Molekulare Ökologie/ Populationsgenetik

SoSe 2009

Hinweise zum Praktikum

Formales

• Tagesablauf• Gruppenaufteilung, Teilnahmeliste• Sicherheitsbelehrung• Laborverantwortliche• Protokollbögen• Labortagebuch• Hinweise zur Auswertung, Bewertung• Literatur

Themen

Molekulare Ökologie: Themen• Molekulare Identifikation: Arten, Individuen, Geschlecht, DNA-

Barcoding• Verhaltensbiologie: Fortpflanzungserfolg, Elternschaft,

Nahrungswahl, Ausbreitung• Populationsgenetik: Populationsgröße, Populationsstruktur,

Fragmentierung, Wachstum, Mortalität, Migration• Phylogeographie: Verbreitungsgeschichte, Verbreitungsgebiet,

Hybridisierung, Herkunftsbestimmung• Genetik im Artenschutz: genetische Diversität, Inzuchtdepression,

Auszuchtdepression, Warenkontrolle• Genetische Ökotoxikologie: Umweltselektion, Anpassung,

Bioindikation• Genetische Mikrobiologie: mikrobielle Gemeinschaften,

Identifikation von Arten• Genetisch modifizierte Organismen: Vertikaler Gentransfer,

Horizontaler Gentransfer

Genetik im Artenschutz (Conservation Genetics): Zielsetzungen

• Reduzierung des Aussterberisikos durch Reduzierung von Inzucht und Verlust genetischer Diversität

• Identifikation von Risikopopulationen• Beschreibung der Struktur einer Population• Klärung des taxonomischen Status• Ableitung von Managementeinheiten• Entdeckung von Hybridisierungen• Nicht-invasive Beprobung• Beschreibung geeigneter Wiederansiedlungsgebiete• Auswahl geeigneten Besatzmaterials• Identifikation einer Art anhand geringer Probenmengen• Besseres Verständnis der Biologie einer Art (Populationsgröße,

Geschlechterverhältnis, Paarungssystem, Ausbreitung...)

Small populationsForensics

Understandingspecies biology

Evolutionary genetics

Taxonomic uncertainties

Introgression

population structure/fragmentation

Outbreeding

Loss of genetic diversityInbreeding Mutational accumulation

Extinction

Reproductive fitness

Genetic management

Identify management unit

wild captive

reintroductionGenetic adaptation to captivity

Nach Frankham et al. 2003

Conservation Genetics

Ist die Taxonomie eindeutig?

Nein Ja

Genetischer Vergleich der Populationen

Chromosomen in identischer Zahl und Form?

Nein Ja – vermutlich eine Art

Unterschiede zwischen Populationen?

Ist Introgression ein Problem?

NeinJa – unterschiedliche Art

Unterschiede innerhalb Populationen?

NeinJa Unbekannt

Einsatz genetischer Marker

Nein Ja – Polymorphismen innerhalb Art

Einsatz weiterer Marker

Nach Frankham et al. 2003

Ist die Taxonomie eindeutig?

Nein Ja

Kleine Population?

NeinJa

Probleme durch Inzucht oder geringe genetische Diversität?

NeinJa

Population zur Kreuzung vorhanden?

Fragmentierung der Population?

NeinJa

Populationstruktur?

Ausreichender Genfluß?

NeinJa Unbekannt

Einsatz genetischer MarkerNach Frankham et al. 2003

Sind bei der Art alle relevanten Aspekte der

Biologie bekannt?

NeinJa

Abstammung? ja nein

Paarungssystem? ja nein

Genfluss? ja nein

Populationsgröße? ja nein

Bottlenecks? ja nein

Falls nein, können genetische Marker hierzu Informationen liefern?

Unterliegt die Art illegaler Jagd oder Handel?

Falls ja, können genetische Marker genutzt werden, um diese zu

entdecken?

Nach Frankham et al. 2003

Organisation der DNA

DNA im ZellkernArt Größe des Genoms

[bp] Chromosomen

Hefe 14 x 106 16

Fadenwurm 80 x 106 4

Taufliege 165 x 106 4

Krallenfrosch 3000 x 106 18

Maus 3000 x 106 20

Mensch 3000 x 106 23

Mais 5000 x 106 10

Zwiebel 15000 x 106 8

Knippers 1997

Vergleich Prokaryoten / Eukaryoten

Prokaryot Eukaryot

Arten Bakterien, blaugrüne Algen

Tiere, Pflanzen, Pilze, Protisten

Organisation der DNA als dichtes Knäuel in der Zelle (Nucleoid)

im Zellkern eingeschlossen,

Protein-DNA-Komplex (Chromatin)

Mitochondrien, (Chloroplasten) nicht vorhanden vorhanden

Endoplasmatisches Reticulum nicht vorhanden vorhanden

Organisation des Eukaryoten-Genoms

• Gene– Kodierungssequenzen (Exons)– Nichtkodiderungssequenzen (Introns)

• Repetitive DNA-Elemente– Satelliten-DNA

• Centromer-DNA• Telomer-DNA• Minisatelliten• Mikrosatelliten

– andere repetitive Elemete• SINE-DNA (short interspersed repetitive elements)• LINE-DNA (long interspersed repetitive elements)

Organisation des Eukaryoten-Genoms

• Minisatelliten: Kopien von DNA-Abschnitten aus 16-64 Basenpaaren (bp)

• Mikrosatelliten: 10 bis 50 Kopien von einfachen Sequenzen aus 2 bis 4 bp

• SINE-DNA (short interspersed repetitive elements): Abschnitte von 100 bis 500 bp

• LINE-DNA (long interspersed repetitive elements): 6000 bis 7000 bp

http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/pv92/aluframeset.htm

Alu-Element-Polymorphismus PV92

• Alu-Elements:– Short INterspersed Elements (SINE)– Erkennungsstelle für Alu– Transposon / „jumping gene“

(Alu→mRNA →DNA →Insertion)– Nur bei höheren Primaten (Entstehung vor 60. Mio. Jahren) )

• PV92:– für Menschen spez. Insertion eines Alu-Elements auf

Chromosom 16– 2 Allele (715 bp = „+“Allel; 415 bp = „-“Allel)

www.geneticorigins.org

Alu-Element PV92

Interview mit Prof. Dr. Lynn Jorde, Eccles Institute of Human Genetics, Utah:

• Vererbung von Alu-Elementen und Verwendung im Studium der menschlichen Abstammung

http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/jorde/usingalu.rm

• Hinweise auf fortlaufende Insertionen und Entstehungsrate

http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/jorde/genetics.rm

DNA-Code?

Wobble-Hypothese (engl. to wobble = wackeln, schaukeln, schwanken)

• durch Kombination der vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) bzw. Uracil (U) lassen sich 64 verschiedene Tripletts bilden

• Drei Tripletts werden als Stopp-Signal interpretiert, die übrigen 61 codieren Aminosäuren

• da nur 21 Aminosäuren (einschließlich Selenocystein) vorkommen, kann eine Aminosäure durch verschiedene Codon-Tripletts (Synonyma) codiert werden:– Arginin, Leucin → 6 synonyme Tripletts– übrigen Aminosäuren → 4, 2 oder eins (Methionin)

(Wikipedia)

Wobbles in der Primersequenz

• R = A+G• Y = C+T• M = A+C• K = G+T• S = G+C• W = A+T• H = A+T+C• B = G+T+C• D = G+A+T• V = G+A+C• N = G+A+T+C

Fragestellung 1:

Wo sind die Ursprünge des modernen Menschen?

Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen

• Vertreter der Art Homo erectus wanderten vor 1,5 Mill. aus Afrika aus und bildeten Populationen in Europa und angrenzenden Gebieten (→ Homo neanderthalensis). Jüngste Funde sind ca. 30.000 Jahre alt.

• 40.000 bis 100.000 Jahre alte Fossilfunde des „modernen“ Menschen Homo sapiens sind aus Afrika, Europa und Asien bekannt.

Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen

• Theorie 1 - Multiregionale (polyphyletische) Abstammung:Der „moderne“ Mensch entwickelte sich aus den regionalen Populationen des Homo erectus.

• Theorie 2 – Monophyletische (Out-of-Africa) Abstammung:Der „moderne“ Mensch entwickelte sich in Afrika, erreichte von dort die übrigen Kontinente und verdrängte Homo erectus.

Methoden

• DNA-Extraktion mit Chelex• Elektrophoretischer Nachweis des Alu-Element-

Polymorphismus PV92• Sequenzanalyse eines mitochondriellen

Genabschnitts

Auswertung

• Allelhäufigkeit• Genotypenhäufigkeit• Heterozygotiegrad• Hardy-Weinberg-Gleichgewicht• Vergleich mit anderen Gruppen→ www.bioservers.org

Links:https://www3.nationalgeographic.com/genographic/index.htmlhttp://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1069

Fragestellung 2:

Wirken Querbauwerke im Verlauf der Haardtrandbäche als

Wanderungshindernisse für Gammariden (Gammarus

fossarum)?

Probestellen

Gewässer (Probestelle) Mündung

Triefenbach (oberhalb Hilschweiher) Speyerbach

Modenbach (unterhalb Buschmühle) Speyerbach

Hainbach (unterhalb Walddusche) Speyerbach

Schwelterbach (bei Grillhütte) Queich

Probestellen

Triefbach Modenbach

Hainbach

Schwelterbach

Gewässergüte

Schw

elte

rbac

h Hainbach

Modenbach

Triefbach

http://www.geoportal-wasser.rlp.de/geoportal/html/geoportal_homepage.html

Strukturgüte

Querbauwerke

Hypothesen?

Methoden

• DNA-Extraktion• Allozymanalyse• RAPD, ISSR• PCR-RFLP

DNA-Extraktion

• Konzentrationsbestimmung mittels Agarosegel

Allozymanalyse

negativeanode

positiveanode

Well

Proteinmigrates

Allozymanalyse

Wie variable sind Proteine?

Anteil polymorpher Proteine(häufigstes Allel < 99 %):

Säugetiere 15%Vögel 22%Insekten 33%Pflanzen 25%

AllozymanalyseVorteile: kostengünstig; Marker

sind co-dominantNachteile: erfasst nur kleinen

Anteil von DNA-Variationen. Viele DNA Varianten führen nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz (z.B. synonyme Substitutionen) bzw einer Änderung der Mobilität im Gel.

Anwendungen:Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung

Interpretation des Bandenmusters

Bandenmuster für a) ein monomeres Enzym, b) ein dimeres Enzym und c) ein tetrameres Enzym. Die Homozygoten werden durch 11 und 22 repräsentiert, die Heterozygoten durch 12.

Interpretation des Bandenmusters

• monomere Quartärstruktur• 6 Alloenzyme

Interpretation des Bandenmusters

• 3 Genorte→ Isoenzyme• dimere

Quartär-strukrur

DNA-Variationen

RFLPPCR-basierte Methoden

RFLP(restriction fragment length

polymorphism)

Restriktionsenzyme

• Restriktionsenzyme schneiden an spezifischen Erkennungssequenzen. Diese Sequenzen sind oft Palindrome:6-cutter: GAATTC 4-cutter: TCGA

CTTAAG AGCT

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html

RFLP-AnalysePCR-Analyse:1) PCR-Reaktion2) Restriktionsverdau3) Gelelektrophorese

Southern-Analyse:1) Restriktionsverdau2) Gelelektrophorese3) Hybridiserung

? ? ?

RFLP-Analyse

Vorteile: Marker sind co-dominant. Genetische Variationen werden direkt auf Ebene der DNA-Sequenz festgestellt.

Nachteile: hoher Arbeitsaufwand, benötigt viel Probenmaterial

Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung

RFLP-Analyse

Aufgabe:• Fragmentgröße 1800 bp• Schnittstellen:

– Allel A – 400bp & 800bp– Allel B – 400bp

→Fragmentmuster für AA, AB, BB?

PCR-basierte Methoden

RAPDAFLPVNTR

Sequenzierung

PCR(polymerase chain reaction)

http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1017

RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)

Analyse der Fragmentmuster

500

1000

1500

Fragment-länge [bp]

Monomorphe BandePolymorphe Bande

Analyse der Fragmentmuster

RAPD

Vorteile: schnell, kostengünstig, hochvariabel.Nachteile: Marker sind dominant. Geringe

Reproduzierbarkeit.Anwendungen: Populationsstrukturierung,

geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung

AFLP(amplified fragment length

polymorphism)

Digestion of DNA with

two enzymes

Ligation of adapters

Primers complementary to adapters and to 3’ region of some of the fragments

AFLP

AFLP

Vorteile: schnell, kostengüstig, hochvariabel, gute Reproduzierbarkeit.

Nachteile: Marker sind dominant.Anwendungen: Populationsstrukturierung,

geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung

Minisatelliten / Mikrosatelliten (VNTR)

→ http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1074

Mikrosatelliten

Mikrosatelliten

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

195 200 205 210 215 220 225 230 235 240

6cSQ_S0005.F11_07050703Z8

Size (nt)

Dye

Sig

nal

2 0 0

2 07 . 5 5

2 0 8 . 6 3

2 0 9 . 6 52 1 0 . 7 0

2 1 1 . 6 7

2 1 2. 7 9

2 1 3 . 7 7

2 1 4 . 8 9

2 1 5 . 8 6

2 1 6 . 8 5

2 2 0

2 4 0

Fragmentlängenbestimmung mit Hilfe eines Sequencers

Größenmarker 212 bp-Peak 216 bp-Peak

Mikrosatelliten

Vorteile: hochvariabel, co-dominantNachteile: kostenintensiv, lange

EntwicklungszeitAnwendungen: Populationsstruktur, geograph.

Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Forensik

Sequenzanalyse

Sequenzanalyse

• Sequenzierung nach Sanger(Anfang 1970er Jahre)

http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1189

• Automatische Sequenzierunghttp://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html

Sequenzanalyse

Vorteile: hochvariabel, co-dominantNachteile: kostenintensivAnwendungen: Populationsstruktur, geograph.

Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung, Phylogenetik

Hardy-Weinberg-Gleichgewicht• Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem

deutschen Arzt Wilhelm Weinberg.• HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population:

– Sehr große Individuenzahl– Panmixie– Keine Selektion– Keine Mutationen– Keine Migration

Hardy-Weinberg-Gleichgewicht

p + q = 1 p2 + 2pq + q2 = 1

• p: relative Häufigkeit des Auftretens des Allels A• q: Allelfrequenz des (zu A komplementären) Allels a• p² = h(AA)• 2pq = h(Aa)• q² = h(aa)

Hobs = Hexp ?

p = 0,5; q = 0,5p² = h(AA) = 0,252pq = h(Aa) = 0,5q² = h(aa) = 0,25

AA

AA

AB

AB

AB

AB

BB

BB

Hobs = Hexp ?

Wahlund-Effekt:Separation von Teilpopulationen führt zu einem Rückgang der Heterozygotie

AB

AA

AA

BB

AB

BB

BB

AA

Hardy-Weinberg-Gleichgewicht• Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem

deutschen Arzt Wilhelm Weinberg.• HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population:

– Sehr große Individuenzahl– Panmixie– Keine Selektion– Keine Mutationen– Keine Migration

Grundlagen der genetischen Vielfalt

Inzucht:

Conner & Hartl 2004

0

0

HHHF −

=

F = InzuchtkoeffizientH0 = erwartete HH = beobachtete H

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Zunahme der genetischen Vielfalt durch:

1. Generation 2. Generation

Mutation Migration

→http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1073

Grundlagen der Populationsgenetik

• Mutation

Conner & Hartl 2004

Grundlagen der Populationsgenetik

• Migration: Inselmodell des Genflusses

)(

)1(

11

1

−−

−

−=−=

+−=

ttt

tt

ppmppp

mpmpp

∆

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Migration

Conner & Hartl 2004

Grundlagen der genetischen Vielfalt

Selektion:

wirkt über Unterschiede in der individuellen Überlebensrate und im Fortpflanzungserfolg

1. Generation 2. Generation

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Selektion (gerichtet)

Conner & Hartl 2004

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Selektion (gerichtet)

Conner & Hartl 2004

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Selektion(stabilisierend)

Conner & Hartl 2004

Grundlagen der genetischen Vielfalt

Genetische Drift:

nur ein Teil der Population reproduziert sich erfolgreich; hierdurch können sich Merkmalshäufigkeiten zufällig ändern

1. Generation 2. Generation

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Genetische Drift: Inzuchtkoeffizient∆F = 1 / 2Ne (Wright 1931)Ft = 1 - (1 - 1/(1/2 Ne)t

Primack 1995

Grundlagen der genetischen Vielfalt

• Migration vs. Drift

Conner & Hartl 2004

mNF

eST 41

1+

=

FST = Fixierungsindex

Grundlagen der genetischen Vielfalt

Flaschenhals-Effekt (bottleneck effect)

Gründer-Effekt (founder effect)

1. See 2. See1. Generation

2. See2. Generation

1. Generation 3. Generation2. Generation

Grundlagen der genetischen Vielfalt

Ebene der VariationBeobachtete Heterozygotieinnerhalb von Teilpopulationen (HI)

Differenzierung zwischen Teilpopulationen (FST)

Effekt auf all Loci?

Mutation ↑ ↑ NeinGenfluss (Migration) ↑ ↓ JaGendrift ↓ ↑ JaSelektion ↑↓ ↑↓ Nein

Grundlagen der genetischen Vielfalt

Inzucht:

Paarung nahverwandter Tiere kann zur Kombination von zwei defekten Genen an einem Genort führen

Zunahme von Erbkrankheiten, verminderte Überlebens- und Fortpflanzungsrate (Inzuchtdepression)

Grundlagen der genetischen VielfaltHybridisierung:

die Kreuzung bereits differenzierter Populationen oder (Unter-)Arten kann die genetische Vielfalt erhöhen oder zu einem Verlust der genetischen Identität führen (Auszuchtdpression)

1. See 2. See

3. See

Projekte

Laufend/ abgeschlossen:• Nicht-invasive Bestandsschätzung von Wildschweinen

(Kolodziej, Thometzek, Eckert)• Phylogenetik von Bachforellenpopulationen des

Pfälzerwaldes (Holzhäuser)• Erfolgskontrolle von Fischwanderhilfen (Wolf)• Sozialstruktur bei Waschbären (Peter)• Warenkontrolle von Heilpflanzen (Süß)

Geplant:• Phylogenetik von Edelkrebspopulationen• Genfluss zwischen Fischbeständen der Rheinaltarme