Stimulationsversuche mit CRH an menschlichem Myometrium

Aus der Universitäts-Frauenklinik

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br

Stimulationsversuche mit Corticotropin-Releasing

Hormone (CRH) an menschlichem Myometrium

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg i. Br.

Vorgelegt 2007

von Almut Hampel

geboren in Neuss

Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters

1. Gutachter: PD Dr. Wolfgang Schäfer

2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Ralf Gutwald

Jahr der Promotion: 2008

„Nicht der Beginn wird belohnt,

sondern einzig und allein das Durchhalten.“

Katharina von Siena

Inhaltsverzeichnis I

I Inhaltsverzeichnis

II Abkürzungsverzeichnis........................................................................IV

1 Einleitung................................................................................................ 1

1.1 Die Geburt beim Menschen...................................................................... 1

1.1.1 Anatomische Grundlagen der schwangerschaftsspezifischen Strukturen 1

1.1.2 Physiologische Zusammenhänge zur Steuerung von Schwangerschaft

und Geburt ............................................................................................... 5

1.2 Das CRH-System................................................................................... 10

1.2.1 CRH ....................................................................................................... 11

1.2.2 CRH-Bindeprotein .................................................................................. 12

1.2.3 Urocortin ................................................................................................ 13

1.2.4 CRH-Rezeptoren.................................................................................... 14

1.3 Biologische Wirkungen von CRH ........................................................... 16

1.3.1 Die Bedeutung von CRH für die Geburt ................................................. 16

1.4 Prostaglandine ....................................................................................... 19

1.4.1 Biosynthese und Metabolismus der Prostaglandine...............................20

1.4.2 Bedeutung der Prostaglandine für die Geburt ........................................ 22

1.4.3 Prostaglandin-Rezeptoren im Myometrium ............................................ 24

1.5 Zielsetzung dieser Arbeit........................................................................ 27

2 Material und Methoden ........................................................................ 28

2.1 Material .................................................................................................. 28

2.1.1 Kommerziell erhältliche Chemikalien und Lösungen.............................. 28

2.1.2 Kits ......................................................................................................... 31

2.1.3 Selbst hergestellte Puffer und Lösungen ............................................... 31

2.2 Patientinnendaten .................................................................................. 33

2.3 Methoden ............................................................................................... 36

2.3.1 Gewinnung und Präparation der Gewebeproben................................... 36

2.3.2 Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der

Prostaglandin-Synthese ......................................................................... 38

2.3.3 Lactatdehydrogenase (LDH)-Test .......................................................... 41

2.3.4 Enzymimmunoassays (EIAs) ................................................................. 43

2.3.5 Zellkultur von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen........................................... 47

Inhaltsverzeichnis II

2.3.6 Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion ....................................................... 50

2.3.7 RT-PCR ................................................................................................. 53

2.3.8 Immunhistochemie (IHC) und Immuncytochemie (ICC) ......................... 56

3 Ergebnisse............................................................................................ 61

3.1 Prostaglandinsekretion im Myometrium ................................................. 61

3.1.1 Prostacyclin............................................................................................ 61

3.1.2 PGE2 ...................................................................................................... 67

3.2 IHC und ICC........................................................................................... 68

3.2.1 Histologische Charakterisierung von Myometriumbiopsien.................... 68

3.2.2 Immuncytochemische Untersuchung von RC-4B/C1-Zellen .................. 78

3.3 ACTH-EIA als CRH-Bioassay ................................................................ 79

3.3.1 Basale Zeitkinetik ................................................................................... 80

3.3.2 Vergleich verschiedener Kulturmedien................................................... 81

3.3.3 CRH als Stimulationsfaktor .................................................................... 81

3.4 Laborinterne Qualitätssicherung ............................................................ 84

3.4.1 Vitalität der Myometriumbiopsien ........................................................... 84

3.4.2 Parallelmessungen beim 6-keto-PGF1α-EIA........................................... 86

3.4.3 Intra- und Interassayvariabilität der EIAs ............................................... 87

3.4.4 Pipettenvergleich und Kontrolle des EIA-Readers ................................. 88

3.4.5 Molekularbiologische Untersuchung von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen.91

4 Diskussion............................................................................................ 93

4.1 Untersuchungen zur Wirkung von CRH im Myometrium........................ 93

4.1.1 Prostaglandine ....................................................................................... 93

4.1.2 Histologische Charakterisierung des Myometriums ............................... 99

4.1.3 Verteilung der CRH-Rezeptoren im Myometrium................................. 101

4.2 CRH-Bioassay...................................................................................... 107

4.3 Methodische Aspekte........................................................................... 108

4.3.1 Gewebekultur ....................................................................................... 109

4.3.2 Interindividuelle Unterschiede .............................................................. 110

4.3.3 Prostaglandin-Assays .......................................................................... 111

4.4 Ausblick................................................................................................ 113

5 Zusammenfassung ............................................................................ 115

6 Literatur .............................................................................................. 116

Inhaltsverzeichnis III

III Abbildungsverzeichnis.........................................................................VI

IV Tabellenverzeichnis ............................................................................VIII

V Danksagung...........................................................................................IX

Abkürzungsverzeichnis IV

II Abkürzungsverzeichnis

3-2B12 Fibroblasten-Ak Klon 3-2B12

5B5 Fibroblasten-Ak Klon 5B5

6-keto-PGF1α 6-keto-Prostaglandin F1α

A260 Absorption bei 260 nm



Abb. Abbildung

ABC-Komplex Streptavidin-Peroxidase-Komplex

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

AFP Alpha-Fetoprotein

Ak Antikörper

AP Alkalische Phosphatase

AtT20 Maushypophysen-Zelllinie AtT20

BEL Beckenendlage

bp Basenpaare

BSA Bovines Serum Albumin

Ca2+

Calcium

cAMP Cyclisches Adenosin-Monophosphat

CAP Contraction-Associated Protein

cDNA Complementary DNA

cGMP Cyclisches Guanosin-Monophosphat

COX Cyclooxygenase

CRE cAMP-Response Element

CRH Corticotropin-Releasing Hormone

CRH-BP CRH-Bindeprotein

CRH-R1 CRH-Rezeptor 1

CRH-R2 CRH-Rezeptor 2

Cx Connexin

DcZAHL Choriale Dezidua von Patientin Nr.ZAHL

D-PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline

DAB 3,3’-Diaminobenzidin

ddH2O Wasser von mindestens doppelt-destillierter Reinheit

DEPC Diethylpyrocarbonat

DHEAS Dehydroepiandrosteronsulfat

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

DP PGD2-Rezeptor

ECCC European Collection of Cell Cultures

EDTA Ethylene Diamine-Tetra Acetic Acid

EIA Enzym-Immunoassay

EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium

EP PGE2-Rezeptor

ERK Extracellular-Signal-Related Kinase

FBS Fetal Bovine Serum

FP PGF2α-Rezeptor

Gαs/q/i-Protein Guanylnucleotid-bindendes-Protein

GR Glucocorticoid-Rezeptor

HBSS Hank’s Balanced Salt Solution

HEPES N(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethansulfonsäure

ICC Immuncytochemie

IHC Immunhistochemie

IL Interleukin

IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium

IP PGI2-Rezeptor

Abkürzungsverzeichnis V

IP3 Inositoltriphosphat

IUGR Intrauterine Growth Retardation

K Konzentration

KB Kilo-Basen

kDa Kilo-Dalton

KP Kontrollprobe(n)

LDH Lactat-Dehydrogenase

Lig., Ligg. Band, Bänder

LPS Lipopolysaccharid

MZAHL Myometrium von Patientin Nr.ZAHL

MAPK Mitogen-Activated-Protein Kinase

MLCK Myosin-Light-Chain-Kinase

mM millimolar

mRNA Messenger RNA

NADH Nicotinamidadenindinucleotid, reduziert

NADPH Nicotinamidadenindinucleotid-Phosphat, reduziert

nM nanomolar

NNR Nebennierenrinde

NO Stickstoffmonoxid

OD Optische Dichte

PZAHL Plazenta von Patientin Nr.ZAHL

PAF Platelet Activating Factor

PBS Phosphate Buffered Saline

PBT PBS-BSA-Triton

PCR Polymerase Chain Reaction

PG Prostaglandin(e)

PGDH 15-Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase

PGE2 Prostaglandin E2

PGF2α Prostaglandin F2α

PGHS Prostaglandin-H-Synthase

PGI2 Prostaglandin I2, Prostacyclin

PKA Proteinkinase A

PKC Proteinkinase C

PLA2 Phospholipase A2

PLC Phospholipase C

RC-4B/C1 Rattenhypophysen-Zelllinie RC-4B/C1

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

RT Reverse Transkription

s. siehe

S Standard

SD Standard Deviation, Standardabweichung

sog. sogenannt

SS Schwangerschaft

SSW Schwangerschaftswoche

Tab. Tabelle

TAE Tris-HCl/Acetat/EDTA

TBE Tris-HCl/Borsäure/EDTA

TNFα Tumor-Nekrose-Faktorα

TP Thromboxan-Rezeptor

UCN Urocortin

Vk Variationskoeffizient

vol Volumen

vWF von Willebrand-Faktor

wg. wegen

g Erdbeschleunigung

Z.n. Zustand nach

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Die Geburt beim Menschen

Die Geburt beim Menschen unterliegt einem komplexen Steuerungsprozess. Die

beteiligten Hormone und Signalstoffe sind zwar weitgehend identifiziert, ihre

Interaktionen zur Ruhigstellung des Uterus während der Schwangerschaft und zur

Auslösung des Geburtsvorgangs jedoch im Detail nicht endgültig geklärt. Besonders

interessant ist in diesem Zusammenhang die Determinierung der Schwangerschafts-

dauer. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden physiologischen Prozesse

bildet die Basis für Einblicke in die Pathomechanismen, die zur Frühgeburt führen. Seit

Mitte der Neunziger Jahre deuten zahlreiche Forschungsergebnisse darauf hin, dass

placentar gebildetes Corticotropin-Releasing Hormone (CRH) eine wichtige Bedeutung

als einflussreicher Faktor für Schwangerschaftsdauer und Geburtsauslösung hat [24,

67, 86, 132].

1.1.1 Anatomische Grundlagen der schwangerschaftsspezifischen Strukturen

Der Uterus ist ein unpaares muskuläres Hohlorgan, das bei der nicht-schwangeren

geschlechtsreifen Frau 7-9 cm lang und birnenförmig ist und ca. 80-120 g wiegt. Das

untere Drittel bildet die Cervix uteri, die oberen zwei Drittel das Corpus uteri, welches

oberhalb der Eileiterabgänge vom Fundus uteri kuppelartig überragt wird. Cervix und

Corpus werden durch eine 0,5-1 cm lange Enge, den Isthmus uteri, miteinander ver-

bunden.

Die ca. 3 cm lange Cervix besteht zu 90% aus Bindegewebe und bildet mit Hilfe

eines zähen, alkalischen Schleimpfropfes den festen unteren Abschluss des Uterus,

der sich erst in der peripartalen Phase öffnet.

Das Corpus uteri besteht zu 70% aus glatter Muskulatur (Myometrium), die von

einem Bindegewebsgerüst durchzogen ist. Der Innenraum des Corpus, das Cavum

uteri, ist mit Gebärmutterschleimhaut (Endometrium) ausgekleidet. Außen ist das

Corpus von Peritoneum überzogen (Perimetrium) und liegt in der Peritonealfalte des

Lig. latum uteri.

Einleitung 2

Der Isthmus wird aufgrund seines Wandaufbaus, der überwiegend aus

Bindegewebe und nur zu einem geringen Teil aus glatter Muskulatur besteht,

anatomisch zur Cervix gerechnet, obwohl seine Drüsen eher denen des Endometriums

entsprechen [165].

Während der Schwangerschaft steigt das Gewicht des Uterus um mehr als das

Zehnfache auf 1000-1500 g. Das Volumen des Cavum uteri erreicht bis zum

Entbindungstermin ca. 5 l. Dabei kommt es zu einer ausgeprägten Hypertrophie der

vorhandenen glatten Muskelzellen (von ca. 40 µm auf 800 µm Länge bei einer Verdrei-

fachung ihres Durchmessers) und einer Zunahme des Bindegewebes. Eine Muskel-

hyperplasie tritt dagegen kaum auf. Die Muskeldichte ist im Fundus und Corpus am

größten und fällt in Richtung Cervix ab. Die vordere und hintere Uteruswand enthalten

mehr Muskelgewebe als die seitlichen Wandabschnitte. Die inneren Wandschichten

des Corpus sind dabei dichter mit Myocyten durchsetzt als die äußeren. Außerdem

dehnt sich die muskuläre Wand im Schwangerschaftsverlauf und wird dadurch dünner;

am Ende der Schwangerschaft ist sie am Fundus, ausgehend von ca. 2 cm, nur noch

0,5-1 cm dick.

Die Cervix bleibt bis kurz vor der Geburt straff verschlossen, dann kommt es zu

einer Auflockerung des Gewebes durch vermehrte Flüssigkeitseinlagerung und

enzymatische Zerstörung der Kollagenfaserbündel und der bindegewebigen Grund-

substanz (Cervixreifung).

Der Isthmus dehnt und verlängert sich im Verlauf der Schwangerschaft, um dem

heranwachsenden Fetus zusätzlichen Platz zu gewähren. Ab dem 3. Trimenon wird er

als unteres Uterinsegment bezeichnet. Myometriumbiopsien für Laboruntersuchungen

können im Rahmen einer Sectio caesarea im Zuge der Wundrandbegradigung i.d.R.

nur aus diesem Segment entnommen werden.

Der uterine Blutfluss steigt vom Beginn der Schwangerschaft bis zur Geburt um

den Faktor 100 auf ca. 500 ml/min. Ab dem 3. Schwangerschaftsmonat nimmt der

Uterus, bedingt durch das Wachstum der Frucht, eine eiförmige Gestalt an [95].

Die unterschiedliche Verteilung der Muskulatur in den einzelnen Uterusabschnitten

führt zu einem differentiellen Reaktionsmuster unter der Geburt: Während der Wehen

findet eine aktive, meist vom linken Tubenwinkel des Fundus ausgehende Kontraktion

des Corpus statt. Das untere Uterinsegment kann wegen seines hohen Bindegewebs-

anteils nicht an der Wehentätigkeit mitwirken, sondern wird passiv gedehnt. Dadurch,

Einleitung 3

dass es durch die Ligg. cardinalia und sacrouterina im kleinen Becken fixiert ist, wird

es bei jeder Kontraktion (Retraktion) des Corpus uteri auseinander gezogen

(Distraktion). Die Grenze zwischen aktivem und passivem Teil des Uterus wird durch

einen Kontraktionsring, die Bandl-Furche, gebildet. Sie wandert mit fortschreitender

Geburt nach kranial und ist durch die Bauchdecke zunehmend tastbar [15, 165].

Die Placenta ist am Geburtstermin ein rundes bis ovales, scheibenförmiges Organ

im oberen oder mittleren Corpus uteri, das in der Mitte 2-4 cm dick ist, einen

Durchmesser von 15-20 cm hat und ca. 500 g wiegt. Sie ist dreischichtig aufgebaut:

Direkt ans Myometrium grenzend liegt die Basalplatte (Decidua und Syncytio-

trophoblast), daran schließen sich die Kotelydonen (Zottenbäume) an, welche zur

Fruchthöhle hin in der Chorionplatte (Syncytiotrophoblast und Cytotrophoblast) fest

verankert sind. An der maternalen Seite werden die durch Bindegewebssepten

voneinander getrennten Kotelydonen von mütterlichem Blut umspült. Der Syncytio-

trophoblast dient dabei als sog. Placentaschranke der Trennung von mütterlichem und

fetalem Kreislauf. Die fetale Seite ist von Amnion überzogen. Als gemeinsam von

Mutter und Fetus gebildetes Organ dient die Placenta der fetalen Ernährung und

Atmung sowie dem Stoffaustausch. Des Weiteren gilt sie als zentraler Ort der

hormonellen Regulation und produziert Steroid-, neuroendokrine - und schwanger-

schaftstypische Proteohormone [165].

Die Eihäute bestehen aus dem Amnion, das aus der Embryonalanlage

hervorgegangen ist, und dem von der Blastocyste gebildeten Chorion. Durch die

zunehmende Fruchtwasserproduktion in der Amnionhöhle wird das Amnion nach

außen gedrängt, bis es eng am Chorion anliegt und beide zusammen als doppelte

Wandung die Fruchthöhle umgeben. Das Chorion ist eng mit der Decidua verzahnt,

nimmt als sog. Paraplacenta aktiv am maternofetalen Stoffaustausch teil und

produziert Prostaglandine u.a. Uterotonine. Das Amnion bildet einen geringen Teil des

Fruchtwassers; seine glatte Oberfläche sorgt für eine ungehinderte Beweglichkeit von

Fetus und Nabelschnur [165].

Die Decidua ist das Ergebnis eines funktionellen und strukturellen Umbaus des

sekretorischen Endometriums. Diese „Schwangerschaftsschleimhaut“ [165] stellt die

maternale Kontaktzone zum Embryo dar. In der Frühphase der Schwangerschaft

erleichtert sie die Adhäsion und Implantation der Blastocyste, fördert die Entwicklung

der Placenta und begrenzt gleichzeitig deren Invasion in die Uteruswand. Nach

Einleitung 4

heutigem Kenntnisstand werden diese Funktionen v.a. durch immunkompetente Zellen

(Makrophagen, Granulocyten, T- und B-Lymphocyten) vermittelt, die in diesem

Stadium in großer Zahl vorhanden sind. Später dient die Decidua der Blutversorgung

der gefäßlosen Eihäute und ist für den Ionen- und Wassertransport im Fruchtwasser

von Bedeutung. Sie ist beteiligt an der Synthese von Oxytocin, Prolaktin, Relaxin, CRH

und Prostaglandinen [95, 185].

1.1.1.1 Myometrium

Das Myometrium ist die Tunica muscularis des Uterus und besteht aus vier

unscharf abgrenzbaren Muskelschichten, die durch viel Bindegewebe voneinander

getrennt und unterteilt sind. Von außen nach innen werden sie als Stratum

subserosum, Stratum supravasculosum, Stratum vasculosum und Stratum sub-

mucosum bezeichnet.

Das Stratum subserosum bildet eine dünne, longitudinal zur Uterusachse ausge-

richtete Muskelschicht. Das daran anschließende Stratum supravasculosum ist aus

mehreren, überwiegend zirkulär verlaufenden Lamellen von glatten Muskelzügen

aufgebaut. Es steht in Kontakt mit der Längsmuskulatur von Vagina und Eileiter.

Während der Schwangerschaft dienen diese beiden Schichten der Stabilisierung des

Uterus.

Das Stratum vasculosum ist die mittlere Schicht, welche die Hauptmasse des

Myometriums ausmacht. Diese Schicht enthält viele große Blut- und Lymphgefäße.

Die muskelstarken Arteriolen haben besonders in der Schwangerschaft einen korken-

zieherartig geschlängelten Verlauf und werden daher als Spiralarterien bezeichnet. Sie

setzen sich bis in das Blutgefäßsystem des Endometriums fort. Im Stratum

vasculosum sind die kurzen, dicken Muskelbündel, von denen unter der Geburt die

Wehen ausgehen, dreidimensional angeordnet.

Die innerste Schicht, das Stratum submucosum, ist ca. 5-7 mm dick und besteht

aus dicht beieinander liegenden, v.a. longitudinal ausgerichteten Muskelzügen.

Insgesamt bilden die spiralförmigen Muskelstränge des Myometriums ein Netz,

dessen Maschen während der Schwangerschaft weitergestellt werden und das so

angeordnet ist, dass sich der Kontraktionsdruck unter der Geburt optimal vom Fundus

Richtung Cervix ausbreiten kann [10, 85, 104].

Einleitung 5

Abb. 1: Bauprinzip der Uterusmuskulatur. Dargestellt sind die scherengitterartig einstrahlenden, sich überkreuzenden myometrialen Muskelzüge, die eine optimale Kraftübertragung vom Fundus Richtung Cervix gewährleisten. Aus [148].

Die Leiomyocyten zeigen im Myometrium häufig Übergangsformen zu Fibroblasten

(Myofibroblasten). Diese Zellen besitzen myofibrillenartige Bündel aus Aktin- und

Myosinfilamenten („Stressfasern“). Sie haben kontraktile Eigenschaften, nehmen aber

zusätzlich aktiv Kollagenvorläufer auf und synthetisieren die extrazelluläre Matrix.

Während sie in der ersten Zyklushälfte eher faserbildend-sekretorisch tätig sind,

verhalten sie sich in der zweiten Zyklushälfte und in der Schwangerschaft überwiegend

kontrahierend [85, 111]. Ferner kommt es in der Schwangerschaft vor, dass sich v.a.

im Stratum submucosum vorhandene undifferenzierte Bindegewebszellen in

Muskelzellen umwandeln [85].

1.1.2 Physiologische Zusammenhänge zur Steuerung von Schwangerschaft und Geburt

Mit der Geburt endet die Schwangerschaft beim Menschen im Normalfall nach 38

Wochen (40 Wochen post menstruationem). Auf dramatische Weise gibt der Uterus

seine Funktion als Schutz- und Ernährungsorgan für den Fetus auf und wird binnen

Stunden mithilfe koordinierter Wehen zum Austreibungsorgan. Dies ist mit enormen

physiologischen Umstellungsvorgängen sowohl im mütterlichen als auch im kindlichen

Organismus verbunden.

Einleitung 6

Da das Kind als „haploidentisches Allotransplantat“ [165] fremdes genetisches

Material vom Vater in sich trägt, müsste es eigentlich bei der Mutter Abstoßungs-

reaktionen hervorrufen. Diese werden verhindert, indem unter Progesteron-Einfluss in

der Frühschwangerschaft eine mütterliche Immuntoleranz aufgebaut wird, so dass der

Fetus sich unter geschützten Bedingungen entwickeln kann. Am Ende der Schwanger-

schaft wird die bis dahin stabile Balance zwischen schwangerschaftserhaltenden und

geburtsauslösenden Faktoren gestört. Der Uterus wird in subtiler Weise auf die Wehen

vorbereitet, und die mütterlichen Abwehrkräfte werden wieder aktiviert, so dass es

durch einen selektiven und kontrollierten Gebrauch von Entzündungsreaktionen zur

Geburt kommt [93]. Hierbei handelt es sich um eine Kaskade von sich gegenseitig

verstärkenden, teils irreversiblen Prozessen, die in der Cervixreifung, der Mutter-

mundsöffnung und schließlich der Austreibung des Feten eskalieren [185].

Ein großes Spektrum unterschiedlicher Signalstoffe umfasst die schwanger-

schaftserhaltenden und geburtsauslösenden Faktoren. Dazu gehören Peptide und

Proteohormone (Oxytocin, CRH, Cytokine), Steroidhormone (Progesteron, Östrogene,

Cortisol), Lipidmediatoren (Eicosanoide, Platelet Activating Factor (PAF)) sowie der

intrazelluläre Botenstoff Calcium. Als Zielgewebe dieser Signalstoffe gelten v.a. das

Myometrium, die Cervix und die Decidua, wichtige Syntheseorte sind aber auch die

Placenta und die Eihäute. Ihre Wirkung entfaltet sich über alle drei Ebenen der

hormonellen Signalübertragung (endokrin, parakrin, autokrin), und zwar in einer

Intensität, die bei kaum einem anderen physiologischen Prozess beobachtet werden

kann. Die komplexen funktionellen Wechselbeziehungen zwischen den einzelnen

Faktoren in vivo konnten trotz zahlreicher in vitro-Untersuchungen noch nicht lückenlos

geklärt werden.

1.1.2.1 Phasen der uterinen Aktivität

Der Funktionszustand des Uterus als Erfolgsorgan der Wehentätigkeit lässt sich

während Schwangerschaft und Geburt in vier Phasen einteilen: Ruhigstellung (Phase

0), Aktivierung (Phase 1), Stimulation (Phase 2) und Involution (Phase 3) [151]. Jede

Phase steht unter dem Einfluss unterschiedlicher Signalstoffe.

Phase 0 erstreckt sich über den größten Teil der Schwangerschaft und ist unter

dem Einfluss von Progesteron durch eine relative uterine Ruhe gekennzeichnet.

Progesteron wird im ersten Trimenon vom Corpus luteum und anschließend von der

Einleitung 7

Placenta gebildet; seine Serumspiegel steigen beim Menschen im Schwangerschafts-

verlauf kontinuierlich an und fallen im Gegensatz zu anderen Spezies auch bei

Wehenbeginn nicht ab. Als weitere Mediatoren, die eine relaxierende Wirkung auf das

Myometrium haben, gelten das über den Second Messenger cyclisches Adenosin-

monophosphat (cAMP) wirkende Prostacyclin (PGI2) [156] und Stickstoffmonoxid (NO),

das seine Wirkung über cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) vermittelt [14]. In

dieser Phase gibt es im Uterus wenige interzelluläre Verbindungen und somit eine

geringe elektrische Kopplung. Die Cervix bleibt fest und geschlossen.

In den letzten Wochen der Schwangerschaft beginnt Phase 1 und mit ihr die

Cervixreifung. Vasodilatorische Substanzen (z.B. Prostaglandin (PG)E2) und chemo-

taktische Cytokine, sog. α-Chemokine (z.B. Interleukin (IL)-8), wirken synergistisch,

indem sie die Invasion von neutrophilen Granulocyten begünstigen [94]. Diese setzen

Proteasen, v.a. Kollagenasen und Hyaluronidasen, und weitere inflammatorische

Cytokine frei, die das cervikale Bindegewebe erweichen und kontrolliert abbauen. Teile

der Decidua werden freigelegt, so dass die selektiven Entzündungsreaktionen auf

diese übergreifen können (Decidua-Aktivierung).

Des Weiteren wird in dieser Phase der Uterus aktiviert, indem das Myometrium für

kontraktionsauslösende Stoffe (Uterotonine) wie Oxytocin, Prostaglandine (PGE2 und

PGF2α) und PAF sensitiviert und somit seine Kontraktionsbereitschaft erhöht wird. Dies

geschieht durch die vermehrte Expression der spezifischen Rezeptoren für diese

Uterotonine. Allein die Zahl der Oxytocinrezeptoren nimmt in dieser Phase um das

Hundertfache zu [95]. Außerdem kommt es, ausgehend vom Fundus uteri, zu einer

verstärkten Ausbildung von Ionenkanälen und Gap Junctions aus Connexin-43, einem

lokal in den Myocyten synthetisierten Protein [198]. Durch die hohe Anzahl von

interzellulären Verbindungen entsteht ein funktionelles elektrisches Syncytium, das

eine synchrone Kommunikation zwischen den Zellen und somit eine einheitliche

Ausrichtung der Muskelkontraktionen ermöglicht.

Die Phase der Aktivierung steht unter dem wachsenden Einfluss von Östrogenen.

Diese werden von der Placenta durch Umwandlung von Dehydroepiandrosteron-Sulfat

(DHEAS) aus der fetalen Nebennierenrinde (NNR) gebildet; ihre Synthese nimmt im

Schwangerschaftsverlauf zu. Da die Östrogenbildung von der fetalen DHEAS-

Produktion abhängig ist, gilt der maternale Östrogen-Serumspiegel als Parameter für

den Reifegrad der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse.

Einleitung 8

Unmittelbar präpartal wird der aktivierte Uterus durch o.g. Uterotonine stimuliert

(Phase 2), so dass rhythmische Wehen entstehen. Die elektromechanische Kopplung

ist in dieser Phase optimal, die Wirkungsmöglichkeit von Oxytocin, PGE2 und PGF2α

maximal ausgebildet. Dabei kommt es erst dann zu einer koordinierten Wehentätigkeit,

wenn die kontraktionsfördernden Faktoren gegenüber den kontraktionshemmenden

überwiegen. Dies geschieht vermutlich nicht nur in Folge einer gesteigerten Produktion

von uteruskontrahierenden, sondern auch durch eine Unterdrückung von

relaxierenden Faktoren. Die Regulation erfolgt dabei weniger über eine Konzen-

trationserhöhung der stimulatorischen Substanzen im mütterlichen Blut, sondern ist in

hohem Maße von der Dichte und Sensitivität der spezifischen Rezeptoren abhängig. In

dieser Phase steigt beispielsweise die Oxytocin-Rezeptordichte nochmals um das 2-

3fache an. Im Rahmen einer positiven Rückkopplungsschleife führt die Reizung von

Dehnungsrezeptoren in der Cervix über sensorische Afferenzen zu einer weiteren

Oxytocin-Freisetzung aus dem Hypophysenhinterlappen (Ferguson-Reflex) [97]. Am

Ende der Stimulationsphase findet die Geburt des Kindes statt.

In Phase 3 wird die Placenta geboren. Durch weitere Kontraktionen (sog.

Nachwehen) beginnt der Uterus, sich unter Oxytocin-Einfluss auf seine ursprüngliche

Größe zurückzubilden (Involution). Dieser Prozess dauert ca. sechs Wochen. Eine

schnelle postpartale Kontraktion des Myometriums, die zur Abklemmung der

Spiralarterien führt, ist essentiell für die physiologische Blutstillung. Sie wird durch

einen hohen lokalen PGE2- und PGF2α-Spiegel vermittelt.

Einleitung 9

Abb. 2: Phasen der uterinen Aktivität während der Schwangerschaft und Geburt. Schwangerschaft und Geburt sind in vier Phasen unterteilt: Ruhigstellung des Uterus (Phase 0), Aktivierung des Uterus (Phase 1), Stimulation des Myometriums (Phase 2) und Involution des Uterus (Phase 3). Dargestellt sind die für jede Phase der uterinen Aktivität charakteristischen Prozesse und beteiligten Signalstoffe. Modifiziert nach [26, 185]. CRH: Corticotropin-Releasing Hormone; NO: Stickstoffmonoxid; Ca

2+: Calcium

1.1.2.2 Steuerung der Kontraktion im Myometrium

Das Myometrium ist sympathisch, parasympathisch und sensorisch über den

Plexus hypogastricus inferior innerviert. Sympathikus-vermittelt kommt es über α-

Rezeptoren zur Uteruskontraktion und Vasokonstriktion, während die parasym-

pathischen Efferenzen über β-Rezeptoren eine Relaxation des Myometriums

zusammen mit einer Vasodilatation bewirken. Dabei ist die Bedeutung der direkten

Einleitung 10

Innervation einer humoralen Rezeptormodulation durch Uterotonine (α-Rezeptoren)

und kontraktionshemmende Faktoren (β-Rezeptoren) untergeordnet. Dies steht im

Einklang mit der Beobachtung, dass die Innervationsfähigkeit des Myometriums im

Schwangerschaftsverlauf abnimmt [18]. Klinische Bedeutung hat der Einsatz von β-

Sympathomimetika (z.B. Fenoterol) zur Tokolyse.

Die Kontraktion der einzelnen Muskelzelle beruht auf der Interaktion der

kontraktilen Proteine Aktin und Myosin (Querbrückenzyklus). Nach Phosphorylierung

der regulatorischen leichten Myosinkette durch die Myosin-Light-Chain-Kinase (MLCK)

kommt es zu einem Verschieben der Aktin- gegen die Myosinfilamte. Dabei wird unter

Adenosintriphosphat (ATP)-Verbrauch die darin gespeicherte chemische Energie in

mechanische Energie umgesetzt. Die entscheidende Rolle bei der Regulation dieses

Prozesses spielt die freie intrazelluläre Calcium (Ca2+)-Konzentration. Der Membran-

depolarisierung folgt ein Einstrom von Ca2+ durch spannungsabhängige Ca2+-Kanäle,

was zu einer Stimulation der MLCK führt und somit die Kontraktion ermöglicht. Das

Protein Calmodulin dient dabei als Ca2+-Sensor. Eine Erschlaffung der Muskelzelle

erfolgt durch einen Abfall der Ca2+-Konzentration durch Wiederaufnahme von Ca2+ ins

endoplasmatische Retikulum, Ausstrom über energieabhängige Membrankanäle oder

Austausch von Ca2+ gegen Natrium [95].

Essentielle Voraussetzung für synchronisierte Kontraktionen der Einzelzellen und

somit eine koordinierte Wehentätigkeit ist eine interzelluläre Erregungsleitung durch

die Ausbildung von Gap Junctions. Grundsätzlich können alle Myocyten spontan

depolarisieren. Diejenigen Zellen, deren Erregungsschwelle am niedrigsten ist und am

schnellsten erreicht wird, haben eine Schrittmacherfunktion für den gesamten Uterus.

Meistens findet sich ein Erregungszentrum im Fundus im Bereich eines Tubenwinkels,

von dem aus sich die Kontraktionen mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 cm/s Richtung

Cervix bewegen [97].

1.2 Das CRH-System

CRH entfaltet seine Wirkung durch Bindung an zwei membranständige Rezeptor-

Isoformen (CRH-R1 und CRH-R2), von denen jeweils noch weitere Subtypen

existieren. Neben CRH binden an diese Rezeptoren auch die verwandten Polypeptide

Einleitung 11

Urocortin I-III. Außerdem existiert ein CRH-Bindeprotein (CRH-BP), welches durch

Bindung an CRH dessen Bioverfügbarkeit herabsetzt.

1.2.1 CRH

CRH ist ein 41 Aminosäuren langes Polypeptid, das 1981 als hypothalamisches

Neuropeptid charakterisiert wurde [211]. Durch Auslösung einer Reaktionskaskade

koordiniert es die neuroendokrine Stressantwort. Im Hypothalamus wird es

vornehmlich in den Nuclei paraventriculares aus einem 191 Aminosäuren langen Pro-

Hormon gebildet. Über das hypophysäre Portalgefäßsystem gelangt es in die

Hypophyse, wo es im Vorderlappen die Ausschüttung von Adrenocorticotropem

Hormon (ACTH) reguliert. ACTH erreicht über den Körperkreislauf die NNR und

stimuliert dort die Cortisolausschüttung. Cortisol und ACTH wirken im Sinne einer

negativen Rückkopplungs-Schleife hemmend auf die hypothalamische CRH-

Ausschüttung, während Stress in all seinen Erscheinungsformen (physisch, psychisch

sowie auf zellulärer Ebene) einen positiven Impuls darstellt.

Kurze Zeit nach seiner Erstbeschreibung wurde CRH auch außerhalb des Hypo-

thalamus nachgewiesen, zunächst weit verbreitet im Zentralen Nervensystem (ZNS),

dann auch in peripheren Organen. 1982 wurde es erstmalig in der Placenta gefunden

[192], später in weiblichen und männlichen Reproduktionsorganen: Myometrium [36],

Endometrium [127], Ovarien [126], Hoden [205]. Während die CRH-Sekretion im ZNS

vornehmlich unter neuronaler Kontrolle steht, wird das periphere CRH ausschließlich

durch humorale Faktoren reguliert: Die Synthese und Freisetzung von CRH werden

von PGE2 und PGF2α, Noradrenalin, IL-1 und Oxytocin stimuliert, von Progesteron und

NO hingegen gehemmt [132]. Überdies wirkt Cortisol stimulierend auf die placentare

CRH-Synthese. Diese positive Rückkopplungs-Schleife steht im krassen Gegensatz zu

den Wirkungsmechanismen im Hypothalamus.

Bei nicht-schwangeren Frauen ist CRH im peripheren Plasma bei einer

Konzentration von 10-20 pg/ml kaum nachweisbar. In der Schwangerschaft steigen die

CRH-Plasmaspiegel kontinuierlich an. Ab der 35. Schwangerschaftswoche ist ein

exponentieller Anstieg zu verzeichnen, der seinen Höhepunkt unter der Geburt findet;

die während der Wehentätigkeit messbaren Konzentrationswerte von 1000-10000

pg/ml entsprechen den Konzentrationen im hypophysären Portalgefäßsystem in

Einleitung 12

Stresssituationen [132]. Die mögliche Bedeutung dieser Befunde für die

Geburtsauslösung wird in Kapitel 1.3.1 näher besprochen werden. Post partum

normalisiert sich die CRH-Konzentration im mütterlichen Plasmaspiegel innerhalb von

wenigen Tagen.

Eine Schwierigkeit bei der Untersuchung des Zusammenhangs zwischen placentar

gebildetem CRH und der Geburt beim Menschen besteht darin, dass nur die Placenta

von Primaten die Fähigkeit besitzt, CRH zu bilden [176]. Bei Pavianen [57] und

Rhesusaffen [54] steigen zwar im Laufe der Schwangerschaft die CRH-Plasmaspiegel

an, doch ein exponentieller Anstieg wenige Wochen vor dem Geburtstermin ist nur bei

Gorillas und Schimpansen zu beobachten [200]. Diese Tatsache schränkt die

Erhebung experimenteller Daten stark ein, da die üblichen Tiermodelle nicht

herangezogen werden können.

1.2.2 CRH-Bindeprotein

Das CRH-Bindeprotein (CRH-BP) ist ein 322 Aminosäuren langes, 37 kDa

schweres Glykoprotein, das nur bei Menschen und Gorillas zu finden ist [168, 200].

Außer in der Leber, dem Hauptsyntheseort, und im ZNS [168] wurde CRH-BP-mRNA

bisher in der Placenta, den Eihäuten und der Decidua [163], jedoch nicht im

Myometrium nachgewiesen. Als einziges spezifisches Bindeprotein für Neuropeptide

verhindert es die Interaktion von CRH mit den CRH-Rezeptoren und blockiert auf diese

Weise dessen Bioaktivität. Während andere Bindeproteine als Trägersubstanzen für

Hormone dazu dienen, die Halbwertszeit ihrer Liganden zu verlängern, bewirkt CRH-

BP ein schnelles Verschwinden von CRH und auch UCN aus dem Blutkreislauf [182].

Dabei ist die Bindung von CRH an CRH-BP zeit- und dosisabhängig.

Bei Nicht-Schwangeren und während des größten Teils der Schwangerschaft liegt

die CRH-BP-Konzentration im peripheren Plasma deutlich höher als die von CRH, so

dass zirkulierendes CRH weitgehend in gebundener Form vorliegt. Somit wird eine

Stimulation der Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse durch placentar gebildetes

CRH verhindert, und die ACTH-Ausschüttung in der Hypophyse bleibt trotz steigender

CRH-Plasmaspiegel unbeeinträchtigt. In den letzten Schwangerschaftswochen sinken

die CRH-BP-Konzentrationen im mütterlichen Plasma stark ab, so dass es zu einer

Sättigung des vorhandenen CRH-BP kommt und zunehmend freies, biologisch aktives

Einleitung 13

CRH zirkuliert [113, 131]. Dieser Effekt trägt zu dem oben erwähnten exponentiellen

CRH-Anstieg bei. Innerhalb von 48 Stunden nach der Geburt steigen die CRH-BP-

Spiegel wieder auf das Niveau vor Beginn der Schwangerschaft [132].

Abb. 3: Die mütterlichen Plasmaspiegel von CRH und CRH-BP im Schwangerschaftsverlauf. Aufgetragen sind die Mittelwerte ± SD der bei 485 Patientinnen gemessenen Konzentrationen an immunreaktivem CRH (offene Kreise) bzw. CRH-BP (ausgefüllte Quadrate) im maternalen Plasma gegen die Tage bis zur Geburt. Aus [131].

1.2.3 Urocortin

Urocortin ist ein 40 Aminosäuren langes, CRH-verwandtes Peptid, das erstmals

1995 im Rattenhirn nachgewiesen wurde [213]. Inzwischen wurden zwei weitere

Urocortin-Formen entdeckt: Urocortin II und -III [112, 175]. Die DNA-Sequenz von

Urocortin weist eine 63%ige Homologie zu Urotensin aus Fischen und eine 41%ige

Homologie zu humanem CRH auf [40]. Als CRH-Agonist bindet es mit ähnlich hoher

Affinität an CRH-BP und CRH-R1 und kann dieses kompetitiv verdrängen. Seine

Affinität zu CRH-R2 und auch seine Second-Messenger-Aktivität liegen um ein

Vielfaches höher als jene von CRH, so dass es als endogener Ligand von CRH-R2

vorgeschlagen wurde [213]. Ebenso wie CRH stimuliert es über beide CRH-

Rezeptoren die cAMP-Produktion und ist in der Lage, die Hypothalamus-Hypophysen-

NNR-Achse zu aktivieren [40]. Außer im ZNS wurde Urocortin im Gastrointestinaltrakt

[143], auf Lymphocyten [6], in der Placenta, den Eihäuten und der glatten

Gefäßmuskulatur des Myometriums [161] nachgewiesen. Auf die fetoplacentare

Einheit wirkt es 30-mal stärker vasodilatorisch als CRH. Diese Beobachtung führte zu

der Hypothese, dass Urocortin lokal produziert wird und regulatorisch auf die

Einleitung 14

uteroplacentare Durchblutung wirkt [33]. Der Nachweis in den intrauterinen Geweben

und im maternalen Plasma war allerdings nicht von allen Forschungsgruppen

reproduzierbar, so dass fraglich bleibt, welche Rolle Urocortin bei der Geburt spielt [48,

56]. Ein Anstieg der Urocortin-Plasmaspiegel analog zum Verlauf des CRH-Spiegels in

den letzten Wochen der Schwangerschaft wurde jedoch von keiner Arbeitsgruppe

beschrieben.

1.2.4 CRH-Rezeptoren

Die CRH-Rezeptoren gehören zur Klasse II der heptahelikalen Guanylnucleotid-

bindenden (G-)Protein-gekoppelten Rezeptoren, welche die Zellmembran siebenmal

mit α-Helices durchspannen [60, 204]. Sie vermitteln die Wirkung ihrer Liganden CRH

und Urocortin vorwiegend über die Adenylatcyclase, den Second Messenger cAMP

und die Proteinkinase (PK)A [62], es sind aber auch andere Signaltransduktionsketten

nachgewiesen worden, bei denen Ca2+ als Second Messenger und verschiedene

Kinasen eine Rolle spielen [179]. Beim Menschen wurden zwei Rezeptor-Subtypen,

CRH-R1 und CRH-R2, gefunden, die auf unterschiedlichen Genen codiert sind [126,

128]. Ihre Aminosäuresequenzen sind zu 70% identisch [39].

Das CRH-R1-Gen liegt auf Chromosom 17q21. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit

waren vier durch differentielles Spleißen entstandene Rezeptor-Isoformen bekannt,

CRH-R1α, -R1β, -R1c und -R1d [64]. Seitdem wurden noch vier weitere Isoformen

identifiziert, nämlich CRH-R1e-h [122]. Die codierende Sequenz des CRH-R1β liegt

auf allen 14 Exons, die anderen Isoformen weisen jeweils typische Deletionen auf.

CRH und Urocortin haben eine ähnlich hohe Affinität zu CRH-R1, wobei die Affinität

von CRH in der Spätschwangerschaft ansteigt [74].

Das CRH-R2-Gen liegt auf Chromosom 7p14. Als Spleißvarianten entstehen die

Rezeptor-Isoformen CRH-R2α, -R2β und -R2γ, die sich nur in ihrer N-terminalen

Sequenz unterscheiden [159]. Zu CRH-R2 weist Urocortin eine deutlich höhere

Affinität auf als CRH [213].

Viele der genannten Rezeptor-Isoformen sind bisher nur auf mRNA-Ebene

identifiziert. Inwieweit sie tatsächlich in funktionelle Proteine umgeschrieben werden,

ist noch ungeklärt.

Einleitung 15

Abb. 4: CRH-R1 beim Menschen mit seinen Spleißvarianten. Die gesamte Sequenz stellt den Rezeptor-Subtypen CRH-R1β dar. Gekennzeichnet sind die den anderen Subtypen fehlenden Sequenz-Abschnitte. Modifiziert nach [64].

Außerhalb des ZNS wurde CRH-R1 in der Nebenniere, in der Haut, in den Ovarien

und Hoden gefunden [27], CRH-R2 in peripheren Blutgefäßen, in der Skelett- und

Herzmuskulatur sowie im Gastrointestinaltrakt [115].

Zur räumlichen Verteilung der Rezeptoren in den intrauterinen Geweben liegen

teilweise widersprüchliche Ergebnisse vor. CRH-R1 wurde im Myometrium von

mehreren Forschungsgruppen sowohl bei Schwangeren als auch bei Nicht-

Schwangeren nachgewiesen [58, 59, 178, 203]. Grammatopoulos et al. [58, 61] fanden

heraus, dass bei Nicht-Schwangeren die Rezeptor-Isoformen CRH-R1α und R1-β

sowie CRH-R2β vorkommen, während in der Schwangerschaft außerdem -R2α und

am Termin zusätzlich noch -R1c und -R1d exprimiert werden. Die Expression von

CRH-R2 in gravidem Myometrium [58, 80, 178, 203, 218] bzw. Placenta, Eihäuten und

Decidua [47, 87] konnte jedoch nicht von allen Forschungsgruppen bestätigt werden.

Im Hinblick auf die unterschiedlichen Funktionen der verschiedenen Bereiche des

Uterus unter der Geburt (starke Kontraktionen im Corpus uteri bei Relaxation des

unteren Uterinsegments) wird eine variable Verteilung der CRH-Rezeptoren im

Myometrium diskutiert [117, 203]. Außerdem wird vermutet, dass sich im Verlauf der

Schwangerschaft im Myometrium das CRH-Rezeptor-Expressionsmuster und mit ihm

Einleitung 16

die Second-Messenger-Bildung durch eine unterschiedliche G-Protein-Kopplung

verändert [60]. Bis wenige Wochen vor der Geburt trägt CRH durch Bindung an CRH-

R1α über PKA und einen Gαs-Signaltransduktionsweg zur Ruhigstellung des

Myometriums bei, dann jedoch werden Rezeptoren exprimiert, die über einen Gαq-

Signaltransduktionsweg und PKC zu Kontraktionen der Myocyten führen [67]. Zu

diesem Effekt trägt eine Oxytocin-vermittelte Desensitivierung der ursprünglichen

CRH-R1α bei [65].

1.3 Biologische Wirkungen von CRH

Seit seiner Erstbeschreibung 1981 sind neben der namensgebenden Wirkung als

Aktivator der Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse im Rahmen der neuroendo-

krinen Stressantwort (ACTH heißt im Englischen „Corticotropin“) eine Vielzahl weiterer

CRH-Funktionen bekannt geworden. So spielt CRH eine Rolle in weiblichen und

männlichen Reproduktionsorganen (Ovulation, Geschlechtshormonsynthese), bei der

Regulation von lokalen Stressreaktionen der Haut, cardiovaskulären Reaktionen,

Emotionen (Ängste, Depressionen), kognitiven Fähigkeiten (Aufmerksamkeit,

Erinnerung), Ess- und Sozialverhalten, und als proinflammatorischer Mediator in

lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen [24, 107, 118, 202, 216].

Interessanterweise lassen sich diese scheinbar ganz unterschiedlichen Funktionen

ebenfalls unter der zentralen Aufgabe von CRH, nämlich der Koordination sämtlicher

neuroendokrinen, vegetativen, elektrophysiologischen, immunologischen und

verhaltensbezogenen Adaptationsvorgänge des Körpers in Stresssituationen, sub-

sumieren. Zweifellos stellt auch die Geburt einen durch Stress gekennzeichneten

Prozess dar, da sowohl im mütterlichen als auch im kindlichen Organismus innerhalb

weniger Stunden immense physiologische Umstellungsleistungen erbracht werden

müssen. In den folgenden beiden Abschnitten soll daher die Bedeutung von CRH für

die Geburt näher beleuchtet werden.

1.3.1 Die Bedeutung von CRH für die Geburt

Zahlreiche Untersuchungen deuten auf einen Zusammenhang zwischen

maternalen CRH-Plasmaspiegeln und dem Zeitpunkt der Geburt hin [21, 43, 78, 100,

Einleitung 17

214]. McLean et al. [131] zeigten in einer Studie mit fast 500 Patientinnen, dass der ab

Anfang des zweiten Trimenons beobachtete, in den letzten Schwangerschaftswochen

exponentielle CRH-Anstieg (s. 1.2.1) bei Frauen, die später eine Frühgeburt hatten,

einen besonders schnellen, steilen Verlauf hatte, während er sich bei Frauen, die über

den errechneten Termin hinaus übertrugen, deutlich langsamer entwickelte. Schon bei

der ersten Blutentnahme in der 16.-18. SSW war bei ersteren Frauen der CRH-Spiegel

gegenüber später termingerecht Entbindenden erhöht, bei letzteren erniedrigt. Daraus

entstand die Hypothese, dass die Dauer der Schwangerschaft durch eine anhand des

CRH-Spiegels abzulesende „placentare Uhr“ schon zu einem frühen Gestations-

zeitpunkt determiniert wird: Ein frühzeitig hoher CRH-Spiegel würde demnach zu einer

ebenfalls frühzeitigen Sättigung von CRH-BP führen, und der daraus folgende Anstieg

des freien, biologisch aktiven CRH würde geburtsauslösende Mechanismen triggern.

Eingehende Untersuchungen haben inzwischen allerdings gezeigt, dass die alleinige

Bestimmung der CRH-Konzentration einen relativ niedrigen prognostischen Wert für

eine drohende Frühgeburt hat, da zum einen große interindividuelle Unterschiede

zwischen den Konzentrationswerten verschiedener Patientinnen bestehen und zum

anderen ein niedriger CRH-Wert die Möglichkeit einer Frühgeburt, die durch

pathologische Ereignisse wie aszendierende Infektionen ausgelöst wird, nicht

ausschließt. Dennoch korreliert ein frühzeitiges hohes CRH-Konzentrations-Niveau

relativ spezifisch mit einem stark erhöhten Risiko für eine Frühgeburt. Durch eine

Bestimmung weiterer Parameter, beispielsweise Alpha-Fetoprotein (AFP) und

Fibronektin sowie Östradiol im Speichel, könnte es gelingen, eine genauere

Vorhersage über den Zeitpunkt der Geburt zu treffen [26, 132].

Bis kurz vor der Geburt wird die Produktion von placentarem CRH durch

Progesteron supprimiert. Durch die Reifung der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-

NNR-Achse oder auch durch fetalen Stress wie Hypoxie kommt es in den letzten

Schwangerschaftswochen zu steigenden Cortisolspiegeln. Diese stimulieren para-

doxerweise die Genexpression und Sekretion von CRH in der Placenta [28, 101, 177],

so dass es am Ende der Schwangerschaft bei steigenden CRH-Spiegeln zu einer

positiven Rückkopplungsschleife kommt, die die CRH-Konzentration weiter ansteigen

lässt. Dies steht im krassen Gegensatz zur Regulation des hypothalamischen CRH,

welches im Sinne einer negativen Rückkopplungsschleife durch Cortisol gehemmt

wird.

Einleitung 18

Die hohe Cortisolkonzentration in der Spätschwangerschaft trägt zur Reifung der

fetalen Lunge bei, indem sie die Produktion von Surfactant A und Phospholipiden

fördert.

Ein weiterer Effekt von placentarem CRH ist die direkte Stimulation der DHEAS-

Synthese in der fetalen Nebennierenrinde [199]. Dieses androgene Steroid gelangt

über den kindlichen Kreislauf in die Placenta und wird dort als Substrat für die

Östrogensynthese verwendet. Die zunehmende Östrogendominanz im mütterlichen

Kreislauf antagonisiert die ruhigstellende Wirkung von Progesteron auf den Uterus,

indem sie die Expression von Oxytocinrezeptoren und die Bildung von Gap Junctions

im Myometrium sowie die Prostaglandin-Synthese in den Eihäuten stimuliert, so dass

der Uterus kontraktionsbereit wird (Phase 1 der uterinen Aktivität; s. 1.1.2.1). CRH hat

demnach einen indirekt stimulatorischen Effekt auf die myometriale Kontraktilität.

Eine direkte Steigerung der Kontraktilität durch CRH ließ sich zwar nicht

nachweisen, doch zeigten sich in vitro synergistische Effekte mit den Uterotoninen

Oxytocin und PGF2α, deren Wirkung CRH deutlich verstärkte [8, 170]. Allerdings ießen

sich diese Effekte nicht von allen Forschungsgruppen zweifelsfrei nachweisen [193].

Neben der Stimulierung von DHEAS und Cortisol in der fetalen Nebennierenrinde

stellt ein starker vasodilatorischer Effekt auf die fetoplacentare Einheit und die uterinen

Gefäße die am besten beschriebene Wirkung von placentarem CRH dar [34, 108].

Dieser Effekt wird über eine NO/cGMP-abhängige Signaltransduktionskaskade

vermittelt [35]. Dadurch wird ein verstärkter Zustrom von Signalstoffen und energie-

liefernden Molekülen ermöglicht.

Eine zweite positive Rückkopplungsschleife, in die CRH eingebunden ist, findet

sich in den Eihäuten. Hier wurden direkte parakrine Effekte von CRH zur Stimulation

der Prostaglandin-Synthese beschrieben [83]. Diese führen wiederum zu einer

gesteigerten CRH-Synthese in der Placenta und den Eihäuten [162, 164]. Cortisol

bildet eine Schnittstelle der beiden beschriebenen positiven Rückkopplungs-

mechanismen, indem es einerseits die Expression des Schrittmacher-Enzyms der

Prostaglandin-Synthese, die Prostaglandin-H-Synthase (PGHS)-2, aktiviert [53] und

andererseits ihr Haupt-Abbauenzym, die 15-Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase

(PGDH), supprimiert [158].

Einleitung 19

1.4 Prostaglandine

Tab. 1: Übersicht über wichtige Prostaglandin-Effekte. Dargestellt sind beispielhafte Prostaglandin-Wirkungen in verschiedenen Organsystemen und Gewebearten. Modifiziert nach [225] und [135].

Organsystem/Gewebe Prostaglandin Wirkungen

PGF2α Kontraktion

PGE2 Kontraktion oder Relaxation

Prostacyclin Relaxation

Glatte Muskulatur

Thromboxan Kontraktion

Prostacyclin Vasodilatation Herz-Kreislauf-System

Thromboxan Vasokonstriktion

Prostacyclin Thrombocyten-Aggregationshemmung

Blut

Thromboxan Thrombocyten-Aggregation

PGF2α Steigerung der Aktivität Gastrointestinaltrakt

PGE2 Steigerung der Aktivität,

Hemmung der Säuresekretion

Niere PGE2, Prostacyclin Natriurese,

Reninfreisetzung

Männliche Geschlechtsorgane PGE2 Erektion, Ejakulation, Spermientransport

Weibliche Geschlechtsorgane PGF2α, PGE2 Geburt/Wehen, Menstruation, Ovulation, Befruchtung

Knochen PGE2 Knochenbildung, Knochenresorption

PGF2α Bronchokonstriktion

PGE2 Brochodilatation

Bronchialsystem

Thromboxan Bronchokonstriktion

Haut PGF2α, PGE2 Entzündungsförderung

Die Prostaglandine dienen als Lipid-Mediatoren der Signal-Vermittlung zwischen

dem Gesamtorganismus bzw. der Umwelt und der einzelnen Zelle. Im Gegensatz zu

„echten“ Hormonen werden sie lokal produziert, vermitteln aber hormonartige Effekte

innerhalb der Zelle. Aufgrund dessen sind sie Teil eines Netzwerks der inter- und

intrazellulären Kommunikation [124]. Außer in Erythrocyten werden sie in allen Zellen

des Körpers synthetisiert und sind somit an allen wichtigen physiologischen Prozessen

beteiligt [72, 135]. Auf ihre Bedeutung für die Geburt soll in den folgenden Abschnitten

näher eingegangen werden; eine Übersicht über ihre Funktionen in anderen

Organsystemen gibt Tab. 1. Charakteristisch für alle Prostaglandine ist ihre äußerst

Einleitung 20

geringe Konzentration im Gewebe, ihre bedarfsabhängige lokale Produktion und ihr

rascher Abbau zu biologisch weitgehend inaktiven Metaboliten [225]. Ihre

Halbwertszeit im Blutkreislauf beträgt weniger als eine Minute [41].

1.4.1 Biosynthese und Metabolismus der Prostaglandine

Die Prostaglandine gehören als Abkömmlinge der mehrfach ungesättigten C-20-

Fettsäure Arachidonsäure neben den Leukotrienen zu den Eicosanoiden. Ihre Bio-

synthese verläuft in drei Stufen [196]: Zunächst wird Arachidonsäure durch Phospho-

lipase (PL)A2 und -C aus Phospholipiden der Zellmembran mobilisiert. Während PLC

in den Eihäuten gleich bleibend exprimiert wird, steigt die PLA2-Expression im

Schwangerschaftsverlauf an, was auf eine Bedeutung für die uterine Arachidonsäure-

Mobilisierung hindeutet [38]. Im nächsten Schritt wird die Arachidonsäure durch die

Cyclooxygenase (COX)-Aktivität der PGHS in PGG2 umgewandelt und anschließend

durch ihre Peroxidase-Aktivität zu PGH2 reduziert. Nach seiner Cyclooxygenase-

Aktivität wird die PGHS im weiteren Text als COX bezeichnet. Dieses Enzym liegt in

zwei Isoformen vor. Die COX-1 wird konstitutiv in fast allen Körperzellen exprimiert,

während die COX-2 induzierbar ist. Dies geschieht v.a. durch Cytokine und

Wachstumsfaktoren im Rahmen inflammatorischer Prozesse [72] und wird vermittelt

über eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor (NF)κB [7, 106]. Die

letzte Stufe der Prostaglandin-Synthese beinhaltet die Umwandlung von PGH2 in

PGE2, PGF2α, PGD2, Thromboxan und Prostacyclin durch spezifische Synthasen. Ihr

Abbau erfolgt durch Oxidierung zu biologisch weitgehend inaktiven 15-keto- und

13,14-dihydro-keto-Metaboliten durch die NAD+-abhängige PGDH [44].

Im Schwangerschaftsverlauf ist ein Anstieg der Prostaglandin-Spiegel im Plasma

und Urin zu beobachten, der u.a. auf einer gesteigerten Aktivität der induzierbaren

COX-2 im Amnion und Myometrium beruht [45, 197]. Sie ist am Termin ca. 100fach

stärker exprimiert als die konstitutive COX-1, deren Expression sich weder während

der Schwangerschaft noch unter der Geburt verändert [194, 195]. Zur myometrialen

COX-Aktivität unter der Geburt liegen zwar von verschiedenen Forschungsgruppen

z.T. kontrovers Befunde vor [73, 228], die bei unterschiedlichen Untersuchungen eine

gesteigerte, eine gleich bleibende, respektive erniedrigte Enzymaktivität feststellten,

doch zweifellos ist die COX-Aktivität im Myometrium von Schwangeren höher als bei

Nicht-Schwangeren [141]. Im Laufe der Schwangerschaft aktiviert die mechanische

Einleitung 21

Dehnung des Myometriums durch den wachsenden Fetus die COX-2 und führt auf

diesem Weg zu einer gesteigerten Prostaglandin-Produktion im Myometrium. Dies ist

möglicherweise als Gegenregulations-Mechanismus zu werten, der die katabolen

Effekte des in der Schwangerschaft auftretenden Hypercortisolismus und die durch

Cortisol hervorgerufene Hemmung der myometrialen Prostacyclin-Synthese anta-

gonisiert [32].

Im Amnion bewirkt CRH eine COX-2-vermittelte Steigerung der Prostaglandin-

Synthese durch eine Stimulation proximaler Calcium/cAMP Response Element (CRE)-

Sequenzen [23, 84, 207]. Während Glucocorticoide in den meisten Zelltypen

hemmend auf die COX-2 wirken, üben sie in den Eihäuten paradoxerweise einen

stimulierenden Effekt aus [137, 227].

Im Amnion ist fast keine PGDH-Aktivität zu beobachten [29, 152], im Chorion zeigt

sie hingegen eine sehr hohe Aktivität. Nach einer gängigen Vorstellung dient sie somit

als relative metabolische Barriere für die Passage kontraktil wirkender Prostaglandine

aus dem Amnion in die Decidua und das Myometrium, wo sie Kontraktionen auslösen

würden [145, 152]. Tatsächlich fand sich bei bis zu 15% der idiopathischen

Frühgeburten eine PGDH-Insuffizienz [151]. Eine zweite mögliche Sichtweise wäre,

dass auch maternal produzierte Prostaglandine aus der Decidua daran gehindert

werden sollen, auf die fetale Seite zu gelangen und dort Mediatoren wie Matrix-

Metalloproteinasen zu aktivieren, die zur Induktion des Blasensprungs beitragen

würden [130].

Erst in der Spätschwangerschaft sinkt die PGDH-Expression und -Aktivität [81].

Dieser Effekt ist besonders stark ausgeprägt bei vorzeitiger Wehentätigkeit [52, 181,

212]. Allerdings wurden hinsichtlich der PGDH-Aktivität auch widersprüchliche Daten

erhoben, die für einen Anstieg der PGDH-Aktivität im Verlauf der Schwangerschaft und

unter der Geburt sprechen [187]. Zur Klärung der genauen Zusammenhänge bedarf es

also weiterer Untersuchungen.

Cortisol bewirkt über eine Hemmung der PGDH einen Anstieg der Prostaglandin-

Konzentration. Diesem Effekt steht eine Stimulation der PGDH durch Progesteron

entgegen [25]. Möglicherweise werden beide Wirkungen durch eine kompetitive

Bindung beider Steroidhormone an den Glucocorticoid-Rezeptor (GR)α vermittelt.

Dieser Konkurrenz-Mechanismus könnte zu einem lokalen Progesteron-Entzug, z.B.

im Fundus-Bereich, beitragen [201] und wurde in ähnlicher Form auch bei der

Regulation des CRH-Gens durch Progesteron und Cortisol beobachtet [86]. Neben

Einleitung 22

Cortisol ruft auch CRH über erhöhtes cAMP eine Hemmung der PGDH im Chorion

hervor [109]. Challis sah darin ein ähnliches Wirkungsmuster: Substanzen, die in den

Eihäuten die COX-2 stimulieren (CRH, Cortisol, IL-1β, TNFα), hemmen im Chorion die

PGDH [24].

1.4.2 Bedeutung der Prostaglandine für die Geburt

Dass die Prostaglandine eine wichtige Rolle für die Wehentätigkeit spielen, wird

aus folgenden Befunden deutlich: Während der Wehentätigkeit ist ein starker Anstieg

der Prostaglandin-Spiegel in Plasma und Urin zu beobachten [91, 155], durch exogene

Prostaglandin-Gabe lassen sich Wehen induzieren und durch COX-Inhibitoren effektiv

hemmen [90]. Außerdem steigern sie in vitro die myometriale Kontraktilität [154] und

wirken synchronisierend auf die Kontraktionen [51].

Wenngleich ihre Bedeutung für die myometriale Kontraktilität die bestuntersuchte

Eigenschaft der Prostaglandine im Zusammenhang mit der Geburt darstellt, zeichnet

sich ab, dass sie für die anderen vier physiologischen Vorgänge, die den Geburts-

prozess kennzeichnen, ebenfalls eine zentrale Bedeutung haben [153]: Sie induzieren

den Blasensprung durch Aktivierung von Matrix-Metallo-Proteinasen, die einen

kontrollierten Kollagen-Abbau katalysieren [130], sie sind durch Regulierung von

Veränderungen im Stoffwechsel der extrazellulären Matrix an der Cervixreifung

beteiligt [16, 92] und tragen postpartal zur Placentalösung und Involution des Uterus

bei [150].

Als weitere spezifische Funktionen der Prostaglandine, die schon im Laufe der

Schwangerschaft eine Rolle spielen, werden u.a. ihr Beitrag zur Aufrechterhaltung des

uteroplacentaren Blutflusses durch Regulation des Gefäßtonus [17, 172],

stimulierende Effekte auf die fetale Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse [24],

immunmodulierende Effekte und die Induktion von Gap Junctions diskutiert [185].

Unter der Geburt unterstützen sie außerdem die fetale Adaptation an den

Wehenprozess, indem sie auf fetale Bewegungen und Atmung zur Energieeinsparung

einen hemmenden Einfluss ausüben [96, 209].

Aus den soeben beispielhaft aufgeführten Prostaglandin-Effekten wird deutlich,

dass Prostaglandine ein komplexes spezifisches Wirkungsspektrum haben. Dabei

verbindet sie die Fähigkeit, die Aktivität aller glatten Muskelzellen unspezifisch zu

Einleitung 23

modulieren [185]. Im Folgenden sollen die in der vorliegenden Arbeit untersuchten

Prostaglandine Prostacyclin und PGE2 kurz charakterisiert werden:

Prostacyclin hat den größten Anteil an der myometrialen Prostaglandin-

Konzentration und wird im Vergleich zu anderen uterinen Geweben auch nur hier in

nennenswerten Mengen produziert [31, 45, 66, 156, 167, 184, 186, 221]. Dabei übt es

durch Bindung an seinen spezifischen Rezeptor (IP) über die Gαs-gekoppelte

Adenylatcyclase/cAMP/PKA-Signaltransduktionskaskade eine uterusrelaxierende und

somit schwangerschaftserhaltende Wirkung aus [146, 156, 219]. In der Spät-

schwangerschaft führt ein wehenunabhängiger Aktivitäts-Anstieg der vorwiegend in

den Myofibrillen der Myocyten [140] lokalisierten PGI-Synthase zu einer zunehmenden

Prostacyclin-Sekretion [72]. Dies spricht möglicherweise für eine Beteiligung dieses

Prostaglandins an der Cervixreifung. Des Weiteren steigert Prostacyclin den utero-

placentaren Blutfluss durch NO/cGMP-vermittelte Vasodilatation sowie durch

Hemmung des vasokonstriktiven Einflusses von PGF2α [34, 119]. In diesem

Zusammenhang spielt es möglicherweise eine wichtige Rolle zur Prävention uteriner

Hypoxie und zur Verhinderung thromboembolischer Komplikationen in der maternalen

und uteroplacentaren Zirkulation [45, 72, 224].

PGE2 ist das vorherrschende Prostaglandin in allen intrauterinen Geweben mit

Ausnahme des Myometriums [23, 53]. Es gilt neben PGF2α als potenter Stimulator der

uterinen Kontraktilität; beide Stoffe sind in der Lage, in jedem Stadium der

Schwangerschaft Wehen zu induzieren [185]. Klinisch wird diese Eigenschaft schon

seit einigen Jahren zur Geburtseinleitung eingesetzt [174]. Dabei ist in vitro die

Fähigkeit von PGE2, myometriale Kontraktionen zu erzeugen, 8-10fach höher als die

von PGF2α, und PGE2 wird dort auch 8-10-mal stärker gebunden [79, 125]. Allerdings

wirkt es im Gegensatz zu PGF2α, das über seinen spezifischen Rezeptor (FP)

ausschließlich kontrahierende Effekte auf das Myometrium ausübt, v.a. auf den

Fundus-/Corpusbereich kontrahierend, während es auf das untere Uterinsegment

einen eher relaxierenden Effekt hat [185]. Außerdem wurden in diesem Uterusbereich

konzentrationsabhängige Effekte beobachtet: In niedrigen Konzentrationen wirkte es

kontraktionsstimulierend, in höheren kontraktionshemmend [191, 220]. Diese gegen-

sätzlichen PGE2-Wirkungen können auf eine räumlich- und zeitlich-differenzielle

Rezeptor-Expression zurückgeführt werden. Unter 1.4.3 wird dieses Thema näher

erläutert werden. Die Tatsache, dass nicht nur im Myometrium als Zielorgan

Einleitung 24

kontraktionsassoziierter Wirkungen PGE2-Rezeptoren exprimiert werden, sondern

auch in den Eihäuten und in der Placenta [68], deutet auf parakrine und autokrine

PGE2-Effekte hin. Die spezifische PGE-Synthase zeigt im Vergleich zur PGI-Synthase

eine schwächere myometriale Expression, die im Schwangerschaftsverlauf und

während der Wehentätigkeit keinen Veränderungen unterliegt [52]. Im Myometrium ist

sie im Cytoplasma der Myocyten, in vaskulären Muskelzellen und im Gefäßendothel zu

finden [52].

1.4.3 Prostaglandin-Rezeptoren im Myometrium

Die Prostaglandine vermitteln ihre Wirkung über spezifische Rezeptoren in der

Membran der Zielzellen [37]. Benannt nach ihren Liganden, lassen sie sich in

verschiedene Subtypen unterteilen, welche die Produktion unterschiedlicher Second

Messenger bewirken. Außerdem sind zahlreiche Spleißvarianten identifiziert worden,

die eine Kopplung an unterschiedliche G-Proteine vermitteln (Gαs, Gαq, Gαi) [102]. Im

Hinblick auf ihre Funktion im Myometrium erfolgt eine Einteilung der Rezeptoren in

eine kontraktile und eine relaxatorische Gruppe. Kontraktile Prostaglandin-Rezeptoren

(EP1 und EP3 für PGE2, FP für PGF2α, TP für Thromboxan) gehören neben den

Oxytocin-Rezeptoren, Gap Junctions und Ionenkanälen zu den kontraktions-

assoziierten Proteinen (CAPs). Sie bewirken eine Kontraktion der Myocyten, indem sie

die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung stimulieren bzw. die Adenylatcyclase hemmen, so

dass die cAMP-Produktion gesenkt wird. Relaxierende Prostaglandin-Rezeptoren (DP

für PGD2, EP2 und EP4 für PGE2, IP für PGI2) steigern über eine Aktivierung der

Adenylatcyclase die cAMP-Synthese [22]. Im schwangeren Myometrium sind bis auf

DP alle Rezeptor-Typen vorhanden, EP3 allerdings nur auf Endothel- und

Stromazellen, während alle anderen auf Myocyten exprimiert sind. Dies lässt

vermuten, dass der Kontraktionseffekt von PGE2 am Termin v.a. direkt EP1- und nur

indirekt EP3-vermittelt entsteht [110].

Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Rezeptoren unterschiedliche

Affinitäten aufweisen können [72]. Aus dieser Beobachtung wurde die Hypothese

abgeleitet, dass bei geringen Prostaglandin-Konzentrationen Rezeptoren aktiviert

werden, die sich in einem „High-Affinity-State“ befinden, während solche im „Low-

Affinity-State“ im Ruhezustand bleiben. Je nach Affinitäts-Zustand des Rezeptors

könnten unterschiedliche Signaltransduktionswegen aktiviert werden. So lässt sich

Einleitung 25

erklären, warum dasselbe Prostaglandin im Myometrium sowohl kontrahierende als

auch relaxierende Effekte hervorrufen kann. Eine derartige biphasische, dosis-

abhängige Wirkung zeigte PGE2 in vitro im unteren Uterinsegment vor Beginn der

Wehentätigkeit; auf eine initiale Stimulation folgte eine Inhibition der Kontraktilität

[191, 220]. Übertragen auf die Situation in vivo könnte dies bedeuten, dass die

vergleichsweise niedrigen PGE2-Konzentrationen während des größten Teils der

Schwangerschaft das untere Uterinsegment zum Schutz des Feten angespannt halten

und erst die höheren PGE2-Konzentrationen kurz vor der Geburt relaxierend wirken

und somit eine Passage des Feten durch den Geburtskanal ermöglichen [22, 69].

Die Tatsache, dass im Myometrium sowohl kontraktile als auch relaxatorische

Prostaglandin-Rezeptoren vorhanden sind, könnte außerdem für eine zeitlich-

differenzielle Rezeptor-Regulation, z.B. durch sich verändernde Hormon-

konstellationen, sprechen [144]. EP2 und EP3 sowie FP sind im schwangeren

gegenüber dem nicht-schwangeren Uterus herrunterreguliert [129]. Während FP am

Geburtstermin wieder verstärkt exprimiert wird, um myometriale Kontraktionen zu

vermitteln [206], sinkt die EP2-Expression im Myometrium im Schwangerschaftsverlauf

ab [110, 138]. Neuere Studien fanden am Geburtstermin einen signifikanten Anstieg

der Expression des kontraktilen EP1 [4, 69], der allerdings auch im unteren

Uterinsegment zu beobachten war. Dies könnte auf eine Beteiligung an postpartalen

Kontraktionen zur Uterusinvolution hindeuten [4], ein für die physiologische Blutstillung

essentieller Prozess. Letztlich sind die beschriebenen Unterschiede in Abhängigkeit

vom Gestationsalter noch nicht endgültig geklärt.

Ferner liegen Befunde vor, die auf eine räumlich-differenzielle Rezeptor-Verteilung

hinweisen. Besonders im unteren Uterinsegment findet sich eine starke EP2-

vermittelte, relaxierende PGE2-Wirkung; der kontraktile EP3 hingegen ist im Fundus-

/Corpusbereich stärker exprimiert als im unteren Uterinsegment [4, 69, 191]. EP4, IP

und TP werden im Myometrium gleich bleibend exprimiert und nicht durch Wehen

beeinflusst [4, 69, 196]. Dabei findet sich eine stärkere IP-Expression in longitudinalen

als in zirkulären Muskelzügen; am schwächsten ist sie in glatter Gefäßmuskulatur

ausgeprägt [173].

Nach neueren Erkenntnissen existieren neben den zellmembrangebundenen auch

nukleäre Prostaglandin-Rezeptoren. Bisher wurde im Myometrium für EP1 und EP4

eine Assoziation mit dem Zellkern nachgewiesen [11, 12, 69]. Da beispielsweise auch

Einleitung 26

die cytosolische PLA2 und beide COX-Isoformen in der nukleär-perinukleären Region

lokalisiert sind [142, 147], ist es wahrscheinlich, dass lokal produzierte Prostaglandine

über die nukleären Rezeptoren Effekte ausüben können, die über die direkte

Stimulation oder Inhibition der myometrialen Kontraktilität hinausgehen; z.B. wäre auf

diese Weise eine Modulation der Gentranskription möglich [69]. Insgesamt wird

deutlich, dass die Vermittlung der Prostaglandin-Wirkungen über ihre spezifischen

Rezeptoren ein Thema darstellt, das in seiner Komplexität noch viele Fragen aufwirft.

Einleitung 27

1.5 Zielsetzung dieser Arbeit

Zur Klärung der Bedeutung von placentarem CRH für die hormonelle Steuerung

der Geburt beim Menschen wurde in dieser Arbeit in vitro untersucht, ob CRH eine

Wirkung auf die Prostaglandin-Synthese im humanen Myometrium ausübt. Myome-

triale Gewebeproben aus dem unteren Uterinsegment wurden dazu bei Schnitt-

entbindungen nach unkomplizierten Schwangerschaftsverläufen am Geburtstermin vor

Einsetzen der Wehentätigkeit gewonnen. Im Einzelnen wurden folgende Aufgaben und

Fragestellungen bearbeitet:

1. Haben CRH und sein verwandtes Peptid Urocortin sowie IL-1β einen

stimulierenden Einfluss auf die 6-keto-PGF1α- und PGE2-Synthese im

Myometrium?

2. In welchen Zellen des myometrialen Gewebeverbands werden die CRH-

Rezeptoren CRH-R1 und CRH-R2 exprimiert, und wie sind die einzelnen

Zelltypen immunhistochemisch zu charakterisieren?

3. Ist die Messung der ACTH-Sekretion der Maus-Hypophysen-Zelllinie AtT20 für

die Etablierung eines Bioassays zur Überprüfung der biologischen CRH-Aktivität

geeignet?

4. Welche methodischen Aspekte sind im Umgang mit Gewebekulturen und EIAs zu

beachten, und inwieweit ist eine große Streuung der EIA-Messwerte auf

technische und bedienerassoziierte Aspekte zurückzuführen?

Material und Methoden 28

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Kommerziell erhältliche Chemikalien und Lösungen

Sämtliche verwendeten Säuren, Laugen und Salze waren vom Reinheitsgrad p.a.

und wurden, sofern nicht in folgender Liste aufgeführt, von den Firmen Merck

(Darmstadt), Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen) oder Carl Roth GmbH

(Karlsruhe) bezogen.

Das verwendete Wasser stammte aus einer Reinstwasseranlage (Milli-Q plus PF,

Millipore, Eschborn). Es entsprach in der Reinheit mindestens doppelt destilliertem

Wasser (ddH2O). In RNA- und RT-PCR-Experimenten wurde das kommerziell

erhältliche Reinstwasser Aqua ad iniectabilia (B. Braun, Melsungen) verwendet.

Agarose Invitrogen, Karlsruhe

Ak-Klon-3-2B12 Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen

Ak-Klon5B5 DAKO Diagnostika, Hamburg

Anti-α-Aktin-Ak DAKO Diagnostika, Hamburg

Anti-CD68-Ak DAKO Diagnostika, Hamburg

Anti-CRH-R1/R2-Ak Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA

Anti-vWF-Ak DAKO Diagnostika, Hamburg

BSA für die IHC Bovines Serum-Albumin, Fraktion V, pH 7,0, Standard Grade; Serva, Heidelberg

BSA für die Zellkultur Bovines Serum-Albumin, Fraktion V, Katalog-Nr. A9418, ≥96%, Zellkultur-getestet; Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Deisenhofen

Chloroform J.T. Baker, Deventer, Holland

CRH Corticotropin-Releasing Hormone; Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

DakoCytomation Target Retrieval Solution

S1700, pH 6,1; DAKO Diagnostika, Hamburg

DEPC-Wasser Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen


DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium D 6546; 0,265 g/l CaCl2·2H2O, 0,0001 g/l Fe(NO3)3·9H2O, 0,09767 g/l MgSO4, 0,4 g/l KCl, 3,7 g/l NaHCO3, 6,4 g/l NaCl, 0,109 g/l Na H2PO4, 0,084 g/l L-Arginin·HCl, 0,0626 g/l L-Cystin·2HCl, 0,584 g/l L-Glutamin; 0,03 g/l Glycin; 0,042 g/l L-Histidin·HCl·H2O, 0,105 g/l L-Isoleucin, 0,105 g/l L-Leucin, 0,146 g/l L-Lysin·HCl, 0,03 g/l L-Methionin, 0,066 g/l L-Phenylalanin, 0,042 g/l L-Serin, 0,095 g/l L-Threonin, 0,016 g/l L-Tryptophan, 0,10739 g/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 0,094 g/l L-Valin, 0,004 g/l Cholinchlorid, 0,004 g/l Folsäure, 0,0072 g/l myo-Inositol, 0,004 g/l Niacinamid, 0,004 g/l D-Pantothensäure, 0,004 g/l Pyridoxin·HCl, 0,004 g/l Riboflavin, 0,004 g/l Thiamin·HCl, 4,5 g/l D-Glucose, 0,0159 g/l Phenolrot·Na; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

DMSO Dimethylsulfoxid; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

dNTP-Mix (10 mM) Invitrogen, Karlsruhe

D-PBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline; 0,2 g/l KH2PO4, 0,2 g/l KCl, 8,0 g/l NaCl, 1,15 g/l Na2HPO4; Invitrogen, Karlsruhe

EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium M 2279; 0,265 g/l CaCl2·2H2O, 0,09767 g/l MgSO4, 0,4 g/l KCl, 2,2 g/l NaHCO3, 6,8 g/l NaCl, 0,122 g/l Na2HPO4, 0,126 g/l L-Arginin·HCl, 0,0313 g/l L-Cystin·HCl, 0,042 g/l L-Histidin·HCl·H2O, 0,052 g/l L-Isoleucin, 0,052 g/l L-Leucin, 0,0725 g/l L-Lysin·HCl, 0,015 g/l L-Methionin, 0,032 g/l L-Phenylalanin, 0,048 g/l L-Threonin, 0,01 g/l L-Tryptophan, 0,0519 g/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 0,046 g/l L-Valin, 0,001 g/l Cholinchlorid, 0,001 g/l Folsäure, 0,002 g/l myo-Inositol, 0,001 g/l Niacinamid, 0,001 g/l D-Pantothensäure, 0,001 g/l Pyridoxin·HCl, 0,0001 g/l Riboflavin, 0,001 g/l Thiamin·HCl, 1,0 g/l Glucose, 0,011 g/l Phenolrot·Na, 0,292 g/l L-Glutamin; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

FBS Fetal-bovines Serum; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

H2O2 30% Wasserstoffperoxid; Merck, Darmstadt

Hämalaun „Mayers Hämalaunlösung für die Mikroskopie“; Merck, Darmstadt


Ham’s F12 Nutrient Mixture N 4888; 0,0441 g/l CaCl2·2H2O, 0,0000025 g/l CuSO4, 0,000834 g/l FeSO4·7H2O, 0,123 g/l MgCl2·6H2O, 0,224 g/l KCl, 1,176 g/l NaHCO3, 7,599 NaCl, 0,14204 g/l Na2HPO4, 0,000863 g/l ZnSO4·7H2O, 0,009 g/l L-Alanin, 0,211 g/l L-Arginin·HCl, 0,01501 g/l L-Asparagin·H2O, 0,0133 g/l L-Asparaginsäure, 0,035 g/l L-Cystein·HCl·H2O, 0,0147 g/l L-Glutamat, 0,00751 g/l Glycin, 0,2096 g/l L-Histidin·3HCl·H2O, 0,00394 g/l L-Isoleucin, 0,0131 g/l L-Leucin, 0,0365 g/l L-Lysin·HCl, 0,00448 g/l L-Methionin, 0,00496 g/l L-Phenylalanin, 0,0345 g/l L-Prolin, 0,0105 g/l L-Serin, 0,0119 g/l L-Threonin, 0,00204 g/l L-Tryptophan, 0,00778 g/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 0,0117 g/l L-Valin, 0,0000073 g/l D-Biotin, 0,01396 g/l Cholinchlorid, 0,00132 g/l Folsäure, 0,018 g/l myo-Inositol, 0,000037 g/l Niacinamid, 0,00048 g/l D-Pantothensäure, 0,000062 g/l Pyridoxin·HCl, 0,000038 g/l Riboflavin, 0,00034 g/l Thiamin·HCl, 0,00136 g/l Vitamin B12, 1,802 g/l D-Glucose, 0,00408 g/l Hypoxanthin, 0,000048 g/l Linolsäure, 0,0013 g/l Phenolrot, 0,000161 g/l Putrescin·HCl, 0,11 g/l Na-Pyruvat, 0,00021 g/l Thioctansäure, 0,00073 g/l Thymidin, 0,146 g/l L-Glutamin; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

Hasenserum Alexis GmbH, Grünberg

HBSS Hank’s Balanced Salt Solution; 8,0 g/l NaCl, 0,4 g/l KCl, 48 mg/l Na2HPO4, 60 mg/l K H2PO4, 1 g/l Glucose, 0,35 g/l NaHCO3; Biochrom, Berlin

IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium E 15-819; 165 mg/l CaCl2, 330 mg/l KCl, 0,076 mg/l KNO3, 97,7 mg/l MgSO4, 0,0173 mg/l Na·Selenit·5 H2O, 4505 mg/l NaCl, 125 mg/l Na2HPO4·H2O, 3024 mg/l NaHCO3, 25 mg/l L-Alanin, 84 mg/l L-Arginin·HCl, 28,4 mg/l L-Asparagin·H2O, 30 mg/l L-Asparaginsäure, 91,24 mg/l L-Cystin·2HCl, 75 mg/l L-Glutamat, 584 mg/l L-Glutamin, 30 mg/l Glycin, 42 mg/l L-Histidin·HCl·H2O, 105 mg/l L-Isoleucin, 105 mg/l L-Leucin, 146 mg/l L-Lysin·HCl, 30 mg/l L-Methionin, 66 mg/l L-Phenylalanin, 40 mg/l L-Prolin, 42 mg/l L-Serin, 95 mg/l L-Threonin, 16 mg/l L-Tryptophan, 103,79 mg/l L-Tyrosin·2Na·2H2O, 94 mg/l L-Valin, 0,013 mg/l Biotin, 4 mg/l D-Calcium-Pantothenat, 4 mg/l Cholinchlorid, 4 mg/l Folsäure, 7,2 mg/l i-Inositol, 4 mg/l Niacinamid, 4 mg/l Pyridoxin·HCl, 0,4 mg/l Riboflavin, 4 mg/l Thiamin·HCl, 0,013 mg/l Vitamin B12, 4500 mg/l D-Glucose, 5958 mg/l HEPES, 15 mg/l Phenolrot, 110 mg/l Na-Pyruvat; PAA Laboratories, Cölbe

Lyphochek Immunoassay Plus Control

Bio-Rad Laboratories GmbH, München

NADH β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, reduziert Di-Natriumsalz 340-102; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen


Pferdeserum Serva, Heidelberg

Pronase 0,1% Linaris, Wertheim-Bettingen

Protease-Inhibitor-Cocktail

P8340; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

RNA-Marker 0,24-9,5 Kb; Invitrogen, Karlsruhe

Romulin AEC Amino-9-Ethyl-Carbazol; Biocarta, Hamburg

Superscript II, RNase-frei Reverse Transkriptase; Invitrogen, Karlsruhe

Taq Polymerase Invitrogen, Karlsruhe

Triton X-100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

Urocortin Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg

2.1.2 Kits

6-keto-PGF1α-EIA-Kit Biotrend, Köln

ACTH-Immulite-Kit und Verdünner DPC Biermann, Bad Nauheim

peqGOLD Trifast Kit Peqlab Biotechnologie, Erlangen

PGE2-EIA-Kit Biotrend, Köln

Pyrocheck-Kit DPC Biermann, Bad Nauheim

Vectastain Elite ABC-Kit, Goat IgG Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA

2.1.3 Selbst hergestellte Puffer und Lösungen

1x DNA-Ladepuffer 5% Glycerin 5 mM EDTA 0,005% Bromphenolblau 0,005% Xylencyanol FF

Formaldehyd, deionisiert 100 ml Formaldehyd 5 g AG 501-X8 Resin; Bio-Rad, München 30 min bei Raumtemperatur rühren, Formaldehyd mit Resin lagern

Formalin 4% 4% Formaldehyd in 1x PBS für die IHC

Formamid, deionisiert 20 ml Formamid 1 g AG 501-X8 Resin; Bio-Rad, München 30 min bei Raumtemperatur rühren, 1 ml Aliquots bei -20°C

HomogenisierungslösungLDH 50 mM Tris 0,154 M KCl

NADH-Lösung 14,1 mM NADH in 1% (m/v) NaHCO3-Lösung


10x NK-Lösung 1,37 M NaCl 0,5 M KCl

1x NKH-Lösung 1x NK-Lösung 2 mM HEPES, pH 7,4 immer frisch ansetzen aus 10x NK-Lösung und 1 M HEPES

25x PBS für die IHC 188 g/l K2HPO4 (43 mM) 180 g/l NaCl (123 mM) 33 g/l Na2HPO4 (10 mM)

PBT-Lösung für die IHC 10 ml PBS 100 mg BSA 20 µl Triton

1x RNA-Ladepuffer 20% deionisiertes Formamid 20% Glycerin 20 mM EDTA 0,02% Bromphenolblau 0,02% Xylencyanol FF

SubstratlösungLDH 44,7 mM K2HPO4

7,35 mM KH2PO4

625 µM Na-Pyruvat

50x TAE-Puffer 2 M Tris 2 M Eisessig (Acetic Acid) 50 mM EDTA, pH 8,0

10x TBE-Puffer 0,89 M Tris 0,89 M Borsäure 20 mM EDTA, pH 8,0

Tris/EDTA-Puffer für die IHC 10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 9,0

10x Zitratpuffer 0,1 M Zitronensäure 0,1 M Natriumzitrat, pH 6,0

Mögliche Wirkungen von CRH wurden an Gewebeproben sowie in Zellkulturen

untersucht. Das für diese Experimente eingesetzte, synthetische Peptid CRH (0,1 mg;

Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg, bzw. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisen-

hofen) wurde in lyophilisiertem Zustand bezogen. Nach Herstellerangaben gilt das bei

-80°C gelagerte, gefriergetrocknete Peptid als jahrelang stabil. In gelöstem Zustand

hingegen wird ein Verbrauch innerhalb 2-3 Monaten empfohlen. Zur Aliquotierung

wurden die Lyophilisate zunächst in 1 ml durch Helium-Begasung sauerstofffreiem

ddH2O gelöst, in Aliquots à 100 µl (CRH, entsprach 10 µg) aufgeteilt und mit einer

Gefriertrocknungsanlage (ALPHA 2-4, Christ Medizinischer Apparatebau, Osterode/


Harz) wieder lyophilisiert. Anschließend wurden die Proben mit Stickstoff begast und

bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.

2.2 Patientinnendaten

In dieser Arbeit wurde myometriales Gewebe (M) von Patientinnen untersucht, bei

denen in der Universitätsfrauenklinik Freiburg eine Kaiserschnittentbindung (Sectio

caesarea) durchgeführt worden war. Für vergleichende Untersuchungen an weiterem

schwangerschaftsspezifischen Geweben wurden zusätzlich Placenta (P)- und choriale

Decidua (Dc)-Proben verwendet. Alle Proben wurden durch die Abkürzung der

Gewebeart und die laufende Patientinnen-Nummer kodiert. In den überwiegenden

Fällen erfolgte die Gewebegewinnung nach geplanter, primärer Sectio am Geburts-

termin, d.h. vor Beginn muttermundswirksamer Wehentätigkeit, nach Beendigung der

37. Schwangerschaftswoche (s. Tab. 2). Die Indikation zu diesem Eingriff wurde aus

unterschiedlichen Gründen gestellt, beispielsweise wegen einer geburtsunmöglichen

bzw. -erschwerenden Kindslage, vorausgegangenen operativen Eingriffen am Uterus

oder wegen Verdachts auf ein relatives Missverhältnis zwischen kindlichem Kopf und

mütterlichem Innenbecken-Durchmesser. Ein geringer Teil der Proben stammt von

Patientinnen, bei denen bis zum Zeitpunkt der termingerechten Schnittentbindung

muttermundswirksame Wehen eingesetzt hatten; hier wurde eine sekundäre Sectio

durchgeführt (s. Tab 3). Wie der tabellarischen Übersicht über die klinischen Daten der

Patientinnen sowie die Verwendung der Gewebeproben zu entnehmen ist, gab es in

beiden Gruppen Patientinnen, bei denen es im Laufe der Schwangerschaft zu einer

vorzeitigen Wehentätigkeit gekommen war.

Die Probengewinnung für die vorliegende Arbeit erfolgte im Rahmen des von der

Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderten Projekts „Rolle von CRH bei

der Auslösung der Geburt“, für das ein positives Votum der Ethik-Kommission der

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg vorliegt (Ethik-Antrag 190/98 vom 05.10.1998).

Alle Frauen gaben vor der Gewebeentnahme nach ausführlicher Aufklärung ihr

schriftliches Einverständnis.


Tab. 2: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten primären Sectiones. Patientinnen mit vorzeitiger Wehentätigkeit sind mit (+) gekennzeichnet. „G/P“ bezeichnet die Anzahl der bisherigen Schwangerschaften und Geburten. Die Gewebearten sind mit „M“ (Myometrium), „P“ (Placenta) oder „Dc“ (Decidua) bezeichnet.

Pa

t.-N

r.

Alt

er

SS

W

G/P

We

he

n

Sectio-Indikation Anamnese

Ge

we

be

Te

st

6 38 39+1 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis

Unauffällige Amniozentese in der 15.SSW, Z.n. sekundärer Sectio 1990 bei relativem Missverhältnis, Medikation: Paracetamol und Tramal ab der 34. SSW wg. Lumboischialgie

M IHC

19 35 38+0 I/II - Gemini Diskordantes fetales Wachstum, Schwere Dermatose, Medikation: Jodthyrox

M P

IHC

56 29 37+5 I/I - Tracheostoma der Mutter

Z.n. Kehlkopftrauma 1996 M IHC

57 36 37+4 V/II - Beckenendlage Z.n. dreimaligem Abort M Dc

IHC

59 37 39+3 IV/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis

Harnwegsinfekt in der 36. SSW mit Antibiotika-Einnahme, Z.n. 2 Sectiones wg. drohender kindlicher Asphyxie, Z.n. Abruptio, Medikation: Jod, Magnesium

M IHC

66 36 40+6 I/I - V.a. relatives Missverhältnis, 18-jährige Sterilitätsanamnese

Z.n. 3x ICSI, aktuell: spontane Konzeption

M IHC


Z.n. Notsectio bei Gemini-SS 1975 bei Geburtsstillstand, Tod des 1. Zwillings unter der Geburt, Tod des 2. Zwillings 03/99 an einem Asthmaanfall

M PGE2


Z.n. sekundärer Sectio 1997 bei Geburtsstillstand, Z.n. Unterschenkelvenenthrombose 1994

M 6keto-PGF1α


Blutungen in der 10. SSW, Diätetisch gut eingestellter Gestationsdiabetes seit der 30. SSW, Z.n. sekundärer Sectio 1996 wg. kindlicher Asphyxie

M 6keto-PGF1α

97 28 38+3 II/I - Beckenendlage Z.n. Abruptio 1997 (7. SSW), Wendeversuch in der 36. SSW, Medikation: Jod, Eisen, Folsäure

Dc PGE2

99 30 38+ III/III - Re-re-Sectio bei absolutem Missverhältnis wg. querverengten, schräg ovalen Beckens

Z.n. 2 primären Sectiones 1991 und 1993

M 6keto-PGF1α

100 35 39+6 I/II - Gemini, 1. Zwilling Beckenendlage, 2. Zwilling Querlage

Arabin-Pessar seit der 24. SSW M 6keto-PGF1α

102 26 37+6 I/II - Gemini, beide Querlage

Unauffällige SS-Anamnese M LDH

104 26 38 III/I (+) Beckenendlage Cerclage und Einlage eines Arabin-Pessars wg. Cervixinsuffizienz und beginnenden Fruchtblasenprolapses,

M LDH


Pa

t.-N

r.

Alt

er

SS

W

G/P

We

he

n


Ge

we

be

Te

st

immer wieder leichte vorzeitige Wehentätigkeit, Z.n. Notfallcerclage 2000, Z.n. Spätabort in der 21. SSW 1999, Medikation: Magnesium

105 32 38 III/II (+) Gemini, 1. Zwilling Schädellage, 2. Zwilling Beckenendlage

Tokolyse wg. vorzeitiger Wehentätigkeit in der 27.-36. SSW, Wachstumsdifferenz der Gemini von ca. 5 Wochen, Arabin-Pessar in der 27.-34. SSW

M 6keto-PGF1α

PGE2

106 38 39+1 III/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis

Z.n. unauffälliger Amniocentese in der 16. SSW, Z.n. 2 Sectiones 1997 und 1999, 1999 Tod des Kindes am 3. Lebenstag wg. Osteogenesis imperfecta

M 6keto-PGF1α

PGE2

107 24 39+1 IV/II - Fetale Spina bifida bekannt seit 20. SSW

Z.n. Clomifen-Therapie, Vaginale Blutung in der 12. SSW, Z.n. Vakuumextraktion 1997 bei grünem Fruchtwasser, Z.n. 2 Aborten 1999 (8. und 12. SSW)

M 6keto-PGF1α

PGE2

109 37 36+6 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis, Gemini, beide Beckenendlage

Z.n. Sectio bei Geburtsstillstand 1994,Arabin-Pessar seit der 24. SSW, Intraoperative PGF2α-Infusion

M 6keto-PGF1α

110 33 37+1 II/II (+) Drillinge nach IVF Cervixinsuffizienz, Intermittierende vorzeitige Wehentätigkeit, Medikation: Magnesium, Calcium, Jodid, Folsäure

M 6keto-PGF1α

111 35 36+5 I/I (+) Querlage, Vorzeitiger Blasensprung

Tokolyse wg. vorzeitiger Wehentätigkeit

M 6keto-PGF1α

112 35 39 I/II - Gemini, 1. Zwilling Beckenendlage, 2. Zwilling Schädellage

Unauffällige SS-Anamnese, Z.n. Beinvenenthrombose 1990 bei bekannter Faktor V-Mutation

M 6keto-PGF1α

113 33 40 III/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis

Vorzeitiger Blasensprung in der 36. SSW, Bronchitis

M 6keto-PGF1α

114 31 39+2 III/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis

B-Streptokokken-positiver Vaginalabstrich

M 6keto-PGF1α

115 35 39+2 II/II - Re-Sectio bei relativem Missverhältnis, V.a. Makrosomie

Insulinpflichtiger Gestationsdiabetes, Depression

M 6keto-PGF1α


Harnwegsinfektion in der 37. SSW, Z.n. primärer Sectio 1997 bei relativem Missverhältnis

M 6keto-PGF1α

117 39 38+4 V/III - Re-re-Sectio bei relativem Missverhältnis

Z.n. 2 Aborten, Z.n. 2 Sectiones wg. engen Beckens, Z.n. Abortus imminens-Blutung in der Früh-SS, Intermittierende Arrhythmien, V.a. chronische Sinusitis

M P

6keto-PGF1α


Z.n. primärer Sectio 1997 bei relativem Missverhältnis

P 6keto-PGF1α


Tab. 3: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten sekundären Sectiones. Patientinnen mit vorzeitiger Wehentätigkeit sind mit (+) gekennzeichnet. „G/P“ bezeichnet die Anzahl der bisherigen Schwangerschaften und Geburten. „M“ beschreibt die Gewebeart (Myometrium).

Pa

t.-N

r.

Alt

er

SS

W

G/P

We

he

n


Ge

we

be

Te

st

88 36 38+6 III/II + Beckenendlage Tokolyse wg. vorzeitiger Wehentätigkeit nach Wendeversuch in der 31. SSW, Z.n. Interruptio 1991, Z.n. IUFT 1999

M 6keto-PGF1α

98 43 39+6 V/III + Re-Sectio bei relativem Missverhältnis

Beginnende Wehentätigkeit am Tag der geplanten Sectio

M LDH

2.3 Methoden

2.3.1 Gewinnung und Präparation der Gewebeproben

2.3.1.1 Myometrium

Im Rahmen der Wundbereinigung wurde vom Operateur vom oberen Rand des

unteren Uterinsegments ein 1-3 cm3 großes, 1-2 g schweres Stück Myometrium

entnommen. Bei Raumtemperatur wurde dieses umgehend in Hank’s Balanced Salt

Solution (HBSS; Biochrom, Berlin) ins Labor transportiert und dort auf einer

Reinraumwerkbank (Antares 48/72; Biohit, Köln) weiterverarbeitet. Unter langsamem

Schütteln auf einem Schüttler (MS 2 Minishaker; IKA Works, Wilmington, NC, USA)

wurde das Gewebe mehrfach in Dulbecco’s Phospate Buffered Saline (D-PBS;

Invitrogen, Karlsruhe) gewaschen. Das sorgfältige Waschen diente der Entfernung von

Blutrückständen, die durch Eicosanoidproduktion die Versuchsergebnisse verfälschen

könnten. Anschließend wurde das Myometrium mit einer sterilen Schere in kleine

Stückchen von 10-30 mg Feuchtgewicht geschnitten und auf einem Papiertuch

abgetupft, um bei der Feststellung des Feuchtgewichtes auf einer digitalen Waage

(AB54; Mettler-Toledo GmbH, Gießen) Messunterschiede zu vermeiden.

Stichprobenartig wurde ein Teil der Myometriumbiopsien zur späteren histo-

logischen Charakterisierung des Gewebes (s. 2.3.8) in 4%iger PBS-gepufferter

Formalinlösung über Nacht fixiert und in Paraffin eingebettet.


Ferner wurde zur Vervollständigung einer Gewebebank für weiterführende

laborinterne Untersuchungen jeweils ein Stückchen pro Gewebeprobe in flüssigem

Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Verarbeitungsdauer von der

Entgegennahme des Gewebes im Operationssaal bis zum Schockgefrieren betrug 30-

55 Minuten.

2.3.1.2 Placenta

Die Gewinnung von Placentaproben erfolgte primär im Kreißsaal nach Entnahme

des Placentarestblutes. Dazu wurden mit Hilfe einer sterilen Schere oder eines

Skalpells aus einer Kotelydone relativ nah am Nabelschnuransatz, wo die Placenta

meist die größte Dicke aufweist, würfelförmige Stücke von 4-8 cm3 herausgeschnitten.

Es wurde darauf geachtet, für die Entnahme makroskopisch möglichst homogen

aussehende Bereiche mit wenigen Blutgefäßen oder Bindegewebssepten

auszuwählen. Zur Weiterverarbeitung (Waschen, Schockgefrieren, Kurzzeit-

Gewebekultur bzw. Einbetten in Paraffin) wurden die Proben anschließend in HBSS

(Biochrom) ins Labor gebracht und dort analog dem unter 2.3.1.1 beschriebenen

Vorgehen verwertet.

2.3.1.3 Decidua

Zu Beginn des Versuchszeitraumes der vorliegenden Arbeit (2000-2004)

existierten zwei verschiedene Methoden der Decidua-Gewinnung. Einerseits wurde

vom Operateur bei einer Sectio das Cavum uteri postnatal mit sterilen Tupfern

ausgewischt und nach Transport in HBSS (Biochrom) ins Labor durch Abpräparation

von den Tupfern sog. uterine Decidua (Du) gewonnen. Die zweite Methode bestand im

Abschaben der Decidua-Schicht unter Laborbedingungen mit einer sterilen stumpfen

Pinzette vom Chorion, weshalb die auf diese Weise gewonnene Decidua als chorial

(Dc) bezeichnet wurde. Nachdem Frau Dr. Eva Schumacher [188] im Rahmen ihrer

medizinischen Dissertation bewiesen hatte, dass die durch die zweite Methode

erhaltene choriale Decidua anatomisch intakter blieb, wurde erstere Methode nicht

weiter durchgeführt. Die Weiterverarbeitung der Decidua erfolgte wie unter 2.3.1.1

beschrieben.


2.3.2 Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der Prostaglandin-Synthese

2.3.2.1 Allgemeiner Versuchsablauf

Zur Untersuchung der basalen Prostaglandin-Synthese im Myometrium und ihrer

Stimulierbarkeit durch CRH wurden Myometriumbiopsien für 24 Stunden inkubiert. Die

Kultivierung erfolgte in Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM; PAA

Laboratories, Cölbe) mit stabilem L-Glutamin und NaHCO3 mit 1% Antibiotika- und

Antimykotika-Zusatz (100 units/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 250 ng/ml

Amphotericin B; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen). Dieses Basalmedium

wurde im Labor einmalig mit einem Pyrocheck-Kit (DPC Biermann, Bad Nauheim)

negativ auf Endotoxine getestet. Dadurch konnte eine unspezifische Stimulation

proinflammatorischer Mediatoren ausgeschlossen werden. Kultiviert wurden die

Gewebeproben bei 37°C in einem Begasungsbrutschrank (CB210; WTC Binder,

Tuttlingen) in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO2.

Der Kulturbeginn lag maximal 2 Stunden nach dem Geburtszeitpunkt. In jede

Vertiefung (Well) einer sterilen Kulturplatte für die Zellkultur mit 24 Vertiefungen à 16

mm Durchmesser (24-Well-Platte; Costar Corporation, Cambridge, MA, USA) wurden

3 Gewebestückchen in 1 ml Nährmedium gegeben.

Um das durch physikalische Reize bei Gewinnung und Präparation eventuell leicht

traumatisierte Gewebe zu äquilibrieren und somit falsch-hohe Prostaglandin-

Messwerte zu vermeiden, wurde der Hauptinkubationsphase eine 30-60-minütige

Vorinkubation vorgeschaltet, an deren Ende die Gewebestückchen in ein neues Well

mit frischem Medium transferiert wurden.

Eine Veränderung der Inkubationsbedingungen in den einzelnen Wells im Verlauf

der Kurzzeitkultur durch Entnahme relativ großer Aliquots des Kulturüberstandes

wurde vermieden, indem jedem Ansatz eine bestimmte Inkubationsdauer zugeordnet

wurde und weiterhin der Überstand nach Ablauf dieser Zeit aliquotiert und mittels

Enzymimmunoassay (EIA) auf seine 6-keto-PGF1α- bzw. PGE2-Konzentration

untersucht wurde. Um außergewöhnlich hohe oder niedrige Messwerte (sog.

Ausreißer) als solche zu erkennen, wurden jeweils Triplikate, d.h. 3 Ansätze, unter

identischen Bedingungen kultiviert und gemessen. Ein Schüttler im Brutschrank

(Innova, Nürtingen) sorgte für eine gleichmäßige Durchmischung der Proben während


der gesamten Kultivierungszeit, die ohne Vorinkubationszeit 22-24 Stunden betrug.

Nach der Inkubation wurden die Kulturüberstände bis zur Analyse bei -20°C gelagert.

Bei insgesamt 24 Inkubationsversuchen wurden die Inkubationsbedingungen wie im

Folgenden beschrieben variiert und in Tab. 4 dargestellt.

Tab. 4: Inkubationsbedingungen in der Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der Prostaglandin-Synthese. “Inkubation AB“ bezeichnet eine zweigeteilte Inkubationsphase von 6-7h (A), nach denen die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) inkubiert wurden. „Inkubation C“ beschreibt eine einteilige Inkubationsphase von 22-24h. Bei den mit „*“ gekennzeichneten Gewebeproben wurden statt Triplikaten Hexaplikate gemessen. „Basal“ bedeutet die Untersuchung der basalen PG-Synthese, „stimuliert“ die Zugabe von CRH und anderen potentiellen Stimulanzien.

Inkubation AB Inkubation C

Basal Stimuliert Basal Stimuliert IMDM/HBSS

M88 +

M89 +

M90 +

M99 +

M100 + +

M101 + +

M102 + +

M104 + +

M105 + +

M106 + +

M107 + +

M109 +

M110 +

M111 +

M112 +

M113 +

M114*

M115*

M116*

M117

2.3.2.2 Unterteilung der Hauptinkubationszeit in zwei Phasen (n=8)

Ausgehend von früheren laborinternen Ergebnissen von Nathalie Stratz

(unveröffentlichte Daten), bei denen sehr große interindividuelle Schwankungen der

Prostaglandin-Werte zwischen den einzelnen Patientinnen auffielen, wurde die Haupt-


inkubationsphase unterteilt in eine Phase A und eine Phase B: Nach 6-7 Stunden

wurde das Gewebe in neues Nährmedium umgesetzt, in dem dann für weitere 16-17

Stunden die Inkubation fortgesetzt wurde. Dadurch erhoffte man sich eine Art interne

Kontrolle durch Korrelation der Werte der Phase B zu Phase A einer einzelnen

Patientin.

Abb. 5: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei zweigeteilter Hauptinkubationszeit. a) basal (n=5), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=3). „V“ beschreibt eine Vorinkubationszeit von 30-60 min. Nach den ersten 6-7h der Hauptinkubationszeit (A) wurden die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) mit oder ohne Zugabe potentieller Stimulanzien inkubiert. Zu den mit „x“ markierten Zeitpunkten wurde Kulturüberstand zur Prostaglandin-Messung abgenommen.

Bei einem Teil der Versuche (n=5) wurde nun zu unterschiedlichen Zeitpunkten

(nach 5, 6, 7, 20, 21, 22 Stunden) die Konzentration von 6-keto-PGF1α zur Bestimmung

des zeitlichen Verlaufs der basalen Sekretion gemessen.

Bei anderen Versuchen (n=3) wurden den Kulturansätzen in Phase B CRH,

Urocortin und Interleukin (IL)-1β. Zur Verlaufsbeobachtung der basalen 6-keto-PGF1α-

Sekretion wurde bei 3 Ansätzen in Phase B nur das Medium gewechselt. Im EIA

wurden dann stimulierte und unstimulierte Ansätze hinsichtlich ihrer 6-keto-PGF1α-

bzw. PGE2-Synthese zu verschiedenen Zeitpunkten miteinander verglichen.


2.3.2.3 Versuche mit nur einer Inkubationsphase (n=16)

Bei einer zweiten Gruppe von Versuchen (n=16) wurde im Anschluss an die

Vorinkubation nur eine einzige 22-24-stündige Inkubationsphase durchgeführt.

Abb. 6: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei nur einer Inkubationsphase. a) basal (n=4), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=9).„V“ beschreibt eine Vorinkubationszeit von 30-60 min, „C“ die Hauptinkubationszeit von 22-24h. Zu den mit „x“ markierten Zeitpunkten wurde Kulturüberstand zur Prostaglandin-Messung abgenommen.

Zur Beobachtung der Zeitkinetik wurde die 6-keto-PGF1α-Konzentration am Ende

der Inkubationszeit nach 22-24 Stunden bestimmt (n=4). Zusammen mit einer

Messung des Überstandes dieser Proben nach 6-7 Stunden diente dies dem Vergleich

zu Proben, bei denen nach 6-7 Stunden ein Mediumwechsel erfolgt war.

Um möglicherweise die Kulturbedingungen zu optimieren, wurde parallel zum

etablierten Einsatz von IMDM als Kulturmedium in einigen Ansätzen (n=3) HBSS

(Biochrom, Berlin) benutzt. Anhand der 6-keto-PGF1α-Konzentration wurde dann

überprüft, welches Nährmedium für die Kurzzeit-Myometriumkultur besser geeignet ist.

Bei der Hälfte der Versuchsansätze wurden statt Gewebe-Triplikaten Hexaplikate

kultiviert, um Schwankungen des Messwert-Mittelwertes der Parallelansätze zu

minimieren.

2.3.3 Lactatdehydrogenase (LDH)-Test

Bei Versuchen mit Gewebeverbänden ist es notwendig, die Gewebevitalität nach

Abschluss der Kultur zu überprüfen. Zur Routineuntersuchung hat sich der

Lactatdehydrogenase-Test nach Benford & Hubbard [9] bewährt. Ihm liegt das Prinzip


zu Grunde, dass bei Zell- und Gewebeschädigungen in einem frühen Stadium die

Membranintegrität gestört wird und dadurch cytoplasmatische LDH aus dem Intra- in

den Extrazellulärraum gelangt. Die Vitalität einer Gewebekultur kann demnach

charakterisiert werden, indem nach einer Gewebeinkubation die LDH-Aktivität im

Medium zur Gesamt-LDH-Aktivität in Beziehung gesetzt wird. Die Gesamt-LDH-

Aktivität wird durch Zellaufschluss ermittelt und stellt die Summe der Aktivitäten im

Medium und im Gewebe dar. Die Messung der LDH-Aktivität basiert auf der

physiologischen Eigenschaft der LDH, unter Verbrauch von Nicotinamidadenin-

dinucleotid (NADH+H+) Pyruvat zu Lactat umzusetzen. Diese enzymatische Reaktion

kann UV-photometrisch quantifiziert werden, indem die Extinktionsabnahme des

zugegebenen NADH+H+ bei 366 nm über einen Zeitraum von 5 Minuten verfolgt wird.

Im Endokrinologischen Labor hat Frau Dr. Karin Werner [217] diese Methode im

Rahmen ihrer naturwissenschaftlichen Doktorarbeit etabliert.

Für die vorliegende Arbeit wurde zum einen überprüft, inwiefern sich das

nochmalige Umsetzen der Myometriumstückchen in frisches Kulturmedium während

der Hauptinkubationsphase (Versuchsaufbau s. 2.3.2.2) im Vergleich zur Verwendung

desselben Mediums für die gesamte Dauer der Inkubation auf die Gewebevitalität

auswirkt. Ferner wurde die Vitalität des Gewebes im zeitlichen Verlauf nach der

Vorinkubationsphase, nach 6 Stunden und nach Beendigung der Gewebekultur

betrachtet.

Hierzu wurden die Kulturüberstände nach Abnahme bei 4°C zwischengelagert und

bis zur photometrischen Messung auf Eis transportiert. Die Gewebeproben wurden in

Mikrodismembrierkammern in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Homogenisierung

des Gewebes erfolgte dann unter Zugabe von 1 ml HomogenisierungslösungLDH

(50 mM Tris, 0,154 M KCl) für je ca. 90 Sekunden im Mikrodismembrator II (B. Braun,

Melsungen). Das auf diese Weise erhaltene Homogenisat wurde nach Auftauen für 5

Minuten bei 12000-mal g zentrifugiert (Rotixa RPO; Hettich Zentrifugen, Tuttlingen),

dekantiert und bis zur Messung auf Eis gelagert. Zur Messung der LDH-Aktivität

wurden 3 ml SubstratlösungLDH (44,7 mM K2HPO4, 7,35 mMKH2PO4, 625 µM Na-

Pyruvat) mit je 300 µl Probe (Gewebesuspension bzw. Kulturüberstand) vermischt und

zum Start der Enzymreaktion mit 50 µl NADH-Lösung (14,1 mM NADH in 1%, m/v,

NaHCO3-Lösung) versetzt. Nach Bestimmung des Extinktionsanfangswertes wurde

nun die Extinktion bei 366 nm, gemessen im Spektralphotometer Ultrospec 3000


(Pharmacia Biotech, Cambridge, Großbritannien), über einen Zeitraum von 5 Minuten

alle 15 Sekunden notiert. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Pyruvat. Abschließend

wurde die Gewebevitalität aus dem Verhältnis der (intrazellulären) LDH-Aktivität des

Homogenisats zur Gesamt-LDH-Aktivität in Prozent berechnet.

2.3.4 Enzymimmunoassays (EIAs)

2.3.4.1 6-keto-PGF1αααα- und PGE2-EIA

Zur Bestimmung der 6-keto-PGF1α- und PGE2-Konzentration in den Kulturüber-

ständen der Myometrium-Kurzzeitkultur wurden kommerzielle, kompetitive Correlate-

EIA Kits der Firma Biotrend (Köln) verwendet (6-keto-PGF1α n=16, PGE2 n=4).

Bei diesem Zwei-Antikörper-Test ist eine 96-Well-Mikrotiterplatte beschichtet mit

Anti-Schaf-Antikörpern vom Esel, die gegen einen polyklonalen Anti-6-keto-PGF1α-

Antikörper vom Schaf bzw. gegen einen monoklonalen Anti-PGE2-Antikörper gerichtet

sind. Nach dem Prinzip der kompetitiven Bindung konkurriert während einer zwei-

stündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur, während der die Mikrotiterplatte zur

gleichmäßigen Durchmischung auf einem horizontalen Schüttler (KS 130 basic; IKA,

Staufen) platziert wird, unmarkiertes 6-keto-PGF1α bzw. PGE2 aus der Gewebekultur

mit markiertem 6-keto-PGF1α bzw. PGE2 aus dem Kit, das kovalent mit intestinaler

alkalischer Phosphatase (AP) gekoppelt ist. Im Anschluss an diesen Vorgang werden

überschüssige Reagenzien in fünf sorgfältigen Waschgängen mit gepufferter

Salzlösung, die nichtionische Detergenzien zur Zurückdrängung unspezifischer

Bindungen enthält, entfernt, sämtliche Flüssigkeit aus den Vertiefungen herausgeklopft

und p-Nitrophenylphosphat als Substrat hinzugefügt. Die AP dient als Amplifizierungs-

system zur Sichtbarmachung der ablaufenden Immunreaktion, indem sie einen Farb-

umschlag von grün nach gelb bewirkt. Nach 45 Minuten wird die Reaktion durch

Zugabe von Stop-Lösung beendet. Die Intensität der gelben Farbe ist proportional zum

Verdrängungsgrad des markierten Antigens und hat ein Absorptionsmaximum bei 405

nm. Somit kann durch Messung der optischen Dichte in einem EIA-Reader (Anthos

Labtec Instruments, Walz/Salzburg, Österreich) die 6-keto-PGF1α- bzw. PGE2-

Konzentration der untersuchten Proben quantifiziert werden.


Als Grundlage für die Berechnungen der 6-keto-PGF1α-Konzentration diente eine

Standardkurve, die durch eine Verdünnungsreihe einer mitgelieferten 6-keto-PGF1α-

Lösung mit einer Konzentration von 500000 pg/ml zustande kam. In 7 Verdünnungs-

schritten entstanden 7 sog. Standards (S1-S7) mit in Tab. 5 dargestellten Konzen-

trationen. Für die Standardkurve des PGE2-Assays wurde eine 8-schrittige

Verdünnungsreihe, ausgehend von 50000 pg/ml, durchgeführt (s. Tab. 5).

Tab. 5: Konzentrationen (in pg/ml) der Prostaglandin-Standards. Der S4 wurde in allen Assays als Präzisionskontrollprobe mitgeführt.

6-keto-PGF1α PGE2

S1 3,2 39

S2 16 78

S3 80 156

S4 400 313

S5 2000 625

S6 10000 1250

S7 50000 2500

S8 5000

Die Kulturüberstände wurden je nach erwartetem Konzentrationsbereich im 6-keto-

PGF1α-Assay 5- bis 500fach verdünnt, im PGE2-Assay 2- bis 40fach verdünnt

eingesetzt.

Die Kreuzreaktivitäten der verwendeten Antiseren mit anderen Eicosanoiden sind

in Tab. 6 zusammengefasst.

Tab. 6: Kreuzreaktivitäten der in den Prostaglandin-EIAs verwendeten Antiseren mit anderen Eicosanoiden.

Eicosanoid Kreuzreaktivität

mit 6-keto-PGF1αKreuzreaktivität mit

PGE2

6-keto-PGF1α 100% 0,6%

2,3-dinor-6-keto-PGF1α 3,17%

PGF2α 1,67% 0,7%

PGD2 0,6%

PGF1α 0,6% 1,4%

PGE1 0,2% 70%

6,15-diketo-13,14-dihydro-PGF1α 0,12% <0,1%

13,14-dihydro-15-keto-PGF1α <0,01% <0,1%

15-keto-PGF2α <0,01%


Eicosanoid Kreuzreaktivität

mit 6-keto-PGF1αKreuzreaktivität mit

PGE2

PGA2 <0,01% 0,1%

PGB1 <0,01% 0,1%

PGE2 <0,01% 100%

Thromboxan B2 <0,01% <0,1%

15-HpETE <0,01%

PGE3 16,3%

2.3.4.2 ACTH-Festphasen-Chemilumineszenz-EIA

Ein kommerzieller Festphasen-Chemilumineszenz-EIA der Firma DPC Biermann

(Bad Nauheim) wurde auf einem Analyseautomaten (Immulite®) durchgeführt, um die

ACTH-Sekretion einer Ratten- (RC-4B/C1) und einer Maus-Hypophysen-Zelllinie

(AtT20) zu überprüfen. Über die klassische neuroendokrine Stimulationskaskade, bei

der die ACTH-Sekretion in Hypophysenzellen durch das hypothalamische CRH

angeregt wird, sollte dies als indirekte Kontrolle der Bioaktivität des in Gewebe- und

Zellkultur experimentell eingesetzten, synthetischen CRH dienen. Die herstellenden

Firmen garantieren zwar die Reinheit, nicht jedoch die Funktionalität ihrer Produkte.

Der ACTH-Assay ist nach dem Sandwich-Prinzip aufgebaut: Eine mit spezifischen,

monoklonalen Anti-ACTH-Antikörpern von der Maus beschichtete Polystyrolkugel im

Immulite®-Teströhrchen dient als Festphase, an die während einer 30-minütigen

Inkubationszeit ACTH aus dem Kulturüberstand bindet. Während einer zweiten

halbstündigen Inkubationszeit bindet ein zweiter, mit AP als Amplifikator markierter,

polyklonaler Anti-ACTH-Antikörper vom Kaninchen an das bereits gebundene ACTH.

Es entsteht ein sog. Sandwich-Komplex. Beide Bindungsreaktionen laufen bei 37°C

ab. Ungebundene Komponenten werden anschließend mittels einer speziellen

Zentrifugalwaschtechnik entfernt. Als Chemilumineszenz-Substrat wird Peroxidase aus

Meerrettich, Adamantyldioxetanphosphat, hinzugefügt und von der gebundenen AP

während der folgenden 10-minütigen Inkubation hydrolysiert. Die dabei ausgelöste

Lichtemission ist der ACTH-Konzentration in den Proben direkt proportional.

Da den Assay eine hohe Präzision und Stabilität auszeichnet, müssen keine

Standard-Kontrollproben pipettiert werden. Die Standardkurven sind als „Master-

kurven“ im Analyseautomaten gespeichert. Alle 4 Wochen bzw. bei Verwendung einer


neuen Charge wird mit einem hoch- und einem niedrig-konzentrierten Kalibrator (DPC

Biermann) eine neue Kalibration durchgeführt.

Beim ersten Versuchsdurchlauf wurden die Proben jeweils zunächst 1:10 mit

Kulturmedium und anschließend noch 1:10 mit einem spezifischen Verdünnungspuffer

(DPC Biermann) verdünnt, je nach Messergebnissen wurde dann mit unterschied-

lichen Verdünnungen noch einmal nachgemessen, wobei das Spektrum von der

unverdünnten Probe der RC-4B/C1-Zelllinie bis zur 3000fach verdünnten Probe der

AtT20-Zelllinie reichte. Als Kontrolle diente ein Placenta-Extrakt, der durch Zerstoßen

eines frischen, sorgfältig mit PBS gewaschenen Placenta-Stückes unter Zugabe von

Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) selbst

hergestellt wurde. Laut Angaben des Herstellers ist der Assay hochspezifisch für

ACTH; demnach sind Kreuzreaktivitäten des verwendeten Antiserums zu anderen in

der Probe vorkommenden ACTH-Fragmenten vernachlässigbar niedrig.

2.3.4.3 Qualitätskontrolle der EIAs

Die Variationskoeffizienten (Vk) der Intraassay-Präzision und Interassay-Präzision

werden aus dem Mittelwert und der Standardabweichung der Einzelmesswerte

errechnet. Sie wurden für die Prostaglandin-EIAs mit Hilfe von Präzisionskontroll-

proben bestimmt, deren Konzentrationen im Bereich des 50%-Intercept-Wertes lagen.

Diese Bedingung wurde am ehesten vom S4 erfüllt, der vierten Verdünnungsstufe der

mitgelieferten Standardlösung. Um Messwert-Unterschiede durch Pipettierungenauig-

keiten zu vermeiden, wurde der S4 einmal zu Beginn der Versuchsreihe in großer

Menge hergestellt, in Portionen für je einen Assay aliquotiert und bei -20°C gelagert.

Zur Ermittlung der Intraassay-Präzision wurden in einem Assay 6-8 Kontrollproben

eingesetzt, von denen 2 Proben vor, 4 in der Mitte und 2 nach den biologischen

Proben angeordnet wurden. Die Interassay-Präzision wurde überprüft, indem in jedem

Assay 2 Kontrollproben auf der Mikrotiterplatte zwischen den Standards und den

biologischen Proben mitgeführt wurden.

Zur Qualitätskontrolle des ACTH-Assays wurde ein kommerzielles Kontrollserum

(Lyphochek Immunoassay Plus Control) der Firma Bio-Rad Laboratories GmbH,

München, benutzt, da von DPC Biermann keine ACTH-Kontrolle erhältlich war. Alle


gemessenen Werte lagen im akzeptablen Bereich der vom Hersteller für andere

Geräte angegebenen Werte.

Die biologischen Proben wurden bei allen EIAs als Duplikate oder Triplikate, z.T.

auch als Hexaplikate eingesetzt. Im Rahmen der 6-keto-PGF1α-EIAs wurden einmalig

18 Parallelansätze auf den Gehalt dieses Prostaglandins untersucht.

Des Weiteren wurde einerseits die Genauigkeit der verschiedenen verwendeten

Pipetten (Einzelpipette, Multipette, Mehrkanalpipette) untersucht und andererseits die

Präzision unterschiedlicher Pipettierer. Im Rahmen dieser Kontrolltests wurde

außerdem die Messgenauigkeit des EIA-Readers überprüft, indem im Anschluss an

eine Messung dieselbe Mikrotiterplatte nach Drehung um 180° ein zweites Mal

gemessen wurde.

2.3.5 Zellkultur von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen

2.3.5.1 Steriles Arbeiten

Um bei der Zellkultur sterile Bedingungen zu gewährleisten, wurden alle Pinzetten,

Scheren und Glasgeräte vor Gebrauch autoklaviert und nach Gebrauch in Buraton

eingeweicht. Sämtliche Labormaterialien aus Kunststoff wurden sterilisiert von

verschiedenen Herstellern bezogen. Die keimfrei auszuführenden Arbeiten wurden auf

einer Sterilbank (ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA) durchgeführt, wobei der

Arbeitsplatz vor der Arbeit mit 70%igem Ethanol und nach der Arbeit mit Barizidal

desinfiziert wurde. Die Sterilbank bot zusätzlich die Möglichkeit einer 2-stündigen UV-

Bestrahlung zur Keimabtötung.

2.3.5.2 Allgemeine Kulturbedingungen

Mit dem Ziel, einen Bioassay zur Kontrolle der biologischen Aktivität des für die

Stimulationsversuche mit der Kurzzeit-Myometriumkultur eingesetzten synthetischen

CRH zu etablieren, wurden von der European Collection of Cell Cultures (ECCC;

Salisbury, Großbritannien) zwei Zelllinien aus Hypophysen-Adenomen bezogen: die

Ratten-Zelllinie RC-4B/C1 und die Maus-Zelllinie AtT20.


Die RC-4B/C1-Zellen zeichneten sich aus durch konfluierendes Wachstum in einer

Mischung aus DMEM und Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) im Verhältnis

1:1 mit 10% fetal-bovinem Serum (FBS) und 2 mM Glutamin (jeweils von Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen). Die AtT20-Zellen wuchsen hingegen frei

schwimmend und Aggregate bildend. Als Kulturmedium wurde vergleichend einerseits

DMEM, andererseits Ham’s F12 Nutrient Mixture mit Zusätzen (Sigma-Aldrich Chemie

GmbH) benutzt. Die Zellen wurden aufgetaut, in 25-cm2-Kulturflaschen mit

Gasaustauschöffnung (BD Biosciences, Heidelberg) in 12 ml Medium ausgebracht und

in Begasungsbrutschränken kultiviert, wobei die RC-4B/C1-Zellen eine wasserdampf-

gesättigte Atmosphäre von 10% CO2 und 90% Luft bei 34°C benötigten, während die

AtT20-Zellen in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre von 5% CO2 und 95% Luft

bei 37°C am besten gediehen. Gesundes Wachstum und fehlende Kontamination

wurden täglich durch Betrachtung der Zellen unter dem Invers-Mikroskop (DM IL;

Leica Mikroskope und Systeme GmbH, Wetzlar) kontrolliert. Nach jeweils 2-3 Tagen

wurde ein Mediumwechsel vorgenommen, und bei Bedarf wurden die Zellen in neue

Kulturflaschen umgesetzt. Die AtT20-Zellen mussten hierzu bei 220-mal g

abzentrifugiert werden. Als Indikator für die Notwendigkeit eines Mediumwechsels

diente ein Farbumschlag des Mediums von rot nach gelb, der durch eine Veränderung

des pH-Wertes aufgrund des vermehrten Anfalls von Stoffwechselprodukten bei

höheren Zellzahlen hervorgerufen wurde. Ab der 3. Passage wurden jeweils mit einem

Teil der Zellen ACTH-Experimente (z.B. Untersuchungen der basalen ACTH-

Sekretion, s. 2.3.5.3, Stimulationsversuche mit CRH, s. 2.3.5.4) durchgeführt.

Alternativ wurde ein Teil der Zellen für Immuncytochemie-Experimente (s. 2.3.8.1) auf

zweikammerigen Kultur-Objektträgern (Culture Slides; BD Biosciences) ausgesät,

während ein letzter Teil in flüssigem Stickstoff zur späteren Verwendung (z.B.

Isolierung von Total-RNA) schockgefroren und bei -80°C gelagert wurde.

2.3.5.3 Langzeitbeobachtung der basalen ACTH-Sekretion

Als Grundlage für die Stimulationsversuche mit CRH diente eine Beobachtung der

basalen ACTH-Sekretion der AtT20-Zellen über einen Zeitraum von 4,25 Tagen (104

Stunden). Für diese Versuche wurden die Zellen auf sterilen 6-Well-Kulturplatten

(Costar Corporation) in 5 ml Medium pro Well kultiviert. Eine Entnahme von 20 µl

Kulturüberstand erfolgte dabei nach 0, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 54, 72, 80, 96 und 104


Stunden. Zusätzlich wurde dabei untersucht, ob sich DMEM oder Ham’s F12 als

Kulturmedium geeigneter erweist.

2.3.5.4 Stimulationsversuche mit CRH

In Anlehnung an die unter 2.3.2 beschriebenen Experimente, in denen eine

Stimulation der Kurzzeit-Myometriumkultur mit CRH durchgeführt wurde, erfolgten

auch mit den beiden Zelllinien Stimulationsversuche. Im Folgenden wird das schon in

der Gewebekultur eingesetzte, 1999 von Bachem Biochemica GmbH (Heidelberg)

bezogene CRH als „alt, lyophilisiert“ bezeichnet. Dies geschieht zur Abgrenzung von

CRH, das 2001, unmittelbar vor den Versuchen mit den beiden Zelllinien, von zwei

verschiedenen Firmen erworben wurde („neu“, Bachem, und „Sigma“, Sigma-Aldrich

Chemie GmbH).

Die RC-4B/C1-Zellen wurden auf sterilen 6-Well-Platten in je 5 ml Nährmedium

ausgesät und am 4. Tag (nach 96 Stunden) mit CRH (alt, lyophilisiert) stimuliert. Das

CRH wurde in zwei verschiedenen Konzentrationen (K) eingesetzt: K1=2,1 nmol/l,

K2=0,21 nmol/l. Nach Stimulation wurden bis zur 6. Stunde im Stunden-, bis zur 12.

Stunde im 2-Stunden-Rhythmus, dann nach 24, 48 und 72 Stunden jeweils 20 µl-

Aliquots entnommen und bei -20°C bis zur Messung der ACTH-Konzentration am

Immulite® zwischengelagert. Als Kontrolle wurde eine unstimulierte Probe mitgeführt.

Während des gesamten Inkubationszeitraumes von einer Woche wurden zur Über-

prüfung der Zellproliferation täglich die Zellzahlen sowohl in den stimulierten als auch

in den unstimulierten Wells bestimmt.

Bei den Stimulationsversuchen mit den AtT20-Zellen (n=7) wurden die

Inkubationsbedingungen hinsichtlich verschiedener Fragestellungen mehrfach modi-

fiziert. Nach mehrfacher Parallelkultur in DMEM und Ham’s F12 (n=3) wurde nur noch

Ham’s F12 als Kulturmedium benutzt, da DMEM nicht besser geeignet erschien. Bei

n=4 Versuchen wurde das CRH der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH eingesetzt,

einmal das „neue“, in entgastem Wasser gelöste CRH von Bachem benutzt, während

das „alte, lyophilisierte“ CRH bei jedem Versuch verwendet wurde, wobei allerdings

verschiedene Konzentrationen (10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM, 0,1 nM) eingesetzt

wurden, um eine Konzentrationsabhängigkeit der Stimulierbarkeit zu überprüfen. Mit

einer Ausnahme, bei der die Kultur schon nach 6 Stunden beendet wurde, lagen die


Entnahmezeitpunkte der Kulturüberstände jeweils bei 0, 2-6, 18, 24 und 27 Stunden

nach Stimulation.

2.3.6 Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion

2.3.6.1 Durchführung der Total-RNA-Isolierung

Aus den Zellen beider Hypophysen-Zelllinien wurde nach der Single-Step-Methode

von Chomczynski & Sacchi [30] cytoplasmatische RNA isoliert, um im nächsten Schritt

mittels RT-PCR (Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion) zu überprüfen,

ob sie CRH-Rezeptoren exprimieren. Da der Erfolg dieser Methode von der möglichst

vollständigen Abwesenheit der äußerst stabilen RNasen abhing, wurden sämtliche

Glasgefäße vorher autoklaviert und sterile Materialien aus Kunststoff verwendet, die

laut Herstellerangaben für die Molekularbiologie getestet, also garantiert RNase- und

DNase-frei waren. Es wurde der peqGOLD Trifast Kit (Peqlab, Erlangen) verwendet.

Zunächst wurden die bei -80°C gelagerten Zellpellets aus ca. 106 Zellen in

flüssigen Stickstoff gegeben und für 1-2 Minuten im Mikrodismembrator II (B. Braun,

Melsungen) pulverisiert. Zur vollständigen Zerstörung der Zellen und Denaturierung

von RNasen wurden die Zellen in 1 ml Guanidiniumisothiocyanat-Phenol-Lösung

resuspendiert. Es folgte eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, um die

Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Zur Phasentrennung aufgrund

unterschiedlicher Polarität wurde pro ml Trifast 200 µl Chloroform (J.T. Baker,

Deventer, Holland) zugegeben und die Proben für 15-30 Sekunden kräftig geschüttelt,

bis sie milchig aussahen. Nach einer 5-minütigen Ruhephase wurden sie für 10

Minuten bei 14000-mal g bei Raumtemperatur zentrifugiert, was zu einer Auftrennung

in drei Phasen führte: eine untere, rote Phenol-Chloroform-Phase, eine obere,

farblose, wässrige Phase und eine dazwischen liegende Interphase. Da die Inter- und

Unterphase DNA und Proteine enthielten, während sich die RNA ausschließlich in der

oberen, wässrigen Phase befand, musste diese unter Vermeidung jeglicher

Kontamination vorsichtig abgenommen und in ein steriles Reaktionsgefäß transferiert

werden.

Im nächsten Schritt wurde die Präzipitation der RNA durchgeführt, indem die

Proben pro Anteil Trifast mit einem halben Anteil Isopropanol (Merck, Darmstadt) für


15 Sekunden gevortext und für 20 Minuten bei -20°C inkubiert wurden. Nach 35-

minütiger Zentrifugation bei 14000-mal g bei 4°C wurde der Überstand abgenommen,

das gelartige RNA-Präzipitat zweimal mit 75%igem Ethanol (J.T. Baker) gewaschen,

für 15 Sekunden gevortext und nochmals für 10 Minuten unter gleichen Bedingungen

zentrifugiert. Ehe die RNA wieder gelöst werden konnte, wurde das Pellet ca. 10

Minuten luftgetrocknet, bis es nicht mehr weiß, sondern durchscheinend aussah. Um

die Löslichkeit der RNA zu gewährleisten, wurde jedoch darauf geachtet, das Pellet

nicht vollständig auszutrocknen.

Zur Inaktivierung der eventuell trotz Einhaltens der Reinheitsvorschriften vorhan-

denen RNasen erfolgte das Lösen der RNA nun durch Zugabe von 100 µl 0,1%igem

Diethylpyrocarbonat (DEPC-)Wasser unter kräftigem Vortexen.

2.3.6.2 Qualitative Erfolgskontrolle durch RNA-Agarose-Gelektrophorese

Als qualitative Methode zur Reinheitsüberprüfung der isolierten RNA diente die

Agarose-Gelelektrophorese. Da cytoplasmatische RNA eukaryotischer Zellen zu 95%

aus ribosomaler RNA besteht, die sich aus 28S-, 18S- und 5S-RNA zusammensetzt,

laufen die 28S- und 18S-Moleküle in zwei scharfen, definierten Banden, die somit als

interne Marker benutzt werden können.

Für die Herstellung eines 1,5%igen, nicht-denaturierenden Gels wurde Agarose

(Biotrend, Köln) in 50 ml 1x TBE-Puffer (pH 8,3; 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM

EDTA) unter Hitzezufuhr vollständig gelöst und mit 0,04% Ethidiumbromid (Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) versetzt. Das Gel wurde in eine horizontale

Gelapparatur (Mini-sub cell GT, Bio-Rad Laboratories) gegossen, bei der ein Kamm

als Platzhalter für die Probentaschen diente. Beim Gießvorgang entstandene Luft-

blasen wurden sorgfältig entfernt, da sie wie auch ein zu geringer Lösungsgrad der

Agarose einen Störfaktor für die gleichmäßige Bandenwanderung darstellen. Vor jeder

RNA-Analyse wurde die Gelapparatur für mindestens 10 Minuten in 0,5 M NaOH

eingeweicht und anschließend mit ddH2O gewaschen, um RNase-Kontaminationen zu

vermeiden.

Zu je 2 µl der unter 2.3.6.1 gewonnenen RNA-Lösung wurde nach 5-minütiger

Denaturierung im Wasserbad bei 65°C (TW12 EcoTemp, Julabo Labortechnik GmbH,

Seelbach) und 1-minütiger Abkühlung auf Eiswasser 10 µl 1x RNA-Ladepuffer (20%


deionisiertes Formamid, 20% Glycerin, 20 mM EDTA, 0,02% Bromphenolblau, 0,02%

Xylencyanol FF) gegeben, die Proben in die Taschen des Gels geladen und mit TBE-

Puffer überschichtet. Durch das im Ladepuffer enthaltene Glycerin wird die spezifische

Dichte der Lösung erhöht, so dass die Proben in die Taschen des Gels hinabsinken.

Das Bromphenolblau dient als markierender Farbstoff für die „Lauffront“ der Banden.

Zusätzlich wurde ein kommerzieller 0,24-9,5 Kb-RNA-Marker als Längenstandard

(Invitrogen, Karlsruhe) auf das Gel aufgetragen.

Die Elektrophorese, bei der die negativ geladenen RNA-Moleküle je nach Größe in

einer bestimmten Geschwindigkeit Richtung Anode wandern (je kleiner, desto

schneller und weiter), erfolgte bei 60 V und 40 mA mit einem Electrophoresis Power

Supply-Gerät (EPS 300; Pharmacia Biotech). Sie dauerte ca. 30 Minuten.

Anschließend konnten die mit Ethidiumbromid gefärbten Banden auf einem

Transilluminator (302 nm; Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen) sichtbar

gemacht und mit einem digitalen Image Documentation and Analysis System (IDA;

Raytest, Straubenhardt) aufgenommen werden.

2.3.6.3 Quantitative Erfolgskontrolle durch Photometrie

Zur Kontrolle, ob tatsächlich reine RNA extrahiert wurde, und zur quantitativen

Analyse der RNA-Menge wurde eine Messung der optischen Dichte (OD) bei 260 nm

(A260) in einem Spektralphotometer (Ultrospec 3000; Pharmacia Biotech) durchgeführt.

Bei dieser Wellenlänge haben die Basen der Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum.

Die A260 wurde gegen die Absorption bei 320 nm (A320) als Nullwert abgeglichen, da

bei dieser Wellenlänge weder Nuklein- noch Aminosäuren absorbieren. Anhand der

Absorption bei 280 nm (A280) wurde die Lösung auf mögliche Proteinverunreinigung

geprüft, da aromatische Aminosäuren bei dieser Wellenlänge ein Absorptions-

maximum haben. Das A260/A280-Verhältnis lag zwischen 1,7 und 1,9. Dies spricht für

einen hohen Reinheitsgrad der RNA spricht.

Bei der Durchführung wurden die Proben auf Eis gelagert. Der Nullabgleich

erfolgte mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen). Die RNA-Lösung wurde mit DEPC-Wasser 1:50 weiter verdünnt. Nach

Sambrook & Russell [180] entspricht eine A260 von 1 einer Konzentration von etwa 40

µg/µl RNA. Da mit dieser Methode RNA nicht von Desoxyribonukleinsäure (DNA)


unterschieden werden kann, ist bei der RNA-Quantifizierung unbedingt auf die

Abwesenheit von DNA zu achten.

2.3.7 RT-PCR

2.3.7.1 Reverse Transkription

Die aus den Ratten- bzw. Maushypophysen-Zellen gewonnene RNA (s. 2.3.6.1)

wurde mit Hilfe der RT-PCR vervielfältigt und auf die Genexpression der CRH-

Rezeptoren CRH-R1 (GenBank Accession No. L23332) und CRH-R2 (Accession No.

U34587) untersucht. Bei dieser Methode wird zunächst die RNA von der Reversen

Transkriptase, einem Enzym aus Retroviren, in komplementäre DNA (cDNA)

umgeschrieben, die dann mittels PCR so lange amplifiziert wird, bis ausreichende

Mengen zur weiteren Charakterisierung, z.B. mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese,

zur Verfügung stehen. Da RNA aufgrund hoher Instabilität nicht für eine direkte

Amplifikation nutzbar ist, ist der „Umweg“ über die stabilere cDNA erforderlich. Um den

Umschreibeprozess beginnen zu können, benötigt die Reverse Transkriptase ein

Oligonukleotid als Primer, das zur Zielsequenz auf dem RNA-Strang komplementär ist,

sich dort anlagert und als Startermolekül für die Synthese eines komplementären

DNA-Stranges dient. Für die weitere Synthese werden Random-Hexamer-Primer, die

sich als Gemisch verschiedener Hexamere an unterschiedliche RNA-Sequenzen

anlagern, hinzugefügt. Hierbei erfolgt die Synthese immer vom 5’- bis zum 3’-Ende der

RNA.

Zunächst wurden 2 µg der Total-RNA auf ein Gesamtvolumen von 16 µl mit

DEPC-Wasser (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) aufgefüllt, in einem Thermocycler (T-

Gradient 96, Biometra, Göttingen) für 5 Minuten bei 85°C denaturiert und bis zur

Weiterverarbeitung auf Eis gelagert. Zur denaturierten RNA wurde dann bis zu einem

Gesamtvolumen von 30 µl First Strand RT Buffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM

KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithioethritol (DTT) und 5 µM Random Hexameren je 0,65

mM Desoxynucleosidtriphosphat (dNTP) und 10 units/µl Superscript II Reverser

Transkriptase (alle Reagenzien von Invitrogen, Karlsruhe) gegeben. Pipettiert wurde,

um Kontaminationen weitestgehend zu vermeiden, in einer mit UV-Licht bestrahlbaren

PCR-Box (P.C.R. Chamber, PLAS LABS, Lansing, MI, USA). Die cDNA-Synthese

wurde für 90 Minuten bei 42°C im Thermocycler durchgeführt. Durch Hitzeinaktivierung


des Enzyms für 15 Minuten bei 85°C wurde die Reaktion beendet. Die auf diese Weise

gewonnene cDNA wurde mit DEPC-Wasser in einem Endvolumen von 90 µl gelöst

und bei -20°C gelagert.

2.3.7.2 First-Round und Nested PCR

Zu 1 µl der unter 2.3.7.1 synthetisierten cDNA (entsprechend 20-100 ng revers

transkribierter Total-RNA) wurden 20 mM Tris HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM

MgCl2, je 200 µM dNTP, 0,025 units/µl Taq Polymerase (hitzestabile DNA-Polymerase

aus Thermus aquaticus; alle von Invitrogen, Karlsruhe) und je 400 nM jedes

spezifischen Primers (s. Tab. 7; synthetisiert bei TIB Molbiol, Berlin) gegeben. Dieses

Reaktionsgemisch wurde mit Aqua ad iniectabilia (B. Braun, Melsungen) bis zu einem

Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt. Im Thermocycler (T-Gradient 96, Biometra,

Göttingen) wurde zunächst die cDNA für 5 Minuten bei 95°C vollständig denaturiert,

anschließend in 35 Zyklen die cDNA amplifiziert. Ein Zyklus bestand jeweils aus der

Trennung der DNA-Doppelstränge (Denaturierung) für 30 Sekunden bei 94°C, der

Anlagerung der Primer an die Zielsequenz (Annealing) für 40 Sekunden bei 62°C und

der eigentlichen Neusynthese des komplementären DNA-Stranges (Elongation) für 90

Sekunden bei 72°C. Um die vollständige Polymerisation aller cDNA-Stränge zu

gewährleisten, wurde der Reaktionsansatz nach Wetzka et al. [218] abschließend ein

weiteres Mal für 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Zur Positivkontrolle der PCR wurde die

Genexpression von Cyclophilin A (Cyph; Accession No. Y00052), einem ubiquitär

exprimierten sog. „Haushaltsgen“, untersucht, da von diesem zellulären Rezeptor von

Cyclosporin kaum Expressionsschwankungen bekannt sind.

Da für die Zielgene CRH-R1 und -R2 nach nur einer PCR-Runde (First Round

PCR) kein oder nur ein schwaches Signal detektiert worden war, wurde anschließend

nach einer Methode von Knippers et al. [98] eine weitere PCR-Runde (Nested PCR)

mit eingeschachtelten Primerpaaren durchgeführt, die innerhalb des ersten Amplikons

lagen. Dadurch wurden sowohl Sensitivität als auch Spezifität der Reaktion erhöht. 1 µl

einer 1:500-Verdünnung des Reaktionsansatzes aus der First Round PCR diente

dabei als cDNA-Matrize. Die Reaktionsbedingungen waren für First Round und Nested

PCR identisch.


Tab. 7: Verwendete Primerpaare für die RT-PCR.

Zielgen Richtung Sequenz Amplikon-

Länge Referenz

First Round PCR

CRH sense antisense

5’-TGGATCTCACCTTCCACCTC-3’ 5’-CATTGTGTTGCTGCTGCAC-3’

308 bp Ahmed et al., 2000

CRH-R1 sense antisense

5’-GCCCTGCCCTGCCTTTTTCTA-3’ 5’-GCTCATGGTTAGCTGGACCA-3’

334 bp Stevens et al, 1998


5’-GCAGCTCGTTGACCATGAAG-3’ 5’-GACACGAAGAAACCCTGGAA-3’

561 bp Sehringer, 2003

Cyclophilin A sense antisense

5’-AGGGTGGTGACTTCACACGCCAT-3’5’-GTCTTGCCATTCCTGGACCCAAA-3’

268 bp Behan et al., 1996

Nested PCR


5’-ACAAACAATGGCTACCGGGA-3’ 5’-TCGCAGGCACCGGATGCTC-3’

216 bp Rodrigues-Linarez et al., 1998 Di Blasio et al., 1997


5’-GCAGCTCGTTGACCATGAAG-3’ 5’-GATGCACCATCCGATGAAGA-3’

196 bp Sehringer, 2003

Die PCR-Bedingungen wurden im Endokrinologischen Labor von Frau Dr. Silke

Biller [13] im Rahmen ihrer medizinischen Dissertation etabliert. Die Auswahl der

spezifischen Primerpaare beruhte einerseits auf bereits veröffentlichten Publikationen,

andererseits auf der biologischen Doktorarbeit von Herrn Dr. Bernd Sehringer [190].

2.3.7.3 DNA-Agarose-Gelelektrophorese

Analog der unter 2.3.6.2 beschriebenen RNA-Agarose-Gelelektrophorese wurden

die PCR-Produkte mittels 2%iger Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die hierfür

verwendeten Gele enthielten neben 2% Agarose (m/v) 1x TBE-Puffer (pH 8,3) und 0,4

µg/ml Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen). Die DNA wurde in

einem Probenvolumen von 10-20 µl mit 1x DNA-Ladepuffer (5% Glycerin, 5 mM

EDTA, 0,005% Bromphenolblau, 0,005% Xylencyanol FF) aufgetragen und mit 1x

TBE-Puffer überschichtet. Je nach Größe der zu erwartenden Banden wurde ein 1Kb

Plus- oder ein 50 bp-DNA-Marker (beide von Invitrogen, Karlsruhe) benutzt. Die

Elektrophorese erfolgte bei einer Stromstärke von 60 mA.


2.3.8 Immunhistochemie (IHC) und Immuncytochemie (ICC)

2.3.8.1 Vorbehandlung der Gewebeproben und Zellen

Zur histologischen Charakterisierung von Myometriumbiopsien wurden Paraffin-

schnitte verwendet. Dazu wurden ca. 1 cm2 große Gewebeproben aus dem unteren

Uterinsegment über Nacht in 4%iger, PBS-gepufferter Formalinlösung (4% Form-

aldehyd in 1x PBS für die IHC) fixiert, in Paraffin eingebettet, mit Hilfe eines Mikrotoms

(Leica, Bensheim) zu 5 µm dicken Schnitten verarbeitet, auf silanisierte Objektträger

(DAKO Diagnostika, Hamburg) aufgezogen und immunhistochemisch angefärbt. Dabei

wurden möglichst aufeinander folgende Gewebeschnitte vom oberen Ende, aus der

Mitte und vom unteren Ende eines Paraffinblocks so verwendet, dass der jeweilige zu

untersuchende Parameter in Schnitten aus allen drei Bereichen parallel angefärbt

werden konnte. Die Einbettung der Biopsien wurde freundlicherweise vom

Histologischen Labor der Universitäts-Frauenklinik durchgeführt. Vor Beginn der

eigentlichen immunhistochemischen Färbung wurde zunächst eine Entparaffinierung

der Schnitte durch eine halbstündige Wärmebehandlung bei 55°C im Wärmeschrank

(WTC Binder) durchgeführt, gefolgt von einer sukzessiven Rehydrierung durch eine

absteigende Alkoholreihe (je 5 Minuten in Xylol 100% und Ethanol 100%, dann für je 2

Minuten in Ethanol 96%, 80% und 70%).

Zur qualitativen Eignungsprüfung der Rattenhypophysen-Zelllinie RC-4B/C1 als

CRH-Bioassay wurden die Zellen nach Kryofixation immuncytochemisch untersucht.

Um die Vorteile des konfluierenden, adhärenten Zellwachstums optimal nutzen zu

können, wurden die Zellen auf speziellen, unbehandelten Kultur-Objektträgern (Culture

Slides; BD Biosciences) mit einem zweigeteilten Kammeraufsatz aus Kunststoff, der

ein Volumen von 250 µl Nährmedium pro Kammer fasste, über 2-3 Tage kultiviert, bis

ein intakter Monolayer entstanden war. Dann wurde das Medium mit überschüssigen

Zellen verworfen, der Kammeraufsatz vom Objektträger entfernt, die angewachsenen

Zellen mit 1x PBS für die IHC gewaschen und trocknen gelassen. Die Fixierung

erfolgte für 5 Minuten bei Raumtemperatur in Methanol und für 3 Minuten bei –20°C in

Aceton. Nach einer 2-stündigen Lufttrocknungsphase wurden die Objektträger in

Alufolie verpackt und bis zur Färbung bei -80°C gelagert. Die Rehydrierung nach dem

Auftauen erfolgte für 3 Minuten in 1x NKH-Lösung (137 mM NaCl, 50 mM KCl, 2 mM

HEPES, pH 7,4).


Anschließend wurden die Gewebeschnitte bzw. Zellen mit einem Markierstift für

die Immunhistochemie (DAKO Pen, DAKO Diagnostika) eingekreist. Dieser Stift

hinterlässt auf dem Objektträger eine farbige, hydrophobe, leicht erhabene Schicht, so

dass die aufgetragenen Reagenzien (50 µl) auf den umkreisten Bereich beschränkt

bleiben und nicht auslaufen können. Dies spart nicht nur Reagenzien und bietet

Schutz vor Austrocknung der Oberfläche, sondern hat überdies den Vorteil, dass

parallel mehrere Schnitte auf dem Objektträger mit jeweils unterschiedlichen

spezifischen Antikörpern inkubiert werden können.

2.3.8.2 Auswahl der spezifischen Antikörper

Zum Nachweis von CRH-Rezeptoren wurden polyklonale Ziegen-Antikörper (Ak)

eingesetzt, und zwar ein unspezifischer, gegen beide Rezeptoren gerichteter (Anti-

R1/R2unspez.) und je ein spezifischer Antikörper (Anti-R1 spez. bzw. Anti-R2spez.; alle von

Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Der Anti-R1 spez. sc-12381 ist gegen

ein Epitop in Richtung des N-Terminus des humanen CRH-R1-Rezeptors zwischen

Aminosäure-Position 81 und 109 gerichtet. Obwohl die Homologie zum CRH-R2-

Rezeptor in diesem Bereich 55% beträgt, ist mit einer Kreuzreaktivität laut

Herstellerangaben nicht zu rechnen, da nie mehr als 5 Aminosäuren nebeneinander

identisch sind. Mit diesem Antikörper sind alle bekannten Spleißvarianten des CRH-

R1-Rezeptors mit Ausnahme des CRH-R1e nachweisbar. Der Anti-R2spez. sc-1826 ist

gegen ein N-terminales Epitop des CRH-R2β-Rezeptors der Maus zwischen

Aminosäure-Position 47 und 66 gerichtet. Ab Position 55 werden die Sequenzen von

CRH-R2α, -β und -γ identisch und weisen mit einer Übereinstimmung von 11 von 12

Aminosäuren eine hohe Sequenz-Homologie zum humanen CRH-R2-Rezeptor auf.

Zum CRH-R1-Rezeptor besteht hingegen eine vernachlässigbare Homologie von

maximal 35%.

Um die Expression der CRH-Rezeptoren innerhalb des myometrialen Gewebe-

verbandes zu beurteilen, wurden als Vergleichsparameter verschiedene Zelltypen mit

spezifischen, monoklonalen Maus-Antikörpern angefärbt: Glatte Muskelfasern wurden

mit einem Antikörper gegen α-Aktin nachgewiesen, Gefäßendothelzellen mit einem

Antikörper gegen von-Willebrand-Faktor (vWF), Makrophagen mit einem Antikörper

gegen das Oberflächenantigen CD68 und Fibroblasten mit dem Antikörper-Klon 5B5

(alle von DAKO Diagnostika) bzw. Klon 3-2B12 (Acris Antibodies GmbH, Hidden-


hausen). Beide Fibroblasten-Antikörper-Klone sind gegen Epitope in der β-Untereinheit

der humanen Prolyl-4-Hydroxylase, dem Schrittmacher-Enzym der Kollagensynthese,

gerichtet. Ihr Unterschied liegt laut Herstellerangaben in ihrer Eignung für

verschiedene Fixierungsarten: Während 5B5 besonders geeignet für den Fibroblasten-

nachweis in Gefrierschnitten und cytologischen Präparaten ist, zeichnet sich 3-2B12

zusätzlich durch gute Verwendbarkeit für Paraffinschnitte aus. Als Positivkontrolle für

CD68 wurde ein Deciduaschnitt mit angefärbt.

In mehreren Vorversuchen wurde für die Gewebeschnitte die jeweils optimale

Verdünnung der Antikörper mit PBT-Lösung (1x PBS für die IHC, 1% BSA für die IHC;

Serva, Heidelberg, 0,2% Triton X 100; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen,

lösen unter Rühren bei 5°C) bestimmt. Sie betrug für die Anti-CRH-Ak zur Färbung der

Gewebeschnitte und für die Anti-α-Aktin-Ak 1:100, für Anti-vWF-Ak und Anti-CD68-Ak

1:25 und für 5B5 1:200. Für den Einsatz von 3-2B12 bei den Myometriumbiopsien ließ

sich keine Verdünnung ermitteln, die reproduzierbar gute Ergebnisse geliefert hätte; in

den überwiegenden Fällen wurde dieser Klon in einer Verdünnung von 1:100 benutzt.

Zum Vergleich wurde er bei paraffinfixierten Hautschnitten im Rahmen einer

Verdünnungsreihe (1:25, 1:50, 1:100, 1:200 und 1:400) verwendet. Die RC-4B/C1-

Zellen wurden mit dem Anti-CRH-R1/R2unspez. in einer Verdünnung von 1:75, mit dem

Anti-R1spez. in einer Verdünnung von 1:100 und mit dem Anti-R2spez. in einer

Verdünnung von 1:100 untersucht.

Als zusätzliche Überprüfung der Zellen auf Eignung als CRH-Bioassay untersuchte

Herr Dr. Feuerhake in der Abteilung Neuropathologie der Universitätsklinik Freiburg

freundlicherweise die Zellen auf die Expression von ACTH-Rezeptoren. Er führte mit

einem spezifischen Antikörper gegen den ACTH-Rezeptor (DAKO Diagnostika) eine

Verdünnungsreihe (1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000) durch. Als Positivkontrolle

diente eine menschliche Hypophyse, die mit Anti-ACTH-Ak in einer Verdünnung von

1:50 angefärbt wurde.

2.3.8.3 Der immunologische Färbevorgang

Den ersten Schritt der eigentlichen Färbeprozedur bildete die Inaktivierung von

endogen vorhandenen Peroxidasen durch die 10-minütige Zugabe von Wasserstoff-

peroxid (H2O2) 3% in 1x PBS für die IHC. Dieser Arbeitsschritt, sowie alle weiteren, bei

denen die Gewebeschnitte mit Reagenzien überschichtet wurden, erfolgte durch


Inkubation bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer auf einem taumelnden

Schüttler (Reax 3; Heidolph, Schwabach). Als nächstes wurde bei den Gewebe-

schnitten eine hitzeinduzierte Antigen-Demaskierung durch Aufkochen im Dampfkoch-

topf für 5 Minuten durchgeführt. Als Kochpuffer diente standardmäßig 10 mM

Zitratpuffer (0,1 M Zitronensäure, 0,1 M Natriumzitratlösung; Merck, Darmstadt). Zur

Optimierung der Färbungs-Ergebnisse wurde vergleichend für die α-Aktin- und CD68-

Färbungen Tris/EDTA-Puffer für die IHC (pH 9,0; 10 mM Tris, 1 mM EDTA) und für die

vWF- und Fibroblasten-Färbungen DakoCytomation Target Retrieval Solution

eingesetzt (S1700, pH 6,1; DAKO Diagnostika). Bei den Zellen wurden die Epitope

durch 15-minütige Andauung mit Pronase 0,1% (Linaris, Wertheim-Bettingen)

demaskiert. Nach Waschen im Glastrog für 2-mal je 5 Minuten in 1x PBS für die IHC

wurden unspezifische Bindungsstellen innerhalb von 30 Minuten mit 10%igem Hasen-

(CRH-Rezeptoren; Alexis, Grünberg) bzw. Pferdeserum (alle übrigen o.g. Antigene;

Serva, Heidelberg) in PBS abgesättigt. Anschließend wurde das jeweilige Serum durch

Abklopfen der Objektträger auf einem Zellstofftuch entfernt, die Schnitte wurden

jedoch nicht gewaschen.

Die Inkubation mit dem spezifischen Primärantikörper erfolgte für mindestens 2

Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C. Anschließend wurde eine 30-

60-minütige Inkubation mit einem polyklonalen, biotinylierten, 1:200 mit PBT

verdünnten Anti-Ziegen-Antikörper vom Hasen (CRH-Rezeptoren) bzw. Anti-Maus-

Antikörper vom Pferd (alle anderen o.g. Antigene) durchgeführt. Beide Zweitantikörper

stammten aus dem Vectastain Elite ABC Kit (Goat bzw. Mouse IgG; Vector

Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Nach Waschen für 2x je 5 Minuten in 1x PBS für die IHC folgte eine Über-

schichtung der Präparate für 30 Minuten mit einem Streptavidin-Peroxidase-Komplex

(ABC-Komplex aus dem Vectastain Elite ABC Kit, 1% Lösung A, 1% Lösung B, in 1x

PBS für die IHC mindestens 30 Minuten vor Gebrauch angesetzt) mit anschließendem

erneuten 10-minütigen Waschgang. Im Vergleich zu peroxidasegekoppelten Zweit-

antikörpern als Amplifikatoren zeichnet sich der Gebrauch des ABC-Komplexes als

Detektionssystem dadurch aus, dass das Signal verstärkt, die Farbreaktion intensiver

und somit der Test empfindlicher wird.

Als Peroxidase-Substrat zum Sichtbarmachen des gebundenen Antikörpers

wurden bei einem Teil der Proben 3,3’-Diaminobenzidin-Tabletten-Sets (Fast-DAB;


Sigma-Aldrich Chemie GmbH) nach Angabe des Herstellers in ddH2O gelöst

(Endkonzentration: 0,7 mg/ml DAB, 1,6 mg/ml Harnstoff-Hydrogenperoxid, 0,6 M Tris)

und je 100 µl hinzugegeben, bis eine makroskopisch sichtbare bräunliche Färbung der

Schnitte erfolgt war. Diese Farbreaktion dauerte bei Raumtemperatur 5-7 Minuten,

wurde durch Spülen (5 Minuten) mit ddH2O beendet, und die Schnitte wurden für 10

Minuten in ddH2O gestellt. Vergleichsweise wurde bei einem anderen Teil der Proben

als Peroxidase-Substrat flüssiges Romulin AEC (Biocarta, Hamburg) verwendet, was

eine rötliche Färbung der Schnitte zur Folge hatte. Obwohl Romulin AEC laut

Herstellerangaben das weniger sensitive Chromogen ist, bietet es gegenüber DAB,

welches karzinogene Eigenschaften hat, den Vorteil der geringeren Toxizität.

Die Gegenfärbung der Zellkerne wurde über 30 Sekunden mit 1%iger, filtrierter

„Mayers Hämalaunlösung für die Mikroskopie“ (Merck, Darmstadt) durchgeführt.

Anschließend wurden die Präparate für mindestens 5 Minuten unter fließendem

Leitungswasser abgespült. Zur Dehydrierung der gefärbten Schnitte wurden die

Objektträger nach einer aufsteigenden Alkoholreihe (je 2 Minuten in Ethanol 70%,

80%, 96% und 100%) in Xylol überführt und anschließend nach Zugabe einiger

Tropfen Entellan (Merck) mit Deckgläsern abgedeckt und über Nacht zum Trocknen im

Abzug stehen gelassen. Positive Färbungen stellten sich bei Verwendung von DAB

intensiv braun, bei Romulin AEC orange-rot dar, während die Zellkerne durch das

Hämalaun blau-violett angefärbt wurden.

Als Negativkontrollen dienten Proben, die ohne Primärantikörper inkubiert,

ansonsten aber identisch behandelt wurden. Somit konnten unspezifische Bindungen

des Sekundärantikörpers identifiziert werden. Ferner wurden Placentaproben mit dem

Antikörper gegen α-Aktin inkubiert, um anhand eines Gewebetyps, der bekannter-

maßen keine glatten Muskelzellen aufweist, zu überprüfen, ob der Antikörper wirklich

eine hohe Spezifität für Leiomyocyten aufweist. Die Beurteilung der gefärbten Schnitte

wurde unter einem Lichtmikroskop (Carl Zeiss, Jena) vorgenommen.

Ergebnisse 61

3 Ergebnisse

3.1 Prostaglandinsekretion im Myometrium

3.1.1 Prostacyclin

3.1.1.1 Basale Zeitkinetik

Da Prostacyclin aufgrund seiner schnellen Metabolisierung unter Labor-

bedingungen schlecht zu untersuchen ist, wurde stattdessen die Sekretion seines

stabilen Metaboliten 6-keto-PGF1α gemessen. Die basale Sekretion im Myometrium

wurde im zeitlichen Verlauf der Gewebekultur beobachtet, um Bezugsdaten für einen

Vergleich mit der Sekretion nach Zugabe potentiell stimulierender Substanzen (CRH,

Urocortin, IL-1β) zu erheben (n=5).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Vor 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 20h 22h 24h

Inkubationszeit

Ko

nz./

FG

(p

g/m

g)

M99

Abb. 7: Zeitlicher Verlauf der basalen 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebe-proben (in pg/mg). „Vor“ steht für die Vorinkubationsphase in der Kurzzeit-Gewebekultur, die der Hauptinkubation vorgeschaltet war.

Trotz großer Schwankungen der Einzelwerte innerhalb der Triplikatmessungen

ergab sich ein grundsätzlich ähnlicher Zeitverlauf, der in Abb. 7 exemplarisch

dargestellt ist: Nach einem leichten Anstieg der Messwerte zwischen der Entnahme

des Kulturüberstandes während der Vorinkubation und zum Startpunkt der

Ergebnisse 62

eigentlichen Inkubation bei 0 Stunden fielen sie bis zur Entnahme bei 1 Stunde stark

ab, um dann bis zum Maximalwert bei 7 Stunden stetig anzusteigen. Gegen Ende der

Kultur (20-24 Stunden) pendelten sie sich ca. auf 4-Stunden-Niveau ein.

3.1.1.2 Vergleich verschiedener Kulturmedien

Zur Optimierung der Kulturbedingungen der Kurzzeit-Gewebekultur wurde ein

Versuchsaufbau konzipiert, in dem manche Myometriumproben (n=3) parallel in IMDM

und HBSS kultiviert wurden. Anschließend wurde anhand der Messung der 6-keto-

PGF1α-Sekretion die Reaktion des Gewebes auf die verschiedenen Nährmedien

verglichen.

Es stellte sich heraus, dass die Messwerte für die Konzentration bezogen auf das

Feuchtgewicht (in pg/mg) bei der Verwendung von IMDM in allen Fällen höher lagen

als bei HBSS. Während der Unterschied überwiegend nicht sehr ausgeprägt war,

fanden sich bei einer Probe für IMDM mehr als doppelt so hohe Werte wie für HBSS.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

M088 M089 M090

Gewebe-Nr.

Ko

nz./

FG

[p

g/m

g] IMDM

HBSS

Abb. 8: Vergleich von IMDM und HBSS als Nährmedium für die Myometriumbiopsien in der Kurzzeit-Gewebekultur anhand der 6-keto-PGF1α-Sekretion. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben.

Bei allen Proben wichen die Werte innerhalb der Triplikatmessungen sehr stark

voneinander ab. Bei einem Vergleich dieser Schwankungsfaktoren zeigte sich, dass

sie bei HBSS (ca. Faktor 6) überwiegend höher lagen als bei IMDM (Faktor 1,5-2,2);

dieser Effekt ist in Tab. 8 dargestellt.

Ergebnisse 63

Tab. 8: Schwankungsfaktoren zwischen jeweils dem kleinsten und dem größten Einzelmesswert innerhalb einer Triplikatmessung. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Myometriumproben. Die Proben sind gekennzeichnet durch einen Buchstaben für die Gewebeart (hier „M“ für Myometrium) in Verbindung mit einer Zahl, die einer bestimmten Patientin zugeordnet ist.

Kulturmedium M88

Konz./FG [pg/mg]

Max. Faktor

M89 Konz./FG [pg/mg]

Max. Faktor

M90 Konz./FG [pg/mg]

Max. Faktor

2583 1109 914

9527 1605 1024

IMDM

21498

8,3

2399

2,2

1350

1,5

Mittelwert 11203 1704 1096

Standardabweichung 9568 650 227

1431 913 246

5229 1058 738

HBSS

8219

5,7

1529

1,7

1474

6,0

Mittelwert 4960 1167 819

Standardabweichung 3402 323 618

3.1.1.3 Stimulation mit CRH, Urocortin und IL-1β

Zur Untersuchung etwaiger Stimulationseffekte auf die 6-keto-PGF1α-Sekretion

wurden Myometriumbiopsien mit CRH, Urocortin und IL-1β inkubiert.

Durch keine der zugegebenen potentiellen Stimulanzien konnte eine reproduzier-

bare Stimulation beobachtet werden. Dennoch war, bezogen auf die jeweiligen

Basalwerte, die Tendenz zu einer leichten Stimulation sowohl durch CRH als auch in

etwas schwächerer Form durch Urocortin und IL-1β zu verzeichnen.

Ergebnisse 64

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

M109 M110 M111 M112 M113

Proben-Nr.

Ko

nz./

FG

[p

g/m

g]

Basal(-)

CRH(-)

UCN(-)

IL-1ß(-)

Abb. 9: Basale und stimulierte 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (109-113). „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben.

3.1.1.4 Modifikation der Hauptinkubationsphase

Mit dem Ziel, starke inter- und intraindividuelle Schwankungen der 6-keto-PGF1α-

Konzentrationswerte durch unterschiedliche Korrelation der Werte zu kontrollieren,

wurde bei einem Teil der Versuche (n=8) die Hauptinkubationsphase in die Phasen A

und B unterteilt und wurden die Gewebeproben nach Ablauf der Phase A in neuem

Kulturmedium weiter inkubiert.

Ein Vergleich der basalen Konzentrationswerte bezogen auf das Feuchtgewicht

der Proben zum Zeitpunkt des Umsetzens und am Ende der Inkubation zeigte, dass

das Umsetzen der Proben zu einer deutlichen Konzentrationsabnahme geführt hatte.

Hingegen hatte bei den Proben, die nur einer Inkubationsphase ausgesetzt gewesen

waren, die Konzentration zugenommen. In Abb. 10 ist diese Beobachtung beispielhaft

dargestellt; hier stand einer Abnahme um 42% bei unterteilter Inkubationsphase eine

Zunahme um 28% bei nur einer Inkubationsphase gegenüber.

Das gleiche Ergebnis galt für die mit o.g. Substanzen potentiell stimulierten

Gewebeproben: Die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht war

nach Phase B durchweg niedriger als nach Phase A, d.h. es war keine Stimulation

erkennbar. Die Ausnahme von dieser Beobachtung bildeten die Proben einer einzigen

Ergebnisse 65

Patientin (M106), bei der sowohl die basalen als auch die stimulierten Messwerte nach

Phase B deutlich höher waren als nach Phase A (nicht gezeigt).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

M100-AB M100-C

Proben-Nr. und Inkubationsart

Ko

nz./

FG

(p

g/m

g)

7h

24h

Abb. 10: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (M100). “AB“ bezeichnet eine zweigeteilte Inkubationsphase von 6-7h (A), nach denen die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) inkubiert wurden. „C“ beschreibt eine einteilige Inkubationsphase von 22-24h. „Konz./FG“ beschreibt die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben.

Des Weiteren fiel auf, dass trotz des Versuches einer Korrelation der Messwerte

von Phase B auf Phase A sehr große interindividuelle Schwankungen auftraten. Dabei

handelte es sich um voneinander abweichende 6-keto-PGF1α-Sekretionsmuster der

verschiedenen Patientinnen, die sich nicht nur in den Absolutwerten, sondern auch in

der prozentualen Konzentrationsänderung (33-79%) darstellten. Das gleiche Problem

zeigte sich beim Versuch einer Normalisierung der Konzentrationswerte nach Phase A

auf die Werte vom Ausgangspunkt der Kultur bei 0 Stunden. Die prozentuale Zu- bzw.

Abnahme der Konzentration dieser beiden Korrelationsversuche (B bezogen auf A und

A bezogen auf 0 Stunden) sind in Tab. 9 zusammengetragen.

Erschwerend kamen große intraindividuelle Abweichungen hinzu; auch hier unter-

lagen sowohl die absoluten Einzelwerte als auch die mit den Einzelwerten berechnete

prozentuale Konzentrationszu- bzw. -abnahme sehr großen Schwankungen (z.B. 19-

57% bei M99).

Ergebnisse 66

Tab. 9: Prozentuale Veränderungen der 6-keto-PGF1α-Konzentration im Verlauf der Kurzzeit-Myometriumkultur. Die 6-keto-PGF1α-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Myometriumbiopsien (Konz./FG in pg/ml) wurde dreimal gemessen: das erste Mal zu Beginn der Inkubationszeit (0h), das zweite Mal am Ende der ersten Hauptinkubationsphase (A), das dritte Mal am Ende der zweiten Hauptinkubations-phase (B), die mit dem Ende der Gewebekultur zusammenfiel. Bei „A bezogen auf 0h“ wurde die prozentuale Konzentrationszu- bzw. -abnahme berechnet, die zwischen dem Messzeitpunkt bei 0h und dem Ende von Phase A stattgefunden hatte. Nach gleichem Schema erfolgte die Berechnung der Konzentrationsänderung bei „B bezogen auf A“. „MW“ steht für den arithmetischen Mittelwert der ebenfalls dargestellten Einzelwerte. Grüne Pfeile nach oben zeigen eine Zunahme-, rote Pfeile nach unten eine Abnahmetendenz der 6-keto-PGF1α-Konzentration an.

Proben-Nr. Stimulanz 0h [Konz./FG] A [Konz./FG] B [Konz./FG] A bezogen auf 0h B bezogen auf A

M99 - 882 1015 690 15% � -32% �

- 927 778 1084 -16% � 39% �

- 619 908 900 47% � -1% �

- 797 2528 1734 217% � -31% �

MW - 806 1307 1102 62% � -16% �

M100 - 1683 902 -46% �

- 1655 1641 -1% �

- 946 719 -24% �

MW - 1428 1087 -24% �

M102 - 26632 43144 62% �

- 26632 18866 -29% �

- 26632 6035 -77% �

MW - 26632 22682 -15% �

M105 - 1453 1731 799 19% � -54% �

- 1336 1234 244 -8% � -80% �

- 732 1515 521 107% � -66% �

MW - 1174 1493 521 27% � -65% �

CRH 1402 447 -68% �

CRH 1589 699 -56% �

CRH 1498 755 -50% �

MW-CRH 1496 634 -58% �

IL-1ß 1766 1222 -31% �

IL-1ß 833 532 -36% �

IL-1ß 2036 1362 -33% �

MW-IL-1ß 1545 1039 -33% �

UCN 1131 1077 -5% �

UCN 877 717 -18% �

UCN 1243 222 -82% �

MW-UCN 1084 672 -38% �

M106 - 393 181 303 -54% � 67% �

- 543 376 396 -31% � 5% �

- 796 283 464 -64% � 64% �

MW - 577 280 388 -52% � 38% �

CRH 277 576 108% �

CRH 274 283 3% �

Ergebnisse 67

Proben-Nr. Stimulanz 0h [Konz./FG] A [Konz./FG] B [Konz./FG] A bezogen auf 0h B bezogen auf A

CRH 433 654 51% �

MW-CRH 328 504 54% �

IL-1ß 86 3953 4497% �

IL-1ß 855 7146 736% �

IL-1ß 173 314 82% �

MW-IL-1ß 371 3804 925% �

M107 - 1379 5774 1567 319% � -73% �

CRH 1095 1456 782 33% � -46% �

UCN 1331 1041 486 -22% � -53% �

IL-1ß 1877 1622 1053 -14% � -35% �

3.1.2 PGE2

Zur Beurteilung der PGE2-Sekretion im Myometrium wurde ihr zeitlicher Verlauf im

Rahmen der Gewebekultur beobachtet (n=4). Dabei wurde die Sekretion nach Zugabe

potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β) mit der basalen Sekretion verglichen.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Vor 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h 22h

Inkubationszeit

Ko

nz./

FG

(p

g/m

g)

basal

CRH

UCN

IL-1ß

Abb. 11: Zeitlicher Verlauf der basalen PGE2-Sekretion im Myometrium (M107). „Konz./FG“ beschreibt die PGE2-Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht der Gewebeproben (in pg/mg). „Vor“ steht für die Vorinkubationsphase in der Kurzzeit-Gewebekultur, die der Hauptinkubation vorgeschaltet war. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Triplikatmessungen.

Für letztere ergab sich eine weitgehend analoge Zeitkinetik zu den Beobachtungen

der basalen 6-keto-PGF1α-Sekretion: Zwischen der Entnahme während der Vorinku-

bation und der Entnahme bei 0 Stunden blieben die Messwerte auf dem gleichen

Ergebnisse 68

Niveau oder stiegen leicht an, fielen bis zu 1 Stunde stark ab und stiegen dann wieder

deutlich an, um zwischen 4 und 6 Stunden ein Maximum zu erreichen. Einzig der 22-

Stunden-Messwert bei Beendigung der Kultur wich deutlich vom Verlaufsmuster bei

der 6-keto-PGF1α-Sekretion ab, indem ein starker Abfall zu beobachten war. Eine

Stimulation durch die zugegebenen Substanzen war nicht zu erkennen; die Messwerte

lagen sogar meistens noch unter den unstimulierten. In Abb. 11 ist der zeitliche Verlauf

der PGE2-Sekretion am Beispiel der Myometriumbiopsie M107 dargestellt.

3.2 IHC und ICC

3.2.1 Histologische Charakterisierung von Myometriumbiopsien

Zum besseren Verständnis der z.T. uneinheitlichen und schwer reproduzierbaren

Ergebnisse der Untersuchungen zur Prostaglandin-Sekretion (s. 3.1) wurden die

Myometriumbiopsien histologisch charakterisiert. Dafür wurden zum einen verschie-

dene im Myometrium vorkommende Zelltypen nachgewiesen und ihr ungefährer

mengenmäßiger Anteil abgeschätzt, zum anderen die Verteilung der CRH-Rezeptoren

innerhalb der Gewebeproben beurteilt. Als Negativkontrollen wurden bei den

Färbungen jeweils Proben mitgeführt, die ohne den Primärantikörper inkubiert wurden;

bei keiner dieser Kontrollen zeigte sich eine Braunfärbung (nicht gezeigt).

Aufgrund der geringeren Toxizität wurde in der überwiegenden Anzahl der

Färbungen Romulin AEC als Peroxidase-Substrat verwendet, obwohl sich heraus-

stellte, dass sich hierbei das spezifische Färbungen kennzeichnende Orange-Rot z.T.

deutlich schlechter von dem durch Hämalaun blau-violett gefärbten Hintergrund abhob

als das durch DAB hervorgerufene intensive Braun. Außerdem kam es bei der

Verwendung von Romulin AEC häufiger vor, dass abgesehen von der spezifischen

Rotfärbung ein unspezifischer rosaroter Schleier über einem Großteil des Gewebe-

schnittes zu beobachten war.

Ergebnisse 69

Abb. 12: Qualitätsvergleich der Chromogene Romulin (A, C) und DAB (B, D) in immunhisto-chemischen Färbungen. Dargestellt sind repräsentative Myometriumschnitte (M57, M59), in denen CRH-R1 (A, B) und vWF (C, D) lokalisiert wurden. Durch Romulin (A, C) werden die spezifischen Zielstrukturen rot, durch DAB (B, D) braun gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Auffällig ist, dass sich die mit DAB angefärbten Strukturen kontrastreicher von den Zellstrukturen im Hintergrund hervorheben. Bei der Verwendung von Romulin war ein Rosaschleier zu beobachten, der sich über den ganzen Gewebeschnitt zog (C). Fotografiert wurde bei 400- (A, B) bzw. 100facher (C, D) Vergrößerung.

3.2.1.1 Endothel

Zum Nachweis von Gefäßendothel wurde ein Antikörper gegen vWF verwendet,

der von den Endothelzellen als Trägerprotein des Hämostasefaktors VIII gebildet wird.

Bei einer sehr guten bis hervorragenden Färbeintensität konnten die Blutgefäße

eindeutig identifiziert werden. Sie zogen sich in allen Größenordnungen durch die

gesamte untersuchte Gewebeprobe. Dabei gab es bei der repräsentativ dargestellten

Probe (M59) geringe Unterschiede im subjektiv geschätzten Anteil, den die Gefäße

jeweils bezogen auf den ganzen Gewebeschnitt ausmachten: Die meisten Gefäße (ca.

10%) fanden sich am Anfang, die wenigsten (ca. 5%) am Ende der Probe, wobei diese

Einteilung willkürlich beim Schneidevorgang der Paraffinblöcke erfolgt war und in

keinem Zusammenhang mit tatsächlichen anatomischen Gegebenheiten stand.

Interessant war ferner, anhand der Färbung festzustellen, dass nicht jeder Spalt im

Gewebe, der der Form nach für ein Gefäß hätte gehalten werden können, sich auch

tatsächlich als ein solches erwies.

Ergebnisse 70

Abb. 13: Immunhistochemischer Nachweis von Gefäßendothel in Myometrium mittels eines Antikörpers gegen vWF. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A), von der Mitte (B) und vom Ende (C) einer Myometriumprobe (M59). VWF-positive Zellen sind braun gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Die Pfeile weisen auf Gewebeauflockerungen und Spalten (Sp) hin, die der Form nach mit Blutgefäßen zu verwechseln wären. Fotografiert wurde bei 400facher Vergrößerung.

3.2.1.2 Makrophagen

Makrophagen wurden identifiziert durch einen Antikörper gegen CD68, ein Glyko-

protein, das zellspezifisch nur von Makrophagen als Oberflächenantigen exprimiert

wird.

Bei einer guten Färbeintensität konnten Makrophagen in der gesamten repräsenta-

tiven Gewebeprobe (M59) sowohl gewebeständig als auch gefäßnah nachgewiesen

werden. Ihr Anteil bezogen auf den ganzen Schnitt betrug maximal ca. 5%, wobei er in

dem als „Ende“ bezeichneten Teil der Biopsie kleiner ausfiel als am Anfang und in der

Mitte. In allen drei repräsentativen Schnitten fanden sich klar abgrenzbare

Einzelzellen, aber auch zu Reihen oder kleinen Nestern gruppierte Makrophagen.

Als Positivkontrolle für den verwendeten Antikörper wurde parallel eine Decidua-

Probe mit angefärbt. Dieses Gewebe hatte sich in der Vergangenheit durch einen

vergleichsweise hohen Makrophagen-Anteil ausgezeichnet, was hier bestätigt werden

konnte; er lag bei ca. 10%. Bei einer hervorragenden Färbeintensität waren die Zellen

sehr deutlich erkennbar. Wie im Myometrium waren sie sowohl einzeln als auch zu

Nestern angeordnet zu finden (s. Abb. 22).

Ergebnisse 71

Abb. 14: Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen CD68. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A), von der Mitte (B) und vom Ende (C) einer Myometriumprobe (M59). CD68-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Die Pfeile markieren gewebsständige (gs) oder gefäß-nahe (gn) Makrophagen, die als Einzelzellen oder gruppiert in Reihen oder kleinen Nestern vorkamen. Fotografiert wurde bei 400facher Vergrößerung.

3.2.1.3 Myocyten

Leiomyocyten wurden durch einen Antikörper gegen α-Aktin kenntlich gemacht,

ein Strukturprotein des Cytoskeletts, das einen zentralen Bestandteil des Kontraktions-

apparats von Muskelzellen bildet.

Beide verwendeten Chromogene führten zu einer hervorragenden Färbeintensität,

wobei DAB eine relativ homogene Verteilung der Braunfärbung innerhalb der

einzelnen Zellen bewirkte, während es bei Romulin AEC zu einer intensiveren

Rotfärbung in den Randbereichen der Zellen mit zentralen Aufhellungen kam. Dadurch

ließen sich die einzelnen Myocyten besser voneinander abgrenzen, so dass sich ein

insgesamt klareres Bild von der Gewebestruktur ergab. Trotz des besseren

Farbkontrastes bei der Verwendung von DAB lieferte Romulin AEC hier also das

bessere Gesamtergebnis. Die Myocyten waren in der gesamten Gewebeprobe gegen-

über anderen Zellarten mit einem Anteil von ca. 55-65% am häufigsten vertreten. Der

Bindegewebsanteil lag jedoch z.T. nur knapp unter dem der Myocyten; bei einer

repräsentativen Probe schwankte er zwischen 30% (Anfang) und 40% (Ende).

Als zusätzliche Negativkontrolle für den eingesetzten Antikörper wurde eine

Placenta-Probe mit angefärbt, da in diesem Gewebe keine Leiomyocyten zu erwarten

sind. Bei keinem der drei Schnitte fand sich eine Braunfärbung.

Ergebnisse 72

Abb. 15: Immunhistochemischer Nachweis von Leiomyocyten im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen α-Aktin. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (D), von der Mitte (A, B, E) und vom Ende (F) einer Myometriumprobe (M59). α-Aktin-positive Zellen sind rot (A, D, E, F) bzw. braun (B) gefärbt. Bei A und B wurde die Chromogene Romulin (A) und DAB (B) verglichen: Während DAB eine homogene Braunfärbung der Myocyten bewirkt hat, finden sich bei Romulin zentrale Aufhellungen (Pfeile, zA) in den Zellen. Die Beschriftung „BG“ an den Markierungspfeilen weist auf bindegewebige Strukturen hin. Bei C ist ein Placentaschnitt gezeigt, der als Negativkontrolle für die α-Aktin-Färbung diente. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Fotografiert wurde in 100- (A-C) bzw. 400facher Vergrößerung (D-F).

3.2.1.4 Fibroblasten

Der Nachweis von Fibroblasten als repräsentative Bindegewebszellen gestaltete

sich als äußerst diffizil. Laborintern etabliert war ursprünglich der Antikörper-Klon 5B5

gegen Prolyl-4-Hydroxylase, das Schrittmacher-Enzym der Kollagensynthese.

Dieser Antikörper hatte gute, reproduzierbare Ergebnisse geliefert, die jedoch zu

einem späteren Zeitpunkt nicht mehr bestätigt werden konnten: Bei einer guten

Färbeintensität wurden in der untersuchten paraffinfixierten Myometriumprobe nur

randständige Fibroblasten angefärbt; der Antikörper konnte nicht in den Gewebeschnitt

eindringen (s. Abb. 16).

Zur Überprüfung, ob dies in der Fixierungsmethode begründet war, wurde eine

Myometriumbiopsie als Gefrierschnitt aufbereitet und dann mit dem Klon 5B5

behandelt. Das Ergebnis war ein hoher Anteil (ca. 40%) intensiv braun gefärbter

Zellen, die sich durch die gesamte Probe zogen. Anteil und Verteilung ließen darauf

schließen, dass es sich tatsächlich um Fibroblasten handelte. Allerdings hatte das

Ergebnisse 73

Gewebe unter der Kryofixation deutlich mehr gelitten als vergleichbare paraffinfixierte

Proben; die Gewebestrukturen erschienen verwaschen und waren weniger deutlich

identifizierbar.

Abb. 16: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten im Myometrium mittels Antikörper-Klon 5B5. Dargestellt sind repräsentative Myometriumschnitte (M56-57), die paraffin- (A) oder kryofixiert (B-C) worden waren. 5B5-positive Zellen sind rot (A) bzw. braun (B-C) gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Auffällig ist, dass in A nur Fibroblasten am Rande des Gewebeschnitts angefärbt wurden. Bei den Gefrierschnitten B-C wirken die Gewebestrukturen verwaschen und sind nicht eindeutig erkennbar. Fotografiert wurde in 100- (B) bzw. 400facher (A, C) Vergrößerung.

Um auch bei paraffinfixierten Gewebeproben einen zuverlässigen Fibroblasten-

nachweis zu erreichen, wurde daher im Folgenden der Klon 3-2B12 eingesetzt, der

ebenfalls gegen die Prolyl-4-Hydroxylase gerichtet ist.

In mehreren Versuchen unter Verwendung unterschiedlicher Verdünnungen wurde

deutlich, dass dieser Klon insofern nicht erwartungsgemäß funktioniert hatte, als dass

er statt Fibroblasten Leiomyocyten angefärbt hatte. Zu diesen hatte er eine sehr hohe

Affinität, wie an der hohen Färbeintensität noch bei einer Verdünnung von 1:200

anstelle der vom Hersteller empfohlenen 1:50 abzulesen war. Dass es sich um

Myocyten handelte, war an ihrer Form und Verteilung in der Gewebeprobe erkennbar

(s. 3.2.1.3). Die Strukturen, die ihrer Form nach dem Bindegewebe zugeordnet werden

mussten, wiesen keinerlei spezifische Rotfärbung, sondern nur die blau-violette

Hintergrundfärbung durch Hämalaun auf.

Ergebnisse 74

Abb. 17: Misslungener Versuch eines immunhistochemischen Nachweises von Fibroblasten im Myometrium mittels eines Antikörper-Klon 3-2/B12. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Dargestellt ist ein repräsentativer Myometriumschnitt (M6) in 100facher (A) und 400facher (B) Vergrößerung. Das Farbschema ist irreführend: Während die Myocyten (My), die eigentlich durch die Hintergrundfärbung mit Hämalaun blau sein müssten, intensiv rot gefärbt sind, weisen die Strukturen, die der Form nach dem Bindegewebe (BG) zugeordnet werden müssen, eine Blaufärbung auf.

Zur Kontrolle, ob der Klon 3-2B12 grundsätzlich funktionierte, wurde er im Rahmen

einer Versuchsreihe mit verschiedenen Verdünnungen bei einer Hautprobe eingesetzt.

Es fanden sich zahlreiche intensiv rot gefärbte Zellen im Corium, aber auch in der

Epidermis, wobei die beste Färbeintensität bei einer Verdünnung von 1:100 erzielt

wurde. Die Negativkontrolle wies keine Rotfärbung auf. Allerdings ließ die Tatsache,

dass so viele Zellen in der Epidermis angefärbt wurden, Zweifel aufkommen, ob es

sich dabei tatsächlich um Fibroblasten handelte.

Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten in der Haut mittels Klon 3-2/B12. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:100 verwendet. Dargestellt ist ein repräsentativer Hautschnitt in 400facher Vergrößerung (A) und als Negativkontrolle ein Schnitt, der ohne Primär-antikörper inkubiert wurde (B). 3-2/B12-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun.

3.2.1.5 Nachweis von CRH-R1

Die gesamte repräsentativ dargestellte Myometriumprobe zeigte eine sehr starke

Expression von CRH-R1. Die Rotfärbung, die diesen Rezeptor kenntlich machte, war

bei einer mittelgradigen Färbeintensität so ausgeprägt, dass die Schnitte bei einer

kleinen mikroskopischen Vergrößerung den Haupteindruck „rot“ vermittelten. Dabei

Ergebnisse 75

war weder die Anfärbung der einzelnen Zellen noch ihre Verteilung im Gewebeschnitt

homogen. Mit Ausnahme des Gefäßendothels, in dem der CRH-R1 gelegentlich

deutlich exprimiert wurde, war eine sichere Zuordnung zu den einzelnen im

myometrialen Gewebeverband vorhandenen Zellen nur teilweise möglich, da sich die

Zellgrenzen verschwommen bis gar nicht darstellten. Dennoch war es aufgrund des

mengenmäßigen Anteils der Leiomyocyten nahe liegend, dass CRH-R1 vornehmlich

diesem Zelltyp zugeordnet werden konnte, wobei auch eine Assoziation mit

Makrophagen nicht auszuschließen war. Beim Vergleich der Gewebeschnitte vom

Anfang, von der Mitte und vom Ende der beispielhalften Probe (M59) fielen zunächst

hinsichtlich der Anteile der unterschiedlichen Zellarten zueinander keine größeren

Unterschiede auf. Die Betrachtung in der Übersichtsvergrößerung verdeutlichte

jedoch, dass der Schnitt vom Ende der Biopsie in dem insgesamt recht kompakten

Muskelgewebe wesentlich mehr große Gefäße aufwies. Diese Beobachtung konnte

bei anderen Myometriumproben bestätigt werden.

Als Positivkontrolle für den Antikörper gegen CRH-R1 wurde eine Deciduaprobe

mit angefärbt. Bei einer mittelgradigen Färbeintensität fand sich der Rezeptor auch in

diesem Gewebe sehr ausgeprägt in decidualen Stromazellen, verteilt über die

gesamte Probe, sowie in Gefäßendothelzellen.

Ergebnisse 76

Abb. 19: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R1 in Myometrium und Decidua. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A-B) und vom Ende (C-D) einer Myometrium- (M59) und einer Deciduaprobe (Dc57, E). CRH-R1-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. In der Übersichtsvergrößerung (100fach) entsteht aufgrund der hohen Rezeptordichte für die Gewebeschnitte A und C der Gesamteindruck „rot“. In der 400fachen (B, D-E) Vergrößerung zeigen sich CRH-R1-positive Gefäßendothelzellen (Pfeile, GF).

Dass immunhistochemische Färbungen mit kritischem Blick beurteilt werden

sollten und nicht jede intensive Rotfärbung zwangsläufig für Spezifität spricht, ergab

sich aus einigen beispielhaften Färbungen, in denen Artefakte das Bild verfälschten:

Immer wieder waren Effekte zu beobachten, bei denen die Probenränder besonders

intensiv rot gefärbt waren. Ferner kam es vor, dass die Rotfärbung körnig wirkte und

sich z.T. an den Zellgrenzen abgelagert hatte.

Ergebnisse 77

Abb. 20: Artefakte bei immunhistochemischen Färbungen. Dargestellt sind exemplarische Myometriumschnitte (M19, M57), bei denen während des Färbevorgangs Artefakte entstanden. Neben der spezifischen Rotfärbung von CRH-R1 sind in A starke Randeffekte (RE) zu erkennen. In B zeigen sich körnige Ablagerungen (kA) des roten Farbstoffs an den Zellrändern. Fotografiert wurde in 100- (A) bzw. 400facher (B) Vergrößerung.

3.2.1.6 Nachweis von CRH-R2

Auch CRH-R2 war in der gesamten als repräsentativ ausgewählten Gewebeprobe

stark exprimiert, wenn auch nach subjektiver Einschätzung etwas weniger als CRH-

R1. Bei einer guten Färbeintensität war die spezifische Rotfärbung besser abgrenzbar

vom Hintergrund, was bei einer geringen mikroskopischen Vergrößerung zu einem

eher fleckig-roten Gesamteindruck führte. Eine definitive Zuordnung zu bestimmten

Zelltypen blieb schwierig, doch lag auch hier die Vermutung nahe, dass CRH-R2 v.a.

in Leiomyocyten zu finden war, wobei Makrophagen ebenfalls in Frage kamen. Im

Gegensatz zu CRH-R1 war keine Affinität zu Gefäßendothelzellen festzustellen. Im

Schnitt des willkürlich bestimmten Endes der repräsentativen Gewebeprobe (M19) war

der Bindegewebsanteil in dem insgesamt kompakten, aber von vielen kleinen Gefäßen

durchsetzten Muskelgewebe etwas höher als am Anfang und in der Mitte (nicht

gezeigt).

Ergebnisse 78

Abb. 21: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 im Myometrium. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte von der Mitte einer Myometriumprobe (M19). CRH-R2-positive Zellen sind rot gefärbt. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Fotografiert wurde in 100- (A) bzw. 400facher (B) Vergrößerung.

Eine mit dem Antikörper gegen CRH-R2 parallel angefärbte Decidua-Probe zeigte

bei mittelgradiger bis guter Färbeintensität eine starke Expression des Rezeptors in

decidualen Stromazellen, jedoch nicht in den Gefäßwänden. Ferner legte der

Vergleich eines Schnittes mit der o.g. CD68-Färbung die Vermutung nahe, dass CRH-

R2 makrophagenassoziiert vorkommt.

Abb. 22: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 und Makrophagen in Decidua. Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte vom Anfang (A, C) und von der Mitte (B) einer Deciduaprobe (Dc57). CRH-R2-positive Zellen sind rot gefärbt (A-B). Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Ein Vergleich mit den in C dargestellten, braun gefärbten CD68-positiven Zellen, die einzeln (EZ) oder in gruppiert in Nestern (N) vorliegen, deutet auf eine CRH-R2-Expression nicht nur in decidualen Stromazellen, sondern auch in Makrophagen hin. Fotografiert wurde in 400facher Vergrößerung.

3.2.2 Immuncytochemische Untersuchung von RC-4B/C1-Zellen

Im Rahmen der Suche nach einer für einen validen CRH-Bioassay tauglichen

Zelllinie wurden die Rattenhypophysen-Zellen RC-4B/C1 auf ihre Expression von

CRH-Rezeptoren und ACTH immuncytochemisch untersucht. Als Negativkontrollen

wurden Proben verwendet, die ohne Primärantikörper inkubiert wurden.

Sowohl ein unspezifischer Antikörper, der nicht zwischen den Rezeptortypen

differenzierte, als auch die Antikörper gegen CRH-R1 und CRH-R2 detektierten CRH-

Ergebnisse 79

Rezeptoren bei einer guten Färbeintensität nur auf wenigen Zellen. Bei der

Auswertung der CRH-R1- und CRH-R2-Färbungen zeigten sich auf dem Objektträger

gelblich-braune, die Zellen umgebende Ränder, die am ehesten auf Lagerungseffekte

zurückzuführen sind. Die als Positivkontrolle durchgeführte ACTH-Färbung ergab bei

einer sehr guten Färbeintensität einen deutlichen Nachweis von ACTH. Alle Negativ-

kontrollen wiesen keinerlei Braunfärbung auf.

Abb. 23: Immuncytochemische Lokalisation von CRH- und ACTH-Rezeptoren auf RC-4B/C1-Zellen. Rezeptor-positive Zellen sind braun gefärbt: CRHunspezifisch (A), CRH-R1 (B), CRH-R2 (D), ACTH, (E). Zusätzlich traten gelblich-braune Artefakte (Pfeile, LE) am Rande der Zellen auf. Die Negativkontrollen (C, F) wurden ohne Primärantikörper inkubiert. Die blaue Färbung beruht auf einer Anfärbung der Zellstrukturen durch Hämalaun. Fotografiert wurde in 400facher Vergrößerung.

3.3 ACTH-EIA als CRH-Bioassay

Mit dem Ziel, einen validen Bioassay zu entwickeln, um die Aktivität des in

Gewebe- und Zellkultur eingesetzten synthetischen CRH zu überprüfen, wurden zwei

ACTH-sezernierende Hypophysen-Zelllinien kultiviert und ihre ACTH-Sekretion mittels

EIA quantifiziert. In Vorversuchen wurde die Ratten-Zelllinie RC-4B/C1 eingesetzt. Da

die Messwerte für ACTH bei Zugabe von CRH in verschiedenen Konzentrationen

(maximal 2,1 nM) unterhalb der Nachweisgrenze blieben (nicht gezeigt), wurden die

Hauptversuche mit schwimmenden, nicht-adhärenten AtT20-Mauszellen durchgeführt

(n=7).

Ergebnisse 80

Zur Kontrolle der Funktionsfähigkeit des EIAs diente die Messung des ACTH-

Gehaltes eines Placenta-Extraktes. Hier war die Konzentration so hoch, dass

sämtliche Werte oberhalb des Messbereichs lagen. Damit war erwiesen, dass der Test

grundsätzlich funktionierte.

3.3.1 Basale Zeitkinetik

Die Zeitkinetik der basalen ACTH-Sekretion in AtT20-Zellen wurde beobachtet

(n=7), um Basisdaten für einen Vergleich mit der Sekretion nach Zugabe von CRH zu

erhalten.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0h 2h 3h 4h 5h 6h 18h 24h 27h

Inkubationsdauer

Ko

nz.

(ng

/ml)

basal

Abb. 24: Zeitkinetik der basalen ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Konzentration (in ng/ml) aus Triplikatmessungen.

Obwohl es in den ersten Stunden nach der 6-stündigen Vorinkubationsphase noch

zu Schwankungen der Messwerte kam, war dennoch eine relativ stabile Zunahme der

ACTH-Konzentration, mit einem leichten Plateau zwischen 4-6 Stunden und 18-24

Stunden zu beobachten. Ab 27 Stunden wichen die Werte dann so sehr voneinander

ab, dass keine allgemeingültige Aussage zum Sekretionsverhalten mehr getroffen

werden konnte. In Abb. 24 ist daher ein typischer Kurvenverlauf bis zum Zeitpunkt von

27 Stunden beispielhaft dargestellt.

Ergebnisse 81

3.3.2 Vergleich verschiedener Kulturmedien

Um die Kulturbedingungen möglichst optimal zu gestalten, wurden die AtT20-

Zellen in zwei verschiedenen Nährmedien kultiviert und anschließend ihre ACTH-

Sekretion vergleichend gemessen (n=3).

Es stellte sich heraus, dass nach den ersten vier Stunden sämtliche ACTH-

Konzentrationswerte der in Ham’s F12 gewachsenen Zellen auf einem deutlich

niedrigeren Niveau lagen als die Werte der in DMEM kultivierten Zellen. Während

erstere sich v.a. im zweistelligen ng/ml-Bereich bewegten, waren die DMEM-Werte

eher im dreistelligen Bereich angesiedelt. Außerdem verlief die ACTH-Sekretion bei

den Zellen aus Ham’s F12 insgesamt langsamer, d.h. mit einer geringeren

Steigerungsrate. In Abb. 25 ist ein repräsentatives Beispiel graphisch dargestellt.

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2 4 6 8 10 12

Inkubationsdauer (h)

Ko

nz.

(ng

/ml)

DMEM

Ham's F12

Abb. 25: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen im zeitlichen Verlauf nach Kultivierung in verschiedenen Nährmedien (DMEM und Ham’s F12). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Konzentration (in ng/ml) aus Triplikatmessungen.

3.3.3 CRH als Stimulationsfaktor

Nachdem CRH als Stimulationsfaktor für die ACTH-Synthese bei allen Versuchen

mit den AtT20-Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen (0,1-10 nM) hinzugefügt

worden war, wurde der zeitliche Verlauf der ACTH-Konzentration dokumentiert.

Ergebnisse 82

Die beste Stimulation zeigte sich regelmäßig bei einer CRH-Konzentration von 10

nM, so dass diese Konzentration schließlich beibehalten wurde. Das Stimulations-

verhalten des niedriger konzentrierten CRH war insofern nicht eindeutig, als dass zwar

mit Ausnahme der ersten 3-4 Stunden immer eine deutliche Stimulation gegenüber

den Basalwerten, jedoch keine gleichbleibende Konzentrationsabhängigkeit erkennbar

war. Dies ist in Abb. 26 ersichtlich. Aus der Zeitkinetik der ACTH-Sekretion ließen sich

optimale Zeitpunkte bei 6 oder 18 Stunden zum Vergleich verschiedener Stimulations-

versuche feststellen. Zu diesen Zeitpunkten fand sich im Kurvenverlauf eine relativ

stabile Steigung der Konzentrationswerte. Allerdings fiel auch hier, wie bei den

Versuchen zur 6-keto-PGF1α-Sekretion, eine sehr große Streuung der Einzelwerte

innerhalb der gemessenen Triplikate auf.

0

10

20

30

40

50

60

70

0h 2h 3h 4h 5h 6h 18h 24h 27h

Inkubationsdauer

Ko

nz.

[ng

/ml]

basal

0,1 nM

1 nM

10 nM

Abb. 26: Stimulation der ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen durch Zugabe von CRH in verschiedenen Konzentrationen (0,1 nM, 1 nM, 10 nM). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Konzentration (in ng/ml) aus Triplikatmessungen.

Sogar noch größer waren die Unterschiede der Messwerte, wenn man mehrere

Stimulationsversuche, die unter identischen Bedingungen durchgeführt worden waren,

miteinander verglich. Die Werte lagen hier auf ganz unterschiedlichem Niveau, wobei

sowohl die basalen als auch die stimulierten Werte von diesen Schwankungen bis zu

Faktor 10 betroffen waren. Abb. 27 verdeutlicht dieses Phänomen.

Ergebnisse 83

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

V1 V2 V3 V4 V5

Versuch

Ko

nz.

[ng

/ml]

Basal

CRH-10 nM

Abb. 27: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen bei verschiedenen CRH-Stimulationsversuchen. Verglichen wurden jeweils die Konzentrationswerte (in ng/ml) der mit 10 nM CRH stimulierten Versuchs-ansätze mit denen der unstimulierten Ansätze. Die Versuche sind mit V1-5 durchnummeriert. Dargestellt sind die Mittelwerte + SD aus Triplikatmessungen.

Zur Kontrolle, ob das „alte“ CRH, das im Labor ca. 2 Jahre in lyophilisierter Form

bei -80°C aufbewahrt worden war, seine volle Bioaktivität behalten hatte, wurde im

Zuge dieser Versuchsreihe neues, gelöstes CRH bestellt und wurden vergleichende

Untersuchungen durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass das „alte“ CRH die ACTH-

Sekretion keineswegs schlechter und sogar gleichmäßiger stimulierte als das „neue“.

Letzteres führte immer wieder zu „Ausreißern“, bei denen ein Einzelwert aus einer

Duplikatmessung bis zu dreimal höher lag als der andere. Zur Veranschaulichung sind

in Abb. 28 zwei Stimulationsversuche exemplarisch dargestellt.

Ergebnisse 84

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

V1 V2Versuch

Ko

nz.

(ng

/ml)

Basal

Basal

CRH-alt

CRH-alt

CRH-neu

CRH-neu

Abb. 28: Vergleich des Stimulationseffektes durch „altes“ versus „neues“, gelöstes CRH auf die ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. Das CRH wurde jeweils in einer Konzentration von 10 nM verwendet. Dargestellt sind die Konzentrations-Einzelwerte (in ng/ml) aus Duplikatmessungen. Die Versuche sind mit V1-2 durchnummeriert.

3.4 Laborinterne Qualitätssicherung

3.4.1 Vitalität der Myometriumbiopsien

Zur qualitativen Überprüfung der Gewebekultur und der verschiedenen Versuchs-

bedingungen, die im Rahmen der Kultur zur Anwendung kamen, wurde die Vitalität der

Myometriumbiopsien mithilfe des LDH-Tests kontrolliert.

Aus der Beobachtung zum zeitlichen Verlauf (n=2) ergab sich, dass die Vitalität

des Gewebes nach der Vorinkubationsphase am höchsten war, nach 6 Stunden

bereits nachgelassen hatte, bis sie nach Beendigung der 22-stündigen Kultur noch bei

56-71,3% lag.

Ergebnisse 85

0

20

40

60

80

100

120

0h 6h 22h

Inkubationszeit

Vit

ali

tät

(%)

M98

M104

Abb. 29: Vitalität der Myometriumproben im zeitlichen Verlauf der Kurzzeit-Gewebekultur.

Des Weiteren wurde untersucht, inwieweit sich das Umsetzen der Gewebeproben

in neues Kulturmedium nach den ersten 6-7 Stunden der Hauptinkubationsphase

hinsichtlich der Gewebevitalität nach Beendigung der Kultur bemerkbar machte. Es

stellte sich heraus, dass der Mediumwechsel in 3 von 4 Fällen für das Gewebe nicht

förderlich gewesen war, sondern ihm eher geschadet hatte: Während die Vitalität nach

nur einer Hauptinkubationsphase (C) noch mindestens bei 50,3% lag, sank sie bei der

unterteilten Inkubation (AB) bis auf 37,9% ab. Es wurde daher in Folgeversuchen auf

das Umsetzen der Biopsien verzichtet.

Ergebnisse 86

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

M99 M100 M102 M104Gewebe-Nr.

Vit

ali

tät

(%)

AB

C

Abb. 30: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die Vitalität der Myometriumproben. Überprüft wurde die Gewebevitalität (in %) nach Beendigung der Kultur. “AB“ bezeichnet eine zweigeteilte Inkubationsphase von 6-7h (A), nach denen die Gewebeproben in frisches Kulturmedium umgesetzt und für weitere 16-17h (B) inkubiert wurden. „C“ beschreibt eine einteilige Inkubationsphase von 22-24h.

3.4.2 Parallelmessungen beim 6-keto-PGF1α-EIA

Während die biologischen Proben bei den EIAs üblicherweise als Triplikate,

manchmal auch als Duplikate oder Hexaplikate eingesetzt wurden, erfolgte im

Rahmen der Untersuchungen zur 6-keto-PGF1α-Sekretion einmalig eine Messung von

18 parallelen Vorinkubationsansätzen. Dies sollte die Frage klären, ob eine größere

Anzahl gemessener Parallelansätze den Schwankungsfaktor zwischen den einzelnen

Messwerten verkleinere.

Das Ergebnis war negativ; die Einzelwerte bewegten sich zwischen 294 und 1770

pg/mg, was gleichbedeutend mit einem Schwankungsfaktor von 6 war. Zur Demon-

stration ist diese Untersuchung in Abb. 31 graphisch dargestellt.

Ergebnisse 87

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 MW

Ansatz-Nr.

Ko

nz./

FG

[p

g/m

g]

Abb. 31: Basale 6-keto-PGF1α-Konzentration im Mediumüberstand von Parallelansätzen in der Kurzzeit-Myometriumkultur. Dargestellt ist die Konzentration bezogen auf das Feuchtgewicht (in pg/mg) von 18 parallelen Ansätzen während der Vorinkubationsphase und ihr arithmetischer Mittelwert (MW).

3.4.3 Intra- und Interassayvariabilität der EIAs

Zur Qualitätssicherung der Prostaglandin-EIAs wurden in jedem Assay immer an

der gleichen Stelle der Mikrotiterplatte 6-8 Präzisions-Kontrollproben (KP) mitgeführt,

aus denen der Variationskoeffizient (Vk) der Intraassay-Variabilität berechnet wurde.

Zwei dieser Kontrollproben dienten außerdem der Berechnung des Vk der Interassay-

Variabilität. Die Ergebnisse dieser Berechnungen sind in Tab. 10 dargestellt.

Versuchsweise wurde überprüft, inwiefern sich die Werte für die Intraassay-Variabilität

verändern, wenn in die Berechnungen statt aller Kontrollproben nur die ersten vier

einfließen. In

Tab. 11 sind die erste und die zweite Berechnung gegenübergestellt. Bei ca. der

Hälfte der ausgewerteten EIAs führte letztere zu einer besseren Intraassay-Variabilität.

Zur Kontrolle des ACTH-Assays wurde ein kommerzielles Kontrollserum benutzt.

Ergebnisse 88

Tab. 10: Intra- und Interassay-Variabilität der EIAs. Vk (in%) steht für die Variationskoeffizienten, die aus dem Mittelwert und der Standardabweichung der Einzelwerte berechnet wurden.

EIA Anzahl der Versuche Intraassay-Vk Interassay-Vk

6-keto-PGF1α 13 13-34% 25%

PGE2 4 9-66% 36%

ACTH 7 6-9% 18%

Tab. 11: Berechnung der Intraassayvariabilität der 6-keto-PGF1α-EIAs mit allen versus den jeweils ersten vier Kontrollproben. Grün unterlegt sind die Werte, die sich in der zweiten Berechnung verbessert hatten. Vk (in%) steht für die Variationskoeffizienten, die aus dem Mittelwert und der Standardabweichung der Einzelwerte berechnet wurden.

1. Berechnung 2. Berechnung

Intraassay-Vk berechnet mit allen Kontrollproben

Intraassay-Vk berechnet mit den ersten 4 Kontrollproben

14,1% 15,8%

13,0% 9,3%

20,4% 9,8%

18,0% 23,1%

34,4% 34,9%

28,4% 31,7%

30,4% 21,0%

18,1% 22,9%

13,5% 15,5%

16,4% 14,4%

18,2% 15,3%

28,4% 10,8%

16,2% 15,2%

3.4.4 Pipettenvergleich und Kontrolle des EIA-Readers

Zur Klärung, ob die starken Ergebnisschwankungen in den Prostaglandin-EIAs auf

Pipettierungenauigkeiten zurückzuführen waren, wurden sowohl die im Labor verwen-

deten Pipetten als auch die Pipettierleistung verschiedener Benutzer miteinander

verglichen, indem vorgegebene Volumina einer Neutralrotlösung auf eine Mikrotiter-

platte pipettiert wurden und anschließend die Aktivitäten im EIA-Reader gemessen

wurden.

Ergebnisse 89

Die Vks der Einzelpipetten lagen zwischen 1,2% (1000µl-Pipette) und 16,1% (10µl-

Pipette). Mit der für die EIAs hauptsächlich eingesetzten 200µl-Pipette wurde ein sehr

guter Vk von 1,6% erreicht. Die Multipette lag mit einer Vk von 4,0% im mittleren

Bereich. Beim Vergleich der Pipettierleistungen von Doktorandin und Doktorvater

erzielte die Doktorandin, die auch sämtliche EIAs pipettiert hatte, den besseren Vk

(7,0% versus 9,6%).

Tab. 12: Kontrolle der im Labor verwendeten Pipetten und Vergleich der Pipettierleistung verschiedener Benutzer. Für die erste Messung wurden vorgegebene Volumina mit den verschiedenen Einzelpipetten und der Multipette pipettiert, für die zweite Messung verwendeten A. Hampel und W. Schäfer nacheinander dieselbe Einzelpipette, um ein vorgegebenes Volumen zu pipettieren. Dargestellt sind die Aktivitäten in dpm. Aus den Einzelwerten wurden die Mittelwerte (MW), Standardabweichungen (SD) und Vks (in %) berechnet.

Pipette 10-100µl 50-200µl 100-1000µl 2-20µl 0,5-10µl Multi (50µl) 10-100µl 10-100µl

Volumen 50µl 150µl 500µl 10µl 5µl 50µl 50µl 50µl

Untersucher A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel A. Hampel W. Schäfer

1 8967 26745 88707 1695 1134 9243 5896 5974

2 9668 27177 90125 1893 1000 9131 6467 5439

3 6519 28086 90102 1743 998 8938 6788 6014

4 9158 27008 87407 1788 983 8879 6702 5238

5 8871 26968 87758 1669 1207 8932 6927 7170

6 9024 26923 87280 1933 1047 9342 6230 6755

7 8980 26919 89793 1796 1051 8895 5712 7244

8 9023 27239 89430 1879 928 8913 6851 7208

9 9320 26581 88901 1684 1081 8900 7469 7210

10 9073 26919 89063 1877 976 8819 6978 6418

11 9009 27277 88908 1879 1213 9068 7209 6427

12 9131 26126 86618 1865 1083 7717 7198 6756

13 9524 26406 87805 1785 1227 9114 7012 5737

14 8855 26659 87741 1945 826 8988 7087 6659

15 9054 26234 87958 1831 1092 8856 7031 7018

16 9235 26695 86824 1779 993 9328 7325 7070

17 9578 26686 89586 1801 989 9081 7202 6822

18 9340 26763 88508 1910 846 8568 7030 6942

MW 9018 26856 88473 1820 1037 8928 6840 6561

SD 667 441 1099 85 114 357 480 633

VK% 7,4 1,6 1,2 4,7 10,9 4,0 7,0 9,6

1. Messung 2. Messung

Ferner wurde kontrolliert, mit welcher Präzision der EIA-Reader seine Messungen

durchführte, indem im Anschluss an eine Messung die Mikrotiterplatte mit den

pipettierten Volumina um 180° gedreht und noch einmal gemessen wurden.

Dabei fiel auf, dass der Reader jeweils in Reihe D und auf den Positionen rechts

unten in der Ecke die höchsten Messwerte bestimmte. Die Unterschiede waren jedoch

als geringfügig einzustufen. Bei dieser Untersuchung wurde zusätzlich noch die für die

Ergebnisse 90

EIAs ebenfalls gelegentlich eingesetzte Mehrkanalpipette überprüft. Mit ihr wurden

gute Vks von 2,3-2,9% erreicht.

Tab. 13: Vergleich von Einzelpipette, Multipette und Mehrkanalpipette und Überprüfung des EIA-Readers. Gemessen wurde die optische Dichte (OD). Nach der ersten Messung (a) wurde die Mikrotiterplatte um 180° gedreht und noch einmal gemessen (b). Grün markiert sind die jeweils höchsten Messwerte einer Reihe. Aus den Einzelwerten wurden die Mittelwerte (MW), Standardabweichungen (SD), Vks (in %) und der Median berechnet.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0,115 0,115 0,117 0,116 0,115 0,115 0,114 0,114 0,114 0,114 0,113 0,113

B 0,117 0,117 0,117 0,117 0,116 0,116 0,116 0,116 0,116 0,114 0,116 0,115

C 0,114 0,116 0,116 0,117 0,115 0,114 0,114 0,114 0,114 0,115 0,113 0,115D 0,122 0,123 0,121 0,121 0,119 0,119 0,118 0,118 0,117 0,117 0,117 0,115

E 0,113 0,114 0,114 0,115 0,113 0,117 0,113 0,112 0,112 0,111 0,112 0,11

F 0,113 0,116 0,113 0,112 0,113 0,111 0,113 0,112 0,113 0,118 0,112 0,114

G 0,115 0,118 0,117 0,118 0,117 0,115 0,115 0,116 0,12 0,115 0,114 0,113H 0,116 0,118 0,12 0,117 0,117 0,117 0,117 0,119 0,117 0,119 0,116 0,116

MW

SD

Vk%Median

a)

0,117

0,003

2,280,12

0,115

0,002

1,860,12

0,115

0,002

1,990,11

Mehrkanalpipette Multipette 200er-Einzelpipette

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0,109 0,108 0,111 0,113 0,111 0,109 0,108 0,108 0,107 0,109 0,11 0,109

B 0,111 0,108 0,109 0,111 0,109 0,109 0,109 0,11 0,111 0,111 0,111 0,11

C 0,107 0,107 0,112 0,109 0,107 0,107 0,107 0,108 0,108 0,108 0,109 0,109

D 0,113 0,114 0,115 0,115 0,113 0,113 0,126 0,112 0,112 0,112 0,112 0,11

E 0,105 0,105 0,106 0,107 0,105 0,105 0,105 0,104 0,105 0,106 0,106 0,106

F 0,104 0,104 0,104 0,104 0,104 0,103 0,105 0,105 0,108 0,106 0,106 0,106

G 0,108 0,109 0,107 0,109 0,108 0,108 0,108 0,107 0,108 0,109 0,109 0,11

H 0,108 0,107 0,11 0,11 0,109 0,109 0,111 0,111 0,111 0,113 0,113 0,112

MW

SD

Vk%

Median

b)

0,002

200er-Einzelpipette

0,109 0,1090,109

Mehrkanalpipette

0,11 0,11 0,11

2,93 3,79 2,12

0,003 0,004

Multipette

Bei einer Gesamtbetrachtung der technischen und methodischen Schwierigkeiten

im Umgang mit EIAs wirkt es plausibel, dass sie in ihrer Gesamtheit zu einer mangeln-

den Beurteilbarkeit etwaiger Stimulationseffekte von CRH, Urocortin und IL-1β geführt

haben. Die Zusammenhänge, die zu den hohen Intraassay-Variabilitäten führten,

konnten allerdings nicht abschließend geklärt werden und bedürfen weiterer

Untersuchungen.

Ergebnisse 91

3.4.5 Molekularbiologische Untersuchung von RC-4B/C1- und AtT20-Zellen

3.4.5.1 RNA-Extraktion

Im Rahmen der Qualitätssicherung wurde nach der RNA-Extraktion aus Zellen

beider Hypophysen-Zelllinien sowohl die Menge der isolierten RNA photometrisch

gemessen (s. 2.3.6.3) als auch eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um

ihren Reinheitsgrad zu überprüfen.

Die Agarose-Gelelektrophorese lieferte für beide Zelllinien gute Ergebnisse mit

einer deutlich erkennbaren, klar abgegrenzten 28S-Bande bei ca. 5,0 KB und einer

18S-Bande bei ca. 1,9 KB. Die nahezu vollständige Abwesenheit eines Schmiers

deutet auf einen hohen Reinheitsgrad der RNA hin. Das Gel für AtT20 ist in Abb. 32

dargestellt.

Abb. 32: Total-RNA von AtT20-Zellen. Dargestellt ist ein mit 1x TBE gepuffertes 1%iges Agarosegel. „28S“ bezeichnet die 28S-rRNA-Bande, „18S“ die 18S-rRNA-Bande eukaryotischer Zellen; sie wurden mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zur Ermittlung der Laufstrecke der Banden (28S bei ca. 5,0 KB, 18S bei ca. 1,9 KB) wurde ein DNA-Marker („ladder“, L) verwendet.

3.4.5.2 RT-PCR

Mittels RT-PCR wurde die Expression von CRH-Rezeptoren in den Zellen der

beiden Hypophysen-Zelllinien als unabdingbare Voraussetzung für ihre Einsatz-

möglichkeit als CRH-Bioassay überprüft. Dabei diente als zusätzliche Positivkontrolle

Ergebnisse 92

für die PCR die Untersuchung des Haushaltsgens Cyclophilin A. Das erwartete

Amplikon in einer Länge von 268 bp erschien in der Agarose-Gelelektrophorese bei

beiden Zelllinien als klar abgrenzbare, deutliche Bande. CRH-R1 und -R2 wurden

mithilfe von eingeschachtelten Primerpaaren im Rahmen einer Nested PCR

untersucht. Während die Bande für das Amplikon von CRH-R1 in einer Länge von 216

bp bei den RC-4B/C1-Zellen undeutlich, bei den AtT20-Zellen aber sehr scharf und

abgegrenzt zum Vorschein kam, ließ sich für CRH-R2 kein klares Signal nachweisen.

Abb. 33: mRNA-Nachweis von CRH-R1 (a) und Cyclophilin (b) in AtT20-Zellen. Für die Primerpaare wurde jeweils eine Negativkontrolle ohne cDNA („No Template Control“, NTC) mitgeführt. Cyclophilin-mRNA diente als Positivkontrolle für den Erfolg der RT-PCR. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5%igen Agarosegelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Zur Ermittlung der Laufstrecke der Banden wurde ein DNA-Marker („ladder“, L) verwendet.

Diskussion 93

4 Diskussion

4.1 Untersuchungen zur Wirkung von CRH im Myometrium

4.1.1 Prostaglandine

In dieser Arbeit wurden die Prostacyclin- und PGE2-Sekretion und ihre Stimulier-

barkeit durch CRH in humanem Myometrium des unteren Uterinsegments untersucht.

Das Hauptaugenmerk der Untersuchungen lag dabei auf 6-keto-PGF1α als stabilem

Metaboliten von Prostacyclin. Diese beiden Prostaglandine waren bei Metabolismus-

studien mit [3H]-Arachidonsäure in 24 Stunden inkubierten Myometriumbiopsien als

Hauptmetabolite aufgefallen [184]. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert

werden, dass die basale Prostacyclin-Synthese im unteren Uterinsegment ca. 15-20-

mal höher ist als die PGE2-Sekretion. Die Wirkung von CRH auf die 6-keto-PGF1α-

Produktion war aufgrund großer inter- und intraindividueller Streuungen der Messwerte

schwer beurteilbar. Eine statistische Auswertung wurde wegen der kleinen

untersuchten Fallzahl (n=8) nicht durchgeführt. Die vorläufigen Ergebnisse zeigten

eine Tendenz zu einer leichten Stimulation der 6-keto-PGF1α-Synthese, die allerdings

nicht zuverlässig reproduzierbar war. Die PGE2-Synthese wurde durch keine der

zugegebenen Substanzen stimuliert. Dieses Ergebnis ist jedoch aufgrund der kleinen

Versuchsgruppe (n=4) nicht als repräsentativ zu werten.

In der Literatur wird eine im Schwangerschaftsverlauf zunehmende Prostaglandin-

Synthese beschrieben, die v.a. durch eine gesteigerte Aktivität der induzierbaren COX-

2 im Amnion und Myometrium zustande kommt [45, 197]. Sie ist am Termin ca.

100fach stärker exprimiert als die konstitutive COX-1 [194]. Allerdings ist diese

Expressionssteigerung schon deutlich vor dem Geburtstermin zu beobachten, so dass

eine maßgebliche Beteiligung der COX-2 an der Weheninduktion unwahrscheinlich ist

[82]. Interessanterweise zeigte sich in einer neueren Studie zwar eine Erhöhung der

COX-2-mRNA Expression unter Wehen am Termin, jedoch nicht bei vorzeitiger

Wehentätigkeit [3]. In der Spätschwangerschaft tragen eine reduzierte PGDH-

Expression und -Aktivität und somit eine niedrigere Prostaglandin-Metabolismus-Rate

zusätzlich zu den erhöhten Prostaglandin-Spiegeln bei [81]. Dieser Effekt ist bei

vorzeitiger Wehentätigkeit besonders stark ausgeprägt [52, 181, 212], so dass die

Diskussion 94

Vermutung nahe liegt, dass ein Zusammenbruch der durch die choriale PGDH

aufgebauten metabolischen Barriere in einem ursächlichen Zusammenhang mit der

vorzeitig erhöhten myometrialen Kontraktilität steht. Allerdings wurden hinsichtlich der

PGDH-Aktivität auch kontroverse Daten erhoben, die für einen Anstieg der PGDH-

Aktivität im Verlauf der Schwangerschaft und unter der Geburt sprechen [187]. Dieses

Thema ist demnach noch nicht abschließend geklärt.

Der Befund der vorliegenden Arbeit, dass die myometriale Sekretion von

Prostacyclin ca. 15-20-mal höher als die PGE2-Sekretion ist, steht im Einklang mit

früheren Daten, nach denen PGI2 als Haupteicosanoid im schwangeren und nicht-

schwangeren Myometrium in vielen Spezies, inkl. Mensch, identifiziert wurde [31, 45,

156, 167, 184, 221]. Seine Konzentration steigt im Schwangerschaftsverlauf bis zum

Geburtstermin sowohl im Fruchtwasser [136] und im maternalen Plasma [223] als

auch im Myometrium [141, 169] stetig an. Dabei ist das Myometrium das einzige

intrauterine Gewebe, in dem überhaupt eine nennenswerte Prostacyclin-Sekretion

stattfindet [66, 186]. Entgegen der nahe liegenden Vermutung, dass die steigenden

Konzentrationen im Zusammenhang mit der ebenfalls zunehmenden Kontraktionskraft

des Uterus stehen, wurde eine Hemmung der myometrialen Kontraktilität durch

Prostacyclin beobachtet [156, 191, 219]. Dennoch gibt es mehrere Möglichkeiten, wie

Prostacyclin sowohl zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft als auch zum

Geburtsprozess beitragen kann:

Die Bindung von Prostacyclin an seinen spezifischen Rezeptor IP führt über die

Gαs-gekoppelte Adenylatcyclase/cAMP/PKA-Signaltransduktionskaskade entweder zur

Inaktivierung der MLCK oder zur Phosphorylierung einer membranständigen Ca2+-

Bindungsstelle zur Herabsetzung der freien Ca2+-Konzentration, so dass es zu einer

Inhibition der myometrialen Aktivität kommt [146]. Somit trägt es zur Ruhigstellung des

Uterus bei. Zahradnik et al. betrachteten Prostacyclin daher als antagonistischen

Regulator im Wechselspiel mit den Uterotoninen PGF2α und Oxytocin zur

Sicherstellung von Relaxationen des Myometriums zwischen den rhythmischen

Kontraktionen in der Wehenpause [226]. Bei Myometriumstreifen in vitro bewirkte es

zunächst eine Kontraktion, die aber nach kurzer Zeit in eine Relaxation überging [137,

228]. Angesichts solcher Beobachtungen stellt sich die Frage, wie übertragbar die

Ergebnisse auf die Situation in vivo sind: Hat endogen produziertes Prostacyclin

wirklich einen relaxierenden Effekt auf das Myometrium, oder spiegeln die publizierten

Diskussion 95

in vitro-Ergebnisse nach Superfusion von Prostaglandinen nur pharmakologische

Effekte wider?

Gehemmt wird die Prostacyclin-Sekretion durch Cortisol. Dieser Effekt wird

möglicherweise durch eine dehnungsassoziierte Stimulation der COX-2 antagonisiert

[32], um auch bei wachsendem Fetus eine Ruhigstellung des Myometriums während

des größten Teils der Schwangerschaft zu gewährleisten.

In den letzten Schwangerschaftswochen geht ein Anstieg der PGI-Synthase-

Aktivität mit einer Zunahme der Prostacyclin-Sekretion einher. Dies könnte auf eine

Beteiligung von Prostacyclin an der Cervixreifung hindeuten [72]. Die PGI-Synthase ist

im Myometrium in den Myofibrillen lokalisiert [140]. Am Geburtstermin ist dort und in

den Eihäuten ein signifikanter, wehenunabhängiger Abfall dieses Enzyms zu

beobachten, während die PGE-Synthase unverändert bleibt. Giannoulias et al. [52]

interpretierten dieses Phänomen als Zeichen für den nachlassenden relaxierenden

Einfluss von Prostacyclin auf das Myometrium. Diese Interpretation ist insofern

problematisch, als dass sie keine plausible Erklärung für die am Termin im Vergleich

zu PGE2 immer noch deutlich höhere Prostacyclin-Sekretion liefert.

Prostacyclin und CRH weisen gemeinsame Eigenschaften auf. Neben ihrer

Fähigkeit, intrazelluläre Vorgänge über den Second Messenger cAMP anzuregen [67,

119, 156], bewirken sie beide eine NO/cGMP-vermittelte Vasodilatation. Darüber

hinaus verhindert Prostacyclin thromboembolische Komplikationen in der maternalen

und uteroplacentaren Zirkulation [45, 224] und steigert den uteroplacentaren Blutfluss

durch Hemmung des vasokonstriktiven Einflusses von PGF2α. Auf diese Weise

gewährleistet es einen adäquaten Zufluss oxygenierten Blutes, der v.a während der

Wehentätigkeit essentiell zur Bereitstellung der für den Kontraktionsapparat nötigen

energiereichen Phosphate ist [34, 119]. Kommt es dennoch zu einer persistierenden

uterinen Hypoxie, wird vermehrt CRH ausgeschüttet, welches über eine Stimulation

der fetalen ACTH- und DHEAS-Sekretion die Östrogensynthese steigert [199]. Diese

fetale Stresssituation führt also zu einer myometrialen Aktivierung.

Trotz der beschriebenen synergistischen Wirkungen von Prostacyclin und CRH

deuten Indizien darauf hin, dass die beiden Substanzen zwar parallele

Wirkungsmechanismen haben, diese aber unterschiedlichen Regulationsmecha-

nismen unterliegen. So ist beispielsweise der vasodilatorische Effekt von PGI2, nicht

aber von CRH, durch COX-2-Inhibitoren hemmbar [35]. Das würde bedeuten, dass sie

Diskussion 96

sich in ihrer Wirkung auf die Zielzellen zwar überschneiden, aber keinen direkten

Einfluss aufeinander ausüben. Der in der vorliegenden Arbeit erhobene Befund, dass

CRH und Urocortin die myometriale Prostacyclin-Synthese nicht stimulieren, steht im

Einklang mit dem Ergebnis einer Untersuchung der Prostacyclin-Sekretion in

myometrialen Primärzellkulturen [24, 66]. Hier zeigte CRH ebenfalls keine Wirkung.

Die Befunde zu kontraktilen CRH-Effekten im Zusammenhang mit Prostaglandinen

werden kontrovers diskutiert. Quartero et al. [171] beobachteten zwar eine

Verstärkung der Oxytocin- und PGF2α-induzierten myometrialen Kontraktilität durch

CRH, mehrheitlich ergaben jedoch in vitro-Studien, dass CRH keinen Einfluss auf die

basale, PGF2α- und Oxytocin-stimulierte Aktivität des Myometriums bei Schwangeren

am Geburtstermin nimmt und auf die basale, IL-1β- und Oxytocin-stimulierte Synthese

des kontraktil wirkenden PGE2 sogar einen hemmenden Einfluss hat [66, 83, 193]. Zu

diesen Beobachtungen passen auch die stichprobenartig erhobenen PGE2-Daten der

vorliegenden Arbeit. Dass diese Wirkung nicht nur myocytenassoziiert auftritt, zeigte

eine Untersuchung zu CRH-Effekten auf die PGE2- und 6-keto-PGF1α-Synthese in

Fibroblasten und Endothelzellen [46]. Vieles spricht also dafür, dass CRH während

des größten Teils der Schwangerschaft sowohl durch direkte, rezeptorvermittelte

Wirkungen (s. 4.1.3) als auch durch seinen Einfluss auf die Synthese kontraktiler

Prostaglandine im Myometrium eine protektive Rolle zur Verhinderung von

Kontraktionen und eines verfrühten Ausstoßens des Feten spielt.

Dennoch ist bekannt, dass CRH einen stimulierenden Einfluss auf die

Prostaglandin-Synthese in der Placenta, den Eihäuten und der Decidua ausübt [26,

83, 109]. Diese Funktion gewinnt in mütterlichen und kindlichen Stresssituationen, in

denen das Wohlergehen des Feten im Uterus akut gefährdet ist, an Bedeutung.

Kindlicher Stress ruft über die Aktivierung der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-

NNR-Achse eine gesteigerte Cortisol-Synthese hervor, die ihrerseits die CRH-

Sekretion stimuliert. Erhöhte CRH-Spiegel wurden beispielsweise im Nabelschnurblut

von Neugeborenen gefunden, die einem Sauerstoffmangel ausgesetzt waren oder

eine intrauterine Wachstumsverzögerung (Intrauterine Growth Retardation, IUGR)

aufwiesen [215]. CRH führt in diesem Fall über eine Stimulierung der PGHS und eine

Hemmung der PGDH zu einer erhöhten Synthese kontraktil wirkender Prostaglandine,

so dass eine Kaskade in Gang gesetzt wird, die letztlich zur Frühgeburt führt. Analog

kann diese Kaskade auch durch maternalen Stress induziert werden [78]. Dazu zählen

Diskussion 97

neben emotionalen Stressoren auch physische, z.B. Unterernährung [21]. Diese

Ergebnisse stehen im Einklang mit der Beobachtung, dass Frauen, die vorzeitig

entbanden, erhöhte CRH-Plasmaspiegel aufwiesen [132]. Verstärkt wird die soeben

beschriebene myometriale Aktivierung durch die Einbindung von Prostaglandinen in

eine weitere positive Rückkopplungsschleife (s. auch Abb. 34): PGE2 und PGF2α

führen über eine Aktivierung der 11β-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenase-1 im Chorion zu

einer Umwandlung von Cortison in aktives Cortisol. Dieses bewirkt eine Stimulation

von CRH und COX-2 sowie eine Inhibition der PGDH, so dass wiederum die

Prostaglandin-Synthese und konsekutiv die Kontraktilität des Myometriums gesteigert

wird [21, 24]. Dieser Cortisol-Effekt, der auch bei exogener Glucocorticoid-Gabe auftritt

[42], ist in vivo allerdings nur transient: Bei länger andauernder Glucocorticoid-Gabe

wird letztlich die Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse supprimiert, so dass durch

eine verminderte Östrogensynthese die myometriale Aktivierung herabgesetzt wird

[24].

Zum Einfluss der Prostaglandine auf die myometriale Kontraktilität wurde in vitro

beobachtet, dass sich ihre Wirkung mit Einsetzen der Wehentätigkeit ändert [191,

220]: Vor Einsetzen der Wehen zeigte PGF2α keinen Einfluss auf den Fundus,

während es im unteren Uterinsegment kontraktionsstimulierend wirkte. PGE2 hingegen

stimulierte das Fundusmyometrium und zeigte im unteren Uterinsegment eine

biphasische Wirkung, bei der es nach einer initial hervorgerufenen Kontraktion zu einer

Relaxation kam. Während der Wehentätigkeit hingegen wurde der Fundus durch beide

Prostaglandine zu Kontraktionen angeregt, im unteren Uterinsegment blieb PGF2α

jedoch wirkungslos, und PGE2 bewirkte eine Hemmung der Kontraktilität. Diese

Beobachtungen stehen im Einklang mit der Hypothese einer funktionellen

Regionalisierung des Uterus [22, 69]: Während das untere Uterinsegment während

des größten Teils der Schwangerschaft einen kontraktilen Phänotyp aufweist, um den

Feten sicher im Uterus zu halten, entspannt es sich unter der Geburt, um dessen

Passage zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu ist der Fundus-/Corpusbereich während

der Schwangerschaft relaxiert, doch am Geburtstermin gehen von hier die Wehen aus.

Es zeichnet sich also ab, dass unterschiedliche Prostaglandin-Wirkungen – die sogar

durch dasselbe Prostaglandin in unterschiedlichen Uterus-Regionen hervorgerufen

werden können –eine wichtige Rolle für die Steuerung der gegensätzlichen Muskel-

tätigkeit in den verschiedenen uterinen Bereichen spielen. Die Basis für diese

unterschiedlichen Prostaglandin-Wirkungen bildet eine fein abgestimmte Regulation

Diskussion 98

und eine zeitlich- sowie räumlich-differenzielle Expression der spezifischen,

membrangebundenen Prostaglandin-Rezeptoren [4, 69, 191, 196]. Dabei sind v.a. die

verschiedenen Subtypen des PGE2-Rezeptors von Bedeutung. In der vorliegenden

Arbeit sind die Funktionen dieser Rezeptoren unter 1.4.3 detailliert erläutert worden.

Urocortin zeigte in den vorliegenden Untersuchungen eine CRH-analoge Wirkung,

indem es die 6-keto-PGF1α-Synthese nicht deutlich veränderte. Auf die PGE2-Synthese

schien es eine eher hemmende Wirkung auszuüben, doch ist dieses Ergebnis

aufgrund der geringen Anzahl untersuchter Proben mit Vorsicht zu betrachten.

Urocortin wird eine kontraktionssteigernde Wirkung auf das Myometrium zuge-

schrieben [160]. Diese wird Gαq-Protein-gekoppelt über eine Aktivierung von

Phospholipase C (PLC) und Inositoltriphosphat (IP3) sowie PKC vermittelt und führt

über die Aktivierung einer Mitogen-Activated-Protein (MAP)-Kinase zu einem Anstieg

der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Urocortin aktiviert Gαq 10-mal stärker als CRH

[61]. Seit Beginn dieser Arbeit wurden zwei weitere Urocortin-Formen entdeckt,

Urocortin II und III; beide haben eine deutlich höhere Affinität zu CRH-R2 als CRH

selbst [112, 175]. Urocortin II bindet an CRH-R2 und bewirkt über eine Aktivierung der

Extracellular-Signal-Regulated-Kinase (ERK)-Kaskade und PKC eine Aktivierung der

MLCK; außerdem ist für diesen Prozess die Aktivierung einer RhoA-assoziierten

Kinase nötig [88]. cAMP setzt die Fähigkeit von Urocortin zur Aktivierung der ERK-

Kaskade herab, so dass eine reduzierte Kontraktilität resultiert [157]. Florio et al. [48]

beobachteten einen deutlich erhöhten Urocortin-Plasmaspiegel während der

Wehentätigkeit. Dabei war die Urocortin-Konzentration in der fetalen Zirkulation

deutlich höher als jene im mütterlichen Kreislauf. Es wurde die Hypothese abgeleitet,

dass Urocortin als fetales Signal zur Förderung von Reifungs- und

Entwicklungsvorgängen, welche die Adaptation an das extrauterine Leben

ermöglichen, die Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse aktiviert [48]. Allerdings

bleibt nach wie vor unklar, ob die erhöhten fetalen Urocortin-Spiegel Ursache oder

Ergebnis der geburtsassoziierten Prozesse sind.

Il-1β zeigte in dieser Arbeit im unteren Uterinsegment ebenfalls keinen eindeutigen

Effekt auf die Prostaglandin-Synthese. Frühere Studien belegten jedoch, dass Prosta-

glandine durch proinflammatorische Cytokine wie Il-1β und TNFα in Myometrium-Pri-

märkulturen vor und nach Uterus-wirksamen Wehen über eine Aktivierung der PLA2

oder eine Induktion der COX-2 stimulierbar waren [139], [45, 66, 166, 167]. Dabei zeigte

Diskussion 99

Prostacyclin bei nachgewiesener Infektion (Chorioamnionitis) einen signifikant

niedrigeren IL-1β-Effekt; es wurde 4fach weniger stimuliert als PGE2 [66]. Eine

mögliche Interpretation dieser Daten könnte sein, dass Prostacyclin zwar beim

physiologischen Geburtsprozess in das proinflammatorische Cytokin-Prostaglandin-

Netzwerk involviert ist, bei pathologischen Mechanismen zur Geburtsauslösung jedoch

eine untergeordnete Rolle spielt.

4.1.2 Histologische Charakterisierung des Myometriums

Bei der histologischen Charakterisierung der humanen Myometriumbiopsien zeigte

sich ein Myocyten-Anteil von 55-65%, eingebettet in ein Bindegewebsgerüst mit

heterogen verteilten Blutgefäßen und Makrophagen. Nach Lehrbuchmeinung finden

sich im unteren Drittel des Uterus deutlich weniger Muskel- als Bindegewebszellen

[165]. Allerdings hatten auch Wetzka (persönliche Mitteilung) und andere

Forschungsgruppen [116, 222] in Biopsien aus dem unteren Uterinsegment einen

hohen Anteil kontraktiler Elemente von bis zu 69% gefunden. Ferner fiel bei einem

direkten Vergleich der Gewebezusammensetzung an verschiedenen Stellen derselben

Probe deren Inhomogenität auf; der Prozentsatz der einzelnen Zellarten variierte um

ca. 5-10%. Im Zusammenhang mit den Prostaglandin-Stimulationsversuchen könnte

diese Beobachtung eine Rolle spielen, da letztlich nicht geklärt ist, welche Zellen des

myometrialen Gewebeverbands welche Prostaglandine in welcher Menge produzieren.

Abgesehen von einem eingeschränkten Fibroblasten-Nachweis mit dem

Antikörper-Klon 5B5 im Kryoschnitt nach einer Methode von Kasper [89], bei dem es

zu einer Schädigung des Gewebes durch die Kryofixation kam, konnten

bindegewebige Strukturen im Paraffinschnitt nur aufgrund ihrer charakteristischen

Form und Verteilung identifiziert werden. Der spezifische Nachweis von Fibroblasten

mit dem Antikörper-Klon 3-2B12 gegen die β-Untereinheit von Prolyl-4-Hydroxylase

misslang. Obwohl dieses Schlüsselenzym der Kollagensynthese als Fibroblasten-

Marker gilt [5], wurden statt Fibroblasten Myocyten angefärbt. Zu diesen wies der

Antikörper eine sehr hohe Affinität auf. Es ist bekannt, dass im Myometrium viele

Übergangsformen zwischen Myocyten und Fibroblasten vorkommen, welche die

Fähigkeit zur Kollagensynthese besitzen. Dies würde zwar eine gewisse Kreuz-

reaktivität des Antikörpers erklären, die auch vom Hersteller eingeräumt wurde (Acris

Diskussion 100

Antibodies GmbH, Dr. Peter Bubeck, persönliche Mitteilung von), jedoch keineswegs

die Tatsache, dass ausschließlich Myocyten, aber kein Bindegewebe angefärbt wurde.

Zur Überprüfung der grundsätzlichen Spezifität des Antikörpers wurde er bei einer

Hautprobe eingesetzt. Auch dieses Ergebnis ist kritisch zu beurteilen, da nicht nur im

Corium, der Bindegewebsschicht der Haut, eine große Anzahl Zellen angefärbt wurde,

sondern auch in der Epidermis, deren Hauptanteil Epithelzellen ausmachen. Zusam-

menfassend bleibt zu konstatieren, dass der Klon 3-2B12 für den Fibroblasten-

Nachweis im Myometrium offenbar nicht geeignet war. In Erwägung zu ziehen wäre

der Einsatz anderer Fibroblasten-Marker, z.B. eines Antikörpers gegen das Hitze-

schockprotein (Hsp)-47 [105] oder des Antikörper-Klons FibAS02 gegen das

Oberflächen-Antigen CD90 [103]. Diese offenen Fragen müssen weiter abgeklärt

werden, was im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht möglich war.

In der Literatur sind zahlreiche Unterschiede zwischen dem unteren Uterinsegment

und dem Corpus-/Fundusbereich des Uterus beschrieben. Im unteren Uterinsegment

sind statt CAPs v.a. relaxationsassoziierte Proteine zu finden, z.B. das durch

Progesteron induzierbare Connexin (Cx)-26, EP2 und EP4 [191, 208]. Dennoch wurde

beobachtet, dass die Expression und Aktivität von COX-1 und -2 und somit die

Prostaglandin-Synthese-Kapazität hier viel höher ist als in den übrigen

Uterusbereichen [201]. Nach Einsetzen der Wehen wurde 15-mal mehr COX-2-mRNA

nachgewiesen als vorher [45]. Diese Beobachtung ist nicht zwangsläufig als

Widerspruch zu den non-kontraktilen Eigenschaften des unteren Uterinsegments zu

werten, da die Prostaglandine dort evtl. eher an der Cervixreifung als an der Myocyten-

Kontraktion beteiligt sind [196].

Im Corpus-/Fundusbereich kommen das Gap Junction-Protein Cx-43 und andere

für die Aktivierung des Myometriums nötige CAPs vor. Ihre Expression wird einerseits

durch die Aktivierung der fetalen Hypothalamus-Hypophysen-NNR-Achse und

andererseits durch die mechanische Dehnung des Uterus induziert. Diese beiden fetal

gesteuerten Wege verlaufen separat, aber dennoch voneinander abhängig [117].

Sehringer [190] fand in einer Fundusprobe eine stärkere CRH-R2-Expression als im

unteren Uterinsegment. Sollte sich diese Beobachtung in weiteren Untersuchungen

bestätigen, könnte sie für eine kontraktionsassoziierte CRH-R2-Funktion sprechen.

Nach aktueller Lehrmeinung wird angenommen, dass im unteren Uterinsegment

durch passive Dehnung die Passage des Feten ermöglicht wird, während vom Fundus

Diskussion 101

die Wehentätigkeit ausgeht [15, 165]. Möglicherweise kommt die Relaxation im

unteren Uterinsegment während der Wehentätigkeit im Sinne einer funktionellen

Autonomie des Uterus durch regionale Unterschiede in der Genexpression, z.B. des

Cx-26-Gens, zustande [24]. Zu dieser Hypothese würde eine räumlich-differenzielle

Rezeptorverteilung passen, wie sie für CRH-, Prostaglandin- und Oxytocin-Rezeptoren

vorgeschlagen wurde [1, 49, 117, 140, 203]. Nähere Informationen zu diesem Thema

finden sich in der vorliegenden Arbeit unter 1.4.3 und 4.1.3.

Ein limitierender Faktor bei Untersuchungen am menschlichen Myometrium ist die

Gewinnung geeigneten Probenmaterials, da bei physiologischen Schwangerschafts-

verläufen im Rahmen von geplanten Sectiones caesareae in der Regel nur

Myometriumbiopsien vom oberen Rand des unteren Uterinsegments genommen

werden können. Diese Tatsache wirft in der Geburtsforschung die Frage auf, inwieweit

die Daten aus diesen Untersuchungen auf andere uterine Regionen übertragbar sind.

Trotz der oben beschriebenen regionalen Unterschiede kamen mehrere Studien zu

dem Ergebnis, dass derartige Rückschlüsse durchaus zulässig sind [116, 219, 222].

Luckas machte beispielsweise vergleichende in vitro-Kontraktionsbeobachtungen an

Myometriumstreifen aus dem unteren und oberen Uterinsegment im Organbad und

fand keinen Unterschied der kontraktilen Eigenschaften [116]. Allerdings wurde in

dieser Studie Myometriumgewebe vom oberen Rand des Sectio-Einschnittes als aus

dem oberen Uterinsegment stammend definiert. Wenngleich Studien dieser Art die

Validität der gängigen Probengewinnungspraxis stützen, ist die Übertragbarkeit der

Daten angesichts der ebenfalls nachgewiesenen Differenzen im Sinne einer sauberen

wissenschaftlichen Methodik immer wieder aufs Neue zu hinterfragen.

4.1.3 Verteilung der CRH-Rezeptoren im Myometrium

Als Hauptsyntheseort für CRH gilt zwar die Placenta [183, 192], aber auch im

Myometrium wird CRH im Schwangerschaftsverlauf in steigenden Konzentrationen

gebildet, die ein Maximum während der Wehentätigkeit erreichen [36]. In der

vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit das Myometrium auch als Zielgewebe

für CRH-Wirkungen in Frage kommt. Dabei erfolgte der CRH-Rezeptor-Nachweis

ausschließlich auf der Basis immunhistochemischer Untersuchungen. Außer im

Bindegewebe konnte CRH-R1 in allen myometrialen Zelltypen, inklusive dem Gefäß-

endothel, sehr stark nachgewiesen werden. Paralleluntersuchungen detektierten

Diskussion 102

außerdem in Decidua eine starke CRH-R1-Expression sowohl in Stroma- als auch in

Endothelzellen. Dieser Befund bestätigte Daten von Wetzka et al. [218]. CRH-R2

wurde in Myocyten und Makrophagen deutlich exprimiert, jedoch nicht in Gefäß-

endothelzellen. Bei der genauen Betrachtung der Rezeptor-Expression fiel eine

inhomogene Verteilung nicht nur innerhalb der einzelnen Zellen, sondern in Bezug auf

den gesamten Gewebeschnitt auf. Ein derartiges, mosaikartiges Expressionsmuster

von CRH und CRH-Rezeptoren wurde schon von Wetzka et al. [218] beschrieben, die

dieses Phänomen dadurch erklärten, dass die Myometriumprobe möglicherweise in

einer frühen Aktivierungsphase des Uterus gewonnen wurde, ehe es zu einer

synchronisierten Rezeptor-Aktivierung über die Ausbildung von Gap Junctions

gekommen war. Eine neuere Studie fand außerdem eine unregelmäßige CRH-

Rezeptor-Verteilung in der Zellmembran von Myocyten [123]. Aus diesem Befund

wurde die Hypothese abgeleitet, dass es möglicherweise sog. „Hotspots“ der CRH-

Rezeptor-Expression gibt, die in bestimmten, begrenzten Bereichen spezifische

Signaltransduktionswege aktivieren.

In den letzten Jahren wurden myometriale CRH-Rezeptoren nicht nur in

Leiomyocyten, sondern auch in uterinen Fibroblasten [58], gewebeständigen

Makrophagen und Endothelzellen [218] sowie Leukocyten [55] nachgewiesen. Dabei

könnte ihre Expression in Fibroblasten für eine Beteiligung an der Cervixreifung

sprechen. Ihre Zahl und Bindungsaffinität nehmen im Verlauf der Schwangerschaft

stark zu [74]. Bei Schwangeren findet sich CRH-R1 v.a. im Myometrium und in den

Eihäuten, wobei seine Expression im Vergleich zu Nicht-Schwangeren geringer ist,

während der Wehentätigkeit aber stark zunimmt. Im unteren Uterinsegment ist er

stärker vertreten als im Corpus-/Fundusbereich des Uterus [203]. Jirecek et al. [80]

zeigten, dass CRH-R2 ein entgegengesetztes Expressionsmuster aufweist; er ist am

Geburtstermin stark exprimiert, aber während der Wehentätigkeit kaum noch

nachweisbar. Bei Frauen mit Frühgeburtsbestrebungen ist er schwächer ausgeprägt

als bei Frauen mit unkomplizierten Schwangerschaftsverläufen. Dieser Befund wurde

so gedeutet, dass es zur Verhinderung exzessiver Kontraktionen in bestimmten

Stadien der Geburt zu einer Herrunterregulation von CRH-R2 kommt, und belegt somit

indirekt eine kontraktionsassoziierte Funktion dieses Rezeptors. Passend zu dieser

Hypothese fand Sehringer [190] bei einer einzelnen Fundusprobe eine stärkere CRH-

R2-Expression als bei den üblichen Proben aus dem unteren Uterinsegment. Diese

Beobachtung muss anhand größerer Probenzahlen weiter abklärt werden.

Diskussion 103

Nach vergleichenden Untersuchungen von Grammatopoulos [58, 61] an

schwangerem versus nicht-schwangerem Myometrium kommt bei Nicht-Schwangeren

v.a. CRH-R1α und -R1β sowie CRH-R2β vor. In der Schwangerschaft werden noch -

R2α und am Geburtstermin zusätzlich -R1c und -R1d exprimiert. Einschränkend muss

angemerkt werden, dass der Expressionsnachweis der meisten CRH-Rezeptor-

Subtypen bisher nur auf mRNA-Ebene erfolgt ist, also keine Rückschlüsse auf die

Existenz funktioneller Proteine zulässt. Dennoch deuten diese Daten darauf hin, dass

CRH-1c und -R1d am Ende der Schwangerschaft eine Rolle spielen und dass die

biologischen Wirkungen von CRH und Urocortin im Myometrium in den verschiedenen

Schwangerschaftsstadien über unterschiedliche CRH-Rezeptor-Subtypen vermittelt

werden. Die Expressionsregulierung dieser Subtypen ist ein dynamischer Prozess, der

über bisher unbekannte Mechanismen erfolgt [63]. Die teilweise kontroversen Daten

zur Rezeptor-Expression im Myometrium [58, 178, 203] sind möglicherweise durch die

Heterogenität des Patientinnenkollektivs erklärbar: Zwar stammten alle Proben von

Patientinnen am Geburtstermin ohne Wehen, aber es konnte nicht prognostiziert

werden, wann die Wehen eingesetzt hätten und in welcher Aktivitätsphase sich der

Uterus somit zum Zeitpunkt der Probenentnahme befand.

Der im Myometrium am stärksten ausgeprägte CRH-Rezeptor-Subtyp ist CRH-

R1α. Gαs-Protein-gekoppelt führt die Bindung seines Liganden über die Adenylat-

cyclase/cAMP/PKA-Signaltransduktionskaskade zu einer Inaktivierung der MLCK,

indem deren Affinität für den Calcium-Calmodulin-Komplex herabgesetzt wird [50].

Dadurch wird die myometriale Kontraktilität gehemmt. Noch verstärkt wird diese

Wirkung durch Stimulation weiterer relaxierender Signaltransduktionswege, z.B. eine

PKA-abhängige oder -unabhängige Aktivierung von Guanylatcyclase, die über cGMP

zur Bildung von NO führt [2], sowie eine Hemmung der Cytokin-induzierten

myometrialen Prostaglandin-Synthese [67]. CRH hat folglich über CRH-R1, zumindest

über das Gαs-Protein, keinen direkten stimulatorischen Effekt auf die Synthese

kontraktiler Prostaglandine [24]. Eine indirekte kontraktionsstimulierende Wirkung ist

hingegen durch die Stimulation der Prostaglandin-Synthese in der Placenta und im

Amnion möglich [26, 83, 109].

Interessanterweise verändert sich während der Schwangerschaft die Affinität von

CRH zu CRH-R1. Die zunächst stetig steigende, am Geburtstermin jedoch erniedrigte

Affinität [62] lässt auf myometriumsrelaxierende CRH-Effekte während des größten

Diskussion 104

Teils der Schwangerschaft, aber auch auf eine Veränderung der CRH-Funktion in

Richtung kontraktionsunterstützender Effekte unter der Geburt, schließen. Mehrere

Indizien stützen dieses Modell. Zum einen wurde beobachtet, dass das gleichmäßig im

gesamten Myometrium exprimierte Gαs-Protein kurz vor der Geburt herrunterreguliert

wird [201]. Ferner bewirkt Oxytocin gegen Ende der Schwangerschaft über die

Aktivierung von PKC eine CRH-R1α-Desensitivierung, so dass es über eine

Aktivitätsminderung der Adenylatcyclase und eine verringerte cAMP-Produktion zu

einer Abschwächung der relaxierenden Wirkung kommt [66, 67]. Des Weiteren mindert

PKC über eine Desensitivierung von CRH-R1β die Aktivität einer membran-

gebundenen Guanylatcyclase, so dass die muskelentspannende Wirkung aufgrund

einer verringerten cGMP-Produktion weiter reduziert wird [2, 122]. Vergleichende

Studien zeigten, dass im Myometrium eine PKC-Aktivierung nur am Geburtstermin

erfolgt. Dies könnte möglicherweise in der vorher zu geringen Anzahl von Oxytocin-

Rezeptoren begründet sein [63]. Insgesamt spricht einiges dafür, dass den an beiden

CRH-Rezeptoren nachgewiesenen, multiplen potentiellen PKC-Bindungsstellen [63]

eine wichtige Bedeutung für die Rezeptor-Regulation zukommt.

In diesem Zusammenhang steht die Tatsache, dass CRH-R1 während der Wehen-

tätigkeit vornehmlich im unteren Uterinsegment verstärkt exprimiert wird, nicht

zwangsläufig im Widerspruch zu der Erkenntnis, dass es am Termin unter Wehen zu

einer CRH-R1-Desensitivierung kommt. Möglicherweise ist die verstärkte Expression

dieses Rezeptors im unteren Uterinsegment als gegenregulatorische Maßnahme des

Körpers zu werten, damit bei einer Abschwächung der CRH-R1-vermittelten

relaxierenden Wirkung das untere Uterinsegment dennoch entspannt und die Passage

des Feten ermöglicht werden kann. Das würde bedeuten, dass sich die Desensi-

tivierung von CRH-R1 letztlich v.a. im Fundus auswirkt. Die Beobachtung, dass nicht

alle CRH-Rezeptoren oxytocinsensitiv sind [67], somit die Möglichkeit zu einer

differenziellen Regulation besteht, könnte dieses Modell unterstützen. Eine räumlich-

differenzielle CRH-Rezeptorverteilung, wie sie ebenfalls für Oxytocin- und

Prostaglandin-Rezeptoren vorgeschlagen wurde [1, 49, 140], würde scheinbar

gegensätzliche CRH-Wirkungen in verschiedenen Bereichen des Uterus plausibel

machen [117, 203].

Die Erkenntnis, dass CRH durch Bindung an CRH-R1α über das Adenylat-

cyclase/cAMP/PKA-System eine Relaxation des Myometriums bewirkt, bildete die

Diskussion 105

Basis zu der Annahme, dass CRH keine direkten kontraktionsstimulierenden Effekte

ausübt [8, 60, 170]. Zunächst in nicht-schwangerschaftsspezifischen Geweben

(Leydig-Zellen, fetale Nebenniere) wurden jedoch CRH-Rezeptoren gefunden, die über

den PLC/Inositol-Triphosphat (IP3)/PKC-Signaltransduktionsweg die intrazelluläre

Ca2+-Konzentration erhöhen [20, 210]. Im Myometrium wurde außerdem eine

Aktivierung unterschiedlicher G-Proteine beobachtet [60]: Während bei Nicht-

Schwangeren keine Kopplung von CRH-Rezeptoren an das Adenylatcyclase/cAMP-

System nachgewiesen werden konnte, führt bei Schwangeren die Aktivierung eines

kurzen, 45 kDa schweren und eines langen, 52 kDa schweren Gαs-Proteins über jene

Signaltransduktionskette zur myometrialen Ruhigstellung. Am Geburtstermin konnte

nur noch das kurze Gαs-Protein, aber zusätzlich ein Gαq-Protein detektiert werden [75],

welches über die PLC/IP3-Kaskade Kontraktionen auslöst [61]. Die Aktivierung von

Gαq erfolgt dabei durch Urocortin in 10facher Stärke im Vergleich zu CRH [61], so

dass bisher ungeklärt ist, inwieweit CRH an der Aktivierung dieses G-Protein-Typs

beteiligt ist. Anhand von Untersuchungen zu Urocortin konnte für CRH-R2 eine

kontraktionsassoziierte Wirkung nachgewiesen werden: Karteris et al. [88] fanden

heraus, dass Urocortin II über CRH-R2 eine Aktivierung der ERK-Kaskade und PKC

eine Aktivierung der MLCK bewirkt und somit die myometriale Kontraktilität steigert.

Basierend auf den Daten zur Kopplung der CRH-Rezeptoren an unterschiedliche

G-Proteine wurde die Hypothese aufgestellt, dass CRH in der Schwangerschaft

myometriale Kontraktionen verhindert, am Termin jedoch über Gαq die myometriale

Kontraktilität erhöht [76]. Ein erhöhter CRH-Plasmaspiegel bei pathologischen

Schwangerschaftsverläufen, die mit einem erhöhten Frühgeburtsrisiko einhergehen,

würde in diesem Modell den Versuch des Körpers darstellen, den Fetus vor zu früher

Entbindung zu schützen. Zu einer Regulationsmöglichkeit der CRH-Genexpression

wurde eine Hypothese aufgestellt, nach der Cortisol mit Progesteron in Placenta und

Eihäuten um die Bindung an den Glucocorticoid-Rezeptor konkurriert [86]. Die

hemmende Wirkung von Progesteron, die während des überwiegenden Teils der

Schwangerschaft dominiert [149], würde demnach durch die im

Schwangerschaftsverlauf steigenden Cortisol-Spiegel zunehmend aufgehoben, so

dass es letztlich zu einem Anstieg der CRH-Konzentration käme. Eine ähnliche

Progesteron-Cortisol-Interaktion ist auch zur Regulation der Prostaglandin-Synthese

beschrieben worden [24]. In vivo wurde beobachtet, dass auch nach exogener

Diskussion 106

Glucocorticoid-Gabe der CRH-Plasmaspiegel über 50% gegenüber dem

Ausgangswert steigt [121].

Abb. 34: Darstellung der dualen CRH-Funktion mit relaxierenden sowie kontrahierenden Effekten auf das Myometrium.Dieses Schema gibt einen Überblick über direkte CRH-R1- und Gαs-gekoppelte Relaxationswirkungen und indirekte, über die Stimulation von Prostaglandinen gesteuerte Kontraktionseffekte sowie ihre möglichen Interaktionen. Mit einer gestrichelten Linie und „?“ markiert ist der bislang hypothetische Gαq-gekoppelte kontrahierende CRH-Effekt. In das Schema integriert sind die Modelle der kompetitiven Steuerung der CRH-Expression durch Progesteron und Cortisol über den Glucocorticoid-Rezeptor und der CRH-R1-Desensitivierungseffekt von Oxytocin. CRH: Corticotropin-Releasing Hormone; CRH-R: CRH-Rezeptor; COX-2: Cyclooxygenase-2; PG: Prostaglandin; PGDH: 15-Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase; PKC: Proteinkinase C; EP: PGE2-Rezeptor; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; IP3: Inositoltriphosphat.

Abschließend ist zu bemerken, dass das Modell, nach dem CRH während des

größten Teils der Schwangerschaft an der Ruhigstellung des Uterus, dann aber auch

an den für eine rhythmische Wehentätigkeit notwendigen Kontraktionen beteiligt ist

und eine maßgebliche Rolle für den komplikationslosen Übergang zwischen diesen

beiden gegensätzlichen Funktionszuständen des Uterus spielt, zunehmend an

Attraktivität gewinnt [63, 67, 76, 203], jedoch bis heute spekulativ bleibt. Aus der

Komplexität der dargestellten CRH-Wirkungen lässt sich somit ableiten, dass eine

Einzelmessung von CRH im Plasma zur Bestimmung des Frühgeburtsrisikos wenig

aussagekräftig ist. Eine Parallelmessung verschiedener Parameter, z.B. von CRH,

Diskussion 107

AFP, Fibronektin und Östradiol im Speichel, könnte möglicherweise zu einer

Steigerung des prädiktiven Wertes beitragen [26, 132].

4.2 CRH-Bioassay

Die Überprüfung der Bioaktivität von CRH ist keine triviale Angelegenheit, da die

Bioaktivität dieses Peptidhormons schon bei einem proteolytischen Abbau von zwei

Aminosäureresten auf <0,1% reduziert wird [134]. Bei Forschungsprojekten, die den

langjährigen Einsatz synthetischen CRHs erforderlich machen, erscheint es daher

sinnvoll und notwendig, zu kontrollieren, wie bioaktiv das Hormon nach Lagerung in

lyophilisiertem Zustand noch ist, zumal die Herstellerfirmen nur eine Garantie auf die

Reinheit, jedoch nicht die Bioaktivität geben. Geeignet sind für diesen Zweck die

Untersuchung der durch CRH angeregten ACTH-Sekretion in Hypophysenzellen und

die Bestimmung des Second Messengers cAMP. Als Teil der vorliegenden Arbeit

wurde die ACTH-Sekretion zweier Hypophysen-Zelllinien untersucht.

Bei Vorversuchen mit der Ratten-Zelllinie RC-4B/C1 blieben sowohl die basalen

Messwerte für ACTH als auch diejenigen, welche nach CRH-Stimulation bestimmt

wurden, unterhalb der Nachweisgrenze. Eine Überprüfung mittels RT-PCR und

Immuncytochemie ergab eine deutliche Expression von CRH-Rezeptor-mRNA sowie -

Protein. Eine weitere Abklärung, warum der Bioassay ergebnislos blieb, war im

Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich.

Die Hauptversuche wurden daher mit schwimmenden, nicht-adhärenten AtT20-

Mauszellen durchgeführt. CRH-Bioassays mit dieser Zelllinie wurden auch schon von

anderen Autoren unter unterschiedlichen Kulturbedingungen beschrieben [19, 70, 71,

120, 133]. In Vorversuchen wurde CRH-Rezeptor-mRNA in den AtT20-Zellen nachge-

wiesen.

Zur Optimierung der Methodik wurden im Rahmen dieser Arbeit die Kultur-

bedingungen für die AtT20-Zellen systematisch variiert. Da in den ersten 6 Stunden

nach Aussaat der Zellen große Schwankungen der Messwerte und erst danach ein

stabiler ACTH-Anstieg zu beobachten waren, wurde im Folgenden erst nach einer 6-

stündigen Vorinkubationsphase mit CRH stimuliert. Ein Vergleich zweier Kulturmedien

ergab für Ham’s F12 einen im zeitlichen Verlauf langsameren ACTH-Anstieg mit einer

Diskussion 108

geringeren Steigerungsrate gegenüber DMEM. Da unter diesen Bedingungen etwaige

Stimulationseffekte durch CRH besser zu erkennen waren, wurde entschieden, Ham’s

F12 weiter zu verwenden.

Es stellte sich heraus, dass das „alte“ CRH, das ca. zwei Jahre in lyophilisierter

Form bei -80°C aufbewahrt worden war, die ACTH-Sekretion nicht schlechter, sondern

sogar etwas gleichmäßiger stimulierte als das neue. Seine anhaltende Bioaktivität war

somit erwiesen. Das bedeutete, dass die schlechte Reproduzierbarkeit der

Prostaglandin-Stimulationsversuche auf andere Faktoren zurückzuführen war. Die

besten Stimulationseffekte wurden in AtT20-Zellen bei einer CRH-Konzentration von

10 nM beobachtet; in geringeren Konzentrationen eingesetztes CRH führte zu stark

streuenden Ergebnissen. Der Einsatz noch höherer Konzentrationen erscheint wenig

sinnvoll, da andernfalls eine zu große Diskrepanz zur physiologischen CRH-

Konzentration im Blutplasma (1000-10000 pg/ml am Geburtstermin) in Kauf genom-

men würde.

Obwohl die biologische Aktivität des eingesetzten synthetischen CRH zweifelsfrei

erwiesen wurde, da die durch CRH stimulierten ACTH-Werte durchweg höher lagen

als die basalen Konzentrationswerte, schränkten große Schwankungen der Replikat-

messungen – ähnlich wie bei den Prostaglandin-Untersuchungen – die Validität des

Assays ein. Dieses Problem wurde noch dadurch verstärkt, dass die Werte der

einzelnen, unter identischen Bedingungen durchgeführten Stimulationsversuche um

den Faktor 10 schwankten. Auch in weiterführenden Experimenten mit adhärenten

AtT20-Zellen gelang es trotz zusätzlicher Optimierungsschritte im Endokrinologischen

Labor nicht, dieses Phänomen auszumerzen [189]. Daher wurde ein CRH-Bioassay

etabliert, in dem die cAMP-Sekretion der AtT20-Zellen bestimmt wurde; dieser lieferte

zuverlässiger reproduzierbare Ergebnisse [190]. Wie Dr. Bernd Sehringer in Erfahrung

brachte, stellt die durch CRH stimulierte ACTH-Sekretion zwar eine wichtige

physiologische Funktion dar, ist jedoch im in vitro-Versuch eine schwierig zu

bestimmende Größe [99].

4.3 Methodische Aspekte

Die Übertragbarkeit von in vitro-Versuchen auf die physiologischen Zusammen-

hänge in vivo ist nur eingeschränkt möglich, da immer nur isolierte Teilsysteme

Diskussion 109

betrachtet werden können, die Umgebungsfaktoren und Wechselwirkungen der

einzelnen Parameter außer Acht lassen. Ferner ist bei Untersuchungen zu mutmaß-

lichen Stimulationseffekten einzelner Substanzen kritisch zu hinterfragen, ob die

Wirkung der exogen zugeführten Substanz nicht nur pharmakologische Effekte wider-

spiegelt. Rückschlüsse auf die physiologische Situation im Gesamtorganismus durch

die in vitro gewonnenen Erkenntnisse bleiben somit bis zu einem gewissen Grade

spekulativ.

Erschwerend kommt hinzu, dass in der humanen Geburtsforschung die Studien-

gruppen zwangsläufig sehr klein sind, da die Geburt ein speziesspezifischer Vorgang

zu sein scheint, der durch Tiermodelle nicht hinreichend erklärt werden kann. Die

Probengewinnung beim Menschen ist jedoch aus ethischen Gründen häufig nur einge-

schränkt möglich. So lässt sich z.B. myometriales Fundusgewebe bei Schwangeren

nur gewinnen, wenn im Anschluss an eine Sectio caesarea eine Hysterektomie durch-

geführt wird. Dies kommt sehr selten vor. Die geringe Anzahl vergleichbarer Proben

kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen.

4.3.1 Gewebekultur

Als Untersuchungsobjekt für die in dieser Arbeit beschriebenen Prostaglandin-

Stimulationsversuche diente nicht eine Zellkultur, sondern eine myometriale Gewebe-

kultur, da bei dieser die Gewebearchitektur noch weitgehend erhalten ist. Während es

bei einer Primärzell-Isolierung durch die Isolierungsprozedur und den Gewebeverdau

zu einer Veränderung der Zusammensetzung der Zellpopulation und der Eigen-

schaften der Zellen kommen kann, ist in einer Gewebekultur auch die Erkennung

indirekter Effekte durch parakrine Zell-zu-Zell-Signale möglich. Bei Zellkulturen besteht

eher die Gefahr, dass unerwünschte Effekte durch eine Reaktion der Zellen auf die

Manipulation während der Isolierung hervorgerufen werden. So wurde beispielsweise

von Lonsdale [114] eine starke Aktivierung der Cytokin-Synthese infolge des

Gewebeverdaus beobachtet. Gerade bei Prostaglandin-Untersuchungen könnte dieser

Effekt aufgrund der diversen Interaktionen zwischen Prostaglandinen und Cytokinen

zu verfälschten Ergebnissen führen.

Im Rahmen methodischer Untersuchungen wurden einige Aspekte der Versuchs-

bedingungen für die Kurzzeit-Myometriumkultur modifiziert. Ein Vergleich verschie-

Diskussion 110

dener Kulturmedien ergab bei Verwendung der gepufferten Salzlösung HBSS eine

größere Streuung der 6-keto-PGF1α-Konzentrationswerte innerhalb der Triplikat-

messungen als für das Vollmedium IMDM. Aus diesem Grund wurde entschieden, das

bis dato im Labor etablierte IMDM weiter zu verwenden. Das Umsetzen der

Myometriumbiopsien in frisches Nährmedium nach den ersten 6-7 Stunden der

Inkubation führte im Vergleich zur 6-keto-PGF1α-Sekretion nicht umgesetzter Proben

zu einer deutlichen Konzentrationsabnahme sowie zu einer stärkeren Abnahme der

Gewebevitalität (37,9% versus 50,3%). Daher wurde in späteren Versuchen die Haupt-

inkubationsphase nicht mehr unterteilt.

Die Vitalität der kultivierten Proben ist bei Gewebekulturen ein essentielles

Kriterium für die mögliche zeitliche Ausdehnung der Kultur. In dieser Arbeit durch-

geführte Untersuchungen zeigten eine stetige Abnahme der Gewebevitalität im

Kulturverlauf; nach 22 Stunden war sie bis auf 56% abgesunken. Eine Fortführung der

Kultur über mehr als 24 Stunden hinaus wäre also wenig sinnvoll.

Neben den genannten Vorteilen hat jede Gewebekultur auch klare Nachteile. So

ist ein limitierender Faktor für die Untersuchung der Wirkung exogen hinzugefügter

Substanzen deren begrenzte Eindringtiefe in das Gewebe. Dieser Schwierigkeit wurde

hier entgegengewirkt, indem die Myometriumprobe in kleine Stückchen geschnitten

und CRH im Überschuss hinzugefügt wurde. Außerdem wurde nach der Vor-

inkubationsphase das Kulturmedium gewechselt, um endogene Proteasen auszu-

waschen. Trotz dieser Maßnahmen ist ein proteolytischer Abbau und somit eine

Inaktivierung der hinzugefügten Substanzen vor Erreichen der Zielzellen unter den

durchgeführten experimentellen Bedingungen nicht ganz auszuschließen.

4.3.2 Interindividuelle Unterschiede

Als Kernproblem bei der Auswertung der Prostaglandin-Stimulationsversuche

manifestierten sich starke interindividuelle Schwankungen der Prostaglandin-Konzen-

trationswerte. Dabei wichen die Sekretionsmuster der einzelnen Patientinnen nicht nur

in den Absolutwerten, sondern auch prozentual stark voneinander ab. Auch der

Versuch einer Art internen Korrelation der 6-keto-PGF1α-Messwerte von Phase B auf

Phase A bzw. von Phase A auf die Werte vom Ausgangspunkt der Kultur bei 0

Stunden führte zu keiner einheitlich erkennbaren Zu- bzw. Abnahmetendenz im zeit-

Diskussion 111

lichen Verlauf. Eine mögliche Ursache für die große Schwankungsbreite der

Messwerte könnte in der Heterogenität des untersuchten Patientinnenkollektivs

begründet sein: Zwar wurden alle Myometriumbiopsien bei geplanten Schnitt-

entbindungen nach einem unkomplizierten Schwangerschaftsverlauf und vor

Einsetzen der Wehentätigkeit gewonnen, aber die genaue Phase der uterinen Aktivität,

in der sich die Patientin zum Zeitpunkt der Sectio caesarea befand, blieb unbekannt.

Es ist also ungewiss, ob sich der Uterus bei Gewebeentnahme noch weitgehend in der

Phase der Ruhigstellung, der Aktivierung oder kurz vor Eintritt in die Phase der

Stimulation befand.

Große Unterschiede der Konzentrationswerte verschiedener Patientinnen wurden

auch im Rahmen von CRH-Untersuchungen beschrieben. So fand McLean individuell

stark differierende CRH-Plasmaspiegel [132]. Inzwischen wurde entdeckt, dass die

Zugehörigkeit zu einer bestimmten ethnischen Gruppe mit Unterschieden des CRH-

Niveaus im Plasma einhergeht. Schwarze Amerikanerinnen haben beispielsweise

niedrigere CRH-Spiegel als Frauen anderer ethnischer Gruppen. Dennoch wurde auch

bei ihnen eine Korrelation zwischen einem erhöhten CRH-Spiegel im zweiten

Trimenon und einem erhöhten Frühgeburtsrisiko festgestellt [77]. Diese Erkenntnisse

deuten darauf hin, dass CRH ein sehr spezifischer, aber wenig sensitiver Indikator für

drohende Frühgeburtlichkeit ist, d.h. dass bei einem hohen Plasmaspiegel eine

Frühgeburt wahrscheinlich ist, ein unauffälliger Plasmaspiegel aber die Möglichkeit

einer Frühgeburt nicht ausschließt.

4.3.3 Prostaglandin-Assays

Eine weitere Dimension des Kernproblems der großen Schwankungsbreite der

Prostaglandin-Konzentrationswerte zeigte sich anhand starker Streuungen innerhalb

der Replikatbestimmungen. Der Versuch, diese intraindividuellen Schwankungen

durch Messung des Kulturüberstands einer größeren Anzahl von Parallelansätzen zu

minimieren, schlug fehl. Bei einer Messung von 18 Ansätzen schien sogar eine

Verstärkung des Problems aufzutreten. Ein derartiger zeit- und kostenintensiver

Mehraufwand ist also weder für eine bessere Interpretierbarkeit noch für eine

gesteigerte Reproduzierbarkeit der Stimulationsversuche zielführend. Da diese

Streuungen der Werte zumindest teilweise durch Gewebeinhomogenitäten der

kultivierten Myometriumproben, z.B. durch unterschiedliche Endothelanteile, bedingt

Diskussion 112

sind, ließe sich das Problem durch Untersuchungen in Zellkulturen reduzieren. Die

Verwendung von Myocyten-, Makrophagen- oder Endothel-Primärzellkulturen birgt

jedoch anders geartete Schwierigkeiten: Durch mögliche Veränderung der

ursprünglichen Zelleigenschaften und fehlende Interaktionen zwischen verschiedenen

Zelltypen werden Rückschlüsse auf die physiologische Bedeutung etwaiger CRH-

Wirkungen auf die Prostaglandinsynthese noch schwieriger als bei der Verwendung

von Gewebekulturen (s. 4.3.1).

Die hohe Intraassay-Variabilität der Prostaglandin-EIAs war möglicherweise zum

Teil darauf zurückzuführen, dass die Kontrollproben über die gesamte Mikrotiterplatte

verteilt wurden. Eine lange Pipettierdauer kann einen negativen Einfluss auf die

Messwerte haben, da bei Schritten mit kurzen Inkubationszeiten die ersten und letzten

Proben auf einer Mikrotiterplatte unterschiedlich lange inkubiert werden. In ca. der

Hälfte der Fälle führte eine Berechnung der Intraassay-Variabilität zu besseren

Werten, wenn statt aller 6-8 Kontrollproben nur die ersten vier in die Berechnung

einflossen. Es wäre also in Erwägung zu ziehen, alle Kontrollproben direkt

nacheinander zu pipettieren.

Weitere potentielle Störfaktoren, die zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der

Stimulationsversuche beitragen können, sind Pipettierprobleme, Randeffekte an der

Mikrotiterplatte, z.B. durch einen Temperaturgradienten, und Messungenauigkeiten

des EIA-Readers. Bei den hier beschriebenen Untersuchungen fielen Pipettier-

probleme nicht stark ins Gewicht. Die hauptsächlich verwendete Pipette wies einen

hervorragenden Vk von 1,6% auf, und der „Risikofaktor Mensch“ zeigte mit einem Vk

von 7% eine akzeptable Pipettierleistung. Randeffekte an der Mikrotiterplatte waren

ebenfalls nicht auffällig. Allerdings zeigte der EIA-Reader Messungenauigkeiten. Er

maß immer in der dritten Reihe (D) die höchsten Werte, wie anhand der Messung

einer um 180° gedrehten Mikrotiterplatte gezeigt wurde. Dieses Phänomen ist u.U.

durch ein nicht mehr exakt justiertes Linsensystem aufgrund gealterten Klebstoffs

erklärbar und wurde tatsächlich bei einer Überprüfung des EIA-Readers von der

Herstellerfirma diagnostiziert. Da die sechste Kontrollprobe bei der Plattenbelegung

immer in Reihe D platziert war, ist es nicht verwunderlich, dass in ca. der Hälfte der 6-

keto-PGF1α-Versuche die Intraassay-Variabilität besser wird, wenn nur die ersten vier

Kontrollproben in die Auswertung einfließen.

Diskussion 113

4.4 Ausblick

Obwohl in der vorliegenden Arbeit keine signifikanten CRH-Effekte auf die

myometriale Prostaglandinsynthese beobachtet wurden, können diese aufgrund der

methodisch bedingten starken Streuung der Messwerte dennoch nicht ausgeschlossen

werden. Weiterführende Untersuchungen mit einer verbesserten Methodik sind daher

notwendig:

Für eine größere Präzision der Prostaglandin-Messungen wäre es sinnvoll, einen

neuen EIA-Reader einzusetzen, die verwendeten Pipetten regelmäßig zur Kontrolle

einzuschicken, mit besonderer Sorgfalt zu pipettieren sowie in einer Versuchsreihe

immer die gleichen routinierten Menschen pipettieren zu lassen.

Um einen direkten Bezug zwischen dem histologischen Aufbau des Myometriums

und der Prostaglandin-Sekretion herstellen zu können, sollte die Biopsie einer

Patientin – soweit es die Größe zulässt – jeweils zur Hälfte für die IHC und zur Hälfte

für die Prostaglandin-Untersuchungen in Gewebekultur verwendet werden.

Ferner wäre eine Etablierung von Markerproteinen zur genauen Zuordnung, in

welcher Phase der uterinen Aktivität sich die Patientin befindet, hilfreich, um die

Homogenität des untersuchten Patientinnenkollektivs zu steigern.

Für ein tiefergehendes Verständnis der Mechanismen für eine dynamische

Regulation der CRH-Rezeptor-Subtypen sollten weitere Untersuchungen durchgeführt

werden, um beispielsweise die physiologische Bedeutung der unterschiedlichen

myometrialen G-Proteine und der Regulation und Interaktion ihrer Signaltransduktions-

wege zu eruieren. Auf diesem Gebiet sind noch viele Fragen offen, z.B. zur Bedeutung

des im Myometrium identifizierten Gαi.

Da die Betrachtung von Einzelparametern für umfassende Erkenntnisse im

Zusammenhang mit dem menschlichen Geburtsprozess offensichtlich nicht ausreicht,

könnten cDNA-Microarrays evtl. einen klärenden Beitrag leisten. Allerdings darf dabei

nicht vergessen werden, dass diese Methode lediglich die Beeinflussung der mRNA-

Menge verschiedener Zielgene abbildet, zudem aufwändig, teuer und nicht beweisend

für eine tatsächliche Expression funktionstüchtiger Proteine ist.

Diskussion 114

CRH spielt zweifellos eine wichtige Rolle beim Geburtsprozess. Dennoch bedarf

das Modell einer dualen Funktion dieses Hormons, das für den größten Teil der

Schwangerschaft eine ruhigstellende Wirkung auf den Uterus, in den letzten

Schwangerschaftswochen aber eine aktive Rolle bei kontraktilen Vorgängen postuliert,

weiterer Klärung. Bis zur endgültigen Entschlüsselung der miteinander verwobenen

physiologischen Interaktionen des Geburtsprozesses in all seinen Facetten ist es

sicherlich noch ein weiter, steiniger Weg, der sich jedoch zu gehen lohnt, um die Zahl

der Frühgeburten, die seit Jahren in den westlichen Industrieländern bei einem Anteil

von 7-15% stagniert, weiter zu senken.

Zusammenfassung 115

5 Zusammenfassung

Seit Mitte der Neunziger Jahre wird placentar gebildetem Corticotropin-Releasing

Hormone (CRH) eine wichtige Bedeutung für die hormonelle Steuerung der Geburt

beim Menschen zugemessen. Ziel dieser Arbeit war die in vitro-Untersuchung von

potentiellen parakrinen Effekten von CRH in menschlichem Myometrium zum Zeitpunkt

der Geburt. Dazu wurden in Kurzzeit-Gewebekulturen von Myometrium, das bei

Schnittentbindungen gewonnen wurde, Stimulationsversuche mit CRH mit der Mes-

sung von Prostaglandinen als Endpunkte durchgeführt. Als Nebenaspekte wurden

parallel die Wirkungen des CRH-verwandten Peptids und IL-1β untersucht. Weiterhin

wurde immunhistochemisch das Vorkommen verschiedener Zelltypen im Myometrium

sowie die Verteilung der CRH-Rezeptoren CRH-R1 und CRH-R2 untersucht. Zur

Überprüfung der Bioaktivität des eingesetzten CRH wurde ein Bioassay etabliert.

Ferner wurden im Rahmen der laborinternen Qualitätssicherung methodische Aspekte

im Umgang mit Gewebekulturen und Enzymimmunoassays (EIAs) adressiert.

Myometriumbiopsien aus dem unteren Uterinsegment wurden am Geburtstermin

bei primären Sectiones caesareae gewonnen und in 24-Stunden-Gewebekulturen mit

den Mediatoren CRH, Urocortin, und IL-1β inkubiert. Mittels EIA wurden der stabile

PGI2-Metabolit 6-keto-PGF1α und PGE2 im Medium quantifiziert. CRH, Urocortin und

IL-1β zeigten auf die Freisetzung von 6-keto-PGF1α keinen signifikanten Effekt. Die

Messergebnisse wiesen dabei eine hohe Streuung auf. Die immunhistochemische

Charakterisierung der untersuchten Myometriumproben mit einem Antikörper gegen α-

Aktin ergab einen Myocyten-Anteil von 55-65%. Die Leiomyocyten waren eingebettet

in ein Bindegewebsgerüst mit heterogen verteilten Gefäßen und Makrophagen. CRH-

R1 wurde außer im Bindegewebe in allen anderen Zelltypen der untersuchten

Myometriumproben immunhistochemisch nachgewiesen. CRH-R2 wurde in Myocyten

und Makrophagen, jedoch nicht im Gefäßendothel, angefärbt. Die biologische Aktivität

des eingesetzten CRH wurde durch Stimulierung von ACTH in einer Maus-Hypo-

physen-Zelllinie (AtT20) überprüft.

Der immunhistochemische Nachweis beider CRH-Rezeptoren im menschlichen

Myometrium stützt das Modell, dass placentares CRH über lokale, parakrine

Wirkungen an der hormonellen Steuerung der Geburt beteiligt ist. Im Rahmen der hier

vorgelegten Untersuchungen wurde jedoch kein signifikanter Einfluss auf die

myometriale Prostaglandinsynthese gefunden.

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Abbildungsverzeichnis VI

III Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Bauprinzip der Uterusmuskulatur. ..................................................................... 5

Abb. 2: Phasen der uterinen Aktivität während der Schwangerschaft und Geburt. ....... 9

Abb. 3: Die mütterlichen Plasmaspiegel von CRH und CRH-BP im Schwangerschaftsverlauf. ............................................................................ 13

Abb. 4: CRH-R1 beim Menschen mit seinen Spleißvarianten. .................................... 15

Abb. 5: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei zweigeteilter Hauptinkubationszeit. a) basal (n=5), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=3). .................................................. 40

Abb. 6: Beobachtung der Prostaglandin-Synthese bei nur einer Inkubationsphase. a) basal (n=4), b) nach Zugabe potentieller Stimulanzien (CRH, Urocortin, IL-1β; n=9). ....................................................................................................... 41

Abb. 7: Zeitlicher Verlauf der basalen 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium.......... 61

Abb. 8: Vergleich von IMDM und HBSS als Nährmedium für die Myometriumbiopsien in der Kurzzeit-Gewebekultur anhand der 6-keto-PGF1α-Sekretion.............. 62

Abb. 9: Basale und stimulierte 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (109-113)..... 64

Abb. 10: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die 6-keto-PGF1α-Sekretion im Myometrium (M100). .................................................... 65

Abb. 11: Zeitlicher Verlauf der basalen PGE2-Sekretion im Myometrium (M107)........ 67

Abb. 12: Qualitätsvergleich der Chromogene Romulin (A, C) und DAB (B, D) in immunhistochemischen Färbungen.............................................................. 69

Abb. 13: Immunhistochemischer Nachweis von Gefäßendothel in Myometrium mittels eines Antikörpers gegen vWF. ..................................................................... 70

Abb. 14: Immunhistochemischer Nachweis von Makrophagen im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen CD68..................................................................... 71

Abb. 15: Immunhistochemischer Nachweis von Leiomyocyten im Myometrium mittels eines Antikörpers gegen α-Aktin................................................................... 72

Abb. 16: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten im Myometrium mittels Antikörper-Klon 5B5. .................................................................................... 73

Abb. 17: Misslungener Versuch eines immunhistochemischen Nachweises von Fibroblasten im Myometrium mittels eines Antikörper-Klon 3-2/B12. ........... 74

Abb. 18: Immunhistochemischer Nachweis von Fibroblasten in der Haut mittels Klon 3-2/B12......................................................................................................... 74

Abbildungsverzeichnis VII

Abb. 19: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R1 in Myometrium und Decidua...................................................................................................................... 76

Abb. 20: Artefakte bei immunhistochemischen Färbungen. ........................................ 77

Abb. 21: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 im Myometrium. ............... 78

Abb. 22: Immunhistochemische Lokalisation von CRH-R2 und Makrophagen in Decidua. ....................................................................................................... 78

Abb. 23: Immuncytochemische Lokalisation von CRH- und ACTH-Rezeptoren auf RC-4B/C1-Zellen. ............................................................................................... 79

Abb. 24: Zeitkinetik der basalen ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. .......................... 80

Abb. 25: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen im zeitlichen Verlauf nach Kultivierung in verschiedenen Nährmedien (DMEM und Ham’s F12). ................................. 81

Abb. 26: Stimulation der ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen durch Zugabe von CRH in verschiedenen Konzentrationen (0,1 nM, 1 nM, 10 nM)............................... 82

Abb. 27: ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen bei verschiedenen CRH-Stimulationsversuchen. ................................................................................ 83

Abb. 28: Vergleich des Stimulationseffektes durch „altes“, lyophilisiertes versus „neues“, gelöstes CRH auf die ACTH-Sekretion von AtT20-Zellen. ............. 84

Abb. 29: Vitalität der Myometriumproben im zeitlichen Verlauf der Kurzzeit-Gewebekultur. .............................................................................................. 85

Abb. 30: Einfluss der Inkubationsart in der Kurzzeit-Gewebekultur auf die Vitalität der Myometriumproben. ..................................................................................... 86

Abb. 31: Basale 6-keto-PGF1α-Konzentration im Mediumüberstand von Parallelansätzen in der Kurzzeit-Myometriumkultur. .................................... 87

Abb. 32: Total-RNA von AtT20-Zellen. ........................................................................ 91

Abb. 33: mRNA-Nachweis von CRH-R1 (a) und Cyclophilin (b) in AtT20-Zellen......... 92

Abb. 34: Darstellung der dualen CRH-Funktion mit relaxierenden sowie kontrahierenden Effekten auf das Myometrium. ......................................... 106

Tabellenverzeichnis VIII

IV Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Übersicht über wichtige Prostaglandin-Effekte. ............................................... 19

Tab. 2: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten primären Sectiones...................................................................................................... 34

Tab. 3: Klinische Daten und Gewebeverwendung der termingerechten sekundären Sectiones...................................................................................................... 36

Tab. 4: Inkubationsbedingungen in der Kurzzeit-Gewebekultur von Myometriumbiopsien zur Untersuchung der Prostaglandin-Synthese. ......... 39

Tab. 5: Konzentrationen (in pg/ml) der Prostaglandin-Standards. ............................... 44

Tab. 6: Kreuzreaktivitäten der in den Prostaglandin-EIAs verwendeten Antiseren mit anderen Eicosanoiden.................................................................................. 44

Tab. 7: Verwendete Primerpaare für die RT-PCR. ...................................................... 55

Tab. 8: Schwankungsfaktoren zwischen jeweils dem kleinsten und dem größten Einzelmesswert innerhalb einer Triplikatmessung........................................ 63

Tab. 9: Prozentuale Veränderungen der 6-keto-PGF1α-Konzentration im Verlauf der Kurzzeit-Myometriumkultur........................................................................... 66

Tab. 10: Intra- und Interassayvariabilität der EIAs....................................................... 88

Tab. 11: Berechnung der Intraassayvariabilität der 6-keto-PGF1α-EIAs mit allen versus den jeweils ersten vier Kontrollproben.......................................................... 88

Tab. 12: Kontrolle der im Labor verwendeten Pipetten und Vergleich der Pipettierleistung verschiedener Benutzer. .................................................... 89

Tab. 13: Vergleich von Einzelpipette, Multipette und Mehrkanalpipette und Überprüfung des EIA-Readers. .................................................................... 90

Danksagung IX

V Danksagung

Allen, die zum Entstehen und Gelingen der vorliegenden Arbeit beigetragen haben,

möchte ich meinen herzlichen Dank aussprechen!

Ich danke PD Dr. Wolfgang Schäfer für die Überlassung des Themas und seine Bereit-

schaft, mich trotz zahlreicher anderweitiger Belastungen bei der Niederschrift meiner

Arbeit zu unterstützen.

Prof. Dr. Dr. Ralf Gutwald danke ich für seine ermutigende Reaktion auf die Anfrage und

die Übernahme des Zweitgutachtens.

Bei Dr. Bernd Sehringer bedanke ich mich für die hervorragende fachliche Betreuung, die

praktische Anleitung sowie die vielen produktiven und fröhlichen Stunden im Laboralltag

(und beim Online-„Wer-wird-Millionär“-Spielen).

Den Mitarbeitern des Endokrinologischen und Klinisch-Chemischen Labors danke ich für

die freundliche Aufnahme in ihrer Mitte. Ganz besonders danke ich Eszter Benedek und

Claudia Nöthling, die mich mit viel Geduld, Humor und freundschaftlicher Herzlichkeit in

die praktischen Arbeitsabläufe einwiesen und zusammen mit Ruht Ziegler und Michael

Simon maßgeblich dazu beitrugen, dass die Zeit im Labor zu einer wertvollen Lebens-

erfahrung wurde.

Den Mitarbeitern des Cytologischen Labors danke ich für ihre Hilfe beim Einbetten und

Herstellen der Gewebeschnitte. Ein Dank geht außerdem an Dr. Feuerhake aus der

Neuropathologie für seine Bereitschaft, die ACTH-Färbung zu übernehmen.

Bei den Patientinnen, die ihr Einverständnis zur Entnahme einer Gewebeprobe gaben,

bedanke ich mich, dass sie diese Arbeit überhaupt erst ermöglichten. Danke auch an das

Kreißsaal- und OP-Team für die Unterstützung bei der Probensammlung.

Dr. Martina Weber-Timpe bin ich zu besonderem Dank für die vielen aufschlussreichen

Gespräche verpflichtet, mit deren Hilfe ich irgendwann tatsächlich schreiben konnte.

Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mich jahrelang ohne zu murren in meinen schein-

bar nie enden wollenden Doktorarbeitsbestrebungen unterstützt haben.

Ganz besonders herzlich bedanke ich mich bei meinen Freunden, die mit mir gelitten, sich

über kleinste Fortschritte mit mir gefreut haben und auch aus der Ferne in vielfältigster

Weise für mich da waren. Danke für all die aufbauenden Worte, persönlich, per SMS oder

Telefon, und für die Care-Pakete in der „Endspurt-Phase“. Besonders Astrid Moser und

Dorothee Reinfried danke ich für das tapfere (und schnelle!) Korrekturlesen.

Und schließlich gebührt ein riesengroßes Dankeschön meinem Freund Sven Hamel, der

nie aufgehört hat, an mich zu glauben, nie müde wurde, mich vom Boden wieder

aufzusammeln, meine Launen geduldig ertragen und mich mit tatkräftiger Hilfe in allen

Lebenslagen unterstützt hat, so dass ich diese schwierige Zeit (wider Erwarten) durch-

halten konnte.

Stimulationsversuche mit CRH an menschlichem Myometrium

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