Strukturelle, funktionelle und genetische Analyse der LEW ... · pers. Komm. persönliche...

Medizinische Hochschule Hannover

Institut für Versuchstierkunde

Strukturelle, funktionelle und genetische Analyse der

LEW/Ztm-ci2 Ratte-

ein Tiermodell für syndromale Taubheit

INAUGURAL - DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Nadine Held

(Grevesmühlen)

Hannover, 2007

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich

2. Gutachterin/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl

Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2007

Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft

(DFG) im Rahmen des Graduiertenkolleg 705-II "Charakterisierung pathophysiologischer

Tiermodelle" gefördert.

Teile der vorliegenden Dissertation wurden in folgendem Artikel zusammengefasst, der in

Kürze zur Veröffentlichung eingereicht wird:

Nadine Held, Bart M.G. Smits, Edwin Cuppen, Hans J. Hedrich, Dirk Wedekind (2007):

Identification of Myo15 as the causing gene for the deviant phenotype of circling 2 rats.

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung 3

2 Literaturübersicht 15 2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte 15

2.2 Rotationsverhalten 18

2.2.1 Lateralität und Bewegungsstörungen bei normalen Tieren 18

2.2.2 Pathophysiologie des Rotationsverhaltens 19

2.2.3 Tiermodelle mit Rotationsverhalten 20

2.2.3.1 Mausmodelle 21

2.2.3.2 Rattenmodelle 24

2.3 Genetik der LEW/Ztm-ci2 Ratte - Vorarbeiten 26

2.4 Kandidaten 27

2.4.1 Kalziumkanäle 27

2.4.2 Unkonventionelle Myosine 29

2.5 Usher Syndrom 32

2.5.1 Krankheitsbild 32

2.5.2 Retinopathia Pigmentosa 34

2.6 Elektroretinographie 35

2.6.1 Photorezeptorzellen 35

2.6.4 Elektroretinographie 36

3 Methoden 38 3.1 Versuchstiere 38

3.1.1 Rattenstämme 38

3.1.2 Genotypisierung 39

3.1.3 Tierhaltung 40

3.2 Kandidatengenanalyse - Sequenzierung 41

3.2.1 Probenentnahme 42

3.2.2 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion 42

3.2.3 Amplifikation der Kandidatengene 43

3.2.4 Sequenzierung 43

3.2.5 Mutationsanalyse 43

3.3 Kandidatengenanalyse - Real Time PCR 44

3.3.1 Probenentnahme 44

3.3.2 Isolierung von Ribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion 44

3.3.3 Reverse Transkription 45

3.3.4 Durchführung der Real Time PCR 45

3.3.5 Auswertung der Daten 46

3.4 Analyse der Proteinstruktur - Klonierung 46

3.4.1 Klonierung der mutationstragenden MyTH4-Domäne 46

3.4.2 Transformation in E. coli 48

3.4.3 Selektion 48

3.4.4 Kontrolle des Ligationsergebnisses 49

3.4.5 Klonierung in den pM765-tev Vektor 50

3.4.6 Transformation des pM765-tev Vektors in E.coli 52

3.4.7 Selektion und Kontrolle des Ligationsergebnisses 52

3.4.8 DNA-Maxipräparation ausgewählter Klone 52

3.5 Analyse der Proteinstruktur - Zellbiologische Methoden 53

3.5.1 Transfektion von Dictyostelium discoideum 53

3.5.2 Selektion transfizierter Zellen mit Geneticin 53

3.5.3 Gewinnung von Sporen 54

3.5.4 Anzucht von D. discoideum aus Sporen 55

3.6 Analyse der Proteinstruktur - Proteinbiochemische Methoden 55

3.6.1 Analytische Proteinpräparation aus D. discoideum 55

3.6.2 Nachweis von Proteinen mittels Gelelektrophorese 55

3.7 Elektroretinographische Untersuchung 56

3.7.1 Übersicht der verwendeten Tiere 56

3.7.2 Dunkeladaptation 57

3.7.3 Narkose 57

3.7.4 Vorbereitung der Versuchstiere 58


3.7.6 Kontrolle der Aufwachphase 60

3.8 Histologische Untersuchung der Retina 60

3.8.1 Entnahme der Augäpfel und Fixation der Organe 60

3.8.2 Einbettung, Schnitttechnik und Färbung der Präparate 61

3.8.3 Auswertung der histologischen Präparate 61

3.9 Untersuchung von Umweltfaktoren für die Vergleichsstudie 63

3.9.1 Infektionserreger 63

3.9.2 Lichtintensität 64

3.9.3 Umgebung und Haltungsbedingungen 64

3.10 Statistische Auswertung 65

4 Ergebnisse 66 4.1 Einleitung 66

4.2 Genetische Untersuchung 67

4.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene 67

4.3 Funktionelle Untersuchungen 68

4.3.1 Real Time PCR 68

4.3.2 Proteinanalytik 69

4.4 Pathophysiologische Untersuchungen 72

4.4.1 Elektroretinographische Voruntersuchungen 72

4.4.2 Untersuchungen zum visuellen Phänotyp der LEW/Ztm-ci2 Ratte (MHH)

und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie 73

4.4.2.1 Verhalten 73

4.4.2.2 Vergleich der Körpermasse 74

4.4.2.3 Elektroretinographie 76

4.4.2.4 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes 82

4.4.2.5 Untersuchung von Umweltfaktoren 85

4.4.3 Elektroretinographische Untersuchung der

HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte 88

5 Diskussion 93

5.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte - Phänotyp und Tiermodell 93

5.2 Genetische Untersuchung 94

5.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene 94

5.3 Funktionelle Untersuchungen 99

5.3.1 Real Time PCR 99

5.3.2 Proteinanalytik 100

5.4 Pathophysiologische Untersuchungen 102

5.4.1 Elektrophysiologische Voruntersuchung 102


und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie 103

5.4.2.1 Tiergruppen 103

5.4.2.2 Verhalten 104

5.4.2.3 Körpergewicht 106

5.4.2.4 Elektroretinographische Untersuchung 107

5.4.2.5 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes 110

5.4.2.6 Untersuchung von Umweltfaktoren 113

5.5 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte als mögliches Tiermodell für das

Usher Syndrom des Menschen 117

5.6 Elektrophysiologische Untersuchung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte 119

5.7 Ausblick 120

6 Zusammenfassung 122

7 Summary 125

8 Literaturverzeichnis 127

9 Anhang I, Material & Methoden 157

9.1 Materialien, Programme und Bezugsquellen; Internet-Adressen 157

9.2 Methoden 169

9.2.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure 169

9.2.1.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure

mit dem NucleoSpin® Tissue Kit 169

9.2.1.2 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Leber und Milz

mit dem NucleoSpin® RNAII Kit 170

9.2.1.3 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Gehirn und Hypophyse

mit dem RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit 171

9.2.2 PCR - Primersequenzen 172

9.2.2.1 Entwicklung von Primern 172

9.2.2.2 Herstellen der Primerlösungen 173

9.2.2.3 Primer für die Genotypisierung

der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte 173

9.2.2.4 Primer für die Sequenzanalysen der Kandidatengene 174

9.2.2.5 Primer für die Expressionsanalyse der Kandidatengene 176

9.2.2.6 Primer für die Klonierung der MyTH4-Domäne 177

9.2.2.7 Primer für die Sequenzierung 177

9.2.3 PCR - Protokolle und Temperaturprofile 177

9.2.3.1 Protokoll und Temperaturprofil für die Standard-PCR

zur Amplifikation genomischer DNA-Fragmente 178

9.2.3.2 Protokoll und Temperaturprofil für die Sequenzanalysen der

Kandidatengene 179

9.2.3.3 Protokoll und Temperaturprofil für die Reverse Transkription

mit dem Omniskript RT Kit 180

9.2.3.4 Protokoll und Temperaturprofil für die Real Time PCR 182

9.2.3.5 Protokoll und Temperaturprofil für die Amplifikation

der MyTH4-Domäne 183

9.2.4 Gelelektrophorese 184

9.2.4.1 Ladepuffer für die PCR-Proben 184

9.2.4.2 Ansetzen des DNA-Längenstandards 184

9.2.4.3 Agarose-Gelelektrophorese 184

9.2.4.4 Kontrolle der RNA-Extraktion

mittels denaturierender Gelelektrophorese 185

9.2.5 Aufreinigung von DNA 186

9.2.5.1 Aufreinigung von PCR-Produkten

mit dem QIAquick PCR Purification Kit 186

9.2.5.2 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

mit dem NucleoSpin® Extract Kit 187

9.2.6 Klonierung von PCR-Fragmenten 187

9.2.6.1 Erzeugung eines A-Überhangs (A-tailing) 187

9.2.6.2 Ligation mit dem pGEM®-T Easy Vector System I 188

9.2.6.3 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit 189

9.2.6.4 Ansatz für den Restriktionsverdau mit EcoRI 189

9.2.6.5 Ansatz für den Restriktionsverdau mit XhoI 190

9.2.6.6 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit 190

9.2.6.7 Restriktionsverdau mit XhoI und NheI im Doppelverdau 191

9.2.6.8 Ligation des pM765-tev Vektors 192

9.2.7 Nachweis von Proteinen 192

9.2.7.1 Extraktion von Proteinen aus D.discoideum 192

9.2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Gele 193

9.2.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Elektrophorese 194

9.2.7.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Coomassie-Färbung 194


9.2.8.1 Protokoll der Phänotypisierung 195

9.2.8.2 Testparameter des skotopischen Einzelblitz-ERGs 196

9.2.8.3 Testparameter des photopischen Einzelblitz-ERGs 196

9.2.8.4 Protokoll zur Dokumentation des Versuchsablaufs 197

9.2.9 Untersuchung von Umweltfaktoren 198

9.2.9.1 RT-PCR zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein-spezifischer RNA 198

10 Anhang II, Ergebnisse 199 10.1 Vergleichsuntersuchung 199

10.1.1 Phänotypisierung 200

10.1.2 Gewicht 202

10.1.3 Lichtintensität 203

10.1.4 Histologie 204

Danksagung

Abkürzungsverzeichnis

/ pro

% Prozent

% v/v Volumenprozent

% w/v Gewichtsprozent °C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM mikromolar

A 2Desoxyadenosin-5monophosphat

Abb. Abbildung

abs. absolut

ad auffüllen auf

Amp Ampicillin

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumperoxodisulfat

Aqua dest. destilliertes Wasser

AS Aminosäuren

ATP Adenosintriphosphat

BD Borna Disease, Bornasche Erkrankung

BDV Borna Disease Virus, Erreger der Bornaschen Erkrankung

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C 2Desoxycytosin-5monophosphat

C- Carboxy-

ca. circa

cd Candela

cds Candelasekunde

cDNA komplementäre DNA

CIAP Alkalische Kälberphosphatase (Calf Intestine Alkaline Phospatase)

cm Zentimeter

CO2 Kohlendioxid

d desoxy

D. Dictyostelium

DA Dopamin

dH2O destilliertes Wasser

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNAse Desoxyribonuklease

DTT 1,4-Dithiolthreitol

E. Escherichia

EB Elutionspuffer

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylenglycoltetraacetat

ERG Elektroretinographie, Elektroretinogramm

evt. eventuell

FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations

fw Vorwärtsprimer (forward)

G 2Desoxyguanosin-5monophosphat

G10 G418-Sulfat (Geneticin)

g Gramm

GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

ggr. geringgradig

H.E. Hämatoxylin-Eosin

hgr. hochgradig

His Histidin

(His)8-tag His-Oktapeptid

Hprt Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase

Hz Hertz

ID Versuchsnummer

ISCEV Internationale Gesellschaft für klinische Elektrophysiologie des Sehens

Kap. Kapitel

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

LB Luria-Bertani Medium

LBAmp Luria-Bertani Medium, mit Ampicillin versetzt

LP Rückwärtsprimer (Lower Primer)

M molar

m2 Quadratmeter

m3 Kubikmeter

mA Milliampere

max. maximal

MDB membrane desalting buffer

MES 2-(n-Morpholino)ethansulfonsäure

mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid

mhc Haupthistokompatibilitätskomplex (main histocompatibility complex)

MHH Medizinische Hochschule Hannover

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

mM Millimolar

MOPS 3-Morpholinpropansulfonsäure

mRNA messenger Ribonukleinsäure

MyTH4-Domäne myosin tail homology-4 Domäne

N- Amino-

nm Nanometer

n.s. nicht signifikant

o- ortho-

ORF Leseraster (open reading frame)

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

pers. Komm. persönliche Kommunikation

pH negativer Logarithmus der Wasserstoffkonzentration

P/S Penicillin/Streptomycin

rev Rückwärtsprimer (reverse)

RNA Ribonukleinsäure

RNAse Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkriptase PCR

RP Retinopathia Pigmentosa

RPE Retinales Pigmentepithel

s. siehe

SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecyl Sulfate)

SDS-PAGE denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit SDS

sek Sekunde(n)

SNC suprachiasmaler Nukleus

sog. sogenannt

T 2Desoxythymidin-5monophosphat

Tab. Tabelle

TAME N-Tosyl-L-Argininmethylesterhydrochlorid

TBST Tris buffered saline Tweed

Taq Thermophilus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA

TEMED N, N, N´,N´-Tetramethylethylendiamin

TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover

Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan

U Einheit(en) (Unit(s))

UP Vorwärtsprimer (Upper primer)

V Volt

v/v volume per volume (Volumenanteile bezogen auf das Gesamtvolumen)

vgl. vergleiche

vs. versus

w/v weight per volume (Gewichtsanteile bezogen auf das Gesamtvolumen)

WT Wildtyp

x mal

Xgal Bromchlorindolyl-Galaktose

ZTL Zentrales Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover

Aminosäuren werden nach dem internationalen Ein- oder Dreibuchstabencode abgekürzt.

Die Abkürzung der Basen entspricht den IUB tentative rules.

1. Einleitung 13

1 Einleitung

Die LEW/Ztm-ci2 Ratte entstand 1991 durch eine Spontanmutation im LEW-Inzuchtstamm

im Zentralinstitut für Versuchstierzucht der DFG, Hannover. Aufgrund des rezessiven

Erbgangs der Mutation zeigen ausschließlich homozygote Tiere eine Symptomatik. Diese ist

gekennzeichnet durch motorischen Bewegungsstörungen wie Hyperaktivität, Opisthotonus,

Ataxien und Drehverhalten (LÖSCHER et al., 1996). Das Dreh- oder Rotationsverhalten

(auch circling-Verhalten), eine aktive, stereotype Bewegung um die eigene Körperachse, kann

spontan oder stressinduziert auftreten (PYCOCK, 1980).

Neurochemische Untersuchungen zur Ursache des Rotationsverhaltens zeigten eine Lateralität

im dopaminergen System von LEW-ci2 Ratten (LÖSCHER et al., 1996; FEDROWITZ et al.,

2000). Daneben konnte eine profunde Taubheit homozygoter Tiere nachgewiesen werden.

Diese basiert auf einer Degeneration des neurosensorischen Epithels der Cochlea. Außerdem

wurden motorische Dysfunktionen in Zusammenhang mit zellulären Schädigungen im

vestibulären System gesehen (KAISER et al., 2001).

Mittels Kopplungsanalyse an einer Rückkreuzungspopulation konnte der chromosomale

Bereich, der die ci-Mutation enthält, eingegrenzt werden. Innerhalb dieses Abschnittes, der

auf Chromosom 10 (RNO10q22) lokalisiert war, wurden aufgrund ihrer Funktionen zwei

Kandidatengene identifiziert, das Myo15 und das Kcnj12 (CHWALISZ et al., 2003).

Entsprechend den bis dahin gestellten Befunden gilt die LEW-ci2 Ratte als mögliches

Tiermodell für neurosensorische Taubheit des Menschen (KAISER et al., 2001) und als

Modell für hyperkinetische Bewegungsstörungen (RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et

al., 2000).

Rotationsverhalten als Folge von degenerativen Veränderungen im Innenohr wurde sowohl

bei Maus- als auch bei Rattenstämmen bereits beschrieben (Kap. 2.2.3). Die Symptomatik

dieser Tiermodelle ist dem Phänotyp der LEW-ci2 Ratte auffallend ähnlich. Die

zugrundeliegende Mutation betrifft dabei häufig Gene, die an der Entstehung des humanen

Usher Syndroms beteiligt sind. Diese genetisch und klinisch sehr variable, hereditäre

Erkrankung ist durch eine langsam fortschreitende Netzhautdegeneration (Retinopathia

Pigmentosa) und früh einsetzende Innenohrschwerhörigkeit oder Gehörlosigkeit von Geburt

1. Einleitung 14

an gekennzeichnet (Pro Retina Deutschland e.V.), wobei zusätzlich Gleichgewichtsstörungen

auftreten können.

Interessanterweise entwickelt keines dieser Tiermodelle den für das Usher Syndrom

charakteristischen Augenphänotyp, der funktionelle Störungen und Degenerationen von

Photorezeptorzellen der Netzhaut einschließt. Im Gegensatz dazu gibt es Hinweise auf ein

eingeschränktes Sehvermögen bei LEW-ci2 Ratten, die sich aus Verhaltensbeobachtungen

und funktionellen Untersuchungen ergaben (VON HÖRSTEN, pers. Komm.). In

histologischen Präparaten der Retinae waren Anzeichen degenerativer Veränderungen zu

erkennen (KAMINO, pers. Komm.).

Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war die genetische Charakterisierung der Mutation, die für

den veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte verantwortlich ist. Zu diesem Zweck sollten die

im Vorfeld ermittelten Kandidatengene vollständig sequenziert und mithilfe einer

Referenzsequenz auf Basenunterschiede untersucht werden. Durch Analysen zur Expression

des identifizierten Gens und des betroffenen Proteins sollten die Auswirkungen der Mutation

erforscht werden.

Ein weiteres Ziel war die Charakterisierung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte, da es

Hinweise auf eine Beeinträchtigung des Sehvermögens bei der Mutante gab. Zu diesem

Zweck sollte der Augenhintergrund von Tieren unterschiedlicher Altersgruppen einerseits

funktionell mit Hilfe der Elektroretinographie und andererseits histologisch untersucht

werden. Erste Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die retinale Symptomatik der LEW-ci2

Ratte abhänigig von den Haltungsbedingungen variierte. Aus diesem Grund sollten in einer

Vergleichsstudie LEW-ci2 Ratten sowie Kontrolltiere aus zwei unterschiedlichen

Tierhaltungen untersucht werden. Neben elektroretinographischen und histologischen

Analysen sollten zusätzlich Umwelt- und Haltungsbedingungen beider Einheiten

gegenübergestellt werden.

Die Ergebnisse der genetischen Analysen in Verbindung mit den Resultaten der

Untersuchungen zum Augenphänotyp der LEW-ci2 Ratte sollten eine Einordnung der

Mutante als Tiermodell für die biomedizinische Forschung ermöglichen.

2. Literaturübersicht 15

2 Literaturübersicht

2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte

Im Jahr 1991 fielen in der 96. Filialgeneration des LEW/Han Inzuchtstammes im

Zentralinstitut für Versuchstierzucht der DFG in Hannover Tiere mit abnormalem

Rotationsverhalten auf. Durch Isolation und gezielte Zucht auffälliger Tiere konnte ein als

LEW-ci2 bezeichneter, coisogener Stamm etabliert werden, der seit 1993 am Zentralen

Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover weitergezüchtet wird. Das Symbol

"ci" bezeichnet das Rotationsverhalten (circling). Der Zusatz "2" war notwendig, da bereits

1986 im selben Inzuchtstamm eine nicht näher charakterisierte Mutation (ci1) mit gleichem

Phänotyp aufgetreten war (DEERBERG et al., 1989).

Aufgrund der schlechten Aufzuchtergebnisse drehender Elternpaare werden homozygote

Merkmalsträger der circling2-Mutation mit heterozygoten Geschwistertieren verpaart

(segregierende Inzucht).

Bereits am 18.-20. Lebenstag zeigen homozygote Nachkommen (ci2/ci2) erste Anzeichen

motorischer Anomalitäten. Dazu gehört neben dem Drehverhalten ein Überstrecken des

Kopfes nach caudo-dorsal (Opisthotonus), was auch als "stargazing" bezeichnet wird. Ab der

3.-4. Lebenswoche intensiviert sich das Drehverhalten, welches salvenartig in Form von

engen "nose-to-tail"-Rotationen ausgeführt und unter Einwirkung von Stress noch verstärkt

wird. Neben dem circling-Verhalten und dem Opisthotonus gehören lokomotorische

Hyperaktivität und Ataxie zur Symptomatik der LEW-ci2 Ratte (LÖSCHER et al., 1996).

Die Mutation folgt einem autosomal rezessiven Erbgang, weshalb heterozygote

Geschwistertiere phänotypisch unauffällig sind.

Da der Großteil homozygoter Tiere eine eindeutige Richtungspräferenz der Rotationen zeigt,

wird das Drehverhalten als lateralisiert bezeichnet. Zusätzlich wiesen die Tiere eine

ausgeprägte einseitige Defizienz der Vorderextremitäten contralateral zur spontanen

Drehpräferenz auf (LÖSCHER et al., 1996). Circling-Verhalten und motorische

Hyperaktivität dieser Tiere sind Ursache für geringere Gewichtszunahmen im Vergleich zu

heterozygoten Geschwistern, ihre Vitalität bleibt davon jedoch unbeeinträchtigt (LÖSCHER

et al., 1996; FEDROWITZ, 1999).


In einer Untersuchung zur Aufklärung des Rotationsverhaltens bei LEW-ci2 Ratten wurden

den Tieren verschiedene zentral wirksame Substanzen appliziert. Die Injektion von

Amphetamin bewirkte bei homozygoten Ratten neben einer gesteigerten Ataxie und

Hyperaktivität eine signifikante Erhöhung der Rotationsrate, was auf eine Imbalanz des nigro-

striatalen DA(Dopamin-)- Systems zurückgeführt wurde (LÖSCHER et al., 1996). Weitere

Hinweise auf eine bilaterale Imbalanz lieferten neurochemische Untersuchungen, die bei

Tieren mit deutlich ausgeprägter Seitenpräferenz eine signifikant geringere Konzentration an

DA und seinen Metaboliten (Homovanillinsäure und 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure) im

Striatum auf der Seite ipsilateral zur Rotationspräferenz offenlegten (LÖSCHER et al., 1996).

Des Weiteren konnten FEDROWITZ et al. (2000) zeigen, dass eine signifikante Erhöhung der

DA-Freisetzung contralateral zur Seite der Drehpräferenz ausschließlich nach Induktion von

Stress, nicht aber in Ruhephasen nachweisbar ist.

Diese Befunde, welche Gemeinsamkeiten zum Ungerstedt-Modell (UNGERSTEDT, 1968)

zeigten, legten zunächst die Vermutung nahe, dass die LEW-ci2 Ratte ein Tiermodell für den

ideopathischen Morbus Parkinson darstellen könnte. Dies bestätigte sich jedoch im Verlauf

weiterer immunhistochemischer Untersuchungen nicht, die zeigten, dass im Unterschied zur

Symptomatik der Parkinson-Krankheit die Anzahl dopaminerger Neurone der SNC und die

Dichte der dopaminergen Terminalen im Striatum keine bilaterale Asymmetrie aufwiesen

(RICHTER et al., 1999). Zusätzlich zu diesen Untersuchungsergebnissen zeichnen sich

betroffene Tiere durch Hyperaktivität und stereotype Kopfbewegungen aus, so dass die LEW-

ci2 Ratte als Modell für hyperkinetische Bewegungsstörungen vorgeschlagen wurde

(RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et al., 2000), wohingegen der Morbus Parkinson eine

hypokinetische Erkrankung darstellt.

Häufig wird Rotationsverhalten bei Ratten und Mäusen jedoch durch Infektionen oder

hereditäre Erkrankungen des Innenohrs aufgrund der Beeinträchtigung des vestibulären

Apparates ausgelöst. Nachdem eine mikrobiologische Pathogenese ausgeschlossen wurde,

erfolgte die funktionelle und histopathologische Untersuchung des cochleären und

vestibulären Systems.

Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit des Hörsinns wurden auditorisch evozierte Potentiale

bei betroffenen und nicht betroffenen LEW-ci2 Ratten abgeleitet. Es konnte gezeigt werden,

dass bei homozygoten Tieren eine vollständige Taubheit vorlag, wohingegen heterozygote

Tiere ein unbeeinträchtigtes Hörvermögen aufwiesen. Histologische Untersuchungen der

Cochlea ergaben einen nahezu vollständigen Verlust des sensorischen Epithels (Cortisches

Organs einschließlich der inneren und äußeren Haarzellen) und der umliegenden


Ganglienzellen. Weiterhin wurden Degenerationen von Zellen cochleärer Kerngebiete im

Hirnstamm festgestellt. Erhaltene Neurone zeichneten sich durch abnormale Gestalt sowie

reduzierte Größe und Dichte aus (KAISER et al., 2001).

Die Funktionsfähigkeit des vestibulären Systems der LEW-ci2 Ratte wurde anhand eines

Schwimmtests sowie weiterer neurophysiologischer Verhaltensuntersuchungen ("Air-Righting

Reflex", "Tail-Hanging Test") analysiert, die Störungen dieses Organsystems bei

homozygoten Tieren deutlich machten. Mutanten zeichneten sich durch Verlust der

Orientierung und abnormales Schwimmverhalten (Unfähigkeit zu schwimmen mit

korkenzieherartigem Abtauchen) sowie durch Defizite bei den Air-Righting und Tail-Hanging

Tests aus (KAISER et al., 2001; LESSENICH, 2002). Als Ergebnis histologischer

Untersuchungen gab es im Gegensatz zur Cochlea keinen Verlust vestibulärer Haarzellen.

Jedoch wiesen diese kleine Protrusionen in den endolymphatischen Raum auf, die auf

Veränderungen des Zytoskeletts der Haarzellen hinweisen könnten. Weiterhin war eine

Verkürzung der Stereozilien sowie eine Reduktion der Ganglienzellzahl zu beobachten. Da

bei jungen LEW-ci2 Ratten (ca. 4 Wochen alt) jedoch ein Verlust vestibulärer Haarzellen

festgestellt werden konnte, wurde eine Regeneration der Haarzellen während der späteren

Entwicklung angenommen. Vestibuläre Kerngebiete wiesen im medialen vestibulären

Nukleus signifikante Abweichungen hinsichtlich Volumen und Neuronendichte auf, zeigten

jedoch keine morphologischen Veränderungen (KAISER et al., 2001). Aufgrund der bis dahin

festgestellten Befunde wurde die LEW-ci2 Ratte als potentielles Tiermodell für

neurosensorische Taubheitsformen des Menschen vorgeschlagen (KAISER et al., 2001).

Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob das Rotationsverhalten der LEW-ci2 Ratte

im Zusammenhang mit epileptischen Anfällen stehen könnte. Beim Menschen ist eine Form

der Epilepsie beschrieben, bei der Patienten anfallsweise wiederholt auf engen Kreisen laufen

oder plötzlich Rotationen des gesamten Körpers bis hin zu mehreren Drehungen zeigen

(GASTAUT et al., 1986; DONALDSON et al., 1986). Während solcher Rotationsepilepsien

werden paroxysmale Veränderungen im EEG (Elektroenzephalogramm) sichtbar (SAKA et

al., 1996; TRINKA et al., 1997; AGUGLIA et al., 1999). Im Vergleich zu nachweislich

epileptischen WAG/Rij Ratten ("petit mal"-Anfälle) konnten bei den LEW-ci2 Ratten keine

epileptiformen Anomalien während der durchgeführten EEG-Untersuchungen festgestellt

werden (LINDEMANN et al., 2001).

Molekulargenetische Studien zur Kartierung der ci2-Mutation gaben erste Hinweise auf eine

mögliche Beteiligung des visuellen Systems am Phänotypen der LEW-ci2 Ratte. Daraufhin

durchgeführte Verhaltensuntersuchungen und erste elektrophysiologische Tests offenbarten


Anzeichen eines reduzierten Sehvermögens bei einigen Tieren (VON HÖRSTEN, pers.

Komm., GOCKELN et al., 2003). Erste histologische Untersuchungen wiesen auf eine

mögliche erblich bedingte Degeneration der Photorezeptoren hin (KAMINO, pers. Komm.).

2.2 Rotationsverhalten

2.2.1 Lateralität und Bewegungsstörungen bei normalen Tieren

Das menschliche Gehirn ist auf unterschiedlichen Ebenen lateralisiert mit der Konsequenz

einer großen Reihe von links-rechts-Asymmetrien von Hirnfunktionen (KANDEL, 1995).

Davon beeinflusst sind beispielsweise kognitive Fähigkeiten (LEVY, 1977; KANDEL, 1995)

und Sprachentstehung (KUPFERMANN, 1995). Bei Labornagern wurden hierzu ausführliche

Untersuchungen durchgeführt, die chemische, funktionelle und morphologische Indices für

Hirnasymmetrien offenlegten. So konnten JERUSSI und GLICK 1974 nachweisen, dass eine

systemische Verabreichung von Amphetamin bei normalen, gesunden Sprague-Dawley

Ratten ein lateralisiertes Drehverhalten auslöst, und führten dieses auf eine intrinsische,

bilaterale Imbalanz im DA-Gehalt des nigro-striatalen Systems von normalen Ratten zurück.

Es wurde angenommen, dass Amphetamin eine neurochemische Imbalanz in diesem System

verstärkt, indem es auf einer Seite größere Mengen an DA freisetzt, mit der Konsequenz, dass

die Ratte nun vermehrt in die bereits basal vorhandene, dominante Richtung gesteuert wird.

Die Differenz im DA-Gehalt zwischen rechtem und linkem Striatum, welche sich nach

Amphetamin-Applikation auf ca. 25% verstärkt, beträgt bei normalen Ratten 10-15% (GLICK

et al., 1976). Weiterführende Untersuchungen konnten zeigen, dass z.B. Sprague-Dawley

Ratten während ihrer nächtlichen Aktivitätsphasen spontan mit Seitenpräferenz drehen, dass

diese bevorzugte Drehrichtung konstant bleibt und mit der Amphetamin-induzierten

Richtungspräferenz übereinstimmt (GLICK et al., 1978). Weiterhin konnte ein Einfluss des

Kortex auf das Rotationsverhalten nachgewiesen werden. So moduliert die Aktivität des

frontalen Kortex die mesolimbischen und nigro-striatalen DA-Funktionen (GLICK und

GREENSTEIN, 1973; ROSS und GLICK, 1981; CARTER und PYCOCK, 1980). Eine

Aktivierung des mesokortikalen DA-Systems durch Stressoren induziert einen Wechsel der

Rotationsrichtung (CARLSON et al., 1987).

1986 konnten SHAPIRO et al. nachweisen, dass zwei Arten von Populationen existieren, und

zwar Populationen mit Drehrichtung weg von und solche mit Drehrichtung hin zur Seite des


Striatums mit der höheren DA-Konzentration. Diese Feststellung ließ vermuten, dass der Grad

der striatalen DA-Asymmetrie ausschließlich die Stärke des Rotationsverhaltens bestimmt,

die Drehrichtung jedoch von weiteren Faktoren beeinflusst wird. Weitere Untersuchungen

zum Rotationsverhalten konnten zeigen, dass der überwiegende Teil der Ratten eine

Rechtspräferenz aufweist (GLICK et al., 1979).

Interessanterweise ist das Drehverhalten (Anzahl an Rotationen innerhalb einer bestimmten

Zeiteinheit) bei weiblichen Tieren stärker ausgeprägt (SHAPIRO et al., 1986). Die Ursache

dafür wird in dem Einfluss von Östrogenen vermutet, da nachgewiesen wurde, dass weibliche

Ratten während des Östrus eine höhere Anzahl von Drehbewegungen ausführen (BECKER et

al., 1982). McDERMOTT konnte 1993 zeigen, dass weibliche Steroide einen Einfluss auf die

Aktivität nigro-striataler DA-Neurone ausüben.

2.2.2 Pathophysiologie des Rotationsverhaltens

Rotationsverhalten wird entweder zentral ausgelöst oder findet seine Ursache peripher in

Defiziten des vestibulären Systems im Innenohr.

Erkrankungen mit lateralisierter Ausprägung, die mit Bewegungsstörungen einhergehen,

entstehen oftmals in den Basalganglien, bei denen es sich um kortikale Kerngebiete handelt,

die Bewegungen modulieren. Zu diesen Erkrankungen zählt die Rotationsepilepsie, bei der

Patienten während typisch epileptiformer Anfälle wiederholt auf engen Kreisen laufen oder

plötzliche Rotationen (mind. um 180°) des gesamten Körpers ausführen (DONALDSON,

1986). Als Ursache für die gezeigten Drehbewegungen werden asymmetrische Entladungen

der Basalganglien vermutet (VERCUEIL et al., 1999; RAMMELLI et al., 1999).

Des Weiteren führt eine unilaterale Stimulation oder Läsion unterschiedlicher Hirnbereiche zu

Rotationsverhalten (PYCOCK, 1980). Diese kann mechanisch zum Beispiel durch

Elektroakupunktur (MA et al., 2006) oder chemisch durch Neurotoxine induziert werden

(UNGERSTEDT und ARBUTHNOTT, 1970; UNGERSTEDT, 1971; PYCOCK, 1980).

Zusätzlich können vestibuläre Dysfunktionen ein Rotationsverhalten auslösen, da vestibuläre

Kerngebiete Projektionen zum striato-pallidalen System ausbilden und somit in den

Schaltkreis der Basalganglien eingreifen (SHIMA, 1984). Neben Alterationen des Nucleus

vestibularis können weiterhin Schäden des Vestibularapparates im Innenohr Ursache für

Rotationsverhalten sein. Dies wurde 1978 durch ALLEVA und BALAZS bestätigt, die

zeigten, dass eine durch Aminoglykoside induzierte, pharmakologische Zerstörung der

Haarzellen im Innenohr ein Drehverhalten bei Ratten auslöst. Neben der induzierten


Schädigung von Zellen des Innenohrs sind erblich bedingte Verluste des Neuroepithels der

Cochlea bekannt, die Bewegungsstörungen nach sich ziehen. Diese Symptomatik ist Teil des

humanen Usher Syndroms, bei dem betroffene Patienten neben progressiver Taubheit und

Visusverlust unter Ataxien und Zwangsbewegungen leiden. Durch Untersuchungen an

Tiermodellen mit Rotationsverhalten und erblich bedingten Haarzellanomalien konnte gezeigt

werden, dass häufig Proteine des Aktinzytoskeletts an der Pathogenese der

Haarzellschädigung beteiligt sind (siehe Kap. 2.2.3).

Weiterhin ist bekannt, dass aufsteigende Infektionen des Mittelohrs (Otitis media) über eine

meist eitrige Entzündung des Innenohrs (Otitis interna) Ataxien und Drehverhalten auslösen

können. Durch die Nähe des Innenohrs zum Gehirn ist eine zentrale Beteiligung am

Krankheitsgeschehen möglich. Verursachende Keime können beispielsweise Staphylokokken,

Streptokokken, Mykoplasmen, Pseudomonaden, aber auch Hefen sein.

Daneben sind Alterationen oder Verluste von Haarzellen im Innenohr durch mechanische

Verletzungen denkbar.

2.2.3 Tiermodelle mit Rotationsverhalten

Es existieren eine Reihe von Maus- und Rattenmutanten, die sich unter anderem durch ein

mehr oder weniger ausgeprägtes Rotationsverhalten auszeichnen. Häufig wird die

Symptomatik aufgrund ihrer Kausalität von Ataxien, stereotypen Kopfbewegungen,

Hyperlokomotion und Hörverlust begleitet, weshalb diese Stämme als Tiermodelle für die

Taubheitsforschung und zur Untersuchung von Hyperkinesien eingesetzt werden.

Einige Mutanten mit abnormalem Drehverhalten, die einen der LEW-ci2 Ratte ähnlichen

Phänotyp aufweisen, sollen hier beschrieben werden.

2.2.3.1 Mausmodelle

shaker 1 (Myo7Ash1)

Die sh1-Mutation entstand ursprünglich im Mäuseinzuchtstamm BALB/c (LORD und

GATES, 1929), mittlerweile existieren insgesamt 10 verschiedene Allele, von denen fünf

induziert sind (LETTS et al., 1994; Jackson Laboratories Mouse Genome Informatics,

www.informatics.jax.org; RINCHIK et al., 1990).

Betroffene Tiere zeichnen sich durch Taubheit, Hyperaktivität, stereotype Kopfbewegungen

und Rotationsverhalten vestibulären Ursprungs aus (GIBSON et al., 1995; LORD und


GATES, 1929). Defekte im Neuroepithel des Innenohrs sind charakterisiert durch progressive

Degeneration der Haarzellen und stark desorganisierte oder degenerierte Stereozilien (DEOL,

1956; KIKUCHI und HILDING, 1965; GRÜNEBERG et al., 1945; MIKAELIAN et al.,

1965; SHNERSON et al., 1983).

Der genetische Ursprung der autosomal rezessiv vererbten Mutation liegt in dem Gen Myo7A

(GIBSON et al., 1995), das für ein unkonventionelles Myosin kodiert. Mutationen im Myo7A

führen beim Menschen zum Usher Syndrom Typ 1B, das neben den kongenitalen Defekten

des vestibulären und auditiven Systems mit einer progressiven Netzhautdegeneration

einhergeht (WEIL et al., 1995; WESTON et al., 1996; LEVY et al., 1997; LIU et al., 1997).

Obwohl LIBBY und STEEL (2001) reduzierte Photorezeptorantworten bei sh1-Mäusen im

Elektroretinogramm nachwiesen, konnte bis heute bei keiner der sh1-Allele eine retinale

Degeneration gezeigt werden.

shaker 2 (Myo15sh2) / shaker 2-J (Myo15sh2-J)

Die sh2-Mutation wurde in der Nachkommenschaft einer mit Röntgenstahlung behandelten

Maus entdeckt (DOBROVOLSKAIA-ZAVASDKAIA, 1928). Betroffene Tiere fallen durch

Rotationsverhalten, stereotype Kopfbewegungen und Taubheit auf (LIANG et al., 1998). Die

Symptomatik ist auf Defekte im Innenohr zurückzuführen, die durch dysmorphe Haarzellen

und extrem kurze, jedoch regelrecht angeordnete Stereozilien gekennzeichnet sind (PROBST

et al., 1998). Aus diesem Grund wurde die Mutante von FRIEDMAN et al. 1995 als

Tiermodell für humane Taubheit (DFNB3) vorgeschlagen.

Die Punktmutation, die in der Motordomäne des Myo15-Gens lokalisiert wurde (PROBST et

al., 1998), folgt einem autosomal rezessiven Erbgang. Das Myo15 kodiert für ein

unkonventionelles Myosin, das dem bei der shaker 1 Maus mutierten Myosin VIIA

morphologisch stark ähnelt.

Im Gegensatz dazu ist die Mutation bei der shaker 2-J Maus durch eine Deletion der letzten

sechs Exons des Myo15-Gens gekennzeichnet, betroffen ist also die gesamte FERM (Four

point one, Ezrin, Radixin, Moesin)- Domäne der Schwanzregion (ANDERSON et al., 2000).

Phänotypische Unterschiede zur shaker 2 Maus sind nicht bekannt.

deaf circler (dfcr) / deaf circler 2 Jackson (dfcr-2J)

Die deaf circler Maus und die deaf circler 2 Jackson Maus entstanden im Jackson

Laboratorium durch Spontanmutationen in Stämmen mit BALB/cByJ (dfcr) bzw. C57BL/6J


(dfcr-2J) Hintergrund. Die Mutationen sind allelisch und folgen einem rezessiven Erbgang

mit vollständiger Penetranz (JOHNSON et al., 2003).

Betroffene Tiere zeichnen sich durch Rotationsverhalten, stereotype Kopfbewegungen,

Gleichgewichtsstörungen sowie Taubheit aus. Sie sind nicht in der Lage zu schwimmen. Die

Symptomatik der dfcr und dfcr-2J Mäuse ist auf eine Dysfunktion des Innenohrs

zurückzuführen, ausgelöst durch einen progressiven Verlust von cochleären Haarzellen und

von Ganglionzellen. Verbliebene Stereozilien erscheinen unorganisiert und strukturverändert

(JOHNSON et al., 2003).

Die zugrundeliegenden Mutationen wurden auf Chromosom 7 lokalisiert. Es handelt sich um

eine 12,8 bp (dfcr) bzw. 1 bp (dfcr-2J) große Deletion im USH1c-Gen, das für das Protein

Harmonin kodiert. Mutationen in diesem Protein sind beim Menschen für nicht-syndromale

Taubheit (DFNB18) sowie für das Usher Syndrom Typ 1c verantwortlich.

Der Augenphänotyp betroffener Tiere, welcher aufgrund der Verbindung zum Usher Syndrom

untersucht wurde, zeigte keine krankhaften Veränderungen (JOHNSON et al., 2003).

whirler (Whrnwi)

Die whirler Maus entstand durch eine Deletionsmutation des whrn-Gens und wird autosomal

rezessiv vererbt (MBURU et al., 2003). Sie befindet sich in einer Region, die homolog zum

humanen DFNB31 ist, einem nicht-syndromalen profunden Typ von rezessivem Hörverlust

(ROGERS et al., 1999; PAIGE et al., 2000; MBURU, et al., 2003; TLILI et al., 2005).

Bei Mensch und Maus führen Mutationen im Whrn-Gen zu neuroepithelialer Taubheit und

vestibulären Dysfunktionen (HOLME et al., 2002). Daneben sind bei betroffenen Whrnwi-

Tieren stereotype Kopfbewegungen und Rotationsverhalten zu beobachten, deren Ursprung in

Defekten des Innenohrs zu suchen ist. Stereozilien der inneren Haarzellen sind abnormal kurz,

äußere Haarzellen dagegen sind in ihrer Länge annähernd regulär, zeigen aber anstelle der

physiologischen W- oder V-Form eine abgerundete U-Form (HOLME et al., 2002).

Das betroffene Whrn-Gen kodiert für ein PDZ-Domänen tragendes Protein, das Whirlin, das

in Prozesse der Elongation und Erhaltung von mechanosensorischen Stereozilien involviert ist

(MBURU et al., 2003) .

waltzer

Die Symptomatik der waltzer Maus ist gekennzeichnet durch Drehverhalten (circling) und

Taubheit, die infolge von schweren Degenerationen cochleärer und vestibulärer,

neurosensorischer Strukturen auftritt (OSAKO und HILDING, 1971). Die zelluläre


Organisation im Cortischen Organ des Innenohrs erscheint physiologisch, jedoch wurden

Defekte der Stereozilien nachgewiesen (DI PALMA et al., 2001). Die für den Phänotyp

verantwortlichen Punktmutationen (v, v6J, vAlb, v2J) sind in dem waltzer-Gen Cdh23 lokalisiert

(BRYDA et al., 1997; DI PALMA et al., 2001). Der zur waltzer-Region orthologe Bereich im

menschlichen Genom beinhaltet den humanen Taubheitslocus DFNB12 und USH1D, einen

Locus für das humane Usher Syndrom (CHAIB et al., 1996; WAYNE et al., 1996).

Phänotypisch nicht zu unterscheiden ist die Ames waltzer Maus, die 1956 von SCHAIBLE

entdeckt und später von OSAKO und HILDING (1971) charakterisiert wurde. Die rezessiv

vererbte Mutation wurde im Protocadherin15-Gen entdeckt (ALAGRAMAM et al., 2001),

COOK et al. beschrieben 1993 vier verschiedene Allele (Pcdh15av, Pcdh15avJ, Pcdh15av-2J,

Pcdh15av3J).

Zu den waltzer-Mutanten zählt außerdem die Snell`s waltzer Maus. Die ursächliche

Spontanmutation (Nullmutation) wurde erstmals 1966 von DEOL und GREEN beschrieben.

Sie betrifft das Myo6-Gen, welches für das unkonventionelle Myosin VI kodiert. Homozygote

Individuen weisen eine erblich bedingte Taubheit, Rotationsverhalten, stereotype

Kopfbewegungen und Hyperaktivität auf. Bereits nach der Geburt setzt ein progressiver

Haarzellverlust im Innenohr ein. Veränderte und desorganisierte innere und äußere Haarzellen

tragen Stereozilien, die zu gigantischen Strukturen fusionieren (AVRAHAM et al., 1995).

Weitere Mausmodelle

Die pirouette (pi) Maus zeichnet sich durch profunde Taubheit und Drehverhalten aus, das auf

Defekten im Innenohr basiert, die denen der Myo15-Mutanten sehr ähnlich sind. Die

autosomal rezessiv vererbte Mutation wurde auf MMU5 kartiert, die Mutante gilt als Modell

für DFNB25.

Die transgene, durch eine Insertionsmutagenese entstandene "chakragati"- Maus zeigt neben

einer Hyperlokomotion spontanes oder stressinduziertes Rotationsverhalten mit

Seitenpräferenz. Eine Dysfunktion von cochleärem oder vestibulärem System konnte jedoch

nicht festgestellt werden (RATTY et al., 1990; FITZGERALD et al., 1992).

Genetisch induziert sind ebenso die vestibulären Dysfunktionen und Degenerationen bei der

DBA/2 Maus, die ebenfalls zu Rotationsverhalten führen (BLOOM und HULTCRANTZ,

1994).

Weitere Mausmutanten, die durch Hyperlokomotion und Bewegungsstörungen wie circling-

Verhalten auffallen, sind die BUS/ldr Maus, die zusätzlich taub ist, und die C3H/He Maus.

Die BUS Mutante weist Degenerationen des Cortischen Organs und des Spiralganglions auf


(YONEZAWA et al., 1999). Bei der C3H/He Maus wurden mittels histologischer

Untersuchungen degenerierte Haarzellen mit morphologisch veränderten Stereozilien in den

Maculae nachgewiesen (KITAMURA et al., 1991).

2.2.3.2 Rattenmodelle

circling3 (ci3)

Die ci3-Mutation trat 1997 spontan am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen

Hochschule Hannover in dem BH-kongenen Inzuchtstamm BH.7A/Won auf, der das a-Allel

des Gens Ptprc (Protein Tyrosin Phosphatase Rezeptor Typ c; Synonym: Cd45, Lca, RT7)

exprimiert. Das von der LEW/Ztm Ratte stammende Allel wurde durch

Verdrängungskreuzung innerhalb von 12 Rückkreuzungsgenerationen auf die BH/Ztm-Ratte

übertragen (HEDRICH, 1990). Bereits im Absatzalter zeigen betroffene Tiere

Hyperlokomotion und spontanes, lateralisiertes Drehverhalten, das durch Stresseinwirkung

verstärkt oder ausgelöst wird. Bei Untersuchungen des vestibulären und cochleären Systems

konnten jedoch weder Dysfunktionen noch Degenerationen festgestellt werden.

Phänotypische Abweichungen wurden aus diesem Grund den nachgewiesenen lateralisierten

Abnormitäten im Bereich der Basalganglien sowie der Lateralität im dopaminergen System

im Striatum zugewiesen (LESSENICH et al., 2001).

tornado (tnd)

Homozygote Ratten, die die tornado-Mutation tragen, fallen durch Taubheit und vestibuläre

Dysfunktion auf, die mit circling-Verhalten, lokomotorischer Hyperaktivität und stereotypen

Kopfbewegungen einhergeht. Sie zeigen damit phänotypisch starke Übereinstimmungen mit

shaker-, waltzer- und whirler-Mausmutanten sowie Ähnlichkeiten zur Symptomatik der

circling2 und circling3 Ratten. Die autosomal rezessiv vererbte tornado-Mutation entstand

vor einem Wistar(Auszucht)-Hintergrund. Es handelt sich um eine ENU-induzierte

Punktmutation in der Motordomäne des Myo7A. Dieses Gen kodiert für das Myosin VIIA, das

ebenfalls bei der shaker1 Mausmutante betroffen ist und als Ursache des humanen Usher

Syndrom Typ 1B nachgewiesen wurde. Im Gegensatz zur Symptomatik dieser Erkrankung

zeigen tnd Ratten weder morphologische noch funktionelle Veränderungen der Retina, einzig

eine Abwesenheit von Melanosomen in apikalen Prozessen des Retinalen Pigmentepithels

(RPE) wurde beschrieben (SMITS et al., 2004).


spinner (spn)

Die spinner-1 Mutation, die einem autosomal rezessiven Erbgang folgt, trat 1973 spontan im

B/1N Stamm auf. Betroffene Tiere zeigen einen leichten Hydrozephalus und die Neigung, in

Uhrzeigerrichtung zu drehen (HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).

Eine starke Ähnlichkeit zum Phänotyp der spinner-1 Mutante weist die spinner-2 Ratte auf.

Mit Hilfe eines Komplementationstests (cis/trans-Test) konnte jedoch nachgewiesen werden,

dass es sich um zwei unabhängige Mutationen handelt (HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).

Genetischer Hintergrund der spn-2 Mutation ist der N:SDN-Auszuchtstamm.

jerker (je)

Synonym: stargazer (stg)

Die 1994 von TRUETT et al. beschriebene und ursprünglich als stargazer (stg) bezeichnete

Mutation entstand in einer Kolonie von Zucker-Ratten (Crl:ZUC-Lepfa). Die Mutation folgt

einem autosomal rezessiven Erbgang und wurde durch Untersuchungen mit

Mikrosatellitenmarkern im distalen Bereich des Chromosoms 5 (RNO5) kartiert. Dieser

Bereich weist große Homologien zu einem Segment des Chromosom 4 (MMU4) der Maus

auf, das das verantwortliche Gen für die jerker-Mausmutante (je) trägt (DEOL, 1954; STEEL

und BOCK, 1983).

Bereits mit Beginn der dritten Lebenswoche zeigen betroffene Tiere einen Opisthotonus,

Hyperaktivität, Rückwärtsbewegungen und Rotationsverhalten. Vestibuläre Dysfunktionen

und profunde Taubheit gehören ebenso zur Symptomatik der jerker Ratte. Mittels

histologischer Untersuchungen konnte eine progressive Degeneration von Haarzellen und von

Zellen des akustischen Ganglions nachgewiesen werden (TRUETT et al., 1994). Zusätzlich

konnten BROCK und ASHBY (1996) eine Fehlfunktion des zentralen dopaminergen Systems

aufdecken, das durch eine verringerte Ansprechbarkeit der Dopaminrezeptoren 2 und 3

gekennzeichnet ist.

waltzing

2001 beschrieben RABBATH et al. eine neue waltzing-Mutation in einer nicht näher

definierten Population von Long-Evans Ratten der Universität Pavia. Diese Mutante steht

höchstwahrscheinlich in keinem Zusammenhang mit der ursprünglich von KING (1936)

beschriebenen waltzing-Rattenmutante (w).

Betroffene Tiere zeigen Rotationsverhalten und vestibuläre Defizite, die sich in einer

Dysfunktion der Kontrolle von Haltung (Kopfhaltung abwärts) und Blick (Ausfälle des


horizontalen vestibulocochleären Reflexes) äußern. Da histologisch keine Veränderung des

neurosensitiven Epithels des Innenohrs nachgewiesen werden konnte, wurde angenommen,

dass Fehlfunktionen in der Transduktion oder der Prozessierung von Signalen im vestibulären

System die Ursache für die Rotationen sein könnten.

2.3 Genetik der LEW/Ztm-ci2 Ratte - Vorarbeiten

Zur Identifikation und Eingrenzung des chromosomalen Segmentes, welches die ci2-Mutation

trägt, wurde ein genomweites Scanning einer segregierenden BN-Rückkreuzungspopulation

([LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm]F1 x LEW/Ztm-ci2) durchgeführt. Die DNA der Tiere wurde mit

insgesamt 86 anonymen und für diese Kreuzung polymorphen Mikrosatellitenmarkern

untersucht. Es zeigte sich eine starke Assoziation des Phänotyps mit einer Region im

zentralen Bereich des Chromosom 10 (RNO10q22). Innerhalb des durch die

Kopplungsanalyse eingegrenzten chromosomalen Abschnittes wurde nach geeigneten

Kandidatengenen gesucht. Die vergleichende Betrachtung des Rattengenoms mit dem des

Menschen und der Maus ("comparative mapping") brachte zwei Gene hervor, die für zwei

unkonventionelle Myosine kodieren und aufgrund ihrer Funktion als Kandidaten in Frage

kamen, das Myo15 und das Myo1c. Die Kandidaten sowie zwei benachbarte Gene von Myo15

(das Znf179 und das Aldh3a1) wurden mittels gengekoppelter Mikrosatellitenmarker auf eine

Kartierung innerhalb der zentralen Assoziationsregion auf RNO10 untersucht, was zum

Ausschluss des Myo1c führte. Die Gene Znf179 und Aldh3a1 wurden ausschließlich zur

Absicherung der Position von Myo15 mitkartiert. Da die Sequenz der Ratte zu diesem

Zeitpunkt (Mai 2003) noch nicht bekannt war, wurde die cDNA-Sequenz der Maus für die

Untersuchungen genutzt.

Die physikalische Kartierung der nicht rekombinanten Region auf RNO10 erfolgte mit Hilfe

der Sequenzen von Ratten-BAC-Klonen. Als Grundgerüst diente ein 106 bp großer Bereich

des Mauschromosoms 11 (MMU11), in dem sich die Sequenzen der Gene befanden, die

homolog zu Myo15, Znf179 und Aldh3a1 sind. Mittels BLAST wurden 11 überlappende

Rattenklone ("Contig") identifiziert, die diesem Bereich des Mausgenoms entsprachen. Die

Kartierung bewirkte eine genaue Lokalisation der Gene und war die Grundlage für die

Entdeckung eines neuen Kandidatengens, dem Kcnj12.

Aufgrund ihrer Lokalisation innerhalb des eingegrenzten Bereiches auf RNO10 und dem

engen Zusammenhang mit dem ci2-Phänotyp sowie mit Krankheitsbildern bei Mensch und


Maus erschienen die Gene Myo15 und Kcnj12 als geeignete Kandidaten (CHWALISZ et al.,

2003).

2.4 Kandidatengene Durch die Erstellung einer physikalischen Karte der durch Kopplungsanalysen eingegrenzten

chromosomalen Region auf RNO10 sowie durch die vergleichende Betrachtung des Ratten-,

Maus- und Menschengenoms konnten aufgrund ihrer Funktion zwei Kandidatengene für die

ci2-Mutation entdeckt werden (siehe Kap. 2.3). Das Kcnj12 kodiert für einen einwärts

gerichteten Kaliumkanal, das Myo15 für ein Protein, dass der Familie der unkonventionellen

Myosine angehört. Entsprechend soll nachfolgend auf diese Gene bzw. Genfamilien

eingegangen werden.

2.4.1 Kaliumeinzelkanäle

Die Familie der zelleinwärts gerichteten Kaliumkanäle (IRK; Kir; "Inwardly rectifying K+

channel") setzt sich aus 7 Subfamilien zusammen. Die innerhalb des Körpers weit

verbreiteten Membranproteine sind an einer Reihe von Zellfunktionen beteiligt. Dazu gehören

die Generierung und Regulation von Membranpotentialen, die Regulation der Erregbarkeit

von Membranen sowie der Aktionspotentialdauer und die Sekretion/Absorption von K+-Ionen

(LAGRUTTA et al., 1996; ISOMOTO et al., 1997; REIMANN und ASHCROFT, 1999).

Die Kaliumkanäle werden durch intrazelluläre Moleküle wie ATP, PIP2

(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat), G-Proteine sowie Na+ reguliert und schleusen

Kaliumionen bevorzugt in die Zellen hinein.

Neben ihrer bedeutenden Funktion im Kaliumhaushalt von cerebralen Arterien und bei der

Entstehung des cardialen Aktionspotentials wird Proteinen dieser Familie eine Schlüsselrolle

beim Transport von Kaliumionen in der Cochlea und in der Netzhaut des Auges zugesagt

(ZARITSKY et al., 2000; WIBLE et al., 1995; MARCUS et al., 2002; YUAN et al., 2003).

Die spezielle Ionenzusammensetzung und das hohe Potential der Endolymphe im Innenohr

sind essentiell für die Hörfähigkeit. Sie werden mithilfe der K+-Zirkulation aus der

Perilymphe in die Endolymphe durch die laterale Cochleawand aufrechterhalten. Es konnte

gezeigt werden, dass eine Gruppe von Kaliumkanälen wie der Kir4.1, der Kir5.1 und der

Kcnq1/Kcne1 in Intermediärzellen der Stria vascularis exprimiert wird und dort eine


bedeutende Rolle bei der K+-Zirkulation spielt (ANDO und TAKEUCHI, 1999; HIBINO et

al., 2004). Die Stria vascularis ist ein stark vaskularisiertes, mehrschichtiges Epithel, das in

der Lateralwand der Cochlea dem Ligamentum spirale angelagert ist (JAHNKE, 1975). Das

endocochleäre Potential (EP), das in der Stria vascularis entsteht, sorgt in Verbindung mit der

hohen K+-Konzentration der Endolymphe für die sensorische Transduktion in den Haarzellen.

Es wird davon ausgegangen, dass Kaliumeinzelkanäle (Kir4.1), die für den Einstrom von

Kaliumionen in Intermediärzellen der Stria vascularis sorgen, für die Generierung des EPs

verantwortlich sind (MARCUS et al., 2002). Gestützt wird diese Hypothese durch die

Tatsache, dass das endocochleäre Potential durch Kaliumkanalblocker beeinflussbar ist

(HIBINO et al., 1997; TAKEUCHI et al., 2000) und in Mausmutanten, denen die

Intermediärzellen fehlen, nicht gemessen werden konnte (CARLISLE et al., 1990).

Neben ihrer Bedeutung bei der Entstehung des cochleären Potentials spielen Kaliumkanäle

eine Schlüsselrolle bei Transportvorgängen von Kaliumionen im subretinalen Raum (SRS).

Der SRS ist ein kleines, extrazelluläres Kompartiment, das die äußeren Segmente der

Photorezeptorzellen umgibt. Menge und Zusammensetzung des Extrazellularfluids des SRS

werden vom Retinalen Pigmentepithel kontrolliert (siehe Kap. 2.6.2 und 2.6.3).

Eine Lichteinwirkung auf die dunkeladaptierte Retina verursacht einen rapiden Abfall der K+-

Konzentration im SRS aufgrund einer Veränderung der Photorezeptorzellaktivität (OAKLEY

und GREEN, 1976; STEINBERG et al., 1980), wodurch ein Reflux von K+-Ionen aus dem

RPE ausgelöst wird (KAROWSKI et al., 1989). Es wird vermutet, dass Kaliumeinzelkanäle

(Kir7.1, Kir4.1, Kir6.2/SUR1) des Retinalen Pigmentepithels an der Regulation des

Kaliumhaushalts im SRS beteiligt sind (SHIMURA et al., 2001; KUSAKA et al., 1999;

ETTAICHE et al., 2001; KUSAKA et al., 2001).

Es wurden eine Reihe von Mausmutanten mit genetischen Veränderungen innerhalb von

Kaliumkanälen beschrieben. Innenohrdegeneration mit Hörverlust sind beispielsweise Folge

einer Mutation im Kir4.1 (Kcnj10, MMU1) Kaliumkanal (KOFUJI et al., 2000; MARCUS et

al., 2002; ROZENGURT et al., 2003). Bei der Kcnj12tm1Swz-Mausmutante hingegen wurde der

Kir2.2 Kaliumeinzelkanal (Kcnj12, MMU11) inaktiviert. Diese Mutante wurde gemeinsam

mit der Kcnj2tm1Swz-Maus (genetisch inaktivierter Kir2.1; Kcnj2; MMU11) für die Erforschung

von Kaliumionen-abhängigen Dilatationen bei cerebralen Arterien herangezogen

(ZARITSKY et al., 2000). Untersuchungen zur Expression und Funktion von Kcnj12 für das

Innenohr und die Netzhaut sind bis heute nicht beschrieben.


2.4.2 Unkonventionelle Myosine

Myosine bilden eine große Familie molekularer Motorproteine, die ATP

(Adenosintriphosphat) hydrolysieren, um Kraft und Bewegung zu erzeugen (MERMALL et

al., 1998).

Die Myosin-Superfamilie besteht aus einer ständig steigenden Anzahl (im Moment 18)

strukturell unterschiedlicher Klassen, die aufgrund phylogenetischer Analysen und aufgrund

von Sequenzunterschieden der konservierten Motordomänen eingeteilt werden (BERG et al.,

2001; Sellers, 1999; Sellers, 2000).

Alle Myosine zeigen einen ähnlichen Aufbau, bestehend aus einer Kopfregion, einer

Nackenregion mit Bindungsstellen für die leichten Ketten sowie der Schwanzregion, die sich

in Sequenz und Ausdehnung zwischen den einzelnen Myosinklassen stark unterscheidet.

Die N-terminale Motordomäne, die die ATP- und Aktin-Bindungsstellen trägt, generiert in

einem ATP-abhängigen Prozess Bewegung entlang von Aktinfilamenten und ist mit der

Schwanzregion über eine flexible Nackenregion verbunden. Diese interagiert mit den leichten

Ketten der Myosine und bindet Calmodulin (CaM; Kalzium-bindendes Protein). Die

Schwanzregion ist dagegen für Interaktionen mit verschiedenen Bindungspartnern ("Cargo")

verantwortlich und bestimmt daher die spezifische Funktion des Myosins (MOOSEKER et

al., 1995; COPE et al., 1996; MERMALL et al., 1998).

Abb. 2.1 Aufbau des Myosin XV. Dargestellt sind die unterschiedlichen Regionen des Proteins

sowie die verschiedenen Domänen des Myosin-Schwanzes.

Man unterscheidet zwischen konventionellen (Klasse 2) Myosinen, die an Kontraktions-

vorgängen in der Muskulatur und an Zellteilungsvorgängen beteiligt sind, und

unkonventionellen Myosinen.

Unkonventionelle Myosine sind weit verbreitet und in eine Reihe von Zellfunktionen

involviert. Als Bestandteil aktinreicher Strukturen spielen sie eine Rolle bei

Kopfregion Nacken Schwanzregion

Myosinkopf N C MyTH4 FERM FERMMyTH4 SH3 IQ IQ


zytoplasmatischen Transportvorgängen, bei der Bewegung von Organellen, Vesikeln und

Partikeln sowie bei der Organisation des Aktinzytoskeletts (BAKER und TITUS, 1998;

MERMALL et al., 1998). Außerdem sind sie an Phagozytosevorgängen, Spermatogenese,

Zellmotilität, Regulation von intrazellulären Transportvorgängen in Membranen und an

neurosensorischen Funktionen wie Hören und Sehen beteiligt (TUXWORTH und TITUS,

2000).

Im Bereich des Innenohrs wurden verschiedene unkonventionelle Myosine nachgewiesen. Sie

sind dort Bestandteil aktinreicher Strukturen der Stereozilien, die apikale Projektionen der

Haarzellen darstellen. Ihre Aufgabe ist die Erfassung von akustischen Signalen und von

Bewegungen im Raum und deren Umwandlung in elektrische Signale (HASSON et al., 1995;

FRIEDMAN et al., 1999; REDOWICZ, 1999). Daneben wurden unkonventionelle Myosine

auch in aktinreichen Strukturen in der Netzhaut des Auges nachgewiesen (HASSON et al.,

1995; LIU et al., 1997).

Mutationen in den Genen, die für die unkonventionellen Myosine VI, VIIA, IX und XV

kodieren, führen beim Menschen und bei der Maus zu Taubheit und vestibulären Defiziten.

Zusätzlich können Defekte im Myo7A beim Menschen eine progressiven Degeneration der

Netzhaut verursachen.

Das Myosin VI ist in der Kutikularplatte der Haarzellen lokalisiert und spielt dort eine Rolle

bei der Aufrechterhaltung der Spannung zwischen den Stereozilien und dem Aktinskelett der

Haarzellen (HASSON et al., 1997; CRAMER, 2000). Daneben ist das Protein in zelluläre

Transportvorgänge (MERMALL et al., 1994) und in rezeptorvermittelte Endozytose

involviert (BUSS et al., 2001). Mutationen im Myo6-Gen sind verantwortlich für die Snell´s

waltzer Mausmutante (siehe Kap. 2.2.3.1) und für eine nicht-syndromartige, dominant

vererbte Taubheitsform (DFNA22) beim Menschen (MELCHIONDA et al., 2001).

Eine ebenfalls nicht syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform beim Menschen

(DFNA17) ist das Ergebnis einer Mutation im MYH9-Gen, das für das Myosin IX kodiert. Die

Expression des homologen Gens (Myh9) wurde auch in der Cochlea der Ratte nachgewiesen

(LALWANI et al., 2000).

Mutationen innerhalb des Myosins VIIA sind beim Menschen assoziiert mit zwei Formen von

nicht-syndromaler Taubheit (DFNB2 und DFNA11) und dem Usher Syndrom Typ 1B

(FRIEDMAN et al., 1999; WEIL et al., 1995). Dieses autosomal rezessive Syndrom geht mit

einem profunden, neurosensorischen Hörverlust, Gleichgewichtsproblemen und progressiver

Retinopathia pigmentosa einher, die zu Blindheit führt (siehe Kap. 2.5). Als Tiermodell zur

Erforschung des humanen Usher Syndroms (USH) gelten die Mausmutante shaker 1 und die


Rattenmutante tornado (siehe Kap. 2.2.3.1/2). Diese Stämme weisen jedoch nicht die für das

USH1B charakteristische, retinale Degeneration auf (HASSON et al., 1997; LIU et al., 1998;

TITUS et al., 1999; SMITS et al., 2003). Tatsächlich wurde das Myosin VIIA durch

genetische Studien als essentiell für die Sehfähigkeit des Menschen eingestuft (HASSON und

MOOSEKER, 1997). Es wird vermutet, dass es an Transportprozessen im Bereich des

Pigmentepithels der Netzhaut (RPE) beteiligt ist (LIU et al., 1999; LIBBY und STEEL,

2001). Die Funktion des Myosins VIIA im auditiven System ist nicht sicher. Aufgrund der

Lokalisation des Proteins in der Umgebung der "cross links" der Stereozilien und der

Kutikularplatte von inneren Haarzellen der Cochlea wird vermutet, dass Myosin VIIA an der

Erhaltung der Stereozilienintegrität beteiligt ist (HASSON et al., 1997; SELF et al., 1998).

Das Myosin XV ist dem Myosin VIIA morphologisch sehr ähnlich, weshalb man ihnen eine

ähnliche Bedeutung zuschrieb. Tatsächlich konnten KAROLYI et al. (2003) zeigen, dass sich

das Myosin XV funktionell deutlich von den Myosinen VI und VII absetzt. Während Myosin

VI und VIIA für die Integrität der Stereocilien sowie für die Verbindung ihrer Strukturen

verantwortlich sind, wird dem Myosin XV eine essentielle Rolle bei der regulären

Längenausbildung der sich entwickelnden Stereozilien zugesagt. Eine weitere Funktion ist die

Erhaltung und Organisation des Aktinzytoskeletts der Stereozilien und der Kutikularplatte der

Haarzellen sowie die Bewegung und Ausschüttung von sekretorischer Granula (PROBST et

al., 1998; LLOYD et al., 2001).

Mutationen im Myosin XV verursachen beim Menschen eine autosomal rezessive, nicht-

syndromale Taubheit, DFNB3 (PROBST et al., 1998, WANG et al., 1998). In shaker 2

Mäusen (siehe Kap. 2.2.3.1), die als murines Homolog gelten (FRIEDMAN et al., 1995;

LIANG et al., 1998), wurde eine Punktmutation in der reaktiven Thiolregion der

Motordomäne sowie eine Deletion der C-terminalen FERM-Domäne nachgewiesen

(PROBST et al., 1998; ANDERSON et al., 2000). Ein Großteil der Mutationen im Myosin

XV des Menschen, die gewöhnlich zur Expression von funktionell beeinträchtigten Proteinen

führen, ist in der Schwanzregion lokalisiert (WANG et al., 1998; LIBURD et al., 2001). Diese

besitzt neben einer SH3-Domäne zwei MyTH4 (Myosin tail homoloyg-4)- und 2 FERM (Four

point one, Ezrin, Radixin, Moesin)-Domänen, die häufig betroffen sind. Da aber Mutationen

mit ähnlichen Auswirkungen auch innerhalb der Motordomäne zu finden sind (LIBURD et

al., 2001), ist davon auszugehen, dass sowohl Kopf- als auch Schwanzregion für die

Funktionsfähigkeit des Myosin XV essentiell sind.

Neuesten Forschungsergebnissen zufolge ist das Myosin XV das einzige bekannte

Motorprotein in Haarzellen, das selektiv Protein zur Stereozilienspitze transportiert


(BELYANTSEVA et al., 2005). Es konnte gezeigt werden, dass die programmierte

Stereozilienelongation nur stattfindet, wenn Myosin XV das PDZ-Protein Whirlin bindet und

zur Stereozilienspitze transportiert.

2.5 Usher Syndrom

2.5.1 Krankheitsbild

Es sind über 400 Syndrome beschrieben worden, die mit Taubheit einhergehen, und etwa 40

von ihnen schließen eine Beeinträchtigung des Visus ein (GORLIN et al., 1995). Zu diesen

Erkrankungen gehört das humane Usher Syndrom (USH), eine erblich bedingte Kombination

von langsam fortschreitender Netzhautdegeneration (Retinopathia pigmentosa) und bereits

früh einsetzender Innenohrschwerhörigkeit oder Gehörlosigkeit von Geburt an (Pro Retina

Deutschland e.V., www.pro-retina.de). Es wird bei mehr als 50% der Menschen, die

gleichzeitig taub und blind sind, diagnostiziert und stellt somit die häufigste Ursache für

Taubblindheit dar. Etwa 18% der Retinopathia pigmentosa-Fälle und 3-6 % der Taubheitsfälle

gehen auf dieses Syndrom zurück (BOUGHMAN et al., 1983). Weltweit gibt es circa 3,5-6,2

Betroffene auf 100.000 Einwohner, in Deutschland leben insgesamt 4000-5000 Betroffene;

jedoch ist unter 70 Menschen einer Träger eines Usher-Allels (SPANDAU und

ROHRSCHNEIDER, 2002).

Man unterscheidet drei verschiedene klinische Subtypen basierend auf der Schwere des

auditiven Funktionsverlustes, dem Auftreten vestibulärer Störungen und dem zeitlichen

Auftreten der Retinopathia pigmentosa (DAVENPORT und OMENN, 1977).

Die klinisch schwerwiegendste Form, USH1, ist charakterisiert durch hochgradige

Schwerhörigkeit oder Taubheit von Geburt an, starke Gleichgewichtsstörungen sowie eine

präpubertal einsetzende, progressive retinale Degeneration, die zu Blindheit führt.

Patienten, die vom USH Typ2 betroffen sind, leiden von Geburt an an einer frequenzabhängig

mittel- bis hochgradigen Innenohrschwerhörigkeit. Im Gegensatz zum USH1 sind die

vestibulären Funktionen jedoch nicht gestört und die retinale Degeneration beginnt erst im

frühen Erwachsenenalter.

Eine weltweit sehr seltene Form des Usher Syndroms ist USH3, welches jedoch in Finnland

die verbreitetste Form (40% der Fälle) der Erkrankung darstellt (PAKARINEN, 1995).


Patienten leiden neben visuellen Funktionsverlusten, die auf retinalen Degenerationen

basieren, unter einer progressiven Schwerhörigkeit.

Ebenso wie die klinische Ausprägung ist auch der genetische Ursprung des autosomal

rezessiv vererbten Usher Syndroms ausgeprägt heterogen. Mindestens zwölf Loci sollen an

der Entstehung der Erkrankung beteiligt sein, neun ursächliche Gene sind bereits entdeckt und

charakterisiert (siehe Tab. 2.1).

Tab. 2.1 Gruppierung des Usher Syndroms.

Form des

USH

Gen Protein Tiermodell zusätzlicher

Phänotyp

USH1B MYO7A Myosin VIIa shaker-1

tornado

DFNA11

DFNB2

USH1C USH1C Harmonin deaf circler DFNB18

USH1D CDH23 Cadherin23 waltzer DFNB12

USH1F PCDH15 Protocadherin15 Ames waltzer DFNB23

USH1G USH1G SANS Jackson shaker

USH2A USH2A USH2A

USH2C VLGR1 VLGR1

USH2D USH2D Whirlin whirler DFNB31

USH3A USH3A Clarin-1

Es ist bekannt, dass die für das Usher Syndrom verantwortlichen Proteine interagieren

(BOEDA et al., 2002; SIEMENS et al., 2002; REINERS et al., 2003; VAN WIJK et al.,

2006). Sie sind Teil eines dynamischen, makromolekularen Komplexes (Usher-Protein

Interaktom), der in neurosensorischen Zellen des Innenohrs und des Auges an ähnlichen

Vorgängen beteiligt ist (ADATO et al., 2005; REINERS et al., 2006; VAN WIJK et al., 2006;

KREMER et al., 2006).


2.5.2 Retinopathia pigmentosa

Die Retinopathia pigmentosa (RP) ist eine erblich bedingte, fortschreitende tapeto-retinale

Degeneration, die meist in Form einer Stäbchen-Zapfen-Dystrophie auftritt. Die RP ist in der

Regel nicht-syndromal, jedoch existieren auch syndromale Formen wie das Usher Syndrom

(siehe Kap. 2.5.1). Erste Symptome, wie Nachtblindheit und Gesichtsfeldeinschränkungen,

treten häufig bereits im Kindesalter auf. Die Erkrankung kann nach progressivem Verlauf

über lange Zeit zu absolutem Visusverlust führen (HAMEL, 2006). Charakteristisch für diese

Form der Retinopathie sind neben dem Verlust von Photorezeptorzellen Pigmentablagerungen

und Gefäßverengungen in der peripheren Retina. Die Degeneration verläuft zentripetal und

betrifft meist primär die Stäbchen-Zellen und erst sekundär die Zapfen. Obwohl es sich um

eine so genannte Stäbchen-Zapfen-Dystrophie handelt, sind Stäbchen immer stärker betroffen

(HAMEL, 2006).

Die therapeutischen Möglichkeiten sind bis heute dürftig. Vitamintherapie und Vermeidung

von Licht aufgrund der zunehmenden Photophobie der Patienten verlangsamen den

Degenerationsprozess wenig, beschränken aber Komplikationen wie Katarakt und

Makulaödem. Von großer Wichtigkeit ist dabei eine frühzeitige Diagnose, die aufgrund von

Potentialableitungen der Photorezeptorzellen (Stäbchen und Zapfen) mit Hilfe eines

Elektroretinogramms (ERG, siehe Kap. 2.6) gestellt wird. Das ERG ist eine sensitive

Methode, die bereits bei einer sehr milden Symptomatik, die von Patienten häufig unbeachtet

bleibt, einen Funktionsverlust sensorischer Strukturen (v.a. der Stäbchen) im Auge nachweist

(PETIT, 2001; HAMEL, 2006).


2.6 Elektroretinographie

2.6.1 Photorezeptorzellen der Retina

Aufgrund der inversen Struktur der Netzhaut muss einfallendes Licht sämtliche Schichten

durchdringen, bis es die Photorezeptoren erreicht. Die Photorezeptorzelle gilt deshalb als das

erste von drei nacheinander geschalteten Neuronen, welche die Sinnesinformation zum

Sehnerv weiterleiten.

Man unterscheidet zwei Arten von Photorezeptoren: die für das Sehen im Dämmerlicht

verantwortlichen, schlanken Stäbchen (skotopisches Sehen) und die weniger

lichtempfindlichen, plumpen Zapfen, die für das Scharf- und Farbensehen zuständig sind

(photopisches Sehen). Stäbchen und Zapfen bestehen aus Außen- und Innensegmenten,

Zellkern und Endstücken. Die Außensegmente sind scheibenförmig gestapelte

Membranausstülpungen, Disci, die den Sehfarbstoff enthalten. Diese werden stetig in den

Innensegmenten gebildet, apikal vorgeschoben und nach ihrer Abstoßung vom Retinalen

Pigmentepithel (RPE) phagozytiert. Neben der Entsorgung des Zellschrotts ist das RPE für

die Versorgung der Außensegmente zuständig.

Die äußere Körnerschicht der Retina

wird von den Zellkernen der Photo-

rezeptoren gebildet, deren Ausläufer in

der äußeren plexiformen Schicht mit

den Fortsätzen der Bipolarzellen inter-

agieren. Neben diesen Ganglienzellen (2.

Neuron) findet man in der inneren Kör-

nerschicht auch Amakrinzellen und

Horizontalzellen, die Querverbindungen

herstellen, sowie gliales Stützgewebe,

die Müller-Zellen. Bipolarzellen leiten

die Sinnesinformation an die Ganglien-

zellen (3. Neuron) weiter, deren Axone zum Nervus opticus ziehen. Bei Stimulation der

Retina durch Licht kommt es zu einer Reihe photochemischer Reaktionen, welche zu

Potentialveränderungen führen. Diese können mithilfe der Elektroretinographie

aufgezeichnet werden (Stades, 2006).

Pigmentepithel

Zapfen

Stäbchen

Bipolare Zellen

Ganglienzellen

Axone der Ganglienzellen

Amakrine Zellen

Horizontalzellen

Abb. 2.2 Aufbau der Netzhaut.


2.6.2 Elektroretinographie

Die Elektroretinographie (ERG) ist eine Untersuchungsmethode zur Aufzeichnung von

schnellen elektrischen Spannungsschwankungen am Auge, die bei plötzlichen Änderungen

der Belichtungsverhältnisse der Netzhaut auftreten. Sie gibt Auskunft über den funktionellen

Zustand der Retina und wird deshalb für die Diagnosestellung unterschiedlicher angeborener

und erworbener Erkrankungen eingesetzt.

In der Ganzfeld- oder Blitzelektroretinographie wird die

Summenantwort der gesamten Netzhaut abgeleitet. Nach

Weitstellung der Pupillen werden über eine weiße Kugel

(Ganzfeld) Lichtblitze steigender Lichtintensität angeboten.

Die dabei entstehenden Spannungsänderungen können mithilfe

empfindlicher Elektroden an der Augenoberfläche abgeleitet

werden. Durch die Verwendung unterschiedlicher Lichtstärken

und -frequenzen ist es möglich, Aussagen über die

verschiedenen Zellgruppen der Retina zu treffen. Eine isolierte

Antwort der Stäbchen und ihrer nachgeschalteten Bipolarzellen

erreicht man durch eine mindestens 30 minütige Dunkeladap-

tation und den Einsatz von niedrigfrequentem Licht geringer Intensität. Durch eine

schrittweise Erhöhung der Leuchtdichte erhält man eine gemischte Antwort von Stäbchen

und Zapfen. Das dunkeladaptierte ERG ist zur Abschätzung und Lokalisation generalisierter

Netzhautfunktionsstörungen unterschiedlicher Ursache von Bedeutung. Bei einer Schädigung

der Stäbchen, wie sie z.B. bei der Retinopathia pigmentosa auftritt, kommt es noch vor dem

Sichtbarwerden krankhafter Veränderungen am Augenhintergrund zu einer Reduktion der

Potentiale.

Das so genannte photopische (Hell-) ERG wird nach zehnminütiger Helladaptation abgeleitet.

Eine stetige Hintergrundbeleuchtung sorgt für die Absättigung der Stäbchenzellen, so dass

eine Messung des Zapfenpotentials möglich ist. Die zusätzliche Reizung mit rasch

flimmerndem Licht ermöglicht die Ableitung einer rein zapfenvermittelten Antwort.

Als Ergebnis der Ableitungen erhält man die von einer PC-Einheit ermittelten ERG-

Messkurven, die Elektroretinogramme. Die Kurven lassen sich in mehrere Abschnitte

unterteilen, die eine Aussage über die Funktionsfähigkeit verschiedener Zellen der Retina

ermöglichen. Bei niedrigen Blitzintensitäten ist nur die so genannte b-Welle erkennbar, die

die die Aktivität der Bipolarzellen widerspiegelt (SHIELLS und FALK, 1999; TIAN und

Abb. 2.3 Ganzfeldkugel


SLAUGHTER, 1995). Eine normale b-Welle bei niedriger Blitzintensität erlaubt den

Rückschluss auf eine regelrechte Funktion der Rezeptorzellen, die im Falle eines

Funktionsverlustes die Bipolarzellen gar nicht anregen könnten. Bei hohen Blitzintensitäten

erscheint vor der positiven b-Welle die negative a-Welle, die in den Außensegmenten der

Photorezeptorzellen entsteht. Die a-Welle ist ein lang andauerndes, negatives Signal, das bei

schwachen Blitzen durch die größere, positive b-Welle überdeckt wird. Bei höheren

Blitzintensitäten tritt sie zunehmend früher auf und wird deshalb vor der b-Welle sichtbar.

Zusätzlich werden nun auch kleine, schnelle Auslenkungen in der aufsteigenden Flanke der b-

Welle erkennbar, welche vermutlich auf die Aktivität von Amakrin- und Horizontalzellen

zurückgehen.

Die Ausmessung der ERG-Ableitung erfolgt folgendermaßen: Die Amplitude der negativen

a-Welle wird von der dem Blitz vorausgehenden Nulllinie (N) zum negativen Tal gemessen.

Die Amplitude der b-Welle reicht vom Tal der a-Welle bis zum darauf folgenden positiven

Gipfel. Die Latenzzeit beschreibt die Dauer von der Auslösung des Lichtstimulus bis zum

Gipfel bzw. Tal der jeweiligen Welle (BACH und KELLNER, 2000).

Abb. 2.4 Skotopisches ERG mitgeringer Lichtintensität. Angegeben sindNullpunkt (Pfeil, Lichtstimulus) undLatenzzeit (Zeit vom Lichtimpuls biszum Gipfel der Amplitude) der b-Welle.

Abb. 2.5 Skotopisches ERG mit hoher Lichtintensität. Angegeben sind Ausmaß der a- und der b-Welle sowie Nullpunkt (Pfeil, Lichtstimulus). Auslenkungen der b-Welle im aufsteigenden Teil.

modif. nach MARMOR et al., 1999 (ISCEV) modif. nach MARMOR et al., 1999 (ISCEV)

Latenzzeit

a

b

3. Methoden 38

3 Methoden

3.1 Versuchstiere

Die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen an Ratten wurden durch die

Bezirksregierung Hannover/Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen Tierversuchsantrag: 509c-

42502-03/651).

Die Zucht von Tieren der Stämme LEW/Ztm und LEW/Ztm-ci2 erfolgte ausschließlich am

Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover (Haltersymbol: Ztm).

3.1.1 Rattenstämme

Der Hintergrundstamm: LEW/Ztm

Der Inzuchtstamm LEW/Ztm wurde zum Zeitpunkt der Untersuchungen in der 121. bis 126.

Inzuchtgeneration am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover

gezüchtet.

Die drehende Rattenmutante: LEW/Ztm-ci2

Der Stamm LEW/Ztm-ci2 wurde nach einer Spontanmutation, die 1991 in der 96.

Filialgeneration des Inzuchtstamms LEW/Ztm auftrat, isoliert. Der coisogene Inzuchtstamm

wurde etabliert und seit 1993 durch Verpaarung homozygoter Merkmalsträger mit

heterozygoten Tieren (segregierende Inzucht) im modifizierten Parallelliniensystem am

Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet. Die

untersuchten Tiere entstammten der Folgegenerationen 25 bis 28.

3. Methoden 39

Das Rattenmodell für das Usher Syndrom: HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd

Bei diesem Stamm handelt es sich um einen Auszuchtstamm. Als Kontrollen dienten Tiere,

die homozygot wildtyp waren. Die WIST-Myo7Atnd Ratten wurden vom Hubrecht

Laboratorium in Utrecht zur Verfügung gestellt.

3.1.2 Genotypisierung

Genotypisierung der LEW/Ztm-ci2 Ratten

Das circling-Verhalten der LEW/Ztm-ci2 Ratte folgt einem autosomal rezessiven Erbgang.

Da deshalb ausschließlich homozygote Tiere ein Rotationsverhalten zeigen, konnte der

Genotyp der Ratte mittels Phänotypisierung festgestellt werden.

Zur Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften wurde das entsprechende Tier einzeln in

einen Käfig gesetzt, in dem sich frische Einstreu befand (Umsetzen). Während der ersten drei

bis vier Minuten wurde das Verhalten der Tiere beobachtet und dokumentiert. Bei den

Beobachtungen standen folgende Parameter im Vordergrund:

! Aufmerksamkeit/Auskundschaften der neuen Umgebung

! Neugier/Angst

! lateralisierte, kreisförmige Drehbewegungen

! Bewegungsstörungen/unsicherer Gang (Ataxien)

! Opisthotonus (stargazing)

! motorische Hyperaktivität

Um das Hörvermögen zu testen, wurde das Tier mit einem definierten akustischen Stimulus

(Blechfeder mit Resonanzkörper: `Knackfrosch´, VON HÖRSTEN et al.; 1993) konfrontiert

und mögliche Schreckreaktionen, wie das Zusammenzucken des Flankenbereiches oder ein

deutliches Zucken der Kopfreaktion, erfaßt (`Klick Test´). Es folgten einfache Maßnahmen

zur Ermittlung der Sehfähigkeit. Dazu wurde ein Gegenstand in den Käfig verbracht, der dem

Tier unbekannt war (`Unknown Object´). Anschließend wurde etwa 1,5 Minuten lang

beobachtet, ob die Ratte zufällig oder bewußt auf das Objekt reagierte. Weiterhin wurde,

unter Verhinderung von Luftbewegungen, ein Gegenstand von oben vorsichtig auf das Tier

3. Methoden 40

zubewegt, um einer Berührung der Tasthaare zu entgehen. Zusätzlich wurde darauf geachtet,

ob das Tier die Begrenzung des unbekannten Käfigs bewußt wahrnahm.

Genotypisierung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratten

Die phänotypischen Merkmale eines Tieres wurden durch Beobachtung der Ratte im

Heimatkäfig bzw. beim Umsetzen (relative Stresssituation) aufgenommen. Dabei wurde

insbesondere auf Hyperaktivität, Drehbewegungen, Opisthotonus und fehlende

Geräuschempfindlichkeit geachtet. Diese Merkmale waren weniger deutlich ausgeprägt als

bei den symptomatisch ähnlichen LEW/Ztm-ci2 Tieren. Da aber die Mutation bekannt war

und ein Marker existierte, wurde eine Genotypisierung der Tiere über die Sequenzierung des

mutationstragenden Gens (Myo7A) erreicht. Die dafür verwendeten Primer sind dem Anhang

I, Kap. 9.3.4 zu entnehmen. Die Sequenzierung wurde im Hubrecht Laboratorium in Utrecht,

Holland vorgenommen.

3.1.3 Tierhaltung

Tierhaltung an der Medizinische Hochschule Hannover (MHH)

LEW/Ztm-ci2 Ratten und LEW/Ztm Tiere für die Kernzucht wurden unter spezifiziert

pathogen-freien Bedingungen (SPF-Haltung) mit Nassbarriere gehalten. Für den Versuch

ausgewählte Tiere wurden bis zur Untersuchung in Typ III Makrolon® -Käfigen in einem

barrieregeschützten Raum (Trockenbarriere) untergebracht.

Die Haltung der HsdRccHan:WIST-Myo7ATnd Ratten erfolgte in individuell ventilierten

Käfigen (individually ventilated cages, IVC) des Typs III (Material Lexan®) in einem

barrieregeschützten Raum (Trockenbarriere).

Die Gruppengröße der auf Weichholzgranulat gehaltenen Ratten betrug je nach Gewicht 1-3

Tiere pro Käfig. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Handelsübliches

Haltungs- (Altromin 1324) bzw. Zuchtfutter (Altromin 1310) sowie Wasser wurden den

Tieren ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Raumtemperatur betrug 20°C ± 2°C, die

Luftfeuchtigkeit 55% ± 5%. Die Beleuchtung erfolgte über Kunstlicht in der Zeit von 6:00

Uhr bis 18:00 Uhr MEZ.

3. Methoden 41

Die genetische Überwachung der im Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen

Hochschule Hannover gezüchteten Stämme erfolgte durch Überprüfung des Genoms mittels

Schwanzhauttransplantation, immunologischer Marker (RT1, RT2, RT3, RT6) und

molekulargenetischer Marker wie Mikrosatellitenmarker (Hedrich, 1990; Ausschuss für

Genetik und Labortierzucht, GV-SOLAS, 2006).

Die Gesundheitsüberwachung der im Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen

Hochschule Hannover gehaltenen Tiere wurde gemäß den FELASA-Empfehlungen

(NICKLAS et al., 2002) im Rahmen von vierteljährlichen Routineuntersuchungen

durchgeführt.

Tierhaltung an der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo)

Die Haltung der in den beschriebenen Versuchen eingesetzten Tiere erfolgte am Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie. Die Ratten wurden einzeln und nach Geschlecht

räumlich getrennt (verschiedene Ständer) auf Weichholzgranulat in Makrolon®-Käfigen des

Typs III gehalten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Handelsübliches

Haltungsfutter (Altromin 1324) sowie Wasser wurde den Tieren ad libitum zur Verfügung

gestellt. Die Raumtemperatur betrug etwa 20°C, die Luftfeuchtigkeit circa 55%. Die

Beleuchtung erfolgte über Kunstlicht in der Zeit von 6:00 Uhr bis 18:00 Uhr MEZ.

3.2 Kandidatengenanalyse - Sequenzierung

Die in Vorarbeiten ermittelten Kandidatengene wurden auf Unterschiede innerhalb ihrer

Basensequenz bei dem mutationstragenden Stamm LEW-ci2 im Vergleich zum

Hintergrundstamm LEW/Ztm untersucht. Dazu wurde DNA beider Stämme aus Ohr- bzw.

Schwanzgewebe isoliert und zur Amplifikation von Genfragmenten eingesetzt. Die dabei

verwendeten Primer schlossen je nach Größe der kodierenden Bereiche einen Teil eines

Exons, ein Exon oder mehrere Exons ein. Die Entwicklung der Primer sowie die

Sequenzierungen wurden im Hubrecht Laboratorium in Utrecht, Holland vorgenommen.

3. Methoden 42

3.2.1 Probenentnahme

Zur Gewinnung von genomischer DNA wurden Milz, Ohren und Schwanzspitze unter

aseptischen Bedingungen nach Tötung des Tieres entnommen, in ein steriles Reaktionsgefäß

verbracht und sofort in flüssigen Stickstoff überführt.

Zur Gewinnung von mRNA wurden Milz, Leber, Gehirn und Hypophyse entnommen. Um

eine Kontamination zu verhindern, erfolgte die Probenentnahme unter Verwendung eines

sterilen Besteckes, welches im Vorfeld mit einer RNase destruierenden Substanz (RNAse

Away) behandelt wurde. Zwischen zwei Sektionen erfolgte eine Reinigung bzw. ein

Austausch des Instrumentariums.

Die Lagerung der Organe erfolgte bei -80°C.

3.2.2 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion

Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)

Zur Isolierung von DNA aus Ohrmuschel und Schwanzspitze wurde das NucleoSpin® Tissue

Kit verwendet. Die Durchführung ist in Anhang I, Kap. 9.2.1 beschrieben.

Die Reinheit der aufgearbeiteten DNA wurde mithilfe eines Kontrollgels überprüft. Es folgte

eine photometrische Konzentrationsbestimmung bei 260 nm und die Einstellung der DNA mit

sterilem Aqua dest. auf 50 ng/µl.

Kontrolle der DNA-Extraktion

Zur Überprüfung von Konzentration und Reinheit der aufgearbeiteten DNA wurde ein

0,8%iges Agarosegel angefertigt. Es wurde ein Gemisch aus je 4 µl Ladepuffer, 8 µl dH2O

und 2 µl der auf 50 ng/µl eingestellten DNA-Probe aufgetragen. Anschließend erfolgte eine

elektrophoretische Auftrennung der Probe. Eine klare, deutlich sichtbare und gut abgegrenzte

Bande war der Beweis für eine gute Qualität der aufgearbeiteten DNA. Die Konzentration der

DNA konnte mit Hilfe des ebenfalls aufgetragenen DNA-Längenstandards abgeschätzt

werden. Die Anfertigung von Gelen und die Durchführung der Gelelektrophorese sind im

Anhang I, Kap. 9.5.3 beschrieben.

3. Methoden 43

3.2.3 Amplifikation der Kandidatengene

Die Primer zur Sequenzierung der Kandidatengene (51 Primerpaare für Myo15 und 3

Primerpaare für Kcnj12), die im Anhang I, Kap. 9.3.4. aufgelistet sind, wurden mithilfe der

Ensembl Genom-Datenbank (http://www.ensembl.org) und des Programms LIMSTILL

(http://limstill.niob.knaw.nl) konstruiert. Die optimale Schmelztemperatur wurde mit 58°C

angegeben. Temperaturprofil und PCR-Konditionen für die sogenannte touchdown PCR

finden sich im Anhang I, Kap. 9.4.2.

3.2.4 Sequenzierung

Die PCR-Produkte aus der Amplifikationsreaktion (Kap. 3.2.3) wurden mit 20 µl dH2O

versetzt und in dieser Verdünnung als Template für die Sequenzierungsreaktion (Anhang I,

Kap. 9.4.2) eingesetzt. Die Sequenzierungsreaktion wurde den Herstellerangaben (Applied

Biosystems) entsprechend durchgeführt.

5 µl des Sequenzierungsproduktes wurden mittels Ethanolfällung in Anwesenheit von 40 mM

Sodiumazetat gereinigt und in einem 96-Kapillar-3730XL DNA Sequenziergerät (Applied

Biosystems) unter Verwendung des Standard Protokolls (RapidSeq, Anhang I, Kap. 9.4.1)

analysiert.

3.2.5 Mutationsanalyse

Die Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mit dem Programm Polyphred

(NICKERSON et al, 1997), wobei polymorphe Positionen manuell herausgesucht und

ausgewertet wurden. Mögliche Auswirkungen auf die Struktur des Proteins wurden anhand

der Programme SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) und PolyPhen analysiert (NG und

HENIKOFF, 2003).

3. Methoden 44

3.3 Kandidatengenanalyse - Real Time (Echtzeit) PCR

Die Echtzeit (Real Time) PCR beruht auf dem Prinzip einer herkömmlichen Polymerase-

Kettenreaktion, jedoch werden Amplifikation und Nachweis des Reaktionsproduktes in ein

und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt. Die Methode bietet also die Möglichkeit der

Quantifizierung der in einer Probe vorhandenen cDNA und lässt Rückschlüsse auf die

eingesetzte Menge an RNA zu. Die Detektion erfolgt mithilfe fluoreszierender Marker nach

jedem PCR-Zyklus.

Es wurde eine sogenannte `Relative Quantifizierung´ durchgeführt, bei der die Expression des

Kandidatengens Myo15 sowohl von LEW-ci2 Ratten als auch von Tieren des

Hintergrundstamms LEW gegen eine interne Kontrolle, das Referenzgen, und gegeneinander

verglichen wurde.

3.3.1 Probenentnahme

12 Wochen alte Tiere der Stämme LEW-ci2 und LEW wurden nach CO2-Inhalation getötet

und das Abdomen median eröffnet. Ein Teil der Leber sowie die Milz wurden steril

entnommen. Nach Absetzen des Kopfes wurde das Schädeldach eröffnet und das Gehirn unter

Schonung des Gewebes gewonnen. Anschließend wurde die Hypophyse vorsichtig

freipräpariert. Alle Organe wurden nach der Entnahme in ein beschriftetes Reaktionsgefäß

überführt und unverzüglich in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Gewebe

erfolgte bei -80°.

3.3.2 Isolierung von Ribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion

Um die Expression von Myo15 in verschiedenen Organen vergleichen zu können, wurde RNA

aus Leber-, Milz-, Gehirn- und Hypophysengewebe extrahiert.

Die Gewinnung von RNA aus Leber und Milz erfolgte wie in Anhang I, Kap. 9.2.2

beschrieben mithilfe des NucleoSpin® RNAII Kits. Aufgrund des hohen Fettanteils in Gehirn

und Hypophyse wurde bei diesen Geweben für die Extraktion von RNA ein spezielles Kit

verwendet, das RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (siehe Anhang I, Kap. 9.2.3).

3. Methoden 45

Die Reinheit der aufgearbeiteten RNA wurde mithilfe eines denaturierenden Kontrollgels

(Anhang I, Kap. 9.5.4) überprüft, auf dem die 18s und 28s Banden der mRNA unter UV-

Illumination bei 260 nm sichtbar gemacht wurden.

Der RNA-Gehalt der Probe wurde photometrisch bestimmt. Die Endkonzentration von 150-

200 ng RNA/µl wurde durch Verdünnung mit RNase freiem Wasser eingestellt.

Die Lagerung der isolierten RNA erfolgte bei -80°C.

3.3.3 Reverse Transkription

Für das Umschreiben der gewonnenen RNA in cDNA mit dem Omniskript RT Kit (siehe

Anhang I, Kap. 9.4.3) wurden Oligo-dT Primer verwendet. Die cDNA diente der

Durchführung der Real Time PCR.

Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.

3.3.4 Durchführung der Real Time PCR

Die Real Time PCR wurde mit den in Anhang I, Kap. 9.3.5 aufgeführten, genspezifischen

Primerpaaren in einem Opticon Real Time Cycler amplifiziert. Bei der Erstellung der

Primersequenzen wurde darauf geachtet, daß die Annealingtemperaturen der Primer nicht

mehr als 1°C differierten, kein Self-Annealing zu beobachten war und das

Amplifikationsprodukt eine Länge von etwa 120 bp besaß. Die Primer wurden so konstruiert,

dass das eingegrenzte Fragment zwei Exons überspannte, so dass eine ungewollte

Amplifikation genomischer DNA zu einem überlangen Fragment geführt hätte.

Die Amplifikation der in Dreifachansätzen und in 4 Verdünnungsstufen (10-1, 10-2, 10-3, 10-4)

eingesetzten Proben wurde in Low-Profile 96-well Mikrotiterplatten durchgeführt. Als

Referenzgen wurde das β-Aktin und als Fluoreszenzfarbstoff das SYBR Green I verwendet,

das sich ausschließlich an Doppelstrang DNA anlagert und durch eine Anregung bei 450 nm

bis 495 nm eine Detektion bei 515 nm bis 545 nm erlaubt. Die optimale SYBR Green I -

Konzentration im PCR-Reaktionsansatz wurde durch Konzentrationsreihen in Vorversuchen

bestimmt, da eine zu geringe SYBR Green I Konzentration ein zu schwaches

Fluoreszenzsignal ergibt. Eine zu hohe Konzentration inhibiert dagegen die PCR-Reaktion.

3. Methoden 46

Reaktionsansatz und Temperaturprofil sind im Anhang I, Kap. 9.4.4 aufgeführt. PCR-

Konditionen und Annealingtemperatur wurden in Vorversuchen optimiert.

Um die Spezifität der Real Time-Amplifikation sicherzustellen, wurde im Anschluß an die

Reaktion eine Schmelzpunktanalyse sowie der Nachweis der amplifizierten Produkte in einem

3%igen Agarose-Gel (analog zu Anhang I, Kap. 9.5.3) durchgeführt.

Bei einer Schmelzkurve wird die Temperatur alle 10 sek um 1°C gesenkt, beginnend bei

96°C. Parallel wird die Intensität der SYBR Green Fluoreszenz gemessen. Bei hohen

Temperaturen sind alle PCR-Produkte denaturiert. Je nach den spezifischen Schmelzpunkten

der PCR-Produkte liegen diese bei abnehmenden Temperaturen in doppelsträngiger Form vor,

wodurch die Fluoreszenz schlagartig ansteigt. Von dieser Schmelzkurve wird mathematisch

die erste Ableitung erstellt, so dass jede schlagartige Intensitätsänderung als Peak dargestellt

wird. Peaks bzw. Plateaus, die nicht an dem Schmelzpunkt des erwarteten PCR-Produktes

liegen, deuten auf unspezifische PCR-Produkte hin.

3.3.5 Auswertung der Daten

Die Analyse der Genexpression erfolgte durch das auf dem Exel -basierenden Programm

Qgene (Müller et al., 2002), wobei unter Berücksichtigung der Amplifikationseffizienz der

untersuchten Gene eine Expressionsratio zu dem β-Aktin Housekeeping-Gen gebildet wurde.

3.4 Analyse der Proteinstruktur - Klonierung

Für eine kristallographische Analyse der Proteinstruktur sind große Mengen an reinem Protein

notwendig. Um dies zu gewährleisten wurde das mutationstragende Element mittels

spezifischer Primer amplifiziert und zur Gewinnung großer Mengen dieses Amplifikates in

Eschericha coli kloniert. Zur Produktion des gewünschten Proteins wurde aus E. coli

isoliertes Insert in ein Derivat des extrachromosomalen D. discoideum-Vektors pDXA

kloniert und in D. discoideum -Wildtyp-Zellen transfiziert.

3.4.1 Klonierung der mutationstragenden MyTH4-Domäne

Unter Klonierung (Cloning) versteht man das Einfügen eines DNA-Fragmentes in einen

Vektor, der die massenhafte Vermehrung dieser DNA ermöglicht.

3. Methoden 47

Herstellung des zu klonierenden Fragmentes

Reaktionsansatz und Temperaturprofil für die PCR zur Amplifikation der mutationstragenden

Domäne sind im Anhang I, Kap. 9.4.5 aufgeführt. Die eingesetzte (ausschließlich aus

Hypophysengewebe isolierte) cDNA wurde dem für die Real Time PCR angefertigten

Probenpool (Kap. 3.3.2) entnommen. Die Konstruktion der für die Amplifikation benötigten,

spezifischen Primer (Anhang I, Kap. 9.3.6) erfolgte mithilfe des Oligo 6.0 Programmes.

Es wurden zwei Reaktionen parallel angesetzt:

Reaktion

Ausgangsmaterial

Stamm

1 cDNAHypophyse LEW-ci2 (Mutante)

2 cDNAHypophyse LEW (Hintergrund)

Zur Amplifikation der MyTH4-Domäne wurde eine proof-reading Polymerase (Phusion High

Fidelity Polymerase, Finnzymes) verwendet. Da proof-reading Polymerasen aufgrund ihrer

3´→ 5´ Exonuklease-Aktivität sogenannte blunt ends produzieren, musste im Anschluß ein

für die TA-Klonierung (TA-Cloning) notwendiger A-Überhang erzeugt werden (A-tailing).

Dies wurde über eine zusätzliche PCR unter Verwendung einer Taq-Polymerase und dATPs

erreicht. Der Reaktionsansatz, der im Anhang I, Kap. 9.7.1 beschrieben ist, wurde für 15 bis

30 min bei 70°C in einem Thermocycler inkubiert.

Das Produkt wurde auf ein Agarose-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt (siehe

Anhang I, Kap. 9.5.3). Die spezifische Bande, die die zu klonierende Sequenz enthielt, wurde

aus dem Gel ausgeschnitten und wie in Anhang I, Kap. 9.6.2 beschrieben mithilfe des

NucleoSpin® Extract Kits aufgereinigt.

Ligation

Das extrahierte Fragment wurde unter Verwendung des pGEM®-T Easy Vector System I-Kits

in einen pGEM®-T Easy Vektor kloniert. Die Arbeitsschritte sind dem Anhang I, Kap. 9.7.2

zu entnehmen.

3. Methoden 48

3.4.2. Transformation in E. coli

Unter Transformation versteht man die Aufnahme von freier DNA in eine Bakterienzelle. Sie

erfolgte nach der Hitzeschockmethode unter Verwendung chemisch kompetenter E. coli-

Bakterien:

6 µl des Ligationsproduktes wurden auf 100 µl unaufgetaute Bakteriensuspension (Lagerung

bei -80°C) gegeben. Während einer Inkubationszeit von 20 min auf Eis wurde die Suspension

mehrfach vorsichtig vermischt. Es folgte eine einminütige Inkubation bei 42°C. Anschließend

wurde die Suspension für 2 bis 4 min auf Eis gestellt.

Nach der Zugabe von 500 µl LB-Medium und anschließender Inkubation von 20 bis 45 min

bei 37°C folgte das Abzentrifugieren der Zellen bei 3000 rpm für 5 min. Der Überstand wurde

entfernt und die Zellen auf einer Ampicillin-haltigen Agarplatte ausplattiert und über Nacht

bei 37°C inkubiert.

Da das transformierte Plasmid (pGEM®-T Easy) ein Resistenzgen für das Antibiotikum

Ampicillin trägt, wurde somit sichergestellt, dass nur erfolgreich transformierte Bakterien

überleben.

3.4.3 Selektion

Blue-White-Screening

Neben dem Resistenzgen für Ampicillin findet sich auf dem Plasmid das lacZ-Gen, welches

für das Enzym β-Galaktosidase kodiert. Innerhalb der Sequenz des Gens liegt der Polylinker

(multiple cloning site) des Plasmids, der weder den Leserahmen zerstört noch die

enzymatische Aktivität des Enzyms beeinflusst. Bei der Spaltung von X-gal (5-Brom-4-

chloro-3-indolyl-β-D-Galaktopyranosid), das beim Blue-White Screen anstelle von Galaktose

als Substrat zugeführt wird, entsteht ein blauer Farbstoff. Um die Expression des Gens zu

induzieren bzw. zu steigern, wird anstelle von Laktose IPTG (Isopropyl-β-D-

thiogalaktopyranosid) zugefügt. Wird die cDNA erfolgreich in den Vektor ligiert, inseriert sie

in den Polylinker und unterbricht die Sequenz, so dass kein funktionsfähiges Enzym gebildet

wird und die Kolonien weiß erscheinen. Im Gegensatz dazu haben solche Kolonien, bei denen

die Bakterien aufgrund fehlgeschlagener Ligation eine Galaktosidaseaktivität aufweisen, eine

blaue Farbe.

3. Methoden 49

Für das Screening wurden dem bei der Ligation gewonnenen Zellpellet 40µl Xgal (20 µg/ml)

sowie 100 µl IPTG (100 mM) hinzugefügt und die Suspension ausplattiert.

Selektion

Pro Transformationsansatz wurden etwa 6 bis 12 weiße Kolonien mithilfe eines

handelsüblichen Zahnstochers entnommen und in 3 ml LBAmp-Medium überführt. Es folgte

eine Inkubation über Nacht bei 37°C und 200 rpm im Thermoschüttler.

3.4.4 Kontrolle des Ligationsergebnisses

Um zu kontrollieren, ob die isolierten Kolonien (Klone) Vektoren mit regelrecht ligiertem

Insert aufwiesen, wurde die Plasmid-DNA aus den Zellen isoliert und das Insert mithilfe von

Restriktionsenzymen ausgeschnitten. Bei der Restriktionsspaltungen werden DNA-Fragmente

aus Vektoren herausgeschnitten bzw. Vektoren geöffnet (linearisiert). Die

Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme befinden sich innerhalb des Polylinkers

(multiple cloning site) in unmittelbarer Nachbarschaft zur Ligationsstelle. Das

ausgeschnittene Fragment besitzt deshalb etwa die Länge des Inserts. Dies wurde mittels

Agarose-Gelelektrophorese überprüft.

Isolation der Plasmid-DNA (DNA-Minipräparation)

Die Arbeitsschritte zur Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit sind

in Anhang I, Kap. 9.7.3 beschrieben.

Restriktionsverdau

Zum Screenen der bei der Mini-Präparation gewonnenen Plasmid-DNA auf regelrecht

ligiertes Insert wurde das Restriktionsenzym EcoRI (Erkennungssequenz: 5´... CTT AA/G

...3´) verwendet. Der Reaktionsansatz für den Verdau mit EcoRI, der im Anhang I, Kap. 9.7.4

aufgeführt ist, wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.

Zur Kontrolle der im EcoRI-Verdau positiven Proben wurden die Restriktionsenzyme XhoI

(5´... C/TC GAG ...3´) und NheI (5´... G/CT AGC ... 3´) verwendet, deren

3. Methoden 50

Erkennungssequenzen sich im Gegensatz zu denen des EcoRI-Enzyms direkt im Insert

befinden. Um die größtmögliche Effizienz der Enzyme auszunutzen, wurden zwei

aufeinanderfolgende Reaktionen durchgeführt. Im ersten Verdau mit dem Enzym NheI,

dessen Reaktionsansatz analog zum Verdau mit dem Enzym EcoRI war, wurde als Puffer

1xTango eingesetzt. Um die Reaktion abzuschließen, wurde das Enzym anschließend durch

eine Inkubation des Ansatzes für 10 min bei 65°C inaktiviert. Das Protokoll für den

nachfolgenden einstündigen Verdau mit XhoI bei 37°C ist dem Anhang I, Kap. 9.7.5 zu

entnehmen.

Im Anschluß an den Verdau wurden die Proben auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch

(Anhang I, Kap. 9.5.3) aufgetrennt und auf Banden entsprechend der Länge der klonierten

Sequenz untersucht.

Sequenzierung zur Kontrolle des Ligationsergebnisses

Die positiven Proben wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) sequenziert. Für

die Sequenzierung wurde die bei der Mini-Präparation gewonnene Plasmid-DNA sowie der

Standardprimer M13 benutzt.

Die Plasmide wurden mit Hilfe des CEQ-Systems (vollautomatische 8-Kapillar-Sequenzierer

und entsprechende Reagenzien) nach dem Prinzip der Didesoxymethode nach Sanger

sequenziert. Dabei wurde jedes Plasmid mindestens dreimal (drei unabhängige Versuche)

sowohl mit dem zugehörigen forward- als auch mit dem reverse- Primer sequenziert.

3.4.5 Klonierung in den pM765-tev Vektor

pM765-tev

Bei dem verwendeten Vektor handelt es sich um ein Derivat des extrachromosomalen D.

discoideum-Vektors pDXA (Manstein et al., 1995).

Zur Amplifikation dieses Vektors wurde der Escherichia coli Stamm XL1-Blue MRF' Kan

(Stratagene, Heidelberg) verwendet.

Der Vektor dient zur Expression und Aufreinigung von Proteinen aus D. discoideum. Er trägt

den Replikationsursprung (ori) des D. discoideum high-copy-number Plasmids Ddp2. Die

3. Methoden 51

Expressionskassette enthält den starken, konstitutiven Aktin-Promotor act15, ein Startcodon

upstream der multiple cloning site (MCS) sowie C- oder N-terminale Sequenzen für

Affinitäts-Tags. Außerdem besitzt der Vektor die act6 Tn5 neoR Kassette für die Resistenz

gegen G418 zur Selektion positiver Transformanten. Downstream der MCS folgen D.

discoideum Polyadenylierungs- und Terminationssignale.

Außerdem enthält er einen high-copy-number E. coli Plasmid-Replikationsursprung sowie das

bakterielle ApR-Gen zur Plasmidproduktion und Selektion in E. coli.

Klonierung

Die Klonierung in den pM765-tev Vektor erfolgte analog zur Klonierung des pGEM®-T Easy

Vektors. Da eine größere Menge an Plasmid-DNA zur Ligation notwendig war, wurde eine

DNA-Maxipräparation durchgeführt. Diese entspricht weitgehend der Minipräparation. Im

Gegensatz zu dieser es ist jedoch möglich, bis zu 500 µg DNA/Probe zu isolieren. Die

Arbeitsschritte zur Durchführung der Maxipräparation sind im Anhang I, Kap. 9.7.6.

aufgeführt. In Vorbereitung auf die Ligation wurde das Insert mithilfe der Reaktionsenzyme

XhoI und NheI ausgeschnitten bzw. der Vektor präpariert. Dies erfolgte wie in Anhang I,

Kap. 9.7.7 beschrieben in einem Doppelansatz (Doppelverdau). Die notwendigen Konditionen

wurden der Internetseite der Firma Fermentas zum Ansatz eines Doppelverdaus entnommen

(http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html).

Dephosphorylierung von DNA

Um nach dem Restriktionsverdau eine Religation des Vektors zu verhindern, mußten

überstehende Phosphatgruppen entfernt werden. Die Spaltungsreaktion wurde mithilfe der

Alkalischen Phosphatase (CIAP) im Anschluß an die Restriktionsspaltung durchgeführt. Es

wurde 1U CIAP/20 pmol DNA verwendet und der Ansatz für 30 min bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurde die Phosphatase durch fünfzehnminütiges Erhitzen auf 85°C inaktiviert.

Um nach der Restriktionsspaltung die Ligation (Anhang I, Kap. 9.7.8) durchführen zu

können, musste allerdings auf einer der beiden zu verknüpfenden Seiten des DNA-Stranges

eine Phosphatgruppe vorhanden sein. Diese wurden vom Insert bereitgestellt.

3. Methoden 52

3.4.6 Transformation des pM765-tev Vektors in E.coli

Die Transformation des pM765-Vektors in E.coli erfolgte analog zur Transformation des

pGEM-T easy Vektors (Kap. 3.4.2).

3.4.7 Selektion und Kontrolle des Ligationsergebnisses

Die Vorgehensweise ist in den Kapiteln 3.4.3 und 3.4.4 beschrieben. Alternativ wurde beim

Verdau das Restriktionsenzym PstI verwendet, dessen Erkennungssequenz (5´... CTG CA/G

...3´) direkt auf der die Mutation enthaltenden Sequenz des Inserts liegt. Außerdem befanden

sich innerhalb der Vektorsequenz zwei weitere Schnittstellen für das Enzym. Die

resultierenden Fragmente besassen eine Länge von 660 bp (Sequenz der LEW und LEW-ci2

Ratte) und 933 bp (nur LEW).

Sequenzierung zur Kontrolle des Ligationsergebnisses

Positive Proben wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) sequenziert. Zur

Sequenzierung wurde die bei der Mini-Präparation gewonnene Plasmid-DNA sowie folgende

Primer (Sequenzen sind im Anhang I, Kap. 9.3.6 sowie 9.3.7 aufgeführt) verwendet:

• MyTH4 rev

• mhc 2233c

Der mhc 2233c Primer wurde anstelle des MyTH4 fw Primers eingesetzt, um zusätzlich den

Übergang zwischen Vektor-Sequenz und klonierter Sequenz beurteilen zu können.

3.4.8 DNA-Maxipräparation ausgewählter Klone

Für die Maxipräparation mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit wurde das im Anhang I, Kap.

9.7.6 beschriebenen Protokoll verwendet.

3. Methoden 53

3.5 Analyse der Proteinstruktur - Zellbiologische Methoden

3.5.1 Transfektion von Dictyostelium discoideum

Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische

Zellkulturzellen. Für Suspensionskulturen bietet sich hierfür die sogenannte Elektroporation

an, bei der die Zellmembran durch Spannungspulse für die zu übertragende DNA permeabel

gemacht wird.

Für die Transfektion von D. discoideum wurde eine Schüttelkultur aus AX3-ORF+-Zellen

(Wildtyp-Zellen) angelegt, indem 100 ml HL-5c-Medium+P/S mit ORF-Zellen einer

konfluenten Petrischale beimpft und für 48 Stunden bei 20°C und 180 rpm inkubiert wurden.

Sobald die Suspension eine Dichte von 2-3 x 106 Zellen/ml erreicht hatte, wurde diese bei

2800 rpm für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden zweimal mit je 20

ml Elektroporationspuffer gewaschen, anschließend in gleichem Puffer resuspendiert und auf

5-8 x 106 Zellen/ml eingestellt. 800 µl dieser Zellsuspension wurden mit 12-20 µg Plasmid-

DNA gemischt und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette mit 0,4 mm Schichtdicke

überführt. Diese wurde anschließend für weitere 5 min auf Eis gekühlt. Die Elektroporation

fand unter folgenden Bedingungen statt:

! 1000V-1200V, 3 µF, 600Ω

! 2 Pulse zu je1 ms, dazwischen 5 sek Pause

Die Küvette wurde sofort auf Eis gestellt. Es wurden 2 Petrischalen mit jeweils 11 ml HL-5c-

Medium vorbereitet, das 10 U/ml Penicillin und 10 µg/ml Streptomycin (P/S) enthielt. Nach 5

bis 10 min Inkubationszeit wurden 100 µl bzw. 700 µl der Zellsuspension unter kreisenden

Bewegungen in eine Petrischale pipettiert, um eine optimale Dichte der transfizierten Zellen

für das Picken von Klonen zu gewährleisten.

3.5.2 Selektion transfizierter Zellen mit Geneticin

Zwölf bis vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurde das Medium abgezogen und

durch 11 ml HL-5c-Medium+P/S+G10 ersetzt. Aufgrund der G10(Geneticin)-Sensibilität der

transfizierten Zellen erfolgte ein Absterben der nichttransformierten Zellen, die durch ein

3. Methoden 54

tägliches Wechseln des Mediums über mehrere Tage entfernt wurden. Nach einer

Wachstumsphase von 7 bis 14 Tagen bildeten die transfizierten Zellen Kolonien, die als

weiße Punkte am Boden der Petrischalen zu erkennen waren. Die Vereinzelung erfolgte,

indem die Pipettenspitze direkt auf eine Kolonie aufgesetzt, diese zusammen mit 1000 µl

Medium aufgezogen und in ein Well (Vertiefung) einer 1 ml-Multiwellplatte überführt wurde.

Auf diese Weise wurden etwa 6-12 Kolonien pro Platte selektiert. Sobald das Well halb

konfluent war, wurde es gespült, die Suspension in eine große Petrischale überführt und mit

HL-5c-Medium+P/S+G10 auf 11 ml aufgefüllt. Das Medium wurde jeden zweiten Tag

gewechselt. War die Platte konfluent, wurden die Zellen mit 1 ml HL-5c-Medium+P/S+G10

vom Plattenboden abgespült und für eine Protein-Minipräparation verwendet, um die

Expressionsrate des gewünschten Proteins zu analysieren.

3.5.3 Gewinnung von Sporen

Dictyostelien existieren unter normalen Bedingungen als einzellige Amöben, die sich jedoch

bei Nahrungsmangel zu einem vielzelligen Verband organisieren und einen Fruchtkörper

ausbilden. Dieser entläßt eine große Anzahl an Sporen, eine restistente Dauerform, die unter

geeigneten Umweltbedinungen wieder als Einzeller auskeimen. Über die Gewinnung von

Sporen konnten wichtige Klone für längere Zeit konserviert werden.

Zur Gewinnung von Sporen wurde eine Schüttelkultur aus 100 ml HL-5c-Medium+P/S+G10

und 1 ml Spüllösung von einer konfluenten Platte des gewünschten Klons angelegt. Es folgte

eine Inkubation bei 20°C und 180 rpm, bis eine Dichte von etwa 5 x 106 Zellen/ml erreicht

war. Die Suspension wurde bei 4°C für 2 min bei 2800 rpm zentrifugiert und das gewonnene

Zellpellet mit 20 ml MES-Puffer gewaschen. Es folgten Pelletierung, erneutes Waschen mit

MES-Puffer, Pelletierung und anschließend die Resuspendierung des Pellets in 400 µl MES-

Puffer. Die gewonnene Zellsuspension wurde auf eine MES-Agarplatte gleichmäßig

ausgestrichen. Nach Trocknung der Flüssigkeit wurde die Platte auf dem Deckel stehend für

24 bis 48 Stunden bei 20°C inkubiert. Die gebildeten Sporen wurden durch einmaliges

Aufklopfen der Petrischale auf den Deckel übertragen und in < 1000 µl 10%iges w/v Glycerin

aufgenommen. Die Lagerung der Sporen erfolgte in 100 µl Aliquots bei -80°C.

3. Methoden 55

Um eine Kontamination der gewonnenen Sporen mit Bakterien oder Hefen auszuschließen,

wurde eine der Portionen ausgesät (Kap. 3.5.4.) und in den folgenden Tagen auf mögliche

Infektionen überprüft.

3.5.4 Anzucht von D. discoideum aus Sporen

Zur Anzucht von D. discoideum aus Sporen wurden 11 ml HL-5c-Medium+P/S in eine

Petrischale gegeben und 100 µl einer Sporensuspension hinzugefügt. Während einer 24

stündigen Inkubation erfolgte das Ausschlüpfen der Zellen. Anschließend wurde das Medium

durch 11 ml HL-5c-Medium+P/S+G10 (Ausnahme: bei AX3-ORF+-Zellen) ersetzt. Der

Wechsel des Mediums erfolgte alle zwei Tage. Sobald die Platte konfluent war, wurde sie mit

1 ml Medium sorgfältig gespült, um eine zu hohe Zelldichte zu vermeiden. Die Spüllösung

wurde für weitere Experimente verwendet.

3.6 Analyse der Proteinstruktur - Proteinbiochemische Methoden

3.6.1 Analytische Proteinpräparation aus D. discoideum

Um transformierte D. discoideum-Kulturen auf die Expression des gewünschten Proteins zu

untersuchen, wurde eine analytische Protein-Mini-Präparation durchgeführt. Die

Arbeitsschritte sind dem Anhang I, Kap. 9.8.1 zu entnehmen.

3.6.2 Nachweis von Proteinen mittels Gelelektrophorese

Die SDS-PAGE (Laemmli, 1970) wird sowohl für die Überprüfung der Expression bei der

analytischen Proteinexpression als auch zur Reinheitsbestimmung bei der Proteinaufreinigung

eingesetzt.

Es wurden SDS-Polyacrylamid-Gele verwendet, die sich aus 10-15%igem Trenngel und

5%igem Sammelgel mit einer Dicke von 0,75 mm zusammensetzten (diskontinuierliche

Gelelektrophorese). Die Zusammensetzung der Teilgele sowie der Ablauf der

Gelelektrophorese sind im Anhang I, Kap. 9.8.2. und 9.8.3. angegeben.

Die Entwicklung des Gels erfolgte mittels Coomassie-Färbung (Anhang I, Kap. 9.8.4).

3. Methoden 56

3.7 Elektroretinographische Untersuchung

Die ophthalmologischen Untersuchungen wurden nach den Richtlinien der "Association for

Research in Vision and Ophthalmology statement for the use of animals in ophthalmic and

vision research" durchgeführt.

3.7.1 Übersicht der verwendeten Tiere

Elektroretinographie

Stamm Genotyp Geschlecht Alter in Tagen Anzahl der

Tiere

männlich ≥ 400 4 homozygot

weiblich ≥ 400 3

männlich ≥ 400 1

LEW/Ztm-ci2

MHH heterozygot

weiblich ≥ 400 6


weiblich ≥ 400 3

männlich ≥ 400 3

LEW/Ztm-ci2

TiHo heterozygot

weiblich ≥ 400 4

männlich ≥ 400 4 LEW/Ztm

MHH

wildtyp

weiblich ≥ 400 3

männlich ≥ 400 4 LEW/Ztm

TiHo

wildtyp

weiblich ≥ 400 3


weiblich ≥ 400 1

männlich ≥ 400 2 heterozygot

weiblich ≥ 400 3

HsdRccHan:

WIST-Myo7Atnd

wildtyp männlich > 100 bis 300 3

weiblich > 100 bis 300 2

3. Methoden 57

Histologie

Stamm

Genotyp

Anzahl der Tiere

homozygot 3 LEW-ci2

MHH heterozygot 3

homozygot 3 LEW-ci2

TiHo heterozygot 3

LEW

MHH

wildtyp 3

LEW

TiHo

wildtyp 3

3.7.2 Dunkeladaptation

Um eine isolierte Antwort der Stäbchenzellen zu erreichen, wurde das zu untersuchende Tier

für etwa zehn Stunden an Dunkelheit adaptiert. Dazu wurde der Käfig in einen lichtdichten,

mit einem ebenfalls lichtdichten Belüftungsschacht versehenen Dunkelschrank (Höhe 930

mm/Breite 930 mm/Tiefe 580 mm) plaziert. Alle im Anschluß an die Dunkeladaptation

durchgeführten Arbeiten erfolgten bei absoluter Dunkelheit oder unter Rotlicht.

3.7.3 Narkose

Die Gewichtsbestimmung des Tieres zur Errechnung der Narkose erfolgte mithilfe einer

handelsüblichen Digitalwaage. Die Narkose wurde nach Fixation des Tieres in nachstehender

Dosierung in einer Mischspritze peritoneal verabreicht:

Ketamin (10%) 100 mg/kg

Xylazin (2%) 4 mg/kg

Die benötigte Menge an Narkosemitteln, eine mögliche Nachdosierung sowie der Verlauf und

die Dauer der Narkose wurden im Versuchsprotokoll (Anhang I, Kap. 9.9.4.) festgehalten.

3. Methoden 58

Die Wirkung der Narkotika setzte nach etwa 2 bis 5 min ein und hielt etwa 30 bis 60 min an.

Die Tiefe der Narkose wurde mittels Zwischenzehenreflex überprüft.

3.7.4 Vorbereitung der Versuchstiere

Zur Weitstellung der Pupillen (Mydriasis) wurden dem Tier etwa 30 min vor Einleitung der

Narkose je ein Tropfen Mydriatikum Stulln® (Tropicamid) und Neosynephrin POS®

(Phenylephrin) in das linke und rechte Auge getropft.

Nach dem Einsetzen der Narkose wurde das Tier auf einem Tablett plaziert, das an der

Ganzfeldkugel befestigt war. Zum Schutz gegen Auskühlung diente eine wärmende

Unterlage. Die Erdungselektrode (wiederverwendbare Subdermal-Nadelelektrode) wurde

oberhalb der Schwanzwurzel unter die Haut gestochen, die Referenzelektroden (Subdermal-

Nadelelektrode) an die linke bzw. rechte Ohrbasis. Der Durchmesser der Ringelektroden (ca.

0,5 mm große, zirkuläre Golddrahtelektroden), die zur Ableitung der Potentiale am Augapfel

dienten, wurden an die Bulbusgröße des Tieres angepaßt. Die Verabreichung eines

Lokalanästhetikums (ein bis zwei Tropfen Metacain) gewährleistete ein ungestörtes Aufsetzen

der Ringelektroden auf die Augäpfel. Durch das Applizieren von transparentem Thilo Tears

Gel wurde ein Austrocknen der Korneae verhindert.

Es folgten eine Impedanzmessung und die Beurteilung der Basislinie (Basisableitung), um

einen perfekten Sitz und eine uneingeschränkte Funktionsfähigkeit der Elektroden

sicherzustellen.

3.7.5 Elektroretinographie

Die Elektroretinographie kann über eine Ableitung der Netzhaut-Stromkurve zur Erkennung

von Erkrankungen des Augenhintergrundes beitragen. Durch eine Stimulation der Netzhaut

mit Lichtreizen entstehen dabei Aktionspotentiale, Antworten der Netzhaut, die nach

Verstärkung aufgezeichnet werden. Die elektrischen Antworten der einzelnen

Netzhautschichten bezogen auf eine Zeitachse ergeben eine Kurve (Elektroretinogramm).

Art, Dauer und Intensität der Lichtstimuli zur Ableitung der Photorezeptorantworten wurden

in Anlehnung an den ISCEF-Standard (International Society for Clinical Electrophysiology of

Vision) ausgewählt.

3. Methoden 59

Die Ableitungen des linken und rechten Auges erfolgten parallel.

Elektroretinographie - Skotopisches ERG

Das ERG-Equipment bestand aus einer Ganzfeldkugel, einem DC-Amplifier und einer PC-

basierten Kontroll- and Aufzeichnungseinheit (Roland Consult, Brandenburg/Wiesbaden,

Germany).

Die Ableitung der Stäbchenantworten (skotopisches ERG) erfolgte bei absoluter Dunkelheit

durch Stimulation mit Einzelblitzen ansteigender Intensitäten beginnend mit 0,01 cds/m2 bis

zu 30 cds/m2. Jede Stufe wurde mit einer Frequenz von 0,2 Hz (Stufen 1-3) bzw. 0,1 Hz

(Stufen 4-6) 3 bis 5 mal wiederholt. Daraus wurde der entsprechende Mittelwert einer Stufe

gebildet. Zur Regeneration der Photorezeptoren erfolgte zwischen zwei Stufen eine Pause von

30 sek.

Die Testparameter des skotopischen Einzelblitz-ERGs sind in Anhang I, Kap. 9.9.2

aufgeführt.

Elektroretinographie - Photopisches ERG

Wurde das photopische ERG im Anschluß an das skotopische ERG durchgeführt, erfolgte

eine zehnminütige Helladaptation bei einer Lichtstärke von 25 cds/m3

(Hintergrundbeleuchtung im photopischen ERG).

Die Ableitung der Zapfen-Photorezeptorzellen wurde unter Verwendung von Einzelblitzen

mit einer Lichtintensität von 3 cds/m2 bis 100 cds/m2 durchgeführt. Abstände zwischen den

Blitzen und Regenerationszeiten waren analog zum skotopischen ERG.

Die Testparameter des photopischen Einzelblitz-ERG sind in Anhang I, Kap. 9.9.3 aufgeführt.

Zusätzlich wurden für das skotopische und das photopische ERG die Latenzzeiten der

Maximalwerte (negative a-Welle und positive b-Welle) aufgezeichnet.

3. Methoden 60

3.7.6 Kontrolle der Aufwachphase

Im Anschluß an die Elektroretinographie wurden die Augen des Tieres eingehend untersucht

und die Ergebnisse im ERG-Protokoll (Anhang I, Kap. 9.9.4) festgehalten. Dabei wurde

insbesondere auf folgende Parameter geachtet:

! vollständige Weitstellung der Pupillen (Mydriasis) beidseits

! äußere Verletzungen der Augen insbesondere der Korneae sowie der

Umgebung der Augen

! Kornea- bzw. Linsentrübungen

! ausreichender Tränenersatz, um ein Austrocknen der Korneae zu

verhindern

Unter Maßnahmen zur Verhinderung der Auskühlung wurde das Tier in einen mit Zellstoff

ausgelegten Käfig verbracht und bis zum vollständigen Erwachen unter Beobachtung

gehalten.

3.8 Histologische Untersuchung der Retina

3.8.1 Entnahme der Augäpfel und Fixation der Organe

Durch Verschluss der Lidränder mittels Pinzette und Schnittführung in Richtung Orbitalring

wurden nacheinander der linke und rechte Bulbus geschützt im Bindehautsack entnommen.

Das Absetzen der Augen erfolgte in der Tiefe der Orbitalhöhle, so dass ein Stück Sehnerv am

Präparat erhalten blieb. Bindehautsack, Muskelreste und intraorbitales Fett wurden vorsichtig

abpräpariert, ohne Auge bzw. Sehnerv zu beschädigen. Die Augen wurden zur Fixierung

direkt nach der Entnahme in einer 5%igen Glutaraldehyd-Lösung inkubiert.

3. Methoden 61

3.8.2 Einbettung, Schnitttechnik und Färbung der Präparate

Die Einbettung und das Schneiden der Präparate wurde am Institut für Humangenetik

vorgenommen.

Nach Dehydrierung in einer Ethanolreihe (mit den Stufen 10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%,

95% and Ethanol absolut) wurde das Gewebe den Herstellerangaben entsprechend in

Technovit 7100 eingebettet. Es folgte eine zwölfstündige Inkubation in einer

Infiltrationslösung (Hardener 1 und Technovit). Anschließend wurden die Augen in einer

Linie durch den Nervus opticus halbiert und den Herstellerangaben entsprechend in Histoform

S eingebettet. Mithilfe eines Mikrotoms wurde eine Serie aus 1-3 mm großen Schnitten

angefertigt. Es wurde eine H.E.-Färbung durchgeführt.

3.8.3 Auswertung der histologischen Präparate

Es wurden folgende Parameter durch Adspektion der Schnitte mithilfe eines Lichtmikroskops

beurteilt:

! Qualität des gesamten Schnittes

(Zusammenhangstrennungen, Überlagerungen usw.)

! Schichtaufbau der Retina (Proportionalität der einzelnen Schichten)

! Ausmaß der Photorezeptoren an zwei verschiedenen Lokalitäten,

zentral in der Nähe des Sehnervenabgangs und peripher (Anzahl der

Zelllagen der äußeren Körnerschicht, Anordnung und Gestalt der

Zellen)

! Außmaß der inneren Körnerschicht und der retikulären Schichten

! Sehnerv (Austrittsstelle, Nervengewebe usw.)

! Retinales Pigmentepithel (Stärke, Ablagerungen, Pigmentakkumulation

usw.)

! Hinweise auf Entzündungen oder Infektionen (Immunzellen,

Narbengewebe usw.)

! Blutgefäße (Ausmaß und Zellfülle)

3. Methoden 62

Zur quantitativen Bewertung der Retinae und zur statistischen Bewertung wurde folgender

Score entwickelt:

Photorezeptorschicht

0 fehlt

oder lückenhaft

+ schwach

++ stark

+++ sehr stark

Anzahl der Zelllagen der äußeren Körnerschicht - peripher

(gezählt ca. 20 Zellreihen entfernt von der Ora serrata)

0 keine Zellen

oder nur vereinzelt Zellen, keine durchgehende Zellschicht

+ 1 bis 2 durchgehende Zellschichten

++ 3 und 3-4 durchgehende Zellschichten

+++ 4 und 4-5 durchgehende Zellschichten

Anzahl der Zelllagen der äußeren Körnerschicht - zentral

(gezählt ca. 20 Zellreihen entfernt von der Sehscheibe, Papilla optica)

0 keine Zellen



++ 5 bis 8 durchgehende Zellschichten

+++ 9 bis 12 durchgehende Zellschichten

Anzahl der Zelllagen der inneren Körnerschicht - zentral

(gezählt ca. 20 Zellreihen entfernt von der Sehscheibe, Papilla optica)

0 keine Zellen



++ 3 bis 5 durchgehende Zellschichten

+++ > 5 durchgehende Zellschichten

3. Methoden 63

Äußere plexiforme Schicht

0 vollständig degeneriert

oder fast vollständig degeneriert

+ im Zentrum vorhanden,

in der Peripherie fast vollständig degeneriert

++ schmal

+++ regelrecht

Restliche Schichten

0 Retina vollständig degeneriert

+ Retina teilweise degeneriert,

Schichten unregelmäßig und ohne reguläres Größenverhältnis

++ regelrechter Schichtenaufbau der Retina

Größenverhältnis der Schichten stimmig

Die histologische Beurteilung der Schnitte erfolgte mithilfe eines Lichtmikroskops bei einer

40-, 100- und 400-fachen Gesamtvergrößerung.

3.9 Untersuchung von Umweltfaktoren für die Vergleichsstudie

3.9.1 Infektionserreger

Jeweils zwei Tiere pro Haltungseinheit wurden auf die in den FELASA-Richtlinien

(NICKLAS et al., 2002) gelisteten Pathogene untersucht. Nach Tötung der Tiere wurden die

notwendigen Proben entnommen und im Mikrobiologischen Labor des Zentralen

Tierlaboratoriums der MHH untersucht.

Zusätzlich wurden Gehirnproben von Tieren der verschiedenen Haltungseinheiten auf eine

Infektion mit dem Virus der Bornaschen Erkrankung überprüft. Die Untersuchung erfolgte am

Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Das Protokoll und die für den

Nachweis eingesetzten Primer sind im Anhang I, Kap. 9.10.1 nachzulesen.

3. Methoden 64

3.9.2 Lichtintensität

Die Lichtintensität in den Tierräumen der beiden Haltungseinheiten wurde mit einem

Luxmeter (roline Digital Lux Meter) an folgenden Lokalisationen bestimmt:

Messpunkt

Höhe des Messpunktes

höchster Punkt des Regals* ca. 2,00 m bis 2,20 m

Regalmitte ca. 1,20 m

Tierregal

tiefster Punkt des Regals* ca. 0,50 m

Raummittelpunkt ca. 1,60 m Tierraum

Boden des Raumes (in Raummitte) 0 m

* Deckel des obersten/untersten Käfigs

3.9.3. Umgebung und Haltungsbedingungen

Zur Erfassung der Umgebungs- und Haltungsbedingungen der Tiere wurden folgende

Parameter im Tierraum untersucht und aufgenommen:

! Futter, Wasser

! Einstreu

! Temperatur

! Lichtregime (Hell-Dunkel-Zyklus)

! Licht (Homogenität der Lichtintensität im Tierraum, Art der

Lichtquelle)

! Geräuschbelastung (Hintergrundgeräusche)

! Pflege/Handling

! Anzahl der Tiere pro Käfig

! Ständersysteme

! hygienische Barriere

3. Methoden 65

3.10. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Ergebnisse der Real Time PCR erfolgte mit dem auf Exel®

basierenden Qgene 96 Programm (MÜLLER et al., 2002). Die CT-Werte des Zielgens

(Myo15) wurden dazu gegen die CT-Werte des Referenzgens (β-Aktin) unter

Berücksichtigung der jeweiligen Amplifikationseffizienzen normalsiert.

Die statistische Analyse der Elektroretinogramme erfolgte mithilfe einer Varianzanalyse (one

way ANOVA) unter Verwendung der Statistikprogramme SPSS und Prism. Teile dieser

Auswertung wurden am Zentrum für Biometrie, Medizinische Informatik und Medizintechnik

der Medizinischen Hochschule Hannover vorgenommen.

Die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Augenpräparate wurde mithilfe des

Statistikprogrammes Prism mithilfe einer Varianzanalyse (one way ANOVA) ausgewertet.

4. Ergebnisse 66

4 Ergebnisse

4.1 Einleitung

Die durch eine Spontanmutation im Inzuchtstamm LEW/Ztm entstandene LEW/Ztm-ci2 Ratte

zeichnet sich durch Rotationsverhalten mit ausgeprägter Seitenpräferenz aus. Dieses wurde

auf eine Imbalance der Dopaminkonzentration und seiner Metaboliten im Striatum der

Hemisphäre zurückgeführt (LÖSCHER et al., 1996). Aufgrund von erloschenen, auditorisch

evozierten Potentialen und des histologisch nachgewiesenen, vollständigen Verlustes des

cochleären Neuroepithels wurde die LEW-ci2 Ratte als Tiermodell für neurosensorische

Taubheit eingestuft (KAISER et al., 2001).

Zusätzlich wurde durch spezielle Untersuchungen des Verhaltens eine Beeinträchtigung des

visuellen Systems festgestellt (VON HÖRSTEN, pers. Komm.; CHWALISZ, 2003).

Eine Kopplungsanalyse, die unter Verwendung anonymer Mikrosatellitenmarker an einer

BN-Rückkreuzungspopulation ((LEW/Ztm-ci2xBN/Ztm)F1xLEW/Ztm-ci2) durchgeführt

wurde, diente zur Ermittlung von chromosomalen Bereichen, die mit dem Phänotyp der

LEW-ci2 Ratte assoziierten sind. Die ci2-Mutation wurde im zentralen Bereich des

Chromosom 10 (RNO10q22) kartiert. Die Identifizierung von Kandidatengenen erfolgte

durch (a) vergleichende Untersuchungen zu humanen und murinen Genomen, (b) die Suche

nach Genen phänotypisch ähnlicher Erkrankungen bei diesen Spezies, (c) die physikalische

Kartierung der Mutation und (d) die Suche nach Zusammenhängen zwischen der Funktion

bestimmter Gene und dem Krankheitsbild der LEW-ci2 Ratte. Die Analysen führten zur

Ermittlung der Kandidatengene Myo15 und Kcnj12 (CHWALISZ, 2003).

Ziel dieser Arbeit war es, die für den Phänotyp der LEW-ci2 Ratte verantwortliche Mutation

zu identifizieren. Des Weiteren sollte eine Charakterisierung des visuellen Phänotyps

vorgenommen werden.

4. Ergebnisse 67

4.2 Genetische Untersuchung

4.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene (Myo15/Kcnj12)

Die Primer zur Sequenzierung der Kandidatengene, Myo15 und Kcnj12, wurden so

konstruiert, dass sie die kodierenden Bereiche (Exons) der Gene flankierten. Die 64 Exons des

Gens Myo15 und das Exon des Gens Kcnj12 wurden abhängig von ihrer Länge mit Hilfe eines

oder mehrerer Primerpaare amplifiziert. Der Vergleich der sequenzierten Basenfolge des

Kandidatengens Kcnj12 mit der Referenzsequenz (ENSRNOG00000002303) zeigte keine

Unterschiede. Dagegen konnte im Exon 56 des zweiten Kandidatengens, Myo15

(ENSRNOG00000028597), ein Basenaustausch festgestellt werden. Es handelt sich um eine

Substitution der Basen Thymin und Cytosin an der Position 43 612 (Abb. 4.1).

Abb. 4.1 Punktmutation in der Sequenz der LEW/Ztm-ci2 Ratte. Die

Basensubstitution (T→C) wurde in Exon 56 des Kandidatengens Myo15 detektiert. Sie

verursacht einen Aminosäurenaustausch (Leuzin→Prolin) in der C-terminalen MyTH4

Domäne in der Schwanzregion des Proteins.

MyTH4

LEW

LEW-ci2

...... G I A K A C E Q N L Q K T L R F G G R L ......

...... G I A K A C E Q N P Q K T L R F G G R L ......

LEW

LEW-ci2

Motordomäne Myo 15

4. Ergebnisse 68

Durch eine anschließende computergestützte Übersetzung der Nukleotidsequenz in eine

Aminosäuresequenz wurde deutlich, dass die Punktmutation einen Austausch der

Aminosäuren Leuzin und Prolin an der Position aa 3157 in der C-terminalen MyTH4-Domäne

der Schwanzregion des Proteins Myosin XV (Abb. 4.1) verursacht.

Um eine Vorhersage über die möglichen Effekte auf das Protein, Myosin XV, treffen zu

können, wurde die Mutation mit den Programmen SIFT (v2.0; sortiert intolerant und tolerant;

Ng, 2003) und PolyPhen (command line Version; Ramenski, 2002; in Verbindung mit der

SwissProt/TrEMBL+PIR Datenbank) geprüft. Beide Programme prognostizierten eine

schädliche Wirkung für das Protein hinsichtlich seiner Funktion bzw. seiner Struktur (SMITS

und MALIK, pers. Komm.).

Aufgrund der Entdeckung des mutationstragenden Gens wird die LEW-ci2 Ratte gemäß den

internationalen Nomenklaturregeln (Rat Genome and Nomenclature Committee) nun als

LEW/Ztm-Myo15ci2 Ratte benannt. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Mutante zur

Vereinfachung weiterhin als LEW-ci2 bezeichnet.

4.3 Funktionelle Untersuchungen

Im Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführte

Northern Blot Analysen zur funktionellen Untersuchung des mutierten Gens in

Hypophysengeweben deuteten auf Expressionsunterschiede zwischen LEW-ci2 Ratten und

Tieren des Hintergrundstammes LEW hin. Da die Ergebnisse nicht eindeutig waren, wurde in

einem zweiten Versuch die Expression der mRNA von homozygoten und heterozygoten

Merkmalsträgern sowie von coisogenen Kontrolltieren im Vergleich zu einem endogenen,

konstant exprimierten Gen (Housekeeping-Gen) mithilfe der quantitativen RT-PCR erneut

untersucht. Das Ziel der Expressionsanalyse war es, zunächst die Auswirkungen der Mutation

des Myo15-Gens auf RNA-Ebene zu verifizieren und später auf Proteinebene zu analysieren.

4.3.1 Real Time PCR

Die Expression des Gens Myo15 wurde mittels Real Time PCR im Hypophysengewebe von

etwa 3 Monate alten LEW-ci2 Ratten und LEW-Kontrolltieren sowie als Zweitkontrolle von

4. Ergebnisse 69

DA Ratten bestimmt. Dazu wurde die Expression des Gens in Relation zu dem Housekeeping-

Gen β-Actin gesetzt. Die relative Expression von Myo15 wurde mittels Varianzanalyse und

anschließendem t-Test hinsichtlich signifikanter Unterschiede zwischen den Stämmen

untersucht. Dabei ergaben sich weder signifikante Unterschiede zwischen der Mutante und

dem Hintergrundstamm noch zwischen Mutante und Zweitkontrolle (Abb. 4.2).

Auch ein Vergleich der Kontrollen untereinander ergab keinen signifikanten Unterschied in

der Expression von Myo15.

4.3.2 Proteinanalytik

Ziel dieser Studie war die Aufklärung einer möglichen Auswirkung der ci2-Mutation auf die

Struktur des Myosin XV. Der mutationstragende Bereich des Proteins befindet sich in der C-

terminalen MyTH4-Domäne der Schwanzregion des Myosin XV (Abb. 4.3). Der für diese

Region kodierende Abschnitt des Gens wurde mithilfe spezifischer Primer amplifiziert (Kap.

3.4.1.). Für eine spätere Isolation und Aufreinigung der Domäne war es notwendig,

Schnittstellen für Restriktionsenzyme in das Amplifikat zu integrieren, die den MyTH4-

Abschnitt flankierten. Weiterhin war es notwendig, am Ende der Domäne die Sequenz für ein

DA LEW LEW-ci2 0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

ng Myo15 RNA

Abb. 4.2 Relative Expression von Myo15 im Hypophysen-

gewebe. Dargestellt sind die Mittelwerte und der Standard-

fehler des Mittelwerts. Die Werte sind gegenüber der

Expression von β-Actin abgeglichen. n.s.= nicht signifikant.

n.s n.sn.s.

4. Ergebnisse 70

Stopkodon zu schaffen, um die Translation an dieser Stelle zu beenden. Deshalb wurden die

Primersequenzen zur Amplifikation der MyTH4-Domäne um einige Basen verlängert und auf

diesem Wege Schnittstellen für die Restriktionsenzyme XhoI (Vorwärtsprimer) und NheI

(Rückwärtsprimer) sowie die Sequenz für ein Stopkodon geschaffen (Tab. 4.1).

Tab. 4.1 Aufbau der Primer zur Amplifikation der MyTH4-Domäne.

fw CTCGAGGACATGCTTTGCTTCAC Primersequenzen rev GCTAGCTCAAGCCCCTCTATGACATCCAG XhoI CTCGAG GACATGCTTTGCTTCAC Schnittstelle für das

Restriktionsenzym NheI GCTAGC TCAAGCCCCTCTATGACATCCAG CTC GAGGACATGCTTTGCTTCAC nicht hybridisierende,

zusätzlich annektierte Basen GCTAGCTCA AGCCCCTCTATGACATCCA Stopkodon GCTAGC TCA AGCCCCTCTATGACATCCA

Rot markiert sind innerhalb der Primersequenzen die konstruierten Schnittstellen für die

Restriktionsenzyme, zusätzlich annektierte Basen und das Stopkodon.

Durch eine Klonierung des Amplifikats in Vektoren (Abb. 4.3) konnten große Mengen an

Insert-DNA gewonnen werden, die für die Transfektion in den Schleimpilz Dictyostelium d.

benötigt wurden.

Das Ligationsergebnis wurde mithilfe eines Restriktionsverdaus überprüft (Kap. 3.3.4). Das

durch die Restriktionsenzyme XhoI und NheI isolierte Insert, das eine Länge von 596 bp

Kopfregion Halsregion Schwanzregion

N

C

MyTH4

FERM

FERM

SH3IQ

IQ

MyTH4

Myosinkopf

Vektor

Abb. 4.3 Aufbau des Myo15 mit den für die

Kopfregion, Halsregion und Schwanzregion

des Proteins kodierenden Abschnitte. Die

mutationstragende, C-terminale MyTH4-

Domäne wurde ausgeschnitten und in

Vektoren (pGEM, pM765-tev) kloniert.

4. Ergebnisse 71

aufwies, wurde mithilfe der Gelelektrophorese nachgewiesen (Abb. 4.4). Ein

Restriktionsverdau gibt allerdings nur Aufschluß über die Länge des Fragmentes, eine

Deletion oder ein Austausch einzelner Basen, verursacht durch Fehler der Polymerase bei der

Amplifikation, kann jedoch mit dieser Methode nicht detektiert werden. Aus diesem Grund

erfolgte im Anschluß an einen erfolgreichen Verdau die Sequenzierung des Inserts und des

Übergangsbereichs zur Vektorsequenz.

Abb. 4.4 Gelelektrophoretische Darstellung des Ligationsergebnisses nach

Restriktionsverdau. Es wurden jeweils 6 Klone (Mutante, Kontrolle) geprüft. Die obere

Bande stellt die Reste der geschnittenen Vektor-DNA (pGEM) dar. Die untere Bande

befindet sich bei etwa 600 bp und stellt das ausgeschnittene Insert dar.

Es wurden zwei Transfektionen durchgeführt, bei der einerseits die Vektoren mit der

mutierten Sequenz der MyTH4-Domäne des LEW-ci2 Stammes und zum anderen die

Referenzsequenz des coisogenen Stammes LEW in den Schleimpilz Dictyostelium

discoideum übertragen wurden. Insgesamt wurden 34 Klone der Mutante und 12 Klone des

Kontroll-Ansatzes auf eine Expression des Myosin XV-Proteins getestet. Die Größe des

Peptids, das aus der MyTH4-Domäne und einem Myosinkopf bestand, betrug etwa 100 kDa.

Alle 12 Klone der Kontrolle wiesen im gelelektrophoretischen Proteinnachweis in diesem

Bereich eine dominante Bande auf (Abb. 4.5, Taschen 11-14). Im Gegensatz dazu fehlte die

Expression bei allen 34 getesteten Klonen der Mutante, wie beispielhaft in Abb. 4.5 (Taschen

1-10) gezeigt ist. Als Expressionskontrolle diente eine Minipräparation von nicht

transformierten ORF+-Zellen (Dictyostelium d.-Wildtyp, Tasche 2).

Vektorrest 1000 bp

500 bp

100 bp

Insert

Marker Ligationen ci2 Ligationen Kontrolle

4. Ergebnisse 72

Abb. 4.5 Gelelektrophoretische Kontrolle der Proteinexpression. Taschen: 1 Marker; 2 Orf+; 3-10 ci2- Klone; 11-14 LEW-Klone

4.4 Pathophysiologische Untersuchungen

4.4.1 Elektroretinographische Voruntersuchungen

Erste Hinweise auf eine eingeschränkte Sehfähigkeit bei LEW-ci2 Ratten zeigten sich

während einer Verhaltensstudie (VON HÖRSTEN, pers. Komm.). In nachfolgenden

elektroretinographischen Untersuchungen wurden stichprobenweise LEW-ci2 Ratten aus zwei

verschiedenen Haltungssystemen (Einheiten) getestet. Alle untersuchten Inzuchttiere

stammten aus derselben Zucht (Zentrales Tierlaboratorium, MHH). Elektroretinographische

Analysen von Ratten aus der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH-Einheit) ergaben

eine uneingeschränkte Funktionsfähigkeit der Netzhaut. Im Gegensatz dazu wiesen einige

LEW-ci2 Tiere aus der Tierärtzlichen Hochschule Hannover (TiHo-Einheit) stark reduzierte

Potentiale im Elektroretinogramm auf, die auf eine Affektion des Augenhintergrundes

deuteten.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Taschen

220 kDa

100 kDa

50 kDa

70 kDa

Expressionsbande

4. Ergebnisse 73


und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie

Mit Hilfe der Vergleichsstudie sollte der retinale Phänotyp von LEW-ci2 Ratten miteinander

verglichen werden, die aus derselben Zucht stammten, jedoch längerfristig an

unterschiedlichen Standorten untergebracht waren. Aus beiden Haltungseinheiten wurden

jeweils sieben homo- und heterozygote LEW-ci2 Tiere sowie sieben Ratten des

Hintergrundstammes LEW ausgewählt. Die Tiergruppen wiesen eine einheitliche

Geschlechtsverteilung auf. Alle Ratten waren älter als 400 Tage. Im Vorfeld der

Untersuchungen wurden Verhaltensbeobachtungen durchgeführt und das Körpergewicht

aufgenommen, um mögliche Zusammenhänge zu Ergebnissen der elektroretinographischen

Tests zu erkennen. Im Anschluß an das ERG erfolgte die histologische Bewertung der

Retinae. Die Voruntersuchungen gaben erste Hinweise darauf, dass die LEW-ci2 Tiere

standortabhängig keine oder schwere Einschränkungen des Sehvermögens aufwiesen. Aus

diesem Grund wurden zusätzlich Faktoren überprüft und verglichen, die für eine Störung des

Visus verantwortlich sein könnten. Dazu gehörten Hygienestatus und Lichtintensität des

Tierraums sowie Haltungsbedingungen der Tiere.

4.4.2.1 Verhalten

Im Vorfeld der elektroretinographischen Untersuchungen wurden jeweils drei homozygote

und drei heterozygote LEW-ci2 Tiere der Vergleichsstudie pro Haltungseinheit bei dem im

Rahmen der Tierpflege notwendigen Umsetzen beobachtet (Phänotypisierung, siehe Kap.

3.1.2). Dabei wurde, verglichen mit den Tieren der MHH-Einheit, ein auffällig träges

Verhalten der TiHo-Ratten im eigenen Käfig beobachtet. Nach dem Umsetzen in die

unbekannte Umgebung zeigten sie dann eine deutlich erhöhte Aktivität. Auffällig war ein im

Vergleich zu den Tieren der MHH-Einheit weniger starkes Rotationsverhalten. Weiterhin

zeigten Tiere der TiHo-Einheit einen stärker ausgeprägten Opisthotonus und die Neigung,

sich in Richtung des Käfigdeckels zu recken. Beim Explorationsverhalten wurden zwischen

den Tiergruppen keine Unterschiede festgestellt, jedoch erkannten weniger Ratten der TiHo-

Einheit das `unbekannte Objekt´. Im Gegensatz zu Tieren der MHH-Haltung setzte keines

der Tiere aus der TiHo-Haltung Kot ab (Tab. 4.2 und Tab. 10.1/10.2).

4. Ergebnisse 74

Tab. 4.2 Phänotypisierung von LEW-ci2 Ratten.

Symptom Ausprägung des Symptoms

Verhalten MHH-Einheit

Verhalten TiHo-Einheit

+++ 5/6 3/6 Aktivität ++ 1/6

+ 1/6 2/6 +++ 1/6 1/6 circling ++ 5/6 4/6

+ 1/6 +++ 5/6 5/6 Exploration des

Käfigs + 1/6 1/6 + 3/6 1/6 - 3/6 4/6

Reaktion auf Objekt

+/- 1/6 ++ 2/6 + 1/6

Kotabsatz

- 3/6 6/6 +++ stark ausgeprägt; ++ mittelmäßig bzw. 3-4 Boli (Kotabsatz); + wenig ausgeprägt, Reaktion positiv (Objekt) bzw. 1-2 Boli (Kotabsatz); +/- nicht eindeutig; - negativ

Anhand der Reaktion auf das unbekannte Objekt (Tab. 4.2) wurde eine Einschätzung über die

Sehfähigkeit der Tiere getroffen. Dieses Ergebnis wurde später mit den Resultaten aus den

elektroretinographischen Untersuchungen (Tab. 4.3) verglichen. Dabei konnte nur eine

Übereinstimmung von 50 % gezeigt werden.

4.4.2.2 Vergleich der Körpermasse

Naturgemäß ist das Körpergewicht bei weiblichen Ratten geringer als bei den männlichen

Tieren. Unabhängig von den Haltungssystemen konnte weiterhin ein tendenziell höheres

Gewicht bei heterozygoten LEW-ci2 Tiere verglichen mit homozygoten nachgewiesen

werden. Außerdem wurde festgestellt, dass LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung unabhängig

vom Genotyp schwerer waren als LEW-ci2 Ratten der MHH-Haltung (Tab. 10.3). Statistisch

signifikant waren diese Unterschiede im Gruppenmittel jedoch nicht. Interessanterweise

waren die Kontrolltiere der TiHo-Haltung im Durchschnitt etwa ebenso schwer wie die

homozygoten LEW-ci2 Tiere, während das Gewicht der Kontrollen in der MHH tendenziell

eher dem Gewicht der heterozygoten LEW-ci2 Tiere glich (was vor allem bei männlichen

Tieren deutlich wurde).

4. Ergebnisse 75

Abb. 4.6 Vergleich der Körpergewichte homozygoter (ci2/ci2) und

heterozygoter (ci2/+) LEW/Ztm-ci2 Tiere beider Haltungseinheiten

(MHH, TiHo) und ihrer Kontrollen (K). Dargestellt sind die Mittelwerte

der männlichen (höherer Wert) und weiblichen Tiere einer Gruppe und

der daraus resultierende Mittelwert.

Abb. 4.7 Körpergewichte getrennt nach dem Geschlecht

(m=männlich, w=weiblich). Vergleich homozygoter (ci2/ci2) und

heterozygoter (ci2/+) LEW-ci2 Tiere innerhalb einer Haltung sowie

zwischen den Einheiten (MHH-TiHo) und ihrer Kontrollen (K).

* p < 0.05, ** p < 0.01

ci2/ci

2 MHH m

ci2/ci

2 MHH w

ci2/+ M

HH m

ci2/+

MHH w

K MHH m

K MHH w

ci2/ci

2 TiH

o m

ci2/ci

2 TiHo w

ci2/+ Ti

Ho m

ci2/+

TiHo w

K TiHo m

K TiHo w0

100

200

300

400

500

600

700

Gew

icht

[g]

** * **

***

ci2/ci

2 MHH

ci2/+

MHH

K MHH

ci2/ci

2 TiHo

ci2/+ T

iHo

K TiHo

200

300

400

500

600

Gew

icht

[g]

4. Ergebnisse 76

Signifikante Unterschiede bestanden zwischen dem Durchschnittsgewicht von weiblichen,

heterozygoten LEW-ci2 Tieren verglichen mit dem Gewicht der homozygoten Tiere sowie

der Kontrollgruppe. Diese Aussage traf für beide Haltungseinheiten zu.

Ein Vergleich der Kontrollgruppen der MHH und TiHo zeigte keine Unterschiede in der

Gewichtsverteilung.

4.4.2.3 Elektroretinographische Untersuchungen

Für die elektrophysiologische Untersuchung wurden pro Haltungseinheit jeweils sieben

homozygote und sieben heterozygote LEW-ci2 Ratten sowie sieben Kontrolltiere (LEW)

gleichen Alters und Geschlechts ausgewählt. Potentialschwankungen am Auge, die durch eine

Stimulation der Retina mit Licht ansteigender Intensitäten entstanden, wurden sowohl unter

skotopischen (dunkeladaptierten) als auch unter photopischen (helladaptierten) Bedingungen

abgeleitet (Kap. 2.6.4). Detailierte Angaben zum Ablauf der Untersuchung und zu den

eingesetzten Lichtstärken innerhalb der einzelnen Stufen finden sich in den Kap. 3.7.5 und

3.7.6.

Aufgezeichnet wurden die Messdaten der a-Welle (negativster Ausschlag) und der b-Welle

(Maximalpunkt) der Ableitungskurve (siehe Abb. 2.4 und 2.5) sowie die Latenzzeiten (Dauer

vom Lichtimpuls bis zum Negativ- bzw. Maximalpunkt der a- und b-Wellen).

Während der Messungen stellte sich heraus, daß die Basislinie (N-Wert) bei einigen Tieren

keine oder kaum Auslenkungen (Antworten der Photorezeptoren auf einen Lichtreiz) zeigte.

In diesem Fall wurde von einem erloschenen ERG ausgegangen.

Erloschene Antworten konnten bei rund 30% der homozygoten und etwa 80% der

heterozygoten, in der TiHo-Einheit gehaltenen LEW-ci2 Ratten festgestellt werden. Im

Gegensatz dazu zeigten Kontrolltiere aus derselben Haltung ebenso wie LEW-ci2 Ratten der

MHH physiologische Antworten im ERG (Abb. 4.8). Die Potentiale der Kontrolltiere

fungierten als Referenzwert. Basierend darauf wurde von einem eingeschränkten ERG

ausgegangen, wenn die b-Welle der skotopischen Ableitung Werte von deutlich unter 200 µV

aufwies. Ein eingeschränktes ERG wurde bei 60% der homozygoten und bei 20% der

heterozygoten LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung aufgezeichnet.

4. Ergebnisse 77

Abb. 4.8 Skotopische Elektroretinogramme (ERG). Dargestellt sind, beispielhaft für die

Gesamtgruppen der Vergleichsstudie, ERG-Aufzeichnungen von einer (I) unbetroffenen LEW-ci2

Ratte (MHH), (II) betroffenen LEW-ci2 Ratte (TiHo), (III, IV) entsprechenden, nicht betroffenen

Kontrolltieren. Angegeben sind die Potentialveränderung in µV (y-Achse) sowie die Latenzzeit in ms

(x-Achse). N=Basiswert, a=a-Welle, b=b-Welle

Aus der Abb. 4.8, die exemplarisch eine typische ERG-Messkurve für jeweils eine LEW-ci2

Ratte und ein Kontrolltier beider Haltungssysteme zeigt, wird ersichtlich, daß sich die

Ableitungskurven der Kontrollgruppen und der MHH-Tiere nicht wesentlich unterscheiden

(Graphik I, III, IV). Vergleichend dazu ist in der Graphik II ein beinahe erloschenes ERG

einer LEW-ci2 Ratte aus der TiHo-Haltung abgebildet.

Um eine präzise Aussage über die Potentialdifferenzen zwischen den Gruppen treffen zu

können, wurden die Einzelwerte der a- und b-Wellen gemittelt und für drei (Dunkel-ERG)

bzw. zwei (Hell-ERG) verschiedene Lichtstärken in den Abb. 4.10 bis 4.17 dargestellt.

Die Abb. 4.10 bis 4.11 zeigen die Werte für die a-Wellen des skotopischen ERGs, welche

die Funktionsfähigkeit von Stäbchen-Photorezeptoren widerspiegeln. Wie den Graphiken zu

entnehmen ist, besteht ein deutlicher Unterschiede zwischen den homo- und heterozygoten

LEW-ci2 Tieren der TiHo-Haltung und den übrigen Gruppen. Die bei niedrigster

Lichtintensität (0,01 cds/m2) aufgezeichneten Messwerte der MHH- und Kontrolltiere

schwankten zwischen 21 und 32 µV, während LEW-ci2 Ratten der TiHo lediglich Werte von

1-2 µV (heterozygot) bzw. 3-11 µV (homozygot) aufwiesen.

20 40 60 80 100 120 140

0

250

500

b

0

250

500

20 40 60 80 100 120 140

b

0

250

500

20 40 60 80 100 120 140

b

0

250

500

20 40 60 80 100 120 140

ms ms

ms ms

µV µV

µV µV

I II

III IV

4. Ergebnisse 78

LEW/Ztm-ci2 (MHH) homozygot LEW/Ztm-ci2 (TiHo) homozygot LEW/Ztm-ci2 (MHH) heterozygot LEW/Ztm-ci2 (TiHo) heterozygot LEW/Ztm (MHH) Kontrolle LEW/Ztm (TiHo) Kontrolle TiHo

Abb. 4.9 Legende für Abb. 4.10 bis 4.17

Abb. 4.10 Skotopisches ERG, a-Welle,rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20

25

50

75

100

125

Abb. 4.11 Skotopisches ERG, a-Welle,linkes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20

100

200

300

400

500

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20

100

200

300

400

500

600

Abb. 4.12 Skotopisches ERG, b-Welle, rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.

Abb. 4.13 Skotopisches ERG, b-Welle, linkes Auge. Vergleichzwischen Genotypen undHaltungseinheiten.

0,01 cds/m2

3 cds/m2 30 cds/m2

0

25

50

75

100

125

µV

µV µV

µV

MHH TiHo

4. Ergebnisse 79

0

10

20

30

40LEW-ci2 (MHH) heteroz.

LEW-ci2 (TiHo) homoz.LEW-ci2 (TiHo) heteroz.

LEW (MHH)

LEW (TiHo)

0,01 cds/m2 0,03 cds/m2 0,3 cds/m2 3 cds/m2 10 cds/m2 30 cds/m2

LEW-ci2 (MHH) homoz.ms

Abb. 4.18 Latenzzeiten. Dargestellt sind die Mittelwerte der b-Wellen der linken

Augen aufgezeichnet während des skotopischen ERGs vergleichend zwischen

Genotypen und Haltungseinheiten.

3 cds/m2 100 cds/m20

10

20

Abb. 4.14 Photopisches ERG, a-Welle, rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.


5

10

15

20

25

Abb. 4.15 Photopisches ERG, a-Welle, linkes Auge. Vergleich zwischen Genotypen und Haltungseinheiten.


100

200


100

200

Abb. 4.16 Photopisches ERG, b-Welle,rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.

Abb. 4.17 Photopisches ERG, b-Welle, linkes Auge. Vergleich zwischen Genotypen und Haltungseinheiten.

µV µV

µV µV

4. Ergebnisse 80

Bei steigenden Lichtstärken von 3 cds/m2 und 30 cds/m2 traten die Unterschiede noch

deutlicher hervor. In diesen Stufen betrugen die Messwerte bei homozygoten LEW-ci2 Tieren

der TiHo 10 bis 30 µV, bei heterozygote lediglich noch 4-6 µV. Die Potentiale der Kontrollen

sowie der LEW-ci2 Tiere der MHH schwankten dagegen zwischen 75-100 µV (3 cds/m2)

bzw. zwischen 50-75 µV (30 cds/m2). Die Differenzen zwischen den Antworten homo- bzw.

heterozygoter LEW-ci2 Tiere der TiHo-Haltung und ihrer Kontrollgruppe waren

hochsignifikant (p<0,0001). Diese Aussage trifft sowohl für das linke als auch für das rechte

Auge zu.

Weiterhin wird deutlich, dass die abgeleiteten Potentiale von heterozygoten LEW-ci2 Tieren

der TiHo niedriger ausfielen als die Messwerte der homozygoten Ratten. Diese Aussage trifft

ebenso auf die in Abb. 4.12 bis 4.13 dargestellten Potentiale der b-Welle zu. Hier ist ein

Unterschied der betroffenen TiHo-Tiere zu den Kontrollgruppen sowie zu LEW-ci2 Ratten

der MHH bereits bei niedrigster Lichtstärke deutlich erkennbar. Während sich die Antworten

der MHH- und Kontrolltiere in dieser Stufe um 280 bis 345 µV bewegten, zeigten

homozygote LEW-ci2 Ratten der TiHo lediglich Werte von 50-70 µV und heterozygote Tiere

Werte von nur 25-40 µV. Bei einer Lichtstärke von 3 cds/m2 betrugen die Werte für MHH-

und Kontrolltiere 325-380 µV, für homozygote LEW-ci2 Ratten der TiHo dagegen nur 75-

140 µV und für heterozygote lediglich 25-40 µV. Bei höchster Lichtintensität bliebt dieses

Verhältnis bei wenig schwächeren Potentialen bestehen. Abweichend davon zeigten

Kontrolltiere ausschließlich am linken Auge erhöhte Werte. Die Potentiale homo- und

heterozygoter LEW-ci2 Ratten der TiHo unterschieden sich in allen Stufen hochsignifikant

von denen der Kontrollgruppe.

Die Werte der a-Wellen des photopischen ERGs sind in den Abb. 4.14 und 4.15 dargestellt.

Wie den Graphiken zu entnehmen ist, waren die starken Unterschiede zwischen den

Potentialen von LEW-ci2 Tieren beider Haltungssysteme unter helladaptierten Bedingungen

nicht so stark ausgeprägt wie im skotopischen ERG. Es waren jedoch größere Varianzen zu

erkennen, die gruppenintern aber auch zwischen den Gruppen auftraten. Die Werte

schwankten zwischen 4-6 µV bei 3 cds/m2 und zwischen 6-18 µV bei 100 cds/m2. Signifikant

geringere (p<0,05) Potentiale (<1µV) zeigten heterozygote LEW-ci2 Tiere der TiHo.

In den Abbildungen 4.16 und 4.17 sind die b-Werte des photopischen ERGs dargestellt. Die

Unterschiede zwischen Potentialen der homo- bzw. heterozygoter TiHo-Tiere und den

Kontrollgruppen waren hochsignifikant und glichen den Ergebnissen des skotopischen ERGs.

Während die Messwerte in beiden Stufen bei heterozygoten Tieren lediglich 5-11 µV und bei

4. Ergebnisse 81

homozygoten Tieren nur 30-50 µV betrugen, wiesen die Kontrolltiere Potentiale von 85-150

µV auf. Allerdings wichen die Messwerte der LEW-ci2 Tiere der MHH ebenfalls von den

Antworten ihrer Kontrollgruppe ab. Diese zeigte starke Schwankungen der Messwerte

zwischen den einzelnen Stufen. Während die Kontrollgruppe der MHH bei einer

Lichtintensität von 3 cds/m2 deutlich niedrigere Werte aufwies als LEW-ci2 Tiere, waren die

Antworten der Kontrollen bei sehr hoher Lichtstärke (100 cds/m2) bedeutend größer. In

einigen Fällen waren diese signifikant.

Im Gegensatz zu den deutlichen Unterschieden zwischen den Potentialen der LEW-ci2 Ratten

der TiHo und der übrigen Gruppen waren die Latenzzeiten der a- und b-Wellen bei allen

Tieren vergleichbar. Dieses Ergebnis konnte sowohl im photopischen als auch im

skotopischen ERG gleichermaßen für alle Stufen nachgewiesen werden und ist in der Abb.

4.18 beispielhaft für alle Ableitungen dargestellt.

Da es keine Unterschiede zwischen den Potentialen sowie den Latenzzeiten der LEW-ci2

Ratten der MHH und der Kontrolltiere gab, wurde bei diesen Tieren eine uneingeschränkte

Sehfähigkeit angenommen.

Tab. 4.3 Überblick über die retinalen Phänotypen der LEW-ci2 Tiere der Vergleichsstudie.

Tier

LEW/Ztm-ci2

(ci2-/-, TiHo)

LEW/Ztm-ci2

(ci2+/-, TiHo)

LEW/Ztm-ci2

(ci2-/-, MHH)

LEW/Ztm-ci2

(ci2+/-, MHH)

1 erloschenes ERG erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen



4 betroffen erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen



7 einseitig betroffen betroffen nicht betroffen nicht betroffen

ci2-/- LEW-ci2 Ratte, homozygot; ci2+/- LEW-ci2 Ratte, heterozygot

4. Ergebnisse 82

4.4.2.4 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes

Reduzierte Antworten von Photorezeptorzellen des Auges auf einen Lichtreiz, die mittels

Elektroretinographie diagnostiziert werden, geben bereits sehr früh Hinweise auf

Erkrankungen der Netzhaut. In diesem Stadium sind in der Regel noch keine Veränderungen

am Augenhintergrund sichtbar. Diese treten oftmals erst zu einem Zeitpunkt auf, an dem das

ERG bereits erloschen oder dramatisch reduziert ist.

Aufgrund der sehr stark affektierten Potentiale von LEW-ci2 Ratten der TiHo-Einheit wurden

im Anschluß an die Vergleichsstudie histologische Untersuchungen von Augen durchgeführt.

Sie sollten aufklären, welche Strukturen der Retina wie stark betroffen waren. Zu diesem

Zweck wurden drei Augen je Genotyp und Haltungseinheit untersucht, insgesamt also 18. Die

Bulbi wurden sagital auf Höhe der Austrittsstelle der Nervenfasern geschnitten, so dass eine

Beurteilung des Sehnerven-Gewebes (Nervus opticus) möglich war. Außerdem bestand bei

dieser Schnittführung die Möglichkeit, die gesamte Pars optica retinae beginnend an der Ora

serrata bis hin zur Papilla optica (Blinder Fleck) zu untersuchen.

Es wurden alle Schichten der Retina sowie zusätzlich das Retinale Pigmentepithel und die

Fasern des Sehnerven beurteilt. Von Bedeutung waren dabei die Stärke der einzelnen

Schichten (Anzahl der Zelllagen), ihre Integrität sowie das Vorhandensein von Zellverlusten

und Veränderungen infektiöser oder entzündlicher Herkunft.

Während der Beurteilung der histologischen Schnitte wurde deutlich, dass die Ergebnisse der

elektroretinographischen Untersuchungen den pathophysiologischen Zustand der

begutachteten Retinae wiederspiegeln. Bei homo- und heterozygoten Tieren der TiHo-Einheit

konnte eine starke Reduktion der Photorezeptorzellschicht nachgewiesen werden. In drei

Fällen war sogar ein vollständiger Verlust dieser Schicht zu beobachten (Abb. 4.23). Die

äußere Körnerschicht zeigte ein ähnliches Bild. In den drei genannten Fällen gab es hier keine

durchgängige Zellschicht mehr, d.h. es waren nur noch vereinzelt Zellen zu finden (Abb.

4.23). Bei zwei Tieren war die Anzahl der Zelllagen im Vergleich zu den Kontrolltieren stark

reduziert (Abb. 4.22), bei einem weiteren erschien die Körnerschicht normal. Die äußere

plexiforme Schicht war bei den drei am stärksten betroffenen LEW-ci2 Tieren der TiHo-

Haltung ebenfalls affektiert, bei den übrigen Ratten jedoch nicht verändert. Die übrigen

Schichten der Retina (innere Körnerschicht, innere plexiforme Schicht, Ganglienzellschicht

und Nervenfaserschicht) zeigten keine Veränderungen (Abb. 4.22 und 4.23).

4. Ergebnisse 83

Abb. 4.23 Retina, 400fach LEW-ci2 Ratte, heterozygot, TiHo

Abb. 4.22 Retina, 400fach LEW-ci2 Ratte, homozygot, TiHo

Abb. 4.21 Retina, 400fach LEW-ci2 Ratte, heterozygot, MHH

Abb. 4.20 Retina, 400fach LEW, Kontrolle

Abb. 4.19 Ora serrata, 400fach LEW, Kontrolle

Abb. 4.19 - 4.23 H.E. gefärbte Schnitte derRetina. Angegeben sind Originalvergrößerung,Stamm und Haltungseinheit. Abb. 4.19 Über-gang zur Ora serrata, unbetroffene Kontrolle;Abb. 4.20 normale Retina eines Kontroll-tieres; Abb. 4.21 leicht verjüngte äußere Kör-nerschicht einer LEW-ci2 Ratte (MHH); Abb.4.22 und 4.23 stark affektierte Retinae vonLEW-ci2 Tieren (TiHo), vollständiger Verlustder Photorezeptorschicht, Abb. 4.22 Verlustder äußeren Körnerschicht und plexiformenSchicht; Abb. 4.23 Verjüngung bis auf 1Zelllage

4. Ergebnisse 84

Die Reduktion der einzelnen Schichten blieb über die gesamte Länge der Pars optica retinae,

die sich kurz vor der Ora serrata naturgemäß verjüngt (Abb. 4.19), konstant. Nur bei einer

einzigen, homozygoten LEW-ci2 Ratte konnten geringe Unterschiede im Ausmaß der

Veränderungen zwischen rechter und linker Seite festgestellt werden.

Starke Zellverluste innerhalb der äußeren Schichten der Retina, wie sie bei LEW-ci2 Tieren

der TiHo-Einheit nachgewiesen wurden, zeigten sich in den histologischen Schnitten der

LEW-ci2 Ratten der MHH nicht. Alle Schichten der Retina sowie das Retinale Pigmentepithel

waren vollkommen normal ausgebildet. Es wurde allerdings festgestellt, dass die

Photorezeptorzellschicht und äußere Körnerschicht bei diesen Tieren im Vergleich zur

Kontrollgruppe schmaler ausgeprägt waren (Abb. 4.20 und 4.21). Die äußere Körnerschicht

wies im Vergleich zu Kontrolltieren zentral etwa zwei (homozygot) bis drei (heterozygot)

Zelllagen weniger auf, peripher handelte es sich um eine Zelllage. Bei den restlichen

Zellschichten konnten keine Unterschiede nachgewiesen werden (Tab. 4.4).

Tab. 4.4 Auswertung der histologischen Schnitte von jeweils 3 Tieren pro Gruppe. Stamm/ Genotyp

Tier Photorez.- zellschicht

äußere K. -zentral-

äußere K. -peripher-

äußere plexif. Schicht

innere K. -zentral-

Restliche Schichten

1 +++ ++ +++ +++ ++ ++ 2 +++ +++ +++ +++ ++ ++

LEW (MHH) wildtyp 3 +++ +++ +++ +++ ++ ++

1 +++ ++ +++ +++ + ++ 2 +++ +++ +++ +++ ++ ++

LEW (TiHo) wildtyp 3 +++ +++ +++ +++ ++ ++

1 ++ ++ ++ +++ ++ ++ 2 +++ ++ ++ +++ ++ ++

LEW-ci2 (MHH) homozygot 3 ++ +++ ++ +++ ++ ++

1 ++ ++ ++ +++ ++ ++ 2 ++ ++ ++ +++ ++ ++

LEW-ci2 (MHH) heterozygot 3 +++ ++ ++ +++ ++ ++

1 li + 0 0 0 ++ ++ 1 re + + + +++ ++ ++

2 + + + 0 ++ ++

LEW-ci2 (TiHo) homozygot

3 0 0 0 + ++ ++ 1 0 0 0 0 ++ ++ 2 + ++ ++ +++ ++ ++

LEW-ci2 (TiHo) heterozygot 3 0 0 0 0 ++ ++

0 Schicht fast vollständig oder vollständig degeneriert; + Schicht stark verjüngt; ++ Schicht normal;

+++ Schicht stark; detailierte Angaben sind dem Kap. 3.8.3 zu entnehmen

4. Ergebnisse 85

Eine Abnahme des Durchmessers der gesamten Netzhaut ist bei allen Tieren auf einen Verlust

oder eine Verdünnung lediglich einzelner Schichten zurückzuführen. Das Retinale

Pigmentepithel und die beurteilbaren Reste des Sehnerven an der Austrittsstelle aus dem

Bulbus zeigten bei keinem der Tiere histologische Veränderungen.

4.4.2.5 Untersuchung von Umweltfaktoren

Alle in der Vergleichsstudie untersuchten LEW-ci2 Tiere stammten aus derselben Linie des

LEW/Ztm-ci2 Inzuchtstammes. Sie unterschieden sich einzig durch ihre Haltung an zwei

unterschiedlichen Standorten. Da bekannt ist, daß Umweltfaktoren an der Ausbildung

retinaler Störungen beteiligt sein können, wurden diese in beiden Haltungseinheiten

untersucht.

Hygienestatus

Zur Kontrolle des Hygienestatus der Tiere wurden Ratten beider Haltungseinheiten auf die in

den Richtlinien der FELASA gelisteten Erreger untersucht (Kap. 3.9.1).

Die Tiere der MHH-Einheit waren frei von Endo- und Ektoparasiten. In Kotproben von

Ratten der TiHo-Einheit konnten dagegen Erreger der Spezies Oxyura syphacia muris

nachgewiesen werden.

Bakterielle Pathogene, die bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung und der MHH-Haltung

nachgewiesen werden konnten, sind in Tab. 4.5 aufgelistet.

Tab. 4.5 Ergebnis der mikrobiologischen Untersuchung.

identifizierte Pathogene

Untersuchungsergebnis

MHH


TiHo

Staph. aureus positiv positiv

Pasteurella pneumotropica positiv positiv

Corynebacterium sp. positiv negativ

Helicobacter sp. positiv positiv

4. Ergebnisse 86

Entsprechend der mikrobiologischen und parasitologischen Analysen wurde die virologische

Untersuchung ebenfalls in Anlehnung an die Richtlinien der FELASA durchgeführt. Die

Tiere der TiHo-Einheit waren virologisch pathogenfrei, bei Ratten der MHH-Einheit konnten

Parvoviren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der virologischen Untersuchung sind der

Tabelle 4.6 zu entnehmen.

Tab. 4.6 Ergebnisse der virologischen Untersuchung.

Neben der Untersuchung auf die in Tab. 4.6 angegebenen Pathogene wurden drei Tiere der

TiHo-Haltung auf eine Infektion mit dem Erreger der Borna-Erkrankung (BDV) getestet.

Grund dafür waren Ähnlichkeiten im histologischen Bild der Retina bei betroffenen LEW-ci2

Ratten im Vergleich zu mit BDV-infizierten Tieren (NARAYAN et al., 1983; KACZA et al.,

2000; STAHL et al., 2003). Der Nachweis erregerspezifischer RNA des Borna-Disease Virus

erfolgte am Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. In den

Hirngewebe-Proben der drei untersuchten LEW-ci2-Ratten (TiHo) konnte keine BDV-

Nukleoprotein-spezifische RNA nachgewiesen werden.

überprüfte Pathogene


MHH


TiHo

Rat Parvo Virus (RPV) positiv negativ

Kilham Rat Virus (KRV) negativ negativ

Coronaviridae negativ negativ

Pneumonievirus der Maus (PMV) negativ negativ

Sendai-Virus negativ negativ

Reoviridae negativ negativ

Hantaanvirus negativ negativ

Mykoplasmen negativ negativ

4. Ergebnisse 87

Abb. 4.24 Gelelektrophorese zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein spezifischer RNA.

2%iges Agarosegel + 100 bp-DNA-Größenmarker. Taschen 0 und 19 Marker; Taschen 1-6

LEW-ci2; Taschen 7/8 Positivkontrolle; Tasche 9 Negativkontrolle (Wasser); Taschen 10-17

GAPDH (Housekeeping-Gen)

Untersuchung der Lichtstärke

Die Untersuchung der Lichtstärke erfolgte in verschiedenen Bereichen der Tierräume, wobei

Messungen im Aufenthaltsbereich der Tiere (Käfiginneres) im Vordergrund standen. Die

Spanne der Lichtintensitäten im Tierraum reichte in beiden Haltungseinheiten gleichermaßen

von 2 lx bis 465 lx (Tab. 10.4). An der Frontseite der Käfige wurden in der MHH-Haltung

Werte von 160 bis 200 lx aufgezeichnet, im Tierraum der TiHo waren die Lichtintensitäten an

diesem Standort mit 85 bis 196 lx vergleichbar groß.

Da dieser Raum durch zwei verschieden starke Lichquellen ausgeleuchtet wurde, differierten

die Messwerte zwischen dem Ständer mit den weiblichen Tieren und dem Ständer mit den

männlichen Tieren. Auf Seite der männlichen Ratten war die Lichtintensität in der Raummitte

halb so stark, im mittleren Bereich des Käfigs bis zu 38% geringer verglichen mit der

weiblichen Regalseite. Während im Aufenthaltsbereich männlicher Tiere in der TiHo-Haltung

zwischen 6 und 28 lx gemessen wurden, betrug die Lichtintensität in Käfigen weiblicher Tiere

in dieser Einheit bis zu 139 lx. Die Unterschiede zeigten sich um so ausgeprägter, je höher im

Käfigständer die Messungen durchgeführt wurden.

Der Tierraum der MHH-Haltung war im Gegensatz zur Haltung der TiHo gleichmäßig

ausgeleuchtet. Im Bereich der Käfigfront waren die Lichtintensitäten hier an allen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

200300

100

500

200300

100

500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

200300

100

500

200300

100

500

4. Ergebnisse 88

Messpunkten am höchsten, während diese im Aufenthaltsbereich der Tiere verglichen mit der

TiHo-Haltung jedoch an allen Messpunkten am niedrigsten waren. Es wurden im

Käfiginneren Lichtstärken von lediglich 2 bis 6 lx nachgewiesen.

Alle dokumentierten Lichtintensitäten im Aufenthaltsbereich der Tiere entsprachen den

Normwerten der GV-Solas (www.gv-solas.de/auss/hal/ratten-haltung.pdf).

Untersuchung der Haltungsbedingungen

Ein Vergleich der Haltungsbedingungen sowie der Ausstattung der Tierräume zeigte deutliche

Unterschiede zwischen beiden Haltungseinheiten. Beim Eintreten in den Tierbereich gab es

im Gegensatz zum Barrieresystem der MHH, in dem die Anwendung von Kittel, Mundschutz,

Kopfhaube und Überschuhen verpflichtend ist, in der TiHo-Haltung keine hygienischen

Vorschriften. Die Tiere waren in beiden Einheiten in Käfigen desselben Typs untergebracht.

In der MHH befanden sich die Käfige in Ständern mit festem Bodenblech, wogegen die

Käfige in der TiHo-Haltung in bodenlose Ständer eingehängt wurden. In der MHH-Haltung

wurden abhängig von Alter und Gewicht ein bis drei Tiere pro Käfig gehalten. In der TiHo

waren die Ratten dagegen in Einzelhaltung untergebracht. Zusätzlich wurden die Tiere hier

nach dem Geschlecht getrennt in zwei unterschiedlichen Ständern gehalten. In der MHH-

Haltung leuchtete eine einzelne Lichtquelle den Raum gleichmäßig aus, wogegen zwei

verschieden starke Lichtquellen den Tierraum der TiHo-Einheit ungleichmäßig ausleuchteten.

Außerdem gab es hier durch Radiomusik bedingte, stetige Hintergrundgeräusche.

4.4.3 Elektroretinographische Untersuchung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte

Durch die Unterschiede im Erscheinungsbild des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte in

verschiedenen Haltungssystemen stellte sich die Frage nach dem Einfluß von Umweltfaktoren

und dem Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Ausprägung des Krankheitsbildes.

Im Laufe der Studie eröffnete sich die Möglichkeit, Tiere eines Stammes mit einem der LEW-

ci2 Ratte ähnlichen Phänotyp zu untersuchen. Der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd

Auszuchtstamm trägt eine Mutation im Exon 3 des Myo7A. Dieses Gen gehört, ebenso wie

das bei der circling2 Ratte mutierte Myo15, zur Gruppe der unkonventionellen Myosine und

ist dem Myo15 strukturell und funktionell sehr ähnlich.

4. Ergebnisse 89

Zur Analyse des retinalen Phänotyps der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd (tornado) Ratte wurden

sieben heterozygote (Altersdurchschnitt: 432 Tage), sechs homozygote (Altersdurchschnitt:

422 Tage) und fünf wildtyp-Tiere (Altersdurchschnitt: 142 Tage) dieses Stammes

elektrophysiologisch untersucht. Die Ableitung der Potentialschwankungen erfolgte unter

dunkeladaptierten (skotopischen) sowie unter helladaptierten (photopischen) Bedingungen.

Die Messwerte einer jeden Gruppe (homozygot, heterozygot, Kontrolle) wurden gemittelt und

vergleichend in den Abb. 4.26 bis 4.33 für drei bzw. zwei verschiedene Stufen

(Lichtintensitäten) graphisch dargestellt.

In allen Abbildungen wird deutlich, daß sich die Potentiale homozygoter und heterozygoter

Tiere nicht unterschieden. Ein signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Genotypen

wurde lediglich für die b-Welle der photopischen Ableitung und ausschließlich am rechten

Auge ermittelt. Im Gegensatz dazu waren im Vergleich zu Kontrolltieren Unterschiede

erkennbar. Die Abb. 4.26 und 4.27 zeigen die im skotopischen ERG gemessenen Potentiale

der a-Welle für das linke und rechte Auge. Bei einer niedrigen Lichtintensiät (0,01 cds/m2)

lagen die Werte aller Gruppen gleichermaßen zwischen 20 und 25 µV. Erst mit steigender

Lichtstärke wird der Unterschied zwischen den Messwerten der Kontrolltiere im Vergleich zu

den Antworten der homozygoten und heterozygoten Tiere deutlicher. Bei 3 cds/m2 bewegten

sich die Potentiale noch zwischen 70 und 115 µV. Signifikante Unterschiede zeigen sich dann

bei einer Lichtstärke von 30 cds/m2. In dieser Stufe wiesen homo- und heterozygoten Tiere

Werte zwischen 40 und 50 µV auf, während die Potentiale bei den Kontrolltiere mit 75 bis 90

µV beinahe doppelt so groß waren. Die Messergebnisse differierten zwischen linkem und

rechtem Auge nur geringgradig.

Eine ähnliche Aussage über die Tendenz zu höheren Potentialen bei Kontrolltieren verglichen

mit homo- und heterozygoten Tieren ist auch den Abb. 4.28 und 4.29 zu entnehmen. Diese

zeigen die Mittelwerte der b-Welle gemessen unter dunkeladaptierten Bedingungen. Auch in

diesem Fall waren die Unterschiede erst bei höchster Lichtstärke signifikant (30 cds/m2). So

lagen die Werte bei homozygoten und heterozygoten Tieren im Mittel um 120 bis 170 µV,

während die Potentiale der Kontrollgruppe 230 bis 260 µV betrugen.

Interessanterweise sind diese für das skotopische ERG typischen Differenzen zur

Kontrollgruppe im photopischen ERG nicht nachweisbar.

Die a-Wellen des Hell-ERGs, die in den Abb. 4.30 und 4.31 dargestellt sind, zeigten auch

innerhalb der einzelnen Gruppen größere Schwankungen. Bei einer Lichtintensität von 3

cds/m2 gemessene Potentiale bewegten sich in allen Gruppen zwischen 8 und 10 µV. Die

Antworten der Kontrollgruppe waren in dieser Stufe etwas höher (13 µV), zeigten aber keine

4. Ergebnisse 90

Signifikanz zu den anderen Gruppen. Bei höchster Lichtstärke stiegen die Messdaten aller

Gruppen gleichmäßig auf 9 bis 13 µV an.

Die starken, gruppeninternen Schwankungen der a-Wellen lassen sich in den b-Werten des

photopischen ERGs, die in den Abb. 4.32 und 4.33 dargestellt sind, nicht wiederfinden. Die

Messdaten der Stufe mit der niedrigsten Lichtintensität unterschieden sich zwischen den

Gruppen nicht und lagen bei etwa 50 µV. Bei einer Lichtstärke von 100 cds/m2 wurden bei

homo- und heterozygoten Ratten Potentiale von 60 bis 100 µV abgeleitet, bei Kontrolltieren

waren es etwa 110 µV. Aufgrund eines sehr niedrigen Mittelwertes der Gruppe homozygoter

Tiere (60 µV) konnten innerhalb dieser Stufe signifikante Unterschiede zu heterozygoten (90

µV) und Kontroll-Tieren (110 µV) festgestellt werden. Diese Aussage bezieht sich allerdings

nur auf das rechte Auge.

In der Abb. 4.34 sind die Mittelwerte der Latenzzeiten (b-Welle, skotop. ERG) vergleichend

für die verschiedenen Genotypen dargestellt. Die Darstellung ist exemplarisch für a- und b-

Wellen des skotopischen und photopischen ERGs, da es in keinem Fall Unterschiede,

signifikant oder tendenziell, zwischen den Genotypen gab.

4. Ergebnisse 91

Abb. 4.25 Legende für Abb. 4.26 bis 4.34

Abb. 4.26 Skotopisches ERG, a-Welle, rechtes Auge.

Abb. 4.27 Skotopisches ERG, a-Welle, linkes Auge.

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20

50

100

150

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m2 0

25

50

75

100

125

WIST-Myo7Atnd homozygot WIST-Myo7Atnd heterozygot WIST Kontrolle

µV µV

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m2 0

50

100150200

250300350400450

Abb. 4.28 Skotopisches ERG, b-Welle, rechtes Auge.

Abb. 4.29 Skotopisches ERG, b-Welle, linkes Auge.

µV

0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20

100

200

300

400

µV

350

250

150

50

450

4. Ergebnisse 92


50

100

150


10

20

Abb. 4.30 Photopisches ERG, a-Welle, rechtes Auge.


10

20

Abb. 4.31 Photopisches ERG, a-Welle, linkes Auge.


50

100

150

Abb. 4.32 Photopisches ERG, b-Welle, rechtes Auge.

Abb. 4.33 Photopisches ERG, b-Welle, linkes Auge.

µV µV

µV µV

0

10

20

30

40

0,01 cds/m2 0,03 cds/m2 0,3 cds/m2 3 cds/m2 10 cds/m2 30 cds/m2

ms

Abb. 4.34 Latenzzeiten. Dargestellt sind die Mittelwerte der a-Wellen der linken Augen auf-

gezeichnet während des skotopischen ERGs vergleichend zwischen den Genotypen.

5. Diskussion 93

5 Diskussion

5.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte - Phänotyp und Tiermodell

Die LEW-ci2 Ratte ist gekennzeichnet durch neurosensorische Taubheit und Bewegungs-

störungen vestibulären Ursprungs, die auf eine Degeneration bzw. Deformation des

sensorischen Epithels im Innenohr zurückgehen.

Das für diesen Inzuchtstamm charakteristische Rotationsverhalten (circling) weist

Ähnlichkeiten zum Phänotyp des induzierten Ungerstedt-Modells auf, welches als ein

geeignetes Tiermodell für den Morbus Parkinson, die häufigste Basalganglienerkrankung des

Menschen, gilt. Trotz pharmakologischer und neurochemischer Gemeinsamkeiten konnte ein

Modellcharakter der LEW-ci2 Ratte für diese Erkrankung jedoch nicht bestätigt werden, da

bei der Mutante im Unterschied zur Symptomatik der Parkinson-Krankheit eine bilaterale

Asymmetrie in der Anzahl dopaminerger Neurone im SNC und in der Dichte der

dopaminergen Terminalen im Striatum nicht nachweisbar sind (RICHTER et al., 1999).

Darüber hinaus stellt der Morbus Parkinson eine hypokinetische Erkrankung dar, wogegen die

LEW-ci2 Ratte ein hyperaktives Verhalten aufweist. Aus diesem Grund wurde die LEW-ci2

Ratte 1999 von RICHTER et al. sowie 2000 von FEDROWITZ et al. als Tiermodell für

hyperkinetische Bewegungsstörungen vorgeschlagen.

Funktionelle Tests sowie histologische Untersuchungen des Innenohres betroffener Tiere

zeigten einen nahezu vollständigen Verlust des sensorischen Epithels in der Cochlea, der die

Taubheit verursacht. Zusätzlich weisen vestibuläre Haarzellen Protrusionen und verkürzte

Stereozilien auf (KAISER et al., 2001). Aufgrund dieser Ergebnisse wird die LEW-ci2 Ratte

seither als Tiermodell für neurosensorische Taubheitsformen des Menschen eingeordnet.

Molekulargenetische Studien zur Kartierung der ci2-Mutation und Verhaltensuntersuchungen

bei LEW-ci2 Ratten gaben erste Hinweise auf eine mögliche Beteiligung des visuellen

Systems am Phänotyp der LEW-ci2 Ratte (CHWALISZ, 2003). Funktionelle und

histologische Analysen einiger Tiere deuteten auf ein eingeschränktes Sehvermögen,

verursacht durch Degenerationen am Augenhintergrund, hin (KAMINO, pers. Komm.;

GOCKELN et al., 2003).

5. Diskussion 94

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, durch eine weiterführende funktionelle und

genetische Charakterisierung der LEW-ci2 Ratte den Modellcharakter dieser Mutante für die

biomedizinische Forschung zu konkretisieren.

5.2 Genetische Untersuchungen

5.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene

In einer vorangegangenen Studie wurde eine Kopplungsanalyse an einer segregierenden BN-

Rückkreuzungspopulation ([LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm]F1 x LEW/Ztm-ci2) vorgenommen, um

die Suszeptibilitätsregion aufzufinden, die für den veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte

verantwortlich ist. In der eingegrenzten Region gelegene Gene wurden auf ihre Lage im

humanen Genom und auf ihre Funktion geprüft. Dabei konnten zwei geeignete Kandidaten

isoliert werden, das Myo15 und das Kcnj12 (CHWALISZ et al., 2003).

Beide Kandidatengene wurden vollständig sequenziert. Der Abgleich der gewonnenen Daten

mit einer Referenzsequenz, die der Ensembl-Datenbank entstammte, führte zur Detektion

eines Basenaustausches im Myo15-Gen. Es handelt sich um eine Punktmutation mit einer

Substitution der Basen Zytosin und Thymin. Das Myo15-Gen kodiert für das Myosin XV, das

der Gruppe der unkonventionellen Myosine angehört. Diese Proteine, die an verschiedenen

Funktionen innerhalb des Zellstoffwechsels beteiligt sind, besitzen eine ähnliche Struktur. Die

N-terminale Motordomäne ist hochkonserviert und wahrscheinlich für gemeinsame

Funktionen der Myosine wie die Regulation intrazellulärer Transportvorgänge verantwortlich,

wogegen die funktionelle Spezifität der einzelnen Proteine vermutlich über die variable

Schwanzregion mit ihren unterschiedlichen Domänen erlangt wird (TUXWORTH und

TITUS, 2000).

Mutationen in unkonventionellen Myosinen, die sowohl in der Motordomäne als auch in der

Schwanzregion vorkommen (Abb. 5.1), führen beim Menschen einerseits zu nicht-

syndromaler Taubheit (Myosin VI, VII, XV), andererseits zu einer mit Taubheit

einhergehenden, syndromalen Erkrankung (Myosin VIIa), dem humanen Usher Syndrom

(LIBURD et al., 2001; AHMED et al., 2003). Daneben sind eine Reihe von Tiermodellen

beschrieben, die Mutationen in unkonventionellen Myosinen aufweisen (siehe auch Kap.

2.2.3), wie die Snell´s waltzer Maus (Myosin VI), die shaker 1 Maus oder die tornado Ratte

5. Diskussion 95

(Myosin VIIa). Interessanterweise sind die Phänotypen dieser Stämme sehr ähnlich, obwohl

es sich teilweise um verschiedene Klassen von Myosinen handelt und unterschiedliche

Regionen der Proteine betroffen sind. Auch die Art der Mutation (Deletion, Punktmutation

mit oder ohne Zerstörung des Leserahmens) hat offenbar keinen Einfluss (siehe auch Kap.

2.2.3).

Neben der LEW-ci2 Ratte sind bereits Mausmodelle mit Mutationen im Myosin XV bekannt.

Die shaker 2 Maus trägt eine Mutation in der Motordomäne, die shaker 2-J Maus weist

dagegen eine umfangreiche Deletion am C-terminalen Ende des Proteins auf (Abb. 5.1).

Obwohl die Mutationen funktionell unterschiedliche Bereiche des Myosin XV betreffen, sind

die Phänotypen beider Stämme nicht zu unterscheiden und zeigen große Übereinstimmungen

mit der LEW-ci2 Ratte (siehe auch Kap. 2.2.3). Diese Tatsache deutet darauf hin, dass sowohl

die Motordomäne als auch die Schwanzregion für die regelrechte Funktion dieses Proteins

von unerläßlicher Bedeutung sind.

Abb. 5.1 Schematische Darstellung der Struktur des Myosin XV. Zusätzlich angegeben sind die

bekannten Mutationen im Myosin XV des Menschen (unterhalb der Zeichnung) und in Tiermodellen

(oberhalb der Zeichnung). (modifiziert nach LIBURD et al., 2001)

Die in der LEW-ci2 Ratte detektierte Mutation befindet sich in der C-terminalen MyTH4-

Region des Myosin XV (Abb. 5.1), einer Domäne, über deren Struktur und Funktion bis heute

wenig bekannt ist. MyTH4-Domänen gibt es auch in den Schwanzregionen anderer Myosine

wie Myosin VIIA, IX und XII, doch auch dort ist ihre Bedeutung bisher ungeklärt. Das

Myosin XV besitzt zwei MyTH4-Domänen. Während die ci2-Mutation die C-terminale

Domäne betrifft, sind Mutationen beim Menschen bisher ausschließlich in der N-terminalen

MyTH4-Region bekannt (Abb. 5.1).

Myosinkopf N CMyTH4 FERM FERM MyTH4 SH3IQ IQ

Q1229X

IVS4+IG>T

G1358S

sh2 C1779Y

N2111Y

I2113F

T2205IK2601X

Q2716H

sh2J

Deletion

ci2 L3157P

5. Diskussion 96

Die Domänen der Myosin-Schwanzregion enthalten spezielle Bereiche, die für Protein-

Protein-Interaktionen verantwortlich sind. Die C-terminale MyTH4-Domäne des Myosin XV

bildet zu diesem Zweck einen funktionellen Komplex mit der benachbarten SH3-Domäne

sowie mit der nachfolgenden FERM-Domäne (DELPRAT et al., 2005). Unter anderem über

diese Komplexe interagiert das Myosin XV mit dem Protein `Whirlin´ (DELPRAT et al.,

2005; BELYANTSEVA et al., 2005), das an der Entstehung der neurosensorischen

Taubheitsform DFNB31 beim Menschen beteiligt ist (MBURU et al., 2003).

BELYANTSEVA et al. (2005) fanden heraus, dass das Myosin XV für den Transport des

Whirlin zu den Stereozilienspitzen der Innenohrhaarzellen verantworlich ist.

Die Punktmutation in der Basensequenz der LEW-ci2 Ratte verursacht einen Austausch der

Aminosäure Leuzin gegen Prolin in der C-terminalen MyTH4-Domäne des betroffenen

Proteins. Computergestützte Analysen der Myosin XV-Aminosäuresequenz legten nahe, dass

das Protein in dieser Region in helikaler Form vorliegt (TSIAVALIARIS, pers. Komm.). Da

Prolinsubstitutionen im Zusammenhang mit strukturellen Veränderungen der betroffenen

Proteine stehen, könnte die Helixstruktur in diesem Bereich aufgelöst sein. Möglicherweise

führen die veränderten Faltungseigenschaften des Proteins zu einem Funktionsverlust der

MyTH4-Domäne und der benachbarten Regionen. Dies hätte zur Folge, dass das mutierte

Myosin XV der LEW-ci2 Ratte das Whirlin nicht oder nicht regelrecht binden kann, so dass

ein Transport dieses Proteins zu den Spitzen der Haarzellstereozilien im Innenohr unterbleibt.

Vergleichbar dazu wurde bereits bei shaker 2 Mäusen, die ebenfalls ein defektes Myosin XV

aufweisen, eine Abwesenheit von Whirlin im Bereich der Stereozilienspitzen nachgewiesen

(KIKKAWA et al., 2005).

Die Interaktion von Whirlin und Myosin XV wurde von BELYANTSEVA et al. (2005) als

Schlüsselevent in der Morphogenese der Haarzellstereozilien bezeichnet. Der Transport von

Whirlin zu den Stereozilienspitzen ist offenbar unerlässlich für eine programmierte

Stereozilienelongation (BELYANTSEVA et al., 2005). Die Myosin XV-Whirlin-Interaktion

ist eine Erklärung dafür, dass die Symptomatik der LEW-ci2 Ratte dem Phänotyp der whirler

Maus sehr ähnlich ist. Allerdings ist das histologische Bild im Innenohr nicht vollkommen

identisch. Die Ursache dafür könnte im Einfluß weiterer Bindungspartner beider Proteine

liegen. Es ist bekannt, dass das Whirlin im Innenohr neben dem Myosin XV mit einer Reihe

weiterer Proteine interagiert. Dabei stellt sich die Frage, welche Auswirkungen eine gestörte

Funktion des mutierten Myosin XV auf die Bindungspartner des Whirlin sowie auf deren

Funktion hat. So konnte kürzlich gezeigt werden, dass ein membran-assoziiertes Protein und

5. Diskussion 97

dessen Interaktionspartner, für deren Lokalisation in den Stereozilien das Whirlin offenbar

notwendig ist, bei Myo15 Mausmutanten im Bereich der Stereozilienspitzen nicht

nachweisbar waren (MBURU et al., 2006).

Die Auswirkung der Mutation im Myosin XV bei der LEW-ci2 Ratte kann in ihrem gesamten

Umfang noch nicht abgeschätzt werden, da die Erforschung der Interaktionen mit anderen

Proteinen noch in den Anfängen steckt. Zwar ist das Whirlin bisher die einzige, bekannte

Ladung (Cargo) des Myosin XV, die MyTH4-Domäne und die benachbarten Bereiche des

Proteins bieten aber möglicherweise weitere Bindungsstellen für Protein-Protein-

Interaktionen.

Eine Interaktion von Whirlin und Myosin XV ist bis heute ausschließlich in Haarzellen des

Innenohrs nachgewiesen (MBURU et al., 2006). Es ist allerdings bekannt, dass Whirlin nicht

nur im Ohr exprimiert wird, sondern auch eine wichtige Funktion in der Netzhaut des Auges

besitzt, wo dem Protein eine Rolle bei der Organisation der Synapsen oder der synaptischen

Vesikeltransmission in Photorezeptorzellen nachgesagt wird (VAN WIJK et al., 2006).

Da es jedoch bisher keine Untersuchungen zur Expression von Myosin XV in der Retina gab,

ist nicht sicher, ob das Protein in diesem Gewebe ebenfalls als Interaktionspartner bzw.

Transporter des Whirlin fungiert. Allerdings handelt es sich bei der Retina wie bei den

Haarzellen des Innenohres um sensorisches Gewebe, das zudem auch Stereozilien-ähnliche

Ausläufer aufweist, die Zilien der Photorezeptorzellen. Daher ist eine Interaktion zwischen

den Proteinen auch in der Netzhaut denkbar.

Weiterhin ist für andere unkonventionelle Myosine eine funktionelle Bedeutung in der

Netzhaut des Auges bereits beschrieben worden (WEIL et al., 1995; LIBBY et al., 2004). Das

Myosin VIIa beispielsweise, das im Zusammenhang mit syndromaler Blindheit beim

Menschen steht, ist vermutlich am Transport von Melanozyten im Retinalen Pigmentepithel

beteiligt (LIU et al., 1998; SMITS et al., 2005). Interessanterweise fanden LLOYD et al.

(2001) Hinweise darauf, dass auch das Myosin XV eine Rolle bei der Bewegung bzw.

Ausschüttung von sekretorischer Granula spielen könnte.

Sowohl das Whirlin als auch das Myosin VIIa sind Teil eines makromolekularen Komplexes,

der in Haarzellen des Innenohres und in der Netzhaut des Auges auf ähnliche Weise agiert

(VAN WIJK et al., 2006). In diesem membrangebundenen, supramolekularen Netzwerk sind

alle bisher bekannten Proteine verbunden, die an der Pathogenese des humanen Usher

Syndroms beteiligt sind (Abb. 5.2). Aus diesem Grund wird der Komplex auch als Usher

5. Diskussion 98

Protein Interaktom bezeichnet (VAN WIJK et al., 2006; KREMER et al., 2006). Eine

Unterbrechung des Netzwerkes führt zu neurosensorischen Degenerationen in Retina und

Cochlea, wie sie beim Usher Syndrom beschrieben werden (Reiners et al., 2006). Über die

Funktionsweise des Usher Protein Interaktoms und die Wechselwirkung der Proteine

untereinander ist bisher wenig bekannt.

Abb. 5.2 Usher Protein Interaktom. Schematische Darstellung der bisher

identifizierten Komponenten und ihrer Interaktionen im Usher Protein

Netzwerk. Myosin XV ist als Bindungspartner von Whirlin beigefügt. (modifiziert nach VAN WIJK et al., 2006; KREMER et al., 2006)

Das Whirlin, das eine zentrale Rolle innerhalb dieses Komplexes spielt, war bislang allerdings

nur im Zusammenhang mit nicht-syndromaler Taubheit beim Menschen (DFNB31) und bei

der whirler Mausmutante bekannt. Erst vor kurzem konnten EBERMANN et al. (2006) eine

Beteiligung des Proteins am humanen Usher Syndrom nachweisen.

Durch die Interaktion mit dem Whirlin besteht eine Verbindung des Myosin XV zu dem

Usher Protein Interaktom. Es existieren zwei verschiedene Bindungsmöglichkeiten des

Proteins an das Whirlin. Die Interaktion mit dem C-terminalen Bereich, der in allen Whirlin-

Isoformen vorkommt, ist wahrscheinlich an die Transportfunktion des Myosin XV in

Makromolekularer Komplex

Protocadherin

Cadherin

USH2A isoform

VLGR1b

Harmonin

Myosin VIIa

Whirlin

Myosin XV

INTRAZELLULÄR EXTRAZELLULÄR

SANS

5. Diskussion 99

Haarzellen des Innenohrs geknüpft. In dieser Region waren auch die bisher entdeckten

Mutationen des Whirlin lokalisiert, die zu nicht-syndromaler Taubheit führten. Die neue, bei

einem Usher-Patienten entdeckte Mutation schädigt das Protein jedoch im N-terminalen

Abschnitt, einer Region, in der sich die Bindungsstellen für die im Usher Protein Netzwerk

organisierten Interaktionspartner, aber auch eine weitere Bindungsstelle für das Myosin XV

befindet (EBERMANN et al., 2006). Es wäre möglich, dass das Myosin XV über die

Interaktion mit dieser Region bisher unbekannte Funktionen übernimmt, die im

Zusammenhang mit den Aufgaben des Usher Interaktoms sowohl im Innenohr als auch im

Auge stehen.

Eine gestörte Whirlin - Myosin XV Interaktion, wie sie vermutlich in der LEW-ci2 Ratte

vorkommt, könnte also neben den bekannten Defekten im Innenohr auch Auswirkungen auf

die Funktionsfähigkeit des Auges haben. Im Gegensatz zu diesem Tiermodell gibt es bisher

jedoch keine Hinweise auf einen visuellen Phänotyp bei humanen Myo15-Mutationen bzw.

bei shaker 2 Mäusen.

5.3 Funktionelle Untersuchungen

5.3.1 Real Time PCR

Im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Northern Blot Analyse zur funktionellen Untersuchung

des Kandidatengens Myo15 durchgeführt, die auf Expressionsunterschiede zwischen den

Genotypen der LEW-ci2 Ratte sowie zwischen LEW-ci2 Ratten und Tieren des coisogenen

Hintergrundstammes LEW hindeutete (CHWALISZ, pers. Komm.). Diese Ergebnisse

erschienen jedoch im Hinblick auf die durch Sequenzierungen identifizierte Punktmutation

zweifelhaft. Eine Erklärung für die widersprüchlichen Ergebnisse des Blots könnte die Lage

der Sonden sein, die in den ersten drei Exons im Bereich der Motordomäne lokalisiert

wurden. Dieser Bereich weist große Homologien zwischen den Genen unkonventioneller

Myosine der verschiedenen Klassen auf, was zu Wechselwirkungen bzw. Kreuzreaktionen

während der Detektionsphase im Blot geführt haben könnte. Aus diesem Grund sollte im

Rahmen dieser Arbeit die Expressionsanalyse des bei der LEW-ci2 Ratte mutierten Gens

mithilfe einer spezifischen Sonde und mithilfe einer sensitiveren Methode wiederholt werden.

5. Diskussion 100

Für die Sonde wurde eine Sequenz im C-terminalen Abschnitt der variablen Schwanzregion

des Myo15 erstellt. Diese wurde mit den Gensequenzen aller unkonventioneller Myosine

abgeglichen, um Wechselwirkungen bzw. Kreuzreaktionen auszuschließen und eine sichere

Detektion des Myo15 zu ermöglichen. Für die Studie wurde die quantitative RT-PCR (Real

Time-PCR) gewählt, um die Expression der mRNA von homozygoten und heterozygoten

LEW-ci2 Ratten sowie von Kontrolltieren im Vergleich zu einem endogenen, konstant

exprimierten Gen (Housekeeping-Gen) zu untersuchen.

Die für die Analyse benötigte RNA wurde aus Hypophysengewebe gewonnen, da eine

Isolation von Myo15-RNA aus dem phänotypisch betroffenen Innenohr äußerst schwierig ist.

Die Ursache besteht darin, dass die Expression des Gens in diesem Gewebe auf nur wenige

Zellen in Bereichen der sich entwickelnden cochleären Haarzellen und in oberen epithelialen

Schichten der Macula sacculi beschränkt bleibt (LIANG et al., 1999). Aufgrund der starken

Myo15-Expression im Hypophysengewebe ist dieses Organ für eine Isolation von RNA für

die Expressionsanalysen besonders geeignet (LIANG et al., 1999). Bei Mäusen konnte eine

Expression von Myo15 zwar in einer Reihe weiterer Organe bzw. Gewebe wie Lunge, Gehirn,

Niere, Magen, Dünndarm, Pankreasinseln usw. nachgewiesen werden, relativ zur Expression

in der Hypophyse war sie dort jedoch ausgesprochen niedrig (LIANG et al., 1999; LLOYD et

al., 2001). Die hohe Expression von Myo15 in der anterioren Hypophyse ist überraschend, da

für betroffene Menschen bzw. Tiere kein offensichtlicher Hypophysen-bedingter Phänotyp

bekannt ist (LIANG et al., 1999; LLOYD et al., 2001).

Der Vergleich der Myo15-Expression ergab, wie vermutet, keine Unterschiede zwischen

LEW-ci2 Ratten und den Kontrollen des Hintergrundstammes sowie den DA-Ratten. Die

phänotypischen Auswirkungen der Mutation bei LEW-ci2 Tieren können also nicht auf

Expressionsdefizite des Myo15-Gens zurückgeführt werden. Aus diesem Grund wurde eine

fehlerhafte Proteinexpression mit Einschränkung der Myosin XV-Funktion angenommen.

5.2.2 Proteinanalytik

Die computergestützte Übersetzung der die ci2-Mutation enthaltenden Nukleotidsequenz

sollte die Auswirkungen der Punktmutation auf die Aminosäuresequenz aufklären. Es zeigte

sich, dass die Basensubstitution einen Austausch der Aminosäure Leuzin in Prolin verursacht.

Um eine Vorhersage über mögliche Effekte auf das Protein treffen zu können, wurde die

Mutation mit den Programmen SIFT und PolyPhen geprüft (siehe auch Kap. 4.2.1). Beide

5. Diskussion 101

Programme prognostizierten eine strukturelle und funktionelle Schädigung des Myosin XV

(SMITS und MALIK, pers. Komm.).

Mit Hilfe dieser Studie sollten die genauen strukturellen Veränderungen bzw. Änderungen der

Faltungseigenschaften des Proteins mittels Kristallographie aufgeklärt werden.

Neben der strukturellen Untersuchung des mutierten Myosin XV einer LEW-ci2 Ratte sollte

für eine vergleichende Betrachtung zusätzlich das Protein des Hintergrundstammes als

Referenz analysiert werden, da bisher Informationen zur regulären Struktur und zu

physiologischen Faltungseigenschaften des Myosin XV fehlen.

Die für eine kristallographische Analyse notwendige Menge des hochreinen Proteins sollte in

Kolonien des Schleimpilzes Dictyostelium discoideum produziert werden. Dieser Einzeller

wird häufig in der Erforschung von konventionellen aber auch von unkonventionellen

Myosinen eingesetzt (MANSTEIN, 1993; SCHLEICHER und EICHENER, 1998).

Da es sich bei dem Myosin XV in seiner Gesamtheit um ein sehr großes Protein handelt,

wurde lediglich der mutationstragende Bereich einschließlich der C-terminalen MyTH4-

Domäne kloniert. Diese Region ist vor allem aufgrund der bekannten Bindungscharakteristik

an das Protein Whirlin sowie im Hinblick auf die kürzlich beschriebene Verbindung zum

Usher Protein Interaktom von besonderer Bedeutung (siehe Kap. 5.2.1).

Das hochreine Myosin XV-Protein sollte jedoch nicht nur für die Analyse der Proteinstruktur

verwendet werden, sondern auch der Entwicklung eines Ratten-Myosin XV spezifischen

Antikörpers dienen. Dieser sollte zur Untersuchung der Myosin XV-Expression am

Rattenauge genutzt werden, da aufgrund der Interaktion von Myosin XV mit Whirlin und der

damit erkennbaren Nähe des Proteins zum Usher Komplex die Vermutung nahe liegt, dass das

Myosin XV Funktionen in diesem Gewebe übernimmt, die bisher unbekannt sind.

Trotz einer großen Anzahl von getesteten D. discoideum-Klonen, die die mutierte Sequenz

des LEW-ci2 Stammes enthielten, konnte keine Expression von Myosin XV in diesen Zellen

detektiert werden. Es ist bekannt, dass in der Myosinforschung bei nur etwa 50 % der

Klonierungen eine Expression nachgewiesen werden kann, die sich für eine Aufreinigung und

Analyse des Proteins eignet. Eine fehlende Expression wird jedoch nur in einer geringen

Anzahl von Fällen, nämlich in etwa 10 (-20) % der Versuche, gesehen (TSIAVALIARIS,

2002). Im Gegensatz dazu konnte in Klonen mit der Sequenz des Hintergrundstammes LEW

eine Expressionsbande nachgewiesen werden, die der gesuchten Größe des Fragmentes

entsprach. Es ist deshalb nicht auszuschließen, dass auch in Klonen mit der Sequenz der

5. Diskussion 102

LEW-ci2 Ratten eine Expression vorlag. Auch in diesem Fall wäre eine Aufreinigung des

Proteins mit anschließender Strukturanalyse sowie die Entwicklung eines Antikörpers

aufgrund der entschieden zu geringen Expression nicht möglich gewesen.

5.4 Pathophysiologische Untersuchungen

5.4.1 Elektrophysiologische Voruntersuchungen

Im Anschluß an die Entdeckung des Myo15 als Kandidatengen für den veränderten Phänotyp

der LEW-ci2 Ratte und aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit des Myosin XV-Proteins zu

dem in das Usher Syndrom involvierten Myosin VIIa wurde eine Verhaltensstudie zur

Überprüfung der Sehfähigkeit bei LEW-ci2 Ratten durchgeführt. Diese ergab erste Hinweise

auf eine Einschränkung des Visus bei Tieren dieses Stammes. Um die Ergebnisse zu

verifizieren, wurden stichprobenweise LEW-ci2 Ratten unterschiedlichen Alters und

Geschlechts elektrophysiologisch untersucht. Das Verfahren der Elektroretinographie (ERG)

ermöglicht es, die Funktionsfähigkeit der Photorezeptorzellen zu überprüfen, welche in der

Netzhaut für die Umsetzung von Lichtreizen in elektrische Signale verantwortlich sind (Kap.

2.6.2) .

Die LEW-ci2 Tiere entstammten zwei verschiedenen Haltungseinheiten, die sich in

unterschiedlichen Instituten befanden. Interessanterweise lieferten die

elektroretinographischen Untersuchungen dieser zwei Tiergruppen stark differierende

Resultate. Während LEW-ci2 Ratten der MHH-Tierhaltung im Vergleich zu ebenfalls

untersuchten Tieren des coisogenen Kontrollstammes LEW keine Auffälligkeiten im ERG

zeigten, gab es nur bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung deutliche Hinweise auf ein

eingeschränktes Sehvermögen (Kap. 4.4.1).

5. Diskussion 103


und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie

Aufgrund der genetischen Identität der im Vorfeld untersuchten Tiere, die aus demselben

Zuchtbestand stammten, musste eine zusätzliche Mutation als Ursache für die

Augensymptomatik bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung ausgeschlossen werden.

Da Tiere des einen Standortes grundsätzlich unbetroffen waren, während alle LEW-ci2 Ratten

der anderen Haltung einen Phänotypen aufwiesen, wurde zuerst nach generellen

Unterschieden zwischen den zwei verschiedenen Tiergruppen gesucht. Dazu diente einerseits

der Vergleich der Körpergewichte von LEW-ci2 Ratten sowie von Kontrolltieren beider

Haltungen. Andererseits wurde das Verhaltens der LEW-ci2 Tiere beider Standorte

miteinander verglichen, um Hinweise auf Unterschiede zwischen den Gruppen zu erhalten.

Im Anschluss an die Charakterisierung des retinalen Phänotyps mittels Elektroretinographie

und histologischer Untersuchung der Netzhaut sollten speziell die Haltungsbedingungen der

beiden Tiergruppen gegenübergestellt werden. Dabei wurden vor allem solche Faktoren genau

überprüft, die für Störungen des Visus verantwortlich sein könnten. Die Ergebnisse sollten

Hinweise darauf geben, ob Unterschiede in der Umwelt der Tiere bestanden und ob

bestimmte Faktoren eine Einfluß auf die Ausprägung der Augensymptomatik von LEW-ci2

Ratten der TiHo-Haltung gehabt haben könnten.

5.4.2.1 Tiergruppen

Wie bereits erwähnt stammten die zu untersuchenden LEW-ci2 Ratten aus zwei

unterschiedlichen Haltungssystemen (MHH-Haltung und TiHo-Haltung). Für die Studie

wurden je eine Gruppe homozygoter, heterozygoter und coisogener Kontrolltiere pro

Haltungseinheit zusammengestellt. Jede Gruppe bestand aus sieben Tieren und wies eine

gleichmäßige Geschlechterverteilung auf.

Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass ein deutlicher Augenphänotyp bei LEW-ci2 Ratten

der TiHo-Haltung erst bei Tieren mit fortgeschrittenen Alter erkennbar war. Aus diesem

Grund wurden für die Studie ausschließlich Tiere mit einem Alter von über 400 Tagen

ausgewählt. Unterschiede bestanden zwischen den Altersmittelwerte der einzelnen Gruppen

(Tab. 5.1), da aufgrund der eingeschränkten Reproduktionsleistung der LEW-ci2 Ratten,

bedingt durch Hyperaktivität und Rotationsverhalten, ein genaues timing der Tiere zum

Versuchsbeginn nicht möglich war. Außerdem konnte die kooperierende Arbeitsgruppe nur

5. Diskussion 104

eine kleine Population alternder LEW-ci2 Ratten mit teilweise weit fortgeschrittenem

Lebensalter zur Verfügung stellen.

Tab. 5.1 Altersdurchschnitt der Tiergruppen aus der Vergleichsstudie.

Tiergruppe

Durchschnittliches Alter zum

Zeitpunkt der Untersuchung

LEW (MHH) - Kontrolle 480 d

LEW-ci2 / homozygot (MHH) 540 d

LEW-ci2 / heterozygot (MHH) 540 d

LEW (TiHo) - Kontrolle 410 d

LEW-ci2 / homozygot (TiHo) 680 d

LEW-ci2 / heterozygot (TiHo) 700 d

5.4.2.2 Verhalten

Das Verhalten von drei LEW-ci2 Tieren je Gruppe wurde sowohl im Heimatkäfig als auch in

einer den Ratten unbekannten Umgebung beobachtet, um Rückschlüsse auf das Sehvermögen

der Tiere zu ziehen. Daneben sollte das Verhalten auf mögliche Einflüsse durch Umwelt und

Haltung analysiert werden.

Bei Beobachtungen der Tiere im Heimatkäfig zeigten sich die Ratten der TiHo-Haltung

auffallend träge. Dies könnte auf den Altersunterschied im Vergleich zu den MHH-Tieren,

der im Schnitt 150 Tage betrug, zurückzuführen sein, da die lokomotorische Aktivität mit

zunehmendem Alter der Ratte sinkt (VALLE, 1971; WILLIG et al., 1987). Als Ursache

kommen weiterhin Gewichtsunterschiede zwischen Tieren der beiden Haltungssysteme in

Frage (Kap. 4.4.2.2). Daneben könnte die Aktivität der TiHo-Tiere aufgrund einer

Veränderung des hormonellen Haushalts, ausgelöst durch die getrenntgeschlechtliche

Haltung, eingeschränkt sein. Außerdem bestand in der TiHo eine Einzelhaltung der Tiere, was

aufgrund fehlender Sozialkontakte zusätzlich zu einem verminderten Bewegungsdrang

geführt haben könnte. Interessanterweise zeigten die Ratten nach dem Umsetzen in eine ihnen

unbekannte Umgebung eine deutlich erhöhte Aktivität. Das Rotationsverhalten, das spontan

aber auch stressinduziert auftreten kann, war allerdings schwächer ausgeprägt als bei Tieren

der MHH-Haltung. Außerdem konnte bei keinem TiHo-Tier ein Kotabsatz beobachtet

werden, der als Indikator für Stresssituationen gilt. Die gesamte Symptomatik deutet auf eine

5. Diskussion 105

geringe Stressanfälligkeit der LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung hin. Die plötzlich gesteigerte

Aktivität im unbekannten Käfig ist möglicherweise auf die Neugier der Tiere zurückzuführen,

die ansonsten aufgrund der Einzelhaltung in einer reizarmen Umgebung ohne soziale

Kontakte zu Artgenossen leben. Dies könnte auch der Grund für die ausgeprägte Exploration

des unbekannten Käfigs sein, die verglichen mit MHH-Tieren mit derselben Aktivität

durchgeführt wurde.

Die Verhaltensweisen der Tiere beider Gruppen unterschieden sich deutlich. Dies gibt einen

Hinweis darauf, dass die Einflüsse der unterschiedlichen Haltungs- und Umweltbedingungen

beider Tierhaltungen (MHH und TiHo) bei den LEW-ci2 Ratten phänotypisch erkennbar

waren.

Um einen Eindruck von dem Sehvermögen der Ratten zu erhalten, wurde den Tieren ein

unbekanntes Objekt in den Käfig gelegt. Aufgrund ihrer Neugier steuern gesunde Ratten den

Gegenstand normalerweise umgehend an, um diesen zu beschnuppern. Bei einem

eingeschränkten Visus läuft ein Tier jedoch an dem Objekt vorbei oder berührt dieses eher

zufällig mit den Tasthaaren, was durch eine Schreckreaktion deutlich wird.

Ein bewusstes Wahrnehmen des Gegenstandes war bei 3 von 6 untersuchten Tieren der

MHH-Haltung und bei nur einem Tier der TiHo-Haltung deutlich zu erkennen. Alle anderen

Tiere zeigten keine oder nicht eindeutige Reaktionen auf das unbekannte Objekt. Zusätzlich

wurde beurteilt, inwiefern die Tiere die Grenzen des Käfigs wahrnahmen.

Ratten, die das Objekt bewusst wahrnahmen, wurden als unbetroffen gewertet. Als betroffen

wurden dagegen solche Tiere eingestuft, die keine Reaktion auf den Gegenstand zeigten. Die

Ergebnisse aus diesem Test wurden mit Resultaten der elektroretinographischen

Untersuchung (ERG) auf Funktionalität des Sehvermögens abgeglichen. Dabei musste

festgestellt werden, dass die Ergebnisse lediglich bei der Hälfte der Probanden

übereinstimmten. Möglicherweise war die durch die unbekannte Umgebung ausgelöste

Stressbelastung verantwortlich dafür, dass die Tiere den unbekannten Gegenstand nicht

erkennbar wahrnahmen. Es wäre allerdings auch denkbar, dass lediglich ein Interesse an dem

Objekt fehlte.

Daneben wurden Tiere beobachtet, die offenbar ziellos durch den Käfig liefen und dabei

gegen die Seitenwände prallten. Diese Tiere wiesen allerdings bei den später durchgeführten

Messungen keine Abweichungen im Elektroretinogramm auf, was bedeutet, dass sie in ihrem

Sehvermögen also nicht eingeschränkt waren. Dieses Phänomen könnte wiederum auf die

5. Diskussion 106

ungewohnte Stresssituation während der Beobachtungen in Zusammenhang mit dem dadurch

induzierten Rotationsverhalten erklärt werden.

Abschließend muss festgestellt werden, dass aufgrund des Phänotyps der LEW-ci2 Ratte, der

durch motorische Störungen geprägt ist, die in dieser Studie angewandten Verhaltenstests

keine eindeutige Identifikation von Sehschwächen ermöglichen.

5.4.2.3 Körpergewicht

Das Körpergewicht der Tiere wurden im Zuge der Narkosevorbereitung für die ERG-

Messungen bestimmt und aufgrund von Hinweisen auf Gruppenunterschiede ausgewertet

(Kap. 4.4.2.2).

Es zeichnete sich die Tendenz ab, dass LEW-ci2 Tiere der TiHo-Haltung im Vergleich zu den

MHH-Ratten und im Vergleich zur eigenen Kontrollgruppe im Durchschnitt ein höheres

Körpergewicht aufwiesen. Aufgrund der großen Varianzen innerhalb der einzelnen Gruppen

konnten jedoch keine Signifikanzen nachgewiesen werden. Aus diesem Grund wurden die

Daten der weiblichen und männlichen Tiere getrennt voneinander erneut verglichen. Dabei

stellte sich heraus, dass die bei männlichen Tieren tendenziell vorhandenen Unterschiede bei

weiblichen Tieren signifikant waren.

Gewichtsdifferenzen zwischen homozygoten und heterozygoten LEW-ci2 Ratten wurden

bereits von LÖSCHER et al. (1996) beschrieben. Sie basieren auf dem gesteigerten

Energieverbrauch der hyperaktiven, homozygoten Tiere. Allerdings waren die Kontrolltiere

der TiHo-Haltung ebenso schwer wie die homozygoten LEW-ci2 Tiere derselben Haltung,

während heterozygote LEW-ci2 Ratten schwerer waren. Zu erwarten wäre aber ein gleiches

Gewicht bei Kontrollen und heterozygoten Tieren, während homozygote LEW-ci2 Ratten

aufgrund ihrer gesteigerten Aktivität leichter sein müssten. Da die Kontrolltiere im

Durchschnitt ein Alter von 410 Tagen aufwiesen, während die LEW-ci2 Ratten

durchschnittlich 690 Tage alt waren, ist dieses Phänomen wahrscheinlich auf die

Altersdifferenz zwischen den Tiergruppen zurückzuführen.

Durch eine isolierte Betrachtung der Genotypen zwischen beiden Haltungssystemen wird

deutlich, dass die hyperaktiven, homozygoten LEW-ci2 Tiere der TiHo- und MHH-Haltung

keine Gewichtsunterschiede aufwiesen, während die heterozygoten LEW-ci2 Ratten der TiHo

deutlich schwerer waren als solche aus der MHH-Haltung (Abb. 4.7). Hier konnten

Altersunterschiede jedoch keine Rolle spielen, da die Altersdifferenz zwischen den

homozygoten Tieren beider Haltungen durchschnittlich ebenso groß war wie die

5. Diskussion 107

Altersdifferenz zwischen den Gruppen mit heterozygoten Tieren. Verantwortlich dafür könnte

die Einzelhaltung der TiHo-Tiere sein, die möglicherweise im Vergleich zur Haltung der

MHH, bei der ein bis drei Tiere pro Käfig untergebracht waren, eine Reduktion des

Bewegungsdranges bzw. eine Aktivitätsminderung der Tiere verursachte. Dies ist ein weiterer

Hinweis darauf, dass Haltungs- bzw. Umweltfaktoren die Ausprägung phänotypischer

Symptome bei LEW-ci2 Ratten beeinflussen.

5.4.2.4 Elektroretinographische Untersuchung

Die elektroretinographische Untersuchung dient der Beurteilung der Leistungsfähigkeit von

Photorezeptorzellen der Netzhaut sowie der ihnen nachgeschalteten Neurone (Kap. 2.6). Sie

wurde in dieser Studie eingesetzt, um die Funktionsfähigkeit des Sehsinns von LEW-ci2

Ratten zu prüfen und somit den visuellen Phänotyp der Mutante zu charakterisieren.

Durch einen Lichtreiz ausgelöste Potentialschwankungen der Retina setzen sich bis zur

Oberfläche des Auges fort, wo sie mithilfe von Elektroden abgeleitet werden können. Bei der

Untersuchung der LEW-ci2 Ratten wurden zu diesem Zweck Ringelektroden eingesetzt, die

auf den Bulbus geschoben wurden. Da eine Möglichkeit zur Fixation der Elektrode am Auge

nicht bestand, wurde der Ring auf die korneanahe Sklera aufgesetzt. Es ist jedoch bekannt,

dass eine direkte Ableitung der Potentiale an der Kornea (Hornhaut) durch Kontaktelektroden

die größten und v.a. stabilsten Amplituden hervorbringt und dass sich die Potentiale mit

steigender Entfernung der Elektroden vom Korneaapex verringern (MARMOR et al., 2004).

Da eine definierte Positionierung der Elektroden auf der Sklera nicht möglich ist, birgt diese

Methodik die Gefahr abweichender Messwerte, die Schwankungen in den Daten einer Gruppe

provozieren können. Es ist deshalb wichtig, innerhalb eines Labors bzw. während derselben

Versuchsreihe eine konstante Methodik anzuwenden (Position der Elektroden,

Lichtintensitäten, Art der Stimuli, Frequenz usw.) und innerhalb des Labors eigene

Referenzwerte für die laufende Studie zu erstellen (MARMOR et al., 2004). Diesem Zweck

dienten die Untersuchungsergebnisse der Kontrollgruppen. Die Elektroretinographie wurde in

Anlehnung an die regelmäßig aktualisierten Richtlinien des ISCEV, der Internationalen

Gesellschaft für klinische Elektrophysiologie des Sehens, durchgeführt.

Die im skotopischen ERG abgeleiteten Maximalwerte der a- und b-Wellen waren bei LEW-

ci2 Ratten der MHH-Haltung und bei den Kontrolltieren der MHH-Haltung gleich. Diese

Werte unterschieden sich auch zwischen den Kontrollgruppen der MHH- und der TiHo-

5. Diskussion 108

Haltung nicht (Kap. 4.4.2.3), so dass davon ausgegangen werden kann, dass bei diesen Tieren

gleichermaßen eine normale Sehfähigkeit vorlag. Diese Referenzwerte (Normalwerte)

konnten durch ERG-Untersuchungen anderer Stämme, wie zum Beispiel der

HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd, bestätigt werden (Kap. 4.4.3). Im Gegensatz dazu waren die

Antworten der LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung stark reduziert, bei einem großen Teil der

Tiere beinahe vollständig erloschen (Kap. 4.4.2.3). Die Differenzen zu den LEW-ci2 Tieren

der MHH-Haltung sowie zu den Kontrolltieren waren sowohl für die a-Welle als auch für die

b-Welle in allen Stufen des ERGs hochsignifikant. Der geringe Altersunterschied zwischen

den LEW-ci2 Ratten der beiden Tierhaltungen kann als Ursache für die Potentialunterschiede

ausgeschlossen werden. Es ist zwar bekannt, dass mit zunehmendem Alter ein stetiger Verlust

an Photorezeptoren sowie eine Abnahme der Sensitivität dieser Zellen zu verzeichnen ist

(JONAS et al., 1992; TZEKOV et al., 2003; MARMOR et al., 2004). Eine altersbedingte

Reduktion der Potentiale wird jedoch auf höchstens 30% bei einem Altersunterschied von

mind. 500 Tagen geschätzt (WEISSE et al., 1974; SEITZ et al., 1977; KATZ et al., 1986;

CAVALLOTTI et al., 2001). Da es sich aber im Mittel um eine Differenz von nur 150 Tagen

handelte und die Potentiale nicht nur reduziert sondern zum großen Teil beinahe vollständig

erloschen waren, müssen andere Faktoren verantwortlich sein. Da eine zweite Mutation oder

der Einfluss modifizierender Gene aufgrund der Herkunft der Tiere (Inzuchtstamm, alle Tiere

aus einem Zuchtbestand) ausgeschlossen werden kann und da es sich um zwei

unterschiedliche Haltungssysteme handelt, könnten visusschädigende Umweltfaktoren an der

Pathogenese beteiligt sein.

Die mittels photopischer Elektroretinographie abgeleiteten Potentiale der Zapfen waren

insgesamt deutlich geringer als die Potentiale des Dunkel-ERGs, da die Zapfen in der Retina

der Ratte nur sehr selten gefunden werden, während die Stäbchen den weitaus größten Teil

der Photorezeptorzellen darstellen (WALLS, 1934; TILGNER, 1966; MATTHEW und LA

VAIL, 1976). Ähnlich wie im skotopischen ERG zeigten die LEW-ci2 Ratten der TiHo-

Haltung reduzierte Antworten der Photorezeptoren (hier der Zapfen) im Vergleich zu den

LEW-ci2 Ratten der MHH-Haltung und der Kontrolltiere. Allerdings waren diese Differenzen

im Hell-ERG nicht so deutlich ausgeprägt. Interessanterweise wurden dagegen weder im

skotopischen noch im photopischen ERG Unterschiede der Latenzzeiten zwischen den

Gruppen erkannt.

In Verbindung mit den Beobachtungen aus dem Dunkel-ERG gleicht dieser Befund dem

Erscheinungsbild einer Retinopathia pigmentosa. Diese Erkrankung, die mithilfe der

5. Diskussion 109

Elektroretinographie diagnostiziert werden kann, führt beim Menschen zu einer Degeneration

der Photorezeptorzellen der Netzhaut (Kap. 2.5.2). Obwohl es sich dabei um eine sogenannte

Stäbchen-Zapfen-Dystrophie handelt, degenerieren primär die Stäbchenzellen und

verursachen erst sekundär den Untergang der Zapfen (BIRD , 1995; BANIN et al., 1999). Die

Stäbchen sind aus diesem Grund stets bedeutend stärker betroffen (HAMEL, 2006). Ein

primärer Stäbchenuntergang könnte eine Erklärung dafür sein, dass die Potentialdifferenzen

zwischen den LEW-ci2 Ratten beider Haltungseinheiten gemessen im skotopischen ERG

bedeutend ausgeprägter sind als im Zapfen-ERG.

Es ist bekannt, dass bei RP-Patienten mit noch milder Symptomatik

(Gesichtsfeldeinschränkung, beginnende Nachtblindheit) bereits stark verminderte

Amplituden, insbesondere der b-Wellen, aufgezeichnet werden (PETIT, 2001; HAMEL,

2006; EBERMANN et al., 2006). Deshalb sollte trotz (fast) erloschener Potentiale der LEW-

ci2 Ratten der TiHo-Haltung im ERG von einem eingeschränkten Sehvermögen dieser Tiere

und nicht von einer bestehenden Blindheit ausgegangen werden. Im Hinblick auf die

Verhaltensbeobachtungen ist es unter diesen Voraussetzungen auch verständlich, dass Tiere

trotz erloschener Potentiale im ERG in den Verhaltenstests das für sie `unbekannte Objekt´

offensichtlich wahrnahmen. Dies ist aus einer geringen Distanz auch mit einem

eingeschränkten Sehvermögen möglich.

Die Retinopathia pigmentosa (RP) kann Bestandteil der Symptomatik des humanen Usher

Syndroms sein (Kap. 2.5.1). Patienten mit dieser Erkrankung zeigen im ERG die typisch

veränderten oder erloschenen Amplituden einer RP, wie sie auch bei LEW-ci2 Tieren der

TiHo-Haltung festgestellt wurden. Charakteristisch für das Usher Syndrom sind außerdem

unveränderte Latenzzeiten (SEELIGER et al., 2001), die bei den Untersuchungen der LEW-

ci2 Tiere ebenfalls beobachtet wurden.

Eine ähnliche Symptomatik konnten LIBBY und STEEL (2001) für Mäuse nachweisen, die

eine Mutation im Myo7A aufwiesen. Dieses Gen ist an der Entstehung des Usher Syndroms

beteiligt. Die Tiere zeigten, ebenso wie betroffene LEW-ci2 Ratten, reduzierte Amplituden

der a- und b-Wellen bei unveränderter Latenzzeit. Allerdings betrugen in dieser Studie die

Differenzen zu den Potentialen der Kontrollen höchstens 20% und die untersuchten Mäuse

waren maximal sieben Monate alt.

5. Diskussion 110

5.4.2.5 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes

Die Elektroretinographie gibt Auskunft darüber, ob die Photorezeptoren auf physiologische

Weise mit einer Potentialveränderung auf einen Lichtreiz reagieren können. Allerdings sagt

diese Methode nichts darüber aus, ob verminderte Potentiale aufgrund von funktionellen

Störungen der Zellen oder aufgrund von Zellverlusten auftreten. Um der Ursache für die im

ERG beobachteten reduzierten bzw. fehlenden Antworten von Photorezeptorzellen der LEW-

ci2 Ratten aus der TiHo-Haltung weiter auf den Grund zu gehen, wurden histologische

Schnitte von Augen angefertigt. In die Untersuchung gingen je drei homo- und heterozygote

LEW-ci2 Tiere sowie je drei Kontrolltiere pro Haltungseinheit ein.

Bei der Auswertung der Schnitte wurde zuerst die Integrität, das Ausmaß sowie der

physiologische Schichtenaufbau der gesamten Retina analysiert. Anschließend folgte eine

detailierte Beurteilung der einzelnen Schichten. Dabei wurde die Anzahl der Zelllagen an

verschiedenen Punkten der Netzhaut ausgezählt, um die relative Dicke (Ausmaß) jeder

Schicht zu bestimmen. Für die Auszählung wurden Lokalisationen in der zentralen und in der

peripheren Retina gewählt, da es aufgrund der elektroretinographischen Untersuchungen der

LEW-ci2 Ratten Hinweise auf einen Zusammenhang zur Retinopathia pigmentosa (des Usher

Syndroms) gab. Bei dieser Erkrankung erfolgt die Schädigung der Photorezeptorzellen

zentripetal, d.h. ungleichmäßig über die Gesamtlänge der Retina von der Peripherie

beginnend und sich zum Zentrum hin ausbreitend. Daneben kommt es bei diesem

Krankheitsbild zu einer Affektion des Sehnerven. Um dieses Gewebe zusätzlich beurteilen zu

können, wurden die Bulbi auf Höhe des Discus opticus (Blinder Fleck) geschnitten.

Die histologische Untersuchung der Netzhautpräparate von LEW-ci2 Ratten der MHH und

von LEW-Kontrolltieren machte deutlich, dass Integrität und physiologischer

Schichtenaufbau der Retina bei diesen Tieren durchgehend erhalten waren. Allerdings stellte

sich die Gesamtdicke der Netzhaut bei den LEW-ci2 Tieren der MHH im Vergleich zu den

Kontrolltieren geringgradig verringert dar. Dies konnte zum Teil auf eine geringe Abnahme

der Photorezeptorzellschicht und eine Reduktion der äußeren Körnerschicht um

durchschnittlich 2-3 Zelllagen zurückgeführt werden. Die äußere Körnerschicht wird von

Zellkernen der Photorezeptoren gebildet und besteht in der Regel aus 8 bis 12 Kernreihen

(WEISSE et al., 1974; SEITZ et al., 1977). LAI et al. (1978) beschrieb bei Ratten mit einem

Alter von mehr als 540 Tagen eine Abnahme dieser Schicht auf unter 8 Zellen sowie eine

altersbedingte Verkürzung der inneren und äußeren Segmente der Photorezeptorzellen. Diese

5. Diskussion 111

ist über die gesamte Netzhaut gleichmäßig verteilt, die retinale Architektur aber bleibt

unbeeinflusst. Zusätzlich wurde in der Literatur eine Reduktion der gesamten Retina bis zu

30% ab einem Alter von 720 Tagen im Vergleich zu jungen Tieren (180 Tage) beschrieben

(WEISSE et al., 1974; SEITZ et al., 1977; KATZ et al., 1986; CAVALLOTTI et al., 2001).

Da eine Altersdifferenz von durchschnittlich 60 Tagen zwischen den über 540 Tage alten

LEW-ci2 Ratten der MHH und den Kontrolltieren bestand, wird davon ausgegangen, dass es

sich bei den Zellverlusten in der Netzhaut von LEW-ci2 Tieren um eine altersbedingte

Degeneration und nicht um eine krankhafte Veränderung ähnlich der Retinopathia pigmentosa

handelt. Die Altersdifferenz ist zwar nicht sehr groß, die Unterschiede im Ausmaß der Retina

bzw. im Umfang der einzelnen Schichten sind allerdings auch nur geringgradig.

Im Gegensatz dazu wiesen die Schnitte von LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung im Vergleich

zu den Kontrollen eine hochgradige Verjüngung der Photorezeptorzellschicht und der äußeren

Körnerschicht auf, die aufgrund der Schwere des Geschehens nicht auf einen

Altersunterschied zurückgeführt werden kann. Während bei der Hälfte der Tiere noch ein bis

höchstens sechs Zelllagen in der äußeren Körnerschicht gezählt wurden, waren bei der

anderen Hälfte Zellen in dieser Schicht nur noch vereinzelt zu finden und bildeten keine

durchgehende Zellreihe mehr. Bei diesen Tieren fand sich zusätzlich eine fast vollständige

Degeneration der Photorezeptorzellschicht und der äußeren plexiformen Schicht. Diese wird

normalerweise durch die Zellausläufer der in diesen Fällen zugrundegegangenen

Photorezeptoren gebildet. Interessanterweise waren die verbliebenen Schichten der Retina

einschließlich des Retinalen Pigmentepithels in ihrer Struktur unverändert. Die Dicke der

Netzhaut war zwar bei den Mutanten im Vergleich zu den Kontrollen geringgradig verringert,

dies kann aber ebenfalls dem Altersunterschied zwischen diesen Gruppen zugeschrieben

werden. Durch die Auswertung der histologischen Präparate konnte ein isolierter,

degenerativer Verlust von Photorezeptorzellen der Retina ausschließlich bei LEW-ci2 Ratten

der TiHo-Haltung diagnostiziert werden.

Netzhautdegenerationen kommen am häufigsten als primäre hereditäre Erkrankungen vor.

Sekundär können sie im Rahmen von Altern, diätetischen und metabolischen Störungen,

Infektionen oder chemischen und physikalischen Traumata entstehen. Erbliche wie erworbene

Retinopathien spielen sich in der Regel in der äußeren Netzhaut ab (DAHME und WEISS,

1999). Mechanische Verletzungen des Auges können aufgrund von Vorberichten und

Untersuchungen der LEW-ci2 Tiere als Ursache der beschriebenen Netzhautschäden

5. Diskussion 112

ausgeschlossen werden. Ebenso kann eine diätetische und daraus bedingte metabolische

Störung nicht ursächlich sein, da ein standardisiertes Futtermittel verabreicht wurde. Eine

kausale physikalische Einwirkung in Form von Licht ist allerdings sehr interessant. Das

histologische Bild einer lichtgeschädigten Netzhaut ist geprägt von einem vollständigen

Verlust der äußeren Körnerschicht mit ansonsten unveränderter Retina (GRIGNOLO et al.,

1969) und weist daher starke Ähnlichkeiten zu den Veränderungen im Auge von LEW-ci2

Ratten der TiHo-Haltung auf. Aufgrund dieser Parallelen wurde die Lichtintensität in den

Tierräumen beider Haltungssysteme überprüft. Die ermittelten Maximalwerte entsprachen

jedoch den für die Versuchstierhaltung vorgegebenen Richtlinien (Kap. 4.4.2.5).

Weiterhin konnten in Schnitten von LEW-ci2 Ratten keine charakteristischen Anzeichen einer

akuten oder abgeklungenen Infektion beobachtet werden. Typisch sind in diesem Fall

degenerative Veränderungen der Netzhaut und des Sehnerven sowie eine gliöse Vernarbung

(DAHME und WEISS, 1999). Dabei kommt es zu einer Schädigung aller Schichten der

Retina sowie des Retinalen Pigmentepithels und zu einer Infiltration von Entzündungszellen.

Netzhautschädigende Erreger wurden bei LEW-ci2 Ratten nicht nachgewiesen (Kap. 4.4.2.5).

Wie bereits erwähnt können retinale Degenerationen auch erblich bedingt sein. Ein Beispiel

dafür ist die progressive Retinaatrophie (PRA) bei Hund und Katze, die neben einer

Degeneration der Netzhaut und der Papille durch umschriebene depigmentierte Bezirke mit

atrophierten Gefäßen gekennzeichnet ist.

Die Ergebnisse der Elektroretinographie von LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung zeigten

bereits deutliche Parallelen zur Retinopathia pigmentosa. Im Gegensatz zur klinischen

Symptomatik gibt es jedoch zwischen den histologischen Befunde von RP-Patienten und von

betroffenen LEW-ci2 Ratten einige Differenzen. Während die RP durch einen zentripetalen

Verlauf der Degeneration geprägt ist, waren die Zellverluste bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-

Haltung über die gesamte Länge der Retina gleichbleibend. Allerdings ist auch beim

Menschen bei einer weit fortgeschrittenen Erkrankung dieser Verlauf in vielen Fällen nicht

mehr erkennbar. Da die betroffenen LEW-ci2 Ratten bereits relativ alt waren (>680 Tage) und

in histologischen Präparaten dieser Tiere oftmals nur noch vereinzelt oder keine

Photorezeptorzellen mehr vorhanden waren, ist anzunehmen, dass die Krankheit weit

fortgeschritten war.

Neben Zellverlusten ist die RP durch eine Verengung retinaler Gefäße, eine Atrophie des

Sehnerven sowie fleckige Alterationen des Retinalen Pigmentepithels (Pigmentablagerungen)

gekennzeichnet. Diese zusätzliche Symptomatik war bei betroffenen LEW-ci2 Tieren nicht zu

5. Diskussion 113

beobachten. Weiterhin sind Einlagerungen in Form von Knochenkörperchen beschrieben, die

allerdings auch bei Patienten mit einer RP variabel auftreten.

Es gibt Spekulationen darüber, ob eine speziesbedingt ungleiche Physiologie des Auges für

die unterschiedliche Ausprägung von retinalen Erkrankungen bei Mensch und Labornagern

ursächlich sein könnte (AMRAOUI et al., 1996; LIBBY und STEEL, 2001). Denn

interessanterweise sind bis heute keine Tiermodelle beschrieben, die eine Mutation in einem

Protein tragen, das in das humane Usher Syndrom involviert ist, und gleichzeitig eine retinale

Degeneration aufweisen.

Ein weiteres Beispiel sind Mutationen im Myo7A, die beim Menschen zum Usher Syndrom

mit vestibulo-cochleärer und visueller Symptomatik führen können, während retinale

Degenerationen bei Maus- und Rattenmodellen fehlen (LIU et al., 1998; SMITS et al., 2005).

Allerdings konnten bei diesen Tieren abnormale Ereignisse in den Photorezeptorzellen wie

fehlerhafte Transportvorgänge mit Akkumulation von Substanzen sowie eine reduzierte

Synthese/Phagozytose von Außensegment-Scheibchen beobachtet werden, die auf eine

Beteiligung des Auges auch bei der Symptomatik von Myo7A-defizienten Tieren hinweisen

(LIU et al., 1999; GIBBS et al., 2003). Bisher konnten die Mechanismen der

Photorezeptorzelldegeneration bei erblicher RP allerdings nicht eindeutig aufgeklärt werden.

5.4.2.6 Untersuchung von Umweltfaktoren

Wie bereits erwähnt, können neben genetischen Defekten auch Umweltfaktoren Ursache für

eine Erkrankung der Netzhaut sein. Da LEW-ci2 Tiere mit gleichem genetischen Hintergrund

abhängig von ihrem Haltungsstandort einen unterschiedlichen visuellen Phänotyp aufwiesen,

liegt die Vermutung nahe, dass die Einwirkung von schädigenden Umwelteinflüssen

verantwortlich ist oder zumindest eine Rolle bei der Pathogenese spielen. Diese Faktoren

wurden deshalb im Rahmen der Vergleichsstudie in beiden Haltungssystemen überprüft.

In der Literatur wird beschrieben, dass retinale Degenerationen als Folge von infektiösen

Retinitiden auftreten können. Isolierte Entzündungen der Netzhaut sind allerdings selten und

entstehen meist im Verlaufe einer bakteriellen oder viralen Allgemeinerkrankung. In der

Regel stellt sich die Retinitis jedoch als Teilbefund, zum Beispiel in Verbindung mit einer

Uveitis, oder als Folgezustand einer Endophthalmitis ein (DAHME und WEISS, 1999). Die

Coronavirus-bedingte Retinopathie bei experimentell mit MHV infizierten Mäusen

(intravitreale Inokulation) zeigt teilweise im Vergleich zur LEW-ci2 Ratte ähnliche

5. Diskussion 114

degenerative Veränderungen der Netzhaut. Die nach 10-140 Tagen einsetzende, retinale

Degeneration betrifft hauptsächlich die äußere Körnerschicht, allerdings können alle

Schichten der Netzhaut, einschließlich des Retinalen Pigmentepithels, von apoptotischen

Zelluntergängen betroffen sein (ROBBINS et al., 1990; KOMURASAKI et al., 1996; WANG

et al., 2000). Es handelt sich um einen langandauernden Krankheitsverlauf (long-lasting

disease) mit einer Beteiligung des körpereigenen Immunsystems (Infiltration von

Immunzellen).

Da bestimmte Infektionen visusschädigend sein können, wurde in Anlehnung an die

Richtlinien der FELASA der Hygienestatus der Tiere beider Haltungseinheiten überprüft

(Kap. 3.9.1). Die wenigen bei den TiHo-Tieren und den Ratten der MHH-Haltung

nachgewiesenen Pathogene (Kap. 4.4.2.5) stehen jedoch in keinem Zusammenhang mit

Infektionen der Netzhaut und anschließenden Degenerationserscheinungen. Einzig bei der

Pasteurellose von Haustieren ist eine Retinitis beschrieben (DAHME und WEISS, 1999). Sie

kommt allerdings ausschließlich als Teilbefund einer Endophthalmitis bei einer bakteriämisch

(systemisch) verlaufenden Infektion vor. Da die Tiere der Vergleichsstudie jedoch klinisch

gesund waren und die Pasteurellen in beiden Haltungssystemen gleichermaßen nachgewiesen

wurden, kann eine solche Infektion als Ursache für die hier beschriebenen Defekte

ausgeschlossen werden.

Daneben wurden LEW-ci2 Ratten zusätzlich auf den Erreger der Borna-Erkrankung (BDV)

getestet, da das BD-Virus in neuronalen Strukturen repliziert und infolgedessen

immunbedingte Degenerationen provoziert. In experimentell infizierten Ratten kam es dabei

auch zu einer Beteiligung des Sehnerven und der Netzhaut (NARAYAN et al., 1983; KACZA

et al., 2000; STAHL et al., 2003). Dieser Erreger konnte ebenfalls nicht nachgewiesen

werden.

Darüber hinaus wurde das Blut von LEW-ci2 Ratten auf entzündungsbedingte

Verschiebungen des Blutbilds untersucht (Daten nicht gezeigt). Diese konnten nicht bestätigt

werden. Daneben fehlten im histologischen Bild Anzeichen für eine akute oder

zurückliegende Infektion wie Infiltration von Immunzellen, Vernarbungen oder fibrinöse

Adhäsionen (Kap. 5.3.2.5), so dass eine erregerbedingte Erkrankung des Augenhintergrunds

bei betroffenen LEW-ci2 Tieren ausgeschlossen werden kann.

Als weiterere Umweltfaktoren wurden die Lichtintensität und der Lichtzyklus in den

Tierräumen überprüft, da zu hohe Lichtbelastungen oder verlängerte Lichtphasen retinale

Degenerationen induzieren können (NOELL et al., 1966; WILLIAMS et al., 1983). Wie das

5. Diskussion 115

sichtbare Licht die Netzhaut schädigt, ist nicht eindeutig geklärt. Diskutiert wird eine

lichtinduzierte Oxidation der mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren in den

Membranscheiben der Stäbchen, wodurch freie, die Zellmembranen der Photorezeptoren

schädigende Radikale entstehen (DAHME und WEISS, 1999). Tiere mit gering pigmentierter

Aderhaut sowie auf Nachtsehen adaptierte Spezies reagieren am empfindlichsten auf die

Lichteffekte. Durch eine überhöhte Lichtbelastung kommt es in der Netzhaut zu einem

vollständigen Verlust der äußeren Körnerschicht, während die restlichen Schichten der Retina

unverändert bleiben (GRIGNOLO et al., 1969). Die histologische Untersuchung des

Augenhintergrundes von LEW-ci2 Ratten (TiHo-Haltung) ergab ebenfalls eine Degeneration

ausschließlich der äußeren Körnerschicht (Kap. 4.4.2.4). Da es sich bei der LEW-ci2 Ratte

um einen albinotischen Stamm handelt, weist diese außerdem eine besondere

Lichtempfindlichkeit auf.

Nach den Richtlinien der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-Solas) soll die

Lichtintensität in Tierräumen etwa 250 lx bis 450 lx betragen. Diese Vorgaben wurden

sowohl in der MHH-Haltung als auch in der TiHo-Haltung erfüllt.

Aufgrund ihrer hohen Lichtempfindlichkeit wird für die Haltung albinotische Ratten aber eine

maximale Lichtbelastung von 60 lx empfohlen (www.gv-solas.de/auss/hal/ratten-haltung.pdf).

In den Innenbereichen der Käfige konnten durchgehend Lichtintensitäten von weniger als 30

lx gemessen werden. Diese Aussage traf jedoch nicht auf die obere Regalreihe des rechten

Ständers in der TiHo-Haltung zu, in der die weiblichen Ratten untergebracht waren. Der

empfohlene Wert wurde an diesem Standort im gesamten Käfig um das Doppelte

überschritten. Grund dafür war die ungleichmäßige Beleuchtung des Raumes mit verschieden

starken Leuchtmitteln. Da die Ständer in dieser Haltungseinheit keine festen Böden

aufwiesen, die eine Abschwächung der Lichtintensität bewirken, kann eine übermäßige

Lichtbelastung auch für die zweite Käfigreihe nicht ausgeschlossen werden.

Im Hinblick auf die unterschiedliche Lichtbelastung der weiblichen und männlichen Tiere der

TiHo-Haltung ist es interessant, dass weibliche LEW-ci2 Tiere dieser Einheit sowohl im ERG

als auch in histologischen Präparaten deutlichere Beeinträchtigungen im Vergleich zu

männlichen Tieren zeigten. Allerdings waren Ratten beiderlei Geschlechts von degenerativen

Netzhautveränderungen und erloschenen Potentialen im ERG betroffen.

Die geringste Lichtintensität, bei der eine phototoxische Retinopathie (bei einem

zwölfstündigen Lichtzyklus über einen Zeitraum von drei Monaten) nachgewiesen wurde,

beträgt 60 bis 65 lx (STÖTZER et al., 1970; ANDERSON et al., 1972; BELLHORN et al.,

1980). Daher wird für die Haltung von Albinoratten eine Lichtintensität von deutlich unter 60

5. Diskussion 116

lx, d.h. zwischen 30 und 50 lx in weiten Teilen des Käfigs angeraten (ANDERSON et al.,

1972; BELLHORN et al., 1980). Bei experimentellen Untersuchungen zur

netzhautschädigenden Wirkung des Lichts, die eine vollständige Degeneration der

Photorezeptorzellschicht nachwiesen, wurden allerdings Lichtintensitäten (1200-1400 lx)

verwendet, die diese Richtwerte um mehr als das 20fache überschritten (VAUGHAN et al.,

2003). Es ist deshalb davon auszugehen, dass die geringe Überschreitung der Lichtintensität

in der Tierhaltung der TiHo zumindest nicht allein für die schwerwiegenden retinalen

Veränderungen bei LEW-ci2 Ratten dieser Einheit verantwortlich sein konnte.

Als ein zusätzlicher, einflussnehmender Faktor käme eine Vitamin A-arme Diät in Frage.

Diese könnte durch falsche Zusammensetzung, Überlagerung oder erhöhte UV-Belastung des

Futters entstehen und in Verbindung mit einer erhöhten Lichtbelastung möglicherweise zu

einer retinalen Schädigung führen (DAHME und WEISS, 1999). Im Zusammenhang mit den

Defekten bei der LEW-ci2 Ratte kann ein solcher Mangel jedoch nicht stehen, da die Tiere

beider Haltungen dasselbe Standardfutter erhielten.

Es ist denkbar, dass weitere Faktoren in der Umwelt der Tiere Einfluss auf die Entstehung

bzw. Ausprägung der Augenerkrankung hatten. So beschrieben SCHLINGMANN et al.

(1993), dass das Wohlbefinden albinotischer Ratten bereits ab einer Lichtintensität von 20 bis

25 lx gestört sein kann. Diese Werte waren in der oberen Regalreihe bei männlichen und

weiblichen LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung im gesamten Aufenthaltsbereich der Tiere

überschritten, was möglicherweise zu einer chronischen Stressbelastung dieser Tiere führte.

Einen andauernden Stress verursachte möglicherweise auch die Einzelhaltung der LEW-ci2

Ratten in der TiHo. Der sogenannte isolationsinduzierte Stress äußert sich bei dieser

ansonsten geselligen Tierart vor allem durch Veränderungen im Verhalten (HATCH et al.,

1963; PARKER und MORINAN, 1986; HILAKIVI et al., 1989; WONGWITDECHA und

MARSDEN, 1996). Unterschiede im Verhalten zwischen LEW-ci2 Tieren der TiHo-Haltung

und der MHH-Haltung (Kap. 4.4.2.1 und Tab. 10.1/10.2) können demnach auf die

differierenden Arten der Unterbringung zurückgeführt werden.

Interessant ist eine Studie von HATCH et al. (1963), die eine offenbar höhere Anfälligkeit

von weiblichen Tieren für Effekte der Isolationshaltung beschreibt. Wie bereits erwähnt

wurde, waren die Retinae weiblicher LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung im Vergleich zu

männlichen Tieren funktionell und histologisch schwerer betroffen. Außerdem gibt es

Hinweise darauf, dass soziale Isolation in Verbindung mit zusätzlichen Stressfaktoren die

Generation neuer Neuronen unterdrückt und dass in diesem Zusammenhang ansonsten völlig

5. Diskussion 117

normale Reize einen potentiell zerstörerischen Einfluss auf Nervenzellen ausüben können

(STRANAHAN et al., 2006).

5.5 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte als mögliches Tiermodell für das Usher

Syndrom des Menschen

Das Usher Syndrom (USH) des Menschen ist eine autosomal rezessiv vererbte Gruppe von

Erkrankungen, die mit neurosensorischer Taubheit oder Hörverlust, vestibulären Störungen

und progressivem Verlust der Sehfähigkeit einhergehen können (siehe auch Kap. 2.5.1). Das

klinische Bild ist heterogen und schwankt in der Schwere der Symptomatik sowie dem

Einsetzen (onset) der Sehstörungen. Bis heute wurden neun Proteine identifiziert, die für das

Entstehen des Usher Syndroms verantwortlich gemacht werden (Tab. 2.1). Für einen Teil

dieser Proteine konnten bereits Tiermodelle etabliert werden (Tab. 2.1), deren phänotypische

Eigenschaften große Übereinstimmungen aufweisen (Kap. 2.2.3). Charakteristisch sind vor

allem vestibuläre Störungen wie Rotationsverhalten, lokomotorische Hyperaktivität sowie

Taubheit. Keines dieser Tiermodelle weist jedoch eine retinale Symptomatik mit

funktionellen und degenerativen Defekten der Photorezeptorzellen auf, die das Usher

Syndrom zusätzlich kennzeichnen. Der Grund dafür könnten Unterschiede der

umweltbedingten Belastungen bei Labortieren im Vergleich zum Menschen, wie zum Beispiel

eine geringere Lichtexposition (LIBBY und STEEL, 2001), speziesabhängige Unterschiede

von physiologischen Abläufen in der Retina oder der Einfluss des genetischen Hintergrundes

sein (AMRAOUI et al., 1996; LIBBY und STEEL, 2001).

Der Phänotyp der LEW-ci2 Ratte weist große Übereinstimmungen zur Symptomatik dieser

Tiermodelle auf. Im Gegensatz zu diesen Stämmen zeigt die LEW-ci2 Ratte jedoch zusätzlich

sowohl einen funktionellen als auch einen histologischen Phänotyp am Auge und weist somit

die vollständige Symptomatik des humanen Usher Syndroms auf. Dazu zählen stark

reduzierte bis beinahe erloschene Potentiale vor allem im skotopischen aber auch im

photopischen ERG sowie ein degenerativer Verlust der Photorezeptoren in der Netzhaut.

Einige Details im histologischen Bild von Usher Patienten, wie knochenkörperartige

Einlagerungen oder der zentripetale Verlauf der Netzhautdegeneration, fehlen bei der LEW-

ci2 Ratte. Die Ausprägung der Augenerkrankung ist aber auch beim Menschen variabel.

5. Diskussion 118

Das bei der LEW-ci2 Ratte mutierte Myosin XV ist beim Menschen ausschließlich im

Zusammenhang mit rezessiver, neurosensorischer Taubheit (DFNB3) bekannt und wurde

bisher nicht mit dem humanen Usher Syndrom in Verbindung gebracht. Durch die Interaktion

mit dem Usher-Protein Whirlin hat das Myosin XV jedoch Verbindung zu dem Usher Protein

Interaktom, das die bisher bekannten USH1 und USH2 Proteine umfasst. Da das Whirlin eine

zentrale Rolle in der Organisation dieses makromolekularen Netzwerkes übernimmt (Kremer

et al., 2006), ist das Myosin XV als Transporter dieses Proteins folglich von großer

Bedeutung für dessen Funktionalität.

Ob die Interaktion zwischen Whirlin und Myosin XV auf die Haarzellen im Innenohr

beschränkt bleibt, ist bisher nicht geklärt. Da der Komplex, einschließlich aller darin

organisierten Proteine, sowohl im Innenohr als auch im Auge funktionell an gleichen

Abläufen beteiligt ist (VAN WIJK et al., 2006; KREMER et al., 2006), ist eine Funktion des

Myosins als Bindungspartner auch im Auge anzunehmen.

Bei humanen Mutationen im Myosin XV-Gen ist im Gegensatz zur LEW-ci2 Ratte bisher

noch kein Phänotyp am Auge beschrieben worden. Möglicherweise spielen hier

Kompensationsmechanismen eine Rolle, die auf bestimmte Gewebe, wie zum Beispiel die

Netzhaut, beschränkt bleiben. Dabei könnten Spleißvarianten (LIANG et al., 1999) oder

strukturell bzw. funktionell ähnliche Motorproteine (unkonventionelle Myosine) die

Aufgaben des fehlenden oder funktionsunfähigen Proteins übernehmen (FRIEDMAN et al.,

1999; KREMER et al., 2006).

Interessanterweise tritt der retinale Phänotyp ausschließlich bei LEW-ci2 Tieren einer

bestimmten Haltung auf, während Ratten einer anderen Haltung unbetroffen sind. Und

obwohl das Usher Syndrom des Menschen ebenso wie das Rotationsverhalten (circling) der

LEW-ci2 Tiere autosomal rezessiv vererbt wird, sind sowohl homozygote also auch

heterozygote Merkmalsträger betroffen. Dies deutet darauf hin, dass Einflüsse aus der

Umwelt eine Rolle bei der Entstehung der Netzhauterkrankung spielen. Da die Kontrolltiere,

die unter denselben Bedingungen wie LEW-ci2 Ratten in der TiHo gehalten wurden, keine

retinale Symptomatik aufwiesen, muss dem visuellen Phänotyp der Mutante ein genetischer

Defekt zugrunde liegen.

Einflüsse von Umweltfaktoren auf den Verlauf der humanen Usher Syndrom-Erkrankung sind

bisher wenig erforscht. Es wird diskutiert, ob hohe Lichtintensitäten oder Licht bestimmter

Wellenlängen die Krankheit negativ beeinflussen. Weiterhin wird angenommen, dass virale

Infektionen während der Kindheit bei Usher-Patienten ein verfrühtes Einsetzen der

Augenerkrankung zur Folge haben könnten (KLUG, Pro Retina, pers. Komm.).

5. Diskussion 119

5.6 Elektrophysiologische Untersuchung der HsdRccHan:WIST-

Myo7Atnd Ratte

Die WIST-Myo7Atnd Ratte bot die Möglichkeit, den retinalen Phänotyp eines Tiermodells für

das Usher Syndrom mit einer Mutation in einem dem Myosin XV eng verwandten und

strukturell sehr ähnlichen Protein zu untersuchen. Bei der WIST-Ratte handelt es sich um

einen Auszuchtstamm mit einem sehr heterogenen, zur LEW-ci2 Ratte völlig verschiedenen

genetischen Hintergrund.

Die Symptomatik der WIST-Myo7Atnd Ratte, die dem Phänotyp der LEW-ci2 Ratte stark

ähnelt, wurde von SMITS et al. (2005) bereits ausführlich beschrieben. Bei Untersuchungen

des Augenhintergrundes konnten bei dieser Mutante jedoch keine retinalen Degenerationen

nachgewiesen werden. Die Abwesenheit von Melanosomen in apikalen Prozessen des

Retinalen Pigmentepithels wies jedoch auf eine Störung physiologischer Vorgänge in der

Netzhaut hin. Ähnliche pathologische Veränderungen wurden bereits von LIU et al. (1998)

bei Myo7A-defizienten Mäusen beschrieben.

Während die von SMITS et al. (2005) untersuchten WIST-Myo7Atnd Ratten ein Alter von

unter 20 Wochen aufwiesen, hatten LEW-ci2 Ratten, bei denen Degenerationen der

Photorezeptorzellen auftraten, bereits ein Alter von etwa 60 Wochen erreicht. Aus diesem

Grund sollten in einer weiteren Studie erneut WIST-Myo7Atnd Ratten elektroretinographisch

untersucht werden, die aber, analog zur Vergleichsstudie der LEW-ci2 Ratte, älter als 400

Tagen sein sollten. Diese Untersuchungen ergaben, dass auch WIST-Myo7Atnd Tiere

fortgeschrittenen Lebensalters funktionell keine retinale Symptomatik aufwiesen. Die

signifikant größeren Potentiale der Kontroll- (WT-) Tiere im skotopischen ERG können auf

den Altersunterschied zu homozygoten und heterozygoten WIST-Myo7Atnd Ratten

zurückgeführt werden (Kap. 4.4.3).

Es ist zu bedenken, dass die untersuchten WIST-Myo7Atnd Tiere nur unter den

Umweltbedingungen der MHH gehalten wurden. LEW-ci2 Ratten dieser Haltungseinheit

zeigten ebenfalls keine reduzierten Potentiale im ERG, während eine retinale Symptomatik

ausschließlich bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung auftrat. Da WIST-Myo7Atnd Ratten aber

den Umweltbedingungen der TiHo-Haltung nicht ausgesetzt waren, konnte sich eine

Augenerkrankung möglicherweise nicht entwickeln.

Außerdem gibt es ansatzweise Parallelen zu den elektrophysiologischen Untersuchungs-

ergebnissen von LEW-ci2 Ratten. Dazu zählen weniger deutliche Potentialunterschiede

5. Diskussion 120

zwischen Kontrollen und homozygoten/heterozygoten WIST-Myo7Atnd Ratten im

photopischen ERG sowie tendenziell geringere Antworten heterozygoter Tiere im Vergleich

zu homozygoten Ratten.

5.7 Ausblick

Da bisher die Entstehung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte nicht in allen Aspekten

aufgeklärt werden konnte, sollten zur Klärung des Modellcharakters dieses Stammes weitere

Untersuchungen folgen. Besonderes Augenmerk sollte dabei auf (a) die Untersuchung von

strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Myosin XV sowie dessen

Bindungseigenschaften, (b) eine weitere Erforschung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2

Ratte einschließlich der Bedeutung von Umweltfaktoren für den Verlauf des Krankheitsbildes

sowie (c) den Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Auswirkungen der ci2 Mutation

gelegt werden.

Im Hinblick auf ihr phänotypisches Erscheinungsbild wäre die LEW-ci2 Ratte als Tiermodell

für eine angeborene Taubblindheit des Menschen, wie das humane Usher Syndrom, geeignet.

Allerdings ist bisher kein Zusammenhang zwischen dem bei diesem Stamm mutierten Gen

(Myo15) und hereditärer Blindheit bekannt. Zunächst sollte geklärt werden, ob und in

welchen Strukturen der Netzhaut das Myosin XV exprimiert wird. Dazu bietet sich eine in-

situ Hybridisierung histologischer Retinapräparate mit Myosin XV-spezifischen RNA-Sonden

oder eine immunhistologische Untersuchung mit spezifischen Antikörpern an. Kann eine

Expression in der Retina bestätigt werden, sollte eine Analyse der spezifischen Funktion von

Myosin XV in diesem Gewebe folgen.

In diesem Zusammenhang sollte die Bedeutung des Myosin XV im Usher Protein Interaktom

detailierter erforscht werden. Die Schwanzregion des Myosin XV bietet mit ihren

verschiedenen Domänen eine Vielzahl von Bindungsstellen, die Interaktionen mit Proteinen

des Komplexes wie dem Whirlin ermöglichen. Durch die Aufklärung dieser Strukturen und

die Entdeckung weiterer Interaktionspartner innerhalb und außerhalb des Usher Protein

Netzwerkes könnten zusätzliche Funktionen des Myosin XV erkannt werden.

Zur Analyse der Faltungseigenschaften und der Struktur des Myosin XV, die sicherlich für

die Untersuchung der Bindungseigenschaften des Proteins hilfreich wäre, könnte erneut eine

Aufreinigung des Proteins aus exprimierenden Dictyostelium d. Kulturen versucht werden. Es

5. Diskussion 121

besteht durchaus die Möglichkeit, bei einer großen Anzahl von Transfektionen einen Klon zu

erhalten, der eine ausreichende Menge des gewünschten Proteins exprimiert. Ist eine

Aufreinigung des Proteins realisierbar, kann ein Antikörper zur Hybridisierung des

Netzhautgewebes erzeugt werden. Es sollte aber berücksichtigt werden, dass die

Erfolgschancen eher gering und die Versuche mit einem erheblichen zeitlichen und

finanziellen Aufwand verbunden sind. Als Alternative zu den Immunisierungen bietet sich

eine synthetische Herstellung der Antikörper an.

Darüber hinaus ist eine weitere Untersuchung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte

notwendig, da zu Ursachen und Verlauf der Augenerkrankung bisher wenig bekannt ist. Der

Umweltfaktor, der neben der genetischen Komponente eine entscheidende Rolle spielt,

konnte noch nicht eindeutig identifiziert werden. Aufgrund der Vielzahl möglicher

Umweltfaktoren ist jedoch eine individuelle Untersuchung jedes einzelnen Faktors kaum

realisierbar. Es erscheint daher sinnvoll, mit einer isolierten Untersuchung der Lichtintensität

zu beginnen, da ein netzhautschädigendes Potential dieses Faktors erwiesen ist und

Unterschiede zwischen den Haltungseinheiten (TiHo, MHH) bestanden. Es sollte aber

bedacht werden, dass auch ein gleichzeitiger Einfluss von zwei oder mehreren

Umweltfaktoren für die Veränderungen am Augenhintergrund erforderlich sein könnten.

Weiterhin sollte der Frage nach dem Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die

phänotypischen Auswirkungen der Mutation nachgegangen werden. Zu diesem Zweck sollte

ein zur LEW-ci2 Ratte congener Stamm mit einem möglichst weit entfernten genetischen

Hintergrund erzeugt und untersucht werden. Im Vorfeld gezüchtete und untersuchte Ratten

einer BN-Rückkreuzungspopulation standen für Studien im Rahmen dieser Arbeit leider nicht

mehr zur Verfügung.

Die Untersuchung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte sollte unter den

Haltungsbedingungen der TiHo fortgesetzt werden, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse

mit der Symptomatik der LEW-ci2 Ratte zu gewährleisten.

6. Zusammenfassung 122

6 Zusammenfassung Nadine Held

"Strukturelle, funktionelle und genetische Untersuchung der LEW/Ztm-ci2 Ratte - ein

Tiermodell für syndromale Taubheit"

Die LEW/Ztm-ci2 Ratte, die 1991 durch eine Spontanmutation im LEW/Ztm Inzuchtstamm

entstand, ist gekennzeichnet durch neurosensorische Taubheit, lokomotorische Hyperaktivität

und vestibuläre Störungen wie Rotationsverhalten, Ataxien, Opisthotonus und

Schwimmunfähigkeit. Die Symptomatik wird durch einen nahezu vollständigen Verlust des

sensorischen Epithels im Innenohr sowie der umliegenden Ganglienzellen verursacht.

Darüber hinaus ist das Sehvermögen der LEW-ci2 Ratte eingeschränkt. Mit Hilfe einer

Kopplungsanalyse an einer Rückkreuzungspopulation wurde die ci2-Mutation auf

Chromosom 10 (RNO10q22) lokalisiert.

Ziel der vorliegenden Arbeit war in erster Linie die Charakterisierung der Mutation, die dem

veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte zugrunde liegt. Im Anschluß an die Identifikation

des betroffenen Gens sollte durch eine vergleichende Betrachtung des menschlichen Genoms

eine Verbindung zur Genetik humaner Erkrankungen geschaffen werden, um die Möglichkeit

einer Einstufung als Tiermodell für Taubblindheit zu prüfen. Des Weiteren wurde im Rahmen

dieser Arbeit eine Charakterisierung des Augenphänotyps der LEW-ci2 Ratte angestrebt.

Mit Hilfe von Sequenzierungen der Kandidatengene wurde die ci2-Mutation in der

Schwanzregion des Myosin XV-Gens lokalisiert. Den internationalen Nomenklatur-

Richtlinien folgend wird die Mutante nunmehr als LEW/Ztm-Myo15ci2 Ratte bezeichnet. Die

Punktmutation im Myo15 verursacht dabei den Austausch einer Aminosäure in einem Bereich

des Proteins, in dem sich wichtige Bindungsstellen für Protein-Protein-Interaktionen befinden.

Da eine reguläre Expression des Gens nachgewiesen wurde, musste davon ausgegangen

werden, dass die Verbindung zu Interaktionspartnern durch strukturelle Veränderungen bzw.

durch Änderung der Faltungseigenschaften des Proteins gestört sind.

Beim Menschen sind Mutationen im Myosin XV-Gen bisher nur im Zusammenhang mit

hereditärer Taubheit bekannt. Kürzlich konnte jedoch eine Verbindung zum Usher Protein

Interaktom nachgewiesen werden. In diesem makromolekularen Netzwerk sind Proteine

organisiert, die an der Entstehung des humanen Usher Syndroms beteiligt sind. Klinisch ist


diese Erkrankung sehr variabel und kann mit kongenitaler, neurosensorischer Schwerhörigkeit

oder Taubheit, vestibulärer Dysfunktion und einem progressiven Sehverlust einhergehen, der

durch eine Retinopathia pigmentosa verursacht wird. Diese ist charakterisiert durch eine

Degeneration von Photorezeptorzellen in der Netzhaut und führt letztendlich zu vollständiger

Blindheit.

Der Augenphänotyp der LEW-ci2 Ratte wurde über eine Funktionsprüfung der Retina mittels

Elektroretinographie (ERG) sowie über eine histologische Bewertung der Netzhaut analysiert.

Erste Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine von der Art des Haltungssystems abhängige

Symptomatik der Tiere. In der folgenden Studie wurden LEW-ci2 Ratten unterschiedlicher

Haltungen sowie Kontrolltiere des Hintergrundstammes LEW elektrophysiologisch und

histopathologisch untersucht. Ergänzend dazu wurde ein Vergleich der Haltungs- und

Umweltbedingungen vorgenommen. Dadurch sollte ein möglicher Einfluss dieser Faktoren

auf die Ausprägung der retinalen Erkrankung überprüft werden.

Bei LEW-ci2 Ratten der ersten Haltung sowie bei Kontrolltieren waren weder

Einschränkungen des Sehvermögen noch degenerative Veränderungen am Augenhintergrund

nachzuweisen. Im Gegensatz dazu zeigten LEW-ci2 Ratten der zweiten Haltung einen mittel-

bis hochgradigen Funktionsverlust der Photorezeptoren im ERG sowie eine starke

Degeneration dieser Zellen, die teilweise zu einem vollständigen Verlust der äußeren Retina

bei unverändertem Retinalen Pigmentepithel führte. Diese Symptomatik zeigt Parallelen zum

humanen Usher Syndrom.

Neben der Untersuchung des Augenphänotyps der LEW-ci2 Ratte wurden in der

Vergleichsstudie zusätzlich die Umwelt- und Haltungsbedingungen der beiden Tierhaltungen

gegenübergestellt. Unterschiede in Verhalten und Gewicht konnten auf verschiedene

Haltungsbedingungen (Einzel- vs. Gruppenhaltung) zurückgeführt werden. Diese stehen

ebenso wie die lediglich geringgradigen Differenzen der Umweltbedingungen beider

Haltungssystemen in keinem Zusammenhang mit den hochgradigen Veränderungen, die am

Augenhintergrund von LEW-ci2 Ratten der zweiten Tierhaltung vorlagen.

Da die retinale Symptomatik bei LEW-ci2 Ratten abhängig vom Haltungssystem auftrat oder

fehlte und da sowohl homozygote als auch heterozygote Tiere betroffen waren, obwohl der

vestibulo-cochleäre Phänotyp autosomal rezessiv vererbt wird, müssen Umweltfaktoren an

der Entstehung der Augenerkrankung beteiligt sein. Parallel gehaltene Kontrolltiere zeigten

jedoch keine Symptomatik. Es ist also davon auszugehen, dass ein genetischer Defekt (ci2-

Mutation) zugrundeliegt, der in Verbindung mit einem bisher unbekannten Umweltfaktor den

Augenphänotyp bei LEW-ci2 Tieren verursacht.


Trotz der Nähe zum Usher Protein Interaktom ist die Bedeutung des von der ci2-Mutation

betroffenen Myosin XV im Zusammenhang mit dem humanen Usher Syndrom bisher nicht

geklärt und sollte eingehend untersucht werden.

Die LEW-ci2 Ratte ist nach wie vor für die Erforschung von syndromaler Taubheit beim

Menschen geeignet. Ob die Mutante zusätzlich als Tiermodell für Taubblindheit eingesetzt

werden kann und welche Rolle die genetische Komponente bzw. die Umweltfaktoren bei der

Ausprägung der retinalen Symptomatik spielen, muss weiter untersucht werden.

7. Summary 125

7 Summary Nadine Held

Structural, functional and genetic analysis of the LEW/Ztm-ci2 rat - an animal model

for syndromal deafness

The LEW/Ztm-ci2 rat arose through a spontaneous mutation in the LEW/Ztm inbred strain in

1991. Homozygous mutants exhibit hereditary sensorineural deafness, locomotor

hyperactivity and vestibular dysfunctions such as circling behaviour, ataxia, opisthotonus and

an inability to swim. The symptoms are caused by a virtually complete loss of the cochlear

neuroepithelium and the surrounding ganglion cells. Furthermore LEW-ci2 rats display

restricted visual capability. The ci2-mutation was mapped to chromosome 10 (RNO10) by a

linkage analysis of a backcross population.

The primary aim of this study was to characterize the mutation that underlies the deviant

phenotype of the LEW-ci2 rat. After identifying the affected gene, a comparative study of the

human genome was carried out to establish a link between the ci2-mutation and the genetics

of human diseases with the objective to evaluate the LEW-ci2 rat as an animal model for

deafblindness. Another aim of this thesis was the characterization of the eye phenotype of the

LEW-ci2 rat.

By sequencing the candidate genes the ci2-mutation could be localized in the tail of the

myosin XV-gene. The point mutation in Myo15 causes the substitution of an amino acid in a

region of the protein that contains important binding sites for protein-protein interactions.

Since a regular expression of Myo15 was found in LEW-ci2 rats it was assumed that the

interaction between the myosin XV and other proteins was disturbed as a result of structural

changes or changes in the folding features of the protein.

Mutations in the myosin XV gene in humans are only known to be linked to hereditary

deafness. However, a connection to the Usher Protein Interactom has recently been found.

This macromolecular network is composed by proteins that are involved in the human Usher

Syndrome. This disease exhibits a broad clinical variety and may be accompanied by

congenital, sensorineural hardness of hearing or deafness, vestibular dysfunctions and a

progressive loss of the visual capability. The latter is caused by a Retinopathia pigmentosa

7. Summary 126

which is characterized by a degeneration of photoreceptor cells in the retina and eventually

leads to blindness.

The eye phenotype of the LEW-ci2 rat was analysed by a functional examination of the retina

using electroretinography (ERG) as well as histological evaluations of bulbi slides. First

investigations indicated a pathology that is linked to the type of housing system. In a

subsequent study LEW-ci2 rats kept under various housing conditions as well as control

animals of the coisogenic strain LEW were examined electrophysiologically and

histologically in a comparitive manner. In addition, environmental and housing conditions of

different animal rooms were compared. The aim was to prove the possible influence of those

factors on the development of the retinal disease. Interestingly, the LEW-ci2 rats housed in

the first unit and the controls exhibited an unaffected vision and no degenerative changes in

the eyeground. The mutants of the second unit on the other hand showed moderate to severe

loss in photoreceptor function caused by a severe degeneration of these cells which partially

lead to a complete loss of the outer retina whilst the Retinal Pigment Epithelium remained

unaltered. This pathology shows an analogy to the human Usher Syndrome.

In addition to the examination of the eye phenotype of the LEW-ci2 rat the environmental and

housing conditions of both animal rooms were examined in a comparative study. Differences

in behaviour and weight of animals that were detected were attributed to the differing housing

conditions. These differences as well as the slight differences of environmental condition of

both units could not be associated with the severe changes of the eyeground of the LEW-ci2

rats of the second unit. Since the retinal phenotype of the LEW-ci2 rat depends on the housing

system and homozygous as well as heterozygous LEW-ci2 rats were affected despite the fact

that the mode of inheritance of the vestibulo-chochlear phenotype is autosomal recessive,

environmental factors have to be involved in the origin of the eye disease. However control

animals that were housed parallel to the LEW-ci2 rats did not show any symptoms. Therefore

it is assumed that a genetic defect (ci2 mutation) in combination with an unknown

environmental factor has caused the eye phenotype of LEW-ci2 rats.

In spite of the closeness to the Usher Protein Interactome the importance of the Myosin XV in

connection with the human Usher Syndrome has so far not been clarified. Thus, additional

investigations have to be carried out.

The LEW-ci2 rat is however still qualified to be used as a research model for syndromale

deafness of humans. Further research have to be done to find out wheather the mutant strain

can additionally be used as an animal model for deafblindness and and to investigate the role

of genetic as well as environmental factors during the development of the eye disease.

8. Literaturverzeichnis 127

8 Literaturverzeichnis

Adato A, Michel V, Kikkawa Y, Reiners J, Alagramam KN, Weil D, Yonekawa H,

Wolfrum U, El-Amraoui A, Petit C (2005):

Interactions in the network of Usher syndrome type 1 proteins.

Hum Mol Genet 14:347-356

Aguglia U, Gambardella A, Le Piane E, Messina D, Russo C, Oliveri RL, Zappia M,

Quattrone A (1999):

Idiopathic generalized epilepsies with versive or circling seizures.

Acta Neurol Scand 99:219-224

Ahmed ZM, Riazuddin S, Wilcox ER (2003):

The molecular genetics of Usher syndrome.

Clin Genet 63:431-444

Alagramam KN, Murcia CL, Kwon HY, Pawlowski KS, Wright CG, Woychik RP

(2001):

The mouse Ames waltzer hearing-loss mutant is caused by mutation of Pcdh15, a novel

protocadherin gene.

Nat Genet 27:99-102

Alagramam KN, Yuan H, Kuehn MH, Murcia CL, Wayne S, Srisailpathy CR, Lowry

RB, Knaus R, Van Laer L, Bernier FP, Schwartz S, Lee C, Morton CC, Mullins RF,

Ramesh A, Van Camp G, Hageman GS, Woychik RP, Smith RJ (2001):

Mutations in the novel protocadherin PCDH15 cause Usher syndrome type 1F.


Alleva FR und Balazs T (1978):

Toxic effects of postnatal administration of streptomycin sulfate to rats.

Toxicol Appl Pharmacol 45:855-859,


Anderson DW, Probst FJ, Belyantseva IA, Fridell RA, Beyer L, Martin DM, Wu D,

Kachar B, Friedman TB, Raphael Y, Camper SA (2000):

The motor and tail regions of myosin XV are critical for normal structure and function of

auditory and vestibular hair cells.


Anderson KV, Coyle FP, O'Steen WK (1972):

Retinal degeneration produced by low-intensity colored light.

Exp Neurol 35:233-238

Ando M, Takeuchi S (1999):

Immunological identification of an inward rectifier K+ channel (Kir4.1) in the intermediate

cell (melanocyte) of the cochlear stria vascularis of gerbils and rats.

Cell Tissue Res 298:179-183

Avraham KB, Hasson T, Steel KP, Kingsley DM, Russell LB, Mooseker MS, Copeland

NG, Jenkins NA (1995):

The mouse Snell's waltzer deafness gene encodes an unconventional myosin required for

structural integrity of inner ear hair cells.

Nat Genet 11:369-375

Bach M und Kellner U (2000):

Elektrophysiologische Diagnostik in der Ophthalmologie.

Ophthalmologe 97:898-920

Baker JP und Titus MA (1998):

Myosins: matching functions with motors.

Curr Opin Cell Biol 10:80-86

Banin E, Cideciyan AV, Aleman TS, Petters RM, Wong F, Milam AH, Jacobson SG

(1999):

Retinal rod photoreceptor-specific gene mutation perturbs cone pathway development.

Neuron 23:549-557


Becker JB, Robinson TE, Lorenz KA (1982):

Sex differences and estrous cycle variations in amphetamine-elicited rotational behavior.

Eur J Pharmacol 80:65-72

Bellhorn RW (1980):

Lighting in the animal environment.

Lab Anim Sci 30:440-449

Belyantseva IA, Boger ET, Naz S, Frolenkov GI, Sellers JR, Ahmed ZM, Griffith AJ,

Friedman TB (2005):

Myosin-XVa is required for tip localization of whirlin and differential elongation of hair-cell

stereocilia.

Nat Cell Biol 7:148-156

Berg JS, Powell BC, Cheney RE (2001):

A millennial myosin census.

Mol Biol Cell 12:780-794

Bloom D, Hultcrantz M (1994):

Vestibular morphology in relation to age and circling behavior.

Acta Otolaryngol 114:387-392

Boeda B, el-Amraoui A, Bahloul A, Goodyear R, Daviet L, Blanchard S, Perfettini I,

Fath KR, Shorte S, Reiners J, Houdusse A, Legrain P, Wolfrum U, Richardson G, Petit

C (2002):

Myosin VIIa, harmonin and cadherin 23, three Usher I gene products that cooperate to shape

the sensory hair cell bundle.

Embo J 21:6689-6699

Boughman JA, Vernon M, Shaver KA (1983):

Usher syndrome: definition and estimate of prevalence from two high-risk populations.

J Chronic Dis 36:595-603


Brock JW, Ashby CR, Jr. (1996):

Evidence for genetically mediated dysfunction of the central dopaminergic system in the

stargazer rat.

Psychopharmacology (Berl) 123:199-205

Bryda EC, Ling H, Flaherty L (1997):

A high-resolution genetic map around waltzer on mouse chromosome 10 and identification of

a new allele of waltzer. Mamm Genome 8:1-4

Buss F, Arden SD, Lindsay M, Luzio JP, Kendrick-Jones J (2001):

Myosin VI isoform localized to clathrin-coated vesicles with a role in clathrin-mediated

endocytosis.

Embo J 20:3676-3684

Buss F, Luzio JP, Kendrick-Jones J (2001):

Myosin VI, a new force in clathrin mediated endocytosis.

FEBS Lett 508:295-299

Carlisle L, Steel K, Forge A (1990):

Endocochlear potential generation is associated with intercellular communication in the stria

vascularis: structural analysis in the viable dominant spotting mouse mutant.

Cell Tissue Res 262:329-337

Carlson JN, Glick SD, Hinds PA (1987):

Changes in d-amphetamine elicited rotational behavior in rats exposed to uncontrollable

footshock stress.

Pharmacol Biochem Behav 26:17-21

Carter CJ, Pycock CJ (1980):

Behavioural and biochemical effects of dopamine and noradrenaline depletion within the

medial prefrontal cortex of the rat.

Brain Res 192:163-176


Cavallotti C, Artico M, Pescosolido N, Feher J (2001):

Age-related changes in rat retina.

Jpn J Ophthalmol 45:68-75

Chaib H, Place C, Salem N, Dode C, Chardenoux S, Weissenbach J, el Zir E, Loiselet J,

Petit C (1996):

Mapping of DFNB12, a gene for a non-syndromal autosomal recessive deafness, to

chromosome 10q21-22.


Chwalisz WT, Koelsch BU, Kindler-Rohrborn A, Hedrich HJ, Wedekind D (2003):

The circling behavior of the deafblind LEW-ci2 rat is linked to a segment of RNO10

containing Myo15 and Kcnj12.

Mamm Genome 14:620-627

Cook S, Lane P (1993):

Re-mutation to Ames waltzer.

Mouse Genome 91:554

Cope MJTV, Whisstock J, Rayment I, Kendrick-Jones, J (1996):

Conservation within the myosin motor domain: implications for structure and function.

Structure 4:969-987

Cramer LP (2000):

Myosin VI: roles for a minus end-directed actin motor in cells.

J Cell Biol 150:F121-126

Dahme E, Weiss E (1999):

Grundriss der speziellen pathologischen Anatomie der Haustiere

Enke Verlag

Davenport S und Omenn G (1977):

Heterogeneity of Usher Syndrome.

Int Conf Birth Defects; Vth, Montreal


Deerberg F, Kaspareit J, Reetz IC (1989):

Circling (ci), a new neurological mutant in the rat.

Rat News Lett 21

Delprat B, Michel V, Goodyear R, Yamasaki Y, Michalski N, El-Amraoui A, Perfettini I,

Legrain P, Richardson G, Hardelin JP, Petit C (2005):

Myosin XVa and whirlin, two deafness gene products required for hair bundle growth, are

located at the stereocilia tips and interact directly.


Deol MS (1956):

The anatomy and development of the mutants pirouette, shaker-1 and waltzer in the mouse.

Proc R Soc Lond B Biol Sci 145:206-213

Deol MS und Green MC (1966):

Snell's waltzer, a new mutation affecting behaviour and the inner ear in the mouse.

Genet Res 8:339-345

Di Palma F, Holme RH, Bryda EC, Belyantseva IA, Pellegrino R, Kachar B, Steel KP,

Noben-Trauth K (2001):

Mutations in Cdh23, encoding a new type of cadherin, cause stereocilia disorganization in

waltzer, the mouse model for Usher syndrome type 1D.


Dobrovolskaia-Zavadskaia N (1928):

L´irradiation des testicules et l´heredite chez la souris.

Arch Biol 38:457-501

Donaldson IM (1986):

Volvular epilepsy.

A distinctive and underreported seizure type.

Arch Neurol 43:260-262


Ebermann I, Scholl HP, Charbel Issa P, Becirovic E, Lamprecht J, Jurklies B, Millan

JM, Aller E, Mitter D, Bolz H (2006):

A novel gene for Usher syndrome type 2: mutations in the long isoform of whirlin are

associated with retinitis pigmentosa and sensorineural hearing loss.

Hum Genet

Eichinger L, Lee SS, Schleicher M (1999):

Dictyostelium as model system for studies of the actin cytoskeleton by molecular genetics.

Microsc Res Tech 47:124-134

el-Amraoui A, Sahly I, Picaud S, Sahel J, Abitbol M, Petit C (1996):

Human Usher 1B/mouse shaker-1: the retinal phenotype discrepancy explained by the

presence/absence of myosin VIIA in the photoreceptor cells.


Ettaiche M, Heurteaux C, Blondeau N, Borsotto M, Tinel N, Lazdunski M (2001):

ATP-sensitive potassium channels (K(ATP)) in retina: a key role for delayed ischemic

tolerance.

Brain Res 890:118-129

Fedrowitz M, Potschka H, Richter A, Loscher W (2000):

A microdialysis study of striatal dopamine release in the circling rat, a genetic animal model

with spontaneous lateralized rotational behavior.

Neuroscience 97:69-77

Fiala B, Snow FM, Greenough WT (1977):

"Impoverished" rats weigh more than "enriched" rats because they eat more.

Dev Psychobiol 10:537-541

Fitzgerald LW, Miller KJ, Ratty AK, Glick SD, Teitler M, Gross KW (1992):

Asymmetric elevation of striatal dopamine D2 receptors in the chakragati mouse:

neurobehavioral dysfunction in a transgenic insertional mutant.

Brain Res 580:18-26


Friedman TB, Liang Y, Weber JL, Hinnant JT, Barber TD, Winata S, Arhya IN, Asher

JH, Jr. (1995):

A gene for congenital, recessive deafness DFNB3 maps to the pericentromeric region of

chromosome 17.

Nat Genet 9:86-91

Friedman TB, Sellers JR, Avraham KB (1999):

Unconventional myosins and the genetics of hearing loss.

Am J Med Genet 89:147-157

Gastaut H, Aguglia U, Tinuper P (1986):

Benign versive or circling epilepsy with bilateral 3-cps spike-and-wave discharges in late

childhood.

Ann Neurol 19:301-303

Gernert M, Bennay M, Fedrowitz M, Rehders JH, Richter A (2002):

Altered discharge pattern of basal ganglia output neurons in an animal model of idiopathic

dystonia.

J Neurosci 22:7244-7253

Gibbs D, Kitamoto J, Williams DS (2003):

Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher

syndrome 1B protein.

Proc Natl Acad Sci U S A 100:6481-6486

Gibson F, Walsh J, Mburu P, Varela A, Brown KA, Antonio M, Beisel KW, Steel KP,

Brown SD (1995):

A type VII myosin encoded by the mouse deafness gene shaker-1.

Nature 374:62-64

Glick SD und Greenstein S (1973):

Possible modulating influence of frontal cortex on nigro-striatal function.

Br J Pharmacol 49:316-321


Glick SD, Jerussi TP, Fleisher LN (1976):

Turning in circles: the neuropharmacology of rotation.

Life Sci 18:889-896

Glick SD, Meibach RC, Cox RD, Maayani S (1979):

Multiple and interrelated functional asymmetries in rat brain.

Life Sci 25:395-400

Glick SD, Cox RD (1978):

Nocturnal rotations in normal rats: correlation with amphetamine-induced rotation and effects

of nigrostriatal lesions.

Brain Res 150:149-161

Gockeln R, Lindemann S, Kamino K, Winter R, Hedrich HJ, Löscher W (2003):

Retinitis Pigmentosa in spontaneous rat mutants with sensorineural deafness and vestibular

dysfunction - a rodent model for Usher Syndrome phenotype 1.

Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44:E-Abstract 1861

Gorlin RJ, Toriello HV, Cohen MM (1995):

Hereditary hearing loss and its syndromes.

Oxford, Oxford University Press

Grignolo A, Orzalesi N, Castellazzo R, Vittone P (1969):

Retinal damage by visible light in albino rats. An electron microscope study.

Ophthalmologica 157:43-59

Hamel C (2006):

Retinitis pigmentosa.

Orphanet J Rare Dis 1:40

Hansen CT, Judge FJ, Whitney RA (1973):

Catalogue of NIH rodents

U.S. Department of Health, Education and Welfare. Washington, D.C.

DHEW Publ. No. 74-606


Hasson T, Gillespie PG, Garcia JA, MacDonald RB, Zhao Y, Yee AG, Mooseker MS,

Corey DP (1997):

Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia.

J Cell Biol 137:1287-1307

Hasson T, Heintzelman MB, Santos-Sacchi J, Corey DP, Mooseker MS (1995):

Expression in cochlea and retina of myosin VIIa, the gene product defective in Usher

syndrome type 1B.


Hasson T und Mooseker MS (1997):

The growing family of myosin motors and their role in neurons and sensory cells.

Curr Opin Neurobiol 7:615-623

Hasson T, Walsh J, Cable J, Mooseker MS, Brown SD, Steel KP (1997):

Effects of shaker-1 mutations on myosin-VIIa protein and mRNA expression.

Cell Motil Cytoskeleton 37:127-138

Hatch A, Balazs T, Wiberg GS (1963):

Long term isolation stress in rats.

Science 142:507

Heckenlively JR, Chang B, Erway LC, Peng C, Hawes NL, Hageman GS, Roderick TH

(1995):

Mouse model for Usher syndrome: linkage mapping suggests homology to Usher type I

reported at human chromosome 11p15.


Hedrich HJ (1990):

Genetic monitoring of inbred strains of rats.

Gustav Fischer Verlag, Stuttgart


Hibino H, Horio Y, Inanobe A, Doi K, Ito M, Yamada M, Gotow T, Uchiyama Y,

Kawamura M, Kubo T, Kurachi Y (1997):

An ATP-dependent inwardly rectifying potassium channel, KAB-2 (Kir4. 1), in cochlear stria

vascularis of inner ear: its specific subcellular localization and correlation with the formation

of endocochlear potential.

J Neurosci 17:4711-4721

Hilakivi LA, Ota M, Lister RG (1989):

Effect of isolation on brain monoamines and the behavior of mice in tests of exploration,

locomotion, anxiety and behavioral 'despair'.

Pharmacol Biochem Behav 33:371-374

Holme RH, Kiernan BW, Brown SD, Steel KP (2002):

Elongation of hair cell stereocilia is defective in the mouse mutant whirler.

J Comp Neurol 450:94-102

Isomoto S, Kondo C, Kurachi Y (1997):

Inwardly rectifying potassium channels: their molecular heterogeneity and function.

Jpn J Physiol 47:11-39

Jahnke K (1975):

The fine structure of freeze-fractured intercellular junctions in the guinea pig inner ear.

Acta Otolaryngol Suppl 336:1-40

Jerussi TP und Glick SD (1974):

Amphetamine-induced rotation in rats without lesions.

Neuropharmacology 13:283-286

Johnson KR, Gagnon LH, Webb LS, Peters LL, Hawes NL, Chang B, Zheng QY (2003):

Mouse models of USH1C and DFNB18: phenotypic and molecular analyses of two new

spontaneous mutations of the Ush1c gene.



Jonas JB, Schneider U, Naumann GO (1992):

Count and density of human retinal photoreceptors.

Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 230:505-510

Kacza J, Vahlenkamp TW, Enbergs H, Richt JA, Germer A, Kuhrt H, Reichenbach A,

Muller H, Herden C, Stahl T, Seeger J (2000):

Neuron-glia interactions in the rat retina infected by Borna disease virus.

Arch Virol 145:127-147

Kaiser A, Fedrowitz M, Ebert U, Zimmermann E, Hedrich HJ, Wedekind D, Loscher W

(2001):

Auditory and vestibular defects in the circling (ci2) rat mutant.

Eur J Neurosci 14:1129-1142

Kandel ER (1996):

Gehirn und Verhalten.

Kandel ER, Schwartz JH, Jessel TM (Hrsg.)

Neurowissenschaften

Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, p. 5-18

Karolyi IJ, Probst FJ, Beyer L, Odeh H, Dootz G, Cha KB, Martin DM, Avraham KB,

Kohrman D, Dolan DF, Raphael Y, Camper SA (2003):

Myo15 function is distinct from Myo6, Myo7a and pirouette genes in development of

cochlear stereocilia.


Karwoski C, Lu H, Newman E (1989):

Spatial buffering of light-evoked potassium increases by retinal Muller (glia) cells.

Science 244:578-580

Katz ML, Robison WG, Jr. (1986):

Evidence of cell loss from the rat retina during senescence.

Exp Eye Res 42:293-304


Kikkawa Y, Mburu P, Morse S, Kominami R, Townsend S, Brown SD (2005):

Mutant analysis reveals whirlin as a dynamic organizer in the growing hair cell stereocilium.


Kikuchi K und Hilding D (1936):

The development of the organ of Corti in the mouse. Acta Otolaryngol 60:207-222, 1965

King HD: A waltzing mutation in the white rat.

J Mammal 17:157-163

Kitamura K, Yagi M, Yoshikawa Y, Ochidubo F, Kato M (1991):

Vestibular pathology in a new-mutant mouse.

Acta Otolaryngol Suppl 481:121-124

Kitamura K, Yoshikawa Y, Ochikubo F (1991):

An ultrastructural study on vestibular sensory cells in a new-mutant mouse.


Kofuji P, Ceelen P, Zahs KR, Surbeck LW, Lester HA, Newman EA (2000):

Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice:

phenotypic impact in retina.

J Neurosci 20:5733-5740

Komurasaki Y, Nagineni CN, Wang Y, Hooks JJ (1996):

Virus RNA persists within the retina in coronavirus-induced retinopathy.

Virology 222:446-450

Kremer H, van Wijk E, Marker T, Wolfrum U, Roepman R (2006):

Usher syndrome: molecular links of pathogenesis, proteins and pathways.

Hum Mol Genet 15 Spec No 2:R262-270


Kupfermann I (1996):

Cortex und Kognition.

Kandel ER, Schwartz, J.H., Jessel, T.M. (Hrsg.)

Neurowissenschaften

Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, p. 353-368

Kusaka S, Horio Y, Fujita A, Matsushita K, Inanobe A, Gotow T, Uchiyama Y, Tano Y,

Kurachi Y (1999):

Expression and polarized distribution of an inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in rat

retinal pigment epithelium.

J Physiol 520 Pt 2:373-381

Kusaka S, Inanobe A, Fujita A, Makino Y, Tanemoto M, Matsushita K, Tano Y,

Kurachi Y (2001):

Functional Kir7.1 channels localized at the root of apical processes in rat retinal pigment

epithelium.

J Physiol 531:27-36

Lagrutta AA, Bond CT, Xia XM, Pessia M, Tucker S, Adelman JP (1996):

Inward rectifier potassium channels. Cloning, expression and structure-function studies.

Jpn Heart J 37:651-660

Lai YL, Jacoby RO, Jonas AM (1978):

Age-related and light-associated retinal changes in Fischer rats.

Invest Ophthalmol Vis Sci 17:634-638

Lalwani AK, Goldstein JA, Kelley MJ, Luxford W, Castelein CM, Mhatre AN (2000):

Human nonsyndromic hereditary deafness DFNA17 is due to a mutation in nonmuscle

myosin MYH9.

Am J Hum Genet 67:1121-1128

Lessenich A (2002):

Charakterisierung zweier Rattenmutanten mit spontanem Drehverhalten.

Hannover, Tierärztliche Hochschule Hannover, Ph.D. These


Letts VA Gervais JLM, Frankel WN (1994):

Remutation at the shaker-1 locus.

Mouse Genome 92

Levy G, Levi-Acobas F, Blanchard S, Gerber S, Larget-Piet D, Chenal V, Liu XZ,

Newton V, Steel KP, Brown SD, Munnich A, Kaplan J, Petit C, Weil D (1997):

Myosin VIIA gene: heterogeneity of the mutations responsible for Usher syndrome type IB.


Liang Y, Wang A, Belyantseva IA, Anderson DW, Probst FJ, Barber TD, Miller W,

Touchman JW, Jin L, Sullivan SL, Sellers JR, Camper SA, Lloyd RV, Kachar B,

Friedman TB, Fridell RA (1999):

Characterization of the human and mouse unconventional myosin XV genes responsible for

hereditary deafness DFNB3 and shaker 2.

Genomics 61:243-258

Liang Y, Wang A, Probst FJ, Arhya IN, Barber TD, Chen KS, Deshmukh D, Dolan DF,

Hinnant JT, Carter LE, Jain PK, Lalwani AK, Li XC, Lupski JR, Moeljopawiro S,

Morell R, Negrini C, Wilcox ER, Winata S, Camper SA, Friedman TB (1998):

Genetic mapping refines DFNB3 to 17p11.2, suggests multiple alleles of DFNB3, and

supports homology to the mouse model shaker-2.


Libby RT, Lillo C, Kitamoto J, Williams DS, Steel KP (2004):

Myosin Va is required for normal photoreceptor synaptic activity.

J Cell Sci 117:4509-4515

Libby RT und Steel KP (2001):

Electroretinographic anomalies in mice with mutations in Myo7a, the gene involved in human

Usher syndrome type 1B.



Liburd N, Ghosh M, Riazuddin S, Naz S, Khan S, Ahmed Z, Liang Y, Menon PS, Smith

T, Smith AC, Chen KS, Lupski JR, Wilcox ER, Potocki L, Friedman TB (2001):

Novel mutations of MYO15A associated with profound deafness in consanguineous families

and moderately severe hearing loss in a patient with Smith-Magenis syndrome.

Hum Genet 109:535-541

Lindemann S, Lessenich A, Ebert U, Loscher W (2001):

Spontaneous paroxysmal circling behavior in the ci2 rat mutant: epilepsy with rotational

seizures or hyperkinetic movement disorder?

Exp Neurol 172:437-445

Liu X, Ondek B, Williams DS (1998):

Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1 mice.


Liu X, Udovichenko IP, Brown SD, Steel KP, Williams DS (1999):

Myosin VIIa participates in opsin transport through the photoreceptor cilium.

J Neurosci 19:6267-6274

Liu XZ, Walsh J, Mburu P, Kendrick-Jones J, Cope MJ, Steel KP, Brown SD (1997):

Mutations in the myosin VIIA gene cause non-syndromic recessive deafness.


Lloyd RV, Vidal S, Jin L, Zhang S, Kovacs K, Horvath E, Scheithauer BW, Boger ET,

Fridell RA, Friedman TB (2001):

Myosin XVA expression in the pituitary and in other neuroendocrine tissues and tumors.

Am J Pathol 159:1375-1382

Lord EM und Gates WH (1929):

Shaker, a new mutation of the house mouse.

Am Nat 63:435-442


Loscher W, Richter A, Nikkhah G, Rosenthal C, Ebert U, Hedrich HJ (1996):

Behavioral and neurochemical dysfunction in the circling (ci) rat: a novel genetic animal

model of a movement disorder.


Ma J, Wang YC, Gan SY (2006):

Effects of electroacupuncture on behaviors and dopaminergic neurons in the rat of

Parkinson´s disease.

Zongquo Zhen Jiu 26:655-657, Abstract

Manstein DJ (1993):

Myosin function in the motile behaviour of cells.

Symp Soc Exp Biol 47:375-381

Manstein DJ, Schuster HP, Morandini P, Hunt DM (1995):

Cloning vectors for the production of proteins in Dictyostelium discoideum.

Gene 162:129-134

Manstein DJ, Titus MA, De Lozanne A, Spudich JA (1989):

Gene replacement in Dictyostelium: generation of myosin null mutants.

Embo J 8:923-932

Marcus DC, Wu T, Wangemann P, Kofuji P (2002):

KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential.

Am J Physiol Cell Physiol 282:C403-407

Marmor MF und Zrenner E (1999):

Standard for clinical electroretinography (1999 update).

Doc Ophthalmol 97:143-156

Marmor MF, Holder GE, Seeliger MW, Yamamoto S (2004):

Standard for clinical electroretinography (2004 update).

Doc Ophthalmol 108:107-114


Matthew M und La Vail, MM (1976):

Survival of some photoreceptor cells in albino rats following longterm exposure to continous

light.

Invest Ophthalmol Vis Sci 15:64

Mburu P, Kikkawa Y, Townsend S, Romero R, Yonekawa H, Brown SD (2006):

Whirlin complexes with p55 at the stereocilia tip during hair cell development.


Mburu P, Mustapha M, Varela A, Weil D, El-Amraoui A, Holme RH, Rump A,

Hardisty RE, Blanchard S, Coimbra RS, Perfettini I, Parkinson N, Mallon AM,

Glenister P, Rogers MJ, Paige AJ, Moir L, Clay J, Rosenthal A, Liu XZ, Blanco G, Steel

KP, Petit C, Brown SD (2003):

Defects in whirlin, a PDZ domain molecule involved in stereocilia elongation, cause deafness

in the whirler mouse and families with DFNB31.


McDermott JL (1993):

Effects of estrogen upon dopamine release from the corpus striatum of young and aged female

rats.

Brain Res 606:118-125

Melchionda S, Ahituv N, Bisceglia L, Sobe T, Glaser F, Rabionet R, Arbones ML,

Notarangelo A, Di Iorio E, Carella M, Zelante L, Estivill X, Avraham KB, Gasparini P

(2001):

MYO6, the human homologue of the gene responsible for deafness in Snell's waltzer mice, is

mutated in autosomal dominant nonsyndromic hearing loss.


Mermall V, McNally JG, Miller KG (1994):

Transport of cytoplasmic particles catalysed by an unconventional myosin in living

Drosophila embryos.

Nature 369:560-562


Mermall V, Post PL, Mooseker MS (1998):

Unconventional myosins in cell movement, membrane traffic, and signal transduction.

Science 279:527-533

Mikaelian DO, Ruben RJ (1964):

Hearing Degeneration in Shaker-1 Mouse. Correlation of Physiological Observations with

Behavioral Responses and with Cochlear Anatomy.

Arch Otolaryngol 80:418-430

Mooseker MS und Cheney RE (1995):

Unconventional myosins.

Annu Rev Cell Dev Biol 11:633-675

Narayan O, Herzog S, Frese K, Scheefers H, Rott R (1983):

Pathogenesis of Borna disease in rats: immune-mediated viral ophthalmoencephalopathy

causing blindness and behavioral abnormalities.

J Infect Dis 148:305-315

Ng PC und Henikoff S (2003):

SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.

Nucleic Acids Res 31:3812-3814

Nickerson DA, Tobe VO, Taylor SL (1997):

PolyPhred: automating the detection and genotyping of single nucleotide substitutions using

fluorescence-based resequencing.

Nucleic Acids Res 25:2745-2751

Nicklas W, Baneux P, Boot R, Decelle T, Deeny AA, Fumanelli M, Illgen-Wilcke B

(2002):

Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and

experimental units.

Lab Anim 36:20-42


Noell WK, Walker VS, Kang BS, Berman S (1966):

Retinal damage by light in rats.

Invest Ophthalmol 5:450-473

Oakley B, 2nd, Green DG (1976):

Correlation of light-induced changes in retinal extracellular potassium concentration with c-

wave of the electroretinogram.

J Neurophysiol 39:1117-1133

Osako S und Hilding DA (1971):

Electron microscopic studies of capillary permeability in normal and ames waltzer deaf mice.


Paige AJ, Kiernan BW, Varela A, Rogers MJ, Hughes D, Steel KP, Brown SD (2000):

A deletion on chromosome 4 cosegregates with the whirler deafness mutation: exclusion of

Orm1 as a candidate.


Pakarinen L, Karjalainen S, Simola KO, Laippala P, Kaitalo H (1995):

Usher's syndrome type 3 in Finland.

Laryngoscope 105:613-617

Parker V und Morinan A. (1986):

The socially-isolated rat as a model for anxiety.

Neuropharmacology 25:663-664

Petit C (2001):

Usher syndrome: from genetics to pathogenesis.

Annu Rev Genomics Hum Genet 2:271-297

Probst FJ, Fridell RA, Raphael Y, Saunders TL, Wang A, Liang Y, Morell RJ,

Touchman JW, Lyons RH, Noben-Trauth K, Friedman TB, Camper SA (1998):

Correction of deafness in shaker-2 mice by an unconventional myosin in a BAC transgene.

Science 280:1444-1447


Pycock CJ (1980):

Turning behaviour in animals.


Rabbath G, Necchi D, de Waele C, Gasc JP, Josset P, Vidal PP (2001):

Abnormal vestibular control of gaze and posture in a strain of a waltzing rat.

Exp Brain Res 136:211-223

Ramelli GP, Donati F, Kollar M, Remonda L, Vassella F (1999):

Rotatory seizures in a patient with tuberous sclerosis.

Epileptic Disord 1:233-235

Ratty AK, Fitzgerald LW, Titeler M, Glick SD, Mullins JJ, Gross KW (1990):

Circling behavior exhibited by a transgenic insertional mutant.

Brain Res Mol Brain Res 8:355-358

Redowicz MJ (1999):

Myosins and deafness.

J Muscle Res Cell Motil 20:241-248

Reimann F und Ashcroft FM (1999):

Inwardly rectifying potassium channels.

Curr Opin Cell Biol 11:503-508

Reiners J, Nagel-Wolfrum K, Jurgens K, Marker T, Wolfrum U (2006):

Molecular basis of human Usher syndrome: deciphering the meshes of the Usher protein

network provides insights into the pathomechanisms of the Usher disease.

Exp Eye Res 83:97-119

Reiners J, Reidel B, El-Amraoui A, Boeda B, Huber I, Petit C, Wolfrum U (2003):

Differential distribution of harmonin isoforms and their possible role in Usher-1 protein

complexes in mammalian photoreceptor cells.



Richter A, Ebert U, Nobrega JN, Vallbacka JJ, Fedrowitz M, Loscher W (1999):

Immunohistochemical and neurochemical studies on nigral and striatal functions in the

circling (ci) rat, a genetic animal model with spontaneous rotational behavior.


Rinchik EM, Carpenter DA, Selby PB (1990):

A strategy for fine-structure functional analysis of a 6- to 11-centimorgan region of mouse

chromosome 7 by high-efficiency mutagenesis.


Robbins SG, Hamel CP, Detrick B, Hooks JJ (1990):

Murine coronavirus induces an acute and long-lasting disease of the retina.

Lab Invest 62:417-426

Rogers MJ, Fleming J, Kiernan BW, Mburu P, Varela A, Brown SD, Steel KP (1999):

Genetic mapping of the whirler mutation.


Ross DA und Glick SD (1981):

Lateralized effects of bilateral frontal cortex lesions in rats.

Brain Res 210:379-382

Rozengurt N, Lopez I, Chiu CS, Kofuji P, Lester HA, Neusch C (2003):

Time course of inner ear degeneration and deafness in mice lacking the Kir4.1 potassium

channel subunit.

Hear Res 177:71-80

Saka E, Saygi S, Ciger A, Selekler K (1996):

Circling seizures.

Seizure 5:299-302

Schaible RH (1956):

Mouse News Lett. 15


Schlingmann F, De Rijk, S.H.L.M., Pereboom, W.J. und Remie, R. (1993):

"Avoidance" as a behavioural parameter in the determination of distress amongst albino and

pigmented rats at various light intensities.

Anim Technol 44:87-95

Seeliger MW, Zrenner E, Apfelstedt-Sylla E, Jaissle GB (2001):

Identification of Usher syndrome subtypes by ERG implicit time.


Seitz R, Weisse, I. und Stötzer H. (1977):

Altersbedingte und lichtabhängige Netzhautveränderungen.

Klin Monatsbl Augenheilkd 171:432

Self T, Mahony M, Fleming J, Walsh J, Brown SD, Steel KP (1998):

Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of

cochlear hair cells.

Development 125:557-566

Sellers JR (1999):

Myosin . Protein Profile.

Oxford, Oxford University Press

Sellers JR (2000):

Myosins: a diverse superfamily.

Biochim Biophys Acta 1496:3-22

Shapiro RM, Glick SD, Hough LB (1986):

Striatal dopamine uptake asymmetries and rotational behavior in unlesioned rats: revising the

model?

Psychopharmacology (Berl) 89:25-30


Shiells RA, Falk G (1999):

Contribution of rod, on-bipolar, and horizontal cell light responses to the ERG of dogfish

retina.

Vis Neurosci 16:503-511

Shimura M, Yuan Y, Chang JT, Zhang S, Campochiaro PA, Zack DJ, Hughes BA

(2001): Expression and permeation properties of the K(+) channel Kir7.1 in the retinal

pigment epithelium.

J Physiol 531:329-346

Shnerson A, Lenoir M, van de Water TR, Pujol R (1983):

The pattern of sensorineural degeneration in the cochlea of the deaf shaker-1 mouse:

ultrastructural observations.

Brain Res 285:305-315

Siemens J, Kazmierczak P, Reynolds A, Sticker M, Littlewood-Evans A, Muller U

(2002):

The Usher syndrome proteins cadherin 23 and harmonin form a complex by means of PDZ-

domain interactions.


Smits BM, Peters TA, Mul JD, Croes HJ, Fransen JA, Beynon AJ, Guryev V, Plasterk

RH, Cuppen E (2005):

Identification of a rat model for usher syndrome type 1B by N-ethyl-N-nitrosourea

mutagenesis-driven forward genetics.

Genetics 170:1887-1896

Spandau UH, Rohrschneider K (2002):

Prevalence and geographical distribution of Usher syndrome in Germany.

Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 240:495-498

Stades FC, Neumann W, Boevé M, Spiess B, Wyman M. (2006):

Praktische Augenheilkunde für den Tierarzt.

Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG


Stahl T, Mohr C, Kacza J, Reimers C, Pannicke T, Sauder C, Reichenbach A, Seeger J

(2003):

Characterization of the acute immune response in the retina of Borna disease virus infected

Lewis rats.

J Neuroimmunol 137:67-78

Steel KP und Bock GR (1983):

Cochlear dysfunction in the jerker mouse.

Behav Neurosci 97:381-391

Steinberg RH, Oakley B, 2nd, Niemeyer G (1980):

Light-evoked changes in [K+]0 in retina of intact cat eye.

J Neurophysiol 44:897-921

Stötzer H, Weisse, I., Knappen, F. und Seitz, R. (1970):

Die Retinadegeneration der Ratte.

Arzneim.-Forsch. 20:811-817

Stranahan AM, Khalil D, Gould E (2006):

Social isolation delays the positive effects of running on adult neurogenesis.

Nat Neurosci 9:526-533

Takeuchi S, Ando M, Kakigi A (2000) :

Mechanism generating endocochlear potential: role played by intermediate cells in stria

vascularis.

Biophys J 79:2572-2582

Tian N und Slaughter MM (1995):

Correlation of dynamic responses in the ON bipolar neuron and the b-wave of the

electroretinogram.

Vision Res 35:1359-1364


Tilgner S (1966):

Die Anatomie des Auges der Ratte und seiner Adnexe.

Halle

Titus MA (1999) :

A class VII unconventional myosin is required for phagocytosis.

Curr Biol 9:1297-1303

Tlili A, Charfedine I, Lahmar I, Benzina Z, Mohamed BA, Weil D, Idriss N, Drira M,

Masmoudi S, Ayadi H (2005):

Identification of a novel frameshift mutation in the DFNB31/WHRN gene in a Tunisian

consanguineous family with hereditary non-syndromic recessive hearing loss.

Hum Mutat 25:503

Tlili A, Mannikko M, Charfedine I, Lahmar I, Benzina Z, Ben Amor M, Driss N, Ala-

Kokko L, Drira M, Masmoudi S, Ayadi H (2005):

A novel autosomal recessive non-syndromic deafness locus, DFNB66, maps to chromosome

6p21.2-22.3 in a large Tunisian consanguineous family.

Hum Hered 60:123-128

Trinka E, Staffen, W., Ladurner, G. und Baumgarner, C. (1997):

Clinical, EEG and MRI findings in 5 patients with gyratory seizures.

Epilepsia 38:160

Truett GE, Brock JW, Lidl GM, Kloster CA (1994):

Stargazer (stg), new deafness mutant in the Zucker rat.

Lab Anim Sci 44:595-599

Tsiavaliaris, G (2002)

Functional characterization of engineered myosin motors and myosin II relay loop mutants by

combining solution kinetics, in vitro motility assays and single molecule techniques

Heidelberg, Ph.D. These


Tuxworth RI und Titus MA (2000):

Unconventional myosins: anchors in the membrane traffic relay.

Traffic 1:11-18

Tzekov RT, Locke KG, Hood DC, Birch DG (2003):

Cone and rod ERG phototransduction parameters in retinitis pigmentosa.


Ungerstedt U (1968):

6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons.

Eur J Pharmacol 5:107-110

Ungerstedt U (1971):

Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational

behaviour.

Acta Physiol Scand Suppl 367:49-68

Ungerstedt U und Arbuthnott GW (1970):

Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the

nigrostriatal dopamine system.

Brain Res 24:485-493

Valle FP (1971):

Rats performance on repeated tests in open field as a function of age.

Pychonomic Sci 23:333-335

van Wijk E, van der Zwaag B, Peters T, Zimmermann U, Te Brinke H, Kersten FF,

Marker T, Aller E, Hoefsloot LH, Cremers CW, Cremers FP, Wolfrum U, Knipper M,

Roepman R, Kremer H (2006):

The DFNB31 gene product whirlin connects to the Usher protein network in the cochlea and

retina by direct association with USH2A and VLGR1.



Vaughan DK, Coulibaly SF, Darrow RM, Organisciak DT (2003):

A morphometric study of light-induced damage in transgenic rat models of retinitis

pigmentosa.


Vercueil L, Kahane P, Francois-Joubert A, Hirsch E, Hoffmann D, Depaulis A,

Marescaux C (1999):

Basal ganglia involvement in rotational seizures.

Epileptic Disord 1:107-112

Verpy E, Leibovici M, Zwaenepoel I, Liu XZ, Gal A, Salem N, Mansour A, Blanchard S,

Kobayashi I, Keats BJ, Slim R, Petit C (2000):

A defect in harmonin, a PDZ domain-containing protein expressed in the inner ear sensory

hair cells, underlies Usher syndrome type 1C.

Nat Genet 26:51-55,

Walls GL (1934):

The visual cells of the white rat.

J comp psychol 18:363

Wang A, Liang Y, Fridell RA, Probst FJ, Wilcox ER, Touchman JW, Morton CC,

Morell RJ, Noben-Trauth K, Camper SA, Friedman TB (1998):

Association of unconventional myosin MYO15 mutations with human nonsyndromic

deafness DFNB3.

Science 280:1447-1451

Wang Y, Detrick B, Yu ZX, Zhang J, Chesky L, Hooks JJ (2000):

The role of apoptosis within the retina of coronavirus-infected mice.


Wayne S, Der Kaloustian VM, Schloss M, Polomeno R, Scott DA, Hejtmancik JF,

Sheffield VC, Smith RJ (1996):

Localization of the Usher syndrome type ID gene (Ush1D) to chromosome 10.



Weil D, Blanchard S, Kaplan J, Guilford P, Gibson F, Walsh J, Mburu P, Varela A,

Levilliers J, Weston MD, et al. (1995):

Defective myosin VIIA gene responsible for Usher syndrome type 1B.

Nature 374:60-61

Weisse I, Stotzer H, Seitz R (1974):

Age- and light-dependent changes in the rat eye.

Virchows Arch A Pathol Anat Histol 362:145-156

Weston MD, Kelley PM, Overbeck LD, Wagenaar M, Orten DJ, Hasson T, Chen ZY,

Corey D, Mooseker M, Sumegi J, Cremers C, Moller C, Jacobson SG, Gorin MB,

Kimberling WJ (1996):

Myosin VIIA mutation screening in 189 Usher syndrome type 1 patients.


Wible BA, De Biasi M, Majumder K, Taglialatela M, Brown AM (1995):

Cloning and functional expression of an inwardly rectifying K+ channel from human atrium.

Circ Res 76:343-350

Willig F, Palacios A, Monmaur P, M'Harzi M, Laurent J, Delacour J (1987):

Short-term memory, exploration and locomotor activity in aged rats.

Neurobiol Aging 8:393-402

Wongwitdecha N und Marsden CA (1996):

Social isolation increases aggressive behaviour and alters the effects of diazepam in the rat

social interaction test.

Behav Brain Res 75:27-32

Yonezawa S, Yoshiki A, Hanai A, Matsuzaki T, Matsushima J, Kamada T, Kusakabe M

(1999):

Chromosomal localization of a gene responsible for vestibulocochlear defects of BUS/Idr

mice: identification as an allele of waltzer.

Hear Res 134:116-122


Yuan Y, Shimura M, Hughes BA (2003):

Regulation of inwardly rectifying K+ channels in retinal pigment epithelial cells by

intracellular pH.

J Physiol 549:429-438

Zaritsky JJ, Eckman DM, Wellman GC, Nelson MT, Schwarz TL (2000):

Targeted disruption of Kir2.1 and Kir2.2 genes reveals the essential role of the inwardly

rectifying K(+) current in K(+)-mediated vasodilation.

Circ Res 87:160-166

9. Anhang I, Material & Methoden 157

9 Anhang I, Material & Methoden

9.1 Materialien, Programme und Bezugsquellen; Internet-Adressen

9.1.1 Materialien

Chemikalien

Acrylamid AppliChem

Agar Bacteriological OXOID

AP Alkalische Phosphatase

APS Serva, Heidelberg

ATP Sigma

dATP Sigma

Bacto Yeast Extract Becton, Dickenson & Co

BigDYE Applied Biosystems

Borsäure (89mM) Roth, Karlsruhe

Bromphenol Blau Sigma

Comassie Brilliant Blue G 250 Serva, Heidelberg

Comassie Brilliant Blue R 250 Serva, Heidelberg

CaCl2.H2O Merck, Darmstadt

CaCl2.2H2O Fluka

DTT Merck, Darmstadt; Fluka

EDTA (2mM) Roth, Karlsruhe

EDTA (TitriplexII) Merck, Darmstadt

EGTA (TitriplexVI) Merck, Darmstadt

Essigsäure 100% J.T.Baker

Ethanol absolut J.T.Baker

Formaldehyd reinst, mind. 35% Merck, Darmstadt

Formamid reinst Merck, Darmstadt

Glucose Sigma

Glutaraldehyd, 25% Serva, Heidelberg


Glycerin Merck, Darmstadt

Glycerin (99%) Serva, Heidelberg

IPTG Sigma

KH2PO4 Merck, Darmstadt

Leupeptin Sigma

2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

MES Sigma

Methanol 100% J.T.Baker

MgCl2-Lösung (25mM) Peqlab Biotechnologie, Erlangen

MgCl2.6H2O Merck, Darmstadt

MOPS Roth, Karlsruhe

Natriumacetat Roth, Karlsruhe

NaCl Aldrich

NaH2PO4.2H2O Fluka

Pepstatin A Sigma

Pepton Serva, Heidelberg

o-Phenantrolin.H2O Sigma

Phosphatpuffer, 100 mM Merck, Darmstadt

PMSF Sigma

Proteose Peptone Becton, Dickenson & Co

RNase AWAY Roth, Karlsruhe

SDS Merck, Darmstadt

Sucrose Sigma

TAME Fluka

TEMED Merck, Darmstadt

TPCK Sigma

Tris Merck, Darmstadt; AppliChem

Tris(hydroxymethyl) Roth, Karlsruhe

Triton-X 100 Merck, Darmstadt

Tween-20 Merck, Darmstadt

Xgal Fermentas


Geräte

Automated Gel Stainer Pharmacia Biotech

Digital Lux Meter, RO-1332 roline

Digitalkamera DC 120 Zoom Kodak, Rochester (N.Y.), USA

Dunkelschrank Forschungswerkstätten der Medizinischen

Hochschule Hannover

Elektrophoresekammer Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule

Hannover

Elektroporator, Gene Pulser Xcell

Electroporation System Bio-Rad

Ganzfeldkugel Roland Consult, Brandenburg/ Wiesbaden

Magnetrührer IKA® RH-KT/C Omnilab

Magnetrührer MR 2002 Heildolph, Schwabach

Mikrowelle R-330A Sharp (Europe), Hamburg

Mikroskop CK2 Olympus

Minishaker IKA® IKA Laboratory Equipment, Wilmington, NC,

USA

Netzgerät PP2200 Biometra, Göttingen

Netzgerät Desatronic Desaga, Heidelberg

Netzgerät MBP 3000 EP IBI

Opticon Real Time Cycler MJ Research, USA

pH-Meter Calimatic 761 Jürgens

Photometer:

DU 800 Spectrophotometer Beckman Coulter

GeneQuant II Pharmacia Biotech, Cambridge, UK

Rotlichtlampe

dark room lamp (E27PF712E) Philips

SDS PAA-Gel- Dokumentation:

Chemidoc Bio-Rad

SDS PAGE Apparatur:

Mini-Protean Bio-Rad

Thermocycler "GeneAmp9700" Applied Biosystems

Thermocycler "Opticon" MJ Research, Watertown (Ma), USA


Thermocycler PTC-200 MJ Research, Watertown (Ma), USA

Thermomixer 5436 Firma Eppendorf-Nethler-Hinz, Hamburg

UV-Transilluminator 312 nm Bachofer, Reutlingen

Vortexer Vibrofix VF1 Janke&Kunkel, Staufen

Zentrifugen und Rotoren:

Avanti Centrifuge J-20 XP Beckman Coulter

Rotoren: -JLA 16.250

-JA 25.50

Biofuge fresco Heraeus Instruments, Osterode

Biofuge pico Heraeus Instruments, Osterode

Verbrauchsmaterialien

Agarosen:

NuSieve Agarose Cambrex Bioscience, Rockland, ME, USA

SeaKem® LE Agarose Cambrex Bioscience, Rockland, ME, USA

Antibiotika:

Ampicillin Serva, Heidelberg

Penicillin G 10000 U/ml +

Streptomycin 10000 µg/ml GIBCO

G418 Sulfat (Geneticin) Calbiochem

Aqua dest. (steril) Eigenproduktion

Bacillol® AF Bode Chemie, Hamburg

Dstroy-Sticks Biozym, Hessisch Oldendorf

Elektroden:

Subdermal Nadelelektroden Roland Consult, Brandenburg/ Wiesbaden

Ringelektroden, Gold Roland Consult, Brandenburg/ Wiesbaden

Enzyme:

Calf Intestine Alcaline

Phosphatase 1U/µl Boehringer-Mannheim

EcoRI Fermentas

NheI Fermentas

XhoI Fermentas

Ethidiumbromidlösung Serva, Heidelberg


(10 mg/ml)

Falcon tubes (15 ml, 50ml) Sarstedt (greiner bio-one)

Gel Star (10000fach konz.) Biozym, Hessisch Oldendorf

Gene Pulser Cuvettes 0,4 cm Bio-Rad

Histoform S Heraeus Kulzer, Wehrheim

Low-Profile Mikrotiterplatten ABgene, Hamburg

Makrolon® -Käfige

Marker:

DNA-Standardgrößenmarker Roche, Basel, CH

(DNA Molecular Weight

Marker XIV, 100 base pair lader)

Page Ruler Protein Ladder US Biological

10-200 kDa

Medikamente:

Narkotika

Ketamin-Gräub® (Ketamin, 10%) Albrecht, Aulendorf

Rompun® (Xylazin, 2%) Bayer, Leverkusen

Mydriatika

Mydriatikum Stulln® (Tropicamid) Pharma Stulln

Neosynephrin POS® (10%) Ursapharm, Saarbrücken

(Phenylephrinhydrochlorid)

Lokalanästhetika

Proparacain POS® Ursapharm, Saarbrücken

(Proxymetacainhydrochlorid, 0,5%) Tränenersatz/Kornealschutz

Thilo Tears Gel Alcon Pharma GmbH, Freiburg

Mikroorganismen:

E. coli xL-1 Blue, K12

Dictyostelium discoideum AX3-Orf+-Zellen (Manstein et al., 1989)

Mikrotiterplatten, 96er Roth, Karlsruhe

dNTP-Gemisch Peqlab Biotechnologie, Erlangen

Nunclon Delta Surface 24-well-Platten Nunc

Oligo(dT)12-18Primer (20mM) Invitrogen

Omniskript RT 4U/µl Qiagen, Hilden


Orange G Sigma, St. Louis (Mo), USA

Pipetten:

Pipetten Eppendorf, Köln

Pipetten (1-1000µl) Gilson

Pipetten (5,10,25ml) Sarstedt

Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht

Plasmide:

pM 765-TEV (5µg/ml) Eigenherstellung, BPC, MHH

Polymerasen:

AmpliTaq Gold® Applied Biosystems, Roche, New Jersey, USA

Phusion High-Fidelity Polym. Finnzymes, Finnland

Taq Polymerase 5U/µl Biotherm

Primer Roth, Karlsruhe

Puffer:

buffer O Fermentas

2.5x dilution buffer Applied Biosystems

10xReaktionspuffer Y Peqlab Biotechnologie, Erlangen

Tango Fermentas

Reaktionsgefäße Eppendorf, Köln

Sarstedt

RNasin® Ribonuklease Inhibitor Promega, Madison, WI, USA

Sybr Green I Biozym, Hess. Oldendorf

Technovit 7100 Heraeus Kulzer, Wehrheim

Tissue Culture Dish 100x20mm Sarstedt


Puffer und Lösungen

Puffer für die Elektrophorese

Ladepuffer 30% Glyzerin

0,05% Orange G

dH2O

10xTBE (pH 8.3) 89 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

89 mM Borsäure

2 mM EDTA

10xMOPS (pH 7.0) 1 mM MOPS

40 mM Natriumacetat

5 mM EDTA

Puffer und Lösungen für proteinbiochemische Arbeiten

100xProtease-Inhibitor Mix I 10 mg/ml TAME

8 mg/ml TPCK

0.2 mg/ml Pepstatin A

0.5 mg/ml Leupeptin

in Ethanol abs.

100xProtease-Inhibitor Mix II 200 mM o-Phenantrolin

100 mM PMSF

in Ethanol abs.

Lysispuffer 50 mM Tris/HCl pH 8.0

2.5 mM EDTA

0.2 mM EGTA


Lysispuffer 1 Lysispuffer

6 U/ml AP

10 µl/ml Protease-Inhibitor Mix I

(frisch hinzufügen)

1 µl/ml Protease-Inhibitor Mix II

(frisch hinzufügen)


1% v/v Triton-X100

Protease-Inhibitor Mix I (frisch hinzufügen)

Protease-Inhibitor Mix II (frisch hinzufügen)


12 mM MgCl2

10 mM ATP (frisch hinzufügen)

Protease-Inhibitor Mix I (frisch hinzufügen)

Protease-Inhibitor Mix II (frisch hinzufügen)

Thrombinpuffer 25 mM Tris/HCl (pH 7.0)

25 mM NaCl

2.5 mM CaCl2

SDS-PAA Sammelgelpuffer 1 M Tris/HCl (pH 6.8)

SDS-PAA Trenngelpuffer 1.5 M Tris/HCl (pH 8.8)

6xProteinauftragspuffer 350 mM Tris (pH 6.8)

36% Glycerin

600 mM DTT

10% SDS

0.01% Bromphenol Blau


10x Laufpuffer (nach Lämmli) 30.2 g Tris

142.6 g Glycerin

1% SDS

Coomassie Blue-Färbelösung 2 g Coomassie Brilliant Blue G 250

0.5 g Coomassie Brilliant Blue R 250

426 ml Ethanol 95%

50 ml Methanol 100%

100 ml Essigsäure 100%

ad 1l H2O

Puffer für Arbeiten mit Dictyostelium discoideum

Elektroporationspuffer 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.1)

(DD-EP Buffer) 50 mM Sucrose

MES-Puffer 20 mM MES (pH 6.8)

0,2 mM CaCl2

2 mM MgCl2

Fixationslösung für die Histologie

5%ige Glutaraldehydlösung 20 ml Glutaraldehyd (25%ig)

80 ml Phosphatpuffer (100 mM)

Phosphatpuffer (pH 7.2-7.4) 75 mM Na2HPO4

25 mM KH2PO4

dH2O


Medien und Nährböden

Luria Bertani-Kulturmedium (LB) 1% (w/v) Pepton

für E.coli (pH 7.0) 1% (w/v) Hefeextrakt

0,5% (w/v) NaCl

evtl. 100 mg/l Ampicillin

HL-5c Medium (pH 6.6) 10 g/l Proteose Peptone

5 g/l Bacto Yeast Extract

10 g/l Glucose

1.2 g/l KH2PO4

0.4 g/l Na2HPO4

frisch zusetzen:

Penicillin/Streptomycin 2 µl/ml (P/S)

G418 Sulfat 10 µg/ml (G10)

LBAmp-Agar (pH 7.0) 1% (w/v) Pepton

1% (w/v) Hefeextrakt

0,5% (w/v) NaCl

2% Agar Bacteriological

75 mg/l Ampicillin

MES-Agar 20 mM MES

0,2 mM CaCl2

2 mM MgCl2

2% Agar Bacteriological

Kits

NucleoSpin® Extract Kit Macherey-Nagel, Düren, D

NucleoSpin® RNAII Macherey-Nagel, Düren, D

NucleoSpin Tissue Kit Macherey-Nagel, Düren, D

pGEM®-T Easy Vector System I Promega, Madison, WI, USA


QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, D

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden, D

QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, D

RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit Qiagen, Hilden, D

Super Signal Dura West Extended

Duration Substrate PIERCE

9.1.2 Programme

Clone Manager Scientific & Educational Software (1999),

Version 5.20

Oligo 6.0 Molecular Biology Insights, Cascade (Co), USA

PolyPhen

Qgene http://www.qgene.com

RetiSystem Roland Consult, Brandenburg/Wiesbaden

SIFT http://blocks.fhcrc.org.sift/SIFT.html

9.1.3 world-wide-web-Adressen

http://www.rgd.mcw.edu (Rat Genome Database)

http://www.informatics.jax.org (Jackson Laboratories Genome Informatics)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (National Center for Biotechnology Information)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html (NCBI,Rat Genome Blast)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html (NCBI, Blast 2 Sequences)

http://www.ensembl.org/ (Ensembl Genome Server)

http://www.ucsc.edu/ (UCSC Genome Bioinformatics)

http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html (BCM Search Launcher)

http://www.ensembl.org/Rattus_norwegicus/geneview/ (Ensembl Geneview)

http://smart.embl-heidelberg.de (Simple Modular Architecture Research Tool)

http://www.expasy.org (ExPASy Proteomics Server)

http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html (Fermentas, Double Digest)

http://www.expasy.org/tools/dna.html (ExPASy Translate Tool)


http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html (REBASE Homepage)

http://www.sanger.ac.uk (Sanger Institute, Genome Research)

http://www.sanger.ac.uk/software/pfam/ (Pfam - Sanger)

http://limstill.niob.knaw.nl (LIMSTILL)


9.2 Methoden

9.2.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure

9.2.1.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure mit dem NucleoSpin® Tissue Kit

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Prä-Lysispuffer T1

Lysispuffer B3

Waschpuffer BW

Waschpuffer B5

Elutionspuffer BE

Proteinase K Lösung

NucleoSpin® Tissue Säulen

25 mg Gewebe wurden mit 180 µl Pre-Lysispuffer versetzt und mit einer sterilen Schere

zerkleinert. Nach Zugabe von 25 µl Proteinase K-Lösung wurde der Ansatz für etwa 15 sek

gemischt (Vortexer) und 1 bis 3 Stunden bei 56°C in einem Thermoschüttler inkubiert.

Anschließend wurden 200 µl eines Lysispuffers hinzugefügt, die Probe erneut gut

durchmischt und für 10 min bei 70°C inkubiert. Es folgten die Abtrennung ungelöster

Gewebe- und Zellreste durch Zentrifugation. Anschließend wurde der Probenüberstand mit

96%igem Ethanol gemischt und die Lösung auf eine Silicium-Gelmembran-Säule

aufgetragen. Nach Zentrifugation folgten zwei Waschschritte der an die Säule gebundenen

DNA mit anschließender Zentrifugation, um restliche Verunreinigungen zu entfernen. Nach

Trocknung der Säule erfolgte die Elution der DNA mit 100 µl eines auf 70°C vorgewärmten

Elutionspuffers.


9.2.1.2 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Leber und Milz mit dem NucleoSpin®

RNAII Kit

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Zelllysis-Puffer (RA1)

RA1

ß-Mercaptoethanol

Ethanol

DNase Reaktionsmischung

rekonstituierte DNase I

DNase-Reaktionspuffer

Waschpuffer RA2 und RA3

RNase-freies Wasser

NucleoSpin® Säulen

NucleoSpin® RNAII Säulen

Collecting Tubes

Maximal 30 mg Gewebe wurden mittels Mikropistille homogenisiert und mit 350 µl RA1

Puffer sowie 3,5 µl Mercaptoethanol kräftig durchmischt. Die Suspension wurde auf die

NucleoSpin Säule geladen und für 1 min zentrifugiert. Die Filtereinheit wurde verworfen und

zu dem Durchfluß wurden 350 µl 70%iges Ethanol hinzugefügt. Nach gründlichem Vortexen

folgte die Überführung des Gemisches auf eine NucleoSpin® RNAII Säule und eine

Zentrifugation für 30 sek. Nach Plazierung in einem sauberen Collecting Tube wurden 350 µl

MDB auf die Säule gegeben und wiederum für eine Minute zentrifugiert. Für den Verdau

unerwünschter DNA-Bestandteile wurde ein DNase Reaktionsmix wie folgt vorbereitet:

pro Isolation 10 µl DNase I

90 µl DNase Reaktionspuffer

95 µl dieses Reaktionsgemisches wurden direkt auf die Membranmitte appliziert. Es folgte

ein 15 minütiger Inkubationsschritt bei RT.


Im Anschluß folgten drei Waschschritte:

Waschen der Säule

Schritt Menge Puffer Zentrifugation

1 200 µl RA2 30 sek

2 600 µl RA3 30 sek

3 250 µl RA3 2 min

Nach der zweiten Zentrifugation musste der Durchfluß verworfen werden, um die Säule im

dritten Schritt ausreichend zu trocknen. Im Anschluß wurde die Säule in ein Nuklease-freies

Reaktionsgefäß (1,5 ml) überführt und 60 µl RNase freies Wasser auf das Zentrum der

Membran appliziert. Durch eine einminütiger Zentrifugation wurde die RNA eluiert. Zur

Konzentrationsbestimmung mittels Photometer wurde eine 1:70 Verdünnung angefertigt. Die

Lagerung der RNA erfolgte bei -80°C.

9.2.1.3 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Gehirn und Hypophyse mit dem RNeasy®

Lipid Tissue Mini Kit

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: RNeasy Mini Spin Säulen

Collection Tubes (1,5 ml)

Collection Tubes (2 ml)

QIAzol Lysisreagenz

Puffer RW1

Puffer RPE

RNase-freies Wasser

Zur Aufarbeitung von RNA wurden max. 100 mg Hirngewebe bzw. zwei Hypophysen

benötigt. Zu dem bei -80°C gelagerten, tiefgefrorenen Gewebe wurden 1 ml QIAzol

Lysisreagenz gegeben und unverzüglich mit einer Mikropistille homogenisiert. Nach einer

Inkubation von 5 min bei RT wurden 200 µl Chloroform hinzugefügt und die gesamte

Suspension ca. 15 sek gemischt (mittels Vortexer). Die dabei entstandene wässrige Phase

wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol versetzt. Maximal 700 µl dieser Suspension wurden auf

eine RNeasy Mini Spin Säule überführt und ca. 15 sek bei RT zentrifugiert. Der Duchfluß

wurde verworfen und in einem zweiten Schritt der Rest der Probe ebenfalls über die Säule


gebunden. Es folgten die Zugabe von 700 µl RW1 Puffer und ein 15 sek andauernder

Zentrifugationsschritt. Zu der in einem neuen Collection Tube plazierten Säule wurden 500 µl

RPE Puffer hinzugefügt, 15 sek zentrifugiert, der Durchfluß verworfen und die Säule

abermals mit 500 µl RPE Puffer gefüllt. Nach der folgenden zweiminütigen Zentrifugation

wurde die Säule in einem neuen Reaktionsgefäß (1,5 ml) plaziert und für eine Minute bei

voller Leistung trocken zentrifugiert. Die Elution der RNA erfolgte mit 30-50 µl RNase-

freiem Wasser durch einminütige Zentrifugation.

Die Reinheit der aufgearbeiteten RNA wurde mithilfe eines denaturierenden Kontrollgels

(Kap. 3.3.2) überprüft. Es folgte eine photometrische Konzentrationsbestimmung. Die

Endkonzentration, die je nach Protokoll der anschließenden Versuchsmethode variieren

konnte, wurde durch Verdünnung mit RNase freiem Wasser eingestellt. Die Lagerung der

isolierten RNA erfolgte bei -80°C.

9.2.2 PCR - Primersequenzen

9.2.2.1 Entwicklung von Primern

Die für die Entwicklung der Primer erforderlichen Gensequenzen wurden folgenden

Programmen des world wide web entnommen:

http://www.genome.ucsc.edu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ensembl.org/

Mit Hilfe des Oligo 6.0 Programmes wurden passende Sequenzen zur Eingrenzung der

entsprechenen Genabschnitte entwickelt. Die Konstruktion der Primer für die Sequenzierung

erfolgte mit dem Programm LIMSTILL (http://limstill.niob.knaw.nl).


9.2.2.2 Herstellen der Primerlösungen

Die als Lyophilisat gelieferten Primer wurden nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest.

rekonstituiert, um eine 100 µM Stammlösung zu erhalten. Daraus wurden Aliqots einer 6,7

µM bzw. 13,4 µM Gebrauchslösung hergestellt, die bei 4°C gelagert wurden. Die Lagerung

der Stammlösung erfolgte bei -20°C.

9.2.2.3 Primer für die Genotypisierung der HsdRccHan:WIST-Myo7ATnd Ratte

Gen

Name des Primers

Sequenz des Primers

Myo7A M7A Ex3 fw 5´>TACACGGGTTCCATCCTGG<3´

M7A Ex3 rev 5´>CGGTTGTTGCGTTTCATGT<3´


9.2.2.4 Primer für die Sequenzanalysen der Kandidatengene

Primer für das Kandidatengen Myo15

Primer

Primerposition Vorwärtsprimer

(forward)

Rückwärtsprimer

(backward/reverse)

Exon 1-a 5´>CCTGAACCTGTGACACCTG<3´ 5´>CGGAGGAGTGATGCTGTG<3´

Exon 1-b 5´>CCAAGAAGTTCCTCCTCAAG<3´ 5´>TCATGTGGAAAGTCATAGGG<3´

Exon 1-c 5´>GGGTATTCATCTCCATACAGC<3´ 5´>TCCAGTAAGGGTGGGTGTAG<3´

Exon 1-d 5´>TGGGAAAGAGAAGCTAGAGG<3´ 5´>ACCATAGGGTGAGCTGTAGG<3´

Exon 1-e 5´>CACTGGAGTGCTCTCATCTC<3´ 5´>CTTCACAGCTCTGGTAGGTG<3´

Exon 1-f 5´>CTCTCTACATCGAACCTCTGG<3´ 5´>AGGTGTGTTCAGGGTCTCAG<3´

Exon 1-g 5´>GACCAAGCCTCCAATTTAAC<3´ 5´>GCTACCTCCTGTTCTGGTTC<3´

Exon 2 5´>TCTCTGACAATGGGAGCAG<3´ 5´>TGGATAGCCCAGCACTAAAG<3´

Exon 3 5´>CCATGTCAAGTAGGGTGGAG<3´ 5´>CTCCATCTTTCCGACTATCC<3´

Exon 4/5 5´>GGGACTCCTTACTCGAGAGC<3´ 5´>GTCTGGATGCAAACCTACG<3´

Exon 5/6 5´>AGTCTTGGGACTGTGGAAAC<3´ 5´>AGGGATCCTAAGGAAACAGG<3´

Exon 7/8 5´>AGGGAAGGCCTCTGTTTG<3´ 5´>TAGGTTTGTTCAACCCAAAG<3´

Exon 9 5´>AACCTGGATAAGTGCCTGAG<3´ 5´>CTCTATGGAGGCCTGATGTC<3´

Exon 10 5´>TCTCAGAACCTCCTGGAAAG<3´ 5´>CGTGTGACAGAGAGGAAGTG<3´

Exon 11 5´>AACTCAGCCCAGTGGTTTAG<3´ 5´>TGGCCTGGAGGAATAG<3´

Exon 12/13 5´>TATCTCCAGTGTCCCTCTCC<3´ 5´>TGGACAGCTTCCCAAGAG<3´

Exon 14 5´>TAGTGAGGACAGATGGGTTG<3´ 5´>ACTGTCTTCTCCGTGTCTCC<3´

Exon 15 5´>AGACAGGACACAGAGATAGGC<3´ 5´>CTTCCACCTCAGTCACTCC<3´

Exon 16 5´>GCTGAAGAATTTGGCACTG<3´ 5´>CACACTGTGGTTCTGTCTCC<3´

Exon 17 5´>ACAGGTGTGGGTGAGTGG<3´ 5´>CACTGCCAGGAATGTGG<3´

Exon 18/19 5´>TGACCCTTTCCCTGTCTG<3´ 5´>GCCACTTGTCCAATGTCAC<3´

Exon 19/20 5´>GGGTCGAGTACCCACTCTC<3´ 5´>AACAACATTGCACGACAGAC<3´

Exon 21/22 5´>TGAGGAGTGTTGTGAGCAAG<3´ 5´>GAGCCTAGGTTCCTCCAAG<3´

Exon 23 5´>CCAGGGTGAAATAGGATCAG<3´ 5´>GCAGGGACTGGTAATTGAG<3´

Exon 24/25/26 5´>ACAGGCCCTTCCCTACTG<3´ 5´>TGGCAGGGTCTGAGTGTC<3´

Exon 27 5´>ACCCAGATATGTCTGTTGTCC<3´ 5´>TGGCCTGGTATTATGGTAGG<3´


Exon 28 5´>CATGACAAGAGAGCATGTGG<3´ 5´>CCTGACCTCTGAACTCCAAG<3´

Exon 29/30 5´>TGTTCCACTTCACCTTAGAGC<3´ 5´>CCCTCCTTTCCAGGTCATAG<3´

Exon 30/31 5´>AGGCTGGCCTGAAGATG<3´ 5´>AGGTCCAATTAGGCTCAAACC<3´

Exon 32/33 5´>TTTATGGAAGCTACCCAACC<3´ 5´>TCTCTGGTACACACACTGAGTC<3´

Exon 34/35/36 5´>TGGTTCATTTCTTGTGGAAG<3´ 5´>TCCTGGCTTCAGAGAGAGAC<3´

Exon 37/38 5´>GCCTGAGTGTAAGCCAGTATG<3´ 5´>GGTGAGCCCAGTACTTGTTG<3´

Exon 39/40 5´>GGTGCTTGTTTGTATTGGTG<3´ 5´>TCACAGGCTCACTCACTCAC<3´

Exon 41/42 5´>ACCTTCTATCACCACCATCC<3´ 5´>AGCAACTCTCAAACCCACAG<3´

Exon 43 5´>ACATGGACCTTGGTGTCTG<3´ 5´>TGTTTCCTTAGCCTTTCGTC<3´

Exon 44/45 5´>CCCAACTCCTTGAATGTGAG<3´ 5´>CAGAGGAGCACAGTAAGCTG<3´

Exon 46 5´>GAGCATCTTCTTAGCCATGAG<3´ 5´>GGCTGTGGTATATCTGTATTGC<3´

Exon 47/48 5´>TGCAAGCCTCTGGAGTAAAG<3´ 5´>GTTGGAACCTGGACTAGCAC<3´

Exon 49 5´>TTAAAGGAACCCGCTCTATC<3´ 5´>ATTGGCTGCACAGTTGG<3´

Exon 50/51 5´>AGGGAGGTCATCTTTCACAG<3´ 5´>GAAGGTTTCTGCAACACCAC<3´

Exon 52/53 5´>GAGGGCATGGTGCAGTC<3´ 5´>CAAGGCACAGAGCAAGAAG<3´

Exon 54 5´>AGGAATGAATGTATCCTGCTG<3´ 5´>TGAGATGAGGGAGTGAACG<3´

Exon 55 5´>AGCCTGTGTCCACCTCTATG<3´ 5´>GTGTATCAATTCGGCACCAG<3´

Exon 56/57 5´>GTGGCTGAGGTAAGAGGAAC<3´ 5´>CCAGAGCCTGGTATCCCTAC<3´

Exon 58 5´>TCCTATGCCTCTTGGTTAGTG<3´ 5´>GACGTTGAGGCATGAAAGAG<3´

Exon 59 5´>CAGTCTGGTGCTGTGTGTG<3´ 5´>CATGGCGTGTGTAGGTTG<3´

Exon 60 5´>CCAGGTGTGCTGCTGTC<3´ 5´>TCAGCAATTGTGAGATAAGAGG<3´

Exon 61 5´>GTCATGCCTACTTTGCAGTG<3´ 5´>GCCATTCTCAGCTTAGCTTC<3´

Exon 62 5´>CAGTGGCTGTCCTGTTGTC<3´ 5´>AGAGAGGTGGAATGCCAAG<3´

Exon 63 5´>GATCAGACCTGCAGGAGAAG<3´ 5´>TGAGTGCAGAATGAGAAAGC<3´

Exon 64 5´>CAGCCAAGGCTGTTACATAG<3´ 5´>GTCTAGGGTCACTGGTCCAC<3´


Primer für das Kandidatengen Kcnj12

Primer

Primerposition Vorwärtsprimer (forward) Rückwärtsprimer

(backward/reverse)

Exon 1 (a) 5´>TCTGTGGTGACTAAACAGAGG<3´ 5´>TCTTCAGTCACGCATCGTAG<3´

Exon 1 (b) 5´>ATCATCTTCTGGGTCATTGC<3 5´>CCTCTACCATGCCTTCCAG<3´

Exon 1 (c) 5´>GCTCTGCTCAAACACAGGTC<3 5´>TCTTCCTAGTATCGCCCATC<3

9.2.2.5 Primer für die Expressionsanalyse der Kandidatengene

Primer für das Kandidaten-Gen

Gen

Name des Primers

Sequenz des Primers

Myo15 Myo15 mRNA-2a UP 5´>ACCTGCCCAGTGTGCGTGAG<3´

Myo15 mRNA-2 LP 5´>TGGTGGGGACTGAGTGCCTG<3´

Primer für die Housekeeping-Gene*

Housekeeping-

Gen

Name des Primers

Sequenz des Primers

β-actin β-actin fw 5´>AGGCCCCTCTGAACCCTAAG<3´

β-actin rev 5´>CCAGAGGCATACAGGGACAAC<3´

HPRT HPRT fw 5´>GCGAAAGTGGAAAAGCCAAGT<3´

HPRT rev 5´>GCCACATCAACAGGACTCTTGTAG<3´

GAPDH GAPDH fw 5´>TGCCAAGTATGATGACATCAAGAAG<3´

GAPDH rev 5´>TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT<3


9.2.2.6 Primer für die Klonierung der MyTH4-Domäne

Name des Primers

Sequenz des Primers

MyTH4-Domäne MyTH4 fw 5´>CTCGAGGACATGCTTTGCTTCAC<3

MyTH4 rev 5´>GCTAGCTCAAGCCCCTCTATGACATCCAG<3´

9.2.2.7 Primer für die Sequenzierung

Name des Primers

Sequenz des Primers

mhc 2233c 5´>GCCACCGATGCTGTTCTCA<3´

9.2.3 PCR - Protokolle und Temperaturprofile

Alle Arbeiten zum Ansetzen einer PCR wurden auf Kühlplatten durchgeführt, um vorzeitige

Reaktionen zu minimieren. Die verwendeten Verbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen,

Reaktionsgefäße und Mikrotiterplatten wurden vor Gebrauch autoklaviert (25 min, 121°C,

121 kPa Überdruck). Die DNA wurde in Mikrotiterplatten vorgelegt. Der Ansatz des

Mastermixes, der die zur Anzahl der entsprechenden Ansätze äquivalente Menge der

restlichen Reagenzien enthielt, erfolgte in einem 1,5 ml bzw. 2 ml Reaktionsgefäß. Nach

Zugabe des Mastermixes zur vorgelegten DNA wurde unverzüglich die PCR-Reaktion

gestartet. Die Lagerung der für die PCR-Reaktionen benötigten Reagenzien erfolgte bei -

20°C, die Lagerung der Produkte der PCR-Reaktionen bei 4°C.


9.2.3.1 Protokoll und Temperaturprofil für die Standard-PCR zur Amplifikation

genomischer DNA-Fragmente

Protokoll:

Reagenzien

Volumina

DNA 1 µl

Aqua dest. 5,6 µl

Reaktionspuffer 1 µl

MgCl2 0,6 µl

dNTPs 1,2 µl

Primer fw 0,25 µl

Primer rev 0,25 µl

Polymerase 0,1 µl

Gesamtansatz 10 µl

Temperaturprofil:

Schritt

Temperatur

in °C

Zeitdauer

in min

1. initiale Denaturation 95 4

2. Denaturation 94 0,25

3. Annealing x* 1

35 mal:

4. Extension 72 2

5. finale Extension 72 7

6. Abkühlung 8 bis Probenentnahme

*die Annealing-Temperatur war abhängig von der spezifischen Annealing-

Temperatur des entsprechenden Primerpaares


9.2.3.2 Protokoll und Temperaturprofil für die Sequenzanalysen der Kandidatengene

Protokoll für die touchdown-PCR:

Reagenzien Volumina

DNA 5 µl

Aqua dest. 5,6 µl

Tricine 25 mM

Glycerol (w/v) 7 %

DMSO (w/v) 1,6%

MgCl2 2 mM

Ammoniumacetat (pH 8,7) 85 mM

dNTPs 200 µM

Primer fw 0,2 µM

Primer rev 0,2 µM

Taq Polymerase 0,2 U

Gesamtansatz 10 µl

Temperaturprofil für die touchdown- PCR:

Schritt

Temperatur

in °C

Zeitdauer

in sek

1 92 60

2 92 20

Schritt 2: 12 Zyklen

3 65 20

Senkung von 0,4°C pro Zyklus

4 72 30

5 92 20

Schritt 5: 20 Zyklen

6 58 20

7 72 30

8 72 180

9 8 for ever


Protokoll für die Sequenzierungsreaktion:

Reagenzien

Volumina

DNA 1 µl

BigDYE 0,25 µl

2.5 x Dilution Puffer 3,75 µl

Universal-M13-Primer 0,4 µM

dH2O x

Gesamtansatz 10 µl

Temperaturprofil für die Sequenzierungsreaktion:

Schritt

Temperatur

in °C

Zeitdauer

in sek

1 92 10

2 50 5

3 60 120

Schritt 1-3: 40 Zyklen

9.2.3.3 Protokoll und Temperaturprofil für die Reverse Transkription mit dem

Omniskript RT Kit

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: RT-Puffer

RNase Inhibitor

Reverse Transkriptase

RNase-freies Wasser


Reagenzien

Volumina

mRNA 9 µl

Aqua dest. 4 µl

RT-Puffer 2 µl

dNTPs (5mM) 2 µl

Oligo dT Primer (20mM) 1 µl

RNase Inhibitor ,

(1:4 Verdünnung, frisch angesetzt)

1 µl

Reverse Transkriptase 1 µl

Gesamtansatz 20µl

Temperaturprofil:

Schritt Temperatur

in °C

Zeitdauer

in min

1 37 60

2 4 bis Probenentnahme

Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.


9.2.3.4 Protokoll und Temperaturprofil für die Real Time PCR

Protokoll:

Reagenzien

Volumina

Endkonzentration

cDNA2 ng/µl 5 µl 10 ng

10x Biotherm Puffer

(MgCl2, 15 mM)

2,5 µl 1x

dNTPs (10mM) 0,5 µl 0,3 mM

Primer fw (10µM) 1,5 µM 600 nM

Primer rev (10 µM) 1,5 µM 600 nM

Sybr Green* 2 µl

Biotherm Taq (5U/µl) 0,2 µl 1U

dH2O (RNase frei) 11,8 µl

Gesamtansatz 25 µl

*Das Sybr Green wurde zur Aufbewahrung in DMSO (1:100) vorverdünnt

und in 5 µl Aliquots bei -20°C gelagert. Für den Reaktionsansatz wurde ein 5

µl Aliquot aufgetaut und in 245 µl TE-Puffer (3 mM TRIS-HCl pH 7.5, 0.2

mM EDTA pH 7.5 in ddH2O) gelöst.

Temperaturprofil:

Schritt

Temperatur

in °C

Zeitdauer

in min

1. initiale Denaturation 95 3

2. Denaturation 95 0, 5

3. Annealing 67,7 0,5

40 mal:

4. Extension 72 0,5




9.2.3.5 Protokoll und Temperaturprofil für die Amplifikation der MyTH4-Domäne

Für die Amplifikation der MyTH4-Domäne wurde eine proof-reading Polymerase (Phusion

High Fidelity Polymerase, Finnzymes) verwendet.

Protokoll:

Reagenzien

Volumina

Template (200 ng) 1 µl

5x HF Puffer 10 µl

DMSO 1,5 µl

dNTPs 1 µl

Primer fw, 100 µM 1 µl

Primer rev, 100µM 1 µl

Polymerase 0,5 µl

Aqua dest. 34 µl

Gesamtansatz 50 µl

Temperaturprofil:

Schritt

Temperatur

in °C

Zeitdauer

in min

1. initiale Denaturation 98 0,5-1

2. Denaturation 98 1

3. Annealing 57 0,5

35 mal:

4. Extension 72 0,5




9.2.4 Gelelektrophorese

9.2.4.1 Ladepuffer für die PCR-Proben

Reagenzien

Volumina/Menge

Endkonzentration

Glyzerin (99%ig) 30 ml 30% (v/v)

Orange G 0,05 g 0,05% (w/v)

dH2O (steril) 70 ml 70% (v/v)

Gesamtansatz 100 ml

Das Lösen des Farbstoffes erfolgte vor der Zugabe des Glyzerin.

9.2.4.2 Ansetzen des DNA-Längenstandards

Es wurden 650 µl des Ladepuffers auf die Stammlösung (DNA Molecular Weight Marker

XIV) gegeben.

9.2.4.3 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Herstellung der Gele wurden 3% (w/v) SeaKem® LE Agarose in 1x TBE Puffer mithilfe

eines Magnetrührers mit Wärmeplatte gelöst. Das Gemisch wurde drei Minuten in einer

Mikrowelle aufgekocht und anschließend durch ständiges Rühren auf einem Magnetrührer

abgekühlt. Bei einer Temperatur von ca. 50°C erfolgte die Zugabe von 4 µl "Gel-Star" pro

100 ml Gellösung. Es folgte die sofortige Überführung des Gemisches in 7 x 9 cm (für 50 ml

Gellösung) bis 24 x 42 cm (für 400 ml Gellösung) große Kunststoffkammern. Anschließend

wurden je nach Größe und Bedarf Gelkämme (1mm stark, bis zu 25 Zähne) eingehängt. Nach

Polymerisierung des Gels wurden die Kämme und Abdichtungen der Kammern (schmale

Seiten der Gelkammer) entfernt und die Gelkammer samt Gel in eine horizontal ausnivellierte

Elektrophoresekammer gelegt. Diese wurde bis zu einer Höhe von mindestens 3 mm oberhalb

des Gels mit 1x TBE Puffer befüllt.


Zusammensetzung des 10x TBE Puffers (pH 8,3):

Reagenzien

Menge

Endkonzentration

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 121 g 89 mM

Borsäure 55,5 g 89 mM

EDTA 9,3 g 2 mM

dH2O ad 1000 ml

Zu 10 µl Probe wurden je 4 µl Ladepuffer zugesetzt. In die jeweils erste Tasche einer Reihe

des Agarosegels wurden 3,5 µl des DNA-Längenstandards aufgetragen, die restlichen

Taschen wurden mit 12 µl des Proben-Ladepuffer Gemisches befüllt. Die Laufzeit der Proben

betrug abhängig von der Größe des Gels und der eingesetzten Stromstärke (50-90 mA) 30

Minuten bis drei Stunden. Die Sichtbarmachung der DNA-Fragment-Banden erfolgte unter

Zuhilfenahme von UV-Licht.

9.2.4.4 Kontrolle der RNA-Extraktion mittels denaturierender Gelelektrophorese

Zur Überprüfung der Konzentration und Reinheit der aufgearbeiteten RNA wurde ein

Kontrollgel angefertigt, auf dem die 18s und 28s Banden der mRNA unter UV-Licht sichtbar

gemacht wurden. Folgende Komponenten wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert:

Reagenzien

Volumina

Endkonzentration

RNA 6 µl

Formaldehyd 4,0 µl 6%

Formamid 12,5 µl 50%

10fach MOPS-Puffer 2,5 µl 10%

Gesamtansatz 25 µl


Nach einer Inkubation von 15 min bei 55°C und einer anschließenden Abkühlung auf Eis

wurden ca. 12 µl der Probe versetzt mit 3 µl Ladepuffer auf ein denaturierendes Agarosegel

folgender Zusammensetzung aufgetragen:

1,2% (w/v) Agarose

1,2% Formaldehyd

0,3 µg/ml Ethidiumbromid

in 1fach MOPS-Puffer

Die Laufzeit des Gels in 1fach MOPS-Puffer betrug ca. 1 bis 1,5 Stunde(n) bei 60 V.

9.2.5 Aufreinigung von DNA

9.2.5.1 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem QIAquick PCR Purification Kit

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer PB

Waschpuffer PE (Konzentrat)

Elutionspuffer EB

QIAquick Spin Säulen

Collection Tubes (2ml)

Zu je 10 µl aufzureinigendem PCR-Produkt wurden 50 µl PB Puffer zugefügt und gemischt.

Mittels Überführung der Lösung auf eine QIAquick Spin Säule und nachfolgender

Zentrifugation wurde die DNA an die Säule gebunden. Es folgten ein Waschschritt mit PE

Puffer, erneute Zentrifugation und Trocknen der Säule. Die Elution der DNA erfolgte mit 50

µl EB Puffer bzw. dH2O.


9.2.5.2 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen mit dem NucleoSpin®

Extract Kit

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer NT1

Puffer NT2

Waschpuffer NT3 (Konzentrat)

Elutionspuffer NE

Nucleo Spin® Extraktionssäulen

Nucleo Spin® collecting tubes

Mithilfe eines Skalpells wurde das DNA-Fragment unter Sichtbarmachung der Bande durch

UV-Licht aus dem Gel extrahiert, in ein steriles Reaktionsgefäß überführt und das

Nettogewicht bestimmt. Zu je 100 mg des ausgeschnittenen Gelfragments wurden 300 µl NT1

Puffer hinzugefügt und die Probe 5-10 min bei 50°C in einem Thermoschüttler inkubiert bis

das Gel vollständig gelöst vorlag. Anschließend wurde die Lösung auf eine Nucleo Spin®

Extraktionssäule überführt. Nach Zentrifugation folgten zwei Waschschritte mit NT3 Puffer

und anschließender Zentrifugation. Die Elution der DNA erfolte mit 35 µl NE Puffer.

9.2.6 Klonierung von PCR-Fragmenten

9.2.6.1 Erzeugung eines A-Überhangs (A-tailing)

Reaktionsansatz:

Reagenzien

Volumina

PCR-Fragment 6,7 µl

dATP, 2 mM 1 µl

MgCl2 0,3 µl

10x Reaktionspuffer 1 µl

Taq Polymerase 1 µl

Gesamtansatz 10 µl

Der Reaktionsansatz wurde für 15 bis 30 min bei 70°C in einem Thermocycler inkubiert.


9.2.6.2 Ligation mit dem pGEM®-T Easy Vector System I

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: pGEM®-T Easy Vektor (50 ng/µl)

Kontroll-Insert (4 ng/µl)

T4 DNA Ligase

2x Rapid Ligationspuffer

Etwa 100 bis 400 ng linearisiertes Plasmid und das zu ligierendes DNA-Fragment wurden

gemischt, mit 10 x Ligasepuffer und 2 bis 10 U Ligase versetzt. Der Ansatz wurde für 1

Stunde bei RT oder für 4 Stunden bei 4°C inkubiert.

Ligationsansatz:

Reagenzien

Standard

Positiv-

Kontrolle

Hintergrund-

Kontrolle

2x Rapid Ligationspuffer 5 µl 5 µl 5 µl

pGEM® Teasy Vektor 1 µl 1 µl 1 µl

PCR-Produkt 2 µl - -

Kontroll-Insert DNA - 2µl -

T4 DNA Ligase 1 µl 1 µl 1 µl

dH2O 1 µl 1 µl 3 µl

Gesamtansatz 10 µl 10 µl 10 µl


9.2.6.3 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit

(DNA-Minipräparation)

Mit diesem Kit können maximal 20 µg DNA/Probe isoliert werden.

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer P1

Lysispuffer P2

Waschpuffer N3

Puffer PE

Elutionspuffer EB

QIAprep Spin Säulen

1 ml des Selektionsansatzes wurden entnommen und für 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert.

Es folgte die Resuspension des Pellets in 250 µl RNAse-haltigem Puffer P1. Durch die

Zugabe von 250 µl Puffer P2 und anschließender Inkubation von 3 bis 4 min bei RT erfolgte

der alkalische Zellaufschluß.

Nach Zugabe von 350 µl Puffer N3 (Neutralisation) wurden die präzipitierten Proteine von

der chromosomalen DNA durch zehnminütige Zentrifugation bei 13000 rpm abgetrennt. Es

folgte die Überführung des die Plasmid-DNA enthaltenen Überstands auf eine QIAprep spin

Säule. Die nach einminütiger Zentrifugation an die Säule gebundene Plasmid-DNA wurde

durch Waschen mit 750 µl PE-Puffer gereinigt und anschließend mit 32 µl EB Puffer eluiert.

9.2.6.4 Ansatz für den Restriktionsverdau mit EcoRI

Reagenzien

Volumina

EcoRI (Restriktionsenzym), 10U/µl 0,25 µl

EcoRI-Puffer 2 µl

DNA 2 µl

dH2O 5,5µl

Gesamtansatz 10 µl

Der Ansatz wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.


9.2.6.5 Ansatz für den Restriktionsverdau mit XhoI

Reagenzien

Volumina

XhoI (Restriktionsenzym), 10U/µl 0,6 µl

10x Tango-Puffer 1,6 µl

vorverdaute DNA 11 µl

dH2O 5,5µl

Gesamtansatz 20 µl

Der Ansatz wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.

9.2.6.6 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit

(DNA-Maxipräparation)

Mit diesem Kit können maximal 500 µg DNA/Probe isoliert werden.

Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer P1

Puffer P2

Puffer P3

Puffer QBT

Puffer QC

QIAGEN-tip 500 Säulen

QIAfilter Maxi Cartridges

Elutionspuffer EB

Zur Vorbereitung wurden zu 100 ml LBAmp-Medium 200 bis 300 µl des Selektionsansatzes

(E.coli-Suspension) gegeben und über Nacht bei 37°C und 200 rpm in einem Thermoschüttler

inkubiert. Resuspension und Zellaufschluß erfolgten mit 10 ml P1 und 10 ml P2 Puffern

analog zur Minipräparation (Kap. 9.7.3). Durch Zugabe von 15 ml Puffer P3 wurde die

Suspension neutralisiert. Zur Isolierung der Plasmid-DNA wurde eine QIAGEN-tip 500-Säule

benutzt. Diese musste vor Gebrauch mit 15 ml QBT Puffer äquilibriert werden, um die

Plasmid-DNA des klaren Lysats zu binden. Vorher wurde die Probe über einen Filter von


ausgefallenen Bestandteilen befreit. Nach zweimaligem Waschen mit QC Puffer wurde die

DNA mit 15 ml Elutionspuffer aus der Säule eluiert und anschließend mit 10,5 ml

Isopropanol gefällt. Es folgte eine dreißigminütige Zentrifugation bei 15000 rpm. Das Pellet

wurde mit 700 µl Ethanol (reinst) gewaschen, und nochmals für eine halbe Stunde bei 13000

rpm zentrifugiert. Nach der Trocknung wurde das Pellet in 60 bzw. 120 µl dH2O

aufgenommen.

9.2.6.7 Restriktionsverdau mit XhoI und NheI (Doppelverdau)

Ansatz des Verdaus:

Reagenzien

Verdau

Vektor-DNA

Verdau

Insert-DNA

DNA 5 µg 5 µg

Xho I, 10U/µl 8 µl 8 µl

Nhe I, 10U/µl 2 µl 2 µl

1xTango 10 µl 10 µl

dH2O 75 µl 75 µl

Gesamtansatz 100 µl 100 µl

Der Ansatz wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.


9.2.6.8 Ligation des pM765-tev Vektors

Ligationsansatz:

Reagenzien

Ansatz

Probe

Ansatz

Kontrolle

Vektor-DNA 5 µg 5 µg

Insert-DNA 5 µl -

10x Ligationspuffer 1 µl 1 µl

T4 DNA-Ligase 1 µl 1 µl

dH2O x µl x µl

Gesamtansatz 10 µl 10 µl

Nach der Inkubation des Ansatzes bei 16°C , alternativ bei 4°C über Nacht, wurde die Ligase

bei einer Temperatur von 65°C für 10 min inaktiviert.

9.2.7 Nachweis von Proteinen

9.2.7.1 Extraktion von Proteinen aus D. discoideum (Protein-Minipräparation)

Für die Präparation von Proteinen aus D. discoideum wurde die konfluente Platte des

gewünschten Klons mit 1ml HL-5c-Medium+P/S+G10 gespült. Die Suspension, die etwa

1x107 Zellen enthielt, wurde durch fünfminütige Zentrifugation bei 2700 rpm pelletiert, mit 1

ml Lysispuffer gewaschen und erneut zentrifugiert. Nachdem das Pellet in 600 µl Lysispuffer

1 resuspendiert wurde, folgte die Zugabe derselben Menge Lysispuffer 2. Anschließend

wurde die Suspension für 20 min bei RT inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 13000

rpm für 30 min. Nachdem das Pellet in 500 µl Lysispuffer gewaschen wurde, folgte eine

erneute Pelletierung durch 25 minütige Zentrifugation. Der Überstand wurde vorsichtig

abpipettiert. Nach Zugabe von 40 µl Lysispuffer 3 wurde das im Pellet enthaltene Protein

unter Verwendung einer Mikropistille extrahiert. Es folgte eine erneute Zentrifugation für 20

min bei 13000 rpm. Der das Protein enthaltende Überstand wurde abgenommen, mit 6x-

Protein-Auftragspuffer versetzt und bei 95°C für 5 min erhitzt. 10 µl der Lösung wurden für


die Analyse mittels SDS-PAGE (Kap. 3.6.2 und 9.2.7.3) verwendet. Als Vergleich diente eine

Protein-Minipräparation von DdAX3-ORF+-Zellen.

9.2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) - Gele

Zusammensetzung des Trenngels:

Reagenzien

10%ig

15%ig

Acrylamid (40%) 1,25 ml 1,88 ml

Tris/HCl Puffer (1,5M; pH 8,8) 1,4 ml 1,4 ml

SDS (1%) 0,5 ml 0,5 ml

H2O 1,85 ml 1,22 ml

APS (40%) 15 µl 15 µl

TEMED 15 µl 15 µl

Zusammensetzung des Sammelgels:

Reagenzien

5%ig

Acrylamid (40%) 95 µl

Tris/HCl Puffer (1M; pH 6,8) 95 µl

SDS (1%) 75 µl

H2O 480 µl

APS (40%) 2,5 µl

TEMED 2,5 µl

Nach dem Mischen der Reagenzien für das Trenngel wurde die Flüssigkeit unverzüglich bis

etwa 1 cm unterhalb des oberen Randes in die Gelkammer gegossen und vorsichtig mit

Isopropanol überschichtet. Nach Polymerisation des Gels wurde der Alkohol abgegossen und

Reste mithilfe eines Filterpapiers entfernt. Es folgte die Vermischung der Reagenzien für das

Sammelgel, das unverzüglich mit einer Pipette auf das Trenngel gegeben wurde.

Anschließend wurde sofort der Probenkamm eingesetzt.


9.2.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Elektrophorese

Nach vollständiger Polymerisation des Trenn- und Sammelgels wurden diese in der

Laufkammer, die etwa 2 cm tief mit Laufpuffer (nach Lämmli) befüllt wurde, eingespannt.

Der Probenkamm wurde vorsichtig entfernt, um die Form der Taschen nicht zu verzerren, und

die Proben aufgetragen. Es wurde eine Stromstärke von 20 mA angelegt, bis die Proben das

Ende des Sammelgels erreicht hatten. Im Anschluß wurde mit einer Stromstärke von 35 mA

gearbeitet. Die Entwicklung des Gels erfolgte mittels Coomassie-Färbung (Kap. 9.8.4).

9.2.7.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Coomassie-Färbung

Das Gel wurde nach beendetem Lauf vollständig mit Coomassie Blue-Färbelösung bedeckt

und auf einem Thermer aufgekocht. Durch mehrmaliges Aufkochen in 6%iger Essigsäure

erfolgte die Entfernung von überschüssigem Farbstoff. Proteinhaltige Abschnitte wurden als

blaue Banden sichtbar.

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10. Anhang II, Ergebnisse 196

9.2.8.2 Testparameter des skotopischen Einzelblitz-ERGs

Stufe

Stimulus

1 0.01 cds/m2

2 0.03 cds/m2

3 0.3 cds/m2

4 (Standard) 3.0 cds/m2

5 (Xenon Flash) 10 cds/m2

6 (Xenon Flash) 30 cds/m2

9.2.8.3 Testparameter des photopischen Einzelblitz-ERGs

Stufe

Stimulus

1 (Standard) + 3.0 cds/m2

2 (Xenon Flash) + 10 cds/m2



bei einer Hintergrundbeleuchtung von 25 cds/m3

9.2.8.4 Protokoll zur Dokumentation des Versuchsablaufs


Protokoll ERG

Datum der Untersuchung:

Uhrzeit der Untersuchung:

Dunkeladaption (Datum/Uhrzeit):

Identifikation des Tieres:

Stamm

Eltern

MF

Geburt

Geschlecht

dreh

nicht

dreh

Alter bei

Unters.

Narkose:

Gewicht des Tieres

Narkosemittel

Menge des Narkosemittels

Sonstige Pharmaka:

Mydriatika

Lokalanästhetikum

Tränenersatz

Untersuchung:

Untersuchungszeitraum

Besonderheiten


9.2.9 Untersuchung von Umweltfaktoren

9.2.9.1 RT-PCR zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein-spezifischer RNA

Aus Anschnitten des Bulbus olfactorius und des Ammonshorns wurde die RNA mittels Trizol

Methode (Invitrogen) isoliert und mit dem RNeasy Minikit (Qiagen) aufgereinigt. Jeweils 165

ng RNA wurden zur Reversen Transkription eingesetzt. Der Nachweis der BDV-

Nukleoprotein spezifischen RNA erfolgte mit dem Primerpaar p334/335 (siehe Tab. 9.1) und

der Nachweis zellulärer RNA mit dem Primerpaar p113/114 (Housekeeping Gen GAPDH).

Als Positivkontrollen wurde RNA aus Rattengehirn, als Negativkontrolle DEPC-Aqua bidest.

als template eingesetzt.

Tab. 9.1 PCR zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein-spezifischer RNA und GAPDH

ID

Probe

Primer

Amplifikatgröße

1 Tier 1 Bulb. olfact. 2 Tier 1 Ammonshorn 3 Tier 2 Bulb. olfact. 4 Tier 2 Ammonshorn 5 Tier 3 Bulb. olfact. 6 Tier 3 Ammonshorn 7 positiv Kontrolle I 8 positiv Kontrolle II 9 Negativkontrolle

p334/ 335

(BDV-Nukleoprotein)

342 bp

10 Tier 1 Bulb. olfact. 11 Tier 1 Ammonshorn 12 Tier 2 Bulb. olfact. 13 Tier 2 Ammonshorn 14 Tier 3 Bulb. olfact. 15 Tier 3 Ammonshorn 16 Positivkontrolle III 17 Positivkontrolle II 18 Negativkontrolle

p113/ 114 (GAPDH)

280 bp


10 Anhang II, Ergebnisse

10.1 Vergleichsstudie

10.1.1 Phänotypisierung

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10.1.2 Gewicht

Genotyp

Geschlecht

Gewicht in g MHH

Gewicht in g TiHo

350 - 415 445 424 450

männlich

460 500 224 - 240 264

homozygote Tiere

weiblich

287 300 - 425

454 595 männlich

482 660 290 - 294 340 305 368 312 400

heterozygote

Tiere weiblich

313 428 450 400 465 441 467 521

männlich

520 560 251 280 271 281

Kontroll- Tiere

weiblich

273 300

Tab. 10.3 Körpergewichte der Ratten der Vergleichsstudie. Vergleich der beiden

Haltungseinheiten. Die Gewichte sind nach Geschlecht und Genotyp getrennt

aufgeführt.

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10.1.4 Histologie

Stamm/ Genotyp

Tier

Photo-rezeptor- schicht

Zelllagen äußere Körnerschicht

Zelllagen innere

Körnersch.

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zentral peripher 1

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(MHH) heterozygot

3

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1

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2

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3-4


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3-4

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fast vollst. degeneriert


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degener. 2

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3-4

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LEW/Ztm-ci2

(TiHo) heterozygot

3

vollständig degeneriert


3-4

regelrecht, aber äußere plexiforme

Schicht degeneriert

Danksagung

Ich bedanke mich bei Prof. Dr. H.J. Hedrich für die Überlassung des Themas, für die

Bereitstellung von Arbeitsplatz und -materialien und die stets gewährte Unterstützung bei der

wissenschaftlichen Arbeit sowie bei der Abfassung dieser Dissertation. Bei Herrn Dr. D.

Wedekind möchte ich mich für die stetige Motivation, für das Interesse und die Unterstützung

bei der Planung und Durchführung der Versuche sowie für seine unermüdliche

Diskussionsbereitschaft bedanken.

Weiterhin bedanke ich mich bei

Frau PD M.-L. Enss für die großartige Betreuung des Graduiertenkollegs, für ihr Engagement

und ihre Unterstützung bei jeglichen Problemen. Der DFG danke ich für die Bereitstellung

der Förder- und Sachmittel im Rahmen des GRK 705-II.

Herrn Dr. R. Gockeln für die Betreuung der elektrophysiologischen Versuche und die

Einarbeitung in dieses Thema. In diesem Zusammenhang möchte ich auch Frau I. Tutschke

und Herrn L. Mentze danken, die mir in allen Fragen bezüglich der ERGs stets mit Rat und

Tat zur Seite standen.

Herrn Prof. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover für die Diskussion wissenschaftlicher Fragen sowie für

die Unterbringung der Tiere in der Tierhaltung des Pharmakologischen Instituts. Weiterhin

danke ich Herrn M. Schirmer für die Zusammenarbeit bei der Vergleichsstudie.

Dr. E. Cuppen und Dr. B. Smits für die Gastfreundschaft beim Laboraufenthalt im Hubrecht

Laboratorium, Utrecht sowie für die Unterstützung bei der Generation der Primer und beim

Durchführen der Sequenzierungen. Weiterhin möchte ich mich für die Überlassung der

HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratten bedanken.

Herrn Prof. D.J. Manstein und Herrn Prof. G. Tsiavaliaris für die Möglichkeit, im Institut für

Biophysikalische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover die Untersuchungen zur

Proteinstruktur des Myosin XV durchführen zu können. Herrn Prof. G. Tsiavaliaris und der

gesamten "Motility Group" insbesondere Herrn M. Taft und Herrn R. Diensthuber möchte ich

für die freundliche Aufnahme und die ständige Hilfsbereitschaft danken.

Herrn Prof. K. Kamino und Frau Dr. S. Schubert, die durch die Anfertigung der

histologischen Schnitte und ihre Diskussionsbereitschaft im Rahmen der Auswertung der

Präparate in besonderem Maße zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Herrn Dr. N. Neuhoff, Herrn M. Tauscher, Frau M. Lorsch und Frau Dr. H. Weiss für die

Hilfe bei der Planung und Durchführung der Real Time PCR.

Frau Dr. C. Herden und Frau Dr. D. Porombka, Institut für Pathologie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover, für die freundliche Unterstützung bei der Untersuchung auf BDV-

Infektion der Mutante.

Den Mitarbeitern des Instituts für Versuchstierkunde für die freundliche Aufnahme, die

erwiesene Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima sowie den Tierpflegern des Zentralen

Tierlaboratoriums für die Betreuung der Tiere und für die freundliche Atmosphäre im Haus.

Mein besonderer Dank gilt Frau S. Pzyklenk und Frau I. Trotz für die Einarbeitung in die

Labormethodik, für die stetige Unterstützung und die gute Zusammenarbeit. Frau T. Arndt

danke ich für die Hilfe bei fachlichen Fragen, ihre Diskussionsbereitschaft und die

Unterstützung bei den statistischen Auswertungen.

Mein Dank gilt insbesondere meiner Familie und meinen Freunden für die moralische

Unterstützung, die stetige Motivationsbereitschaft und für ihr Vertrauen.

Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Freund, Sebastian Hütker, bedanken, der mich

während der dreijährigen Promotionszeit mit unendlicher Geduld und Belastbarkeit, mit

Gesprächs- und Diskussionsbereitschaft sowie viel Optimismus unterstützt hat.

Strukturelle, funktionelle und genetische Analyse der LEW ... · pers. Komm. persönliche...

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