TECHNISCHE UNIVERSITÄTDRESDEN

ILB

Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Lehrstuhl Lebensmitteltechnik

Verbundprojekt: Aktive Verpackung mit antimikrobiellen Eigenschaften - Teilprojekt 3:

Toxikologische Bewertung von aktiven Verpackungen mit antimikrobiellen

Eigenschaften

Abschlussbericht: Forschungsvorhaben: 0330313

Bearbeitungszeitraum: 01.01.2003 bis 30.04.2004

für: Forschungszentrum Jülich GmbH, Berlin bearbeitet von:

Autor: Dipl.-Lebensmittelchem. Tommy Opitz

Durchführende Institution: Technische Universität Dresden Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik

Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley

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Inhaltsverzeichnis

Titelblatt

Inhaltsverzeichnis

1. Aufgabenstellung und Zielsetzung ………………………………….………3

2. Methodische Umsetzung ...………………………………………….………6

3. Ergebnisse ………………………………………………………….……...20

4. Zusammenfassung und Ausblick …………………………………...……..30

5. Literaturverzeichnis .……………………………………………….……....32

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1. Einleitung, Aufgabenstellung und Zielsetzung

Einleitung

Die Verpackung eines Gutes hat neben dem Informations- und Werbeaspekt vor allem den

Schutz des Produktes bei Transport und Lagerung zur Aufgabe. Insbesondere im

Lebensmittelbereich werden zusätzlich noch hohe Ansprüche an die hygienische Qualität

gestellt. Eine mikrobiologische Schädigung von Lebensmitteln kann durch verschiedenste

Maßnahmen herabgesetzt oder verhindert werden:

• Reduzierung der Wasseraktivität (Trocknen, Pökeln, usw.)

• Absenken des pH-Wertes (Einlegen, Fermentieren)

• Hochtemperatur-Behandlung (Pasteurisieren, Sterilisieren)

• Absenkung der Lagertemperatur (Kühl- bzw. Tiefkühllagerung)

• Bestrahlung (Mikrowellen-, UV-Bestrahlung)

• Mechanische, elektrische und chemische Methoden (Konservierungsstoffe,

Elektroimpulse)

• Einsatz aktiver Verpackungen

Als aktive Verpackungen werden solche bezeichnet, die selbsttätig unerwünschten und

qualitätsmindernden Veränderungen des verpackten Gutes entgegenwirken (Bleisch, 2003).

Diese Art der Verpackung beeinflusst gezielt die stoffliche Zusammensetzung der

Atmosphäre im Kopfraum der Verpackung. Sie verhindert bzw. verzögert den

Qualitätsverlust des Packgutes während der Lagerung entweder durch selektives Binden von

unerwünschten, flüchtigen aus dem Gut austretenden Komponenten (z.B. Oxygen

scanvenger) oder durch die Abgabe konservierender Stoffe.

Im Rahmen des „Active Packaging“ werden unterschiedlichste Stoffgruppen zur Hemmung

des Wachstums von Mikroorganismen eingesetzt: 1. Wasserabsorber Verminderung von Kondensat-Tröpfchen an der Oberfläche von

Verpackungsfolien durch mehrlagige Kunststoffe in denen eine

saugfähige Schicht eingearbeitet ist

2. Sauerstoffabsorber Bindung von Sauerstoff aus dem Kopfraum der Verpackung und

Verminderung der Oxidation

4

3. Ethanol-Emitter Kondensation von Ethanol an der Oberfläche des Gutes und

Verhinderung von Schimmelpilz-Wachstum

4. Silber-Ionen Silberzeolithe als Kontaktschicht auf Kunststofffolien (PE, PP

und PS)

5. Fruchtbehandlungsmittel Auftrag als Wachsemulsion auch direkt auf die Verpackung zur

Verhinderung von Schimmelpilzbefall

6. Pflanzliche Wirkstoffe Verwendung von natürlichen Bioziden bzw. Biostatica als

Zusatz auf und in Packstoffen

Erste Ansätze zur Herstellung antimikrobiell ausgerüsteter Verpackungen wurden schon in

den 60er Jahren beschrieben. Bereits damals wurden Papiere mit und ohne Wachskaschierung

Calciumsorbat dotiert und für den Einsatz im Bereich Molkereiprodukte erfolgreich getestet.

Feuchtigkeits- und Sauerstoffabsorber kommen in Japan und den USA bereits als kleine,

chemikaliengetränkte Kissen zur Einlage in Lebensmittelverpackungen zum Einsatz. Die

Akzeptanz der Verbraucher im europäischen Markt gegenüber solchen Produkten ist bislang

jedoch gering [HOLLEY, 2002].

Entscheidend für die Suche nach neuen antimikrobiellen Wirkstoffen zur Verwendung in

Verpackungen sind neben der verlängerten Haltbarkeit auch ökonomische und ökologische

Aspekte. Neben einem hohen Wirkniveau bei sehr geringen Aufwandmengen erwartet man

ein breites Wirkungsspektrum mit geringen bzw. keinen toxischen Nebenwirkungen auf das

Packgut. Weiterhin soll ein hoher Sicherheitsgrad für Umwelt, Anwender und

Endverbraucher gewährleistet sein

Zu neuen Wirkstoffen führen grundsätzlich zwei Wege: die chemische Synthese und die

Suche nach geeigneten Naturstoffen. Die chemische Synthese hat den Vorteil, dass sie

meistens kostengünstiger ist und gut reproduzierbare Ergebnisse liefert. Zusätzlich zeichnet

sich die chemische Synthese durch ihre gute Zugänglichkeit von Derivaten aus. Ihre Nachteile

liegen jedoch in der großen Anzahl von Syntheseprodukten, die geprüft werden müssen, um

zu einem brauchbaren antimikrobiell wirkenden Packstoff zu gelangen. Bei den Naturstoffen

ist die Auffindungsrate geeigneter Substanzen etwas höher und die Zahl der möglichen

Metabolite, wegen der Komplexizität der Strukturen, praktisch unbegrenzt. Nachteile liegen

in der oft schwierigen und teuren Herstellung, in der schlechten Zugänglichkeit von Derivaten

sowie in der meist erschwerten Standardisierung des Ausgangsmaterials [HAN, 2000;

PIRINGER, 1993].

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Weiterhin ist die Isolierung der aktiven Reinsubstanzen in der Regel beträchtlich teurer als die

Herstellung synthetischer Produkte. Darüber hinaus ist die biologische Aktivität und Stabilität

von Naturstoffen im Freiland oft geringer. Bei der Verwendung von Rohextrakten als

Wachstumshemmer von Mikroorganismen können Probleme hinsichtlich der

Standardisierung und der Toxizität auftreten, so dass die geforderten Voraussetzungen für

eine lebensmittelrechtliche Zulassung schwer zu erfüllen sind [BEELITZ, 2001]. Die häufig

sehr komplexe Struktur der Moleküle aus Naturstoffen sowie ihr komplexes

Wirkungsspektrum erschweren zudem eine chemische Synthese. Dennoch stellt die Isolierung

aktiver Substanzen aus Pflanzen eine vielversprechende Methode zur Auffindung von

Molekülen dar, welche in der Lage sind, aufgrund ihrer Eigenschaften einen Weg zu neuen

innovativer Verpackungen aufzuzeigen.

Die Naturstoffe können entweder direkt zur Bekämpfung / Hemmung von unerwünschten

Mikroorganismen verwendet werden oder als Ausgangsstoff bei der Synthese von

Wirkstoffen dienen.

In der Literatur ist ein breites Spektrum von ätherischen Ölen bekannt, welche bakterizid,

fungizid oder gar insektizid wirken können [PIZZALE, et al. 1998; SUHR, et al. 2003]

Aufgabenstellung

Toxikologische Bewertung von aktiven Verpackungen mit antimikrobiellen

Eigenschaften

Im Rahmen des Forschungsvorhabens am Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik

der TU Dresden sind Hemmstofftests an aktiven Verpackungen durchzuführen und die

Toxizität von antimikrobiell wirkenden Substanzen zu bewerten. Weiterhin soll eine Analyse

der Hauptinhaltsstoffe der antimikrobiell wirksamen Naturstoffe erfolgen, sowie der

Wirkstoffgehalt in Abhängigkeit der Anwenderkonzentration bestimmt werden.

Untersuchungen zu den verschiedenen technologischen Verfahrensvarianten zur Wirkstoff-

Applikation mit Hinblick auf die Verluste im Zuge der Lagerung sind durchzuführen.

Zielsetzung

In Abstimmung mit den Projektpartnern (IBN GmbH Dresden, Papierverarbeitung Görlitz

GmbH, ELBTAL Druckerei und Kartonagen Kahle GmbH, Heinrich Ludwig

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Verpackungsmittel GmbH) sollte im Laufe der Bearbeitungszeit eine strapazierfähige,

antimikrobiell wirksame Verpackung für Lebensmittel- und Technikanwendungen hergestellt

werden. Das Wachstum der Mikroorganismen sollte durch Auftrag von pflanzlichen

Wirkstoffen auf Papp- und Papierwerkstoffe verhindert bzw. eingeschränkt werden. Die

hergestellten Packstoffe mussten dabei eine ausreichende Wirkungszeit, besonders gegenüber

Schimmelpilzen, aufweisen sowie lebensmittelrechtlich unbedenklich sein.

2. Methodische Umsetzung

2.1. Materialauswahl

Beim Screening verschiedener antimikrobiell wirksamer Stoffklassen wurde das

Hauptaugenmerk auf pflanzliche Stoffe gelegt, speziell auf ätherische Öle und Extrakte von

Heil- und Gewürzpflanzen.

Als ätherische Öle werden im allgemeinen angenehm riechende ölige Produkte bezeichnet,

die durch Wasserdampfdestillation oder Extraktion von Pflanzen oder Pflanzenteilen bzw.

durch Abpressen der äußeren Fruchtschalen einiger Citrusarten gewonnen werden.

In Vorversuchen zeigte besonders Nelkenblätteröl und Nelkenextrakt eine antimikrobielle

Wirkung auch bei geringen Konzentrationen.

Der in Malaysia beheimatete, ca. 10 bis 12 m hohe, immergrüne Gewürznelkenbaum

(Syzygium aromaticum, Myrtaceae) liefert die getrockneten Blütenknospen (Nelken). Aus

den Nelken, deren Stielen sowie Blättern und Zweigen des Baumes werden verschiedene

Nelkenöle gewonnen, deren Inhaltsstoffe auch für die sensorischen Eigenschaften des

Nelkengewürzes verantwortlich sind.

Durch Wasserdampfdestillation aus Blättern und Zweigen wird das mengenmäßig wichtigste

Nelkenöl in 2 bis 3%iger Ausbeute gewonnen. Es wird in der Aromenindustrie, Parfümerie,

der Zahnmedizin und Mundpflege, als Insektenabwehrstoff in Sonnenschutzmitteln sowie zur

Herstellung von Eugenol, Isoeugenol und Vanillin verwendet.

Nelkenblätteröl enthält 82–88% Eugenol (Abb. 1) als Hauptkomponente.

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Abb. 1 Eugenol (4-Allyl-2-methoxyphenol)

Eugenol wirkt mäßig giftig bei oraler Aufnahme und kann bei direktem Kontakt

sensibilisierend sowie hautreizend wirken.

Weitere, in geringen Konzentrationen vorkommende, Inhaltsstoffe des Nelkenblätteröls sind

die Caryophyllene. Man unterscheidet diese Sesquiterpene in α-Caryophyllen /Humulen

(Abb. 2) und β-Caryophyllen (Abb. 3).

Abb. 2 Humulen (α-Humulen, α-Caryophyllen,

2,6,6,9-Tetramethyl-1,4,8-cycloundecatrien) in seinen 3 Isomeren.

Abb. 3 β-Caryophyllen,

In Abstimmung mit den Projektpartnern wurden möglichst geringe Konzentrationen an

Nelkenblätteröl / und Nelkenextrakt festgelegt, um einerseits kostensparend zu arbeiten und

andererseits die verwandte Matrix (Leime, Druckfarben etc.) der Anwender nicht zu

verändern. Die empfohlenen Wirkstoffkonzentrationen wurden bei 5 bis 10 % bei

Nelkenextrakt und 2,5 bis 5 % für Nelkenblätteröl festgelegt.

OH

CH2

OCH3

CH CH2

H3C

CH3

CH2

CH3

H2C

CH3

CH3

CH3

1

467

10 CH3H3C

H3C CH3

α β γ

H3C

H3C

H2CH

HCH3

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2.2. Analyse der ätherischen Öle / Extrakte

2.2.1. Chemisch-physikalische Analyse

Zur Charakterisierung des Nelkenblätteröls / -extrakts wurden sensorische Merkmale der

beiden Naturstoffe erfasst sowie die Dichte, pH-Wert und Brechungsindex gemessen.

Die in Tab. 1 und 2 dargestellten Ergebnisse resultieren jeweils aus Dreifachbestimmungen.

Tab. 1 Nelkenblätteröl (Herkunftsland Indonesien)

Kenngröße Messgerät Ergebnis

Dichte ( 20°C)

Pyknometer

1,041 g/cm³

pH-Wert ( 100 g/l H2O, 20°C) Messelektrode 6,2

Brechungsindex (20°C) Refraktometer 1,536

Aussehen flüssig

Farbe leicht gelblich

Sensorik

Geruch typisch, leicht scharf

Tab. 2 Nelkenblätterextrakt

Kenngröße Messgerät Ergebnis

Dichte ( 20°C)

Pyknometer

1,021 g/cm³

pH-Wert ( 100 g/l H2O, 20°C) Messelektrode 5,8

Brechungsindex (20°C) Refraktometer 1,407

Aussehen flüssig

Farbe braun

Sensorik

Geruch typisch nach Nelken

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2.2.2. Identifizierung und Quantifizierung der Hauptkomponenten

Dünnschichtchromatographische Kontrolle des Nelkenblätteröls

Die Dünnschichtchromatographie (DC) erlaubt im Gegensatz zur Gaschromatographie auch

die Untersuchung von nicht flüchtigen neben flüchtigen Inhaltsstoffen. Bei der Analyse

ätherischer Öle ist die DC als Screening-Methode bzw. zur Detektion von Hauptbestandteilen

geeignet und liefert gruppenspezifische Signale zur Identifizierung von Substanzen.

Die Dünnschichtchromatographie wurde zur Absicherung und Kontrolle von Extrakt und

ätherischem Öl auf 5×5-cm-Mini-DC-Platten durchgeführt. Die Trennung erfolgte auf einer

Kieselgel-60-F254-Platte (Fa. Merck, Darmstadt), als mobile Phase diente ein Gemisch aus

80 : 20 Hexan / Diethylether. Zur Entwicklung der DC-Platte wurde sie mit einer

Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz besprüht.

Gaschromatographie

Zur Identifizierung der Hauptkomponenten des Nelkenblätteröls bzw. –extraktes mittels

Gaschromatographie (GC), kommt ein gemeinsam mit dem Institut für Lebensmittelchemie

an der TU Dresden entwickeltes Verfahren zur Anwendung.

Abb. 4 GC/MS-Gerät an der TU Dresden (Agilent / HP 6890 Series mit 5973 MSD)

Dabei wird nach der Isolierung der ätherischen Öle mittels simultaner Destillation/Extraktion

das erhaltene Duftstoffgemisch gaschromatographisch an einer partiell polaren Kapillarsäule

getrennt, die Inhaltsstoffe mittels Massenspektrometer identifiziert (Totalionenstrom) und

enthaltene kontaktallergene Duftstoffe quantifiziert (Select Ion Mode).

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Probenvorbereitung (Simultane Destillation-Extraktion SDE)

5 bis 10 g Probe werden in einen 500 ml Rundkolben eingewogen. Man fügt 5 g

Natriumchlorid, 3 Glasperlen, 150 ml destilliertes Wasser und eine Spatelspitze

Silikonentschäumer hinzu. Anschließend werden 5 ml einer Dicyclohexylmethanol-Lösung

(DHM; interner Standard; 460 g/ml in n-Pentan) dazu pipettiert und der Kolben zur besseren

Durchmischung leicht geschwenkt.

In einen 100 ml Rundkolben füllt man je 25 ml n-Pentan und Diethylether und fügt 2

Glasperlen hinzu. Beide Kolben werden an die SDE-Apparatur (vgl. Abb. 5) angeschlossen.

Jetzt wird das U-Rohr der Apparatur so mit Wasser und n-Pentan gefüllt, dass sich die

Phasengrenze direkt unter der Rücklaufverbindung des n-Pentans befindet.

Die wässrige Probelösung (Heizpilz) und das n-Pentan (mittels Wasserbad, ca. 70°C) werden

parallel langsam zum Sieden erhitzt. Es ist darauf zu achten, dass die Lösemitteldämpfe des n-

Pentans zuerst im Kopfraum der Apparatur

ankommen. Die Destillationsdauer beträgt 4

Stunden.

Nach beendeter Destillation wird das n-

Pentan aus dem U-Rohr durch Kippen der

Apparatur in den Lösemittelkolben

überführt. Das n-Pentan entfernt man am

Rotationsverdampfer bei 50°C und

Normaldruck. Anschließend wird der

Rückstand in wenig n-Pentan

aufgenommen, in einen 5 ml Maßkolben

überführt und zur Marke aufgefüllt.

Das so gewonnene Destillat wird in ein Vial

gefüllt und gaschromatographisch

untersucht.

Abb. 5 Apparatur zur simultanen Destillation/Extraktion nach LIKENS und NICKERSON

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GC-MS

Parameter: Trennsäule : Kapillarsäule ZB5 (30 m x 0,25 mm ID; 0,25 µm Film)

5 % Phenylmethylsiloxan

Injektor : 120°C, pulsed splitless 0,5 min 25 psi

Injektionsvolumen : 1,0 µl

Temperaturprogramm : 2 min 50°C 5°C/min bis 109°C

3,0 min 109°C 5°C/min auf 250°C

3 min 113°C 5°C/min auf 250°C

10 min 250°C

Trägergas : Helium 1,0 ml/min

Detektor : 280°C, Massenselektiverdetektor (MS)

Elektronenstoßionisation (positiv) Dwell time 80

Abb. 6 Massenspektrum der isolierten Eugenolkomponente (m/z = 164)

Eugenol ist erwartungsgemäß die Hauptkomponente des Nelkenblätteröls. Unter

Berücksichtigung der Verdünnungsschritte wurde aus einer Dreifachbestimmung folgende

Zusammensetzung ermittelt.

OH

CH2

OCH3

CH CH2

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Tab. 3 Zusammensetzung Nelkenblätteröl

2.3. Beurteilung der Lagerstabilität

Die Beurteilung der Lagerstabilität der mit Nelkenblätteröl / Nelkenblätterextrakt versetzten

Verpackungsmaterialien erfolgte anhand des Eugenolgehaltes - mit etwa 85% die

Hauptkomponente der ätherischen Öle - über einen Zeitraum bis 6 Monate nach der

Herstellung.

Dabei wurde analog zu den beschriebenen Methoden der Quantifizierung der

Hauptkomponenten mittels GC/MS vorgegangen. Eine Kalibrierung des Gerätes erfolgte

mittels einer Duftstoff-Stammlösung (Gemisch aus 22 Duftstoffen - u.a. Eugenol und β-

Caryophyllen) sowie dem inneren Standard Dicyclohydroxymethanol (DHM). Diese wurden

in Verdünnungsschritten von 1:1 bis 1:1000 injiziert und eine Kalibriergerade erstellt (y =

0,610 x - 0,0038 bei r2 = 0,998). Die Nachweisgrenze / Bestimmungsgrenze wurde für die

Eugenol - Standardsubstanz mit 6 µg/ml bzw. 18 µg/ml ermittelt.

Inhaltsstoffe Anteil in %

α-Pinen 0,02 Methyl-N-Aminoketon 0,04

2-Heptanol 0,02 Furfural 0,08

α-Cubeben 0,07 α-Copaenn 0,15

Linalol 0,01 β-Caryophyllen 10,57

Methylbezoat 0,03 Methylsalizylat 0,13 Terpinen-4-ol 0,02 α-Humulen 1,13

5-Methyl-Furfural 0,05 Benzaldehyd 0,02

Caryophyllenoxid 0,19 Methyleugenol 0,13

Chavicol 0,11 Farnesol 0,30 Eugenol 73,50

Aceteugenol 11,98 E-Isoeugenol 0,16 Z-Isoeugenol 0,02

Benzylbenzoat 0,05 Humuladion 0,01

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2.4. Migrationsexperimente

Um Aussagen zum Stoffübergang antimikrobieller Komponenten der Verpackung auf das

Packgut zu erhalten wurden Migrationsexperimente mit Mehl als Testlebensmittel

durchgeführt. Zum Einsatz kam ein handelsübliches Weizenmehl Type 505.

Die Migrationsversuche wurden an den Proben W 16, W 18, W19 und W 21 (Papiertüten der

Fa. H. Ludwig Verpackungsmittel GmbH, Siebenlehn) durchgeführt. Bei den zu

untersuchenden Proben handelte es sich um jeweils 500 g-Verpackungseinheiten für Mehl

und Graupen. Die antimikrobiell wirksame Beschichtung erfolgte durch Zugabe von 10 %

Nelkenblätteröl (W 16), 20 % Nelkenblätterextrakt (W19) und 20 % Nelkenblätteröl (W18

und W20) in der Druckfarbe.

Die beschichteten Papiertüten wurden mit jeweils 200 g des handelsüblichen Weizenmehls

befüllt und 3 unterschiedlichen Temperaturregimen ausgesetzt:

1) Stresslagerung (1 Woche bei 40 + 2 °C im Wärmeschrank)

2) Normallagerung (3 Wochen bei 23°C Raumtemperatur)

3) Kühllagerung (4 Wochen bei 8°C im Kühlschrank)

Nach Ende der Lagerversuche wurden etwa 10 g des Mehls entnommen (möglichst nah am

Rand der Verpackung) und zur Bestimmung des Eugenolgehaltes mittels GC-MS eingesetzt.

2.5. Toxikologische Untersuchungen

2.5.1. Hemmstofftests / Wachstumskurven

Hemmstofftests

Bereits zur Auswahl der am besten mikrobiell wirkenden ätherischen Öle und Extrakte

wurden in Zusammenarbeit mit der IBN GmbH Dresden Hemmstoftests mit Aspergillus niger

in Petrischalen durchgeführt. Weitere Untersuchungen zur Hemmung dieses Testkeims

wurden an den behandelten Verpackungen durchgeführt.

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Wachstumskurven

Mit den verwendeten AQUALYTIC ® - Digitalmanometer ist es durch selbsttätige Messung

und Aufzeichnung des Druckes in einem geschlossenen System möglich, den Stoffwechsel

einer Kultur zu überwachen. Beim aeroben Abbau von organischer Substanz durch

Mikroorganismen entsteht Kohlendioxid, das im System mit Kalilauge absorbiert wird. Der

zum Abbau benötigte Sauerstoff wird der Gasphase entnommen. Dadurch sinkt der Druck im

System, der Druckabfall ist somit ein Maß für den Sauerstoffverbrauch. Der Druckabfall im

Reaktionsgefäß, welcher dem Sauerstoffverbrauch entspricht, wird vom Drucksensor

periodisch erfasst und gespeichert. Der Drucksensor basiert auf dem Prinzip des

piezoelektrischen Effekts und bewirkt, dass sich bei Zug oder Druck auf Kristalle deren

Gitterbausteine verschieben. Durch das dabei entstehende Dipolmoment werden die Kristalle

positiv oder negativ aufgeladen. Die elektrische Polarität wird im Mess-Sensor über eine

Widerstandsbrücke gemessen und elektronisch aufgezeichnet, die Daten per Infrarotsensor

abgerufen

Die Wachstumshemmtests werden in dieser Form an Pseudomonas putida jeweils vor und

nach der Behandlung des Substrates (Packstoffe) mit mikrobiell wirksamen Komponenten

getestet.

2.5.2. Leuchtbakterientest

Heißwasserextrakt

Zur Vorbereitung des Leuchtbakterientests wurde ein Heißwasserextrakt der beschichteten

Proben gemäß DIN EN 647 hergestellt. Die Prüfnorm beschreibt ein Verfahren zur Extraktion

von Papier- und Papp-Werkstoffen, die für einen direkten Lebensmittelkontakt vorgesehen

sind. Zur Bereitung des Extraktes werden 10 g Probe in etwa 1 bis 2 cm² große Stücke

geschnitten und in einem Erlenmeyerkolben mit 200 ml kochendem Wasser übergossen.

Danach wird der Kolben verschlossen und für 2 h bei 80°C im Wasserbad unter

gelegentlichem Umschütteln stehen gelassen. Anschließend wird der Überstand dekantiert

und die Probenstücke mit 80°C heißem Wasser gewaschen. Der Extrakt und die Waschanteile

werden in einem Messkolben auf 23°C abgekühlt und der Kolben bis zur Marke aufgefüllt.

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Leuchtbakterientest

Die Bestimmung der Toxizität erfolgt nach EN ISO 11348-1. Dabei tritt eine Hemmung der

Lichtemission von Vibrio fischeri, einem

marinen Leuchtbakterium, bei Zugabe von

potentiell toxischer Substanz auf. Die

Durchführung erfolgt als Batch-Test. Dazu

werden definierte Volumina des Testgutes

mit einer Leuchtbakteriensuspension in

einer Küvette vereinigt und die Abnahme

der Lumineszenz über einen Zeitraum von

30 min gemessen. Die Hemmwirkung wird

anhand von Verdünnungsreihen bestimmt, bei der die Lichtemission erstmals kleiner als 20 %

des Ausgangswertes ist.

Geräte: Fluoreszens-Spectrometer F 4500 der Fa. HITACHI,

pH-Messgerät inkl. Glaselektrode der Fa. WTW,

Thermostat mit Thermoblock der Fa. EPPENDORF,

Autoklav, Kühlschrank, Kolbenhubpipetten, Kühlzentrifuge, Stoppuhr,

Magnetrührer, Inkubator

Materialien: Medium 1: für frisch gezüchtete Bakterien

- 8,0 g D(+)-Glucose-Monohydrat ( C6H12O6 · H2O )

- 20,0 g Natriumchlorid ( NaCl )

- 2,035 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat ( MgCl2 · 6 H2O )

- 0,30 g Kalimchlorid ( KCl )

- 11,9 g N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N-(2-ethansulfonsäure) ( HEPES )

In Wasser lösen, 30 min rühren und den pH-Wert auf 7,0 + 0,2 einstellen.

Anschließend mit Wasser auf 1 l auffüllen.

Medium 2: Flüssigmedium für Vor- und Hauptkulturen

- 30,0 g Natriumchlorid ( NaCl )

- 6,10 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat ( NaH2PO4 · H2O )

- 2,75 g Di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat ( K2HPO4 · 6 H2O )

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- 0,204 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat ( MgSO4 · 7 H2O )

- 0,500 g Di-Ammoniumhydrogenphospaht ( (NH4)2HPO4 )

- 3 ml Glycerin

- 5,00 g Pepton aus Casein

- 0,50 g Hefeextrakt

In Wasser lösen und den pH-Wert auf 7,0 + 0,2 einstellen. Mit Wasser auf 1 l

auffüllen. 50 ml in einen Erlenmeyerkolben überführen und bei 121°C im

Autoklav sterilisieren.

Medium 3: Schutzmedium

- 66,0 g D(+)-Glucose-Monohydrat ( C6H12O6 · H2O )

- 4,0 g Natriumchlorid ( NaCl )

- 2,0 g L-Histidin

- 0,5 g Rinderserumalbumin ( BSA )

Bei 37°C vollständig in Wasser lösen und falls erforderlich den pH-Wert auf

7,0 + 0,2 einstellen. Mit Wasser auf 100 ml auffüllen. Schutzmedium immer

frisch zubereiten.

Kultivierung:

Die Leuchtbakterien vom Stamm Vibrio fischeri NRRL B-1117 (DSM 7151) werden in

Petrischalen überimpft. Dabei werden dem Medium 2 12 g/l Agar zugesetzt und anschließend

bei 121°C autoklaviert. Unter sterilen Bedingungen werden die Leuchtbakterien mit einer

Impföse in die Petrischalen überführt und anschließen 2 bis 3 Tage bei 20°C im Dunkeln

inkubiert.

Zur Herstellung der Vor- und Hauptkulturen wird jeweils eine lichtemittierende Einzelkolonie

identifiziert und steril in einen Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium 2 überimpft.

Die Aufbewahrung der Leuchtbakterien erfolgt in einer Vorratssuspension. Hierbei wird die

Hauptkultur in einer Kühlzentrifuge bei 6000 g für 15 min zentrifugiert. Die sedimentierten

Partikel werden in einer eisgekühlten Natriumchlorid-Lösung (20 g/l) resuspendiert und in ein

vorgekühltes Becherglas gegeben. Nun fügt man unter ständigem Rühren etwa 4 ml Medium

3 je 50 ml Hauptkultur-Ansatz hinzu. Zum Einstellen der geforderten Trübung von etwa 2500

+ 500 FNU ist anschließend eine weitere Zugabe des Schutzmediums (Medium 3) nötig

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(mind. 10 ml Schutzmedium je ml resuspendierte Partikel. Die Vorratssuspension wird in

Teströhrchen gegeben und ist im Gefrierschrank bei -20°C etwa einen Monat haltbar.

Durchführung:

Die aus der Heißwasserextraktion gewonnenen Fraktionen werden einer pH-Messung

unterzogen (pHsoll = 6 - 8,5). Bei starken Abweichungen ist eine Korrektur des pH-Wertes in

Richtung 7,0 vorzunehmen.

Von jeder Probe werden Verdünnungsreihen (siehe Tab. 4) vorbereitet.

Tab. 4 Verdünnungsreihen Verdünnung Verdünnungsstufe

D

wässriges

Probenextrakt [µl]

Verdünnungs-

wasser

[µl]

Vorratssuspension

[µl]

1 in 1,25 1 800 200

1 in 2 2 500 500

1 in 3 3 333,3 166,7 500

1 in 4 4 250 250 500

1 in 6 6 166,7 333,3 500

1 in 8 8 125 375 500

1 in 12 12 83,3 416,7 500

1 in 16 16 62,5 437,5 500

1 in 24 24 41,7 458,3 500

1 in 32 32 31,3 468,7 500

1 in 40 40 25,0 475 500

1 in 50 50 20,0 480 500

Kontrolle für

D = 1 800 200

D ≥ 2 500 500

Im Thermostat werden die Kontrollansätze, die Verdünnungsstufen der Probe und die

Verdünnungslösung bei (15 + 1) °C temperiert.

Die Vorratssuspension der Leuchtbakterien wird aus dem Gefrierschrank entnommen und bei

20°C aufgetaut. Anschließend gibt man das Medium 1 im 5-fachen Überschuss zur Menge an

aufgetauter Vorratssuspension zu und homogenisiert das Gemisch mit einem Plümper.

Die folgenden Arbeitsschritte erfolgen je Probe nacheinander in 20 s Abständen:

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1. das vorbereitete Gemisch wird zu je 500 µl in die leeren im Thermoblock bei (15 + 1)

°C befindlichen Küvetten gegeben

15 min Inkubationszeit

2. die Leuchtintensität I0 der Testsuspension mittels Fluoreszens-Spectrometer bei 490

nm bestimmen

3. Zugabe von 500 µl der jeweiligen Probenverdünnung (bei Blindwert entsprechend mit

Wasser), kurz schütteln

15 min Inkubationszeit

4. die Leuchtintensität I15 aller Küvetten bestimmen

15 min Inkubationszeit

5. die Leuchtintensität I30 aller Küvetten bestimmen

Auswertung:

Aus den gemessenen Leuchtintensitäten wird ein Korrekturfaktor fkt berechnet (Gl. 1). Dabei

werden die Ausgangswerte I0 aller Testansätze korrigiert, bevor sie als Bezugswerte zur

Abnahme der Leuchtintensität verwendet werden können.

0I

If kt

kt = (t = 15 und 30 min) (1)

fkt Korrekturfaktor für die jeweilige Kontaktzeit

Ikt Lumineszenz nach Ablauf von 15 bzw. 30 min

I0 Lumineszenz der Kontrolltestsuspension vor Zugabe des

Verdünnungswassers

Der Mittelwert des Korrekturfaktors fkt dient zur Berechnung des korrigierten Wertes für I0

unmittelbar vor Zugabe der Probe (Gl. 2).

ktct fII ⋅= 0 (2)

Ict korrigierter Wert für I0

ktf Korrekturfaktor für die jeweilige Kontaktzeit

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Die Hemmwirkung des Testansatzes wird nach Gleichung (3) berechnet.

100⋅−

=ct

Ttctt I

IIH (3)

Ht Hemmwirkung nach 15 bzw. 30 min in %

ITt Lumineszenz des Testansatzes nach 15 bzw. 30 min

Zur Berechnung der Konzentrationseffekte wird der Gamma-Wert für jede Verdünnungsstufe

nach Gleichung (4) errechnet.

t

tt H

H−

=Γ100

(4)

Γt Gamma-Wert des Testansatzes nach Ablauf der

Kontaktzeit von 15 oder 30 min

tH Mittelwert von Ht aus (3)

Den Konzentrationseffekt EC für jede Inkubationszeit kann man mit Hilfe einer einfachen

linearen Regression berechnen. Der Konzentrationseffekt für eine gegebene Inkubationszeit

(z.B. 15 oder 30 min) kann durch die folgende lineare Gleichung (5) beschrieben werden.

abc tt lglglg +Γ= (5)

ct Anteil des wässrigen Extraktes im Testansatz in %

b Steigung der beschriebenen Geraden

lg a Wert des y-Achsenabschnittes der beschriebenen

Geraden

Mit der Methode der kleinsten Quadrate lassen die EC20 -und EC50 - Werte berechnen (ct =

EC20 bei Γ30 = 0,25 und ct = EC50 bei Γ30 = 1,00).

20

3. Ergebnisse

3.1. Materialauswahl

Im ersten Teil der Bearbeitungszeit wurde gemeinsam mit den Industriepartnern eine

Festlegung der antimikrobiell wirksamen Naturstoff-Klasse (ätherische Öle und deren

Extrakte) vorgenommen sowie ein Rahmen für die eingesetzten Konzentrationen beim

Anwender abgesteckt. Als besonders geeignet, das Wachstum von Testkeimen (z.B.

Aspergillus niger, Trichoderma viride, Aspergillus tereus) zu verlangsamen bzw. zu

verhindern, erwiesen sich kommerziell erhältliches Nelkenblätteröl und Nelkenextrakt. Sie

wurden als Bestandteile von Druckfarben und Leimen in Konzentrationen von 2,5 - 5 % beim

Nelkenblätteröl und 5 - 10 % beim Nelkenextrakt zum Einsatz kommen. Im Offset-

Druckverfahren führte eine Beimengung von Nelkenblätteröl / -extrakt zu Beeinträchtigungen

im Produktionsablauf sowie zu einer Farbverschiebung. Die bedruckten Proben wurden in

einem zweiten Arbeitsschritt mit einer Lackschicht versehen, die ebenfalls Nelkenblätteröl / -

extrakt in Konzentrationen von 5 - 10 % enthielt.

3.2. Analyse der ätherischen Öle

Da die Zusammensetzung von Naturstoffen wie ätherischen Ölen immer gewissen

Schwankungen unterliegen, erfolgte eine exakte Quantifizierung der wirksamen

Komponenten (Eugenol-Gehalt) in den Ölen / Extrakten zeitnah zur Bestimmung des

Gehaltes dieser Stoffe in den antimikrobiell ausgerüsteten Verpackungsmaterialien.

Die zur Anwendung vorgesehenen Nelkenextrakte wurden zuerst durch sensorische und

chemisch-physikalische Analysen näher charakterisiert.

Im nächsten Schritt erfolgte eine Quantifizierung der Hauptinhaltsstoffe durch eine

Aufarbeitung / Aufreinigung der Proben mittels simultaner Destillation und Extraktion und

nachfolgender gaschromatographischer Analyse (GC-MS).

Eugenol konnte in einer Dreifachbestimmung durch Massenspektrometrie eindeutig als

Hauptkomponente des Nelkenblätteröls identifiziert und mit 73,5 + 3,2 % bestimmt werden

21

(siehe Tab. 3). Die beiden wichtigen Nebenbestandteile Aceteugenol und ß-Caryophyllen

wurden mit Gehalten von 12,0 + 1,9 % und 10,6 + 1,8 % gefunden.

Abb.7 GC-MS Chromatogramm der Probe W 19 (20 % Nelkenextrakt in Druckfarbe)

Reinheitsuntersuchungen des verwendeten Nelkenblätteröls ergaben einen Anteil von 85,43 +

1,77 % Eugenol beim Nelkenblätterextrakt betrug dieser Anteil 83,71 + 1,91 %. Über den

Anteil dieser Hauptkomponente ist die Rückrechnung auf die Gesamtmenge an ätherischem

Öl / Extrakt im Produkt möglich.

3.3. Beurteilung der Lagerstabilität

Die Beurteilung der Lagerstabilität der mit Nelkenblätteröl bzw. Nelkenblätterextrakt

versetzten Proben erfolgte anhand des Eugenolgehaltes. Der Eugenolgehalt wurde mittels

GC-MS Analytik mit vorangegangener SDE als Summenparameter aus Eugenol und

Aceteugenol bestimmt.

22

Tab. 5 Beurteilung der Lagerstabilität über die Abnahme des Eugenolgehaltes

Probe

Herstellung

/ Eingang

Anteil in %

an aufgetragenem Nelken-

Eugenolgehalt (mg/m²)

Wieder-findung

(%)

Eugenolgehalt (mg/m²)

Wieder-findung

(%)

-extrakt

-blätteröl

März / April 04

Juni / Juli 04

G 16 17.09.03 10 0,204 51,0 0,183 45,8

G 17 04.12.03 20 0,539 67,4 0,506 63,3

G 18 04.12.03 20 0,548 68,5 0,512 64,0

G 19 04.12.03 100 3,412 85,3 3,291 82,3

G 20 04.12.03 100 3,288 82,2 3,197 79,9

G 21 04.12.03 10 0,291 72,8 0,272 68,0

G 22 04.12.03 10 0,287 71,8 0,256 64,0

K 17 06.12.03 10 0,033 8,3 nicht

K 20 06.12.03 5 0,016 8,0 bestimmt

K 23 06.12.03 10 0,037 9,3 0,044 11,0

W 17 11.12.03 10 0,189 47,3 0,166 41,5

W 18 11.12.03 20 0,492 61,5 0,459 57,4

W 19 11.12.03 20 0,422 52,8 0,383 47,9

W 20 11.12.03 20 0,445 55,6 0,391 48,9

W 21 11.12.03 20 0,460 57,5 0,418 52,3

W 22 11.12.03 20 0,474 59,3 0,423 52,9

Die Berechnung der Wiederfindung erfolgt mit der Annahme einer gleichmäßigen Verteilung

auf der Oberfläche des Papiers bzw. im Leim des Bodens und der Seitennaht. Es wurde von

einer durchschnittlichen Auftragsmenge von 4 g/m² ausgegangen, da eine exakte Bestimmung

des Auftrages während der Herstellung der Proben bei den Industriepartnern nicht möglich

war. Diese Auftragsmenge entspricht in etwa dem Anteil an Druckfarbe für einen

vollflächigen Druck.

23

G 16G 17

G 18G 19

G 20G 21

G 22K 17

K 20K 23

W 17

W 18

W 19

W 20

W 21

W 22

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Euge

nolg

ehal

t [m

g/m

²]

Probe

Juni / Juli März / April

Abb. 8 Abnahme des Eugenolgehaltes während der Lagerung über 6 Monate

Die geringe Abnahme des Wirkstoffgehaltes (von 2,3 % bei Probe G 20 bis 7,8 % bei Probe

G 22) im Vergleich zu den im März gemessenen Werten lässt sich z.T. durch die idealen

Lagerbedingungen, im Kühlschrank bei 8°C in jeweils einzeln verschweißten

Umverpackungen, erklären. Weiterhin findet in der Zeit direkt nach der Herstellung der

größte Übergang von leicht flüchtigen Öl- und Extraktbestandteilen in die

Umgebungsatmosphäre statt und wurde hier nicht berücksichtigt.

Für die untersuchten Proben der Fa. Elbtal Druckerei Dresden (K 17, K 20 und K 23)sind mit

der verwendeten Methode zur Eugenolbestimmung keine verlässlichen Angaben zur

Wiederfindung möglich. Die Komponenten des ätherischen Öls lassen sich aufgrund des

Einbringens in eine Lackschicht nicht mittels SDE (Wasserdampfdestillation) in das

Lösungsmittel n-Pentan überführen. Eine direkte Extraktion mit n-Pentan führt jedoch durch

eine Reihe von aus dem Papier und Lack gelösten Stoffen (Weichmacher,

Konservierungsmittel, Füllstoffe usw.) zu zahlreichen Störpeaks und Überlagerungen im GC-

MS Spektrum.

24

3.4. Migrationsexperimente

In Auswertung der durchgeführten Lagerversuche mit dem trockenen Modell-Lebensmittel

Mehl konnten bei keinem Temperatur-Zeit-Regime Eugenolgehalte nachgewiesen werden.

Beispielhaft ist in Abbildung 9 das GC-MS-Chromatogramm einer bei 40°C gelagerten

Mehlprobe dargestellt (Stresslagerung: 200g Weizenmehl (Type 505) bei 40°C über einen

Zeitraum von 7 Tagen).

Abb. 9 Lagerversuch Weizenmehl (7 Tage bei 40°C)

Wie im Chromatogramm ersichtlich fehlt der typische Eugenol-Peak bei einer Retentionszeit

von 22.58 min. Die auftretenden Siloxan-Peaks bei 13,83 min; 21,22 min und 27,97 min

werden durch Auswaschungen des GC-Säulenmaterials (sog. Ausbluten der Säule)

verursacht. Die Siloxane sind sehr leicht durch ihre hohen Molmassen mz > 450 zu

identifizieren und sind nur in geringen Konzentrationen enthalten. Nach dem Austausch der

Chromatographie-Säule traten Siloxan-Peaks nur noch sehr vereinzelt auf (siehe auch Abb. 7)

Siloxane

25

Tab. 6 Auswertung der Stresslagerung von Weizenmehl bei 40°C

Bezeichnung Herstellung Nelken- Nelken- Anteil Ort Einwaage

Weizenmehl Eugenol-

gehalt extrakt blätteröl in % [ g ] [ µg/ml ]

Neg-Kontrolle 19.04.04 0 10,009 n.n

W 16 11.12.03 x 10 Druckfarbe 10,092 n.n W 18 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,032 n.n W 19 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,052 n.n W 21 11.12.03 x 20 Druckfarbe 10,044 n.n

Trotz des fehlenden quantitativen Nachweises der Nelkenkomponente entwickelten speziell

die im Wärmeschrank bei 40°C gelagerten Proben beim Öffnen einen sehr dominanten und

charakteristischen Nelkengeruch. Daraus lässt sich ein Vorhandensein von Eugenol im

Gasraum um die Verpackung sowie über dem Packgut ableiten.

3.5. Toxikologische Untersuchungen

Wachstumskurven

Die Wachstumshemmtests mit den im Zwischenbericht 1 dargestellten AQUALYTIC ® -

Digitalmanometer verliefen unspezifisch. Das heißt, dass es bei Pseudomonas putida im

wässrigen Medium bei Zugabe von unbehandeltem Verpackungsmaterial einerseits zu

Wachstumshemmung kam, andererseits zu vermehrter Sauerstoffzehrung durch das einer

weiteren Kohlenstoffquelle in Form von Papier (Fremdbesiedelung). Eine verlässliche

Aussage über die Hemmwirkung der in verschiedenen Konzentrationen aufgetragenen

antimikrobiellen Agenzien ist daher nicht möglich.

Leuchtbakterientest

Die Bestimmung der Biotoxizität mittels Leuchtbakterientest (DIN EN ISO 11348) gehört

neben den ebenfalls normierten Fisch-, Daphnien- und Algentest zu den führenden Tests in

der Toxizitätsanalytik. Als Organismen werden marine Leuchtbakterien der Spezies Vibrio

fischeri NRRL B-11177 eingesetzt. Es handelt sich um ein halophiles, fakultativ anaerobes,

gramnegatives Stäbchen mit polarer Begeißelung, dessen Biolumineszenz Bestandteil des

26

Stoffwechsels ist. Jede Art von Toxizität beeinträchtigt diese Stoffwechselprozesse und kann

entsprechend erfasst werden.

Im durchgeführten Test wurde die Hemmung der Biolumineszenz ermittelt, indem definierte

Volumina des Heißwasserextraktes der Proben mit einer Leuchtbakteriensuspension in einer

Küvette vereinigt werden. Das eigentliche Testkriterium ist die nach einer Kontaktzeit von 30

min gemessene Abnahme gegenüber einem Kontrollansatz. Die Lumineszenzmessungen

wurden an einem Fluoreszens-Spectrometer F 4500 der Firma HITACHI durchgeführt.

Die Toxizität einer Substanz wird üblicherweise in Prozent der Leuchtkraft-Hemmung bei der

jeweiligen Verdünnungsstufe bzw. als EC50-Wert angegeben. Als Effektkonzentration EC

wird die Konzentration des Analyten bezeichnet, bei der ein bestimmter Prozentsatz

untersuchter Organismen betroffen ist (EC20 - 20%; EC50 - 50%).

Tab. 7 Auswertung Leuchtbakterientest

Probe

G 14 10%

Nelkenblätteröl im Bodenleim

G 17 20%

Nelkenblätter-extrakt in der Druckfarbe

W 18 20%

Nelkenblätteröl in der

Druckfarbe

W 20 20%

Nelkenblätter-extrakt im Bodenleim

K 35 10%

Nelkenblätteröl im Lack

Verdünnungs-

stufe D

Hemmung nach 30 min

30H [%]

2 69,78 79,07 84,77 77,68 54,97

3 54,19 63,87 75,85 58,08 21,08

4 20,28 32,34 43,70 41,61 5,49

6 7,37 10,93 13,65 14,73 1,67

8 1,34 3,60 9,06 7,66

12 3,20

EC20 - Wert [%]

24,7 20,9 17,0 18,4 33,3

EC50 - Wert [%]

35,5 31,2 26,6 30,3 46,6

27

In Tabelle 7 sind die ermittelten Werte für die Toxizitätsuntersuchungen mit dem

Leuchtbakterium Vibrio fischeri aufgeführt. Die kursiv dargestellten Werte der Verdünnung

(D) werden als niedrigste unwirksame Verdünnung (LID) bezeichnet sind solche, bei denen

H30 < 20 % ist. Die Daten für Hemmung 30H sind Mittelwerte aus jeweils 3 Messungen.

Die EC50 - Werte schwanken in einem Bereich von 26,6 (Probe W 18)bis 46,6 (Probe K 35)

wobei die Zahlenwerte als Reziproke ihrer Toxizität zu verstehen sind, d. h. EC50 > 100% -

nicht toxisch; EC50 < 1% - extrem toxisch.

Wie bereits bei der Aufarbeitung für die GC-MS Versuche ersichtlich, kommt es bei einer

Applikation des Nelkenblätteröles im Lack (Probe K 35) zu einer sehr starken / hydrophoben

Bindung und die Wirkstofffreisetzung erfolgt nur langsam.

Es lassen sich jedoch aufgrund der Aufarbeitung der Proben für den Leuchtbakterientest;

Überführen des Nelkenblätteröls bzw. -extraktes von den Trägermaterialien in den flüssigen

Aggregatzustand durch Heißwasser-Extraktion; keine detaillierten Aussagen über die

alleinige Hemmwirkung der aufgebrachten antimikrobiell wirksamen Komponenten treffen.

Eine Vergleichsprobe aus unbehandeltem Karton GC - 270 g/m² (Grundkörper der Probe W

35) zeigte durch herausgelösten Verbindungen die während der Extraktion eine Hemmung

von 37,2 % bei D = 2. Das, zum weiteren Vergleich eingesetzte, reine Eugenol (>99% der Fa.

Merck Darmstadt) ist mit einem ermittelten EC50-Wert von 1,6 % bereits als stark toxisch zu

bewerten.

Die Hersteller von Druckfarben und Leim geben in den entsprechenden

Sicherheitsdatenblättern lediglich eine verbale Beschreibung der humantoxischen Wirkung an

(GefahrstoffVO / EG-Richtlinie 88/379/EWG). Es kann aber davon ausgegangen werden,

dass diese Trägermaterialien der antimikrobiellen Komponenten an sich schon eine Hemmung

im Leuchtbakterientest bewirken.

Die in Tabelle 7 aufgeführten Werte verstehen sich demnach als eine Durchschnittsangabe der

Toxizität aller wasserlöslichen Verbindungen des Verpackungsmaterials zu beurteilen.

28

3.6. Lebensmittelrechtliche Beurteilung

Bedarfsgegenstände sind gemäß Definition in § 5 Abs. 1 Deutschem Lebensmittel- und

Bedarfsgegenständegesetz (LMBG):

(1) Gegenstände, die dazu bestimmt sind, bei dem Herstellen, Behandeln,

Inverkehrbringen oder dem Verzehr von Lebensmitteln verwendet werden und dabei

mit den Lebensmitteln in Berührung kommen oder auf diese einwirken;

(2) Packungen, Behältnisse oder sonstige Umhüllungen, die dazu bestimmt sind, mit

kosmetischen Mitteln oder Tabakerzeugnissen in Berührung zu kommen….

In dieser Erweiterung müssen sich die hergestellten antimikrobiellen Verpackungsmaterialien

dem LMBG unterwerfen.

Der Fünfte Abschnitt: Verkehr mit sonstigen Bedarfsgegenständen des LMBG regelt in § 30

Verbote zum Schutz der Gesundheit:

Es ist verboten,

(1) Bedarfsgegenstände derart herzustellen oder zu behandeln, dass sie bei bestimmungs-

gemäßem oder vorauszusehenden Gebrauch geeignet sind, die Gesundheit durch ihre

stoffliche Zusammensetzung, insbesondere durch toxikologisch wirksame Stoffe oder

durch Verunreinigungen, zu schädigen;

(2) Gegenstände oder Mittel, die bei bestimmungsgemäßem oder vorauszusehenden

Gebrauch geeignet sind, die Gesundheit durch ihre stoffliche Zusammensetzung,

insbesondere durch toxikologisch wirksame Stoffe oder durch Verunreinigungen, zu

schädigen, als Bedarfsgegenstände in den Verkehr zu bringen; …..

Speziell die Wirkstoffe des Nelkenblätteröls / -extrakts besitzen ein allergenes Potential

[SCHUMANN, 2001] und sind somit auch geeignet den Gesundheitszustand der Verbraucher

negativ zu beeinflussen.

Der § 31 LMBG regelt den Übergang von Stoffen auf Lebensmittel:

Es ist verboten,

(1) Gegenstände als Bedarfsgegenstände im Sinne des § 5 Abs. 1 Nr. 1 gewerbsmäßig so

zu verwenden oder für solche Verwendungszwecke in den Verkehr zu bringen, dass

29

von ihnen Stoffe auf Lebensmittel oder deren Oberfläche übergehen, ausgenommen

gesundheitlich, geruchlich und geschmacklich unbedenkliche Anteile, die technisch

unvermeidbar sind……

Dieser Paragraph lässt wenig Spielraum hinsichtlich einer Beeinflussung von Lebensmitteln

durch Nelkenwirkstoffe, allein schon durch ihren geringen Geruchsschwellenwert. Den

Übergang von Stoffen auf das Lebensmittel die „technisch unvermeidbar“ sind regeln u.a.

auch die EU- Verordnungen RL 76/893/EWG Art. 2 und RL 89/109/EWG Art 2.

In der Bedarfsgegenstände-Verordnung findet man in den Anlagen zu § 8 Übergang von

Stoffen auf Lebensmittel:

Anlage 3 Abschnitt 3 Zugelassene Stoffe, für die besondere

Verwendungsbeschränkungen gelten

Eugenol EWG-Verpackungsmaterial-Referenznummer: 17160

SML (spez. Migrationswert) = n.n. (nicht nachweisbar)

NG (Nachweisgrenze der Methode) = 0,02 mg / kg

Anlage 6 …gilt der Anteil der Stoffe die vom Bedarfsgegenstand auf das

Lebensmittel übergeht als geruchlich und geschmacklich unbedenklich,

wenn der für das Lebensmittel typische Geruch nicht nachteilig

beeinflusst wird….(es wird ein Verfahren mit Blind- und

Vergleichsproben vorgeschlagen)

Auch wenn nach 14-tätiger Stresslagerung kein Eugenol mittels GC-MS nachweisbar war

(Anforderung gem. § 8 BedarfsgegenständeV Anlage 3) würde eine Gegenüberstellung von

Blind- und Vergleichsprobe das mit Nelkenwirkstoff versetzte Verpackungsmaterial

geruchlich leicht erkennbar machen.

30

4. Zusammenfassung und Ausblick

Ätherische Öle sind prinzipiell dazu geeignet, das Wachstum von Mikroorganismen zu

hemmen. Im Rahmen des Forschungsvorhabens wurden erste Anwendungen im

Verpackungsbereich für Papier-Packstoffe getestet.

Nelkenblätteröl und Nelkenblätterextrakt, als antimikrobielle Komponenten, wurden in

Konzentrationen von 5 bis 20 Vol.-% dem Klebstoff, der Druckfarbe oder dem Lack

zugesetzt und auf verschiedene Papier- und Pappwerkstoffe appliziert.

Die Analytik der Nelkenbestandteile erfolgte über GC-MS Untersuchungen mir

entsprechender Vorbehandlung. Über die quantitative Erfassung der Hauptkomponente dieser

Verbindungen, das Eugenol, war es möglich einen Wirkstoffverlust während der Lagerung

bzw, einen Übergang auf ein Testlebensmittel nachzuweisen. In der Regel sind Verpackungen

nach einem Zeitraum von 3 bis 6 Monaten beim Verbraucher angekommen. In

Lagerversuchen unter geschlossenen Bedingungen konnte der Wirkstoffverlust während

dieses Zeitraumes maximal 8 % betragen. Für den Anwendungsfall wird eine ähnliche

Aufbewahrung der Packmittel (kühl, lichtgeschützt, Luftabschluss) empfohlen.

In Migrationsexperimenten mit einem trockenen Testlebensmittel konnte kein Eugenol

nachgewiesen werden. Bei höheren Temperaturen kam es jedoch zu einer deutlichen

Geruchsentwicklung durch flüchtige Komponenten des ätherischen Öls / Extraktes.

Die sensorische Wahrnehmungsschwelle (Geruch) liegt bei einer Vielzahl von ätherischen

Ölen deutlich über der Wirkschwelle dieser Stoffe, somit ist eine Geruchsneutralisierung der

behandelten Verpackung nur durch Überlagern des Eigenaromas mit anderen Duftstoffen

möglich. Die Applikation in einer Lackschicht bietet eine Chance den typischen Geruch der

Nelkenkomponenten zu binden - bei leichter Abschwächung der antimikrobiellen

Wirksamkeit.

Im Leuchtbakterientest mit Vibrio fischeri zeigten die funktionalisierten Packstoffe eine

mittlere bis mäßige toxikologische Wirkung. Reines Eugenol in hohen Konzentrationen ist

stark toxisch und besitzt kontaktallergenes Potential.

Für einen weiteren Anwendungsverlauf sollte eine weitere Minimierung der Auftragsmengen

an Nelkenblätteröl und -extrakt bei Einhaltung der erwünschten fungiziden und bakteriziden

Wirkung erfolgen. Es wäre anstrebenswert, den auftretenden Eigengeruch der

funktionalisierten Verpackungsmaterialien beispielsweise durch eine bindende Lackschicht zu

31

minimieren. Dies könnte ebenfalls zu einem geringeren kontaktallergenen Potential der

Verpackung führen.

Nach derzeitiger Rechtslage dürfte eine Verpackung, bei der Nelkenblätteröl oder -extrakt

direkt mit der Druckfarbe oder dem Leim aufgetragen wurde, keine Zulassung nach LMBG

erhalten - dafür ist die Beeinflussung des Eigengeruchs der zu verpackenden Lebensmittel zu

groß. Weiterhin sollten Lagerversuche mit wasser- bzw. ölhaltigen Modelllebensmitteln die

Migration auf das Packgut (Lebensmittel) untersuchen.

Für eine technische Anwendung sind die im Bearbeitungszeitraum untersuchten Materialien

sehr gut geeignet.

32

5. Literaturverzeichnis

BELITZ, H. D.; GROSCH, W.; SCHIEBERLE, P.:

Lehrbuch der Lebensmittelchemie; Berlin, Heidelberg: Springer Verlag, 5. überarbeitete

Auflage, 2001

BLEISCH, G.; et al.:

Lexikon Verpackungstechnik; Hamburg: B. Behr’s Verlag GmbH & Co., 2003

BUCHNER, N.:

Verpackung von Lebensmitteln, Berlin, Heidelberg: Springer Verlag, 1999

BundesDeutscheGesetze;

Große Sammlung 14.01.2003; CD-ROM; Bonn; Deutscher Anwalt Verlag; 2003

ELLENDT, K.; et al.:

Analysis of sensitizing fragrances by gas chromatography - mass spectrometry; SÖWF-

Journal; 127. Jahrgang; No. 12; 2001; 46 ff

HAN, J. H.:

Antimicrobial Food Packaging, Foodtechnology Vol. 54, No. 3; 2000; 56-65

HOLLEY, C.:

Wo bleibt die Aktive Verpackung?, Verpackungs-Rundschau, 7/2002, TWB 37

LÜMMEN, P.:

Bakterielle Biolumineszenz: Biochemie, Physiologie und Molekulargenetik; Forum

Mikrobiologie; No. 10; 1988; 428-434

MERTZ, K. W.; JEHN, H. A.:

Praxishandbuch moderne Beschichtungen, Carl Hanser Verlag München Wien, 2001

33

MILES, W. H.; SMILEY, P. M.:

Isolation of Volatile Oils from Species by Steam Distillation and Bioassay for Biological

Activity, J. Chem. Ed, 2002, 79-90

NEUMANN, R.; MOLNAR, P.:

Sensorische Lebensmitteluntersuchung, Fachbuchverlag Leipzig, 2.Auflage, 1991

PADGETT, T.; HAN, I. Y.; DAWSON, P. L.:

Incorporation of food-grade antimicrobial compounds into biodegradable packaging films;

Journal of Food Protection; 1998, No. 10; 1330-1335

PIRINGER, O. G.:

Verpackungen für Lebensmittel; Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1993

PIZZALE, L.; BORTOLOMEAZZI, R.; TOGNON, R.:

Chemical Composition and Antioxidant Activity of Essential Oils of Different Botanical

Origin, Universität Udine, 1998

SCHUMANN, R.:

Allergien durch Riechstoffe; Bundesgesungheitsblatt - Gesundheitsforschung / Gesundheits-

schutz; Springer-Verlag; 2001; No. 44; 705-708

STREHLE, G.:

Verpacken von Lebensmitteln; Hamburg: B. Behr’s Verlag GmbH & Co., 1997

SUHR, K. I.; NIELSEN, P.V.:

Antifungal activity of essential oils evaluated by two different application techniques against

rye bread spoilage fungi; Journal of Applied Microbiology, 2003, No. 94, 665-667

ZIPFEL, W.; RATHKE, K.-.D:

Lebensmittelrecht - Loseblatt-Kommentar; München, Beck Verlag; 1992-2002