Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase bei Gropferd und

Aus dem Institut für Physiologische Chemie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase

bei Großpferd und Pony

im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

NADINE RIEBANDT

aus Rotenburg / Wümme

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Sallmann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Sallmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 24. 05. 2005

Für meine Eltern

Gisela und Friedemann

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG Seite 1

2. LITERATURÜBERSICHT 2

2.1. Fettstoffwechsel der Equiden 2

2.1.1. Besonderheiten bei Equiden 2

2.1.2. Bedeutung der Lipasen im Fettstoffwechsel des Pferdes 3

2.1.2.1. Die Hormonsensitive Lipase 3

2.1.2.2. Die Hepatische Triglyceridlipase 10

2.1.2.3. Die Lipoprotein Lipase 11

2.1.3. Die Lipoproteine 11

2.1.4. Die Rolle des Insulins 13

2.2. Der Fettstoffwechsel des Pferdes im Hungerzustand 14

2.3. Das equine Hyperlipämie–Syndrom 16

2.3.1. Charakterisierung der Hyperlipämie-Erkrankung 16

2.3.2. Klinische Symptome und veränderte Blutwerte 18

2.3.3. Therapie und Prophylaxe 20

2.3.4. Pathologie und molekulare Pathogenese 21

3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 23

3.1. Material und Methoden 23

3.1.1. Versuchstiere 23

3.1.2. Haltung und Fütterung 24

3.1.3. Probenentnahme 24

3.1.3.1. Probenentnahme am anästhesierten Pony 24

3.1.3.2. Probengewinnung von Schlachttieren (Großpferd und Pony) 25

3.1.4. Transport der Proben 26

3.1.5. Isolierung der Adipocyten 26

3.1.6. Bestimmung der Zellzahl 27

Inhaltsverzeichnis

3.1.7. Live / dead-Färbung 28

3.1.8. Messung der Lipolyserate 30

3.1.8.1. Vorversuche zur Auswahl des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes 30

3.1.8.2. Erstellen einer Eichkurve mittels Palmitinsäure 32

3.1.8.3. Eingesetzter Lipolyseansatz 35

3.1.9. Berechnung der Lipolyserate 37

3.1.10. Verschiedene DBcAMP-Konzentrationen 38

3.2. Statistische Auswertung 38

3.2.1. Deskriptive Statistik 38

3.2.2. Analytische Statistik 39

4. ERGEBNISSE 40

4.1. Vergleich verschiedener DBcAMP-Konzentrationen im Testansatz 41

4.2. Ergebnisse der Messung der Lipolyserate 44

4.3. Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate 49

4.4. Vergleich der in vitro Daten (Schlachtponys) mit ex vivo in vitro Daten

(anästhesierte Ponys des Instituts) für das Inguinalfett

52

4.5. Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate 55

4.6. Lipolyserate in Fettgewebeproben unterschiedlicher Lokalisationen 60

4.7. Vergleich der Lipolyserate in Kontroll-, Noradrenalin- und DBcAMP-

Ansätzen

62

5. DISKUSSION 68

5.1. Versuchsanstellung und Methodik 68

5.1.1. Versuchstiere 68

5.1.2. Schlachtung und Operation 69

5.1.3. Probenmaterial 70

5.1.4. Isolierung der Adipocyten 71

5.1.5. Bestimmung der Lipolyserate 72

5.2. Versuchsergebnisse 73

5.2.1. Die Lipolyserate 73

Inhaltsverzeichnis

5.2.2. DBcAMP als Stimulans der Lipolyse 77

5.2.3. Lipolyseraten bei Schlachtponys und anästhesierten Ponys 78

5.2.4. Der Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate 80

5.2.5. Der Einfluss der Lokalisation des Fettgewebes auf die Lipolyserate 83

5.2.6. Der Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate 85

5.3. Betrachtungen im Zusammenhang mit dem Hyperlipämie-Syndrom 87

6. ZUSAMMENFASSUNG 89

7. SUMMARY 91

8. LITERATURVERZEICHNIS 93

9. ANHANG 115

9.1. Bezugsquellen 115

9.1.1. Verwendete Geräte 115

9.1.2. Medikamente 117

9.1.3. Reagenzien 118

9.2. Stammlösungen 120

9.3. Tabellen 122

Abkürzungsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

In dieser Arbeit wurden die offiziellen Abkürzungen für chemische Elemente, deren

Verbindungen und übliche Einheiten verwendet.

α alpha

Aa. Arteriae

Abb.

AC

Abbildung(en)

Adenylatcyclase

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

ADA Adenosindesaminase

ADRP adipose differentiation-related protein

ANOVA Analysis of Variance

AP Alkalische Phosphatase

Apo Apolipoprotein

AR Adrenorezeptor

AS Aminosäure(n)

AST Aspartat-Aminotransferase

ATP Adenosintriphosphat

β beta

BSA Bovines Serumalbumin

bspw. beispielsweise

BUN

bzw.

blood urea nitrogen

beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

DBcAMP Dibuturyl-cyclisches Adenosinmonophosphat

dl Deziliter


DMF Dimethylformamid

EKG Elektrokardiogramm

et al. und andere (et alii)

FFS Freie Fettsäure(n)

FS

g

Fettsäure(n)

Gramm

GIP

Gi

Gs

Glucose-abhängiges Insulinotropes Polypeptid

inhibierendes G-Protein

stimulierendes G-Protein

γ-GT Gamma-Glutamyltransferase

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

HDL high density lipoprotein, Lipoprotein hoher Dichte

HSL Hormonsensitive Lipase

HTGL Hepatische Triglyceridlipase

i.m. intramusculär

i.v. intravenös

kDa Kilodalton

kg Kilogramm

KGW

KR-Lösung

Körpergewicht

Krebs-Ringer-Lösung

l Liter

LDH Lactatdehydrogenase

LDL low density lipoprotein, Lipoprotein geringer Dichte

LPL

M

Lipoprotein Lipase

Mol

mg Milligramm

min Minuten

ml Milliliter

mM, mmol Millimol

MW Mittelwert

n Anzahl


NA Noradrenalin

NE

NEFA

Norepinephrin

nonesterified fatty acid, nicht veresterte Fettsäure(n)

nm Nanometer

nmol Nanomol

NSAID nonsteroidal antiinflammatory drugs, Nichtsteroidale

Antiphlogistica

PKA Proteinkinase A

pCO2 CO2-Partialdruck

p

s

S

Irrtumswahrscheinlichkeit

siehe

Seite

SDH

s.o.

Sorbitoldehydrogenase

siehe oben

t Zeit

TGL Triglyceride

U Unit

u.a. unter anderem

v.a. vor allem

VLDL very low density lipoprotein, Lipoproteine sehr niedriger

Dichte

Vv. Venae

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

λ Lambda

µl

µmol

Mikroliter

Mikromol

1. Einleitung

1. EINLEITUNG

In ersten Studien zu den stoffwechselphysiologischen Grundlagen der extrem hohen

Blutlipidspiegel bei dem am Hyperlipämie-Syndrom erkrankten Pony haben

BREIDENBACH et al. (1999) eine 7fach erhöhte Empfindlichkeit der in vitro stimulierten

Lipolyseraten von Ponyadipocyten feststellen können. Zur Klärung der molekularen

Grundlagen der Hyperlipämie beziehen sich die Fragestellungen nun auf Faktoren, die eine

hohe Lipolyse auslösen können. Dabei müssen prä- bzw. rezeptoral eintretende Ereignisse

von post-rezeptoralen differenziert werden. Nachdem WRAGE (2002) eindeutig darlegen

konnte, dass Ponys im Vergleich zu Großpferden nicht über eine größere Zahl an zuständigen

β-Rezeptoren auf der Oberfläche der Adipocyten verfügen, wird nun in parallel laufenden

Studien noch abgeklärt, ob die stimulierenden Hormone des Nebennierenmarks (Adrenalin,

Noradrenalin) bei Pony und Pferd in sehr unterschiedlichem Maße zur Verfügung stehen oder

eine unterschiedliche Ausstattung hinsichtlich der inhibierenden α2-Rezeptoren besteht.

Ziel der vorliegenden Studie war es, post-rezeptoral zu prüfen, ob zwischen Pony und

Großpferd Unterschiede bei der direkten Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase (HSL)

durch cAMP existieren.

Zu diesem Zweck wurde den Zellsuspensionen aus isolierten Adipocyten Dibutyryl–cAMP

hinzugefügt und die ablaufende Lipolyse über zwei Stunden fluorophotometrisch gemessen.

Die Untersuchung erfolgte vergleichend sowohl mit Bauch– als auch mit Inguinalfett.

Für die Probengewinnung standen institutseigene Ponys zur Verfügung, denen unter

Vollnarkose subkutanes Fettgewebe aus dem Inguinalbereich entnommen wurde. Auf die

Entnahme von Bauchhöhlenfett wurde bei diesen Tieren verzichtet.

Des Weiteren wurden zur Schlachtung bestimmte Pferde und Ponys zur Beprobung

herangezogen, wobei Gewebe beider Lokalisationen zur Verfügung standen, da sie direkt im

Anschluss an den Schlachtvorgang entnommen werden konnten.

1

2. Literaturübersicht

2. LITERATURÜBERSICHT

2.1. Fettstoffwechsel der Equiden

2.1.1. Besonderheiten bei Equiden

Die mit der Nahrung aufgenommene verdauliche Zellulose wird im Dickdarm der Equiden zu

flüchtigen Fettsäuren (FS) abgebaut. Nach ihrer Absorption dienen sie der Energiegewinnung,

der Synthese von langkettigen FS (aus Acetat und Butyrat) und der Gluconeogenese (aus

Propionat). Die Aufnahme von langkettigen FS mit dem Futter ist gering. Diese können

jedoch von Pferden in Leber und Fettgewebe aus Glucose, Acetat und Butyrat gebildet

werden. Bei überenergetischer, insbesondere Kohlenhydrat-reicher Ernährung, werden aus

Glucose gebildete FS in den Depotfettgeweben gespeichert. Ist die Nahrungszufuhr nicht

ausreichend, werden diese langkettigen FS zur Energiegewinnung mobilisiert

(KOLB 1983).

Shetland-Ponys haben im Gegensatz zu Großpferden einen höheren Gehalt an Freien FS

(FFS) im Blut (KOLB 1983). Dieser ist von der Umgebungstemperatur abhängig. Während

der warmen Monate können weniger FS im Blut nachgewiesen werden als in der kalten

Jahreszeit (ROBIE et al. 1975 b). Daraus ist abzulesen, dass Pferde in der Lage sind, bei Kälte

vermehrt FS zu mobilisieren. Es existieren viele Hinweise in der einschlägigen Literatur, dass

insbesondere Ponys in unterschiedlichen Stresssituationen (Trächtigkeit, Infektion,

Wurminvasion, körperliche Aktivität etc.) schnell und effizient Fettsäuren lipolytisch aus den

Fettdepots freisetzen (FÜRLL u. SCHÄFER 1992; WATSON et al. 1992; HALLEBEEK u.

BEYNEN 2001).

2


2.1.2. Bedeutung der Lipasen im Fettstoffwechsel des Pferdes

2.1.2.1. Die Hormonsensitive Lipase

Die Hormonsensitive Lipase (HSL) ist eine neutrale Hydrolase (YEAMAN 2004), die die

Hydrolyse der Triglyceride (TGL) (s. Abb. 1) katalysiert und dabei eine besondere Spezifität

zu 1-Ester- bzw. 3-Esterbindungen zeigt (FREDRIKSON u. BELFRAGE 1983; LANGIN et

al. 1996).

O

OO O

OO C (CH2)nCH3

C

CCH3(CH2)n

CH3(CH2)n

H3C

H3C

C OO

CH3(CH2)n

O

OO O

OO C (CH2)nCH3

C

CCH3(CH2)n

CH3(CH2)n

O

OO O

OO C (CH2)nCH3

C

CCH3(CH2)n

CH3(CH2)n

OO O

OO C (CH2)nCH3

C

CCH3(CH2)n

CH3(CH2)n

H3C

H3C

C OO

CH3(CH2)n

H3C

H3C

C OO

CH3(CH2)n

H3C

H3C

C OO

CH3(CH2)n

A:

B:

Abb. 1: Chemische Strukturen der Substrate für die Hormonsensitive Lipase (nach Yeaman

2004). A: Triacylglycerol. B: Cholesterolester.

3


Darüber hinaus werden auch Diacylglycerole durch ihre Aktivität zu Monoacylglycerolen

abgebaut (FREDRIKSON et al. 1981; LANGIN et al. 1996). Da die physiologische Rate der

Hydrolyse von Diacylglyceriden wesentlich höher liegt als die der Hydrolyse der TGL, stellt

die Spaltung der Esterbindung am TGL-Molekül durch die HSL den limitierenden Schritt im

Ablauf der Lipolyse dar (FREDRIKSON et al. 1981; LANGIN et al. 1996).

Nach der Struktur stellt dieses Enzym ein Polypeptid dar. Die HSL des Menschen ist zu 82 %

identisch mit der von Ratte und Maus (LANGIN et al. 1996). Sie besteht aus 775

Aminosäuren (AS) mit einer Masse von 88 kDa. Die HSL der Ratte weist 768 AS bei einer

Masse von 84 kDa auf (YEAMAN 1990, 2004).

Die Aktivität des Enzyms wird über seine reversible Phosphorylierung kontrolliert, die an

unterschiedlichen Stellen im Molekül ablaufen kann. Dabei werden drei Bereiche

unterschieden (YEAMAN 2004) (siehe Abb. 2).

4


N CSer 423 Ser 563Ser 565

Ser 659Ser 660

Asp 703His 733

Regulatorischeund basale Untereinheit

C-terminaler BereichN-terminaler Bereich

A: Primärstruktur

B: Strukturelle Bereiche

N CSer 423 Ser 563Ser 565

Ser 659Ser 660

Ser 563Ser 565

Ser 659Ser 660

Asp 703His 733

Regulatorischeund basale Untereinheit

C-terminaler BereichN-terminaler Bereich

A: Primärstruktur

B: Strukturelle Bereiche

Abb. 2: Die Struktur der Hormonsensitiven Lipase mit den drei Bereichen (modifiziert nach

Yeaman 2004).

A zeigt die lineare Aminosäurensequenz der HSL aus Adipocyten. Die Zahlen geben die

Abfolge der Aminosäuren im Enzym der Ratte wieder.

B zeigt die strukturellen Untereinheiten des Enzyms. Der C-terminale Bereich beinhaltet die

basale (Serinrest 565) und die regulatorische (Serinrest 563) Seite (siehe Text).

Die regulatorische Stelle im Molekül ist durch den Serinrest 563 charakterisiert und wird

durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert (OLSSON u. BELFRAGE

1987). Dieser Vorgang wird durch Stimulation der Fettzelle mit lipolytisch wirkenden

Hormonen angeregt (STRALFORS u. HONNOR 1989; YEAMAN 1990). Dabei wird jeweils

ein Mol Phosphat pro Mol der regulatorischen Untereinheit der HSL inkorporiert

(STRALFORS u. BELFRAGE 1983). Das zur Phosphorylierung benötigte Phosphat wird

zuvor vom Adenosintriphosphat (ATP) abgespalten (siehe Abb. 3).

5


Adenylat-

cyclase

G

ß2-Rezeptor

G

α2-Rezeptor

+ _

cAMP

PKA

ATP ADP

Pi

Triacylglycerinlipaseinaktiv

Triacylglycerinlipaseaktiv

Phosphoproteinphosphatase I

ATP Pi ~ Pi

Adenylat-

cyclase

Adenylat-

cyclase

GGG

ß2-Rezeptor

ß2-Rezeptor

GG

α2-Rezeptor

α2-Rezeptor

++ __

cAMP

PKA

ATP ADPATP ADP

Pi





Phosphoproteinphosphatase I

ATP Pi ~ Pi

Abb. 3: Hormonelle Regulation der HSL (Triacylglycerinlipase) des Fettgewebes (nach

Löffler 1999).

α- und β-Rezeptoren regulieren die Aktivität der Adenylatcyclase (AC) und erhöhen oder

erniedrigen so den intrazellulären cAMP-Gehalt. cAMP aktiviert die Proteinkinase (PKA), die

die HSL phosporyliert. Durch die Wirkung der Phosphatase wird die HSL inaktiviert.

cAMP = cyclisches Adenosinmonophosphat. G = G-Protein.

Durch die Phosphorylierung wird die HSL in den aktiven Zustand versetzt. Eine Erhöhung

der Aktivität der cAMP-abhängigen PKA durch Stimulation der Fettzelle ist also mit einer

vermehrten Phosphorylierung der HSL und folglich mit einer gesteigerten Lipolyserate

verbunden (STRALFORS u. HONNOR 1989).

6


Werden Adipocyten dagegen ohne lipolytische Hormone inkubiert, so dass keine zusätzliche

Aktivierung der PKA stattfindet, kommt es zur Phosphorylierung des Serinrestes 565 der

basalen Untereinheit des Enzyms (OLSSON u. BELFRAGE 1987). Ihr Serinrest ist Teil einer

Dreiergruppe, die außerdem Reste von Aspartat und Histidin enthält (siehe Abb. 2) (LANGIN

et al. 1996; YEAMAN 2004). Die Phosphorylierung der basalen Untereinheit hat zwar keinen

Einfluss auf die Aktivität der HSL (OLSSON u. BELFRAGE 1987; YEAMAN 1990),

dennoch kann dieser Vorgang eine regulierende Funktion auf den Fettabbau ausüben, denn

die Phosphorylierung der einen Seite (regulatorisch oder basal) verhindert vollständig die der

anderen Seite (YEAMAN 1990; LANGIN et al. 1996; YEAMAN 2004). Das heißt

beispielsweise, wenn die basale Seite phosphoryliert ist, dann ist die regulatorische Seite nicht

zugänglich für die cAMP-abhängige PKA, so dass die Lipase nicht aktiviert werden kann. Auf

diese Weise wird ein antilipolytischer Effekt auf die HSL ausgeübt (GARTON et al. 1989).

Der dritte Bereich ist die N-terminale Untereinheit, deren Funktion unklar ist. Vermutet wird

eine Interaktion mit anderen Proteinen und die Vermittlung einer Bindung an Lipide

(YEAMAN 2004).

Nicht nur die Phosphorylierung der Serinreste übt eine Kontrolle über den aktiven Zustand

der HSL aus. Auch die örtliche Verschiebung innerhalb der Fettzelle und die Interaktion mit

anderen Proteinen nimmt Einfluss. So ist das Enzym unter basalen Bedingungen im Cytosol

lokalisiert, wandert jedoch nach lipolytischer Stimulation der Zelle zur Oberfläche des

intrazellulären Fetttröpfchens (YEAMAN 2004). Diese Ortsveränderung ist bspw. bei älteren

Ratten verringert (EGAN et al. 1992; CLIFFORD et al. 2000), woraus eine geringere

Lipolyserate resultiert.

Wie die HSL nach ihrer Aktivierung an Fetttröpfchen bindet, ist noch unklar, da die Struktur

keine hydrophoben Regionen aufweist, die eine Affinität erklären könnten (LANGIN et al.

1996). Es ist jedoch anzunehmen, dass für die Bindung so genannte Perilipine verantwortlich

sind. Dabei handelt es sich um spezifische, Adipocyten-assoziierte Proteine, die

möglicherweise als Andockstellen für die HSL fungieren (GREENBERG et al. 1991). Die

hydrophoben Perilipine werden ebenfalls nach Stimulation der Adipocyten durch lipolytische

Hormone über die cAMP-abhängige PKA phosphoryliert (LANGIN et al. 1996). Durch die

7


Phosphorylierung dissoziieren sie vom Lipid, so dass die HSL Zugang zu diesem erhält

(CLIFFORD et al. 2000). Damit üben auch Perilipine unter basalen Bedingungen einen

hemmenden Einfluss auf die Lipolyse aus (BRASAEMLE et al. 2000). Nur die parallele

Phosphorylierung von Perilipinen und der HSL machen die Andockung des Enzyms an die

Fetttröpfchen möglich, da nur die aktive HSL am Lipid binden kann (YEAMAN 2004).

Neben Perilipin existieren weitere Lipid bindende Proteine. Das ADRP (adipose

differentiation-related protein) befindet sich ebenfalls in der Nähe der Lipidtropfen, kommt

jedoch nur in Vorläuferzellen der Adipocyten vor. In reifen Fettzellen wird es durch das

Perilipin ersetzt (BRASAEMLE et al. 1997). Des Weiteren wird das so genannte Lipotransin

(SYU u. SALTIEL 1999) ebenfalls über die PKA phosphoryliert. Lipotransin ist noch nicht

weitergehend erforscht worden, so dass nur wenig über dessen Funktion bekannt ist

(YEAMAN 2004).

Für die Phosphorylierung der HSL sind mehrere Proteinkinasen (PK) verantwortlich

(OLSSON et al. 1986; GARTON et al. 1989) (siehe Abb. 4).

8


cAMP-abhängige Proteinkinase

cGMP-abhängige Proteinkinase

AMP-aktivierte Proteinkinase

Ca++/Calmodulin-abhängige Proteinkinase

GSK 4

- Met – Arg – Arg - Ser563 – Val - Ser565 – Glu – Ala -

Seite 1 Seite 2(regulatorisch) (basal)

cAMP-abhängige Proteinkinase

cGMP-abhängige Proteinkinase

AMP-aktivierte Proteinkinase

Ca++/Calmodulin-abhängige Proteinkinase

GSK 4

- Met – Arg – Arg - Ser563 – Val - Ser565 – Glu – Ala -

Seite 1 Seite 2(regulatorisch) (basal)

Abb. 4: Sequenz der HSL der Ratte und Serinreste, an denen die Phosphorylierung stattfindet

(nach Yeaman 1990). cAMP = cyclisches Adenosinmonophosphat. cGMP = cyclisches

Guanosinmonophosphat. AMP = Adenosinmonophosphat. GSK = Glycogen-Synthase-Kinase.

Während auf der regulatorischen Seite die cAMP-abhängige PKA agiert, wirken auf der

basalen Seite die Ca2+ / Calmodulin-abhängige PK II, die Glykogen Synthase-Kinase 4 und

die 5´-AMP-aktivierte PK (YEAMAN 1990; LANGIN et al. 1996), wobei letztere in vivo die

größte Rolle spielt (YEAMAN 2004).

Wie aus Abb. 3 ersichtlich wird, ist die HSL Substrat für Phosphoproteinphosphatasen, durch

deren Wirkung das Enzym inaktiviert wird, indem die Phosphatgruppe abgespalten wird.

Hierfür sind die Phosphatasen 1, 2A und 2C verantwortlich (LANGIN et al. 1996). Sie

dephosphorylieren sowohl den regulatorischen als auch den basalen Bereich im Molekül der

HSL, wobei jede der drei Phosphatasen eine größere Affinität zum basalen Bereich zeigt

(OLSSON u. BELFRAGE 1987; YEAMAN 1990). Gemäß OLSSON u. BELFRAGE (1987)

ist die Aktivität der Phosphatase 1 auf der basalen Seite um 20 % und die der Phosphatasen

2A und C sogar um 80 % höher als im regulatorischen Bereich. Die Phosphatase 2B hat

dagegen keinen Einfluss auf die HSL (STRALFORS u. HONNOR 1989).

9


Insulin fördert die Phosphatasen, denn es verursacht eine Dephosphorylierung der HSL im

regulatorischen Epitop, in deren Folge die Aktivität der Lipase abnimmt (OLSSON u.

BELFRAGE 1987; STRALFORS u. HONNOR 1989).

Die HSL ist nicht nur im Fettgewebe nachgewiesen, sondern wurde auch in anderen Geweben

gefunden, wie z.B. Corpus luteum, Hoden, Herz, Nebennieren, Milchdrüse, Skelettmuskel

(COOK et al. 1983; HOLM et al. 1987; SMALL et al. 1991; YEAMAN 2004), sowie in der

Mukosa des Dünndarms (GROBER et al. 2003) und in β-Zellen des endokrinen Pankreas

(MULDER et al. 1999). Dagegen scheint diese Lipase in Leber und Niere nicht vorzukommen

(HOLM et al. 1987).

In diesem Zusammenhang soll noch erwähnt sein, dass die HSL nicht nur gegenüber Lipiden

aktiv ist, sondern ihre Wirksamkeit auch bezüglich Cholesterolestern entfaltet (s. auch Abb. 1

B) (YEAMAN 1990, 2004). Dies ist wichtig in Bezug auf die Bereitstellung von freiem

Cholesterol als Vorstufe für die Synthese von Steroiden in entsprechenden Geweben, wie

z.B. dem Corpus luteum (COOK et al. 1983).

2.1.2.2. Die Hepatische Triglyceridlipase

Die Leber stellt mit der Hepatischen Triglyceridlipase (HTGL) ein eigenes Enzym zur

Hydrolyse von TGL-reichen Lipoproteinen wie Chylomikronen- und VLDL-remnants und

Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) bereit (JACKSON u. McLEAN 1991). Es ist an der

sinusoidalen Oberfläche der Hepatocyten lokalisiert (TARRANT et al. 1998). Auch auf dieses

Enzym nimmt das Insulin in aktivierender Weise Einfluss.

Die Aktivität der HTGL ist im Plasma hyperlipämischer Ponys erhöht (WATSON et al.

1992).

10


2.1.2.3. Die Lipoprotein Lipase

Die Lipoprotein Lipase (LPL) ist in vielen Geweben des Körpers präsent, v.a. in Fettgewebe

und Muskulatur, während sie in der Leber nicht nachgewiesen wurde. Das Enzym ist an der

luminalen Seite des Endothels der Gefäße lokalisiert und ist dort über die Bindung an

Heparansulfatproteoglycane in der Gefäßwand verankert (CAMPS et al. 1990; BRAUN u.

SEVERSON 1992).

Als Substrate dienen der LPL Chylomikronen und Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL).

Das Enzym katalysiert die hydrolytische Spaltung der darin enthaltenen TGL. Die

entstehenden Freien Fettsäuren (FFS) können von anderen Geweben aufgenommen und zur

Energiebereitstellung genutzt werden (SCHMIDT et al. 2001). Damit hat die LPL eher die

Aufgabe, Lipidsubstanzen in der Peripherie des höheren Organismus zu verteilen, während

die bislang betrachteten Lipasen direkt den Abbau der TGL bewirken.

Die Aktivität der LPL wird im Fettgewebe hormonell reguliert. Insulin und das Glucose-

abhängige Insulinotrope Polypeptid (GIP) sind in der Lage, das Enzym zu stimulieren

(NAYLOR 1982 a; ROBINSON u. SPEAKE 1989).

Durch die intravenöse Gabe von Heparin ist es möglich, die LPL aus ihrer Verankerung am

Endothel zu lösen (BENSADOUN 1991) und darüber ebenfalls eine Steigerung ihrer

Aktivität im Blut zu erreichen. Diese Wirkung des Heparins macht man sich bei der Therapie

der Hyperlipämie zunutze, obwohl ein derartiges Vorgehen fragwürdig ist, da bei betroffenen

Ponys die Aktivität des Enzyms bereits erhöht ist (WATSON et al. 1992).

2.1.3. Die Lipoproteine

Die Lipoproteine sind in drei Klassen einzuteilen, so dass Lipoproteine hoher Dichte (high

density lipoprotein, HDL), niedriger Dichte (low density lipoprotein, LDL) und sehr niedriger

Dichte (very low density lipoprotein, VLDL) unterschieden werden. Hinzu kommen die

Chylomikronen, die nach der Absorption von Nahrungsbestandteilen von Darmepithelien in

die Galle sezerniert werden und TGL zur Leber transportieren. Bei gefasteten Individuen sind

Chylomikronen in der Regel nicht nachweisbar. Die Lipoproteine werden durch die LPL

gespalten und die entstehenden FFS werden von den Geweben aufgenommen und gespeichert

oder dienen als Energielieferanten (McCULLAGH 1978). Die LDL lassen sich weiter in

11


Unterklassen gliedern (LDL1, LDL2, LDL3), die sich in der aufgezählten Reihenfolge durch

eine abnehmende TGL-Masse und einen zunehmenden Gesamtcholesterolgehalt auszeichnen.

Es ist anzunehmen, dass auch bei den HDL Untergruppen bestehen (WATSON et al. 1991).

Da die Lipide nicht wasserlöslich sind, werden sie im Plasma an Apolipoproteine (Apo)

gebunden, wobei das jeweilige Apoprotein für das entsprechende Lipid charakteristisch ist.

Bspw. enthalten VLDL und LDL der Pferde das Apo B, HDL werden an Apo A-I gebunden

(WATSON et al. 1991).

Die dominierende Lipoproteinfraktion bei Tieren sind die HDL, beim Menschen dagegen

herrschen die LDL vor, gefolgt von VLDL und HDL (McCULLAGH 1978). Beim Pferd

nehmen die HDL etwa 61 % an der Gesamtmasse der Lipoproteine ein, die VLDL ca. 24 %.

Die LDL haben mit ungefähr 15 % den geringsten Anteil (WATSON et al. 1991). ROBIE et

al. (1975 a) ermittelten ähnliche Werte.

Bei gesunden Equiden sind im Plasma nur wenige VLDL vorhanden (McCULLAGH 1978;

BAUER 1983). Die Gehalte im Plasma gesunder Ponys liegen jedoch höher als die bei

Großpferden, während die Konzentrationen für LDL und HDL bei beiden Spezies etwa gleich

sind (WATSON et al. 1990, 1991).

Entzieht man Ponys für einige Zeit die Nahrung, ergeben sich keine Unterschiede bezüglich

der Gehalte an LDL und HDL verglichen mit gefütterten Tieren. Die Fraktion der VLDL

steigt jedoch an und es wurde eine veränderte Zusammensetzung nachgewiesen. Die VLDL

gehungerter Tiere sind größer, sie enthalten mehr Cholesterol und weniger Protein (BAUER

1983; FRANK et al. 2002).

Über einen Anstieg von leichten Lipoproteinfraktionen bei Nahrungskarenz wird auch bei

anderen Spezies berichtet. So kommt es bei Ratten nach Hungerphasen ebenfalls zum Anstieg

der VLDL, bei Kaninchen zusätzlich zu einer Erhöhung der LDL (ALADJEM u. RUBIN

1954). Bei Menschen kommt es zu einer signifikanten Zunahme der LDL, wohingegen die

Konzentrationen von HDL kaum verändert sind (RUBIN u. ALADJEM 1954). Bei Hunden

und Katzen bleibt eine derartige Reaktion auf Nahrungskarenz offensichtlich aus

(McCULLAGH 1978).

Für die Konzentrationen der Lipoproteine im Plasma ist auch die Körperkondition des Tieres

ausschlaggebend. WATSON et al. (1990) stellten bei ihren Untersuchungen an Eseln fest,

dass die Gehalte an VLDL positiv mit dem Körpergewicht korreliert sind. Je dicker die Esel

12


waren, desto höher waren die VLDL-Werte. Für LDL und HDL gilt dieser Zusammenhang

nicht, die Konzentrationen waren unabhängig vom Körpergewicht der Tiere gleich.

Während der Trächtigkeit steigen die TGL im Plasma bei Ponys in Form von HDL und

VLDL an. Auch hier sind die VLDL TGL-reicher und ärmer an Protein, so dass sie denen

während des Fastens ähneln. Nach dem Abfohlen ist die Aktivität der LPL erhöht und somit

sinkt die VLDL-Konzentration wieder (WATSON et al. 1993).

Erkranken Ponys an Hyperlipämie, kommt es zu einem drastischen Anstieg der VLDL

(WATSON et al. 1990), weil die Leber ihre Synthese aufgrund der massiven Fettmobilisation

verstärkt (McCULLAGH 1978). WATSON et al. (1992) begründen diese Erhöhung mit dem

Auftreten einer weiteren VLDL-Fraktion (VLDL1), die bei gesunden Tieren nicht vorkommt.

Sie weist die oben erwähnten Veränderungen in der Zusammensetzung auf (größerer

Durchmesser, mehr TGL, weniger Protein) und unterscheidet sich auch in Bezug auf ihre

Apolipoproteine von denen gesunder Tiere. Die Gehalte an LDL und HDL sind dagegen bei

hyperlipämischen Tieren unverändert.

2.1.4. Die Rolle des Insulins

Das Peptidhormon Insulin wird bei Nahrungsaufnahme aus den β-Zellen des Pankreas

sezerniert. Hauptreize für seine Freisetzung stellen dabei erhöhte Blutglucose-, Aminosäuren-

(AS) und FFS-Konzentrationen dar.

Der physiologische Effekt des Insulins ist die Hemmung der durch Catecholamine induzierten

Lipolyse (Antilipolyse). Die antilipolytische Wirkung des Hormons erfolgt über die

Reduzierung der Phosphorylierung der HSL (NILSSON et al. 1980). Dabei kommt es nach

Bindung des Peptids an eigene Rezeptoren in der Membran der Fettzellen zur Aktivierung der

Phosphodiesterase (cAMP-cGI-PDE). Diese verursacht die Abnahme des intrazellulären

cAMP-Spiegels und folglich eine Reduzierung der Aktivität der cAMP-abhängigen PKA.

Daraus resultieren eine verminderte Phosphorylierung und gesenkte Aktivität der HSL

(ERIKSSON et al. 1995; BREIDENBACH et al. 1999). Darüber hinaus steigert es die

Funktion der LPL, was zu einer erhöhten Clearance der TGL aus dem Plasma führt

(FREESTONE et al. 1991). Die Wirkung des Insulins wird durch Corticosteroide (permissive

lipolytische Aktivität der Corticoide) antagonisiert (WEINBERG 1987).

13


In Studien haben sich Ponys verglichen mit Großpferderassen als insulinresistent erwiesen

(JEFFCOTT et al. 1986), wodurch die Entstehung von Hufrehe und Hyperlipämie begünstigt

wird. Insulinresistenz bezieht sich in diesem Zusammenhang auf die geringere

Empfindlichkeit der Zellen gegenüber diesem Hormon und beschreibt einen Zustand, in dem

für das Auslösen biologischer Reaktionen eine höhere Konzentration notwendig ist als üblich

(FREESTONE et al. 1991). Besonders stark ausgeprägt ist diese Insulinresistenz bei Ponys,

die an Hufrehe erkrankt sind oder sich in einem adipösen Ernährungszustand befinden

(COFFMAN u. COLLES 1983; JEFFCOTT et al. 1986).

Die Insulinresistenz ist laut JEFFCOTT et al. (1986) vermutlich Resultat einer natürlichen

Selektion, in deren Folge sich Ponys in freier Wildbahn an eine ungenügende

Futterversorgung anpassen konnten. Zur Verteilung der Kohlenhydrate in die Muskulatur war

eine reduzierte Insulinaktivität erforderlich. Mit der Domestikation der Ponys ging erhöhte

Kolenhydratfütterung einher, was nunmehr – unter noch bestehender Insulinresistenz - zur

Umleitung großer Kohlenhydratmengen in die Leber und deren Umbau in TGL führte. Nach

Transport der TGL mittels VLDL in das Blut ist die Hyperlipämie eine logische Konsequenz

(JEFFCOTT et al. 1986).

Auch bei Menschen, die eine Hypertriglyceridämie aufweisen, wird über Insulinresistenz

berichtet (STEINER et al. 1984).

2.2. Der Fettstoffwechsel des Pferdes im Hungerzustand

Futterrestriktion, experimentell herbeigeführt, haltungs- oder krankheitsbedingt auftretend,

führt zur Mobilisierung von Depotfett. Dies ist vor allem die Folge der Aktivitätssteigerung

der HSL durch erhöhte Catecholamin- und Glucagonspiegel (WATSON u. LOVE 1994). In

diesem Zusammenhang werden FS und Glycerol an das Blut abgegeben. Beim Pferd sind

dies, wie auch bei anderen Spezies, vorwiegend langkettige FS (KOLB 1983). Die FS werden

an Albumin gebunden zur Leber und anderen Organen transportiert, wo sie entweder als

Energielieferanten dienen oder in unterschiedlichen Anteilen im Lebergewebe zu TGL

verestert werden. Die so entstandenen TGL werden in VLDL verpackt und wieder an das Blut

abgegeben (BAUER 1983; WATSON u. LOVE 1994). Bei Überforderung der VLDL-

14


Synthese bleiben TGL-Anteile in der Leber zurück und können zur Entstehung der Fettleber

Anlass geben. Der höchste Anstieg an Serumlipiden in und nach Hungerperioden ist bei den

TGL zu verzeichnen, Cholesterol steigt in einem geringeren Ausmaß (NAYLOR et al. 1980;

BAUER 1983). Dabei ist bemerkenswert, dass die Veränderung der TGL-Gehalte im Serum

bei Pferden geringer ausfällt als bei Ponys (NAYLOR et al. 1980; JEFFCOTT et al. 1986).

Die Zunahme, die sich für die VLDL ergibt, zeigt sich nicht bei den HDL und LDL. Ihre

Konzentrationen bleiben unverändert (BAUER 1983; FREESTONE et al. 1991).

Beim Vergleich mit anderen Tierarten ergab sich, dass Schweine und Ponys ähnliche Werte

für Cholesterol und FFS im Serum aufweisen. Bei Nahrungskarenz steigen die Komponenten

bei beiden Spezies an, bei Ponys jedoch erheblich schneller und zu höheren Maximalwerten.

Sehr ähnlich verhält es sich mit den TGL, mit dem Unterschied, dass sich deren

Konzentration im Blut unter Normalbedingungen auf einem niedrigeren Level einstellt als bei

Schweinen (BAETZ u. PEARSON 1972). Auch bei Ratten und Menschen wird durch

Nahrungsentzug eine Erhöhung der FFS ausgelöst, bei Ratten verdoppelt sich ihre

Konzentration im Serum innerhalb von 24 Stunden (SZTALRYD u. KRAEMER 1994 b).

Die Veränderungen hinsichtlich der Blutparameter bei hungernden Ponys sind zwar

grundsätzlich in der beschriebenen Richtung ausgelenkt, andererseits kann das Ausmaß der

Veränderungen einzelner Komponenten bei den Individuen sehr stark variieren (MORRIS et

al. 1972).

Auffallend am Hungerstoffwechsel der Equiden ist, dass Ketonkörper während

Fastenperioden nicht ansteigen, weder im Blut noch im Harn. Auch bei Tieren, die an

Hyperlipämie erkrankt sind, kommt es nicht zur Ausbildung einer Ketonämie (GAY et al.

1978; NAYLOR et al. 1980; ROSE u. SAMPSON 1982; KOLB 1983). Es ist anzunehmen,

dass Pferde nur über eine geringe Fähigkeit zur Ketonkörpersynthese verfügen. Dies könnte

eventuell eine mögliche Erklärung dafür sein, dass die Mobilisation von FS bei Ponys sehr

leicht zur Ausbildung einer Hyperlipämie führt und nicht zu einer Ketose, wie sie unter den

genannten Bedingungen bei Rindern und Schafen auftritt (WATSON et al. 1992).

15


2.3. Das equine Hyperlipämie–Syndrom

2.3.1. Charakterisierung der Hyperlipämie-Erkrankung

Bei der Hyperlipämie handelt es sich um eine Entgleisung des Fettstoffwechsels, über die

erstmals 1969 von SCHOTMAN u. WAGENAAR bzw. SCHOTMAN u. KRONEMAN

berichtet worden ist. Sie ist weltweit verbreitet (ERIKSEN u. SIMESEN 1970; GAY et al.

1978; NAYLOR et al. 1980; BARDIES et al. 1981; GILBERT 1986; FÜRLL u. SCHÄFER

1992; WATSON et al. 1992). Ihre Inzidenz beträgt etwa 5 % (WATSON u. LOVE 1994).

Betroffen sind in besonderem Maße Shetland–Ponys (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a) und Esel

(FORHEAD et al. 1994; WATSON u. LOVE 1994; TARRANT et al. 1998), aber auch andere

Ponyrassen wie z.B. Miniponys (MOORE et al. 1994; MOGG u. PALMER 1995), Welsh–

Mountain–Ponys (WATSON et al. 1992) und Australische Ponys (JEFFCOTT u. FIELD

1985 b). Äußerst selten manifestiert sich die Erscheinung bei Großpferden (NAYLOR et al.

1980; FIELD 1988; DUNKEL u. McKENZIE 2003).

Das Geschlecht nimmt ebenfalls Einfluss auf das Geschehen dieser Stoffwechselstörung. Es

erkranken hauptsächlich Stuten (FÜRLL u. SCHÄFER 1992), selten jedoch Wallache oder

Hengste (WATSON et al. 1992), was auf die hormonelle Beeinflussung des Stoffwechsels bei

Stuten, vor allem durch das Progesteron, zurückgeführt wird (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a).

Betroffene weibliche Tiere befinden sich zudem in der Mehrzahl der Fälle in Laktation oder

im späten Stadium der Trächtigkeit (GAY et al. 1978; BARDIES et al. 1981; JEFFCOTT u.

FIELD 1985 a).

Eine Altersdisposition scheint es nicht zu geben (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; FÜRLL u.

SCHÄFER 1992), da die Hyperlipämie in allen Altersstufen vorkommt. Bei Jungtieren ist sie

allerdings eher rar (GILBERT 1986; MOORE et al. 1994; HUGHES et al. 2002) und wird

selten bei Tieren unter 18 Monaten beobachtet (WATSON u. LOVE 1994), da hier offenbar

prädisponierende Faktoren wie Krankheit oder erhöhte Anforderungen an den Stoffwechsel

durch Leistung fehlen und Depotfett wenig ausgebildet ist (HUGHES et al. 2002).

Als weiterer begünstigender Faktor gilt der Ernährungszustand. Es sind besonders Tiere

betroffen, die einen guten, zumeist jedoch adipösen Zustand aufweisen (SCHOTMAN u.

KRONEMAN 1969; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a).

16


ROBIE et al. (1975 b) und WATSON et al. (1992) nennen darüber hinaus eine jahreszeitlich

bedingte Häufung, wonach die Hyperlipämie in kalten Monaten vermehrt beobachtet wird als

in warmen.

Kennzeichnend für die Hyperlipämie ist eine Erhöhung von VLDL, TGL und FFS im Plasma

(WATSON u. LOVE 1994). Normalwerte von TGL im Plasma gesunder Tiere liegen

zwischen 6–78 mg / dl (NAYLOR 1982 b), wobei zwei Ausnahmen zu berücksichtigen sind.

Nach WATSON et al. (1990) kann die Konzentration bei gesunden Eseln bis zu 290 mg / dl

betragen und bei Ponystuten gegen Ende der Trächtigkeit auf Werte um 250 mg / dl ansteigen

(WATSON et al. 1993), ohne dass krankhafte Veränderungen auftreten.

Je nach Ausmaß der TGL–Erhöhung werden in der Literatur die Begriffe Hyperlipidämie und

Hyperlipämie unterschieden, wobei NAYLOR (1982 b) ersteres als milde Lipämie

bezeichnet, der sowohl die Opaleszenz des Plasmas als auch eine Dysfunktion der Leber

fehlen. TGL sind zwar erhöht, jedoch bleiben die Werte unter 500 mg / dl. Im Gegensatz dazu

definiert er die Hyperlipämie als einen Zustand, bei dem die Plasma–TGL–Werte auf weit

über 500 mg / dl ansteigen, eine Leberschädigung in Form der Fettinfiltration vorliegt und das

Plasma eine milchig–trübe, opake Erscheinung aufweist.

Die Hyperlipämie tritt selten als eigenständige Primärerkrankung in Erscheinung (FÜRLL u.

SCHÄFER 1992), sondern ist vielmehr als sekundäre Komplikation einer zugrunde liegenden

Erkrankung zu sehen, wobei hier v.a. Beeinträchtigungen des Magen–Darm–Traktes eine

Rolle spielen (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969; WATSON u. LOVE 1994), gefolgt von

Hufrehe. Eine seltene Ursache entdeckte NAYLOR (1982 b), der über eine durch einen

Tumor der Hirnanhangsdrüse ausgelöste Hyperlipämie eines Ponys berichtet. Ein Rückgang

der Futteraufnahme bis hin zum Sistieren, wie es bei der Entstehung der Hyperlipämie üblich

ist, fehlt bei dieser Primärerkrankung. Betroffene Tiere haben einen normalen oder sogar

gesteigerten Appetit. Der Grund für die Mobilisierung des Depotfettes liegt also nicht in einer

Anorexie, sondern vielmehr in hormonellen Imbalancen bedingt durch die tumoröse

Entartung der Hypophyse.

Die Prognose dieser Erkrankung hängt nicht nur von der Schwere der Hyperlipämie ab,

sondern auch von der auslösenden Primärkrankheit (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969).

Im Allgemeinen ist sie jedoch als schlecht zu bewerten. Die Mortalität liegt bei 60–80 %

17


(JEFFCOT u. FIELD 1985 a), bei Eseln mit bis zu 95 % sogar noch höher (TARRANT et al.

1998).

Die Diagnose sollte über eine Blutuntersuchung gesichert werden, wobei sowohl der

Plasmagehalt von Gesamtlipiden, TGL, FFS und Glycerol bestimmt als auch Nieren– und

Leberwerte (Kreatinin, Alkalische Phosphatase, AST, SDH, LDH) untersucht werden sollten.

Denn klinische Störungen treten ab einer Gesamtlipidkonzentration von 5 g / l auf, diese

Grenze wird jedoch makroskopisch noch nicht durch die typischen Plasmaveränderungen

sichtbar (FÜRLL u. SCHÄFER 1992).

2.3.2. Klinische Symptome und veränderte Blutwerte

Die klinischen Symptome der Hyperlipämie sind unspezifisch (NAYLOR 1982 a; FÜRLL u.

SCHÄFER 1992), nicht pathognomonisch (SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969) und

resultieren aus dem durch Fettinfiltration bedingten Leber– und Nierenversagen (siehe

Pathologie) (WATSON u. LOVE 1994). Nach JEFFCOTT u. FIELD (1985 a) werden sie in

schwerer Ausprägung ab einer Serum–TGL–Konzentration von > 500 mg / dl deutlich.

Die anfängliche Inappetenz kann sich zu völliger Anorexie steigern (GAY et al. 1978), die

Tiere erscheinen unfähig zu schlucken (ERIKSEN u. SIMESEN 1970) und verweigern z.T.

die Tränkeaufnahme, es kommt zum Verfall der körperlichen Kondition (JEFFCOTT u.

FIELD 1985 a). Sie sind schläfrig bis stuporös, zeigen Inkoordination der Bewegung (Ataxie)

und Muskelzittern, die Körpertemperatur ist z.T. erhöht (38,5–41°C), Tachykardie und

Tachypnoe sind zu beobachten, in einigen Fällen kommt es zum Festliegen (GAY et al.

1978).

Darmgeräusche sind ebenso verringert (GAY et al. 1978) wie die Kotmenge oder es stellt sich

eine schwere Diarrhoe ein (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969). Koliksymptome treten auf,

die bei Abwesenheit einer Magen–Darm-Erkrankung aus der Schwellung der Leber und der

damit verbundenen Dehnung ihrer Kapsel resultieren. Im Bauchbereich entstehen Ödeme

(WATSON u. LOVE 1994).

Des Weiteren berichten SCHOTMAN u. KRONEMAN (1969) von EKG–Veränderungen,

deren klinische Manifestationen als „Hegglin–Syndrom“ bezeichnet werden und von

DEEGEN (1972) mit der Hyperlipämie in Verbindung gebracht wurden.

18


Betroffene Tiere weisen ikterische oder zyanotische Schleimhäute sowie Foetor ex ore auf

(SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969).

Bei tragenden Tieren kann es, meist im Endstadium der Erkrankung, zum Abort kommen

(WATSON u. LOVE 1994).

Insgesamt zeigt die Hyperlipämie einen schnellen Verlauf und führt innerhalb von sechs bis

zehn Tagen zum Tod (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a).

Plasma hyperlipämischer Tiere zeigt sich milchig–trüb und opak, zuweilen ist ein

Blauschimmer erkennbar, der durch die Lichtstreuung der VLDL verursacht wird, deren

Gehalt, ebenso wie der von TGL, FFS und Cholesterol, erhöht ist (SCHOTMAN u.

WAGENAAR 1969; NAYLOR 1982 a). Da diese Veränderungen in leichteren Fällen mit

bloßem Auge noch nicht erkennbar sind, sollte eine Blutuntersuchung durchgeführt werden

(FÜRLL u. SCHÄFER 1992). Von besonderem Interesse sind dabei Leber– und Nierenwerte.

So sind aufgrund der Organschädigung die Plasmaaktivitäten von γ-GT, AP, LDH und SDH

erhöht (WATSON u. LOVE 1994), die Synthese von Gerinnungsfaktoren dagegen erniedrigt,

was sich in einer verlängerten Koagulationszeit (ERIKSEN u. SIMESEN 1970) und einer

gesteigerten Blutungsneigung (FÜRLL u. SCHÄFER 1992) widerspiegelt.

Harnstoff und Kreatinin steigen wegen gestörter Nierenfunktion an (NAYLOR et al. 1980).

BUN ist jedoch in der Anfangsphase der Erkrankung kein verlässlicher Parameter zur

Bestimmung einer Nierenfunktionsstörung, da auch die Leberbeeinträchtigungen zu

veränderten Werten führen können (WATSON u. LOVE 1994). In einigen Fällen kann eine

Azotämie auftreten, die eine TGL–Aufnahme in periphere Gewebe verringert, da sie einen

hemmenden Einfluss auf die LPL ausübt (NAYLOR 1982 b).

Blutglucosekonzentrationen können zu Beginn erniedrigt sein (GAY et al. 1978), sind aber

erhöht bei Tieren, deren Hyperlipämie sekundär zu einem Adenom der Hypophyse entstanden

ist (NAYLOR 1982 b).

Im Verlauf der Hyperlipämie entwickelt sich eine metabolische Azidose, der pH-Wert des

Blutes fällt ab (SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969), Bikarbonat ist verringert, und der pCO2

sinkt ebenfalls (WENSING et al. 1973 b).

Trotz des Energiemangelzustandes, in dem sich hyperlipämische Tiere befinden, entwickelt

sich bei Pferden weder eine Ketonurie noch eine Ketonämie (GAY et al. 1978; NAYLOR et

al. 1980), wie es bei Rindern und Schafen der Fall ist (s.o.).

19


2.3.3. Therapie und Prophylaxe

Die Therapie der Hyperlipämie sollte frühzeitig eingeleitet werden und eine Behandlung der

Primärerkrankung einschließen (NAYLOR 1982 a). Eine negative Energiebilanz muss

ausgeglichen werden (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a). Um den Stoffwechsel tragender Stuten

zu entlasten, sollte der Abort eingeleitet werden (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969),

Fohlen sind abzusetzen (WATSON u. LOVE 1994).

Ein weiterer, wichtiger Punkt der Therapie ist die Reduktion der Lipidkonzentration im

Plasma und das Verringern der Mobilisation FFS aus Depotfett. Zu diesem Zweck wird

hyperlipämischen Ponys exogenes Insulin verabreicht (BARDIES et al. 1981), um seinen

antilipolytischen Effekt (SALEH et al. 1999) auszunutzen. Die Wirksamkeit ist jedoch

umstritten, da sich Ponys in anderen Studien als insulinresistent (COFFMAN u. COLLES

1983; JEFFCOTT et al. 1986; FREESTONE et al. 1991) erwiesen haben.

Außerdem wird Heparin verabreicht, wodurch die Aktivität der LPL gesteigert und damit die

Spaltung von TGL verbessert wird. Jedoch ist auch diese Anwendung kritisch zu betrachten,

da die Aktivität der LPL bei hyperlipämischen Ponys normal, bisweilen sogar erhöht ist

(WATSON et al. 1992). Im Übrigen ist die Blutgerinnung bei diesen Tieren aufgrund der

Unfähigkeit der geschädigten Leber, Gerinnungsfaktoren zu produzieren, gestört. Heparin als

Antikoagulanz verschlechtert die Situation zusätzlich, was als Ursache für die in der Sektion

zu findenden Hämorrhagien angesehen werden kann (WATSON u. LOVE 1994; NAYLOR

1982 a). Folglich ist bei der Anwendung von Heparin Vorsicht geboten.

Glucocorticoide und NSAID (wie z.B. Metamizol) sind bei der Therapie der Hyperlipämie

ebenfalls kontraindiziert, da sie die Erkrankung verschlimmern können (FÜRLL u.

SCHÄFER 1992).

Zur Prophylaxe werden eine adäquate, leistungsgerechte Fütterung bei Vermeidung von

Adipositas und Energiemangelzuständen empfohlen. Außerdem sollten Stresszustände

weitgehend reduziert oder vermieden werden und drastische Maßnahmen zur schnellen

Gewichtsreduktion unterbleiben sowie eine regelmäßige Wurmprophylaxe erfolgen

(SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969; FÜRLL u. SCHÄFER 1992; WATSON u. LOVE

20


1994). FREESTONE et al. (1992) empfehlen darüber hinaus ein Bewegungsprogramm in

Kombination mit kontrollierter Futteraufnahme zur Verbesserung der Insulinsensitivität.

Da tragende Stuten besonders gefährdet sind, sollte eine regelmäßige Bestimmung der

Plasma–TGL–Werte Teil einer monatlichen Gesundheitsüberprüfung sein (WATSON u.

LOVE 1994).

2.3.4. Pathologie und molekulare Pathogenese

Die klinischen und biochemischen Veränderungen resultieren vor allem aus dem Versagen

von Leber und Niere, welche am stärksten betroffen sind. Ihre Gewebe sind blass,

geschwollen und von fettiger Struktur. Die fettige Degeneration der inneren Organe ergibt den

häufigsten Sektionsbefund bei hyperlipämischen Tieren und resultiert aus der direkten

Aufnahme der Fettsubstanzen aus den VLDL in die Zellen. An der Leber kann es zu Fissuren

kommen, bis hin zu Rupturen des Organs, die zu intraabdominalen Blutungen führen. Diese

stellen häufig die Todesursache dar.

Fettinfiltrationen zeigen sich aber auch im Skelettmuskel. Hier kommt es in der Folge zu

hyaliner Degeneration. In der Nierenrinde entstehen Nephrosen, Glomerulonephritis und

Niereninfarkt, im Myokard kann es zum Infarkt kommen. Lymphatische Gewebe wie Milz

und Lymphknoten degenerieren, was unter anderem Ursache für eine erhöhte

Infektanfälligkeit betroffener Tiere ist. In einigen Fällen sind des Weiteren Pankreatitis und

eine Atrophie des exokrinen Teils der Drüse zu finden, wodurch die Insulinsekretion

vermindert wird.

Häufige Befunde sind ebenfalls Schleimhautulzerationen in Speiseröhre, Magen und Darm,

Lungenödem, Gefäßläsionen und fokale Hämorrhagien (ERIKSEN u. SIMESEN 1970; GAY

et al. 1978; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; MURRAY 1985; FÜRLL u. SCHÄFER 1992;

WATSON u. LOVE 1994).

Die Pathogenese auf molekularer Basis kann gegenwärtig nur ungenügend beschrieben

werden.

Die Hyperlipämie entsteht, wenn durch Stressfaktoren wie z.B. Krankheit, Trächtigkeit,

Laktation, aber auch allein durch Transport (FORHEAD et al. 1995) die Futteraufnahme über

21


mehrere Tage verringert ist oder gänzlich verweigert wird, und die Tiere so in eine negative

Energiebilanz geraten (SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969; NAYLOR 1982 a). Um den

Energiebedarf decken zu können, kommt es zur Mobilisierung von Depotfett (JEFFCOTT u.

FIELD 1985 a), in deren Folge FFS in einem Umfang in das Plasma abgegeben werden, der

die Kapazität der Leber zu oxidativem und ketogenem Stoffwechsel übersteigt, so dass die

FFS zu TGL verestert und diese in Form von VLDL in das Blut sezerniert werden (WATSON

u. LOVE 1994). Im Plasma ergeben sich also erhöhte Werte von FFS, TGL und VLDL

(BAUER 1983; FREESTONE et al. 1991).

Als Grundlage für die massiv gesteigerte Lipolyse wird eine Aktivitätserhöhung der HSL

diskutiert, die durch stressbedingte Ausschüttung von ACTH, Glucocorticoiden und

Catecholaminen bedingt sein könnte (WATSON u. LOVE 1994). Es bleibt unklar, warum

dieses molekulare, für viele Spezies geltende Pathogeneseprinzip lediglich beim Pony zur

Hyperlipämieerkrankung führt. In diesem Zusammenhang sind die Wirkmechanismen der

lipolytischen Hormone beim Pony im Detail darzustellen. Diese Arbeit soll einen Beitrag

dazu leisten und insbesondere eine eventuelle postrezeptorale Empfindlichkeit im Bereich der

cAMP-Kaskade bei Ponyadipocyten beschreiben.

22

3. Eigene Untersuchungen

3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN

3.1. Material und Methoden

In dieser Studie sollte die Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase durch von außen

zugeführtes Dibutyryl-cAMP bei Ponys und Großpferden verglichen werden. Die Messungen

erfolgten sowohl an Bauch– als auch an Inguinalfett, um eventuell vorhandene Unterschiede

zwischen Geweben dieser beiden Lokalisationen aufzudecken.

Um die Messung der Lipolyserate durchführen zu können, mussten die Adipocyten isoliert

werden. Hierfür kam die Methode nach RODBELL (1964) zum Einsatz, welche von

BREIDENBACH (1996) an die Verhältnisse beim Pferd adaptiert wurde.

3.1.1. Versuchstiere

Zur Verfügung standen sechs Shetlandpony-Wallache des Instituts für Physiologische Chemie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover im Alter zwischen fünf und zwölf Jahren. Die Tiere

waren klinisch gesund und befanden sich in einem guten Ernährungszustand bei einem

mittleren Körpergewicht von 155,8 ± 39,0 kg.

Die Tierversuche zur Entnahme von Adipocyten wurden unter dem Aktenzeichen

509c-42502-01/489 von der Bezirksregierung Hannover genehmigt.

Des Weiteren wurden 28 ebenfalls klinisch gesunde und zur Schlachtung bestimmte

männliche und weibliche Tiere, darunter 18 Pferde im Alter zwischen drei und 23 Jahren und

zehn Ponys im Alter zwischen neun und 26 Jahren, zur Probengewinnung herangezogen. Ihr

Ernährungszustand variierte von mäßig bis sehr gut, wobei das mittlere Körpergewicht der

Pferde 587,2 ± 78,9 kg betrug und das der Ponys bei 344,6 ± 97,7 kg lag.

Genaue Angaben über Größe, Gewicht und Alter der Tiere sind in den Tabellen 1, 2 und 3 im

Anhang (Seite 122, 123, 124) aufgeführt.

23


3.1.2. Haltung und Fütterung

Die Ponys des Instituts wurden in Einzelboxen auf Stroh gehalten und erhielten Auslauf

sowohl auf einem gepflasterten Paddock als auch auf einem Sandplatz. Die Futterrationen

setzten sich, dem Erhaltungsbedarf der Tiere entsprechend, aus Melasseschnitzeln,

Mineralfutter, Vollkornpellets und Heu zusammen. Die Wasserversorgung erfolgte ad

libitum.

Viele der Schlachttiere waren bereits einige Zeit vor dem eigentlichen Schlachttermin auf

dem Betriebsgelände eingestallt. Sie wurden in Boxen auf Stroh gehalten und mit

Melasseschnitzeln, gequetschtem Hafer und Heu gefüttert. Hinsichtlich der unmittelbar vor

ihrer Tötung angelieferten Tiere sind weder über Haltung noch Fütterung weitergehende

Details bekannt.

3.1.3. Probenentnahme

3.1.3.1. Probenentnahme am anästhesierten Pony

Die im Institut gehaltenen Tiere wurden zur Entnahme von Inguinalfett in Vollnarkose

versetzt. Die Gewinnung von Bauchhöhlenfett hätte einen Eingriff von erheblichem Umfang

bedeutet und wäre mit dem Risiko der gesundheitlichen Beeinträchtigung behaftet gewesen,

so dass zum Wohle der Ponys auf diese Maßnahme verzichtet wurde.

Vor dem Eingriff wurde den Ponys über Nacht das Futter entzogen und die Einstreu aus der

Box entfernt. Die Wasserversorgung erfolgte ad libitum. Außerdem wurden die Tiere einer

Allgemeinuntersuchung unterzogen.

Beginn der Operationsvorbereitungen war jeweils um zehn Uhr morgens.

Zunächst wurde den Ponys nach Rasur und Desinfektion der Punktionsstelle eine

Verweilkanüle in die Vena jugularis gelegt. Die Sedation erfolgte mit Sedivet ®

(Romifidin, 0,08 mg / kg KGW i.v.) mit anschließender Narkoseeinleitung durch Diazepam

(Diazepam - ratiopharm® 0,5 %; 0,04 mg / kg KGW i.v.) und Ketamin (10 % ; 2,2 mg / kg

24


KGW i.v.). Die eigentliche Narkose wurde mittels Triple Drip, bestehend aus 500 ml

Myolaxin ® (Guaifenesin 15 %), 30 ml Ketamin 10 % und 3 ml Sedivet ®, aufrechterhalten.

Nach Rasur und Desinfektion des OP-Feldes wurden im Inguinalbereich seitlich des Penis ein

etwa fünf Zentimeter langer Hautschnitt angelegt und ca. vier Gramm Fettgewebe

entnommen. Nach Instillation von Benzylpenicillin in die Wundhöhle zur

Infektionsprophylaxe erfolgte der Wundverschluss durch eine Hautnaht mittels U–Heften

unter Verwendung von Vicryl®. Die Naht wurde mit Wundspray abgedeckt und die Tiere

erhielten zur Schmerzlinderung und Entzündungshemmung Metacam®

(Meloxicam, 0,6 mg / kg KGW, i.m.). Des Weiteren wurden die Ponys antibiotisch mit

Tardomyocel® (Benzylpenicilin–Benzathin, 4 ml / 100 kg KGW, i.m.) versorgt. Zur

Tetanusprophylaxe wurden jeweils 5 ml Tetanus–Serum i.m. injiziert.

Nach Beendigung der Operation fand eine Überwachung der Tiere während der

Aufwachphase bis zur vollständigen Erholung statt.

Bei einem Pony kam es zu Schwellungen des Wundfeldes mit Ödembildung im Inguinal–

sowie Bauchbereich ohne Störung des Allgemeinbefindens. Es wurde daraufhin über einige

Tage lokal mit einer Heparin enthaltenden Salbe behandelt und der ödematisierte Bereich

wurde mehrmals täglich bis zur vollständigen Abschwellung gekühlt.

3.1.3.2. Probengewinnung von Schlachttieren (Großpferd und Pony)

Die Probenentnahme fand in einem auf Pferdeschlachtung spezialisierten Betrieb statt. Die

zur Schlachtung bestimmten Tiere wurden mittels Bolzenschuss betäubt, die Tötung erfolgte

durch Blutentzug nach Eröffnen der Vv. jugulares und Aa. carotides mittels

Entblutungsschnitt am kaudalen Rand der Drosselrinne.

Die Gewebeproben von jeweils etwa fünf Gramm wurden direkt im Anschluss an die

Ausweidung und Teilung der Tierkörper subkutan aus dem Inguinalbereich, Nähe Penis bzw.

Euter, sowie aus der Bauchhöhle, etwa im Bereich zwischen Nabel und Sternum, beidseits der

Linea alba, entnommen.

25


3.1.4. Transport der Proben

Sowohl bei den institutseigenen Ponys wie bei den Schlachttieren wurden die Gewebeproben

in 37°C warme physiologische Kochsalzlösung (0,9 %) gelegt, die Probengefäße in einem mit

ebenfalls körperwarmem Wasser gefüllten Isolierbehältnis zum Labor transportiert und bis

zur alsbaldigen Bearbeitung bei dieser Temperatur gehalten.

3.1.5. Isolierung der Adipocyten

Die Zusammensetzungen der im Folgenden genannten Puffer sind im Anhang (Seite 120)

aufgeführt.

Die Isolierung der Fettzellen geht auf die Methode von RODBELL (1964) zurück, die von

BREIDENBACH (1996) modifiziert wurde, um sie auch beim Pferd anwenden zu können.

Um eine Auskühlung des Probenmaterials zu verhindern und physiologische Bedingungen zu

gewährleisten, erfolgte die Präparation der Adipocyten in einem Brutraum bei 37°C.

Inguinal– und Bauchfett wurden in gleicher Weise bearbeitet.

Zunächst wurden die Gewebeproben von eventuell noch vorhandenen Faszien und

Blutgefäßen befreit. Jeweils 2 g Fett wurden anschließend mit einem Skalpell fein geschnitten

und in 10 ml Krebs-Ringer-HEPES-Puffer mit 3,5% Bovinem Serum–Albumin

(KR–Lösung I) unter Zugabe von 250 µl Collagenase–Stammlösung in 50 ml Falcon–

Röhrchen unter Carbogenbegasung (95 % O2, 5 % CO2) 60 Minuten bei 37°C im Wasserbad

inkubiert. Danach erfolgte das Filtrieren durch Nylon–Gaze, um die vereinzelten Fettzellen

von verbliebenen Gewebeverbänden zu trennen.

Damit die Zellausbeute erhöht werden konnte, erfolgte dieser Teil der Adipocytenpräparation

im Doppelansatz, zum anschließenden Waschen wurden beide Ansätze zu einer Probe in

10 ml–Falcon–Röhrchen vereinigt.

Die Waschung diente der Entfernung der Collagenase aus der Zellsuspension und erfolgte

durch Absaugen des Unterstandes nach Flotation der Fettzellen mittels Spritze und

26


aufgesetzter Kanüle und anschließender Zugabe von 10 ml Krebs–Ringer–HEPES–Puffer mit

1 % Bovinem Serum-Albumin (KR-Lösung II). Nach erneuter Flotation wurde dieser

Vorgang dreimal wiederholt. Im Anschluss an das letzte Waschen wurde der Unterstand so

weit wie möglich abgesogen.

3.1.6. Bestimmung der Zellzahl

Zur Bestimmung der Zellzahl und damit der Zellausbeute wurden 100 µl Zellsuspension in

einen Eppendorf–Cup pipettiert und 100 µl KR–Lösung II sowie 10 µl

Methylenblaumischung (bestehend aus 25 µl Methylenblau 2 % + 475 µl Krebs–Ringer–

HEPES–Puffer) hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von fünf Minuten wurden 10 µl

der Färbelösung in eine Thoma–Zählkammer überführt und jeder Ansatz unter dem

Mikroskop (Leica DM IRB) dreimal gezählt, wobei ausschließlich Adipocyten mit Zellkern

berücksichtigt wurden. Aus den Ergebnissen der drei Zählungen wurde der Mittelwert

gebildet und die Gesamtzellzahl der Präparation nach folgender Formel ermittelt:

Gesamtzellzahl = gezählte Zellzahl x Kammerfaktor x Volumen

Für die gezählte Zellzahl wurde oben genannter Mittelwert in die Formel eingefügt, das

Volumen ergab sich aus der Menge der verbleibenden Zellsuspension in den 10 ml–Falcon–

Röhrchen nach Absaugen des Unterstandes im Anschluss an den letzten Waschvorgang. Da

hier zur Zellzählung die Kammer nach Thoma verwendet wurde, betrug der Kammerfaktor

20.000. Aus der Berechnung ergab sich die Zellzahl im Ausgangsvolumen. Die Abb. 5 zeigt

eine typische Zellpopulation nach Färbung mit Methylenblau in 400facher Vergrößerung.

27


Abb. 5: Adipocyten nach der Färbung mit Methylenblau. 400fache Vergrößerung.

3.1.7. Live / dead–Färbung

Um die Lebensfähigkeit der Adipocyten nach den einzelnen Präparationsschritten

nachzuweisen, wurde eine live / dead–Färbung durchgeführt.

Hierbei handelt es sich um eine Simultanfärbung mit den beiden Reagenzien Ethidiumiodid

und Calcein–Acetoxymethyl. Jeweils 1 µl der Reagenzien werden zu 1 ml Fettzellsuspension

hinzugegeben und 30 bis 45 Minuten inkubiert.

Ethidiumiodid stellt einen Nukleinsäurefarbstoff dar, der nur durch geschädigte Membranen

toter Zellen zu penetrieren vermag. Entsprechende Zellen erscheinen rot. Calcein–

Acetoxymethyl ist ein Substrat für Esterasen, durch die es zu einem grün fluoreszierenden

Produkt, dem Calcein, hydrolysiert wird. Diese Grünfluoreszenz ist damit Indikator für

28


Zellen, die sowohl Esterase–Aktivität besitzen als auch eine intakte Zellmembran, um die

Produkte dieser Enzyme in der Zelle zurückzubehalten. Sie sind folglich lebensfähig (siehe

Abb. 6).

In den im Rahmen dieser Untersuchungen in geschilderter Weise gefärbten Präparaten lag die

Lebensfähigkeit der Adipocyten bei über 90 %.

Abb. 6: Adipocyten nach Simultanfärbung. 400fache Vergrößerung. Lebende Zellen grün,

tote Zellen und vereinzelte Zellkerne rot.

29


3.1.8. Messung der Lipolyserate

Wie bereits 1998 von BREIDENBACH et al. beschrieben, wurde zur Messung der

Lipolyserate ein fluorophotometrisches Verfahren angewendet, bei dem SNAFL-1 als

pH–sensitiver Farbstoff (Fluorochrom) eingesetzt wurde, der in Abhängigkeit zur Menge der

im Verlauf der Lipolyse freigesetzten Fettsäuren und der daraus resultierenden pH–

Wertsenkung im Inkubationsmedium seine relative Fluoreszenz ändert, was im

Spektrofluorophotometer gemessen werden kann.

Die Bezugsquellen aller verwendeten Reagenzien und Arbeitsmaterialien sind dem Anhang

zu entnehmen.

3.1.8.1. Vorversuche zur Auswahl des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes

In den vorliegenden Versuchen sollte die Lipolyserate an Fettgewebe von Großpferd und

Pony anhand der Fettsäurefreisetzung gemessen werden. Aus der Freisetzung von Fettsäuren

resultiert ein Ansäuern des Inkubationsmediums und damit verbunden eine pH-Wertsenkung.

Das geplante Vorgehen machte einen Farbstoff notwendig, der die pH-Verschiebung durch

Akkumulation von FS im Testansatz zu detektieren in der Lage war, so dass diese im

Spektrofluorophotometer gemessen und als Änderung der relativen Fluoreszenzeinheiten

notiert werden konnte. Der Farbstoff musste also ein pH-sensitives Fluorochrom mit einem

ausreichend großen Spektrum im benötigten pH-Bereich darstellen.

BREIDENBACH (1996) entschied sich in seinen Untersuchungen für

Seminaphthofluorescein-1 (SNAFL-1). Die von ihm verwendete Charge war jedoch nicht

mehr erhältlich. Um eventuell vorhandene Unterschiede zwischen verschiedenen Chargen

ausschließen zu können, wurden die nunmehr angebotene Charge von SNAFL-1 und andere

Farbstoffe in den Vorversuchen ausgetestet.

Zur Auswahl standen neben Seminaphthofluorescein-1 die Fluorochrome 5,6–

Carboxyfluorescein und Seminaphthorhodafluor (SNARF).

Um den geeigneten Farbstoff auszuwählen, wurden deren Spektren aufgezeichnet.

30


Zu diesem Zweck wurden von jedem Fluorochrom Stammlösungen mit Dimethylformamid

(DMF) in einer Konzentration von 20 mM hergestellt. Für diesen Teil der Arbeit wurden

Präzisionsküvetten aus Quarzglas eingesetzt, die mit 2,5 ml Krebs-Ringer-Lösung mit 0,5 %

Bovinem Serum-Albumin (KR-Lösung III) befüllt wurden. Die Konzentration an Farbstoff

betrug 3 µmol / l, wie diese auch in den Testansätzen zur Messung der Lipolyserate eingesetzt

werden sollte. Jeder Farbstoff wurde im dreifachen Ansatz ausgehend von drei

unterschiedlichen pH–Werten des Puffers, nämlich 6,5, 7,0 und 7,4, getestet. Die pH–Werte

wurden bei einer Temperatur von 37°C mit 0,1 M NaOH eingestellt. Die Messungen erfolgten

ebenfalls bei 37°C im beheizten Spektrofluorophotometer, um identische Bedingungen wie in

den Messungen der Lipolyserate in den Geweben zu gewährleisten. Die Zusammensetzung

der KR–Lösung III ist im Anhang (Seite 120, 121) aufgeführt.

Die jeweilige Küvette wurde in den Strahlengang des Spektrofluorophotometers gesetzt und

am Gerät wurden sowohl eine entsprechende Exzitations– wie auch Emissionswellenlänge

gewählt. Nach dem Öffnen des Strahlenganges wurde über einen angeschlossenen Schreiber

das Emissionsspektrum aufgezeichnet.

Die Einstellungen am Spektrofluorophotometer für die Messung mit 5,6-Carboxyfluorescein

betrugen für die Exzitationswellenlänge 488 nm, der aufgezeichnete Bereich erstreckte sich

von 580 nm bis 500 nm. Für die Bandbreite wurde sowohl für die Exzitation als auch für die

Emission eine Wellenlänge von 5 nm am Gerät gewählt. Die Einstellung Gain lag bei 5.

SNARF wurde mit einer Exzitationswellenlänge von 534 nm angeregt und sein Spektrum

ausgehend von 750 nm bis 580 nm verfolgt. Dabei lag die Bandbreite für beide Wellenlängen

bei 10 nm, Gain war auf 20 festgelegt.

Für SNAFL-1 wurde für die Exzitation eine Wellenlänge von 485 nm festgelegt. Sein

Emissionsspektrum wurde von 600 nm bis 500 nm aufgeschrieben, wobei mit einer

Bandbreite von jeweils 5 nm und Gain 50 gearbeitet wurde.

Aus den einzelnen Spektren war eine deutlich größere Dynamik des Fluorochroms SNAFL-1

im gewünschten pH-Bereich von 7,4 bis 7,0 ersichtlich, weshalb sich dieses als geeigneter für

die Messungen der Lipolyseraten erwies, als SNARF oder 5,6-Carboxyfluorescein. Die

letztgenannten Farbstoffe zeigten kaum Unterschiede in ihren Spektren. Da BREIDENBACH

31


(1996, 1998, 1999) ebenfalls diesen Farbstoff verwendete, konnte somit zusätzlich eine

Vergleichbarkeit der Daten gewährleistet werden. Alle Versuche wurden mit Farbstoff der

gleichen Charge durchgeführt.

3.1.8.2. Erstellen einer Eichkurve mittels Palmitinsäure

Um die Änderungen der relativen Fluoreszenz mit der Menge der zugesetzten Palmitinsäure

zur KR-Lösung III korrelieren zu können, wurde eine Eichkurve erstellt.

Hierfür wurde die Palmitinsäure in Ethanol gelöst und eine 20 mM Stammlösung hergestellt.

Die Messung erfolgte im dreifachen Ansatz, wobei zu 2,5 ml KR-Lösung III bei Anwesenheit

des Fluoreszenzfarbstoffes in 5 µl–Schritten Palmitinsäurestammlösung mittels Hamilton-

Pipette hinzugegeben und die jeweilige Änderung der relativen Fluoreszenzeinheit notiert

wurde. Als Kontrolle diente die Zugabe gleicher Mengen Ethanol. Die Gesamtmenge der

eingesetzten Palmitinsäurestammlösung bzw. des Ethanols betrug 80 µl. Die Ansätze in den

Küvetten und die Einstellungen am Photometer werden aus den nachstehenden Tabellen

ersichtlich.

Kontrolle

Probe

KR III in ml 2,5 2,5

SNAFL in µmol / l 3 3

Ethanol je 5 µl -

Palmitinsäure 20 mM in

Ethanol

-

je 5 µl

Tab. 4: Ansätze in den Küvetten zur Erstellung einer Eichkurve. Insgesamt wurden 80 µl

Ethanol bzw. Palmitinsäure hinzugefügt.

32


Wellenlänge

Exzitation Emission

Wellenlänge Bandbreite

Exzitation Emission

Gain

λ = 520 nm

λ = 600 nm

λ = 10 nm

λ = 10 nm

50

Tab. 5:Einstellungen am Spektrofluorophotometer zur Erstellung der Eichkurve.

Aus den Werten der drei Messungen wurde der Mittelwert gebildet und die Kontrolle davon

als Blindwert subtrahiert. Dabei ergaben sich die in Abb. 7 eingetragenen Messpunkte.

33


Palmitinsäure

6

8

10

12

14

16

18

20

22

y = 0,0131 x + 0,8582R² = 0,9705p < 0,001

34

600 800 1000 1200 1400 1600

rela

tive

Fluo

resz

enze

inhe

iten

nmol

Abb. 7: Mit Palmitinsäure erstellte Eichkurve. Es konnte eine lineare Regressionskurve an

die Messpunkte angepasst werden.

Die Steigung der an die Mittelwertkurve angelegten Regressionsgeraden zeigte einen linearen

Zusammenhang zwischen Fettsäureangebot und Höhe der relativen Fluoreszenzeinheiten,

wonach die Zugabe von 1 nmol Fettsäure einen Anstieg von 0,0131 relativen

Fluoreszenzeinheiten ergab.


3.1.8.3. Eingesetzter Lipolyseansatz

Zum Zweck der Messung der Lipolyserate in den jeweiligen Fettzellsuspensionen wurden die

Küvetten im Anschluss an das Auszählen in der Thoma–Kammer für die jeweiligen Ansätze

bestückt, wobei die Zellzahl in jedem Ansatz auf 250.000 eingestellt wurde. Nach dem

Überführen der eingestellten Menge der Zellsuspension in die Küvetten folgte die Zugabe von

jeweils 50 µl der Stammlösungen von N6, 2´-O–Dibutyryladenosin–3´:5´-Cyclomonophoshat

(DBcAMP) bzw. Noradrenalin (NA) und Adenosindesaminase (ADA). In jede Küvette wurde

die gleiche Menge des Fluoreszenzfarbstoffes Seminaphthofluorescein-1 (SNAFL-1)

pipettiert und das Volumen mit KR–Lösung III mit 0,5 % Bovinem Serum-Albumin (BSA)

auf 2,5 ml aufgefüllt. Ein Pipettierschema ist der Tabelle 6 zu entnehmen, welches sowohl für

die Proben aus dem Inguinal– wie auch aus dem Bauchbereich gilt.

Küvette 1

Kontrolle

Küvette 2

NA

Küvette 3

DBcAMP

Zellzahl jeweils 250.000

DBcAMP - - 50 µl

SNAFL-1 37,5 µl 37,5 µl 37,5 µl

NA - 50 µl -

ADA - 50 µl -

KR III Jeweils ad 2,5 ml

Tab. 6: Ansätze in den Küvetten zur Messung der Lipolyseraten in separierten Adipocyten

von Großpferd und Pony.

35


Dabei ergaben sich für die eingesetzten Reagenzien die in der Tabelle 7 eingetragenen

Konzentrationen.

Konzentration

DBcAMP 1 mmol / l

SNAFL-1 3 µmol / l

NA 0,3 µmol / l

ADA 200 U / l

Tab. 7: Konzentrationen der Reagenzien in den Küvetten zur Messung der Lipolyseraten in

separierten Adipocyten von Großpferd und Pony.

Die Messungen der Lipolyseraten wurden im beheizten Spektrofluorophotometer bei

folgenden Einstellungen des Gerätes durchgeführt: Exzitationswellenlänge 520 nm,

Emissionswellenlänge 600 nm, Bandbreite jeweils 10 nm, Gain 50. Die relativen

Fluoreszenzeinheiten wurden im Abstand von zehn Minuten über zwei Stunden gemessen und

protokolliert. Zwischen den Messzeitpunkten lagerten die Proben in einem auf 37°C beheizten

Magnetrührer. Noradrenalin wurde den jeweiligen Ansätzen nach der ersten Messung

hinzugefügt.

36


3.1.9. Berechnung der Lipolyserate

Um die Raten der Fettsäurefreisetzung berechnen zu können, wurde die folgende Formel

angewendet:

nmol FS rel. FE (Probe) nmol FS

────────── = ────────────── * ────────────── min min 0,0131 rel. FE

rel. FE = relative Fluoreszenzeinheiten; FS = Fettsäure.

Die Änderung der relativen Fluoreszenzeinheiten der Probe pro Minute ergab sich dabei aus

dem Wert der Steigung. Diese wurde für jeden Probenansatz derart bestimmt, dass für die

entsprechenden Messdaten aus der Lipolysemessung die lineare Regression angepasst wurde.

Aus der resultierenden Steigung der Geraden konnte die Lipolyserate bestimmt werden. Zur

Ermittlung dieser Steigung wurden die jeweils letzten sechs Messwerte herangezogen, also

die letzten 60 Minuten berücksichtigt.

Der Faktor 0,0131 nmol -1 ergab sich bereits in den Vorversuchen bei der Erstellung der

Eichkurve (siehe 3.1.8.2.). Er entspricht dem Anstieg der relativen Fluoreszenzeinheiten bei

Zugabe von 1 nmol Fettsäure zum Inkubationsansatz und folgte, wie schon beschrieben, aus

der Berechnung der Steigung der Mittelwertkurve aus den drei Messungen der relativen

Fluoreszenz von SNAFL-1 nach Zugabe von Palmitinsäure.

37


3.1.10. Verschiedene DBcAMP-Konzentrationen

Um den Einfluss verschiedener DBcAMP–Gehalte auf den Verlauf der Lipolyse zu testen,

wurden die Messungen bei den institutseigenen Tieren nicht nur in einer DBcAMP-

Konzentration von 1 mmol / l durchgeführt, sondern darüber hinaus sowohl mit 0,5 mmol / l

als auch mit 1,5 mmol / l, wobei sich die Konzentration von 1 mmol / l nach den bereits in der

Literatur beschriebenen Angaben richtete (FARIAS–SILVA et al. 1999; PORTILLO et al.

1999; MORIMOTO et al. 2001). Die übrigen Arbeitsschritte entsprechen dem oben

genannten Vorgehen. Weitergehende Details bezüglich der in den Messungen verwendeten

Konzentration befinden sich im Kapitel 4.1. auf Seite 41 des Ergebnisteils.

3.2. Statistische Auswertung

3.2.1. Deskriptive Statistik

Um die resultierenden Werte vergleichen zu können, wurden die Ergebnisse jeder

Einzelmessung der verschiedenen Ansätze in einer Kurve über den Verlauf der Lipolyse

festgehalten und die jeweilige Regressionsgerade, deren Funktion und ihr Bestimmtheitsmaß

dargestellt.

Aus den Funktionen der Regressionsgeraden waren ihre entsprechenden Steigungen, die ein

Maß für die freigesetzten Fettsäuren pro Zeiteinheit sind, abzulesen (s.o.). Diese konnten für

die einzelnen Ansätze der Gruppen (Kontrolle, Noradrenalin–vermittelte und DBcAMP–

induzierte Lipolyse) zusammengefasst werden. Daraus wurden sowohl der Mittelwert als auch

die Standardabweichung gebildet, aus denen die statistischen Berechnungen erfolgten.

Bei nicht normalverteilten Werten wurde der Median festgelegt.

38


3.2.2. Analytische Statistik

Anhand der sich ergebenden Mittelwerte, Standardabweichungen und Mediane erfolgte die

statistische Auswertung unter Anwendung des Programms Sigma Stat 3.01 des Herstellers

SPSS.

Zunächst wurde jeweils ein Überprüfen auf Normalverteilung vorgenommen.

Sofern die Daten der zu vergleichenden Gruppen diese Eigenschaft aufwiesen, wurde im

Zwei–Gruppen–Vergleich der t–Test angewendet oder im Fall eines Vergleichs zwischen

mehreren Gruppen eine ANOVA mit anschließendem Tukey–Test durchgeführt. Hier konnten

sowohl die arithmetischen Mittel als auch die Standardabweichungen zur Charakterisierung

herangezogen werden.

Lagen dagegen nicht normalverteilte Daten vor, wurde dementsprechend der Mann–Whitney

Rank Sum Test oder eine One Way ANOVA on Ranks (Kruskal–Wallis) durchgeführt, wobei

auf die Angabe des Medians als Gruppenwert zurückgegriffen werden musste.

Unterschiede, bei denen der p–Wert ≤ 0,05 beträgt, wurden als signifikant angesehen und in

Abbildungen mit gekennzeichnet.

39

4. Ergebnisse

4. ERGEBNISSE

Da die Probennahme nicht bei allen Tieren in vollem Umfang möglich war, konnte nicht bei

allen Pferden und Ponys auf vollständige Datensätze, das heißt Ergebnisse sowohl aus den

Messungen des Bauch– als auch des Inguinalfettes, zurückgegriffen werden.

So wurde bei den institutseigenen Ponys wegen des Ausmaßes des notwendigen chirurgischen

Eingriffs auf die Entnahme von Bauchhöhlenfett verzichtet und nur subkutanes Gewebe aus

dem Inguinalbereich verwendet.

Da der Ernährungszustand besonders bei den Schlachttieren stark variierte, war es in einigen

Fällen nicht möglich, Fettgewebe aus dem Bereich der Bauchhöhle aufgrund seiner z.T.

äußerst geringen Ausprägung bei mageren Tieren zu entnehmen. Bei solchen Pferden

beschränkte sich die Probengewinnung folglich auf die Entnahme von Inguinalfett.

Des Weiteren konnten bei der Präparation der Adipocyten in einigen Ansätzen keine oder nur

zu wenig Zellen isoliert werden, um die nötige Zellzahl von 250.000 für die Messungen zu

gewährleisten. Schwierigkeiten ergaben sich dabei vor allem bei der Bearbeitung des

Bauchfettes.

40

4. Ergebnisse

4. 1. Vergleich verschiedener DBcAMP–Konzentrationen im Testansatz

Um den Einfluss verschiedener DBcAMP–Konzentrationen auf den Verlauf der Lipolyse zu

untersuchen, wurde diese für die Messungen der Proben der institutseigenen Tiere variiert und

neben 1 mM auch die Konzentrationen 0,5 mM bzw. 1,5 mM untersucht.

0 20 40 60 80 100 120

rela

tive

Fluo

resz

enze

inhe

iten

0

5

10

15

20

25

30

MW 0,5 mM DBcAMP

t in min

MW 1,0 mM DBcAMP

0

5

10

15

20

25

30

MW 1,5 mM DBcAMP

Lipolyse Inguinalfett

Abb. 8: Graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse bei drei unterschiedlichen

DBcAMP–Konzentrationen von Adipocyten aus Inguinalfett der Institutsponys. Die Zellzahl

wurde auf 250.000 eingestellt. Darstellung der Mittelwertkurven. MW = Mittelwert.

41

4. Ergebnisse

Wie die graphische Darstellung in Abb. 8 verdeutlicht, ist eine steigende DBcAMP-

Konzentration nicht mit einer Erhöhung der relativen Fluoreszenz verbunden. Zwischen den

drei abgebildeten Kurven besteht statistisch kein Unterschied.

Nach der Umrechnung der gemessenen relativen Fluoreszenzeinheiten in Fettsäurefreisetzung

in nmol / min wurden für die drei DBcAMP-Konzentrationen statistische Berechnungen

angestellt. Die Unterschiede erwiesen sich in einer ANOVA on Ranks und einem zusätzlich

durchgeführten t-test als nicht signifikant (siehe Abb. 9), weshalb für folgende Versuche die

mittlere Konzentration von 1,0 mM gewählt wurde, was auch dem Vorgehen anderer Autoren

entspricht (WAHRENBERG et al. 1989; FARIAS-SILVA et al. 1999).

42

4. Ergebnisse

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

5

10

15

20

25

30

b b b

a

Kontrolle 0,5 mM 1,0 mM 1,5 mM DBcAMP

Abb. 9: Vergleich verschiedener DBcAMP–Konzentrationen (0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM),

Inguinalfett, Institutsponys. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen

signifikanten Unterschied hin (p < 0,05). n = jeweils 4.

43

4. Ergebnisse

4. 2. Ergebnisse der Messung der Lipolyserate

Nach Stimulation der Adipocyten in den Testansätzen mit Noradrenalin bzw. DBcAMP

erfolgte die Messung der Fettsäurefreisetzung im Spektrofluorophotometer über einen

Zeitraum von 120 Minuten jeweils in 10-minütigen Abständen. Die dabei eintretende

pH–Wertänderung wurde durch den Indikator SNAFL-1 detektiert und als relative

Fluoreszenzeinheit notiert.

Aus den ermittelten Werten wurden anschließend Graphen skizziert, um den Verlauf der

Fettsäurefreisetzung bildlich darzustellen.

Beispielhaft werden im Folgenden die Graphen für jeweils ein Pferd bzw. Pony angeführt.

Die zugrunde liegenden Einzelwerte sind den Tabellen 8 und 9 im Anhang (Seite 125, 126.)

zu entnehmen.

44

4. Ergebnisse

0 20 4 0 60 8 0 10 0 1 20

0

10

20

30

40

K on tro lle

0 20 40 60 80 100 120

0

10

20

30

40

N A / A D A

t in m in

0 20 4 0 6 0 8 0 10 0

rela

tive

Fluo

resz

enze

inhe

iten

0

10

20

30

40

D B cA M P

A: Lipolyse Bauchfett Pferd

1 2 0

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

K o n tro lle

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

N A / A D A

t in m in

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

rela

tive

Fluo

resz

enze

inhe

iten

0

1 0

2 0

3 0

4 0

D B c A M P

A, B: Graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse von Adipocyten aus Bauch-

B: Lipolyse Inguinalfett Pferd

Abb. 10

und Inguinalfett des Pferdes 20 sowohl im Kontrollansatz als auch nach Stimulation mit

NA / ADA (0,3 µM / l; 200 U / l) bzw. DBcAMP (1,0 mM). Die Zellzahl wurde auf 250.000

eingestellt.

45

4. Ergebnisse

Wie aus den Graphen der Abb. 10 A und B ersichtlich wird, ergab sich für die Kontrollen

keine wesentliche Änderung der relativen Fluoreszenz während der Versuchszeit. Dieses

Resultat war zu erwarten, da im Inkubationsmedium keinerlei die Lipolyse aktivierenden

Substanzen enthalten sind.

Der Zusatz des Catecholamins NA in Verbindung mit ADA entwickelte bei den Großpferden

kaum Effektivität und es ergab sich kein wesentlicher Unterschied in der Fluoreszenz

zwischen den Adipocyten der beiden Lokalisationen. Lediglich beim Inguinalfett zeigte sich

eine schwache Tendenz zu höheren Werten am Ende der Inkubationszeit, diese lag aber nie

über zehn relativen Fluoreszenzeinheiten.

Ein deutlicher Anstieg der relativen Fluoreszenz war dagegen bei Zugabe von DBcAMP zum

Testansatz zu verzeichnen, der eine stärkere Ausprägung zeigte als bei Zusatz von NA / ADA.

Ein stetiger Anstieg der Kurven war aber in der Regel erst ab der 60. Minute zu erkennen.

46

4. Ergebnisse

47

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

K o n tr o l le

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 00

5

1 0

1 5

2 0

2 5

N A / A D A

t in m in

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

rela

tive

Fluo

resz

enze

inhe

iten

0

5

1 0

1 5

2 5

2 0

D B c A M P

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 00

5

1 0

1 5

2 0

2 5

K o n tro l le

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 00

5

1 0

1 5

2 0

2 5

N A / A D A

t in m in

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

A: Lipolyse Bauchfett Pony

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

D B c A M P

rela

tive

Fluo

resz

enze

inhe

iten B: Lipolyse Inguinalfett Pony

Abb. 11 A, B: Graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse von Adipocyten aus Bauch-

und Inguinalfett des Ponys 16 sowohl im Kontrollansatz als auch nach Stimulation mit

NA / ADA (0,3 µM / l; 200 U / l) bzw. DBcAMP (1,0 mM). Die Zellzahl wurde auf 250.000

eingestellt.

4. Ergebnisse

Die der Abb. 11 A und B zu entnehmenden Kurvenverläufe der Kontrollansätze der Ponys

stimmten mit denen der Großpferde überein, auch hier verliefen die Graphen während der

gesamten Versuchszeit weitgehend auf einem Niveau.

Dagegen waren deutliche Anstiege der relativen Fluoreszenz bei Zugabe von NA / ADA zum

Inkubationsmedium zu verzeichnen. Diese waren bei den Pferden in deutlich geringerer

Ausprägung ersichtlich.

Durch DBcAMP im Medium ließen sich die Adipocyten der Ponys noch intensiver als mit

NA / ADA, aber in ähnlich starker Intensität stimulieren wie die der Pferde.

Die Steigungen der Kurven erwiesen sich in einer ANOVA mit p < 0,01 als hoch signifikant.

48

4. Ergebnisse

4. 3. Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate

Um zu prüfen, ob Unterschiede zwischen Großpferd und Pony bezüglich des Verlaufs der

Lipolyse existieren, wurden zunächst die DBcAMP–Ansätze der beiden Spezies getrennt nach

Bauch– und Inguinalfett miteinander verglichen.

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 13 n = 4

Großpferd Pony

Abb. 12: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in den DBcAMP-Ansätzen (1 mM) des

Bauchfettes zwischen Großpferd und Pony. Der Punkt • im Diagramm kennzeichnet jeweils

einen Ausreißer.

49

4. Ergebnisse

Der Verlauf der Lipolyse des Bauchfettes (Abb. 12) ergab keinen statistisch signifikanten

Unterschied zwischen Pferd und Pony. Die Lipolyseraten liegen mit Medianen von 16,6 nmol

FS / min bei den Pferden und 14,9 nmol FS / min bei den Ponys etwa auf gleicher Höhe.

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 16 n = 10

Großpferd Pony

Abb. 13: Vergleich der Lipolyserate in DBcAMP-Ansätzen (1 mM) des Inguinalfettes

zwischen Großpferd und Pony. Der Unterschied ist mit p = 0,007 signifikant.

50

4. Ergebnisse

Der in Abb. 13 gezeigte speziesspezifische Vergleich der Proben aus Inguinalgewebe ist

dagegen mit p = 0,007 als signifikant zu betrachten. Mit einem Mittelwert von 18,9 ± 9,0

nmol FS / min liegt die Lipolyserate bei den Pferden deutlich höher als bei den Ponys, bei

denen der Mittelwert 9,9 ± 4,0 nmol FS / min beträgt.

Da sich bei den bislang präsentierten Lipolyseraten zwischen Großpferd und Pony ein

Unterschied im Inguinalfett andeutete, sich jedoch beide Gruppen in Bezug auf das Bauchfett

beinahe gleich verhielten, wurde in einem weiteren Test der Einfluss der Lokalisation (4.6.)

näher untersucht.

51

4. Ergebnisse

4. 4. Vergleich der in vitro Daten (Schlachtponys) mit ex vivo in vitro Daten

(anästhesierte Ponys des Instituts) für das Inguinalfett

Der Vergleich zwischen Schlachtponys und narkotisierten Ponys diente der Überprüfung, in

welchem Maße der Abbau von Triglyceriden durch Narkose bzw. Schlachtvorgang

beeinflusst wird und ob ein Unterschied aus beiden Formen der Probengewinnung resultiert.

Hierzu wurden sowohl die Ansätze mit NA / ADA als auch mit DBcAMP verglichen.

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

5

10

15

20

25

30

35

NA / ADA-Ansätze des Inguinalfettes

n = 6 n = 5

Narkoseponys Schlachtponys

Abb. 14: Vergleich der Lipolyserate der NA / ADA–Ansätze des Inguinalfettes zwischen

geschlachteten und anästhesierten Ponys. Der Unterschied ist mit p = 0,023 signifikant.

52

4. Ergebnisse

In den Proben mit NA / ADA (Abb. 14) verlief die Lipolyse bei den narkotisierten Ponys im

Gegensatz zu den geschlachteten intensiver. Der Mittelwert ist hier mit 18,7 ± 6,4 nmol FS /

min doppelt so groß wie der der Schlachthoftiere mit 9,0 ± 5,0 nmol FS / min. Der

Unterschied ist mit p = 0,023 gesichert.

Das gleiche Resultat wie in den Ansätzen mit NA / ADA ergab sich bei DBcAMP-

Stimulation (siehe Abb. 15).

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

5

10

15

20

25

30

35

DBcAMP-Ansätze des Inguinalfettes

n = 6 n = 5

Narkoseponys Schlachtponys

Abb. 15: Vergleich der Lipolyserate der DBcAMP–Ansätze des Inguinalfettes zwischen

geschlachteten und anästhesierten Ponys. Der Unterschied ist mit p = 0,019 signifikant.

53

4. Ergebnisse

Auch bei Zugabe von DBcAMP zum Testansatz war, wie in Abb. 15 ersichtlich, eine höhere

Lipolyserate bei den von in Narkose befindlichen Tieren gewonnenen Proben deutlich. Die

Mittelwerte lagen bei den narkotisierten Ponys bei 20,1 ± 7,2 nmol FS / min, bei den

geschlachteten Tieren bei 9,4 ± 4,7 nmol FS / min. Mit p = 0,019 ist das Ergebnis ebenfalls

signifikant.

Aufgrund der signifikanten Unterschiede zwischen Schlachttieren und narkotisierten Ponys

wurden die letztgenannten nicht in die folgenden Gruppenvergleiche integriert, obwohl ihre

Ergebnisse aussagekräftiger waren.

Die anästhesierten Ponys wurden nicht zuletzt auch aus Gründen der Unsicherheit bezüglich

der verwendeten Narkosemittel von übrigen Erhebungen ausgeschlossen, da es nicht sicher

war, ob die einzelnen Substanzen selbst lipolytisch aktiv waren. Da sich bei diesen Tieren

erhöhte Lipolyseraten ergaben, konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die verwendeten

Narkosemittel eventuell einen die Lipolyse steigernden Effekt hatten. Es erschien deshalb

angezeigt, bei den weiteren Studien nur Gewebe zu verwenden, die von Schlachttieren

stammten. Darüber hinaus verfügte das Institut nur über sechs eigene Tiere. Mit den

Schlachttieren stand eine deutlich größere Probandenzahl zur Verfügung. Des Weiteren war

diese Entscheidung auch im Hinblick auf den Tierschutz gefällt worden.

54

4. Ergebnisse

4. 5. Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

Um einen eventuell vorhandenen Einfluss des Geschlechts zu untersuchen, wurden die

DBcAMP-Ansätze weiblicher mit denen männlicher Tiere verglichen. Der Test wurde

getrennt nach Bauch– und Inguinalfett durchgeführt. Da keine Bauchfettproben männlicher

Ponys zur Verfügung standen, wurden Inguinal- und Bauchfettansätze von männlichen und

weiblichen Tieren zweimal miteinander verglichen. Beim ersten Versuchsdurchgang wurden

Proben gemessen, die sowohl von männlichen und weiblichen Ponys und Großpferden

stammten, während beim zweiten Versuchsdurchgang Proben nur von Großpferden

verglichen wurden.

10

20

30

40

50

n = 9 n = 17

(2 Ponys, (8 Ponys,

7 Pferde) 9 Pferde)

männlich weiblich

Abb. 16: Vergleich der Lipolyserate im Inguinalfett (1 mM DBcAMP) zwischen männlichen

und weiblichen Tieren. In den Daten sind Großpferde und Ponys enthalten.

55

4. Ergebnisse

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 6 n = 11

(6 Pferde, keine Ponys) (4 Ponys, 7 Pferde)

männlich weiblich

Abb. 17: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate im Bauchfett (1 mM DBcAMP) zwischen

männlichen und weiblichen Tieren. In den Daten sind Großpferde und Ponys enthalten. Der

Punkt • im Diagramm kennzeichnet jeweils einen Ausreißer.

56

4. Ergebnisse

In den Abbildungen 16 und 17 ist kein signifikanter Unterschied im Verlauf der Lipolyse in

Abhängigkeit vom Geschlecht feststellbar. Mittelwert und Standardabweichung aus den

Messungen mit Inguinalgewebe liegen bei 14,4 ± 10,7 nmol FS / min bei den männlichen

Tieren, bzw. betragen 16,0 ± 7,5 nmol FS / min bei den weiblichen Tieren.

Die Ergebnisse aus den Messungen mit Bauchfett wurden im Box Plot dargestellt (Abb. 17).

Der Median liegt bei den männlichen Tieren bei 14,5 nmol FS / min, bei den weiblichen

beträgt er 16,4 nmol FS / min.

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 7 n = 9

männlich weiblich

Abb. 18: Vergleich der Lipolyserate in den DBcAMP-Ansätzen (1mM) aus Inguinalfett

zwischen männlichen und weiblichen Tieren. In den Daten sind nur Großpferde enthalten.

57

4. Ergebnisse

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 6 n = 7

männlich weiblich

Abb. 19: Vergleich der Lipolyserate in den DBcAMP-Ansätzen (1 mM) aus Bauchfett

zwischen männlichen und weiblichen Tieren. In den Daten sind nur Großpferde enthalten.

58

4. Ergebnisse

Bei alleiniger Betrachtung der Daten von den Großpferden ergab sich ebenfalls kein

statistisch signifikanter Unterschied (siehe Abbildungen 18 und 19) hinsichtlich der

Geschlechterverteilung der Proben. Aufgrund der Normalverteilung der Daten konnten in

diesem Fall sowohl die Ergebnisse aus den Messungen an Bauch– als auch die des

Inguinalfettes im Säulendiagramm dargestellt werden.

Mittelwerte und Standardabweichungen betrugen für das Inguinalfett 16,1 ± 11,2 nmol

FS / min bei den männlichen bzw. 22,1 ± 6,1 nmol FS / min bei den weiblichen Tieren, für

das Bauchfett resultierten 19,2 ± 11,5 nmol FS / min bei den männlichen bzw. 21,2 ± 10,8

nmol FS / min bei den weiblichen Pferden.

Da sich für keine der genannten Testpaarungen statistisch signifikante Unterschiede ergaben,

wurden die Geschlechter in den nachstehend dargestellten Betrachtungen zusammengefasst

und nicht nach männlichen und weiblichen Tieren getrennt beurteilt.

59

4. Ergebnisse

4. 6. Lipolyserate in Fettgewebeproben unterschiedlicher Lokalisationen

Die Messungen der Lipolyserate erfolgten gleichermaßen an Bauch– und Inguinalfett in

Proben, die von Schlachtpferden genommen wurden. Mit diesem Versuchsansatz sollte

verifiziert werden, ob bei den beiden betrachteten Spezies –wie in Abb. 10 und 11 angedeutet-

tatsächlich unterschiedliche Lipolyseraten in Bauch- und Inguinalfettgewebe bestehen.

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 16 n = 13

Inguinalfett Bauchfett

Abb. 20: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in DBcAMP-Ansätzen (1 mM) zwischen

Inguinal– und Bauchfett der Großpferde. Der Punkt • im Diagramm kennzeichnet jeweils

einen Ausreißer.

60

4. Ergebnisse

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

50

n = 10 n = 4

Inguinalfett Bauchfett

Abb. 21: Vergleich der Lipolyserate in DBcAMP-Ansätzen (1 mM) zwischen Inguinal– und

Bauchfett der Ponys. Der Unterschied ist mit p = 0,047 signifikant.

Bei den Großpferden ergab sich in dieser Studie kein signifikanter Unterschied zwischen den

Lipolyseraten aus Geweben verschiedener Lokalisationen (Abb. 20). Die Mediane der Daten

lagen mit 16,1 nmol FS / min (Inguinalfett) und 16,6 nmol FS / min (Bauchfett) annähernd

auf gleichem Niveau.

Ein mit p = 0,047 schwach signifikanter Unterschied war dagegen in der Gruppe der Ponys zu

verzeichnen (Abb. 21). Die Lipolyserate im Bauchfett war mit einem Mittelwert von 18,3 ±

11,0 nmol FS / min höher angesiedelt als im Inguinalfett (Mittelwert 10,0 ± 4,0 nmol FS /

min).

61

4. Ergebnisse

4. 7. Vergleich der Lipolyseraten in Kontroll-, NA / ADA- und DBcAMP-Ansätzen

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

In den nachfolgend referierten Testansätzen wurden die Inkubationen sowohl ohne

Mediatoren (Kontrollen) als auch mit NA / ADA einerseits und DBcAMP andererseits

durchgeführt. Diese Gegenüberstellung ermöglichte es, die Beeinflussung der Lipolyse

sowohl durch die Rezeptorebene als auch durch die postrezeptorale Ebene zu vergleichen.

Darüber hinaus sollte auch die Reproduzierbarkeit der Resultate, die mit NA / ADA erzielt

wurden, überprüft werden (BREIDENBACH et al. 1999).

b

a

n = 4 n = 1 n = 4

Kontrolle NA / ADA DBcAMP

Abb. 22: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in den drei verschiedenen Probenansätzen des

Bauchfettes der Schlachtponys. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen

signifikanten Unterschied hin. p = 0,029.

62

4. Ergebnisse

Bei den Schlachtponys (siehe Abb. 22) standen nur vier Proben aus Bauchhöhlengewebe zur

Verfügung und es konnte nur ein Ansatz nach NA-Stimulation gemessen werden. Daher war

es in diesem Fall nicht möglich, die Varianzanalyse durchzuführen. In einem separat

durchgeführten t-test ergab sich jedoch für Kontrollen und DBcAMP-Ansätze ein mit

p = 0,029 signifikanter Unterschied.

Trotz der sehr geringen Probenzahl für NA / ADA-Messungen (n = 1) wurde der Vergleich

aller drei Testansätze aufgeführt. Das Ergebnis hinsichtlich der Fettsäurefreisetzung der

Ponyzellen nach Inkubation mit NA / ADA bestätigte die Befunde von BREIDENBACH

(1996).

63

4. Ergebnisse

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

5

10

15

20

b

a b

a


n = 6 n = 6 n = 10


Inguinalfettes der Schlachtponys. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen

signifikanten Unterschied hin.

Beim Inguinalfett der Ponys (siehe Abb. 23) ist ein mit p = 0,006 signifikanter Unterschied

zwischen den mit DBcAMP stimulierten Ansätzen und den Kontrollen ersichtlich, während

sich die Lipolyseraten in NA / ADA- und DBcAMP–haltigen Medien nicht deutlich

voneinander unterschieden, was durch die Mediane von 7,6 nmol FS / min (für NA / ADA)

und 10,4 nmol FS / min (für DBcAMP) erkenntlich wird. Der Median der Kontrollansätze

betrug 0,46 nmol FS / min.

64

4. Ergebnisse

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

b

a a

n = 9 n = 9 n = 9



Bauchfettes der Großpferde. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen einen signifikanten

Unterschied auf.

Auch bei der Betrachtung des Bauchfettes der Pferde (Abb. 24) ergibt sich ein als signifikant

anzusehender Unterschied bezüglich der mit DBcAMP stimulierten Zellsuspensionen im

Vergleich zu den Kontrollen bzw. zu den NA / ADA–haltigen Ansätzen (p = < 0,001),

während dieser zwischen den Kontrollen und mit NA / ADA versetzten Proben nicht besteht.

65

4. Ergebnisse

Die Mediane von Kontrollansätzen und NA / ADA–stimulierten Proben lagen mit 0,3 nmol

FS / min bzw. 1,8 nmol FS / min auf ähnlicher Höhe, während eine deutlich höhere

Lipolyserate in den DBcAMP–haltigen Inkubationsansätzen durch einen Median von 16,6

nmol FS / min angezeigt wird.

Fetts

äure

frei

setz

ung

in n

mol

/ m

in

0

10

20

30

40

c

b

a

n = 9 n = 9 n = 9


Abb. 25: Vergleich der Lipolyserate in den drei verschiedenen Probenansätzen des

Inguinalfettes der Großpferde. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen einen signifikanten

Unterschied auf.

66

4. Ergebnisse

Im Vergleich des Inguinalfettes der Großpferde (siehe Abb. 25) ist ebenfalls ein signifikanter

Unterschied erkennbar (p = < 0,001), der sich in diesem Fall jedoch auf alle gegeneinander

getesteten Probenansätze bezieht. Die Lipolyserate der DBcAMP–stimulierten Proben mit

einem Mittelwert von 19,3 ± 8,7 nmol FS / min erreicht dabei etwa die doppelte Höhe der

NA / ADA–haltigen Testansätze, bei denen der Mittelwert 8,7 ± 4,1 nmol FS / min beträgt.

67

5. Diskussion

5. DISKUSSION

Die vorliegende Studie sollte einen Beitrag zur Klärung der Frage liefern, inwieweit der

lipolytisch wirksamen cAMP-Kaskade für die Einstellung der Aktivität der Hormonsensitiven

Lipase beim Pony hinsichtlich der Hyperlipämieentstehung eine wichtige Rolle zukommt.

Nachdem die bisherigen Untersuchungen (s. Einleitung) nicht für einen ausschlaggebenden

Effekt auf die Lipolyse vor und an den Adipocytenrezeptoren sprechen (WRAGE 2002), war

nunmehr beabsichtigt, in einer ersten Studie eventuelle postrezeptorale Einflüsse vor allem

auf die Hormonsensitive Lipase aufzudecken. Wegen der unterschiedlichen

Empfindlichkeiten gegenüber der betrachteten Fettstoffwechselentgleisung wurde in dieser

Untersuchung wiederum der Speziesvergleich Pony-Großpferd durchgeführt. Aufgrund seiner

Lipidlöslichkeit und der Membrangängigkeit wurde isolierten Adipocyten beider Pferderassen

Dibutyryl-cAMP im Lipolysemedium zugesetzt. Somit konnte die Empfindlichkeit der

Lipolyse gegenüber dem Second-messenger cAMP überprüft werden. Zur Bestimmung der

Lipolyseraten eignete sich das von BREIDENBACH et al. (1998) entwickelte Messverfahren,

das die Freisetzung von langkettigen Fettsäuren aus TGL bestimmt.

5.1. Versuchsanstellung und Methodik

5.1.1. Versuchstiere

Da diese Studie das Ziel verfolgte, Unterschiede im Fettstoffwechsel zwischen Großpferden

und Ponys darzustellen, wurden Proben beider Spezies in die Versuche aufgenommen.

Die Gruppe der Schlachttiere stellte sich naturgemäß als weitgehend inhomogen dar. Um

dennoch möglichst einheitliches Material zu erhalten, wurden bei den Großpferden

ausschließlich Warmblutpferde, hier vorwiegend Hannoveraner, beprobt, während Kaltblüter,

Vollblüter und andere Zuchten keine Verwendung fanden. Für die Ponyproben wurden

Shetland–Ponys oder Kreuzungen aus dieser Rasse gewählt, da hier eine Prädisposition zum

equinen Hyperlipämie–Syndrom besteht (THILSTED et al. 1982; WATSON et al. 1992;

68

5. Diskussion

MOORE et al. 1994; DIETZ u. HUSKAMP 1999). Die Probengewinnung gestaltete sich

schwierig, da Ponys sehr selten zur Schlachtung angeliefert werden.

Es standen zusätzlich Ponys zur Verfügung, die im Institut für Physiologische Chemie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover gehalten wurden. Dabei handelte es sich ausnahmslos

um männliche Tiere (Wallache). Bei den Schlachttieren wurden allerdings Gewebeproben

sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren genommen. Bei den Untersuchungen

im Rahmen dieser Arbeit war eine nach dem Geschlecht getrennte Betrachtung nicht

erforderlich, weil die vergleichende Fettsäurefreisetzung in den Fettgeweben männlicher und

weiblicher Tiere keine Einwirkung des Geschlechts erkennen ließ (s. S. 55, Kapitel 4.5.).

Dieser Sachverhalt wird unter Punkt 5.2.4. (Seite 80) der Diskussion näher erläutert werden.

5.1.2. Schlachtung und Operation

In dem auf die Pferdeschlachtung spezialisierten Betrieb wurden einmal wöchentlich Tiere

zur Gewinnung von Lebensmitteln geschlachtet. Zum Teil wurden diese unmittelbar vor der

Tötung angeliefert, andere waren bereits Tage oder Wochen auf dem Betriebsgelände

eingestallt. Da es sich um einen Familienbetrieb handelt und nur ein kleiner Schlachtraum

vorhanden ist, wurden die Pferde einzeln zur Schlachtung geführt und wie bereits beschrieben

(s. 3.1.3.2. auf Seite 25) getötet. Die Probenentnahme erfolgte direkt nach der Ausweidung

und Teilung der Tierkörper. Bei der Auswahl der Schlachttiere wurden vornehmlich solche

bevorzugt, die schon mehrere Tage im Betrieb eingestallt waren. Bei diesen Tieren war eine

einheitliche Fütterung gewährleistet (s. 3.1.2. S. 24) und somit ein variabler Einfluss der

Fütterung auf die Messwerte nicht anzunehmen.

Bei den Ponys des Instituts für Physiologische Chemie wurden ausreichend große Proben nur

von subkutanem Inguinalfett genommen, nachdem ein Hautschnitt angelegt wurde. Dies war

erforderlich, da eine Probennahme mittels Biopsienadel nicht ausreichend Gewebe geliefert

hätte und ein derartiger Eingriff mit Hinblick auf die Lokalisation (Nähe Penis)

wahrscheinlich von den Probanden nicht ohne Allgemeinnarkose toleriert worden wäre und

diese erheblichem Stress ausgesetzt hätte.

69

5. Diskussion

Zur Durchführung der Vollnarkose wurde eine Kombination aus Romifidin, Diazepam,

Ketamin und Guaifenesin gewählt und im so genannten Triple Drip angewendet. Dies erwies

sich nach eigenen Beobachtungen als sanfte Methode, bei der die Tiere ohne Vorkommnisse

ein ausreichend tiefes Toleranzstadium erreichten, während der gesamten Dauer der

Operation eine ruhige Lage zeigten und nach Beendigung der Infusion rasch erwachten. Die

Aufwachphase gestaltete sich dabei ohne Exzitationen und mit einer schnellen Erholung.

Auf die eventuelle Wirkung der eingesetzten Medikamente auf die für den Fettabbau

wichtigen Parameter wird auf Seite 78 im Abschnitt 5.2.3. eingegangen.

5.1.3. Probenmaterial

Jedem Probanden wurden etwa vier bis fünf Gramm Fettgewebe entnommen. Die Wahl fiel

dabei sowohl auf subkutanes Gewebe aus dem Inguinalbereich als auch auf Bauchhöhlenfett.

Ausschlaggebend für die Entscheidung zur Verwendung der Gewebe beider Lokalisationen

war dabei, dass im hiesigen Institut bereits Studien durchgeführt wurden, die beide Gewebe

betrafen, wobei BREIDENBACH (1996) Inguinalfett nutzte und WRAGE (2002) Bauchfett

bearbeitete. Darüber hinaus können bei gleichzeitigem Einsatz in der gleichen Studie evtl.

Unterschiede der beiden Lokalisationen hinsichtlich der lipolytischen Aktivitäten aufgedeckt

werden (s. S. 83 Kapitel 5.2.5.).

Auch CARPENE et al. beschrieben 1994 die Anwendung von subkutanem Inguinalfett für

Lipolysestudien beim Meerschweinchen. Eine Vielzahl von Autoren (u. a. NILSSON u.

BELFRAGE 1979; FREDRIKSON et al. 1981; SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a;

FARIAS–SILVA et al. 1999) verwendete für ihre Lipolyseuntersuchungen epididymales

Fettgewebe der Ratte. Diese Lokalisation wurde v. a. deshalb beprobt, weil die Gewinnung

von Fettgewebe sehr leicht und schnell erfolgen kann. Depotfett aus dieser Region steht bei

Pferden jedoch nicht zur Verfügung, sondern stellt vielmehr eine Besonderheit bei Nagetieren

(POND 1987) dar.

70

5. Diskussion

5.1.4. Isolierung der Adipocyten

Die von RODBELL (1964) geschilderte Methode ist ein gängiges Verfahren zur Gewinnung

vereinzelter Zellen, das in der Literatur von einer Vielzahl von Autoren, darunter NILSSON

und BELFRAGE (1979), LANGIN et al. (1992), MORIMOTO et al. (2001) und auch zur

Separation von humanen Fettzellen (BURNS et al. 1972; WAHRENBERG et al. 1987;

KATHER 1988) beschrieben wurde.

Aufgrund der Dauer des Transports der Proben vom Schlachtbetrieb zum Labor erfolgte die

Isolierung der Fettzellen aus Schlachtmaterial im Vergleich zum operativ im hiesigen Institut

entnommenen Gewebe, welches unmittelbar nach der Gewinnung bearbeitet werden konnte,

mit einer zeitlichen Verzögerung von z.T. fünf Stunden. Es musste deshalb nach der

Vereinzelung der Zellen deren Lebensfähigkeit überprüft werden. Die durchgeführte

Live / dead-Färbung, die dem Nachweis der Lebensfähigkeit von Zellen dient, zeigte aber

eindeutig eine hohe Integrität der Adipocyten mit einem nur geringen Anteil toter Zellen (s.

Abb. 6 S. 29).

Abweichend von der nach BREIDENBACH (1996) geschilderten Durchführung der Methode

zum Isolieren der Fettzellen (Separieren der Adipocyten bei Zimmertemperatur) wurde dieser

Teil der Versuche im Brutraum bei einer Temperatur von 37°C vorgenommen.

Von ROCHON u. BUKOWIECKI (1990) wurde ein Einfluss niedriger

Umgebungstemperaturen auf die Lipolyse beschrieben. Die Autoren stellten eine Abnahme

der Sensitivität von Adipocyten gegenüber Catecholaminen fest, nachdem die Zellen von

Ratten gewonnen wurden, die sieben Tage lang einer Temperatur von 5°C ausgesetzt waren.

Für die Sensitivität gegenüber Dibutyryl–cAMP war in ihren Untersuchungen kein Einfluss

unterschiedlicher Umgebungstemperaturen nachweisbar.

Da die Lipolyse in der vorliegenden Studie nicht nur mit DBcAMP, sondern vergleichend

auch mit NA als Vertreter der Catecholamine stimuliert werden sollte, musste ein möglicher

Kälteeinfluss vermieden werden. Das Fehlen einer derartigen Einwirkung konnte aber für die

eigenen Versuche einerseits nicht gänzlich ausgeschlossen werden, weil oben genannte

Autoren die Auswirkungen der niedrigeren Temperaturen auf die Spaltung der Triglyceride

erst nach sieben Tagen überprüften und aus ihren Ergebnissen nicht hervorgeht, ob eine

frühere Beeinträchtigung der Lipolyse zu erwarten ist. Andererseits war der Einfluss einer

71

5. Diskussion

Umgebungstemperatur unterhalb 37°C auf die Spaltung von Fetten in dieser Arbeit nicht sehr

wahrscheinlich, da BREIDENBACH (1996) die Proben bei einer Temperatur < 37°C

bearbeitete und nicht über eine nachteilige Beeinflussung berichtete. Darüber hinaus waren

die für diese Studie beprobten Tiere nicht dauerhaft einer Temperatur von 5°C ausgesetzt.

Dennoch erfolgte das Separieren der Zellen im Brutraum, um möglichst konstant

physiologische Bedingungen einzuhalten.

Wegen der großen Empfindlichkeit von Fettzellen bedurfte die Bearbeitung höchster Sorgfalt.

So wurden sowohl für die Isolierung als auch für die Messungen der Lipolyserate

Plastikbehältnisse (Küvetten aus Acryl) verwendet, da dieses Material im Gegensatz zu Glas,

wie schon von RODBELL (1964) beschrieben, schonender für die Adipocyten ist,

wohingegen Oberflächen aus Glas einem Großteil der Zellen Membranschäden zufügte.

Die Carbogenbegasung erforderte ebenfalls ein hohes Maß an Sorgfalt und wurde für jeden

Ansatz neu reguliert, da ein zu starkes Aufwirbeln der Suspension ebenso zu Brüchen der

Adipocytenmembranen führte, was dann an einer über den Zellen schwimmenden homogenen

Fettschicht erkennbar war.

5.1.5. Bestimmung der Lipolyserate

Zur Messung der Lipolyse stehen einige Verfahren zur Verfügung.

So wird in der Literatur oftmals die Freisetzung von Glycerol aus Fettzellen in das

Inkubationsmedium beschrieben (ROCHON u. BUKOWIECKI 1990; LANGIN et al. 1992;

MORIMOTO et al. 2001) und NILSSON u. BELFRAGE (1979) entwickelten eine Methode,

bei der die Lipolyse über pH-stat-Titration gemessen wurde. Dabei werden die aus den

stimulierten Adipocyten zusammen mit einer äquivalenten Menge Fettsäuren abgegebenen

Protonen mit NaOH titriert. Die Menge NaOH, die benötig wird, um den vorher eingestellten

pH-Wert des Mediums konstant zu halten, entspricht dabei der Menge freigesetzter

Fettsäuren.

Bei all diesen Bestimmungsmöglichkeiten werden jedoch Adipocyten von Ratten verwendet,

so dass eine Methode entwickelt werden musste, die auch bei equinen Zellen angewendet

72

5. Diskussion

wird. Diese wurde erstmals von BREIDENBACH (1996) etabliert und kommt ebenfalls in der

vorliegenden Studie zum Einsatz. Hierbei wird die Fettsäurefreisetzung aus Adipocyten durch

die sich ergebende Abnahme des pH–Wertes (s.o.) fluorophotometrisch über das

pH–sensitive Fluorochrom SNAFL-1 bestimmt.

Zwar besteht ein inhibierender Einfluss von niedrigen pH–Werten auf die Lipolyse, der

sowohl in vitro (HJEMDAHL u. FREDHOLM 1976, 1977; FAIN u. SHEPHERD 1975) als

auch in vivo (HJEMDAHL u. FREDHOLM 1974) auftritt. Diesen stellte BREIDENBACH

(1996) in seinen Versuchen jedoch nicht fest und konnte ihn für seine Untersuchungen

ausschließen, obwohl die Messungen über einen Zeitraum von zwei Stunden andauerten.

In der eigenen Studie haben sich in einigen Versuchen teilweise gegen Ende der Messung

(110-120 Minuten) abfallende Kurvenverläufe ergeben, die darauf zurückzuführen sein

könnten, dass die Lipolyserate aufgrund des niedrigen pH–Wertes im Medium abnahm.

Bedeutend für die Fettsäurefreisetzung in das umgebende Medium ist weiterhin dessen

Albuminkonzentration. Albumin stellt seinerseits einen Puffer dar, der Fettsäuren zu binden

vermag. Eine zu hohe Konzentration würde die Messungen aufgrund der Pufferwirkung

verfälschen. Andererseits ist seine Anwesenheit jedoch erforderlich, da die FS über die

Bindung an Albumin aus der Fettzelle hinaustransportiert werden. Ohne Albumin findet keine

Fettsäurefreisetzung aus den Zellen statt (MEISNER u. TENNEY 1977).

Gemäß der früheren Ergebnisse von BREIDENBACH (1996) konnte eine niedrige

Albuminkonzentration (BSA) von 0,5% im Inkubationsmedium eingehalten werden, wobei

FS freies BSA (FS ≤ 0,02%) verwendet wurde.

5.2. Versuchsergebnisse

5.2.1. Die Lipolyserate

Die Messung der Lipolyserate in den Kontrollansätzen, die keine stimulierenden Agenzien im

Inkubationsmedium enthielten, ergab keine Änderung der relativen Fluoreszenz. Dieses

Resultat war zu erwarten, denn schon NILSSON und BELFRAGE (1979) und

BREIDENBACH et al. (1998, 1999) beobachteten bei ihren Untersuchungen weder in

73

5. Diskussion

Adipocyten von Ratten noch Pferden oder Ponys eine Fettsäurefreisetzung ohne vorherige

Stimulation der Lipolyse beispielsweise durch NA.

Die Messungen im NA-stimulierten Ansatz erfolgten gemäß BREIDENBACH (1996, 1998,

1999), der die Lipolyseraten vergleichend anhand von Rattenadipocyten und Fettzellen von

Großpferd bzw. Pony untersuchte und diese mit NA stimulierte, bei gleichzeitigem

Vorhandensein von ADA im Inkubationsmedium. Dabei beobachtete er, dass zur Messung

einer Fettsäurefreisetzung die alleinige Zugabe von NA zum Testansatz bei den Rattenzellen

ausreichend war. Selbiges ergab sich für Adipocytensuspensionen von Ponys. Dagegen war

bei den Zellen der Großpferde im NA-haltigen Ansatz keine Fettsäurefreisetzung messbar.

Hier bedurfte es darüber hinaus dem Hinzufügen von ADA zum Medium, um den

antilipolytischen Einfluss des sich in Fettzellsuspensionen anreichernden Adenosins

(KATHER 1988) auszuschalten.

Adenosin stellt ein Nukleosid dar, das über eigene Rezeptoren (A1-Rezeptoren) auf der

Oberfläche der Fettzellen eine inhibierende Wirkung auf die Lipolyse ausübt, indem durch

seine Bindung der intrazelluläre cAMP-Gehalt durch Hemmung der Adenylatcyclase gesenkt

wird (LONDOS et al. 1980).

Eine Anreicherung von Adenosin während der Inkubation von Fettzellen ist laut KATHER

(1988) unvermeidbar, da aus isolierten und geschädigten Zellen kontinuierlich

Adeninnukleotide abgegeben und diese außerhalb der Zellen durch Nukleotidasen zu

Adenosin metabolisiert werden. Dies führt zu seiner Anreicherung im umgebenden Medium.

Dabei ist das Ausmaß der Adenosinakkumulation abhängig von der Zelldichte im Testansatz

(KATHER 1988).

Der Adenosinantagonist ADA verdrängt Adenosin enzymatisch von seinen Rezeptoren

(SHECHTER 1982).

Auch Adipocyten von Ponys steigern bei Zusatz von ADA zum Inkubationsmedium ihre

Lipolyserate (BREIDENBACH et al. 1999). Um für die eigenen Versuche gleiche

Voraussetzungen für die Messung der Fettsäurefreisetzung zu schaffen und dabei eine

möglichst große Änderung der relativen Fluoreszenz messen zu können, wurde sowohl den

Ansätzen aus Pferdeadipocyten als auch denen aus Fettzellen der Ponys der

74

5. Diskussion

Adenosinantagonist hinzugefügt. Dabei wurde stets die gleiche Menge ADA eingesetzt, da

die Neigung der Verlaufskurven über die Fettsäurefreisetzung gemäß BREIDENBACH et al.

(1998) nicht durch unterschiedliche Konzentrationen beeinflusst wird.

Darüber hinaus macht die graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse in NA-

stimulierten Testansätzen (Abb. 10 und 11) eine höhere Fettsäurefreisetzung bei Ponyzellen

im Gegensatz zu Adipocyten der Großpferde deutlich. Dieses Ergebnis der eigenen

Untersuchungen deckt sich mit den Aussagen von BREIDENBACH et al. (1998, 1999), die

ebenfalls von einer besseren Stimulierbarkeit der Ponyfettzellen mit NA berichteten. Sie

führen dies darauf zurück, dass der Gehalt an Adenosin in den Suspensionen aus Fettzellen

von Ponys entweder nicht ausreichend ist, um die Lipolyse zu hemmen oder diese Zellen

nicht sensitiv genug für den hemmenden Einfluss des Nukleosids sind. Diese These ist

durchaus schlüssig, berichten doch u.a. SHECHTER (1982), MERSMAN (1992) und

GOKMEN-POLAR et al. (1996) über Unterschiede hinsichtlich der Sensitivität gegenüber

Adenosin zwischen verschiedenen Spezies. BREIDENBACH et al. (1998) stimulierten

Rattenadipocyten ebenfalls nur mit NA und verzeichneten eine deutliche Fettsäurefreisetzung.

Auch Zellen dieser Spezies scheinen offensichtlich nicht auf die Gegenwart von ADA im

Inkubationsmedium angewiesen zu sein, was darauf hindeutet, dass sie hierfür weniger

empfindlich sind oder die stimulierenden Agenzien eine höhere Aktivierungspotenz

aufweisen. Diese Aussage wird durch Ergebnisse von GOKMAN-POLAR et al. (1996)

gestützt.

Nach Zugabe von ADA zum Inkubationsmedium ermittelten BREIDENBACH et al. (1999)

auch für die Ponyfettzellen eine deutlich höhere Lipolyserate verglichen mit der aus den

Messungen an Adipocyten von Großpferden.

Im Rahmen dieser Studie wurde zusätzlich ein Vergleich von Kontrollen, NA / ADA- und

DBcAMP- Ansätzen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 22-25 im Kapitel

4.7. dargestellt.

75

5. Diskussion

Die oben genannte Beobachtung, dass Ponyzellen stärker auf eine Anregung mit NA / ADA

reagieren als Fettzellen von Großpferden, scheint auf eine DBcAMP-vermittelte Stimulation

der Adipocyten nicht zuzutreffen, wurden doch in der vorliegenden Studie für die genannten

Ansätze ähnliche Lipolyseraten ermittelt.

Dennoch ergaben sich Unterschiede zwischen BREIDENBACHS und den eigenen

Untersuchungen in Bezug auf die Lipolyserate in den mit NA stimulierten Testansätzen.

Während er eine lineare Fettsäurefreisetzung über 120 Minuten messen konnte, war ein

Anstieg der Verlaufskurven in den eigenen Versuchen mit einer Verzögerung erst nach 50 bis

60 Minuten zu verzeichnen. Auch HONNOR et al. (1985) erwähnen eine derartige lag-Phase,

welche von BREIDENBACH et al. (1998) mit der Akkumulation von Adenosin im

Testansatz in Verbindung gebracht wird. Diese Erklärung erscheint jedoch für die vorliegende

Studie unwahrscheinlich, da diese Verzögerung nicht nur bei den Zellen der Großpferde

auftrat, sondern auch bei Adipocytensuspensionen der Ponys, obwohl sich diese als

weitgehend unbeeinflusst von Adenosin bezüglich ihrer Lipolyserate erwiesen haben

(BREIDENBACH et al. 1999). Ein anderer Erklärungsansatz für die verspätet einsetzende

Fettsäurefreisetzung in den eigenen Versuchen gilt dem verwendeten BSA. BSA besitzt

Puffereigenschaften und verfügt über mehrere Bindungsstellen für Fettsäuren (SPECTOR u.

FLETCHER 1978; BREIDENBACH 1996). BREIDENBACH (1996) verwendete ein

Albumin mit einem Restfettsäuregehalt von 0,1 %, in dieser Studie kam ein BSA mit

geringerem Gehalt, nämlich < 0,02 % zum Einsatz. Es wäre also denkbar, dass dieses

Albumin über mehr freie Bindungsstellen verfügt und folglich mehr Fettsäuren aufnimmt,

bevor diese als FFS über das Messsystem detektiert werden können und so eine Änderung der

relativen Fluoreszenz deutlich wird.

Des Weiteren kann derzeit nicht ausgeschlossen werden, dass die Charge des eingesetzten

Farbstoffes aufgrund von Schädigungen bei der Lagerung an Intensität gegenüber pH-

Wertverschiebungen eingebüßt hatte.

76

5. Diskussion

5.2.2. DBcAMP als Stimulans der Lipolyse

In dieser Arbeit wurden die Raten der Fettsäurefreisetzungen auch nach Zugabe von drei

unterschiedlichen Konzentrationen DBcAMP, nämlich 0,5 mM, 1,0 mM und 1,5 mM, zu den

entsprechenden Testansätzen miteinander verglichen. Die im Anschluss an die Messungen

erstellten Graphen zeigten einen wenig unterschiedlichen, beinahe parallelen Verlauf, was

darauf schließen ließ, dass die Lipolyserate durch steigende DBcAMP-Konzentrationen im

Medium nicht wesentlich erhöht werden kann. Folglich kam bei allen Messungen die mittlere

Konzentration von 1,0 mM DBcAMP zum Einsatz. Diese ist gleichzeitig die in der Literatur

am häufigsten beschriebene und von den Autoren verwendete Konzentration (BURNS et al.

1972; WAHRENBERG et al. 1989; TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-MELOU et al.

1999; FARIAS-SILVA et al. 1999; PORTILLO et al. 1999; MORIMOTO et al. 2001), wobei

jedoch auch niedrigere (GOKO et al. 1984; HELLMER et al. 1992) bzw. höhere

Konzentrationen erwähnt werden (ROCHON u. BUKOWIECKI 1990).

Die Unterschiede der Lipolyseraten in Abhängigkeit von der DBcAMP-Konzentration haben

sich für die eigenen Versuche als nicht signifikant erwiesen. Ob hohe DBcAMP-Gehalte im

Inkubationsmedium, wie bspw. 5 mM (ROCHON u. BUKOWIECKI 1990) die Lipolyserate

tatsächlich in entscheidendem Maße erhöht hätte, kann hier nicht geklärt werden, da alle oben

genannten Autoren die Lipolyserate über die steigende Freisetzung von Glycerol im Medium

ermittelt haben, in der vorliegenden Studie jedoch die Fettsäurefreisetzung über den Abfall

des pH-Wertes detektiert wurde. Die resultierenden Graphen sind somit nicht unmittelbar

miteinander vergleichbar.

Das verwendete DBcAMP war für die Versuche besonders geeignet, da es durch die beiden

Butyrylgruppen genügend lipophil ist und ihm dadurch die Penetration von biologischen

Membranen möglich ist (BLECHER et al. 1970).

77

5. Diskussion

5.2.3. Lipolyseraten bei Schlachtponys und anästhesierten Ponys

Beim Vergleich der Lipolyseraten zwischen Geweben aus geschlachteten und narkotisierten

Ponys fiel auf, dass sowohl in NA-haltigen wie auch in DBcAMP-stimulierten Testansätzen

von in Narkose gewonnenen Zellen eine signifikant höhere Fettsäurespaltung ablief als bei

den von Schlachttieren entnommenen Gewebeproben.

Es lag die Vermutung nahe, dass diese erhöhte Lipolyserate auf den Einfluss der zur Narkose

eingesetzten Medikamente zurückzuführen sein könnte.

Tatsächlich berichten ADAMS et al. (1992, 1994) über eine derartige Beeinflussung beim

Menschen und von einer deutlichen Stressreaktion unter Ketaminnarkose. Sie stellten

signifikant höhere Werte für Adrenalin, NA, ACTH, Cortisol und freies Glycerol im Plasma

der Probanden fest als vor der Narkose.

Die ersten vier Substanzen sind nachweislich dazu in der Lage, die Lipolyse bei Säugern,

inklusive des Menschen, zu stimulieren (WATSON u. LOVE 1994; SAHLEH et al. 1999).

Wie man jedoch den Untersuchungen von TAYLOR et al. (1995) und LUNA et al. (1996)

entnehmen kann, die zur Narkose ihrer Versuchsponys eine Kombination aus Detomidin,

Ketamin und Guaifenesin verwendeten, geht von diesen Pharmazeutika keine positive

Einwirkung auf die Lipolyse aus. Anhand von Blutproben wurden vor, während und nach der

Narkose neben anderen die Plasmagehalte von Cortisol und Catecholaminen gemessen.

Jedoch ergaben sich für letztere aufgrund fehlender sympathischer Stimulation während der

Narkose keine Veränderungen und die Konzentration an Cortisol nahm signifikant ab.

Das beschriebene Narkoseregime verursachte darüber hinaus eine Hyperglycämie, von der

vermutet wird, dass sie eine normale Reaktion der Nebennierenrinde auf Stress verhindert

(TAYLOR et al. 1995), was eine sinkende Cortisolkonzentration erklären würde.

In der vorliegenden Studie wurde statt Detomidin Romifidin eingesetzt, das jedoch der

gleichen Wirkstoffgruppe entstammt. Basierend auf den genannten Ergebnissen von

TAYLOR et al. (1995) wird für die eigenen Versuche eine stimulierende Wirkung der

Narkosemittel als Begründung für die gesteigerte Fettsäurefreisetzung in der Gruppe der

operierten Ponys ausgeschlossen.

78

5. Diskussion

Ein weiterer Ansatzpunkt zur Erklärung ist die Tatsache, dass die zur Operation

herangezogenen Tiere bereits mehr als zwölf Stunden zuvor einer erheblichen Stresssituation

ausgesetzt waren. Ihnen wurde bereits am Nachmittag des Vortages das Futter entzogen und

die Einstreu aus der Box entfernt, während die Stallgefährten weiterhin die normale Ration

erhielten. Dieses Vorgehen erzeugte zweifelsohne mentalen Stress, was darauf schließen lässt,

dass das jeweils betroffene Tier schon vor Einleitung der Narkose eine erhöhte

Fettmobilisation aufgewiesen haben könnte. Denn durch Stress wird die Nebenniere aktiviert

und aus der Rinde Cortisol freigesetzt, welches die Lipolyse stimuliert und darüber hinaus die

Effektivität von zirkulierendem Insulin reduziert, so dass seine antilipolytische Wirkung

aufgehoben wird (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; MOGG u. PALMER 1995).

Die eingangs angeführte These wird gestützt durch die Ergebnisse von FARIAS-SILVA et al.

(1999), die die Lipolyserate an Ratten untersuchten, welche zuvor erheblichem Stress in Form

von Elektroschocks unterzogen worden waren. Sowohl basale als auch stimulierte Lipolyse

waren bei den gestressten Tieren deutlich höher als bei den Kontrolltieren. Es ist nicht

auszuschließen, dass sich diese Erkenntnisse auf Ponyfettzellen übertragen lassen, da sich die

Adipocyten beider Spezies in BREIDENBACHS (1996, 1998) Arbeiten ähnlich verhielten.

JEFFCOTT u. FIELD (1985 a) nennen des Weiteren operative Eingriffe als Ursache für eine

erhöhte Triglyceridmobilisation durch Stressinduktion.

Auch GOLENZ et al. (1992) erwähnen Stress als Auslöser für die Sekretion von Adrenalin,

NA, ACTH und Glucagon, die die Lipolyse über eine Aktivierung der HSL vorantreiben.

Außerdem führt Stress beim Menschen über Aktivierung des sympathischen Nervensystems

zu einer deutlichen Erhöhung der lipolytischen Aktivität im Fettgewebe, wobei sowohl

mentaler (HAGSTRÖM-TOFT et al. 1993) als auch physischer Stress (WAHRENBERG et

al. 1987; ARNER et al. 1990) dies auslösen können.

FORHEAD et al. (1995) berichten von gefasteten Eseln, bei denen ebenfalls erhöhte

Cortisolwerte im Plasma gemessen wurden, ähnlich wie bei Ponys (FREESTONE et al.

1992).

Darüber hinaus könnte das Fasten die institutseigenen Ponys bereits in eine negative

Energiebilanz geführt haben, woraus ebenfalls eine Triglyceridmobilisierung aus Fettgewebe

durch die HSL resultiert (MOGG u. PALMER 1995).

79

5. Diskussion

Ob bei den Institutsponys die Plasmawerte der genannten, die Fettmobilisation fördernden

Mediatoren vor der operativen Probenentnahme erhöht waren, kann hier abschließend nicht

bewiesen werden, weil keine Blutproben zu deren Bestimmung entnommen wurden.

Im Vergleich zu den operierten Tieren waren die geschlachteten Ponys weniger Stress

ausgesetzt, weil die Mehrzahl der Probanden bereits Tage oder Wochen vor der Schlachtung

in den betriebseigenen Stallungen untergebracht und daher mit der Umgebung vertraut waren.

Außerdem wurden sie weiterhin gefüttert.

Gerade bei den unmittelbar vor der Schlachtung angelieferten Tieren lässt sich eine

Stresseinwirkung dennoch nicht völlig ausschließen, angemerkt seien hier besonders der

Transportstress und seine Folgen auf die Fettmobilisation (FORHEAD et al. 1995), welche

jedoch möglicherweise über eine zu kurze Zeitspanne einwirkte, als dass sie über eine erhöhte

Lipolyse in den Messungen deutlich geworden wäre.

5.2.4. Der Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate

Vom equinen Hyperlipämie-Syndrom sind vor allem Stuten betroffen (THILSTEDT et al.

1982; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; WATSON u. LOVE 1994), Hengste dagegen selten, und

Wallache scheinen eine mittlere Stellung zwischen beiden Geschlechtern einzunehmen

(FÜRLL u. SCHÄFER 1992).

Aufgrund dieser Erscheinung sollte in dieser Arbeit in einem Vergleich der Lipolyseraten

zwischen männlichen und weiblichen Tieren zu klären versucht werden, inwieweit das

Geschlecht die Fettmobilisation bestimmt. Die Untersuchungen konnten jedoch dahingehend

keinen Aufschluss bringen. Ein signifikanter Unterschied in dem Ausmaß der

Fettsäurefreisetzung zwischen Stuten und Wallachen konnte nicht ermittelt werden. Dabei

muss aber berücksichtigt werden, dass die Studie in vitro erfolgt ist, was keinen endgültigen

Schluss auf die in vivo-Verhältnisse zulässt.

Vielfach wird das gehäufte Auftreten bei Stuten mit der hormonellen Ausstattung der Tiere in

Verbindung gebracht, wobei besonders das Progesteron in Betracht gezogen wird (FÜRLL u.

SCHÄFER 1992). Dieses Hormon inhibiert die antilipolytische Wirkung des Insulins

80

5. Diskussion

(TARRANT et al. 1998; SCHMIDT et al. 2001), so dass sein hemmender Einfluss auf die

Triglyceridspaltung über eine Hemmung der Aktivität der HSL entfällt (PERLEY u. KIPNIS

1966; JEFFCOTT u. FIELD 1985 b; MOGG u. PALMER 1995; SCHMIDT et al. 2001) und

FS vermehrt aus dem Gewebe abgegeben werden können. Beim Menschen ist der

Progesterongehalt abhängig vom Zyklus, wobei die Werte in späteren Zyklusphasen ansteigen

(REBUFFE-SCRIVE et al. 1985). Auch den Östrogenen kommt eine stimulierende Wirkung

bezüglich der Lipolyse zu (SALEH et al. 1999).

Bei tragenden Stuten muss darüber hinaus die Bedeutung des Prolaktins beachtet werden, das

die Aktivität der LPL induziert (WATSON et al. 1993), woraus ein weiterer Anstieg der

NEFA im Blut resultiert, sofern deren Internalisierung in die Zielzellen nicht mit der

Freisetzungsrate korreliert. Eine positive Beeinflussung der Lipolyseraten durch Prolaktin

kann für die vorliegende Studie jedoch ausgeschlossen werden, da keine tragenden Tiere der

Schlachtung zugeführt worden sind und Gewebeproben somit nicht verfügbar waren.

Die Rolle des Geschlechts bezüglich der Fettmobilisation in humanen Adipocyten wird

kontrovers diskutiert. RICHELSEN (1986) fand in seinen Untersuchungen eine signifikant

höhere basale Lipolyserate bei Frauen als bei Männern und auch die Stimulation mit dem

β-Agonisten Isoproterenol zeigte bei weiblichen Probanden eine signifikant höhere

lipolytische Wirkung als bei männlichen. Dasselbe Ergebnis erhielt der Autor nach

Stimulation der α-Rezeptoren, wodurch eine Hemmung der Triglyceridspaltung ausgelöst

wird. Dieser Effekt war bei Frauen ebenfalls stärker als bei Männern, was auf den höheren

α-Rezeptorenbesatz der weiblichen Fettzellen zurückgeführt wurde. Auf den Adipocyten

beider Geschlechter ließen sich dagegen gleich viele β-Rezeptoren nachweisen.

Eine gegenteilige Feststellung machten HELLMER et al. (1992), die keine

geschlechtsspezifischen Unterschiede bezüglich der Lipolyse an menschlichen Fettzellen

beobachteten. Dieses Ergebnis könnte mit der Tatsache in Zusammenhang stehen, dass in

beiden Arbeiten Gewebe unterschiedlicher Lokalisationen verwendet wurden, die

unterschiedliche lipolytische Aktivität besitzen (TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-

MELOU et al. 1999). Auch die Bedingungen der Probenentnahme variierten.

Ob der fehlende Geschlechtseinfluss in der vorliegenden Studie auf den Rezeptorenbesatz der

Zellen zurückzuführen ist, kann weder bestätigt noch ausgeschlossen werden, da derartige

81

5. Diskussion

Untersuchungen nicht durchgeführt worden sind. Von WRAGE (2002) wurde zwar ein

größerer Besatz der Zellmembranen der Pferde mit β-Rezeptoren nachgewiesen,

vergleichende Studien zur Anzahl der α-Rezeptoren liegen jedoch noch nicht vor. Des

Weiteren wurden von WRAGE (2002) nur Wallache beprobt, so dass kein Vergleich

zwischen den Geschlechtern gezogen werden kann.

Weiterhin sind Adipocyten von Frauen in einigen Körperregionen größer als die der Männer

(REBUFFE-SCRIVE et al. 1985) und auch die Menge des Fettgewebes überwiegt häufig bei

Frauen (REBUFFE-SCRIVE et al. 1985; RICHELSEN 1986), trotz vergleichbarer

Körpergewichte der in diesen Arbeiten getesteten Personengruppen.

Es ist bekannt, dass sowohl die Anzahl der Adipocyten als auch ihre Größe den Verlauf der

Fettsäurefreisetzung aus dem Gewebe bestimmen (ARNER u. ÖSTMAN 1978; ARNER et al.

1979; BRAY et al. 1977; ARNER et al. 1981), wobei die Größe der Zellen mit der

intrazellulären cAMP-Konzentration und der resultierenden Lipolyserate positiv korreliert ist

(ARNER u. ÖSTMAN 1978; GRUEN et al. 1980).

Über die Größe der in dieser Studie verwendeten Zellen kann keine Aussage gemacht werden.

Es ist zwar erwiesen, dass Adipocyten der Ponys größer sind als die der Pferde (WRAGE

2002), jedoch fehlt auch hier ein geschlechtsspezifischer Vergleich. Die in der vorliegenden

Untersuchung ermittelten annähernd gleichen Lipolyseraten bei Stuten und Wallachen

sprechen eher gegen verschieden große Fettzellen bei den Geschlechtern.

Die Tatsache, dass die Wirkung des Geschlechts auf die Fettmobilisation in dieser Arbeit

nicht aufgetreten ist, könnte darauf zurückgeführt werden, dass keine Hengste, sondern

Wallache für die Untersuchungen herangezogen worden sind, die keinem Testosteroneinfluss

unterliegen.

82

5. Diskussion

5.2.5. Einfluss der Lokalisation des Fettgewebes auf die Lipolyserate

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte auch ein möglicher Einfluss der Lokalisation des

untersuchten Fettgewebes auf die Lipolyserate von equinen Adipocyten nach Stimulation mit

DBcAMP ermittelt werden. Diesbezüglich sind Unterschiede für verschiedene Spezies in der

Literatur diskutiert worden. Die grundlegende Erkenntnis dabei ist, dass sich Fettgewebe aus

dem Inneren der Bauchhöhle als lipolytisch aktiver als subkutanes Fett erwiesen hat

(SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a; TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-MELOU et al.

1999).

Für die Situation beim Menschen liegen widersprüchliche Berichte vor.

Von einigen Autoren wurde übereinstimmend eine höhere basale Lipolyse im subkutanen

Fettgewebe als im abdominalen Gewebe ermittelt, während sich die Hormon-stimulierte

TGL-Spaltung als signifikant stärker in Gewebeproben des Bauchhöhlenfettes erwies

(EFENDIC 1970; KATHER et al. 1977; LAFONTAN et al. 1979; SMITH et al. 1979;

ENGFELDT u. ARNER 1988; SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a; ARNER 1995; SALEH et

al. 1999). Dabei wurde vor allem die Stimulation mit NA betrachtet.

ÖSTMAN et al. (1979) stellten zwar ebenfalls eine stärkere lipolytische Aktivität nach

Inkubation der Zellen mit NA im Bauchfett im Gegensatz zum subkutanen Gewebe fest,

kamen darüber hinaus jedoch entgegen oben genannter Autoren zu dem Ergebnis, dass die

basale Lipolyserate in abdominalen Zellen bereits höher ist als in subkutanen Adipocyten.

Diese regionalen Unterschiede der Gewebe in ihrer lipolytischen Aktivität werden auf einen

verschieden starken Besatz mit β-AR-Subtypen zurückgeführt. Da diese Rezeptoren auf

Zellen des abdominalen Gewebes in höherer Dichte vorkommen, können Catecholamine im

Bauchfett stärker lipolytisch wirken als in Proben aus subkutanem Gewebe (WAHRENBERG

et al. 1989; HELLMER et al. 1992). Über verschiedene Verteilungen der β-AR wird auch

beim Hund berichtet (TAOUIS et al. 1987).

HELLMER et al. (1992) untersuchten des Weiteren die Fettsäurefreisetzung nach Inkubation

der Adipocyten mit DBcAMP. Sie stellten dabei keine signifikanten regionalen Unterschiede

in der lipolytischen Aktivität der Zellen fest und bestätigten damit frühere Ergebnisse von

83

5. Diskussion

WAHRENBERG et al. (1989). In ihren Studien blieben Unterschiede aufgrund der gewählten

Lokalisation nach Stimulation mit Mediatoren, die distal der Rezeptoren wirken, darunter

DBcAMP, ebenfalls aus.

Bei Ratten stellen sich verglichen mit humanen Fettzellen z.T. umgekehrte Verhältnisse dar.

Laut SZTALRYD u. KRAEMER (1994 a) weisen subkutane Adipocyten dieser Spezies im

Gegensatz zu Fettdepots aus dem Inneren des Körpers eine verminderte basale Lipolyserate

auf. Außerdem ist die Aktivität der HSL bei diesen Tieren sowohl im epididymalen als auch

im retroperitonealen Fettgewebe größer als in subkutanen Zellen. Das Gleiche gilt für die

Rate der HSL-Synthese, und die Autoren begründen dies mit der geringeren Expression von

HSL-Genen im subkutanen Fettgewebe.

Ähnliche Erkenntnisse bezüglich der Ratte gewannen LACASA et al. (1991), die Fettzellen

aus dem Parametrium mit Adipocyten aus subkutanem Gewebe vergleichend untersuchten. Es

ergab sich eine niedrigere cAMP-Produktion in den subkutanen Fettzellen und außerdem eine

geringere Anzahl an β-AR begleitet von einer reduzierten lipolytischen Aktivität dieses

Gewebes. TAVERNIER et al. (1995) bestätigten die Angaben hinsichtlich des Besatzes der

Adipocytenmembran des subkutanen Gewebes mit β-Rezeptoren und der Aktivität der HSL.

Eine wechselnde Reaktionsfähigkeit von Geweben unterschiedlicher Lokalisationen

gegenüber β-Agonisten ist auch beim Kaninchen gegeben (LANGIN et al. 1992). So ist die

lipolytische Aktivität nach Stimulation mit verschiedenen Mediatoren, inklusive DBcAMP,

bei diesen Tieren in retroperitonealem Fettgewebe signifikant höher als in Inguinalfett

(BOUSQUET-MELOU et al. 1999).

In der hier vorliegenden Studie konnte in der Gruppe der Großpferde kein Unterschied in

Bezug auf die freigesetzten FS zwischen Bauchhöhlen- und Inguinalfettgewebe nach

Inkubation der Zellen mit DBcAMP ermittelt werden. Diese Adipocyten gleichen damit

denen des Menschen, die ebenfalls in beiden genannten Lokalisationen keine bedeutenden

Unterschiede in der TG-Mobilisation zeigten (WAHRENBERG et al. 1989).

Bei den Ponys hingegen ergab sich für die Proben aus Bauchfettgewebe eine signifikant

höhere Lipolyserate als im Inguinalfettgewebe. Einerseits stimmt dieser Befund mit den in der

84

5. Diskussion

Literatur dokumentierten Ergebnissen überein (Bauchfettgewebe ist lipolytisch aktiver als

Inguinalfettgewebe bzw. subkutanes Fett, siehe oben). Andererseits scheinen sich die

Adipocyten der Ponys dahingehend von humanen Fettzellen zu unterscheiden, dass die Zellen

des Bauchfettgewebes nach DBcAMP-Zugabe deutlich mehr FS freisetzen als subkutane

Zellen aus dem Inguinalbereich. Bei menschlichen Zellen bestehen dagegen keine regionalen

Unterschiede nach DBcAMP-Zusatz zum Inkubationsmedium (WAHRENBERG et al. 1989;

HELLMER et al. 1992). Adipocyten der Ponys gleichen aber in ihrem Verhalten denen der

Ratte. Zellen beider Spezies zeichnen sich durch eine bessere Stimulierbarkeit mit

Catecholaminen gegenüber denen der Großpferde aus (BREIDENBACH et al. 1998, 1999).

Darüber hinaus wurde in Rattenzellen eine höhere Aktivität und Synthese der HSL in

Fettzellen aus dem Bereich der Bauchhöhle als aus subkutanem Gewebe nachgewiesen

(SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a; TAVERNIER et al. 1995). Aufgrund der vorliegenden

Ergebnisse ist anzunehmen, dass sich die Adipocyten von Ratten und Ponys hinsichtlich der

Lipolyseaktivitäten ähneln. Die bessere Ansprechbarkeit auf DBcAMP in Bauchhöhlenfett

kann nicht, wie bei anderen Spezies im Fall der Catecholamine, auf einen höheren Besatz der

Membranen mit β-AR zurückgeführt werden, denn diesbezüglich liegen nur Angaben zum

Bauchfett vor (WRAGE 2002), nicht aber über den Besatz im Inguinalfett. Darüber hinaus

entfaltet cAMP seine Wirkung nicht über adrenerge Rezeptoren, sondern stellt vielmehr einen

direkten (postrezeptoralen) Aktivator der PKA und damit der HSL dar. Aufgrund dieser

Tatsachen liegt die Vermutung nahe, dass auch in Adipocyten aus dem Bauchhöhlenbereich

der Ponys im Gegensatz zum Inguinalfett und zu Großpferden eine höhere Aktivität der HSL

zugrunde liegt.

5.2.6. Der Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate

Im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom ist der Speziesvergleich der Lipolyseraten das

zentrale Anliegen der vorliegenden Arbeit. Die Anregung der TGL-Mobilisation sollte mit

DBcAMP erfolgen, weil auf diese Weise ein erster Einblick in eventuelle postrezeptorale

Einflüsse auf die HSL-Aktivität erzielt werden kann. Die Inkubation der Zellen aus

Bauchhöhlenfettgewebe mit DBcAMP führte für beide untersuchten Spezies zu

85

5. Diskussion

vergleichbaren Lipolyseraten. Dieses Resultat steht im Gegensatz zu den Daten, die bei

Inkubation mit NA / ADA gemessen werden konnten (BREIDENBACH et al. 1999).

Ein besonders bemerkenswertes Ergebnis brachte der Vergleich der DBcAMP-Stimulation

von Adipocyten aus dem Inguinalbereich zwischen Pony und Großpferd. Hier konnte eine

signifikant höhere Lipolyserate bei den Fettzellen vom Großpferd festgestellt werden. Dieses

Resultat ist gerade im Hinblick auf die oben zitierten Lipolyseraten für die Bauchfettzellen bei

NA / ADA-Stimulation unerwartet, muss aber nicht unbedingt den früheren Feststellungen,

dass die hohe Lipolyserate bei Ponys mit der Hpyerlipämieentstehung in Zusammenhang

gebracht wird, entgegenstehen. Die größere Masse des Bauchhöhlenfettgewebes kann

durchaus bestimmend für die Stoffwechselentgleisung beim Pony sein, so dass eine höhere

Empfindlichkeit des Inguinalfettgewebes gegenüber DBcAMP beim Großpferd quantitativ

keine pathognomonische Bedeutung haben muss.

Eine mögliche Ursache für die oben genannte Diskrepanz zwischen NA / ADA- und

DBcAMP-Stimulation könnte das Alter der beprobten Tiere sein. Es konnte gezeigt werden,

dass Adipocyten älterer Tiere mit geringerer lipolytischer Aktivität auf Stimulation reagieren

als Zellen jüngerer Tiere (ENGFELDT u. ARNER 1988; LANGIN et al. 1992). Dies wird

aber mit einer Veränderung des Gleichgewichtes zwischen α- und β-Adrenorezeptoren

begründet (LANGIN et al. 1992), was als Ereignis zu bewerten ist, das der cAMP-Kaskade

vorgelagert ist. Darüber hinaus lag das Durchschnittsalter der Ponys (15,7 ± 5,8 Jahre) nur

geringgradig über dem der Pferde (13 ± 6,7 Jahre). Diese Differenz war nicht signifikant, so

dass eine Begründung des Versuchsresultats mit einem Altersunterschied nicht möglich ist.

Zur Abklärung dieser Frage sind weitere Untersuchungen erforderlich, die letztendlich zu

einer Beurteilung aller Aspekte der Regulation der HSL führen.

86

5. Diskussion

5.3. Betrachtungen im Zusammenhang mit dem Hyperlipämie-Syndrom

Das durch die Entgleisung des Fettstoffwechsels gekennzeichnete Hyperlipämie-Syndrom der

Ponys manifestiert sich mit stark erhöhten Fettsäure- und TGL-Gehalten im Plasma. Dabei

gelten Triglycerid-Konzentrationen von > 500 mg / dl als hyperlipämisch (NAYLOR 1982 b;

FIELD 1988; MOORE et al. 1994).

Die genauen Ursachen des massiven Fettabbaus im Zuge dieser Erkrankung sind bis heute

nicht eindeutig aufgeklärt. Der vorliegenden Arbeit lag die Hypothese zugrunde, dass die

HSL auslösend für das Syndrom sein könnte. Vermutet wurde eine sensiblere und gesteigerte

Reaktion des Enzyms auf erhöhte cAMP-Spiegel innerhalb der Fettzelle.

Ausschlaggebend für diese Annahme waren die Ergebnisse von BREIDENBACH (1996). Er

zeigte, dass Adipocyten der Ponys einen linearen Anstieg der Fettsäurefreisetzung nach

Stimulation mit NA aufwiesen. Dieses Resultat beobachtete er jedoch nicht bei Fettzellen der

Großpferde. Erst nach Zusatz von ADA zum Inkubationsmedium ließen sich auch diese

Zellen zur Fettsäurefreisetzung stimulieren. Die Lipolyserate der Ponys blieb jedoch

signifikant höher.

Die Bindung von Catecholaminen an β-Rezeptoren der Adipocytenmembran aktiviert über

eine Signalkaskade innerhalb der Fettzelle nach Erhöhung der cAMP-Konzentration die HSL.

Die erleichterte Stimulierbarkeit der Ponyzellen konnte nicht auf einen größeren Besatz der

Membranen mit β-Rezeptoren zurückgeführt werden, die die verantwortliche Kaskade durch

Kopplung an Gs-Proteine (stimulierende G-Proteine) in Gang setzen. Ponys weisen auf ihren

Adipocyten im Gegensatz zu Großpferden eine signifikant geringere Dichte an β-Rezeptoren

auf (WRAGE 2002).

Die Erkenntnisse ließen den Schluss zu, dass die über β-Rezeptoren bewirkte Stimulierung

der HSL an der Hyperlipämieentstehung beteiligt sein könnte.

Die HSL ist eine neutrale Lipase (SZTALRYD u. KRAEMER 1994 b), die die erste

Esterbindung in gespeicherten TGL hydrolysiert. Ihre Aktivierung wird über die PKA

vermittelt, die vom cAMP-Gehalt in der Zelle abhängig ist und eine Phosphatgruppe von ATP

auf das Enzym überträgt (STEINBERG u. HUTTUNEN 1972).

87

5. Diskussion

In dieser Arbeit wurden isolierte Adipocyten mit DBcAMP inkubiert. Dieses Vorgehen

erzeugte jedoch keine vermehrte Freisetzung von FS bei Ponyzellen im Vergleich zu Zellen

der Großpferde. Adipocyten beider Spezies ließen sich etwa in gleicher Weise stimulieren.

Die Hypothese, dass die HSL der Ponys verglichen mit der der Großpferde sensibler reagieren

und Fettgewebe daher mit gesteigerter Lipolyse auf Stresssituationen antworten würde, hat

sich anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht erhärten können.

Damit bleibt weiterhin zu untersuchen, ob die Gründe für eine gesteigerte Lipolyserate der

Ponys im Rahmen des Hyperlipämie-Geschehens an anderer Stelle der cAMP-Kaskade

lokalisiert sind.

Andere mögliche Wirkorte innerhalb der Signalkaskade, die Einfluss auf das Ausmaß der

Lipolyse nehmen könnten, sind die an die Rezeptoren der Membran gekoppelten G-Proteine,

die in Abhängigkeit zum Rezeptorliganden entweder stimulierende oder inhibierende

Wirkung ausüben können. Der Besatz mit β-Rezeptoren konnte aber bereits als Ursache für

die Hyperlipämie ausgeschlossen werden. Über den Besatz mit inhibierenden α-Rezeptoren

liegen dagegen noch keine Erkenntnisse vor. Dieser Aspekt wird gegenwärtig untersucht.

Außerdem kommt die in der Membran der Adipocyten verankerte Adenylatcyclase (AC) in

Betracht, die die Synthese von cAMP vermittelt.

Darüber hinaus sollten die PKA und die Phosphatasen als möglicher Auslöser für eine

unterschiedlich ablaufende TGL-Spaltung bei Großpferd und Pony beachtet werden.

Diese Möglichkeiten sollten weiter untersucht werden, um eventuell Erkenntnisse über

auslösende Faktoren der gesteigerten Fettmobilisation beim Pony zu gewinnen.

88

6. Zusammenfassung

6. ZUSAMMENFASSUNG

Nadine Riebandt

Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase bei Großpferd und Pony im Hinblick auf

das Hyperlipämie-Syndrom

Gegenstand der vorliegenden Studie war die Inkubation von isolierten Adipocyten von

Großpferden und Ponys mit DBcAMP. Dadurch sollte die HSL postrezeptoral angeregt und

eine Freisetzung von FS aus den Zellen erreicht werden. Anhand eines pH-sensitiven

Messsystems wurde die resultierende pH-Wertabnahme im Medium fluorophotometrisch

detektiert, so dass vergleichend zwischen beiden Spezies Rückschlüsse bezüglich der

stattgefundenen Lipolyserate gezogen werden konnten. Für die Untersuchungen wurden

Gewebeproben aus Bauchhöhlen- und subkutanem Inguinalfett verwendet, die von

anästhesierten bzw. ausgeweideten Schlachttieren gewonnen worden sind. Ziel der Versuche

war es, einen weiteren Beitrag zur Aufklärung der Ätiologie des Hyperlipämie-Syndroms der

Ponys zu leisten.

Zur Auswertung der Ergebnisse erfolgte eine Gruppierung der beprobten Tiere gemäß

unterschiedlicher Gesichtspunkte.

So wurde ein möglicher Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyse getestet, der jedoch,

entgegen der Berichte anderer Autoren, in dieser Studie ausblieb. Dagegen konnte eine

Abhängigkeit der Fettsäurefreisetzung von der Lokalisation des entnommenen Gewebes

nachgewiesen werden, wobei sich das Bauchfett als lipolytisch signifikant aktiver erwies als

das subkutane Gewebe aus dem Inguinalbereich. Dieser Befund entspricht den in der Literatur

gemachten Angaben. Erstaunlich war die Beobachtung, dass im Vergleich der Spezies das

Inguinalfett der Pferde in höherem Maße stimulierbar war als das der Ponys.

Obwohl in dieser Studie vorrangig die Stimulation der Adipocyten mit DBcAMP untersucht

wurde, wurde vergleichend auch die Anregung durch NA / ADA in die Betrachtungen

89

6. Zusammenfassung

einbezogen. Die Ergebnisse deckten sich mit der Erhebungen von BREIDENBACH et al.

(1999). Es wurde deutlich, dass die Zellen der Ponys mit auffallend höherer Lipolyse auf die

Inkubation mit NA / ADA reagierten als die der Pferde. Der Zusatz von DBcAMP zum

Inkubationsmedium bewirkte bei den Ponyfettzellen keinen Unterschied im Ausmaß der

Freisetzung von FS verglichen mit NA / ADA, während die Lipolyserate der Adipocyten von

Großpferden nach DBcAMP signifikant höher war als nach NA / ADA-Anregung. Die

DBcAMP-Stimulierung führte bei den Bauchhöhlenfettzellen zu vergleichbaren Lipolyseraten

beider Spezies.

Die vorliegende Studie kann demnach über die molekulare Basis der erhöhten

Lipolyseneigung des Ponys im Vergleich mit Großpferden noch keine schlüssige Antwort

geben.

Es bleibt zu prüfen, ob prärezeptoral die α-Rezeptoren eine entscheidende Rolle spielen.

Postrezeptoral muss geklärt werden, inwiefern weitere Regulationsfaktoren der HSL

(Gs-Proteine, Gi-Proteine, Insulin) von Bedeutung sind.

90

7. Summary

7. SUMMARY

Nadine Riebandt

Stimulation of hormone-sensitive lipase in horses and ponies with regard to the

hyperlipaemia syndrome

The topic of the present study was the incubation of isolated adipocytes of horses (wormblod)

and ponies (Shetland Pony) with dbcAMP. Thus should stimulate hormone-sensitive lipase

proximal to the receptors and cause a release of FA out of the cells.

With a pH-sensitive measuring system the resulting decrease in pH within the medium has

been detected by fluorophotometry so that comparative conclusions between both species

could be drawn concerning their rate of lipolysis.

For these investigations specimens from the subcutaneous adipose tissue of the inguinal

region and the abdominal cavity have been used. They were taken from anaesthetised ponies

and from horses and ponies delivered to a slaughterhouse following their evisceration.

The aim of these attempts was to contribute to the education of the aetiology of the

hyperlipaemia syndrome in ponies.

To analyse the results the animals have been grouped according to different aspects.

Thus an influence emanating from the gender on the lipolysis has been tested that however

has been lacking within this study.

On the other hand it has been possible to prove a dependance of the FA release to the location

of the collected tissue. Adipose tissue deriving from the abdominal cavity appeared to be

significantly more active as subcutaneous inguinal fat depots relating to lipolysis. This finding

corresponds to the multiple statements within the literature.

It has been astonishing that in the comparison of the species adipocytes from horses inguinal

tissue could be stimulated in a superior extent as cells of ponies.

91

7. Summary

Even though the stimulation of adipocytes with dbcAMP has been investigated prior in this

study the incitement comparing with NE / ADA has been integrated in the examinations as

well. The results align with the exaltations made by BREIDENBACH et al. (1999).

It was evident that ponies’ adipocytes react with explicitly larger rate of lipolysis to

stimulation with NE / ADA than cells from horses. The supplement of dbcAMP to the

incubation medium containing fat cells from ponies caused no difference referring to the

degree of FA release in comparison with NE / ADA. While the rate of lipolysis in horses’

adipocytes has been significantly greater following dbcAMP stimulation than incitement with

NE / ADA. The stimulation with dbcAMP leaded to comparable rates of lipolysis in

abdominal fat cells in both species.

According to this the present study can not give a conclusive response to the molecular basis

of the augmented tendency to lipolysis in ponies in comparison with horses.

Further investigations are necessary to elucidate whether the α-adrenergic receptors play an

important role. Distal to the receptors it has to be clarified how far other regulating

mechanisms of the hormone-sensitive lipase, such as Gs-proteins, Gi-proteins and insulin, are

of importance.

92

8. Literaturverzeichnis

8. LITERATURVERZEICHNIS

ADAMS, H. A., R. BAUER, B. GEBHARDT, W. MENKE u. B. BALTES-GOTZ (1994)

Total i.v. anesthesia with S-(+)-ketamine in orthopedic geriatric surgery. Endocrine stress

reaction, hemodynamics and recovery.

Anaesthesist 43, 92-100

ADAMS, H. A., A. THIEL, A. JUNG, G. FENGLER u. G. HEMPELMANN (1992)

Studies using S-(+)-ketamine on probands. Endocrine and circulatory reactions, recovery and

dream experiences.

Anaesthesist 41, 588-596

ALADJEM, F., u. L. RUBIN (1954)

Serum Lipoprotein Changes During Fasting in Rabbits.

Am. J. Physiol. 178, 267-268

ARNER, P. (1995)

Differences in lipolysis between human subcutaneous and omental adipose tissues.

Ann. Med. 27, 435-438

ARNER, P, P. ENGFELDT u. H. LITHELL (1981)

Site differences in the basal metabolism of subcutaneous fat in obese women.

J. Clin. Endocrinol. Metab 53, 327-332

ARNER, P., P. ENGFELDT u. J. ÖSTMAN (1979)

Relationship between lipolysis, cyclic AMP and fat-cell size in human adipose tissue during

fasting and in diabetes mellitus.

Metabolism 28 (3), 198-209

93


ARNER, P., E. KRIEGHOLM, P. ENGFELDT u. J. BOLINDER (1990)

Adrenergic regulation of lipolysis in situ at rest and during exercise.

J. Clin. Invest. 85, 893-898

ARNER, P., u. J. ÖSTMAN (1978)

Relationship between the tissue level of cyclic AMP and the fat cell size of human adipose

tissue.

J. Lipid Res. 19, 613-618

BAETZ, A. L., u. J. E. PEARSON (1972)

Blood Constituent Changes in Fasted Ponies.

Am. J. Vet. Res. 33, 1941-1946

BARDIES, J., J. P. BRAUN, P. BENARD u. G. RICO (1981)

Hyperlipémie des équidés.

Rec. Méd. Vet. 157, 713-715

BAUER, J. E. (1983)

Plasma lipids and lipoproteins of fasted ponies.

Am. J. Vet. Res. 44 (3), 379–384

BENSADOUN, A. (1991)

Lipoprotein lipase.

Annu. Rev. Nutr. 11, 217-237

BLECHER, M., J. T. Ro´ANE u. P. D. FLYNN (1970)

Metabolism of Dibutyryl Cyclic Adenosine 3´, 5´-Monophosphate during its Regulation of

Lipolysis and Glucose Oxidation in Isolated Rat Epididymal Adipocytes.

J. Biol. Chem. 245 (8), 1867-1870

94


BOUSQUET-MELOU, A., C. MUNOZ, J. GALITZKY, M. BERLAN u. M. LAFONTAN

(1999)

Pregnancy modifies the α2-β-adrenergic receptor functional balance in rabbit fat cells.

J. Lipid Res. 40, 267-274

BRASAEMLE, D. L., T. BARBER, N. E. WOLINS, G. SERRERO, E. J. BLANCHETTE-

MACKIE u. C. LONDOS (1997)

Adipose differentiation-related protein is an ubiquitously expressed lipid storage droplet-

associated protein.

J. Lipid Res. 38, 2249-2263

BRASAEMLE, D. L., B. RUBIN, I. A. HARTEN, J. GRUIA-GRAY, A. R. KIMMELL u. C.

LONDOS (2000)

Perilipin A increases triacylglycerol storage by decreasing the rate of triacylglycerol

hydrolysis.

J. Biol. Chem. 275, 38486-38493

BRAUN, J. E., u. D. L. SEVERSON (1992)

Regulation of the synthesis, processing and translocation of liproprotein lipase.

Biochem. J. 278, 337-347

BRAY, G. A., J. A. GLENNON, L. B. SALANS, E. S. HORTON, E. DANFORTH u. E. A.

H. SIMS (1977)

Spontaneous and experimental human obesity: effects of diet and adipose cell size on

lipolysis and lipogenesis.

Metabolism 177 (26), 739-747

BREIDENBACH, A. (1996)

Triglyceridspaltende Plasma–und Gewebslipasen von Pferd und Pony im Hinblick auf das

Hyperlipämiesyndrom.

Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.

95


BREIDENBACH, A., H. FUHRMANN, R. BUSCHE u. H.-P. SALLMANN (1998)

Studies on Equine Lipid Metabolism. 1. A Fluorometric Method for the Measurement of

Lipolytic Activity in Isolated Adipocytes of Rats and Horses.

J. Vet. Med. A 45, 635- 643

BREIDENBACH, A., H. FUHRMANN, E. DEEGEN, A. LINDHOLM u. H.-P.

SALLMANN ( 1999)

Studies on Equine Lipid Metabolism 2. Lipolytic Activities of Plasma and Tissue Lipases in

Large Horses and Ponies.

J. Vet. Med. A 46, 39- 48

BURNS, T. W., P. E. LANGLEY u. G. A. ROBISON (1972)

Studies on the Role of Cyclic AMP in Human Lipolysis.

Advances in Cyclic Nucleotide Research 1, 63-84

CAMPS, L., M. REINA, M. LLOBERA, S. VILARO u. T. OLIVECRONA (1990)

Lipoprotein lipase: cellular origin and functional distribution.

Am. J. Physiol. 258, C673-C681

CARPENE, C., I. CASTAN, P. COLLON, J. GALITZKY, J. MORATINOS u. M.

LAFONTAN (1994)

Adrenergic lipolysis in guinea pig is not a β3-adrenergic response: comparison with human

adipocytes.

Am. J. Physiol. 266, R905-R913

CLIFFORD, G. M., C. LONDOS, F. B. KRAEMER, R. G. VERNON u. S. J. YEAMAN

(2000)

Translocation of hormone-sensitive lipase and perilipin upon lipolytic stimulation of rat

adipocytes.

J. Biol. Chem. 275, 5011-5015

96


COFFMAN, J. R., u. C. M. COLLES (1983)

Insulin tolerance in laminitic ponies.

Can. J. Comp. Med. 47, 347–351

COOK, K. G., R. J. COLBRAN, J. SNEE u. S. J. YEAMAN (1983)

Cytosolic cholesterol ester hydrolase from bovine corpus luteum. Its purification,

identification and relationship to hormone-sensitive lipase.

Biochim. Biophys. Acta 751, 46-53

DEEGEN, E. (1972)

Die prognostische Bedeutung des „Hegglin–Syndroms” bei der Hyperlipämie der Ponys.

Dtsch. Tierärztl. Wochenschr. 79 (12), 297–301

DIETZ, O. (1999)

Hyperlipämie (Hyperlipoproteinämie) der Ponys.

In: O. DIETZ u. B. HUSKAMP (Hrsg): Handbuch Pferdepraxis

Enke Verlag, Stuttgart, S. 305-306

DUNKEL, B., u. H. C. McKENZIE (2003)

Severe hypertriglyceridaemia in clinically ill horses: diagnosis, treatment and outcome.

Equine Vet. J. 35 (6), 590-595

EFENDIC, S. (1970)

Catecholamines and metabolism of human adipose tissue. III. Comparison between the

regulation of lipolysis in omental and subcutaneous adipose tissue.

Acta Med. Scand 187, 477-483

97


EGAN, J. J., A. S. GREENBERG, M.-K. CHANG, S. A. WEK, M. C. MOOS Jr. u. C.

LONDOS (1992)

Mechanism of hormone-stimulated lipolysis in adipocytes: Translocation of hormone-

sensitive lipase to the lipid storage depot.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8537-8541

ENGFELDT, P., u. P. ARNER (1988)

Lipolysis in human adipocytes, effects of cell size, age and of regional differences.

Horm. Meta. Res. Suppl. 19, 26-29

ERIKSEN, L., u. M. G. SIMESEN (1970)

Hyperlipaemia in ponies.

Nord. Vet. Med. 22, 273–284

ERIKSSON, H., M. RIDDERSTRALE, E. DEGERMAN, D. EKHOLM, C. J. SMITH, V. C.

MANGANIELLO, P. BELFRAGE u. H. TORNQVIST (1995)

Evidence for the key role of the adipocyte cGMP-inhibited cAMP phosphodiesterase in the

antilipolytic action of insulin.


FAIN, J. N., u. R. E. SHEPHERD (1975)

Free Fatty Acids as Feedback Regulators of Adenylate Cyclase and Cyclic 3´: 5´-AMP

Accumulation in Rat Fat Cells.

J. Biol. Chem. 250, 6586-6592

FARIAS-SILVA, E., D. M. GRASSI-KASSISSE, V. WOLF-NUNES u. R. C. SPADARI-

BRATFISCH (1999)

Stress-induced alteration in the lipolytic response to β-adrenoceptor agonists in rat white

adipocytes.

J. Lipid Res. 40, 1719-1727

98


FIELD, J. R. (1988)

Hyperlipemia in a Quarter Horse.

Comp. Contin. Educ. Pract. Vet. 10 (2), 218-221

FORHEAD, A. J., J. FRENCH, P. IKIN, J. N. FOWLER u. H. DOBSON (1994)

Relationship between plasma insulin and triglyceride concentrations in hypertriglyceridaemic

donkeys.

Res. Ver. Sci. 56, 389-392

FORHEAD, A. J., D. SMART, R. F. SMITH u. H. DOBSON (1995)

Transport–induced stress responses in fed and fasted donkeys.

Res. Vet. Sci. 58, 144–151

FRANK, N., J. E. SOJKA, u. M. A. LATOUR (2002)

Effect of withholding feed on concentration and composition of plasma very low density

lipoprotein and serum nonesterified fatty acids in horses.

Am. J. Vet. Res. 63 (7), 1018-1021

FREDRIKSON, G., u. P. BELFRAGE (1983)

Positional specificity of hormone-sensitive lipase from rat adipose tissue.

J. Biol. Chem. 258, 14253-14256

FREDRIKSON, G., P. STRALFORS, N. O. NILSSON u. P. BELFRAGE (1981)

Hormone-sensitive lipase from rat adipose tissue. Purification and some properties.

J. Biol. Chem. 256, 6311-6320

FREESTONE, J. F., R. BREADLE, K. SHOEMAKER, R. T. BESSIN, K. J.

WOLFSHEIMER u. C. CHURCH (1992)

Improved insulin sensitivity in hyperinsulinaemic ponies through physical conditioning and

controlled feed intake.

Equine Vet. J. 24 (3), 187–190

99


FREESTONE, J. F., K. J. WOLFSHEIMER, R. B. FORD, G. CHURCH u. R. BESSIN

(1991)

Triglyceride, insulin and cortisol reponses of ponies to fasting and dexamethasone

administration.

J. Vet. Intern. Med. 5 (1), 15–22

FÜRLL, M., u. M. SCHÄFER (1992)

Vorkommen und Verlauf der Hyperlipidämie bei Ponys.

in: 12. Arbeitstagung der Fachgruppe Pferdekrankheiten,

Wiesbaden, 09. / 10. April 1992, S. 239–254

GARTON, A. J., D. G. CAMPBELL, D. CARLING, D. G. HARDIE, R. J. COLBRAN u.

S. J. YEAMAN (1989)

Phosphorylation of bovine hormone-sensitive lipase by the AMP-activated protein kinase. A

possible antilipolytic mechanism.

Eur. J. Biochem. 179, 249-254

GARTON, A. J., u. S. J. YEAMAN (1990)

Identification and role of the basal phosphorylation site on hormone-sensitive lipase.

Eur. J. Biochem. 191, 245-250

GAY, C. C., N. D. SULLIVAN, J. S. WILKINSON, J. D. McLEAN u. D. C. BLOOD

(1978)

Hyperlipaemia in ponies.

Aust. Vet. J. 54 (10), 459–462

GILBERT R. O. (1986)

Congenital hyperlipaemia in a Shetland pony foal.

Equine Vet. J. 18 (6), 498–500

100


GOKMEN-POLAR, Y., E. C. CORONEL, S. W. BAHOUTH u. J. N. FAIN (1996)

Insulin sensitizes β-agonist and forskolin-stimulated lipolysis to inhibition by 2´, 5´-

dideoxyadenosine.

Am. J. Physiol. 270, C 562-C 569

GOKO, H., S. TAKASHIMA, S. SHIMIZU, S. KAGAWA u. A. MATSUOKA (1984)

Effects of verapamil on lipolysis due to dibutyryl cyclic AMP.

Biochem. J. 220, 321-324

GOLENZ, M. R., D. A. KNIGHT u. K. E. YVORCHUK–St. JEAN (1992)

Use of a human enteral feeding preparation for treatment of hyperlipemia and nutritional

support during healing of an esophageal laceration in a miniature horse.

J. Am. Vet. Med. Assoc. 200 (7), 951–953

GREENBERG, A. S., J. J. EGAN, S. A. WEK, N. B. GARTY, E. J. BLANCHETTE-

MACKIE u. C. LONDOS (1991)

Perilipin, a major hormonally regulated adipocyte-specific phosphoprotein associated with the

periphery of lipid storage droplets.

J. Biol. Chem. 266, 11341-11346

GROBER, J., S. LUCAS, M. SORHEDE-WINZELL, I. ZAGHINI, A. MAIRAL, J.-A.

CONTRERAS, P. BESNARD, C. HOLM u. D. LANGIN (2003)

Hormone-sensitive lipase is a cholesterol esterase of the intestinal mucosa.

J. Biol. Chem. 278, 6510-6515

GRUEN, R., R. KAVA u. M. R. C. GREENWOOD (1980)

Development of basal lipolysis and fat cell size in epididymal fat pads of normal rats.

Metabolism 29, 246-253

101


HAGSTRÖM-TOFT, E., P. ARNER, H. WAHRENBERG, A. WENNLUND, U.

UNGERSTEDT u. J. BOLINDER (1993)

Adrenergic Regulation of Human Adipose Tissue Metabolism in situ during Mental Stress.

J. Clin. Endocrin. Metab. 76 (2), 392-398

HALLEBEEK, J. M., u. A. C. BEYNEN (2001)

A preliminary report on a fat–free diet formula for nasogastric enteral administration as

treatment for hyperlipaemia in ponies.

Vet. Quart 23, 201–205

HELLMER, J., C. MARCUS, T. SONNENFELD u. P. ARNER (1992)

Mechanisms for Differences in Lipolysis between Human Subcutaneous and Omental Fat

Cells.

J. Clin. Endocrin. Metab. 75 (1), 15-20

HJEMDAHL, B., u. P. FREDHOLM (1974)

Comparison of the lipolytic activity of circulating an locally released noradrenaline during

acidosis.

Acta Physiol. Scand. 92, 1-11


Cyclic AMP-dependent and independent inhibition of lipolysis by adenosine and decreased

pH.



Direct antilipolytic effect of acidosis in isolated rat adipocytes.


102


HOLM, C., P. BELFRAGE u. G. FREDRIKSON (1987)

Immunological evidence for the presence of hormone-senitive lipase in rat tissues other than

adipose tissue.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 148, 99-105

HONNOR, R. C., G. S. DHILLON u. C. LONDOS (1985)

cAMP-dependent Protein Kinase and Lipolysis in Rat Adipocytes.

J. Biol. Chem. 260 (28), 15130- 15138

HUGHES, K. J., D. R. HODGSON u. A. J. DART (2002)

Hyperlipaemia in a 7–week–old miniature pony foal.

Aust. Vet. J. 80 (6), 350–351

JACKSON, R. L., u. L. R. McLEAN (1991)

Human postheparin plasma lipoproteinlipase and hepatic triglyceride lipase.

Methods Enzymol. 197, 339-345

JEFFCOTT, L. B., u. J. R. FIELD (1985 a)

Epidemiological aspects of hyperlipaemia in ponies in south eastern Australia.

Aust. Vet. J. 62, 140–141

JEFFCOTT, L. B., u. J. R. FIELD (1985 b)

Current concepts of hyperlipaemia in horses and ponies.

Vet. Rec. 116, 461-466

JEFFCOTT, L. B., J. R. FIELD, J. G. McLEAN u. K. O´DEA (1986)

Glucose tolerance and insulin sensitivity in ponies and standardbred horses.

Equine Vet. J. 18 (2), 97–101

103


KATHER, H. (1988)

Purine Accumulation in Human Fat Cell Suspensions. Evidence that Human Adipocytes

Release Inosine and Hypoxanthine rather than Adenosine.

J. Biol. Chem. 263, 8803-8809

KATHER, H., K. ZOLLIG, B. SIMON u. G. SCHLIERF (1977)

Human fat cell adenylate cyclase: regional differences in adrenaline responsiveness.

Eur. J. Clin. Invest. 7 (6), 595-597

KOLB, E. (1983)

Der Stoffwechsel der Glukose und der Fettstoffe beim Pferd, unter besonderer

Berücksichtigung der Hyperlipidämie.

Mh. Vet.-Med. 38, 429-436

LACASA, D., B. AGLI, R. PECQUERY u. Y. GIUDICELLI (1991)

Influence of ovariectomy and regional fat distribution on the membranous transducing system

controlling lipolysis in rat fat cells.

Endocrinology 128 (2), 747-753

LAFONTAN, M., L. DANG-TRAN u. M. BERLAN (1979)

Alpha-adrenergic antilipolytic effect of adrenaline in human fat cells of the thigh: comparison

with adrenaline responsiveness of different fat deposits.

Eur. J. Clin. Invest. 9 (4), 261-266

LANGIN, D., C. HOLM u. M. LAFONTAN (1996)

Adipocyte hormone-sensitive lipase: a major regulator of lipid metabolism.

Proc. Nut. Soc. 55, 93-109

104


LANGIN, D., M. PORTILLO, M. DAUZATS u. M. LAFONTAN (1992)

Drop in the “Atypical” β-Adrenergic Response and Modification of the β / α 2-Adrenoceptor

Balance in Fat Cells from Aging Rabbits.

Endocrinology 130, 307-315

LÖFFLER, G. (1999)

Basiswissen Biochemie mit Pathobiochemie

Springer Verlag

LONDOS, C., D. M. COOPER u. J. WOLFF (1980)

Subclasses of external adenosine receptors.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (5), 2551-2554

LUNA, S. P., P. M. TAYLOR u. M. J. WHEELER (1996)

Cardiorespiratory, endocrine and metabolic changes in ponies undergoing intravenous or

inhalation anaesthesia.

J. Vet. Pharmacol. Ther. 19, 251-258

McCULLAGH, K. G. (1978)

Plasma lipoproteins in animal health and disease.

Vet. Annual 18, 41-50

MEISNER, H., u. K. TENNEY (1977)

pH as an indicator of free fatty acid release from adipocytes.

J. Lipid Res. 18, 774-776

MERSMANN, H. J. (1992)

Regulation of Porcine Adipose Tissue Lipolytic Activity by Adrenergic Agonists and

Antagonists.

Comp. Biochem. Physiol. 102 C, 407-411

105


MOGG, T. D., u. J. E. PALMER (1995)

Hyperlipidemia, hyperlipemia and hepatic lipidosis in American Miniature Horses: 23 cases

(1990–1994).

J. Am. Vet. Med. Assoc. 207 (5), 604–607

MOORE, B. R., S. K. ABOOD u. K. W. HINCHCLIFF (1994)

Hyperlipemia in 9 Miniature Horses and Miniature Donkeys.

J. Vet. Int. Med. 8 (5), 376–381

MORIMOTO, C., K. KAMEDA, T. TSUJITA u. H. OKUDA (2001)

Relationships between lipolysis induced by various lipolytic agents and hormone-sensitive

lipase in rat fat cells.

J. Lipid Res. 42, 120-127

MORRIS, M. D., D. B. ZILVERSMIT u. H. F. HINTZ (1972)

Hyperlipoproteinemia in fasting ponies.

J. Lipid Res. 13 (3), 383-389

MULDER, H., L. S. HOLST, H. SVENSSON, E. DEGERMANN, F. SUNDLER, B.

AHREN, P. RORSMAN u. C. HOLM (1999)

Hormone-sensitive lipase, the rate-limiting enzyme in triglyceride hydrolysis, is expressed

and active in β-cells.

Diabetes 48, 228-232

MURRAY, M. (1985)

Hepatic lipidosis in a post parturient mare.

Equine Vet. J. 17 (1), 68–69

NAYLOR, J. M. (1982 a)

Hyperlipaemia and hyperlipidaemia in horses, ponies and donkeys.

Compend. Contin. Educ. Pract. Vet. 4 (7), 321–326

106


NAYLOR, J. M. (1982 b)

Treatment and diagnosis of hyperlipemia and hyperlipidemea.

Proc. Am. Assoc. Eq. Pract. 27, 323–329

NAYLOR, J. M., D. S. KRONFELD u. H. ACLAND (1980)

Hyperlipemia in horses: Effects of undernutrition and disease.

Am. J, Vet. Res. 41 (6), 899–905

NILSSON, N. Ö., u. P. BELFRAGE (1979)

Continuous monitoring of free fatty acid release from adipocytes by pH-stat titration.

J. Lipid Res. 20, 557-560

NILSSON, N. Ö., P. STRALFORS, G. FREDRIKSON u. P. BELFRAGE (1980)

Regulation of adipose tissue lipolysis: Effects of noradrenaline and insulin on phophorylation

of hormone-sensitive lipase and on lipolysis in intact rat adipocyts.

FEBS Letters 111 (1), 125-130

OLSSON, H., u. P. BELFRAGE ( 1987)

The regulatory and basal phosphorylation sites of hormone-sensitive lipase are

dephosphorylated by protein phosphatase-1, 2A and 2C but not by protein phosphatase-2B.

Eur. J. Biochem. 168, 399-405

OLSSON, H., P. STRALFORS u. P. BELFRAGE (1986)

Phosphorylation of the basal site of hormone-sensitive lipase by glycogen synthase kinase-4.

FEBS Lett. 209, 175-180

ÖSTMAN, J., P. ARNER, P. ENGFELDT u. L. KAGER (1979)

Regional differences in the control of lipolysis in human adipose tissue.

Metabolism 28 (12), 1198-1205

107


PERLEY, M., u. D. M. KIPNIS (1966)

Effect of Glucocorticoids on Plasma Insulin.

New Engl. J. Med 274, 1237-1241

POND, C. (1987)

Fat and Figures.

New Scientist 4, 62-66

PORTILLO, M. P., A. I. TUEROS, J. S. PERONA, V. RUIZ-GUTIERREZ, I. TORRES u.

M. T. MACARULLA (1999)

Modifications induced by dietary lipid source in adipose tissue phospholipid fatty acids and

their consequences in lipid mobilization.

B. J. Nutr. 82, 319-327

REBUFFE-SCRIVE, M., L. ENK, N. CRONA, P. LÖNNROTH, L. ABRAHAMSSON, U.

SMITH u. P. BJÖRNTORP (1985)

Fat Cell Metabolism in Different Regions in Women. Effect of Menstrual Cycle, Pregnancy

and Lactation.

J. Clin. Invest. 75, 1973-1976

RICHELSEN, B. (1986)

Increased α2- but similar β-adrenergic receptor activities in subcutaneous gluteal adipocytes

from females compared with males.

Eur. J. Clin. Invest. 16, 302-309

ROBIE, S. M., C. H. JANSON, S. C. SMITH u. J. T. O´CONNOR (1975 a)

Equine serum lipids: Lipid Composition and Electrophoretic Mobility of Equine Serum

Lipoprotein Fractions.

Am. J. Vet. Res. 36 (12), 1715–1717

108


ROBIE, S. M., C. H. JANSON, S. C. SMITH u. J. T. O´CONNOR (1975 b)

Equine serum lipids: Serum lipids and glucose in Morgan and Thoroughbred Horses and

Shetland Ponies.

Am. J. Vet. Res. 36 (12), 1705–1708

ROBINSON, D. S., u. B. K. SPEAKE (1989)

Role of insulin and other hormones in the control of lipoprotein lipase activity.

Biochem. Soc. Trans. 17, 40-42

ROCHON, L., u. L. J. BUKOWIECKI (1990)

Alterations in adipocyte response to lipolytic hormones during cold acclimation.

Am. J. Physiol. 258, C835-C840

RODBELL, M. (1964)

Metabolism of isolated fat cells. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis.

J. Biol. Chem. 239, 375-380

ROSE, R. J., u. D. SAMPSON (1982)

Changes in certain metabolic parameters in horses associated with food deprivation and

endurance exercise.

Res. Vet. Sci. 32, 198-202

RUBIN, L., u. F. ALADJEM (1954)

Serum Lipoprotein Changes During Fasting in Man.

Am. J. Physiol. 178, 263-266

SALEH, J., A. D. SNIDERMAN u. K. CIANFLONE (1999)

Regulation of plasma fatty acid metabolism.

Clin. Chim. Acta 286, 163–180

109


SCHMIDT, O., E. DEEGEN, H. FUHRMANN, R. DÜHLMEIER u. H.-P. SALLMANN

(2001)

Effects of Fat Feeding and Energy Level on Plasma Metabolites and Hormones in Shetland

Ponies.

J. Vet. Med. A 48, 39-49

SCHOTMAN, A. J. H., u. J. KRONEMAN (1969)

Hyperlipemia in ponies.

Neth. J. Vet. Sci. 2 (1), 60–64

SCHOTMAN, A. J. H., u. G. WAGENAAR (1969)

Hyperlipemia in ponies.

Zbl. Vet. Med. A 16 (1), 1-7

SHECHTER, Y. (1982)

Evaluation of Adenosine or Related Nucleosides as Physiological Regulators of Lipolysis in

Adipose Tissue.

Endocrinology 110, 1579-1583

SMALL, C. A., S. J. YEAMAN, D. W. WEST u. R. A. CLEGG (1991)

Cholesterol ester hydrolysis and hormone-sensitive lipase in lactating rat mammary tissue.


SMITH, U., J. HAMMERSTEN, P. BJÖRNTORP u. J. KRAL (1979)

Regional differences and effect of weight reduction on human fat cell metabolism.

Eur. J. Clin. Invest. 9 (5), 327-332

110


SPECTOR, A. A., u. J. E. FLETCHER (1978)

Transport of fatty acid in the circulation.

in: J. M. Dietschy, A. M. J. Gotto u. J. A. Ontko (Hrsg.): Disturbances in lipid and lipoprotein

metabolism.

Waverly Press, Inc. Baltimore, Maryland, USA, 229-249

STEINBERG, D, u. J. K. HUTTUNEN (1972)

The Role of Cyclic AMP in Activation of Hormone-Sensitive Lipase of Adipose Tissue.

Adv. Cycl. Nucl. Res. 1, 47-62

STEINER, G., F. J. HAYNES, G: YOSHINO u. M. VRANIC (1984)

Hyperinsulinemia and in vivo very-low-density lipoprotein-triglyceride kinetics.

Am. J. Physiol 246, E 187-E 192

STRALFORS, P., u. P. BELFRAGE (1983)

Phosphorylation of hormone-sensitive lipase by cyclic AMP-dependent protein kinase.

J. Biol. Chem. 258, 15146-15152

STRALFORS, P., u. R. C. HONNOR (1989)

Insulin-induced dephosphorylation of hormone-sensitive lipase.

Correlation with lipolysis and cAMP-dependent protein kinase activity.

Eur. J. Biochem. 182, 379- 385

SYU, L.-J., u. A. R. SALTIEL (1999)

Lipotransin: A novel docking protein for hormone-sensitive lipase.

Mol. Cell 4, 109-115

SZTALRYD, C., u. F. B. KRAEMER (1994 a)

Differences in Hormone-Sensitive Lipase Expression in White Adipose Tissue from Various

Anatomic Locations of the Rat.

Metabolism 43 (2), 241-247

111


SZTALRYD, C., u. F. B. KRAEMER (1994 b)

Regulation of hormone-sensitive lipase during fasting.

Am. J. Physiol. 266, E179-185

TAOUIS, M., M. BERLAN, P. MONTASTRUC u. M. LAFONTAN (1987)

Characterization of dog fat cell adrenoceptors: variations in alpha-2 and beta adrenergic

receptors distribution according to the extent of the fat deposits and the anatomical location.

J. Pharmacol. Exp. Ther. 242 (3), 1041-1049

TARRANT, J. M., T. M. CAMPBELL u. B. W. PERRY (1998)

Hyperlipaemia in a donkey.

Aust. Vet. J. 76 (7), 466–469

TAVERNIER, G., J. GALITZKY, P. VALET, A. REMAURY, A. BOULOUMIE, M.

LAFONTAN u. D. LANGIN (1995)

Molecular mechanisms underlying regional variations of catecholamine-induced lipolysis in

rat adipocytes.

Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 268, E1135-E1142

TAYLOR, P. M., S. P. L. LUNA, J. W. SEAR u. M. J. WHEELER (1995)

Total intravenous Anesthesia in ponies using detomidine, ketamine and guaiphenesin –

pharmacokinetics, cardiopulmonary and endocrine effects.

Res. Vet. Sci. 59, 17-23

THILSTED, J. P., J. DiPIETRO, J. R. SZABO, R. W. ELY u. G. M. MESFIN (1982)

Hyperlipemia in pony mares.

Mod. Vet. Pract. 63, 467-450

WAHRENBERG, H,. P. ENGFELDT, J. BOLINDER u. P. ARNER (1987)

Acute adaptation in adrenergic control of lipolysis during physical exercise in humans.

Am. J. Physiol. 253, E383-E390

112


WAHRENBERG, H., F. LÖNNQVIST u. P. ARNER (1989)

Mechanisms Underlying Regional Differences in Lipolysis in Human Adipose Tissue.

J. Clin. Invest. 84, 458-467

WATSON, T. D. G., L. BURNS, S. LOVE, C. J. PACKARD u. J. SHEPHERD (1991)

The isolation, characterisation and quantification of the equine plasma lipoproteins.

Equine Vet. J. 23 (5), 353-359

WATSON, T. D. G., L. BURNS, S. LOVE, C. J. PACKARD u. J. SHEPHERD (1992)

Plasma lipids, lipoproteins and post–heparin lipases in ponies with hyperlipaemia.

Equine Vet. J. 24 (5), 341–346

WATSON, T. D. G., L. BURNS, C. J. PACKARD u. J. SHEPHERD (1993)

Effects of pregnancy and lactation on plasma lipid and lipoprotein concentrations, lipoprotein

composition and post – heparin lipase activities in Shetland pony mares.

Journal of Reproduction and Fertility 97, 563–568

WATSON, T. D. G., u. S. LOVE (1994)

Equine hyperlipidemia.

Comp. Cont. Educ. Pract. Vet. 16 (1), 89–98

WATSON, T. D. G., D. MURPHY u. S. LOVE (1992)

Equine hyperlipaemia in the United Kingdom: Clinical features and blood biochemistry of 18

cases.

Vet. Rec. 131, 48–51

WATSON, T. D. G., C. J. PACKARD, J. SHEPHERD u. J. N. FOWLER (1990)

An investigation of the relationships between body condition and plasma lipid and lipoprotein

concentrations in 24 donkeys.

Vet. Rec. 127, 498–500

113


WEINBERG, R. B. (1987)

Lipoprotein metabolism: Hormonal regulation.

Hosp. Pract 22, 223-243

WENSING, T. H., A. J. H. SCHOTMAN u. J. KRONEMAN (1973 a)

A new method in the treatment of hyperlipaemia in ponies.

Neth. J. Vet. Sci. 5 (2), 145–147

WENSING, T. H., A. J. H. SCHOTMAN u. J. KRONEMAN (1973 b)

Various new clinical chemical data in the blood of normal ponies and ponies affected with

hyperlipaemia (hyperlipoproteinaemia).

Tijdschr. Diergen. 98 (14), 673–680

WRAGE, S. (2002)

Beta-adrenerge Rezeptoren im equinen Fettgewebe und ihre Bedeutung im Hinblick auf das

Hyperlipämie-Syndrom des Ponies.

Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.

YEAMAN, S. J. (1990)

Hormone-sensitive lipase – a multipurpose enzyme in lipid metabolism.


YEAMAN, S. J. (2004)

Hormone-sensitive lipase – new roles for an old enzyme.

Biochem. J. 379, 11-22

114

9. Anhang

9. ANHANG

9.1. Bezugsquellen

9.1.1. Verwendete Geräte

Einmal–Küvetten aus Acryl,

4,5 ml, vier klare Seiten

photometrische Messung der

Lipolyseraten

Carl Roth GmbH, 76185

Karlsruhe, Deutschland

Spritzen Braun Injekt 5 ml Absaugen der Unterstände

zwischen den einzelnen

Waschvorgängen

Braun, 34209 Melsungen,

Deutschland

Einmal-Injektionskanülen

Sterican Ø 0,90 x 70 mm

Falcon–Röhrchen Inkubation der Probenansätze

und Waschen der Adipocyten

Becton Dickinson Labware

Europe, 38800 Le Pont De

Claix, France

Hamilton-Pipette Pipettieren der Palmitinsäure

Hellma Präzisionsküvetten Erstellen einer Eichkurve mit

Palmitinsäure

Magnetrührer des Cary 1E

UV-Visible

Spectrophotometer Varian

Aufbewahrung der Küvetten

zwischen den Messungen

Mikroskop Leica DM IRB Auszählen der Fettzellen nach

Methylenblaufärbung und

Beurteilung des Zellkerns

Nylon–Gaze Filtration der Adipocyten-

suspension im Anschluss an

die Inkubation

Eckert GmbH, 79183

Waldkirch, Deutschland

115

9. Anhang

Operations– und

Infusionsbesteck, Tupfer und

Nahtmaterial

Operation der Institutsponys Wirtschaftsgenossenschaft

Deutscher Tierärzte (WDT),

30827 Garbsen, Deutschland

Schreiber Aufzeichnen der Spektren der

Fluorochrome

Spektrofluorophotometer

Shimadzu RF–510

Messung der Lipolyserate Shimadzu Seisakusho LTD,

Kyoto, Japan

Wasserbad Braun Inkubation der Proben Braun, 34209 Melsungen,

Deutschland

Zählkammer Modell Thoma Auszählen der Fettzellen und

Zellzahleinstellung

WDT, 30827 Garbsen,

Deutschland

Zeiss Axiovert 35 M Beurteilung der Live / dead–

Färbung

116

9. Anhang

9.1.2. Medikamente

Diazepam

Narkoseeinleitung ratiopharm GmbH, 89079

Ulm, Deutschland

Ketamin

Narkoseeinleitung und

-aufrechterhaltung im Triple

Drip

CP-Pharma, 31303 Burgdorf,

Deutschland

Metacam®

Schmerzlinderung,

Entzündungshemmung

Boehringer Ingelheim

Vetmedica GmbH, 55216

Ingelheim / Rhein,

Deutschland

Myolaxin®

Narkoseaufrechterhaltung im

Triple Drip

Vétoquinol/ Chassot, 88212

Ravensburg, Deutschland

Procain–Benzylpenicillin

(Euterinjektor)

lokale Wundversorgung WDT, 30827 Garbsen,

Deutschland

Sedivet®

Sedation und Narkose-

aufrechterhaltung im Triple

Drip

Boehringer Ingelheim

Vetmedica GmbH, 55216

Ingelheim / Rhein,

Deutschland

Tardomyocel® comp. III

postoperative Antibiose Bayer Vital, 51368

Leverkusen

Tetanus–Serum

Tetanusprophylaxe WDT, Serumwerk Memsen,

27318 Hoyerhagen

vetren® gel

Heparin–haltige Salbe,

Behandlung p. o.

Altana Pharma, Konstanz

Zinkoxyd–Salbenspray

Wundspray, Abdeckung der

Operationsnaht

CP–Pharma, 31303 Burgdorf,

Deutschland

117

9. Anhang

9.1.3. Reagenzien

Alle Reagenzien hatten den Reinheitsgrad pro analysi.

NaCl Transport der Proben (0,9 %);

Pufferlösungen

Sigma–Aldrich Chemie

GmbH, 89552 Steinheim,

Deutschland

Palmitinsäure Erstellen der Eichkurve

Collagenase Typ II

HEPES

Glucose

BSA

Adipocytenpräparation

DBcAMP

[±]Norepinephrin[+]-

Hydrogentatrat (NA)

Messung der

Lipolyserate

ADA Typ II Boehringer Mannheim GmbH

Biochemica, 6800 Mannheim,

Deutschland

SNAFL-1 pH–sensitives Fluorochrom

zur Messung der Lipolyserate

Molecular Probes Europe BV,

2333 AA Leiden, The

Netherlands

SNARF

5,6-Carboxyfluorescein

pH–sensitive Farbstoffe

Live / dead-Färbung Simultanfärbung zum

Nachweis der Lebensfähigkeit

Methylenblau Anfärben der Adipocyten zum

Auszählen in der Thoma-

Kammer

Merck KgaA, 64295

Darmstadt, Deutschland

DMF Lösen von SNAFL-1 Sigma–Aldrich Chemie


Deutschland

118

9. Anhang

NaOH Einstellen der pH-Werte der

Puffer

Carl Roth GmbH, 76185

Karlsruhe, Deutschland

KCl Ansetzen der Pufferlösungen Sigma–Aldrich Chemie


Deutschland

MgSO4*7H2O

CaCl2*2H2O Merck KgaA, 64295

Darmstadt, Deutschland

KH2PO4

119

9. Anhang

9.2. Stammlösungen

Im Folgenden aufgeführte Stammlösungen wurden aliquotiert und, mit Ausnahme des

DBcAMP, bei – 20°C eingefroren. DBcAMP wurde vor jedem Messdurchgang neu angesetzt.

- Krebs–Ringer-Stammlösung (NaCl 590 mM):

- 590 mmol / NaCl

- 24,8 mmol / l KCl

- 12,7 mmol / CaCl2*2H2O

- 5,59 mmol / l KH2PO4

- 5,59 mmol / l MgSO4*7H2O

- Aqua bidest

- Krebs-Ringer-Stammlösung (NaCl 655 mM)

- 655 mmol / l NaCl

- 24,8 mmol / l KCl

- 12,7 mmol / CaCl2*2H2O

- 5,59 mmol / l KH2PO4

- 5,59 mmol / MgSO4*7H2O

- Aqua bidest

Die nachstehend aufgeführten Stammlösungen wurden in den angegebenen Konzentrationen

angesetzt und die Reagenzien dabei, wenn nicht anders beschrieben, in Aqua bidest gelöst.

- HEPES 150 mmol / l

- Glucose 140,mmol / l

- BSA 70 g / l

120

9. Anhang

- Collagenase 20 g / l, gelöst in 0,9 %iger NaCL

- SNAFL-1 20 mmol / l , gelöst in DMF

- DBcAMP 50 µmol / l, gelöst in KR-Lösung III

- NA 6,26 mmol / l

- ADA 10 U / l, gelöst in 0,9 %iger NACl

Die Puffer für das Separieren (KR-Lösung I) und Waschen (KR-Lösung II) der Fettzellen

wurden zu jedem Messdurchgang frisch hergestellt und bestanden aus der erstgenannten KR-

Stammlösung (NaCL 590 mmol /l) und aus den Stammlösungen von HEPES, Glucose und

BSA. Mit A. bidest wurde auf das erforderliche Endvolumen aufgefüllt. Die

Endkonzentration des BSA betrug für den Puffer, der für das Isolieren der Zellen verwendet

wurde, 3,5 %. Der Puffer zum Waschen der Adipocyten enthielt 1 % BSA.

Die zweite KR-Stammlösung (NaCl 655) diente der Herstellung des für den Messvorgang

bestimmten Puffers (KR-Lösung III), der darüber hinaus Glucose- und BSA-Stammlösung

enthielt. Auch hier wurde mit A. bidest bis zum Endvolumen aufgefüllt. Die

Endkonzentration des BSA lag in diesem Puffer bei 0,5 %.

Die pH-Werte der geschilderten Puffer wurden mit 0,1 M NaOH bei 37°C auf 7,4 eingestellt.

121

9. Anhang

9.3. Tabellen

Tiernummer

Geschlecht

Alter (Jahre)

Größe (cm)

Gewicht (kg)

1 Wallach 6 100 172

2 Wallach 5 102 175

3 Wallach 10 111 214

4 Wallach 10 89 145

5 Wallach 6 87 109

6 Wallach 12 91 120

Tab. 1: Daten der Ponys aus dem Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover. Das durchschnittliche Alter betrug 8,2 ± 2,9 Jahre. Das

Durchschnittsgewicht lag bei 155,8 ± 39,0 kg.

122

9. Anhang

Tiernummer

Geschlecht

Alter (Jahre)

Größe (cm)

Gewicht (kg)

7 Wallach 9 115 220

8 Stute 20 134 360

9 Stute 11 146 470

10 Stute 11 130 380

11 Stute 20 107 250

12 Stute 15 133 396

13 Stute 26 99 170

14 Stute 9 134 400

15 Wallach 15 143 430

16 Stute 21 134 370

Tab. 2: Daten der Schlachtponys. Das durchschnittliche Alter betrug 15,7 ± 5,8 Jahre. Das


123

9. Anhang

Tiernummer

Geschlecht

Alter (Jahre)

Größe (m)

Gewicht (kg)

17 Wallach 12 1,66 580

18 Wallach 5 1,70 640

19 Wallach 5 1,70 550

20 Wallach 23 1,68 630

21 Stute 20 1,67 690

22 Wallach 3 1,63 510

23 Stute 19 1,68 630

24 Stute 13 1,52 530

25 Wallach 16 1,76 720

26 Stute 17 1,49 420

27 Wallach 3 1,60 510

28 Wallach 11 1,82 730

29 Stute 15 1,59 560

30 Stute 15 1,61 520

31 Stute 13 1,80 610

32 Wallach 3 1,68 580

33 Stute 21 1,58 570

34 Stute 20 1,67 590

Tab. 3: Daten der Schlachtpferde. Das durchschnittliche Alter betrug 13 ± 6,7 Jahre. Das


124

9. Anhang

relative Fluoreszenzeinheiten

Bauchfett Inguinalfett

t in min Kontrolle NA DBcAMP Kontrolle NA DBcAMP

0 0,3 1,7 2,4 1,1 1,3 0,4 10 1,6 0,3 2,6 0,5 1,2 1,1 20 1,2 0,4 3,3 0,7 1,4 1,1 30 1,2 0,0 4,0 0,7 1,0 2,0 40 1,1 0,0 6,1 0,6 0,5 3,6 50 1,6 0,1 9,3 0,7 0,6 6,1 60 1,9 0,7 15,4 0,6 0,3 8,8 70 2,3 1,0 20,3 0,1 0,4 13,5 80 2,1 1,2 24,5 0,4 1,4 16,3 90 2,1 1,3 30,9 0,5 2,3 21,6 100 1,8 1,8 36,0 0,5 4,2 27,8 110 1,9 3,1 40,0 0,4 5,8 32,4 120 2,9 3,6 42,6 0,0 7,7 36,2

Tab. 8: Einzelwerte des Pferdes Nr. 20, dessen Verlauf der Lipolyse in Kapitel 4.2. auf Seite

45 graphisch dargestellt ist.

125

9. Anhang

relative Fluoreszenzeinheiten

Bauchfett Inguinalfett

t in min Kontrolle NA DBcAMP Kontrolle NA DBcAMP

0 1,4 0,0 1,1 0,0 1,3 0,6 10 0,4 1,2 0,5 1,3 0,1 0,5 20 0,5 1,4 0,0 1,2 0,0 0,0 30 0,5 1,5 0,5 1,0 0,6 0,2 40 0,3 3,0 1,5 1,3 0,2 0,3 50 0,4 3,5 4,4 1,4 1,2 1,0 60 0,4 4,4 8,0 1,8 1,6 2,0 70 0,3 6,6 9,7 1,8 1,7 4,3 80 0,3 8,5 13,1 2,0 2,8 6,5 90 0,3 11,1 16,9 2,0 3,8 8,7 100 0,1 12,7 17,6 2,1 4,8 10,5 110 0,1 15,0 19,2 1,8 6,2 11,9 120 0,0 16,6 20,7 1,7 7,6 13,2

Tab. 9: Einzelwerte des Ponys Nr. 16, dessen Verlauf der Lipolyse in Kapitel 4.2. auf Seite 47

graphisch dargestellt ist.

126

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Sallmann danke ich herzlich für die Überlassung dieses

interessanten Themas. Die angenehme und freundliche Atmosphäre, die in seiner

Arbeitsgruppe herrschte, wird mir ebenso in dankbarer Erinnerung bleiben, wie die

Möglichkeit, zu jeder Zeit meine Angelegenheiten vorbringen und Lösungsansätze

diskutieren zu können.

Herrn Dr. R. Busche danke ich, der mit seinen Anregungen zur Durchführung der Versuche

zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat und besonders bei computertechnischen

Problemen Hilfe gewährte.

Den Mitarbeitern des Instituts für Physiologische Chemie möchte ich für ihre freundliche

Aufnahme in das Team und für die stets offenen Ohren, denen ich begegnen durfte, und die

gewährte Hilfe danken. An dieser Stelle sei besonders Frau Andrea Widdel–Bigdely genannt,

die mit ihrer herzlichen Art einen schier endlosen Optimismus versprühte und mir immer mit

Rat und Tat zu Seite stand.

Auch meiner Mitdoktorandin Britta Zahn sei für viele fröhliche Momente gedankt, die immer

von herzhaftem Lachen begleitet waren. In besonders heiterer Erinnerung werden mir unsere

beinahe nächtlichen Fahrten zum Schlachthof bleiben. Für ihre private und berufliche Zukunft

wünsche ich ihr das Beste.

Zu besonderem Dank bin ich der Roßschlachterei Knoche und Sohn in Helmstedt verpflichtet,

ohne die diese Arbeit wohl nicht entstanden wäre. In äußerst kooperativer und hilfsbereiter

Weise sorgten die Mitarbeiter dafür, dass ich ausreichend Probenmaterial sammeln konnte

und vermittelten mir darüber hinaus das Gefühl, willkommen zu sein.

Ich möchte auch meiner Freundin Kathrin danken, die in ihrer Eigenschaft als Deutschlehrerin

das Übel der so genannten „Rechtschreibreform“ in meine Arbeit einziehen ließ und letzte

Fehler ausmerzte.

Danksagung

Ich danke meiner Freundin Wiebke. Sie verfügt über den Magister in Englisch und war meine

erste Anlaufstelle, als es um die Korrektur des Summary ging, bei der sie mir hilfreich zur

Seite stand.

Ein liebevolles Dankeschön gebührt Mario, der während dieser Zeit nicht nur meine guten

Launen geduldig ertragen hat und dabei trotzdem nicht den Glauben an mich verlor und mich

statt dessen mit unermüdlichem Eifer umsorgte.

In herausragender Weise und aus ganzem Herzen möchte ich meinen Eltern danken, ohne die

ich nicht bis hierher gekommen wäre, die voller Stolz auf das blicken, was ich geschafft habe

und auf deren Rückhalt, Unterstützung und Hilfe ich immer bauen konnte. Danke.

Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase bei Gropferd und

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