Screening bioquímico para DTN y...

Belén Prieto García

Servicio de Bioquímica Clínica

AGC Laboratorio de Medicina

Hospital Universitario Central de Asturias

15 – 10 – 2014

Curso precongreso Diagnóstico prenatal: Utilización de

las herramientas de laboratorio clínico de forma conjunta

Screening bioquímico para DTN

y cromosomopatías

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

ScreeningScreening bioqubioquíímico para DTN mico para DTN

y cromosomopaty cromosomopatííasas

El Objetivo del diagnóstico prenatal NO

es conseguir bebés perfectos…

… sino ayudar a sus padres a obtener la

información que necesitan sobre la salud de su

hijo no nacido para poder tomar decisiones

informadas sobre sí mismos y su familia de

acuerdo a su propio sistema de valores.




Diagnóstico prenatal

Aplicación de pruebas de screening y diagnóstico para conocer el estado

de salud del feto con vistas a:

Manejar el embarazo

Determinar los desenlaces potenciales

Planificar complicaciones al nacimiento

Decidir sobre la interrupción del embarazo

Descubrir condiciones con posible impacto en futuras

gestaciones


Cribado Aplicación sistemática de una prueba o conjunto de pruebas a personas

que no presentan síntomas de una determinada enfermedad, para

identificar a aquellos individuos cuyo riesgo de padecerla sea lo

suficientemente alto como para que justifique posteriores

intervenciones diagnósticas o preventivas.

Seguro y fiable

Existencia de procedimiento diagnóstico aceptable


y cromosomopaty cromosomopatííasasCongreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014



1. Cribado de defectos de cierre del tubo neural (DTN)

• Hitos del diagnóstico prenatal de DTN

• Alfafetoproteína (AFP)

2. Cribado de cromosomopatías

• Hitos del diagnóstico prenatal de S Down

• Estrategias de cribado

• Cribado combinado

3. Diagnóstico prenatal no invasivo

Sumario Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014


y cromosomopaty cromosomopatííasasCribado de DTN

Día 26

Día 18

Etiología:

Combinación de factores ambientales y genéticos

Teratógenos

Déficit nutricionales: ácido fólico (Vit B12)


Bergstrand y Czar :

Descripción de la AFP

Hitos del cribado prenatal: DTN

Adaptado de J Canick. Intensive Course on Screening for

Down’s Syndrome. May 2013

Wald : MoM

Prevalencia de DTN al nacimiento en Inglaterra y Gales

1965-1997

Ác fólico: prevención primaria de los defectos de cierre del tubo neural (Wald)

Adaptado de: Wald NJ, Leck I. Antenatal and Neonatal Screening, Oxford, 2000

Wald y Cuckle: Primer programa de cribado prenatal sérico (AFP)

Wald y Brock :

Asociación AFP en LA

y SM con DTN

David Brock Univ. Edinburgh



Confirmación en LA: AFP y AChE




AFP hGC hCG/AFP

Anencefalia

Espina Bífida

N

N

Cribado de DTN AFP

• Glicoproteina con Pm 70KDa • Codificada en q11-22 del crom 4 • Detectable en SM a partir de sem 10 • 15% por semana de gestación

• Max en Sem 25

Factores que afectan a la [AFP]SM

Edad gestacional Peso materno DID Etnia nº fetos trastornos renales del feto que cursen con proteinuria anomalías estructurales fetales

Riesgo de: DTN MIU

Aborto



y cromosomopaty cromosomopatííasasCribado de DTN

Espina Bífida abierta 80-85%

Anencefalia 90-95%

No Afectados

AFP suero materno (MoM)

Entre el 50% y 70% de DTN se pueden prevenir si las mujeres toman 400 g de ácido fólico al día, antes y después del embarazo


Hitos del cribado prenatal: T21



Penrose : Asociación edad materna con riesgo de S. Down Lionel Penrose

UCL

Cribado S. Down edad materna

Lejeune y Jacobs : T21 identificada como causa de S. Down

Jerome Lejeune Univ. René Descartes, Paris

1966

Steele y Breg : Análisis cromosómico LA

Wald y Cuckle :

Asociación AFP en SM y S

Down

Howard Cuckle

Univ. of Leeds

Estimación riesgo S. Down: edad

materna + AFPSM

Bogart, Canick, Haddow, Wald y vanLith:

Desarrollo marcadores 2º trimestre

1999 Wald : Combinación de marcadores de 1º y 2º trimestre: cribado

integrado

Lo : ADN fetal libre en sangre materna

Adaptado de J Canick. Intensive Course on Screening for

Down’s Syndrome. May 2013

Nicolaides : TN como test de cribado de S Down

Wald: Combinación de marcadores ecográficos

y bioqcos para el cribado de 1er trimestre

SANGRE MATERNA


http://www.amazon.com/gp/reader/0898708125/ref=sib_dp_pt#reader-link



1997


Estrategias de cribado prenatal de cromosomopatías

La SEGO recomendó descartar la indicación de pruebas invasivas basadas únicamente en la edad materna

2005

baja efectividad alto coste

• económico • posibles pérdidas fetales





PAPP-A AFP hGC hCG/AFP uE3 InhA

Trisomía 21

Trisomía 18

Anencefalia

Espina Bífida

N

N

N

N

N

N

N


Estrategias de cribado prenatal de cromosomopatías

La SEGO recomendó descartar la indicación de pruebas invasivas basadas únicamente en la edad materna

2005

baja efectividad alto coste

• económico • posibles pérdidas fetales

1er

trimestre 2º trimestre 1er

y 2º trimestresTasa detección

(%)

TN 64-70%

Combinado

TN+PAPP-A +

hCG total o libre

Triple AFP+hCG+uE3

82-87%

Cuádruple

AFP+hCG+uE3+InhA 69%

Integrado

1er

trim:TN+PAPP-A

2º trim: Cuádruple94-96%

Secuencial88-94%

Estrategias de cribado. Tasa de detección (para un 5% de FP).

Adaptada de ACOG Practice Bulletin 2007

y propuso el CRIBADO combinado del primer trimestre (test combinado) y su implantación

en todo el territorio nacional para todas las gestantes que acudieran al obstetra antes de la semana 14

(nivel de evidencia IIb, grado de recomendación B)




y cromosomopaty cromosomopatííasashCG: Bioquímica

Síntesis: células sincitio-trofoblásticas de placenta Propiedades: Glicoprot: 70% proteína / 30% carbohidratos Pm 38 kDa 237 aa organizados en subunidades y , no unidas covalentemente

20-25% se excreta en orina intacta, el resto se degrada en tejidos

Cinética: detectable en suero materno a los 7-8 días de la concepción incremento exponencial a lo largo del 1er trimestre

se duplica cada ~48h máx: sem 8 – 11 meseta: sem 18-20

Vida media: 50 h


Mantenimiento del cuerpo lúteo

Estimulación:

- Producción de PROG por cuerpo lúteo

- Esteroidogénesis adrenal fetal

- Céls Leydig del feto masculino para producir TEST

- Esteroidogénesis placentaria (favorece captación de colesterol y aromatización)

Inmunosupresión (modulador linfocitario)

Actividad tirotrópica

hCG: Funciones ScreeningScreening bioqubioquíímico para DTN mico para DTN


Glicoproteína perteneciente a la superfamilia de las metaloproteasas

dependientes de Zn (Metzincinas)

En gestación, forma heterotetrámeros 2:2 con la proforma básica

mayor del eosinófilo (proMBP)

En no embarazadas y varones circula como homodímero (400 KDa)

PAPP-A: Bioquímica

Boldt HB, Conover CA. Growth Horm IGF Res. 2007;17(1):10-8



PAPP-A: Bioquímica ScreeningScreening bioqubioquíímico para DTN mico para DTN


Síntesis: Células sincitio-trofoblásticas de placenta Fluido folicular de céls de la granulosa Osteoblastos En quemaduras: fibroblastos En aterosclerosis: céls músculo vascular liso

Boldt HB, Conover CA. Growth Horm IGF Res. 2007;17(1):10-8

Funciones




TN elevada (>3.5mm) se asocia con mayor riesgo de:

Anomalías cromosómicas

Defectos cardíacos estructurales graves

Alteraciones esqueléticas

DTN y otras anomalías estructurales

Muerte fetal intrauterina

Acúmulo fisiológico y transitorio de líquido debajo de la piel de la nuca del bebé, observable por ecografía.

El grosor varia con las semanas de gestación.

Observable ente semanas 11-13 (óptima semana 12)

Translucencia Nucal (TN) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014



1. El feto debe ocupar 3/4 de la imagen

2. El feto debe estar en posición neutra

La hiperextensión del cuello fetal puede aumentar la TN 0.6 mm

La flexión del cuello puede reducir la TN en 0.4 mm

3. Una vuelta de cordón ( 5 -10% de casos) puede incrementar la TN 0.8 mm

4. La membrana amniótica y la nucal deben estar separadas

5. Se debe medir el máximo grosor de la translucencia subcutánea

TN Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Marcadores:

ßhCG libre

PAPP-A

TN

Cribado combinado en 1er Trimestre

Cálculo riesgo T21 y T18

corregido con edad materna y otros factores (peso materno, DM-I, tabaquismo…)

Md poblacionales propias

Md poblacionales FMF

MoM

Umbral 1: 250



Imprescindible datación ecográfica (longitud cráneo-caudal) para estimar el riesgo


Cribado combinado en 1er Trimestre



490490490490N =

Unaffected 1st Trimester

PAPP_A_MoMBHCG_MOMSAFP_MOMNT_MOM

3

2

1

0

Sanos 1er trimestre

Down syndrome First Trimester

PAPP_A_MoMBHCG_MOMNT_MOM

6

5

4

3

2

1

0

T21 1er trimestre

Trisomy 18 First Trimester

PAPP_A_MoMBHCG_MOMNT_MOM

8

7

6

5

4

3

2

1

0

T18 1er trimestre


Cálculo del Riesgo

Valor del marcador

MoM normalizado

MoM corregido

MoM

Estandarización Unidad medida: MoM

Factores de corrección

Tabaco

DID

FIV... Normalización:

log y truncajes

Riesgo final = Riesgo a priori x LR

LR

Cálculo matemático

EGeradaMedianaEsp

dorValorMarcaMoM

)(

)(

DpoblaciónSf

anapoblaciónSfLR



Indep. de edad gestacional y unidades

logMoM siguen una normal

Tesis doctoral E. Mtnez-Morillo, HUCA




DS Risk = Mat. Age Risk x LR

Discriminatory Variable

3210-1-2

1 .0

.8

.6

.4

.2

0 .0

)(

)(

DpoblaciónSf

anapoblaciónSfLR = h2/h1

h1

h2

Detección

Sanos Afectos

Riesgo final = Riesgo por Edad materna x LR

MoMTNkPAPPAkhCGMoMkY lnlnln 321

Variable discriminatoria


Cálculo matemático

V

2

332323131

3232

2

22121

31312121

2

1

)()(

)()(

)()(

xxxxxxxxx

xxxxxxxxx

xxxxxxxxx

xVxVxxxf

n

n

1

212

1exp2),...,(

2

1

2

Símbolos: μ : mediana poblacional σ : desviación estándar poblacional ρ : coeficiente de correlación xi: x1, x2,….xn : MoM de cada marcador (i)

LR = f (población sana) / f (población con SD)



Tesis doctoral E. Mtnez-Morillo, HUCA


C O N T R O L D E C A L I D A D

Control epidemiológico de la calidad global del

cribado (Captación, Seguimiento…)

Control de la exactitud del riesgo

predicho

Estudio de la evolución de las Medianas de los

MoM en el tiempo

Vigilar las tasas de detección y FP

Base de datos central

Analítico: QC interno/externo

Ecográfico: MoM TN por ecografista



S 94% FP 3.5%




Protocolo 1er trim

27 27,8 29,0

58 59,8 62,4

8 8,2 8,6

93 95,9 100,0

4 4,1

97 100,0

1 paso

2 pasos

ambos

Total

NoContestan

Total

n %

%

válido

España: Situación actual

Grupo de Trabajo Diagnóstico Prenatal SEQC (Manuscrito en elaboración)

Indicadores de evaluacion

33 34,0

14 14,4

35 36,1

82 84,5

15 15,5

97 100,0

No def inidos

Def inidos pero sin evaluación

documentada

Con evaluacion documentada

Total

No contestan

Total

n %


Métodos diagnósticos (obtención invasiva de tejido fetal)

Amniocentesis

Biopsia corial

Funiculocentesis

Métodos de cribado

Ecografía

Marcadores bioquímicos

Diagnóstico Prenatal: ¿escenario actual?

Certeza

Riesgo

Células fetales

ADN fetal

de cromosomopatías

SANGRE MATERNA



Diagnóstico Prenatal No invasivo (DPNI)


Realidad clínica desde la implementación del análisis de:

• sexo fetal

• estado rhesus D (RHD)

Relativamente sencillo: detección de genes fetales completamente

ausentes del genoma materno (alta fiabilidad mediante PCR)

Estado actual del DPNI en sangre materna

El verdadero reto es la detección eficaz de enfermedades

monogénicas fetales (ej. b-talasemia, fibrosis quística) y, sobre

todo, de anomalías cromosómicas fetales (ej. trisomía 21) con

eficacia suficiente en gestantes de bajo riesgo.

Dificultad: detectar con fiabilidad ligeras diferencias entre el

genoma materno y el fetal (ej. Mutaciones puntuales o

adición de un único cromosoma, frecuentemente materno)



Degradación de las células fetales en sangre materna

Elevado número de eritroblastos en apoptosis

Placentario

Relación entre la concentración de ADN fetal

y la edad gestacional

Aumento de la concentración de ADN fetal

en gestantes con preeclampsia

Correlación con la concentración de hCG

Detección de mARN derivado de la placenta

Transferencia directa de ADN

Presencia de ADN fetal en otros líquidos biológicos

Origen del ADN fetal libre en sangre materna



Bodurtha & Strauss, NEJM 2012


Retos técnicos del DPNI

• La cantidad de DNA fetal circulante es baja

• Existen pocos marcadores específicos de DNA fetal

• El DNA predominante en plasma materno es de la gestante



Hitos recientes que impulsaron el DPNI Análisis cuantitativo de SNPs en transcritos mRNA específicos fetales (Lo et al., 2007; Maron et al., 2007)

Análisis epigenético (Tong et al., 2006; Old et al., 2007)

Análisis proteómico (Nagalla et al., 2007)

Identificación de nuevos biomarcadores proteicos en plasma materno asociados a gestaciones portadoras de T21


Benn PA, Borrell A, Crossley J et al. Prenat Diagn 2011


y cromosomopaty cromosomopatííasasDPNI

Antes de que se implante rutinariamente el screening poblacional para S Down mediante MPS, se necesitan ensayos clínicos adicionales que aporten evidencia acerca de que sea:

• Eficaz en población de bajo riesgo

• Adecuado en sub-poblaciones como gemelos o FIV

• Ofertable de manera coste-efectiva y equitativa

• Capaz de combinarse con otros cribados, para estimar un riesgo

compuesto


- Médicamente necesario en las siguientes circunstancias:

• Edad materna 35 años en FPP

• Hallazgos ecográficos que indiquen alto riesgo de aneuploidía

• Historia previa de embarazo afecto de trisomía

• Resultado positivo en el cribado prenatal de aneuploidías

• Translocación Robertsoniana equilibrada en los progenitores, con riesgo alto para T21 o T13.

- Médicamente no necesario para embarazadas que no cumplen los criterios anteriores o gestaciones múltiples.

Se necesitan estudios más amplios para evaluar el uso de estos tests en poblaciones de bajo riesgo o embarazos múltiples.



DPNI – Recomendaciones ACOG 2012

DPNI Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Sólo evalúa T-21, T-18, T-13 Las tasas de detección son altas, pero no se detecta el 100% (screening, no diagnóstico: cada resultado positivo requiere confirmación mediante prueba invasiva)

2-3% casos no informativos, particularmente con altos IMC

En captaciones tardías, puede no dar tiempo a repetir el test o realizar PI

No ha sido evaluado extensamente en población de bajo riesgo ni en embarazos múltiples


y cromosomopaty cromosomopatííasasDPNI Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

MaterniT21

- Validado en embarazos que cumplían los anteriores criterios

- Desde Feb 2012, se comercializa MaterniT21 PLUS, que amplía el test para T18 y T13.

Verifi y Harmony Prenatal Test

- Validados en embarazos que cumplían los anteriores criterios (SG10)

- No válidos en casos de donación de óvulos

Los CDC estadounidenses crearon el modelo de procesos ACCE para evaluar tests genéticos o basados en genómica.

Los 4 componentes principales del proceso ACCE son:

. validez Analítica: Fiabilidad para medir el genotipo de interés

. validez Clínica: Consistencia y exactitud de la detección o predicción del desenlace intermedio o final

. utilidad Clínica: Probabilidad de que el test mejore significativamente el desenlace

. implicaciones Eticas, legales y sociales (CDC, 2010)




y cromosomopaty cromosomopatííasasDPNI MaterniT21 Hayes et al. (2011), Palomaki et al. (2011)

Diversos estudios indican S T21 entre 97 - 100%, 4 muestras (multiplex)

E entre 97.9 - 99.8%, con FPR 0.2% - 2.1%

• 5.6% - 6.5% de muestras excluidas del análisis por fallos en el QC preanalítico (inadecuado volumen o procesamiento inapropiado de la muestra)

• Fallos en la secuenciación hasta en un 4.4% de las muestras

• La eficacia depende del contenido guanina-citosina (GC) del cromosoma analizado (sesgo GC)

• La proporción de DNA fetal presente en el plasma materno aumenta con la edad gestacional y a menor peso materno

Aunque los estudios de validez analítica publicados proporcionan resultados prometedores, sería necesario desarrollar:

- ensayos clínicos independientes más amplios

- con protocolos estandarizados, uniformidad en los métodos de análisis

- y poblaciones de pacientes bien definidas y especificadas


Validez analítica

Revisión sistemática sobre la exactitud diagnóstica del DPNI de trisomías

fetales mediante DNA o RNA en sangre materna.

n=681 embarazos

S global 125/125 (100%)

E 552/556 (99.3%)

El DPNI de T21 por análisis de ácidos nucleicos fetales en plasma

materno parece tener una elevada exactitud diagnóstica.

Concluyen que faltan estudios prospectivos a gran escala para plantearse

la implementación en la práctica clínica.



Verweij et al. (2012)




MPS (secuenciación masiva en paralelo) no diferencia qué fragmentos de DNA proceden de la madre y cuáles del feto

Requisito: mín 4% DNA fetal en plasma materno

S 100% y E 97.9% para T21, con VPP de 96.6% y VPN de 100%,

Permite descartar T21 fetal en embarazos de alto riesgo.




Se obtuvo resultado en el 95.1% de los casos (1949 de 2049)

DPNI

Riesgo >99% en 8 T21 y 2 de 3 T18

Riesgo <1% en 99.9% (1937 de 1939) casos euploides

Identifica T21 y T18 con un 0.1% FP No reemplaza el test invasivo, si el riesgo es alto


Verifi

ClinicalTrials.gov NCT01122524 (Bianchi et al., 2012)

Ensayo MELISSA (MatErnal Blood IS Source to Accurately Diagnose Fetal Aneuploidy):

- Estudio observacional prospectivo, multicéntrico

- Incluyeron 2882 sometidas a PI

Se clasificaron correctamente:

89 de 89 T21 (S 100%)

35 de 36 T18 (S 97.2%)

11 de 14 T13 (S 78.6%)

Concluyen que son necesarios más estudios para ganar confianza en la eficacia de estos tests en población de bajo riesgo o embarazo múltiple



Harmony Prenatal Test Sparks et al. (2012)

Análisis ciego de 167 embarazos

Análisis digital de regiones seleccionadas (DANSR), combinado con

fetal-fraction optimized risk of trisomy evaluation (FORTE)

Clasifican correctamente los 36 T21 y 8 T18.

Cohorte de validación ciega, con 250 euploides, 72 T21 y 16 T18.

163 de 171 pasaron los criterios de QC.

FORTE aporta un riesgo individualizado y clasifica correctamente trisomías

Concluyen que vale en alto riesgo y que faltan estudios en medio-bajo riesgo

Harmony Prenatal Test Ashoor et al. (2012)

Caso – control nested, 11-13 SG pre PI, 300 euploides, 50 T21 y 50 T18.

S T21 100% (50/50), T18 98% (49/50), E 100% (297/297).



DPNI Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Estudio NICE 50 centros n=3228

Previo a estudio invasivo por cualquier indicación



(Norton ME et al., AJOG 2012)

DPNI

Harmony Prenatal Test



y cromosomopaty cromosomopatííasasDPNI Fetal Diagn Ther 2014

1-5% no resultado en 1ª muestra

Tiempo respuesta: promedio 10d, 95-98% 14 d, 2-5% 3-4 sem

Coste elevado




Embarazo único: Detección ~99 y 97 % para T21 y T18 (FP 0.43%)

X0 (89%) y T13 (92%): menor contenido GC, mosaicismo…

Gemelar: diferente contribución al DNA fetal, <4% del total…




Nature. 2012


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