Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmitteltechnologie Studiengang Bioprodukttechnologie

Sandwich-ELISA zur Identifizierung von

Fischallergen

Bachelorarbeit

Vorgelegt von: Juliane Schleinstein

Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Christine Wittmann

M.Eng. Manuela Henke

Neubrandenburg, den 05.03.2012

URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis2012-0024-1

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Abstract

The main target of the work “Sandwich-ELISA for the identification of fish allergen”

comprehends the discovery of a combination of monoclonal antibodies in a Sandwich-

ELISA-technique to detect the fish allergen Parvalbumin in different fish species.

Reference material comes from the fish species codfish, herring, Alaska coalfish, redfish,

tuna and tilapia. The Sandwich-ELISA was operated with primary and secondary

monoclonal antibodies. The secondary antibodies were labeled with horse radish

peroxidase to uncover the antigen-antibody-reaction. The activity of this antigen-antibody

complex was tested with different HRP-labeled secondary antibodies and different

concentrations of fish species.

An efficient antibody combination could be found, which detected five of six assayed fish

antigens. Thereby this antibody combination is multireactive, because it could

substantiate the similar Parvalbumine of different fish species. It had the qualitative

detection at an antigen concentration of 100 ng/ml. Therefore, more assays have to be

performed.

3

Abstract .......................................................................................................................................... 2�

Verzeichnis verwendeter Abkürzungen ....................................................................................... 4�

1 Einleitung .................................................................................................................................... 5�

1.1 Fisch als Allergen- Parvalbumin ...................................................................................... 6�

1.2 Allergenkennzeichnung auf verpackten Lebensmitteln ................................................... 7�

1.3 Nachweisverfahren von Allergenen ................................................................................. 8�

1.3.1 Nachweismethode ELISA ................................................................................... 8�

2 Material und Methoden ........................................................................................................... 11�

2.1 Material .......................................................................................................................... 11�

2.1.1 Allgemeine Chemikalien ................................................................................... 11�

2.1.2 Puffer und Lösungen .......................................................................................... 12�

2.1.3 Monoklonale Antikörper von Biometec GmbH ................................................ 13�

2.1.4 Antigen- Fischextrakte ....................................................................................... 13�

2.1.5 Messgeräte ......................................................................................................... 14�

2.2 Methoden ....................................................................................................................... 14�

2.2.1 HRP-Labeling .................................................................................................... 14�

2.2.2 Sandwich-ELISA ............................................................................................... 16�

3 Ergebnisse ................................................................................................................................. 18�

3.1 HRP-Labeling ................................................................................................................ 18�

3.2 Sandwich-ELISA ........................................................................................................... 20�

3.2.1 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G11als Referenz ............................. 20�

3.2.2 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G7 ................................................... 21�

3.2.3 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak E9 ................................................... 22�

3.2.4 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak D12 ................................................. 23�

3.2.5 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak C9 ................................................... 24�

4 Diskussion .................................................................................................................................. 25�

5 Ausblick ..................................................................................................................................... 28�

6 Zusammenfassung .................................................................................................................... 29�

7 Verzeichnisse ............................................................................................................................. 30�

7.1 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 30�

7.2 Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ 30�

7.3 Literaturverzeichnis........................................................................................................ 30�

8 Anhang ....................................................................................................................................... 32�

Anhang 1 .............................................................................................................................. 32�

Anhang 2 .............................................................................................................................. 33�

Anhang 3 .............................................................................................................................. 34�

Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit ..................................................... 36�

4

Verzeichnis verwendeter Abkürzungen

Abkürzung bzw. Symbol Bezeichnung

ELISA Enzym linked immuno sorbent assay (Enzymgekoppelter Immunadsorbtionstest)

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

HRP Horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase)

TMB Tetramethylbenzidin

BSA Bolvine serum albumin (Rinderserumalbumin)

PBS Phosphat buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)

DNA Desoxyribonuclein acid (Desoxyribonukleinsäure)

RT Raumtemperatur

Ak Antikörper

K Kabeljau

H Hering

R Rotbarsch

A.S. Alaska Seelachs

Th Thunfisch

T Tilapia

D5 Wi 11 3G 9D5

G7 Wi 11 3D12G7

E9 Wi 11 3G4F9

D12 Wi 115H1D12

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1 Einleitung

Fisch ist ein wertvolles Lebensmittel. Laut eines 2001 veröffentlichten Rückblicks zum

Thema „Berufsbezogene Fisch- und Meeresfrüchteallergien“ aus der Zeitung Occuptional

and Environmental Medicine werden ca. 72 Prozent des weltweiten Fischfangs zu

Lebensmitteln verarbeitet. Die Nachfrage nach Fisch aller Art ist groß und führt häufig in

der Fischerindustrie zu Überfischung wertvoller Fische und damit zu Lieferengpässen.

Fischarten wie Seezunge oder Rotzunge sind davon betroffen und werden oft in

komplexen Produkten mit minderwertigen Fischen anderer Art mit ähnlichen

sensorischen Qualitäten ersetzt. Steigende Komplexität der Lebensmittelprodukte und

stetig wachsende Produktpaletten erfordern hohe Produktsicherheit und ständige

Überwachung. Besonders für Allergiker ist eine genaue Deklaration aller

Lebensmittelzutaten von großer Bedeutung. Nicht selten sind versteckte

Fischkomponenten, besonders oft in importieren Waren, enthalten, die nicht deklariert

werden. Es besteht dann beim Verzehr dieser Produkte für Fisch-Allergiker ein großes

Gesundheitsrisiko. Selbst Spuren von Fisch in Lebensmitteln können bei Allergikern zu

allergischen Reaktionen wie Hautrötungen, Asthma oder Nesselsucht führen, bis hin zu

gastrointestinalen Symptomen wie Diarrhö, Übelkeit, Erbrechen oder einem anaphylak-

tischen Schock.

Hauptverursacher dieser allergischen Reaktionen von Fisch ist größtenteils ein Protein –

das Parvalbumin. Es ist ein niedermolekulares Muskelprotein vieler Fische, dessen

allergieauslösende Konzentration laut der Veröffentlichung „Berufsbezogene Fisch- und

Meeresfrüchteallergien“ im Bereich von 0,001 bis 5,061 μg/m3 Luft liegt. Analytisch

lassen sich diese Proteine mit dem immunologischen ELISA-Verfahren (Enzym Linked

Immuno Sorbent Assay-Verfahren) nachweisen. Mit diesem Verfahren lassen sich selbst

Spuren von Allergenen qualitativ wie auch quantitativ bestimmen. In dieser Arbeit soll

ein solches Verfahren für den Nachweis von Parvalbumin in verschiedenen Fischarten

optimiert werden. (Lehrer;Lopata,A,2009); (Jeebhay; Robins; Lehrer.; Lopata, 2001);

(Heinrich, 2009); (Swoboda, 2011)

6

1.1 Fisch als Allergen-Parvalbumin

Fisch ist ein großer Eiweißlieferant und Träger vieler essentieller Aminosäuren und gilt

daher als wichtiger Bestandteil in der menschlichen Ernährung. Zudem enthält Fisch

wichtige Mineralstoffe wie Jod, Selen und Vitamine. Aufgrund des hohen Eiweißgehaltes

zählt Fisch neben Getreide und Hülsenfrüchte jedoch zu den häufigsten Auslösern von

Lebensmittelallergien. Unter Lebensmittelallergien versteht man unkontrollierte

Überreaktionen des Körpers auf bestimmte Zutaten von Lebensmitteln. Vom

körpereigenen Immunsystem werden diese normalerweise unschädlichen Substanzen als

Eindringlinge betrachtet und wirken dadurch als Auslöser von Abwehrreaktionen. (Max

Rubner Institut, 2011)

Allergien gegen Fisch kommen vor allem in Ländern mit hohem Fischkonsum vor. Als

Hauptallergen bei Fischen gilt das Fischprotein Parvalbumin. Dieses Protein kommt

sowohl bei niederen Wirbeltieren, wie bei Fischen als Muskelprotein, als auch in höheren

Wirbeltieren im Zentralnervensystem vor. Dabei ist die Parvalbuminkonzentration in

weißem Muskelfleisch höher als im dunklen Muskelfleisch. Das weiße Muskelfleisch

wirkt daher stärker allergen. Parvalbumin ist niedermolekular, kalziumbindend und

besitzt eine hohe Hitzeresistenz. Aufgrund der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber

hohen Temperaturen, sauren Agenzien und proteolytischen Enzymen gilt dieses Protein

bei 95 % der Fischallergiker als ein hoch potent sensibilisierendes Molekül. Parvalbumin

zählt zu den EF-Hand-Proteinen, welche durch sogenannte EF-Hand-Motive

charakterisiert sind. Diese Motive sind bestimmte Aminosäurestrukturen in Proteinen,

welche durch die Form Helix-Loop-Helix gekennzeichnet sind. Ein Loop besteht dabei

aus zwölf Aminosäuren, der räumlich zu einer Schleife geformt ist, in dessen Mitte

Moleküle eingelagert und gebunden werden können. In der folgenden Abbildung 1 ist

beispielhaft ein EF-Hand-Motive des Parvalbumin dargestellt.

Abb. 1: EF-Hand-Motiv eines Parvalbumins

Fisch enthält eine Vielzahl an Proteinen, wovon bisher wenige als Allergene identifiziert

wurden, wie beispielsweise das Allergen Gad c1. Dieses als erstes isolierte und als

Parvalbumin identifizierte Fischallergen stammt von der Fischart Kabeljau ab. Bisher

wurden von weiteren Fischarten Allergene identifiziert, die ähnliche Aminosäuren-

7

sequenzen wie das Gad c1 aufweisen. Diese sind in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet.

Tab. 1: Beispiele identifizierter Parvalbumine verschiedener Fischarten

Fischart Fischallergenbezeichnung

Kabeljau Gad c1, Gad m1

Lachs Sal s1

Karpfen Cyp c1

Markrele Sco j1, Sco a1, Sco s1

Auf Grund der Ähnlichkeiten der genannten Parvalbumine sind hohe Kreuzsensi-

bilisierungen vorhanden, wodurch Fischallergiker meist nicht nur gegen eine Fischart

sondern gegen mehrere Fischarten allergisch reagieren. (Iron, 2009); (Swoboda, 2011);

(Gajewski; Hsieh, 2009)

1.2 Allergenkennzeichnung auf verpackten Lebensmitteln

Aus verbraucherrechtlichen Gründen ist es von großer Bedeutung, in Lebensmitteln

enthaltene Allergene zu deklarieren, auch wenn diese nur in sehr geringen Mengen oder

gar in Spuren enthalten sein können. Fisch und Fischerzeugnisse gehören zu den 14

„allergenen“ Zutaten, die bei sensibilisierten Menschen Lebensmittelallergien oder

Lebensmittelunverträglichkeiten verursachen können. Aus diesem Grund unterliegen

diese 14 Allergene laut der RL 2000/13/EG (Anhang IIIa) der Allergenkennzeichnungs-

pflicht. Die Wiberg GmbH schrieb dazu: „Allergene müssen in der Zutatenliste

aufgeführt werden, sofern sie in einem Lebensmittel als Zutat vorhanden sind, es sich um

technologische Hilfsstoffe handelt oder auch wenn es sich um die Zutat einer

zusammengesetzten Zutat oder um sogenannte ‚carry-over-Zutaten‘ aus Vorstufen

handelt“.

Das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BEMLV)

veröffentlichte:“ Seit dem 25. November 2005 müssen grundsätzlich alle Zutaten, die in

einer zusammengesetzten Zutat, wie etwa Fruchtfüllungen in Backwaren, enthalten sind,

angegeben werden“. Es gibt jedoch Ausnahmen, bei denen die Kennzeichnungspflicht

nicht gilt. Dies ist der Fall bei Stoffen, die durch die Verarbeitung oder den

Herstellungsprozess ihr allergenes Potential verlieren. Zu diesen Ausnahmen gehört

beispielsweise Fischgelatine als Träger bei Vitaminzubereitungen oder als Klärhilfsmittel.

In einer neuen Verordnung, die EU-Verordnung Nr. 1169/2011, welche ab 2014 in Kraft

8

tritt, sollen kennzeichnungspflichtige allergen-wirkende Zutaten in dem Zutaten-

verzeichnis besonders hervorgehoben werden. Zudem sollen zusätzlich unverpackte

Lebensmitteln, wie beispielsweise Speisen aus der Kantine oder unverpackte

Fleischerzeugnisse in der Fleischteke, gekennzeichnet werden, sofern diese Allergene

enthalten. (BMELV), (Wiberg GmbH, 2007)

1.3 Nachweisverfahren von Allergenen

Die Identifizierung von Proteinen bzw. Allergenen erfolgt zum größten Teil über

proteinchemische Tests. Zur Proteinbestimmung eignen sich elektrophoretische Test-

verfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und immunologische Testverfahren wie

Enzym- oder Radioimmunoassays (ELISA). Das PCR-Verfahren basiert auf der

Unterscheidung verschiedener Proteine auf der Grundlage der DNA. Für die Selektion

von Fischallergen sind bereits PCR-Methoden im Einsatz. Aus (Schülz, 2009) geht

hervor, dass der Nachweis von Parvalbumin aus Makrelen mit Hilfe eines PCR-

Verfahrens möglich ist. Dieser Test kann qualitativ und quantitativ für den Nachweis von

Fischallergenen eingesetzt werden. PCR-Verfahren sind aufwendige und zeitintensive

Untersuchungsverfahren, die spezifisch Parvalbumine bestimmen. Es gibt jedoch eine

Vielzahl an Fischarten mit unterschiedlichen Parvalbuminen, die alle Allergien auslösen

können. Daher wäre ein unspezifisches Nachweisverfahren für alle Fischparvalbumine

von Vorteil. Die Methode des Sandwich-ELISAs bietet die Möglichkeit diese

Fischantigene unspezifisch zu erkennen. Bei der Analyse von biologischem Material

mittels immunologischen Verfahren wird die Selektivität der Antikörper-Antigen-

Reaktion zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Antigenen genutzt. Das

Prinzip der ELISA-Methode wird im folgenden Kapitel näher erläutert.

Beispiele für ältere Methoden zur Identifizierung von Proteinen sind unter anderem die

isoelektrische Fokussierung von Fischproteine, d. h. die Identifizierung der Proteine über

den charakteristischen isoelektrischen Punktes, oder photometrische Bestimmungen.

(Heinrich,2009); (Heinrich,2011); (Korte, 2004); (Schülz, 2009)

1.3.1 Nachweismethode ELISA

ELISA (Enzym linked immuno sorbent assay) bedeutet übersetzt enzymgekoppelter

Immunadsorptionstest. Dieses Nachweisverfahren basiert auf einer enzymkatalysierten

Farbreaktion einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Als Antigene können verschiedene

Substanzen wie Proteine, Viren, Hormone und Toxine wirken. In dieser Arbeit werden

9

Fischextraktproben als Antigene eingesetzt. Gegen diese Antigene richten sich

spezifische Abwehrzellen, die Antikörper. Diese Antikröper erkennen über eine

bestimmte Bindungsstelle (Paratop) spezifisch das gesuchte Epitop am Antigen. Mit dem

Einsatz von Markerenzymen kann die spezifische Antigen-Antikörper-Kopplung durch

eine Farbumsetzung sichtbar gemacht und photometrisch gemessen werden. Dieses

Nachweisverfahren findet in vielen Bereichen Anwendung, z. B. in der Lebensmittel-

industrie, der Medizin und Pharmazie.

Es gibt verschiedene ELISA-Techniken. Hauptsächlich unterscheidet man zwischen

indirekter, kompetitiver ELISA und Sandwich-ELISA. Bei einem kompetitiven ELISA

sind Antigenreferenzmaterialien mit Enzymen gekoppelt, die mit freiem Antigen aus der

Probe um die freien Bindungsstellen an den Antikörpern konkurrieren. Hier ist die

enzymkatalysierte Farbstoffkonzentration umgekehrt proportional zur Menge des

Antigens. Im Gegensatz dazu dient der Sandwich-ELISA dem Nachweis hochmole-

kularer Verbindungen, bei der das Substrat-Enzym an einen sekundären Antikörper

gekoppelt ist. Das Antigen besitzt zwei Bindungsstellen und wird, bildlich gesehen, in

einem Sandwich von zwei Antikörpern umgeben (Abb.2). Ist dies der Fall, erfolgt nach

einer Substratzugabe eine enzymkatalysierte Farbstoffumsetzung, die direkt proportional

der Menge des Antigens ist.

Abb. 2: Prinzip eines Sandwich-ELISA

(http://www.cellsignal.com/ddt/elisa_line.html)

Bei diesem Sandwich-ELISA-Verfahren ist es wichtig, dass man spezifische Antikörper

einsetzt, sogenannte monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, an einer spezifischen

Bindungsstelle (Epitop) am Antigen zu binden. Diese monoklonalen Antikörper stammen

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aus geklonten Zelllinien von B-Lymphozyten eines Versuchstieres. Diese spezifischen

monoklonalen Antikörper werden an ein Trägermaterial (96-well Mikrotiterplatten)

gebunden und das zu untersuchende Antigen wird dazu gegeben. Anschließend wird ein

weiterer enzymmarkierter monoklonaler Antikörper hinzugegeben, welcher die gleiche

Affinität gegen das gesuchte Antigen besitzt. Als Enzym findet häufig die

Meerrettichperoxidase (HRP) Anwendung, welche zu der Klasse der Peroxidasen gehört.

Diese Enzyme sind in der Lage Peroxide zu radikalisieren, so kann z. B. als Substrat

Wasserstoffperoxid eingesetzt und durch den Einsatz von HRP in zwei Hydroxy-Radikale

gespalten werden. Diese Radikalisierung kann durch den Einsatz von Indikatorfarbstoffen

sichtbar gemacht werden. Diese Farbstoffe werden durch die Hydroxy-Radikale

protoniert, indem ihnen ein Elektron entzogen wird. Dadurch kommt es zu einer

Blaufärbung. Als Farbstoff kann beispielsweise Tetramethylbenzidin (TMB) eingesetzt

werden. Nach Zugabe einer Stopplösung, meist mittels einer Mineralsäure, wird das

Enzym denaturiert und der Farbstoff erfährt eine weitere Protonierung, was zum

Farbumschlag nach Gelb führt. Im Wellenlängenbereich von 450 nm kann die Farb-

konzentration des protonierten Farbstoffes photometrisch bestimmt werden.

(Schleinstein, 2011); (Baltes,1995); (Holtzhauer 1996)

Ziel dieser Bachelorarbeit ist es, unterschiedliche Antikörperkombinationen zu

untersuchen, welche unspezifisch der Fischart gegenüber spezifisch Fisch- Parvalbumin

erkennen. Dabei gilt vorerst ein rein qualitativer Nachweis dieses Allergens. Die

Multireaktivität der Antikörperkombinationen wird mit den Fischantigenen der Fischarten

Kabeljau, Hering, Alaska Seelachs, Rotbarsch, Thunfisch und Tilapia getestet. Dabei

handelt es sich um reine Fischextrakte.

11

2 Material und Methoden

2.1 Material

Im Folgendem sind die verwendeten Materialien aufgeführt.

2.1.1 Allgemeine Chemikalien

Substanz Summenformel, Bezeichnung

Hersteller

di-Natriumcarbonat Na2CO3 Merck KGaA Natriumhydrogencarbonat NaHCO3 Merck KGaA

Dimethylsulfoxid C2H6OS Merck KGaA

Natriumdihydrogenphosphat- Dihydrat NaH2PO4 × 2H2O Carl Roth GmbH&

Co. KG di-Natriumhydrogenphosphat- Dihydrat Na2HPO4 × 2H2O Carl Roth GmbH&

Co. KG Polyoxyethylen-sorbitanmonolaurat (Tween 20) C58H114O26 Sigma-Aldrich Co

Bovine Albumin Serum (BSA) - Sigma-Aldrich Co Tetramethylbenzidin C16H20N2 Sigma-Aldrich Co Natriumacetatpuffer CH3COONa Sigma-Aldrich Co Ethanol p.a. C2H5OH Merck KGaA Natriumchlorid p.a. NaCl Merck KGaA Milchpulver - Merck KGaA Wasserstoffperoxid 1%ig p.a. H2O2 Merck KGaA Schwefelsäure c = 2 mol/l (4N) p.a. H2SO4 Merck KGaA Salzsäure (Tris HCL) p.a. C4H11NO3HCL Merck KGaA

Merrettichperoxidase p.a. EZ-link Plus Activated Peroxidase Merck KGaA

Sodium Cyanoborohydride p.a. - AppliChem GmbH Reinst-Wasser H2O

12

2.1.2 Puffer und Lösungen

Alle Puffer und Lösungen wurden mit destilliertem Wasser hergestellt.

Puffer für HRP-Labeling

Substratpuffer-PBS, 80 mmol/l, pH 7,6

Rezeptur: 1,43 g des NaH2PO4 × 2H2O wird mit 13,46 g Na2HPO4 × 2H2O und 8,5 g NaCl vermengt und mit Reinst-Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die fertige Lösung wird bei 4 °C gelagert.

Quenching Puffer: 3 M Ethanolalamin, pH 9

Rezeptur: Dieser Puffer wird nach p.a. hergestellt.

Reagenzien für HRP-Labeling

Merrerttichperoxidase: Diese ist 1 mg „lyophilized EZ-link Plus Activated Peroxidase“, welche die Firma Piercenet als p.a. geschickt hat.

Reduktionsmittel - Sodium Cyanoborohydride, ebenfalls p.a.

Puffer für Sandwich-ELISA

Substratpuffer

Rezeptur: 25 ml 0,1 mol/l Natriumacetatpuffer, mit 10%iger Zitronensäure auf pH 5,5 eingestellt, mit 400 μl Tetramethylbenzidin (TMB) und 100 μl 1%ige H2O2 vermengt.

Stopplösung 4 N H2SO4, nach p.a.

Coatpuffer: Natriumkarbonat-Puffer, 50 mmol/l, pH 9,6

Rezeptur: 1,70 g Na2CO3 mit 2,86 g NaHCO3 vermengen und mit dest. Wasser auf 1 l auffüllen.

Assaypuffer: PBS (phosphat buffered saline), 80 mmol/L, pH 7,6

Rezeptur: Gleiche Herstellung, wie Substratpuffer der HRP-Labeling.

Waschpuffer: PBS, 80 mmol/l, pH 7,6 + 0,05% Tween 20

Rezeptur: 199,9 ml PBS-Puffer (Assaypuffer) mit 0,1 ml Tween vermischen und mit 1,8 l dest. Wasser auf 2 l auffüllen.

13

2.1.3 Monoklonale Antikörper von Biometec GmbH

Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfolgt durch eine Immunisierung von

Versuchstieren. Dabei wird dem Versuchstier ein Antigen injiziert, um dagegen

spezifische Antikörper zu produzieren. Die Bildung der monoklonalen Antikörper erfolgt

nicht wie bei den polyklonalen Antikörpern im Blut, sondern in den sogenannten B-

Lymphozyten der Milz. Über Entnahme der B-Zellen, deren Fusionierung mit

Tumorzellen und die Kultivierungen auf bestimmten Nährlösungen können gezielte

Antikörper produziert und über Klonierungen vervielfältigt werden. Diese Antikörper

sind dann für ELISA-Techniken einsetzbar. (Avondet,Hofmann,Landolt)

Für diese Bachelorarbeit wurden die benötigten monoklonalen Antikörper tiefgefroren als

eine unbehandelte Stammlösung von der Firma Biometec GmbH aus Greifswald der

Hochschule Neubrandenburg zur Verfügung gestellt. Für den Einsatz der Antikörper in

einem immunologischen Testverfahren als Sandwich-Komplex mussten diese noch

mittels einer Affinitätschromatographie vorbereitet werden. Die in der Tabelle 2

aufgelisteten aufgereinigten Antikörper wurden verwendet, wobei der Antikörper Wi

113G9 D5 bei allen Versuchen als primärer Antikörper eingesetzt wurde.

Tab. 2: Liste über verwendete Antikörper

Antikörper Proteinkonzentration (mg/ml) Klassifizierung Synonym

Wi 113G 9 D5 2,8 primärer Ak D5 Wi 113D12 G7 3,6 sekundärer Ak G7 Wi 113G4 E9 3,5 sekundärer Ak E9 Wi 115H1 D12 1,8 sekundärer Ak D12 Wi 114B10 C9 1,8 sekundärer Ak C9

2.1.4 Antigen- Fischextrakte

Tab. 3: Liste über verwendete Fischextrakte als Antigene

Fischextrakte Probenkonzentration in mg/ml Synonym Fischantigen

Kabeljau 2,09 K Hering 2,27 H Alaska Seelachs 1,71 A.S. Rotbarsch 3,56 R Thunfisch 18,50 Th Tilapia 10,30 T

Die Tabelle 3 listet die verwendeten Fischproben auf. Hierbei handelt es sich um die

Fischrohextrakte von Kabeljau, Hering, Alaska Seelachs, Rotbarsch, Thunfisch und

14

Tilapia. Die Gewinnung der Proteinextrakte kann entweder mittels Kochen des

zerkleinerten Fisches mit einem Auftragepuffer erfolgen oder durch Extrahieren der

Probe mit Hilfe eines Lysepuffers. Die in dieser Arbeit verwendeten Fischproben wurden

im Dezember 2009 über eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration

aufgereinigt. Die Rohextrakte des Kabeljau, sowie vom Rotbarsch und Tilapia wurden im

Februar 2010 hergestellt. Der Rohextrakt des Thunfisches wurde aus der Reinigung von

Januar 2010 genommen. Die ausgefallenen Proteine wurden bei –20 °C eingefroren und

wurden für den Einsatz im ELISA im aufgetauten Zustand eingesetzt. Die in den

Versuchen eingesetzten Antigenkonzentrationen wurden in PBS-Puffer als

Ausgangskonzentration 1:1000, 1:10.000 und 1:100.000 verdünnt, um eine

konzentrationsabhängige Komplexreaktion zwischen den Antikörpern und den Antigen

bestimmen zu können.

2.1.5 Messgeräte

• Mikrotiterplatten-Reader Modle „Sunrise“ von Tecan (Computerprogramm „Magellan“) • UV-Vis Spektralphotometer „Specord S100“ (Carl Zeiss Technologie) von Analytik

Jena • Mikrotiterplatten-Waschautomat „SLT-lab Instrument A-5082 Astria“ Typ Columbus • Reinst-Wasser-Gerät „SGReinstwasser-System von SG Wasseraufbereitung und

Regenerierstation GmbH

2.2 Methoden

Es wurden das HRP-Labeling und der Sandwich-ELISA angewandt, welche in den

folgenden Kapiteln näher beschrieben werden.

2.2.1 HRP-Labeling

Unter Labeling versteht man das Verknüpfen eines Enzyms an Antikörper. Das

Konjugieren der Enzyme an Antikörper ist für den Einsatz von Immunosensoren mit

Antikörper-Sandwich-Komplex essentiell. Beim Labeln von Antikörpern speziell mit

Horse Radish Peroxidase (HRP) wird mit Hilfe eines Natriumperiodat (in diesem Fall

Sodium Cyanoborohydrid) der Kohlenhydratanteil des Enzyms zu Aldehydgruppen

oxidiert. Diese Aldehydgruppen verbinden sich mit den radikalen Aminogruppen des

Antikörpers unter Bildung Schiffscher Basen, was in der Abbildung 3 allgemein

chemisch dargestellt wird. Damit ist der Antikörper mit dem Enzym HRP gelabelt.

(Schleinstein, 2011); (Kemeny,1994)

15

Abb. 3: Schematische Darstellung der chemischen Kopplung von Meerrettichperoxidase (http://www.piercenet.com/products/browse.cfn?fldiD=01030202)

Durchführung des Labeling

Vor dem HRP-Labeling wurden die Konzentrationen der einzelnen Antikörper auf 1

mg/ml mit PBS-Puffer verdünnt. Gelabelt wurde mit 1 mg EZ-link Plus Activated

Peroxidase, welches in 100 μl Reinst-Wasser aufgelöst wurde. Nach der Zugabe der

gereinigten Antikörper und 10 μl Sodium Cyanoborohydrid musste das Gemisch 1 h

unter der Abzugshaube inkubieren. Anschließend wurden 20 μl Quenching-Puffer,

bestehend aus Ethanolalamin mit pH 9, zugegeben und für weitere 15 min inkubiert. Die

Antikörper sind jetzt HRP-gelabelt. Die Dialyse zur Reinigung der HRP-gelabelten

Antikörper wurde in einer Entsalzungssäule durchgeführt. Dieser Reinigungsschritt dient

der Trennung des gebildeten Konjugat von ungebundenen Enzymen bzw. Antikörpern.

Dabei wurde eine D-SaltTM-Dextran-Entsalzungssäule von Pierce verwendet. Von der

Funktionsweise her ist diese Entsalzungssäule eine Chromatographiesäule. Das

enthaltene Gel in der Säule bildet dabei die stationäre Phase und die Konjugatlösung die

mobile Phase. Die gelabelten Antikörper besitzen eine größere Molekülgröße und werden

in der Säule stärker zurückgehalten, sodass einzelne Enzyme bzw. nicht gelabelte

Antikörper die Säule schneller verlassen. Zum Lösen der Moleküle von der Säulenmatrix

wird das Eluatmittel PBS-Puffer verwendet und die gereinigten gelabelten Antikörper in

Fraktionen aufgefangen. Zur Durchführung wurde zuerst das enthaltene Ethanol aus der

Säule mit 20 ml PBS-Puffer ausgespült und die Menge des gelabelten Antikörper auf die

Säule aufgebracht und mit 15 ml PBS-Puffer nachgespült. Danach wurden die gereinigten

Ak in einzelne Fraktionen je 1,5 ml Eppendorfgefäße aufgefangen und die Konzentration

der einzelnen Fraktionen photometrisch gemessen. Dabei wurden die Antikörper bei λ =

280 nm gegen PBS-Puffer als Nullprobe und die HRP-Konzentration bei λ = 424 nm

gemessen.

Anschließend wurde die Substratumsetzung der einzelnen Fraktionen der gelabelten Ak

mit den höchsten Extinktionswerten auf der Mikrotiterplatte gemessen, um somit

qualitativ bestimmen zu können, ob das HRP-Labeling funktioniert hat. Dazu wurden die

Ak mit Coating-Puffer (pH-Wert 9,6) 1:2000 verdünnt und davon 200 μl auf die

16

Kunststoffplatte aufgetragen. Nach der Inkubationszeit von 1 h bei 4 °C folgte ein

Waschvorgang zur Entfernung nicht gebundener Antikörper. Anschließend wurden 200 μl

der Substratlösung, zusammengesetzt aus 1%igem Wasserstoffperoxid und TMB in

Natriumacetatpuffer, aufgetragen und nach 5 min Inkubationszeit mit 50 μl Schwefel-

säure gestoppt. Die Farbumsetzung wurde photometrisch mittels dem UV-Mikrotiter-

platten- Reader Modle „Sunrise“ von Tecan bei λ = 450 nm kontrolliert.

2.2.2 Sandwich-ELISA

Der Sandwich-ELISA wurde nach folgendem Schema durchgeführt:

• Fixierung der Antikörper an Mikrotiterplatte • Blockieren • Auftragen des Antigens • zweite Antikörperfraktion • Substratzugabe • Konzentrationsbestimmung

Fixierung der Antikörper an Mikrotiterplatte

Zuerst wurden primäre Antikörper auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Zur

Immobilisierung wurden die Antikörper mit Coating-Puffer 1:1000 verdünnt und je 150

μl auf die Mikrotiterplatte pipettiert und 12 Stunden bei 4 °C inkubiert. Aufgrund von

elektrostatischen Anziehungskräften zwischen den Antikörpern und der Kunststoffplatte

ist das Fixieren möglich. Zur Entfernung überschüssiger Antikörper wurde ein

Waschvorgang durchgeführt.

Waschvorgang

Die Mikrotiterplatte wurde mittels eines SLT-lab Instrument A-5082 Astria Typ

Columbus Waschautomaten gespült. Dabei wurde die Platte 5-mal periodisch mit 300 μl

pro Well Waschpuffer, zusammengesetzt aus PBS-Puffer mit Tween 20, ausgewaschen.

Blockieren

Aufgrund der elektrostatischen Anziehungskräfte der Kunststoffplatten könnten freie Bin-

dungspositionen durch Nichtantikörperbindungen eingenommen werden. Diese sorgen

für Kreuzreaktionen, welche das Ergebnis verfälschen könnten. Diese freien Bindungen

wurden mit 1%iger Milchpulver-Lösung (in PBS gelöst) blockiert und für 1 h bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Überschuss des Blockmittels wieder

17

in einem erneuten Waschvorgang entfernt.

Auftragen des Antigens

Die Antigene wurden in jeweils 3 Konzentrationsstufen (in PBS-Puffer) hergestellt und

auf die mit Antikörper fixierte Mikrotiterplatte aufgetragen. In Form einer 3-fach-

Bestimmung wurden jeweils 150 μl des Antigens pipettiert und nach einer Einwirkzeit

von 1h bei Raumtemperatur folgte erneut ein Waschvorgang.

Zweite Antikörperfraktion

Die sekundären Antikörper wurden 1:2000 in PBS-Puffer verdünnt. Anschließend wurden

150 μl dieser gelabelten Antikörper pro Well auf die Antigene gegeben und für 1 h bei

Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte erneut ein Waschschritt.

Substratzugabe

200 μl Substratlösung wurden zu dem Antigen-Antikörper-Komplex gegeben, um über

eine enzymkatalysierte Farbreaktion die Konzentration der gebundenen Antigene sichtbar

zu machen. Die Reaktionszeit wurde auf 5 min bei Raumtemperatur festgelegt. Nach der

Einwirkzeit wurde die Farbreaktion mit der Zugabe von 50 μl Schwefelsäure beendet.

Konzentrationsbestimmung

Die gelbe Farbkonzentration wurde bei 450 nm photometrisch bestimmt.

Durchführung Sandwich-ELISA

Als primärer Antikörper wurde in allen Versuchen der Ak Wi 113G9 D5 eingesetzt.

Dieser Antikörper wurde in (Blank, 2012) als optimalen primären Ak für die untersuchten

Fischarten K, H, A.S., R, Th und T ermittelt. Es wurden vier unterschiedlich sekundär

HRP-gelabelte Antikörper eingesetzt und deren Reaktionsvermögen zu einem

Referenzpaar verglichen. Die eingesetzten sekundären Antikörper sind in Tab. 2

aufgelistet. Die Durchführung der Sandwich-ELISA erfolgte jeweils nach demselben

Versuchsablauf.

18

3 Ergebnisse

Im Folgenden werden die ermittelten Ergebnisse dargestellt und erläutert.

3.1 HRP-Labeling

Nach dem Labeln der Antikörper und der anschließend durchgeführten Dialyse mit einer

Salzsäule wurden die Konzentrationen der Antikörper-Lösungen in den einzelnen

Fraktionen bestimmt. Über eine Standardreihe mit BSA-Standard-Lösung (Bolvine serum

albumin) ließ sich eine Geradengleichung ermitteln. Die Tabelle 4 zeigt die ermittelten

Extinktions-Werte der jeweiligen Konzentration der untersuchten BSA-Standard-Lösung.

Tab. 4: Konzentration BSA Standards und deren Extinktionen

BSA Standard-konzentration (mg/ml)

Extinktion

0,25 0,155 0,50 0,397 1,00 0,827 1,50 1,173 2,00 1,492 2,50 1,788

Aus diesen Werten ergab sich eine lineare Abhängigkeit zwischen Absorption und BSA-

Konzentration (Abb.4), die über die Geradengleichung 0.0390.721 +x=y definiert

wurde.

Abb.4: Kalibriergerade BSA

19

Durch Umstellen der Geradengleichung nach x ergibt sich0.721

0.039−y=x . Die ermittelten

Konzentrationen der HRP-gelabelten Antikörper sind im Anhang 1 und 2 aufgelistet.

Bei dem HRP-Labeling des G7 konnten insgesamt 17 Fraktionen mit einer mittleren

Konzentration von c = 0,09 mg/ml gewonnen werden. Um qualitativ das Markieren

bestimmen zu können, wurden Stichprobenartig die Fraktionen auf die Funktionalität der

sekundären Ak getestet. Die Extinktionswerte einer photometrischen Messung sollten

zwischen 0,3 und 2 liegen, da dort nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz ein sicherer

linearer Zusammenhang zwischen Absorption und Stoffkonzentration besteht. Sollten die

Extinktionswerte über diesem Bereich liegen, müssen die Proben verdünnt werden.

Aufgrund der hohen Konzentration der Antikörper in den Fraktionen ist eine mindestens

1:2000 Verdünnung erforderlich. Daher wurden die verwendeten Ak-Fraktionen stets

1:2000 verdünnt. Die Fraktion mit der höchsten Konzentration wurde für den

nachfolgenden Sandwich-ELISA zum Vergleich verwendet. Die Fraktion 2 hatte bei dem

Ak G7 die höchste Antikörperkonzentration und wurde in den Sandwich-ELISA

eingesetzt.

Bei dem Markieren des E9-gelabelten Ak konnten 18 Fraktionen aufgefangen werden mit

einer mittleren Konzentration von c = 0,095 mg/ml. Die Fraktion 1 erzielte die höchste

photometrisch gemessene Proteinkonzentration, aber keine Substratumsetzung. Eine

solch hohe gemessene Proteinkonzentration deutet auf das Auffangen von ungelabelten

Ak, Enzymen bzw. Verunreinigungen hin, welche für einen ELISA in dieser Form nicht

anwendbar sind. Im Vergleich dazu erwies Fraktion 3 zwar eine etwas geringere

photometrisch gemessene Extinktion, aber die höchste gemessene Substratumsetzung.

Fraktion 3 wurde dementsprechend für nachfolgende Versuche eingesetzt.

Wie auch bei Ak E9 wurde bei der Vorbehandlung des D12-gelabelten Ak ebenfalls 18

Fraktionen gewonnen. Ebenso erzielte auch hier Fraktion 3 die höchste Substrat-

umsetzung. Dasselbe konnte bei dem C9-gelabelte Ak erzielt werden.

20

3.2 Sandwich-ELISA

Alle Ergebnisse der durchgeführten Sandwich-ELISA-Versuche sind im Anhang 3

tabellarisch aufgeführt.

3.2.1 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G11als Referenz

Durch eine Komplexbildung von Antigen und gelabelten Antikörpern kommt es zu einer

Substratumsetzung, welche photometrisch messbar ist. Die dadurch ermittelten

Extinktionswerte spiegeln die Umsetzungsrate wieder und damit die Funktionalität der

Ak-Kombinationen. Die Kombination der Antikörper D5 als primären Ak und G11 als

sekundären Ak wurde (Blank, 2012) bereits untersucht. Als Vergleichsreferenz wurden

die sechs Fischantigene mit diesem Ak-Paar getestet (Abb. 5).

Abb. 5: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G11

In Vorversuchen erwies sich diese Ak-Kombination bereits als multireaktiv für die

untersuchten Fischantigene. Selbst in niedrigen Proteinkonzentrationen konnten diese

nachgewiesen werden, sodass ein Antigenkonzentrationsbereich von 10 – 1000 ng/ml

festgelegt wurde. Bei allen durchgeführten Versuchen wurde stets PBS-Puffer als

Nullprobe eingesetzt und in den Graphiken als schwarz-gestrichelte Linie dargestellt.

Aus der Abb. 5 ist zu entnehmen, dass alle untersuchten Fischantigene, mit Ausnahme

21

von Thunfisch, mit dieser Ak-Kombination nachgewiesen wurden. Dies gilt ab einer

Konzentrationsstufe von ca. 200 ng/ml. Unterhalb dieser Proteinkonzentration ist die

Bestimmung dieser 6 Antigene nicht mehr signifikant nachgewiesen worden.

3.2.2 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak G7

Untersucht wurde die Kombination des Antikörper-Paares D5 als primären Antikörper

und G7 als sekundärer Antikörper. In der Abb. 6 sind die Ergebnisse der untersuchten

Fischantigene graphisch dargestellt.

Abb. 6: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G7

Das Antigen Kabeljau erzielte im Vergleich zu den anderen Antigenen die höchste

Absorption mit dieser Antikörperkombination. Hierbei wurde eine Extinktion von E =

0,436 bei einer Antigenkonzentration von 2090 ng/ml gemessen. Es besteht eine

Abhängigkeit zwischen der Fischkonzentration und der optischen Dichte. Je stärker das

Antigen konzentriert ist, umso höher wird im Allgemeinen eine Extinktion gemessen. So

ist die Substratumsetzung bei einer Antigenkonzentration von 209 ng/ml bei E = 0,124

und bei 20,9 ng/ml liegt der Extinktionswert im sehr niedrigen Bereich bei E = 0,01.

Neben Kabeljau wurden auch die Antigene der Fischarten Hering, Alaska Seelachs,

Rotbarsch und Tilapia detektiert. Die Fischprobe Thunfisch konnte bei keiner Kon-

zentrationsstufe nachgewiesen werden.

22

3.2.3 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak E9

Unter gleichen Bedingungen wie in dem Versuch mit dem Ak G7 wurde das

Reaktionsverhalten des sekundären HRP-gelabelten Ak E9 untersucht. Wie in Abb.7

abgebildet, konnten die Antigene Hering und Rotbarsch selektiv detektiert werden.

Abb. 7: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-E9

Diese beiden Fischantigene wurden von diesem Ak ab einer Probenkonzentration von ca.

200 ng/ml nachweislich gebunden. Der Nachweis von Heringantigen ist im höheren

Konzentrationsbereich bei diesem Ak besser als beim Rotbarschantigen. Unter 100 ng/ml

Probenkonzentration konnten die beiden Fischantigene nicht mehr nachgewiesen werden.

Alle Extinktionswerte der übrigen untersuchten Fischproben erzielten die gleichen Werte

wie die PBS-Kontrolle. Damit konnten diese Fischantigene von dieser Antikörper-

kombination nicht detektiert werden.

23

3.2.4 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak D12

In diesem Versuch wurde als sekundärer Ak der D12 eingesetzt. Im Unterschied zu den

ersten Versuchen erzielte die Kontroll-Probe einen geringfügig veränderten Extinktions-

wert, wie in Abb. 8 zu erkennen.

Abb. 8: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-D12

Die Verschiebung der Kontrolle ist auf die Herstellung einer neuen PBS-Kontrolllösung

zurück zu führen. Wie aus der Graphik hervorgeht, liegen ca. 80 % der Datenwerte

unterhalb der Kontrolllinie. Dennoch konnte diese Antikörperkombination das Antigen

Rotbarsch im Konzentrationsbereich ab 300 ng/ml detektieren. Die Antigene Tilapia und

Thunfisch liegen ab einer Proteinkonzentration von ca. 100 ng/ml im sehr niedrigen

Bereich über dem Nullwert der Kontrolle. Bei den Probenantigenen Kabeljau, Hering und

Alaska Seelachs liegen die Extinktionen aller untersuchten Konzentrationsstufen im

Bereich der Kontrolle und wurden demnach von dieser Antikörperkombination nicht

nachgewiesen.

24

3.2.5 Sandwich-ELISA mit HRP-gelabelten Ak C9

Die folgende Grafik (Abb. 9) zeigt die Nachweisfähigkeit des sekundären Antikörpers

C9.

Abb. 9: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-C9

Wie auch im Versuch zuvor liegen einige Messwerte unterhalb der Kontrolllinie. In den

vorherigen Versuchen wurden in der niedrigsten Proteinkonzentrationsstufe keine

auswertbaren Messwerte ermittelt. Aufgrund dessen wurde in dieser Untersuchung in

einem um eine Zehnerpotenz höheren Konzentrationsbereich gearbeitet. Es konnten vier

der sechs Fischantigene nachgewiesen werden. Im Vergleich zum Ak D12 wurden

zusätzlich zu dem Antigen Rotbarsch in dieser Antikörperkombination auch Kabeljau,

Hering und Alaska Seelachs nachgewiesen. Diese Ak-Kombination weist deutlicher

Kabeljau und Hering nach als die anderen detektierten Fischantigene.

25

4 Diskussion

Als primärer Antikörper wurde der D5 verwendet. In Voruntersuchungen sowie in (Blank,

2012) erzielte dieser Antikörper bei allen hier untersuchten Fischantigenen positive

Ergebnisse im Sandwich-ELISA-Verfahren. Es ist von großer Bedeutung, dass der

primäre Antikörper in der Lage ist, alle zu testenden Fischantigene zu binden. Kann

dieser Antikörper ein Antigen nicht koppeln, wird das ungebundene Antigen im

Waschprozess entfernt. Damit kann dieses Antigen im Test nicht mehr erfasst werden.

Aus Zeit- und Kostengründen konnte dieser Antikörper nicht mehr als sekundärer

Antikörper untersucht werden.

Beim Vergleich der vier gegeneinander getesteten HRP-gelabelten sekundären Antikörper

G7, E9, D12 und C9 mit dem sekundären Ak G11 als Referenzantikörper konnte ermittelt

werden, dass drei dieser vier Antikörper multireaktiv sind. Als multireaktiv gilt ein

Antikörper, wenn dieser in der Lage ist mindestens zwei Antigene aus verschiedenen

Fischarten zuerkennen.

Wie in den Voruntersuchungen von C. Blank und in einem durchgeführten Wieder-

holungsversuch wurde der Referenzantikörper G11 als multireaktiv gegen die

Fischantigene K, H, A.S., R und T positiv getestet. Die Fischprobe Th konnte in den hier

untersuchten Antigenkonzentrationen in beiden Versuchen mit dem Ak G11 keine

auswertbaren Extinktionen erzielen. Thunfisch hat einen hohen Anteil an dunklem

Muskelfleisch. Dunkles Muskelfleisch besitzt im Gegensatz zum weißen Muskelfleisch

eine geringere Konzentration an Allergen auslösendem Parvalbumin. (Gajewski; Hsieh,

2009) Daher ergab der Test mit Thunfischantigen selbst bei den hier höchsten

eingesetzten Konzentrationen keine positiven Ergebnisse. Aufgrund der geringeren

Parvalbuminkonzentration in dem Muskelfleisch dieser Fischart, müssten höhere

Antigenkonzentrationen eingesetzt werden, um positive Ergebnisse zu erzielen. Neben

dem Referenzantikörper wies der untersuchte Ak G7 ebenfalls selektiv die Fischantigene

K, H, A.S., R und T nach und gehört somit zu den multireaktiven monoklonalen

Antikörpern. Auch hier wurde das Antigen Th nicht detektiert. Der Ak C9 konnte vier

von sechs Fischantigenen nachweisen und kann ebenfalls als multireaktiv betrachtet

werden. Dieser Ak detektierte K, H, A.S. und R. Der Ak E9 ist für den Nachweis der

Fischproben Rotbarsch und Hering selektiv. Dieser Ak ist als weniger multireaktiv zu

betrachten und daher für unspezifische Fischantigenuntersuchungen eher ungeeignet. Der

Ak D12 konnte selektiv den Nachweis des Antigens aus Rotbarsch deutlich erbringen.

Das Fischantigen aus Tilapia wurde über den gesamten Konzentrationsbereich in

26

geringem Maße erkannt, sodass eine Untersuchung sogar unterhalb einer Konzentration

von 10 ng/ml erfolgen könnte. Die restlichen untersuchten Fischantigene konnten bei

diesem HRP-gelabelten Ak keine messbaren Ergebnisse erzielen, sodass diese Ak-

Kombination für unspezifische Allergenuntersuchungen ebenfalls ungeeignet wäre.

Beim Vergleich der fünf untersuchten Antikörper ist auffällig, dass der

Referenzantikörper deutlich höhere Extinktionen erzielte, als die vier getesten Ak. Der

Referenzantikörper G11 stammte aus einer Fraktion mit einer gelabelten Ak-Konzen-

tration von ca. 0,4 mg/ml und wurde in einer 1:2000 Verdünnung in PBS-Puffer getestet.

Die untersuchten gelabelten Ak G7, E9, D12 und C9 hatten eine Ausgangskonzentration

von ca. 0,2 mg/ml in den einzelnen Fraktionen und wurden ebenfalls in einer 1:2000

Verdünnung für den Einsatz im Sandwich-ELISA eingesetzt. Die Differenz der

eingesetzten Antikörper-Konzentrationen zwischen dem G11 und den vier neu gelabelten

Antikörpern ergab vermutlich den Unterschied in der Substratumsetzung. In dieser Arbeit

ist das Ziel unspezifisch Fischantigene qualitativ nachzuweisen und nicht quantitativ.

Daher ist es unerheblich, wie hoch die eingesetzte Antikörperkonzentration der

sekundären Ak ist. Sobald ein Antikörper ein Antigen koppelt und es zur

Substratumsetzung kommt, gilt der Allergennachweis als positiv. Im direkten Vergleich

der Ergebnisse des Referenzantikörpers G11 aus der (Blank, 2012) und aus dem hier

durchgeführten Wiederholungsversuch ist weiterhin ein Unterschied in den

Extinktionswerten trotz identisch eingesetzter Ak-Konzentrationen festgestellt worden.

Allgemein liegen die Messwerte von (Blank, 2012) höher als die Werte aus dem

Wiederholungsversuch. Für den Wiederholungsversuch wurden zwar die gleichen

Fischantigene verwendet, jedoch entstammen diese nicht demselben Herstellungsdatum.

Darin könnte dieser Messwertunterschied unter anderem begründet sein. Zusätzlich

könnte ein abweichend verwendetes Volumen der sekundären Ak-Lösungen die Differenz

erzeugt haben. In (Blank, 2012) wurde ein Volumen von 200 μl G11-Antikörperlösung

pro Well verwendet. Im Wiederholungsversuch hingegen wurden nach vorgeschriebenem

Versuchsplan 150 μl G11-Ak-Lösung eingesetzt. Dies könnte ebenfalls zu den

abweichenden Ergebnissen beider Arbeiten geführt haben. Durch einen zu geringeren

Einsatz an gelabelten Antikörpern könnten frei vorhandene Antigenepitope nicht im

ausreichenden Maße durch die sekundären Ak gebunden werden, sodass diese Antigene

im Test nicht nachweisbar sind. Wie bereits erwähnt spielt jedoch die Konzentration der

sekundären Ak keine wesentliche Rolle, da ausschließlich der Fund eines Antigens

ausreicht, um einen positiven Antigennachweis zu erhalten. Da ebenfalls bei allen vier

27

untersuchten Antikörpern die gleiche Menge an Antikörperlösungen eingesetzt wurde,

sind die Ergebnisse im Vergleich untereinander durchaus repräsentativ. In der

Studienarbeit von C. Blank sind im Antigenkonzentrationsbereich von ca. 1 ng/ml

auswertbare Extinktionswerte erreicht worden. Blank schrieb: „In dieser Arbeit konnten

mit dem Antikörperpaar 3G9 und 1G3 bei S, R und H Proteinkonzentrationen im

einstelligen ng/ml-Bereich erkannt werden. Das sind zum Beispiel für A. Seelachs 1,28

ng Parvalbumin pro ml Lösung“. In den Untersuchungen dieser Arbeit konnte ein

Antigennachweis bis zu einem Konzentrationsbereich von ca. 100 ng/ml sicher

nachgewiesen werden. Das sekundäre Ak D12 konnte das Fischantigen aus Tilapia sogar

bis 10 ng/ml detektieren. Es lässt sich vermuten, dass auch in geringeren Konzentrationen

dieses Antigen in der Ak-Kombination mit D12 nachweisbar wäre.

Die Nachweismethode Sandwich-ELISA dient dem qualitativen und quantitativen

Nachweis von Antigenen im Spurenbereich (ppm-Bereich). Die Untersuchungen wurden

dementsprechend in hohen Verdünnungsstufen durchgeführt, die bei solch kostbaren und

geringen Probemengen eine hohe Fehlerquote verursachen. Genaues Pipettieren und

intensives Homogenisieren von solch geringen Mengen sind daher von großer

Bedeutung. Ein sicheres und genaues Arbeiten kann durch eine Standardabweichung

überprüft werden. Die Standardabweichungen der Mehrfachuntersuchungen lagen stets

unterhalb von 5% und bestätigen damit ein sauberes Arbeiten und eine sichere

Untersuchungsmethode (Anhang 3).

In (Gajewski; Hsieh, 2009) wurden zwei Antikörper gegen Parvalbumin in einem

indirekten ELISA gegeneinander getestet. Dabei wurden neben 26 Fischarten, inklusive

der in dieser Bachelorarbeit getesteten Fischantigene K, A.S., R, Th und T, auch weitere

Tierarten untersucht. Der Antikörper Mab PARV-19, gegen Parvalbumin eines Frosches,

erkennt dabei unabhängig der Tierarten Parvalbumin. Der Antikörper Mab 3E1 gegen das

Katzenhai-Parvalbumin hingegen, ist in den Untersuchungen als rein Fischspezifischer

Parvalbumin-Antikörper ermittelt worden (Gajewski; Hsieh, 2009). Wie auch in dieser

Bachelorarbeit sind solche Antikörper bedeutsam für den Nachweis von Fischallergenen

in komplexen Lebensmitteln. Schnelltests für Fischallergiker sollten ausschließlich

positiv auf Fisch-Parvalbumin reagieren und damit dem Verbraucher Schutz vor

versteckten Fisch-Allergenen im Lebensmittel bieten. Wie in der Publikation sind auch

die in dieser Arbeit untersuchten Antikörper rein Fischspezifisch. Ziel war es, eine

Antikörperkombination zu finden, die zwar allgemein Fischallergene erkennt, aber

unspezifisch in der Fischart positive Ergebnisse erzielt. Im Vergleich zu dem

28

Referenzantikörperpaar D5-G11 erwies sich die Kombination D5-G7 ebenfalls als

tauglich im Nachweis von Fischartunabhängigem Parvalbumin. Der hier aus Zeitgründen

nicht getestete sekundäre Ak D5, der immer als primärer Ak aufgrund seiner Fischart-

übergreifenden Erkennung verwendet wurde, sollte in weiteren Tests untersucht werden.

Vermutlich erzielt diese Kombination der gleichen Ak-Gruppe bessere Ergebnisse.

5 Ausblick

Der Konzentrationsbereich der verwendeten Antigene sollte für die hier untersuchten Ak-

Kombinationen weiter ausgeweitet werden. Einerseits könnten einige Ak-Kombinationen

erst in größeren Antigenkonzentrationen wirksam sein. Andererseits kann der hier

festgestellte Negativ-Nachweis bestimmter Fischartparvalbumine auch in höheren

Konzentrationen bestätigt werden. Ebenso gilt es zu überprüfen, ob die Kombination von

D5-D12 die Fischart Tilapia im Spurenbereich unter 10 ng/ml noch positiv nachweisen

kann. Allgemein sollten weitere Kombinationsmöglichkeiten der Ak getestet werden. Das

aus Zeit- und Kostengründen hier nicht als sekundärer Antkörper getestete Antikörper D5

sollte in Untersuchungen als Kombination D5-D5 erprobt werden, weil dieses Antikörper

alle sechs Fischarten-Antigene erkennen kann. Das funktionale Ak-Paar D5-G7 und das

Referenz-Ak-Paar D5-G11 sollten über weitere Fischarten wie in der Publikation bereits

beschrieben, getestet und in komplexen Lebensmitteln wie z. B. Suppen erprobt werden.

Die Funktionalität des Sandwich-ELISA-Verfahrens wird unterschiedlich zwischen

reinen Fischextrakten und realen Lebensmitteln ausfallen. Dennoch ist die Wirksamkeit

des Verfahrens in realen Lebensmitteln entscheidend und sollte abschließend auch dort im

großen Umfang untersucht werden.

29

6 Zusammenfassung

Zu Beginn der Versuchsreihe wurde eine schon zuvor untersuchte Antikörperkombination

von monoklonalen Antikörpern auf dessen Funktionalität in einem

Antigenkonzentrationsbereich von 10 ng/ml bis 1000 ng/ml untersucht. Dieses

Antikörperpaar Wi 11 3G9 D5 als primären Antikörper und Wi 111G3 G11 als

sekundären Antikörper galt in dieser Arbeit als Referenz-Antikörperpaar. Im Vergleich

zur Referenz-Kombination wurden vier weitere sekundäre Antikörper mit jeweils

demselben primären Antikörper auf ihre Funktionalität untersucht. Die Funktionalität der

Antikörperkombinationen wurden mit den Antigenen aus Kabeljau, Hering, Alaska

Seelachs, Rotbarsch, Thunfisch und Tilapia getestet. Die Kombination 11 3G9 D5 als

Fängerantikörper und Wi 113D12 G7 als sekundärer gelabelter Antikörper konnte fünf

der sechs untersuchten Fischantigene nachweisen und ist damit ebenso multireaktiv wie

die Referenz-Kombination D5-G11. Mit der Kombination Wi 113G9 D5 und Wi 114B10

C9 als sekundärer gelabelter Antikörper wurden vier Antigene nachgewiesen. Mit dem

sekundären Antikörper Wi 113G4 E9 bei gleichen primären Antikörper wurden zwei

Antigene nachgewiesen (Hering und Rotbarsch) und der Antikörper Wi 115H1 D12

konnte nur das Antigen aus Rotbarsch deutlich nachweisen. Anhand der ermittelten

Ergebnisse gelten die Antikörperkombinationen D5-G7 und D5-G11 als ausreichend

multireaktiv für den qualitativen Nachweis des Fischallergens Parvalbumin und sollten

daher in weiteren Untersuchungen intensiver verfolgt werden.

30

7 Verzeichnisse

7.1 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: EF-Hand-Motiv eines Parvalbumins ...................................................................... 6�

Abb. 2: Prinzip eines Sandwich-ELISA .............................................................................. 9�

Abb. 3: Schematische Darstellung der chem. Kopplung von Meerrettichperoxidase ....... 15�

Abb.4: Kalibriergerade BSA ............................................................................................. 18�

Abb. 5: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G11 ...... 20�

Abb. 6: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-G7 ........ 21�

Abb. 7: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-E9 ........ 22�

Abb. 8: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-D12 ...... 23�

Abb. 9: Extinktionswerte der sechs Fischantigene bei der Ak-Kombination D5-C9 ........ 24�

7.2 Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Bisher identifizierte Parvalbumine verschiedener Fischarten ................................. 7�

Tab. 2: Liste über verwendete Antikörper ......................................................................... 13�

Tab. 3: Liste über verwendete Fischextrakte als Antigene ................................................ 13�

Tab. 4: Konzentration BSA Standards und deren Extinktionen ........................................ 18�

Tab. 5: Ext.- und Konzentrationswerte Ak G7 und Ak E9 nach dem HRP-Labeling ...... 32�

Tab. 6: Ext.- und Konzentrationswerte Ak D12 und Ak C9 nach dem HRP-Labeling .... 33�

Tab. 7: Extinktionswerte, MW und Standardabweichung der untersuchten sek. Ak ........ 34�

7.3 Literaturverzeichnis

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31

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Wiberg GmbH: Kennzeichnung von Allergenenund zusammengesetzten Zutateten, http://www.wiberg.eu/gastronomie/service/lebensmittelrecht/allergenkennzeichnung.htm. 2007; 05.01.2012

32

8 Anhang

Anhang 1

Tab. 5: Extinktions- und Konzentrationswerte des Ak G7 und Ak E9 nach dem HRP-Labeling

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Die Fraktion ohne Substratumsetzung im qualitativen Nachweis der Funktionalität der

HRP-gelabelten Ak wurde rot markiert.

Formel für die Mittelwertbestimmung:

Arithmetische Mittel: n / x=x �

� x = Summe aller Messwert

n = Anzahl der Messwerte

33

Anhang 2

Tab. 6 : Extinktions- und Konzentrationswerte des Ak D12 und Ak C9 nach dem HRP-Labeling

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Formel für die Standardabweichung:

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11

ini X

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n = Anzahl der Messungen

Xi = Messwert

X = arithmetisches Mittel

34

Anhang 3

Tab. 7: Extinktionswerte, MW und Standardabweichung der untersuchten sekundären Ak

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35

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36

Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit

Hiermit versichere ich, Juliane Schleinstein, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig

angefertigt habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt

habe.

Ort, Datum Unterschrift