation of toxic compoundsMicrobial conversion of aromatic compoundsis often embedded in a complex metabolicnetwork, involving parallel reactions, transportlimitations, and different kinds of inhibition(feed back, feed foreward). Design of efficientdegradation strategies requires knowledge ofthe routing of substrates and pathwayintermediates as well as the dynamic of eachsingle rate limiting step. Kinetic modeling inaddition to experimental techniques is apowerful tool to describe and predict thecomplex system behaviour. We investigatedquinoline degradation (coumarin pathway) byComamonas acidovorans and developed adynamic reaction model. This model is able todescribe quinoline conversion under variousculture conditions and different cultivationtechniques including the temporaryaccumulation of pathway intermediates undercertain culture conditions. To cope with thelarge number of possible model structures,which had to be tested, an algorithm forstructure elucidation and data fitting wasdeveloped which is based on geneticprogramming.

Other projects include investigating theinfluence of easy degradable compounds onthe mineralization of toxic compounds.This work is carried out using thesimultaneous degradation of phenol, benzoateand acetate as a model system. In closecooperation with the division of Microbiology,the degradation of 4-chlorosalicylate (4CS) bya community of 4 strains is investigated. Thegoal is to develop a mathematical reactionmodel to elucidate the synergistic interactionsof the different strains and to predict thedynamics of 4CS degradation.

Microbial Degradation Processes (SP 4.2)

The research activities of this project intend to recognize design strategies for efficient microbialdegradation processes. This includes the development of new biodegradable materials as well as theconversion of residues to valuable products. The work is mainly focused on basic research topicssuch as elucidation of degradation mechanisms, the investigation of substrate surface /microorganism relationships (polymers) and the identification of rate limiting steps.

1,3-PropanediolAs a feedstock for microbial production of 1,3-propanediol by-product glycerol from ethanolfermentation processes is presently discussed.In cooperation with an industry partner wewere able to convert several crude glycerolsoriginating from alcohol distilleries sucessfullyto propanediol.

Biodegradation of polymersThe main goal of the research onbiodegradable plastics was to gain more basicinformation about the degradationmechanism of polyesters. Systematicdegradation studies on different, well definedmodel polyesters with lipases showed, thatbeside the ester structure, the mobility andflexibility of the polymer chain itself plays adominant role in controlling biodegradation.Degradation testing could be speeded up in arange of time of some seconds by usingpolyester nano-particles in enzymaticdegradation.

Under anaerobic conditions it was possibleto isolate and identify a number of polyesterdegrading strains and, for the first time, toidentify an anaerobic, polyester-cleavingenzyme.

Publications ❘ VeröffentlichungenBiebl H, Schwab-Hanisch H, Sprör C,Lünsdorf H (2000) Propionispiravibrioides, nov. gen. sp., a new gram-negative, spore-forming anaerobe thatferments sugar alcohols. Arch Microbiol174:239-247

Hecht V, Langer O, Deckwer W-D (2000)Degradation of phenol and benzoic acid in athree phase airlift reactor. Biotechnol Bioeng70:391-399

Müller R-J, Kleeberg I, Witt U, Deckwer W-D(2001) Biodegradation of polyesterscontaining aromatic constituents. J Biotechnol86:87-95

Molekulare mikrobielle Ökologie (SP 4.3)


Projektleiter ❘ Project leader: Dr. W.- R. Abraham ❘ Arb. Gr. Chemische Mikrobiologie ❘Res. Group of Chemical Microbiology

Projekmitarbeiter ❘ Project members: M. Abang, W.-R. Abraham, I. Buchholz, S. Hermann, R. Huppmann,T. Jeschke, E. Surges, P. Wolff, all Research Group Chemical Microbiology; D. Bludau, J. Bötel, I. Brettar,T. Chernikova, S. Eichler, W. Fehr, A. Felske, L. Frese, P. Golyshin, O. Golyshina, E. Haase, S. Heim, V. Heindl,H. Heuer, C. Hoch, M. Höfle, C. Höltje, B. Jung, H. Jungnitz, F. Kaminski, A. Krüger, M. Labrenz, J. Leonhäuser,H. Lünsdorf, M. Martinez, G. Molinari, K. Münch, B. Pauling, V. Pires Martins dos Santos, I. Pöhler, I. Pubantz,D. Regenhardt, I. Sabirova, D. A. Santosa, M. Strocchi, C. Strömpl, M. Sylla, S. Y. Um, I. Wagner-Döbler,A. Wasliczek, R. Weller, D. Wenderoth, K. Wilken, M. Yakimov, all Research Group Microbial Ecology

Die wenigsten Bakterien in der Umweltlassen sich als Reinkulturen im Laborkultivieren und können daher mit denMethoden der klassischen Mikrobiologieuntersucht werden. Zudem leben Mikro-ben in der Natur in komplexen Gemein-schaften und ihre Aktivität resultiert ausvielfältigen Interaktionen zwischen dereneinzelnen Mitgliedern. Die MikrobielleÖkologie befaßt sich mit dem Studiumnatürlicher, mikrobieller Gemeinschaften.Sie identifiziert die Mitglieder der Gemein-schaft, bestimmt deren Aktivitäten unduntersucht deren physiologische Rollen.Zusammen werden diese Informationenein Verständnis ergeben, wie komplexemikrobielle Gemeinschaften in natürli-chen Habitaten funktionieren, und welcheParameter die Aktivitäten der Gemeinschaf-ten regulieren. Die Verwertung hydrophober Substratestellt für Mikroorganismen eine besondereSchwierigkeit dar, da diese Verbindungenwegen ihrer Unlöslichkeit in Wasser nichtbioverfügbar sind. Einige Bakterien produ-zieren daher Lösungsvermittler (Biotenside),welche wie Waschmittel die Oberflächen-spannung des Wassers herabsetzen. Mitdem Lichenysin A, einem zyklischenLipoheptapeptid, haben wir den bisherwirksamsten Vertreter dieser Naturstoff-klasse entdeckt. Die Verbindung wirdnicht-ribosomal synthetisiert und dasdafür verantwortliche Enzym enthältDomänen, welche die einzelnen Amino-säuren des Lichenysin A zusammenfügen.Durch den Austausch einiger dieserDomänen und der Expression des soneukombinierten Gens in Bacillus subtilisgelang es uns, neue Biotenside zu produ-zieren, welche veränderte Tensidaktivitätenund Toxizitäten aufweisen.

Bakterien verstoffwechseln nicht nur dieunterschiedlichsten Substrate, sondernunterliegen ihrerseits wiederum dem Fraß-druck durch andere Mikroben. Wir habenin einem Modellsystem untersucht, welcheunterschiedlichen Mechanismen Umwelt-bakterien entwickeln, um sich vor demFraß durch Protozoen zu schützen. EinigeStämme verändern ihre Zellform undwachsen zu langen Fäden aus, welche vonden Protozoen nicht geschluckt werdenkönnen, andere wiederum schließen sichzu Verbänden zusammen, welche dannzu groß sind, um von den Protozoengefressen zu werden. Die Bildung von größeren Zellaggregatendient aber nicht nur dem Schutz vor Fress-feinden, sondern hat viele Vorteile fürdie Mikroben. Daher lebt der weit über-wiegende Teil der Mikroorganismen inAggregaten, sogenannten „Biofilmen”,zusammen. Zu Biofilmen organisiertweisen Bakterien in der Regel völligandere Eigenschaften auf als in derplanktonischen Form. Hier akkumulierenund tauschen sie Nährstoffe aus, weisenResistenz gegenüber Fressfeinden,Schwermetallen oder Antibiotika auf, umnur einige Beispiele zu nennen. Die Strukturund Funktion solcher interagierendenSysteme zu verstehen, erfordert den Einsatzverschiedener, auf einander abgestimmterTechniken, die zusammen ein Bild deskomplexen Systems Biofilm ergeben. Wirhaben einen integrierten, multidisziplinärenAnsatz zur Untersuchung von Biofilmenentwickelt, welche hydrophobe Verbin-dungen verstoffwechseln. Aus Boden- oderSedimentproben werden auf hydropho-ben Substraten (z. B. PCB) autochthoneBiofilme angezogen und elektronenoptischcharakterisiert. Hier lassen sich die räum-liche Struktur der Biofilme sowie die


Elementverteilungen in ihnen untersuchen.Darüber hinaus wird die organismischeStruktur der bakteriellen Gemeinschaft desgleichen Biofilms mittels der 16S rDNAGensequenzen ermittelt, welche über SSCPaufgetrennt und deren Hauptbanden se-quenziert werden, um eine eindeutigeArtzuordnung zu erreichen. Von denBiofilmen werden Isolate unter selektivenBedingungen gewonnen, die dannwiederum zur Untersuchung von Ergeb-nissen aus der Biofilm-Analyse herangezo-gen werden. Schließlich wird der Gradund die Geschwindigkeit des Substrat-abbaus mittels organisch-chemischerAnalyse bestimmt. Die so erhaltenenInformationen über die Struktur, dieBiodiversität und die metabolischeAktivität des Biofilms ergibt ein völligneues Bild der Interaktion von Bakterienmit hydrophoben Substraten.

In einer Anwendung dieses polypha-sischen Ansatzes wurden in Feldversuchenin sauren Tagebaurestseen (pH 2,7) Auf-wuchskörper eingebracht und währendmehrerer Monate im Wasser zur Ausbil-dung autochthoner Biofilme exponiert(Abbildung). Unsere Untersuchungenergaben, dass die entstandenen Biofilmeeine hohe Biodiversität aufweisen undsich im wesentlichen aus Bakterien derGattungen Acidocella, Acidiphillium,Paenibacillus, Mycobacterium und einigenweiteren Stämmen zusammensetzen, diezu bislang unbekannten Bakterien-gattungen gehören. Die Bakterienreagieren mit den Ionen des Seewassers,denn in den Biofilmen wurden von unsMineralaggregate gefunden, welche sichmorphologisch von denen im See-sediment unterschieden und die durchElementanalyse im Elektronenmikroskopals Schwertmannit identifiziert wurden.Wir konnten damit erstmals nachweisen,dass die Bakterien im Biofilm zurMineralienneubildung in sauren Tagebau-restseen beitragen.

In einem sauren Tagebau-restsee, dessen Wasser durchden hohen Eisengehalt rotgefärbt ist, wird einSchwimmkörper ausge-bracht. Nach ein paarMonaten hat sich ein Biofilmauf den Objekträgern ge-bildet (kleines Bild untenrechts). Die elektronenmi-kroskopische Untersuchungan Ultradünnschnitten zeigtGruppen verschiedenerBakterien und dazwischenfeine Nadeln von Mineral-aggregaten, welchen vonden Bakterien des Biofilmsgebildet wurden (Bild oben

rechts).

A device to grow biofilms isset into an acidic mininglake which is red colored byhigh concentrations of ironions. After several month abiofilm was formed on thesubstrata (small insert, lowerright). Electron microscopyof ultra-thin sectionsrevealed groups of differentbacteria interspersed withfine needles of mineralaggregates formed bybacteria of the biofilm(insert, upper right).


Most bacteria from the environment cannot begrown as pure cultures in the laboratory.Therefore, the methods of classicalmicrobiology to study them cannot be applied.Furthermore, in nature microbes live incomplex communities and their activitiesresult from a multitude of interactionsbetween the different members. Microbialecology deals with the investigation of naturalmicrobial communites. The different membersof the communities are identified, theiractivities determined and their physiologicalroles elucidated. Together, these informationwill give an understanding of how complexmicrobial communities function in theenvironment and which parameters controlthe activities of the communities. The utilization of hydrophobic substratesoffers a special problem for microbes becausethe insolubility of these compounds in waterprevents their bioavailability. Some bacteriareact to this challenge by producingbiosurfactants which like washing powderreduce the surface tension of water. Wediscovered Lichenysin A, the currently mostactive member of this class of naturalcompounds, a cyclic lipoheptapeptide. Its has anon-ribosomal biosynthesis and the responsibleenzyme contains domains which add theindividual amino acids to the growing peptidechain. Exchanging some of these domains andexpressing the newly combined gene inBacillus subtilis we succesfully produced thenew biotensides which possess different tensideactivities and altered toxicities. Bacteria do not only metabolize very diffentsubstrates but are themselves subject to grazingby other microbes. We investigated what typesof mechanism bacteria from the environmentdeveloped to protect themselves from grazingby protozoa in a model system. Some strainschanged their cell forms and grew to largefilaments which cannot be swallowed by pro-tozoa, others aggregated to groups which areas well too large to be fed by other microbes.

The formation of larger cell aggregates doesnot only protect the bacteria from grazers buthas many more advantages for the microbes.Therefore, most microbes live in aggregates, socalled biofilms. Organized to biofilms bacteriausually display a completely different behaviorthan the planctonic form. Here theyaccumulate and exchange nutrients, escape

grazers, or are resistent against heavy metalsor antibiotics, only to mention some aspects.To understand structure and function of suchinteracting systems requires the application ofdifferent and well matched techniques whichcombined give a picture of the complex biofilmsystem. We developed an integrated andmultidisciplinary approach to study biofilmsmetabolizing hydrophobic substrates. Soil andsediment samples were used to grow auto-chthonous biofilms on hydrophobic substrates(e. g. PCB) which were then analysed byelectron microscopy. Here, the spatial structureof the biofilm and the distribution of chemicalelements can be analysed. With the samebiofilm the taxonomic composition of itsmicrobial community is determined using 16SrDNA gene sequences which are separated onSSCP gels with subsequent sequencing of theimportant bands to achieve an unambiguousidentification of the bacterial species. Strainsare isolated under selective conditions fromthe biofilm which are used to analyse resultsobtained from the investigations of the biofilm.Finally, the extent and rate of substratedegradation is determined applying organo-chemical analysis. The combined informationsconcerning the structure, the biodiversity andthe metabolic activity of the biofilm revealed acompletely new picture of the interaction ofbacteria with hydrophobic substrates and thecomposition of the microbial community couldbe correlated with the three-dimensionalstructure of the biofilm and the degradation ofthe substrate.This polyphasic approach was applied in fieldstudies in acidic mining lakes (pH 2,7) whereautochthonous biofilms formed on substrataexposed in the water column for several month(Figure). Our analysis revealed that thebiofilms formed possessed a high biodiversityand were mainly composed of bacteria of thegenera Acidocella, Acidiphillium,Paenibacillus, Mycobacterium and someother strains belonging to hitherto unknowngenera. The bacteria react with ions from thelake water because mineral aggregates werefound in the biofilm and identified asschwertmannite applying elemental analysisin the electron microscope. With this resultwe could demonstrate for the first time thatbacteria in biofilms contribute to the de novoformation of minerals in acidic mining lakes.

Molecular Microbial Ecology (SP 4.3)


Publications ❘ VeröffentlichungenHahn M, Moore ERB, Höfle MG (2000) Roleof microcolony formation in the protistangrazing defense of the aquatic bacteriumPseudomonas sp. MWH1. Microb Ecol39:175-185.

Yakimov MM, Giuliano L, Timmis KN,Golyshin PN (2000) Recombinantacylheptapeptide lychenysin: high level ofproduction by Bacillus subtillis cells. J MolMicrobiol Biotech 2:217-224.

Abraham W-R, Hesse C, Pelz O, Hermann S,Tesar M, Moore E R B, Timmis K N (2001)Sharing of nutritional resources in bacterialcommunities determined by isotopic ratiomass spectrometry of biomarkers. In: Focus onBiotechnology. Applied Microbiology (Eds.Hofman M & Anné J). Vol. 2: (Eds. DurieuxA & Simon J-P), Kluyver, Dordrecht, pp. 143-154.

Lünsdorf H, Strömpl C, Osborn A M, MooreE R B, Abraham W-R, Timmis K N (2001)Approach to analyse interactions ofmicroorganisms, hydrophobic substrates andsoil colloids leading to formation of compositebiofilms, and to study initial events inmicrobiogeological processes. MethodsEnzymol 336:317-331.

Nogales B, Moore ERB, Llobet-Brossa E,Rossello-Mora, R Amann R, Timmis KN(2001) Combined use of 16S rDNA and 16SrRNA to study the bacterial community in aPCB polluted soil. Appl Environm Microbiol67:1874-1884.

Lünsdorf H, Wenderoth D F, Abraham, W.-R.(2001) Microbial consortia in compositebiofilms from acidic mining lakes. Water, Soil,and Air Pollution (Focus), in press.

Bioprozessentwicklung und -validierung (QF 1)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Querschnittsfunktion: Bioprozessentwicklung123

Koordinator ❘ Coordinator:Prof. Dr. W.- D. Deckwer ❘Abt. Prozessentwicklung ❘ Dept.of Process Development

Bioprocess Development and Validation (QF 1)

Zu den Aufgaben dieser Querschnitts-funktion, die die GBF als nationalesForschungszentrum überregional wahr-nimmt, gehört die Durchführung biotech-nologischer Prozesse bis in den Kubikme-termaßstab sowie die Abtrennung undBereitstellung biologisch aktiver Substan-zen. Dies kann gegebenenfalls auch unterGMP-Bedingungen erfolgen. Neben derAbwicklung von Aufträgen und praxisna-hen Prozessentwicklungen durch dieAbteilung Produktionstechnik konzentrie-ren sich die Aktivitäten auf die Weiterent-wicklung des verfahrenstechnischenMethodenspektrums, insbesondere inBezug auf verbesserte Kultivierungsme-thoden und Produktreinigungsverfahrenauf Basis eines quantitativen Verständnis-ses der Zellmaschinerie. Dazu werden inzunehmendem Maße auch die Methoden

The task of this function is to perform bio-technological processes with various organismsup to the scale of several cubic meters. Thisincludes the separation and production ofbiologically active substances, also under GMPcompliances if desired. Production orders andprocess developments were carried out for anumber of scientific and industrial partners.Otherwise, the activities concentrated on thedevelopment of improved product purificationmethods, quantitative cell physiology andmetabolic engineering. Mammalian

des Metabolic Engineering verwendet.Als biologische Systeme werden diebekannten Säuger-Produktionszelllinien(CHO, BHK), Insektenzellen sowiebakterielle Systeme wie E. coli undeukaryontische Expressionssysteme(Hefen, Pilze) eingesetzt. Damit soll eineBasis geschaffen werden, um die geneti-schen und metabolischen Netzwerkesowie deren Regulation und Interaktion inihren wesentlichen Grundzügen zuverstehen und für die Produktion vonGenprodukten, Antikörpern und anderenbiologischen Metaboliten unter verfah-renstechnischen Gesichtspunkten zunutzen. Letztlich ist es Ziel, validierbareModelle für Herstellverfahren technischund medizinisch einsetzbarer Bioproduktezu schaffen und effektive Prozessführungs-und Regelungsstrategien bereitzustellen.

production cell lines, insect cells as well asmicrobial strains were applied for thesepurposes. A major objective is to improve theunderstanding of the genetic and metabolicnetworks as well as their regulation andinteraction. The results will form a rationalefor models of biological production systemswhich will contribute to safe, robust, fast andeconomic transfer of technologies into largerscale and to provide efficient process andcontrol strategies.

Highlights from Research and Development Networking Task: Bioprocess Development 124

Expressions- und Produktionssysteme (QF 1.1)

Projektleiterin ❘ Project leader: PD Dr. U. Rinas ❘ Arb. Gr. Mikrobielle Systeme ❘ Res. GroupMicrobial Systems

Projektmitarbeiter ❘ Project members: U. Bilitewski, J. Cabrera-Crespo, C. Fortmann, M. Ganzlin, B. Henze, F.Hoffmann, S. Marten, H. Schillig, J. Schumacher, L.F. Vallejo, J. van den Heuvel, J. Weber, U. Widow

Proteine aus rekombinanten Mikro-organismen

Erkennung und Überwindung vonEngpässen in der Erzeugung vonbiologisch aktiven Proteinen mit Hilferekombinanter Mikroorganismen: DieArbeiten umfassten zellphysiologischeUntersuchungen an proteinprodu-zierenden Zellen, die mathematischeBeschreibung und modellmäßigeVorhersage der zellulären Vorgänge inReaktion auf die erzwungene Fremdpro-teinsynthese (z.B. Proteom- undStoffflussanalysen) sowie die Entwicklungvon Prozessführungsstrategien zureffizienten Synthese, gegebenenfallsRenaturierung, und Reinigung biologischaktiver (Pharma)proteine vonmikrobiellen Expressionssystemen.

β-Galaktosidase als Biosensor für dieDetektion von anti-HIV Antikörpern inhumanen Seren

Im Rahmen eines von der GBF koordi-nierten und von der Europäischen Uniongeförderten Projekts wurde ein auf Basisdes bakteriellen Enzyms β-Galaktosidasebasierendes chimeres Protein (Insertiondes antigenen Peptids P1 des gp41-Proteins des HIV Virus in β-Galaktosidase)entwickelt, dass erfolgreich für dieDetektion von anti-HIV-Antikörpern inHIV-infizierten Patienten in einemhomogenen Assay eingesetzt werdenkonnte (Abb. 1). Das Detektionsprinzipberuht auf einer partiellen Inaktivierungder enzymatischen Aktivität der β-Galaktosidase durch die Insertion desantigenen Peptids und einer partiellenRückgewinnung der Enzymaktivität durchBindung von Antikörpern an das chimäreProtein.

Abb. 1. Modulation der β-Galaktosidaseaktivität derchimären rekombinantenProteine mit HIV-Epitop-Insertionen in verdünntenSeren (1:40) von fünfverschiedenen HIV-1 (graueBalken) und einem HIV-2infizierten Patienten (ge-streifte Balken) im Vergleichzur Modulation in Anwesen-heit von Anti-P1 monoklo-nalen Antikörperen, 25 ng/µl(schwarze Balken). Eines derchimären Proteine mit einerInsertion des antigenenPeptids P1 mit einer Längevon 35 Aminosäuren an derPosition 795 der nativen β-Galaktosidase aus E. colikonnte für die selektiveDetektion von Antikörpernin den Seren von HIV-1infizierten Patientengenutzt werden. Der Hinter-grund der Abbildung zeigteinen Ausschnitt aus einem3D Modell der chimären β-Galaktosidase mit einerInsertion eines antigenenPeptids (in rot) an derPosition 795 der nativen β-Galaktosidase aus E. coli.

Fig. 1. Modulation of the β-galactosidase activity in thechimeric recombinantproteins containing HIVepitopes using diluted sera(1:40) from five differentHIV-1 (gray bars) and oneHIV-2 infected patient(hatched bars) in com-parison to the modulation inthe presence of anti-P1monoclonal antibody at 25ng/µl (black bars). One ofthe chimeric proteinscontaining an insertion ofthe antigenic peptide P1with the length of 35 aminoacids at position 795 of thenative E. coli β-galactosidasewas proven to selectivelydetect antibodies in the seraof HIV-1 infected patients.The background of thefigure represents a part of a3D model of the chimeric β-galactosidase with anantigenic peptide insertion(in red) at amino acidposition 795 of the nativeE. coli β-galactosidase.


Stabilisierung von ProteinenAm Beispiel der Peroxidase aus Meer-rettich wurde im Rahmen eines von derEU geförderten Projektes die Stabili-sierung von Proteinen sowie die Verbesse-rung der elektrischen Kommunikationzwischen Protein und Elektrode durch denZusatz von Polymeren untersucht. Diebeim Einsatz des Enzyms in Enzym-elektroden und Enzymaktivitätsassaysgewonnenen experimentellen Datenwurden durch Untersuchungen zuVeränderungen der Proteinstruktur unddurch Modellierung der Wechselwirkungzwischen Protein und Polymerunter-einheiten bzw. Elektrodenoberfläche(Zusammenarbeit mit Abt. SF, Dr. Hecht,Dr. Reichelt, Dr. Schmidt) ergänzt. Beieinigen Polymeren, wie zum BeispielPolyethylenimin, ergaben die Modell-rechnungen Wechselwirkungen miteinzelnen Proteinregionen, die wahr-scheinlich vor allem auf Coulomb-Kräftenberuhen, während andere Polymere, wiezum Beispiel DEAE-Dextran oder dieeingesetzten Methacrylate, eherunspezifische Wechselwirkungen mit demgesamten Protein zeigten (Abb. 2). Damitkönnten diese Polymere in der Art einerPaketschnur die Proteinstruktur bewahrenund somit das Protein stabilisieren. EineEnzymstabilisierung wird experimentelltatsächlich vor allem durch die beidenletzteren Polymere beobachtet, wobeiinsbesondere das eingesetzte Acrylat auchvor der Inaktivierung des Enzyms durch

Abb. 2. Darstellung derWechselwirkungen zwischenUntereinheiten des Poly-acrylats (Gafquat; in ball-stick-Darstellungen) mit derPeroxidase aus Meerrettich(semitransparente Ober-fläche mit Ca-Kette undKohlehydratresten undHäm-Gruppe). Die Stickstoff-atome des Polymers sindblau, Sauerstoffatome rotund Kohlenstoffatomeschwarz. Der Blick ist auf dasaktive Zentrum in der Mittedes Moleküls.

Fig. 2. Superposition ofsubunits of the acrylate-polymer Gafquat (ball andstick representation) onhorseradish peroxidase(semitransparent surfacewith Ca trace and ball stickrepresentation forcarbohydrate and hemegroup). Nitrogen atoms arecoloured blue, oxygenatoms red and carbon atomsblack (Gafquat). The view isto the active site in themiddle of the molecule.

sein Substrat Wasserstoffperoxid schützte.Da der Zusatz des Substrates erst bei sehrhohen Konzentrationen zu Veränderungender Proteinstruktur führt, ist dieStabilisierung hier möglicherweise aufeinen eher chemischen Schutz durch dasPolymer zurückzuführen.

Expressionsdiagnostik rekombinanterProduktionsstämme mit DNA-Chips

Die heterologe Proteinproduktion mitrekombinanten Mikroorganismen(Escherichia coli) führt zu verändertenStoffwechselprozessen der Zellen, die sichzum Beispiel auch in einer erhöhtenProduktion von Stressproteinen äußern.Bislang wurde die veränderte Zellphysio-logie ausschließlich über Proteinunter-suchungen analysiert. Da DNA-Chipszunehmend verfügbar werden, sollten alsErgänzung die Methoden für zukünftigequantitative Expressionsanalysen etabliertwerden. Dazu wurde ein E. coli-Produzentenstamm für hbFGF (humanerbasischer Fibroblastenwachstumsfaktor)ausgewählt. Vorgesehen ist die Analyse derExpression insbesondere des heterologenProteins zusammen mit der derStressproteine. Daher mußten zunächstgeeignete Oligonukleotide für denNachweis der Ziel-mRNAs von z.B. hbFGF,Heat-shock-Proteinen, und einergeeigneten Kontrol-mRNA gefunden bzw.bestätigt und ihre Immobilisierungetabliert werden (Abb. 3). Der Einsatzeines kommerziellen E. coli-Chips erlaubtprinzipiell die Analyse der Expressionetlicher Stressproteine. Allerdings werdenquantitative Aussagen und damit auchAussagen zur Kinetik der Expression erstmit der Integration von internenStandards möglich.


Expression and Production Systems (QF 1.1)

Proteins from recombinant micro-organisms

Identification and overcoming of bottlenecksassociated with the production of biologicallyactive proteins with recombinantmicroorganisms: The work includedinvestigations of the cell physiology of proteinproducing cells, the mathematical descriptionand prediction of the cellular reactions causedby the forced synthesis of the foreign protein(e.g. proteom and metabolic flux analysis) aswell as the development of process strategiesfor efficient synthesis, if necessaryrenaturation, and purification of biologicallyactive (pharma) proteins from microbialexpression systems.

β-Galactosidase as biosensor for anti-HIVantibody detection in human sera

In the framework of a project coordinated bythe GBF and financed by the EuropeanUnion, a molecular biosensor based on theE. coli enzyme β-galactosidase (carrying aninsertion of the antigenic peptide P1 of thegp41 protein of the HIV virus) has beengenerated that can be used for the detection ofanti-HIV antibodies in the sera of HIVinfected humans using a homogeneous assaysystem (Fig. 1). The principle of detection isbased on the partial deactivation of theβ-galactosidase activity through the insertionof the antigenic peptide followed by a partialrecovery of the enzyme activity upon antibodybinding to the chimeric protein.

Stabilization of proteinsWithin the framework of an EU-project theinfluence of polymers on the stability ofproteins and their electrical communicationto electrodes was investigated using theexample of horseradish peroxidase. In additionto experimental data obtained with enzymeelectrodes and enzyme activity assays changesof the protein structure were investigated andthe interaction of polymer subunits with theprotein was modeled (cooperation with Dept.SF, Dr. Hecht, Dr. Reichelt, Dr. Schmidt).Modeling showed that some polymers, such aspolyethyleneimine, have distinct binding sitesfor the polymers, whereas others, such asDEAE-dextran or the used poly-acrylate, offermore unspecific binding sites. As mainly thelatter showed stabilizing effects for the

enzyme, this general stabilizing effect could beexplained by wrapping the polymer round thepolymer like a string. Hydrogen peroxide actsas a suicide substrate for horseradishperoxidase, these inactivating effects were alsominimized by the addition of the poly-acrylate(Fig. 2). However, the addition of hydrogenperoxide lead to structural effects only at highsubstrate concentrations and thusmaintainance of the protein structure cannotbe used as an explanation for the observedprotection. Probably chemical effects from sidechains of the poly-methacrylate are moreimportant.

Expressionanalysis of recombinantproduction strains with DNA-Chips

The production of heterologous proteins inrecombinant microorganisms, e.g.Escherichia coli, changes the cell physiologyleading for example to an increasedproduction of stress proteins. Up to nowmainly changes in the pattern of cellularproteins were analysed. The increasedavailability of DNA-chips is to be utilized tocomplement these investigations with thetranscriptional analysis. The kinetics of thestress response can only be elucidated ifquantitative analysis of the mRNAs ispossible. An E. coli-strain for the productionof the human basic fibroblast growth factor(hbFGF) was chosen to establish suitablemethods. As the hbFGF gene expression wasfollowed in comparison to the heat shockresponse, probes suitable for the detection ofthe hbFGF - mRNA together with a control-mRNA had to be defined and a suitableimmobilization procedure was established(Fig.3). The application of a commercially

Abb. 3. Der von uns verwen-dete kommerziell verfügba-re E. coli-Chip enthältOligonukleotide, die für dieGene vor allem vonStressproteinen spezifischsind. Bereits 5 Min. nach derInduktion der Protein-produktion (hier: hbFGF-Produktion) ist eine deutli-che Erhöhung der Expressi-on einzelner Stressproteinezu sehen. In dieser Abbil-dung sind die Ergebnissedargestellt, die mit mRNA-Proben 10 Min. nach derInduktion erhalten wurden.Jeder der gezeigten Spots istfür ein Gen spezifisch, wobeidie Fluoreszenz-Intensitäthier in Falschfarben wieder-gegeben ist und nach Stan-dardisierung quantitativeAussagen zulässt. Die ge-samte Gruppe der unter-suchten Gene ist im Duplikatdargestellt.

The used commerciallyavailable E. coli-chipcontained oligonucleotideswhich are specific mainly forgenes of heat shockproteins, each gene beingrepresented by one oligo-nucleotide. Already 5 min.after the induction of theheterologous proteinproduction (here: hbFGF-production) a significantincrease in the expression ofsome of the heat shockproteins was observed. Thepicture shows the resultsobtained from samples 10min. after the induction.Each of the spotsrepresented the expressionof one specific gene, thefluorescence intensity isrepresented by colouring(yellow to white is highestintensity) and allowsquantitative analysis whenstandards are considered.The whole group ofinvestigated genes is shownin duplicate.


available E. coli-DNA-chip for some of theheat shock protein genes showed thatquantification of the response, and thus theanalysis of the kinetics will only be possible, ifstandards are integrated in the analysis.

Publications ❘ VeröffentlichungenBabu KR, Swaminathan S, Marten S,Khanna N, Rinas U (2000) Production ofinterferon-α in high-cell density cultures ofrecombinant Escherichia coli and its singlestep purification from refolded inclusion bodyproteins. Appl Microbiol Biotechnol, 53:655-660.

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Metabolic Engineering der mikrobiellen Produktion von 1,3-Propandiol

Projektleiter ❘ Project leader: PD Dr. A.-P. Zeng ❘ Arb.Gr. Mikrobielle Systeme ❘ Res. GroupMicrobial Systems

Im Rahmen eines von der GBF koordinier-ten EU-Projekt „1,3-Propanediol – Aversatile bulk chemical from renewableresources by novel biocatalysts andprocess strategies” wurde für die beidenProduktionsstämme Klebsiella pneumo-niae und Clostridium butyricum ein neuesFedbatch-Verfahren entwickelt, das zu einersignifikanten Erhöhung sowohl der Endpro-duktkonzentration (>86 g/l) als auch derProduktivität führte. Weiterhin wurde dieProduktion von 1,3-Propandiol aus Glucoseuntersucht, sowie die Möglichkeit einer

Projektmitarbeiter ❘ Project members: B. Fang, M. Hartlep, W. Hußmann, N. Prayitno, W. Sabra, J. Sun, C. Ulmer, J.van den Heuvel, A. Walter

Abb. 1. Anhand vongenomischen Daten rekon-struiertes und erweitertesdha-Regulon mit zusätz-lichen regulatorischenGenen von K. pneumoniae.

Fig. 1. On the basis ofgenomic data the dha-regulon of K. pneumoniaehas been reconstructed andextended with additionalregulatory genes.

direkten enzymatischen Umwandlung desGlycerins. Für das Metabolic Engineeringdes Prozesses haben wir anhand vonkürzlich veröffentlichten genomischenDaten das komplette dha Regulon von K.pneumoniae rekonstruiert und mit den dha-Regulon von 3 anderen Organismenverglichen. Mehrere regulatorische undsensorische Proteine sowie wichtigeInteraktionsdomainen wurden identifi-ziert (Abb. 1), die Targets für eine globale,genetische Optimierung des Prozessesdarstellen.

Metabolic Engineering of the Microbial Production of 1,3-propanediol

Within the GBF-coordinated EU project “1,3-Propanediol – A versatile bulk chemical fromrenewable resources by novel biocatalysts andprocess strategies” a new fed-batch process wasdeveloped for both Klebsiella pneumoniaeand Clostridium butyricum that achieved asignificant increase of both the finalproduction concentration (>86 g/l) andvolumetric productivity. We also studied theconversion of glucose to 1,3-propanediol and

PEP-utilizing enzymes

dhaK

dhaK2

dhaK1

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dhaR

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orfX

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dhaB1

dhaB2

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orfZ

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evgS

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hdeB

the possibility of a direct enzymatic conversionof glycerol. For metabolic engineering of theprocess we reconstructed and expanded thedha regulon of K. pneumoniae from recentlypublished genomic data and compared it withthe dha regulon of other production strains.Several regulatory and sensory proteins andinteraction domains were identified whichshould be the targets for a global geneticoptimisation of the process.

Zentrales Thema dieses Projektes ist ange-wandte Prozessentwicklung auf den Ge-bieten Kultivierung von Mikroorganismenund Zellkulturen sowie Aufkonzentrierungund Reinigung biotechnologischer Pro-dukte. Für diese Aufgabe stehen umfang-reiche moderne Ressourcen, die ständigweiter entwickelt werden, zur Verfügung:• insgesamt 25 Bioreaktoren vom Labor-

maßstab bis zu 2000 l Arbeitsvolumenfür die Mikroorganismenkultivierung

• Reaktoren für den Batch- und Per-fusionsbetrieb zur Züchtung vonZellkulturen bis zu 100 l Arbeitsvolumen

• Aufarbeitungsgeräte, wie z.B. Zentrifu-gen, Zellaufschlußgeräte, Filtrationsan-lagen, Verdampfer und Gefriertrock-nung, die sowohl klassische Aufarbei-tungsrouten für niedermolekulare Pro-dukte ermöglichen wie auch moderneProzesstrategien für die Reinigungrekombinanter Proteine.

Alle Arbeiten dieses Projektes werden mitPartnern aus Forschungsgruppen der GBF,Universitäten, öffentlichen Forschungs-einrichtungen und der Industrie durchge-führt. Eine wichtige Aufgabe ist die Unter-stützung von GBF-Forschungsgruppendurch Bereitstellung von Anlagen, Bera-tung und Durchführung von Untersu-chungen zu verschiedenen Themen:

Verfahrensentwicklung (QF 1.2)


Leiter ❘ Head: Dr. A. Roß ❘ Arb. Gr. Bioreaktionstechnik ❘ Res. Group of Bioreaction Techniques

Mitarbeiter ❘ Members: V. Jäger, W. Kessler, R. Krützfeldt, H. Schüler

Arbeiten für und mit Partnern aus Uni-versitäten und öffentlichen Forschungs-einrichtungen werden als originäreQuerschnittsaufgabe der GBF betrachtet.In 2000/2001 wurden solche Arbeiten fürForschungsgruppen der UniversitätenAachen, Braunschweig, Frankfurt, Lübeck,Düsseldorf und Stuttgart sowie das EMBLin Heidelberg durchgeführt. Etwa 25 %der Projekte wurden mit Industriepartnerndurchgeführt.

Einige im Berichtszeitraum bearbeiteteThemen seien hier exemplarisch genannt:• Herstellung von Carotenoiden als

Futtermittelzusatz• Herstellung rekombinanter Proteine

mit P. pastoris, insbesondere eine Scale-up-Studie zur Herstellung von Insulin

• Rekombinante Proteine in E. coli fürdie Ganzzellbiotransformation zur Her-stellung chiraler Substanzen.

Ausbildung von Studenten und Wissen-schaftlern auf dem Gebiet Bioverfahrens-technik ist ein wichtiger Aspekt derProjektaktivitäten (Durchführung vonKursen im Rahmen des ITP-Programms,Praktika, experimentelle Arbeiten fürDiplom- und Doktorarbeiten).

Projekt Themen1.1 Aufkonzentrierung von Patientendialysat zur Isolierung von EPO-Varianten

Herstellung verschiedener Wachstumsfaktoren mit dem Baculovirus-Expsessionssystem

1.3 EU- Demonstrationsprojekt zur Zellkultivierung im Airliftreaktor3.1 Kultivierung von Myxobakterien zur Herstellung niedermolekularer Produkte4.3 EU- Demonstationsprojekt zur Hg- Entfernung aus Abwässern


Process Development (QF 1.2)

The focus of this project is applied processdevelopment for cultivation of microorganismsand cell cultures and isolation ofbiotechnological products. For this task state-of-the art equipment is available:• 25 bioreactors from laboratory scale up to

2000 l working volume for cultivation ofmicroorganisms

• bioreactors for batch and perfusionoperation for cultivation of mammaliancells up to 100 l working volume

• downstream processing equipment likecentrifuges and separators, homogenizers,filtration plants, evaporator and freezedryer enabling classical DSP routes for lowmolecular weight products as well as mo-dern processes for isolation of recombinantproteins.

Any work of this project is done in cooperationwith partners from research groups of GBF,universities, public research institutes andindustry. An important task is support of GBFresearch groups by provision of equipment,consulting and experimental research formany different topics:

Support of research groups from universitiesand public research institutes have alwaysbeen an original networking task of GBF. In2000 / 2001 those projects have been donewith partners at the universities Aachen,Braunschweig, Frankfurt, Lübeck, Düsseldorfand Stuttgart and the EMBL in Heidelberg.About 25 % of the projects are performed withindustrial partners.

Some of the projects in the report periodwill be mentioned as example:• Production of carotenoids for animal

nutrition use• Recombinant proteins from P. pastoris,

especially a scale up study for production ofinsulin

• Recombinant enzymes in E. coli to be usedin whole cell biotransformation for chiralcompounds.

Training of students and scientists in bio-chemical engineering is an important part ofthe project activities (ITP-courses, experimen-tal work for diploma and PhD thesis etc.).

Project Subject1.1 Concentration of dialysate from patients for isolation of EPO derivatives

Production of several growth factors using the baculovirus expression system1.3 EU-demonstration project on cultivation of CHO-cell line in an airliftreactor3.1 Cultivation of gliding bacteria for production of low molecular weight compunds4.3 EU-demonstration project on Hg-remediation from industrial waste water

GMP–Verfahrensentwicklung (QF 1.3)


Projektleiter❘ Project leader: Dr. H. Ziehr ❘ Arb. Gr. GMP- Technikum ❘ Res. Group GMP PilotPlant

Projektmitarbeiter ❘ Project members: J. Berlin, M. Bittner, B. Börner, F. Bünstorf, S. Duvar, M. Homeier, H. Hustedt,S. Kluger, K. Körner, R. Kraume-Flügel, K. H. Kroner, C. Mollenschott, N. Papamichael, J. Paulsen, B. Randel,I. Schuma, W. Stach. U. Willig

GMP-Technikum der GBF – die einzigeHGF-GMP-Pilotanlage in Betrieb

Seit mehreren Jahren verfügt die GBF übereine Erlaubnis gem. § 13 des Arzneimittel-gesetzes zur gentechnischen Herstellungvon Wirkstoffen. Damit war und ist sie alseinziges HGF Forschungszentrum in derLage, Herstellungsverfahren für neueWirkstoffe vom Labor bis zur wirklichenAnwendungsreife zu entwickeln. Diesbedeutet, dass die dabei anfallenden Wirk-stoffsubstanzen anschließend in Form vonklinischen Prüfungen am Menschen zumEinsatz kommen.

Seit 1998 verfügt die Arbeitsgruppeüber eine hochkompartimentierte Mehr-zweckbiotechnikumsanlage (GMP I), dieaus diversen lufttechnisch von einandergetrennten und separat zugänglichenReinräumen besteht. Die Arbeitsbereichesind nach aktuellem Stand der Technik fürdie Bearbeitung komplexer biopharma-zeutischer Prozesse ausgestattet. Die luft-technische Trennung der Arbeitsräumeermöglicht ein zeitparalleles Arbeiten anverschiedenen Prozessen ohne die poten-zielle Gefahr von Kreuzkontimationen.

Im Berichtszeitraum wurde eine neueGMP-Biotechnikumsanlage (GMP II)geplant (und wird gegenwärtig in Betriebgenommen), die eine Kultivierung ingrößeren Volumina (bis 400 l) ermöglichtund zudem nach dem neuesten Qualitäts-standard der europäischen- und US-amerikanischen Arzneimittelbehörden(EMEA und FDA) ausgelegt ist.

Zudem wurde im Berichtszeitraum eineGMP-Kleinstanlage, basierend aufIsolatortechnologie (GMP III) konzipiert,

die gemeinsam mit SP 1.2 für die GMP-gerechte Herstellung von viralen Wirkstof-fen für die Gentherapie und die Abfüllungvorgesehen ist.

Für mehrere pharmazeutische Unter-nehmen wurden F&E-Projekte bearbeitet.Dabei wurde insbesondere die wichtigeQuerschnittsfunktion für junge Biotechno-logieunternehmen offenbar, die in derRegel weder über eigene Erfahrung inGMP-gerechtem Arbeiten, geschweigedenn über eigene GMP-Anlagen verfügenund ohne die Zugriffsmöglichkeit auf dieGMP-Optionen der GBF in der vorgegebe-nen Fristigkeit gesetzte Projekt-Meilenstei-ne nicht hätten erreichen können.

Erfolgreiche KooperationsvorhabenGemeinsam mit der Unilever-Tochter BACb.V. (Bussum, Niederlande) wurden groß-technische (präparative) Chromatographie-verfahren zur Isolation von technischenEnzymen und Antikörperfragmenten ent-wickelt und anschließend routinemäßigdurchgeführt.

Für das Biotech-UnternehmenMediGene AG (Martinsried) wurde einekomplette Verfahrensentwicklung auf Basisvon Baculovirusinfektionen und Insekten-zellkultur zur Herstellung eines Wirkstof-fes gegen Papillomviren durchgeführt undabgeschlossen. Der dabei hergestellteWirkstoff befindet sich gegenwärtig in derklinischen Prüfung.

Für die hessischen Biotech FirmenBRAIN AG und Viscum AG (Zwingenberg)wurden Verfahrensentwicklungs- undValidierungsstudien für den Herstellungs-prozess eines rekombinanten Pharma-

Aufgabe der Arbeitsgruppe GMP-Technikum ist es, auf der Basis von Kooperationsvor-haben mit Dritten biotechnologische Wirkstoffherstellungsverfahren bis in einen solchenPilotmaßstab zu entwickeln, dass ausreichend Material für die vorklinische und klinischeForschung erzeugt werden kann. Dies schließt Verfahrensvalidierungsstudien ein undgeschieht – wenn erforderlich – unter dem Reglement der Guten Herstellungspraxis(GMP), dem Qualitätssicherungssystem der pharmazeutischen Industrie.


proteins durchgeführt. Für das Gemein-schaftsunternehmen von der GBF unddem Göttinger Institut für Bioanalytik derFa. IBA Biologics wurden diverseVerfahrensentwicklungsstudien bearbeitet.

GMP Process Development (QF 1.3)

The GMP Pilot Plant at GBF – the onlysuch plant in operation within the HGF

GBF was licensed according to § 13 of theGerman Drug Act for the production ofgenetically engineered substances. As suchGBF is the only HGF research centre whichcan develop production processes for novelactive substances from laboratory to maturity.The active substances thus produced can thenbe applied on clinical testing.

Since 1998 the group has had a highlycompartmented multipurpose pilot plant(GMP I) at its disposal, comprising diverserooms served by separate HVAC systems andaccessed separately. They are built to provide asuitable environment for handling complexbiopharmaceutical systems. The separateHVAC systems allows concurrent work ondifferent processes without the potentialdanger of cross-contamination.

During the last year work on a new GMPpilot plant (GMP II) was carried out and iscurrently being commissioned. It will enableus to perform cultivation at larger scale (400L) according to current European and USauthority regulations.

In addition a small GMP plant based onisolator technology was planned (GMP III) tobe used for production of viral substances forgene therapy and final filling under GMPrules.

Several R&D projects were carried out forclients in the pharmaceutical industry,revealing the important linking function foryoung biotech companies which neither haveknow-how in GMP nor their own GMP plant.Without the utilisation of the GMP facilitiesat GBF the project milestones would not havebeen achieved within the time schedule set.

Successful CooperationsScaled-up (preparative scale) chromatographyprocesses for the isolation of industrialenzymes and antibody fragments weredeveloped and subsequently executed routinelyfor BAC b.v. (Bussum, The Netherlands), aUnilever subsidiary.

A complete process development based onBaculovirus infection of insect cells for theproduction of a substance against Papillomavirus was carried out for MediGene AG(Martinsried), a biotechnology-basedcompany. The substance produced in theproject is currently in clinical trials.

Process development and validation studiesfor production of a recombinant pharmaprotein was carried out for BRAIN AG andViscum AG (Zwingenberg). A number ofdevelopment studies were realized for IBABiologics, a subsidiary of GBF and the“Institut für Bioanalytik“ in Göttingen.

Process development studies on arecombinant pharmaceutical active substancewere carried out for Biogenerix AG (Mann-heim), a subsidiary of Merckle Ratiopharm.

The task of the GMP Pilot Plant group is to develop biotechnological processes for novel activesubstances from laboratory to pilot scale in cooperation with third parties, so as to produceadequate volumes of material for preclinical and clinical trials. This entails considerable processdevelopment and validation studies carried out – when required – under Good ManufacturingPractice rules, the quality assurance system of the pharmaceutical industry.

Für das Merckle Ratiopharm-Tochterunter-nehmen Biogenerix AG, Mannheim,wurde eine Prozessentwicklungsstudie füreinen rekombinanten Pharmawirkstoffdurchgeführt.

Struktur und Funktion biologischer Makromoleküle (QF 2)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Querschnittsfunktion: Struktur biologischer Makromoleküle133

Koordinator ❘ Coordinator:Dr. H. Blöcker ❘ Abt. Genom-analyse ❘ Dept. of Genom Analysis

Die Genomsequenzanalyse ist dasklassische Beispiel für Globalstrategien.Durch die modernen Genomzentren wiedie GBF wäre heute die serielle Analyseeiniger oder vieler Gene eines Organismuseine Verschleuderung von Ressourcen. MitHilfe starker Automatisierung undParallelisierung hat die GBF in denvergangenen Jahren eine exzellente Infra-struktur zur kostengünstigen Sequenz-analyse geschaffen und erfolgreicheingesetzt. Sie reicht von der Anlage derKlonbibliotheken bis zur bioinformati-schen Funktionsanalyse. Die gegenwärtigeKapazität beträgt über 10 Megabaseninterpretierter Sequenz pro Jahr. Derartmassiv anfallende Sequenzinformationenhaben den Blick wieder stärker auf dieUntersuchung der Funktion und Wechsel-wirkung von Proteinen gerichtet. Dieglobale Strategie der Proteomanalysebereitet dabei den Boden für diedetaillierte biochemische und struktur-analytische Untersuchung der Funktioneinzelner Proteine und ist essentiell fürdie Aufklärung regulatorischer Zusam-menhänge in der Zelle.

Die für die Proteomanalyse üblicher-weise eingesetzten Basistechnologien,Massenspektrometrie, Proteinsequenzie-rung und 2D-Gelelektrophorese, bedürfenjedoch in der GBF wie andernorts starkerInnovation in Richtung Geschwindigkeit,Kosten, Zuverlässigkeit und Vollständig-keit der Erfassung des Proteoms.Methodische Fortschritte in der Struktur-analyse ermöglichen einen breiterenEinsatz dieser Methoden. Dies betrifft dieAnwendung von MAD- und Cryotech-niken unter Nutzung von Synchrotron-strahlung in der Proteinkristallographie,multidimensionale Hochfeld-NMR sowiehochauflösende Massenspektroskopie.

Fortschritte in Medizin und Biotechnik sind zu einem guten Teil von einer Vertiefung desbiologischen Verständnisses abhängig. Der rationale Weg, dies zu erreichen, führtheutzutage über Globalstrategien. Mit ihrer Hilfe lassen sich ganze Verbindungsklassen derbiologischen Zelle entdecken oder näher untersuchen. Dies wird im vorliegendenSchwerpunkt mit den Methoden der Genom- und Proteomforschung, der Bioinformatiksowie der Strukturanalyse angegangen. Es werden Beiträge geleistet, die zur vollständigenBeschreibung aller zellulären Potenziale zur Synthese, Regulation und Kommunikationführen werden.

Effiziente Genom-, Proteom- und Protein-strukturanalyse ist in starkem Maßeabhängig von funktionierender Daten-verarbeitungsinfrastruktur und Verfahrender molekularen Bioinformatik. Aus derDatenmenge müssen sinnvolleInformationen gewonnen und intelligentgespeichert werden. Aus diesem Grundwird auch an der GBF aktive Forschungs-und Entwicklungsarbeit auf dem Gebietder Bioinformatik geleistet. Bisher bezogsich dies auf Datenbank- und algo-rithmische Arbeiten zur Sequenzinterpre-tation regulatorischer Potentiale. ImRahmen von „functional genomics” wirdsich die Bioinformatik zunehmend aufGenexpressionsdaten und -mechanismen,auf biologische Vernetzungen und derenmedizinische Implikationen konzentrie-ren. Alle hier beschriebenen Aktivitätender GBF sind stark international vernetztund haben ihren eigenen Stellenwertnachgewiesen.

Highlights from Research and Development Networking Task: Structures of Biological Macromolecules 134

Genome sequence analysis is the classicalexample for global strategies. With moderngenome centres (such as the GBF), the serialanalysis of a few or many genes of anyorganism would be a waste of resources. Overthe past few years the GBF has built up anexcellent infrastructure for the efficientsequence analysis, mainly by extendedautomation and parallelisation. Theinfrastructure stretches from the generation ofall clone libraries to the functional analysis bybioinformatic tools. The current annualcapacity is above 10 megabases of interpretedsequence. Such large amounts of genomicsequence information has now drawn more ofour attention towards the investigation ofprotein function and interaction.

The global strategy of proteome analysislays the basis for the detailed biochemical-structural investigation of the functioning ofindividual proteins and is essential forattempts to unravel regulatory links within thebiological cell. Basic technologies in proteomeanalysis are mass spectrometry, proteinsequencing and 2D gel electrophoresis. At theGBF and elsewhere these technologies must beimproved substantially with respect to speed,cost, reliability and completeness of proteomecoverage. Recent methodological progress in3D-structural analysis (structural genomics)has led to a much broader application of thisgeneral technology. This applies particularly toMAD and cryo techniques during the use ofsynchroton radiation in proteincrystallograghy, multi-dimensional high-fieldNMR spectroscopy as well as high resolutionmass spectrometry.

Structure and Function of Biological Macromolecules (QF 2)

It is now widely accepted that progress in medicine and biotechnology is very much dependent ona deeper insight into biology. The most efficient way of achieving this is by appling globalstrategies. This enables researchers to discover new classes of biological compounds or to study themin greater detail. In the current major research and development areas of the GBF this is beingachieved by concerted activities in the fields of genome and proteome research, bioinformatics aswell as structural analysis. We contribute to the complete description of all synthesis, regulationand communication potentials of the biological cell.

Efficiency in genome, proteome and proteinstructure analysis depends to a large extent ona competent data handling infrastructure andprocedures for molecular bioinformatics.Useful information must be gained from thelarge quantities of data and made accessiblein an intelligent fashion. Therefore, the GBFalso has ongoing research and developmentactivities in bioinformatics. Until recently thiswas related to database and algorithmdevelopment for the sequence interpretation ofregulatory potentials. In the framework of“functional genomics” there will be a strongerbioinformatics focus on gene expression dataand mechanisms, on biological networks andtheir medical implication. All GBF activitiesas described here have strong internationallinks and have demonstrated theirimportance.

Genomics und Proteomics (QF 2.1)

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Querschnittsfunktion: Strukturen biologischer Makromoleküle135

Projektleiter ❘ Project leader: Dr. H. Blöcker ❘ Abt. Genomanalyse ❘ Dept. of Genome Analysis

Projektmitarbeiter ❘ Project members: Genomics: M. Böcher, M. Czubayko, K. Hornischer, M. Kalisz, G. Kauer,B. Neelen, G. Nordsiek, M. Scharfe, O. Schön, M. Yang; Proteomics: M. Baumgärtner, O. Diekmann, L. Jänsch, U.Kärst, C. Krantz, R. Munder, J. Schaumburg, J. Wehland

In den letzten Jahren hat sich die Sequenzanalyse von sehr großen Bereichen genomischerDNA oder gar von kompletten Genomen als Startpunkt und lohnender Ansatz fürbiotechnologische Forschung und Anwendung durchgesetzt. In einem Wechselspiel vonmethodischen Entwicklungen und der Generierung großer Datenmengen stellen wir diespezifischen Chancen der Globalstrategien Genomsequenzanalyse und Proteomanalysesowie der zugehörigen Bioinformatik in den Dienst einer biologischen Wissens-vermehrung.

GenomicsAn der GBF existiert ein funktionierendesGenomlabor mit internationalemAnspruch. Die etablierte Infrastrukturdeckt alle Arbeitsgänge von der Erstellungder Klonbibliotheken bis zur bioinfor-matischen Tiefenanalyse ab. Dies konntedurch die Beteiligung an mehrerenerfolgreichen internationalen Kooperatio-nen gezeigt werden (humane Chromoso-men 9, 21 u.a.m.). Zur Zeit können bis zuca. 4.000 Klone pro Tag analysiert werden.Die Jahreskapazität liegt bei über 10Megabasen bioinformatisch detailliertuntersuchter Sequenz. Ferner werden ausden von uns analysierten neuen Geneneinige ausgewählte Gene zellfrei oder inE. coli exprimiert und der weiterenFunktionsanalyse durch Laborexperimentezugeführt.

Nach Beendigung unseres Beitrageszum Listerien-Genomprojekt der EU (ca.3,5 Megabasen an Rohdaten) und am EU-Projekt Arabidopsis thaliana, laufenweiterhin größere Beteiligungen amHumangenomprojekt des BMBF. Inletzterem wurden ca. 8 Megabasen ausden Chromosomen 21 und 9 sequenziertund annotiert. Herausragendes Ergebniswar hier die Veröffentlichung der Sequenzdes humanen Chromosoms 21 und seinebioinformatische Analyse (deutsch-japanisches Konsortium) sowie derAbschluß der „working draft“-Phase desHumangenomprojektes (internationalesKonsortium, „G16“). Außerdem wurdenvon uns fast 2.0 Mb an neuer humanercDNA aus organ- oder stadienspezifischenBanken analysiert (deutsches Konsorti-

um). Kürzlich wurde damit begonnen, diegesamten Genome mehrerer Bakterien(z.B. apathogener E. coli-Stamm) zuanalysieren. Im Rahmen des BMBF-Projektes „Krankheitsbekämpfung durchGenomforschung“ wurde zudem begon-nen, ausgewählte Bereiche des Ratten-genoms und das Chromosoms 22 desSchimpansen (entspricht dem von unsbereits analysierten menschlichenChromosom 21) zu untersuchen.

Durch Eigenentwicklungen (diversePatentanmeldungen) ist die Roboterstraßezur automatischen DNA-Präparation undanschließender automatischerSequenzierung weiter ausgebaut worden.Das objektorientierte Design und dieImplementierung der Software geben unsdie Möglichkeit einer schnellen Erweite-rung, Umgestaltung oder auch Um-nutzung der Anlage. Weitere größeremethodische Entwicklungen betreffeneine komplette Software-Umgebung fürdie digitale Bildverarbeitung und einenvöllig neuen Ansatz zur Speicherung,Filterung und Sinnanalyse jeglichersequenzbasierter Information.

ProteomicsZiel unserer Arbeit ist die Analyse derExpressionsmuster verschiedener Proteinevon Listeria monocytogenes – einemhumanpathogenen Bakterium – mittelshochauflösender 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) undschneller Proteinidentifizierung durchMassenspektrometrie anhand der vollstän-dig bekannten Genomsequenz. Als ersterSchritt werden Proteine der wichtigen


Subproteome (sekretorische, Zellwand-gebundene und Membranproteine) desWildtyps nach Anzucht unter Standard-bedingungen kartiert und identifiziert,weil die Interaktion mit Wirtszellenwährend der Infektion durch externeProteine vermittelt wird. Auf dieser Basiswird die differentielle Genexpressionunter verschiedenen Umweltbedingungenuntersucht, wobei das besondere Interesseden anhand der in silico-Analyse desGesamtgenoms als wahrscheinlichVirulenz-assoziierten Proteinen gilt. Dieso erhaltenen Daten werden dann mitdenen klinischer Isolate des Serovars 4bund der Spezies L. innocua und L. ivanoviiverglichen.

Besondere Aufmerksamkeit gilt denOberflächenproteinen von L. monocyto-genes nicht nur, weil die meisten bekann-ten und vermuteten Virulenzproteine hierauftreten, sondern auch deshalb, weildieses Bakterium nach den Ergebnissender Genomanalyse über einen ungewöhn-lich großen Satz – etwa 11% – an Protei-nen mit Transportfunktionen verfügt.

Parallel zur Proteinidentifizierungwerden Methoden zur Isolierung vonSubproteomen, zur quantitativen Analysevon Proteinmustern, zur Extraktion undAuftrennung von hydrophoben Membran-proteinen und zur Erhöhung der Em-pfindlichkeit der massenspektrometri-schen Identizierung weiter und neuentwickelt.

Die mit verschiedenen Verfahrenextrahierten Proteine wurden durchdenaturierende 2D-PAGE - für Membran-proteine oder native Proeinkomplexedurch Blue Native-PAGE - aufgetrennt.Ausgeschnittene Proteinflecken aus 2D-Gelen wurden durch MALDI-MS anhandder Massen tryptischer Peptide oder durchESI-MS/MS anhand kurzer Sequenzab-schnitte identifiziert, Banden aus 1D-Gelen durch N-terminale Sequenzierung.

Das sekretorische Subproteom vonL. monocytogenes EGD weist nachFluoreszenzfärbung 160 Proteinfleckenauf; von denen bisher 39 – entsprechend28 verschiedener Proteine, die teilweise inmehr als einem Flecken auftreten –identifiziert wurden; darunter befindensich neben einer Reihe von Proteinenunbekannter Funktion auch die Virulenz-proteine Internalin A, B und C, mpl und

Listeriolysin O. Es ist beabsichtigt, dassekretorische Proteom möglichst vollstän-dig zu kartieren, um damit eineVergleichsbasis für die Analyse unter-schiedlicher Umweltbedingungen und zurCharakterisierung von Mutanten zuerhalten; darüberhinaus werden auch diezum mehrfachen Auftreten einzelnerProteine führenden Modifikationenidentifiziert.

Zellwandgebundene Proteine wurdenentweder durch serielle Extraktion (mitPuffern, Salzen und Detergentien) odernach Herstellung von Protoplasten ausdem Überstand isoliert. Bisher wurdenhier 82 Flecken oder Banden (aus 1D-Gelen) identifiziert, die 74 unterschiedli-chen Proteinen entsprechen. Neben fastallen in diesem Subproteom zu erwarten-den Virulenzproteinen und einer Reihevon Proteinen unbekannter Funktionwurden auch ein neues, wahrscheinlichVirulenz-assoziiertes Protein - vermutlichein an Transportprozessen beteiligtesLipoprotein – und eine neue Muramidaseidentifiziert.

Membran- und Membran-assoziierteProteine wurden mit 1D-, 2D- und BlueNative PAGE analysiert. 50 Proteine, diemeisten davon Membran-assoziiert,wurden bisher identifiziert. Wegen derbesonderen Schwierigkeit, sehr hydropho-be integrale Membranproteinerepoduzierbar aufzutrennen sind hierweitere Entwicklungsarbeiten notwendig,wobei weitere Verfahren wie z. B. die FreeFlow-Elektrophorese getestet und einge-setzt werden sollen, um die Limitierungender derzeit verfügbaren Trenntechniken zuüberwinden.

LPXTG-anchoredprotein

Cell wallassociatedprotein

Lipoteichoicacid

Membraneassociated protein

Secretoryprotein

Integralmembraneprotein

Schema der OberflächeGram-positiver Bakterien(© M. Baumgärtner)

Scheme of the surface ofGram-positive bacteria(© M. Baumgärtner)


Genomics and Proteomics (QF 2.1)

The sequence analysis of large stretches of genomic DNA or even of complete genomes has recentlyfound wide acceptance as a basic and profitable approach to biotechnological research anddevelopment. In an interplay of the development of methods and mass data production we aredemonstrating the specific benefits of the two global strategies, genomics and proteomics, includingaccompanying bioinformatics.

GenomicsThe GBF houses an active genome laboratoryof high international standard. Its infra-structure covers all necessary steps from thegeneration of BAC libraries down to the in-depth analysis by bioinformatics. This wasshown in a number of successful internationalcollaborations (human chromosomes 9, 21etc.). Currently the GBF lab has a throughputof up to 4,000 clones per day. The annualcapacity is above 10 megabases (Mb), inclu-ding detailed analysis with bioinformaticstools. Selected genes (from the pool of newgenes analysed here) are submitted to geneexpression experiments, either in cell-freesystems or in E. coli. Isolated proteins arethen further analysed for various functionalaspects.

After our contribution to the Listeriagenome project of the EU (about 3.5 Mb ofraw data) and the Arabidopsis thaliana EUproject, we are now running a majorcontribution to the German human genomeproject (BMBF). 8 Mb of chromosomes 21and 9 have been sequenced and annotated.The outstanding result in the frame of thisactivity was the publication of the sequence of

the human chromosome 21 and itsbioinformatical analysis (German-Japaneseconsortium) as well as the finishing of theworking draft phase of the human genomeproject (international consortium, “G 16”).In addition, we analysed almost 2 Mb of newhuman cDNAs from various organ- anddevelopment-specific libraries (as part of aGerman consortium). Recently, we started theanalysis of the complete genomes of a fewbacterial genomes (for example a non-pathogenic strain of E. coli). Moreover, in theframe of a national programme (“Fightingdisease by genome resarch”) we have recentlybegun to analyze selected regions of the ratgenome and the chimp chromosome 22(equivalent to the human chromosome 21which was analysed by us).

The robotic environment for DNApreparation and subsequent automaticsequencing was substantially enhanced. Thisis mainly due to in-house developments(several patent applications). The object-oriented design and the implementation of thesoftware enable us to expand or rearrangequickly the current robotic environment oreven to use it for entirely different purposes.Further method developments were a completesoftware environment for image analysis anda novel approach to storage, filtering andconceptual analysis of sequence-basedinformation.

ProteomicsThe objective of this work is to analyse theprotein expression patterns of the differentgenes of the human pathogen Listeriamonocytogenes using high resolution 2D-gelelectrophoresis and rapid protein identificationby mass spectrometry based on the completedgenome sequence. The first step is to map andidentify proteins from the major subproteomes,secretory, cell wall-associated, and membranefrom the wild type strain grown understandard conditions because the interactionswith host cells are mediated through externalproteins of the pathogen. Building on this firm

Titelbild der ZeitschriftNature vom 15. Februar2001 anläßlich derVeröffentlichung der erstenArbeitsversion des mensch-lichen Genoms. Das Bildsymbolisiert, worum es denWissenschaftlern desinternationalen Konsortiumsgeht: Einerseits die Chemi-kalie DNA, andererseits umdie Menschen aller Konti-nente, aller Hautfarben undjeglicher ethnischenGruppen. Alle Ergebnissedes InternationalenSequenzanalyse-Konsorti-ums sind frei verfügbar fürjeden Interessenten.Mit freundlicher Genehmi-gung von Nature undMacmillan Magazine Ltd.

Cover picture of the15 February 2001 issue ofNature on the occasion ofthe publication of the first„working draft“ of thehuman genome. The picturesymbolizes what the work ofthe scientists of theinternational consortium isrelated to: On the one handit is the chemical DNA, onthe other hand it ismankind, no matter fromwhich continent, of whichcolour or from whichethnicity. All results of theInternational SequenceAnalysis Consortium arefreely available to anybody.Permission kindly granted byNature and MacmillanMagazine Ltd.


basis differential gene expression related toenvironmental conditions is being addressed;based on the in silico analysis of the L.monocytogenes genome new proteins underprfA control are being identified. Informationgathered with the EGDe strain will becompared to clinical isolates of serovar 4b andL. innocua and L. ivanovii.

Particular attention is paid to the surfaceproteins of L. monocytogenes not onlybecause most of the known and putativevirulence factors are expected to be found inthese fractions but also because, based on thegenome analysis, this organism harbours anunusually large set of proteins – about 11% –with putative transport functions.

In parallel method development forimproved subproteome isolation protocols,quantitative analyses of 2D gels based onfluorescent dyes, extraction and separation ofhydrophobic membrane proteins, andincreasing the sensitivity the peptideidentification by peptide mass fingerprintingand sequence tag generation is beingaddressed.

Extracted proteins were separated bystandard denaturing two-dimensionalelectrophoresis (2D-PAGE) and - for theisolation of membrane proteins and proteincomplexes - Blue Native PAGE. 2D gels wereevaluated, spots selected, cut out, digested,and subjected to MALDI-TOF-MS foridentification by peptide mass fingerprintingand/or ESI-MS/MS (Q-TOF) foridentification through sequence tags fromfragments. Proteins separated by 1DSDS-PAGE were identified mainly by Edmanprotein sequencing.

The secretory subproteome of the L.monocytogenes EGDe strain shows 160spots upon fluorescent dye staining. Of these,39 (corresponding to 28 proteins) have beenidentified, including the virulence factorsInternalin A, B, and C, mpl, and ListeriolysinO, and several proteins of unknown function.Our intention is to identify as many spots aspossible, then use this known pattern toanalyse the differences seen under differentgrowth conditions or with mutants, andidentify the types of posttranslationalmodifications that cause several proteins toproduce more than one spot on 2D gels.

Cell wall associated proteins were isolatedby two approaches, (i) serial extraction withbuffer, salts, and detergents, and (ii)preparing defined cell fractions by making

protoplasts to isolate cell wall proteins fromthe supernatant. So far, 82 spots or bands(from 1D SDS-PAGE) were identifiedcorresponding to 74 proteins. Among these anew PrfA-regulated protein – a putativetransport-associated lipoprotein - was detectedwhich is a candidate for mutagenesis, as wellas a new putative muramidase and most ofthe known virulence-associated proteinsexpected in this fraction, e.g., Internalin B,hly, ActA, and PlcA.Membrane and membrane-associatedproteins were analysed by 1D, 2D, and BlueNative PAGE electrophoresis to developprocedures for reproducible separations. 50peptides that are mainly membrane associatedhave been identified so far but further methoddevelopment is necessary. New techniquessuch as Free Flow Electrophoresis are beingtried to improve on the current methodologicallimits.

Publications ❘ VeröffentlichungenEuropean Union Chromosome 3 ArabidopsisSequencing Consortium, The Institute forGenomic Research & Kazusa DNA ResearchInstitute (2000) Sequence and analysis ofchromosome 3 of the plant Arabidopsisthaliana. Nature 408:820-823.

International Human Genome SequencingConsortium (2001) Initial Sequencing andAnalysis of the Human Genome. Nature409:860-921.

Zweidimensionale Auf-trennung von Membran-proteinen durch BlueNative-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

2D separation of membraneproteins by Blue NativePAGE

Bioinformatik (QF 2.2)

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Projektleiter ❘ Project leader: Dr. E. Wingender ❘ Arb. Gr. Bioinformatik ❘ Res. Group ofBioinformatics

Projekmitarbeiter ❘ Project members: A. Potapov, K. Seidl, I. Liebich, M. Christensen, T. Crass, R. Gohla, H. Michael,F. Schacherer, V. Drewes, A. Bischoff

Regulatorische Netzwerke: DieGenotyp-/Phänotyp-PlattformK. Seidl

Viele erworbene oder angeborene Krank-heiten können auf Fehlfunktionen vonGenen zurückgeführt werden, die schonwährend der Embryonalentwicklung poten-tiell gestörte Regelkreise manifestieren.Mit der Zielsetzung, den Einfluss geneti-scher Variationen sowohl auf zellspezifischeals auch auf systemische Netzwerke zumodellieren, wurde eine Genotyp-/Phäno-typ-Plattform etabliert, die pathologischrelevante Daten erfasst, bewertet undschließlich in Beziehung mit den entspre-chenden Regelkreisen setzen kann.

Mit dem Einbringen von pathologischrelevanten Daten und ihren Effekten indie virtuelle Abbildung der Signaltrans-duktion wird eine neue Qualität für dieBewertung der Reaktionsmuster innerhalb

regulatorischer Netzwerke geschaffen unddie Bedeutung einzelner Netzwerkbausteinefür die Genesis und Aufrechterhaltung desjeweiligen Phänotyps näher beleuchtet. Inder immensen Anhäufung von Informa-tionen bezüglich Genotyp-/Phänotyp-Beziehungen soll die computergestützteSimulation von regulatorischen Netzwer-ken innerhalb der Grundlagenforschungneue Impulse liefern sowie bei der Her-stellung von neuen Medikamenten eineffektives Werkzeug sein.

Regulatorische Netzwerke: ModellierungA. Potapov, V. Drewes

Zur Modellierung der Architektur regula-torischer Netzwerke und ihrer Modulewurde ein neuer Ansatz vorgeschlagen. Eswurde ein auf Boolscher Logik basierenderFormalismus entwickelt, der Prozesseunterschiedlicher Komplexität als mehrfachkonditionale Ereignisse behandelt. Mitdiesem Formalismus können regulatorischeKaskaden und ihre Netzwerke in eineralgebraischen Form ausgedrückt werden,die für ihre Speicherung sowie computer-gestützte Analyse geeignet ist.

HNB: DatenbankenM. Christensen, I. Liebich

Im Berichtszeitraum wurde eine neueAusgabe der „S/MAR transaction database“(S/MARt DB), die in Kooperation mitProf. Bode (AG Epigenomics) entwickeltwurde, veröffentlicht. Dabei wurde dieDatenbankpräsentation um zwei Formularezur direkten Eingabe relevanter Datendurch den wissenschaftlichen Benutzerergänzt. Während S/MARt DB Informationenzu DNA-Abschnitten bereitstellt, die dasGenom in funktionelle Bereiche unterteilen,sammelt die gerade im Aufbau befindlicheDatenbank TRANSsplice Daten zu regu-liertem Spleißen.

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten Querschnittsfunktion: Strukturen biologischer Makromoleküle

Vom experimentellen zumbioinformatorischen Ansatz

From the bench tobioinformatics

140

HNB: Zentale WWW-KoordinationT. Crass, R. Gohla

Als technische Voraussetzung für die ange-strebte Vernetzung der heterogenen HNB-Bioinformatik-Ressourcen wurden zunächstein zentraler HNB-Server mit Nutzer-authentifizierung installiert. Weiterhinwurden abstrakte Beschreibungen derverfügbaren Software in einer Datenbankgesammelt, um – darauf aufbauend –komplexere Arbeitsabläufe (Tasks) zudefinieren. Derzeit wird an den fürdie Task-Automatisie-rung nötigenAblaufsteuerungs- und Datenaustausch-mechanismen gearbeitet. Als erstes HNB-Web-Interface für Nicht-Fachleute wurdeder „Question Based Navigator” entwickelt(http://www.hnbioinfo.de).

CYGD: Comprehensive Yeast GenomeDatabaseH. Michael

Im Februar 2000 wurde mit einer groß-angelegten Aktualisierung der Hefedatender TRANSFAC Datenbank begonnen.TRANSFAC enthält Daten über Transkript-ionsregulatoren und ihre Bindungsstellen.Die gesammelte Information wird alsseparates Datenbankmodul Teil derComprehensive Yeast Genome Database(CYGD) werden. CYGD ist einmultidisziplinäres europäisches Projektzur Erstellung einer umfassendenDatenressource für das Genom der HefeSaccharomyces cerevisiae.

Highlights from Research and Development Networking Task: Structures of Biological Macromolecules

Veröffentlichungen ❘ PublicationsWingender E, Chen X, Hehl R, Karas H,Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüß M,Reuter I, Schacherer F (2000) TRANSFAC:an integrated system for gene expressionregulation. Nucl Acids Res. 28:316-319.

Kel AE, Kel-Margoulis O V, Farnham PJ,Bartley SM, Wingender E, Zhang, MQ(2001) Computer-assisted Identificationof Cell Cycle-related Genes: New Targetsfor E2F Transcription Factors. J Mol Biol309:99-120.

Hehl R, Wingender E (2001) Database -assisted promoter analysis. Trends PlantSci 6:251:254.

Wingender E, Chen X, Fricke E, Geffers R,Hehl R, Liebich I, Krull M, Matys V,Michael H, Ohnhäuser R, Prüß M,Schacherer F, Thiele S, Urbach S (2001)The TRANSFAC system on gene expressionregulation. Nucl. Acids Res. 29:281-283.

Dr. Edgar Wingender in derDiskussion mit Mitarbeitern

Dr. Edgar Wingenderdiscussing problems withcolleagues

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Regulatory Networks: The Genotype-Phenotype Platform

Many of the acquired or innate diseases canbe traced back to malfunctions of particulargenes and the subsequent disarrangement ofbiological circuits during embryonicdevelopment. In order to model the effects ofgenetic variations on cell specific as well assystemic networks, a genotype-phenotypeplatform was generated, which enablesrecording and evaluation of pathologicallyrelevant data and finally to allocate of theaberrant genes and gene products within thenetwork of correpsonding regulatorycomponents.

The inclusion of pathologically relevantdata and their downstream effects into thevirtual representation of signal transductioncreates a new quality for the evaluation ofreaction patterns within regulatory networks.It will light up the meaning of individualnetwork components for genesis andmaintenance of particular phenotypes. Withinthe huge accumulation of informationconcerning genotype-phenotype correlationsthe computational simulation of regulatorynetworks will give new stimuli for basicsciences. Moreover, the genotype-phenotypeplatform will serve as a useful tool for thedesign of new medical and therapeutic drugs.

Regulatory Networks: ModellingTo model the architecture of regulatorynetworks and their modules, a new approachhas been suggested. The necessary formalismhas been developed which treats processes ofdifferent complexity as a multiple conditionalevent and is based on a variant of Booleanlogic. By using this formalism, regulatorypathways and their networks could beexpressed in an algebraic form suitable fortheir storage and computer-assisted analysis.

HNB: DatabasesA new release of the S/MAR transactiondatabase (S/MARt DB), which was developedin cooperation with Prof. Bode (ResearchGroup EPI), has been made available.Thereby, S/MARt DB has been complementedby two forms that allow direct submission ofrelevant data by the researcher. While S/MARt DB provides information aboutelements of the DNA that subdivide the

genome into fuctional regions, our newlydeveloped database TRANSsplice collects dataon regulated splicing.

HNB: Central WWW-CoordinationAs a technical prerequisite for the intendedintegration of the HNB’s heterogeneousbioinformatics resources, a central HNB server(including user authentication) was installed.Furthermore, abstract descriptions of theavailable software tools were collected withina database, in order to allow for the definitionof more complex work flows (tasks).Currently, the flow control and data exchangemechanisms required for task automation areunder development. Finally, a “question basednavigator” has been developed as a first HNBweb interface suitable for non-expert users.

CYGDIn February 2000 we have started a massiveupdate of the TRANSFAC database ontranscriptional regulators and their respectivebinding sites with data on the yeastSaccharomyces cerevisiae. This informationwill form a separate database moduleintended as an integral part of the Compre-hensive Yeast Genome Database (CYGD).The CYGD project is a multidisciplinaryEuropean effort to build a comprehensive dataresource for information on the yeast genome.

Bioinformatics (QF 2.2)


Strukturanalyse (QF 2.3)

Projektleiter ❘ Project leader: Dr. H.-J. Hecht ❘ Abt. Strukturforschung ❘ Dept. of MolecularStructure Research

Projekmitarbeiter ❘ Project members: K.-D. Aumann, K. Bruns, A. F. Bückmann, B. Hoffmann, H. Kalisz, M. Kalisz,D. Krumme, M. Nimtz, J. Reichelt, V. Wray

Struktur von extrazellulären Glutathion-S-Transferasen

Etwa 20 Millionen Menschen, überwiegendin Afrika, leiden unter der durch den Befallvon Wurm-Parasiten ausgelösten KrankheitOnchozerkose, die bei einem Teil derInfizierten zur vollständigen Erblindungführt. In Zusammenarbeit mit demBernhard-Nocht-Institut für Tropen-medizin in Hamburg wurde die Strukturvon zwei extrazellulären Glutathion-S-Transferasen mit 4 oder 5 N-Glycosylier-ungsstellen aus dem humanpathogenenWurm-Parasiten Onchocerca volvulusaufgeklärt. Die Glykosylierungsmusterdieser sekretorischen Enzyme, die einewichtige Rolle bei der Verteidigung desParasiten gegen die Immunantwort desWirts spielen, konnten mittels HPLC-MS,MALDI-MS and ESI-MS/MS für jedeeinzelne Glykosylierungsstelle bestimmtwerden. Die hohe Relevanz der Glykanefür die Antigen-Erkennung durch dasmenschliche Immunsystem wurde durchVergleich der Immunantwort auf natürlichglykosyliertes und rekombinantes ungly-kosyliertes Protein nachgewiesen. DiesesErgebnis belegt die große Bedeutung derkorrekten posttranslationalen Modifikationvon Proteinen, die als Ziele für Impfstoffein Frage kommen.

Modell der Wechselwirkungvon Trypanothion mit derOberfläche von Trypare-doxin vor Abschluss derReaktion durch Knüpfungder intramolekularenTrypanothion-Disulfidbrücke

Model of the interaction oftrypanothione with thesurface of tryparedoxinbefore the completion ofthe reaction through coup-ling of the intramoleculartrypanothione disulphidebridge

3D Strukturen der Tryparedoxine ausCrithidia fasciculata

Als Beitrag zur Entwicklung von Wirkstoffengegen pathogene Trypanosomatide wurdendie 3D Strukturen zweier Tryparedoxineaus Crithidia fasciculata in Zusammen-arbeit mit der Abteilung von Prof. Dr. L.Flohé (TU BS) untersucht. Die Thioredoxin-ähnlichen Tryparedoxine sind Teil des erstkürzlich aufgeklärten speziellen Peroxid-stoffwechsels in Trypanosomatiden undgelten als indirekt validierte Zielmo-leküle für Wirkstoffe. Die Wechselwirkungmit dem für Trypanosomatide spezifischenRedoxmetaboliten, Trypanothion, wurdeanhand von Strukturvergleichen modelliert.An diesem Modell wurde die enzymatischeAktivität von Tryparedoxinvarianten, diean einzelnen Aminosäuren in der Umge-bung des aktiven Zentrums gezielt verän-dert waren, untersucht. Die Strukturanalyseeines kovalenten Reaktionsintermediatsder Cys44Ser Tryparedoxin II-Variante mitdem Teilsubstrat Glutathionylspermidinbei 1.4 Å Auflösung bestätigt die in derunmittelbaren Umgebung des aktivenZentrums modellierten Enzym Substrat-wechselwirkungen. Zusammen mit denStrukturen des oxydierten und reduziertenTryparedoxins ermöglicht dies einedetaillierte Beschreibung der molekularenVorgänge während der Reaktion.Die strukturellen Unterschiede zwischenTryparedoxin und Thioredoxin, demhomologen Enzym beim Menschen, lassendie Entwicklung Tryparedoxin-spezifischerInhibitoren als möglich erscheinen, diezur Bekämpfung der Chagas Krankheitund Schlafkrankheit verursachendenParasiten beitragen können.

142Highlights from Research and Development Networking Task: Stuctures of Biological Macromolecules

3D Structure of Tryparedoxins fromCrithidia fasciculata

The structure of two tryparedoxins fromCrithidia fasciculata have been investigatedas a contribution to the development of drugsagainst pathogenic trypanosomatids incollaboration with the Department ofPhysiological Chemistry, TU Braunschweig.The thioredoxin-like tryparedoxins are anindispensible component of the recentlyelucidated peroxide metabolism in theseorganisms and may be considered as indirectvalidated drug targets. Their interaction withthe trypanosomatid specific redox metabolite,trypanothione, was modelled through structurecomparisons. This model was verified throughinvestigation of the enzymatic activity oftryparedoxin mutants that had single aminoacid exchanges in the vicinitiy of the activesite. The structural analysis of a covalentreaction intermediate of the Cys44Sertryparedoxin-II-mutant containing the partialsubstrate glutathionylspermidine at aresolution of 1.4Å confirmed the structuralcharacteristics of the active site of themodelled enzyme-substrate interaction. Incombination with the structure of the oxidizedand reduced tryparedoxins it was possible toformulate a detailed molecular description ofthe reaction process. It seems likely that thestructural differences between tryparedoxinand thioredoxin, the homologous humanenzyme, will allow the development oftryparedoxin-specific inhibitors that couldcombat Chagas disease and sleeping sicknessoriginated through parasitic infection.

Structure of extracellular Glutathion-S-Transferases

Some 20 million people, predominantly livingin subsaharan Africa are infected by thefilarial parasite Onchocerca volvulus, thecausative agent of onchocerciasis, which maylead to irreversible blindness. In cooperationwith the Bernhard-Nocht-Institute for TropicalMedicine in Hamburg, the structure of twoextracellular glutathion-S-transferases fromthe parasite with 4 or 5 N-glycosylation siteshave been elucidated. The glycosylationpattern of these secretory proteins wascharacterized for each individual glycosylationsite using HPLC/MS, MALDI/TOF-MS andESI-MS/MS. The high relevance of the

Structure Analaysis (QF 2.3)

glycans for the antigen recognition of thehuman immune system was demonstrated bycomparison of the immune response fornatural glycosylated and recombinant non-glycosylated proteins. The results show theimportance of the correct posttranslationalmodification of proteins with are candidatesfor the development of vaccines.

Publications ❘ VeröffentlichungenHofmann B, Budde H, Bruns K, Guerrero SA, Kalisz H M, Menge U, Montemartini M,Nogoceke E, Steinert P, Wissing JW, Flohé L,Hecht HJ (2001) Structures of tryparedoxinsrevealing interaction with trypanothione, BiolChem 382:459-471.


144Highlights from Research and Development Networking Task: Structures of Biological Macromolecules

Strukturelle Charakterisierung mikrobieller Pathogentitäts-faktoren (QF 2.4)

Projektleiter ❘ Project leader: Priv.-Doz. Dr. D. Heinz ❘ Nachwuchsforschergruppe StrukturMikrobieller Pathogenitätsfaktoren ❘ Junior Research Group Structure of Pathogenic MicrobialFactors

Projekmitarbeiter ❘ Project members: I. Astner, M. Barzik, V. Beier, S. Ehinger, S. Frese, M. Machner, K. Schober,W.-D. Schubert, J. Moser (Gastwissenschaftler – TU Braunschweig)

Virulenzfaktoren aus Listeriamonocytogenes

Listeria monocytogenes ist ein human-pathogenes Bakterium, das auf Grundintensiver Erforschung inzwischen alsModellsystem für fakultativ intrazelluläreErreger etabliert ist. Die Infektion erfolgtmeist über kontaminierte Lebensmittelund kann zu schweren Erkrankungen(Listeriose) führen. Das Bakterium verfügtüber eine begrenzte Anzahl von Proteinen,sogenannter Virulenzfaktoren, die dasEindringen und die Fortbewegung derBakterien in der Wirtszelle ermöglichen.Ziel einer Kooperation mit J. Wehland(GBF) und T. Chakraborty (Univ. Giessen)ist die Strukturbestimmung listeriellerVirulenzfaktoren.

Wir konnten kürzlich die Kristall-strukturen der funktionellen Domänenmehrerer Internaline (InlB, InlE und InlH)bei hoher Auflösung aufklären (Abb. 1).Internaline vermitteln das Eindringen derBakterien in die Wirtszelle. Charakteristi-sches Strukturmerkmal aller Internaline isteine einzigartige „Internalin-Super-domäne“, die eine neuartig fusionierteImmunoglobulin-Domäne enthält. Die

Internalin-Strukturen erlauben die Identi-fikation von Oberflächenbereichen,welche wahrscheinlich für diezellspezifische Invasion verantwortlichsind. Durch gezielten Aminosäureaus-tausch mittels gerichteter Mutagenese undVerwendung von Invasionsassays sind wirnun erstmals in der Lage, die Rolle einzel-ner Aminosäuren für die Invasion undStabilität der Proteine zu ermitteln.

Abb. 1. Struktur derRezeptor-Bindungsdomänevon Internalin B aus L.monocytogenes.

Fig. 1. Structure of thereceptor-binding domain ofinternalin B from L.monocytogenes.

Die Nachwuchsforschergruppe „Strukturelle Charakterisierung mikrobiellerPathogenitätsfaktoren“ beschäftigt sich mit der Aufklärung der Raumstruktur vonBiomakromolekülen mittels Röntgenstrukturanalyse. Der Schwerpunkt der Untersu-chungen liegt auf Virulenzfaktoren aus humanpathogenen Bakterien sowie ihrerInteraktionspartner in der Wirtszelle. Darüberhinaus beschäftigen wir uns mit derStrukturaufklärung von Enzymen der bakteriellen Tetrapyrrolbiosynthese und Proteinendes eukaryontischen Zytoskeletts. Die Strukturen sollten unsere Erkenntnisse überbakterielle Infektionen auf molekularer und atomarer Ebene entscheidend vergrößernsowie eine Grundlage für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe zur gezielten Bekämp-fung pathogener Keime schaffen.

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Das Protein ActA ist ein weiterer wichtigerlisterieller Virulenzfaktor. Es ermöglichtdie Bewegung der geissellosen Bakterieninnerhalb der Wirtszelle durch spezifischeRekrutierung von Aktin aus dem Zyto-skelett der Wirtszelle. Die zentrale Domä-ne des Proteins enthält vier repetitiveprolinreiche Regionen (KonsensussequenzFPPPP), die spezifisch mit den EVH1-Domänen der eukaryontischen Ena/VASP-Proteinfamilie interagieren. Diese Wech-selwirkungen führen zu einem signifikan-ten Anstieg der Aktinrekrutierung. ImRahmen einer Kooperation mit C.Urbanke (MHH Hannover) konnteerstmals eine 1:4-Stöchiometrie für denActA-EVH1-Komplex experimentell unterVerwendung einer analyzischen Ultra-zentrifuge ermittelt werden. Desweiterenkonnte gezeigt werden, dass ActA, imGegensatz zu früher publizierten Berich-ten, als monomeres Protein aktiv ist.

Es gelang uns außerdem einen weiterenlisteriellen Virulenzfaktor, Listeriolysin,der für das Entkommen der Bakterien ausdem Phagulosom unmittelbar nach derInvasion verantwortlich ist, zu produzie-ren und zu reinigen. Erste Kristallisations-versuche sind im Gange. PrfA ist derzentrale transkriptionelle Aktivator deslisteriellen Virulenzgenclusters. DasProtein wurde ebenfalls gereinigt und fürKristallisationsversuche eingesetzt.

Enzyme der bakteriellen Tetrapyrrol-biosynthese

Die Tetrapyrrolbiosynthese ist einubiquitärer und zentraler anabolerStoffwechselweg, der zur Bildungwichtiger Tetrapyrrole, wie z. B. Häm,Sirohäm, Chlorophyll und Vitamin B

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aus einfachen Vorläufermolekülen führt.Im Rahmen einer Kooperation mit derArbeitsgruppe von D. Jahn (TU Braun-schweig) interessieren wir uns für dieStrukturanalyse von Enzymen dieseswichtigen Stoffwechselweges. Kürzlichgelang es uns die erste Kristallstruktureiner Glutamyl-tRNA-Reduktase (GluTR)aufzuklären. Das Enzym katalysiert denersten Schritt der Tetrapyrrolbiosynthesein Pflanzen und den meisten Bakterien,die Reduktion von tRNA-aktiviertemGlutamat zu Glutamat-Semialdehyd. DerAldehyd wird anschließend durch eineAminomutase (GSAM) transaminiert, was

zur Bildung des ersten gemeinsamenVorläufermoleküls aller Tetrapyrrole,Aminolävulinsäure (ALA), führt.Die dimere GluTR weist eine ungewöhn-liche V-förmige Struktur auf, in der einelange α-Helix jedes Monomer durchläuft(Abb. 2). Das aktive Zentrum konntedurch Kokristallisation des Enzyms mitdem kompetitiven Inhibitor Glutamycinlokalisiert werden, was uns in die Lageversetzte, den katalytischen Mechanismusdes Enzyms bei atomarer Auflösungabzuleiten. Die Modellierung des SubstratsGlutamyl-tRNA auf das Enzym zeigt einehohe strukturelle Komplementaritätzwischen Substrat und Enzym, welcheauch die Anticodon-Region der tRNA miteinschließt. Die Struktur der GluTR legtaußerdem nahe, dass vermutlich ein ternärerKomplex aus GluTR, GSAM und Glutamyl--tRNA für die effiziente Bildung von ALAverantwortlich ist.

Da sowohl GluTR als auch GSAM inMensch und Tier nicht vorkommen, bestehtein beträchtliches Interesse an beidenProteinen für die Entwicklung neuer Anti-biotika und Herbizide.

Weitere ProjekteDas Enzym Tubulin-Tyrosin-Ligase (TTL)katalysiert die ribosomenunab-hängige Tyrosinierung des C-Terminus deszytoskelettalen Proteins α-Tubulin. Da dieseTyrosinierung die Entwicklung eukaryon-tischer Zellen in kritischer Weise beein-flusst, ist die Strukturaufklärung des Enzymsvon großem Interesse. TTL aus Schweinwurde rekombinant in E. coli produziert,gereinigt und kristallisiert. Eine Optimie-rung der Kristallisationsbedingungen istim Gange.


146Highlights from Research and Development Networking Task: Structures of Biological Macromolecules

Virulence factors of L. monocytogenesListeria monocytogenes is a humanpathogen, and an established model system tostudy facultative intracellular bacteria.Infection through food contamination canlead to listeriosis, an often fatal disease. Thebacteria produce a limited number of proteins,so-called virulence factors, that are responsiblefor the penetration of the host cell andmovement within the host. In collaborationwith the groups of J. Wehland (GBF) and T.Chakraborty (Univ. Giessen) we aim toelucidate the structures of these proteins.We were able to determine the high resolutioncrystal structures of the functional domains ofseveral internalins (InlB, InlE and InlH)(Fig. 1). Internalins mediate the invasion ofthe host cell by the bacteria. Common to allinternalins is a structurally unique “internalinsuperdomain” that contains a novel domainfusion involving an immunoglobulin domain.We also identified regions at the surface ofinternalins that may be responsible for host-cell specific invasion. The use of site-directedmutagenesis and invasion assays will allow usto determine the role of individual aminoacids in the invasion process and the stabilityof the proteins.

ActA is another critical virulence factor ofL. monocytogenes. It allows for themovement of the otherwise immobile bacteriain the host cell by recruiting the host’scytoskeletal actin. A central domain of theprotein contains four repetitive proline-richregions (sequence FPPPP), that interact withthe EVH1-domains of the Ena/VASP-family ofproteins. These interactions lead to a dramatic

Structural Characterization of Bacterial VirulenceFactors (QF 2.4)

The junior research group “Structural characterization of bacterial virulence factors” aims todetermine the three-dimensional structure of biomacromolecules using X-ray crystallography. Inparticular we focus on virulence factors from human pathogenic bacteria as well as theirinteracting partners in the host cell. In addition we are interested in enzymes involved in thebacterial tetrapyrrole biosynthesis and selected eukaryotic cytoskeletal proteins. The three-dimensional structures should broaden our knowledge about bacterial infections at the atomic leveland lay the foundation for the development of novel drugs against pathogenic bacteria.

increase in actin recruitment. In acollaboration with C. Urbanke (MHHHannover) a 1:4 stoichiometry of the ActA-EVH1-complex was experimentallydetermined using analytical ultracentrifu-gation. Furthermore we were able to show thatActA is a monomeric protein in contrast topreviously published reports.

We were also able to produce and purifyanother listerial virulence factor, listeriolysin,responsible for the escape of the bacteria fromthe phagosome after invasion. Crystallizationstrials are in progress. PrfA is the centraltranscriptional regulator of the listerialvirulence gene cluster. The protein waspurified and subjected to first crystallizationtrials.

Enzymes of the bacterial tetrapyrrolebiosynthesis

The tetrapyrrole biosynthesis is a ubiquitousand central anabolic pathway leading to theformation of essential tetrapyrroles such asheme, siroheme, chlorophyll and vitamine B

12

from simple precursors. In collaborating withthe group of D. Jahn (TU Braunschweig) wefocus on the elucidation of the 3D-structuresof enzymes belonging to this pathway.Recently, we have solved the first crystalstructure of a glutamyl-tRNA-reductase(GluTR). This enzyme catalyzes the first stepof tetrapyrrol biosynthesis in plants and mostbacteria, the reduction of a tRNA-activatedglutamate to glutamate-semialdehyde. Thealdehyde is subsequently transaminated by anaminomutase (GSAM) to yield the commonprecursor of all tetrapyrrols, aminolevulinicacid. The dimeric GluTR has an unusual V-like shape dominated by a long curved α-helixrunning through each monomer (Fig. 2). Theactive site was located by cocrystallizing theenzyme with the competitive inhibitorglutamycin. We were thus able to derive the

147

catalytic mechanism at atomic resolution.Modeling of the substrate glutamyl-tRNAshowed a striking structural complementaritybetween the large substrate and the enzymethat also includes the anticodon region of thetRNA. Based solely on the structure of GluTR,we also hypothesize that GluTR, GSAM andglutamyl-tRNA form a ternary complex toefficiently catalyze the first two steps oftetrapyrrole biosynthesis. As humans andanimals do not have GluTR and GSAM, theseproteins are of considerable interest as targetsfor the development of novel antibiotics andherbicides.

Other projectsThe enzyme tubulin-tyrosine ligase (TTL)catalyzes the non-ribosomal tyrosination of theC-terminus of cytoskeletal α-tubulin. Becauseof the critical correlation between tubulintyrosination and cell development, structure-function studies on this unusual enzyme are ofgreat interest. Porcine TTL was recombinantlyproduced from E. coli and purified. We arepresently optimizing crystallization conditionsto produce larger crystals of the protein.

Abb. 2. Struktur derGlutamyl-tRNA-Reduktaseaus Methanopyrus kandleri.

Fig. 2. Structure of glutamyl-tRNA-reductase fromMethanopyrus kandleri.


Publications ❘ VeröffentlichungenBarzik M, Schubert W-D, Carl UD, WehlandJ, Heinz DW (2000) Crystallization andpreliminary X-ray analysis of the EVH1domain of Vesl-2b. Acta Crystallogr Section D56:930-932.

Barzik M, Carl UD, Schubert W-D, Frank R,Wehland J, Heinz DW (2001) The N-terminal domain of Homer/Vesl is a new classII EVH1 domain. J Mol Biol 309:155-169.

Schubert W-D, Göbel G, Diepholz M, DarjiA, Kloer D, Hain T, Chakraborty T, WehlandJ, Domann E, Heinz DW (2001) Internalinsfrom the human pathogen Listeriamonocytogenes contain a fused superdomainstructure. J Mol Biol 312:783-793.

Schubert W-D, Göbel G, Kloer D,Chakraborty T, Wehland J, Domann E, HeinzDW (2001) Crystal strukture of the conservedcore of internalins from the human pathogenListeria monocytogenes. Nova Acta LeopoldSupp 16:29-31.

Machner MP, Urbanke C, Barzik M, Otten S,Sechi A S, Wehland J, Heinz DW (2001)ActA from Listeria monocytogenes can interactwith up to four Ena/VASP homology domainssimultaneously. J Biol Chem, in press

Moser J, Schubert W-D, Beier V, BringemeierI, Jahn D, Heinz DW (2001) V-shapedstructure of glutamyl-tRNA-reductase, the firstenzyme of tRNA-dependent tetrapyrrolebiosynthesis. EMBO J, in press

Co-operations ❘ KooperationenProf. Dr. G. S. Chhatwal, Dr. S.Hammerschmidt, Dr. M. Probst-Kepper, Prof.Dr. J. Wehland, Dr. S. Weiss (GBF); Prof.Dr. D. Jahn, Prof. Dr. B. Jockusch (TUBraunschweig); Prof. Dr. T. Chakraborty(Univ. Giessen); Prof. Dr. C. Urbanke(MHH Hannover); Prof. Dr. R. Seckler(Univ. Potsdam).

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TU Lehrstuhl für Physiologische Chemie in der GBF

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten TU Lehrstuhl für Physiologische Chemie149

Leiter ❘ Leader: Prof. Dr. Dr.h.c. L. Flohé ❘ Arb. Gr.Chemische Mikrobiologie ❘Res. Group of ChemicalMicrobiology Selenbiochemie: Sex und Selen

ProjektleiterProf. Dr. Dr. h.c. L. Flohé

Im vorangegangenen Band berichteten wirüber unsere überraschende Entdeckung,dass die Mitochondrienkapsel im Mittel-stück von Spermatozoen bis zu 50 % ausdem Selenprotein Phospholipidhydrope-roxid-Glutathionperoxidase (PHGPx)besteht. Während der letzten Schritte derSpermienreifung wird PHGPx aus einerlöslichen aktiven Peroxidase in ein enzym-atisch inaktives Strukturprotein umgewan-delt (Ursini F et al. (1999) Science285:1393-96). Der Mechanismus dieserMetamorphose konnte zwischenzeitlichzum Teil aufgeklärt werden: In der Endpha-se der Spermatogenese oxidiert PHGPxmit Hilfe von Peroxiden Proteinthioleanstatt Glutathion und bildet so ein dreidim-ensionales Netz oxidierter Proteine. Die

Relevanz der PHGPx für die männlicheFertilität wurde erhärtet durch inverseGenetik bei Mäusen (berichtet von M.Brielmeier, GSF, anläßlich „Selenium2000" in Venedig) und Studien zur Korre-lation von PHGPx-Gehalt und Fertilisatio-nskapazität menschlicher Spermien[Kooperation mit F. Ursini, UniversitätPadua]. (Abb. 1)

Oxidationsschutz in pathogenen ProtozoenProjektleiterProf. Dr. Dr. h.c. L. Flohé

Das Trypanothion-vermittelte Oxidations-schutzsystem, das wir 1997 in demInsektenpathogen Crithidia fasciculataentdeckten, wurde in human- undtierpathogenen Trypanosomatiden wieTrypanosoma cruzi, T. brucei brucei, T. bruceirhodesiense, Leishmania donovani, L. majorund L. infantum nachgewiesen. DerStoffwechselweg wurde anderenorts alsessentiell für die Vitalität und Virulenzvon T. brucei belegt.

Eine repräsentative Auswahl beteiligterEnzyme, z. B. Tryparedoxine und Trypare-doxin-Peroxidasen, wurde gentechnischfür funktionelle und strukturelle Studienhergestellt, um rationales Inhibitor-Designvorzubereiten. Die molekulare Interaktionvon Tryparedoxinen mit Trypanothionwurde durch gezielte molekulareMutagenese, Modellierung und Röntgen-Strukturanalyse aufgeklärt. Mit ähnlichenVorgehensweisen wurde die katalytischeTriade der Tryparedoxin-Peroxidasen, inder ein Cystein durch ein Arginin und

Die Abteilung Biochemie der Technischen Universität Braunschweig, die von der GBFbeherbergt und teilfinanziert wird, beschäftigt sich im Wesentlichen mit der Identifizie-rung, Herstellung, Charakterisierung und Validierung molekularer Targets für dieWirkstoffsuche. Konkret werden Enzymsysteme untersucht, die der Utilisation oderDetoxifikation von Peroxiden dienen. Die Zielfelder umfassen die Steuerung der männli-chen Fertilität und die Therapie von Infektionskrankheiten.

Abb. 1. Selen, das Elementdes Mondes, im Zentrum derkatalytischen Triade derGlutathion-Peroxidasen[nach L. Flohé: Biospektrum(2) 2000, 112]

Fig. 1. Selenium, theelement of the moon, in thecenter of the catalytic triadof glutathione peroxidases[adapted from L. Flohé:

Biospectrum (2) 2000, 112]

Mitarbeiter ❘ Members: M. Bittner, H. Budde, M. Comini, B. Hofmann, T. Jäger, H. Kollmus, U. Menge, S. Pilawa,K. Plank-Schumacher, M. Singh, H. Sztajer, S. Tschurz, J. Wissing, C. Wylegalla

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Wasserstoffbrücken-Bindung mit derHydroxylfunktion eines Threonins oderSerins aktiviert wird, aufgeklärt [Koopera-tion mit H. J. Hecht, GBF, A. Tomas,Universität Porto, und W. Colli, Universi-tät São Paulo]. (Abb. 2)

Ein Gen des Malariaparasiten Plasmodi-um falciparum, das nach Sequenzho-mologie für eine typische Glutathion-Peroxidase kodieren sollte, wurde in E. coliexprimiert. Die Untersuchung vonEffizienz und Spezifität des Enzyms ergabein weiteres Beispiel funktioneller Diversi-fikation in der molekularen Evolution:Das vermeintliche Glutathion-Peroxidase-Gen kodierte für ein Thioredoxin-Peroxi-dase [Kooperation mit Ch. Slomianny,Institute Pasteur, Lille].

Antigene und Virulenzfaktoren pathoge-ner MykobakterienProjektleiterProf. Dr. M. Singh

Putative Komponenten des Antioxi-dationssystems von Mykobakterien wieAhpC und Mykothiol-Reduktase wurdenkloniert und in E. coli exprimiert. DieReinigung von Mykothiol und derMykothiol-Reduktase wird zur Zeit durch-geführt (DFG-Projekt). In einem EU-Projekt (TB-Vakzinentwicklung) wudendrei Protein- und zwei DNA-Vakzin-Kandidaten aufgereinigt und als Endotoxin-freie Präparate hergestellt. Diese Vakzinkan-didaten werden zur Zeit von unserenPartnern in Mäusen getestet.

Veröffentlichungen ❘ Publicationsda Fonseca DP, Frerichs J, Singh M, SnippeH, Verheul AF (2000) Induction ofantibody and T-cell responses byimmunization with ISCOMS containingthe 38-kilodalton protein ofMycobacterium tuberculosis. Vaccine19:122-131.

Flohé L, Andreesen J R, Brigelius-Flohé R,Maiorino M, Ursini F (2000) Selenium,the Element of the Moon, in Life on Earth.IUBMB Life 49:411-420.

Highlights from Res. and Development GBF Hosted Dep. of Physiological Chemistry of TU Braunschweig

Guerrero SA, Lopez JA, Steinert P,Montemartini M, Kalisz HM, Colli W,Singh M, Alves MJM, Flohé L (2000) His-tagged tryparedoxin peroxidase ofTrypanosoma cruzi as a tool for drugscreening. Appl Microbiol Biotechnol53:410-414.

Lopez JA, Carvalho TU, de Souza W, FlohéL, Guerrero SA, Montemartini M, KaliszHM, Nogoceke E, Singh M, Alves MJM,Colli W (2000) Evidence for aTrypanothione-dependent PeroxidaseSystem in Trypanosoma cruzi. Free RadBiol Med 28:767-772.

Hofmann B, Budde H, Bruns K, GuerreroSA, Kalisz HM, Menge U, MontemartiniM, Nogoceke E, Steinert P, Wissing JB,Flohé L, Hecht H-J (2001) Structures ofTryparedoxins Revealing Interaction withTrypanothione. Biol Chem 382:459-471.

Jepson A, Fowler A, Banya W, Singh M,Bennett S, Whittle H, Hill AV (2001)Genetic regulation of acquired immuneresponses to antigens of Mycobacteriumtuberculosis: a study of twins in WestAfrica. Infect Immun 69:3989-3994.

Sztajer H, Gamain B, Aumann K-D,Slomianny C, Becker K, Brigelius-Flohé R,Flohé L (2001) The Putative GlutathionePeroxidase Gene of Plasmodiumfalciparum Codes for a ThioredoxinPeroxidase. J Biol Chem 10:7397-7402.

Abb. 2. Die neuartigekatalytische Triade vonPeroxiredoxinartigen Peroxi-dasen. In der N-terminalenDomaine der Tryparedoxin-Peroxidase von L. donovanibildet Cys 52 eine Wasser-stoffbrücke mit Thr 48 undwird elektrostatisch durchArg 128 aktiviert. In dieserTriade wird Cys 52 durchH2O2 zu einem Derivat derunterschwefligen Säure oxi-diert, das dann mit Cys 172einen zweiten Untereinheitzur oxidierten Peroxidasereagiert [unveröffentlicht].

Fig. 2. A novel catalyticaltriad as is typical ofperoxiredoxin-type peroxi-dases: In the N-terminaldomain of tryparedoxinperoxidase of L. donovaniCys 52 is hydrogen-bondedto Thr 48 and electro-statically activated by Arg128. In this triad the Cys 52is oxidized by H2O2 to asulfenic acid derivativewhich then reacts with Cys172 of a second subunit toform the oxidizedperoxidase [unpublished].

Forschungs- und Entwicklungsarbeiten TU Lehrstuhl für Physiologische Chemie151

Selenium Biochemistry: Sex and SeleniumProject leaderProf. Dr. Dr. h.c. L. Flohé

In the 1999/2000 issue we had reported onour surprising finding that the mitochondrialcapsule in the midpiece of spermatozoaconsists up to 50 % of the selenoproteinphospholipid hydroperoxide glutathioneperoxidase (PHGPx). During the final stepsof sperm maturation PHGPx is tranformedfrom a soluble active peroxidase into anenzymatically inactive structural protein.(Ursini F et al. (1999) Science 285:1393-1396). The mechanism of this “moon-lighting” process could meanwhile be partiallyelucidated: During late spermatogenesisPHGPx oxidizes protein thiols instead ofglutathione at the expense of hydroperoxidesto generate a threedimensional network ofoxidatively cross-linked proteins. The relevanceof PHGPx to male fertility could be supportedby inverse genetics in mice (reported by M.Brielmeier, GSF, at Selenium 2000 in Venice)and studies on the correlation of PHGPxcontent and fertilisation capacity of humansperm [cooperation with F. Ursini, Universitàdi Padova]. (Fig. 1)

Antioxidant defense in pathogenicprotozoaProject leaderProf. Dr. Dr. h.c. L. Flohé

The trypanothione – mediated antioxidantdefense system that had been discovered by usin 1997 in the insect-pathogen Crithidiafasciculata was demonstrated to be operativein trypanosomatids pathogenic to man andlife stock such as Trypanosoma cruzi, T.brucei brucei, T. brucei rhodesiense,Leishmania donovani, L. major and L.infantum. The pathway has elsewhere beenvalidated as to be pivotal for vitality andvirulence of T. brucei brucei.

A representative set of involved enzymes,in particular tryparedoxins and tryparedoxinperoxidases, were prepared by recombinant

techniques for functional and structuralstudies to pave the road for rational inhibitordesign. The molecular interaction oftryparedoxins with trypanothione waselucidated by combination of site-directedmutagenesis, molecular modelling and x-raycrystallography. By related techniques thecatalytic triad of tryparedoxin peroxidases wasshown to be built up by a cysteine residueactivated by a neighbouring arginine and byhydrogen bonding of the hydroxyl function ofa threonine or serine residue [cooperationwith H. J. Hecht, GBF, A. Tomas, Universityof Porto, and W. Colli, University of SãoPaulo]. (Fig. 2)

A gene of the malaria parasitePlasmodium faciparum gene presumed,according to sequence homology, to encode atypical glutathione peroxidase was expressedin E. coli: Investigation of efficiency andspecificity of the enzyme revealed anotherexample of functional diversification inmolecular evolution: The putative glutathioneperoxidase gene encoded a thioredoxinperoxidase [cooperation with Ch. Slomianny,Inst. Pasteur, Lille]

Antigens and virulence factors ofpathogenic mycobacteriaProject leaderProf. Dr. M. Singh

Several putative components of mycobacterialanti-oxidative defense system have beencloned and expressed in E.coli. Prominentamong these are AhpC and mycothiolreductase. Purification of mycothiol andmycothiol reductase is in progress (DFG-funded). In an EU-funded project, severalvaccine candidates have been identified fornasal vaccination against tuberculosis. DNAand proteins of the vaccine candidates havebeen purified as highly homogeneous,endotoxin-free preparations which arecurrently being tested in mice by our partners.

GBF Hosted Department of Physiological Chemistry of TUBraunschweig

The Department of Biochemistry of the Technical University of Braunschweig, which is hosted andpartially financed by the GBF, is essentially engaged in identification, production, characterisationand validation of molecular targets for drug discovery. More precisely, enzymatic systems in chargeof utilisation and detoxification of peroxides, are investigated. The fields of potential applicationscomprise the manipulation of male fertility and the therapy of infection diseases.

Seite 153/154Beobachtung des automati-sierten Reinigungsprozesseswährend der Entwicklungs-phase der Reinigungs-routinen.

Page 153/154Observation of theautomated cleaning-in-placeprocess during cleaningroutine development.

Dienstleistungen155

Scientific Services Bio Pilot Plant Unit andCell Culture Plant

• Design and optimisation of processes forcultivation of microorganisms and cellcultures and the recovery of bioproducts,which includes i.a.• scale-up from laboratory recipes toproduction scale (up to 2000 l cultivationvolume in case of microorganisms)• analysis and improvement of singleprocess steps like cultivation, cellseparation, cell disruption or any type offiltration process• adaptation of cells to serumfree media

• Production of bioproducts for research oruse as test material like recombinant E.coli-biomass or HeLa-cell mass for researchlabs, proteins for stucture research,enzymes or low molecular weightcompounds

Spektrum wissenschaftlicher Dienstlei-stungen Biotechnikum/BRT und ZKT

• Design und Optimierung von Prozes-sen zur Kultivierung von Mikroorganis-men und Zellkulturen und zur Isolie-rung biotechnologischer Produkte, u.a.• Scale-up von der Laborvorschrift inden Produktionsmaßstab (bis zu 2000 lKulturvolumen bei Mikroorganismen)• Analyse und Verbesserung einzelnerProzeßschritte wie Kultivierung,Zellabtrennung, Zellaufschluß oderjegliche Art von Filtrationsprozessen• Adaption von Zellkulturen anserumfreie Medien

• Produktion biotechnologischerProdukte für die Forschung oder zurVerwendung als Testmaterial wie z.B.

Biotechnikum

Leiter ❘ Head: Dr. A. Roß ❘ Arb. Gr. Bioreaktionstechnik ❘ Res. Group BioreactionTechniques

Bio Pilot Unit

Biomasse von rekombinantem E. colioder HeLa-Zellmasse für Forschungs-laboratorien, Proteine für die Struktur-forschung, Enzyme oder nieder-molekulare Produkte

• Validierungsstudien wie z.B. zur Frageder Sterilisierbarkeit von Geräten undAnlagen

• Beratung in jeder Frage, die im Zusam-menhang steht mit biotechnologischenProzessen für die Produktion vonProteinen und anderen Produkten ausMikroorganismen und Zellkulturen.Tiefgehende Erfahrungen liegen vor mitProduktionssystemen wie rekombinan-tem E. coli, P. pastoris und Baculovirus;sie sind jedoch nicht auf diese Systemebegrenzt.

• Validation studies like sterilisability ofequipment

• Consulting in case of any question referringto biotechnological processes for productionof proteins and other products frommicroorganism and cell cultures. Indepthexperience is available, but not limited to,for recombinant E. coli, P. pastoris andBaculovirus as production systems.

GMP-Technikum

Services 156

Leiter ❘ Head: Dr. H. Ziehr ❘ Arb. Gr. GMP-Technikum ❘ Res. Group GMP Pilot Plant

GMP Unit

Die Arbeitsgruppe GMP Technikum (s.a.QF 1.3) führt weitestgehend im Unterauf-trag für Klienten aus der pharmazeutischchemischen- und Biotech-Industrie F&E-Projekte durch. Dabei handelt es sich umdie Bearbeitung vornehmlich bioverfah-renstechnischer- und arzneimittelrecht-licher Fragestellungen, die im Rahmen derHerstellung neuer zumeist rekombinanterPharmawirkstoffe auftreten. Es gilt dabeidie arzneimittelrechtlichen Anforderungen,insbesondere aber das Qualitätssiche-rungssystem „Gute Herstellungspraxis“(GMP) auf Herstellungsprozesse abzubil-den. Das Leistungsspektrum beinhaltet• die Optimierung und Maßstabsver-

größerung von Kultivierungsverfahrenmit Mikroorganismen und tierischenZellen,

• die Entwicklung präparativer Reini-gungsverfahren für rekombinanteProteine und Nukleinsäuren,

• die Entwicklung und Validierung von

The GMP pilot plant group (s. a. QF 1.3)carries out R&D projects predominantly forclients in the pharmaceutical and biotechindustries. Generally, these projects focus onbiochemical engineering and regulatoryquestions encountered in the production ofnovel, usually recombinant pharmaceuticalsubstances. Such projects are carried outwithin the legal requirements forpharmaceutical development, especially withrespect to “Good Manufacturing Practice“(GMP). The service spectrum includes• optimisation and scale up of cultivation

steps with microbial and animal cells,• development of preparative purification

schemes for recombinant proteins andnucleic acids,

• development and validation of analyticalmethods for in-process and final productcontrols,

analytischen Verfahren für InProzess-kontrollen sowie Produktfreigabe,

• die Validierung von einzelnen Prozess-schritten innerhalb von Biotech-Herstellungsverfahren sowie

• die entsprechende Validierung desGesamtprozesses (Konsistenz).

Soweit erforderlich erfolgen die Arbeitenunter der Berücksichtigung des GMP-Reglements mit einer Herstellungs-erlaubnis gem. § 13 des Arzneimittelgeset-zes (AMG). So hergestellte Wirkstoffekönnen anschließend damit zu klinischenPrüfmustern weiterverarbeitet werden.

Mit dem Institut für pharmazeutischeTechnologie der Technischen UniversitätBraunschweig besteht eine enge Zusam-menarbeit, über die es möglich ist, auchFragestellungen der Stabilitätstestung,Formulierung und galenischen Entwick-lung zu bearbeiten. Kleinstmengen vonDarreichungsformen (Klinikprüfmuster)können hergestellt werden.

• validation of single steps within theproduction process, and

• validation of the whole process(consistency).The work is done unter GMP rules when

required. The substances produced cansubsequently be formulated and used withinclinical studies.

Strong contacts exist between the group andthe “Institut für pharmazeutische Technolo-gie“ at the Technical University of Braun-schweig which enable questions on stability,formulation and galenic development to beaddressed. Smale volumes of substances forclinical trials can be produced.

Instrumentelle Analytik

Dienstleistungen157

Leiter ❘ Leader: Dr. V. Wray ❘ Abt. Strukturforschung ❘ Dept. of Structure Research

Mitarbeiter ❘ Members: U. Beutling, R. Christ, H.-J. Hecht, H. Kalisz, M. Nimtz

NMR-Spektroskopie und Massen-spektrometrie:

Die Strukturen sowohl von nieder-molekularen als auch hochmolekularenNaturstoffen können mittels der Kombi-nation moderner massenspektrometrischerTechniken mit multidimensionalen NMRVerfahren aufgeklärt werden. Im Allgemei-nen wird folgende Vorgehensweise gewählt:Die komplette Struktur von nieder-molekularen Naturstoffen wird routine-mäßig mittels einer Kombination von EI/CI/ESI-MS mit 1D und 2D 1H und 13CNMR Spektrometrie aufgeklärt. DieIdentität von Molekülteilen und derenVerknüpfung kann im Normalfall vondem 2D 1H COSY/TOCSY und 1Hdetektiertem 13C-1H Korrelationenabgeleitet werden. 1H Kern-Overhauser-Effekt Experimente liefern zusätzlicheInformationen über Konfiguration undKonformation. Die Massenspektrometrieliefert das Molekulargewicht und dasFragmentierungsverhalten des jeweiligenMoleküls. Diese Informationen bestätigenund erweitern die Daten, die von denNMR Experimenten geliefert werden.Zudem sind auch extrem geringe Substanz-mengen sowie Substanzgemische massen-spektrometrischen Untersuchungenzugänglich.

Die direkte massenspektrometrischeAnalyse großer intakter Biomoleküle wieProteine, Oligonukleotide und komplexeKohlenhydrate ist routinemäßig mittelsMALDI/TOF und ESI möglich. DieSekundär- und Tertiärstruktur vonPeptiden und Proteinen bis zu einemMolekulargewicht von 20 kDA kann durcheine Kombination von 2D/3D homo- undheteronuklearer Korrelations-NMRerhalten werden, wenn genügend iso-topenmarkiertes (15N, 13C) Proteinmaterialvorhanden ist.

Ein Schwerpunkt der makromolekularenForschung liegt auch auf der massenspek-trometrischen Untersuchung von Glyko-proteinen, deren Oligosaccharidanteilmittels von in der Abteilung entwickeltenESI-MS/MS-Techniken und hydrolytischenMikroderivatisierungsmethoden, die dieKohlenhydratzusammensetzung und dieAufklärung der Verknüpfung der verschie-denen Monosaccharidbausteine („Methyl-ierungsanalyse“) erlauben, charakterisiertwird. Derzeit wird an der Miniaturisierungder genannten Techniken gearbeitet, umselbst mit dem aus 2D Gelen isoliertenGlykoproteinmaterial noch strukturelleDaten des Oligosaccharid-Anteils zuerhalten. Als weiterer Schwerpunkt wurdeim vergangenen Jahr die massenspektro-metrische Mikrotechnik zur Identifizie-rung und Charakterisierung von Proteinenaus 2 D Gelen („Proteomics“) anhand desMolekulargewichts ihrer proteolytischenFragmente mittels MALDI/TOF-MS weiterintensiv genutzt und die Automatisierungder Arbeitsabläufe vorangetrieben. Fallsdurch diese Technik keine eindeutigeIdentifizierung von Gel-Spots möglichwar, wurde die massenspektrometrische(Partial)-Sequenzierung dieser Peptid-fragmente aus der ungereinigten proteoly-tischen Mischung mittels ESI-MS/MSroutinemässig eingesetzt (Qtof 2), wasinsbesonders für nicht homogene Protein-Spots bzw. modifizierte Proteine die besteMöglichkeit zur Charakterisierungdarstellt.

Im Rahmen der analytischen Arbeiten wurden Massenspektrometrie (MS), Kern-magnetische Resonanzspektroskopie (NMR), Röntgenstrukturanalyse (RSA) und Protein-Sequenzierung eingesetzt.

158Services

Röntgenstrukturanalyse:Meist in Ergänzung oder als Bestätigungvon mittels NMR und Massenspektrometrieerhaltenen Ergebnissen kann im nieder-molekularen Bereich eine Strukturbestim-mung bei Vorliegen geeigneter Kristalle inder Regel mit Hilfe der direkten Methodenroutinemäßig durchgeführt werden, wobeibei Anwesenheit von Atomen mitanomaler Streuung auch die, speziell beiNaturstoffen wesentliche, absoluteKonfiguration der untersuchten Verbin-dung erhalten wird.

Der Schwerpunkt der Röntgenstruktur-analyse lag jedoch eindeutig bei derStrukturanalyse von Proteinen (QF 2.3).Zur Durchführung der bei Proteinenwesentlich aufwendigeren Arbeiten zurKristallisation und Strukturlösung mittelsmolekularem oder isomorphen Ersatzstehen in der Abteilung ein Pipettier-roboter sowie ein Meßplatz mit Flächen-zähler und Drehanodengenerator zurVerfügung, ergänzt durch die von Max-Planck-Instituten und GBF gemeinsambetriebene Meßstation BW6 am DESY, diedie Messung von hochaufgelösten Datenund die Phasenbestimmung über anomaleDispersion ermöglicht. Zur Datenaus-wertung und Analyse der Strukturen sowiezur Modellierung homologer Strukturenstehen in der Abteilung 5 Grafikrechnersowie umfangreiche Rechenmöglichkeitenauf Rechnern des Rechenzentrums zurVerfügung. Die Weiterentwicklung desModellingprogramms Bragi ermöglichtdabei eine flexible Anpassung an neuauftretende Fragestellungen.

Proteinsequenzierung:Die N-terminale Sequenzierung erfolgtmittels automatischem Edman-abbau mitSequenzern von PE-Applied Biosystems(Procise 494A und 473A). Die Sequenz-ierung wurde eingesetzt zur Aufklärungneuer Proteinsequenzen, zur Gewinnungvon Oligonucleotid-Sonden, für die DNA-Sequenzierung bzw. Klonierung, für dieIdentifizierung von Proteinen in Daten-banken, sowie zur Kontrolle von Identitätund Reinheit rekombinant hergestellterProteine. Proben können sowohl inLösung als auch auf PVDF-Membranengebunden im unteren Picomolbereichanalysiert werden. Die durchschnittlicheSequenzlänge beträgt dabei 17 Aminosäu-

ren. Proteine, die N-terminal blockiertsind bzw. von denen zusätzliche interneSequenzen benötigt werden, werdenenzymatisch oder chemisch gespalten, dieerhaltenen Peptide über Kapillar-HPLCgetrennt und zur Sequenzierung bzw.Aminosäureanalyse eingesetzt.Die Aminosäureanalysen von Proteinenund Peptiden werden zusätzlich mit demAminosäureanalysator PE-ABI 420 A/H impmol-Bereich durchgeführt. Anwendun-gen sind die Quantifizierung von Protein-mengen, die Überprüfung der Reinheitbzw. der Stöchiometrie von synthetischenPeptiden aus der Peptidsynthese, dieIdentifizierung von Peptiden ausproteolytischen Maps anhand ihrerAminosäurezusammensetzung, und derNachweis N-terminaler Blockierungen.

159

NMR Spectroscopy and MassSpectrometry:

The structures of both small and largemolecular weight natural products areaccessible through the combination of modernmass spectrometric and multi-dimensionalNMR spectroscopic techniques. In general, forthe majority of small natural products thetotal structure is elucidated in a routinemanner from the combination of EI/CI/ESIMS and 1D and 2D homonuclear andheteronuclear 1H and 13C NMR spectroscopy.The identity of fragments in the molecule andtheir sequence is normally deduced from 2D1H COSY/TOCSY and 1H-detected multiple-bond 13C-1H data, respectively. Additional 1Hnuclear Overhauser enhancement data affordsconfigurational and conformationalinformation. Mass spectrometric data providesexplicit information on the mass andfragments present that are used to extend andconfirm that gained during NMR studies, andhas the added advantage of providinginformation for very small amounts ofcompound.

The direct analysis of large intactbiomolecules such as proteins, oligonucleotidesand complex carbohydrates is routinelyavailable through the use of MALDI- andESI-MS. While in solution the secondary andtertiary structure of peptides and proteins,with molecular weights up to at least 20,000Daltons, can be elucidated when appropriatelylabelled material (15N and 13C) is availablethrough the application of a combination of2D/3D homo- and heteronuclear correlationNMR spectroscopy. Currently, the emphasisin the macromolecular field has been concen-trated on the MS elucidation of glycoproteins,in particular the characterisation ofoligosaccharides using ESI-MS/MS techniquesand hydrolytic micro-derivatisation methodsdeveloped in the department that allowdetermination of the carbohydrate composition

Instrumental Analytics

and the linkages of the various mono-saccharide units (methylation analysis). Theminiaturisation of the above techniques toallow the extraction of information about theoligosaccharide moiety of glycoproteins evenwith the minute amounts of materialextracted from 2 D gels was a major target in2000. Furthermore, a pronounced effort forthe automatisation of MS micro-techniquesfor the identification and characterisation ofproteins from 2D gels (“Proteomics”) throughthe determination of the molecular weight oftheir proteolytic fragments using MALDI/TOF-MS has been initiated. In those caseswhere unambiguous identification of the gel-spots was not possible, partial MS-sequencingof these from unpurified proteolytic mixtureshas been routinely performed using ESI-MS/MS (Qtof 2). This is the best way for theidentification and characterisation ofheterogenous or modified protein spots.

X-ray Crystallography:Structure determinations of low molecularweight compounds, mostly as a completion orconfirmation of NMR/MS studies, can usuallybe routinely performed on suitable crystalsusing direct methods. The absolute configu-ration of such compounds, valuable especiallyfor natural products, can be determinedprovided atoms with anomalous scattering arepresent.

The main emphasis in X-ray crystallo-graphy lies clearly in the structural analysis ofproteins (see section QF 2.3). In thedepartment a pipette-robot as well as a X-rayunit with an area detector and rotating anodeare available for crystallisation and datacollection. The joint Max-Planck-Institutes/GBF managed beamline BW6 at DESY allowsin addition the measurement of highresolution data and phase determination usinganomalous dispersion. Data processing andstructural analysis, as well as modelling ofhomologous structures, can be performed on 5graphic workstations in the department andon the numerous facilities available in thecomputer centre. Further development of theprogramme Bragi offers flexibility in theaddressing of specific problems.

The instrumental methods available are mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonancespectroscopy (NMR), X-ray crystallography, and protein sequencing.

Dienstleistungen

160

Protein Sequencing:N-terminal protein sequencing is performed byautomated Edman degradation on PE-AppliedBiosystems sequencers (Procise 494A and473A). Applications include elucidation ofnew protein sequences, identification ofproteins in data banks as well as the control ofthe identity and purity of recombinant proteins.Samples may be analyzed in solution as wellas bound to PVDF membranes in the lowpicomole range. The average sequence lengthobtained is 17 amino acids. Proteins, that areN-terminally blocked or for which internal

Services

sequences are required, are cleavedenzymatically or chemically. The resultingpeptides are separated by capillary-HPLC andsubsequently subjected to sequencing as wellas amino acid analysis.

Amino acid analyses of peptites and proteinsare performed on an Applied Biosystems 420A/Hanalyzer in the picomole range. Applicationsinclude protein concentration determination,checking of purity as well as stoichiometry ofsynthetic peptides, identification of peptidesfrom proteolytic maps through the amino acidcomposition and proof of N-terminal blocking.

a Proteinsequenzierung 461 Proben mit 7627 Abbauschritten, sowie 185 Proben mit1106 Aminosäureanalysen. ❘ Protein sequencing of 461 samples with 7627 cleavages, as well as185 samples with 1106 amino acid analyses.b Proben folgender Institute wurden 1999 untersucht: ❘ Samples from the following instituteswere investigated in 2000: Berlin Technische Hochschule, Humboldt-U. Institut fürBiochemie, Institut für Pharmazie; Braunschweig TU-Institut für Anorganische Chemie,Institut für Biochemie und Biotechnologie, Institut für Botanik, Institut für Lebensmittel-chemie, Institut für Organische Chemie, Institut für Pharmazeutische Biologie, Lehrstuhlfür Physiologische Chemie, DSM, Zucker Institut; Dresden U-Klinikum-Institut fürImmunobiologie; Düsseldorf U-Institut für Pharmazeutische Biologie; Giessen U-Veterinär-Institut für Biochemie/Endokrinologie; Greifswald U-Institut für Pharmazie;Halle Institut für Pflanzenbiochemie; Hamburg Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedi-zin, Heinrich-Pette-Institut; Hannover MHH, Tierärztliche Hochschule; Münster Institutfür Pharmazeutische Biologie u. Phytochemie; Paderborn U-Gesamthochschule; WürzburgU-Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie.

Statistical Analysis 2000

2000 NMR MS SEQ

Untersuchte ProbenNo. of samples analysed

% Auslastung durch GBF% Internal GBF useage

% Auslastung durch Kunden% External useage

Anzahl der GBF-KundenNo. of GBF customers

Anzahl externer InstituteNo. of External Institutesb

Instrumentation available

3267

71,1

12

41

28,9

99,4

6480

0,6

75

5

646a

98,6

1,4

61

2

Bruker DPX 300Bruker ARX 400Bruker DMX 600

QTOF II (Micromass)Finnigan GCQFinnigan MAT 95Finnigan TSQ 700Bruker REFLEXJeol JMS HX 110/110A

Applied Biosystems420AAppliedBiosystems 473AAppliedBiosystems 494

Rechenzentrum

Dienstleistungen161

Leiter ❘ Head: Dr. N. Bedorf

Mitarbeiter ❘ Members: K.-D. Aumann, R. Christ, W. Lehnberg, U. Leuner, D. N. Lincoln, J. Reichelt, E. Zimmermann

InternetzugangAnfang Juli 2000 wurde das neue deutscheForschungsnetz (Gigabit-Wissenschafts-netz; kurz G-Win) in Betrieb genommen.Der Anschluss der GBF an diese demamerikanischen Internet-2 vergleichbareInfrastruktur erfolgte im August 2000.

Zur Zeit nutzt die GBF eine Über-tragungsrate von 34 Mbit/sec bei einemmaximalen Volumen von 330 Gigabyte/Monat.

Zur Realisierung des Anschlusseswurden sämtliche Komponenten derInternet-Anbindung, Wanrouter, Firewall,Mailserver, externer und internerWebserver und Modemserver, schrittweisedurch aktuelle Hard- und Software ersetzt.Als Betriebsystem dieser Server setzen wirSuse Linux ein. Die Webserver-, dieProxyserver- und die Mailserver-softwaresind ‘open Source’ Produkte.

Die Netzwerkanbindung der beteiligtenSysteme untereinander erfolgt per Fast-Ethernet mit einem FDDI-Uplink zumBackbone der GBF.

ZentralserverDie zentralen Fileserver (Neon) warennach 6 Jahren Betrieb der gestiegenenAuslastung nicht mehr gewachsen. AlsErsatz wurde eine Doppelprozessor Alpha- Compaq ES40 - mit 2 GByte Arbeitsspei-cher und 500 GByte Plattenkapazität ineinem RAID-Subsystem beschafft. AlsBetriebssystem wird zur Zeit VMS 7.2 mitden PC-Diensten Pathworks eingesetzt.Auf dieser Hardware ist aber auch einWechsel des Betriebssystems zu Tru64Unix oder Linux möglich.

DatenbankserverZwei der Terminalserver für die PCDatenbanken - Current Contents,Medline, Römpp, Duden u.a. - wurdengegen Doppelprozessor PCs PIII 500512MB Arbeitsspeicher ausgewechselt, beizwei weiteren Terminalservern wurde derPentium Pro Prozessor 200 MHz gegenCeleron 500 getauscht. Gleichzeitig wurdedie Plattenkapazität aller Terminalserververgrößert, so dass fast alle Datenbankenjetzt von schnellen Festplatten und nichtmehr von CDs betrieben werden.Das Antwortverhalten dieser Server, ins-besondere unter der Last simultanerZugriffe, konnte hiermit deutlichverbessert werden.

SchulungsraumIm letzten Jahr konnten wir einen neuenRaum für das hausinterne (Computer)-Schulungsprogramm beziehen. Der Raumist mit 13 Pentium III PCs, LCD-Monito-ren, einem Beamer und einem interakti-ven Lernsystem (Schüler-Lehrer DisplaySteuerung) ausgestattet.

Services 162

Computing Centre

Internet accessThe new German Research Network (Gigabit-Wissenschaftsnetz, abbrev. G-Win) was put inoperation in July 2000. This network issimilar to the American internet-2. Theconnection of the GBF followed in August2000.

Currently the GBF uses a transfer rate of34 Mbit/sec with a maximum volume of 330Gigabyte/month.

To implement the connection, variousinternet components - the wan router,firewall, mail server, external and internalweb servers, and modem server were replacedstepwise. Suse Linux was installed as theoperating system in these servers. The webserver, the proxy server, and the mail serverare open-source products. These componentsare interconnected by fast-ethernet with aFDDI uplink to the GBF backbone.

File ServerAfter 6 years of operation the central fileserver (Neon) was unable to meet theincreasing demand. As a replacement, adouble-processor Alpha computer was acquired- a Compaq ES40 - with 2 Gbyte main-memory and 500 Gbyte disk capacity in aRAID-subsystem. The operating system iscurrently VMS 7.2 with the PC serverPathworks installed. On this hardware it isalso possible to change the operating system toTru64 Unix or to Linux.

Database ServerTwo of the terminal servers for the PCdatabases – Current Contents, Medline,Römpp, Duden, etc. – were upgraded todouble-processor Pentium III PCs with 512Mbyte memory. On two other terminalservers, the 200 MHz Pentium Pro processorswere upgraded to 500 MHz Celeronprocessors. At the same time the disk capacityof all the terminal servers was increased sothat almost all databases are new accessedfrom fast disks rather than from CDs. Theresponse time of these servers, especially withsimultaneous access load, was therebysignificantly improved.

In-house TrainingIn the last year we were able to obtain a newroom for the in-house (computer) trainingprogramme. The room is equipped with 13Pentium III PCs, LCD monitors, a beamer,and an interactive study system (student-teacher display control).

Herr Aumann bei derÜberprüfung des Zentral-rechners.

Mr Aumann controlling theComputer Systems.

Dienstleistungen163

Leiter ❘ Head: Prof. Dr. Jonas

Mitarbeiter ❘ Member: K. Eckhoff, M. Hermes, M. Kirchner, A. Plähn, J. Scriven, H. Steinke

Wissenschaftliche Information und Bibliothek

Die wesentlichen Aufgaben der Bibliotheksind:

1. Beschaffung und Bereitstellung dergedruckten Literatur in Form von Zeit-schriften, Serien und Monographien fürdie wissenschaftlichen Bereiche undsämtliche Infrastruktureinrichtungen derGBF;

2. Beschaffung der nicht im Hausevorhandenen benötigten Literatur überelektronische und konventionelleDokumentliefersysteme

3. Betrieb eines integriertenBibliotheks-Informationssystems alsOnline-Benutzerkatalog der Bibliotheks-bestände und zur Bibliotheksverwaltung;

4. Bereitstellung von elektronischerInformation wie Literatur- und Fakten-datenbanken über das CD-ROM-Netz derGBF oder über die Digitale Bibliothek imIntranet sowie von elektronischem Zugangzu Zeitschriftenvolltexten.

Die Bibliothek wird als Präsenzbiblio-thek geführt und steht neben den Mitar-beitern der GBF auch Wissenschaftlern ausanderen Forschungseinrichtungen und derWirtschaft zur Verfügung. Mit denBibliotheken der Region und den anderenHGF-Bibliotheken steht die GBF-Biblio-thek in engem Kontakt und ständigemGedankenaustausch.

BestandszahlenDie Bibliothek umfasste zum Ende desJahres 2000 13.160 Monographien, 21.950gebundene Zeitschriftenbände, 5.000Patentschriften, Dissertationen und Sonder-drucke sowie 294 Zeitschriftenabonnements,88 fortlaufende Serien, 102 Loseblattsamm-lungen sowie 30 CD-ROM/Disketten-

Abonnements. Der Zuwachs betrug bei denMonographien 598 und bei den Zeitschrif-ten 895 Bände.

FernleiheDurch die Nutzung elektronischerDokumentenliefersysteme wie Subito oderGBV-direkt wurden die Lieferzeiten für dieüber die Fernleihe zu beschaffendeLiteratur drastisch verkürzt. In deutschenLieferbibliotheken nicht vorhandeneLiteratur wird von der Bibliothek über denDokumentenlieferdienst der BritishLibrary beschafft. Von den insgesamtca. 5.000 Fernleihbestellungen wurdenca. 60% über die Bibliothek aufgegeben.In der aktiven Fernleihe wurden 240kopierte Artikel an andere Bibliothekenversandt.

BibliotheksinformationssystemDas integrierte Bibliotheksinformations-system Bibliotheca2000 wurde imBerichtszeitraum vollständig etabliert, sodass heute alle Module, also Katalog,Erwerbung, Verbuchung und Periodika-verwaltung, für die Bibliotheksverwaltungeingesetzt werden.

Bibliotheca2000 läuft auf einem NT-Server und setzt auf der Centura-SQL-Baseauf. Neben den (Client-)Arbeitsplätzenund Benutzerkatalogen (OPACs) in derBibliothek sind die Daten auch über dasIntranet abfragbar.

Intranet der BibliothekDie Bibliothek hat im Berichtsjahr einumfassendes Intranet-Angebot aufgebautund bereitgestellt, das von den Mitarbei-tern sehr gut angenommen wurde. Neben

Bibliothek

Leiter ❘ Head: A. Plähn

Mitarbeiter ❘ Members: M. Hermes, H. Steinke

Services 164

aktuellen Hinweisen und Informationenzur Bibliothek wird hier eine Liste derOnline-Zeitschriften angeboten, dieZeitschriftenliste der Bibliothek steht zurVerfügung, Informationen zum elektroni-schen Dokumentlieferdienst Subito stehenbereit, der WebOPAC ermöglicht dieRecherche in den Bibliotheksbeständenund zahlreiche Links auf bibliographischeund Faktendatenbanken im Internetermöglichen einen direkten Zugriff aufinteressante Informationen im www.

Elektronische ZeitschriftenDie HGF-Bibliotheken haben sich imBerichtsjahr zu einem Konsortiumzusammengeschlossen, um mit den

großen wissenschaftlichen Zeitschriften-verlagen Verträge über die Nutzung derOnline-Ausgaben abschließen zu können.Mit Academic Press und Elsevier Sciencewurden inzwischen Verträge unterschrie-ben. Durch den Cross Access hat die GBFsomit auch Zugriff auf zahlreiche nichtabonnierte Zeitschriften, so dass dieOnline-Zeitschriftenliste der Bibliothekim Intranet ca. 600 fachlich relevanteZeitschriften verzeichnet.

Die Nutzung der Online-Zeitschriftenist sehr intensiv. Auf dem Server vonAcademics Press war die GBF im Berichts-zeitraum bei der Anzahl der heruntergeladenen Artikel führend unter allenHGF-Einrichtungen.

Scientific Information and Library

The main tasks of the library are:1. To obtain and provide printed scientific

literature to the staff2. To offer interloan services to the staff3. To operate a library automation system

for providing an online library catalogue4. To provide electronic information by way

of CD-ROM-network, digital library on theintranet or access to fulltext of electronicjournals

Though a reference library, the GBF-libraryis also accessible for external users, scientistsor students from their research institutes orcompanies. The library is in close contact withother HGF-libraries and the scientific librariesof the region.

StocksThe collection contains about 13,160monographs, 21,950 journal volumes, 5,000patents, dissertations and offprints as wellas 294 journal subscriptions, 88 serialsubscriptions, 102 loose-leaf subscriptions and30 CD-ROM/diskette-subscriptions. In 2000598 monographs were acquired and 900journal volumes were bound.

InterloanThe GBF-library uses electronic documentdelivery systems like Subito and GBV-direktfor interloan. Most of the interloan documentswere received within three days. There werenearly 5,000 interloan orders in 2000. About60 % were processed by the library staff. 240articles were copied for external interloanrequests.

Libray Information SystemBibliotheca2000 is the new library infor-mation system which has been established toreplace URICA. There was an update to an32-bit version in Autumn. Data conversionfrom URICA did not cause any problems.Bibliotheca2000 is NT-server-based and runsa Centura-SQL-base. The library cataloguecan be accessed by way of intranet WebOPACor by client workstations in the library.

Intranet ServicesThe intranet services of the library have beenwidely extended. A digital library has beenlaunched beneath services like lists of theonline-journals and the printed journals, theWebOPAC for catalogue searches and a newssection.

Library

Dienstleistungen165

Online JournalsGBF library provides electronic access to about80 of the subscribed journals to the staff. TheHGF-libraries have merged to a consortium tomake contracts with the most importantscientific journal publishers for accessibility ofonline journals on a fulltext basis. Contractshave been signed with Academic Press andElsevier Science. By way of cross access thereare many journals accessible, which are notsubscribed in printed form. The current onlinejournals list shows about 600 subject relevantjournals.

The online journals are heavily used by theGBF staff. By the number of article downloadsthe GBF was on top of HGF institutes on theAcademic Press IDEALibrary server.

Die Bibliothek alsInformationsquelle fürwissenschaftlicheNeuigkeiten.

The library as source forlatest scientific information.

Services 166

GBF-FORUM

Ende August 2000 wurde das GBF-FO-RUM nach knapp zehn Monaten Bauzeiteröffnet. Damit wurde einem seit langembestehenden Bedarf der GBF Rechnunggetragen, ein multiflexibles Konferenz-zentrum, das auch für Ausstellungengeeignet ist, Rechnung zu tragen. DasGBF-FORUM wurde seitens der verschie-denen Arbeitsgruppen der GBF sehr gut

GBF-FORUM

The GBF-FORUM was inaugurated afternearly 10 months construction time at the endof August 2000. This was an important stepas the GBF hadn’t possessed such aninfrastructure. Now it has become possible touse this multiflexible conference centre formeetings, presentations as well as exhibitions.The various groups at the GBF immediately

started to use the FORUM. But alsointernational meetings and events frombiotech-industries took place since itsinauguration. The GBF-FORUM can be usedfor lectures, meetings, exhibitions,presentations, events, etc. (Mrs. C. Krone,eMail: [email protected]).

angenommen. Außerdem fanden bereitsetliche internationale Tagungen undVeranstaltungen von Wirtschaftsunter-nehmen der Biotech-Branche statt. DasGBF-FORUM kann für Vorträge, Tagungen,Ausstellungen von Wissenschaft undWirtschaft, Präsentationen, etc. genutztwerden (Frau Claudia Krone, eMail:[email protected]).

Nutzung des GBF-FORUMS ❘ Use of GBF-FORUM

Zeitraum ❘ Period IX –XII 2000 I-VI 2001

Arbeitstage ❘ Working days 82 123

Tage der Nutzung ❘ Days of use 72 (87,8%) 119 (96,7%)

Veranstaltungen ❘ Events 163 (2,26/d) 298 (2,5/d)

Seite 167/168Vortrag im GBF-FORUMwährend des Symposiums„Biokonversion vonNachwachsendenRohstoffen“, Sept. 2000

Page 167/168Lecture in the GBF-FORUMduring the Symposium”Bioconversion of RawMaterials“, Sept. 2000

Weitere Aktivitäten und Informationen169

Tagungen, Kurse und Lehrveranstaltungen ❘ Meetings, Courses andLectures

Die wesentlichen Elemente der wissenschaftlichen Zusammenarbeit und des Erfahrungs-austausches zwischen Mitarbeitern der GBF und denen anderer Forschungseinrichtungenund aus der Industrie waren im Berichtszeitraum weiterhin die Durchführung vonTagungen und Kolloquien, eigene Vortragstätigkeit, Aus- und Weiterbildungsfunktionen,Lehrtätigkeit von GBF-Mitarbeitern, Kooperationsprojekte und Technologietransfer.

Die internationale Zusammenarbeit wurde in 2000/2001 insbesondere mit Instituten,Universitäten und Industrien aus den Ländern Argentinien, Australien, Belgien, Brasilien,Chile, China, Dänemark, Finnland, Frankreich, Großbritannien, Israel, Italien, Kanada,Mexiko, Neuseeland, Niederlande, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Spanien,Tschechien und USA durchgeführt.

The essential elements of scientific cooperation and the exchange of experience between staff of theGBF and external research institutions as well as industry were the holding of meetings andlectures, training courses, teaching by the GBF staff, cooperation projects and technology transfer.

In 2000/2001 international cooperation was realised with groups from institutes, universitiesand industries from the following countries: Argentina, Australia, Belgium, Brazil, Chile,Denmark, Finland, France, Great Britain, Israel, Italy, Canada, Mexico, New Zealand, TheNetherlands, Austria, Portugal, Sweden, Switzerland, Spain, Czek Republic, and USA.

Kurse ❘ CoursesITP ❘ ITP

International Training Programme inBiotechnology (ITP): Der 14. Kurs des“International Training Programme inBiotechnology” fand vom 23. Oktober2000 bis 6.12.2000 in der GBF statt.Schwerpunkt des Kurses, der unter derLeitung von Dr. Ross mit Unterstützungseiner Kollegen aus der Bioverfahrens-technik und anderen Bereichen der GBFdurchgeführt wurde, war eine Einführungin die industrielle Biotechnologie.Teilnehmer waren 15 Wissenschaftler ausAsien, Afrika und Lateinamerika. Ziel desKurses ist es, jungen Wissenschaftlerndieser Regionen mit der biotechnolo-gischen Forschung in Deutschlandbekannt zu machen und auf diese Weisedie Grundlage für Kooperationen inForschung und Anwendung in und mitden jeweiligen Herkunftsländern zufördern.

International Training Programme inBiotechnology (ITP): The fourteenth ITPcourse “Introduction to IndustrialBiotechnology” took place in the GBF from 23October - 6 December 2000 under thedirectorship of Dr. Ross. He was supported byscientists from the biochemical engineeringdivision and by leading scientists of the GBF.

There were 15 participants from Asia, Africaand Latin America. One of the purposes of thecourse is to enable participants to becomeacquainted with biotechnological research inGermany. The course also acts as a startingpoint for scientific collaboration in both basicand applied research.

CDG-Kurs für junge Wissenschaftler ausASEAN-Ländern ❘ CDG-Programme:Training for Biotechnologists fromASEAN Countries

Im Jahr 2000 fand zum zweiten Mal imRahmen eines gemeinsamen Förder-programms der Carl Duisberg Gesellschaft(CDG), der GBF, der BioRegioN, und derZentralstelle für Arbeitsvermittlung (ZAV)ein Trainingsprogramm für Biotechno-logen aus den ASEAN Ländern (Thailand,Malaysia, Indonesien, Philippinen,Vietnam) an der GBF statt. 19 jungeWissenschaftler von Universitäten und ausder Industrie erhielten nach einemintensiv-Deutschkurs eine „Einführungin Moderne Methoden in der Biotechno-logie“. Der Kurs dazu wurde vom 19.Juni-14. Juli 2000 an der GBF gehalten.Anschließend gingen die Wissenschaftlerzu einem mehrmonatigen Weiterbildungs-aufenthalt in Biotech-Industrien undForschungslaboratorien im Raum derBioRegioN. Im Herbst 2000 erhielten sie

Further Activities and Information 170

dann noch einen 14-tägigen Intensivkursin Technologietransfer an der GBF sowieeine Einführung in Biotech Managementan der CDG. Ein Besuch auf der EXPO imRahmen der Konferenz – Bioconversion ofRenewable Raw Materials – fand auchstatt.

Im Jahr 2001 startete der 3. Kurs imRahmen dieses Förderprogramms. Vom 2.Mai bis 1. Juni 2001 fand hierzu der Kurs„Einführung in die Moderne Biotechno-logie“ an der GBF statt.

This training programme is a joint venturewith the Carl Duisberg Gesellschaft (CDG),the GBF, BioRegioN and the CentralPlacement Office (ZAV); it was held for thesecond time in 2000. 19 young scientists fromuniversities and from industry in Thailand,Malaysia, Indonesia, the Philippines andVietnam took part. A course entitled “ModernMethods in Biotechnology” was held at theGBF as a theoretical introduction to industrialbiotechnology from 19 June-14 July 2000.There were lectures, seminars, demonstrationsand excursions. After the course theparticipants undertook practical training infirms in the BioRegioN or in researchinstitutes. In September 2000 the participantshad the opportunity to take part in theconference “The Bioconversion of RenewableRaw Materials” which was held jointly atEXPO and in the GBF. The participants alsounderwent a 2-week training course intechnology transfer at the GBF and thetraining programme ended with a manage-ment workshop dealing with aspects ofmanagement competence at the CDG inCologne.

The third programme in the series startedin March 2001 with a 6-week intensiveGerman course and this was followed by anIntroduction to Modern Biotechnology Courseat the GBF from 2 May-1 June 2001.

Fortbildung ❘ Internal Training Pro-grammes

Das interne Fortbildungsprogrammerscheint in zwei Ausgaben pro Jahr. Ein-gebunden in das Fortbildungsprogrammder GBF sind zahlreiche Schulungen ausdem IT-Bereich. Neben der Vielzahl vonIT-Seminaren werden u.a. Kurse aus denBereichen Kommunikation, Sprachen undGBF-Spezifisches angeboten. AlleSeminare finden ausschließlich in denRäumlichkeiten der GBF statt. Für die IT-Schulungen steht ein eigener fest einge-richteter Schulungsraum mit 12 Arbeits-plätzen zur Verfügung. Für die Schulungenim Umgang mit Standard-Software sowievertiefende Kurse wird überwiegendeigenes Personal eingesetzt, für speziellereThemen meist externe Dozenten verpflich-tet. Das Seminarangebot orientiert sichz. T. an der Nachfrage der Mitarbeiter undz.T. an der Notwendigkeit der Durch-führung bestimmter Schulungen.

Grundsätzlich dient das Schulungs-konzept dazu, die Lernfähigkeit undMotivation der Mitarbeiter zu verbessernsowie die Flexibilität und Mobilität derMitarbeiter zu erhöhen.

The internal training programme is publishedtwice a year. Incorporated into the GBF’straining programme are numerous activitiesfrom the IT domain. In addition to a largenumber of IT workshops, courses in the fieldsof communication, languages and specificGBF activities are also offered. All workshopstake place exclusively on the premises of GBF.For the IT training courses, a speciallyequipped room is available with 12workstations. The training courses in handlingstandard software as well as in-depth coursesare mainly held by GBF staff, whereasexternal instructors are generally engaged formore specific topics. The workshops offered arein part oriented to the demand by staffmembers and in part to the necessity oforganizing certain training courses.

The training concept basically serves toimprove the learning ability and motivation ofstaff members and to increase their flexibilityand mobility.


Tagungen und Kolloquien ❘ Meetings and LecturesMit der Inbetriebnahme des neuen GBF-FORUMs im September 2000 wurden Tagungen,Kolloquien und Bereichsseminare in verstärktem Maße wieder durchgeführt.

From September 2000 after the inauguration of the GBF-FORUM meetings, lectures and internalseminars were held more regularly.

23.-25.05.00 1st International Symposium on Synthesis, Screening and Sequencing,Special Event at the ACHEMA 2000 in Frankfurt. DECHEMA, R. Frank,member of international scientific committee

09.-12.07.00 2nd International Symposium: Biotechnology for Conservation of theEnvironment (Registered Project of the World Exposition, Germany),Munster (D. Blohm, W.-R. Abraham, R. Dierstein)

18./20.09.00 BMBF-ICMR Joint Project: Indo-German Workshop on Tuberculosis(Prof. Dr. G. S. Chhatwal, GBF)

25.-28.09.00 Internationales Symposium „Biokonversion von NachwachsendenRohstoffen/Bio-conversion of Renewable Natural Resources”, gefördertdurch Carl Duisberg Gesellschaft und UNESCO. Eröffnung am 25.9. aufder EXPO2000 in Hannover, anschließend Fortsetzung im GBF-FORUM.Teilnehmer aus 24 Ländern (Prof. Jonas, GBF)

29.09.00 Workshop INCO Projekt „PHA production from sugar cane derivatives”,gefördert durch EU (Profs. Steinbüchel, Universität Münster; Jonas, GBF)

06.-08.00 Fortbildungsveranstaltung „Gentechnik-Sicherheitsverordnung“ (GenTSV),(Dr. E.Grund)

10.01.01 Workshop: Microarray, Bioinformatics and Lab-on-a-Chip Technology,Agilent Technologies Europe and R. Frank

19.-21.03.01 Workshop: Submit 3 – The Annotation software used by TIGR (TheInstitute of Genome Research), Braunschweig, Germany (S. Heim, GBF)

13.06.01 Workshop: Microarrays und Bioinformatik bei MWG-Biotech13.08.01 Workshop: National Health and Medical Research Council Australia und

GBF: NHMRC-GBF Workshop on Streptococci (Prof. Dr. G. S. Chhatwal)

GBF-Kolloquien und Seminare ❘ GBF Colloquia and Seminars18.01.00 Dr. Wolfram Gronwald, Universität Regensburg: „Auf dem Weg zur auto-

matischen Zuordnung von NMR-Spektren, das Programm AUREMOL“10.02.00 Dr. H. Wolfgang Höffken, BASF Aktiengesellschaft: „Structure based drug

design in pharma research“16.02.00 Arno Müller, Institut für Genetik, Düsseldorf: „Dying early: analysis of cell

death in the fly embryo“14.03.00 Andreas Lengeling, GSF, München: „Functional genomics on mouse

chromosome 5“

Lehrveranstaltungen von GBF-Mitarbeitern ❘ Teaching Engagements byGBF Employees

Einige der Bereichsleiter der GBF sind ingemeinsamen Berufungsverfahren mit derTU Braunschweig und der GBF berufenworden und damit in das Vorlesungs-angebot der TU Braunschweig eingebun-den. Eine Reihe von weiteren Wissen-schaftlern der GBF, darunter vielehabilitierte, halten Vorlesungen, Seminareund Praktika an der TU Braunschweig undanderen Universitäten oder Fachhoch-schulen ab. Im Berichtszeitraum waren

dies über 30 wissenschaftliche Mitarbeiterder GBF.

Several of the division heads at GBF werenominated in a joint appointmentarrangement between the Technical Universityof Braunschweig and the GBF and, therefore,are involved in giving lectures at the TUBraunschweig. In addition, other GBFscientists give lectures and/or hold practicalsat the TU Braunschweig and other universitiesor technical colleges. During the reportedperiod more than 30 scientific employees wereinvolved in those teaching engagements.


06.04.00 Uwe Knippschild, Heinrich-Pette-Institut, Hamburg: „Characterisation offunctions of the protein kinase casein kinase 1 delta, an importantregulator of the tumour suppressor p53“

10.04.00 Dr. Yvonne Genzel, Univ. Marseille:Epoxide Hydrolases: „Enantioselectivebiohydrolysis of pyridyloxiranes“

10.04.00 Mary Beckerle, University of Utah, „Signaling at sites of cell adhesion: Arole for zyxin“

22.05.00 Marius Sudol, Mt. Sinai School of Medicine: „Role of the WW Domain inSignaling and Disease“

29.05.00 Gareth Griffiths, EMBL, Heidelberg: „Latex bead phagosomes and the linksbetween actin nucleation, fusion and membrane signaling“

31.05.00 Dr. Michal Lebl, Illumina Inc. San Diego: „Fibre-optic-based DNA-giga-arrays as next generation tools for the large-scale analysis of geneticvariation and function“

22.06.00 Dr. Klaus Maskos, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried:„Metalloproteases: Structure, function and inhibition“

17.07.00 Yu-Li Wang, University of Massachusetts: „How fibroblast propel andguide their movements“

21.08.00 Stefan Ehlers, Borstel: „Mechanismen der Granulomnekrose inmykobakterien-infizierten Mäusen“

24.08.00 Dr. Jakob Pernthaler, Max-Planck-Inst. für Marine Mikrobiologie, Bremen:„Culturability and growth strategies of pelagic bacteria from the GermanBight“

01.09.00 Dr. Francis Mulaa, Univ. of Nairobi: „Cell cycle regulation in the malariaparasite Plasmodium falciparum“

04.09.00 Prof. Dr. Anil Grover, Postgraduate Institute for Medical Education andResearch, Chandigarh, Indien: „Rheumatic fever and rheumatic heartdisease in children of North India“

06.09.00 Silvia Lommel, Institut für Genetik, Köln: „Generation of conditional N-WASP und Arp2/3”

15.09.00 Stefan Lindner, Institut für Kreislaufkrankheiten, München: „Regulationpodosomaler Adhäsionsstrukturen durch WASP und Arp2/3”

15.09.00 Prof. Solomon Victor, Director of The Heart Institute, Madras/Indien:„Genes and God“

17.10.00 Dr. Holger Heuer, BBA: „Reservoirs of gentamicin resistance genes in theenvironment“

17.10.00 Dr. Holger Rheims, DSM: „Mikrobiologische Unterschungen zurCharakterisierung bisher nicht kultivierbarer Aktinobakterien ausBodenproben“

19.10.00 Prof. Dr. Wolfram Bode, MPI Martinsried: „Crystal structures of bloodclotting factors: interesting targets for the design of antithrombotics”

28.11.00 Prof. Dr. Robert Seckler, Universität Potsdam: „The parallel ß-helix in P22tailspike protein: Structure, function, stability and folding“

19.12.00 Dr. Wulf Blankenfeld, University of St. Andrews, UK: „Ein interessantesDrug-target in bakteriellen Infektionen“

18.01.01 Dr. Oliver Ohlenschläger, Institut für Molekulare Biotechnologie, Jena:„Structural studies of proteins affecting haemostasis“

22.01.01 Harald Mischak, MHH: „Protein Kinase C: mehr als nur eine Familie vonKinasen“

23.01.01 Dr. Ulrich Wendt, Abt. Strukturbiologie, Aventis Pharma, Frankfurt: „Thestructure of squalen-hopene cyclase: Unraveling the complexity ofcholesterol and triterpene formation“

26.01.01 Charles Parkins, Mount Vernon Hospital Northwood: „Tumourendothelium as a target for chemotherapy-progress with the tubulin-binding agent Combretastatin A4"

02.02.01 Dr. Michael Geissler, Univ. Hospital, Freiburg: „ImmuntherapeutischeAnsätze gegen das hepatozelluläre Karzinom“

05.02.01 Monique Arpin, Institut Curie: „Role of ezrin in epithelial cellmorphogenesis and signaling“

20.02.01 Prof. Dr. Edward L. Kaplan, University of Minnesota Medical School,Minneapolis/USA: „Rheumatic fever and rheumatic heart disease“

22.02.01 Prof. Dr. Udo Heinemann, Max-Delbrück-Centrum für MolekulareMedizin, Berlin: „High throughput structure analysis, structural genomicsand protein structure factory“

05.03.01 Dr. Michael Weyand, MPI Dortmund: „The alpha-active site of tryptophansynthase: One end of the allosteric communication“

22.03.01 Helmut Ponta, Institut für Toxikologie und Genetik: „CD44, a keyregulator of cellular growth“

23.03.01 Dr. Andreas Ehlich, Universität Köln: „How does recombination ofimmunoglobin genes regulate B lymphocyte develompent“

29.03.01 Prof. Dr. A. Wittinghofer, MPI Dortmund: „Studies of Ras, a molecularswitch involved in signal transduction, and their implications for drugdevelopment“

02.04.01 Dr. Rhodri Ceredig, Laboratoire d‘Immunochemie INSERM, Grenoble: „Bcell development in young mice: in vivo und in vitro studies“

02.04.01 Dr. Alex Steinkasserer, Universitätsklinikum Erlangen: „Dendritic Cells -from bench to bedside“

03.04.01 Dr. Heinz Jacobs, Basel Institute for Immunology: „SecondaryDiversification of Immunoglobulin Genes“

09.04.01 Prof. Dr. Brigitte Schlegelberger, Inst. für Molekulare Pathologie, MHH:„Genetic classification and risk stratification in non-Hodgkin‘slymphomas“

02.05.01 Prof. Dr. Georgii Georgiev, Inst. of Gene Biology, Moscow: „The upperlevel: transcription tuning meCpG binding, insulators and long-rangeinteractions“

14.05.01 Dr. Rolf Apweiler, EMBL-EBI, Hixton Hall, Cambridge/UK: „Databases forfunctional genomics and proteomics: New developments around SWISS-PROT/TrEMBL/InterPro“

15.05.01 Prof. Dr. R. Amann, Max-Planck-Inst. für Marine Mikrobiologie, Bremen:„Genomics of Marine Biogeochemical Cycles“

16.05.01 Prof. Francis T. F. Tsai, Dept. of Biochemistry & Molecular Biology, BaylorCollege of Medicine, Houston/Texas/USA: „Form follows function - Whatdo crystal structures tell us about protein function“

28.05.01 Prof. Dr. Heidrun Herrmann, Universität Greifswald: „Regulation desPhenolabbaus bei Pseudomonas putida“

18.06.01 Giorgio Scita, The European Institute of Oncology, Mailand: „Integrationcoordination of signaling through Eps8"

26.06.01 Prof. Dr. Bernhard Ryffel, Institut Transgenose, Orleans/France: „Role ofTNF and Lymphotoxin in host resistance to mycobacterial infection“

02.07.01 Guy Cornelis, Universite Catholique de Louvain, Brussels: „Molecular andcell biology of the Yersinia infection“

02.07.01 Prof. Dr. D. Söll, Yale University Connecticut: „Aminoacyl-tRNA synthesisin the postgenomic era“

05.07.01 Dr. Christian Mielke, Universität Würzburg: „Dynamics of Human DNATopoisomerases IIa and B in Living Cells“

23.07.01 Dr. Rolf Hühne, Institut für Genetik, Universität zu Köln: „AraC operatornetwork at the araBAD promoter of E. coli“

26.07.01 Dr. Ingo Autenrieth, Universität Tübingen: „Yersinia enterocolitica: mucosalinvasion strategy and host responses“

27.07.01 Dr. Ilya N. Shindyalov, San Diego Supercomputer Center, La Jolla/USA:„Combinatorial Extension (CE) Structure Alignment Algorithm“



30.07.01 Dr. Stefan Rose-John, Christian-Albrechts-Universität Kiel: „Coordinationof Cytokine Biology by Membrane Bound and Soluble Receptors“

01.08.01 Dr. Benjamin Callen, Adelaide University/Australia: „Topic: Interferencebetween face-to-face promoters of bacteriophage: the mechanism of amoving repressor“

09.08.01 Prof. Dr. Hans R. Schöler, University of Pennsylvania: „Gene Function andRegulation in Pluripotent Stem Cells of Mammals“

15.08.01 Dr. Barbara Bertram, DKFZ Heidelberg: „Frauenforschung-Frauengesund-heit. Forschen Frauen anders?“

16.08.01 Dr. Stefan Beissert, Universitätsklinikum Münster: „Über die Bedeutungvon Langerhanszellen bei der Entwicklung von Autoimmunität“

16.08.01 Dr. Thorsten Buch, Institut für medizinische Mikrobiologie, TU München:„Secondary Rearrangements in a TCRalpha Insertion Model“

20.08.01 Dr. Ramnath Maniduth, Royal Vet. & Agric. University of Copenhagen/Denmark: „The use of two dimensional SDS PAGE to monitor geneexpression of class IIa bacteriocin Listeria monocytogenes“

Technologietransfer, Lizenzen und Patente ❘ Technology Transfer,Licences and Patents


Prof. Dr. R. Jonas (seit ❘ from 2001), Dr. D. Lobas, C. Schrader (bis ❘ until 2000) (Technolo-gietransfer ❘ Technology Transfer); Dr. C. Kügler-Walkemeyer (Recht und Lizenzen ❘ LegalAffairs and Licenses); D. Meseke (Patente ❘ Patents)

Aufgaben ❘ TasksIn der GBF besteht ein großes Interesse ander Entwicklung innovativer Produkte,Verfahren und Dienstleistungen, insbeson-dere in Kooperation mit industriellenPartnern. Ein wichtiges Ziel der GBF ist es,die im Rahmen der Forschung erbrachtenErgebnisse durch Technologietransfer zurAnwendung zu bringen. Deshalb sind fürdie GBF• Ausgründung von Firmen• Lizenzvergabe• Service und Dienstleistungen im

Rahmen von Industriekooperationenwichtige Parameter für die Umsetzbarkeitihrer FuE-Ergebnisse. Allen Ansätzen liegteine Sicherung des Know-how’s zugrunde.Diese erfolgt in der Regel im Rahmen vonPatenten, die dann im Zuge des Technolo-gietransfers lizenziert werden. Aus diesemGrund ist die GBF Mitglied in Vereinigun-gen wie BioRegioN und dem Transfer-kolleg Biotechnologie e.V..

The GBF is increasingly interested in thedevelopment of innovative products, processesand services, especially in cooperation withindustrial partners. The aim is to rapidly andeffectively apply the research results obtainedby means of technology transfer. There arethree approaches with the same priority atGBF:• services within the framework of industrial

cooperations• granting licences• establishing spin-out companies.

All approaches are based on safeguardingthe know-how involved. This takes place, as arule, by means of patents for which licencesare then granted within the framework oftechnology transfer. For this reason the GBF ismember of BioRegioN and TransferkollegBiotechnologie e.V..

Wirtschaftserlöse und Drittmittel ausForschungsförderung ❘ Proceeds fromindustries and Third Parties

Die Gesamterlöse waren in 2000 um 1451TDM (6%) niedriger als im Vorjahr.Grund dafür waren geringere Einnahmen(-1114 TDM) aus F&E Tätigkeiten mit derWirtschaft und aus sonstigen Erlösen(-1161 TDM). Mehreinnahmen gab esdagegen bei Lizenzerlösen (+386 TDM),nationaler (+357 TDM) und internatio-naler (+81 TDM) Forschungsförderung.

The proceeds were less (-1451 TDM) in2000 than in 1999. Reasons for this wereless receipts from R&D projects with industry(-1114 TDM) and further proceeds (-1161TDM). Additional receipts were obtainedfrom licenses (+386 TDM) and projectsgrants (+438 TDM).

Further activities and information 176

Deutschland ❘Germany (TDM)

2.044

37

362

234

2.677

6.061

3.298

9.359

12.036

Erlöse aus F&E Vorhaben und Drittmittel Forschungsförderung ❘Receipts from R&D activities with industries and third parties

F&E-Aufträge aus der Wirtschaft ❘ R&D projects with industry

F&E-Aufträge staatl. Stellen ❘ R&D projects with public institutions

Lizenzverträge ❘ licence contracts

Weitere Erlöse ❘ further receipts

Zwischensumme ❘ subtotal

Drittmittel Forschungsförderung ❘ Project grants from third parties

BMBF und EU ❘ BMBF and EU

Sonstige ❘ others

Zwischensumme Drittmittel ❘ subtotal third parties

Erlöseund Drittmittel insgesamt ❘ total receipts

Ausland ❘Exterior (TDM)

Gesamtsumme ❘total sum (TDM)

1.561

0

1.652

0

3.213

3.877

24

3.901

7.114

3.605

37

2.014

234

5.890

9.938

3.322

13.260

19.150

Von den Erlösen aus F&E Tätigkeiten wur-den 88 TDM in der Umweltforschung und5569 TDM in der Gesundheitsforschungerzielt. Bei der Forschungsförderung erhieltder Bereich Umwelt Zuwendungen in Höhevon 3675 TDM, während die Gesundheits-forschung mit 9585 TDM unterstützt wurde.

F&W-Tätigkeiten ❘ R&D Activities

F&E-Vorhaben/F&E-Aufträge ❘ R&D Projects, R&D Contracts

Lizenzverträge ❘ License Contracts

Summe ❘ Sum

Erlöse aus dem Infrastrukturbereich ❘ Proceeds from the Infrastucture

Erlöse aus nationaler Quelle ❘ Proceeds from National Sources

Erlöse aus dem Ausland/Supranationalen Einrichtungen ❘ Proceedsfrom Exterior/Supranational Organisations

Drittmittel insgesamt ❘ Total Proceeds from Third-Party Funds

1998 (in TDM)

3.784

1.050

4.834

1.168

8.174

3.106

17.282

1999 (in TDM) 2000 (in TDM)

4.756

1.275

6.031

1.395

9.003

3.820

20.249

3.642

2.014

5.656

0.234

9.358

3.901

19.150

The proceeds from R&D projects were gainednearly exclusively by the sector of healthresearch (5569 TDM), the environmentalresearch received 88 TDM. Grants from thirdparties supported the environmental researchwith 3675 TDM and the health research with9585 TDM.

Drittmittelerträge 1998-2000 ❘ Proceedsfrom Third-Party Funds 1998-2000


HGF-Strategiefonds ❘ Fonds for strategicresearch within the Helmholtz Centres(HGF)

Die GBF war im Jahr 2000 an denfolgenden HGF-Strategiefonds Projekten

Laufzeit ❘ termvon-bis ❘ from-until

1.7.98-30.6.01

1.7.98-30.6.01

1.7.98-30.6.01

1.7.98-30.6.01

1.7.98-30.6.01

1.7.98-30.6.01

1.7.98-30.6.01

1.7.00-30.6.03

1.7.00-30.6.03

1.7.00-30.6.03

Leiter ❘ Coordinator

Dr. H. Hauser

Prof. Dr. J. Wehland

PD Dr. C. Guzman

Dr. S. Weiß

Dr. W. Lindenmaier,Dr. K. Dittrich

Dr. H-J. Hauser

PD Dr. M. Höfle

PD Dr. J. Buer

Dr. S. Weiß

Dr. W. Abraham

Summe ❘sum (TDM)

597,5

168,6

168,6

168,6

168,6

168,6

1.546,0

500,0

1.500,0

Thema ❘ Title

GMP Virus Produktion ❘ GMP virus production

Listerien Expression HPV-Antigene ❘ Lesterial expression HPV-antigenes

Salmonellen HPV-Antigene ❘ salmonella HPV-antigenes

DANN-Immunisierung gegen HPV ❘ DANN immunization against HPV

HPV-induzierte Tumore ❘ HPV induced tumours

HPV-Vakzinierung ❘ HPV vaccination

Systernintegr. Umweltbiologie ❘ integrated environmental biotechnology

Immuntherapie II ❘ immune therapy II

Krebs Immuntherapie ❘ cancer immune therapy

Bodenfunktion ❘ soil functions

Patente und Lizenzen ❘ Patents andlicenses

Um zu einer klareren Übersicht zugelangen wurden in der folgenden Tabellenur die Erstanmeldungen von Patentenberücksichtigt. Die Zahl der der Erstan-meldungen folgenden Anmeldungen, vorallem im Ausland, lag für das Jahr 2000

1998

1999

2000

Zahl der Erfindungsmel-dungen und Patentanmel-dungen ❘ First submissionof patents

Zahl der gehaltenenPatentfamilien ❘Holdings of patent families

Erteilte Patente ❘Patent granted

Zahl der validen erteiltenPatente ❘Holdings of patents granted

15

13

11

120

133

144

8

5

3

90

94

96

Patente

Patents 1998-2000

beteiligt. Mit den Projekten werdenmehr als 5,2 Mio DM eingeworben.

In 2000 the GBF received support for thefollowing HGF-strategic research projects.The overall gain is more than 5.2 mio DM.

bei über 100 Anmeldungen und dieGesamtzahl der gehaltenen Patente beieinigen Hunderten.

To get a clearer overview the following tableonly considers the first application of patents.The number of follow-ups of a first patentapplication was more than 100 in 2000, andthe total number of holdings several hundreds.

178Further activities and information

Lizenz- und Know-how-Verträge

Licences and Know-how-contracts 1998-2000

Einnahmen ❘ Proceeds

Aufwendungen ❘ Expenditure

1998 1999 2000

1.050 TDM

710 TDM

1.275 TDM

1.293 TDM

2.014 TDM

1.140 TDM

Die Einnahmen erreichten im Jahr 2000einen Höchststand mit 2014 TDM. Durchleicht rückläufige Aufwendungen konntehier ein Überschuss von fast 900 TDMerzielt werden.

In 2000 the proceeds reached the highestvalue up to now. As the expenditures wereslightly below the 1999 value, a surplus ofnearly 900 TDM could be achieved.

Ausgründungen und Existenz-gründerzentrum ❘ Spin-out Companiesand Firms on the GBF Biotec Campus

In 2000/2001 gab es erneut Ausgrün-dungen aus der GBF: Bionethos GmbH(PD Dr. A. Bader), Eugene GbR(Dr. W. Müller) und der Verein ForumFunktionelle Genomanalyse e.V. ( H.Schlender). Da die Voxna BioMed in 2000sowie BioBase und SciNet in 2001 dasGBF-Existenzgründerzentrum verlassenhaben, sind es weiterhin 16 BiotechVereine und Firmen auf dem GBF-Campusund im DSMZ-Gebäude.

Am 5. Dezember 2000 wurde das GBF-Existenzgründerzentrum offiziell einge-weiht. Der Ausbau der 3. und 4. Etage desY-Gebäudes der GBF wurde im wesentli-chen abgeschlossen. Es stehen rund 800qm Laborfläche und ca. 1050 qm Büro-und Lagerfläche zur Verfügung. Durch dieAnschaffung von Geräten über die Förde-rung durch das Niedersächsische Wirt-schaftsministerium konnten die Infra-strukturräume fast fertig gestellt werden.Es steht zu erwarten, dass es in 2001/02 zuEngpässen beim Raumbedarf der bereitsexistierenden Firmen kommen wird, dadie Stadt Braunschweig erst in der 2.Jahreshälfte 2002 mit dem Bau des neuenBioTec-Zentrums fertig werden wird.Andererseits wird damit der schon vorlanger Zeit geplante BioTech-Park nebendem GBF-Gelände Realität. Die Anzahlder neu geschaffenen Arbeitsplätze durchdas Existenzgründerzentrum betrug Ende2000 rund 130. Diese Zahl dürfte erst ab

2002 zunehmen, da dann genügendweitere Nutzfläche durch das neue BioTec-Zentrum zur Verfügung stehen wird.

The following spin-out companies wereestablished in 2000/2001: Bionethos GmbH(PD Dr. A. Bader), Eugene GbR (Dr. W.Müller), and Verein Forum FunktionelleGenomanalyse e.V. (H. Schlender). As thefollowing companies VoxnaBioMed, BioBase,and SciNet left the GBF Bio Tec Campus in2000/2001, 16 companies continue theiractivities at the GBF Bio Tec Campus and inthe DSMZ-building.

The GBF Bio Tec Campus was officiallyinaugurated at 5 December 2000. Thecompletion of the 3rd and 4th floor of the Y-building of the GBF was nearly finished.There are about 800 sqm of laboratories andsome 1050 sqm of offices. Various laboratoryequipment were acquired with a support fromthe Ministry of Economics of the State ofLower Saxony to fit out several rooms asinfrastructure labs for common use. It isexpected that there will be a bottle neck withregard to the space required by the firms in2001/2002, because the new BioTec buildingof the City of Braunschweig which is underconstruction will be only ready in the 2nd halfof 2002. On the other hand this new buildingis the first step in the direction of a Bio TecPark that has become necessary for the region.The number of new jobs created through thenew spin-out companies reached 130 at theend of 2000. It should considerably increaseafter the new Bio Tec building will be ready.


Liste der auf dem GBF-Geländeansässigen Firmen ❘ List of the firms onthe GBF Bio Tec Campus

Geschäftsführer/An-sprechpartner ❘Person for contact

OMNILAB Laborzen-trum GmbH & Co. KG

TRACE Biotec AG

ASA Spezialenzyme

Hartmann Analytic

Bioinformation

Cosmix molecularbiologicals GmbH

AIMS ScientificProducts GmbH

RELIATech GmbH

Lionex GmbH

Affymetrix

IBA Biologics GmbH

AMODIA BiosciencesGmbH

Glyco Thera GbR

Bionethos GmbH

Eugene GbR

Forum FunktionelleGenomanalyse e.V.

GBF Ausgründer in derRegion:BIOBASEBiologischeDatenbanken GmbH

Firma ❘ Company Telefon/Fax ❘Phone/Fax

e-Mail Internet

M. Kling / U. Kurzina

Dr. Wolfgang Künnecke

Dr. Arno Cordes

Dr. Ursula Hartmann

Dr. Edgar Wingender

Prof. Dr. J. Collins/Dr. Szardenings

Dr. Norbert Zander

Dr. Bernhard Barleon

Prof. Dr. Mahavier Singh

Dr. Bernd Haase

Dr. J. Bertram /Dr. Garke

Dr. Ulrich Krause /Dr. Sabine Peters

Dr. Harald Conradt

Dr. Augustinus Bader

Dr. Werner Müller

H. Schlender

Dipl.-Chem. HolgerKaras / Dr. EdgarWingender / Peter Lotz

Tel. 05108-91 67 0Tel. 61 40-900Fax 05108-91 67 67

Tel. 26 13 30

Tel. 26 13 10

Tel. 2 60 28 0

Tel. 6 18 14 27

Tel. 12 08 60Fax 2 60 12 99

Tel. 2 60 28 65Tel. 0177-7 63 72 99Fax 2 60 28 66

Tel. 2 60 18 32Fax 2 60 18 33

Tel. 2 60 12 66Tel. 0175-5 94 22 91Fax 2 60 11 59

Tel. 61 81-570Tel. 05181-82 66 10Tel. 0172-8 16 22 00Tel. 08847-69 75 75

Tel. 0551-50 67 21 18Tel. 61 81-170GF: Rudolf-Wissell-Str. 28, 37079 Göttingen

Tel. 2 60 17 64Fax 2 60 17 66

Tel. 7 07 28 01Fax 7 07 28 03Büro: Okerstr. 11,38100 Braunschweig

Tel. 61 81-122

Tel. 61 81-687/-487

Tel. 61 81-738

Tel. 05331-85 84 0Fax 05331-85 84 70Halchtersche Str. 33,38304 Wolfenbüttel

[email protected]@omnilab.de

[email protected]

[email protected]

[email protected]

[email protected]@cosmix.de

[email protected]

[email protected]

[email protected]

[email protected]

[email protected][email protected]

[email protected]@amodia.de

[email protected]

[email protected]

[email protected]

[email protected]

[email protected]@biobase.de

www.omnilab.de

www.trace-ag.de

www.asa-enzyme.de

www.hartmann-analytic.de

www.cosmix.de

www.aims-scientific-products.de

www.reliatech.de

www.lionex.de

www.affymetrix.com

www.amodia.com

www.bionicor.de

www.lifegen.de

www.biobase.de


Wissenschaftliche Bilanz in Zahlen ❘ Scientific Balance in Figures

Im folgenden sind verschiedene Ergebnis-se aus dem F&E-Bereich der GBF alsWissenschaftliche Bilanz zur besserenÜbersicht seit 1998 tabellarisch aufge-führt: Veröffentlichungen, erfolgreichdurchgeführte Diplom- und Doktor-arbeiten.

Übersicht über an der GBFangefertigte Diplomarbei-ten, Dissertationen undHabilitationen*

Overview of Master thesis,PhD thesis and habilitationsthat were elaborated atthe GBF*

*Neun Wissenschaftler/innen der GBFhabilitierten sich seit 1998: zwei 1998,einer 1999, je drei in 2000 und 2001.

Diplomarbeiten, Dissertationen, Habilitationen ❘Master thesis, PhD thesis, Habilitations 1998-2001

Various results from R&D of the GBF arepresented here as a scientific balance for theyears 1998-2000/2001.

*Nine GBF scientists concluded theirhabilitations since 1998: two in 1998, one in1999, three in both years 2000 and 2001.

Veröffentlichungen ❘ Publications 1998-2000

JahrYear

Index.Zeitschriften

Indexjournals

Nicht index.ZeitschriftenNon Indexjournals

Bücher,Proceedings

Books,proceedings

Sonstige Ver-öffentlichungen

Otherpublications

Veröffentlichungeninsgesamt

Total number ofpublications

1998

1999

2000

1998/2000

188

226

197

611

14

7

8

29

38

41

24

103

8

–

3

11

248

274

228

750

DiplomarbeitenMaster thesis

1998

1999/2000

2000/2001

insgesamt ❘ total

3

8

2

13

mit Aus-zeichnung

withdistinction

sehr gutvery good

gutgood

befriedigendsatisfactory

ohneNotenangabe

Result notavailable

SummeTotal Number

DissertationenDissertations

1998

1999/2000

2000/2001

insgesamt ❘ total

18

24

27

69

12

20

19

51

3

4

3

10

3

3

2

8

1

1

1

1

2

3

-

4

7

3

-

4

7

24

28

35

87

21

32

28

81

Presse- und Öffentlichkeitsarbeit


Leiter ❘ Leader: Th. Gazlig

Mitarbeiter ❘ Members: R. Barthel, A. Koch, R. Radloff

Die Presse- und Öffentlichkeitsarbeit beruht auf den Säulen Presse- und Medienarbeit,interne Kommunikation, Internet und allgemeine Öffentlichkeitsarbeit mit den Teilberei-chen Ausstellungen, Veranstaltungen, Messen und Besucherwesen. Alle vier Bereichewurden im vergangenen Jahr weiterentwickelt und ausgebaut. Ziel der Kommunikationsar-beit ist es, die GBF mit ihrer neuen Ausrichtung als Forschungszentrum für Infektions-krankheiten zu positionieren sowie für die Akzeptanz der Forschungsarbeiten zu werben.So konnte die hohe Medienpräsenz regional auf dem hohen Niveau gehalten werden undüberregional sowie in der Fachpresse ausgebaut werden. Auch die Internet-Präsenz wurdein einem ersten Schritt überarbeitet. Dabei wurde auf die Bedürfnisse der Nutzer geachtet:1. zielgruppenspezifische Ansprache, 2. Orientierung und Navigation und 3. Aktualitätund Funktionalität. Angesichts der enormen Bedeutung des Internets wird der Auftritt derGBF konsequent weiterentwickelt.

Wissenschaft im DialogKontinuierlich engagiert sich die GBF fürden unmittelbaren Dialog mit einerbreiten Öffentlichkeit. Beispielhaftstanden hierfür in der zweiten Jahreshälfte2000 die Ausstellungen Fut[o]ur, eineInitiative der regionalen Forschungs-einrichtungen im Braunschweiger Landes-museum, und „Lebendige Wissenschaft“der Helmholtz-Gemeinschaft im Deut-schen Museum München.

Eine besondere Bedeutung für die Öffent-lichkeitsarbeit der GBF hat die Teilnahmeam Jahr der Lebenswissenschaften, dasvom Bundesministerium für Bildung undForschung für 2001 ausgerufen wurde. DieGBF engagierte sich bei der Auftakt-veranstaltung in Berlin und präsentiertesich auf der Science Street im LeipzigerHauptbahnhof (19. bis 28. April 2001)unter anderem mit einer millionenfachenVergrößerung eines Tuberkel-Bakteriumsim Sitzkissenformat und einer Reinigungs-anlage für quecksilberverseuchtes Abwas-ser. Zudem beteiligte sich die GBF imbesonderen Maße als Mitorganisator amWissenschaftstag auf dem Opernplatz inHannover am 15. Juni 2001. ZahlreicheAussteller der Biotech-Szene präsentiertenin anschaulicher Weise neueste Forschungaus der grünen und roten Biotechnologie.Diskussionen zu aktuellen Themen mitPolitik und Wissenschaft rundeten dasProgramm ab.

Die rund 51 Besuchergruppen im Jahr2000 dokumentieren das Bedürfnis vielerregionaler und überregionaler Interessen-gruppen, sich vor Ort über die GBF zuinformieren. Auch in der ersten Hälfte2001 haben bereits über 279 Besucher dieGBF besucht: Das Spektrum reichte vonVertretern wissenschaftlicher Einrichtun-gen aus dem In- und Ausland, aus derlokalen, Landes- oder Bundespolitik bis zuVereinen, Verbänden, Schulklassen undLeistungskursen sowie Studierenden.Darüber hinaus lockte der traditionelle

Pressekonferenz anlässlichder Tagung des Niedersäch-sischen Landeskabinetts imGBF-FORUM.

Press conference on theoccasion of the Cabinet´smeeting of Lower Saxony inthe GBF-FORUM.

(Prof. Dr. Rudi Balling (2.v. l.),Sigmar Gabriel (2.v.r.))

Präsentation der GBF aufder Science Street im Leipzi-ger Hauptbahnhof anlässlichdes Jahres der Lebens-wissenschaften 2001.

Presentation of the GBF onthe Science Street at LeipzigMainstation on the occasionof the year of the LifeSciences 2001.


Press and public relations activities rest on the pillars of press and media activities, internalcommunications, Internet and general public relations work with subactivities relating toexhibitions, events, trade fairs and visitors. All four domains were further developed and expandedin the past year. The aim of communication activites is to establish the GBF with its neworientation as a research institution for infectious diseases and to gain acceptance for its researchwork. It has been possible to regionally maintain the high level of media coverage and to expandthis coverage nationwide and in the trade press. Presence on the Internet was also revised in a firststep, complying with user needs by: 1) addressing target groups, 2) orientation and navigation and3) up-to-dateness and functionality. In view of the enormous significance of the Internet, GBF’sappearance is being consistently further developed.

Science in DialogueGBF continuously commits itself to conductinga direct dialogue with the public at large.Examples in the second half of 2000 were theexhibitions “Fut[o]ur”, an initiative by theregional research institutions in theBraunschweig state museum, and “LebendigeWissenschaft” by the Helmholtz Associationin the German Museum, Munich.

Of particular significance for GBF’s publicrelations work is its participation in the Yearof the Life Sciences proclaimed by the FederalMinistry of Education and Research for 2001.GBF took part in the opening event in Berlinand presented itself on the Science Street at

Leipzig main station (19 to 28 April 2001)inter alia with the million-fold enlargement ofa cushion sized tubercle bacterium and aclean-up system for mercury-contaminatedwaste water. Moreover, GBF was particularlyinvolved as a co-organizer in the Science Dayat Opernplatz in Hanover on 15 June 2001.Numerous exhibitors from the biotech scenegave a lively presentation of their latestresearch in green and red biotechnology.Discussions on current topics with politiciansand scientists rounded off the programme.

Roughly 51 groups of visitors in the year2000 document the need of many regionaland supraregional interest groups to inform

Press and Public Relations

„Tag der offenen Tür“ rund 1.500 Braun-schweiger an. Prominenteste Gäste warenin diesem Jahr die Bundesministerin fürBildung und Forschung EdelgardBulmahn, aus Niedersachsen Ministerprä-sident Sigmar Gabriel, Wissenschafts-minister Thomas Oppermann sowie derrussische Forschungsminister ProfessorMichail Petrowitsch Kirpitschnikow.

Anwendungen präsentierenAuf der Hannover Messe 2001 präsentiertesich die GBF zusammen mit anderenHochschulen und Unternehmen auf demniedersächsischen Gemeinschaftsstand.Die GBF stellte den BioDisk-Synthesizeraus, ein Testverfahren zur Suche nachMolekülen für Diagnostik und Therapie.Auf der „BIOTECHNOLOGY 2000“ in

Berlin zeigte die GBF vom 3. bis 8. Sep-tember 2000 ein Testverfahren zur Suchenach biologisch aktiven Molekülen fürDiagnostik und Therapie und aktuelleForschungsergebnisse aus der Umweltbio-technologie.

Edelgard Bulmahn, Bundes-ministerin für Bildung undForschung (BMBF) zu Besuchin der GBF.

Edelgard Bulmahn, FederalMinister of Education andResearch, visits the GBF.


themselves on the spot about GBF. Also in thefirst half of 2001 more than 279 visitors havealready visited GBF, ranging fromrepresentatives of scientific institutions athome and abroad, through local, federal stateand government politicians up to clubs,associations, school classes and advanced levelcourses, and university students. Furthermore,the traditional “Open Day” attracted roughly1,500 inhabitants of the region. The mostprominent guests this year were EdelgardBulmahn, Federal Minister of Education andResearch, Sigmar Gabriel, Govenor of LowerSaxony, Thomas Oppermann, Lower Saxony’sscience minister, and Professor MikhailPetrovich Kirpichnikov, Russia’s researchminister.

Presenting ApplicationsAt Hanover Trade Fair 2001 the GBFpresented itself together with other universitiesand companies at Lower Saxony’s joint stand.GBF exhibited the BioDisk synthesizer, atest system used in searching for moleculesfor diagnosis and treatment. At“BIOTECHNOLOGY 2000” in Berlin, from3 to 8 September 2000 GBF presented atest system used in searching for biologicallyactive molecules for diagnosis and treatmentas well as current research results fromenvironmental biotechnology.

Der Wurm im Visier. GBF-Wissenschaftler Dr. WounterJansen erklärt dem russi-schen ForschungsministerProf. Michail PetrowitschKirpitschnikow Infektions-versuche mit Streptokokkenam Fadenwurm C. elegans.

The worm in focus. GBF-Scientist Dr. Wounter Jansenexplains Prof. MichailPetrowitsch Kirpitschnikow,Russia´s research minister,experiments concerningC. elegans nematodes“infected” by streptococci.

Niedersachsens Wirtschafts-ministerin Dr. SusanneKnorre am GBF-Stand aufder Hannover Messe.

Dr. Susanne Knorre, LowerSaxony´s Minister ofEconomics, visited GBF atthe Hannover fair.


Gewinn des BioProfile-Wettbewerbs2001

Im BioProfile-Wettbewerb des Bundesmi-nisteriums für Bildung und Forschung istdie Region Braunschweig, Göttingen,Hannover mit ihrem Beitrag „FunktionelleGenomanalyse – Plattform für Diagnostikund Therapie“ zu einem der drei Siegergekürt worden. Das von der GBF koordi-nierte Konzept ist Bestandteil der Landes-initiative BioRegioN. Damit wird in denkommenden fünf Jahren die UmsetzungErfolg versprechender Ideen aus dermedizinischen Biotechnologie in innova-tive Produkte, Verfahren und Dienstlei-stungen im Städtedreieck mit 15 Millio-nen Euro gefördert.

Die funktionelle Genomanalysegewinnt zunehmend an Bedeutung: Mitihr können Krankheiten ursächlich geheiltwerden, bei denen heute nur die Behand-lung von Symptomen möglich ist. Beson-ders in den Bereichen Infektions-,Stammzell- und Neurobiologie besitzendie Forschungseinrichtungen und Unter-nehmen in Südniedersachsen dasPotenzial, in den kommenden JahrenAnsätze für neue Diagnoseverfahren undMedikamente zu erarbeiten. Zusammenmit den Universitätskliniken in Göttingenund Hannover sowie dem StädtischenKlinikum in Braunschweig verfügt Süd-niedersachsen zudem über die wissen-schaftliche Expertise und technischeAusstattung, um sämtliche Aufgaben beider Produktentwicklung bis zu klinischenPrüfungen zu erfüllen.

Zur Umsetzung ihres erfolgreichenBioProfile-Konzeptes haben Wissenschaft-ler und Unternehmer aus der Regionbereits Anfang Mai den Verein „ForumFunktionelle Genomanalyse e.V.“ gegrün-det. Er wird regelmäßig Foren organisie-ren, in dem Forscher Projekte vor allemaus der medizinischen Genomforschungvorstellen. Ein Kuratorium aus namhaftenWissenschaftlern und Unternehmernidentifiziert Vorhaben mit wirtschaftli-chem Potenzial, um sie dann für eineweitere Förderung zum Beispiel mitMitteln aus dem BioProfile-Wettbewerbvorzuschlagen. Eine gewinnorientierteManagement GmbH wird anschließend

den Forschern helfen, ihre Erfolg verspre-chenden Ideen in Firmengründungen zuüberführen. Sie soll den Prozess derProduktentwicklung begleiten, bis sich dieUnternehmen am Markt durchgesetzthaben.

BioFuture-Preis für Dr. Jutta EichlerIm Wettbewerb BioFuture des Bundesmi-nisteriums für Bildung und Forschungwurde im Mai 2001 GBF-WissenschaftlerinDr. Jutta Eichler für ihr Forschungsvorha-ben „Synthetische Nachahmungen vonProteinbindungstaschen“ ausgezeichnet.Die Nachwuchsforscherin setzte sich inder Endrunde gegen mehr als 80 Mitbe-werber aus dem gesamten Bundesgebietdurch. In dem Forschungsprojekt werdenverschiedenste dreidimensionale Taschenkünstlich aus Peptiden nachgebildet.Diese Peptide werden an Trägermoleküle

Auszeichnungen

Die Gewinner im BioProfile-Wettbewerb des Bundesmi-nisteriums für Bildung undForschung (BMBF).

Winning the BioProfile-Conception of the FederalMinistry of Education andResearch.

(Prof Dr. Rudi Balling (GBF),Parlam. StaatssekretärDr. Thomas Catenhusen,Prof. Dr. Karl Molitor(IPF PharmaCeuticals),Dr. Georg Forsmann(Vorsitzender der BioProfileJury) (v. l. n. r.))

Dr. Jutta Eichler, Preisträge-rin im BioFuture-Wettbe-werb des Bundesministeri-ums für Bildung und For-schung (BMBF).

Dr. Jutta Eichler, winner ofthe BioFuture competitionof the Federal Ministry ofEducation and Research(BMBF).

(Scaffolds) gebunden, die Eichler eben-falls entwickelt. Die nachgeahmtenTaschen (Mimikry) ähneln dabei dennatürlichen Proteinbindungsdomänen.Diese bestehen häufig aus Bausteinen, diean verschiedenen Orten der Aminosäure-kette angeordnet sind, in der räumlichenStruktur des Moleküls jedoch nahbeieinander liegen.

„OCC Science and Humanity Prize“ 2001für Prof. Dr. Flohé

Den mit 30.000 US-Dollar dotierten„OCC Science and Humanity Prize“ 2001teilen sich Leopold Flohé, Professor an derTechnischen Universität in Braunschweigund Leiter der Gastforschergruppe an derGBF und Professor Lester Packer von derUniversität von Kalifornien, Berkeley,USA. Die jährlich vom „Oxygen Club ofCalifornia“ (OCC) vergebene Auszeich-nung ehrt Persönlichkeiten, die sich durchbahnbrechende Innovationen in derbiomedizinischen Forschung und ihrEngagement für die Wissenschaft verdientgemacht haben.

Bergey Medaille für Prof. Dr. HansReichenbach

Prof. Dr. Hans Reichenbach hat am 1.Februar 2001 die Bergey Medaille erhalten,die seit 1994 durch den Bergey´s ManualTrust in Georgia, USA, an herausragendeForschungspersönlichkeiten vergebenwird. Geehrt wird Reichenbach für seinLebenswerk „taxonomische Forschungs-arbeiten an Myxobakterien“. Diegleichnamige Stiftung gibt auch dasStandardwerk Bergey’s Manual of

Systematic Bacteriology heraus, an dessenNeuausgabe Reichenbach zumwiederholten Male beteiligt sein wird.

Kooperationspreis des LandesNiedersachsen

Den Kooperationspreis des LandesNiedersachsen 2000 haben die GBF unddie Biobase GmbH gewonnen.Gemeinsam haben sie Datenbanken undProgramme etabliert, die zum Beispiel dieSuche nach medizinisch relevanten Genenerleichtern und so die Entwicklungpharmazeutischer Wirkstoffe unterstützen.Diese Aufgabe wird angesichts derDatenberge aus der Genomforschungimmer wichtiger.

Inhoffen-Medaille und FörderpreiseDer französische Wissenschaftler ProfessorDr. Pierre Potier wurde 2001 für seineherausragenden Arbeiten zur Bekämpfungvon Krebs mit der Inhoffen-Medaille derTU Braunschweig und der GBF ausge-zeichnet. Auf seinen Forschungen basierenmehrere Medikamente gegen Tumore inBrust, Lunge oder Blase. So ist es demDirektor des Institut de Chimie desSubstances Naturelles in Gif sur Yvette beiParis gelungen, den Wirkstoff Taxol aufumweltverträgliche Weise halbsynthetischherzustellen.

Der Förderverein der GBF zeichnetezudem herausragende Doktorarbeiten aus:Preisträger 2001 waren Dr. Oliver Pabstund Dr. Stefan Hüttelmaier. Pabst hat sichmit Genen auseinander gesetzt, die in derEmbryonalentwicklung wichtig sind. ImMittelpunkt seiner Untersuchungen amInstitut für Biochemie und Biotechnologieder TU Braunschweig stand ein Gen, dasin der Maus an der Entstehung des Immun-systems und des Verdauungstraktes beteiligtist. Hüttelmaier hat sich mit den moleku-laren Eigenschaften von Kontaktstellentierischer und menschlicher Zellenbeschäftigt. Seine Arbeit liefert wichtigeneue Aspekte zu einem besseren Verständ-nis des Aufbaus und der Funktionnormaler Zellkontakte und erweitert diebisherigen Kenntnisse über pathologischeVorgänge zum Beispiel bei der Tumor-bildung und bei Muskelerkrankungen.Preisträger des Fritz-Wagner-Preises war indiesem Jahr Jan Henrik Enß vom Institutfür Bioverfahrenstechnik der TU. Enß hat


Prof. Dr. Hans Reichenbach:

Träger der Bergey Medaille2001

awarded with the BergeyMedal in 2001

Winning the BioProfile Competition 2001In the BioProfile competition of the FederalMinistry of Education and Research, theBraunschweig-Göttingen-Hanover region wasone of the three winners with its presentation“Funktionelle Genomanalyse – Plattform fürDiagnostik und Therapie” (functional genomeanalysis – a platform for diagnosis andtreatment). The concept coordinated by GBFis part of the BioRegioN federal stateinitiative. In the next five years it will serve topromote the conversion of promising ideasfrom medical biotechnology into innovativeproducts, processes and services in the abovetriangle of cities with funds amounting toEuro 15 million.

Functional genome analysis is increasinglygaining significance. It may serve to curediseases for which today only the treatment ofsymptoms is possible. Especially in the fields ofinfections, stem cells and neurobiology, the

research laboratories and companies insouthern Lower Saxony have the potential forevolving approaches for new diagnosticmethods and drugs in the coming years.Together with the university hospitals inGöttingen and Hanover as well as the clinicalcentre of the town of Braunschweig, LowerSaxony moreover has the scientific expertiseand technical equipment to fulfil all tasksfrom product development up to clinicaltesting.

For the implementation of their successfulBioProfile concept, scientists andentrepreneurs from the region founded theassociation “Forum Funktionelle Genom-analyse e.V.” (functional genome analysisforum) in early May. This association willregularly organize platforms at whichresearchers will present projects above all frommedical genome research. A supervisory boardcomposed of established scientists and

Awards

in seiner Diplomarbeit Methodenuntersucht, mit denen sich Biofilme aufmetallischen Oberflächen analysieren undzerstören lassen.

Der Arbeitskreis für Zellbiologie undBiomedizinische Forschung e. V. derGesellschaft für BiotechnologischeForschung (GBF) vergab die Förderpreisefür die Jahre 2000 und 2001. Der Förder-verein versteht seinen Preis als unbüro-kratische Motivationsspritze für erstklassigeGrundlagenforschung. Dr. Carsten Hornighat seine Doktorarbeit über die Entstehungvon Blutgefäßen an der TU Braunschweigangefertigt. Hornigs Untersuchungenbeschäftigten sich mit einer Variante desVEGFR-1-Rezeptors. Der Rezeptor ist einewichtige Schaltstelle im Wachstumsprozessneuer Blutgefäße. Karsten Kretschmerforscht im Rahmen seiner Doktorarbeit ander GBF an speziellen Zellen des Immun-systems, den antikörperproduzierendenB1-Zellen. Sie spielen offenbar bei derKrankheitsabwehr von Kindern (bis zum8. Lebensjahr) eine wichtige Rolle.

Die Dr.-Wilhelm-Kempe-Stiftung desBlutspendedienstes des Deutschen RotenKreuzes (DRK) Niedersachsen, Sachsen-

Anhalt, Oldenburg, Bremen hat seineStipendien 2001 für Forschungsprojekteüber hämatopoetische Stammzellenvergeben. Das Projekt von Lars Macke,Doktorand an der GBF, beschäftigt sichmit der „Qualitätskontrolle von dendri-tischen Zellen für die Immuntherapie“.


Förderpreis des „Arbeitskrei-ses für Zellbiologie und Bio-medizinische Forschung“ alsunbürokratische Motivationfür erstklassige Forschung.

Promotion prize of the „Ar-beitskreis für Zellbiologieund Biomedizinische For-schung“ as an unbureau-cratic motivation for firstclass basic research.

(Prof. Dr. Jürgen Bode, Preis-träger Karsten Kretschmer,Dr. Carsten Hornig (v. l. n. r.))


entrepreneurs will identify projects with ascientific potential and propose them forfurther support, for example, from funds of theBioProfile competition. A profit-orientedManagement GmbH will then help theresearchers to turn their promising ideas intostart-up companies. Its function is toaccompany the process of product developmentuntil the companies have gained acceptancein the market.

BioFuture Award for Dr Jutta EichlerIn the BioFuture competition of the FederalMinistry of Education and Research, Dr JuttaEichler, a GBF scientist, was awarded a prizein May 2001 for her research project“Synthetische Nachahmungen von Protein-bindungstaschen” (synthetic imitations ofprotein binding pockets). The young scientistwas successful in the final round against morethan 80 competitors from all over Germany.In the research project, a variety of three-dimensional pockets are artificially reproducedfrom peptides. These peptides are bound tocarrier molecules (scaffolds) also developed byEichler. The imitated pockets (mimicry)resemble the natural protein binding domainswhich frequently consist of building blocksarranged in different locations of the aminoacid chain, which are, however, close to eachother in the spatial structure of the molecule.

“OCC Science and Humanity Prize” 2001for Prof. Dr Flohé

The “OCC Science and Humanity Prize”2001 endowed with US $ 30,000 is shared byLeopold Flohé, professor at the Technical

University in Braunschweig and head of theguest scientists group at GBF, and ProfessorLester Packer from the University ofCalifornia, Berkeley, USA. The prize awardedannually by the “Oxygen Club of California”(OCC) honours personalities of outstandingmerit due to groundbreaking innovations inbiomedical research and their commitment toscience.

Bergey Medal for Prof. Dr. HansReichenbach

Professor Reichenbach was awarded theBergey Medal on 1 February 2001. Thisaward has been given to outstanding scientistsby the Bergey Manual Trust in Georgia, USA,since 1994. Professor Reichenbach washonoured as a result of his lifelongcontribution to “taxonomic research work onmyxobacteria”. The Bergey`s Foundation alsopublishes the standard work “Bergey`sManual of Systematic Bacteriology”; ProfessorReichenbach was once again involved with thelatest version of this publication.

Cooperation Prize of the Federal State ofLower Saxony

The Cooperation Prize 2000 of the federalstate of Lower Saxony was won by GBF andBiobase GmbH. They jointly establisheddatabases and programmes which, forexample, facilitate the search for medicallyrelevant genes and thus enhance thedevelopment of active pharmaceuticalingredients. This task is becoming more andmore important in view of the mountains ofdata from genome research.

Inhoffen Medal and Promotion PrizeProfessor Dr Pierre Potier, a French scientist,was awarded the Inhoffen Medal of TUBraunschweig and GBF in 2001 for hisoutstanding work on combatting cancer.Several medical drugs for tumours of thebreast, lung or bladder are based on hisresearch. Thus, for example, the director of theInstitut de Chimie des Substances Naturelles

Prof. Dr. Leopold Flohé er-hielt für bahnbrechende In-novationen in der biomedi-zinischen Forschung den“OCC SET Science andHumanity Prize” 2001.

For his groundbreakinginnovations in biomedicalresearch Prof. Dr. LeopoldFlohé was awarded the“OCC Science and HumaningPrize” 2001.


in Gif-sur-Yvette near Paris succeeded inproducing the active ingredient taxol semi-synthetically in an environmentallycompatible manner.

The GBF “Förderverein” (promotionassociation) moreover awarded prizes foroutstanding PhD theses. The 2001 prizewinners were Dr Oliver Pabst and Dr StefanHüttelmaier. Pabst worked on genes ofimportance in embryo development. Hisinvestigations at the Institute of Biochemistryand Biotechnology of TU Braunschweigfocused on a gene which in mice is involved inthe development of the immune system andthe digestive tract. Hüttelmaier concernedhimself with the molecular properties ofcontact sites of animal and human cells. Hiswork provides important new aspects for abetter understanding of the structure andfunction of normal cell contacts and extendsprevious knowledge on pathological processes,for example, in tumour formation andmuscular diseases. The winner of the FritzWagner prize this year was Jan Henrik Enßfrom the Institute of Biochemical Engineeringof the Technical University. In his diplomadissertation, Enß investigated methods withwhich biofilms on metallic surfaces can beanalysed and destroyed.

The “Arbeitskreis für Zellbiologie undBiomedizinische Forschung e. V.” (workinggroup for cell biology and biomedical research)of the German Research Centre forBiotechnology (GBF) awarded the“Förderpreise” (promotion prizes) for the years2000 and 2001. The “Förderverein” regardsits prize as an unbureaucratic motivation forfirst-class basic research. Dr Carsten Hornigmade his PhD thesis on the formation ofblood vessels at TU Braunschweig. Hornig’sstudies were concerned with a variation of theVEGFR-1 receptor. The receptor is animportant switching point in the growthprocess of new blood vessels. Within theframework of his PhD thesis, KarstenKretschmer is conducting research at GBF onspecial cells of the immune system, theantibody-producing B1 cells. They apparentlyplay an important role in children’s defenceagainst diseases (up to the age of 8).

The Dr Wilhelm Kempe Foundation of theblood transfusion service of the German RedCross (DRK) in Lower Saxony, Saxony-Anhalt, Oldenburg, Bremen has awarded its2001 scholarships for research projects onhaematopoietic stem cells. The project of LarsMacke, doctoral student at GBF, relates to thequality control of dendritic cells forimmunotherapy.

Veröffentlichungen ❘ Publications


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Seite 207/208Luftbild Gelände der GBF,Herbst 2000

Page 207/208Aerial photo of GBF campus,Autumn 2000

InternationalTrainingProgramme

Infection Biology

Topic of 15th Course:

to Vaccine

From 5 August to 13 September, 2002, the 15th Course will take place at the GBF.

Interested candidates from Developing Countries should contact

eitherMrs. Jeannie Scriven . MA (Univ. Dublin) Mphil (Univ. Bath) . Administrator – International TrainingProgramme in Biotechnology of the Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH . German Research Centre for BiotechnologyMascheroder Weg 1 . 38124 Braunschweig/Germay . E-mail: [email protected] . Phone 00 49 531 61 81 272 . Fax 00 49 531 61 81 278

orthe GBF Website: www.gbf.de

From Gene

Impressum

Ergebnisbericht ❘ Annual Report 2001

Herausgegeben von ❘ Published byGesellschaft für Biotechnologische Forschung mbHGBF – German Research Centre for Biotechnology Ltd.Mascheroder Weg 1D-38124 BraunschweigTelefon +49-5 31/61 81-0Telefax +49-5 31/61 81-515E-mail: [email protected]: www.gbf.de

Mitglied der ❘ Member ofHermann von Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF)

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Herstellung ❘ Printed byDöring Druck, Druckerei und Verlag GmbH, Braunschweig

Gedruckt auf chlorfrei gebleichtem Papier ❘ Printed on acid-free and chlorine-free paper

ISSN 0935-0497

Seite 215: Titelbild der Zeitschrift Environmental Microbiolog, Vol. 2 (2), 2000, anläßlich der Veröffentli-chung des Aufsatzes “Clay hutches: a novel interaction between bacteria and clay minerals” vonLünsdorf H, Erb RW, Abraham W-R, Timmis KN, S. 161-168. Mit freundlicher Genehmigung des BlackwellPublishing Verlages.

Page 215: Cover picture of the Environmental Microbiology, Vol. 2 (2), 2000, on the occasion of thepublication of the article “Clay hutches: a novel interaction between bacteria and clay minerals” fromLünsdorf H, Erb RW, Abraham W-R, Timmis KN, pp. 161-168. The permission of Blackwell Publishing isgratefully acknowledged.

Quo vadis GBF? - Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung€¦ · Die GBF entwickelt sich zu...

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