Aus dem Institut fr Humangenetik

(Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Klaus Zerres)

SMA-Studie:

Der CNTF-Genotyp als potentieller Einflussfaktor auf den klinischen

Verlauf der infantilen spinalen Muskelatrophie

Von der Medizinischen Fakultt

der Rheinisch-Westflischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Julia Hansmeier

aus Salzkotten

Berichter: Frau Professorin Dr. med. Sabine Rudnik-Schneborn

Herr Professor Dr. med. Martin Georg Husler

Tag der mndlichen Prfung: 18.08.2014

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfgbar.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkrzungsverzeichnis..................................................................................................... III

Abbildungsverzeichnis ...................................................................................................... V

Tabellenverzeichnis .......................................................................................................... VI

1 Einleitung ................................................................................................................. 1

1.1 Klinik der infantilen spinalen Muskelatrophie ............................................................. 1

1.2 Genetik der infantilen spinalen Muskelatrophie ........................................................... 3

1.3 Einflussfaktoren auf den klinischen Verlauf der SMA ................................................. 4

1.4 CNTF ciliary neurotrophic growth factor .................................................................. 7

1.5 Fragestellung dieser Studie ........................................................................................... 9

2 Material und Methoden ........................................................................................... 10

2.1 Patientenkollektiv und klinische Daten ...................................................................... 10

2.2 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .................................... 10

2.3 CNTF-Mutationsanalyse mittels HAE III-Restriktionsverdau ................................... 13

2.3.1 PCR .................................................................................................................13

2.3.2 HAE III-Restriktionsverdau ............................................................................15

2.4 CNTF-Mutationsanalyse mittels Sequenzierung nach Sanger ................................... 16

2.5 CNTF-Mutationsanalyse mittels Pyrosequencing ...................................................... 19

2.5.1 Pyro-Primersynthese .......................................................................................21

2.5.2 PCR und Pyrosequencing ...............................................................................21

2.6 Statistik ....................................................................................................................... 23

3 Ergebnisse .............................................................................................................. 24

3.1 Kenngren fr das Gesamtkollektiv ......................................................................... 24

3.2 Fallberichte der vier Patienten mit CNTF-Genotyp homozygot mutiert .................... 25

3.2.1 Fallbericht 1: Patient 1057 ..............................................................................29

3.2.2 Fallbericht 2: Patient 1132 ..............................................................................29

3.2.3 Fallbericht 3: Patientin 254 .............................................................................30

3.2.4 Fallbericht 4: Patient 249 ................................................................................30

3.3 CNTF-Genotyp-Verteilung im Gesamtkollektiv ........................................................ 31

3.4 Analyse des CNTF-Allels auf Vorliegen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts ....... 32

Inhaltsverzeichnis

II

3.5 Analyse klinischer Parameter ..................................................................................... 33

3.6 Kaplan-Meier-Analyse fr Krankheitsbeginn und berleben .................................... 40

4 Diskussion .............................................................................................................. 45

4.1 Infantile autosomal-rezessive spinale Muskelatrophie: Pathogenese in vivo

und im Tiermodell ....................................................................................................... 45

4.1.1 SMN-Proteinmangel als Ursache der SMA ....................................................45

4.1.2 SMA-Mausmodelle.........................................................................................47

4.2 Funktion des CNTF im Tiermodell ............................................................................ 49

4.3 Ergebnisse klinischer Studien unter Bercksichtigung des CNTF ............................. 52

4.3.1 Ergebnisse aus vorangegangenen Studien zu verschiedenen neurologischen

Erkrankungen ..................................................................................................52

4.3.2 CNTF-Genotyp-Frequenz im Bezug zum Hardy-Weinberg-

Gleichgewicht .................................................................................................54

4.3.3 CNTF in Bezug auf die klinischen Parameter dieses SMA- Kollektivs .........57

5 Zusammenfassung................................................................................................... 61

6 Anhang ................................................................................................................... 64

6.1 Ergnzung zu Tabelle 8 .............................................................................................. 64

6.2 Ergnzung zu Tabelle 9 .............................................................................................. 65

6.3 Ergnzung zu Tabelle 10 ............................................................................................ 65

6.4 Ergnzung zu Tabelle 11 ............................................................................................ 67

6.5 Ergnzung zu Tabelle 13 ............................................................................................ 69

6.6 Ergnzung zu Tabelle 15 ............................................................................................ 71

7 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 72

8 Danksagung ............................................................................................................ 79

9 Erklrung zur Datenaufbewahrung .......................................................................... 80

10 Eidesstattliche Erklrung ber den Eigenanteil ........................................................ 81

Abkrzungsverzeichnis

III

Abkrzungsverzeichnis

ALS Amyotrophe Lateralsklerose AMP Adenosinmonophosphat APS Adenosin-5-Phosphosulphat Aqua dest. Aqua destillata ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar BTFp44 Basal Transcription Factor Subunit p44 bzw. beziehungsweise ca. circa CLC Kardiotrophin-like Zytokin CNTF Ciliary Neurotrophic Factor CNTF-R Ciliary Neurotrophic Factor Rezeptor alpha CPAP Continuous Positive Airway Pressure CT-1 Kardiotrophin-1 d.h. das heit dATP Desoxyadenosintriphosphat dATPS Desoxyadenosine-alpha-thio-triphosphat DdeI Restriktionsenzym aus Desulfovibrio desulfuricans ddNTPs Didesoxyribonukleosidtriphosphate DNA Desoxyribonukleinsure dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate EMG Elektromyographie et al. lateinisch: et alii, fr: und andere F-ALS Familire Amyotrophe Lateralsklerose FDR False Discovery Rate F-Primer Forward-Primer gp130 Glykoprotein 130 GTF2H2 General Transcription Factor IIH Polypeptide 2 H0 Nullhypothese H1 Alternativhypothese H4F5 = SERF1A/B

Small EDRK-rich Factor 1A/B

HAE III aus Haemophilus aegyptius isoliertes Restriktionsenzym Hinfl Restriktionsenzym aus dem Bakterium Haemophilus influenzae hnRNP heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein Particle HPLC High Performance Liquid Chromatography IL-6, IL-11 Interleukin-6 / -11 kDa kilo-Dalton LIF / LIFR Leukemia Inhibitory Factor / LIF-Rezeptor l Mikroliter M Molare Masse MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification mRNA Messenger-Ribonukleinsure MS Multiple Sklerose NAIP Neuronales Apoptose Inhibitor Protein NaOH Natriumhydroxid

Abkrzungsverzeichnis

IV

NEB New England Biolabs ng Nanogramm NGF nerve growth factor NNT-1 Novel Neurotrophin-1 NP Neuropoietin OSM Onkostatin M PCR Polymerase Chain Reaction pH potentia Hydrogenii pmn progressive motor neuropathy PPi Pyrophosphat pr-mRNA Prkursor-Messenger-Ribonukleinsure rpm revolutions per minute R-Primer Reverse-Primer s. siehe SAP Shrimp Alkaline Phosphatase SD Standardabweichung sec Sekunde SF-3 B-Zell stimulierender Faktor 3 SMA Spinale Muskelatrophie SMARD Spinal Muscular Atrophy With Respiratory Distress SMN1 = telSMN Telomerische Kopie des Survival-Motor-Neuron-Gens SMN2 = cSMN Zentromerische Kopie des Survival-Motor-Neuron-Gens SMN-Protein Survival-Motor-Neuron-Protein SNP Single Nucleotide Polymorphismus snRNP small nuclear Ribonucleoprotein Particle ssDNA Einzelstrang-DNA Ta