Ruhr-Universit¤t Bochum Prof. Dr. med. Andreas Pfeiffer .Enzym, das zur Bildung der...

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  • Ruhr-Universität Bochum

    Prof. Dr. med. Andreas Pfeiffer

    Dienstort: Universitätsklinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin

    in Berlin-Steglitz

    Deutsches Institut für Ernährungsforschung Bergholz-Rehbrücke

    Herstellung und Etablierung von 4-Hydroxytamoxifen aktivierbaren PKCα-,

    PKCβ1- und PKCδ-Fusionsproteinen

    Inaugural-Dissertation

    zur

    Erlangung eines Doktorgrades der Medizin

    einer

    Hohen Medizinischen Fakultät

    der Ruhr-Universität Bochum

    Vorgelegt von

    Suma Mary Plammootil

    aus Frankfurt am Main

    2003

  • Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

    Referent: Prof. Dr. med. A. Pfeiffer

    Korreferent: Prof. Dr. med. W. Schmidt

    Tag der Mündlichen Prüfung: 29.04.2004

  • Für meine beiden Großväter

    K. T. George und P.C. Varkey

  • 1

    Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung

    1.1. Signalkaskaden 6

    1.2. Die Charakterisierung der Proteinkinase C 7

    1.3. Die Struktur der Proteinkinase C 7

    1.4. Die MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinase)- Signalkaskade 8

    1.5. Die klinische Bedeutung der Proteinkinase C 9

    1.6. Der Östrogenrezeptor 10

    1.7. Der mutierte Östrogenrezeptor 11

    1.8. Ziel der Arbeit 12

    2. Materialien 13

    3. Experimentelle Methoden

    3.1. Bakterienpräparation 15

    3.1.1. Herstellung kompetenter Bakterien 15

    3.1.2. Transformation kompetenter Bakterien 16

    3.2. Plasmid-Präparation 16

    3.2.1. Plasmid-Präparation im analytischen Maßstab 16

    3.2.2. Plasmid-Präparation im großen Maßstab 17

    3.3. Reaktionen zur Subklonierung von DNA-Fragmenten 18

    3.3.1. Restriktion von DNA-Molekülen 18

    3.3.2. Dephosphorylierung von DNA am 5`Ende 18

    3.3.3. Partieller Verdau für die Restriktion der PKCα 19

    3.3.4. Ligation 19

    3.4. DNA-Sequenzierung im Prism Big-Dye Terminator 20

    3.5. Elektrophorese von DNA-Molekülen in Agarosegelen 21

    3.6. HEK293 Zellkultur 21

    3.7. Quantifizierung von HEK293-Zellen mit der Neubauer-

    Zählkammer und Subkultivierung für die Experimente 22

    3.8. Durchführung einer PCR und Reinigung der Reaktionsprodukte 22

  • 2

    3.8.1. Polymerase-Kettenreaktion 22

    3.8.2. Reinigung der PCR-Reaktionsprodukte 24

    3.9. Proteinanalyse 24

    3.9.1. Proteinextraktion aus Zellen der Zellkultur 24

    3.9.2. Proteinbestimmung nach Stoschek 25

    3.9.3. SDS Protein-Gelelektrophorese 25

    3.9.4. Semitrockener Proteintransfer 27

    3.9.5. Immunoblot-Analyse 27

    5.1.1. Quantifizierung der Signalintensitäten von Immunoblot-

    Analysen 28

    3.10. Transfektion und PKC-Aktivitätsbestimmung 29

    3.11. Untersuchung der intrazellulären Signaltransduktion mittels

    des dualen Luciferase-Assays 31

    3.12. Statistische Auswertung 32

    4. Ergebnisse

    4.1. Herstellung der PKC-Fusionsproteine 33

    4.1.1. Amplifikation der PKC-cDNA-Fragmente 34

    4.1.2. Subklonierung des MER 36

    4.1.3. Durchführung eines partiellen Verdaus für die PKCα 38

    4.1.4. Subklonierung für das pcDNA/PKC-Konstrukt 39

    4.1.5. Fusion der pcDNA/PKC-Konstrukte mit der MER-cDNA und 39

    abschließende Restriktionsüberprüfung

    5.1. Immunoblot-Analysen zum Nachweis der Expression der

    PKC-Fusionsproteine 41

    4.3. Nachweis der Aktivität der PKC-Fusionsproteine in vitro 43

    5.1. Reportergen-Untersuchungen mit dem dualen Luciferase-Assay

    zum Nachweis der Funktionalität der PKC-Fusionsproteine 46

    4.4.1. Untersuchung von Elk1-abhängiger Luciferase-Genexpression

    durch die PKC-Fusionsproteine 46

    4.4.2. Einsatz der MEK-Inhibitoren PD98059 und U0126 50

    5. Diskussion

  • 3

    5.1. Ziel der Arbeit 53

    5.2. Herstellung der PKC-Fusionsproteine 53

    5.3. Nachweis der Expression der Fusionsproteine 54

    5.4. Bedeutung von PKC-Bindeproteinen

    55

    5.5. Nachweis der Enzymaktivität der Fusionsproteine 55

    5.6. Regulation der PKC durch Phosphorylierung 56

    5.7. Regulation der PKC durch Proteasen 57

    5.8. Untersuchung der Funktionalität der Fusionsproteine 58

    5.9. PKC und der MAPK-Signaltransduktionsweg 59

    5.10. Bedeutung von unterschiedlich hohen Aktivitäten von

    PKC-Isoenzymen 61

    5.11. Weitergehende Untersuchungsmöglichkeiten unter

    Verwendung der etablierten Fusionsproteine 62

    5.12. Klinische Bedeutung der PKC 63

    5.13. Fazit 64

    6. Zusammenfassung 65

    7. Literaturverzeichnis 67

    8. Danksagungen 80

    9. Lebenslauf 81

  • 4

    Abkürzungsverzeichnis

    Abb. Abbildung

    abs. absolut

    Ac Acetat

    AKAP Proteinkinase A Ankerproteine

    APS Ammoniumpersulfat

    ATP Adenosintriphosphat

    bp Basenpaare

    BSA Rinderserumalbumin

    cDNA komplemetäre DNA

    CIAP alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

    CMV Cytomegalievirus

    cpm gezählte radioaktive Zerfälle pro Minute

    CTP Cytidintriphosphat

    DMEM Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium

    DMSO Dimethylsulfoxid

    DNA Desoxyribonukleinsäure

    dNTP Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

    DTT Dithiothreitol

    EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Natriumsalz

    EGTA Ethylen-Glykol-bis-(β-Amino-Ethyl-Ether)-N-N’-Tetraessigsäure

    ER Östrogenrezeptor

    ERK extrazellulär signal-regulierte Proteinkinase

    EtOH Ethanol

    FKS fötales Kälberserum

    g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)

    GTP Guanosintriphosphat

    h / min / sec Stunde / Minute / Sekunde

    kb Kilobasenpaare

    KDa Kilodalton

    LPS Lipopolysacharide

    MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

    MAPKK MAPK Kinase

  • 5

    MAPKKK MAPK Kinase Kinase

    MEK MAPK/ERK Kinase

    MEKK MEK Kinase

    MER mutierter Östrogenrezeptor

    NaAc Natriumacetat

    nm / ng nanomolar / nanogramm

    NTP Ribonukleotide (ATP, CTP, GTP, UTP)

    4-OHT 4-Hydroxytamoxifen

    PAA Polyacrylamid

    PKC Proteinkinase C

    PKM Ca2+/Phospholipid-unabhängige Form der PKC, die dem

    katalytischen Fragment entspricht

    RACK Rezeptor für akivierte Kinase

    RICK Rezeptor für inaktivierte Kinase

    RNA Ribonukleinsäure

    RT Raumtemperatur

    SDS Natriumdodecylsulfat

    STICK PKC Substrate, die mit der PKC interagieren

    TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

    TAM 4-Hydroxy-Tamoxifen

    TCA Trichloressigsäure

    TE Tris-EDTA

    TEMED N,N,N’,N’Tetramethylethylendiamin

    TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat

    Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

    U Enzymeinheit

    ü.N. über Nacht

    UTP Uridintriphosphat

    vs. versus

    % (v/v) Volumenprozent

    % (w/v) Gewichtsprozent

    Zahl´ Anzahl in Minuten

    Zahl´´ Anzahl in Sekunden

  • 6

    1. Einleitung

    1.1. Signalkaskaden

    Endokrine Erkrankungen hängen oft von veränderten Hormonspiegeln, oxidativen

    und metabolischen Vorgängen sowie Veränderungen in der Lipidzusammensetzung

    ab, die sich meist in Differenzierungs- und Wachstumsvorgängen sowie in der

    Aktivität von Ionenkanälen zeigen (Huang, 1989). Extrazelluläre Signale werden

    nach Aktivierung eines Rezeptors über unterschiedliche Signalkaskaden, meist über

    sogenannte „second messenger“, zum Zytoplasma oder Zellkern weitergeleitet (Hug

    und Sarre, 1993). Hydrophobe Liganden können dabei durch die Zellmembran

    diffundieren und nach Bindung an einen intrazellulären Rezeptor direkt die

    Transkription aktivieren. Hydrophile Liganden aktivieren meist zelluläre

    Oberflächenrezeptoren, die dann ihrerseits entweder direkt oder über sogenannte

    „Transducer“ (z.B. G-Proteine) einen Effektor stimulieren. Dieser kann dann über

    Verteilungsveränderungen von „second messengern“ Zielproteine aktivieren, die als

    solches oder über weitere Zielproteine die Genexpression auf der Ebene der

    Transkription oder Translation verändern können (Hug und Sarre, 1993). Ein

    wichtiger Signaltransduktionsweg läuft über den 7fach Transmembranrezeptortyp, an

    den nach Bindung eines Liganden ein trimeres G-Protein des Subtyps q koppelt und

    so die Phospholipase C-β aktiviert. Diese ist ein Phosphoinositid-spezifisches

    Enzym, das zur Bildung der „second messenger“ sn-1,2-Diacylglycerin (DAG) und

    1,4,5-myo-Inositoltriphosphat (IP3) aus zellulärem Phosphatidylinositol-4,5-

    bisphosphat führt. Des weiteren kann DAG auch aus zellulärem Phosphatidylcholin

    ohne IP3-Entstehung nac