1

Ringvorlesung "Chemisch Biologische Synthese"

3. Aminosäuren und Peptide (3h) 3.1. Aminosäuren und deren Synthese (T. Schrader) 3.2. Peptidsynthesen (T. Schrader) 3.3. Globale Strukturen (T. Schrader) 3.1. Aminosäuren und deren Synthese a) Allgemeines zu Aminosäuren: evtl. aus Voet-Voet. Wichtig: Bausteine aller Peptide,

Seitenketten machen nach der Faltung die Funktion der meisten Peptide als Biokatalysatoren und Rezeptoren aus. 20 proteinogene, 8 essentielle Aminosäuren. Zwitterionische Struktur auch im Kristall, dadurch gute Löslichkeit in Wasser, schlechte in org. Lösungsmitteln sowie hohe Schmelzpunkte (~300°C). Klassifizierung in unpolare, polare und geladene Seitenketten. Nomenklatur in 3-Buchstaben- (Ala, Ser) bzw. Ein-Buchstaben-Codes (K,L,F). Meistens L-, bei Bakterienzellwänden meist D-; meist α−, aber auch β− wichtig (z. B. in Medikamenten). Herausforderungen bei der Synthese: Amphiphiler Charakter (N-/C-Schützung) und Racemisierungstendenz (auch bei Peptidsynthesen ein Problem, z.B. über Oxazolinonbildung).

Abb. Alle Aminosäuren mit Seitenketten und Buchstabencodes.

Ph

H2N CO2H

H2N CO2HH2N CO2HH2N CO2HH2N CO2H H2N CO2H

Leu

L

Ile

I

Val

V

H2N CO2HH2N CO2H

Phe

F

Gly

G

Ala

A

Tyr

Y

H2N CO2H

OH

His

H

Gln

Q

Trp

W

H2N CO2H

H2N CO2H

NHN

H2N CO2H

NH

Asn

N

Pro

P

Thr

T

Glu

E

Cys

C

Ser

S

Asp

D

H2N CO2H

OH

H2N CO2H

SH

Lys

K

Met

M

Arg

R

H2N CO2H

H2N CO2H

HN

NH2

NH

H2N CO2HH2N CO2H

S-Me

CO2H

H2N CO2H H2N CO2H

NH2

H2N CO2H

CO2H

H2N CO2H

CO2HCO2HHN CO2H H2N CO2H

OH

H2N CO2H

O

NH2

H2N CO2H

NH2O

Geladen:

Polar:

Unpolar:

2

Klassische Aminosäuresynthesen werden vorausgesetzt: Strecker, Gabriel, Erlenmeyer, Schöllkopf. Literaturverzeichnis für neuere Reviews über asymmetrische Synthesen, z. B.: R. M. Williams, Synthesis of optically active α-Amino Acids, Pergamon, Oxford, 1989; R. O. Duthaler, Tetrahedron 1994, 50, 1539-1650; H. Heimgartner, Angew. Chem. 1991, 103, 271-297. Es gibt auch bei dem einfachen Grundgerüst der Aminosäuren mehrere prinzipielle Wege, um das N-C-C-System aufzubauen. Zu jedem Weg findet man Hunderte von Synthesen in der Literatur. Die besten neueren wollen wir kennenlernen. a) α-Aminosäuren: katalytische Hydrierung (Monsanto-Prozeß für L-DOPA gegen

Parkinson, Nobelpreis für Knowles), Ausblick Dehydrogenasen und andere enzymatische Verfahren.

b) evtl. Claisen-Umlagerung chelatisierter Enolate (Kazmeier); aus T. Wirth-Highlight:

Angew. Chem. 1997, 109, 235-237 über α-alkylierte α-Aminosäuren:

ee = 93%

OROR

Ac-NH CO2H

Rh-I

DIPAMP

OHOH

H2N CO2H

Dehydro-Aminosäure L-DOPA

P

P

Ph

Ph

OMe

OMe

DIPAMP

N CO

OR2

H

AcR1

N CO

OR2

PG

Ac

EX

N CO

OR2Ac

Nu

"N"δ+ CO

OR2R1

NC

NAc

R1

O R3NH

O

F3C

R1

O R2

1. LHMDS

2. MXn

R3R2

OTFA

OMN

R1 Claisenuml.

H3O+ OH2NR1

OH

R3 R2

3

c) Chirale Imidazolinone und Oxazolidinone aus Glycin (Seebach) d) evtl. Einbau in Peptide über 3-Amino-2H-Azirine (Heimgartner) ; aus T. Wirth-Highlight:

Angew. Chem. 1997, 109, 235-237 über α-alkylierte α-Aminosäuren e) Asymmetrische Strecker-Varianten (aus: T. Lindel, Nachrichten 2000, 48, 790-792; und:

L. Yet, Angew. Chem. Highlight 2001, 113, 900-901): Klassische Strecker-Variante der Synthese von α-Aminosäuren Jacobsen-Katalysatoren (Al und metallfrei) Benzhydrylamine (Snapper, Hoveyda)

1. Boc2O

2. Me3OBF4

1. H+

2. Campher-sulfonsäure

N

N O

H

H

N

N OMe

BocR

H2N

H2N O+CHO

N

N OMe

Boc

1. LDA

2. R--X N

N OMe

Boc RR'

CO2R"

1. BuLi in situ

2. R'-CH=CH-CO2R"

d.r.>97:3

4N TFA/H2O CO2Me

R1R2H2N

d.r.>97:3

R H

N+ HCN

1. 5 Mol% cat.,-70°C, 1d

2. TFAA R CN

N

O

F3CMeOH/HCl

Pd(PPh3)4R CO2Me

NH2

< 95% ee

R N

Ph

Ph

10 Mol% cat.,10 Mol% Ti(OiPr)4,

2 Äquiv. TMSCN,i-PrOH, RT, 1d

R N

Ph

Ph

CN

H

< 99% ee

N

tBu

NN

O

O

O

OMe

H

H

OtBuOHX

cat.

N N

O O

tBu tBu

tBu tBuAl

Clcat.

R-CHO + NH3 + HCNR

NH2

CN R

NH2

CO2H

H3O+

R

NH

H

4

Shibasaki-Binole mit Al (Lewissäure/base) Kobayashi-Binole mit Zr f) β-Aminosäuren: Amino Acids 1996, 11 (3-4), 397-405; N. Sewald: Darstellung von

chiralen β-Aminosäuren über as. kat. Michael-Addition mit dem Feringa-System; dazu neuere (Highlight von Magriotis, Angew. Chem. 2001, 113, 4507-4509):

Noyori: Sibi: g) Chem. Soc. Rev.: 1996, 25, 117-128: As. Synthese von β-Aminosäuren.

R H

N

1. 9 Mol% cat,2 Äquiv. TMSCN,20 Mol% PhOH

2. 2N HCl

R CN

NH

H

1. HCl (g)2. DDQ

3. 1N HCl4. Amberlyst A-21

HR CONH2

NH2

< 96% ee

O

OAlCl

P

PO

O

Ph

Ph Ph

Ph

cat.

Br

Br

OHOH

Br

OHOH

Br

+

0.1 Äquiv. 0.1 Äquiv.

+N

N

Me

0.3 Äquiv.

+ Zr(OtBu)4

0.1 Äquiv.

1. 2 Äquiv. HCN2. 1 Äquiv. R-CHO

3. 1 Äquiv.-40°C, 1 d

HO

H2N

HO

HN

CNR

4 Stufen

NH3+Cl-

CO2MeR

Br

Br

O

OZr

OtBuO

Br

O

Br

NMI

OtBu

ZrO

O

Br

Br

NMI

cat.

NHAc

MeO2C

H2 (1 atm), BINAP

Ru(OAc)2, 0.5 Mol%

NHAc

MeO2C

H

96% ee

NN O

RMgBr2, H2N-OBn

cat., 30 Mol%N

N O

R

NH-OBn

O

N N

O

cat.

< 95% ee

PPh2PPh2

5

h) in Arbeit: Review von D. Seebach über seine β-Peptide (Angew. Chem. 2003). Hier nur die Synthesen, die Strukturen später im dritten Teil bei den globalen Strukturen; Eur. J. Org. Chem. 1999, 335-360; 2000, 1-15 (beides Synthesen); Angew. Chem. 1999, 1223 (β-sheets).

i) Mit β-Aminosäuren macht man die wichtigen β-Lactamantibiotika. Die beste katalytische asymmetrische β-Lactamsynthese (Highlight von Magriotis, Angew. Chem. 2001, 113, 4507-4509):

3.2. Peptidsynthesen: a) Problematik der Verknüpfung von freien Aminosäuren: Schutzgruppen und

racemisierungsfreie quantitative Amidknüpfung. Die Fmoc, Boc und Z-Schutzgruppe sowie der t-Butylester und Benzylester (an und ab). Alle Seitenketten müssen ebenfalls geschützt werden, am besten so, daß sie alle in einem Schritt milde wieder entfernt werden können (heute vor allem Trifluoressigsäurespaltung bevorzugt).

Aufbringen von PG1 und PG2 mit Z-Cl, Boc2O, Fmoc-Cl, Isobuten, Benzylchlorid; Abspalten mit H2/Pd-C / TFA und Piperidin (Fmoc, E1cb). b) Lösungssynthese mit Kupplungsreagenzien. Aktivierung der Säure über: gemischte

Anhydride, Aktivester, DCC/EDC-HOBt-Methode, HATU/HBTU, PyBop, PyClop, T3P. Probleme bei der Peptidsynthese: Man braucht eine racemisierungsfreie, quantitative und schnelle Kupplung ohne Nebenprodukte. Oft tritt aber gerade durch Protonierung oder Deprotonierung der aktivierten Peptide eine teilweise Racemisierung ein. Folgende Nebenreaktionen muß ein gutes Kupplungsreagenz daher vermeiden:

PG1-NHX

R1

O

H2N O-PG2

R2

O+ PG1-NH

R1

O

O

R2O-PG2N

H

PG1 = Z, Boc, Fmoc PG2 = tBu, Bn

O N

O

HO N

O

HO N

O

H

H

Z-NH Boc-NH Fmoc-NH

O

Ph H

Cl+

Me2N NMe2 Me2N NMe2H

+

O

Ph H

Cl

Nu O

Ph H

Nu N

HEtO2C

Ts

HPh

ON

H CO2Et

Ts

Staudinger-Reaktion

+ Nu

- Protonen-schwamm

N

Bz-OH

OMe

10 Mol%Nu =

6

1. Azlacton-Bildung: 2. Unerwünschte Cyclisierungen: Dipeptid-Ester bilden spontan Diketopiperazine. Z-geschützte Peptide können Hydantoine bilden. Spezielles Problem von Boc-Aminosäuren. 3. Racemisierung: 4. Überaktivierung: Literatur: J. Pept. Protein. Res. 1987, 29, 574; Angew. Chem. 1963, 75, 282; THL 1992,33, 2815.

N O

O

R'

HR

NOH

O

R'

HR

XHNO

O

R'

HR

XB

BH+ N O

O

R'

R

......

O

HN

H2N OR''

R

R'

O

O

NH HNR''

RR'

OO

O

NHC

O

OR''O

O

R'

HN O

O

OR'

HNNH

O

O

R

R

NHN

O

O

CHR' CO R''

R

HN O

O

OR'

R'NH CH

RC

O

OR''R'NH C

H

R OH

OR''R'NH C

R

OR''

H+ OH

R'''HNC

O

OX

R'

R'''HNC

O

OH

R'

R'''HN

OO

R'

OR'''HN

R'DCC

OxazolonN-Acylharnstoff

symmetrisches Anhydrid

7

Übersicht über die gebräuchlichsten Kupplungsreagenzien: gemischte Anhydride: Aktivester: DCC/HOBt: Zweiter Schritt:

N C N

N EDC

N C N

DCC

X NN

N

O

NMe2

NMe2

X = C : O-HBTUX = N : O-HATU

NN

N

O PN

N

N

PF6-

PyBOP

NAlkyl

X

Mukayiama, BEP, ....

N P Cl

PF6-

3

PyClop

O NP

O O

Cl

BOP-Cl

2

OPO

POPO

O

OProp

Prop

Prop

T3P

NN

N

O PMe2N

NMe2

NMe2

PF6-

BOP

X NN

N

OH

NMe2

Me2NPF6

-

X = C : N-HBTUX = N : N-HATU

Boc-NH

R1

O

O

R2O-tBu

NH

+

H2N O-tBuR2

O

Boc-NHOH

R1

O

Cl O

O

R3NBoc-NH

OR1

O O

O

Boc-NHO

R1

ONO2

Boc-NHO

R1

OF

FF

FF

RO

OR

O

O

NC

NH

NN

N

O

NN

NR'-NHR'' R

OR''N R

8

Hydroxybenztriazol vermeidet eine Überaktivierung der Carbonsäure auf der Iminoester-Zwischenstufe, die zu unerwünschten Nebenreaktionen führt wie Zyklisierungen, Harnstoffbildung, Oxazolonbildung und - Racemisierung! Literatur zu unerwünschten Nebenreaktionen: Pept. Protein. Res. 1987, 29, 574; Angew. Chem. 1963, 75, 282; THL 1992,33, 2815. Literatur zu DCC: JOC 1989, 54, 1922; JACS 1966, 88, 1013; JACS 1966, 88, 1020. Literatur zu wasserlöslichen Varianten (EDC): JOC 1961, 61, 2525. T3P: Ganz neu ist dieses preiswerte Kupplungsreagenz (Clariant), das ebenfalls racemisierungsfrei arbeitet und wasserlösliche Phosphonat-Nebenprodukte liefert, die sehr bequem durch Ausschütteln abtrennbar sind:

Literatur: Chem Commun. 1999, 1842. HATU / HBTU: Dies ist der Merzedes Benz unter den Kupplungsreagenzien!

N-HBTU und O-HBTU N-HATU und O-HATU (NGE) Lange Zeit wurde O-HBTU als vorliegende Struktur postuliert; die Kristallstruktur lieferte jedoch N-HBTU; leider ist die reaktivere Spezies jedoch O-HBTU; dafür gibt es seit neuestem auch eine effiziente Synthese. TBTU = HBTU mit Tetrafluoroborat als Gegenion. Der Vorteil von HATU ist ein Nachbargruppeneffekt (NGE) des Pyridin-Stickstoffs mit der freien Aminogruppe, der deren Nucleophilie erhöht: JOC 1998, 63, 9678; Angew. 2002, 114, 457. Der Mechanismus der Kupplung verläuft wie folgt:

NN

N

ONMe2

NMe2

NN

N

OH

NMe2

Me2N PF6-

N NN

N

ONMe2

NMe2

N NN

N

OH

NMe2

Me2N PF6-

N NN

N

OO

RH NR2

OPO

POPO

O

OProp

Prop

Prop OPO

POPO

O

OProp

Prop

Prop O

P OP

OPO

O

OProp

PropProp

O R

O-

R-CO2H

NMP

R-NH2Produkt

T3P

9

Bop und PyBop: Allgemein sind phosphorhaltige gute Abgangsgruppen sehr beliebt. Hier ist der Mechanismus ganz ähnlich, aber es entsteht das besser lösliche Phosphorsäuretriamid (Vorteil: Trispyrrolidinophosphinoxid ist nicht giftig wie HMPT).

Bop PyBop PyClop: geht auch gut bei sterisch anspruchsvollen Carbonsäuren.

PF6-

PF6-

NN

N

OMe2N

NMe2

O

OR

NN

N

Me2NNMe2

O

OR

O-

NN

N

OO

R

NN

N

O

NMe2

Me2N

NN

N

ONMe2

NMe2

RCOO-

RO

ONMe2

NMe2

ONMe2

NMe2

AminProdukt

HOBt-

+

NN

N

O PN

NN

PF6-

NN

N

O PMe2N

NMe2

NMe2

PF6-

N P Cl

PF6-

3

PyClop

N P X N P O

OR

N P O

PF6-

3 3

RO

HO

RNH2

RO

NH

R R

O

O

Base

3

X = Cl X = OBt (PyBOP)

2+ Oxazolinon

PF6-

+

RNH2

10

c) Festphasensynthese (Merrifield, Nobelpreis): Harze (Wang), Ankuppeln der ersten Aminosäure, Repetitive Kupplung der Bausteine und Entschützung am Harz, Kaisertest et al. auf vollständige Kupplung, Abspaltung vom Harz. HPLC-Analytik und -Aufreinigung (evtl. Beispiel). Erreichbare Größe heute: 30 Aminosäuren-max. 50 Aminosäuren.

Zum Test auf vollständige Kupplung verwendete man früher Ninhydrin, dessen Färbung durch Zusätze nach blau verstärkt wurde (Kaisertest). Viel empfindlicher (Nachweis von <1% freier Aminogruppen) ist aber der rote Azofarbstoff NF31, der kovalent an die freien Aminogruppen des unvollständig gekuppelten Pepids auf einem selektierten Harzkügelchen gebunden wird. Die rote Farbe zeigt unvollständige Kupplung an. Nach Abspaltung des Peptids vom Harz unter gleichzeitiger Entfernung sämtlicher Seitenketten-Schutzgruppen (meistens mit TFA) erfolgt die Reinigung über präparative HPLC und anschließend die Reinheitskontrolle über analytische HPLC. Beispielchromatogramme eines rohen und eines gereinigten Oligopeptids: roh:

Fmoc-HNOH

R2

O

Fmoc-NHO

R1

O

OHO

2

+1. DMAP

2. Piperidin H2N

R1

O

O

DIC/HOBt

Wang-Harz

N

R1

O

O

H

OFmoc-NH

R2

TFAfreies Peptid

O2N NN N O

OO NO2 H2N

R1

O

O+

NF31

11

gereinigt: d) Sequenzanalyse: Edman-Abbau (vollautomatisch, Identifikation über HPLC mit UV-

Detektion). Lenkung der Cyclisierung wahrscheinlich über HSAB (Thiazolinon: weiches protoniertes Amid - Angriff vom Schwefel; Thiohydantoin: hartes Carboxylkation: Angriff vm harten Stickstoff). e) Größere Peptide: Peptidligation: klassische Verfahren über Thioester und Cysteine.

Neuere Varianten (Kießling etc.) über die Staudinger-Reaktion an beliebiger Stelle. Native Ligation an Cysteinen (gut bis ~100 Aminosäuren):

Val-Tyr-His-Ala + Ph-N=C=S N NN

NN

SPh

H H O

H

Ph-OH

O

H

NHN

O

H O

H3O+ N

SN OPh

H+ H2N

NN

Ph-OH

O

H

NHN

O

H O

H+

N

SN OPh

H 1. OH-

2. H3O+

H+

N NOH

SPh

H H O

NN

Ph

S

O

H

H2N-PeptidN

X

H

R1

O

+ NaSPh H2N-PeptidN

S-Ph

H

R1

O

+ H2N

Peptid-OH

O

HS

Umesterung

- PhS-H2N-Peptid

NH

R1

O

S

O

Peptid-OHH2N

H2N-PeptidNH

R1

OHN Peptid-OH

O

HSintra-molekular!

12

P. E. Dawson et al., Science 1994, 266, 776. Neuere Varianten (gut bis ~300 Aminosäuren): Repetitive Kupplung von Peptidfragmenten mit N-terminalem geschützten Cystein und C-terminalem Thioester am Harz. Entschützung des neuen N-terminalen Cysteins bereitet die nächste Runde vor: Staudinger-Ligation (Kießling et al., beliebige Stelle): f) Biochemische Peptidligation: Proteinsplicing und Konformations-assistierte Ligation. 3.3. Globale Strukturen: a) Einführung über Peptidfaltung: Nach der Biosynthese in den Ribosomen falten sich die

entstandenen Proteinstränge zur nativen, bioaktiven Koformation von alleine? Hier handelt es sich um einen immer noch unzureichend verstandenen Ordnungsprozeß mit faszinierender Perfektion und Schnelligkeit: binnen weniger Sekunden werden Trillionen potentieller Konformationen in die thermodynamisch stabilste umgewandelt, bei der sich das gesamte Protein ansammelt; nur diese ist biologisch aktiv. Bei Fehlfaltungen assistieren "Helferlein": Chaperone sind große molekulare Proteinkästen mit definierten Bereichen für die ungestörte Faltung von gestreckten Polypeptidketten, die aus dem Ribosom kommen. Mehr dazu unten.

Übersicht Peptidfaltung: M. Karplus, C. M. Dobson, A. Sali, Angewandte Chemie 1998, 110, 908-935. Karplus führt Energiehyperflächen mit komplexen Fortschrittsvariablen ein, die

SepharoseCys-PeptidPG-Cys-Peptid-COSR +pH 7

H2O

PG-Cys-Peptid-CO-NH-Cys-PeptidSepharose

SepharoseH3N+-Peptid-CO-NH-Cys-Peptid-CO-NH-Peptid

H3N+-Peptid-COSR- PG

HS PPh2Peptid X

O

+ Peptid

O

PPh2SN3-Peptid

N-Peptid

Peptid

O PPh2

S

Iminophosphoran

Peptid

O

NPeptid

PPh2

S

H2O

Peptid

O

NPeptid

H

via: N N N Peptid

PPh2R

-N2

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ähnlich wie die bei den Reaktionen kleiner Moleküle (H + H2) nur wenige günstige Trakejtorien erkennen lassen, auf denen die Faltungsreaktion wahrscheinlich wie ein Golfball ins thermodynamische Loch rollt, ohne viel Zeit zum Abtasten aller möglichen Wege zu verbrauchen. Abb. 8-5 (Voet-Voet: S. 193: Hypothetische Faltung eines dimeren Proteins: Zuerst entsehen lokale Sekundärstrukturen, die sich nach und nach übereinander lagern und schließlich die enge kompakte Faltung ergeben, die im letzten Schritt zum Dimer aggregiert. Heute diskutiert man hydrophobe Cluster von unpolaren Aminosäureresten als nucleation sites solcher Sekundärstrukturen. Die wichtigsten attraktiven Wechselwirkungen scheinen also solvophobe und dispersive WWen zu sein.

14

Chaperone:

Die Chaperone binden ATP, welches über ihre ATP-Synthase-Aktivität hydrolysiert wird und so die Konformation der Chaperone verändert. Dadurch wird die Affinität für das nichtnative Protein ganz stark verändert. Nach Zusammensetzung der molekularen Kapsel (Gro-El und Gr-ES) erfolgt die Faltung des Proteins. Nach ATP-Hydrolyse geht der Gro-El und Gro-ES-Komplex auseinander, und das gefaltete Protein wird wieder heraus gelassen.

Übersicht Chaperone: S. Walter, J. Buchner, Angewandte Chemie 2002, 114, 1142-1158. b) Nur zwei Bindungen in α-Aminosäuren sind drehbar; damit verbinden sich die

charakteristischen Diederwinkel θ und φ. Diese kann man per NMR-Experiment über die Karplus-Gleichung ermitteln (Bystrov-Modifikation für den zusätzlichen Stickstoff: Faktor 1.09 für die höhere Elektronegativität). In letzter Zeit ist es auch gelungen, Peptide mit externen Liganden konformationell zu fixieren. Der Nachweis erfolgte z.B. über die Karplus-Analyse der 3JH,H-Kopplungskonstanten (s. unten: Aminopyrazole als β-Faltblatt-Liganden). Die konformationelle Freiheit unterschiedlicher Aminosäuren im Peptidverband wird durch zweidimenionale sogenannte Ramachandran-Plots dargestellt und zeigt auch direkt die unterschiedliche Tendenz von Aminosäuren, bestimmte Konformationen zu bevölkern.

Lit: (a) Delepierre, M.; Dobson, C. M.; Poulsen, F. M. Biochemistry 1982, 21, 4756. (b) Bystrov, V. F. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1976, 10, 41. Abbildung Diederwinkel + Karplus-Gleichung: 3J = [Acos2θ - Bcosθ + Csin2θ ] / 1.09

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Abbildung: Aminopyrazol + Ac-Gly-Val-OMe. Kopplungskonstanten um die 10 Hz zeigen perfekte β-sheet-Konformation an (Diederwinkel θ um die 180°). Ramachandran-Plot: Voet-Voet, 144, 7-7 und 7-8. Ein Ramachandran-Plot stellt die erlaubten Bereiche für Diederwinkel verschiedener Aminosäuren in Proteinen dar. Man sieht, daß ein großer Teil des Konformationsraumes gar nicht zugänglich ist. c) α-Helix und β-Sheet sind extrem wichtige Peptid-Sekundärstrukturen von fundamentaler

Bedeutung. Sie sollte genau verstanden werden (parallel, antiparallel, biologische Funktion, Voet-Voet, auch β-Schleifen, 7-22). Pathologische Faltungsprobleme führen zu schwersten Krankheiten, die unter dem Namen protein-folding deseases in die Literatur eingegangen sind (BSE, Creutzfeld-Jakob, Alzheimer).

HN C

H

C'O

θ

θ

θ

3J (NH-α-CH) Ac-L-Val-L-Val-OMe complexationNH(1) NH(2) [%]

free 8.2 8.5 0Pyrazol 8.2 9.0 50APCE 8.6 9.6 65MAMP 9.8 10.0 85PivAStyP 9.0 9.7 86AcAStyP 9.6 9.8 93TriFlAStyP 10.0 9.8 94

16

Abb. α-Helix, β-Sheet (auch antiparallel). Betonung des H-Brückenmusters (vgl. Voet-Voet).

Abb. β-Schleife: Hier befinden sich Aminosäuren wie Prolin, die gerne einen Knick in der Hauptkette induzieren.

Abb.: Prionenstäbchen (links) + Alzheimer Amyloid-Plaque (rechts). Abb.: Verkappen der β-sheets im Prionprotein: neue Therapie von BSE? d) Kristallstrukturen von Proteinen werden durch die unterschiedliche Darstellung von α-

Helices und β-Sheets im Rückgrat übersichtlich; man erkennt im Vergleich sofort den dramatisch unterschiedlichem Gehalt an Sekundärstrukturen in Proteinen unterschiedlicher Funktion (von reinen β-Sheet zu reinen α-Helix-Proteinen). Die Berechnung von Proteinstrukturen ist auch heute noch nur mit Homologie-Modeling und ähnlichen Vereinfachungen möglich (SYBYL von Tripos und Insight von Accelrys, früher MSI). Die Bestimmung von dreidimensionalen Strukturen erfolgt heute entweder über X-ray (klassisch) oder in den letzten Jahren immer stärker auch durch NMR-Experimente (Nobelpreis 2002 für K. Wüthrich, TROSY-Experiment, evtl. Abbildung). Man geht dabei wie folgt vor: 15N-Markierung aller Aminosäuren und Peptidsynthese klassisch oder molekularbiologisch durch Überexpression in Mikroorganismen; nach zweidimensionalen COSY-Experimenten zur Zuordnung aller Aminosäureesignale Aufnahme von dreidimensionalen NOESY-Spektren; Zuordnung aller NOESY-Kreuzpeaks und quantitative dreidimensionale Reproduktion der Proteinstruktur über Computer-Algorithmen; in vielen Fällen hervorragende Übereinstimmung mit Kristallstrukturen; manchmal aber starke Abweichungen. Gute Ergänzung: X-ray zeigt meist hohe Auflösung

• ...Fast Screening Method:

PrP alone

PrP withAmpOx

S P

NNH

NH H

N HNN

O O

HN

O

OHR

N

O

HR

HH

RHN

RH O

O

NH

OMe

N NH

NHH

NH N N

OO

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aller gut strukturierten Bereiche; NMR zeigt wahre Struktur in wäßriger Lösung und kann auch Dynamik abbilden (wichtig für die molekulare Erkennung und Katalyse).

Kristallstruktur von: α-Helix-reich: Calmodulin: Voet 18-21, S. 496. Cytochrom c: Voet 20-18, S. 543. Myoglobin: 7-41, S. 167. Das Cytochrom b in der Atmungskette vermittelt Elektronentransferreaktionen durch die zwischen den Helices eingelagerten Hämgruppen, welche jeweils an Histidinen aufgehängt sind. Dazu Schemabild des Adrenalinrezeptors, der eine Bindungsmulde von 7 membrandurchspannenden Helices bildet, die das Adrenalinmolekül binden und das Signal über die Membran weiterleiten: Nach Andocken des Adrenalinmoleküls wird das Signal über eine Konformationsänderung im Inneren des Rezeptors über die Membran ins Zellinnere geleitet und dort weiter verstärkt.

P

P P P

P

P

P

Adrenalin

Signal

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Myoglobin (links) ist ein globuläres (kompaktes) Protein, welches durch die α-Helices äußerst steif gebaut ist. Zwei Histidine tragen auch hier wieder die Hämgruppe, die für den Transport von Sauerstoff verantwortlich ist. Calmodulin (rechts) bindet Ca2+-Ionen und reguliert damit deren Spiegel. Die α-Helix in der Mitte trennt als Abstandhalter zwei globuläre Domänenn, die über ihre Carbonylsauerstoffe im Rückgrat jeweils zwei Ca2+-Ionen binden können. β-Sheet-reich: Concanavalin A: Voet 7-43, S. 169; Carboanhydrase: Voet 7-44, S. 169. (In der Nähe befinden sich auch auch viele schöne Abbildungen von β-Schleifen etc.! Dazu werden Elektronendichteverteilungen und Röntgenbeugungsmuster gezeigt - Empfehlung). Concanavalin A (links) besteht praktisch nur aus zwei β-Faltblättern, bildet also zwei steife Wände. Es gehört zur wichtigen Familie der Lectine, die spezifisch Zucker binden, hier besonders α-D-Glucose. Carboanhydrase (rechts) hat die Funktion, CO2 in Hydrogencarbonat HCO3

- zu überführen. Dazu benutzt es ein über drei Histidine gebundes Zink2+-Kation,

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welches ein gebundenes Wasser deprotoniert und als nucleophiles OH--Teilchen an CO2 angreifen läßt Für diese katalytische Funktion sind die drei Histidine in β-Faltblätter eingelagert und bilden dadurch die optimale steife Anordnung zur gleichzeitigen Bindung des Zn2+-Kations. Dazu Kofaktoren in Enzymen gebunden: Beispiel der Alkoholdehydrogenase mit NAD+ in der Rossman-Spalte: TROSY-Experiment und NMR-Strukturen. Aus der Homepage von Kurt Wüthrich:

Rinder-Prionprotein Menschliches Prionprotein Erkennen Sie die beunruhigende Ähnlichkeit!?

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Wie funktioniert eine dreidimensionale Strukturbestimmung mit NMR? Nach 13C- und 15N- Markierung erfolgt zunächst die vollständige Zuordnung aller 1H-, 13C- und 15N-Kerne über COSY-Experimente (blau). Anschließend werden alle NOE-Kontakte zwischen Protonen vermessen und quantitativ ausgewertet (rot). Die Summe aller NOE's liefert schließlich die dreidimensionale Anordnung.

N

O

C

H3C

O

N HC

HCH2

OH

H

H

15

15

13

13 NOE

COSY