RestriktionsverdauTheorie

Restriktionsenzyme sind die molekularen Scheren in der Biotechnologie. Ursprünglich wurden sie erstmals in Bakterien entdeckt und isoliert. Da Bakterien sehr leicht DNA aufnehmen können, besteht ihre Aufgabe darin artfremde DNA zu schneiden und somit zu verhindern, dass diese in das eigene Genom aufgenommen wird.

Molekülansicht des Restriktionsenzyms Restriktionsenzyme schneiden DNA

Diese Eigenschaft ist in der Gentechnik von sehr großer Bedeutung, da bestimmte Enzyme sehr spezifisch schneiden. Es entstehen so DNA Fragmente mit genau definierten Schnittstellen, die dann weiter untersucht werden können.

Einfacher Restriktionsverdau eines ringförmigen Plasmids. Eine Schnittstelle ergibt ein lineares DNA Fragment

Hind III37°C

Plasmid-DNA Plasmid mit HindIII Schnittstelle

DNA linearisiert

In diesem Versuch wird das Plasmid PSK untersucht. Es handelt sich dabei um eine ringförmige DNA, die unter anderem die genetische Information für eine Antibiotikaresistenz (Ampicillin) beherbergt. Das Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen Hind III und Dra I sowie einer Kombination aus beiden geschnitten. Anhand dieser Fragmente soll dann eine Karte des Plasmids erstellt werden, die Auskunft über die Schnittstellen ergibt, d.h. eine Restriktionskarte.

Vektorkarte von PSK Schnittstellen der verwendeten Enzyme

Hind III

Dra 1

Optimale Enzymaktivität bei 37°C

A A G C T TT T C G A A

T TT AAAAAA TT T

Resistenz

20µl

RestriktionsverdauStart

Jetzt werden 3 µl vom RestriktionsenzymDra I (grün) in das Eppi Nr 2 pipettiert

Dann werden 3 µl von Hind III (blau)in das Eppi Nr. 3 pipettiert

1

2

3

4

17µl 17µl 17µl

Das Plasmid-DNA Gemisch (gelb) wird nach folgendem Schema pipettiert

Inhalt der Eppendorfgefäße

gelb = Gemisch aus DNA, Puffer,H2O

grün = Restriktionsenzym Dra Iblau = Restriktionsenzym Hind IIIgrün/blau= Gemisch Dra I & Hind III1,2,3,4 = leere Eppendorfgefäße

Es sollen 4 Reaktionsansätze pipettiert werden. Eine Kontrolle ohne Restriktionsenzym, zwei Einfachverdaus und ein Doppelverdau. Die leeren Eppendorfgefäße 1,2,3,4 wie im rechten Bild beschriften und die Schritte abarbeiten.

DNA 1 2 3 4

DNA

1 2 3 4

Restriktionsverdau

Anschließend werden die Eppendorfgefäße 1,2,3,4 durch Vortexen gemischt.

Zum Schluss werden noch 3 µl von dem Gemisch Hind III/ DraI in das Eppi Nr. 4 pipettiert. In jedem Eppendorfgefäß befinden sich jetzt 20 µl.

Jetzt kommen die Eppis für 1 Stunde bei 37 ° C in den Thermoblock

5

6

7

8

Da sich beim Mischen einige Tropfen am Gefäßrand absetzten, müssen die Eppendorfgefäße 20 sek. zentrifugiert werden. (Achtung! Zentrifuge immer austarieren)

Weiter zur Gelelektrophorese

Gelelektrophorese

Theorie 1Nach einem Restriktionsverdau besitzt man ein Gemisch aus unterschiedlich langen linearisierten DNA Fragmenten

Um dieses Gemisch aufzutrennen, wird ein Gel verwendet. Das Gel besteht aus Puffer, in dem Agarose durch Erhitzen gelöst wird. Kühlt das Gemisch ab, so entsteht ein Netz auf molekularer Basis.

Wird an dem Gel Spannung angelegt, so wandert die negativ geladene DNA (Phosphatrest mit negativ geladenem Sauerstoff) zum positiven Pol. Dabei laufen DNA Fragmente mit wenig Basenpaaren schneller durch das Netz. Größere Fragmente sind langsamer.

Einzelsträngige DNA mit negativ geladenen Phosphatresten

Schematische Darstellung: Netz im Agarosegel

Auf dem rechten Schaubild wird dieser Sachverhalt noch einmal verdeutlicht.Die DNA Fragmente mit dem Index Asind länger, d.h. sie wandern langsamer durch das Gelnetz. Die kleineren Fragmente B laufen schneller durch das Gel.

Gelelektrophorese

Theorie 2

Zu dem zu analysierenden DNA Gemisch wird noch ein Ladepuffer zugegeben. Dieser enthält einen Farbstoff mit dem man abschätzen kann, wie weit die DNA im Gel schon gewandert ist. Sind Marker und das DNA – Puffergemisch auf das Gel aufgetragen, kanndie Spannung angelegt werden. (Siehe dazu Gelelektrophorese Schritt 9)

Nachdem die DNA in das Gel gewandert ist, muss sie sichtbar gemacht werden. Dazu verwendet man Ethidiumbromid – ein Farbstoff der mit der DNA interkaliert und unter UV- Licht fluoresziert.

Um Später eine Aussage über die Anzahl der Basenpaare also die Länge eines DNA Fragments machen zu können wird ein Standard- Marker mit auf das Gel aufgetragen. Er besteht aus einem Gemisch von DNA Fragmenten mit bekannter Größe.(Siehe dazu Gelelektrophorese Schritt 10)

Formel von Ethidiumbromid.Das flache mehrgliedrige Ringsystemlagert sich zwischen zwei benachbarte Basenpaare

Farbstoffbandenach 1h bei 130 V

Schematische Darstellung derDNA- Doppelhelix mit dengestapelten Basen in der Mitte

Farbstoffmoleküle

Gestreckte DNA Helix durch eingelagerte Farbstoffmoleküle (blau)

GelelektrophoreseStart

Zuerst wird der Gelschlitten senkrecht in die Kammer eingesetzt. Dadurch erhält man eine rechteckige Form, in welche das Gel gegossen werden kann.

Auf dem rechten Bild ist die Gelelektrophoresekammer abgelichtet und ein dazu passener Gelschlitten.

Das flüssige Agarose - Gel (Vorsicht heiß!) wird dann in die rechteckige Form gegossen. Anschließend wird der Kamm eingesetzt. Dadurch werden im Gel Taschen gebildet, in die später das DNA Gemisch eingefüllt werden kann.

Das Gel benötigt ca. 30 min zum trocknen. Zum Schutz vor Verunreinigung wird auf dem Apparat der Deckel aufgesetzt.

1

2

3

4

Gelelektrophorese

Der Schlitten mit dem festen Gel wird jetzt herausgenommen und um 90° gedreht. Dann wird er so eingesetzt, dass der Kamm oben ist. (Die Anschlüsse für die Elektroden müssen sich auf der rechten Seite befinden.)

Nach dem das Gel sich verfestigt hat kann der Deckel wieder abgenommen werden.

Jetzt wird der Kamm vorsichtig aus dem Gel gezogen.

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8

Die Gelelektrophoreskammer wird mit 1 x TBE – Puffer bis zur Haltelinie gefüllt (Beim Füllen abwechselnd in die rechte und die linke Kammer den Puffer zugeben bis das Gel vom Puffer bedeckt ist.

Gelelektrophorese

Fertig zum Färben

Der Restriktionsverdau ist nach 1 h fertig.Die Eppis können aus dem Thermoblock entnommen werden. Dann wird in jedes Eppendorfgefäß 5 µl Ladepuffer hinzugegeben (Kurz vortexen und 5 sek. Zentrifugieren)

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10

11

12

Marker

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Die DNA Gemische werden dann nach folgenden Schema aufgetragen

1: DNA 3: Hind III2: Dra 1 4: Dra 1& HindIII

Zum Schluss wird der Deckel geschlossen. Dann wird die Elektrophoresekammer mit dem Netzgerät verbunden. Dabei auf richtige Polung achten (rot = - ; schwarz = + )

Bei 130 V und 55 mAh wird das Gel unter Spannung gesetzt. Nach einer Stunde wird die Stop- taste betätigt.Das Gel ist dann Fertig zum Färben.

Färben und Auswerten

Start

1

2

3

4

Da der verwendete Farbstoff Ethidiumbromidkrebserregend ist, wird das Färben von denBetreuern durchgeführt. Die Gele werden nachdem Färben unter UV - Licht betrachtet und fotographiert.

Auf dem linken Feld wird das Foto eingeklebt. Dann werden die Marker -Banden beschriftet. Jetzt kann die ungefähre Größe der zu untersuchenden Banden abgeschätzt und notiert werden.

Banden (Anzahl der Basenpaare)Hind III :__________________Dra I :__________________HindIII & Dra I:____________

Jetzt werden die DNA – Fragmente in dierechte Tabelle eingezeichnet. Ein Fragment ist gleichbedeutend mit einer Schnittstelle !

- Geben Sie die Größe des Plasmids (kb)an- Zeichnen Sie die relativen Positionen der Hind III und Dra 1 Schnittstellen ein - Ist die Anordnung der Schnittstellen die einzig mögliche oder gibt es noch eine Alternative ?

Hind III Dra I Hind III & Dra I

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

kb

Erstellt für das „Regensburger Experimentierlabor“ (Autor: Johannes Wällisch)