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Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften

Studiengang Lebensmittel – und Bioprodukttechnologie

WS 2013/14

Die Entwicklung eines Lateral Flow Assay zum Nachweis

von Fischallergenen

Verfasser: Robert Falk

1. Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. Christine Wittmann

2. Betreuer: Prof. Dr. sc. agr. Heidrun Schniedewind

URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis 2013 – 0133 – 3

1

Abstract

The work is about the development of a Lateral Flow Assay for the detection of fish allergen,

especially Parvalbumin, in food. In general food allergy increases over the last years and

becomes a problem of public interest, because of the health hazard for persons concerned.

Parvalbumin is identified to be the main fish allergen that is responsible for about 90 % of IgE –

mediated immune reactions to fish. The aim of the work is to develop a colloidal gold-based

Lateral Flow Assay for the rapid detection of Parvalbumin in food. Therefore several

investigations are performed to optimize the production of colloidal goldparticles and the

preparation of the LFA components developing a high sensitive LFA. Finally a test for the

detection of Parvalbumin of codfish with an LOD of 4,88 μg/ml is developed. Furthermore a

cross reactivity of the used monoclonal antibody (specific for codfish) against pollack (up to 48

μg/ml) and hering (up to 49 μg/ml) could be determined. Further investigations, especially in

complex food, to optimize the developed LFA are necessary.

2

INHALTSVERZEICHNIS

VERZEICHNIS DER VERWENDETEN FORMELZEICHEN, SYMBOLE UND

ABKÜRZUNGEN ......................................................................................................................... 4

1. EINLEITUNG ....................................................................................................................... 5

1.1 Lebensmittelallergie .......................................................................................................................... 7 1.1.1 Definition & Klassifikation ............................................................................................................ 7 1.1.2 Aufbau & Funktionalität des Immunsystems ............................................................................... 9 1.1.3 Antikörper .................................................................................................................................. 15 1.1.4 Immunologische Mechanismen allergischer Reaktionen .......................................................... 17 1.1.5 Allergene & Fischallergen Parvalbumin .................................................................................... 20 1.1.6 Rechtliche Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht von Allergenen ......................... 22

1.2 Immunchromatographische Anaylseverfahren ............................................................................ 24 1.2.1 Allgemein................................................................................................................................... 24 1.2.2 Lateral Flow Assay .................................................................................................................... 26

2. MATERIAL & METHODEN ............................................................................................ 27

2.1 Chemikalien & Equipment .............................................................................................................. 27 2.1.1 Chemikalien .............................................................................................................................. 27 2.1.2 Puffer & Lösungen .................................................................................................................... 28 2.1.3 Antikörper .................................................................................................................................. 29 2.1.4 Fischproben .............................................................................................................................. 29 2.1.5 LFA – Komponenten ................................................................................................................. 29 2.1.6 Geräte ....................................................................................................................................... 30

2.2 Lateral Flow Assay .......................................................................................................................... 30 2.2.1 Aufbau ....................................................................................................................................... 31 2.2.2 Funktionsprinzip ........................................................................................................................ 34

2.3 Versuchsvorbereitung ..................................................................................................................... 37 2.3.1 Fischprobenaufbereitung .......................................................................................................... 37 2.3.2 Proteingehaltbestimmung ......................................................................................................... 37 2.3.3 Untersuchung zur optimalen Konjugation zw. Antikörper und kolloidalem Gold ...................... 38 2.3.4 Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats ................................................................ 39 2.3.5 Vorbereitung der LFA – Komponenten ..................................................................................... 39

2.4 LFA – Testdurchführung ................................................................................................................. 41

3. ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 43

3.1 Proteingehaltsbestimmung der Fischproben ............................................................................... 43

3

3.2 Konjugationsoptimierung zwischen Nanogoldpartikeln und sekundärem Antikörper ............ 44

3.3 Vorversuche ..................................................................................................................................... 46 3.3.1 Herstellungsoptimierung vom Antikörper – Nanogold – Konjugat ............................................ 47 3.3.2 Optimierung der LFA – Komponenten ...................................................................................... 49

3.4 Hauptversuche ................................................................................................................................. 55 3.4.1 Ermittlung optimaler Antikörperpaarkombination ...................................................................... 55 3.4.2 Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze ..................................................................................... 61 3.4.3 Signalstärkenoptimierung & Verbesserung der Nachweisgrenze............................................. 66

4. ABSCHLUSSDISKUSSION .............................................................................................. 71

5. ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 75

LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................... 76

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................ 80

TABELLENVERZEICHNIS ..................................................................................................... 81

ERKLÄRUNG ÜBER DIE SELBSTSTÄNDIGE ANFERTIGUNG DER ARBEIT ........... 82

4

Verzeichnis der verwendeten Formelzeichen, Symbole und Abkürzungen

AS - Aminosäure

BfR - Bundesinstitut für Risikobewertung

CD - Cluster of Differentiation

CDR - Complementarity Determining Regions

DNA - Desoxyribonukleinsäure

ECARF - European Centre for Allergy Research Foundation

ELISA - Enzyme – linked Immunosorbent Assay

IgA - Immunglobulin A

IgD - Immunglobulin D

IgE - Immunglobulin E

IgG - Immunglobulin G

IgM - Immunglobulin M

IL - Interleukin

kDA - Kilo Dalton (atomare Masse)

KP I - Konjugatpadpuffer I

LFA - Lateral Flow Assay

LMKV - Lebensmittelkennzeichnungsverordnung

LOAEL - Lowest Observed Adverse Effect Level

MB I - Membranpuffer I

MHC - Major Histocompatibility Complex

MRI - Max Rubner – Institut

nm - Nanometer

OD - Optische Dichte

PCR - Polymerase Chain Reaction

pAK - primärer Antikörper

RT - Raumtemperatur

sAK - sekundärer Antikörper

pg - Pikogramm

SPR – Biosensoren - Surface Plasmon Resonance Biosensoren

VITAL - Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling

5

1. Einleitung

In der öffentlichen Gesundheit der Bevölkerung sind in der heutigen Zeit allergieauslösende

Lebensmittel ein Problem von stetig wachsender Bedeutung, da einerseits eine Zunahme von

Lebensmittelallergien über die letzten Jahrzehnte zu verzeichnen ist und andererseits mit ihnen

ein hohes gesundheitliches Risiko für die Betroffenen einhergeht [1]. Als Ursachen für den

stetigen Anstieg von Lebensmittelallergien vermutet man die sich ändernden Lebens – und

Ernährungsgewohnheiten der Bevölkerung, hervorgerufen durch die Globalisierung und das

erweiterte Nahrungsmittelangebot [2]. Schätzungen zufolge leiden etwa 4 – 8% der deutschen

Bevölkerung unter Nahrungsmittelallergien oder Nahrungsmittelunverträglichkeiten. [3] [2]. Das

Bewusstsein, einer ständig präsenten Gefahr bei der Nahrungsaufnahme ausgesetzt zu sein sowie

die mühsame Nahrungsmittelbeschaffung, bedingt durch das aufmerksame Studieren der

Zutatenliste auf der Lebensmittelverpackung, vermindern die Lebensqualität der Allergiker

erheblich [4]. Zur Verbesserung des Verbraucherschutzes hat die Europäische Kommission die

EU Richtlinien 2003/89, 2006/142 und 2007/68/EG als Ergänzung zur EU Richtlinie 2000/13

zur Kennzeichnung bzw. Deklaration von Inhaltsstoffen erlassen [5]. Darin enthalten sind unter

anderem die kennzeichnungspflichtigen allergischen Inhaltsstoffe, wobei letztendlich 8

Allergene für mehr als 90% der auftretenden Lebensmittelallergien verantwortlich sind [5]. Zu

dieser Kategorie gehören neben Eiern, Milch, Gluten, Krustentiere, Nüsse (Erdnüsse,

Baumnüsse) und Sojabohnen auch Fisch als einer der Hauptverursacher von allergischen

Symptomen, wie z. B. Atemwegsstörungen, Kreislaufbeschwerden, Hautreizungen, Verdauungs-

störungen oder einem lebensbedrohlichen anaphylaktischem Schock [6].

In einer gesunden Humanernährung nimmt Fisch eine wichtige Rolle ein, da er reichhaltig an

mehrfachungesättigten Fettsäuren (Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure), fettlöslichen

Vitaminen sowie an Proteinen mit einer hohen biologischen Wertigkeit ist [7]. Eine Fischallergie

stellt demnach neben den gesundheitlichen Risiken auch einen signifikanten Einschnitt für die

Ernährungsweise dar. Hauptsächlich ist die Fischallergie bei Kindern und jungen Erwachsenen

zu beobachten bzw. bei Personen aus Küstenregionen / Küstenländern wie z. B. Norwegen, die

einen hohen Fischkonsum aufweisen oder in der Fischindustrie tätig sind [7] [8]. Für über 90%

der Betroffenen ist das Fischallergen Parvalbumin der Hauptverursacher einer IgE – vermittelten

Immunreaktion des Körpers [9] [10]. Bei Parvalbumin handelt es sich um Ca2+/Mg2+ bindende

Muskelproteine, die vorwiegend im weißen Muskelfleisch von Fischen, wie z. B. Kabeljau,

Seelachs oder Flunder, vorkommen und die Bewegungsabläufe (Muskelentspannung)

unterstützen [10].

6

Zum Nachweis von Parvalbumin in Lebensmittelprodukten existieren bereits mehrere

Verfahren, wie z. B. PCR, ELISA oder SPR – Biosensoren [11]. Der gemeinsame Vorteil dieser

Methoden ist die hohe Spezifität und Sensitivität, sodass bereits Spuren von Parvalbumin in der

Nahrung detektiert werden können. Die Nachweisgrenze beim ELISA liegt z. B. bei 0.01 mg

Parvalbumin/kg Lebensmittel [12]. Mittels PCR ist der Nachweis von Parvalbumin sogar bis auf

die Nukleinsäurenebene möglich, jedoch wird das Allergen nicht direkt nachgewiesen, weshalb

die Methode vorwiegend als Indikator für allergene Lebensmittelbestandteile eingesetzt wird

[13]. Die aufgeführten Nachweisverfahren sind jedoch sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv,

kostenintensiv und teilweise laborgebunden, zumal deren Durchführung geschultes und

qualifiziertes Personal erfordert [5]. Deshalb ist die Entwicklung eines praktikablen Schnelltests,

der zuverlässig, genau und zeitsparend arbeitet sowie die Rechtsvorschriften erfüllt,

unumgänglich [5]. Einerseits kann dadurch der Hersteller die Problematik der „versteckten

Allergene“, d h. die Kontamination (Kreuzkontaminationen) von Lebensmittelprodukten mit

Parvalbumin, während des Herstellungsprozesses schnell und kostengünstig überprüfen,

wodurch der Verbraucherschutz steigt. Andererseits sind Schnelltests auch für den Verbraucher

geeignet, um Lebensmittel, die mit Spuren von Fisch deklariert sind, zu überprüfen, wodurch

sich Produktauswahl und Produktsicherheit erhöhen und letztendlich zur Verbesserung der

Lebensqualität für den Allergiker führen. Grundlage für die Entwicklung des Schnelltestformats

zum Parvalbuminnachweis bildet dabei die Methode Lateral Fow Assay, welche auf

immunchromatographischen Vorgängen basiert, bei denen spezifische Antigen – Antikörper

Wechselwirkungen genutzt werden, um entsprechende Analyten, wie z. B. Hormone, Toxine,

Pestizide oder Allergene, optisch nachzuweisen [14]. Vorteile dieser Technik sind die kurzen

Analysezeit, das benutzerfreundliche Format, die lange Haltbarkeit (Lagerfähigkeit) sowie die

kostengünstige Herstellung, weshalb sich die Technik in vielen Bereichen etabliert hat, wie z. B.

in der Medizin zum Nachweis von Krankheiten, pathogenen Organismen, Schwangerschaften

oder in der Strafverfolgung zum Drogennachweis [15] [16].

Die Masterarbeit beschäftigt sich demnach mit der Entstehung von Lebensmittelallergien und

den dabei ablaufenden immunologischen Mechanismen im menschlichen Körper, wobei

insbesondere auf die Fischallergie, die rechtlichen Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungs-

pflicht und deren Einfluss auf die Lebensmittelindustrie eingegangen wird. Das Hauptziel der

Arbeit ist die Entwicklung eines LFA basierenden Schnelltests zum qualitativen Nachweis von

Fischallergenen, einschließlich dessen Beurteilung hinsichtlich Funktionalität, Sensitivität und

Praktikabilität im Vergleich mit anderen etablierten Nachweisverfahren.

7

1.1 Lebensmittelallergie

1.1.1 Definition & Klassifikation

Im Allgemeinen handelt es sich bei Lebensmittelallergien um abnormale immunologische

Reaktionen gegenüber Lebensmitteln, die bestimmte Inhaltsstoffe (Allergene) enthalten [4].

Dabei differenziert man Lebensmittelallergien anhand der Vermittlungsart und der Zeitdifferenz

von Allergenaufnahme / Nahrungsmittelaufnahme bis hin zur ersten Überempfindlichkeits-

reaktion in 2 Kategorien [4]. Im Vergleich dazu handelt es sich bei Lebensmittelintoleranzen um

Unverträglichkeitsreaktionen auf Lebensmittel oder deren Inhaltsstoffe unter Ausschluss des

Immunsystems und der damit verbundenen Bildung von Antikörpern [9]. Abbildung 1 gibt dabei

einen schematischen Überblick zur Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittel-

unverträglichkeiten.

Abbildung 1: Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelintoleranzen

Reaktionen auf Lebensmittel

Lebensmittelallergie Lebensmittelintoleranz

Zell – vermittelte – Allergie (nicht IgE vermittelt) z. B.

- Zöliakie

Typ – I – Allergie (IgE vermittelt) z. B.

- Erdnussallergie - Fischallergie - Kuhmilchallergie

Enzymatische Int. (Stoffwechselstörung) z. B.

- Laktoseintoleranz

Pharmakologische Int. z. B.

- Biogene Amine - Glutamate

1

2

1

2

Idiosynkratische Int. z. B.

- Sulfit bedingtes Asthma

- Tartrazin bedingtes Asthma

3

8

Zur 1. Kategorie der Lebensmittelallergien zählt die Typ – I – Allergie (Soforttyp), welche durch

Immunglobin E (IgE) Antikörper vermittelt wird und allergische Reaktionen innerhalb von

Minuten bis maximal 1 Stunde nach der Nahrungsaufnahme auftreten [4]. Die IgE Antikörper

bewirken die Ausschüttung von Histamin und weiteren Botenstoffen durch die Mastzellen,

wodurch allergische Symptome, wie z. B. Asthma, Nasenschleimhautentzündungen, Schwel-

lungen und Erweiterung der Blutgefäße, hervorgerufen werden [17]. Zudem kann durch IgE

vermittelte Reaktion eine Anaphylaxie ausgelöst werden, bei der es sich um eine schnell und

heftig auftretende Immunreaktion handelt, die durch Abfall des Blutdrucks, Brustschmerzen und

Kreislaufschock gekennzeichnet ist [17]. Eine Anaphylaxie ist demnach sehr lebensbedrohlich,

da sie den gesamten Organismus betrifft und somit auch einen schwerwiegenden Einfluss auf die

Organfunktionen hat, der bis hin zum tödlichen Kreislaufversagen führen kann. Der

anaphylaktische Schock und Asthma zählen zu den häufigsten Todesursachen, die in Verbindung

mit Lebensmittelallergien vom Soforttyp I gebracht werden können [4]. Derartige extreme

Immunantworten werden hauptsächlich durch Erdnüsse hervorgerufen, jedoch treten sie auch

gelegentlich bei Eiern, Milch oder Schalentieren auf [17]. Die Fischallergie, welche durch das

Allergen Parvalbumin (Muskelprotein) ausgelöst wird, gehört ebenfalls zur 1. Kategorie der Typ

– I – Allergien und kann bei den betroffenen Allergikern die beschriebenen Symptome auslösen.

Generell kommen IgE – vermittelte allergische Reaktionen häufiger bei Säuglingen und

Kleinkindern vor als bei Erwachsenen, wobei genetische Faktoren auf die Entstehung von Typ –

I – Allergien einen signifikanten Einfluss haben [17]. In diesem Zusammenhang beschreibt der

medizinische Begriff Atopie die erbliche Neigung, auf den Kontakt mit harmlosen

Umweltsubstanzen überempfindlich zu reagieren. Demnach existiert bei Allergikern eine

körperliche Bereitschaft, Immunglobin E Antikörper in erhöhten Mengen zu bilden, wobei dieser

Umstand genetisch verankert ist [17].

Zur 2. Kategorie der Lebensmittelallergien gehört die Zell – vermittelte (Typ IV) „verzögerte

Überempfindlichkeitsreaktion“. Hervorgerufen werden diese Allergien in der Regel durch

sensibilisierte Immunzellen im Dünndarm, wobei es sich hauptsächlich um Lymphozyten (T –

Zellen) handelt, die gegen die entsprechenden allergieauslösenden Substanzen sensibilisiert sind

[4]. Die Folge sind Gewebeentzündungen, die sich auf bestimmte Körperbereiche beschränken,

und erst 24 h bis 48 h nach der jeweiligen Nahrungsaufnahme (Stoffaufnahme) auftreten [4]. Das

bekannteste Beispiel ist die Zöliakie (Glutenunverträglichkeit), bei der die Betroffenen auf

Proteine (Prolamine, Gluteline) mit hohem Anteil an Prolin und Glutamin überempfindlich

reagieren, was zur chronischen Erkrankung der Dünndarmschleimhaut führt [18]. Ursache dafür

ist die Fähigkeit der Proteine, die Epithelzellschicht der Darmschleimhaut bei den erkrankten

9

Personen zu passieren wodurch das Enzym t-Transglutaminase die Gliadinpeptide modifiziert,

und eine lokale Immunreaktion ausgelöst wird, bei der die Aktivierung von T-Lymphozyten

erfolgt [18]. Insbesondere in vielen Getreidesorten, wie z. B. in Weizen, Roggen, Gerste oder

Hafer, kommt dieses Klebereiweiß (Prolamine / Gluteline) vor und ist bei der Brot – und

Gebäckherstellung essentiell für das Teiggerüst bzw. das Gashaltevermögen eines Teiges

notwendig [18]. Zöliakie ist die in Europa am häufigsten auftretende genetische Erkrankung mit

einer Häufigkeit von 0,3 – 0,5 % [9].

Im Vergleich zu Lebensmittelallergien lassen sich Lebensmittelintoleranzen in 3 Kategorien

einteilen. Zur 1. Kategorie gehören die enzymatischen Intoleranzen, bei denen es sich um

genetisch bedingte Stoffwechselstörungen handelt [4]. Betroffene Personen sind dabei nicht in

der Lage, bestimmte Lebensmittel bzw. deren Inhaltsstoffe zu verstoffwechseln, da spezifische

körpereigene Enzyme zum Abbau der Stoffe nicht gebildet werden können. Z. B. sind Laktose

intolerante Personen unfähig, den Milchzucker zu metabolisieren, da das intestinale Enzym β –

Galaktosidase nicht vorhanden ist [4]. Demnach kann Laktose nicht von den Darmlumen

absorbiert werden, was zur Fermentation der Laktose durch die Darmbakterien führt und als

Folge bei den Betroffenen schaumige Diarrhoe und Flatulenz auslöst [4]. Die 2. Kategorie der

Lebensmittelintoleranzen beinhaltet die pharmakologischen Intoleranzen, bei denen

Lebensmittelinhaltsstoffe pharmakologische Wirkungen hervorrufen können. So weisen

Betroffene dieser Kategorie eine Intoleranz gegenüber Lebensmitteln auf, die Histamin

(Gewebshormon / Neurotransmitter) enthalten oder eine vermehrte Histaminausschüttung im

Körper bewirken, wie z. B. Champagner, Rotwein, Schokolade, Tomaten, Thunfisch oder

Johannesbeeren [9] [17]. Die Symptome einer pharmakologischen Intoleranz sind u. a. Übelkeit,

Erbrechen, Juckreize oder Hautreitzungen [9]. In der 3. Kategorie werden die idiosynkratischen

Intoleranzen zusammengefasst, bei denen Lebensmitteln negative körperliche Reaktionen

auslösen, der Mechanismus hinter dieser Reaktion jedoch noch ungeklärt bzw. unbewiesen ist

[4]. Z. B. sind die genauen Wirkmechanismen für Asthma, das durch den Farbstoff Tartrazin

oder durch Sulfite ausgelöst wird, noch nicht eindeutig geklärt [4].

1.1.2 Aufbau & Funktionalität des Immunsystems

Der menschliche Organismus besitzt zum Selbstschutz gegen die pathogene Wirkung von

Fremdsubstanzen biologische und chemische Abwehrmechanismen, die harmonisch aufeinander

abgestimmt sind und je nach Bedrohungsgrad unterschiedlich reagieren. Auslöser

immunologischer Reaktionen sind Antisomatogene (Antigene), da sie auf Grund ihrer

körperfremden Struktur durch das menschliche Immunsystem als Gefahr eingestuft werden. Im

10

Allgemeinen lässt sich das menschliche Abwehrsystem in 3 verschiedene Bereiche einteilen,

wobei diese in Tabelle 1 dargestellt sind. [19]

Tabelle 1: Einteilung menschlicher Immunreaktionen (Probst, 2004, S. 267)

Unspezifische Immunreaktion Spezifische Immunreaktion

Passive Resistenz Aktive Resistenz Immunität

Erblich bedingte allgemeine

Unempfindlichkeit durch die

körperliche Konstitution

Unspezifische Abwehr im

Körperinneren durch Proteine

und phagocytierende Abwehr-

zellen

Im Laufe des Lebens

erworbener hochspezifischer

Abwehrmechanismus

Die unspezifische Immunreaktion stellt das von Geburt an vorhandene Abwehrsystem dar, um

den menschlichen Organismus unspezifisch gegenüber pathogene Erreger zu schützen. Man

unterscheidet in die Teilbereiche passive Resistenz und aktive Resistenz. Bei der passiven

Resistenz handelt es sich um mechanische, chemische und mikrobielle Mechanismen, die das

Eindringen und Wirksamwerden körperfremder Strukturen verhindern sollen. Tabelle 2 gibt

dabei eine Übersicht zu den einzelnen Barrieren und ihre Schutzmechanismen. [19]

Tabelle 2: Barrieren der passiven Resistenz (Probst, 2004, S. 268)

Mechanisch Chemisch Mikrobiell

- Haut mit wasserabwei-

sender, verhornter toter

Außenschicht

- Augenspülung durch

Tränenflüssigkeit

- Schleimhäute durch Sekre-

tion adhäsiven Schleims

- niedrige pH-Werte auf der

Haut (3 – 5 ), im Scheiden-

gewölbe (4 – 4,5) und im

Magen (1 – 2)

- bakterizide Wirkung des

Lysozyms in Tränen – und

Speichelflüssigkeit

- Apathogene Bakterien im

Mund, Darm sowie auf der

Haut bilden Konkurrenzflora

Die aktive Resistenz beinhaltet die „zweite Abwehrreihe“ und verhindert die Vermehrung der

Antigene, nachdem diese die Barrieren der passiven Resistenz überwunden haben. In diesem

Zusammenhang spielen Mastzellen, Granulocyten, Makrophagen und natürliche Killerzellen

eine entscheidende Rolle, da diese mittels Rezeptorerkennung ein breites Spektrum an Erregern

identifizieren. Diese unspezifischen Abwehrzellen besitzen eine amorphe Zellgestalt, wodurch

sie zwischen dem humoralen Blut – und Lymphsystem wechseln können und somit über

11

Interzellularräume in der Lage sind, den gesamten Organismus zu kontrollieren. Granulocyten

und Makrophagen, auch Fresszellen genannt, stellen das Bindeglied zur spezifischen

Immunreaktion dar, auf Grund ihrer Fähigkeit Fremdpartikel sowie pathogene Mikroorganismen

mittels Endocytose aufzunehmen und intrazellulär zu verdauen (Vorgang der Phagocytose).

Nach diesem Verdauungsprozess werden die antigenen Determinanten (Epitope) der

körperfremden Strukturen, bei denen es sich um charakteristische Antigenfragmente handelt, auf

der Membranoberfläche der Zellen positioniert, wobei diese Epitope einen Signalcharakter für

die spezifischen Immunzellen besitzen, um entsprechende spezifische Immunreaktionen

einzuleiten. Abbildung 2 gibt dabei einen allgemeinen Überblick zu den verschiedenen

Abwehrzellen und ihrer Entstehung bzw. ihrem Vorkommen [17] [19].

Abbildung 2: Im menschlichen Organismus vorkommende Abwehr - und Immunzellen

(Probst, 2004, S. 269)

Die spezifische Immunantwort wird auch als adaptive Immunreaktion bezeichnet, da es sich um

eine erworbene Fähigkeit handelt, die erst nach dem Kontakt mit den jeweiligen Antigenen

ausgelöst werden kann. Demnach tritt sie in Kraft, wenn die Abwehrreihen der unspezifischen

Immunreaktion überwunden worden sind. Die spezifische Immunreaktion lässt sich in die

humorale Immunantwort und die zelluläre Immunantwort aufteilen. Beide Abwehrsysteme

laufen parallel ab und ergänzen sich nachhaltig in ihrer Wirkungsweise. Demnach umfasst die

humorale Immunantwort die Antikörperproduktion in der Lymph – und Blutflüssigkeit gegen die

freien Antigene in den Körperflüssigkeiten und wird hauptsächlich über B – Lymphozyten

12

realisiert. Im Gegensatz dazu beinhaltet die zelluläre Immunantwort die Bildung von Killerzellen

gegen Erreger (Antigene), die in Körperzellen eingedrungen sind, und wird hauptsächlich über T

– Lymphozyten realisiert. Beide Zelltypen werden in Untergruppen eingeteilt und können

anhand ihrer membrangebunden Oberflächenmarker systematisiert werden. Abbildung 3 gibt

dabei einen Überblick über die an der spezifischen Immunantwort beteiligten Zelltypen und

deren Einteilung. [17] [19]

Abbildung 3: An spezifischer Immunantwort beteiligte Zelltypen (Probst, 2004, S. 271)

Anhand der Abbildung 3 wird ersichtlich, dass sich die T – Lymphozyten in T – Killerzelle, T –

Helferzelle und T – Entzündungszelle aufteilen. Die T – Helferzelle sowie die T –

Entzündungszelle besitzen als membrangebundenen Oberflächenmarker den CD4 – Rezeptor

(Glykoprotein) und sind für die Regulation der Immunantwort durch Ausschüttung von

Cytokinen, wie z. B. Interleukine oder Interferon, verantwortlich. Die T – Killerzelle ist mit dem

CD8 – Rezeptor ausgestattet, der als Erkennungsmolekül für körpereigene Zellen dient.

Demnach ist die Aufgabe der T – Killerzelle die Identifizierung und Zerstörung infizierter

Körperzellen bzw. ausgemachter Fremdzellen. Im Gegensatz dazu entwickelt sich die B – Zelle

zur Plasmazelle, wobei auf den B – Lymphozyten spezielle Immunglobuline (IgM) als

Rezeptoren für Antigenbindungen lokalisiert sind, weshalb ihre Aufgabe die Antigenpräsentation

einschließlich der Synthese von Antikörpern ist. [17] [19]

13

Im Allgemeinen lässt sich die Entwicklung einer spezifischen Immunantwort in verschiedene

Phasen unterteilen. In der ersten Phase werden die Antigene, welche nach der Infektion nicht in

Wirtszellen eindringen konnten, durch Makrophagen bzw. B – Lymphozyten in den sekundären

lymphatischen Organen, wie z. B. Milz, Mandeln oder Lymphknoten, erfasst und mittels

Phagocytose aufgenommen. Anschließend erfolgt die Prozessierung (Abbau & Bearbeitung) der

Antigene im Zellinneren, wobei die entstehenden kurzkettigen Peptide an MHC – Moleküle

gebunden werden. Bei MHC-Komplexen handelt es sich um Gene, die für

Gewebeverträglichkeit, Immunerkennung und die immunologische Individualität essentiell sind,

da die Genprodukte körpereigene Antigene umfassen und auf der Zelloberfläche zur

Identifizierung von Körperzellen lokalisiert sind [20]. Demnach erfolgt der Transfer der

antigenen Determinanten / Epitop (Peptid – MHC – Komplex) zur Zelloberfläche, sodass diese

den T – Lymphocyten dargeboten werden können. Von den im Blut und Lymphen befindlichen

T – Zellen (ca. 100.000) besitzt lediglich eine Zelle den zum Epitop passenden T – Zell –

Rezeptor, wobei diese Bindung nach dem Schlüssel – Schloss – Prinzip funktioniert und durch

CD4 – bzw. CD8 – Co – Rezeptoren der T – Lymphozyten stabilisiert wird. Im Anschluss daran

kommt es zur Differenzierung, d. h. die T – Lymphozyten mit CD8 – Rezeptor entwickeln sich

zu Killerzellen und im Gegenzug T – Lymphozyten mit CD4 – Rezeptor zu Helferzellen. Dabei

werden die Lymphozyten durch den Kontakt mit mehreren Oberflächenmarkern der Antigen

präsentierenden Zelle aktiviert, wobei die interzelluläre Kommunikation über Cytokine

(Proteine, Glykoproteide), wie z. B. Interferon oder Interleukine, realisiert wird. An die

Differenzierungsphase schließt sich die Klonselektion der T – Zellen an. Das bedeutet, die

Teilung der bis dato ruhenden T – Zelle setzt ein, sodass in sehr kurzer Zeit ein Klon erbgleicher

Zellen mit höchster Antigenspezifität entsteht und parallel dazu die Synthese der Cytokine

gefördert wird. In dieser Phase entsteht ebenfalls das immunologische Gedächtnis (adaptive

Immunantwort), da T – und B – Zellen in der Lage sind nach dem Erstkontakt mit

Antigenpräsentierenden Makrophagen durch Unterbrechung ihrer Weiterentwicklung zu

langlebigen Gedächtniszellen zu werden. Im weiteren Verlauf der spezifischen Immunantwort

lagern sich die spezifischen Antikörper, gebildet während der Immunisierung durch B –

Lymphozyten, über komplementäre Molekülstrukturen beider Reaktionspartner durch nicht

kovalente Bindungen mit den entsprechenden Antigenen zu Antigen – Antikörper – Komplexen

zusammen und immobilisieren dadurch die Antigene bzw. bereiten sie für den anschließenden

Abbau vor. Zum Abschluss der Immunantwort findet die Lyse der infizierten Körperzellen statt.

Dabei werden zunächst die durch Pathogene infizierte Körperzellen anhand ihrer auf der

Zellmembranoberfläche befindlichen an MHC – Moleküle gebundenen Epitope (antigene

14

Determinanten), durch die T – Killerzellen identifiziert. Anschließend binden sich die T –

Killerzellen mittels spezifischer Rezeptoren an die infizierte Zelle, wodurch der Kontakt die

Freisetzung des in der T – Killerzelle produzierten Perforin bewirkt. Es kommt zur Perforation

der Zellmembran, sodass durch die entstandenen Poren Granzyme B (Proteasen) in die Zelle

eindringen können und dort eine Apoptose (programmierten Zelltod) auslösen. Die Zelle stirbt

ab und wird anschließend aufgelöst. Abbildung 4 dient zur Veranschaulichung des im Vorfeld

beschriebenen Vorgangs der spezifischen Immunantwort. [17] [19] [21]

Abbildung 4: Übersicht zur spezifischen Immunantwort im menschlichen Organismus

(Probst, 2004, S. 273)

15

1.1.3 Antikörper

Antikörper sind quartär strukturierte Glykoproteine aus der multigenen Proteinfamilie der

Immunglobuline und spielen eine essentielle Rolle bei der menschlichen Immunabwehr gegen

pathogene Fremdsubstanzen bzw. körperfremde Strukturen. Die Einteilung der Immunglobuline

(Antikörper) erfolgt in 5 Hauptklassen (Isotypen), die man anhand von Größe, Ladung,

Aminosäurezusammensetzung und Kohlenhydratgehalt unterscheiden kann. Die Bezeichnung

der einzelnen Klassen ist IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Anhand von Abbildung 5 soll der

allgemeine Grundaufbau der Immunglobuline und die daraus resultierenden Funktionalität am

Beispiel des Immunglobulins G (IgG) erläutert werden. [19] [22]

Abbildung 5: Aufbau der Antikörpergrundstruktur (IgG) (Wild, 2001, S. 119)

Im Allgemeinen setzen sich Antikörper aus 2 identischen schweren Polypeptidketten („Heavy

Chains“) und 2 identischen leichten Polypeptidketten („Light Chains“) zusammen. Die beiden

schweren Ketten sind über Disulfidbrückenbindungen mit einander verlinkt, wobei jede schwere

Kette ebenfalls über eine Disulfidbrücke mit einer leichten Kette verbunden ist. Daraus ergibt

sich eine flexible Y – Form des Proteinmoleküls. Des Weiteren sind die schweren Ketten

unterteilt in 3 konstante (CH1, CH2, CH3) sowie 1 variable (VH) Domäne. Die leichten Ketten

gliedern sich in 1 konstante (CL) und 1 variable (VL) Domäne. Dabei bestehen die einzelnen

Domänen aus schätzungsweise 110 Aminosäuren. Die hohe Spezifität der jeweiligen Antikörper

ergibt sich aus der Strukturvielfalt (Sequenzvielfalt der AS) der variablen Domänen VL und VH,

16

die sich am Ende der jeweiligen Kette befinden und das Fv-Fragment bilden. Innerhalb der

beiden variablen Domänen (VL/VH) sind jeweils 3 hypervariable AS – Sequenzbereiche, die

auch als CDR („Complementarity Determining Region“) bezeichnet werden und eine β –

Faltblattstruktur aufweisen. Letztendlich bilden diese 6 CDR pro Antikörperarm die spezifische

Antigenbindungsstelle, wonach jeder Antikörper 2 identische Bindungsstellen für Antigene

besitzt. Die Funktionalität der Antikörper bzw. die unterschiedlichen Effektormechanismen der

einzelnen Isotypen werden über die variierenden Fc – Regionen, die sich am unteren schweren

Kettenende (CH2, CH3) befinden, realisiert. Man unterscheidet dabei in 5 Hauptarten schwerer

Ketten bzw. Fc – Regionen, die durch entsprechende Fc – Rezeptoren (Membranrezeptoren)

gebunden werden können und dadurch die spezifischen Eigenschaften der verschiedenen

Immunglobuline bestimmen. Dabei handelt es sich um die Domänen Fcα (IgA), Fcγ (IgG), Fcε

(IgE), Fcδ (IgD) und Fcμ (IgM). Z. B. ist der Fcε – Rezeptor auf der Membranoberfläche von

Mastzellen zu finden und bindet die Fc – Domäne des IgE, sodass die Mastzelle aktiviert wird,

sobald sich Antigene an den IgE Antikörper binden. Dieser Vorgang ist insbesondere bei IgE

vermittelten Immunantworten (Typ – I – Allergien) relevant. [17] [19] [22]

Im oberen Teil wurde bereits erwähnt, dass insgesamt 5 Immunglobulinklassen existieren, die

unterschiedliche Funktionen bei der Immunabwehr des Menschen übernehmen und teilweise in

weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. Bei den Immunglobulinen der Klasse IgM

und IgD handelt es sich um Monomere, die auf der Zelloberfläche von B – Lymphozyten

lokalisiert sind und die Funktion antigenspezifischer Rezeptoren ausführen. Des Weiteren ist

IgM dazu in der Lage, durch Polymerisation Pentamere zu bilden, was die eigentlich IgM –

Struktur im Blutserum widerspiegelt. Generell besitzen die variablen Domänen des IgM eine

geringe Bindungsaffinität gegenüber Antigenen, jedoch ist die Bindungsstärke auf Grund der

hohen Anzahl an Bindungsstellen (10) in der Pentamerform sehr ausgeprägt. Insbesondere in der

Frühphase der Immunatwort tritt IgM vorwiegend auf, wobei im weiteren Verlauf IgG, IgA bzw.

im Falle einer allergischen Immunreaktion IgE Antikörper den größten Anteil darstellen. Dieses

Phänomen wird als Isotypen – Klassenwechsel bezeichnet und beinhaltet eine DNA bedingte

Umstellung der Gene, die für die Synthese der konstanten Domänen der schweren

Polypeptidketten zuständig sind. Das heißt, es existieren unterschiedliche Isotypen mit der

gleichen Antigenspezifität, da die variablen Domänen unverändert bleiben. Gesteuert wird dieser

Prozess durch die T – Zellen und die Sekretion der entsprechenden Cytokine, wie z. B.

Interleukin – 4 (IL – 4), das die B – Lymphozyten auf die IgE Produktion umstellt. Das bereits

erwähnte IgG besitzt eine monomere Struktur und ist das am häufigsten im Blutserum

vorkommende Immunglobulin mit einem Anteil von 70 – 75%. IgG wird zudem in 4

17

Unterklassen aufgeteilt, die sich durch strukturelle Unterschiede im Aufbau der schweren

Polypeptidketten zueinander unterscheiden. Des Weiteren wird IgG als der wichtigste Antikörper

der Sekundärreaktion (Immunantwort) beschrieben, wobei die Unterklassen IgG1 sowie IgG3

plazentagängig sind und eine passive Immunisierung des Fötus bewirken. Der Antikörper IgA

stellt mit einem Blutserumanteil von 15 – 20% neben dem IgG das zweithäufigste

Immunglobulin im menschlichen Organismus dar und ist ebenfalls in Tränenflüssigkeit und

intestinalen Sekreten wie Speichel nachweisbar. Zudem ist IgA in der Lage, durch

Polymerisation Diamere zu bilden und verfolgt als hauptsächliches Ziel, die Anheftung von

Bakterien oder Viren an Epitheloberflächen zu verhindern, sodass eine Infektion humoraler

Zellen unmöglich bzw. eingeschränkt wird. Beim letzten Isotyp handelt es sich um den IgE

Antikörper, der bei allergischen Immunreaktionen involviert ist und bei Immunantworten

gegenüber Parasiten (z. B. Würmern) eine entscheidende Rolle spielt. Die schwere

Polypeptidkette dieses Antikörpers besitzt eine zusätzliche konstante Domäne (CH), wodurch die

Fcε – Region mit hoher Affinität an den Fcε – Rezeptoren auf den Mastzellen, basophilen

Granulozyten (enthalten Histamin, Heparin) sowie auf eosinophilen Granulozyten binden kann.

Zudem kann diese Bindung über mehrere Jahre aktiv bleiben, sodass bei der entsprechenden

Antigenaufnahme der Antigen – Antikörper – Komplex die Mastzelle zur Ausschüttung

allergieauslösender Stoffe, wie z. B. Histamin, veranlasst. [17] [19]

1.1.4 Immunologische Mechanismen allergischer Reaktionen

Im Allgemeinen existieren 4 Allergietypen, bei denen die spezifischen Immunreaktionen

entweder durch Antikörper (Allergietypen I – III) oder durch T – Zellen übertragen werden (Typ

IV – Allergie). Im Falle der Fischallergie, die zu den Typ I – Allergien zählt, wird die

Immunreaktion durch IgE Antikörper vermittelt. [23] Generell läuft die Entwicklung einer

Lebensmittelallergie (Soforttyp – I) in 2 Phasen ab, wobei die 1. Phase als Sensibilisierung und

die 2. Phase als Erhebung bzw. Effektorphase bezeichnet wird. Anhand von Abbildung 6 soll der

Prozess näher erläutert werden [17].

18

Abbildung 6: Entstehungsprozess einer IgE vermittelten Typ-I-Allergie (Probst, 2004,

S.279)

In der Sensibilisierungsphase kommt es zunächst zum 1. Kontakt zwischen den entsprechenden

Antigenen, meist einem natürlichen in der Nahrung vorkommenden Protein (Parvalbumin bei

Fisch) und den B – Lymphozyten. Die Antigene binden dabei zunächst an die auf der

Membranoberfläche der B – Lymphozyten befindlichen IgM/IgD Antikörper, wodurch der

Antigen – Immunglobulin – Komplex anschließend intern abgebaut wird. In Folge dessen

kommt es zur Bindung der Peptid Segmente an die entsprechenden MHC – Moleküle, sodass

diese präsentiert und durch die jeweiligen T – Helferzellen anhand des passenden Epitops

identifiziert werden. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass man in 2 Arten von T –

Helferzellen differenziert. Zum einen gibt es die Th1 CD4+ - Zellen, deren Eigenschaften die

Interferon – γ Ausschüttung sowie die IgG vermittelte Zerstörung intrazellulärer Bakterien und

Pilze ist. Des Weiteren sind durch Th1 – Zellen unangemessen ausgelöste Immunantworten die

Grundlage für die Entstehung von Typ – IV Allergien (z. B. Zöliakie). Andererseits gibt es die

Th 2 CD4+ - Zellen, die vorwiegend Interleukin (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) als Botenstoff

ausschütten und für die IgE vermittelte Zerstörung von Parasiten (Würmern) verantwortlich sind.

Diese Th 2 – Zellen sind ebenfalls einer der Hauptgründe für die Entstehung von IgE vermittelter

Lebensmittelallergien, da sie in der Sensibilisierungsphase die Isotypen – Umstellung der B –

Lymphozyten bewirkt. D. h. nachdem der T – Zell – Rezeptor an das MHC – Peptidsegment

(Antigenfragment) auf der B – Zelle gebunden hat, kommt es zur zusätzlichen Ausschüttung von

Th 2 Cytokinen (IL-4, IL-13). Dadurch erfolgt zunächst die Entwicklung der B – Zelle zur

19

Plasmazelle, die anschließend in der Lage ist, IgE – Antikörper zu produzieren. Demnach ist die

unangemessene Immunreaktion der Th 2 – Zellen gegenüber harmlosen Proteinen eine der

Hauptursachen für IgE vermittelte Lebensmittelallergien. Im weiteren Verlauf der

Sensibilisierungsphase kommt es zur Bindung des IgE – Antikörpers an den Fcε – Rezeptoren

auf den Mastzellen. Wie bereits unter Punkt 1.1.3 beschrieben, besitzen die Immunglobuline E

Fcε – Domänen sowie eine zusätzliche konstante Domäne (CH), wodurch eine hohe

Bindungsaffinität zum Mastzellenrezeptor (Fcε) besteht und daraus eine lange Bindungsdauer

resultiert. Die Bindung der IgE Antikörper an die Mastzellen bildet dabei den Abschluss der

Sensibilisierungsphase, wobei der menschliche Körper nun gegen diese Antigene sensibilisiert

ist. [17] Während dieser Phase treten in der Regel keine Symptome einer allergischen

Abwehrreaktion auf [4].

In der 2. Phase, auch als Effektorphase bezeichnet, kommt es im Falle einer erneuten

Antigenaufnahme zur Kreuzvernetzung zwischen den auf der Mastzelle befindlichen IgE –

Antikörpern und den spezifischen Antigenen, wobei das Antigen für eine erfolgreiche

Querverbindung an beide Epitope (linker-rechter Arm) des IgE – Antikörpers binden muss, um

eine ausreichende Mastzellstimulation zu erreichen [24]. Die Vernetzung bewirkt eine

Konformitätsänderung des Antigen – Antikörperkomplexes, wodurch Calcium-Ionen in die

Mastzelle strömen und diese dadurch aktiviert wird. In Folge dessen tritt die exocytotische

Freisetzung (Degranulation) der Mediatoren, die in den Granula der Mastzellen gespeichert sind,

ein. Bei diesen Mediatoren bzw. Botenstoffen handelt es sich vorwiegend um Histamin,

Serinproteasen, Proteoglykane, Leukotricine und Serotonin. Innerhalb der Degranulation binden

die Proteoglykane ionisch an das Histamin und die Serinproteasen, wodurch eine kristalline

Struktur entsteht, die eine erhöhte Löslichkeit aufweist (solubilisiert). Die Freisetzung der

Mediatoren erfolgt in kürzester Zeit nach dem Kontakt zwischen Antigen und IgE – Antikörper

und bewirkt im Organismus die Auslösung schwerwiegender allergischer Symptome. Histamin

ist dabei für Bronchokonstriktion (Verengung der Atemwege), Schleimsekretion, Vasodilatation

(Erweiterung der Blutgefäße), Juckreiz, Nesselsucht sowie Gewebeschwellungen durch

Wassereinlagerungen (Ödem) verantwortlich, wobei im schlimmsten Fall ein anaphylaktischer

Schock ausgelöst werden kann. [17] Leukotricine hingegen zählen zu den Mediatoren, die

allergische Symptome langsamer entwickeln lassen, wie z. B. verzögerte asthmatische

Reaktionen [4]. Letztendlich ist die Ausprägung allergischer Symptome hauptsächlich von der

Antigenmenge, der IgE – Konzentration im Körper und der Bindungsaffinität des Antigens

abhängig [17].

20

1.1.5 Allergene & Fischallergen Parvalbumin

Im Allgemeinen handelt es sich bei Lebensmittelallergenen um Substanzen, die mit IgE –

Antikörpern reagieren, eine allergische Sensibilisierung sowie eine allergische Immunantwort

hervorrufen. Letztendlich müssen alle 3 Kriterien durch das Allergen erfüllt werden, sodass die

Bezeichnung „komplettes Allergen“ zutrifft. Im Gegensatz dazu handelt es sich um

„unvollständige Allergene“, wenn die Kriterien lediglich zum Teil erfüllt werden. Dabei

unterscheidet man in „Nicht – Allergieauslöser“, die lediglich mit IgE – Antikörpern reagieren

ohne eine allergische Sensibilisierung oder Immunreaktion auszulösen, und in „Nicht –

Sensibilisierungsauslöser“, die ebenfalls mit IgE – Antikörpern reagieren, jedoch eine allergische

Immunreaktion auslösen, ohne selbst am Sensibilisierungsvorgang beteiligt zu sein. Im Falle der

1. Gruppe („Nicht – Allergieauslöser“) weisen einige pflanzliche und tierische Glykoproteine die

Eigenschaft auf, mit auf den Mastzellen befindlichen IgE – Antikörper zu reagieren, jedoch

bleibt eine Stimulation (Degranulation) der Mastzellen aus, da sie auf Grund ihres monovalenten

Charakters lediglich mit einem Epitop der IgE – Antikörper reagieren und letztendlich keine

Kreuzvernetzung der IgE – Rezeptoren bewirken. Glykoproteine werden auch als Hapten –

Träger – Komplexe bezeichnet, wobei Haptene Substanzen darstellen, die lediglich mit einem

entsprechenden Protein – Trägermolekül allergieauslösend sind. Im Gegensatz dazu sind bei der

2. Gruppe („Nicht – Sensibilisierungsauslöser“) Substanzen durch Kreuzreaktivität in der Lage,

allergische Immunreaktionen zu bewirken, ohne vorher selbst eine IgE – Produktion zu

induzieren. Zum Beispiel existiert eine Kreuzreaktivität zwischen dem Birkenpollenallergen und

dem Apfelallergen. Das Pollenallergen löst dabei den Sensibilisierungsprozess im Organismus

aus, sodass IgE – Antikörper durch Plasmazellen produziert werden. Demnach kommt es bei der

Aufnahme des Apfelallergens zur Kreuzreaktivität zwischen den Bindungsstellen der IgE –

Antikörper auf den Mastzellen und denen des Allergens auf Grund ähnlicher bzw. identischer

Eigenschaften der Epitope vom Pollenantigen und Apfelantigen. In Folge dessen wird die

Degranulation der Mastzelle hervorgerufen und diese initiiert eine allergische

Immunreaktion. [24]

Das Fischallergen Parvalbumin erfüllt die Kriterien eines „kompletten Allergens“ und ist

demnach in der Lage, den Sensibilisierungsprozess sowie die Immunreaktion beim 2. Kontakt

auszulösen [24]. Parvalbumin gehört zur Klasse der tierischen Lebensmittelallergene, im

Speziellen zu den Calcium-bindenden EF – Hand – Proteinen, wobei EF – Hand für eine

spezifische Proteindomäne (Aminosäuresequenz) steht [4]. Auf Grund dieser Struktureigenschaft

besitzt Parvalbumin eine hohe Affinität gegenüber Ca2+ und Mg+. Insbesondere im weißen

Muskelfleisch niederer Wirbeltiere, wie z. B. im Kabeljau, Seelachs oder Flunder, kommt

21

Parvalbumin in höheren Mengen vor. Im Gegensatz dazu tritt Parvalbumin im dunklen (roten)

Muskelfleisch, wie z. B. im Thunfisch oder Schwertfisch, oder in der Skelettmuskulatur höherer

Wirbeltiere in geringeren Konzentrationen auf, sodass im Falle der genannten Fischarten ein

geringeres allergisches Potential besteht. Des Weiteren ist Parvalbumin insbesondere am Prozess

der Muskelentspannung beteiligt, da es Ca2+ Ionen zwischenspeichert und von den Myofibrillen

(Funktionseinheit in Muskelzelle) zum Sarkoplasmatischen Retikulum transportiert. Dort erfolgt

die Speicherung der Ca2+ Ionen, sodass beim Eintreffen eines Aktionspotenzials die Ionen erneut

in die Myofibrillen diffundieren und die Muskelkontraktion auslösen. [10] Generell ist die

Parvalbuminstruktur in verschiedenen Fischarten sehr ähnlich bzw. als homolog anzusehen,

sodass eine Kreuzreaktivität der IgE – Antikörper gegenüber unterschiedliche Fischarten besteht.

Zudem wurde festgestellt, dass sich die Parvalbumin Isotypen unter den Fischen einer Art

unterscheiden, wobei diese differenzierte Expression der Parvalbumin Isotypen auf die

entsprechenden physiologischen Anforderungen während der Wachstumsphase zurückzuführen

ist. [25] Anhand von Abbildung 7 soll die Parvalbuminstruktur, insbesondere das EF – Hand –

Motiv, näher erläutert werden.

Abbildung 7: Karpfenparvalbumin mit 2 Calcium-bindenden Seiten (lila markiert)

(Breiteneder, 2005, S. 16)

22

Wie bereits im Vorfeld erwähnt, gehört Parvalbumin zur Calcium – bindenden Proteinfamilie der

EF – Hand. Hinter dieser Bezeichnung verbirgt sich der strukturelle Aufbau einer Calcium –

bindenden Domäne die aus 2 α – Helix besteht, die über eine β – Schleife (Calcium – bindend)

miteinander verbunden sind. Dabei stellt das EF – Hand – Motiv, auch als Helix – Turn – Helix

– Motiv (HTH) bezeichnet, ein sekundäres Proteinstrukturelement dar. Des Weiteren handelt es

sich bei den EF – Hand Proteinen um die ersten intrazellulären Calcium – bindenden Proteine,

die identifiziert und charakterisiert worden sind, zumal neben Parvalbumin ebenfalls Troponin C

(in Skelett – und Herzmuskel), Calbindin (Transportprotein) oder die Leichte – Myosinkette

(Motorprotein z. Bewegungserzeugung) in diese Kategorie gehören. [26] Das Fischallergen

Parvalbumin setzt sich aus 3 EF – Hand – Motiven zusammen, wobei 2 dieser Motive

(Motivdomänen) Calcium – bindend und in Abbildung 7 lila gefärbt sind. Das 3. EF – Hand –

Motiv im Parvalbumin stellt eine „inaktive Domäne“ dar, die eine Art Schutzkappe bildet und

die hydrophobe Oberfläche der beiden aktiven Domänen abdeckt. Auf Grund seiner Struktur und

den daraus resultierenden chemischen Eigenschaften weist das Fischallergen eine hohe Resistenz

gegenüber Hitze, chemischer Denaturierung sowie proteolytischem Enzymabbau auf. [27]

Außerdem wurde festgestellt, dass Parvalbumin selbst nach Hitzeeinwirkungen von 90°C seine

Struktur nur teilweise verliert bzw. die Strukturveränderung reversibel ist, sodass das allergische

Potenzial bestehen bleibt. Besonders für von einer Fischallergie betroffene Allergiker ist dieser

Umstand sehr kritisch, da es keine effiziente Möglichkeit gibt, Parvalbumin vollständig zu

inaktivieren. [28] Des Weiteren besitzt Parvalbumin ein geringes Molekulargewicht zwischen 10

– 12 kDa, weist eine hohe Wasserlöslichkeit auf und der Isoelektrische Punkt liegt im Bereich

3,9 (Karpfen) – 6,6 (Lungenfisch) [10] [26].

1.1.6 Rechtliche Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht von Allergenen

Allergiker müssen bei der Nahrungsaufnahme darauf achten, dass die von ihnen verzehrten

Produkte keine Lebensmittelallergene enthalten, da bereits geringe Spuren der entsprechenden

Substanzen lebensbedrohliche Immunreaktionen auslösen können. Im Fall einer Fischallergie

haben Untersuchungen ergeben, dass bereits Immunreaktionen bei 1 mg Fischprotein / kg

Nahrungsmittel verursacht werden, wobei die allergieauslösenden Proteinkonzentrationen unter

Allergikern stark schwanken (1mg/kg – 100mg/kg), da genetische und physiologische Faktoren

einen signifikanten Einfluss darauf haben [29]. Demnach sind Allergiker bei der

Lebensmittelauswahl auf die eindeutige Kennzeichnung von allergenenthaltenden Lebensmitteln

23

durch die Lebensmittelhersteller angewiesen, wobei die rechtlichen Grundlagen durch den

Gesetzgeber bestimmt werden müssen.

Die Grundlage für die Kennzeichnung von Lebensmitteln bildet die Richtlinie 2000/13/EG vom

20. März 2000 „zur Angleichung der Rechtsvorschriften der Mitgliedsstaaten über die

Etikettierung und Aufmachung von Lebensmitteln, sowie die Werbung hier“. Des Weiteren wird

die Allergenkennzeichnung durch diese Richtlinie und insbesondere durch die entsprechenden

Änderungen in den Richtlinien 2003/89/EG vom 10.11.2003, 2006/142/EG vom 22.12.2006 und

2007/68/EG vom 27.11.2007 geregelt. Im Anhang IIIa der Richtlinie 2003/89/EG wurden 12

Produktgruppen aufgelistet, die eine allergische Immunreaktion auslösen, weshalb diese

Produkte sowie die daraus hergestellten Lebensmittel kennzeichnungspflichtig sind. Im weiteren

Verlauf wurden diese Produktgruppen in der Richtlinie 2006/142/EG um die Gruppen Lupine

und Weichtiere (Krebstiere) ergänzt, wobei diese im Anhang IIIa der Richtlinie 2007/68/EG

aufgeführt werden und ebenfalls als kennzeichnungspflichtig einzustufen sind. Die von der EU

erlassenen Richtlinien mit den jeweiligen Vorgaben wurden in die deutsche

Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV) aufgenommen. Damit ist die Allergenkenn-

zeichnung für die Lebensmittelindustrie seit 2005 gesetzmäßig festgelegt. Dadurch soll der

Verbraucherschutz erhöht und insbesondere Personen, die an einer Lebensmittelallergie bzw.

Lebensmittelunverträglichkeit leiden, besser über Produktinhaltsstoffe informiert werden. [9]

Problematisch ist jedoch, dass es keine gesetzlichen Grenzwerte für Allergene der 14

Produktgruppen gibt, Gluten (20 mg/kg) und Sulfit (10 mg/kg) ausgeschlossen, da die

wissenschaftlichen Daten zu allergieauslösenden Lebensmitteln noch unzureichend sind, um

fundierte Schwellenwerte zu definieren. Diesbezüglich wurden durch das BfR und MRI

verschiedene internationale Modelle, wie z. B. das australische VITAL – Konzept oder das

ECARF – Konzept, hinsichtlich der Festlegung von Schwellenwerten zur Allergenkenn-

zeichnung überprüft und als unzureichend bewertet, da die wissenschaftliche Datenlage derzeit

nicht ausreicht und demnach weitere Forschungen notwendig sind. Im Falle einer zwingend

erforderlichen Festlegung von vorläufigen Schwellenwerten empfiehlt das BfR und MRI nach

derzeitiger wissenschaftlicher Lage einen allergenspezifischen Bereich von 0,01% - 0,001%

allergener Inhaltsstoff pro fertigem Lebensmittel zu definieren. [29]

Eine weitere Problematik sind Kreuzkontaminationen im Herstellungsprozess, z. B. durch den

Einsatz kontaminierter Rohstoffe oder durch Verschleppung auf Grund unzureichender

Reinigungsmaßnahmen, nicht in den Richtlinien berücksichtigt worden. Generell sind

Kreuzkontaminationen nach heutigem Stand der Technik bei der industriellen Herstellung nicht

vermeidbar, wodurch der Hersteller keine 100% allergenfreien Produkte deklariert, sofern eine

24

Kreuzkontamination bei den jeweiligen Produkten nicht ausschließbar ist. Z. B. sind geringe

Spuren von Nüssen in Vollmilchschokolade nicht auszuschließen, wenn in dem Betrieb

Schokoladenprodukte mit Nüssen hergestellt werden. Deshalb gibt es auf vielen Packungen die

freiwilligen und vorsorglichen Warnhinweise „Kann Spuren von…enthalten“ oder „Spuren:…“,

sodass letztendlich die rechtliche Haftung des Produzenten beschränkt wird. Grund dafür ist,

dass der Lebensmittelhersteller für fehlerhafte oder falsche Allergenkennzeichnungen auf

Verpackungen, die eine Gesundheitsschädigung des Verbrauchers zur Folge haben, haftet,

soweit der Verbraucher die Kennzeichnungsfehler beweisen kann. Rechtlich relevant ist in

diesem Falle das Produkthaftungsgesetzt, insbesondere §3 Abs. 1 a, der Produktfehler im Sinne

der fehlerhaften Darbietung einer Allergenkennzeichnung beinhaltet, zu denen auch

Warnhinweise zählen, die nicht den gesetzlichen Anforderungen entsprechen. [9] Dabei spielt

insbesondere die aktuelle EU – Verordnung Nr. 1169/2011 vom 22.11.2011 eine entscheidende

Rolle, da sie die Allergenkennzeichnung auf europäischer Ebene neu regelt, wobei z. B.

allergieauslösende Inhaltsstoffe im Zutatenverzeichnis besonders hervorgehoben werden müssen

(z. B. durch Schriftart oder Farbe). Zudem muss zukünftig auch unverpackte Ware (z. B.

Bedienthekenbereich) entsprechend gekennzeichnet werden. [30] Grundsätzlich meiden

Allergiker jedoch Verpackungen, die mit entsprechenden Warnhinweisen gekennzeichnet sind,

zumal die vorsorgliche Deklaration durch die Hersteller steigt. Einerseits wird dadurch die

Auswahl an Lebensmitteln für betroffene Personen immer geringer und andererseits verliert die

Industrie potentielle Käufer für ihre Produkte, wodurch Umsatzeinbußen entstehen. [9]

1.2 Immunchromatographische Anaylseverfahren

1.2.1 Allgemein

Zur Kategorie der immunologischen Testverfahren zählen, neben dem LFA, auch ELISA oder

die SPR Biosensoren (SPR Immunoassay). Im Allgemeinen basieren diese Testverfahren auf der

Wechselwirkung zwischen einem selektiven Antikörper und dem jeweiligen Zielanalyten

(Antigen), wobei diese zusammen einen Antigen – Antikörper – Komplex bilden. Die

immunologische Reaktion kann dabei z. B. über Enzymmarkierungen (Meerrettichperoxidase,

alkalische Phosphatase) im Fall des ELISA – Verfahrens oder durch Radionuklide (I125) im Fall

des radioimmunologischen Verfahrens sichtbar gemacht werden. Neben den genannten

Markierungsmöglichkeiten existiert eine Vielzahl weiterer Visualisierungsmethoden, wie z. B.

Fluoreszenzpolarisation, Chemolumineszenz oder elektrochemische Detektionsmethoden

(Impedanzmessung) im Fall von SPR – Biosensoren. Grundsätzlich unterscheidet man die

25

immunologischen Verfahren in heterogene und homogene Immunassays. Bei den heterogenen

Analyseverfahren wird ein Immunreagenz auf einer Festphase, wie z. B. Latexkugeln,

Magnetpartikeln, Mikroplatten, Teströhrchen oder Filterpapier, immobilisiert und anschließend

erfolgt durch einen Waschschritt die Trennung gebundener und freier Reagenzien. Im Gegensatz

dazu findet die Immunreaktion bei homogenen Immunassays in Lösung statt, wodurch kein

weiterer Waschschritt notwendig ist. Die Störanfälligkeit der homogenen Reaktion ist jedoch auf

Grund von Matrixinterferenzen höher. [31]

Die einzigartige Charakteristik der immunologischen Testverfahren wird durch 3 entscheidende

Antikörpereigenschaften geprägt. Eine dieser Eigenschaften ist die hohe Bindungsspezifität des

Antikörpers gegenüber den jeweiligen Antigenen, sodass in Anwesenheit verschiedener

Substanzen die Zielanalyten selbst in sehr geringen Konzentrationsbereichen

(10-12 [pg]) detektierbar sind. Zudem existiert zwischen Antikörpern und Antigenen eine hohe

Bindungsstärke (nicht – kovalente Bindung), die dazu beiträgt, dass die gebildeten Komplexe die

Signalentwicklung bzw. das Testverfahren überstehen und demnach sehr präzise im niedrigen

Konzentrationsbereich gearbeitet werden kann. Zusätzlich ist das weite Bindungsspektrum der

Antikörper sehr vorteilhaft, da diese in der Lage sind, an die unterschiedlichsten Chemikalien

(natürliche/künstliche), Biomoleküle, Zellen oder Viren zu binden. Auf Grund dieser Tatsachen

ist die Bindungskinetik von Antikörper – Antigen Wechselwirkungen für die

immunchromatographischen Testverfahren sehr wichtig, da sie ausschlaggebend für die

Entwicklung effizienter Analyseverfahren ist. Dabei beeinflussen verschiedene Faktoren, wie z.

B. der pH – Wert, Temperatur, Reaktionszeit oder Pufferkonzentration (Ionenstärke) diese

Gleichgewichtsreaktion. [22]

Im Allgemeinen sind für analytische Methoden, insbesondere bei denen, die für den Nachweis

gesundheitsschädigender Substanzen in Lebensmitteln eingesetzt werden, z. B. zum Nachweis

von Allergenen, Pestiziden oder Mykotoxinen, die aufgeführten Faktoren essentiell:

zufriedenstellende Sensitivität - Detektionsbereich mg/kg - μg/kg

ausreichende Spezifität - Detektion in komplexen Matrizen

schnelle Detektion - kurze Analysezeit

einfache Handhabung - keine Fachleute notwendig

Die existierenden immunologischen Testverfahren erfüllen die Anforderungen zum großen Teil,

jedoch ist insbesondere der Faktor der einfachen Handhabung problematisch, da sehr häufig

geschultes Fachpersonal zur Durchführung notwendig ist. Im Fall von forschungsunabhängigen

26

Anwendungen also für den „Heimgebrauch“ oder für industrielle Anwendungszwecke („Vor –

Ort – Schnelltests, z. B. zur Verbesserung des Verbraucherschutzes oder zur Einhaltung der

Qualitätsanforderungen, sind viele immunologische Testverfahren ungeeignet. [4]

1.2.2 Lateral Flow Assay

Das immunchromatographische Testverfahren Lateral Flow Assay erfüllt die im Vorfeld

aufgeführten Anforderungen und zeichnet sich zusätzlich durch eine hohe Zuverlässigkeit und

geringe Kosten aus. Grundsätzlich basiert das LFA – Verfahren auf spezifischen

Wechselwirkungen zwischen Antikörper – Antigen, wobei die Visualisierung des

Testergebnisses über den Einsatz von Markern realisiert wird. Dabei handelt es sich vorwiegend

um farbige oder fluoreszierende Nanopartikel, wie z. B. kolloidales Gold, Latex, Karbon oder

Liposome. Letztendlich handelt es sich beim LFA um Teststreifen, die aus einem Trägermaterial

bestehen, auf dem verschiedene Antikörper (sAK, pAK, IgG) immobilisiert sind, wobei der

Teststreifen durch das Auftragen der flüssigen Probe aktiviert wird. Die LFA – Methode wird für

qualitative sowie semiquantitative Nachweise als Vor – Ort – Schnelltest in vielen

Einsatzbereichen angewendet, wie z. B. zum Nachweis von Pathogenen, Hormonen

(Schwangerschaftstest), Drogen, Metaboliten in der Medizin oder Allergenen (Erdnussprotein

etc.) in der Lebensmittelbranche. [32]

27

2. Material & Methoden

2.1 Chemikalien & Equipment

Für die Experimente zur Entwicklung eines LFA zum Nachweis von Fischallergenen werden die

im Anschluss aufgeführten Chemikalien und Geräte verwendet.

2.1.1 Chemikalien

Zur Herstellung der jeweiligen Pufferlösungen werden die folgenden Reagenzien verwendet:

Sodium tetraborate, Lot. A0237931, ACROS Organics, USA

Natriumhydrogenphosphat, Lot. A925646638, Merck, Germany

Di – Natriumhydrogenphosphat, Lot. F529186905, Merck, Germany

Natriumchlorid, Lot. 161169881, Carl Roth GmbH, Germany

Natronlauge 0,1 M, Lot. 0638/08/10, Carl Roth GmbH, Germany

Bei der Herstellung aller weiteren benötigten Lösungen werden folgende Chemikalien

eingesetzt:

Succrose, Lot. 1260903, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland

Dextran 35, Lot. 3707873, Carl Roth GmbH, Germany

BSA (further purified fraction V), Lot. 027K0740, SIGMA –Aldrich Inc., USA

Casein Sodium Salt, Lot. 10K0198, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH,

Switzerland

Tween 20, Lot. BCBF7669V, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland

Polyvinylpyrrolidone (PVP), Lot. 013K0049, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH,

Switzerland

Natriumazid, Lot. 25358170, Carl Roth GmbH, Germany

Kaliumcarbonat, Lot. A258946657, Merck, Germany

Kolloidale Goldlösung ø 40 nm (OD 1,1), Lot. 8818, BB International, UK

Bradford Reagent, Lot. 116K433J, SIGMA – Aldrich Chemie GmbH, Switzerland

28

2.1.2 Puffer & Lösungen

Während der Experimente werden die aufgeführten Pufferlösungen verwendet:

5 mM Boraxpuffer (pH 9,0)

100 mM PBS (pH 7,4)

40 mM PBS (pH 7,4)

100 mM PB (pH 7,4)

10 mM PB (pH 7,0)

Für die Herstellung des 5 mM Boraxpuffers (pH 9,0) wird Sodium tetraborate in destilliertem

Wasser gelöst und anschließend der pH – Wert mit 0,1 M Natronlauge auf 9,0 eingestellt. Die

Herstellung des 100 mM PBS (pH 7,4) erfolgt durch das Mischen von Natrium-

hydrogenphosphat und Di – Natriumhydrogenphosphat. Dabei werden zunächst separat 13,9 g

des einbasischen Natriumhydrogenphosphats in 500 ml destilliertem Wasser und 28,4 g des

zweibasischen Di – Natriumhydrogenphosphats in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst.

Anschließend werden 600 ml destilliertes Wasser mit 48 ml einbasischer Lösung und 252 ml

zweibasischer Lösung kombiniert, sodass 100 mM PB (pH 7,5) entsteht. Durch die Zugabe von 8

g NaCl auf 1000 ml PB (pH 7,5) bildet sich 100 mM PBS (pH 7,4). Bei der Herstellung des 10

mM PB wird zunächst 100 mM PB (pH 7,0) durch das Mischen von 600 ml dest. Wasser mit

117 ml einbasischer Lösung und 183 ml zweibasischer Lösung hergestellt. Anschließend erfolgt

die Verdünnung mit Reinstwasser auf 10 mM PB (pH 7,0). Alle hergestellten Pufferlösungen

werden mit Filterpapier (ø 0,45 μm, Schleicher & Schnell, Lot.: DC 0406-1) gefiltert.

Während der Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats werden die aufgeführten

Lösungen verwendet:

100 mM Kaliumcarbonatlösung (pH 11,2) in Reinstwasser

10% BSA in 5 mM Boraxpuffer (pH 9,0)

Des Weiteren werden die folgenden Lösungen zur Vorbehandlung der einzelnen LFA –

Komponenten eingesetzt:

Membranblocker:

o 5% Succrose in 10 mM PB – Puffer (pH 7,0)

o 1% BSA in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)

o 1 % PVP in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)

29

o 2% Casein in 100 mM PBS – Puffer (pH 7,4)

Konjugatpad:

o 0,5% Casein + 0,5 % Tween 20 in 100 mM PBS (pH 7,4)

o 0,5 % BSA + 0,2% Tween 20 in 40 mM PBS (pH 7,4)

o 5% Succrose + 1% BSA + 0,5% Tween 20 in 40 mM PBS (pH 7,4)

Sample Pad:

o 5% Succrose + 5 % Dextran + 0,5% Tween 20 + 0,05% Natriumazid

2.1.3 Antikörper

Es werden für die Untersuchungen monoklonale Antikörper eingesetzt, die gegen Parvalbumin

aus Kabeljau gerichtet sind. Die Antikörper werden bereits aufgereinigt von der BIOMETEC

GmbH Greifswald bezogen. Dabei handelt es sich um die aufgeführten monoklonalen

Antikörper:

Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111

Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111

Wi 11 – 3D12G7 [1,9 mg/ml] in 0,01% Thiomersal Lot. Ch100111

Außerdem wird der polyklonale Antikörper für die Experimente verwendet:

Host: Goat – Anti [2 mg/ml]

Antigen: Mouse IgG (H+L)

Label: unconjugated

Lot. OE1714962, Thermo Scientific, IL61101, USA

2.1.4 Fischproben

Die Fischproteine werden aus tiefgefrorenem Kabeljau (Lot. L161/3), Alaska Seelachs (Lot.

417/3B) und Hering isoliert. Der Fisch stammt von Frigofood International Sarl 27, Luxemburg.

2.1.5 LFA – Komponenten

Für die Durchführung des Lateral Flow Assay werden die im Anschluss aufgeführten

Komponenten eingesetzt, wobei alle Materialen von der Millipore – Corporation, Bedford, MA

01730, USA, stammen:

30

Membran:

o HIFLOW Plus 75 Membran; Lot. 0035621

o HIFLOW Plus 090 Membran; Lot. R2PN90542



o HIFLOW Plus 240 Membran; Lot. 0050819X07081

Konjugatpad:

o Glass Fiber Conjugate Pad; Lot. 92083401

Sample Pad:

o Cellulose Fibre Sample Pad; Lot. 92054701

Absorbentpad:

o Absorbent Pad GF/DVA 17 x 300 mm; Lot. 580896-2

o Absorbent Pad CF6 27 x 300 mm; Lot. 655959-1

2.1.6 Geräte

Während der Durchführung der Experimente kommen die nachfolgend aufgeführten

Gerätschaften zum Einsatz:

Horizontal – Schüttler (Heidolph Polymax 1040)

Spektralfotometer (1510 Thermo Scientific Multiskan Go)

Laborzentrifuge (3K30 SIGMA)

Trockenschrank (Heraeus Instruments UT 20)

Reinstwassersystem Clear UV Plus (SG Wasseraufbereitung & Regenerierstation)

Vortexer (Heidolph Reax top)

Magnetrührer (Variomag)

pH – Meter (pH 720 WTW Series inoLab)

Waage (BP210S Sartorius)

Universal – Zerkleinerer (KRUPS, Speedy Plus Universal Zerkleinerer)

2.2 Lateral Flow Assay

Die immunchromatographische Methode Lateral Flow Assay wird, wie bereits unter Punkt 1.2.2

beschrieben, auf Grund seiner positiven analytischen und praktikablen Eigenschaften in vielen

Anwendungsgebieten eingesetzt. Insbesondere in der Lebensmittelindustrie weckt die Methode

31

erhöhtes Interesse, da sie als Vor – Ort – Schnelltest zur Erstuntersuchung von Chargen auf

Kontaminationen (Allergene, Toxine) eingesetzt werden kann. [33]

2.2.1 Aufbau

Ein Lateral Flow Assay setzt sich generell aus 5 unterschiedlichen Komponenten zusammen, die

für die korrekte Funktionalität genau aufeinander abgestimmt sein müssen. Bei den 5

Komponenten handelt es sich um:

1. Sample Pad

2. Konjugatpad

3. Membran

4. Test – und Kontrolllinie

5. Absorbentpad

Anhand von Abbildung 8 soll der allgemeine Aufbau eines LFA – Teststreifen dargestellt und

die Funktionen der einzelnen Komponenten näher erläutert werden. [4]

Abbildung 8: Aufbau eines LFA - Teststreifen (www.rapid-diagnostics.org, 05.08.2013)

Das Sample Pad befindet sich über dem Konjugatpad, besteht aus einem papierartigen Material

und dient zur Probenfilterung, d. h. es soll sämtliche Feststoffe (Lebensmittelpartikel etc.)

zurückhalten, die einen negativen Einfluss auf die Kapillarkräfte ausüben [4]. Des Weiteren

dient das Sample Pad als Zwischenspeicher für die Probe, um diese zum Konjugatpad zu

befördern und dort gleichmäßig zu verteilen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass Sample

Pad mit verschiedenen Substanzen, wie z. B. Proteinen, Tensiden, Puffern oder Zuckern, zu

32

behandeln, um die Flussrate (Flow) zu beeinflussen. Derartige Behandlungen bewirken eine

Verbesserung der Probenviskosität oder der Reaktionszeit zwischen Zielanalyten (Antigenen)

und dem Antikörper – Nanogoldkomplex auf dem Konjugatpad. [32]

Ein weiterer Bestandteil des LFA ist das Konjugatpad (Conjugate Pad), welches sich unterhalb

des Sample Pads befindet und ca. 2 mm überlappend auf der Membran (Nitrocellulose

membrane) ist. Das Konjugatpad besteht aus fiberglasartigem Material, auf das der markierte

sekundäre Antikörper (Antikörper – Konjugat) aufgetragen wird. Dabei kann das Auftragen des

Konjugats entweder über Sprühen erfolgen, was eine wohldefinierte und reproduzierbare

Konjugatmenge pro mm² ergibt, oder durch „Baden“ geschehen, was eine unkontrollierte

Konjugatmenge pro mm² bewirkt und Intensitätsschwankungen der Test – und Kontrolllinie zur

Folge haben kann. [4] Als Antikörper – Marker (Label) wird hauptsächlich kolloidales Gold

eingesetzt, gefolgt von gefärbten Latexpartikeln. Außerdem kommen gefärbte Karbon – oder

Selenpartikel zum Einsatz, wobei chemilumineszierende oder fluoreszierende Nanopartikel

selten verwendet werden. Die kolloidale Stabilität der Nanopartikel in Lösung spielt eine

entscheidende Rolle für die Funktionalität des LFA – Teststreifens. Diese wird erreicht, indem

die Antikörper auf der Oberfläche der Nanogoldpartikel binden. [32] Die Ursache dafür ist, dass

Proteine, insbesondere Antikörper, dazu in der Lage sind, an der Oberfläche der kolloidalen

Goldpartikel (Nanopartikel) stark zu adsorbieren, sodass stabile Konjugate gebildet werden

können, wobei die Antikörper (Proteine) ihre biologischen Eigenschaften behalten. Die

Proteinadsorbtion an der Goldoberfläche ist eine nicht kovalente Bindung, die einerseits auf

ionischen Wechselwirkungen zwischen negativ geladenen Nanopartikeln und positiv geladenen

Proteinstellen basiert und andererseits durch hydrophobe Anziehungskräfte zwischen dem

Protein und der Metalloberfläche zu Stande kommt. Des Weiteren haben koordinative

Bindungen zwischen dem Metall und den leitfähigen Stickstoff – und Schwefelatomen der

Antikörper (Proteine) einen Einfluss auf die Ausprägung der nicht kovalenten Bindung. Die

Problematik bei den sogenannten Biokonjugaten (Nanopartikel – Protein) ist, dass diese auch an

anderen Systembestandteilen bzw. Stoffen mit hoher Affinität adsorbieren können und dadurch

unerwünschte Bindungen (nicht spezifisch) eingehen. Auf Grund dieser Tatsache werden die

Biokonjugate zusätzlich mit „trägen“ (inerten) Makromolekülen, wie z. B. BSA (Bovine Serum

Albumin), Gelatine oder Polyethylen Glykol, nach der Adsorption der Antikörper (Proteine)

stabilisiert. [34] Weitere wichtige Faktoren für die Konjugatbildung sind die

Pufferzusammensetzung, Pufferstärke und der pH – Wert der Lösung sowie die Größe der

Nanopartikel, im Falle von kolloidalem Gold 15 – 40 nm [32].

33

Die Membran ist die zentrale Komponente des LFA und stellt mit den wichtigsten Teil des

immunchromatographischen Systems dar, da einerseits auf ihr die Test – und Kontrolllinie

immobilisiert sind und andererseits ihre Materialeigenschaften die Signalerzeugung maßgebend

beeinflussen. Auf Grund seiner positiven Eigenschaften wird vorwiegend Nitrozellulose als

Membranmaterial eingesetzt, wobei auch andere Materialen, wie z. B. Nylon, Polyethersulfon

oder Polyethylen zum Einsatz kommen. Eine der vorteilhaften Eigenschaften von Nitrozellulose

ist das hohe Vermögen, Proteine (Antikörper) zu adsorbieren. Zunächst sind Wechselwirkungen

zwischen den Nitrogruppen (funktionelle Gruppe -NO2) des Polymers und den Carbonylgruppen

(funktionelle Gruppe –CO) der Peptidbindung (Protein) ausschlaggebend für die anfängliche

Anziehungskraft. Die Adsorption wird anschließend über weitere Wechselwirkungen zwischen

der Nitrozellulose und den hydrophoben Proteindomänen verstärkt. Im Fall vom IgG –

Antikörper (Kontrolllinie) beträgt die Bindungskapazität z. B. 100 μg/cm², was sehr hoch ist, da

in der Regel lediglich 1 – 2 μg/cm aufgetragen werden. Zusätzlich erhält die Nitrozellulose-

membran die biologische Aktivität der gebundenen Proteine über einen langen Zeitraum, wobei

diesbezüglich Pufferzusammensetzungen einen größeren Einfluss haben. Ein weiterer Vorteil

von Nitrozellulosemembranen sind die Oberflächeneigenschaften, da diese sehr glatt

(geschmeidig) sind und deshalb die Antikörper der Test – und Kontrolllinie sehr gut aufgetragen

werden können. Hingegen bewirken raue Strukturen ein unregelmäßiges Auftragen der Linien

auf die Membranoberfläche, sodass eine ungleichmäßige Signalerzeugung während des Tests die

Folge sein kann. In der Regel wird das Membranmaterial auf Grundlagen bestehend aus

Polypropylen, Polyethylen oder Polystyrol zur Verbesserung der Stabilität und Festigkeit

geklebt. Die jeweilige Grundlage hat jedoch keinen Einfluss auf die Reaktionen während der

LFA – Durchführung. [35] Ausschlaggebend für die kapillare Fließgeschwindigkeit (s/cm)

sprich die Zeit, welche die Flüssigkeitsfront (Probe – Antikörper – Konjugat) benötigt, um sich

im Membranmaterial zu bewegen, ist die Porengröße. Diese beeinflusst maßgeblich die

Reaktionszeit und somit auch die Sensitivität des Tests [4].

Die Test – und Kontrolllinie sind auf der Membran immobilisiert, wobei die Testlinie vor der

Kontrolllinie positioniert wird. Bei der Testlinie handelt es sich um den primären Antikörper

(Fänger – Antikörper), der lediglich die Zielanalyten (Antigene) bindet bzw. detektiert, die am

sekundären Antikörper (goldmarkierter Antikörper) gebunden sind. Die Positionierung der

Testlinie auf der Membran beeinflusst die Leistungsfähigkeit des LFA – Tests, da eine weitere

Entfernung der Testlinie vom Sample Pad / Konjugatpad eine längere Reaktionszeit für die

Bildung des Antigen – Antikörper (sekundärer) – Nanogoldkomplexes zur Folge hat. Dabei ist

zu beachten, dass die Fließgeschwindigkeit mit zunehmender Distanz abnimmt. Die

34

Kontrolllinie stellt ebenfalls einen Antikörper dar, in der Regel einen IgG – Antikörper, der

sämtliche Proteinmoleküle, wie z. B. den goldmarkierten sekundären Antikörper, bindet.

Demnach wird anhand der Kontrolllinie die Funktionalität des LFA überprüft. Die letzte

Komponente eines LFA ist das Asorbentpad, welches am Ende des Teststreifens, ca. 2 mm

membranüberlappend, positioniert ist und den Abtransport der Flüssigkeit übernimmt. Deshalb

besteht es hauptsächlich aus mehrschichtiger Cellulose mit einer hohen Saugfähigkeit, sodass

viel Feuchtigkeit durch die Kapillarwirkung aufgenommen werden kann. Durch das

Vorhandensein eines Absorbentpads kann ein höheres Probenvolumen eingesetzt werden,

wodurch sich die Sensitivität verbessert. [32]

2.2.2 Funktionsprinzip

Beim LFA existieren grundsätzlich 2 Funktionsprinzipien, die je nach Anwendungsbereich

eingesetzt werden. Das erste Prinzip wird als Kompetitiver LFA bezeichnet, bei dem sich die

Signalentwicklung verschlechtert, je höher die Konzentration der Zielanalyten in einer Probe ist.

Dabei korreliert die Verschlechterung des Signals mit der Konzentrationszunahme an

Zielanalyten. [32] Normalerweise wird dieses Format zur Detektion von Hormonen oder

Pestiziden eingesetzt, da diese von geringer molekularer Größe sind. Es existieren jedoch auch

derartige Formate zum Nachweis von Allergenen. [4]

Das zweite LFA – Prinzip wird als Sandwich – Format bezeichnet und kommt bei Analyten zum

Einsatz, die mehr als ein Epitop für Antigen – Antikörper – Interaktionen besitzen. Es ist

ebenfalls Grundlage der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen und wird

deshalb näher erläutert. Abbildung 9 soll dabei zur Verdeutlichung der Abläufe im LFA

Sandwich – Format dienen.

35

Abbildung 9: Funktionsprinzip des LFA Sandwich – Formats (www.lequanbio.com,

11.09.2013)

Im ersten Schritt erfolgt die Probenaufgabe auf das Sample Pad, wobei die aufgebebenen

Volumina zwischen 150 – 250 μl liegen. Die Probe läuft anschließend durch das Sample Pad

zum Konjugatpad, wo sich die goldmarkierten sekundären Antikörper befinden. Diese sind

spezifisch gegen ein Epitop des Zielanalyten gerichtet und binden sich an jenen. In diesem

Zusammenhang ist die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit entscheidend, sodass ausreichend

Reaktionszeit für die Bindung zwischen sekundärem Antikörper und Antigen vorhanden ist, da

der kapillare Fluss durch die Membran sofort nach der Probenaufgabe einsetzt. Des Weiteren

muss beachtet werden, dass das Konjugatpad mit der Membran überlappt, sodass der

Kapillarfluss überhaupt zu Stande kommt. Im weiteren Verlauf bindet der Antigen – Antikörper

– Goldkomplex an den primären Antikörper (Testlinie), der auf der Membran immobilisiert ist

und spezifisch gegen ein anderes (freies) Epitop des Zielanalyten gerichtet ist, d. h. die beiden

Antikörper (sAK / pAK) konkurrieren nicht um dasselbe Epitop. Dadurch erfolgt die Anlagerung

der goldmarkierten Komplexe an die Testlinie, was zur Bildung einer roten Linie führt. Die

Signalstärke (Intensität der Färbung) ist direkt proportional zur Antigenkonzentration in der

Probe. In diesem Fall ist die Fließgeschwindigkeit erneut ein wichtiger Faktor für die

36

Reaktionszeit und Testsensitivität. An den auf der Kontrolllinie befindlichen IgG – Antikörper

binden die goldmarkierten Antikörper ohne Antigen, sodass sich die Kontrolllinie in Folge der

Anlagerung ebenfalls rot verfärbt. Dabei ist zu beachten, dass immer ein Überschuss an

goldmarkierten sekundären Antikörpern präsent sein muss. Dadurch wird gewährleistet, dass

einerseits ausreichend Antigen – Antikörper – Komplexe gebildet werden können, um sich am

primären Antikörper anzulagern und andererseits noch genügend freie sekundäre Antikörper

vorhanden sind, um sich an der Kontrolllinie anzusammeln. In diesem Fall bestätigt die

Kontrolllinie diesen Überschuss und garantiert, dass der Test funktioniert. Letztendlich gibt es 3

mögliche Testergebnisse, die durch die jeweilige Linienbildung angezeigt werden und anhand

von Abbildung 10 näher erläutert werden sollen. [32] [36]

Abbildung 10: Mögliche Testergebnisse eines LFA Sandwich - Format (Koppelmann 2006,

S. 179)

Die in Abbildung 10 dargestellten Teststreifen zeigen 3 verschiedene Testergebnisse, wobei zu

erwähnen ist, dass die Teststreifen in diesem Fall eingehaust sind und diese Form die

kommerziell erwerblichen darstellt. Teststreifen a zeigt ein positives Ergebnis, d. h., dass

Zielanalyten in der Probe präsent sein müssen. Dabei bestätigt die Kontrolllinie, dass der Test

korrekte Resultate liefert. Hingegen zeigt Teststreifen b ein negatives Ergebnis, da keine

Testlinie zu sehen ist und demnach keine Antigene in der Probe sind. In diesem Fall bestätigt

ebenfalls das Vorhandensein der Kontrolllinie, dass der Test funktioniert. Teststreifen c zeigt ein

ungültiges Ergebnis, da keine der beiden Linien gebildet wurden und der Test somit nicht

37

ordnungsgemäß abgelaufen ist. Zudem handelt es sich ebenfalls um ein ungültiges Ergebnis,

wenn eine Testlinie vorhanden ist, jedoch keine Kontrolllinie angezeigt wird. [4]

2.3 Versuchsvorbereitung

In diesem Abschnitt soll die Vorgehensweise geschildert werden, die notwendig ist, um einen

LFA im Sandwich – Format zum Nachweis von Fischallergenen durchzuführen. Die im Rahmen

dieser Arbeit angestellten Untersuchungen berücksichtigten die entsprechenden Punkte.

2.3.1 Fischprobenaufbereitung

Die Proben der Fischarten Kabeljau, Alaska Seelachs und Hering werden aufgetaut und anschlie-

ßend im Universal – Zerkleinerer homogenisiert, sodass die Muskelstrukturen zerstört werden.

Anschließend erfolgt die Zugabe von 250 ml 100mM PB – Puffer (pH 7,0) zu je 500 g der

entsprechenden Fischproben. Auf Grund der Tatsache, dass Parvalbumin ein hitzestabiles

Protein (bis 90°C) ist, werden die Proben bei 80°C 30 Minuten lang erhitzt, sodass die

hitzeempfindlichen Proteinstrukturen denaturieren und ausfallen. Im Anschluss daran werden die

Proben abgekühlt und für 20 min. bei 4°C mit 12.000 rpm zentrifugiert, sodass die denaturierten

Proteine sowie andere Partikel vom hitzestabilen Parvalbumin getrennt werden. Nach dem

Zentrifugieren wird der Überstand sorgfältig abgenommen, gefiltert und bei -20°C bis zur

weiteren Verwendung gelagert. [28] [37]

2.3.2 Proteingehaltbestimmung

Die Bestimmung des Proteingehalts in den Fischproben wird mittels Bradford Assay durch-

geführt. Dabei handelt es sich um eine kolorimetrische Methode zur Konzentrations-bestimmung

von Proteinen. Das Verfahren beruht generell auf der Bindung des Farbstoffes Coomassie

Brilliant Blau G an Proteine in saurem Medium, wodurch sich das Absorptionsmaximum des

Farbstoffes von 465 nm nach 595 nm verschiebt. Ursache dafür ist die Komplexbildung von

Coomassie Brilliant Blau G mit den kationischen und unpolaren Seitenketten der Proteine. Diese

Komplexbildung bewirkt eine Stabilisierung des Farbstoffes in seiner anionischen

(unprotonierten) Sulfonatform, wobei das Absorptionsmaximum dieser Form im Bereich bei 595

nm liegt. Des Weiteren ist der Extinktionskoeffizient des Protein – Farbstoff – Komplexes höher

im Vergleich zum unkomplexierten Farbstoff, wodurch die Absorptionszunahme bei 595 nm

gegenüber dem freien Farbstoff photometrisch ermittelt werden kann und letztendlich

38

maßgebend für die Proteinkonzentration ist. Demnach kann über die Erstellung einer

Kalibrierungsgeraden mit einer Standardsubstanz die Proteinkonzentration einer unbekannten

Probe quantifiziert werden. Bei der Auswahl des Standards muss beachtet werden, dass dieser

einen ähnlichen Gehalt an basischen Aminosäuren hat wie die zu quantifizierende Probe, da die

Farbreaktion davon abhängig ist. Als Standardsubstanz für die Kalibrierung wird in der Regel

BSA (Rinderserumalbumin) eingesetzt. Dabei ist zu beachten, dass die zu untersuchenden

Proben im Konzentrationsbereich der Standards liegen. Des Weiteren sind die Inkubationszeiten

(5-45 min.) einheitlich auf die gesamte Untersuchung anzuwenden, da sonst Ungenauigkeiten

bezüglich der Proteinkonzentrationen entstehen. Nach Abschluss der photometrischen Messung

wird durch lineare Regression und Interpolation der Proteingehalt der Proben ermittelt. [38] [39]

2.3.3 Untersuchung zur optimalen Konjugation zw. Antikörper und kolloidalem Gold

Die Untersuchung dient zur Ermittlung der minimalen Antikörperkonzentration, die erforderlich

ist, um kolloidales Gold zu stabilisieren, sodass es nicht zur Aggregation der Partikel kommt, die

durch einen Farbumschlag von Rot nach Blau gekennzeichnet ist. Der Grund dafür ist, dass

kolloidales Gold in Lösung hergestellt wird, in der ein Gleichgewicht zwischen elektrostatischer

Abstoßung und Van – der – Waals – Wechselwirkung zwischen den Goldpartikeln besteht. Der

Einsatz von Puffern (ionische Substanzen) bewirkt jedoch eine Verschiebung des

Gleichgewichts, sodass die Anziehungskräfte (Van – der – Waals – Kräfte) größer werden als die

Abstoßungskräfte, was letztendlich zur Aggregation der Nanopartikel führt. Der Einsatz von

Puffern ist jedoch unumgänglich für den LFA, da dieser für die Stabilisierung der Antikörper

und die Reaktionsabläufe essentiell ist. [40] Wie bereits unter Punkt 2.2.1 erwähnt, wird durch

die Zugabe von Proteinen (Antikörpern, BSA) der Verklumpung durch Oberflächenadsorption

entgegengewirkt. Dafür ist die Ermittlung der optimalen Bedingungen für die Konjugatbildung,

d. h. die minimal notwendige Antikörperkonzentration, unumgänglich [34].

Die Untersuchung wird nach der Methode Wang et al. (2009) durchgeführt, wobei zunächst das

Absorptionsmaximum des Antikörper – Goldkomplexes zwischen 520 nm und 580 nm mittels

Spektralanalyse ermittelt wird. Anschließend wird die optische Dichte von Goldkonjugaten mit

unterschiedlicher Antikörperkonzentration in 10% NaCl – Goldlösung (pH 9,0) am

Absorptionsmaximum photometrisch bestimmt. Die Ergebnisse werden grafisch dargestellt,

wodurch eine Sättigungskurve entsteht. Zur Bestimmung der minimalen Antikörper-

konzentration werden 120% der Konzentration genommen, die durch den ersten Punkt auf der

Sättigungsgeraden repräsentiert werden. Dadurch wird garantiert, dass ausreichend Proteine

39

(Antikörper) vorhanden sind, um das kolloidale Gold in Puffern (ionischen Substanzen) zu

stabilisieren. [40]

2.3.4 Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats

Für die Herstellung des Antikörper – Nanogold – Konjugats müssen die unter den Punkten 3.2.1

und 2.3.3 beschriebenen Fakten bezüglich der Stabilisierung der kolloidalen Goldlösung

berücksichtigt werden. Andernfalls kann es zur Agglomeration, der Goldpartikel kommen was

das Goldkonjugat für weitere Verwendungen unbrauchbar macht. Zur Konjugatherstellung

existiert eine Vielzahl von Methoden, die den benötigten Rahmenbedingungen angepasst sind,

jedoch ist das Grundprinzip einheitlich. Zu Beginn der Konjugatherstellung wird der benötigte

pH – Wert (7,5 – 10,0) der kolloidalen Goldlösung eingestellt, sodass für die

Adsorptionsreaktion optimale Bedingungen herrschen. Anschließend wird der sekundäre

Antikörper in der benötigten Konzentration zur kolloidalen Goldlösung gegeben und diese mit

Puffer aufgefüllt. Während der Inkubationszeit von 30 Minuten auf dem Horizontalschüttler

erfolgt die Bildung des Antikörper – Nanogold – Komplexes durch Oberflächenadsorption. [40]

Im nächsten Schritt werden die noch freien Bindungsstellen der Goldpartikel durch die Zugabe

„inerter“ Makromoleküle (z. B. BSA) geblockt, sodass keine weiteren Stoffe an der Oberfläche

adsorbieren können. [34] Für diesen Vorgang ist erneut eine Inkubationszeit von 30 Minuten

notwendig. Anschließend werden die Konjugate bei 4°C zentrifugiert, sodass sich das

Goldkonjugat als Pellet absetzt. Der Überstand wird abgenommen und das Goldkonjugat in

Puffer resuspendiert. Der Zentrifugiervorgang mit anschließender Resuspendierung des Pellets

wird erneut wiederholt. Der Antikörper – Nanogold – Komplex ist dann bereit, um auf das

Konjugatpad aufgetragen zu werden. [41] Die während der Untersuchungen verwendeten

Reagenzien sowie Parameter mit den daraus resultierenden Ergebnissen sind unter Punkt 3.3.1

genau beschrieben.

2.3.5 Vorbereitung der LFA – Komponenten

Die LFA – Komponenten können durch verschiedene Reagenzien hinsichtlich ihrer

Eigenschaften modifiziert werden, sodass die Funktionalität des LFA – Teststreifen verbessert

bzw. optimiert wird. Im ersten Schritt der Membranvorbereitung wird die Membran aus der

Vorlage (30 cm Membranstreifen) in 6 cm breite Streifen geschnitten. Danach erfolgt das

Auftragen des primären Antikörpers (Testlinie) und des IgG – Antikörpers (Kontrolllinie) auf die

Membranfläche. Dabei kann das Auftragen automatisch (mit Dispenser) oder manuell

40

(mit Pipette) durchgeführt werden. Anschließend wird die Membran für 5 min bei RT

vorgetrocknet und kommt danach für 1 h bei 30°C in den Trockenschrank. Die niedrige

Trocknungstemperatur wird eingesetzt, um die immobilisierten Antikörper zu schonen. Nach der

Trocknung erfolgt das Blocken der Membran, sodass die freien Bindungsstellen der

Nitrozellulose nicht mit dem Konjugat oder den Zielanalyten in Wechselwirkung treten und

somit den Test unbrauchbar machen. Zum Blocken der Membran werden Proteine, wie z. B.

BSA oder Casein, oder Laminier Mittel, wie z. B. PVP, eingesetzt. Dazu werden die jeweiligen

Substanzen in Puffer gelöst und die Membran anschließend für 30 min bei RT in der Lösung

inkubiert. Zur Verbesserung der Proteinlöslichkeit werden grenzflächenaktive Reagenzien, wie

z. B. Tween 20, verwendet. Im Anschluss daran erfolgt das Spülen der Membranfläche mit

destilliertem Wasser zur Entfernung der überschüssigen Moleküle bzw. Fremdpartikel. Zum

Abschluss besteht die Möglichkeit, die Membran mit Konservierungsmitteln, wie z. B. Succrose,

zu behandeln, die einerseits die auf der Membran befindlichen Proteine schützen und

andererseits einen positiven Einfluss auf das Resolubilisierungsverhalten haben. Dafür werden

die Konservierungsmittel ebenfalls in Puffer gelöst und die Membran anschließend für 15

Minuten in der Lösung bei RT inkubiert. Nach der Prozedur wird die behandelte Membranfläche

erneut mit destilliertem Wasser gespült und über Nacht bei RT getrocknet. Dabei wird die

Membran dunkel gelagert und durch eine perforierte Abdeckung (z. B. Alufolie) vor

Verschmutzung geschützt. Die zur Vorbehandlung der Membran eingesetzten Reagenzien sind

unter Punkt 2.1.2 (Membranblocker) zu finden. [41] [42]

Das Konjugatpad wird zur Vorbereitung aus der Vorlage in Streifen von 0,6 cm x 10 cm

geschnitten. Die Konjugatpadstreifen können anschließend mit verschiedenen Reagenzien

behandelt werden, die Eigenschaften wie z. B. Sensitivität oder Resolubilisierungsverhalten des

Goldkonjugats beeinflussen. Dabei werden die entsprechenden Substanzen, wie z. B. BSA,

Succrose oder Casein, in Puffern gelöst und das Konjugatpad anschließend für 30 min. in der

Lösung inkubiert. Anschließend erfolgt die Trocknung der Streifen bei 30°C für 1 h im

Trockenschrank. Danach wird auf die Konjugatpads das Goldkonjugat pipettiert oder die

Streifen werden gefaltet und anschließend in das Goldkonjugat getaucht. Dabei müssen 500 μl

Goldkonjugat für die Herstellung von 5 Konjugatpads (2,0 cm x 0,6 cm) eingeplant werden. Die

Trocknung der Konjugatpads erfolgt über Nacht bei RT unter einer perforierten Abdeckung (z.

B. Alufolie) zum Schutz vor Verschmutzungen. Des Weiteren werden die Konjugatpads beim

Trocknen auf Träger (z. B. Pipettenspitzen) gelegt, sodass der Trocknungsvorgang durch

Luftzirkulation verbessert wird. Dadurch wird gewährleistet, dass das Konjugat im Konjugatpad

bleibt und nicht durch Wechselwirkungen mit anderen Oberflächen austritt. Die zur Vorbe-

41

handlung des Konjugatpads eingesetzten Reagenzien sind unter Punkt 2.1.2 (Konjugatpad)

beschrieben [41] [42]

Das Sample Pad kann ebenfalls mit verschiedenen Reagenzien, wie z. B. Succrose, Dextran

oder Tween 20, behandelt werden, um die Probenverteilung auf das Konjugatpad zu verbessern

oder die Sensitivität des Teststreifen zu verstärken. Es besteht die Möglichkeit, Substanzen wie

Natriumazid einzusetzen, die konservierende Eigenschaften besitzen. Dabei werden die

entsprechenden Reagenzien ebenfalls in Puffer gelöst und das Sample Pad (1,7 cm x 0,6 cm) in

der Lösung für 30 min bei RT inkubiert. Danach wird das Sample Pad bei 30°C für 1 h im

Trockenschrank getrocknet und anschließend dunkel und trocken bis zum Einsatz gelagert. Das

zur Vorbehandlung eingesetzte Reagenz ist unter Punkt 2.1.2 (Sample Pad) beschrieben. [41]

Das Absorbentpad bedarf keiner weiteren Vorbehandlung, da es lediglich zum Abtransport bzw.

Aufsaugen des Goldkonjugats nach dem Testdurchlauf dient.

2.4 LFA – Testdurchführung

Die jeweiligen LFA – Komponenten werden zurecht geschnitten und anschließend zu einem

Teststreifen zusammengesetzt. Dabei wird die Membran (6,0 x 0,6 cm), das Konjugatpad (2,0 x

0,6 cm), das Sample Pad (1,7 x 0,6 cm) und das Absorbentpad (4,0 x 0,6 cm) entsprechend der

angegebenen Maße in Streifen geschnitten. Bei diesem Vorgang ist zu beachten, dass

Einweghandschuhe getragen werden, der Arbeitsplatz sauber ist und der Arbeitsvorgang

räumlich getrennt von möglichen Fischproben (Verdünnungsreihen etc.) durchzuführen ist.

Generell empfiehlt es sich 2 separate Arbeitsplätze zu schaffen, um Kreuzkontaminationen zu

vermeiden, da diese das Ergebnis verfälschen. Zudem muss darauf geachtet werden, dass die

Membran nicht auf der Lauffläche berührt wird, auf der die jeweiligen Antikörper immobilisiert

sind. An den Enden der Membran befinden sich abgedeckte Klebeflächen, die für die

Handhabung zu nutzen sind. Nachdem die Komponenten zurecht geschnitten sind, erfolgt der

Zusammenbau der Teststreifen, wozu es sich empfiehlt, neue Einweghandschuhe zu verwenden

und die einzelnen Teile auf weißem Papier zu positionieren. Im ersten Schritt des

Zusammenbaus wird die Abdeckung der langen Membranklebefläche (2 separate Teile) entfernt

und das Konjugatpad mit einer Pinzette 2 mm membranüberlappend durch leichten Druck

aufgebracht. Es ist darauf zu achten, dass das Konjugatpad vor der Druckausübung gerade ist

und in Fluchtrichtung mit der Membran steht. Der verbleibende Überstand von der Klebefläche

wird abgeschnitten. Im zweiten Schritt wird das kürzere Ende der Klebefläche von der

Abdeckung entfernt und das Absorbentpad 2 mm membranüberlappend nach gerader

Ausrichtung durch Druck befestigt. Der letzte Schritt beinhaltet das Aufbringen des Sample Pads

42

auf das Konjugatpad, wobei dieses mittels Pinzette zum Rand hin abschließend auf dem

Konjugatpad ausgerichtet wird und das Anpressen durch kurzen Druck erfolgt. Bei diesem

Schritt sollte der Teststreifen bereits in waagerechter Position liegen, sodass anschließend keine

größeren Bewegungen notwendig sind und das Sample Pad ohne weitere Fixierungen halten

kann. Auf Grund des glasfaserartigen Materials, aus dem das Konjugatpad besteht, hält das

Sample Pad. Abbildung 11 gibt einen schematischen Überblick zum korrekten Zusammenbau

eines Teststreifens.

Abbildung 11: Schematischer Teststreifenaufbau

Nach dem korrekten Zusammenbau des Teststreifens werden zwischen 150 – 250 μl

Probenvolumina aufgegebenen, wodurch der LFA Test gestartet wird. Sollte der Flow nicht

einsetzten, ist mittels Pipettenspitze ein kurzer Druck auf das Sample Pad auszuüben.

43

3. Ergebnisse

3.1 Proteingehaltsbestimmung der Fischproben

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration via Bradford Assay wird das „96 Well Plate Assay

Protocol“ der Firma SIGMA angewendet [41]. Für die Erstellung der Kalibrierkurve wird BSA

als Standardsubstanz eingesetzt und Konzentrationen im Bereich von 0,25 – 1,5 mg/ml

hergestellt. Als Puffer für die entsprechenden Verdünnungsreihen wird PB 10 mM (pH 7,0)

genutzt. Die Fischproben sind 100fach verdünnt, um im Konzentrationsbereich der BSA –

Standards zu liegen. Es werden 250 μl Bradford Reagenz in die jeweilige Kavität gegeben und

anschließend mit 5 μl der entsprechenden Substanz (BSA – Standard, Fischprobe, Puffer)

vermischt. Nach ca. 10 Minuten Inkubation auf dem Horizontalschütter (Stufe 6) werden die

photometrischen Messungen (Doppelbestimmungen) bei RT 20°C im Spektralfotometer

durchgeführt. Die auf Basis der Messwerte errechnete Kalibrierkurve ist in Abbildung 12

dargestellt.

Abbildung 12: Kalibrierkurve zur Proteinbestimmung der Fischproben

Die Kalibrierkurve weist einen hohen Regressionskoeffizienten auf. Demnach besteht zwischen

den Messwerten eine lineare Abhängigkeit, was durch den Graphen verdeutlicht wird. Anhand

der Kalibriergeraden werden die unbekannten Proteinkonzentrationen der Fischproben mittels

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5

Extin

ktio

n (O

ptis

che

Dic

hte)

Konzentrationen der BSA - Standards [mg/ml]

BSA - Kalibriergerade

Standardsy = 0,1927x + 0,41 R² = 0,998

44

Doppelbestimmung ermittelt und sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Standardabweichung für die

photometrischen Messungen innerhalb einer Fischart liegt unter 2%.

Tabelle 3: Proteinkonzentration der Fischproben

Kabeljau [mg/ml] Hering [mg/ml] Alaska Seelachs [mg/ml]

48,8 49,0 48,4

Die Proteinkonzentrationen der Fischproben liegen annähernd im gleichen

Konzentrationsbereich, wobei die Werte als realistisch eingeschätzt werden, da in der Literatur

die Eiweißgehalte auch eine geringe Schwankungsbreite aufweisen. Auf Basis der in Tabelle 3

abgebildeten Konzentrationen werden alle Verdünnungsreihen sowie Nachweisgrenzen der

Experimente berechnet bzw. ermittelt.

3.2 Konjugationsoptimierung zwischen Nanogoldpartikeln und sekundärem Antikörper

Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Antikörperkonzentrationen werden nach

Wang et al. (2009) exemplarisch am Antikörper Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] durchgeführt.

Dazu wird eine Verdünnungsreihe des Antikörpers im Konzentrationsbereich 0,02 – 0,16 mg/ml

erstellt. Als Verdünnungsreagenz wird 5mM Boraxpuffer (pH 9,0) eingesetzt. Zur Durchführung

der Spektralanalyse wird in die Kavitäten der 96 Well Platte 250 μl Goldsuspension gegeben und

diese mit 5 μl Kaliumcarbonat versetzt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 25 μl

Antikörperlösung in die jeweiligen Kavitäten. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten auf

dem Horizontalschüttler bei Stufe 6 werden 25 μl 10% NaCl – Lösung in die jeweiligen

Kavitäten gegeben und erneut für 15 Minuten auf dem Horizontalschüttler bei Stufe 6 inkubiert.

Danach wird die Spektralanalyse im Spektralfotometer bei RT 20°C im Bereich 470 – 610 nm

durchgeführt. Es wird bei den eingesetzten Mengen an kolloidaler Goldlösung und Antikörpern

von Wang et al. (2009) abgewichen, um Material zu sparen, jedoch ist das Verhältnis der

Mengen zueinander gleich. Des Weiteren werden die Inkubationszeiten von 5 Minuten auf 15

Minuten verlängert, um die Oberflächenadsorption zu verbessern. Der Spektralbereich wird

ebenfalls erweitert, um eine genauere Aufzeichnung zu erhalten. Zudem werden bei den

Untersuchungen Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Ergebnisse der Spektralanalyse sind in

Abbildung 13 dargestellt.

45

Abbildung 13: Spektralanalyse zur Optimierung der Konjugationsbedingungen

Aus den in Abbildung 13 dargestellten Ergebnissen wird ersichtlich, dass das

Absorptionsmaximum von reinem kolloidalem Gold bei 522 nm – 526 nm liegt. Hingegen

bewegt sich das Maximum im Falle der Goldkonjugate unterschiedlicher Konzentrationen

zwischen 528 – 535 nm. Ursache für die leichte Verschiebung des Absorptionsmaximums ist die

Komplexbildung zwischen kolloidalem Gold und den Antikörpern, wodurch sich die

Partikelgröße der in Lösung befindlichen Komponenten verändert. Es ist zu erkennen, dass das

Absorptionsmaximum ab einer Konzentration von 0,14 mg/ml bei einer OD um 1,0 liegt. Dies ist

als positiv zu bewerten, wenn man eine kolloidale Goldlösung mit einer OD von 1,1 einsetzt, da

die Höhe der optischen Dichte letztendlich einen signifikanten Einfluss auf die Signalstärke des

LFA hat. Das Absorptionsmaximum für die im Anschluss durchgeführten photometrischen

Messungen zur Bestimmung der minimalen Antikörperkonzentration wird anhand der

Spektralanalyse auf 530 nm festgelegt. Die Ergebnisse der photometrischen Messungen sind in


0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610

Opt

isch

e D

icht

e (E

xtin

ktio

n)

Wellenlänge [nm]

Spektralanalyse sAK + Gold 40 nm [470 - 610 nm]

Gold 40 nm

sAK 0.00 mg/ml

sAK 0.02 mg/ml

sAK 0.04 mg/ml

sAK 0.06 mg/ml

sAK 0.08 mg/ml

sAK 0.10 mg/ml

sAK 0.12 mg/ml

sAK 0.14 mg/ml

sAK 0.16 mg/ml

46

Abbildung 14: Photometrische Messungen zur Optimierung der Konjugationsbedingungen

Abbildung 14 zeigt die Extinktionen verschiedener Antikörperkonzentrationen in kolloidaler

Goldlösung am ermittelten Absorptionsmaximum von 530 nm. Dabei handelt es sich um die

Mittelwerte der photometrischen Doppelbestimmung. Die Standardabweichung für die

ermittelten Einzelwerte liegt unter 5%. Aus der Grafik geht hervor, dass bei einer sekundären

Antikörperkonzentration von 0,14 mg/ml die Sättigungsgerade beginnt. Demzufolge befindet

sich die minimale Antikörperkonzentration zur Stabilisierung von 1 ml kolloidaler Goldlösung

bei etwa 0,17 mg/ml. Bei zukünftigen Optimierungsversuchen der Antikörperkonzentration darf

dieser Wert nicht unterschritten werden.

3.3 Vorversuche

Die Ziele der Vorversuche waren die Entwicklung eines LFA – Teststreifens, der eine Testlinie

und eine Kontrolllinie anzeigt sowie die Optimierung der Vorbereitungsschritte zur Herstellung

der jeweiligen LFA – Komponenten. Letztendlich sollte das Verfahren für die Hauptversuche

soweit optimiert werden, dass der Teststreifen einwandfrei funktioniert und die

Versuchsvorbereitung effizient durchgeführt werden kann.

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16

Opt

isch

e D

icht

e

sAK Konzentration [mg/ml]

Optimierung sAK Konzentration zur Konjugatherstellung

530 nm

Trend

47

3.3.1 Herstellungsoptimierung vom Antikörper – Nanogold – Konjugat

In den Vorversuchen wird Wi 11 – 3G9D5 [2,5 mg/ml] als sekundärer Antikörper eingesetzt.

Zur Herstellung des Goldkonjugats werden die Methoden von Choi et al. (2010) und Safenkova

et al. (2010) als Grundlage bzw. Orientierung genutzt, wobei die verwendeten Mengen

(Volumina) zur Materialeinsparung angepasst werden. Zu Beginn der Konjugatherstellung wird

500 μl kolloidale Goldlösung in Eppendorfgefäße (1,5 ml) gefüllt und mit 10 μl

Kaliumcarbonatlösung (100 mM, pH 11,2) zur Justierung des pH – Wertes (9,0) versetzt.

Anschließend werden 100 μl sekundärer Antikörper (unverdünnt) zur Goldlösung zugegeben

und diese auf 1 ml mit Boraxpuffer (5 mM, pH 9,0) aufgefüllt. Nach einer Inkubationszeit von

30 min bei RT auf dem Horizontalschüttler (Stufe 6) werden 100 μl 10 % BSA – Boraxlösung

(pH 9,0) zur Goldlösung gegeben und diese erneut für 30 min bei RT auf dem

Horizontalschüttler (Stufe 6) inkubiert. Nach jedem Zugabeschritt wird die Lösung für mindes-

tens 30 Sekunden auf dem Vortexer gründlich durchmischt. Das Zentrifugieren der Goldlösung

wird mit der Laborzentrifuge (3K30) bei 4°C und 8800 rpm für 60 Minuten durchgeführt. Zudem

wird für das Zentrifugieren der Rotorkopf 12110 H mit zugehörigem Deckel verwendet. Im

Anschluss an das erste Zentrifugieren werden ca. 80 – 90% des Überstandes aus dem

Eppendorfgefäß entnommen und das Pellet in 1 ml PB (10 mM, pH 7,0) auf dem Vortexer

resuspendiert. Danach erfolgt das zweite Zentrifugieren bei den gleichen Parametern wie im

ersten Durchlauf. Der Überstand wird erneut abgenommen und das Pellet in 500 μl PB (10 mM,

pH 7,0) auf dem Vortexer resuspendiert und bis zum weiteren Gebrauch, spätestens am nächsten

Tag, bei 4°C im Kühlschrank zwischengelagert.

Es zeigt sich, dass die oben beschriebene Methode zur Konjugatherstellung am besten geeignet

ist. Diesbezüglich werden während der Untersuchungen verschiedene Experimente durchgeführt,

in denen die Parameter des Zentrifugierens und die zur Herstellung eingesetzten Reagenzien

variieren. In Bezug auf den Vorgang des Zentrifugierens werden die in der Tabelle 4

dargestellten Parameter überprüft.

48

Tabelle 4: Parameter des Zentrifugierens bei der Konjugatherstellung

Versuch Zeit [min] Drehzahl [rpm] T [°C] Quelle

1 20 10.000 4 Choi et al. (2010) [42]

2 20 12.000 4 eigene Anpassung

3 30 10.000 4 Safenkova et al. (2010) [44]



Das Zentrifugieren mit den Parametern aus den Versuchen 1 und 2 hat nicht funktioniert, da sich

das Goldkonjugat bereits nach dem ersten Zentrifugieren an der Innenwandung des

Eppendorfgefäßes absetzt und dadurch unbrauchbar ist. Der Einsatz einer höheren Drehzahl bei

gleichbleibender Zeit bringt keine Verbesserung, wobei zunächst vermutet wird, dass eine

höhere Drehzahl ein besseres Absetzen am Gefäßboden bewirkt auf Grund höherer G – Kräfte.

Die Problematik der Konjugatabsetzung an der Gefäßinnenwand ist in Abbildung 15 dargestellt.

Abbildung 15: Abgesetztes Goldkonjugat an der Innenwandung eines Eppendorfgefäßes

49

Bei den Folgeexperimenten 3 und 4 wird eine neue Methode ausprobiert, die eine Zeitver-

längerung des Zentrifugierens vorsieht. Dabei setzt sich das Konjugat nach dem ersten Durchlauf

am Gefäßboden als Pellet ab, wodurch ein zweiter Zentrifugiervorgang durchgeführt werden

kann. Das Goldkonjugat bildet jedoch nach dem zweiten Zentrifugieren erneut an der Innen-

wandung einen Schmierfilm und ist für weitere Verwendungen unbrauchbar. Eine Drehzahl-

erhöhung bei gleichbleibender Zeit und Temperatur führt zu keiner signifikanten Verbesserung

der Problematik. Es wird vermutet, dass die hohe Drehzahl das Problem verursacht, da durch die

hohen G – Kräfte der Antikörper – Nanogold – Komplex zu stark an die Innenwandung gedrückt

wird. In Folge dessen verteilt sich der Komplex an der Gefäßwandung und tritt mit dieser in

Wechselwirkungen. Zur Bestätigung der Hypothese wird im Versuch 5 die Drehzahl verringert

und die Zeit erhöht bei gleichbleibender Temperatur. Dies führt zu den gewünschten

Ergebnissen. Die Problematik der Konjugatabsetzung an der Gefäßwand ist nicht mehr

aufgetreten. Zur Erhöhung der Herstellungssicherheit beim Zentrifugieren werden die optimalen

Parameter auf 8800 rpm für 60 Minuten bei 4°C festgelegt. Dadurch wird sichergestellt, dass die

Konjugatherstellung standardisiert und ohne Materialverlust durchgeführt werden kann.

Es wird ebenfalls der Einsatz verschiedener Pufferlösungen während der Konjugatherstellung

untersucht. Dabei wird zum Resuspendieren des Pellets PBS (40 mM, pH 7,4) ohne Zusätze und

mit BSA Zusätzen (1% 1. Durchlauf, 0,1% 2. Durchlauf) getestet. Des Weiteren wird zum

Blocken der freien Bindungsstellen vor dem Zentrifugieren 1% BSA – PBS Lösung ausprobiert.

Während der Untersuchungen ist kein signifikanter Einfluss auf die Konjugatqualität

festzustellen. Es empfiehlt sich jedoch, die im Vorfeld als optimal beschriebenen Reagenzien

einzusetzen, da sie die Reaktionsbedingungen für die Konjugatherstellung begünstigen und sich

im Verlauf der durchgeführten Experimente als sichere Parameter erweisen. Außerdem zeigt

sich, dass das Zentrifugieren der Kernprozess der Konjugatherstellung ist, weil er einen hohen

Einfluss auf die Qualität des Goldkonjugats ausübt.

3.3.2 Optimierung der LFA – Komponenten

Zur Optimierung der LFA – Komponenten werden die Methoden von Choi et al. (2010), Zhang

et al. (2009) und Kolosova et al. (2008) als Grundlage genutzt. In den Vorversuchen wird Wi 11

– 1G3G11 [3,85 mg/ml] als primärer Antikörper für die Testlinie und Goat – Anti Mouse IgG [2

mg/ml] als Antikörper für die Kontrolllinie unverdünnt eingesetzt. Es wird die Hi Flow Plus 240

Membran verwendet. Die Testlinie und Kontrolllinie werden manuell mittels Pipette auf-

getragen, wobei das Volumen 2,5 μl/cm (je 2 x aufgetragen) beträgt. Die Membran wird

anschließend für 5 Minuten bei RT vorgetrocknet und dann für 1h bei 30°C in den Trockenofen

50

gegeben. Nach dem Trocknen wird die Membran für 30 Minuten in 1% PVP (in 100 mM PBS)

eingelegt und danach mit destilliertem Wasser für 1 Minute unter dem Wasserhahn gewaschen.

Im Anschluss daran erfolgt die Inkubation der Membran in 5% Succrose (in 10 mM PB) für 15

Minuten sowie erneutes Waschen mit destilliertem Wasser für 1 Minute unter dem Wasserhahn.

Zum Abschluss wird die Membran in Plastikschalen gelegt, die am Boden gewellt sind, sodass

die Trocknung auch auf der unteren Membranseite gewährleistet werden kann. Die Plastik-

schalen werden mit perforierter Alufolie abgedeckt und die Trocknung der Membran erfolgt über

Nacht bei RT. Das Konjugatpad wird aus der Vorlage in Streifen (0,6 cm x 10 cm) geschnitten.

Das hergestellte Goldkonjugat (500 μl) wird mit 500 μl einer 5% Succrose – 1% BSA – 0,5%

Tween 20 Lösung (in 40 mM PBS) direkt im Eppendorfgefäß auf dem Vortexer gemischt.

Anschließend wird der Konjugatpadstreifen sorgfältig gefaltet und mittels Pipette ins

Goldkonjugat getaucht, sodass dieser sich vollsaugen kann. Der mit Konjugat durchtränkte

Streifen wird zum Trocknen auf Pipettenspitzen in eine Plastikschale gelegt, sodass die

Auflagefläche des Streifens möglichst gering ist und das Goldkonjugat im Pad bleibt. Dadurch

können Wechselwirkungen mit der Plastikoberfläche auf ein Minimum reduziert werden. Die

Plastikschale wird ebenfalls mit perforierter Alufolie abgedeckt und das Konjugatpad bei RT

über Nacht getrocknet. Das Sample Pad und das Absorbentpad werden nach den, unter Punkt 2.4

beschriebenen Maßen zurecht geschnitten und nicht vorbehandelt. Der Zusammenbau und der

LFA – Test werden ebenfalls nach Punkt 2.4 durchgeführt, wobei die in den Vorversuchen

eingesetzten Probenvolumina 150 μl betragen. Die Fischproben der 3 getesteten Fischarten

werden für die Vorversuche mit PB 10 mM (pH 7,0) 10fach verdünnt.

Während der Untersuchungen zeigt sich, dass die Kombination der im Vorfeld beschriebenen

Parameter, Komponenten sowie Reagenzien die besten Ergebnisse hinsichtlich der Bildung von

Test und Kontrolllinie liefern. In Abbildung 16 sind die Testreifen abgebildet, die entsprechend

der Vorgehensweise behandelt sind.

51

Abbildung 16: Optimierte Teststreifen der Vorversuche

Anhand von Abbildung 16 ist zu sehen, dass die Testlinie und Kontrolllinie klar zu erkennen

sind. Dabei hat sich die Kontrolllinie nach 3 Minuten und die Testlinie nach 5 Minuten gebildet,

wobei der Testreifen nach 3 Minuten durchgelaufen ist, d. h. das Absorbentpad erreicht. Der

Testdurchlauf ist sehr schnell und es bildet sich eine einheitliche Flowfront. Die Intensität der

Linien, insbesondere der Testlinie, nimmt nach 15 Minuten nicht mehr zu. Das Fischallergen

Parvalbumin kann bei den in Abbildung 16 angegebenen Proteinkonzentrationen klar detektiert

werden. Des Weiteren zeigt sich, dass die gegen Kabeljau gerichteten monoklonalen Antikörper

eine Kreuzreaktivität gegenüber Hering und Alaska Seelachs aufweisen.

Zur Optimierung der LFA – Komponenten bzw. zur Entwicklung der im Vorfeld beschriebenen

Vorgehensweise werden während der Vorversuche verschiedene Experimente durchgeführt.

Dabei werden zunächst unterschiedliche Vorbehandlungen der LFA – Komponenten getestet, um

den Einfluss auf die Singnalentwicklung und das Laufverhalten zu überprüfen. Die jeweiligen

Testkombinationen sind in Tabelle 5 dargestellt.

52

Tabelle 5: Kombination verschiedener Vorbehandlungen der LFA Komponenten

Vers

.

Sample Pad Konjugatpad Membran Membrantyp

1 unbehandelt

0,5% BSA +

0,2% Tween 20

1% BSA + 5%

Succrose Hi Flow Plus 75

2 unbehandelt

0,5% Casein +

0,5% Tween 20

1% BSA + 5%


3 0,5% Tween 20 + 5%

Succrose +5% Dextran +

0,05% Natriumazid

unbehandelt 1% BSA + 5%


4

unbehandelt

5% Succrose +

1% BSA + 0,5%

Tween 20

2% Casein Hi Flow Plus 75

5

unbehandelt

5% Succrose +

1% BSA + 0,5%

Tween 20

1% PVP + 5%


6

unbehandelt

5% Succrose +

1% BSA + 0,5%

Tween 20

1% PVP + 5%


Bei den in Tabelle 5 dargestellten Kombinationen wird lediglich die Fischprobe des Kabeljaus

eingesetzt, um eine Test – und Kontrolllinie zu erzeugen. Zudem wird zu Beginn Wi 11 –

3G9D5 [2,5 mg/ml] als primärer Antikörper auf der Membran immobilisiert und Wi 11 –

1G3G11 [3,85 mg/ml] als sekundärer Antikörper zur Herstellung des Goldkonjugats genutzt. Bei

den Versuchen 1 – 3 kann mit den Vorbehandlungen und der Antikörperpaarkombination weder

eine Test – noch eine Kontrolllinie erzeugt werden. Zudem ist festzustellen, dass aus dem

unbehandelten Konjugatpad (V3) kein Goldkonjugat eluiert, obwohl das Sample Pad

entsprechend vorbehandelt wird. Das liegt vermutlich daran, dass das Goldkonjugat nach der

Trocknung nicht mehr resolubilisiert werden kann und in Wechselwirkungen mit

glasfaserartigem Material des Konjugatpads tritt. Das Phänomen ist in den Versuchen 1 – 2 nicht

erkennbar, da der Einsatz von BSA und des grenzflächenaktiven Stoffes Tween 20 diesem

Verhalten entgegenwirken. Eine Wiederholung des Versuchs sowie der Tausch zwischen dem

primären und sekundären Antikörper bringen keinen Erfolg. Die Teststreifen der Versuche 1 – 3

sind in Abbildung 17 dargestellt.

53

Abbildung 17: Teststreifen Versuche 1 – 3

Mit den Versuchen 4 – 5 wird die Versuchsplanung überdacht und angepasst, da in den

Versuchen 1 – 3 kein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt wird. Dabei erfolgt die Kombination

neuer Vorbehandlungen nach Kolosova et al. (2008). Der Tausch der Antikörperpaarungen, d. h.

die Verwendung von Wi 11 – 1G3G11 [3,85 mg/ml] als primärer und Wi 11 – 3G9D5 [2,5

mg/ml] als sekundärer Antikörper wird beibehalten. Durch die Anpassungen kann ein Signal

erzeugt werden, jedoch sind beide Linien verwischt und deshalb nicht voneinander zu

differenzieren. Als Ursache für die unklaren Linien werden die Eigenschaften der Membran Hi

Flow Plus 75 sowie der geringe Abstand zwischen den Linien (0,5 cm) ermittelt. Es wird

festgestellt, dass der Membrantyp für die Untersuchungen ungeeignet ist, da die Lauffläche sehr

dünnschichtig ist und somit bei der manuellen Antikörperimmobilisierung leicht beschädigt

werden kann. Des Weiteren wird beobachtet, dass sich beim Auftragen der Antikörper ein breiter

Hof bildet, d. h. der flüssige Antikörper geht zu sehr in die Breite, wodurch sich die Linie

ebenfalls verbreitert. Diesem Verhalten kann durch den Einsatz von weniger Antikörpervolumen

nicht entgegengewirkt werden, weshalb die robustere Membran Hi Flow Plus 240 mit einer

dickschichtigen Lauffläche für den Versuch 6 ausgewählt wird. Außerdem zeigt sich, dass das

Laufverhalten der Flowfront durch 1% PVP Lösung im Gegensatz zu 1% BSA verbessert

werden kann. Die 2 % Casein Lösung ruft ebenfalls gute Laufeigenschaften hervor, jedoch ist

die Kombination der Vorbehandlung von Membran und Konjugatpad optimaler. Insbesondere

die Vorgehensweise nach Kolosova et al. (2008) zur Behandlung des Goldkonjugats mit der 5%

Succrose - 1% BSA - 0,5% Tween 20 Lösung bewirkt eine signifikante Verbesserung der

54

Farbintensität und der Signalentwicklung. Die Testreifen aus den Versuchen 4 – 5 mit den

verwischten Linien sind in Abbildung 18 dargestellt.

Abbildung 18: Testreifen Versuche 4 – 5

Die im Versuch 6 beschriebene Vorbehandlung bringt die besten Ergebnisse hinsichtlich

Laufverhalten, Signalentwicklung und Signalstärke und stellt deshalb die optimalen Bedin-

gungen dar. Während der Vorversuche werden neben den bereits erwähnten Membrantypen (HF

75, HF 240) die Eigenschaften der Membrantypen HF 090, HF 135 und HF 180 untersucht. Es

zeigt sich, dass lediglich die Membran HF 180 für weitere Testzwecke in Frage kommt, da sie

ebenfalls eine robustere Lauffläche im Vergleich zu den anderen Membrantypen aufweist. Des

Weiteren ermöglicht sie auch eine verbesserte Reaktionszeit für die Komplexbildung zwischen

sAK – Antigen – pAK durch die geringere Laufgeschwindigkeit. Letztendlich stellt jedoch die

Membran HF 240 das Optimum dar. Auf Grund ihrer hohen Schichtdicke und der geringeren

Laufgeschwindigkeit besitzt sie einerseits die besten Grundvoraussetzungen für die manuelle

Antikörperimmobilisierung und andererseits gewährleistet sie ausreichend Reaktionszeit für die

Komplexbildung bzw. für die Signalentwicklung.

Das Ziel der Vorversuche einen LFA – Teststreifen zu entwickeln, der eine Testlinie und eine

Kontrolllinie anzeigt, wird erreicht. Zudem erfolgt die Optimierung der Vorbereitungsschritte

zur Herstellung der LFA – Komponenten. Auf Grundlage der in den Vorversuchen ermittelten

Ergebnisse erfolgen die Untersuchungen bzw. Experimente der Hauptversuche.

55

3.4 Hauptversuche

Die Hauptversuche verfolgen als Ziel die Entwicklung eines LFA – Teststreifens zur Detektion

des Fischallergens Parvalbumin, wobei dieser eine hohe Zuverlässigkeit in Verbindung mit einer

hohen Sensitivität aufweisen soll. Des Weiteren wird als Ziel die Ermittlung der Nachweisgrenze

verfolgt sowie die Optimierung dieser mit den vorhandenen Ressourcen. Letztendlich soll durch

die Untersuchungen eine Grundlage geschaffen werden, auf der weiterführende Experimente zur

Verbesserung des Schnelltest einschließlich des Herstellungsverfahrens durchgeführt werden

können.

3.4.1 Ermittlung optimaler Antikörperpaarkombination

Die Herstellung des Goldkonjugats und die Vorbereitung der LFA – Komponenten für die

Versuche werden nach den optimierten Bedingungen, beschrieben unter den Punkten 3.3.1 und

3.3.2, durchgeführt. Zu Beginn der Hauptversuche wird der letzte Vorversuch (Versuch 6 / Abb.

16), bei dem eine Kreuzreaktivität des monoklonalen Antikörpers gegenüber Hering und Alaska

Seelachs festgestellt wurde, wiederholt. Dabei wird neben den 3 Teststreifen mit den

entsprechenden Fischarten ein weiterer Teststreifen eingesetzt, der als Blindwert dient und auf

den an Stelle von Fischprotein (Parvalbumin) PB 10 mM (pH 7,0) gegeben wird. PB 10 mM ist

der gleiche Puffer, mit dem auch die Fischproben verdünnt werden. Bei den Untersuchungen ist

festzustellen, dass das Parvalbumin aller 3 Fischarten eindeutig detektiert werden kann, jedoch

ist auch der Blindwert positiv. Die Testlinien der 3 Fischarten sind bereits unmittelbar nach dem

Kontakt mit der Flow Front schwach erkennbar (1 Minute), wobei die jeweiligen Kontrolllinien

nach 4 Minuten die Funktionalität der Teststreifen bestätigen. Die Testlinie des Blindwertes ist

nach 5 Minuten schwach zu erkennen und die Kontrolllinie bildet sich nach bereits nach 4

Minuten. Nach 12 Minuten sind bei allen Testreifen eindeutige Signale zu erkennen, wobei nach

20 Minuten keine Verbesserung der Intensität mehr eintritt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 19

dargestellt.

56

Abbildung 19: Positive Blindwerte (Wdh. Vorversuch - V6)

Als Ursache für die positiven Blindwerte wird zunächst unsauberes Arbeiten vermutet, d. h., dass

es zu einer Kreuzkontamination während der Vorbereitung gekommen ist. Im Verdacht stehen

dabei die eingesetzten Sample Pads und Konjugatpads, obwohl durch die getrennten

Arbeitsplätze und die gewissenhafte Vorgehensweise (regelmäßige Reinigung / Handschuhe /

räumliche Trennung) eine Kontamination während der Herstellung fast ausgeschlossen werden

kann. Dennoch werden für die Wiederholung LFA – Komponenten einer anderen Herstellungs-

charge und ein zusätzlicher Blind – Teststreifen mit Reinstwasser als Probe verwendet, um

Kreuzkontaminationen auszuschließen. Eine Kontamination der Pufferlösungen wird von

vornherein ausgeschlossen, da diese separat zu den Proben gelagert werden. Die Wiederholung

des Versuchs ergibt ebenfalls positive Blindwerte, sodass neue Ansatzpunkte zur Problemlösung

gesucht werden.

Der neue Ansatz zur Problemlösung befasst sich mit der Kombination der entsprechenden

Antikörperpaare. Dabei wird vermutet, dass der sekundäre Antikörper unkomplexiert, d. h. ohne

gebundenes Antigen an den primären Antikörper bindet und in Folge dessen die positiven

Blindwerte entstehen. Deshalb werden Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene

Kombinationen zwischen sekundärem und primärem Antikörper untersucht werden. Dadurch

sollte einerseits die Problematik positiver Blindwerte analysiert und andererseits die optimale

Antikörperpaarkombination für die Weiterentwicklung des LFA – Verfahrens zum Nachweis des

Fischallergens Parvalbumin gefunden werden. Für die Untersuchungen werden die im Vorfeld

optimierten Methoden (Siehe Punkt 3.3.1 / 3.3.2) eingesetzt. Die 3 verwendeten Fischproben

57

werden 10fach mit PB 10 mM verdünnt, wobei für die beiden Blindwerte erneut PB 10 mM und

Reinstwasser verwendet wird. Tabelle 6 stellt die untersuchten Antikörperpaarkombinationen

dar.

Tabelle 6: Untersuchte Antikörperpaarkombinationen

Versuch Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper

1 Wi 11 – 3G9D5 Wi 11 – 1G3G11

2 Wi 11 – 1G3G11 Wi 11 – 3G9D5

3 Wi 11 – 1G3G11 Wi 11 – 3D12G7

4 Wi 11 – 3D12G7 Wi 11 – 1G3G11

5 Wi 11 – 3D12G7 Wi 11 – 3G9D5

6 Wi 11 – 3G9D5 Wi 11 – 3D12G7

Die Untersuchungen zur Optimierung der Antikörperpaarkombinationen zeigen, dass

insbesondere die Kombinationen der Versuche 2, 5 und 6 sehr gut harmonieren. Die

Antikörperpaarungen liefern eindeutige Signale, wobei es sich bei der V 2 – Kombination um die

Antikörperpaarung handelt, die bei den im Vorfeld als optimal beschriebenen Methoden

eingesetzt wird. Die Problematik der positiven Blindwerte kann jedoch durch die Experimente

nicht gelöst werden, da in allen 6 Versuchen beide Testreifen (PB 10 mM / Reinstwasser) ein

positives Testergebnis anzeigen. Dabei wird beobachtet, dass die Testliniensignale der

Blindwerte in den Versuchen 1, 3, 4 teilweise stärker sind als die der eigentlichen 3 Fischproben.

Hingegen sind die positiven Blindwerte der Versuche 2, 5, und 6 deutlich schwächer als die

Testliniensignale auf den LFA – Streifen mit dem Fischprotein (Parvalbumin). In Abbildung 20

sind die Ergebnisse des Versuchs 2 dargestellt.

58

Abbildung 20: Antikörperpaarkombination - Versuch 2

Anhand von Abbildung 20 wird ersichtlich, dass insbesondere Kabeljau und Alaska Seelachs

sehr starke Signale aufweisen und diese sich deutlich von den schwach positiven Blindwerten

unterscheiden. Im Vergleich mit den anderen Fischproben liefert Hering eine sehr schwache

Testlinie, wobei dies durch Testschwankungen, z. B. durch unterschiedliche Konjugatqualitäten

die sich aus dem Trocknungsprozess ergeben, hervorgerufen werden kann. Die Testlinie

entwickelt sich bei den Fischproben annähernd einheitlich innerhalb von 3 Minuten und die

Kontrolllinie ist bereits nach 2 Minuten vorhanden, wobei die Intensität über die Zeit

unterschiedlich zunimmt. Bei den Blindwerten zeigt sich die Testlinie erst schwach nach 10

Minuten und die Kontrolllinie nach 5 Minuten. Zum Vergleich mit den sehr guten Signalstärken

aus den Versuchen 2, 5 und 6 enthält Abbildung 21 einen Vertreter der eher schlechten

Antikörperpaarkombinationen (V3).

59

Abbildung 21: Antikörperpaarkombination - Versuch 3

Anhand von Abbildung 21 ist der Unterschied zum Versuch 2 eindeutig zu erkennen. Es wird

ersichtlich, dass die Blindwerte ein stärkeres Testliniensignal erzeugen als die eigentlichen

Proben mit dem Fischprotein Parvalbumin. Die Kontrolllinien bilden sich im Versuch 3 nach 3

Minuten annähernd einheitlich. Bei den Testlinien kann erst nach 25 Minuten eine leichte

Schattierung auf der Testlinie erkannt werden, die in ihrer Intensität nicht weiter zunimmt.

Auf Grund der guten Signalentwicklung mit der Antikörperpaarkombination V 2 und der guten

Erfahrung bei den Vorbereitungen zur LFA – Testdurchführung wird die Paarung in den

Folgeexperimenten weiter eingesetzt. Die Untersuchungen zur optimalen Antikörperpaar-

kombination können die Problematik der positiven Blindwerte nicht lösen, weshalb eine neue

Ursache in Betracht gezogen wird. Dabei wird vermutet, dass die Kombination der behandelten

LFA – Komponenten, insbesondere die Membran und das Konjugatpad, nicht optimal

aufeinander abgestimmt sind und deshalb Wechselwirkungen zwischen den Reagenzien

auftreten. D. h. es wird überlegt, ob das PVP die Membran an der Stelle unzureichend blockt, wo

der primäre Antikörper immobilisiert ist, also zwischen den einzelnen primären Antikörpern, und

es deshalb zur Anlagerung von BSA kommt, das die freien Bindungsstellen der

Nanogoldpartikel blockt. Diese Möglichkeit wird in Betracht gezogen, da sich unmittelbar nach

dem die Flow Front über den immobilisierten primären Antikörper zieht, sich eine schwache

Schattierung auf der Testlinie bildet und demnach eine Wechselwirkung zwischen den

Komponenten definitiv vorhanden ist. Deshalb werden erneut Folgeversuche durchgeführt, um

die beteiligten Komponenten dieser Reaktion zu ermitteln. Dabei werden verschiedene

Vorbehandlungen der LFA – Komponenten miteinander kombiniert, die einerseits in den

Vorversuchen gute Signale entwickelt haben und andererseits noch nicht bei Blind – Testreifen

60

zum Einsatz gekommen sind. Die unterschiedlichen Kombinationen der LFA – Komponenten

sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7: Folgeversuche zur Antikörperpaarkombination

Versuch Sample Pad Konjugatpad Membran Membrantyp

1 unbehandelt 5% Succrose + 1%

BSA + 0,5% Tween 20 2% Casein HF 240

2 unbehandelt 5% Succrose + 1%

BSA + 0,5% Tween 20

1% BSA + 5%

Succrose HF 240

3 unbehandelt 0,5% BSA + 0,2%

Tween 20

1% PVP + 5%

Succrose HF 240

In den Folgeversuchen zur Antikörperpaarkombination zeigt sich, dass die Kombination aus

Versuch 1 keine positiven Blindwerte erzeugt, d. h. die Vorbehandlung der Membran mit 2%

Casein in PBS 100 mM (pH 7,4) für 30 Minuten ist die optimale Methode zum

Membranblocken. Dabei wird auf eine anschließende Behandlung der Membran mit 5%

Succrose verzichtet. Zudem ist zu erwähnen, dass die Behandlungsart des Konjugatpads und der

Membran von Kolosova (2008) stammt. Es kommt zu keinen Einschränkungen bezüglich der

Signalentwicklung und Farbintensität bei den 3 Fischproben (10fach verdünnt), sodass

Parvalbumin eindeutig detektiert wird bei negativen Blindwerten (PB 10 mM / Reinstwasser).

Durch die Membranbehandlung mit 2% Casein verlangsamt sich die Geschwindigkeit der Flow

Front, sodass mehr Zeit für die Reaktionen (Komplexbildung) zur Verfügung steht. Die

Teststreifen sind nach 7 Minuten komplett durchgelaufen (Sample Pad – Absorbentpad), wobei

sich die Kontrolllinie einheitlich bei allen LFA – Streifen nach 8 Minuten bildet und in ihrer

Intensität nach 20 Minuten am Maximum ist. Die Testlinien bei den 3 Fischproben bilden sich

nach 10 Minuten und können nach 15 Minuten als eindeutig positiv eingestuft werden. Hingegen

kommt es bei den Blindwerten nach 1h zu keiner Testlinienbildung oder schwachem

Schattierungsansatz, sodass diese als eindeutig negativ beurteilt werden. Das Ergebnis des

Versuch 1 ist in Abbildung 22 dargestellt, wobei eine Wiederholung des Versuchs 1 die gleichen

Ergebnisse bringt. Die in den Versuchen 2 – 3 angewandten Vorbehandlungen sind ungeeignet

und führen zu positiven Blindwerten.

61

Abbildung 22: Folgeversuch 1 - Negative Blindwerte

Anhand der Abbildung 22 wird ersichtlich, dass die Fischproben eindeutig positiv und die

Blindwerte eindeutig negativ sind. Auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse werden die Versuche

zur Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze durchgeführt. Die Vorbereitung der Membran wird

dahingehend angepasst, dass an Stelle von 1% PVP in PBS 100 mM (pH 7,4) mit anschließender

5% Succrose Behandlung die Membran lediglich für 30 Minuten in 2% Casein (in PBS 100 mM

pH 7,4) inkubiert wird, um anschließend bei RT über Nacht zu trocknen. Die Vorbereitung der

anderen LFA – Komponenten bleibt unverändert und wird weiterhin nach den unter Punkt 3.3.1

und Punkt 3.3.2 beschriebenen Methoden durchgeführt.

3.4.2 Ermittlung der LFA – Nachweisgrenze

In den bisher durchgeführten Vorversuchen und Hauptversuchen wird ein funktionsfähiger LFA

– Schnelltest entwickelt und optimiert, sodass das Fischallergen Parvalbumin nachgewiesen

werden kann. Die bei der Testentwicklung eingesetzten Proteinkonzentrationen sind jedoch mit

ca. 4,9 mg/ml (4,9 g/kg) sehr hoch, da bei diesen Versuchen die Signalentwicklung und

Verfahrensoptimierung im Vordergrund stehen. Zum Spurennachweis in Lebensmitteln ist diese

Nachweisgrenze jedoch unzureichend, weshalb Versuche zur Ermittlung der Test –

Nachweisgrenze durchgeführt werden. Der Test zeigt bei den Experimenten eindeutige Signale

bei Test – und Kontrolllinie, wodurch niedrigere Konzentrationsbereiche zur Ermittlung der

Nachweisgrenze untersucht werden. Die Versuchsvorbereitung wird nach den Punkten 3.3.1 und

3.3.2 durchgeführt, wobei die Membranbehandlung entsprechend der Ergebnisse unter Punkt

3.4.1 (2% Casein zum Blocken) angepasst ist. Die Konzentrationsbereiche der 3 Fischarten

(Parvalbumin) werden in 100er Verdünnungsschritten aufgeteilt (mg/ml - μg/ml – ng/ml), sodass

62

einerseits Material eingespart werden kann und andererseits der Nachweisgrenzenbereich grob

abgeschätzt wird. Für den jeweiligen Konzentrationsbereich werden pro Fischart 2 LFA –

Streifen verwendet, um Schwankungen zwischen den Teststreifen zu erkennen. Des Weiteren

werden pro Versuch 2 Blind – Streifen mit PB 10 mM und Reinstwasser zur Kontrolle

eingesetzt. Das Probevolumen wird bei den Versuchen von 150 μl auf 200 μl pro Testreifen

erhöht. Die untersuchten Konzentrationsbereiche sind in Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8: Konzentrationsbereiche zur Abschätzung der Nachweisgrenze

Bereich Kabeljau Hering Alaska Seelachs

[mg/ml] 4,88 4,90 4,84

[μg/ml] 48 49 48

[ng/ml] 480 490 480

Die Untersuchungen ergeben, dass Kabeljau bis 48 μg/ml nachgewiesen werden kann, jedoch ist

das Testliniensignal bei den Streifen sehr schwach und zeigt sich erst nach 1h in Form einer

leichten Schattierung. Im Vergleich dazu ist das Testliniensignal im Konzentrationsbereich 4,88

mg/ml bereits nach 15 Minuten erkennbar, wobei nach 20 Minuten bei beiden Testreifen ein

eindeutiges Signal vorhanden ist. Im Messbereich 480 ng/ml ist kein Testliniensignal auf den

LFA – Streifen zu erkennen. Die Kontrolllinien aller Testreifen bilden sich nach 5 – 7 Minuten

annähernd einheitlich. Bei den Untersuchungen zur Fischart Hering kann eine Kreuzreaktivität

bis in den Konzentrationsbereich 49 μg/ml nachgewiesen werden, wobei sich das Testlinien-

signal beider LFA – Streifen nach 30 Minuten entwickelt. Im Messbereich 4,9 mg/ml sind auch

hier die Testsignale früher (nach 10 Minuten) zu erkennen. Die Funktionalität aller Teststreifen

wird durch die Bildung der Kontrolllinie bestätigt. Die Kreuzreaktivität des Parvalbumin der

Fischart Alaska Seelachs kann bis in den Konzentrationsbereich 48 μg/ml nachgewiesen werden.

Die Testlinien bilden sich in dem Messbereich nach 50 Minuten, sind jedoch sehr schwach. Die

Kontrolllinien bestätigen die Funktionalität der Teststreifen, wobei alle Blindwerte der

Untersuchungen negativ sind.

Auf Grundlage der ermittelten Ergebnisse kann der Nachweisbereich stärker eingeschränkt

werden, sodass Zwischenverdünnungen (10fach) eingebaut sind. Dadurch soll einerseits die

Signalstärke in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration verdeutlicht werden und andererseits

die Nachweisgrenze aufgezeigt werden, bei der eine eindeutige Detektion noch möglich ist.

Gleichzeitig dient dieser Versuch als Wiederholung des zuvor durchgeführten Versuchs. Dabei

63

ist die Vorgehensweise gleich, wobei die verwendeten Konzentrationsbereiche für die jeweiligen

Fischarten in Tabelle 9 dargestellt sind.

Tabelle 9: Konzentrationsbereiche zur Ermittlung der Nachweisgrenze

Bereich Kabeljau Hering Alaska Seelachs

[μg/ml] 480 490 480

[μg/ml] 48 49 48

[μg/ml] 4,8 4,9 4,8

Die Folgeversuche zur Ermittlung der Nachweisgrenze zeigen, dass das Kabeljau Protein bis zu

einer Konzentration von 4,8 μg/ml nachweisbar ist. Das Testliniensignal entwickelt sich bei

einem von zwei Streifen nach 40 Minuten und ist nach 55 Minuten schwach zu erkennen. Der

zweite dieser Teststreifen zeigt lediglich eine sehr schwache Schattierung, die nicht als

eindeutiges Signal gewertet wird, da sie kaum zu erkennen ist. Im Konzentrationsbereich ist die

Signalentwicklung deutlicher, wobei sich nach 30 Minuten 2 Testlinien auf beiden Streifen

bilden. Die Intensität der Signale ist schwach, aber als eindeutig positiv zu bewerten. Generell

werden starke Schwankungen bezüglich der Signalentwicklung sowie Intensität innerhalb eines

Messbereichs und zwischen den Messbereichen beobachtet. Es treten bei allen LFA – Streifen

Kontrolllinien auf, sodass diese die Funktionalität der Streifen bestätigten. Die Ergebnisse der

Kabeljau Teststreifen sind in Abbildung 23 dargestellt.

Abbildung 23: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Kabeljau

64

Bei der Fischart Hering kann bei den Folgeversuchen eine Kreuzreaktivität bis zu einer

Proteinkonzentration von 49 μg/ml festgestellt werden. Damit wird die Nachweisgrenze aus den

vorherigen Experimenten bestätigt und nicht weiter verbessert. Die Testliniensignale im

Messbereich 49 μg/ml entwickeln sich unterschiedlich, sodass ein Streifen nach 25 Minuten als

positiv bewertet werden kann und der zweite Streifen erst nach 40 Minuten ein schwaches Signal

bildet, das noch als erkennbar einzustufen ist. Demnach treten auch beim Hering starke

Schwankungen innerhalb eines Messbereichs sowie zwischen den Messbereichen auf. Bei allen

Testreifen der Versuchsreihe bilden sich Kontrolllinien. Die Ergebnisse der Teststreifen sind in


Abbildung 24: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Hering

Es wird durch die Folgeversuche ermittelt, dass Alaska Seelachs bis zu einer

Proteinkonzentration von 48 μg/ml nachweisbar ist und demnach die Kreuzreaktivität aus den

Voruntersuchungen bestätigt wird. Im Messbereich 48 μg/ml können 2 von 2 Testreifen als

positiv eingestuft werden, jedoch tritt eine starke Signalschwankung innerhalb des Messbereichs

auf. Im Vergleich mit den Schwankungen, die bei den anderen Fischarten beobachtet werden,

handelt es sich hierbei um den größten Unterschied zwischen 2 Teststreifen eines Konzen-

trationsbereichs. Die intensive Testlinie des einen LFA – Streifens entwickelt sich bereits nach

15 sehr gut und kann eindeutig als positiv eingestuft werden. Im Vergleich dazu erscheint die

Testlinie des zweiten Streifens erst nach 30 Minuten und zeigt keine Veränderungen in Bezug

auf die schwache Intensität. Alle Teststreifen der Versuchsreihe weisen Kontrolllinien auf,

wodurch die Funktionalität bestätigt wird. Die Versuchsergebnisse der Fischart Alaska Seelachs

65

sind in Abbildung 25 dargestellt, wobei insbesondere auf die starke Signalschwankung im

Konzentrationsbereich 48 μg/ml zu achten ist.

Abbildung 25: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Alaska Seelachs

Die Untersuchungen zur Ermittlung der Nachweisgrenze zeigen, dass Kabeljau bis zum

Konzentrationsbereich 4,8 μg/ml mit dem entwickelten und optimierten LFA – Verfahren

nachweisbar ist. Problematisch ist jedoch die hohe Signalschwankung, insbesondere innerhalb

eines Konzentrationsbereiches, wodurch eine eindeutige Interpretation der Testergebnisse nicht

gewährleistet werden kann. Zudem sind die erzeugten Testsignale auch zwischen den

Messbereichen sehr unterschiedlich, sodass kein deutlicher Zusammenhang zwischen Parv-

albuminkonzentration und Signalintensität erkennbar ist. Dabei stehen die Konjugatpads im

Verdacht, die starken Messschwankungen hervorzurufen, da diese unterschiedliche

Farbintensitäten aufweisen. Demzufolge müssen sich die Konjugatpads, auch innerhalb einer

Charge, hinsichtlich der auf ihnen befindlichen Konjugatmenge unterscheiden. Dies bedeutet,

dass die Konzentration an sekundärem Antikörper und Nanogoldpartikeln zwischen den Pads

variiert und die LFA – Streifen keine einheitlichen Signale entwickeln können. Auslöser dieser

Problematik ist die Herstellung der Konjugatpads, da diese in 10 cm Streifen geschnitten und

anschließend mit Goldkonjugat durchtränkt werden. Dadurch kommt es beim Trocknungs-

prozess zur Aufkonzentrierung des Goldkonjugats an den Padenden des 10 cm – Streifens, was

eine einheitliche Konjugatpadqualität verhindert. Die Ansammlung des Goldkonjugats an den

Padenden wird einerseits durch Kapillarkräfte und andererseits durch die Schwerkraft

hervorgerufen, da die Streifen sich auf Pipettenspitzen zur besseren Trocknung befinden. Die

66

Problematik ist erst bei den Versuchen zur Ermittlung der Nachweisgrenze aufgefallen, da in

diesen geringen Konzentrationsbereichen bereits minimale Veränderungen ausreichen, um die

Sensitivität der LFA – Streifen zu beeinflussen. In den Untersuchungen zur Signalstärken-

optimierung soll die Problematik unterschiedlicher Konjugatpadqualitäten durch Optimierung

des Herstellungsverfahrens gelöst werden, um die Nachweisgrenze zu verbessern und die

Messschwankungen auf ein Minimum zu reduzieren.

3.4.3 Signalstärkenoptimierung & Verbesserung der Nachweisgrenze

In den Versuchen zur Ermittlung der Nachweisgrenze wird festgestellt, dass diese beim

Parvalbumin des Kabeljaus im Bereich 4,9 μg/ml (4,6 mg/kg) liegt, jedoch die starken

Signalschwankungen keine zuverlässige und einheitliche Detektion in diesem Konzentrations-

bereich ermöglichen. Als Ursache für die Problematik wird der Herstellungsprozess des

Konjugatpads ermittelt, insbesondere der Trocknungsprozess. Demnach ist eine Optimierung des

Prozesses erforderlich, um qualitativ gleichwertige Konjugatpads herzustellen, die die

Signalschwankungen auf ein Minimum reduzieren und somit die Zuverlässigkeit des LFA –

Verfahrens erhöhen. Dafür werden die Versuchsvorbereitung der Konjugatherstellung und die

Vorbereitung des Konjugatpads angepasst. Bei der Konjugatherstellung wird das Goldkonjugat

nach dem zweiten Zentrifugieren, im Anschluss an die Abnahme des Überstands, nicht in 500 μl

PB 10 mM (pH 7,0), sondern sofort in 500 μl 5% Succrose - 1% BSA - 0,5% Tween 20 Lösung

(in 40 mM PBS, pH 7,4) resuspendiert. Normalerweise wird diese Lösung erst nach der Zugabe

von 500 μl PB 10 mM zugegeben, um das Laufverhalten des Konjugats und die Sensitivität des

Tests zu verbessern. Durch das Weglassen dieses Zwischenschrittes erhöht sich die

Konzentration des sekundären Antikörpers und die der Nanogoldpartikel im Konjugat. Dabei

wird vermutet, mit dieser Anpassung eine Verbesserung der Signalstärke und der Sensitivität zu

erzielen. Des Weiteren wird die Vorbereitung des Konjugatpads dahingehend angepasst, dass die

glasfaserartigen Konjugatstreifen bereits vor dem Tränken in Goldlösung auf eine Länge von 2

cm geschnitten werden. Dadurch soll verhindert werden, dass das Goldkonjugat sich vorwiegend

an den Padenden des 10 cm Streifens anlagert und zwischen den Konjugatpads qualitative

Unterschiede entstehen. Eine Anlagerung der Goldlösung an den Konjugatpadenden, wenn diese

sich bereits im „Endzustand“ befinden, wird als weniger kritisch betrachtet, da sich durch das

Tränken auf allen Konjugatpads annähernd die gleiche Menge Goldkonjugat befindet. Die

einzelnen Pads werden dabei mittels Pinzette direkt in das Eppendorfgefäß gegeben und

anschließend auf Pipettenspitzen getrocknet. Auf Grund der geringen Länge, die mehr Stabilität

liefert, wird ebenfalls der Einfluss der Schwerkraft beim Trocknen verringert. Alle weiteren

67

Versuchsvorbereitungen werden nach den unter den Punkten 3.3.1 und 3.3.2 beschriebenen

Methoden und nach den beschriebenen Anpassungen zur Membranbehandlung unter Punkt 3.4.1

(2% Casein-beschichtung) durchgeführt. Abbildung 26 zeigt die Trocknung der mit

Goldkonjugat durchtränkten Konjugatpads (links) und die angebrachten Konjugatpads auf den

Teststreifen (rechts).

Abbildung 26: Konjugatpadtrocknung (links) und Teststreifen mit Konjugatpads (rechts)

Anhand von Abbildung 26 wird ersichtlich, dass die durchgeführten Optimierungen, in Bezug

auf die Versuchsvorbereitung, einheitliche und qualitativ gleichwertige Konjugatpads mit einer

intensiven Rotfärbung liefern. Für die Versuche zur Signalstärkenoptimierung werden die

jeweiligen ermittelten Nachweisgrenzen der 3 Fischarten als Ansatzpunkt verwendet, um

Messbereiche für die Untersuchungen festzulegen. Es wird mit einer Verbesserung der

Signalstärke und Sensitivität durch die Anpassungen gerechnet, weshalb die Protein-

konzentrationen der 3 Fischarten weiter verringert werden. Dabei werden pro Messbereich 3

LFA – Streifen eingesetzt, sodass die Messschwankungen besser zu erfassen sind und Rück-

schlüsse auf die Effektivität der Optimierungen gezogen werden können. Es werden erneut 2

Blindstreifen (PB 10 mM, Reinstwasser) eingesetzt, wobei das Probevolumen 200 μl beträgt.

Die Proteinkonzentrationen werden mit PB 10 mM verdünnt. Tabelle 10 enthält die untersuchten

Messbereiche zur Verbesserung der Nachweisgrenze.

68

Tabelle 10: Messbereiche zur Verbesserung der Nachweisgrenze

Kabeljau Hering Alaska Seelachs

4,8 μg/ml 490 μg/ml 480 μg/ml

480 ng/ml 49 μg/ml 48 μg/ml

48 ng/ml 4,9 μg/ml 4,8 μg/ml

Die durchgeführten Anpassungen ergeben bei der Fischart Kabeljau eine Verbesserung der

Signalstärke im Konzentrationsbereich 4,8 μg/ml, wobei es zu keinen Signalschwankungen in

diesem Bereich kommt. Die Testlinien bilden sich bei allen 3 LFA – Streifen einheitlich nach 25

Minuten und die Signalintensität erreicht nach 40 Minuten ihr Maximum. Des Weiteren zeigt

jeweils ein Testreifen im Bereich 480 ng/ml und 48 ng/ml eine sehr schwache Test-

linienschattierung, die sich nach 40 Minuten entwickelt und in ihrer Intensität nicht weiter

zunimmt. Dabei sind alle weiteren LFA – Streifen negativ und erzeugten demnach kein Test-

liniensignal. Außerdem werden alle Streifen als funktionsfähig eingestuft, da sich durchweg nach

6 Minuten Kontrolllinien bilden. Auf Basis der ermittelten Ergebnisse wird die Nachweisgrenze

für Kabeljau (Parvalbumin) auf 4,8 μg/ml festgelegt, da es in diesem Messbereich zu einer

deutlichen Signalentwicklung kommt und keine Signalschwankungen innerhalb des Konzen-

trationsbereichs auftreten. Die Ergebnisse der Versuchsreihe sind in Abbildung 27 dargestellt.

Abbildung 27: Signalstärkenoptimierung Kabeljau

69

Bei der Fischart Hering bewirkt die Optimierung eine Verbesserung der Signalstärke im

Konzentrationsbereich 49 μg/ml, wobei alle 3 Teststreifen ein einheitliches Signal entwickeln

und demnach keine Signalschwankungen auftreten. Die Testlinien bilden sich nach 25 Minuten

und ihre Intensität erreicht ihr Maximum nach 40 Minuten. Im Messbereich 4,9 μg/ml wird keine

Testlinie gebildet, sodass die aus dem Hauptversuch 3.4.2 ermittelte Nachweisgrenze (49 μg/ml)

bestätigt werden kann. Demnach weist der eingesetzte monoklonale Antikörper eine

Kreuzreaktivität gegenüber Hering bis zu einer Proteinkonzentration von 49 μg/ml auf. Die

Teststreifen der Versuchsreihe entwickeln alle eine Kontrolllinie nach ca. 7 Minuten. Bei einem

Teststreifen im Konzentrationsbereich 490 μg/ml treten Probleme beim Laufverhalten auf, die

durch versehentliches Berühren mit der Fingerfläche (Fettabdruck) ausgelöst werden. Die

Ergebnisse sind Abbildung 28 dargestellt.

Abbildung 28: Signalstärkenoptimierung Hering

Bei der Fischart Alaska Seelachs bewirkt die Optimierung eine Verbesserung der Signalstärke

im Konzentrationsbereich 48 μg/ml, wobei geringere Proteinkonzentrationen keine Testlinie

erzeugen. Demnach wird auch in diesem Fall die ermittelte Nachweisgrenze (48 μg/ml) aus dem

Hauptversuch 3.4.2 bestätigt, sodass der monoklonale Antikörper Kabeljau bis zu dieser

Proteinkonzentration eine Kreuzreaktivität aufweist. Bei der Signalentwicklung in diesem

Messbereich kommt es zu keiner Signalschwankung, d. h. alle 3 LFA – Streifen entwickeln

einheitlich nach 25 Minuten eine Testlinie, die in ihrer Intensität nach 40 Minuten das Maximum

erreicht. Zudem werden auch bei dieser Versuchsreihe alle Kontrolllinien nach ca. 7 Minuten

70

gebildet, sodass die Funktionalität des LFA – Verfahrens bestätigt werden kann. Die Ergebnisse

sind in Abbildung 29 dargestellt.

Abbildung 29: Signalstärkenoptimierung Alaska Seelachs

In den Untersuchungen zur Signalstärkenoptimierung wird die Problematik der

Messschwankungen innerhalb eines Konzentrationsbereiches durch die Optimierung der

Konjugatherstellung behoben. Die Erhöhung der Antikörper – und der Goldpartikelkonzentration

durch Verringerung des Resuspendierungsvolumens sowie die Anpassung des

Trocknungsprozesses hinsichtlich einer Verkürzung der zu trocknenden Konjugatstreifen

bewirkt eine deutliche Verbesserung der Signalstärke. Insbesondere die Signalstärke im

Konzentrationsbereich der Nachweisgrenze kann bei den jeweiligen Fischproben optimiert

werden, wobei in diesem Bereich keine Messschwankungen erkennbar sind.

Das Ziel der Hauptversuche, einen LFA – Teststreifen zur Detektion des Fischallergens

Parvalbumin zu entwickeln, der eine hohe Zuverlässigkeit in Verbindung mit einer hohen

Sensitivität aufweist, wird erreicht. Des Weiteren kann durch die Hauptversuche eine

Nachweisgrenze ermittelt werden, die mit den vorhandenen Ressourcen ausgereizt wird.

71

4. Abschlussdiskussion

Das Hauptziel der Arbeit, einen LFA basierenden Schnelltest zum qualitativen Nachweis von

Fischallergenen, insbesondere des Allergens Parvalbumin, zu entwickeln, wird erreicht. Die in

den Hauptversuchen ermittelten Ergebnisse zeigen, dass die Nachweisgrenze des LFA – Tests

bezüglich der Fischart Kabeljau (Fischprotein) bei 4,8 mg/kg liegt und eine Kreuzreaktivität des

eingesetzten monoklonalen Antikörpers gegenüber Alsaka Seelachs (48 mg/kg) und Hering (49

mg/kg) besteht. Diese Sensitivität bezüglich der Nachweisgrenze ist grundsätzlich als positiv zu

bewerten, da laut der Stellungnahme 002/2010 des BfR vom 29.07.2009 der LOAEL für Fisch

zwischen 1 – 100 mg Protein / kg Lebensmittel definiert wird und demzufolge die ermittelte

Nachweisgrenze sich im unteren Bereich der LOAEL – Angabe befindet. Dabei muss jedoch

berücksichtigt werden, dass bei den durchgeführten Untersuchungen lediglich reine Fischproben

eingesetzt werden und deshalb keine Aussagen über das Detektionsverhalten des LFA – Tests in

komplexen Lebensmitteln getroffen werden können. Auf Grund dieser Tatsache müssen

Folgeversuche durchgeführt werden, in denen definierte Mengen Fischprotein (Parvalbumin)

komplexen Lebensmitteln zugesetzt werden, um den Einfluss auf die Sensitivität, Signalstärke

und das Laufverhalten zu untersuchen und die beschriebene Vorbereitung der LFA –

Komponenten ggf. anzupassen. Außerdem ist eine weitere Verbesserung der in den

Hauptversuchen ermittelten Nachweisgrenze erforderlich, weil einerseits die derzeitige

Detektionsgrenze nicht unterhalb des angegebenen LOAEL (1 – 100 mg Protein/kg Lebens-

mittel) liegt und andererseits das BfR die in der Stellungnahme 002/2010 dargestellten LOAEL –

Werte, auf Grund verschiedener Unsicherheiten, als kritisch eingestuft.

Zur Verbesserung der Nachweisgrenze existieren mehrere Möglichkeiten, die sich vorwiegend

auf den Prozess der Konjugatherstellung und der Versuchsvorbereitung beziehen. In den

durchgeführten Experimenten wird zur Konjugatherstellung kolloidales Gold mit einer sehr

geringen OD von 1,1 eingesetzt. Im Gegensatz dazu verwendet Shyu et al. (2002) [14]

kolloidales Gold mit einer OD von 5,0 und Kolosova et al. (2007) [45] setzt sogar kolloidales

Gold mit einer OD von 10,2 ein. Dabei bewirkt kolloidales Gold mit einer hohen OD ein

stärkeres Detektionssignal durch eine intensivere Linienfärbung (höhere optische Aktivität) auch

in geringen Konzentrationsbereichen. Außerdem weist die in den Versuchen eingesetzte

Goldlösung eine Partikelgröße von 40 nm auf und wird nicht eigenständig hergestellt. Wang et

al. (2009) [40] setzt ebenfalls kolloidales Gold mit einer Größe von 40 nm ein, da Goldpartikel

mit zunehmender Partikelgröße instabil werden. Des Weiteren stellt Wang et al. (2009) die

kolloidale Goldlösung eigenständig nach der durch Frens (1973) [46] beschriebenen Methode

her. Dabei besteht die Möglichkeit, Goldpartikel unterschiedlicher Größen bzw. Durchmesser zu

72

produzieren und so das Detektionssignal weiter zu verbessern. Nach Posthuma – Trumpie et al.

(2009) [32] bewirken höhere Partikelgrößen eine Verbesserung der Sensitivität. Die durch Wang

et al. (2009) beschriebene Problematik der zunehmenden Instabilität von Goldpartikeln mit

wachsendem Partikeldurchmesser ist nach Posthuma – Trumpie et al. (2009) nicht eindeutig

geklärt, da mehrere Untersuchungen unterschiedliche Ergebnisse aufweisen. Ein weiterer

wichtiger Parameter für die Konjugatherstellung ist der pH – Wert der kolloidalen Goldlösung,

wobei in den Untersuchungen 5 mM Boraxpuffer (pH 9,0) zur Komplexbildung zwischen

sekundärem Antikörper und Nanogold eingesetzt wird und für das Blocken der freien

Bindungsstellen 10% BSA – Boraxpuffer (5 mM, pH 9,0) zum Einsatz kommt. Im Gegensatz

dazu verwendet Choi et al. (2010) [42] 100 mM Boraxpuffer (pH 8,5) für die Komplexbildung

und setzt 1% BSA – PBS (10 mM pH 7,4) für das Blocken ein. Nach Wang et al. (2009) hat die

Pufferzusammensetzung einen essentiellen Einfluss auf die Stabilität der Goldpartikel, sodass

dies für die Komplexbildung zwischen Partikel und sekundärem Antikörper sehr wichtig ist. In

Folgeuntersuchungen müssen deshalb verschiedene pH – Werte und Puffer zur Optimierung der

Komplexbildung untersucht werden, weil diese ebenfalls die Sensitivität des LFA beeinflussen.

Safenkova et al. (2010) [44] beschreibt dabei unterschiedliche pH – Werte und Puffer, die zu

berücksichtigen sind. Neben den Eigenschaften der kolloidalen Goldlösung wird in der Arbeit

das Zentrifugieren als Kernprozess der Konjugatherstellung ermittelt, wobei die optimierten

Parameter 8.800 rpm für 60 Minuten bei 4°C betragen. Im Vergleich dazu zentrifugiert

Safenkova et al. (2010) bei 10.000 rpm (4°C) für 30 Minuten und Choi et al. (2010) bei 10.000

rpm für 20 Minuten. In den Untersuchungen zeigt sich, dass die hohen Drehzahlen ein Absetzten

des Goldkonjugats an der Innenwandung des Eppendorfgefäßes bewirken und das Konjugat

unbrauchbar wird. In Bezug auf die Zentrifugierzeit besteht jedoch noch Verbesserungspotential,

weshalb in Folgeexperimenten verkürzte Zeiten bei gleichbleibender Drehzahl untersucht

werden sollten, um den Vorbereitungsprozess zu optimieren.

In den durchgeführten Experimenten werden verschiedene Methoden zur Vorbehandlung der

LFA – Komponenten untersucht. Die nach Kolosova et al. (2008) [41] eingesetzte indirekte

Konjugatpadbehandlung mit 5% Succrose – 1% BSA – 0,5% Tween 20 in PBS (40 mM, pH 7,4)

sowie die Beschichtung der Membran mit 2% Casein liefern die besten Ergebnisse hinsichtlich

Signalentwicklung und Nachweisgrenze. Im Vergleich dazu kommt es beim Blocken der

Membran nach Wang et al. (2009) mit 1% BSA nicht zur Signalentwicklung. Die nach Choi et

al. (2010) beschriebene Behandlung des Sample Pads mit 5% Succrose – 5% Dextran – 0,5%

Tween 20 – 0,05 % Natriumazid führt ebenfalls zu keiner Signalentwicklung, da kein Konjugat

aus dem Konjugatpad eluiert. Ursache dafür ist vermutlich eine Verschlechterung des

73

Resolubilisierungsverhaltens des Konjugats, hervorgerufen durch das unbehandelte Konjugat-

pad. Eine interessante Vorbehandlung der Membran wird durch Guo et al. (2009) [47]

beschrieben, bei der 0,25% BSA – 0,25% PVP – 5% Succrose in PBS (10 mM, pH 8,5)

eingesetzt werden. Eine derartige Kombination von PVP und BSA wird in den durchgeführten

Experimenten nicht untersucht und sollte in Folgeexperimenten näher betrachtet werden, auch

vor dem Hintergrund, dass PVP positive Blindwerte erzeugt. Als optimaler Membrantyp für die

Untersuchungen hat sich die Membran HF Plus 240 etabliert, wobei die nach Kolosova et al.

(2008) eingesetzte HF Plus 75 sowie die nach Wang et al. (2009) verwendete HF Plus 090

schlechte bis gar keine Signale erzeugen. Ein Verbesserungspotential zur Vorbereitung der LFA

– Komponenten besteht bei den Antikörpern (sAK, pAK, IgG), da diese in den Experimenten

unverdünnt eingesetzt werden, um eine hohe Sensitivität zu erreichen. Im Vergleich dazu setzen

Wang et al. (2009) sAK – Konzentrationen von 9,6 μg/ml und pAK Konzentrationen von 1

μg/ml ein. Hingegen beträgt bei Choi et al. (2010) die sAK – Konzentration 100 μg/ml und die

Konzentration von pAK und IgG 1 mg/ml. In diesem Zusammenhang muss berücksichtigt

werden, dass eine Verringerung der Antikörperkonzentration eine Verschlechterung der

Sensitivität zur Folge hat. Zudem muss bei Folgeexperimenten die in den Experimenten

ermittelte minimale Antikörperkonzentration von 0,14 mg/ml zur Stabilisierung von 1 ml

kolloidaler Goldlösung beachtet werden. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die Menge der

immobilisierten Antikörper zu optimieren. In den Untersuchungen werden 2,5 μl unverdünnter

Antikörper (pAK / IgG) pro cm zur Immobilisierung verwendet, wobei nach Kolosova et al.

(2008) 1 μl/cm und im Falle von Wang et al. (2009) 1 μl/cm pAK und 0,5 μl/cm IgG

immobilisiert werden. Eine Reduzierung der Antikörperkonzentration beeinflusst grundsätzlich

die Sensitivität, jedoch sind ebenfalls die wirtschaftlichen Einsparungen zu berücksichtigen.

Der entwickelte Lateral Flow Assay besitzt derzeit eine Detektionsgrenze für Kabeljau von 4,88

mg Fischprotein / kg (4,88 μg/ml) sowie eine Kreuzreaktivität gegenüber Hering (49 mg/kg) und

Alaska Seelachs (48 mg/kg). Im Vergleich dazu weist der durch Faeste et al. (2008) [12]

beschriebene quantitative Sandwich ELISA zum Nachweis von Fischallergenen einen LOD von

5 mg Fisch / kg Lebensmittel (0,01 mg Parvalbumin/kg) auf. Demnach ist die Nachweisgrenze

des entwickelten LFA bereits in einem vergleichbaren Detektionsbereich, wobei Faeste et al.

(2008) ebenfalls Kabeljau untersucht. In diesem Zusammenhang muss jedoch berücksichtigt

werden, dass es sich bei Faeste et al. (2008) um einen validierten Test handelt, der in 4

komplexen Lebensmitteln, wie z. B. Suppe, Brot oder weißer Sauce, den oben genannten LOD

von 5mg/kg erreicht. Im Vergleich dazu wird in den Experimenten Parvalbumin qualitativ in

reinen Fischproben unterschiedlicher Konzentrationen nachgewiesen. Demzufolge ist der

74

Konzentrationsbereiche zwar der gleiche, jedoch ist die Sensitivität der beiden Testverfahren

anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht miteinander vergleichbar. Dafür sind weitere

Untersuchungen in den nach Feaste et al. (2008) beschriebenen komplexen Lebensmitteln

notwendig. Neben dem Sandwich ELISA stellen SPR Biosensoren ebenfalls ein Verfahren zum

Allergennachweis dar. Koppelmann et al. (2006) [4] beschreiben SPR Biosensoren, die einen

LOD von 10 ng/ml (10 μg/kg) aufweisen. Dabei handelt es sich um aufgereinigte Proteine von

Eiern und Milch, die untersucht werden, weshalb ein direkter Vergleich schwierig ist. Anhand

des durch Koppelmann et al. (2006) beschriebenen Detektionslimit im Nanogrammbereich wird

jedoch ersichtlich, dass der entwickelte LFA eine deutlich geringere Sensitivität aufweist und

weitere Optimierungen notwendig sind. Außerdem ist eine Wiederholung der Versuche, in denen

die Nachweisgrenze von 4,88 mg/kg ermittelt wird, erforderlich, sodass eine höhere

Zuverlässigkeit bestätigt werden kann. Nach Posthuma – Trumpie et al. (2009) besitzen jedoch

LFA – Formate im Allgemeinen ein sehr hohes Potential als praktikable Vor – Ort – Schnelltests

auf Grund ihrer einfachen Handhabung, hohen Sensitivität und Zuverlässigkeit, im Gegensatz zu

ELISA und SPR Biosensoren.

Letztendlich stellen die in der Arbeit ermittelten Ergebnisse eine fundierte wissenschaftliche

Grundlage dar, auf deren Basis der entwickelte LFA – Test zum Nachweis von Fischallergenen

weiter optimiert werden kann. In diesem Zusammenhang müssen die im Vorfeld beschriebenen

Sachverhalte in den Folgeexperimenten berücksichtigt werden.

75

5. Zusammenfassung

Die Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines Lateral Flow Assay zum Nachweis von

Fischallergenen, insbesondere Parvalbumin, in Lebensmitteln. Hintergrund ist die Problematik,

dass in der heutigen Zeit allergieauslösende Lebensmittel ein Problem von stetig wachsender

Bedeutung sind und ein hohes gesundheitliches Risiko für die Betroffenen mit ihnen einhergeht.

Im Falle einer Fischallergie ist für über 90% der Betroffenen das Fischallergen Parvalbumin der

Hauptverursacher einer IgE – vermittelten Immunreaktion des Körpers. Die existierenden

Nachweisverfahren, wie z. B. PCR, ELISA oder SPR – Biosensoren, sind sehr zeitaufwendig,

arbeitsintensiv, kostenintensiv und teilweise laborgebunden, zumal deren Durchführung

geschultes und qualifiziertes Personal erfordert. Im Vergleich dazu sind die Vorteile der

immunchromatographischen Technik Lateral Flow Assay kurze Analysezeiten, ein benutzer-

freundliches Format, die lange Haltbarkeit (Lagerfähigkeit) sowie die kostengünstige

Herstellung. Das Hauptziel der Arbeit ist demnach die Entwicklung eines LFA basierenden

Schnelltests zum qualitativen Nachweis von Fischallergenen, einschließlich dessen Beurteilung

hinsichtlich Funktionalität, Sensitivität und Praktikabilität im Vergleich mit anderen etablierten

Nachweisverfahren. Die Masterarbeit geht dabei auf die Entstehung von Lebensmittelallergien

und den dabei ablaufenden immunologischen Mechanismen im menschlichen Körper ein, wobei

insbesondere die Fischallergie, die rechtlichen Rahmenbedingungen zur Kennzeichnungspflicht

und deren Einfluss auf die Lebensmittelindustrie betrachtet wird. In den durchgeführten

Versuchen zur Entwicklung des LFA wird einerseits die Herstellung von Goldkonjugaten sowie

dessen Optimierung beschrieben und andererseits werden diverse Untersuchungen zur

Verbesserung der verwendeten LFA – Bestandteile Membran, Konjugatpad und Sample Pad

dargestellt. Letztendlich gelingt es, das Hauptziel der Arbeit zu erreichen, einen Kabeljau

spezifischen LFA – Test zu entwickeln und dessen Nachweisgrenze durch weitere Versuche auf

4,88 μg/ml zu optimieren. Außerdem wird eine Kreuzreaktivität der eingesetzten monoklonalen

Antikörper gegenüber den Fischarten Alaska Seelachs (48 μg/ml) und Hering (49 μg/ml)

ermittelt. Fazit der Untersuchungen ist, dass die Sensitivität grundsätzlich als positiv zu bewerten

ist, jedoch weitere Verbesserungen hinsichtlich Detektionslimit und Testeigenschaften, wie z. B.

Laufverhalten, Analysezeit oder Signalstärke, erforderlich sind. Des Weiteren sind

Folgeexperimente in komplexen Lebensmitteln notwendig, um einen praktikablen und sensitiven

Vor – Ort – Schnelltest zu entwickeln. Die Arbeit stellt demnach eine wissenschaftlich fundierte

Grundlage dar, auf der weitere Untersuchungen aufbauen können.

76

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80

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Einteilung von Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelintoleranzen .............. 7

Abbildung 2: Im menschlichen Organismus vorkommende Abwehr - und Immunzellen ........... 11

Abbildung 3: An spezifischer Immunantwort beteiligte Zelltypen ............................................... 12

Abbildung 4: Übersicht zur spezifischen Immunantwort im menschlichen Organismus ............. 14

Abbildung 5: Aufbau der Antikörpergrundstruktur (IgG) ............................................................ 15

Abbildung 6: Entstehungsprozess einer IgE vermittelten Typ-I-Allergie .................................... 18

Abbildung 7: Karpfenparvalbumin mit 2 Calcium-bindenden Seiten (lila markiert) ................... 21

Abbildung 8: Aufbau eines LFA - Teststreifen ............................................................................. 31

Abbildung 9: Funktionsprinzip des LFA Sandwich – Formats..................................................... 35

Abbildung 10: Mögliche Testergebnisse eines LFA Sandwich - Format ..................................... 36

Abbildung 11: Schematischer Teststreifenaufbau ......................................................................... 42

Abbildung 12: Kalibrierkurve zur Proteinbestimmung der Fischproben ...................................... 43

Abbildung 13: Spektralanalyse zur Optimierung der Konjugationsbedingungen ........................ 45

Abbildung 14: Photometrische Messungen z. Optimierung d. Konjugationsbedingungen .......... 46

Abbildung 15: Abgesetztes Goldkonjugat an der Innenwandung eines Eppendorfgefäßes ......... 48

Abbildung 16: Optimierte Teststreifen der Vorversuche .............................................................. 51

Abbildung 17: Teststreifen Versuche 1 - 3 ................................................................................... 53

Abbildung 18: Testreifen Versuche 4 - 5 ...................................................................................... 54

Abbildung 19: Positive Blindwerte (Wdh. Vorversuch - V6) ....................................................... 56

Abbildung 20: Antikörperpaarkombination - Versuch 2 .............................................................. 58

Abbildung 21: Antikörperpaarkombination - Versuch 3 .............................................................. 59

Abbildung 22: Folgeversuch 1 - Negative Blindwerte .................................................................. 61

Abbildung 23: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Kabeljau ............................ 63

Abbildung 24: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Hering ............................... 64

Abbildung 25: Ergebnisse zur Ermittlung der Nachweisgrenze vom Alaska Seelachs ................ 65

Abbildung 26: Konjugatpadtrocknung (links) und Teststreifen mit Konjugatpads (rechts) ......... 67

Abbildung 27: Signalstärkenoptimierung Kabeljau ...................................................................... 68

Abbildung 28: Signalstärkenoptimierung Hering ......................................................................... 69

Abbildung 29: Signalstärkenoptimierung Alaska Seelachs .......................................................... 70

81

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Einteilung menschlicher Immunreaktionen ................................................................. 10

Tabelle 2: Barrieren der passiven Resistenz ................................................................................. 10

Tabelle 3: Proteinkonzentration der Fischproben ......................................................................... 44

Tabelle 4: Parameter des Zentrifugierens bei der Konjugatherstellung ........................................ 48

Tabelle 5: Kombination verschiedener Vorbehandlungen der LFA Komponenten ..................... 52

Tabelle 6: Untersuchte Antikörperpaarkombinationen ................................................................. 57

Tabelle 7: Folgeversuche zur Antikörperpaarkombination ........................................................... 60

Tabelle 8: Konzentrationsbereiche zur Abschätzung der Nachweisgrenze .................................. 62

Tabelle 9: Konzentrationsbereiche zur Ermittlung der Nachweisgrenze ...................................... 63

Tabelle 10: Messbereiche zur Verbesserung der Nachweisgrenze ............................................... 68

82

Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt habe und keine

anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Neverin, den 24.09.2013 _________________________

Ort, Datum Unterschrift

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