Tierärztliche Hochschule Hannover · Abbildung 4.13: Entwicklung der S. aureus -Tierprävalenz in...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zur Sanierung von

Staphylococcus aureus- Mastitiden mittels

stallspezifischer Vakzinen in Schaf- und

Ziegenherden

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Julia Jokiel

Bremen

Hannover 2009

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. M. Ganter (Klinik für kleine Klauentiere

und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik)

1. Gutachter: Prof. Dr. M. Ganter

2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2009

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................. ......................................................

ABBILDUNGSVERZEICHNIS.............................. ........................................................

TABELLENVERZEICHNIS ................................ ..........................................................

1 EINLEITUNG..................................................................................................... 23

2 LITERATURÜBERSICHT ................................. ................................................ 25

2.1 Staphylococcus aureus ............................................................................... 25

2.2 Epidemiologie von S. aureus -Mastitiden ........................................ ........... 26

2.3 Pathogenese von S. aureus -Mastitiden ........................................ ............. 27

2.4 S. aureus als Mastitiserreger bei Schafen und Ziegen........ ..................... 30

2.5 S. aureus -Mastitis-Diagnostik............................... ...................................... 31

2.5.1 Erregernachweis ........................................................................................ 31

2.5.1.1 Kulturelle Untersuchung...................................................................... 31

2.5.1.2 PCR .................................................................................................... 33

2.5.2 Zytologische Untersuchung von Milchproben............................................. 35

2.5.2.1 Physiologischer Zellgehalt von Schaf- und Ziegenmilch ..................... 36

2.5.2.2 Vergleichbarkeit von California Mastitis Test (CMT) und somatischem

Zellgehalt (SCC)................................................................................................ 38

2.5.2.3 Entwicklung des Zellgehalts bei Nachweis von S. aureus................... 39

2.6 Bekämpfung der S. aureus -Mastitis .......................................... ................. 40

2.6.1 Antibiotikatherapie...................................................................................... 40

2.6.1.1 Laktationsantibiose ............................................................................. 42

Inhaltsverzeichnis

2.6.1.2 Trockenstellen unter antibiotischem Schutz........................................ 43

2.6.2 Maßnahmen im Herdenmanagement......................................................... 44

2.6.3 Vakzination................................................................................................. 46

2.6.3.1 Zusammensetzung von S. aureus-spezifischen Vakzinen .................. 47

2.6.3.1.1 Antigene .......................................................................................... 47

2.6.3.1.1.1 Lebende Bakterien ................................................................... 47

2.6.3.1.1.2 Abgetötete (inaktivierte) Bakterien ........................................... 49

2.6.3.1.1.2.1 Stallspezifische Vakzinen .................................................. 49

2.6.3.1.1.3 Toxoide..................................................................................... 50

2.6.3.1.1.4 Kapsel und Pseudokapsel ........................................................ 51

2.6.3.1.1.5 Clumping Faktor A (ClfA).......................................................... 51

2.6.3.1.1.6 Protein A................................................................................... 52

2.6.3.1.1.7 Weitere Antigene...................................................................... 52

2.6.3.1.2 Adjuvantien...................................................................................... 53

2.6.3.2 Applikationsformen.............................................................................. 54

2.6.3.2.1 Systemisch ...................................................................................... 54

2.6.3.2.2 Lokal – nahe Lnn. inguinales superficiales ...................................... 55

2.6.3.2.3 Lokal – intrazisternal (i.z.)................................................................ 55

2.6.3.3 Applikationszeitpunkt .......................................................................... 56

2.6.4 Kombination von Vakzination und Antibiose .............................................. 57

3 MATERIAL UND METHODEN.............................. ............................................ 59

3.1 Vorversuch ......................................... .......................................................... 59

3.2 Versuchstiere ...................................... ......................................................... 59

3.2.1 Betrieb A .................................................................................................... 60

3.2.2 Betrieb B .................................................................................................... 61

3.3 Versuchsaufbau..................................... ...................................................... 61

3.3.1 Impfung ...................................................................................................... 61

3.3.2 Milchproben................................................................................................ 63

Inhaltsverzeichnis

3.4 Impfstoff .......................................... ............................................................. 64

3.5 Analytische Methoden............................... .................................................. 65

3.5.1 Bakteriologische Untersuchungen.............................................................. 65

3.5.1.1 Kulturelle Untersuchung...................................................................... 65

3.5.1.2 Resistenztests..................................................................................... 66

3.5.1.3 S. aureus-spezifische PCR ................................................................. 66

3.5.1.3.1 DNA-Isolierung ................................................................................ 66

3.5.1.3.2 Photometrische Messung des DNA-Gehaltes ................................. 68

3.5.1.3.3 Replikation der DNA mittels PCR .................................................... 68

3.5.1.3.4 Agarose-Gelelektrophorese............................................................. 70

3.5.1.3.5 Auswertung der Gele....................................................................... 70

3.5.1.4 Typisierung einiger S. aureus-Isolate mittels DNA-Microarray............ 71

3.5.2 Zytologische Untersuchungen.................................................................... 71

3.5.2.1 Bestimmung des Zellgehalts ............................................................... 71

3.5.2.2 Semiquantitative Bestimmung des Zellgehalts mittels California Mastitis

Test (CMT) ........................................................................................................ 72

3.6 Statistische Auswertung ............................ ................................................. 72

3.6.1 Häufigkeiten (Chi-Quadrat-Homogenitätstest und McNemar-Test) ............ 73

3.6.2 Gehalte an somatischen Zellen und CMT-Werte (Wilcoxon’s two sample test

und Wilcoxon’s signed rank test) .......................................................................... 73

4 ERGEBNISSE................................................................................................... 74

4.1 Vorversuch ......................................... .......................................................... 74

4.2 Ergebnisse bakteriologischer Untersuchungen ........ ............................... 75

4.2.1 Vergleichbarkeit von kultureller Untersuchung und PCR............................ 75

4.2.2 Resistenztests............................................................................................ 76

4.2.3 Typisierung einiger S. aureus-Isolate mittels DNA-Microarray ................... 77

4.3 Effekte der Vakzination in den Betrieben ........... ....................................... 78

4.3.1 Betrieb A .................................................................................................... 78

Inhaltsverzeichnis

4.3.1.1 Impfreaktionen .................................................................................... 78

4.3.1.2 S. aureus-Prävalenz............................................................................ 79

4.3.1.2.1 Entwicklung im gesamten Tierbestand ............................................ 79

4.3.1.2.2 Entwicklung in der Impfgruppe s.c................................................... 81

4.3.1.2.3 Entwicklung in der Impfgruppe i.z.................................................... 82

4.3.1.2.4 Impfgruppenvergleich ...................................................................... 83

4.3.1.3 Gehalt an somatischen Zellen............................................................. 84





4.3.1.3.5 Vergleich S. aureus-positiver und -negativer Milchproben .............. 90

4.3.2 Betrieb B .................................................................................................... 92

4.3.2.1 Impfreaktionen .................................................................................... 92

4.3.2.2 S. aureus-Prävalenz............................................................................ 93





4.3.2.2.5 Entwicklung im Schafbestand.......................................................... 97

4.3.2.2.6 Entwicklung im Ziegenbestand........................................................ 98

4.3.2.2.7 Tierartvergleich................................................................................ 99

4.3.2.3 Gehalt an somatischen Zellen........................................................... 100

4.3.2.3.1 Entwicklung im gesamten Tierbestand .......................................... 100

4.3.2.3.2 Entwicklung in der Impfgruppe s.c................................................. 101

4.3.2.3.3 Entwicklung in der Impfgruppe i.z.................................................. 102

4.3.2.3.4 Impfgruppenvergleich .................................................................... 104

4.3.2.3.5 Entwicklung im Schafbestand........................................................ 105

4.3.2.3.6 Entwicklung im Ziegenbestand...................................................... 106

4.3.2.3.7 Tierartvergleich.............................................................................. 107

4.3.2.3.8 Vergleich S. aureus-positiver und negativer Milchproben.............. 109

Inhaltsverzeichnis

5 DISKUSSION.................................................................................................. 112

5.1 Beurteilung der angewandten Methoden............... .................................. 112

5.2 Beurteilung der Ergebnisse ......................... ............................................. 116

5.2.1 Beurteilung der Ergebnisse bakteriologischer Untersuchungen............... 116

5.2.1.1 Vergleichbarkeit von kultureller Untersuchung und PCR .................. 116

5.2.1.2 Resistenztests................................................................................... 118

5.2.1.3 Typisierung einiger S. aureus-Isolate mittels DNA-Microarray.......... 118

5.2.2 Beurteilung der Effekte der Vakzination ................................................... 120

5.2.2.1 Vorversuch........................................................................................ 121

5.2.2.2 Impfreaktionen .................................................................................. 121

5.2.2.3 S. aureus-Prävalenz.......................................................................... 122


5.2.2.3.2 Entwicklung in den verschiedenen Impfgruppen ........................... 124

5.2.2.3.3 Entwicklung bei den verschiedenen Tierarten ............................... 126

5.2.2.4 Gehalt an somatischen Zellen........................................................... 127

5.2.2.4.1 Ausgangssituation in den Betrieben .............................................. 127


5.2.2.4.3 Entwicklung in den verschiedenen Impfgruppen ........................... 130

5.2.2.4.4 Entwicklung bei den verschiedenen Tierarten ............................... 131

5.2.2.4.5 Entwicklung in Abhängigkeit vom S. aureus-Nachweis ................. 133

5.3 Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick .......... ............................ 134

6 ZUSAMMENFASSUNG .................................... .............................................. 138

7 SUMMARY...................................................................................................... 141

8 LITERATURVERZEICHNIS ............................... ............................................. 143

9 ANHANG............................................. ............................................................ 164

9.1 Angaben zu Tierzahlen und –bewegungen in den Betrie ben................. 164

Inhaltsverzeichnis

9.1.1 Betrieb A .................................................................................................. 164

9.1.2 Betrieb B .................................................................................................. 165

9.2 Tabellen zu S. aureus -Prävalenzen ....................................... ................... 167

9.2.1 Betrieb A .................................................................................................. 167

9.2.1.1 Gesamtbestand................................................................................. 167

9.2.1.2 Impfgruppe s.c. ................................................................................. 168

9.2.1.3 Impfgruppe i.z. .................................................................................. 169

9.2.2 Betrieb B .................................................................................................. 170

9.2.2.1 Gesamtbestand................................................................................. 170

9.2.2.2 Impfgruppe s.c. ................................................................................. 171

9.2.2.3 Impfgruppe i.z. .................................................................................. 172

9.2.2.4 Schafe............................................................................................... 173

9.2.2.5 Ziegen ............................................................................................... 174

9.3 Tabellen zu somatischen Zellgehalten und CMT-Werten ....................... 175

9.3.1 Betrieb A .................................................................................................. 175

9.3.1.1 Gesamtbestand................................................................................. 175

9.3.1.2 Impfgruppe s.c. ................................................................................. 175

9.3.1.3 Impfgruppe i.z. .................................................................................. 176

9.3.1.4 S. aureus-negative Milchproben........................................................ 176

9.3.1.5 S. aureus-positive Milchproben......................................................... 177

9.3.2 Betrieb B .................................................................................................. 177

9.3.2.1 Gesamtbestand................................................................................. 177

9.3.2.2 Impfgruppe s.c. ................................................................................. 178

9.3.2.3 Impfgruppe i.z. .................................................................................. 178

9.3.2.4 Schafe............................................................................................... 179

9.3.2.5 Ziegen ............................................................................................... 179

9.3.2.6 S. aureus-negative Milchproben........................................................ 180

9.3.2.7 S. aureus-positive Milchproben......................................................... 180

DANKE… ............................................................................................................... 181

Abkürzungsverzeichnis


AFLP amplified fragment length polymorhism

(deutsch: Amplifikationsfragment-Längen-

polymorphismus )

agr accessory gene regulator

a.p. ante partum

Bp Basenpaare

°C Grad Celsius

CAE Caprine Arthritis Encephalitis

cfu (deutsch: KBE) colony forming units (deutsch: Kolonie bildende

Einheiten)

CC clonal complex

ClfA Clumping factor A

CMT California Mastitis Test

CNS koagulase-negative Staphylokokken

coa-Gen Koagulase-Gen

CP 5 Kapselpolysaccharid 5

CPS koagulase-positive Staphylokokken

DCC DeLaval Cell Counter™

DEPC Diethyldicarbonat

DNA desoxyribonucleic acid

(deutsch: Desoxyribonukleinsäure)

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

et al. et alii (deutsch: und andere)

Fa. Firma

FICA Freund’s incomplete adjuvant (deutsch:

unvollständiges Freund’sches Adjuvans)

FnBp Fibronektin Bindungsprotein


g Fallbeschleunigung

g Gramm

ggr. geringgradig

hgr. hochgradig

Ig Immunglobulin

IMI Intramammäre Infektion

i.z. intrazisternal

k.d.P. keine diskordanten Paare

L Liter

Lnn. Lymphonodi

mgr. mittelgradig

min Minuten

Mio Millionen

ml Milliliter

MLST multilocus sequence typing (deutsch: multilokuläre

Sequenz-Typisierung)

MLVA multiple-locus VNTR analysis

mM millimol

MRSA Methicillin-resistente Staphylococcus aureus

MSSA Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µM Mikromol

neg. negativ

ng nanogramm

n.s. nicht signifikant

nuc-Gen Thermonuklease-Gen

PCR polymerase chain reaction

(deutsch: Polymerasekettenreaktion)

PFGE pulsed-field gel electrophoresis

(deutsch: Pulsfeld-Gelelektrophorese)


p.p. post partum

p-Wert Irrtumswahrscheinlichkeit

p. vacc. post vaccinationem

pos. positiv

ρ Korrelationskoeffizient

RFLP restriction fragment length polymorphism

(deutsch: Restriktionsfragment-

Längenpolymorphismus)

rRNA ribosomal ribonucleic acid

(deutsch: ribosomale Ribonukleinsäure)

s Sekunden

S. Staphylococcus

SAS Statistical Analysis System

s.c. subkutan

SCC somatic cell count (deutsch: somatischer Zellgehalt)

spp. Subspecies

Taq-Polymerase Thermus aquaticus-Polymerase

TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer (siehe dort)

TRIS Trishydroxymethylaminomethan

TSST-1 toxic shock syndrome toxin 1

tst toxic shock syndrome protein

Tth-Polymerase Thermus thermophilus-Polymerase

UV ultraviolett

V Volt

VNTR variable number of tandem repeats

vs. versus

Abbildungsverzeichnis


Abbildung 3.1: Intrazisternale Applikation der Vakzine.................................................63

Abbildung 3.2: Zeitleiste für die Impfungen und Probenentnahme...............................64

Abbildung 4.1: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in Betrieb A bei

Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h.

durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt

im Bestand befindlichen Tiere.............................................................79

Abbildung 4.2: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe s.c.

des Betriebes A bei Betrachtung ausschließlich der zu allen

Zeitpunkten, d.h. durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum

jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe s.c. angehörenden Tiere..................81

Abbildung 4.3: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe i.z.

des Betriebes A bei Betrachtung ausschließlich der zu allen


jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe i.z. angehörenden Tiere...................82

Abbildung 4.4: Vergleich der S. aureus-Tierprävalenzen der Impfgruppen s.c. und

i.z. des Betriebes A .............................................................................84

Abbildung 4.5: Entwicklung des somatischen Zellgehaltes (links) bzw. des CMT-

Wertes (rechts) der Milch im gesamten Tierbestand des

Betriebes A .........................................................................................84


Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe s.c. des Betriebes A ......86


Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe i.z. des Betriebes A .......87

Abbildung 4.8: Vergleich der somatischen Zellgehalte in der Milch der subkutan

(links) und intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes A .....89


Abbildung 4.9: Vergleich der CMT-Werte der Milch der subkutan (links) und

intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes A ......................89

Abbildung 4.10: Vergleich der somatischen Zellgehalte S. aureus-negativer (links)

und -positiver (rechts) Milchproben des Betriebes A...........................91

Abbildung 4.11: Vergleich der CMT-Werte S. aureus-negativer (links) und -

positiver (rechts) Milchproben des Betriebes A...................................91

Abbildung 4.12: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in Betrieb B bei

Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h.

durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt

im Bestand befindlichen Tiere.............................................................93

Abbildung 4.13: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe s.c.

des Betriebes B bei Betrachtung ausschließlich der zu allen


jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe s.c. angehörenden Tiere..................95

Abbildung 4.14: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe i.z.

des Betriebes B bei Betrachtung ausschließlich der zu allen


jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe i.z. angehörenden Tiere...................96

Abbildung 4.15: Vergleich der S. aureus-Tierprävalenzen der Impfgruppen s.c.

und i.z. des Betriebes B ......................................................................97

Abbildung 4.16: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz im Schafbestand des

Betriebes B bei Betrachtung ausschließlich der zu allen

Zeitpunkten, d.h. durchgängig beprobten Schafe bzw. aller zum

jeweiligen Zeitpunkt im Betrieb befindlichen Schafe ...........................97

Abbildung 4.17: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz im Ziegenbestand des

Betriebes B bei Betrachtung ausschließlich der zu allen

Zeitpunkten, d.h. durchgängig beprobten Ziegen bzw. aller zum

jeweiligen Zeitpunkt im Betrieb befindlichen Ziegen ...........................98


Abbildung 4.18: Vergleich der S. aureus-Tierprävalenzen der Tierarten

(Schaf/Ziege) des Betriebes B ............................................................99


Wertes (rechts) der Milch im gesamten Tierbestand des

Betriebes B .......................................................................................100


Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe s.c. des Betriebes B ....101


Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe i.z. des Betriebes B .....102


(links) und intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes B ...104


intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes B ....................104


Wertes (rechts) der Milch der Schafe des Betriebes B .....................105


Wertes (rechts) der Milch der Ziegen des Betriebes B......................106

Abbildung 4.26: Vergleich der somatischen Zellgehalte der Milch der Schafe

(links) und Ziegen (rechts) des Betriebes B ......................................107

Abbildung 4.27: Vergleich der CMT-Werte der Milch der Schafe (links) und

Ziegen (rechts) des Betriebes B........................................................108


und -positiver (rechts) Milchproben des Betriebes B.........................110

Abbildung 4.29: Vergleich der CMT-Werte S. aureus-negativer (links) und -

positiver (rechts) Milchproben des Betriebes B.................................110

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Virulenzfaktoren von S. aureus nach SELBITZ (2002) .............................25

Tabelle 2.2: Literaturangaben zum physiologischen Zellgehalt von Schafmilch .....36

Tabelle 2.3: Literaturangaben zum physiologischen Zellgehalt von

Ziegenmilch.........................................................................................36

Tabelle 2.4: Zusammenhang von CMT-Score und Leukozytenzahl in

Ziegenmilch (UPADHYAYA u. RAO 1993)..........................................38

Tabelle 3.1: Beurteilung des CMT...........................................................................72

Tabelle 4.1: Vierfeldertafel zum Vergleich der Ergebnisse aus kultureller

Untersuchung und PCR ......................................................................76

Tabelle 4.2: Ergebnisse der bei den aus Milchproben isolierten Staphylokokken

durchgeführten Resistenztests............................................................77

Tabelle 4.3: Ergebnisse der S. aureus-Prävalenzvergleiche der verschiedenen

Beprobungszeitpunkte im Betrieb A auf Tier- bzw.

Euterhälftenbasis (McNemar-Test) .....................................................80

Tabelle 4.4: S. aureus-Prävalenzen der Tiere (T) sowie Euterhälften (EH) der

Impfgruppen des Betriebes A und Ergebnisse der

Prävalenzvergleiche zwischen den Impfgruppen (Chi-Quadrat-

bzw. Fischer’s exact Test)...................................................................83

Tabelle 4.5: Ergebnisse der Zeitpunktvergleiche bzgl. des somatischen

Zellgehaltes der Milch aller Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s

signed rank test) .................................................................................85

Tabelle 4.6: Ergebnisse der Zeitpunktvergleiche bzgl. der CMT-Werte der Milch

aller Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test) ...................85


Zellgehaltes der Milch der subkutan geimpften Tiere des

Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)...........................................87

Tabellenverzeichnis


der subkutan geimpften Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed

rank test) .............................................................................................87


Zellgehaltes der Milch der intrazisternal geimpften Tiere des

Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)...........................................88


der intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s

signed rank test) .................................................................................88

Tabelle 4.11: Mediane der somatischen Zellgehalte x 1000/ml (Zeitpunkt 1 bis 4)

bzw. der CMT-Werte (Zeitpunkt 5 bis 9) S. aureus-positiver und –

negativer Milchproben des Betriebes A sowie Ergebnisse der

entsprechenden Vergleiche zum jeweiligen Zeitpunkt (Wilcoxon’s

two sample test)..................................................................................92


Beprobungszeitpunkte im Betrieb B auf Tier- bzw.

Euterhälftenbasis (McNemar-Test) .....................................................94


Zellgehaltes der Milch der Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s

signed rank test) ...............................................................................100


der Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)...................101


Zellgehaltes der Milch der subkutan geimpften Tiere des

Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test).........................................102


der subkutan geimpften Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed

rank test) ...........................................................................................102

Tabellenverzeichnis


Zellgehaltes der Milch der intrazisternal geimpften Tiere des

Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test).........................................103


der intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s

signed rank test) ...............................................................................103


Zellgehaltes der Milch der Schafe des Betriebes B (Wilcoxon’s

signed rank test) ...............................................................................105


der Schafe des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)................106


Zellgehaltes der Milch der Ziegen des Betriebes B (Wilcoxon’s

signed rank test) ...............................................................................107


der Ziegen des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)................107


bzw. der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch der Schafe und

Ziegen des Betriebes B sowie Ergebnisse der entsprechenden

Vergleiche zum jeweiligen Zeitpunkt (Wilcoxon’s two sample test)...109


bzw. der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) S. aureus-positiver und –

negativer Milchproben des Betriebes B sowie Ergebnisse der

entsprechenden Vergleiche zum jeweiligen Zeitpunkt (Wilcoxon’s

two sample test)................................................................................111

Tabelle 9.1: Anzahl der Tiere im Betrieb A zu den jeweiligen

Beprobungszeitpunkten ....................................................................164

Tabelle 9.2: Anzahl der untersuchten Euterhälften im Betrieb A zu den jeweiligen


Tabellenverzeichnis

Tabelle 9.3: S. aureus-Status und Zeitpunkt des Abgangs von Tieren

(Euterhälften) durch Schlachtung oder Verenden im Betrieb A.........165

Tabelle 9.4: Anzahl der Tiere im Betrieb B zu den jeweiligen


Tabelle 9.5: Anzahl der untersuchten Euterhälften im Betrieb B zu den jeweiligen


Tabelle 9.6: S. aureus-Status und Zeitpunkt des Abgangs von Tieren

(Euterhälften) durch Schlachtung oder Verenden im Betrieb B.........166

Tabelle 9.7: Anzahl und Prozentsatz S. aureus-positiver bzw. -negativer Tiere

sowie Euterhälften des Betriebes A zu den jeweiligen Zeitpunkten

bei Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten

beprobten Tiere.................................................................................167


sowie Euterhälften des Betriebes A zu den verschiedenen

Zeitpunkten bei Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt im

Bestand befindlichen Tiere................................................................167


sowie Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes A zu den

jeweiligen Zeitpunkten bei Betrachtung ausschließlich der zu

allen Zeitpunkten beprobten Tiere ....................................................168


sowie Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes A zu den

verschiedenen Zeitpunkten bei Betrachtung aller zum jeweiligen

Zeitpunkt der Gruppe s.c. angehörenden Tiere ................................168


sowie Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes A zu den



Tabellenverzeichnis


sowie Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes A zu den


Zeitpunkt der Gruppe i.z. angehörenden Tiere .................................169


sowie Euterhälften des Betriebes B zu den jeweiligen Zeitpunkten

bei Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten

beprobten Tiere.................................................................................170


sowie Euterhälften des Betriebes B zu den verschiedenen


Bestand befindlichen Tiere................................................................170


sowie Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes B zu den




sowie Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes B zu den


Zeitpunkt der Gruppe s.c. angehörenden Tiere ................................171


sowie Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes B zu den




sowie Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes B zu den


Zeitpunkt der Gruppe i.z. angehörenden Tiere .................................172

Tabellenverzeichnis

Tabelle 9.19: Anzahl und Prozentsatz S. aureus-positiver bzw. -negativer Schafe

sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den jeweiligen

Zeitpunkten bei Betrachtung ausschließlich der zu allen

Zeitpunkten beprobten Schafe ..........................................................173


sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den verschiedenen


Bestand vorhandenen Schafe...........................................................173

Tabelle 9.21: Anzahl und Prozentsatz S. aureus-positiver bzw. -negativer Ziegen

sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den jeweiligen

Zeitpunkten bei Betrachtung ausschließlich der zu allen

Zeitpunkten beprobten Ziegen ..........................................................174


sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den verschiedenen


Bestand vorhandenen Ziegen ...........................................................174

Tabelle 9.23: Median, oberes und unteres Quartil sowie Maximum und Minimum

der somatischen Zellgehalte x 1000/ml (Zeitpunkt 1 bis 4) bzw.

der CMT-Werte (Zeitpunkt 5 bis 9) der Milch aller Tiere des

Betriebes A .......................................................................................175



der CMT-Werte (Zeitpunkt 5 bis 9) der Milch in der Impfgruppe

s.c. des Betriebes A ..........................................................................175




i.z. des Betriebes A ...........................................................................176

Tabellenverzeichnis



der CMT-Werte (Zeitpunkt 5 bis 9) der S. aureus-negativen

Milchproben des Betriebes A ............................................................176



der CMT-Werte (Zeitpunkt 5 bis 9) der S. aureus-positiven

Milchproben des Betriebes A ............................................................177



der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch aller Tiere des

Betriebes B .......................................................................................177




s.c. des Betriebes B ..........................................................................178




i.z. des Betriebes B ...........................................................................178



der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch der Schafe des

Betriebes B .......................................................................................179



der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch der Ziegen des

Betriebes B .......................................................................................179

Tabellenverzeichnis



der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der S. aureus-negativen

Milchproben des Betriebes B ............................................................180



der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der S. aureus-positiven

Milchproben des Betriebes B ............................................................180

Einleitung

23

1 Einleitung

Staphylococcus aureus ist als einer der wichtigsten Mastitiserreger bei Schafen und

Ziegen zu bezeichnen. Neben subklinischen Mastitiden verursacht er insbesondere

beim kleinen Wiederkäuer auch akute bis perakute (gangränöse) Mastitiden, die

häufig mit dem Tod des Tieres einhergehen (DEUTZ et al. 1995; WINTER u.

BAUMGARTNER 1999; BERGONIER et al. 2003; MØRK et al. 2007). Die

subklinischen Mastitiden besitzen darüber hinaus eine besondere

lebensmittelhygienische Relevanz, da das Ausscheiden von S. aureus bei klinisch

unauffälligem Euterbefund und unverändertem Sekret insbesondere durch Rohmilch

und –produkte zu Lebensmittelinfektionen und –intoxikationen beim Verbraucher

führen kann. Beispielsweise während der Käsereifung können ursprünglich in der

Milch vorhandene S. aureus Enterotoxine produzieren (BACHMANN u. SPAHR

1995). Die Milch kleiner Wiederkäuer ist hier als besonders wichtige „Enterotoxin-

Quelle“ einzustufen, weil die aus Schaf- und Ziegenmilch isolierten S. aureus zu

einem Großteil Toxinproduzenten sind (SCHERRER et al. 2004). Selbst aus

pasteurisierter Ziegenmilch hergestellter Käse kann S. aureus-Enterotoxine enthalten

(AKINEDEN et al. 2008).

Zusätzliche Relevanz erlangt S. aureus durch die so genannten Methicillin-

resistenten S. aureus (MRSA), insbesondere, da der Austausch von Isolaten

zwischen Tieren und Menschen möglich ist (JUHÁSZ-KASZANYITZKY et al. 2007;

GUINANE et al. 2008). Diese MRSA sind zunehmend Erreger nosokomialer

Infektionen, weshalb eine Besiedelung möglichst vermieden werden sollte. Ein

erhöhtes Risiko kann hier neben direkt mit dem Tier in Kontakt stehenden Personen

wie Landwirten, Tierärzten, Melkern oder Schlachthofpersonal auch für

Konsumenten von Rohmilch bestehen (JUHÁSZ-KASZANYITZKY et al. 2007).

Aufgrund des genannten Gefahrenpotentials erscheinen eine effektive Therapie

bestehender S. aureus-Mastitiden, die Verhinderung von Neuinfektionen sowie eine

möglichst sichere Diagnostik sehr wünschenswert. Da sowohl die antibiotische

Therapie während der Laktation (MORONI et al. 2005b) wie auch das Trockenstellen

unter antibiotischem Schutz (NICKERSON 1993b) zumeist unbefriedigende

Einleitung

24

Ergebnisse liefern, wurden bei Milchkühen bereits zahlreiche Versuche

unternommen, S. aureus mit einer Vakzination zu bekämpfen. Im Bereich der kleinen

Wiederkäuer und insbesondere der Ziegen gibt es auf Bestandsebene zu einer

solchen Vakzination allerdings nur wenige Erkenntnisse. Bezüglich der Diagnostik ist

zu erwähnen, dass die nach Standardmethoden durchgeführte kulturelle

Untersuchung eine unbefriedigende Sensitivität aufweist (SEARS et al. 1990;

KRÖMKER et al. 2008), was den Sanierungserfolg durch Nichtauffinden von

S. aureus-Ausscheidern beeinträchtigen kann.

Aus diesen Gründen war das Hauptziel dieser Arbeit, den Einfluss einer

stallspezifischen Vakzine auf das Vorkommen von S. aureus sowie die Gehalte an

somatischen Zellen in Milchziegen- bzw. Milchschafbeständen zu untersuchen und

zu prüfen, ob die stallspezifischen S. aureus-Vakzinen entscheidend zur Sanierung

von Ziegen- und Schafbeständen mit bekannter S. aureus-Problematik beitragen

können.

Ferner sollte mittels einer S. aureus-spezifischen PCR als Bestandteil des

Sanierungskonzeptes versucht werden, die diagnostische Sensitivität gegenüber der

kulturellen Untersuchung von Milchproben zu erhöhen.

Nicht zuletzt sollte geprüft werden, ob verschiedene Applikationswege der Vakzine

zu unterschiedlichen Ergebnissen im Hinblick auf die Eutergesundheit führen.

Literaturübersicht

25

2 Literaturübersicht

2.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus gehört zur Familie der Micrococcaceae. Staphylokokken sind

grampositive, unbewegliche, fakultativ anaerobe Bakterien, die keine Sporen bilden.

Die einzelnen Kokken haben einen Durchmesser von 0,5 bis 1,5 µm und ordnen sich

in charakteristischer Weise in unregelmäßigen, traubenförmigen Haufen an.

In der Kultur bildet S. aureus häufig goldfarbene Kolonien, woraus sich der Name

ableitet. Die Kolonien können jedoch auch ein grauweißes, weißes, gelbes oder

gelboranges Erscheinungsbild haben. S. aureus kann diverse Virulenzfaktoren

ausbilden, welche grob in an die Zelloberfläche gebundene und sezernierte Faktoren

(Enzyme und Toxine) unterteilt werden können. Die wichtigsten sind in Tabelle 2.1

dargestellt. Eine nähere Beschreibung der Rolle dieser Virulenzfaktoren erfolgt in

Kapitel 2.3.

Tabelle 2.1: Virulenzfaktoren von S. aureus nach SELBITZ (2002)

Kapselzellgebundene "Schleimhülle" = Pseudokapsel

Faktoren Protein AFibronektinbindendes Protein (FnBp)Clumping-FaktorKoagulaseHyaluronidase

sezernierte Hämolysine (α, β, γ, δ)Faktoren Enterotoxine

Exfoliative ToxineLeukozidin

S. aureus ist, wie Staphylokokken im Allgemeinen, ein Besiedler von Haut und

Schleimhaut auch bei gesunden Menschen und Tieren. Als Krankheitserreger tritt er

vornehmlich bei lokalen aber auch systemischen eitrigen Prozessen in Erscheinung,

besonders häufig sind aufgrund seiner Lokalisation eitrige Dermatitiden nach

Hautverletzungen zu finden. Auch beim kleinen Wiederkäuer kann diese

Literaturübersicht

26

Staphylokokkendermatitis oft beobachtet werden. Eines der wirtschaftlich betrachtet

bedeutendsten durch S. aureus hervorgerufenen Krankheitsbilder stellt die Mastitis

dar. Dies gilt sowohl für das Rind als auch für kleine Wiederkäuer. Die S. aureus-

Mastitis der Schafe und Ziegen wird in Kapitel 2.4 näher beschrieben.

2.2 Epidemiologie von S. aureus-Mastitiden

Der Erreger kommt zwar ubiquitär und auch auf Haut und Schleimhaut vor, muss

aber für die Infektion, welche in der Regel via Strichkanal stattfindet, zunächst in die

Nähe der Zitzenspitze gelangen. Da S. aureus zu den so genannten „kuhassoziierten

Erregern“ gezählt wird, stellt die infizierte Milchdrüse das wichtigste Erregerreservoir

dar (HOEDEMAKER 2001) und eine Übertragung findet hauptsächlich während der

Melkzeit oder aber, beim kleinen Wiederkäuer, durch so genannte milchräubernde

Lämmer (BERGONIER et al. 2003; CONTRERAS et al. 2007) statt. Letztere saugen

neben ihren eigenen Muttertieren auch an anderen, so dass es im Falle einer

S. aureus-Infektion einer der besaugten Euterhälften zu einer Übertragung auf die

jeweils anderen besaugten Euterhälften kommen kann. Die Übertragung während

des Melkens kann einerseits die Folge kontaminierter Melkzeuge bzw. des

Rückflusses kontaminierter Milch (ANDERSON 1982), andererseits aber auch die

Folge einer Kontamination der Hände des Melkers sein, insbesondere, wenn keine

Handschuhe getragen werden (VAUTOR et al. 2003; FABIANO et al. 2005). Dass es

allerdings auch S. aureus-Stämme gibt, die vorwiegend Eigenschaften so genannter

„Umweltkeime“ aufweisen und dementsprechend mittels zahlreicher weiterer

Vektoren wie z.B. Wasser, Einstreu, Arbeitsgeräte oder Fliegen übertragen werden

können, zeigten unter anderem Untersuchungen von SOMMERHÄUSER et al.

(2003). Diese sind in Kapitel 2.6.2 näher beschrieben. Auch FOURNIER et al. (2008)

fanden bei ihren Untersuchungen in 26 Milchkuhherden nur einen S. aureus-

Genotyp, der Eigenschaften eines „kuhassoziierten Erregers“ zeigte, während

S. aureus-Stämme, die anderen Genotypen angehörten, sich eher wie koagulase-

negative Staphylokokken (CNS) verhielten und offensichtlich mittels verschiedenster

Vektoren übertragen werden konnten.

Literaturübersicht

27

Diverse Untersuchungen z.B. der Exotoxingene bzw. mittels RFLP (restriction

fragment length polymorphism) konnten zeigen, dass sich die S. aureus-Isolate aus

der Milch kleiner Wiederkäuer von denen, die aus Kuhmilch isoliert wurden, und auch

teilweise die Isolate von Schafen und Ziegen untereinander mehr oder weniger

deutlich unterscheiden (SMYTH et al. 2005; VIMERCATI et al. 2006). VAUTOR et al.

(2003) schlossen aus ihren Untersuchungen mittels Pulsfeld-Gelektrophorese

(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) auf eng an das Schafeuter adaptierte

Stämme, während VAN LEEUWEN et al. (2005) mittels amplified fragment length

polymorphism (AFLP) und multilocus sequence typing (MLST) lediglich bei von

Ziegen isolierten S. aureus-Stämmen eine Wirtsspezifität nachweisen konnten.

2.3 Pathogenese von S. aureus-Mastitiden

Nach der Besiedelung der Zitzenspitze durch S. aureus folgt, insbesondere bei

Vorschädigung der Zitze durch z.B. fehlerhafte Melktechnik (ANDERSON 1982), die

Penetration des Zitzenkanals (BERGONIER et al. 2003), die durch Ausbreitung der

Kolonien von der Zitzenspitze aus aktiv erfolgen kann (HOEDEMAKER 2001) und

schließlich die Anheftung der Bakterien an die Epithelzellen der Zitzen- und

Drüsenzisterne (FROST 1975; FROST et al. 1977). Bei dieser Anheftung kann

beispielsweise die Pseudokapsel („Schleim“), die die meisten an Mastitisgeschehen

beteiligten S. aureus-Stämme ausbilden, fördernd wirken (AGUILAR et al. 2001).

Bestimmte Zellwand-Adhäsine scheinen an der Anlagerung beteiligt zu sein, denn

AGUILAR und ITURRALDE (2001) konnten sie außer bei bovinen auch bei sieben

von acht ovinen S. aureus-Mastitis-Isolaten nachweisen. Außerdem kann die

Anlagerung an Epithelzellen nach Schädigung dieser durch von S. aureus

produzierte Toxine erleichtert sein (BASELGA et al. 1994). Nachdem der enge

Kontakt zwischen S. aureus und den Epithelzellen hergestellt ist, können letztere

Pseudopodien-artige Fortsätze ausbilden, die zur Internalisierung der Bakterien

führen (ALMEIDA et al. 1996). Am Eindringen in die Epithelzellen ist auf der Seite

von S. aureus hauptsächlich Fibronektin Bindungsprotein (FnBp) beteiligt, das die

schnelle Ausbreitung von S. aureus im Euter fördert (BROUILLETTE u. MALOUIN

2005; ZECCONI et al. 2005). Nach der Aufnahme in die Epithelzelle kann S. aureus

Literaturübersicht

28

aus dem Endosom ins Cytoplasma „flüchten“, indem die Endosomen-Membran

vermutlich mit Hilfe von Hämolysinen aufgelöst wird. Dies kann zur Apoptose der

nicht-professionellen Phagozyten führen (BAYLES et al. 1998). Im Anschluss an die

Ausbreitung in Zitzen- und Drüsenzisterne steigen die Bakterien in das

Milchkanalsystem auf und bilden tiefe Infektionstaschen im Alveolargewebe, die zu

Abszessen und der Bildung von Narbengewebswällen führen, welche S. aureus im

Gewebe einschließen (NICKERSON 1993a).

Durch S. aureus geschädigtes Drüsengewebe stellt die Milchproduktion ein (ZHAO u.

LACASSE 2008) oder nimmt sie, im Falle einer Infektion während der Lactogenese,

gar nicht erst auf. SORDILLO et al. (1989) fanden in entsprechend geschädigten

Epithelzellen weniger raues endoplasmatisches Retikulum als in gesunden Zellen,

was zu eingeschränkter Sekretion führte. Außerdem werden Milchgänge durch

degenerierte und abgeschilferte Epithelzellen sowie Leukozyten verstopft, so dass es

zur Involution der blockierten Bereiche und zu einem Absinken der Milchleistung

kommt. Zusätzlich kann der blockierte Milchfluss zu einer Akkumulation von Toxinen

und damit zu einer stärkeren Gewebeschädigung führen (NICKERSON u. OWENS

1993). Öffnen sich die verstopften Milchgänge wieder, können andere Bereiche der

Milchdrüse infiziert werden (FROST 1975; NICKERSON u. OWENS 1993).

Die Ausprägung der klinischen Symptome bei einer intramammären Infektion (IMI)

mit S. aureus ist mannigfaltig. Sie reicht von perakuter (gangränöser) Mastitis bis hin

zu subklinischen Formen (ANDERSON 1982). Bei der gangränösen Mastitis sorgen

Toxine wie das α- und β-Toxin (GUINANE et al. 2008), toxic shock syndrome toxin-1

(TSST-1) und auch das Enterotoxin C (MATSUNAGA et al. 1993; TOLLERSRUD et

al. 2000) mit gefäßverengender Wirkung für eine Ischämie mit nachfolgender

Nekrose der tubulären Gewebebezirke, so dass das Euter kalt, zyanotisch und

ödematös wird. Durch Thrombenbildung in großen Venen kommt es zu einem

feuchten Gangrän. Das Sekret ist serumartig bis blutig. Betroffene Tiere zeigen meist

Intoxikationserscheinungen und verlieren bestenfalls das betroffene Viertel bzw. die

betroffene Hälfte, häufig kommt es aber auch zum Tod des Tieres (NEUMEISTER

1984; BEZEK u. HULL 1995; CONTRERAS et al. 2003).

Literaturübersicht

29

Oftmals entwickelt sich eine klinische oder subklinische chronische Infektion mit

S. aureus. Hierbei stellen sich große Bereiche der Milchdrüse unauffällig dar, jedoch

kommt es zu der oben beschriebenen Formierung von (Mikro-) Abszessen

(ANDERSON 1982). Da der Grund für die chronische Infektion die Ineffektivität bei

der Elimination der Bakterien ist, kommt es zu einem verlängerten Einstrom an

neutrophilen Granulozyten (SLADEK et al. 2005). SHOSHANI et al. (2000) stellten

fest, dass die Phagozytose-Kapazität der Granulozyten mit der Zeit abnimmt, was die

Elimination der chronischen Infektion zusätzlich erschwert. S. aureus sorgt mit Hilfe

zahlreicher Virulenzfaktoren dafür, dass die Wirtsabwehr ineffektiv bleibt. So konnten

z.B. Protein A, welches an den Fc-Teil von Antikörpern bindet und diese somit

unschädlich macht (FOSTER u. MCDEVITT 1994) sowie der Clumping Faktor, der

Fibrinogen aus dem Plasma bindet, gehäuft bei chronischen S. aureus-Mastitiden

nachgewiesen werden (MATSUNAGA et al. 1993). Auch die Koagulase führt zu einer

„Verklumpung“ von Plasma durch die konformative Aktivierung von Prothrombin

(PANIZZI et al. 2004).

Die bereits bei der Anlagerung an Epithelzellen erwähnte Pseudokapsel kann

zusätzlich die Opsonisierung durch Antikörper und Komplement verhindern und

somit die Phagozytose inhibieren (KARAKAWA u. YOUNG 1979; WILKINSON et al.

1979). Außerdem kommt es bei S. aureus-Isolaten aus Mastitismilch häufiger als bei

Hautisolaten zu einer so genannten Biofilmbildung, wobei eine Schleimhülle um

mehrere Zellschichten die Wirtsabwehr zusätzlich beeinträchtigt (FOX et al. 2005).

Auch die Kapsel stellt ein Phagozytose-Hindernis dar, obwohl VERBRUGH et al.

(1982) feststellten, dass der Komplementfaktor C3 auch unterhalb der Kapsel an

S. aureus binden kann.

Einen weiteren wichtigen Virulenzfaktor stellen die Leukozidine dar. Hierbei handelt

es sich um Exotoxine, die Granulozyten und Monozyten durch Porenbildung in deren

Membranen töten. Leukozidine konnten bei S. aureus aus Mastitismilch von

Wiederkäuern fast immer nachgewiesen werden, so dass die Vermutung nahe liegt,

dass sie für die Pathogenese der Mastitis essentiell sind (HAVERI et al. 2007).

Allerdings ergaben sich tierartspezifische Unterschiede bezüglich des Leukozidin-

Typs (RAINARD et al. 2003).

Literaturübersicht

30

Die epidermiolytischen exfoliativen Toxine ETA und ETB konnten von HAVERI et al.

(2007) bei keinem der von ihnen untersuchten S. aureus-Isolate aus bovinen

intramammären Infektionen (IMI) nachgewiesen werden, so dass sie für die

Pathogenese der Mastitis möglicherweise zu vernachlässigen sind.

Ob die Form der Mastitis, die sich aus einer intramammären Infektion mit S. aureus

entwickelt, allerdings tatsächlich von den Virulenzfaktoren des jeweiligen S. aureus-

Stammes abhängt, ist noch nicht abschließend geklärt. Verschiedene

Virulenzfaktoren der unterschiedlichen Stämme scheinen das klinische Bild der

Mastitis beeinflussen zu können (JONSSON 1985; ZECCONI et al. 2005). Im

Gegensatz dazu stellten MIDDLETON et al. (2002) mittels PFGE allerdings fest,

dass die gleiche Menge eines identischen S. aureus-Stammes bei einigen Kühen zu

einer klinischen Mastitis führte, während sich bei anderen Tieren gar keine IMI

entwickelte. Hieraus schlossen sie, dass andere Faktoren als der Stamm und somit

auch als das Repertoire an Virulenzfaktoren den jeweiligen Schweregrad der Mastitis

bestimmen.

2.4 S. aureus als Mastitiserreger bei Schafen und Ziegen

Staphylokokken sind die wichtigsten, da am häufigsten isolierten Mastitiserreger bei

Schafen und Ziegen. Anders als beim Rind spielen Streptokokken und gramnegative

Erreger wie Enterobacteriaceae hier nur eine sehr geringe Rolle. Sowohl die CNS als

auch S. aureus sind von großer Bedeutung, allerdings ist S. aureus aufgrund der

meist deutlicheren klinischen Symptomatik hervorzuheben (BERGONIER u.

BERTHELOT 2003; BERGONIER et al. 2003). WHITE und HINCKLEY (1999)

bezeichneten S. aureus aufgrund seiner Pathogenität sogar als den wichtigsten

Mastitiserreger bei Ziegen. Im Gegensatz zu Rindern, wo S. aureus nur gelegentlich

als Erreger einer gangränösen Mastitis auftritt, ist diese Symptomatik bei kleinen

Wiederkäuern häufiger zu beobachten (BEZEK u. HULL 1995). MØRK et al. (2007)

stellten fest, dass 65,3% der klinischen Mastitiden bei Fleischschafen durch

S. aureus hervorgerufen wurden. 8,8% der klinischen Mastitiden verliefen gangränös,

hier wurde zu 72,9% S. aureus isoliert.

Literaturübersicht

31

Auch wenn ARIZNABARRETA et al. (2002) S. aureus nur zu 1,7% in Milchproben

von Schafen mit subklinischen Mastitiden nachweisen konnten und ihn daher

vorwiegend als Erreger klinischer Mastitiden bei Schafen bezeichneten, so hat er

doch auch bei subklinischen Euterentzündungen seine Bedeutung. Beispielsweise

konnten DEUTZ et al. (1995) S. aureus als häufigsten Erreger chronischer

Schafmastitiden (63,8%) isolieren und zusätzlich nachweisen, dass bei einer

Infektion mit S. aureus der Rückgang der Milchleistung durchschnittlich am größten

war. DEINHOFER und PERNTHANER (1993) wiesen S. aureus in immerhin 22,2%

der Milchproben von Schafen mit chronischen Staphylokokken-Mastitiden nach, bei

den restlichen Erregern handelte es sich um CNS.

Bei Ziegen wurde in verschiedenen Studien die Prävalenz von S. aureus als Erreger

subklinischer Mastitiden mit 10,7 bis 35,4% angegeben (KALOGRIDOU-

VASSILIADOU 1991; BOSCOS et al. 1996; HALL u. RYCROFT 2007; MIN et al.

2007). UPADHYAYA und RAO (1993) konnten bei 26,5 % der untersuchten Ziegen

einer Fleischrasse S. aureus aus der Milch isolieren. Im Allgemeinen handelt es sich

bei S. aureus um den bei Ziegen am zweithäufigsten nachgewiesenen Erreger hinter

der Gruppe der CNS (MORONI et al. 2005a), in einzelnen Herden kann er aber auch

den vorwiegend isolierten Keim darstellen (WINTER u. BAUMGARTNER 1999).

Dass einige Autoren lediglich S. aureus-Prävalenzen von 0 bis 8% für Ziegen und 1,4

bis 4% für Milchschafe angeben (BERGONIER et al. 2003; MAURER u. SCHAEREN

2007b) liegt mit großer Wahrscheinlichkeit an der bereits angesprochenen stark

variierenden Herdenprävalenz.

2.5 S. aureus-Mastitis-Diagnostik

2.5.1 Erregernachweis

2.5.1.1 Kulturelle Untersuchung

Das am häufigsten zur S. aureus-Diagnostik eingesetzte Mittel ist die kulturelle

Isolierung der Erreger aus aseptisch entnommenen Milchproben. Der Vorteil dieser

Methode besteht insbesondere darin, dass mit lebenden Bakterien gearbeitet wird,

die auch zur Resistenztestung herangezogen werden können, so dass eine

Literaturübersicht

32

adequate Therapie eingeleitet werden kann (s.u.). Allerdings bietet dieses Verfahren

aufgrund der teils intermittierenden Ausscheidung von S. aureus keine

hundertprozentige diagnostische Sicherheit. Laut SEARS et al. (1990) wird S. aureus

in sogenannten „high or low shedding cycles” mit der Milch von artifiziell infizierten

Kühen ausgeschieden. Für die „low shedders” wurde für die kulturelle Untersuchung

eine Sensitivität von 70±13,5% angegeben, während bei den „high shedders” 100%

verzeichnet wurden. Insgesamt betrug die Sensitivität bei Entnahme und

Untersuchung nur einer Milchprobe 74,5 ± 16,75% und erhöhte sich bei

Untersuchung von 2 bzw. 3 Proben auf 94 bzw. 98%. Bei auf natürlichem Wege mit

S. aureus infizierten Eutervierteln gaben die Autoren eine Sensitivität von 63 bis

100% an.

In einer anderen Studie wurde für die kulturelle Untersuchung einer Milchprobe eine

Sensitivität von 60 bis 87% in Abhängigkeit vom Volumen des Inoculums

beschrieben (BUELOW et al. 1996). Diese Abhängigkeit war insbesondere für die

„low shedders“ deutlich, denn hier stieg die Sensitivität bei Vergrößerung des

Inoculums von 0,01 auf 0,1 ml von 60 bis 79% auf 85 bis 87% an. Von den Autoren

wurde ein 3-Tages-Intervall zur Probennahme empfohlen.

Zur Erhöhung der Sensitivität der kulturellen Untersuchung kann laut VILLANUEVA

et al. (1991) auch das Einfrieren der Milchproben bei -20°C beitragen. Nach 23

Tagen bei dieser Temperatur wurden 1,48-mal mehr S. aureus isoliert als dies aus

derselben Frischmilch der Fall war. Als mögliche Gründe hierfür gaben die Autoren

die Lyse von Phagozyten, welche noch lebensfähige Bakterien enthielten, sowie die

Auflösung von Bakterien-Clustern an. Beides führte zu einer Erhöhung der Kolonie

bildenden Einheiten (KBE). Von der Erhöhung der KBE in mit S. aureus

kontaminierten Milchproben nach dem Einfrieren berichteten auch HUBÁČKOVÁ und

RYŠÁNEK (2007) sowie GODDEN et al. (2002). In letzterer Studie wurde außerdem

festgestellt, dass bei Kühen das Vorgemelk besser zur kulturellen Untersuchung auf

S. aureus geeignet ist als das Nachgemelk.

Eine weitere Möglichkeit, die Sensitivität der kulturellen Untersuchung

heraufzusetzen, bietet nach ZECCONI et al. (1997) die Zentrifugation der Milchprobe

Literaturübersicht

33

bei 2.000 g und die anschließende Kultur des Sediments. Dieses Vorgehen erhöhte

in der o.g. Studie die Anzahl der S. aureus-Nachweise aus Milchproben auf 145,5%.

Die Spezifität der kulturellen Untersuchung in Bezug auf den S. aureus-Nachweis

wird insgesamt deutlich höher eingeschätzt als die Sensitivität. Zu unterscheiden

sind hier die falsch positive Deutung des Ergebnisses der Laboruntersuchung -

nämlich immer dann, wenn eigentlich keine intramammäre Infektion (IMI) vorliegt,

sondern z.B. eine Kontamination oder eine Besiedelung des Strichkanals (ADAMS et

al. 1992; HICKS et al. 1994) – und das falsch positive Laborergebnis selbst.

Letzteres kann z.B. darin begründet sein, dass in den meisten Labors alle koagulase-

positiven Staphylokokken (CPS) als S. aureus angesprochen werden, obwohl

CAPURRO et al. (1999) zeigen konnten, dass es sich nur bei 97% der dort isolierten

CPS tatsächlich um S. aureus handelte. Dieses Ergebnis unterscheidet sich vom

Ergebnis der Studie von DEINHOFER und PERNTHANER (1993), die in Schaf- und

Ziegenmilchproben keine anderen CPS als S. aureus nachweisen konnten.

Zur Erhöhung der Spezifität empfehlen sowohl HICKS et al. (1994) als auch ADAMS

et al. (1992) die Untersuchung von 3 Milchproben, von denen mindestens 2 als

positiv beurteilt werden sollten, um das Euterviertel als mit S. aureus infiziert zu

bezeichnen.

2.5.1.2 PCR

Auf Grund der teilweise suboptimalen Sensitivität der Standard-Methoden wie der

kulturellen Untersuchung wurden in den letzten Jahren zunehmend Anstrengungen

unternommen, um die S. aureus-Diagnostik zu verbessern. Einen viel ver-

sprechenden Ansatz hierfür liefert die Polymerasekettenreaktion (PCR). Bei dieser

Methode werden bestimmte Genfragmente des nachzuweisenden Erregers mittels

so genannter Primer spezifisch vervielfältigt und anschließend mit Hilfe einer

Gelelektrophorese als fluoreszierende Banden unter UV-Licht dargestellt (SAIKI et al.

1988). Dass diese Vorgehensweise für den Nachweis von S. aureus aus Milch

geeignet ist, zeigten KHAN et al. (1998), indem sie mittels Thermonuclease-Gen

(nuc-Gen) spezifischer Primer S. aureus sowohl in der Milch artifiziell infizierter

Schafe als auch in Schafmilch und Wasser, denen S. aureus zugesetzt worden war,

detektieren konnten. Die analytische Spezifität dieses Tests lag bei 100%, die

Literaturübersicht

34

Sensitivität beim Nachweis aus der Milch der künstlich infizierten Schafe bei über

90%. Die Nachweisgrenze bei zu Milch oder Wasser hinzu gegebenen S. aureus lag

bei 1 KBE/ml.

Obwohl KUŹMA et al. (2003) ebenfalls einen nuc-Gen spezifischen Primer für ihre

PCR verwendeten, lag die Sensitivität in ihrer an Kühen mit chronischer S. aureus-

Mastitis durchgeführten Studie lediglich bei 72,4% (bei Einsatz von 1 µl DNA) und die

Nachweisgrenze bei 500 KBE/ml. Die Spezifität hingegen betrug 100%.

Auch YAMAGISHI et al. (2007) arbeiteten mit einem nuc-Gen spezifischen Primer

und verglichen die direkte PCR mit einer PCR nach Anreicherungskultur. Als

Nachweisgrenze bei der direkten PCR gaben sie 106 KBE/ml an, was nach

Anreicherungskultur allerdings auf 100 KBE/ml reduziert werden konnte. In jedem Fall

erwies sich die PCR als sensitiver gegenüber der Bakteriologie, da z.B.

Tankmilchproben in der Bakteriologie negativ, in der PCR hingegen positiv für

S. aureus waren.

Ebenfalls mit einer Anreicherungskultur setzten GILLESPIE und OLIVER (2005) die

Nachweisgrenze für S. aureus bei der von ihnen durchgeführten multiplex real-time

PCR von 103 KBE/ml auf 100 KBE/ml herab. Als möglichen Grund für die verbesserte

Sensitivität nach Anreicherung wurde die Verdünnung von Inhibitoren der Thermus

aquaticus (Taq)-Polymerase genannt. Die DNA wurde aus Mastitismilch von Kühen

isoliert und in der PCR gleichzeitig der Erregernachweis von S. aureus,

Streptococcus uberis und Streptococcus agalactiae geführt. Die Sensitivität betrug

91,7% für S. aureus. Der Erreger konnte sicher von anderen CPS unterschieden

werden.

Neben dem reinen Erregernachweis bietet die PCR weitere diagnostische

Möglichkeiten, wie bei Nutzung entsprechend spezifischer Primer z.B. den Nachweis

von Superantigenen (SMYTH et al. 2005) oder Enterotoxin-Genen (TKÁČIKOVÁ et

al. 2003; SMYTH et al. 2005; CREMONESI et al. 2007). Insbesondere die Detektion

der Enterotoxin-Gene kann aus lebensmittelhygienischer und Verbraucherschutz-

Sicht sehr hilfreich sein, da die Isolierung der entsprechenden Gene nicht nur aus

Milch, sondern auch aus Molkereiprodukten wie z.B. Rohmilchkäse möglich ist.

CREMONESI et al. (2007) gaben für den Nachweis von S. aureus (Koagulase (coa)-

Literaturübersicht

35

und nuc-Gen) und seiner Enterotoxin-Gene eine Detektionsgrenze von 100 KBE/g

Rohmilchkäse aus Kuh- oder Ziegenmilch an.

Abgesehen vom qualitativen S. aureus-Nachweis wurde von einigen Autoren auch

ein quantitativer Nachweis aus künstlich oder natürlich kontaminierter Kuh- und/oder

Ziegenrohmilch bzw. aus Rohmilchkäse mittels PCR durchgeführt (CREMONESI et

al. 2005; HEIN et al. 2005; GRABER et al. 2007; STUDER et al. 2008).

Insgesamt erwies sich die PCR in einigen Punkten als überlegen gegenüber der

Bakteriologie als Standard-Methode in der S. aureus-Diagnostik. Die Autoren

beschrieben sie in der Regel als die schnellere Methode, da sie das Ergebnis meist

innerhalb eines Tages lieferte (KHAN et al. 1998; STUDER et al. 2008). Außerdem

eignete sie sich anders als die Bakteriologie auch zum Nachweis abgetöteter

Bakterien, also z.B. nach einer voran gegangenen Antibiose oder aus

formalinfixierter Milch. Es ist allerdings zu bedenken, dass die Sensitivität der PCR

durch Störfaktoren wie z.B. eine ineffiziente DNA-Extraktion oder eine starke

kompetitive Mikroflora in der Milch herabgesetzt werden kann (KHAN et al. 1998;

CREMONESI et al. 2007). Auch zu viele somatische Zellen und phagozytierte

bakterielle DNA stören die PCR und verursachen in der Gelelektrophorese so

genannte „Schmierbanden“ (KUBOTA et al. 2007). Um Inhibitionen bei der PCR zu

verringern, ersetzten KIM et al. (2001) die störanfällige Taq-Polymerase durch die

robustere Thermus thermophilus (Tth)-Polymerase. Dies erhöhte die Sensitivität für

den S. aureus-Nachweis in der Milch experimentell infizierter Kühe von 65 auf 80%.

Mit einem zusätzlichen DNA-Reinigungsschritt mit Chelex-100 stieg die Sensitivität

sogar auf 100%.

2.5.2 Zytologische Untersuchung von Milchproben

Bevor im Folgenden die Aussagekraft des somatischen Zellgehalts der Milch bzw.

des CMT-Wertes für die S. aureus-Mastitis-Diagnostik erläutert wird, erscheinen

zunächst einige Ausführungen zum physiologischen Zellgehalt von Schaf- und

Ziegenmilch sowie zur Vergleichbarkeit von somatischem Zellgehalt und CMT

notwendig.

Literaturübersicht

36

2.5.2.1 Physiologischer Zellgehalt von Schaf- und Z iegenmilch

Zum physiologischen Zellgehalt von Schaf- und Ziegenmilch gibt es unterschiedliche

- teils sehr widersprüchliche - Angaben. In Tabelle 2.2 und Tabelle 2.3 sind Werte

dargestellt, die die jeweiligen Autoren entweder als Grenzwert für „normale“, also

Milch gesunder Tiere vorschlagen, oder die sie in ihren Untersuchungen an klinisch

und bakteriologisch gesunden Tieren vorgefunden haben.

Tabelle 2.2: Literaturangaben zum physiologischen Zellgehalt von Schafmilch

Autoren Zellgehalt pro ml Milch

BERGONIER u. BERTHELOT (2003) 130-150 x 103

BERGONIER et al. (2003) 200.000 – 1,5 Millionen, meist < 500.000

DEUTZ et al. (1989) 100.000

HAENLEIN (2002) 600-800 x 103

HARIHARAN et al. (2004) 2.285 x 103

FTHENAKIS (1994) <1 Million

MAURER u. SCHAEREN (2007a) < 300 x 103

EITAM u. EITAM (1993) 1.604 x 103

Tabelle 2.3: Literaturangaben zum physiologischen Zellgehalt von Ziegenmilch

Autoren Zellgehalt pro ml Milch

BERGONIER et al. (2003) 520.000 – 1,1 Millionen

BOSCOS et al. (1996) 0,19 – 2,8 Millionen

HALL u. RYCROFT (2007) 428 x 103 ; 75% < 500 x 103; 93% < 1 Million

MIN et al. (2007) 2.259 x 103

MORONI et al. (2005a) 70% < 500 x 103; 83% < 1 Million; 89% < 1,5 Millionen

PAAPE u. CAPUCO (1997) 50-400 x 103

POUTREL et al. (1993) 687 x 103

ZENG u. ESCOBAR (1993) > 1 Million

Anhand dieser kleinen Auswahl unterschiedlicher Werte lässt sich die Schwierigkeit

bei der Erstellung eines validen Grenzwertes bereits erahnen. Daher liegt ein solcher

Grenzwert auf der europäischen Ebene auch bislang nicht vor, während in den USA

Literaturübersicht

37

sowohl für Schafe als auch für Ziegen ein Grenzwert von 1 Million Zellen/ml

Tankmilch gilt (PAAPE et al. 2007). Diesen Wert einzuhalten gestaltet sich

insbesondere für Ziegenhalter aus verschiedenen Gründen schwierig. Zunächst sei

hier die im Ziegeneuter stattfindende apokrine Sekretion genannt, die im Gegensatz

zur merokrinen Sekretion von Rind und Schaf den Anteil zytoplasmatischer Partikel

in der Milch erhöht. Wird der Gehalt an somatischen Zellen nun mit einer nicht DNA-

spezifischen Methode wie beispielsweise dem Coulter Counter bestimmt, werden

diese Partikel mitgezählt und sorgen für ein zu hohes Messergebnis. Da allerdings

einige der zytoplasmatischen Partikel noch Kernfragmente enthalten können, kann

es selbst bei Verfahren, bei denen die DNA spezifisch angefärbt wird, zu leicht

erhöhten Messergebnissen im Vergleich zu Schaf- oder Kuhmilch kommen (PAAPE

u. CAPUCO 1997).

Neben dieser Besonderheit unterliegen sowohl Ziegen als auch – wenn auch in

geringerem Maße – Schafe zahlreichen Faktoren, die einen großen Einfluss auf die

physiologische Zellzahl haben. So gibt z.B. HAENLEIN (2002) an, dass 90% der

Variation des Gehaltes somatischer Zellen in Ziegenmilch nicht durch eine

intramammäre Infektion bedingt sind. PAAPE et al. (2007) nennen als wichtige den

Zellgehalt von Ziegenmilch beeinflussende Faktoren das Management (siehe auch

HARRER 2006), das Laktationsstadium, die Parität und den Caprine Arthritis

Encephalitis (CAE)-Status. Allerdings konnten sie keinen Anstieg der Zellzahl mit

steigender Parität und fortgeschrittenem Laktationsstadium sowie keinen

Rasseeinfluss auf die Zellzahl bei Schafen feststellen. BERGONIER et al. (2003)

beschreiben als weitere Einflussfaktoren auf den Zellgehalt von Ziegenmilch abrupte

Futterumstellungen und Stress, unter anderem auch durch Behandlungen und

Impfungen. Auch das Melkverfahren übt einen Einfluss auf die Zellzahl aus, denn

maschinell gemolkene Ziegen weisen einen höheren Gehalt an somatischen Zellen

auf als von Hand gemolkene (KOSEV et al. 1993a). Im Gegensatz zu diesen

Untersuchungen konnten BOSCOS et al. (1996) bei Anwendung des California

Mastitis Tests (CMT) keine Einflüsse durch Rasse, Parität oder Laktationsstadium

feststellen.

Literaturübersicht

38

2.5.2.2 Vergleichbarkeit von California Mastitis Te st (CMT) und

somatischem Zellgehalt (SCC)

Es wurden zahlreiche Studien zur Vergleichbarkeit von SCC und CMT sowohl mit

Schaf- als auch mit Ziegenmilch durchgeführt.

Für Schafmilch sprachen DEUTZ et al. (1995) sowie MAURER und SCHAEREN

(2007a) von einer guten bzw. sehr guten Übereinstimmung von CMT und

fluoreszenz-optisch-elektronisch ermittelten Zellgehalten. BERGONIER und

BERTHELOT (2003) gaben als Wert für die Übereinstimmung 80% an, wobei

negative und fragliche CMT-Ergebnisse mit Zellgehalten < 25.000/ml, starke und

sehr starke Reaktionen mit solchen von 500.000/ml bis 900.000/ml gleichzusetzen

waren. In den Untersuchungen von MAURER und SCHAEREN (2007a) hingegen

zeigten negative CMT-Reaktionen Gehalte an somatischen Zellen von im Mittel

60.000 Zellen/ml, schwach positive 300.000 bis 900.000 Zellen/ml und stark positive

2 bis 10 Millionen Zellen/ml an.

Auch bei Ziegenmilch wird zumeist von einer guten Übereinstimmung von mit

fluoreszenz-optisch-elektronisch ermittelten Zellgehalten und CMT ausgegangen

(WINTER u. BAUMGARTNER 1999; HARRER 2006). Aus den in Kapitel 2.5.2.1

genannten Gründen ist die Nutzung eines DNA-spezifischen Verfahrens zur

Zellzählung in Ziegenmilch essentiell (HAENLEIN 2002). UPADHYAYA und RAO

(1993) ermittelten für CMT und Leukozytenzahl einen Korrelationskoeffizienten von

ρ = 0,83. Die nachfolgende Tabelle 2.4 zeigt die mikroskopisch ermittelte

Leukozytenzahl und die dazugehörigen CMT-Ergebnisse dieser Untersuchung.

Tabelle 2.4: Zusammenhang von CMT-Score und Leukozytenzahl in Ziegenmilch

(UPADHYAYA u. RAO 1993)

CMT-Score Leukozytenzahl (Millionen/ml)

- 0,07-0,81

+/- 0,09-0,81

+ 0,31-2,13

++ 0,67-3,60

+++ 1,99-9,34

Literaturübersicht

39

2.5.2.3 Entwicklung des Zellgehalts bei Nachweis vo n S. aureus

Der Gehalt der Milch an somatischen Zellen (somatic cell count, SCC) kann

Hinweise auf das Bestehen einer S. aureus-Infektion des Euters geben. Generell

wird bei einer bestehenden Infektion der Milchdrüse mit S. aureus von einem

besonders hohen SCC, auch im Vergleich mit Infektionen anderer Ätiologie,

ausgegangen (KOSEV et al. 1993b; MORONI et al. 2005a). So lag in einer

Untersuchung von 2002 (ARIZNABARRETA et al.) der dekadische Logarithmus des

Gehaltes an somatischen Zellen in mit S. aureus infizierter Schafmilch bei 6,68, in

bakteriologisch negativer hingegen bei 4,86. BERGONIER und BERTHELOT (2003)

gaben einen Wert von 2,3 – 5 Mio Zellen/ml Milch für S. aureus-positive Schafe an.

MAURER und SCHAEREN (2007a) stellten bei einem Nachweis von S. aureus in

Schafmilch auch immer eine starke bis sehr starke Reaktion im Schalmtest fest. In

einer Studie von 1995 (BOSCOS et al.) zeigten 89% der S. aureus-positiven Ziegen

einen SCC von > 2 Mio Zellen/ml und einen CMT-Score von > 2, insgesamt lagen die

Zellgehalte dieser Ziegen in einem Bereich von 1,78 bis 4,58 x 106 Zellen/ml. Bei

Ziegen mit subklinischen Mastitiden fanden HALL und RYCROFT (2007) die

höchsten Zellgehalte, im Mittel 7,5 x 106 Zellen/ml, wenn S. aureus als Erreger

nachgewiesen wurde.

Auf Grund dieser hohen Zellzahlen wurde vorgeschlagen, durch Untersuchung des

SCC bzw. Durchführen eines CMT „infektionsverdächtige“ Tiere herauszufinden

(VESTWEBER 1994; HOEDEMAKER 2001; STEFFL u. PHILIPP 2007). Gleichzeitig

wurde aber auf den starken Polymorphismus von S. aureus hingewiesen, und auf die

Existenz von S. aureus-Stämmen, die nur einen niedrigen SCC im Tier bedingen.

Schon ANDERSON (1982) beschrieb, dass S. aureus-Nachweise aus Kuhmilch nicht

immer mit einem erhöhten SCC einhergehen müssen. Gleiches gaben auch

VESTWEBER u. LEIPOLD (1993) sowie WIDEL (1994) und ZECCONI et al. (2005)

in ihren Arbeiten an. Während DEINHOFER und PERNTHANER (1993) bei

Infektionen mit S. aureus bei Schafen und Ziegen stets eine höhere Zellzahl

vorfanden als bei Infektionen mit CNS, konnten DEUTZ et al. (1995) diesbezüglich

keine signifikanten Unterschiede in der Zellzahl bei Schafen feststellen. EITAM und

EITAM (1993) fanden in ihren Untersuchungen an Schafen sogar, dass Infektionen

Literaturübersicht

40

mit Pseudomonaden und Mikrokokken zu deutlich höheren Zellgehalten führten als

Infektionen mit S. aureus (letztere im Mittel 2.924 x 103 Zellen/ml). Beim Vergleich

der Zellgehalte von Ziegen mit subklinischen Mastitiden unterschiedlicher Ätiologie

durch MIN et al. (2007) erwiesen sich die durch S. aureus hervorgerufenen

Zellzahlen, im Mittel 4.724 x 103 Zellen/ml, als nicht erhöht gegenüber den Zahlen,

die durch andere Erreger hervorgerufen wurden. MAURER und SCHAEREN (2007b)

stellten fest, dass anders als in ihrer Untersuchung an Schafen 16,7% der mit

S. aureus infizierten Ziegen im Schalmtest negativ reagierten. Auch UPADHYAYA

und RAO (1993) fanden negative und fragliche CMT-Ergebnisse bei mit S. aureus

infizierten Ziegen.

Ein hoher Gehalt an somatischen Zellen kann also weder als spezifisch (KHAN et al.

1998) noch als besonders sensitiv im Hinblick auf eine S. aureus-Infektion der

Milchdrüse, insbesondere bei Ziegen, bezeichnet werden.

2.6 Bekämpfung der S. aureus-Mastitis

2.6.1 Antibiotikatherapie

Der Therapieversuch mittels Antibiotika-Gabe ist eine immer noch häufig praktizierte,

jedoch selten zufrieden stellende Maßnahme in der Bekämpfung von S. aureus als

Mastitiserreger. Bevor im Folgenden die Antibiotikatherapie getrennt nach

Behandlung während der Laktation und Behandlung in der Trockenstehphase

abgehandelt wird, sollen hier zunächst einige übergreifende Punkte besprochen

werden.

Die Selbstheilungsraten für Mastitiden betragen, lässt man die Ätiologie außer Acht,

35 bis 67% beim Schaf und 20 bis 60% bei der Ziege, wenn diese trocken gestellt

werden (BERGONIER et al. 2003). Speziell für Infektionen mit S. aureus fanden

allerdings DEUTZ et al. (1995) bei Milchschafen eine wesentlich niedrigere

Selbstheilungsrate von 11,1%, während für Milchkühe ein Wert von 25% angegeben

wird (VESTWEBER 1994; HOEDEMAKER 2001). Diese Selbstheilungsraten gilt es

bei der Bewertung der im Folgenden genannten Heilungsraten für die

unterschiedlichen Formen der Antibiotikatherapie zu berücksichtigen.

Literaturübersicht

41

Ebenfalls Berücksichtigung finden sollten die Vor- und Nachteile der Antibiose; im

Fall einer erfolgreichen Therapie steigt die Nutzungsdauer, sinkt die Infektionsgefahr

für andere Tiere des Bestandes, steigt die Milchqualität und sinkt das Risiko für

Lebensmittelinfektionen und –intoxikationen beim Verbraucher (DEUTZ et al. 1995).

Die Nachteile liegen gerade bei einer verlängerten Therapie, wie sie häufig nötig ist,

in den Kosten, der Wartezeit auf die Milch, möglicher Rückstände in der Milch (trotz

Einhaltung der Wartezeit) und dem erhöhten Infektionsrisiko bei wiederholter

intrazisternaler Applikation von Antibiotika (BARKEMA et al. 2006). Einen weiteren

Nachteil deckten STEFFL und PHILIPP (2007) auf, denn sie fanden heraus, dass

nach einer erfolgreichen Therapie von S. aureus-Mastitiden, hier durch Behandlung

der subklinisch infizierten Tiere mit Pirlimycin und Trockenstellen der Herde mit

Cloxacillin die Prävalenz von klinischen Mastitiden hervorgerufen durch

Streptococcus uberis und Corynebacterium spp. bei Milchkühen stieg. JUHÁSZ-

KASZANYITZKY et al. (2007) vermuteten anhand der Ergebnisse ihrer

Untersuchung sogar eine Beteiligung des antibiotischen Trockenstellens mit

Cloxacillin und Cephalosporinen an dem Nachweis von MRSA in der Milch von

Kühen. Außerdem ist stets zu bedenken, dass sowohl für Schafe als auch für Ziegen

in Deutschland derzeit kein Antibiotika-Präparat zur intrazisternalen

Mastitisbehandlung zugelassen ist.

Insbesondere in ökologisch wirtschaftenden Betrieben stellt die Behandlung mit

Antibiotika ein großes Problem dar, da sich die Wartezeit verdoppelt und Tiere

höchstens dreimal pro Jahr mit so genannten chemisch-synthetischen allopathischen

Tierarzneimitteln oder Antibiotika behandelt werden dürfen, damit die Produkte als

ökologisch erzeugt gelten (ANONYM 2008). Je nach Verband, dem der Betrieb

angeschlossen ist, kann der Einsatz von Antibiotika sogar noch restriktiver

gehandhabt werden als dies nach der EG-Verordnung der Fall ist.

Mögliche Gründe für das Versagen insbesondere der intrazisternalen

Antibiotikatherapie von S. aureus-Mastitis sind ein verzögerter Beginn oder zu frühes

Beenden der Behandlung, das falsche Präparat, Resistenzen, zum Zeitpunkt der

Behandlung metabolisch inaktive Bakterien, Schutz der Bakterien in Leukozyten, zu

wenig Kontakt von Bakterien und Antibiotikum durch schlechte Diffusion bzw. durch

Literaturübersicht

42

Narbengewebe im Euter und eine Inaktivierung des Antibiotikums durch Milch- oder

Serumkomponenten (NICKERSON u. OWENS 1993; VESTWEBER 1994). Was die

Resistenzen betrifft, so fanden SCHRÖDER et al. (2005) heraus, dass nahezu 100%

der aus Kuhmilch isolierten S. aureus empfindlich für eine Behandlung mit Oxacillin,

Cephalothin, Cefacetril, Cefquinom und Neomycin waren. Immerhin 88% der Isolate

erwiesen sich als empfindlich für eine Behandlung mit Penicillin, Ampicillin und

Cefoperazon. Bei ihren Untersuchungen in Brasilien stellten AIRES-DE-SOUSA et al.

(2007) fest, dass 33% der S. aureus-Isolate von Schafen und Ziegen resistent

gegenüber Penicillin und 6,5% der Isolate intermediär gegenüber Erythromycin und

Clindamycin reagierten. Vielen anderen Antibiotika, wie z.B. Oxacillin und

Cephalothin gegenüber waren die Isolate allerdings voll empfindlich. Auch VAUTOR

et al. (2007) untersuchten aus Schafmilch isolierte S. aureus, die sich in 79% der

Fälle als gegenüber allen getesteten Antibiotika empfindlich erwiesen. LOLLAI et al.

(2008) resümierten, dass die Resistenzlage bei Schafen besser wäre als bei Kühen

und der Anteil der resistenten Isolate insgesamt als rückläufig einzustufen wäre.

2.6.1.1 Laktationsantibiose

Die Antibiotikatherapie während der Laktation wird zumeist mittels einer

intrazisternalen Applikation durchgeführt. Die Auswahl der gegen S. aureus

eingesetzten Antibiotika sollte nach einem Resistenztest erfolgen; muss aufgrund

akuter Symptomatik allerdings sofort eine Behandlung begonnen werden, sollten

Cephalosporine verwendet werden (SCHRÖDER et al. 2005). Die Heilungsraten für

eine S. aureus-Mastitis bei Antibiotikatherapie während der Laktation liegen laut

HOEDEMAKER (2001) bei 30 bis 40% (bakteriologische Heilung), und auch

VESTWEBER (1994) nennt einen Wert von < 50% für Milchkühe. In ihrer Studie an

Milchschafen kamen DEUTZ et al. (1995) auf einen Wert von 55,1%. Diese eher

niedrigen Werte dürften durch die bereits o.g. Ursachen für Therapieversagen

begründet sein. Einige Autoren empfehlen als Erfolg versprechendere Variante die

Kombinationstherapie aus intrazisternaler und intramuskulärer Applikation eines

Antibiotikums (NICKERSON u. OWENS 1993) oder die verlängerte intrazisternale

Therapie z.B. mit Pirlimycin (LUBY u. MIDDLETON 2005). In einer Studie verglichen

SANDGREN et al. (2008) die Heilungsraten von subklinischen Mastitiden bei Kühen

Literaturübersicht

43

nach fünftägiger intrazisternaler Behandlung mit Benzyl-Penicillin mit denen nach

ebenso langer intramuskulärer Verabreichung von Penethamat-Hydrojodid. Es gab

keinen signifikanten Unterschied, wenngleich die systemische Therapie leichte

Vorteile brachte. Insgesamt erwies sich die Heilungsrate bei Infektionen mit

S. aureus als wesentlich geringer im Vergleich zu Infektionen mit Streptococcus

dysgalactiae und Streptococcus uberis. Es wurden keine positiven Langzeiteffekte

der Laktationsantibiose auf die Milchproduktion, das Überleben und Neuinfektionen

der behandelten Tiere festgestellt.

SOL et al. (1997; 2000) untersuchten an Milchkühen Faktoren mit einem Einfluss auf

die Heilungsrate sowohl klinischer als auch subklinischer S. aureus-Mastitiden bei

Laktationsantibiose. Eine sehr hohe Zellzahl vor Behandlungsbeginn, das

Betroffensein der Hinterviertel, Infektionen in der frühen bis mittleren Laktation, mehr

als zwei Kalbungen, mehrfacher Nachweis von S. aureus vor Behandlungsbeginn

sowie der Nachweis resistenter Stämme verschlechterten die Heilungschancen

deutlich. Es gab keinen Zusammenhang zwischen dem Grad der klinischen

Symptome und der Heilungsrate. Anhand der oben genannten Faktoren könnte die

Abgrenzung behandlungswürdiger Tiere von solchen, die der Schlachtung zugeführt

werden sollten, erleichtert werden. BARKEMA et al. (2006) und HOEDEMAKER

(2001) kamen in Bezug auf Milchkühe allerdings zu dem Schluss, dass eine

Behandlung bei subklinisch mit S. aureus infizierten Tieren während der Laktation

wirtschaftlich nicht zu vertreten sei. Auch MORONI et al. (2005b) bezeichneten eine

antibiotische Behandlung während der Laktation von chronisch mit S. aureus

infizierten Ziegen als nicht sinnvoll.

2.6.1.2 Trockenstellen unter antibiotischem Schutz

Mittels Trockenstellen unter antibiotischem Schutz lassen sich bei Milchkühen mit

S. aureus-Mastitis Heilungsraten von 50% bis 80% (NICKERSON 1993b;

VESTWEBER 1994; HOEDEMAKER 2001) erreichen.

SHPIGEL et al. (2006) verglichen den Therapieerfolg von intrazisternaler und

intramuskulärer Behandlung beim Trockenstellen in einer Milchkuhherde mit 40%iger

S. aureus-Prävalenz. Während die Heilungsrate nach intramuskulärer Applikation

von Cefquinom bei 28% lag, was nahezu der Spontanheilungsrate entspricht, konnte

Literaturübersicht

44

mittels intrazisternaler Applikation von Nafcillin, Benzylpenicillin und

Dihydrostreptomycin als Kombinationspräparat die Heilungsrate auf bis zu 80%

gesteigert und die Neuinfektionsrate im Vergleich zur systemischen Behandlung

deutlich gesenkt werden. Dennoch konnte die Herde nicht vollständig von S. aureus

befreit werden.

NICKERSON und OWENS (1993) sehen zwar, ebenso wie SEARS und MCCARTHY

(2003), leichte Vorteile bei der Antibiotikatherapie beim Trockenstellen gegenüber

der Laktationstherapie, weisen aber auch darauf hin, dass nicht alle chronischen

S. aureus-Mastitiden eliminiert werden können, kein Schutz vor Neuinfektionen

besteht, die Empfänglichkeit für Umwelterreger in therapierten Eutervierteln steigt

und die Rückstandsproblematik zu bedenken sei. Wenn eine Behandlung erfolgt,

sollten alle Kühe eines Bestandes behandelt werden.

In Frankreich wurden 2003 (BERGONIER et al.) 84,3% der Ziegenherden mit

antibiotischen Trockenstellern behandelt. Im Gegensatz zu Kühen wird beim kleinen

Wiederkäuer empfohlen, Tiere selektiv, z.B. nach der Durchführung eines CMTs, zu

behandeln. Insbesondere bei Ziegen sollte die Rückstandsproblematik bei der

Anwendung von Antibiotika zum Trockenstellen Beachtung finden, da die

Trockenstehphase hier häufig kürzer ausfällt (BERGONIER et al. 2003). Zum Teil ist

die Applikation von Antibiotika zum Trockenstellen bei Ziegen auch gar nicht möglich,

da auf eine Trockenstehphase verzichtet wird und die Ziegen durchgehend gemolken

werden.

2.6.2 Maßnahmen im Herdenmanagement

Zur Sanierung einer mit S. aureus infizierten Milchkuhherde wurden zusätzlich zu

therapeutischen Maßnahmen oder auch als alleiniges Kontrollprogramm viele

Möglichkeiten aufgezeigt, das Herdenmanagement zu verbessern und so die

Infektionskette zu unterbrechen. Da S. aureus in der Regel als „kuhassoziierter“

Erreger gehandelt wird, liegt das Hauptaugenmerk dieser Verbesserungen auf den

Melkzeiten, denn diese stellen die Hauptübertragungszeiten dar. Hier ist sowohl auf

eine einwandfreie Melktechnik als auch insbesondere auf eine gute Melkhygiene zu

achten (HOEDEMAKER 2001; BARKEMA et al. 2006). Die Melkhygiene beinhaltet

das Vormelken, die Zitzenreinigung mit Einmaltüchern, das Zitzendippen (mit einem

Literaturübersicht

45

Präparat, das eine desinfizierende und eine pflegende Komponente enthält) nach

dem Melken und nicht zuletzt die Arbeit des Melkers mit behandschuhten Händen.

Diese Maßnahmen sind nötig, um die Verschleppung bzw. Übertragung von

S. aureus über die Zitzenhaut oder die Hände des Melkers zu verhindern oder

zumindest einzugrenzen. Bezüglich des Dippmittels ist zu bedenken, dass

konventionelle Präparate bei ökologischer Milchwirtschaft nicht eingesetzt werden

dürfen (CONTRERAS et al. 2007).

Auch beim kleinen Wiederkäuer stellen Tiere mit subklinischen bzw. chronischen

Mastitiden oder auch Dermatitiden die Hauptinfektionsquelle dar, so dass auch hier

die Übertragung v.a. während des Melkens stattfindet. Als weiterer wichtiger Vektor

sind allerdings die milchräubernden Lämmer zu nennen (BERGONIER et al. 2003;

CONTRERAS et al. 2007).

Einige Autoren raten über die Melkhygiene hinaus zur Einhaltung einer konstanten

Melkreihenfolge, bei der junge und bekannt gesunde Tiere zuerst, infizierte stets

zuletzt gemolken werden (BERGONIER et al. 2003; ZECCONI 2006). Als Steigerung

dieser Maßnahme bei hoher Prävalenz bietet sich die Bildung von S. aureus-

positiven und negativen Gruppen an. Allerdings stellten MIDDLETON et al. (2001)

fest, dass die Trennung von Kühen während des Melkens in Gruppen

Neuansteckungen nicht verhindern konnte. Auch NICKERSON und OWENS (1993)

waren der Meinung, die Gruppenbildung habe keinen positiven Einfluss auf die

S. aureus-Prävalenz.

Das Merzen chronisch infizierter Tiere wird meist als die effektivste Maßnahme in der

S. aureus-Bekämpfung betrachtet (NICKERSON u. OWENS 1993; BARKEMA et al.

2006). Um die Übertragung während des Melkens durch ein Ausscheider-Tier zu

minimieren, kann auch das betroffene Viertel bzw. die betroffene Hälfte des Euters

trocken gestellt werden.

Mit Hilfe eines Kontrollprogramms versuchten SOMMERHÄUSER et al. (2003)

sieben Milchkuhherden in Bezug auf S. aureus-Mastitis zu sanieren. Das Programm

umfasste Vormelken, Euterreinigung mit Einmalpapiertüchern, Zitzendippen, gute

Melktechnik, Merzen von Tieren mit einem dauerhaften Gehalt an somatischen

Zellen >100.000/ml Milch bzw. mit S. aureus-positivem kulturellem Befund der Milch

Literaturübersicht

46

und die Remontierung ausschließlich aus dem eigenen Bestand. In den meisten

Herden sanken die Inzidenz und Prävalenz von S. aureus-Mastitiden, während das

Vorkommen von Umweltkeimen als Mastitiserreger zunahm. In drei Herden zeigte

sich bei der Typisierung der S. aureus-Isolate, dass diese die typischen Merkmale

eines „kuhassoziierten“ Erregers aufwiesen (einzelner Stamm mit großer

Ausbreitung) und durch das Kontrollprogramm zu reduzieren waren. In drei anderen

Herden kamen viele verschiedene, wenig verbreitete Stämme vor, die sich somit

mehr wie „Umweltkeime“ verhielten und durch die eingeleiteten Maßnahmen nicht

immer zu kontrollieren waren. Auch MIDDLETON et al. (2001) postulierten, dass die

verschiedenen S. aureus-Stämme bedingt durch eine variierende Kontagiosität eine

unterschiedliche „Resistenz“ gegenüber Kontrollmaßnahmen aufwiesen.

ZECCONI (2006) entwickelte ebenfalls ein Kontrollprogramm, welches sich für

Milchkuhherden mit einer S. aureus-Prävalenz von 10 bis 20% eignet. Innerhalb von

18 Monaten konnte die Prävalenz auf unter 1% gesenkt werden. Bestandteil des

Programms waren im Wesentlichen die oben genannten Verbesserungen der

Melkhygiene sowie die Gruppenbildung und ein spezielles Probennahmeschema.

Zusätzlich sollte auf eine gute Hygiene insbesondere der Einstreu und auch des

restlichen Stalls geachtet werden, da insbesondere bei einer hohen S. aureus-

Prävalenz auch die Einstreu, Arbeitsgeräte, Wasser, Futter, Insekten und sogar die

Luft als Vektor in Frage kommen (HOEDEMAKER 2001; BERGONIER et al. 2003).

NAGAHATA et al. (2007) erzielten mit verbesserter Melkhygiene und antibiotischem

Trockenstellen in einer Milchkuhherde mit einer S. aureus-Prävalenz von 41,2% eine

Reduktion der somatischen Zellgehalte sowie eine Erregerelimination nach 18

Monaten. In einer erneuten Beprobung nach 33 Monaten konnte allerdings bei 2%

der Tiere wieder S. aureus in den Milchproben nachgewiesen werden.

2.6.3 Vakzination

In vielen Ländern werden mittlerweile Vakzinen gegen Mastitiden und insbesondere

auch gegen S. aureus-Mastitiden sowohl bei Rindern als auch bei kleinen

Wiederkäuern eingesetzt (BERGONIER et al. 2003). Ziel der Vakzination sollte die

Förderung der Selbstheilung bereits bestehender, v.a. subklinischer Mastitiden sowie

die Verhinderung von Neuinfektionen sein (HOEDEMAKER et al. 2001).

Literaturübersicht

47

NORDHAUG et al. (1994a) erhofften sich von der idealen Vakzine das Verhindern

des Angehens einer Infektion sowie der Entwicklung einer Entzündung. Ebenfalls als

wünschenswert betrachteten sie aber die Herabsetzung des Schweregrades der

klinischen Symptome der Mastitiden sowie eine schnellere Bakterienclearance.

Konkreter wurden O’BRIEN et al. (2001), denn sie nannten als Ziel der Impfung die

Erhöhung der Effektivität der neutrophilen Granulozyten bei der Phagozytose von

S. aureus durch eine erhöhte Konzentration opsonisierender Antikörper in der Milch.

LEE (1996) ergänzte, dass die induzierten Antikörper Toxine neutralisieren sollten.

Da die natürliche Infektion keinen ausreichenden Schutz vor einer neuerlichen

Infektion bietet, sollten die bakteriellen Antigene in der Vakzine durch z.B. ein

geeignetes Adjuvans oder ein spezielles Impfregime unterstützt werden, um die

Immunantwort zu verbessern (TALBOT u. LACASSE 2005). Des Weiteren sollte die

Vakzine keine unerwünschten Nebenwirkungen wie Gewebeschäden des

sekretorischen Gewebes oder einen Milchleistungsrückgang auslösen (SUTRA u.

POUTREL 1994).

Als wichtigster wirtschaftlicher Vorteil der Vakzine gegenüber der Behandlung mit

Antiinfektiva ist die in der Regel wesentlich kürzere Wartezeit für die Milch zu sehen

(WIDEL 1994), die insbesondere auch ökologisch wirtschaftenden Betrieben

entgegen kommt, welche stets die doppelte Wartezeit einzuhalten haben (ANONYM

2008).

Um die gesteckten Ziele zu erreichen wurden bereits zahlreiche verschiedene

Vakzinen in etlichen Studien erprobt. Der Großteil dieser Versuche wurde allerdings

am Rind durchgeführt. Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über die bereits

abgelaufenen Untersuchungen gegeben werden.

2.6.3.1 Zusammensetzung von S. aureus-spezifischen Vakzinen

2.6.3.1.1 Antigene

2.6.3.1.1.1 Lebende Bakterien

Bezüglich der Antigene ist zunächst die Unterscheidung von Lebend- und Totvakzine

wichtig. Der Großteil der in den Studien verwendeten Impfstoffe ist den Tot- bzw.

Literaturübersicht

48

Inaktivatvakzinen zuzuordnen, jedoch kamen in einigen Untersuchungen auch nicht

abgetötete S. aureus zum Einsatz. WATSON (1984) erprobte eine subkutan zu

verabreichende Lebendvakzine an tragenden Färsen. Die Bakterien waren zuvor

mittels mehrmaliger Subkultivierung (bis zum Verlust der hämolytischen Aktivität)

attenuiert worden. Zwar entwickelten sich Abszesse an der Applikationsstelle, aber

sie bot zwei bis drei Wochen post partum (p.p.) guten Schutz vor einer

experimentellen Infektion via Strichkanal mit 102 S. aureus.

PELLEGRINO et al. (2008) impften hochtragende Färsen mit einer avirulenten

Mutante von S. aureus, die von BOGNI et al. (1998) beschrieben worden war. Nach

der experimentellen Infektion 10 Tage p.p. mit dem homologen virulenten Stamm

entwickelte nur die Hälfte der geimpften Tiere eine Mastitis, jedoch alle Kontrolltiere.

Des Weiteren blieb die Zellzahl bei den vakzinierten Tieren niedriger, die

Milchleistung lag um 20% höher und die spezifische Antikörperkonzentration (IgG)

zeigte sich sowohl im Serum als auch in der Milch deutlich höher als bei den

Kontrolltieren.

In einigen an Schafen durchgeführten Untersuchungen wurden die Wirkungen einer

Tot- und einer Lebendvakzine unmittelbar miteinander verglichen. Diese zeigten,

dass mit einer Lebendvakzine geimpfte Tiere nach einer experimentellen Infektion

stets eine geringere Ausprägung der klinischen Symptome sowie eine erhöhte

Milchleistung gegenüber den mit einer Totvakzine geimpften Tieren aufwiesen. Zwar

zeigten Tiere nach Impfung mit der Inaktivatvakzine, sofern ein Adjuvans verwendet

worden war, höhere Serum-Antikörpertiter, jedoch brachte die Lebendvakzine eine

verbesserte Zellantwort mit spezifischen Antikörpern mit sich. Diese verbesserte

Zellantwort zeigte sich in einer höheren Konzentration an Leukozyten (v.a.

Lymphozyten) in der efferenten Lymphe des Ln. popliteus von Schafen, denen zuvor

eine S. aureus-spezifische Lebend- bzw. Inaktivatvakzine im Bereich der

Hintergliedmaße subkutan appliziert worden war (KENNEDY et al. 1981). Alle

Untersucher betrachteten die Antikörper-Antwort in der Milch als vernachlässigbar.

Diese Ergebnisse zeigten sich auch nach experimenteller Infektion mit einem

heterologen Stamm (WATSON u. LEE 1978; KENNEDY et al. 1981; WATSON u.

KENNEDY 1981).

Literaturübersicht

49

2.6.3.1.1.2 Abgetötete (inaktivierte) Bakterien

Der Großteil der in den Untersuchungen verwendeten Vakzinen enthielt abgetötete

Bakterien, jedoch häufig zusätzliche Bestandteile wie z.B. Toxoide oder

Exopolysaccharide (siehe Kapitel 2.6.3.1.1.3 und 2.6.3.1.1.4). An dieser Stelle sollen

zunächst nur Studien erwähnt werden, in denen mit Vakzinen gearbeitet wurde, die

neben diesen abgetöteten Bakterien ausschließlich Adjuvantien enthielten.

In einem Impfversuch mit hochtragenden Schafen verwendeten HADIMLI et al.

(2005) eine polyvalente Vakzine, die neben abgetöteten S. aureus auch abgetötete

S. epidermidis, S. simulans und S. saprophyticus sowie Aluminiumhydroxid als

Adjuvans enthielt. Diese bewirkte einen Anstieg von spezifischen IgG-Antikörpern

sowohl im Blut- als auch im Milchserum und eine verminderte Rate an S. aureus-

Mastitiden nach der Lammung bei den Impflingen verglichen mit den Kontrolltieren.

LUBY et al. (2007) erprobten den in den USA kommerziell erhältlichen Impfstoff

Lysigin® (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc., St.Joseph, MO, USA) an tragenden

Färsen. Dieser Impfstoff enthält S. aureus-Stämme der Kapsel-Serotypen 5, 8 und

336. Nach experimenteller Infektion der Tiere mit einem heterologen Stamm an Tag

6, 7 und 8 der Laktation schieden abgesehen von einem Impfling alle den Stamm bis

zum Ende der Studie aus, obwohl spezifische IgG-Antikörper sowohl in der Milch als

auch im Blutserum deutlich angestiegen waren.

Mit einer Vakzine („Mastivac I“) bestehend aus drei inaktivierten Feldisolaten von

S. aureus und unvollständigem Freund’schen Adjuvans (FICA) impften LEITNER et

al. (2003a) Kühe und unterzogen sie anschließend einer experimentellen Infektion

mit einem der in der Vakzine enthaltenen S. aureus-Stämme. Hier zeigten sich in der

Gruppe der Impflinge signifikant weniger S. aureus-Ausscheider als in der

Kontrollgruppe.

2.6.3.1.1.2.1 Stallspezifische Vakzinen

In Ermangelung eines zugelassenen Impfstoffes gegen S. aureus-Mastitiden werden

in Milchviehbeständen in Deutschland häufig stallspezifische Vakzinen eingesetzt.

Diese enthalten im betreffenden Betrieb isolierte Bakterien in inaktivierter Form und

kamen auch in zwei Studien von 2001 zum Einsatz. HOEDEMAKER et al. (2001)

Literaturübersicht

50

setzten eine stallspezifische Vakzine in einer Milchviehherde mit einer S. aureus-

Prävalenz von 20-30% ein. Nach der Einführung der Vakzine stieg die S. aureus-

Prävalenz sowohl in der Behandlungs- als auch in der Kontrollgruppe zunächst an

und es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Zellzahlen

zwischen den Gruppen. Der Serumtiter spezifischer Antikörper stieg nach der 2.

Impfung nicht weiter an. Die stallspezifische Vakzine brachte in diesem Fall,

eventuell bedingt durch den variierenden Immunstatus in der Herde vor der Impfung,

also nicht den gewünschten Erfolg.

TENHAGEN et al. (2001) impften Färsen mit einer Vakzine, die neben zwei

stallspezifischen S. aureus-Stämmen Aluminiumhydroxid als Adjuvans enthielt. Nach

dem Kalben zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich der S. aureus-

Prävalenz sowie der Ausprägung der klinischen Symptome im Fall einer S. aureus-

Mastitis zwischen der Behandlungs- und der Kontrollgruppe. Lediglich die Zellzahlen

tendierten bei den Impflingen zu geringeren Werten.

2.6.3.1.1.3 Toxoide

In zahlreichen Studien wurden für die Vakzine neben abgetöteten Bakterien auch

inaktivierte Toxine als Antigene genutzt. So enthielt die von NICKERSON et al.

(1993) bei Rindern genutzte Vakzine abgetötete S. aureus des Stamms JG80,

Toxoide sowie Dextransulfat und FICA als Adjuvantien. Bereits DERBYSHIRE und

SMITH (1969) benutzten für die Immunisierung von Ziegen sowohl abgetötete

S. aureus als auch Toxoid. Auch in den Untersuchungen von NORDHAUG et al.

(1994a), MCDOWELL und WATSON (1974), TOLLERSRUD et al. (2002), WATSON

(1992b), WATSON et al. (1996) sowie WATSON und DAVIES (1993) wurde mit

Vakzinen gearbeitet, die unter anderem Toxoide als antigenen Bestandteil enthielten.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen hauptsächlich insbesondere weniger

klinische S. aureus-Mastitiden sowohl nach künstlicher Infektion (MCDOWELL u.

WATSON 1974; NICKERSON et al. 1993) wie auch in Feldversuchen (NORDHAUG

et al. 1994a; WATSON et al. 1996) im Vergleich zu den Kontrolltieren. Außerdem

wurden meist höhere Milchleistungen und geringere somatische Zellgehalte bei

geimpften Tieren festgestellt.

Literaturübersicht

51

2.6.3.1.1.4 Kapsel und Pseudokapsel

Da S. aureus in der Regel von einer Kapsel und bei Beteiligung an einem

Mastitisgeschehen häufig auch von einer Pseudokapsel bestehend aus

Exopolysacchariden („Schleim“) umgeben ist (s.o.), wurden in einigen Vakzinen

diese Exopolysaccharide als Antigene integriert. Beispielsweise war dies bei den von

GIRAUDO et al. (1997) und TOLLERSRUD et al. (2002) in ihren Untersuchungen an

Milchrindern bzw. Schafen verwendeten Vakzinen der Fall. Für ihre Untersuchungen

an Schafen verwendeten AMORENA et al. (1994) neben inaktivierten S. aureus, S.

simulans und Toxoid in Liposomen inkorporierte Exopolysaccharide. Nachdem die

Schafe vor der Lammung zweimal geimpft und 4 Wochen post partum (p.p.) mit

S. aureus bzw. S. simulans experimentell infiziert worden waren, traten signifikant

weniger häufig Mastitiden auf und die spezifischen Serum-Antikörpertiter waren

deutlich höher als bei Tieren, die eine Vakzine ohne Exopolysaccharide in

Liposomen erhalten hatten. Vor der Infektion mit S. aureus bot nur die Vakzine mit

den oben genannten Bestandteilen Schutz.

Eine weitere Möglichkeit, die Vakzine mit diesen Antigenen zu versorgen, ist die

Kultivierung von S. aureus unter „in vivo“-Bedingungen. Hierbei wird der Kultur Milch

zugesetzt, was die Bildung der charakteristischen Pseudokapsel auslöst, welche bei

Kultivierung unter Standard-Laborbedingungen ausbleibt (WATSON u. KENNEDY

1981; WATSON u. WATSON 1989).

2.6.3.1.1.5 Clumping Faktor A (ClfA)

Eine Vakzine, die Antikörper gegen ClfA induziert, soll die Anlagerung von S. aureus

an Epithelzellen der Zisternenschleimhaut reduzieren und die Phagozytose von

freien S. aureus steigern. Bei der ersten Erprobung einer DNA-Vakzine gegen ClfA

an Mäusen wurden zwar Antikörper induziert, die bei der Clearance von S. aureus

hilfreich waren, jedoch boten sie keinen Schutz vor einer künstlichen

intraperitonealen Infektion mit S. aureus (BROUILLETTE et al. 2002).

Später wurde diese DNA-Vakzine, gefolgt von einem Protein-Booster, auch bei

Färsen eingesetzt. Erst nach der Boosterung stiegen die ClfA-spezifischen

Antikörper in der Milch deutlich an, wobei der Anstieg der IgA-Konzentration nur kurz

Literaturübersicht

52

ausfiel. Geimpfte Färsen zeigten nach einer experimentellen Infektion weniger

Bakterien in der Milch und weniger schwere klinische Symptomatik, aber keinen

Unterschied im Gehalt an somatischen Zellen gegenüber der Kontrollgruppe

(SHKRETA et al. 2004). EL-DIN et al. (2006) verwendeten neben der DNA-Vakzine

diverse genetische Adjuvantien um die Immunantwort zu verstärken.

2.6.3.1.1.6 Protein A

Da es sich bei Protein A um einen der wichtigsten Virulenzfaktoren von S. aureus

handelt, wurde schon früh versucht, dieses als Antigen in Vakzinen einzusetzen.

Schon 1985 wurde die Wirkung einer Protein A-Vakzine mit der von Somato-Staph™

(Vorläufer des bereits erwähnten Lysigin®) bei Kühen in der ersten Laktation

verglichen. Die Belastbarkeit der Immunität wurde überprüft, indem die Zitzen der

Kühe für die Dauer eines Jahres einmal täglich an fünf Tagen pro Woche in eine

S. aureus-Suspension getaucht wurden. Zwar war die Inzidenz intramammärer

Infektionen in allen Gruppen ähnlich, jedoch stieg die spontane Heilungsrate von

47% in der Kontrollgruppe auf 73% bei den mit Somato-Staph™ geimpften Tieren

und auf sogar 83% in der Protein A-Gruppe. Außerdem sank der Gehalt an

somatischen Zellen in den Impfgruppen (NICKERSON et al. 1985; PANKEY et al.

1985).

RYŠÁNEK et al. (1988) verwendeten in ihrer Untersuchung an Kühen eine Vakzine,

die abgetötete S. aureus, Toxoide von α- und β-Toxinen, Protein A und

Aluminiumhydroxid als Adjuvans enthielt. Nach experimenteller Infektion mit einem

heterologen Stamm konnte zwar kein S. aureus in der Milch nachgewiesen werden,

aber es entwickelten sich bei 19 Tieren klinische Mastitiden (gegenüber 26 in der

Kontrollgruppe).

2.6.3.1.1.7 Weitere Antigene

O’BRIEN et al. (2001) verwendeten für ihre Untersuchungen an Kühen keine ganzen

inaktivierten S. aureus sondern ein Lysat der Bakterien, welches zur Verlängerung

der Immunantwort in Mikropartikel eingeschlossen wurde. So wurde ein längerer

Antigen-Kontakt bei einmaliger Applikation gewährleistet, was zu einer gesteigerten

Phagozytose über einen längeren Zeitraum führte.

Literaturübersicht

53

Ebenfalls eine Verlängerung der Immunantwort erreichten TOLLERSRUD et al.

(2001) bei Färsen mit einer Vakzine, die ein Konjugat aus Kapselpolysaccharid 5

(CP 5) und humanem Serumalbumin enthielt. Die Antikörperantwort im Serum erwies

sich als vergleichbar stark und ebenso langanhaltend wie die auf eine Impfung mit

ganzen abgetöteten Bakterien und Mineralöl als Adjuvans.

Da nur eine begrenzte Anzahl verschiedener S. aureus-Stämme und damit

verschiedener Antigene in einer Vakzine verwendet werden kann, aber nicht immer

eine Kreuzreaktivität gegeben ist, entwickelten PEREZ-CASAL et al. (2006) Protein-

Chimären, die in Mäusen eine starke humorale und zelluläre Antwort hervorriefen.

CHANG et al. (2008) erprobten an Kühen den in Korea erhältlichen Impfstoff

MastaVac™, der rekombinante, Enterotoxin C produzierende S. aureus-Mutanten

enthält. Nach der intrazisternalen Verabreichung von drei - subklinische Mastitiden

verursachenden - S. aureus-Stämmen an die geimpften Tiere schied keines dieser

Tiere S. aureus aus, wohl aber 75% der Kontrolltiere. Auch der Gehalt an

somatischen Zellen blieb bei den Impflingen auf einem niedrigen Level.

2.6.3.1.2 Adjuvantien

Adjuvantien haben unterschiedliche Funktionen, z.B. die Induktion einer lokalen

Entzündung, die Schaffung eines „Antigendepots“, Gewebezerstörung und damit

eine Alarmierung der Immunzellen sowie die Stimulation von Antigen-

präsentierenden Zellen. Je nach Adjuvans kann somit die Immunantwort moduliert

werden. TOLLERSRUD et al. (2002) verglichen die Antikörper-Antwort im Serum von

Schafen, welche mit einer Vakzine geimpft wurden, die neben zwei inaktivierten

S. aureus-Stämmen, α- und β-Toxoid sowie Exopolysacchariden entweder Mineralöl

oder Carbopol als Adjuvans enthielt. Beide Varianten führten zu einer geringeren

Rate an klinischen Mastitiden verglichen mit der Kontrollgruppe, jedoch zu

unterschiedlichen Antikörperantworten. So kam es nur bei der Vakzine mit Mineralöl

zu einem Anstieg an Anti-β-Toxin-IgG (Antikörpern), der Titer von Anti-α-Toxin-IgG

stieg bei Verwendung von Mineralöl schneller an. Was jedoch die Anti-Kapsel-IgG

betrifft, so führte Carbopol zu höheren Titern als Mineralöl.

LEE et al. (2005) verwandten für die Impfung von Kühen eine trivalente Vakzine mit

FICA oder Aluminiumhydroxid als Adjuvans. Zwar sorgte beides für einen Anstieg

Literaturübersicht

54

von spezifischen IgG im Serum, jedoch wurde bei Anwendung von FICA mehr das

Phagozytose fördernde IgG2 gebildet.

Eine besonders gute IgG2-Antwort wurde in verschiedenen Studien sowohl an

Schafen als auch an Kühen durch Dextransulfat hervorgerufen (WATSON 1992b;

WATSON u. DAVIES 1993). Außerdem gaben die Autoren an, dass die Kombination

von Dextransulfat und Mineralöl zu einer mindestens ein Jahr andauernden

spezifischen IgG2-Antwort führt. Zu bedenken ist die Toxizität von Dextransulfat, die

bei hohen Konzentrationen des Adjuvans mit steigender Anzahl inaktivierter

Bakterien in der Vakzine zunimmt. Bei Schafen sollte daher laut WATSON und

DAVIES (1993) die Dosis Dextransulfat einen Wert von 10 mg/kg nicht

überschreiten. Auch lokale Reaktionen an der Applikationsstelle wie Schwellungen

sind häufig und waren auch in den genannten Untersuchungen zu beobachten. Bei

Verwendung von Mineralöl kam es stets zu granulomatösen Läsionen an der

Applikationsstelle.

Ein ebenfalls von WATSON und DAVIES (1993) erprobter Calcium-Phosphat-Zusatz

blieb verglichen mit der Vakzine ohne Adjuvans ohne signifikanten Effekt auf die

Antikörper-Antwort.

2.6.3.2 Applikationsformen

2.6.3.2.1 Systemisch

Bei der Mehrzahl der durchgeführten Impfversuche gegen S. aureus-Mastitis wurden

die Tiere systemisch, also entweder subkutan oder intramuskulär geimpft. Auf Grund

der Vielzahl der hierfür verwendeten verschiedenen Lokalisationen sollen diese hier

nicht näher erläutert werden. Die systemische Applikation kam sowohl beim kleinen

Wiederkäuer (AMORENA et al. 1994) als auch beim Rind zum Einsatz (WATSON et

al. 1996) und führte je nach Zusammensetzung der verabreichten Vakzine zu

Abszessen (DERBYSHIRE 1961), Granulomen (KENNEDY u. WATSON 1982) oder

vorübergehenden Schwellungen (GIRAUDO et al. 1997) an der Applikationsstelle.

Literaturübersicht

55

2.6.3.2.2 Lokal – nahe Lnn. inguinales superficiale s

Um die lokale Immunität gezielter zu erhöhen, wurden Vakzinen zunehmend auch

(O'BRIEN et al. 2001; LEE, J. W. et al. 2005) bzw. ausschließlich (NORDHAUG et al.

1994a; HOEDEMAKER et al. 2001; TOLLERSRUD et al. 2002) subkutan in die Nähe

der Lymphonodi (Lnn.) inguinales superficiales verabreicht. NICKERSON et al.

(1985; 1993) verglichen bei Kühen die intramuskuläre Verabreichung mit der

Verabreichung in die Nähe der genannten Lymphknoten und stellten eine höhere

Zell- und Antikörperantwort bei der letzteren Variante fest. Allerdings konnte kein

offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Heilungsrate von S. aureus-Mastitiden

und der Leukozytenanzahl in der Zitze nachgewiesen werden.

2.6.3.2.3 Lokal – intrazisternal (i.z.)

Die lokale Immunantwort der Schleimhäute soll durch die lokale Applikation des

betreffenden Antigens am besten stimuliert werden. Bestätigt wurde dies durch

Untersuchungen, bei denen nach intramammärer Vakzination ein deutlicher Anstieg

spezifischer Antikörper in der Milch nachgewiesen wurde, welcher relativ gesehen

größer ausfiel als der Anstieg im Blut (NONNECKE et al. 1986). Auch WILSON et al.

(1972) verzeichneten einen deutlichen Anstieg von spezifischen IgG1 und IgA in der

Milch, nachdem sie Färsen in der Hochträchtigkeit mit einer Vakzine gegen E.coli

intrazisternal geimpft hatten. Mit lyophilisierten CP 5 und 8 S. aureus-Stämmen

impften BARRIO et al. (2003) Kühe in gleicher Weise und mit ähnlichem Ergebnis.

Bezüglich der intrazisternalen Verabreichung von Vakzinen in der Trockenstehphase

wiesen RYŠÁNEK et al. (1988) allerdings darauf hin, dass dies zu einer Schädigung

des sekretorischen Gewebes und somit zu einer geringeren Aktivität desselbigen in

der Folgelaktation führen kann.

Bei Impfversuchen an Ziegen stellte DERBYSHIRE (1961) fest, dass nach einer

intrazisternalen Immunisierung und anschließender experimenteller Infektion mit

S. aureus weniger schwere klinische Symptome auftraten als bei ungeimpften

Euterhälften. In einer weiteren Studie impften DERBYSHIRE und SMITH (1969)

Ziegen mit einer Vakzine bestehend aus inaktivierten S. aureus und Toxoiden in der

Trockenstehphase i.z., was zunächst zu Fieber, Schwellung der betroffenen

Literaturübersicht

56

Euterhälfte und später zu einem geringeren Aufeutern dieser Euterhälfte führte.

Allerdings waren vakzinierte Euterhälften nach experimenteller Infektion mit dem

homologen Stamm im Gegensatz zu Kontrollhälften klinisch unauffällig und wiesen

bereits vor der Infektion erhöhte Antikörpertiter im Milchserum auf. Auch CHANG et

al. (1981) stellten fest, dass der Antikörpertiter nur in den jeweils i.z. geimpften

Vierteln von trocken stehenden Kühen und im Blut anstieg, nicht jedoch in den

ungeimpften Vierteln derselben Kuh.

In einer Untersuchung an hochtragenden Schafen, in der die Effekte intrazisternaler

und intramuskulärer Applikation einer Vakzine aus inaktivierten S. aureus und

Toxoiden auf den Ausgang einer experimentellen Infektion verglichen wurden, zeigte

sich, dass die intrazisternale Vakzinierung den besseren Schutz bot (MCDOWELL u.

WATSON 1974). Der Antikörpertiter in der Milch war nach i.z. Impfung deutlich

höher, die Tiere zeigten nach experimenteller Infektion weniger klinische

Symptomatik und einen geringeren Rückgang der Milchleistung als systemisch

geimpfte Tiere.

Die Kombination von systemischer und intrazisternaler Applikation einer S. aureus-

spezifischen Vakzine in der Trockenstehphase bedingt laut WATSON und

LASCELLES (1975) höchste Antikörpertiter im Kolostrum.

Dass auch eine intrazisternale Vakzination während der Laktation möglich ist,

zeigten GARCÍA et al. (1996) an Mäusen, denen sie eine thermosensitive S. aureus-

Mutante i.z. applizierten. Nach der Impfung wurden deutlich mehr spezifische IgA in

der Milch der Mäuse nachgewiesen und nach experimenteller Infektion wesentlich

weniger Bakterien ausgeschieden als dies bei intraperitonaeal geimpften Tieren der

Fall war.

2.6.3.3 Applikationszeitpunkt

Im Wesentlichen lassen sich zwei Zeitpunkte für die Vakzination unterscheiden: die

Laktation und die Trockenstehphase. Bei dem Großteil der durchgeführten

Impfversuche, unabhängig davon, ob diese an Rindern oder kleinen Wiederkäuern

durchgeführt wurden, wurde die Trockenstehphase als Zeitpunkt für die Vakzination

gewählt. Dies ist unter Anderem darin begründet, dass die Impfung laut ANDERSON

(1978) zunächst immer zu einer - wenn auch milden - Mastitis führen muss, was mit

Literaturübersicht

57

einer Erhöhung der Zellzahl einhergeht. Dies ist während der Laktation insbesondere

in Rinderbetrieben aufgrund der einzuhaltenden Zellzahlgrenzwerte unerwünscht

(NORDHAUG et al. 1994b). Des Weiteren zeigten bereits früh durchgeführte

Versuche, dass die Impfung während der Trockenstehphase zu hohen spezifischen

Antikörpertitern im Kolostrum führt (WATSON u. LASCELLES 1975).

In den seltenen Fällen, in denen die Vakzination während der Laktation stattfand, war

dies teilweise durch die begleitende intramammäre Antibiotikatherapie (s.u.) bedingt

(LUBY u. MIDDLETON 2005; SMITH et al. 2006). HOEDEMAKER et al. (2001)

kombinierten beide Zeitpunkte, indem sie die Grundimmunisierung der Kühe

während der Laktation, die Boosterung hingegen in der Trockenstehphase

durchführten.

GÓMEZ et al. (1998) verabreichten Mäusen eine attenuierte S. aureus-

Lebendvakzine entweder in der frühen Laktation oder in der Hochträchtigkeit

intramammär und konnten bei beiden Varianten einen signifikanten Anstieg

spezifischer IgA-Antikörper in der Milch, einen guten Schutz vor experimenteller

Infektion sowie keine unerwünschten Nebenwirkungen verzeichnen.

In einem Versuch mit Färsen wurden die Tiere entweder vier und acht Wochen a.p.

oder eine und fünf Wochen p.p. subkutan mit einer Vakzine gegen S. aureus geimpft.

Die S. aureus-Prävalenz sank bei den a.p. geimpften Tieren um 64%, bei den p.p.

geimpften sogar um 68% gegenüber der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse beider

Impfgruppen unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Weiterhin war kein

Unterschied bezüglich des Gehaltes an somatischen Zellen festzustellen (GIRAUDO

et al. 1997).

2.6.4 Kombination von Vakzination und Antibiose

Da meistens weder eine konventionelle Antibiotikatherapie noch eine Vakzination

allein ausreichen, um chronische S. aureus-Mastitiden zu heilen, wurde auch die

Kombination beider Verfahren an chronisch mit S. aureus infizierten Kühen getestet.

Hierbei wurde jeweils eine verlängerte intramammäre Pirlimycin-Therapie mit der

Verabreichung von Lysigin® (s.o.) gemäß unterschiedlicher Impfschemata kombiniert.

Während SMITH et al. (2006) eine Heilungsrate von 40% gegenüber 9% in der

Kontrollgruppe postulierten, konnten LUBY und MIDDLETON (2005) zwar einen

Literaturübersicht

58

Anstieg der Heilungsrate, aber keinen klaren Vorteil gegenüber der ausschließlichen

verlängerten Antibiotikatherapie verzeichnen.

Material und Methoden

59

3 Material und Methoden

3.1 Vorversuch

Zur Überprüfung der Verträglichkeit des Impfstoffes bei intrazisternaler Applikation

wurde dieser Applikationsweg im Vorfeld an zwei Ziegen des Betriebes A, die zu

diesem Zweck in die Klinik für kleine Klauentiere verbracht worden waren, getestet.

Die Tiere wurden gemeinsam auf Stroh aufgestallt und mit Heu und pelletiertem

Kraftfutter gefüttert. Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Die beiden Ziegen

wurden zweimal täglich von Hand gemolken, wobei Handschuhe getragen wurden

(nobaglove Latex, Fa. NoBa Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG, Wetter). In

regelmäßigen Abständen wurden Milchproben entnommen, die im Institut für

Lebensmittelqualität und –sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

mittels der für den Hauptversuch beschriebenen Methoden kulturell und auf ihren

Gehalt an somatischen Zellen untersucht wurden.

Nachdem die Ziegen am Morgen ausgemolken worden waren, wurden ihnen in der

für den Hauptversuch beschriebenen Weise je Euterhälfte 2,5 ml der

stallspezifischen Vakzine intrazisternal appliziert. Anschließend wurde in

regelmäßigen Abständen die Rektaltemperatur der Ziegen gemessen sowie über 3

Tage jeweils zur Melkzeit ein CMT durchgeführt.

Bei der zweiten Impfung, die 4 Wochen nach der ersten erfolgte, wurden die

Messung der Rektaltemperatur und der CMT in größeren zeitlichen Abständen

durchgeführt als bei der Erstimpfung.

Um zusätzlich die Verträglichkeit des Impfstoffes in der Hochträchtigkeit zu

überprüfen, wurden die Ziegen in der Trockenstehphase ca. 14 Tage vor der

Lammung subkutan geimpft.

3.2 Versuchstiere

Bei den Versuchstieren handelte es sich um Schafe bzw. Ziegen aus zwei

Milcherzeugerbetrieben mit bekannter S. aureus-Problematik. Im Folgenden sollen

diese Betriebe mit ihren Haltungsbedingungen näher beschrieben werden.


60

3.2.1 Betrieb A

Dieser nach EU-BIO-Richtlinien wirtschaftende Milchziegenbetrieb im Landkreis

Cuxhaven hielt im Untersuchungszeitraum 68 bis 79 laktierende bunte deutsche

Edelziegen nebst deren Lämmern, 4 Böcken und ca. 20 Zutretern bzw. Alttieren. Die

laktierenden Ziegen waren in 4, zeitweise auch 5 durch Gitter abgetrennten

Stallabteilen eines Stallraumes aufgestallt. Bis auf einzelne Ausnahmen blieben die

Gruppen, bei ähnlicher Gruppengröße, innerhalb dieser Abteile stabil. Jedes Abteil

entsprach einem Tiefstreustall mit Fressgitter, in welchem die Tiere während des

Melkens fixiert wurden. Gefüttert wurden die Tiere mit einer Heulage (im Anschluss

an das Melken) sowie einer Getreideschrot-Mischung (vor bzw. während des

Melkens). Den Ziegen standen Minerallecksteine und Selbsttränken zur Verfügung.

In den Sommermonaten hatten die Tiere bei trockener Witterung zwischen der

Morgen- und Abendmelkzeit Weidegang.

Zu den Melkzeiten wurden die Ziegen im Fressgitter ihres jeweiligen Stallabteils

fixiert. Gemolken wurde mit einer Eimermelkanlage, die mit Hilfe eines Handwagens

zu den Ziegen transportiert wurde. Die Zitzen wurden trocken gereinigt und es wurde

vorgemolken, anschließend wurde das Melkzeug angesetzt. Der Melker trug

während des Melkens keine Handschuhe. Auch auf Zitzendippen nach dem Melken

wurde verzichtet.

Die ermolkene Milch wurde, bis auf die Menge, die der Lämmerfütterung diente, in

eigener Hofkäserei vollständig zu Rohmilchkäse verarbeitet und auch größtenteils

direkt vermarktet.

Die Lämmer, die bis zur Schlachtung im Herbst aufgezogen wurden, wurden ebenso

wie die Böcke und Alttiere in einem separaten Stall gehalten. Allerdings befanden

sich im Betrieb noch 3 Hunde, mehrere Katzen sowie Hühner und Enten, die alle

mehr oder weniger freien Zugang zu den Stallungen sowie zu den Futtermitteln

hatten. Neben dem Ziegenstall wurden außerdem einige Schweine in einem Koben

mit Auslauf gehalten.


61

3.2.2 Betrieb B

In diesem nach Demeter-Richtlinien wirtschaftenden Betrieb im Landkreis Hannover

wurden neben weißen deutschen Edelziegen und Milchschafkreuzungstieren auch

Rinder, Schweine und Geflügel in jeweils separaten Ställen gehalten. Der Bestand

insbesondere an Schafen schwankte im Untersuchungszeitraum stark (39 bis 21

melkende Schafe), die Anzahl melkender Ziegen lag zwischen 24 und 21 Stück.

Neben den melkenden Tieren waren noch deren Lämmer, je 2 Ziegen- und

Schafböcke sowie bis zu 30 Zutreter bzw. Altschafe, die nicht gemolken wurden, im

Bestand. Schafe und Ziegen wurden in einem Stall, aber getrennten Abteilen

gehalten. Es handelte sich jeweils um Tiefstreuställe, und gefüttert wurde den Tieren

überständiges Klee-Heu. Zu den Melkzeiten bekamen die Tiere zusätzlich eine

Getreide-Mineralfutter-Mischung auf dem Melkstand angeboten. Von Frühjahr bis

Herbst hatten die Tiere zwischen der Morgen- und Abendmelkzeit Weidegang.

Die Tiere wurden auf einem aus Holz gefertigten Melkstand mittels tief verlegter

Rohrmelkanlage mit bis zu 12 Melkzeugen gemolken. Zu diesem Zweck wurden sie

je nach Anzahl der jeweils zu melkenden Tiere in 2 bis 3 Gruppen (meist 1 Ziegen-

und eine Schafgruppe sowie eine gemischte) auf den Melkstand getrieben. Die

Melker (wechselnde Personen) trugen stets Einmalhandschuhe, die Zitzen wurden

trocken gereinigt und es wurde vorgemolken. Nach dem Abnehmen des Melkzeugs

wurden die Zitzen mit einem Jod-Glyzerin-Präparat gedippt.

Die ermolkene Milch diente wie in Betrieb A neben der Lämmerfütterung

hauptsächlich der Herstellung von Rohmilchkäse, welcher durch den Betrieb selbst

vermarktet wurde.

3.3 Versuchsaufbau

3.3.1 Impfung

Nach Erregerisolation aus spontan mit S. aureus infizierten Schafen und Ziegen der

Versuchsbestände wurden jeweils stallspezifische Vakzinen hergestellt (s.u.). Die

Grundimmunisierung erfolgte innerhalb der Laktation. Die Vakzinen wurden dem

Großteil der Tiere (54 Tieren des Betriebes A und 46 Tieren des Betriebes B)

zweimal im Abstand von 4 bis 6 Wochen subkutan (s.c.) an der seitlichen Brustwand


62

appliziert, einer kleineren Gruppe (15 Tieren des Betriebes A und 14 Tieren des

Betriebes B) zweimal im selben Abstand intrazisternal (i.z.). Drei Tieren des

Betriebes B wurde die Vakzine zunächst s.c. und anschließend i.z. verabreicht. Die

nächste Boosterung fand innerhalb der ersten 14 Tage nach der Lammung statt und

wurde ausschließlich s.c. durchgeführt. Hier erfolgte auch die erste Impfung der

Zutreter des Betriebes A (alle s.c.), welche nach 4 bis 6 Wochen erneut geimpft

wurden. Die Zutreter des Betriebes B wurden nicht geimpft.

Für die subkutane Impfung wurden sterile Einmalspritzen (Fa. Transamed Inform

GmbH, Berlin) und Fine-Ject Einmalkanülen (∅ 1,1 mm, Länge 25 mm, Fa. Henke

Sass Wolf, Tuttlingen) benutzt. Je Tier wurden 5 ml der stallspezifischen Vakzine im

Bereich der seitlichen Brustwand appliziert.

Die intrazisternale Applikation fand direkt im Anschluss an das Melken der Tiere statt

und wurde mit behandschuhten (nobaglove Latex, Fa. NoBa Verbandmittel Danz

GmbH & Co. KG, Wetter) Händen durchgeführt. Hierbei wurde mit

Venenverweilkanülen (Vygonüle T, ∅ 1,1 mm, Länge 33 mm, Fa. Vygon GmbH &

Co. KG, Aachen) gearbeitet, aus denen der metallische Mandrin entfernt worden

war. Diese wurden, nach vorherigem, gründlichem Desinfizieren der Zitzenkuppe mit

in 70%igem Alkohol getränktem Zellstoff, vorsichtig und unter leichten

Drehbewegungen in den Zitzenkanal vorgeschoben (siehe Abbildung 3.1). Je

Euterhälfte wurden 2,5 ml der stallspezifischen Vakzine mit einer frischen Vygonüle

appliziert.

Bei den im Anschluss an die Impfung stattfindenden Melkzeiten wurden alle

geimpften Tiere normal gemolken, allerdings wurde die Milch sicherheitshalber

zunächst entsorgt.


63

Abbildung 3.1: Intrazisternale Applikation der Vakzine

3.3.2 Milchproben

Zur labordiagnostischen Untersuchung (s.u.) wurden allen geimpften Tieren zu

folgenden Zeitpunkten Milchproben entnommen:

• bei Erstimpfung

• 14 Tage nach der Erstimpfung

• bei Zweitimpfung

• 14 Tage nach der Zweitimpfung

• ca. 6 Wochen nach der Zweitimpfung

• ca. 14 Wochen nach der Zweitimpfung

• vor dem Trockenstellen (nur in Betrieb A)

• bei Boosterung nach der Lammung

• 4 Wochen nach Boosterung


64

Die Milchprobenentnahme wurde in Anlehnung an die Leitlinien zur Entnahme von

Milchproben unter antiseptischen Bedingungen (DVG 2000) durchgeführt. Die

Probennahme erfolgte zur normalen Melkzeit als Hälftenanfangsgemelk. Nachdem

die ersten drei Milchstrahlen aus jeder Zitze verworfen worden waren, wurden die

Zitzenkuppen mit in 70%igem Alkohol getränktem Zellstoff desinfiziert. Bei der

Probennahme wurden Handschuhe (s.o.) getragen und es wurden sterile

Probenröhrchen aus Polystyrol (Röhre 13 ml, 95 x 16,8 mm, Sarstedt

Aktiengesellschaft & Co., Nümbrecht) verwendet. Die Proben wurden anschließend

umgehend und bis zur Bearbeitung im Labor gekühlt (4°C) transportiert und gelagert.

Nach der Entnahme der Milch für die bakteriologische und zytologische

Untersuchung und ggf. für den California Mastitis Test (CMT), soweit dieser noch

nicht am Tier durchgeführt worden war (siehe Kapitel 3.5.2.2), wurden die Proben bis

zur Durchführung der weiteren Untersuchungen bei -21°C eingefroren.

1.ImpfungProbe

Probe

2.ImpfungProbe

Probe

Probe

Probe ProbeTrockenstellen

LammungBooster-Impfung

1.Impfung ZutreterProbe


1.ImpfungProbe

Probe

2.ImpfungProbe

Probe

Probe

Probe ProbeTrockenstellen

LammungBooster-Impfung



Abbildung 3.2: Zeitleiste für die Impfungen und Probenentnahme

3.4 Impfstoff

Die stallspezifischen Vakzinen wurden von Mitarbeitern der Fa. WDT, Garbsen im

Serumwerk Memsen, Hoyerhagen hergestellt. Sie enthielten eine Suspension

inaktivierter S. aureus, die aus Milchproben von Tieren der jeweiligen Betriebe isoliert

worden waren. Für die Herstellung der Impfstoffe wurden die aus der Milchprobe

einer Ziege des Betriebes A isolierten S. aureus, bzw. die aus fünf verschiedenen


65

Milchproben von Ziegen und Schafen sowie Kühen des Betriebes B isolierten

S. aureus verwendet.

3.5 Analytische Methoden

3.5.1 Bakteriologische Untersuchungen

3.5.1.1 Kulturelle Untersuchung

Die kulturelle Untersuchung erfolgte aus den Milchproben der Beprobungszeitpunkte

1 bis 5 sowie 8 (Betrieb B) bzw. 9 (Betrieb A) und wurde von Mitarbeitern des

Instituts für Lebensmittelqualität und –sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover durchgeführt. Hierbei wurden 10 µl der jeweiligen Milchprobe mittels

Einmalösen auf Äskulinblutagar (Fa. Oxoid, Wesel) ausgestrichen. Zur Anreicherung

wurde zusätzlich eine Nährbouillon mit 10 µl Milch beimpft und für 24 Stunden bei

37°C bebrütet. Anschließend wurden 10 µl der bebrüt eten Bouillon wiederum auf

Äskulinblutagar ausgestrichen und erneut für 24 Stunden bei 37 °C bis zur

Auswertung bebrütet. Die Äskulinblutagarplatte ohne Anreicherung wurde nach 24-

und nach 48-stündiger Bebrütung im Wärmeschrank bei 37°C ausgewertet und die

Bakterienkulturen anhand von Koloniemorphologie, Hämolyseverhalten und

Äskulinspaltung soweit möglich differenziert. Zur Erstellung von Reinkulturen wurden

bei Verdacht auf das gleichzeitige Vorliegen unterschiedlicher Bakterienspezies

Subkulturen einzelner Kolonien angelegt. Bei Verdacht auf S. aureus aufgrund von

Hämolyseverhalten und/oder Koloniemorphologie wurden ein Staphylasetest (Fa.

Oxoid, Wesel), die Überprüfung der Koagulasereaktion (Fa. Becton Dickinson,

Franklin Lakes, New Jersey, USA) sowie im Zweifelsfall ein Test auf Hyaluronidase

mit Hilfe einer mit Streptococcus equi beimpften Blutplatte durchgeführt. Als

S. aureus abschließend klassifiziert wurden hämolysierende Staphylokokken, die

Clumping-Faktor-, Koagulase- und Hyaluronidase-positiv waren.


66

3.5.1.2 Resistenztests

Die Resistenztests wurden mit aus den Milchproben isolierten Staphylokokken

(S. aureus und CNS) ebenfalls im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit der

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.

Für diese wurden Micronaut-S® Mikrotitrationsplatten (Fa. Genzyme Virotech GmbH,

Rüsselsheim) zur Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien verwendet. Die Methode

beruht auf der Rehydratisierung von Antibiotika durch Zugabe einer standardisierten

Bakteriensuspension. Eine Öse Koloniematerial wurde in 11 ml Mueller Hinton II

Bouillon überführt und nach gründlichem Mischen die Micronaut-S®-Platte mit dieser

Suspension beimpft. Die Auswertung erfolgte nach einer 24-stündigen Bebrütung bei

37°C.

3.5.1.3 S. aureus-spezifische PCR

Mittels der S. aureus-spezifischen PCR wurden die Milchproben der

Beprobungszeitpunkte 6 und 7 (Betrieb B) bzw. 6 bis 8 (Betrieb A) sowie 126

Milchproben, die zusätzlich der kulturellen Untersuchung unterzogen worden waren,

untersucht.

3.5.1.3.1 DNA-Isolierung

Die DNA-Extraktion erfolgte mittels eines MasterPure™ DNA Purification Kits

(Epicentre® Biotechnologies, Madison, WI, USA) gemäß des nachstehenden

Protokolls in einem für diesen Zweck eingerichteten Raum. Bei der Durchführung

wurden nicht sterile Einmalhandschuhe (rotiprotect-Latex, Fa. Carl Roth GmbH & Co.

KG, Karlsruhe) verwendet, die vorher mit 70%igem Alkohol desinfiziert wurden. Auch

wurden alle für die Extraktion notwendigen Gefäße vor der Benutzung autoklaviert.

Folgende Reagenzien entstammen dem o.g. Kit :

Proteinase K (50µg/µl)

2x T&C Lysis Solution

MPC Protein Precipitation Reagent

TE-Puffer


67

Protokoll:

1. Lyse der Milch

• eingefrorene Milchproben auftauen

• pro Probe je 2 µl Proteinase K (50 µg/µl) und 300 µl 2x T&C Lysis Solution in

ein 1,5 ml Tube ( Safe-Lock Tubes, PCR clean, Fa. Eppendorf AG, Hamburg)

geben

• je 300 µl der Milch in das Tube aus dem vorherigen Schritt überführen und

gründlich mischen (Vortex Genie 2, Model G – 560 E, Fa. Scientific Industries

Inc., Bohemia, New York, USA)

• Inkubation bei 65°C im Wasserbad (Gesellschaft für Labortechnik mbH,

Burgwedel) für 15 min

• Proben für 3 bis 5 Minuten auf Eis stellen

2. DNA-Extraktion

• je 300 µl MPC Protein Precipitation Reagent zu der lysierten Milch hinzugeben

und kräftig mischen (10 s)

• Proben 5 min bei 13.000 g zentrifugieren (Biofuge pico, Heraeus, Fa. Kendro

Laboratory Products, Osterode)

• Überstand in ein 2 ml Tube (Mµlti®-Reaktionsgefäß 2 ml, Fa. Carl Roth GmbH

& Co. KG, Karlsruhe) überführen, Pellet verwerfen

• je 900 µl Isopropanol (2-Propanol Rotipuran®, 2,5 L, Fa. Carl Roth GmbH &

Co. KG, Karlsruhe) zum Überstand hinzugeben und 30 bis 40 mal vorsichtig

schwenken

• Proben 5 min bei 13.000 g zentrifugieren, Überstand verwerfen

• Pellets mit 500 µl 75%igem Ethanol (hergestellt aus Ethanol Rotipuran®, 2,5

L, Fa. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe und Aqua bidest, doppelt

autoklaviert) waschen


• Pellets mit 250 µl 75%igem Ethanol (s.o.) waschen


• Pellet trocknen lassen (ca. 30 Minuten)


68

• Pellet in 70 µl TE-Puffer resuspendieren

3.5.1.3.2 Photometrische Messung des DNA-Gehaltes

Zur photometrischen Messung des DNA-Gehaltes wurde zunächst eine 1:20

Verdünnung des Produktes der DNA-Extraktion hergestellt, d.h. 30 µl dieses

Produktes wurden mit 570 µl Aqua bidest, doppelt autoklaviert (eigene Herstellung)

verdünnt. Der Leerwert wurde mittels 570 µl Aqua bidest, doppelt autoklaviert und 30

µl des oben genannten TE-Puffers ermittelt. Die Proben wurden in Quarzküvetten

überführt und bei 260 nm im Photometer (Spectrophotometer UVIKON XL, Biotek

Instruments, Neufahm) ihre Extinktion ermittelt. Anschließend wurde der Leerwert

vom gemessenen Wert für die Probe subtrahiert und das Ergebnis mit 100

multipliziert. Der so errechnete Wert entspricht dem Gehalt an DNA in ng/µl Probe.

(Gemessene Extinktion – Leerwert) x 100 = DNA-Gehal t in ng/µl

3.5.1.3.3 Replikation der DNA mittels PCR

Als Detektionssystem für S. aureus wurden Primer verwendet, deren Sequenzen im

Bereich des 16 s rRNA (ribosomale Ribonukleinsäure) Genabschnitts des Koagulase

(Coa)-Gens erstellt worden waren (Fa. Bio & Sell, Nürnberg).

Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µl pro Probe angesetzt. Der

Mastermix wurde in einem abgetrennten Raum unter einer Hera-Safe

Sicherheitswerkbank (Typ HS 12, Heraeus, Fa. Kendro Laboratory Products, Hanau)

aus folgenden Bestandteilen (je Probe) angemischt:

• 7,88 µl Wasser für die Molekularbiologie (DEPC-behandelt, Fa. Carl Roth

GmbH & Co. KG, Karlsruhe)

• 2,5 µl 10xPuffer 15 mMol MgCl2 (Fa. Qiagen GmbH, Hilden)

• 0,5 µl dNTP-Mix 10mM (Fa. Finnzymes Oy, Espo, Finnland)

• 2 µl Primer Staph V 0,5 µM (Fa. Bio & Sell, Nürnberg)

• 2 µl Primer Staph R 0,5 µM (Fa. Bio & Sell, Nürnberg)

• 0,125 µl HotStarTaq® DNA-Polymerase 5 units/µl (Fa. Qiagen GmbH, Hilden)


69

Das Gesamtvolumen der PCR-Ansätze setzte sich wie folgt zusammen:

25µl gesamt = 15 µl Mastermix + (x Wasser + y DNA)

Das Produkt der DNA-Extraktion wurde in einem gesonderten Raum (Cycler-Raum)

hinzu gegeben. Das Volumen richtete sich hierbei nach der DNA-Konzentration, die

zuvor photometrisch bestimmt worden war (s.o.). Ziel war es, mindestens 200 ng

DNA pro Probe einzusetzen. Lag die DNA-Konzentration der Proben deutlich über

250 ng/µl, wurden diese mit Wasser für die Molekularbiologie (s.o.) verdünnt.

Zuvor waren unter der Sicherheitswerkbank zwischen 1 und 10 µl Wasser für die

Molekularbiologie (gemäß der o.g. Formel) in jeweils ein 0,2 ml Tube (PCR-Gefäße

farblos, Fa. Brand GmbH & Co. KG, Wertheim) überführt worden und anschließend

je 15 µl des Mastermixes hinzu gegeben worden.

Es wurden stets eine Positiv- und eine Negativkontrolle sowie zwei Wasserkontrollen

(eine wurde unter der Sicherheitswerkbank, eine erst im Cycler-Raum geschlossen)

mitgeführt, um Kontaminationen oder Verschleppung von DNA bzw. Störungen im

Ablauf der PCR erkennen zu können.

Um derartige Kontaminationen mit Fremd-DNA und auch Nukleasen zu verhindern,

wurden die Sicherheitswerkbank und die Arbeitsfläche im Cycler-Raum in

regelmäßigen Abständen für 30 Minuten mit UV-Licht bestrahlt.

Die PCR wurde mittels eines Eppendorf Mastercyclers (Fa. Eppendorf AG, Hamburg)

mit folgendem Programm durchgeführt:

1. 15 min bei 95°C (Denaturierung)

2. 35 Zyklen bestehend aus folgenden 3 Schritten:

• 1 min bei 94°C (Denaturierung)

• 30 s bei 57°C (Primerhybridisierung, sog. „Anneali ng“)

• 1 min bei 72°C (Elongation)

3. 10 min bei 72°C (Elongation)

Nach Beendigung dieses Programms wurden die Proben bis zur Entnahme aus dem

Mastercycler in diesem auf 4°C heruntergekühlt.


70

3.5.1.3.4 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Darstellung der DNA-Banden wurden Horizontalgele mit einer Konzentration von

2% Agarose verwendet. Zur Herstellung dieser Gele wurden pro Gel 33 g Agarose

(Universal Agarose, Fa. Bio & Sell, Nürnberg) und 165 ml 1xTBE-Puffer vermischt

und im Mikrowellenherd (Sharp, 800 Watt) mehrfach bis zum Kochen erhitzt. Der o.g.

TBE-Puffer war zuvor in zehnfach konzentrierter Form aus 108 g TRIS Pufferan®,

55 g Borsäure, 9,3 g EDTA Dinatriumsalz Dihydrat (alle Fa. Carl Roth GmbH & Co.

KG, Karlsruhe) sowie Aqua bidest (eigene Herstellung) ad 1000 g hergestellt und

anschließend steril filtriert (Steritop™, 0,22 µm, Millipore Corporation, Bedford,

Massachusetts, USA) worden. Nach dem Kochen wurde das Agarose-TBE-Puffer-

Gemisch bis auf ca. 60°C abgekühlt und es wurden 16 ,5 µl GelStar® Nucleic Acid

Gel Stain (Fa. Lonza Rockland, ME, USA) unter Verwendung von Nitril-Handschuhen

(Nobaglove-Nitril, Fa. NoBa Verbandmittel Danz GmbH & Co. KG, Wetter) hinzu

gegeben. Anschließend wurde das Gemisch in Kammern (Comphor Midi, Fa. Biozym

Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) gegossen, wo es abkühlte und polymerisierte.

Sobald das Gel fest geworden war, wurde es mit 1xTBE-Puffer (s.o.) vollständig

beschichtet.

Nachdem zu jeder der Proben aus der PCR 3 µl verdünnter Farbmarker (eigene

Herstellung; für 6 ml Farbmarker 3 ml 0,1%ige Bromphenolblau-Stammlösung, 2 ml

Glycerin und 1 ml TE-Puffer) hinzu gegeben und vermischt worden waren, wurden je

20 µl in eine Tasche des Gels pipettiert (Pipette Precision®, Fa. Biozym Scientific

GmbH, Hessisch Oldendorf; Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S., Fa. Eppendorf AG,

Hamburg). Zusätzlich wurde auf jedes Gel auch 100Bp DNA-Leiter equalized (Fa.

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe) aufgetragen. Nach dem Auftragen wurde an

das Gel für 60 min eine Spannung von 100 V angelegt (Biometra® Standard Power

Pack, biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen).

3.5.1.3.5 Auswertung der Gele

Das DNA-Fragment wurde nach Anregung mit einem Blaulichttransilluminator (Flu-o-

blu, Fa. Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf) als fluoreszierende Bande auf

dem Gel sichtbar. Diese Banden wurden mit Hilfe einer Digitalkamera und des


71

Programms Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics®, Bethesda, Maryland, USA)

dokumentiert. Sie traten stets einzeln und in gleicher Länge auf, jedoch waren sie

durch variierende Signalstärken nicht immer mit der Kamera darstellbar.

Ausgewertet wurden nur solche Gele, bei denen die Positivkontrolle eine deutliche

Bande zeigte und die Negativ- sowie die Wasserkontrollen eindeutig als negativ zu

beurteilen waren. Proben, deren Banden derjenigen der Positivkontrolle entsprachen

wurden als positiv beurteilt, alle anderen hingegen als negativ.

3.5.1.4 Typisierung einiger S. aureus-Isolate mitte ls DNA-Microarray

Die Typisierung der jeweils für die Vakzinen verwendeten sowie einiger weiterer

(nach der Vakzination identifizierter) S. aureus-Isolate aus den Betrieben wurde im

Institut für Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus

der TU Dresden und in Zusammenarbeit mit dem Friedrich-Löffler-Institut (FLI) in

Jena durchgeführt. Zur Anwendung kam der von MONECKE et al. (2007)

beschriebene Microarray.

3.5.2 Zytologische Untersuchungen

3.5.2.1 Bestimmung des Zellgehalts

Die Bestimmung des Gehaltes der Milch an somatischen Zellen erfolgte aus den

Milchproben der ersten vier (Betrieb A) bzw. drei (Betrieb B) Beprobungszeitpunkte

im Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit der Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover mittels eines DeLaval Cell Counters™ (DCC; Fa. DeLaval

GmbH, Glinde). Dieses Gerät arbeitet mit einem fluoreszenz-optisch-elektronischen

Verfahren. Die DNA der in der Milch befindlichen Zellen wird mit dem

Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid angefärbt und anschließend mit Licht definierter

Wellenlänge bestrahlt. Aus der Fluoreszenz der DNA ergeben sich Lichtpunkte,

welche durch das Gerät gezählt werden.


72

3.5.2.2 Semiquantitative Bestimmung des Zellgehalts mittels California

Mastitis Test (CMT)

Der CMT wurde ab dem fünften (Betrieb A) bzw. vierten (Betrieb B)

Beprobungszeitpunkt durchgeführt. Es wurden in etwa 1,5 ml des

Hälftenanfangsgemelkes entweder im Rahmen der Milchprobenentnahme direkt in

zwei der vier Felder der CMT-Schale (Fa. Bayer HealthCare, Leverkusen) gemolken,

oder aber später im Labor aus den Milchprobenröhrchen, nachdem diese gründlich

geschüttelt worden waren, in die Schale gegeben. Danach wurde ca. das gleiche

Volumen CMT-Reagenz (Fa. WDT, Garbsen) hinzu gegeben, die Schale mehrfach

gut geschwenkt und anschließend die Hälfte des Gemisches verworfen. Nun wurde

unter mehrmaligem Schräghalten der Schale gemäß der unten abgebildeten Skala

(Tabelle 3.1) die Schlierenbildung des Gemisches beurteilt.

Tabelle 3.1: Beurteilung des CMT

CMT-Score Art der Reaktion

0 keine Reaktion

0,5 fragliche Reaktion

1 ggr. Schlierenbildung

1,5 mgr. Schlierenbildung

2 hgr. Schlierenbildung

2,5 beginnende Gallerte

3 Gallerte

3.6 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mittels Microsoft Office Excel 2003 (Fa.

Microsoft GmbH, Unterschleißheim) und SAS Version 9.1 2006 (Fa. SAS Institute

Inc., Cary, NC, USA). P-Werte <0,05 wurden als signifikant erachtet.


73

3.6.1 Häufigkeiten (Chi-Quadrat-Homogenitätstest un d McNemar-Test)

Als S. aureus-negativ wurden Milchproben eingestuft, aus denen keine oder aber

andere Erreger als S. aureus isoliert werden konnten. S. aureus-positive Proben

konnten neben S. aureus auch weitere Erreger enthalten.

Der statistische Vergleich der Anzahl S. aureus-positiver und –negativer Tiere und

Euterhälften innerhalb eines Betriebes zu den verschiedenen Zeitpunkten erfolgte

mittels des McNemar-Tests, da es sich um verbundene Stichproben handelte.

Hingegen wurden Impfgruppen- und Tierartvergleiche zu jeweils einem Zeitpunkt

mittels des Chi-Quadrat-Homogenitätstests oder Fischer’s exact test für

unverbundene Stichproben durchgeführt.

Auch die Vergleichbarkeit von kultureller Untersuchung und PCR wurde mit dem

McNemar-Test und dem Kappa-Index untersucht.

3.6.2 Gehalte an somatischen Zellen und CMT-Werte ( Wilcoxon’s two

sample test und Wilcoxon’s signed rank test)

Die Gehalte an somatischen Zellen und CMT-Werte wurden zunächst mittels des

Kolmogorov-Smirnov und des Shapiro-Wilk Tests auf Normalverteilung untersucht.

Da auch durch Logarithmierung keine Normalverteilung erreicht werden konnte,

wurden diese Daten mit Median, 75%- und 25%-Quantil sowie Minimum und

Maximum angegeben und graphisch als Boxplots dargestellt. Der statistische

Vergleich der Gehalte an somatischen Zellen und CMT-Werte innerhalb eines

Betriebes zu den verschiedenen Zeitpunkten erfolgte mittels Wilcoxon’s signed rank

test für verbundene Stichproben. Impfgruppen- und Tierartvergleiche sowie

Vergleiche in Abhängigkeit vom S. aureus-Nachweis wurden hingegen mit

Wilcoxon’s two sample test für unverbundene Stichproben durchgeführt.

Ergebnisse

74

4 Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob stallspezifische Vakzinen

einen entscheidenden Beitrag zur Sanierung von Schaf- und Ziegenherden mit

bestehender S. aureus-Mastitis-Problematik leisten können. Hierzu war es zunächst

angezeigt, in einem Vorversuch die Verträglichkeit des Impfstoffes bei intrazisternaler

Applikation zu überprüfen. Die intrazisternale Vakzination sollte bei jeweils 20 bis

25% der Tiere eines Bestandes durchgeführt werden, während die übrigen Tiere

subkutan geimpft werden sollten. Dies sollte Aufschluss darüber geben, ob

verschiedene Applikationswege zu unterschiedlichen Ergebnissen im Hinblick auf die

Eutergesundheit führen. Des Weiteren wurde im Rahmen des Sanierungskonzeptes

der Versuch unternommen, mittels einer S. aureus-spezifischen PCR die

diagnostischen Möglichkeiten gegenüber der kulturellen Untersuchung zu

verbessern. Außerdem erfolgte eine weitergehende molekularbiologische

Charakterisierung einiger S. aureus-Isolate sowie eine Untersuchung zu

vorliegenden Resistenzen gegenüber Antibiotika.

4.1 Vorversuch

Der Vorversuch wurde an zwei Ziegen (Nr. 75 und 76) durchgeführt, die zu diesem

Zweck in der Klinik für kleine Klauentiere aufgestallt wurden.

Die intrazisternale Applikation der stallspezifischen Vakzine führte zu einem

deutlichen Anstieg der Körperinnentemperatur insbesondere bei Ziege 75, die im

Gegensatz zur Ziege 76 mit der makroskopisch unauffälligen Milch der rechten

Euterhälfte vor der Vakzination stets S. aureus ausgeschieden hatte. Allerdings

normalisierten sich die Temperaturen schnell, so dass bereits 20 Stunden nach der

Applikation Werte gemessen werden konnten, die unter denen der Ausgangswerte

lagen. Ansonsten zeigten beide Tiere nach der Vakzination ein ungestörtes

Allgemeinbefinden sowie erhaltene Fresslust. Die Milch beider Tiere war nach der

Vakzination stets als makroskopisch unauffällig zu bezeichnen. Der somatische

Zellgehalt stieg nach der Applikation des Impfstoffes vorübergehend deutlich an.

Ergebnisse

75

Die zweite intrazisternale Impfung führte zu einem geringeren Anstieg der

Körperinnentemperatur als die Erstimpfung bei wiederum ungestörtem

Allgemeinbefinden und makroskopisch unauffälliger Milch.

Während des gesamten Untersuchungszeitraumes wurde zu keinem Zeitpunkt

S. aureus in der Milch einer der Euterhälften von Ziege 76 oder der linken Euterhälfte

von Ziege 75 nachgewiesen. Aus der Milch der rechten Euterhälfte von Ziege 75

konnte S. aureus allerdings auch nach der Impfung weiterhin kulturell isoliert werden.

Die Impfung in der Hochträchtigkeit wurde bei Ziege 75 vierzehn und bei Ziege 76

fünfzehn Tage a.p. durchgeführt. Die subkutane Verabreichung des Impfstoffes

führte zu keinerlei Schwellung an der Applikationsstelle, die Tiere zeigten

ungestörtes Allgemeinbefinden ohne einen Anstieg der Körperinnentemperatur.

Beide Ziegen brachten drei bzw. zwei gesunde Lämmer zur Welt.

4.2 Ergebnisse bakteriologischer Untersuchungen

4.2.1 Vergleichbarkeit von kultureller Untersuchung und PCR

Eine zuverlässige Diagnostik hat stets einen entscheidenden Anteil an dem Erfolg

der Sanierung einer Herde von einem bestimmten Krankheitsbild. In der

vorliegenden Untersuchung war die Identifikation von Tieren, die S. aureus mit der

Milch ausschieden, insofern essentiell, als einerseits Prävalenzentwicklungen im

Zuge der Vakzination möglichst zuverlässig dargestellt und andererseits

„Dauerausscheider“ von S. aureus bevorzugt der Schlachtung zugeführt werden

sollten. Daher wurde eine S. aureus-spezifische PCR durchgeführt und die

Ergebnisse dieser mit denen der kulturellen Untersuchung zum Erregernachweis

verglichen.

Insgesamt 126 Milchproben wurden sowohl kulturell als auch mittels PCR untersucht.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 4.1 dargestellt. Der

statistische Vergleich der Ergebnisse der kulturellen Untersuchung und der PCR

mittels McNemar-Test ergab eine nicht signifikant verschiedene Reaktion (p=0,3359)

sowie eine mittlere Übereinstimmung beider Tests (Kappa=0,5688).

Ergebnisse

76

Tabelle 4.1: Vierfeldertafel zum Vergleich der Ergebnisse aus kultureller

Untersuchung und PCR

S. aureus PCR positiv PCR negativ Summe

kulturell positiv 55 16 71

kulturell negativ 11 44 55

Summe 66 60 126

4.2.2 Resistenztests

Zur näheren Charakterisierung der bei Schaf- und Ziegenmastitiden ätiologisch

beteiligten S. aureus-Stämme sowie um Aufschluss über ein mögliches Vorkommen

von MRSA zu geben, wurden aus den Milchproben isolierte S. aureus und auch CNS

Resistenztests unterzogen. Diese ergaben unabhängig vom Betrieb, aus dem die

jeweilige Milchprobe stammte, stets das gleiche Bild: Die Staphylokokken reagierten

auf alle hier getesteten Antibiotika empfindlich, lediglich auf Erythromycin wurde stets

eine intermediäre Reaktion beobachtet. Die verwendeten Antibiotika sowie die

Ergebnisse der Tests sind noch einmal in Tabelle 4.2 zusammengefasst.

Ergebnisse

77

Tabelle 4.2: Ergebnisse der bei den aus Milchproben isolierten Staphylokokken

durchgeführten Resistenztests

P A Ox CEZO Tet Pirl E Gen CPZ AmC CEQ

S S S S S S I S S S S

S S S S S S I S S S S

A=Ampicillin E = Erythromycin/Spiramycin u. Tylosin

AmC = Amoxicillin/Clavulansäure Gen = Gentamicin

CEQ = Cefquinom Ox = Oxacillin/Cloxacillin

CEZO = Cefazolin/Cefalexin P = Penicillin G

CPZ = Cefoperazon Pirl = Pirlimycin/Lincomycin

Tet = Tetracyclin/Oxytetracyclin

S = sensibel R = resistent I = intermediär

Erreger

S.aureus

CNS

4.2.3 Typisierung einiger S. aureus -Isolate mittels DNA-Microarray

Wie die durchgeführten Resistenztests diente auch die Typisierung der näheren

Charakterisierung der bei Schaf- und Ziegenmastitiden ätiologisch beteiligten

S. aureus-Stämme.

Die überwiegende Mehrheit der zur Typisierung eingeschickten S. aureus-Isolate

konnte als agr_I/ CC133-MSSA [tst1+, entC/L+] identifiziert werden - unabhängig

vom Betrieb, aus dem sie stammten. Sowohl der Impfstamm des Betriebes A als

auch acht weitere S. aureus-Isolate aus Milchproben dieses Betriebes wurden

diesem Stamm zugeordnet. Zusätzlich konnte ein Isolat als ein bei Menschen häufig

vorkommender Stamm, agr_I/ ST7-MSSA [entA-N315+, sak/scn+, blaZ+] identifiziert

werden. Eines der mittels kultureller Untersuchung als S. aureus eingestuften Isolate

konnte im DNA-Microarray nicht als S. aureus bestätigt werden.

Auch im Betrieb B war der oben genannte Stamm agr_I/ CC133-MSSA [tst1+,

entC/L+] Bestandteil der stallspezifischen Vakzine. Von insgesamt fünf für die

Vakzine verwendeten Isolaten stellte er mit dreien den Großteil. Außerdem waren

noch zwei Isolate eines nah verwandten Stammes, agr_I/ CC133-MSSA [tst1+, entA-

Ergebnisse

78

320E+, entC/L+] Bestandteil dieser Vakzine. Zwei weitere getestete Isolate aus

Milchproben von Ziegen des Betriebes B stellten sich ebenfalls als der am häufigsten

isolierte Stamm heraus.

4.3 Effekte der Vakzination in den Betrieben

Im Folgenden werden die Entwicklungen der S. aureus-Prävalenz sowie der

somatischen Zellgehalte getrennt für die Betriebe, in denen die stallspezifische

S. aureus-Vakzine eingesetzt wurde, dargestellt.

Für die Zeitpunktvergleiche der S. aureus-Prävalenz und des Gehaltes an

somatischen Zellen sowie des CMT-Wertes der Milch wurden ausschließlich

durchgängig beprobte Tiere berücksichtigt. Dies waren im Betrieb A 59 Tiere (118

Euterhälften). Von diesen 59 Tieren wurden 48 Tiere (96 Euterhälften) subkutan und

11 Tiere (22 Euterhälften) intrazisternal geimpft. Im Betrieb B wurden insgesamt 39

Tiere (78 Euterhälften), d.h. 21 Ziegen (42 Euterhälften) und 18 Schafe (36

Euterhälften) durchgängig beprobt. Der Impfgruppe s.c. gehörten 14 Schafe und 16

Ziegen, also insgesamt 30 Tiere (60 Euterhälften) an, intrazisternal wurden jeweils 4

Schafe und Ziegen, also insgesamt 8 Tiere (16 Euterhälften) geimpft. Um einen

besseren Überblick über die Situation im gesamten Betrieb zu geben, wurde bei der

graphischen Darstellung der Prävalenzentwicklungen jeweils zusätzlich die

Entwicklung aller, also nicht nur der durchgängig beprobten Tiere im Bestand

berücksichtigt. Zu den Impfgruppenvergleichen, Tierartvergleichen sowie Vergleichen

S. aureus-positiver und –negativer Milchproben wurden stets alle jeweils im Betrieb

vorhandenen Tiere herangezogen. Angaben zu den genauen Tierzahlen in den

Betrieben zum jeweiligen Beprobungszeitpunkt finden sich in Kapitel 9.1.

4.3.1 Betrieb A

4.3.1.1 Impfreaktionen

In Betrieb A kam es in den ersten Tagen nach der ersten Vakzination zu einem

starken Rückgang der Herdenmilchleistung, dessen Gipfel mit ca. -30% am dritten

Tag p. vacc. erreicht wurde. Das Allgemeinbefinden der geimpften Tiere war

insgesamt als ggr. bis mgr. gestört zu bezeichnen, einige wenige Tiere,

Ergebnisse

79

insbesondere in der Gruppe der intrazisternal geimpften Tiere, zeigten eine erhöhte

Körperinnentemperatur bis 40,7°C. Veränderungen am Euter oder Schwellungen an

der Applikationsstelle wurden nicht beobachtet.

Nach der zweiten Vakzination kam es nur zu einem geringen Abfall der

Herdenmilchleistung und ggr. gestörtem Allgemeinbefinden einzelner Tiere. Eine

Ziege, der die Vakzine intrazisternal verabreicht worden war, verendete infolge einer

beidseitigen gangränösen Mastitis. Da keine Sektion durchgeführt wurde, konnte

diese Diagnose allerdings nicht abgesichert werden.

Die Boosterimpfung, die ausschließlich subkutan durchgeführt wurde, rief weder

Störungen des Allgemeinbefindens der Tiere noch einen merklichen

Milchleistungsrückgang hervor.

4.3.1.2 S. aureus-Prävalenz

4.3.1.2.1 Entwicklung im gesamten Tierbestand

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

1 (1

.Impf

ung) 2

3 (2

.Impf

ung) 4 5 6 7

8 (L

amm

ung) 9

Beprobungszeitpunkte

S.a

ureu

s-P

räva

lenz

durchgängig beprobte Tiere

alle Tiere im Bestand

Abbildung 4.1: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in Betrieb A bei Betrachtung

ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h. durchgängig beprobten Tiere bzw. aller

zum jeweiligen Zeitpunkt im Bestand befindlichen Tiere

Ergebnisse

80

Die S. aureus-Prävalenz in Betrieb A stieg nach der ersten Vakzination zunächst

signifikant an und sank anschließend bis zum Trockenstellen wieder bis auf einige

„Dauerausscheider“, d.h. Tiere, die zu jedem Beprobungszeitpunkt positiv getestet

wurden, ab.

Nach der Lammung bzw. der Boosterimpfung kam es zu einem erneuten

signifikanten Anstieg der S. aureus-Prävalenz.


Beprobungszeitpunkte im Betrieb A auf Tier- bzw. Euterhälftenbasis (McNemar-Test)

Zeitpunkte 1 2 3 4 5 6 7 8

1 (1.Impfung)

2 0,00230,0013

3 (2.Impfung) n.s. 0,0013n.s. 0,0008

4 n.s. 0,0013 k.d.Pn.s. 0,0008 k.d.P

5 n.s. 0,0013 k.d.P k.d.Pn.s. 0,0008 k.d.P k.d.P

6 n.s. 0,0008 n.s. n.s. n.s.n.s. 0,0005 n.s. n.s. n.s.

7 n.s. 0,0013 k.d.P k.d.P k.d.P. n.s.n.s. 0,0008 k.d.P k.d.P k.d.P. n.s.

8 (Lammung) n.s. 0,0045 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.n.s. 0,0027 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

9 n.s. n.s 0,0082 0,0082 0,0082 0,0047 0,0082 0,03390,0348 n.s 0,0047 0,0047 0,0047 0,0027 0,0047 0,0196

k.d.P. = keine diskordanten Paare, d.h. jedes Tier wies bei beiden zu vergleichenden

Beprobungszeitpunkten den identischen S. aureus-Status auf

n.s. = nicht signifikant

Ergebnisse

81

4.3.1.2.2 Entwicklung in der Impfgruppe s.c.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

1 (1

.Impfu

ng) 2

3 (2

.Impfu

ng) 4 5 6 7

8 (L

ammung

) 9


S.a

ureu

s-P

räva

lenz


alle Tiere im Bestand (s.c.)

Abbildung 4.2: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe s.c. des

Betriebes A bei Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h.

durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe s.c.

angehörenden Tiere

In der Impfgruppe s.c. des Betriebes A zeigte sich eine ähnliche Entwicklung wie bei

Betrachtung des Gesamtbestandes. Nach der ersten Impfung erfolgte ein

signifikanter Anstieg der S. aureus-Tier- (p=0,0023) sowie -Euterhälftenprävalenz

(p=0,0013). Ab dem dritten Beprobungszeitpunkt bis zum Trockenstellen gab es bei

Berücksichtigung nur der durchgängig beprobten Tiere keine positiv getesteten Tiere

mehr, so dass eine statistische Evaluierung nicht möglich war. Bei Betrachtung aller

im Bestand vorhandenen Tiere erfolgte im gleichen Zeitraum eine deutliche

Reduktion auf nur eine Dauerausscheiderin, welche vor Beendigung des Versuchs

der Schlachtung zugeführt wurde.

Nach der Lammung traten auch in der Impfgruppe s.c. erneut S. aureus-positive

Tiere auf. Allerdings war die Tier- (2:8: p=0,0023; 2:9: p=0,0209) und die

Ergebnisse

82

Euterhälftenprävalenz (2:8: p=0,0013; 2:9: p=0,0290) signifikant niedriger als dies

zum Beprobungszeitpunkt 2 der Fall war.

4.3.1.2.3 Entwicklung in der Impfgruppe i.z.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

1 (1

.Impf

ung) 2

3 (2

.Impf

ung) 4 5 6 7

8 (L

amm

ung) 9


S.a

ureu

s-P

räva

lenz


alle Tiere im Bestand (i.z.)

Abbildung 4.3: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe i.z. des

Betriebes A bei Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h.

durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe i.z.

angehörenden Tiere

In der Impfgruppe i.z. bewegte sich die S. aureus-Prävalenz stets auf einem hohen,

relativ konstanten Niveau. Unter Berücksichtigung aller dieser Gruppe zum jeweiligen

Zeitpunkt angehörenden Tiere gab es nach der Impfung Hinweise auf einen Anstieg

der Prävalenz. Der Abfall, der in Abbildung 4.3 für alle Tiere noch vor dem

Trockenstellen zu erkennen ist, wurde unter anderem durch die Schlachtung

einzelner Ausscheiderinnen herbeigeführt.

Auch in der Impfgruppe i.z. konnte nach der Lammung zum Beprobungszeitpunkt 9

ein Anstieg der S. aureus-Prävalenz verzeichnet werden, der auf Tierebene zu einem

signifikanten Unterschied gegenüber Zeitpunkt 6 (6:9: p=0,0455), auf Ebene der

Ergebnisse

83

Euterhälften zu einem solchen zu den Zeitpunkten 3, 4, 5, 7 und 8 (3:9, 4:9, 5:9, 7:9,

8:9: p=0,0455) sowie 6 (6:9: p=0,0253) führte.

4.3.1.2.4 Impfgruppenvergleich

Mit Ausnahme des zweiten Beprobungszeitpunktes lag die S. aureus-Prävalenz in

der Impfgruppe i.z. zu allen Beprobungszeitpunkten über der Prävalenz in der

subkutanen Impfgruppe, wie in Abbildung 4.4 zu sehen ist. Zu den Zeitpunkten 3, 4,

5, 7 und 9 unterschieden sich die Prävalenzen jeweils signifikant (p-Werte siehe

Tabelle 4.4).

Tabelle 4.4: S. aureus-Prävalenzen der Tiere (T) sowie Euterhälften (EH) der

Impfgruppen des Betriebes A und Ergebnisse der Prävalenzvergleiche zwischen den

Impfgruppen (Chi-Quadrat- bzw. Fischer’s exact Test)

Zeitpunkte p-Wert (T) p-Wert (EH)Impfgruppe s.c. Impfgruppe i.z. Impfgruppe s.c. Impfgruppe i.z.

1 (1.Impfung) 3,7% 13,3% n.s. 6,7% 6,7% n.s.2 29,1% 20,0% n.s. 15,5% 13,3% n.s.

3 (2.Impfung) 1,8% 26,7% 0,0061 0,9% 16,7% 0,00174 1,8% 30,8% 0,0037 1,8% 19,2% 0,00295 1,8% 30,8% 0,0037 1,8% 15,4% 0,01246 1,8% 16,7% n.s. 1,8% 8,3% n.s.7 1,8% 25,0% 0,0157 1,8% 12,5% 0,04

8 (Lammung) 2,9% 18,2% n.s. 2,2% 9,1% n.s.9 7,5% 45,5% 0,0038 4,5% 27,3% 0,0023

S.aureus -Tierprävalenz S.aureus -Euterhälftenprävalenz

Ergebnisse

84

0%5%

10%15%20%25%30%35%40%45%50%

1 (1

.Impf

ung) 2

3 (2

.Impf

ung) 4 5 6 7

8 (L

amm

ung) 9


S.a

ureu

s-P

räva

lenz

Impfgruppe s.c.

Impfgruppe i.z.

Abbildung 4.4: Vergleich der S. aureus-Tierprävalenzen der Impfgruppen s.c. und i.z.

des Betriebes A

signifikanter Unterschied zwischen den Impfgruppen (p < 0,05)

hochsignifikanter Unterschied zwischen den Impfgruppen (p < 0,01)

4.3.1.3 Gehalt an somatischen Zellen



Wertes (rechts) der Milch im gesamten Tierbestand des Betriebes A

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0

1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung) 4


Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

Ergebnisse

85

Bereits nach der ersten Impfung gab es Hinweise auf ein Absinken des somatischen

Zellgehaltes der Milch der Tiere des Betriebes A. Die niedrigsten Werte wurden zum

Beprobungszeitpunkt 3 (Zweitimpfung) ermittelt, dieser unterschied sich signifikant

von den Zeitpunkten 1, 2 und 4 (p-Werte siehe Tabelle 4.5). Bei der 4.

Probenentnahme, d.h. nach der zweiten Vakzination, stieg der Gehalt an

somatischen Zellen wieder signifikant an.

Die CMT-Werte, die ab dem 5. Beprobungszeitpunkt ermittelt wurden, sanken bis

zum Trockenstellen, d.h. Zeitpunkt 7, kontinuierlich und signifikant ab (Tabelle 4.6).

Nach der Lammung (Zeitpunkt 8) wurden die niedrigsten CMT-Werte im Betrieb A

gemessen. Zum Zeitpunkt 9 erfolgte zwar ein deutlicher Anstieg, jedoch lag der hier

ermittelte Wert immer noch signifikant niedriger als die zu den Zeitpunkten 5, 6 und 7

gemessenen.

Tabelle 4.5: Ergebnisse der Zeitpunktvergleiche bzgl. des somatischen Zellgehaltes

der Milch aller Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung) 41 (1.Impfung) n.s. < 0,0001 n.s.

2 n.s. 0,0008 n.s.3 (2.Impfung) < 0,0001 0,0008 0,0245

4 n.s. n.s. 0,0245

Tabelle 4.6: Ergebnisse der Zeitpunktvergleiche bzgl. der CMT-Werte der Milch aller

Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 5 6 7 8 (Lammung) 95 0,0194 < 0,0001 < 0,0001 < 0,00016 0,0194 0,0023 < 0,0001 < 0,00017 < 0,0001 0,0023 < 0,0001 < 0,0001

8 (Lammung) < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,00019 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

Ergebnisse

86



Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe s.c. des Betriebes A

Die Entwicklung des Gehaltes an somatischen Zellen in der Impfgruppe s.c. des

Betriebes A spiegelt den Verlauf im Gesamtbestand wider. Auch hier war zunächst

ein Absinken des Zellgehalts bis zum Beprobungszeitpunkt 3 zu beobachten, gefolgt

von einem erneuten Anstieg der Werte zum Beprobungszeitpunkt 4. Der zu diesem

Zeitpunkt ermittelte Wert lag aber immer noch signifikant unter dem bei der

Erstimpfung gemessenen. Der zum Zeitpunkt 3 gemessene Zellgehalt war wiederum

gegenüber den Zeitpunkten 1, 2 und 4 signifikant erniedrigt. Die signifikanten p-

Werte sind in Tabelle 4.7 dargestellt.

Die CMT-Werte sanken auch hier zunächst bis zum Trockenstellen ab und erreichten

den niedrigsten Wert bei der ersten Beprobung nach der Lammung, um

anschließend wieder anzusteigen; allerdings auf ein Niveau, das deutlich unter den

vor der Lammung ermittelten Werten lag. Die Werte der Zeitpunkte unterschieden

sich jeweils signifikant voneinander, wie in Tabelle 4.8 zu sehen ist.

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

Ergebnisse

87


der Milch der subkutan geimpften Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung) 41 (1.Impfung) n.s. < 0,0001 0,0015

2 n.s. < 0,0001 n.s.3 (2.Impfung) < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

4 0,0015 n.s. < 0,0001

Tabelle 4.8: Ergebnisse der Zeitpunktvergleiche bzgl. der CMT-Werte der Milch der

subkutan geimpften Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 5 6 7 8 (Lammung) 95 0,0213 0,0001 < 0,0001 < 0,00016 0,0213 0,0082 < 0,0001 < 0,00017 0,0001 0,0082 < 0,0001 < 0,0001

8 (Lammung) < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,00019 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001



Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe i.z. des Betriebes A

Der Milchzellgehalt der intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes A erreichte am

dritten Beprobungszeitpunkt den höchsten Wert. Dieser unterschied sich von den für

die Zeitpunkte 1, 2 und 4 ermittelten Werten jeweils signifikant (Tabelle 4.9).

Dementsprechend folgte zum Zeitpunkt 4 eine erneute Reduktion des Zellgehaltes.

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

Ergebnisse

88

Bei den CMT-Werten gab es bis zum Trockenstellen lediglich Hinweise auf

Absenkung. Nach der Lammung wurde der niedrigste Wert ermittelt, der sich von

den Werten der anderen Beprobungszeitpunkte jeweils signifikant unterschied. Der

zum Beprobungszeitpunkt 9 ermittelte Wert lag wiederum deutlich höher, allerdings

noch signifikant niedriger als zum Zeitpunkt 5 (p-Werte siehe Tabelle 4.10).


der Milch der intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank

test)

Zeitpunkte 1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung) 41 (1.Impfung) n.s. 0,0074 n.s.

2 n.s. 0,0405 n.s.3 (2.Impfung) 0,0074 0,0405 0,0467

4 n.s. n.s. 0,0467


intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes A (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 5 6 7 8 (Lammung) 95 n.s. n.s. < 0,0001 0,04616 n.s. n.s. 0,0002 n.s.7 n.s. n.s. 0,0006 n.s.

8 (Lammung) < 0,0001 0,0002 0,0006 0,00239 0,0461 n.s. n.s. 0,0023

Ergebnisse

89



(links) und intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes A


intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes A

hochsignifikanter Unterschied zwischen den Impfgruppen (p < 0,01)

Vergleicht man die Entwicklungen des somatischen Zellgehaltes in den beiden

Impfgruppen, so zeigt sich während der ersten 3 Beprobungszeitpunkte eine nahezu

gegenläufige Entwicklung (Abbildung 4.8). Sanken die Werte in der Impfgruppe s.c.

bis zum Zeitpunkt 3 ab, so stiegen sie in der Impfgruppe i.z. an. Am

Beprobungszeitpunkt 3 unterschieden sich die Werte beider Gruppen signifikant

voneinander (p < 0,0001).

10,0

100,0

1000,0

10000,0



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

10,0

100,0

1000,0

10000,0



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

Ergebnisse

90

Die Entwicklung der CMT-Werte verlief in beiden Gruppen eher parallel. Ein

signifikanter Unterschied ergab sich nur zum Zeitpunkt 9, zu dem die Ergebnisse der

intrazisternal geimpften Tiere mit einem p-Wert von 0,0038 deutlich über denen der

subkutan geimpften lagen.

4.3.1.3.5 Vergleich S. aureus -positiver und -negativer Milchproben

Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei den S. aureus-positiven und -negativen

Tieren nicht stets um dieselben Tiere handelte, war eine statistische Auswertung der

Entwicklung des somatischen Zellgehaltes in diesen „Gruppen“ nicht möglich.

Beim Vergleich der Zellgehalte der Milch S. aureus-positiver und –negativer

Milchproben des Betriebes A fällt auf, dass die Werte für die positiven Proben mit

Ausnahme des Zeitpunktes 5 stets über den Werten der negativen Proben liegen. Zu

den Beprobungszeitpunkten 2, 3, 4, 6 und 9 war dieser Unterschied signifikant (p-

Werte siehe Tabelle 4.11). Die Entwicklung des somatischen Zellgehalts bei den

S. aureus-negativen Tieren spiegelt den Verlauf im Gesamtbestand wider, während

die somatischen Zellgehalte der S. aureus-positiven Milchproben nach der ersten

Vakzination zunächst relativ konstant blieben und erst bei der Probenentnahme nach

der zweiten Vakzination (Zeitpunkt 4) deutlich anstiegen.

Die CMT-Werte in S. aureus-negativen Proben sanken zum Trockenstellen

geringfügig ab, während alle S. aureus-positiven Milchproben zu den Zeitpunkten 5,

6 und 7 einen CMT-Wert von 3,0 aufwiesen. Nach der Lammung sanken die Werte in

beiden Gruppen zunächst ab, um bei der zweiten Beprobung nach der Lammung

(Zeitpunkt 9) wieder anzusteigen und im Falle der S. aureus-positiven Milchproben

schon wieder fast identische Werte zu erreichen wie vor der Lammung.

Ergebnisse

91


und -positiver (rechts) Milchproben des Betriebes A

Abbildung 4.11: Vergleich der CMT-Werte S. aureus-negativer (links) und -positiver

(rechts) Milchproben des Betriebes A

signifikanter Unterschied in Abhängigkeit vom S. aureus-Nachweis (p < 0,05)

hochsignifikanter Unterschied in Abhängigkeit vom S. aureus-Nachweis

(p < 0,01)

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

5 6 7 8 (Lammung) 9


CM

T-S

core

Ergebnisse

92


bzw. der CMT-Werte (Zeitpunkt 5 bis 9) S. aureus-positiver und –negativer

Milchproben des Betriebes A sowie Ergebnisse der entsprechenden Vergleiche zum

jeweiligen Zeitpunkt (Wilcoxon’s two sample test)

Zeitpunkte p-WertS.aureus pos. S.aureus neg.

1 (1.Impfung) 1042,5 940 n.s.2 1174 709 0,0098

3 (2.Impfung) 1221 372 0,01644 2680 610 0,00565 3,0 3,0 n.s.6 3,0 2,5 0,03957 3,0 2,5 n.s.

8 (Lammung) 1,0 0,5 n.s.9 3,0 1,3 0,0022

Median

4.3.2 Betrieb B


Bei den Tieren des Betriebes B wurden in Folge der Vakzinationen mit der

stallspezifischen Vakzine keine unerwünschten Nebenwirkungen der

Impfstoffapplikation festgestellt.

Ergebnisse

93



0%

5%

10%

15%

20%

25%

1 (1

.Impfu

ng) 2

3 (2

.Impfu

ng) 4 5 6

7 (L

ammung

) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz


alle Tiere im Bestand

Abbildung 4.12: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in Betrieb B bei Betrach-

tung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h. durchgängig beprobten Tiere bzw.

aller zum jeweiligen Zeitpunkt im Bestand befindlichen Tiere

Im Tierbestand des Betriebes B kam es nach der ersten Vakzination zu einem

signifikanten Absinken der S. aureus-Prävalenz, welchem allerdings sofort ein

zumindest auf Euterhälftenbasis signifikanter Anstieg folgte (Beprobungszeitpunkt 3).

Nach der zweiten Vakzination sank die Anzahl S. aureus-positiver Tiere dann erneut

ab, so dass zum Trockenstellen hin (Zeitpunkte 5 und 6) eine signifikant niedrigere

Prävalenz vorlag als zum Beprobungszeitpunkt 3. Auch nach der Lammung stieg die

S. aureus-Prävalenz nicht wieder an, lediglich die so genannten „Dauerausscheider“

(zwei Ziegen) wurden weiterhin positiv getestet. Die signifikanten p-Werte der

Zeitpunktvergleiche sind in Tabelle 4.12 dargestellt.

Ergebnisse

94


Beprobungszeitpunkte im Betrieb B auf Tier- bzw. Euterhälftenbasis (McNemar-Test)

Zeitpunkte 1 2 3 4 5 6 7

1 (1.Impfung)

2 0,02530,0253

3 (2.Impfung) n.s. n.s.n.s. 0,0455

4 0,0253 k.d.P. n.s.n.s. n.s. n.s.

5 0,0082 n.s. 0,0253 n.s.0,0082 n.s. 0,0143 n.s.

6 0,0082 n.s. n.s. n.s. n.s.0,0082 n.s. 0,0339 n.s. n.s.

7 (Lammung) 0,0082 n.s. 0,0253 n.s. n.s. n.s.0,0082 n.s. 0,0143 n.s. n.s. n.s.

8 0,0082 n.s. 0,0253 n.s. n.s. n.s. k.d.P.0,0339 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s.

k.d.P = keine diskordanten Paare, d.h. jedes Tier wies bei beiden zu vergleichenden

Beprobungszeitpunkten den identischen S. aureus-Status auf

n.s. = nicht signifikant

Ergebnisse

95


0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

20%

1 (1

.Impf

ung) 2

3 (2

.Impf

ung) 4 5 6

7 (L

amm

ung) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz


alle Tiere im Bestand (s.c.)

Abbildung 4.13: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe s.c. des

Betriebes B bei Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten, d.h.

durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe s.c.

angehörenden Tiere

Die Entwicklung der S. aureus-Prävalenz in der Impfgruppe s.c. des Betriebes B

spiegelt den Verlauf im Gesamtbestand wider. Signifikante Unterschiede waren hier

allerdings nur zwischen Beprobungszeitpunkt 1 und den Zeitpunkten 5, 6, 7 sowie 8

(1:5, 1:6, 1:7, 1:8: p=0,0455 sowohl auf Tier- als auch auf Euterhälftenbasis) und bei

Betrachtung der Euterhälften zusätzlich zwischen Zeitpunkt 3 und 5, 7 sowie 8 (3:5,

3:7, 3:8: p=0,0455) gegeben.

Ergebnisse

96


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

1 (1

.Impfu

ng) 2

3 (2

.Impfu

ng) 4 5 6

7 (L

ammung

) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz


alle Tiere im Bestand (i.z.)

Abbildung 4.14: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz in der Impfgruppe i.z. des


durchgängig beprobten Tiere bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe i.z.

angehörenden Tiere

In der Impfgruppe i.z. des Betriebes B nahm die S. aureus-Prävalenz den gleichen

Verlauf wie bereits für den Gesamtbestand und die Impfgruppe s.c. beschrieben

(siehe Abbildung 4.14), jedoch ohne signifikante Unterschiede zwischen den

Zeitpunkten.


Die S. aureus-Prävalenz in der Impfgruppe i.z. lag auf Tierbasis zu keinem

Beprobungszeitpunkt signifikant über der in der Impfgruppe s.c. (Abbildung 4.15).

Lediglich auf Basis der Euterhälften betrachtet lieferte der Impfgruppenvergleich am

Beprobungszeitpunkt 4 mit einem p-Wert von 0,0234 ein signifikantes Ergebnis.

Ergebnisse

97

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

1 (1

.Impf

ung) 2

3 (2

.Impf

ung) 4 5 6

7 (L

amm

ung) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz

Impfgruppe s.c.

Impfgruppe i.z.

Abbildung 4.15: Vergleich der S. aureus-Tierprävalenzen der Impfgruppen s.c. und

i.z. des Betriebes B

4.3.2.2.5 Entwicklung im Schafbestand

0%

5%

10%

15%

20%

25%

1 (1

.Impf

ung) 2

3 (2

.Impf

ung) 4 5 6

7 (L

amm

ung) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz

durchgängig beprobte Schafe

alle Schafe im Bestand

Abbildung 4.16: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz im Schafbestand des


Ergebnisse

98

durchgängig beprobten Schafe bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt im Betrieb

befindlichen Schafe

Auch im Schafbestand des Betriebes B erinnert der Verlauf der S. aureus-Prävalenz

zunächst an den im Gesamtbestand beobachteten Verlauf. Zum

Beprobungszeitpunkt 5 wurde keines der Schafe positiv getestet. Allerdings wurden

vor dem Trockenstellen (Zeitpunkt 6) doch noch zwei Tiere als Ausscheider

identifiziert, was sich nach der Lammung nicht mehr bestätigte.

Die Beprobungszeitpunkte 5, 7 und 8 konnten aufgrund der fehlenden positiv

getesteten Schafe nicht in die statistische Evaluierung einbezogen werden. Keiner

der durchgeführten Zeitpunktvergleiche lieferte für den Schafbestand ein

signifikantes Ergebnis.

4.3.2.2.6 Entwicklung im Ziegenbestand

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

1 (1

.Impfu

ng) 2

3 (2

.Impfu

ng) 4 5 6

7 (L

ammung

) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz

durchgängig beprobte Ziegen

alle Ziegen im Bestand

Abbildung 4.17: Entwicklung der S. aureus-Tierprävalenz im Ziegenbestand des


durchgängig beprobten Ziegen bzw. aller zum jeweiligen Zeitpunkt im Betrieb

befindlichen Ziegen

Ergebnisse

99

Im Ziegenbestand erfolgte zunächst die gleiche Entwicklung der S. aureus-Prävalenz

wie bereits für den Gesamtbestand, die Impfgruppen und die Schafe beschrieben.

Nachdem die Zahl der positiv getesteten Tiere nach der Zweitimpfung auf zwei Tiere

zurückgegangen war, wurde vor dem Trockenstellen (Beprobungszeitpunkt 6) in

keiner Milchprobe der Ziegen mehr S. aureus nachgewiesen. Nach der Lammung

wurden allerdings zwei bereits als Ausscheider bekannte Ziegen wiederum als

solche identifiziert.

Mangels positiv getesteter Ziegen konnte Beprobungszeitpunkt 6 nicht in die

statistische Auswertung einbezogen werden. Auf Tierbasis lieferte keiner der

durchgeführten Zeitpunktvergleiche ein signifikantes Ergebnis, auf Basis der

Euterhälften lag die S. aureus-Prävalenz zum Zeitpunkt 3 jeweils mit einem p-Wert

von 0,0455 signifikant über der der Zeitpunkte 5 und 7.

4.3.2.2.7 Tierartvergleich

Der Vergleich der S. aureus-Prävalenz bei Schafen und Ziegen des Betriebes B

lieferte weder auf Tier- noch auf Euterhälftenbasis zu einem der

Beprobungszeitpunkte ein signifikantes Ergebnis.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

1 (1

.Impfu

ng) 2

3 (2

.Impfu

ng) 4 5 6

7 (L

ammung

) 8


S.a

ureu

s-P

räva

lenz

Schafe

Ziegen

Abbildung 4.18: Vergleich der S. aureus-Tierprävalenzen der Tierarten (Schaf/Ziege)

des Betriebes B

Ergebnisse

100




Wertes (rechts) der Milch im gesamten Tierbestand des Betriebes B

Im Betrieb B stieg der somatische Zellgehalt der Milch nach der ersten Vakzination

signifikant an. Zum dritten Beprobungstermin hin sanken die Werte zwar wieder

deutlich ab, lagen aber noch immer signifikant über den bei der ersten Impfung

ermittelten Werten (p-Werte siehe Tabelle 4.13).

Die CMT-Werte stiegen zum Trockenstellen hin etwas an, signifikant war dieser

Unterschied zwischen Beprobungszeitpunkt 5 und 6. Nach der Lammung lagen die

CMT-Werte deutlich unter den vor dem Trockenstellen ermittelten Werten, und die

Werte vom Beprobungszeitpunkt 8, d.h. ca. sechs Wochen p.p. waren signifikant

niedriger als die bei der Boosterimpfung innerhalb der ersten 14 Tage nach der

Lammung. Die p-Werte dieser Zeitpunktvergleiche sind in Tabelle 4.14 dargestellt.


der Milch der Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung)1 (1.Impfung) < 0,0001 < 0,0001

2 < 0,0001 0,00183 (2.Impfung) < 0,0001 0,0018

1

10

100

1000

10000

1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung)


Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

101


Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 4 5 6 7 (Lammung) 84 n.s. n.s. < 0,0001 < 0,00015 n.s. 0,0023 0,0003 < 0,00016 n.s. 0,0023 < 0,0001 < 0,0001

7 (Lammung) < 0,0001 0,0024 < 0,0001 0,00038 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0003



Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe s.c. des Betriebes B

Die Entwicklung des Gehaltes an somatischen Zellen der Milch in der Impfgruppe

s.c. des Betriebes B spiegelt den Verlauf im Gesamtbestand wider. Auch hier folgte

auf einen signifikanten Anstieg nach der ersten Vakzination ein deutlicher Abfall,

dennoch blieb aber der Wert gegenüber der ersten Beprobung signifikant erhöht.

Bei den CMT-Werten kam es vom Beprobungszeitpunkt 5 zum Trockenstellen

(Zeitpunkt 6) hin zu einem signifikanten Anstieg. Nach der Lammung lagen auch hier

die Werte sehr deutlich unter den zuvor ermittelten und waren zum

Beprobungszeitpunkt 8 gegenüber den Werten vom Zeitpunkt 7 noch einmal

signifikant abgesunken. Die p-Werte der Zeitpunktvergleiche in der Impfgruppe s.c.

zeigen Tabelle 4.15 und Tabelle 4.16.

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

102


der Milch der subkutan geimpften Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)


2 < 0,0001 0,03173 (2.Impfung) < 0,0001 0,0317


subkutan geimpften Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 4 5 6 7 (Lammung) 84 n.s. n.s. < 0,0001 < 0,00015 n.s. 0,0172 0,0037 < 0,00016 n.s. 0,0172 0,0003 < 0,0001

7 (Lammung) < 0,0001 0,0037 0,0003 < 0,00018 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001



Wertes (rechts) der Milch in der Impfgruppe i.z. des Betriebes B

Auch die Entwicklung in der Impfgruppe i.z. des Betriebes B folgte prinzipiell der

Entwicklung im Gesamtbestand. Nach der ersten Impfung erfolgte ein signifikanter

Anstieg des Gehaltes an somatischen Zellen. Die zum Beprobungszeitpunkt 3

ermittelten Werte blieben gegenüber den Werten der ersten Beprobung weiterhin

signifikant erhöht.

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

103

Die CMT-Werte stiegen zum Trockenstellen hin kontinuierlich, wenn auch nicht

signifikant, an. Nach der Lammung kam es zwar zu einem Absinken der Werte,

jedoch bestand eine Signifikanz nur beim Vergleich der Werte des Zeitpunktes 6 mit

denen des Zeitpunktes 7. Eine erneute Reduktion der Werte zum Zeitpunkt 8 führte

dann zu einer signifikanten Absenkung verglichen mit den Beprobungszeitpunkten 4,

5 und 6, wie in Tabelle 4.18 dargestellt.


der Milch der intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank

test)

Zeitpunkte 1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung)1 (1.Impfung) 0,0006 0,0182

2 0,0006 n.s.3 (2.Impfung) 0,0182 n.s.


intrazisternal geimpften Tiere des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 4 5 6 7 (Lammung) 84 n.s. n.s. n.s. 0,00205 n.s. n.s. n.s. 0,00106 n.s. n.s. 0,0166 0,0010

7 (Lammung) n.s. n.s. 0,0166 n.s.8 0,0020 0,0010 0,0010 n.s.

Ergebnisse

104



(links) und intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes B


intrazisternal (rechts) geimpften Tiere des Betriebes B

signifikanter Unterschied zwischen den Impfgruppen (p < 0,05)

Beim Vergleich der somatischen Zellgehalte zu den Beprobungszeitpunkten 1 bis 4

in den Impfgruppen s.c. und i.z. konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt

werden.

Die CMT-Werte stiegen in beiden Gruppen zum Trockenstellen hin an, in der

Impfgruppe i.z. allerdings deutlicher als in der Impfgruppe s.c., was durch den

signifikant niedrigeren CMT-Wert der letzteren zum Zeitpunkt 6 bestätigt wird

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

105

(p=0,0389). Auch nach der Lammung zum Beprobungszeitpunkt 8 lagen die CMT-

Werte in der Impfgruppe s.c. signifikant unter denen der Impfgruppe i.z. (p=0,0103).

4.3.2.3.5 Entwicklung im Schafbestand


Wertes (rechts) der Milch der Schafe des Betriebes B

Der Milchzellgehalt der Schafe des Betriebes B stieg nach der Vakzination zum

Beprobungszeitpunkt 3 signifikant an (p-Werte siehe Tabelle 4.19).

Der CMT-Wert stieg bis zum Trockenstellen ebenfalls signifikant an, so dass die

Vergleiche der Zeitpunkte 4 und 6 sowie 5 und 6 jeweils signifikante Ergebnisse

lieferten. Die Werte der Beprobungszeitpunkte nach der Lammung (7 und 8) lagen

signifikant niedriger als die der Zeitpunkte 5 und 6, die Werte zum Zeitpunkt 4 waren

allerdings nur gegenüber denen des Beprobungszeitpunktes 8 deutlich erhöht. Die p-

Werte der Zeitpunktvergleiche sind in Tabelle 4.20 dargestellt.


der Milch der Schafe des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 1 (1.Impfung) 2 3 (2.Impfung)1 (1.Impfung) n.s. 0,0227

2 n.s. 0,00673 (2.Impfung) 0,0227 0,0067

1

10

100

1000

10000



Zellz

ahl x

100

0/m

l

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8

BeprobungszeitpunkteC

MT

-Sco

re

Ergebnisse

106


Schafe des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 4 5 6 7 (Lammung) 84 n.s. 0,0347 n.s. 0,00075 n.s. 0,0051 0,0490 < 0,00016 0,0347 0,0051 0,0001 < 0,0001

7 (Lammung) n.s. 0,0490 0,0001 n.s.8 0,0007 < 0,0001 < 0,0001 n.s.

4.3.2.3.6 Entwicklung im Ziegenbestand


Wertes (rechts) der Milch der Ziegen des Betriebes B

Bei den Ziegen des Betriebes B führte die Erstimpfung zu einem sehr deutlichen

Anstieg des Gehaltes an somatischen Zellen in der Milch. Auch hier folgte ein

signifikanter Abfall der Werte zum Beprobungszeitpunkt 3, die signifikante Erhöhung

gegenüber Zeitpunkt 1 blieb allerdings erhalten.

Bei den CMT-Werten gab es ausgehend von einem hohen Niveau zum Zeitpunkt 4

Hinweise auf ein Absinken zum Trockenstellen hin. Bereits zur ersten Beprobung

nach der Lammung (Zeitpunkt 7) waren die CMT-Werte signifikant niedriger als noch

vor dem Trockenstellen, zur zweiten Beprobung nach der Lammung (Zeitpunkt 8)

sanken sie allerdings noch stärker ab (p-Werte siehe Tabelle 4.21 und Tabelle 4.22).

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

107


der Milch der Ziegen des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)


2 < 0,0001 < 0,00013 (2.Impfung) < 0,0001 < 0,0001


Ziegen des Betriebes B (Wilcoxon’s signed rank test)

Zeitpunkte 4 5 6 7 (Lammung) 84 n.s. n.s. < 0,0001 < 0,00015 n.s. n.s. 0,0113 < 0,00016 n.s. n.s. 0,0042 < 0,0001

7 (Lammung) < 0,0001 0,0113 0,0042 0,00418 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0041

4.3.2.3.7 Tierartvergleich

Abbildung 4.26: Vergleich der somatischen Zellgehalte der Milch der Schafe (links)

und Ziegen (rechts) des Betriebes B

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

Ergebnisse

108

Abbildung 4.27: Vergleich der CMT-Werte der Milch der Schafe (links) und Ziegen

(rechts) des Betriebes B

hochsignifikanter Unterschied zwischen den Tierarten (p < 0,01)

Ausgehend von einem signifikant niedrigeren Gehalt an somatischen Zellen der

Ziegenmilch des Betriebes B verglichen mit der Schafmilch kehrte sich dieses Bild

nach der ersten Vakzination mit der stallspezifischen S. aureus-Vakzine um, so dass

die Gehalte in der Ziegenmilch zum Beprobungszeitpunkt 2 nun signifikant über

denen in der Schafmilch lagen (siehe Abbildung 4.26). Zum Zeitpunkt 3 war der

Unterschied allerdings nicht mehr signifikant.

Anschließend wiesen die Ziegen des Betriebes B allerdings stets signifikant höhere

CMT-Werte auf als die Schafe, lediglich zum Zeitpunkt 8 war diese Signifikanz nicht

mehr gegeben. Die p-Werte der Tierartvergleiche zu den jeweiligen Zeitpunkten sind

in Tabelle 4.23 dargestellt.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

109


bzw. der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch der Schafe und Ziegen des

Betriebes B sowie Ergebnisse der entsprechenden Vergleiche zum jeweiligen

Zeitpunkt (Wilcoxon’s two sample test)

Zeitpunkte p-WertSchafe Ziegen

1 (1.Impfung) 66,5 29 < 0,00012 82 299 < 0,0001

3 (2.Impfung) 91,5 115 n.s.4 0,0 3,0 < 0,00015 0,5 2,5 0,00046 0,5 2,5 0,0002

7 (Lammung) 0,0 1,0 0,00078 0,0 0,0 n.s.

Median

4.3.2.3.8 Vergleich S. aureus -positiver und negativer Milchproben

Wie bereits für Betrieb A beschrieben war aufgrund der Tatsache, dass es sich bei

den S. aureus-positiven und –negativen Tieren nicht stets um dieselben Tiere

handelte, eine statistische Auswertung der Entwicklung des somatischen

Zellgehaltes in diesen „Gruppen“ nicht möglich.

Die Zellgehalte S. aureus-positiver und -negativer Milchproben unterschieden sich

vor der Erstimpfung nicht signifikant voneinander. Nach einem unterschiedlich

starken Anstieg in beiden Gruppen lagen die Werte der positiven Proben zum

Beprobungszeitpunkt 2 allerdings signifikant über denen der negativen Proben.

Anschließend sanken die Zellgehalte in den S. aureus-positiven Proben stärker

wieder ab als in den -negativen, so dass zum Zeitpunkt 3 wiederum kein signifikanter

Unterschied vorlag.

Die CMT-Werte der S. aureus-positiven Milchproben lagen zu den Zeitpunkten 4, 7

und 8 signifikant über denen der –negativen Milchproben. Zu den

Beprobungszeitpunkten 5, 7 und 8 wiesen alle S. aureus-positiven Milchproben einen

CMT-Wert von 3 auf.

Ergebnisse

110


und -positiver (rechts) Milchproben des Betriebes B

Abbildung 4.29: Vergleich der CMT-Werte S. aureus-negativer (links) und -positiver

(rechts) Milchproben des Betriebes B

signifikanter Unterschied in Abhängigkeit vom S. aureus-Nachweis (p < 0,05)

hochsignifikanter Unterschied in Abhängigkeit vom S. aureus-Nachweis

(p < 0,01)

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

1

10

100

1000

10000



Zel

lzah

l x 1

000/

ml

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4 5 6 7 (Lammung) 8


CM

T-S

core

Ergebnisse

111


bzw. der CMT-Werte (Zeitpunkt 4 bis 8) S. aureus-positiver und –negativer

Milchproben des Betriebes B sowie Ergebnisse der entsprechenden Vergleiche zum

jeweiligen Zeitpunkt (Wilcoxon’s two sample test)

Zeitpunkte p-WertS.aureus pos. S.aureus neg.

1 (1.Impfung) 67,5 51 n.s.2 1355 114,5 0,0098

3 (2.Impfung) 105 96 n.s.4 3,0 1,0 0,02145 3,0 1,0 n.s.6 2,0 1,0 n.s.

7 (Lammung) 3,0 0,0 0,02118 3,0 0,0 0,0013

Median

Diskussion

112

5 Diskussion

5.1 Beurteilung der angewandten Methoden

Für die vorliegende Arbeit wurden in zwei Betrieben die laktierenden Ziegen bzw.

Schafe und Ziegen mit einer stallspezifischen S. aureus-Vakzine geimpft um

herauszufinden, ob eine solche Vakzine entscheidend zu einer Sanierung von Schaf-

und Ziegenbeständen mit bekannter S. aureus-Problematik beitragen kann.

Dementsprechend wurde nach der Impfung auf eine experimentelle Infektion

verzichtet, wie sie jedoch bereits in vielen Impfversuchen bei Rindern und kleinen

Wiederkäuern durchgeführt wurde (DERBYSHIRE 1961; NICKERSON et al. 1993;

AMORENA et al. 1994; LUBY et al. 2007). Aus diesem Grund ist ein Vergleich mit

derartigen Versuchen schwierig.

Die verwendete Vakzine wurde von der Fa. WDT, Garbsen hergestellt und enthielt

eine Suspension inaktivierter S. aureus-Isolate aus den jeweiligen Betrieben, was der

üblichen Form stallspezifischer Vakzinen entspricht. Wie bereits in Kapitel 2.6.3.1

beschrieben kamen in zahlreichen Untersuchungen ebenso zahlreiche weitere

Substanzen als Bestandteil der jeweiligen verwendeten Vakzine zum Einsatz.

Beispielsweise verwendeten NORDHAUG et al. (1994a) und WATSON et al. (1996)

für ihre Versuche an Rindern Vakzinen, die jeweils auch α- und β-Toxoid enthielten.

Bestandteile der Kapsel bzw. der Pseudokapsel von S. aureus verwendeten

AMORENA et al. (1994), GIRAUDO et al. (1997) und TOLLERSRUD et al. (2002) bei

ihren Impfversuchen an Schafen bzw. Rindern. Als weitere Antigene in Vakzinen

gegen S. aureus kamen u.a. der Clumping Faktor (SHKRETA et al. 2004) und

Protein A (NICKERSON et al. 1985; PANKEY et al. 1985) zum Einsatz. Die

genannten Bestandteile sowie einige zugesetzte Adjuvantien, insbesondere

Dextransulfat und FICA (WATSON 1992a; WATSON u. DAVIES 1993; LEE, J. W. et

al. 2005) sollten die Bildung von spezifischen Antikörpern induzieren bzw. verstärken

und somit Toxinwirkungen abschwächen, anti-phagozytäre Wirkungen von Kapsel

und Pseudokapsel mildern, die Anlagerung von S. aureus an Epithelzellen

verhindern sowie die Phagozytose von S. aureus durch das Ausschalten von

Virulenzfaktoren gezielt steigern. Die Steigerung dieser spezifischen Wirkungen

Diskussion

113

konnte bei der hier verwendeten Vakzine mangels entsprechender Bestandteile nicht

erwartet werden.

Neben dem Beitrag zur Betriebssanierung sollte auch überprüft werden, ob eine

intrazisternale Applikation der Vakzine bessere Ergebnisse erzielen kann als die

systemische, d.h. subkutane Verabreichung. Als systemische Variante wurde hier,

gemäß der Angaben des Herstellers, die subkutane Applikation gewählt, da diese

der gängigen Praxis zur Verabreichung von Vakzinen in Schaf- und Ziegenbetrieben

entspricht. Die hier ebenfalls durchgeführte intrazisternale Verabreichung wurde bei

Schafen und Ziegen bereits von DERBYSHIRE und SMITH (1969) sowie

MCDOWELL und WATSON (1974) erprobt, allerdings in der Trockenstehphase.

Auch diese Applikationsform wurde vom Impfstoffhersteller angegeben.

Um mögliche Schädigungen des sekretorischen Gewebes und eine geringere

Milchleistung in der Folgelaktation durch die intrazisternale Applikation in der

Trockenperiode (RYŠÁNEK et al. 1988) zu vermeiden, wurde die Vakzination

bewusst in die Laktationsphase gelegt; auch wenn in den meisten zuvor

durchgeführten Untersuchungen die Impfstoffapplikation während der

Trockenstehphase stattfand, um die kolostrale Antikörperbildung zu beeinflussen

(DERBYSHIRE u. SMITH 1969; CHANG, C. C. et al. 1981; BARRIO et al. 2003). Der

durch die Impfung in der Laktation meist ansteigende Gehalt an somatischen Zellen

(NORDHAUG et al. 1994b) stellt bei Milchkühen aufgrund der

Zellzahlbeschränkungen ein größeres Problem dar als bei kleinen Wiederkäuern, für

die in Europa keine gesetzlichen Regelungen zum somatischen Zellgehalt der Milch

bestehen. Allerdings sind mögliche negative Einflüsse auf die Käseherstellung zu

bedenken (PIRISI et al. 1993).

Der S. aureus-Nachweis wurde in der vorliegenden Untersuchung entweder mittels

kultureller Untersuchung (Zeitpunkte 1 bis 5 sowie Zeitpunkt 9 in Betrieb A und

Zeitpunkt 8 in Betrieb B) der aseptisch entnommenen Milchproben oder mittels einer

S. aureus-spezifischen PCR (Betrieb A Zeitpunkte 6 bis 8, Betrieb B Zeitpunkte 6

und 7) durchgeführt. Bei der Interpretation der S. aureus-Prävalenzen zu den

unterschiedlichen Beprobungszeitpunkten ist daher stets zu bedenken, dass die

Methode, mit der diese bestimmt wurden, nicht immer dieselbe war.

Diskussion

114

Die kulturelle Untersuchung stellt den Goldstandard für den S. aureus-Nachweis dar.

Allerdings ist die Sensitivität für den S. aureus-Nachweis bei einmaliger Beprobung,

wie in dieser Untersuchung zu den jeweiligen Beprobungszeitpunkten durchgeführt,

gemäß SEARS et al. (1990) und ADAMS et al. (1992) eher unbefriedigend (siehe

auch Kapitel 2.5.1.1). Dennoch stellt die einmalige Milchprobenentnahme mit

Verwendung von 10 µl Milch als Inoculum pro Probe ohne vorheriges Einfrieren oder

Zentrifugieren und Ausstreichen des Sediments der Milch die gängige Praxis für die

kulturelle Untersuchung von Milchproben dar, auch wenn größere Inocula oder die

genannten Verfahren die Sensitivität für den S. aureus-Nachweis erhöhen könnten

(VILLANUEVA et al. 1991; ZECCONI et al. 1997; KRÖMKER et al. 2008). Da die

vorliegende Untersuchung darauf abzielte, eine praxistaugliche und somit

finanzierbare Sanierung von Schaf- und Ziegenbetrieben mit S. aureus-Mastitiden zu

erreichen, wurden die üblichen Verfahren für eine kulturelle Untersuchung von

Milchproben angewandt.

Auch die durchgeführte S. aureus-spezifische PCR sollte möglichst praxistauglich

und wenig aufwändig sein, daher wurde hier auf zusätzliche vorherige

Anreicherungskulturen (GILLESPIE u. OLIVER 2005; YAMAGISHI et al. 2007)

verzichtet und die DNA-Isolierung direkt aus der Milch und nicht aus dem Sediment

nach Zentrifugation (KUŹMA et al. 2003; HEIN et al. 2005) durchgeführt, obwohl

diese Maßnahmen die Sensitivität verbessern können. Die Sequenzen der

verwendeten Primer entstammten dem 16 s rRNA-Genabschnitt des coa-Gens.

Ähnliche Primer verwendeten auch SMYTH et al. (2005) für ihre Untersuchungen, in

vielen anderen Studien wurden allerdings Primer aus dem Bereich des nuc-Gens

genutzt (KIM et al. 2001; CREMONESI et al. 2005; GRABER et al. 2007). Die PCR

wird in Kapitel 5.2.1.1 noch näher besprochen.

Die Bestimmung des Gehaltes an somatischen Zellen wurde mittels eines

fluoreszenz-optisch-elektronischen Verfahrens bzw. semiquantitativ mittels CMT

durchgeführt. Das fluoreszenz-optisch-elektronische Verfahren entwickelt sich immer

mehr zur Standardmethode und bietet gerade bei Ziegenmilch Vorteile, da es sich

um eine DNA-spezifische Zellzählung handelt. Diese ist bei Ziegenmilch aufgrund

der apokrinen Sekretion im Euter und der somit anfallenden zytoplasmatischen

Diskussion

115

Partikel für eine ausreichend genaue Zählung vonnöten (PAAPE u. CAPUCO 1997).

Allerdings berichtete HAENLEIN (2002), dass eine Kalibrierung der Gerätschaften

mit Ziegenmilch nötig wäre. Da diese Kalibrierung für die vorliegende Untersuchung

nicht durchgeführt wurde, ist es möglich, dass die Zellgehalte der Ziegenmilchproben

hier tatsächlich um bis zu 24% unter den gemessenen Werten liegen. Nach

CONTRERAS et al. (2007) sollten außerdem das Alter, die Aufbewahrung und die

Temperatur der Milch großen Einfluss auf die mittels fluoreszenz-optisch-

elektronischer Verfahren gemessenen Zellgehalte haben.

Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse von semiquantitativem CMT und quantitativer

Zellzahlbestimmung wurde sowohl bei Schaf- (DEUTZ et al. 1995; BERGONIER u.

BERTHELOT 2003; MAURER u. SCHAEREN 2007a) als auch bei Ziegenmilch

(HARRER 2006; MAURER u. SCHAEREN 2007b) von vielen Autoren als gut

eingestuft. UPADHYAYA und RAO (1993) waren sogar der Ansicht, dass bei Ziegen

der CMT besser zur Mastitiserkennung geeignet wäre als die Leukozytenzahl. Aus

Kostengründen wurde daher hier ab der fünften (Betrieb A) bzw. vierten (Betrieb B)

Beprobung dazu übergegangen, anstatt der quantitativen Zellzahlbestimmung den

CMT durchzuführen.

Auf eine Bestimmung von spezifischen S. aureus-Antikörpern aus Blut oder Milch

wurde in der vorliegenden Untersuchung bewusst verzichtet, auch wenn diese in den

meisten vorangegangenen Impfversuchen gegen S. aureus-Mastitiden zur

Überprüfung des Impferfolges durchgeführt wurde. Zwar konnten bei diesen

Versuchen regelmäßig Anstiege der spezifischen Antikörper-Konzentration v.a. im

Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt werden, jedoch konnten diese Antikörper

S. aureus-Mastitiden nach experimenteller Infektion nicht gänzlich verhindern

(AMORENA et al. 1994; HADIMLI et al. 2005; LUBY et al. 2007; PELLEGRINO et al.

2008). Zusätzlich ist zu bedenken, dass es sich bei der hier durchgeführten Studie

um einen Sanierungsversuch von S. aureus-Problembeständen handelte, so dass

insbesondere chronisch infizierte Tiere vermutlich schon vor der Vakzination

spezifische Antikörper aufwiesen, wie es auch von LEITNER et al. (2000) für

chronisch infizierte Kühe bestätigt wurde. MIDDLETON et al. (2009) konnten nach

Vakzination der Kühe einer Herde mit 3% S. aureus-Prävalenz mit Lysigin® keinen

Diskussion

116

Unterschied zwischen der Impf- und der Kontrollgruppe bezüglich der

Konzentrationen spezifischer IgA, IgG1, IgG2 und IgM in der Milch feststellen.

Bei chronischen Infektionen mit S. aureus ist die Effektivität von Antikörpern aufgrund

der intrazellulären Überlebensfähigkeit des Erregers insgesamt kritisch zu beurteilen

(TALBOT u. LACASSE 2005) und es ist zu überlegen, ob nicht eine Aktivierung der

neutrophilen Granulozyten und eine Steigerung des „respiratory burst“ wichtigere

Faktoren für die Eliminierung von S. aureus aus dem Euter darstellen.

5.2 Beurteilung der Ergebnisse

5.2.1 Beurteilung der Ergebnisse bakteriologischer Untersuchungen

5.2.1.1 Vergleichbarkeit von kultureller Untersuchu ng und PCR

Die in dieser Untersuchung verwendete PCR lieferte nur eine mittlere

Übereinstimmung mit der durchgeführten kulturellen Untersuchung. Elf der

insgesamt 55 untersuchten, kulturell für S. aureus negativen Milchproben ergaben in

der PCR ein positives Ergebnis. Dies war durchaus zu erwarten, da auch

metabolisch inaktive oder abgetötete Bakterien (z.B. durch Antibiotika), die kulturell

nicht mehr anzuzüchten sind, durch die PCR nachgewiesen werden können (KHAN

et al. 1998). Insofern schien die PCR bezüglich der Sensitivität der kulturellen

Untersuchung überlegen zu sein. Auch HEIN et al. (2005) fanden mit ihrer nuc-Gen

spezifischen PCR 19% S. aureus-positiver Rohmilchproben (Kuh- und Ziegenmilch),

die in der mikrobiologischen Untersuchung negativ getestet worden waren. Ebenso

berichteten YAMAGISHI et al. (2007) von einer höheren Sensitivität der von ihnen

durchgeführten S. aureus-spezifischen PCR im Vergleich zur kulturellen

Untersuchung der Milchproben. Hingegen erwiesen sich in der Untersuchung von

KUŹMA et al. (2003) alle kulturell negativ auf S. aureus getesteten Milchproben auch

in der nuc-Gen spezifischen PCR als negativ.

Allerdings konnten mit der in der vorliegenden Untersuchung durchgeführten PCR

nur 55 der insgesamt 71 kulturell als S. aureus-positiv identifizierten Milchproben

mittels der PCR als positiv eingestuft werden. Dies widerspricht deutlich den

Angaben von GRABER et al. (2007), die mit ihrer nuc-Gen spezifischen PCR in allen

Diskussion

117

Kuhmilchproben, die mittels kultureller Untersuchung positiv auf S. aureus getestet

worden waren, ebenfalls S. aureus nachweisen konnten. HEIN et al. (2005)

berichteten von nur 1% falsch negativ getesteter Proben. Beim Vergleich dieser

Ergebnisse mit denen der vorliegenden Untersuchung ist allerdings zu bedenken,

dass für viele der Studien zumindest teilweise künstlich kontaminierte Rohmilch

(KHAN et al. 1998; HEIN et al. 2005) oder auch Milch artifiziell infizierter Kühe (KIM

et al. 2001) oder Schafe (KHAN et al. 1998) verwendet wurde.

Ein möglicher Grund für die relativ große Differenz zwischen kulturell und in der PCR

S. aureus-positiv getesteten Proben ist eine Störung der PCR durch z.B. große

Mengen an somatischen Zellen. Da insbesondere nach der Verabreichung der

stallspezifischen Vakzine die Gehalte an somatischen Zellen in den positiven

Milchproben beider Betriebe stark anstiegen und vor der PCR keine wie von

KUBOTA et al. (2007) proklamierte Trennung von somatischen Zellen und Bakterien

durchgeführt worden war, ist eine Beeinflussung der Ergebnisse der PCR durchaus

denkbar. Weiterhin kommt eine Verfälschung dieser Ergebnisse durch eine starke

kompetitive Mikroflora in Betracht (CREMONESI et al. 2007). Einige der S. aureus-

positiven Milchproben enthielten hier zusätzlich weitere Bakterien wie z.B. CNS,

welche als Störfaktor fungiert haben könnten. GRABER et al. (2007) bezeichneten

allerdings ihre nuc-Gen spezifische PCR für Kuhmilch auch bei gleichzeitigem

Vorhandensein großer Mengen CNS in der Milchprobe als sicher.

Prinzipiell könnte die große Differenz zwischen kulturell und in der PCR S. aureus-

positiv getesteten Proben statt durch eine fehlerhafte PCR auch durch falsch positive

Ergebnisse in der kulturellen Untersuchung begründet werden. Dies ist z.B. möglich,

wenn alle CPS als S. aureus klassifiziert werden, obwohl auch S. intermedius und

S. hyicus koagulase-positiv sein können (CAPURRO et al. 1999). Möglich erscheint

dies auch in der vorliegenden Untersuchung insbesondere, da eines der kulturell als

S. aureus identifizierten, in der PCR jedoch negativ getesteten Isolate in der

Typisierung nicht als S. aureus klassifiziert werden konnte. Da nur wenige Isolate

typisiert wurden, ist nicht auszuschließen, dass noch weitere Proben durch die

kulturelle Untersuchung falsch positiv, durch die PCR hingegen korrekt als S. aureus-

negativ eingestuft wurden.

Diskussion

118

5.2.1.2 Resistenztests

Die in der vorliegenden Untersuchung durchgeführten Resistenztests zeigten eine

nahezu volle Empfänglichkeit aller getesteten S. aureus-Isolate gegenüber den

verwendeten Antibiotika. Von ähnlich guten Ergebnissen berichteten bereits LOLLAI

et al. (2008), die eine sinkende Resistenzrate bei aus Schafmilch isolierten S. aureus

postulierten und weniger als 2% Penicillin-resistente Stämme vorfanden. Auch

MØRK et al. (2005b) wiesen lediglich bei drei von 384 S. aureus-Isolaten aus der

Milch von Fleischschafen eine Penicillin-Resistenz nach. Hingegen hatten AIRES-

DE-SOUSA et al. (2007) bei Schafen und Ziegen noch 33% Penicillin-resistente

S. aureus isoliert. Auch sie fanden, wie es in der vorliegenden Untersuchung der Fall

war, intermediäre Reaktionen auf Erythromycin. VAUTOR et al. (2007) identifizierten

auch zwei Oxacillin-resistente S. aureus-Stämme bei Milchschafen, während die

Isolate der vorliegenden Studie und aus weiteren Untersuchungen stets Oxacillin-

empfindlich waren (MORONI et al. 2005b; AIRES-DE-SOUSA et al. 2007).

Die Beobachtungen von HAVERI et al. (2007), die bei S. aureus-Isolaten aus

bovinen Milchproben eine Tendenz zur Penicillin-Resistenz nachwiesen, soweit

diese von persistent infizierten Kühen stammten, konnten durch die hier

durchgeführten Resistenztests nicht bestätigt werden. Weder die Isolate von

persistent noch von vorübergehend infizierten Schafen oder Ziegen wiesen eine

Penicillin-Resistenz auf.

Offensichtlich beruht der Status von S. aureus-Problembeständen, wie sie hier

untersucht wurden, also nicht auf einer ausgeprägten Antibiotika-Resistenz der im

Bestand vorkommenden S. aureus-Stämme, sondern könnte vielmehr durch

betriebsbedingte Strukturen (Hygiene) bedingt sein.

Weiterhin ist wichtig festzuhalten, dass sich aus keiner der untersuchten Proben von

Schafen und Ziegen Hinweise auf das Vorkommen von MRSA ergaben.

5.2.1.3 Typisierung einiger S. aureus-Isolate mitte ls DNA-Microarray

Dass fast alle der zur Typisierung eingeschickten Isolate unabhängig von

Ursprungsbetrieb oder -tierart als agr_I/ CC133-MSSA [tst1+, entC/L+] identifiziert

werden konnten, spricht für eine geringe Wirts- aber möglicherweise ausgeprägte

Diskussion

119

Gewebespezifität der Isolate. Gleiches wurde von MØRK et al. (2005a) berichtet, die

mittels PFGE nur wenige verschiedene, eng verwandte S. aureus-Isolate bei Kühen,

Schafen und Ziegen in Norwegen nachweisen konnten. Sie schlossen daraus auf

eine geringe Wirts- aber größere anatomische Spezifität, die sich vermutlich zu

Zeiten herausbildete, als mehrere Wiederkäuerspezies zusammen auf einem

landwirtschaftlichen Gehöft gehalten wurden. Entgegen der These der

Gewebespezifität konnten VAUTOR et al. (2009) mit einem Microarray gleiche

S. aureus-Stämme sowohl in der Nase als auch in Milchproben von an subklinischen

Mastitiden erkrankten Schafen identifizieren. Sie fanden keine gewebespezifischen

Virulenzfaktoren. VIMERCATI et al. (2006) konnten entgegen der hier beobachteten

geringen Wirtsspezifität deutliche Unterschiede bei S. aureus-Isolaten von Schafen,

Ziegen und Kühen bzgl. der Koagulase-Subtypen, des Protein A-Gens sowie der

Enterotoxin-Gene feststellen. Auch SCHERRER et al. (2004) fanden deutliche

phänotypische Unterschiede zwischen aus der Tankmilch von Kühen und kleinen

Wiederkäuern isolierten S. aureus-Stämmen.

MORONI et al. (2005b) konnten mit Hilfe der multiple-locus variable number of

tandem repeats analysis (MLVA) bei chronisch mit S. aureus infizierten Ziegen nur

einen Klon nachweisen, der also Eigenschaften eines „kuhassoziierten“ Erregers

aufweisen musste. Da in der vorliegenden Untersuchung ebenfalls ein deutlich

dominierender S. aureus-Stamm in den jeweiligen Betrieben nachgewiesen wurde,

kann auch hier von einer Übertragung des Erregers vorwiegend während der

Melkzeit ausgegangen werden. FOURNIER et al. (2008) identifizierten aus bovinen

Mastitismilchproben per PCR hingegen zwar einen Genotyp, der Eigenschaften

eines „kuhassoziierten“ Erregers aufwies, zusätzlich aber viele weitere Genotypen,

die sich epidemiologisch eher wie CNS verhielten und auch weniger pathogen

zeigten.

Bezüglich der Pathogenität ist zu sagen, dass der in der vorliegenden Arbeit

vornehmlich isolierte S. aureus-Stamm zwar hauptsächlich subklinische, durchaus

aber auch klinische und sogar perakute Mastitiden auszulösen vermochte. Dies

entspricht Untersuchungen von MIDDLETON et al. (2002), die mittels PFGE

feststellten, dass dieselbe Menge S. aureus desselben Stammes bei einigen Kühen

Diskussion

120

zu einer klinischen Mastitis führte, während sie bei anderen gar keine intramammäre

Infektion hervorrief. Zu anderen Ergebnissen kamen HAVERI et al. (2007), die aus

der Milch von Kühen mit persistenten IMI häufiger S. aureus mit Penicillin-Resistenz

und den Enterotoxinen d und j isolieren konnten.

Des Weiteren zeigt das Vorkommen von agr_I/ CC133-MSSA [tst1+, entC/L+] in

beiden Betrieben, dass eine räumlich relativ weite Ausbreitung möglich ist, was für

Effektivität bei der Infektion von Eutergewebe kleiner Wiederkäuer spricht. Auch

dieses wurde von MØRK et al. (2005b) bestätigt, die bei Fleischschafen in Norwegen

mittels PFGE nachweisen konnten, dass unabhängig von der Region 5 Pulstypen

59% der S. aureus-Isolate stellten. Ebenso stellten VAUTOR et al. (2005) mittels

MLST und PFGE eine weite Verbreitung gleicher oder genetisch eng verwandter

S. aureus-Klone in Schafmilchproben fest.

Der Nachweis eines Stammes, der häufig bei Menschen vorkommt, deutet auf eine

Übertragung vom Menschen auf das Tier hin. Denkbar wäre eine Übertragung von

den Melkerhänden auf das Euter, wie sie auch von FABIANO et al. (2005) bei Kühen

nachgewiesen wurde. Dies kommt hier insbesondere in Frage, da im Betrieb A vom

Melker keine Handschuhe getragen wurden.

Ein weiteres wichtiges Ergebnis der Typisierung ist die Tatsache, dass die in der

jeweiligen stallspezifischen Vakzine verwendeten S. aureus-Isolate demjenigen

Stamm entsprachen, der nach der Vakzination aus Milchproben geimpfter Tiere

isoliert werden konnte. Dies ist in sofern von Bedeutung, als eine Infektion mit einem

heterologen Stamm das Ergebnis bezüglich der Immunitätsbildung gegen den

Impfstamm hätte verfälschen können. Andererseits wäre natürlich eine Immunität

gegen zahlreiche - am besten alle - S. aureus-Mastitis-Stämme wünschenswert,

weshalb in zahlreichen Impfversuchen mit anschließender experimenteller Infektion

heterologe S. aureus-Stämme für diese verwendet wurden (WATSON u. KENNEDY

1981; RYŠÁNEK et al. 1988; LUBY et al. 2007).

5.2.2 Beurteilung der Effekte der Vakzination

Zur besseren Vergleichbarkeit und zur Verdeutlichung der Unterschiede zwischen

beiden Betrieben werden alle in den Betrieben erhobenen Ergebnisse im Folgenden

betriebsübergreifend und nicht getrennt für die Betriebe A und B diskutiert.

Diskussion

121

5.2.2.1 Vorversuch

Bei beiden Ziegen des Vorversuchs führte die intrazisternale Applikation des

stallspezifischen S. aureus-Impfstoffs zu einem vorübergehenden Anstieg der

Körperinnentemperatur. Gleiches wurde von DERBYSHIRE und SMITH (1969)

berichtet, die trockenstehenden Ziegen eine Vakzine aus inaktivierten S. aureus und

Toxoid intrazisternal verabreichten. Zusätzlich beobachteten sie eine Schwellung und

ein geringeres Aufeutern der jeweiligen Euterhälften, während die hier geimpften

Ziegen keine Schwellung des Euters zeigten. Da die Ziegen in der vorliegenden

Untersuchung während der Laktation geimpft wurden, konnte eine geringere

Anbildung geimpfter Euterhälften nicht beurteilt werden.

Ebenfalls aufgrund des Applikationszeitpunktes der Vakzine, der bei den meisten

Untersuchungen in der Trockenstehphase lag, gibt es nur wenige Erfahrungen zur

Entwicklung des somatischen Zellgehalts im Zuge der Vakzination. NORDHAUG et

al. (1994b) empfahlen allerdings, die Boosterimpfungen aufgrund des

Zellzahlanstiegs in der Trockenstehphase durchzuführen. ANDERSON (1978)

proklamierte, dass eine Impfung gegen Mastitiserreger immer zu einer, wenn auch

milden, Mastitis und somit auch zu einem Anstieg des somatischen Zellgehaltes

führen müsste. Bei beiden Ziegen des Vorversuchs war nach der intrazisternalen

Vakzination ein deutlicher Zellzahlanstieg festzustellen. Dieser könnte ebenso wie

die Erhöhung der Körperinnentemperatur ein Zeichen der von ANDERSON (1978)

erwähnten milden Mastitis als Reaktion auf die Impfstoffapplikation sein. Welche

Mechanismen hier genau beteiligt sind, kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur

vermutet werden und müsste genauer untersucht werden.

Insgesamt konnte aus dem Vorversuch auf eine gute Verträglichkeit der verwendeten

stallspezifischen S. aureus-Vakzine bei intrazisternaler Applikation geschlossen

werden.


Während in Betrieb A in Folge der Erstimpfung massive Impfreaktionen wie Fieber,

gestörtes Allgemeinbefinden der Tiere und ein deutlicher Milchleistungsrückgang

beobachtet werden konnten, wurden in Betrieb B keinerlei Nebenwirkungen

Diskussion

122

beobachtet. Der fehlende Rückgang der Milchleistung in Betrieb B könnte auf der

ohnehin sehr geringen Milchleistung der dort gehaltenen laktierenden Schafe und

Ziegen beruhen. Andererseits könnten die besonders ausgeprägten Nebenwirkungen

bei den Tieren des Betriebes A auch durch eine zusätzliche Infektion der Tiere im

Bestand und die somit größere Belastung des Immunsystems hervorgerufen worden

sein. Im Betrieb A waren zum Zeitpunkt der Erstimpfung einzelne Tiere mit ggr.

Symptomen einer Atemwegserkrankung (Pasteurellose) aufgefallen, allerdings war

diese Problematik bereits seit Langem bekannt und auch schon ein Therapieversuch

unternommen worden. Auch in anderen Untersuchungen mit S. aureus-Impfstoffen

an Ziegen insbesondere bei intrazisternaler Applikation konnten Nebenwirkungen wie

Fieber beobachtet werden (DERBYSHIRE 1961; DERBYSHIRE u. SMITH 1969).



Die Entwicklung der S. aureus-Prävalenz verlief in den Betrieben A und B zunächst

eher gegenläufig. Während in Betrieb A die Prävalenz nach der Erstimpfung von 5,1

auf 23,7% anstieg, sank sie im Betrieb B von 23,1 auf 10,3% ab. Im Betrieb A folgte

ein Absinken auf 3,4%, in Betrieb B hingegen ein erneuter Anstieg auf 18,0%. Im

Betrieb B folgte der Zweitimpfung dann der erneute Abfall bis auf schließlich 5,1%.

Eine mögliche Erklärung für den starken Prävalenzanstieg nach der Erstimpfung in

Betrieb A könnte sein, dass die Impfung zu einer Aktivierung von im Gewebe

eingeschlossen S. aureus (NICKERSON 1993a) führte, so dass es zu einer

stärkeren Ausscheidung von S. aureus mit der Milch und damit zu einer besseren

Detektierbarkeit mittels kultureller Untersuchung kam. Ein ähnlicher Ansatz wäre die

Beurteilung der Erstimpfung als Stressereignis, welches zu höheren

Ausscheidungsraten von S. aureus führte (KRÖMKER et al. 2008). Allerdings ist

fraglich, ob dieser Effekt über 14 Tage anhalten würde. Denkbar wäre natürlich auch

ein anderes Stressereignis unmittelbar vor der zweiten Beprobung. Die genannten

Möglichkeiten liefern allerdings nur sinnvolle Erklärungen, wenn alle in der zweiten

Beprobung positiv getesteten Tiere bereits bei der Erstimpfung infiziert waren, jedoch

mittels der hier durchgeführten kulturellen Untersuchung nicht identifiziert werden

Diskussion

123

konnten. Eine Neuinfektion der Tiere durch die Vakzine ist durch die inaktivierten

Bakterien auszuschließen, durch Kontamination z.B. der Vygonüle bei

intrazisternaler Applikation aber nicht gänzlich unmöglich. Auch eine Feldinfektion

zwischen der ersten und zweiten Beprobung wäre denkbar. Dagegen spricht

allerdings, dass die Prävalenz im Betrieb A nach der zweiten Beprobung wieder

zurückging. Dies deutet vielmehr auf einen Clearance-Effekt der Vakzine hin, wie er

z.B. auch bei PANKEY et al. (1985) beschrieben wurde, die nach Impfung eine

doppelt so hohe Spontanheilungsrate wie bei ungeimpften Kühen feststellten.

Schwieriger zu erklären ist die anfängliche Prävalenzentwicklung im Betrieb B.

Natürlich kommen auch hier den jeweiligen Impfungen und Probennahmen

vorausgegangene Stressereignisse als Ursache der hohen Prävalenzen zu den

Beprobungszeitpunkten 1 und 3 in Frage. Möglicherweise führte aber auch die

Erstimpfung bereits zu einer Verbesserung der Immunitätslage, die allerdings erst

nach der Boosterimpfung und damit zum Beprobungszeitpunkt 4 und den folgenden

zu einer dauerhaften Bakterienclearance führen konnte.

Ab dem Beprobungszeitpunkt 3 (Betrieb A) bzw. 5 (Betrieb B) blieben die

Prävalenzen bis zum Trockenstellen in beiden Betrieben relativ konstant. Da hier

zumeist dieselben Tiere in allen Beprobungen S. aureus ausschieden, kann von

„Dauerausscheidern“ gesprochen werden. In beiden Betrieben wurden nicht alle

dieser Dauerausscheider vor Beginn der folgenden Laktation der Schlachtung

zugeführt, so dass jeweils zunächst drei solcher Tiere im Bestand verblieben.

Während es im Betrieb A nach der Lammung zu einem erneuten Anstieg der

S. aureus-Prävalenz kam, der vermutlich auf Neuinfektionen beruhte, blieb die

Prävalenz in Betrieb B weiterhin konstant. Zwei der bekannten Dauerausscheider

des Betriebes B wurden in beiden Probennahmen nach der Lammung weiterhin als

S. aureus-Ausscheider identifiziert, ein Tier wurde bei beiden Beprobungen negativ

getestet, d.h. es kam vermutlich zu einer Spontanheilung, möglicherweise unterstützt

durch das Trockenstellen (BERGONIER et al. 2003). Die zwei verbliebenen

S. aureus-positiven Tiere des Betriebes B wurden nach Beendigung der

vorliegenden Untersuchung geschlachtet. Zwar wurden auch in Betrieb A noch zwei

der drei verbliebenen - und weiterhin positiv getesteten - Tiere aus dem Betrieb

Diskussion

124

entfernt, jedoch war es vorher offensichtlich bereits zu einer erneuten Ausbreitung

von S. aureus im Betrieb gekommen. Zu erwähnen ist, dass es sich bei den neu

infizierten Tieren im Betrieb A grundsätzlich um Alttiere, nicht aber um Zutreter

handelte. Möglicherweise bot die stallspezifische Vakzine ihnen also einen besseren

Infektionsschutz als den Alttieren. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen GIRAUDO et

al. (1997) und CALZOLARI et al. (1997), die eine Vakzine gegen S. aureus zunächst

Färsen und in der zweiten Untersuchung Kühen verabreichten. Bei Färsen schien die

Vakzine bessere Erfolge zu erzielen als bei Kühen.

Die unterschiedliche Entwicklung der S. aureus-Prävalenz in den Betrieben

insbesondere nach der Lammung lässt sich möglicherweise durch unterschiedliches

Herdenmanagement, insbesondere die Melkzeit betreffend, erklären. In Betrieb B

trugen, wie bereits in Kapitel 3.2.2 beschrieben, die Melkerinnen Handschuhe, was in

Betrieb A nicht der Fall war. Dies könnte die Ausbreitung von S. aureus im Betrieb A

gemäß FABIANO et al. (2005) und VAUTOR et al. (2003) gefördert bzw. erleichtert

haben. Außerdem wurden im Betrieb B im Gegensatz zum Betrieb A die Zitzen der

Tiere nach dem Melken mit einem Jod-Glyzerin-Präparat gedippt, was die

Kolonisation der Zitzen mit S. aureus und somit das Vorkommen von S. aureus-

Mastitiden verringern soll (FOX 1992; BARKEMA et al. 2006). SOMMERHÄUSER et

al. (2003) berichteten jedoch auch über S. aureus-Stämme, bei deren Vorkommen

Zitzendippen die Zahl der Neuinfektionen nicht beeinflussen konnte. Andererseits

wurde in Betrieb A eine Melkreihenfolge eingehalten, was gemäß BERGONIER et al.

(2003) und WILSON et al. (1995) Neuinfektionen zumindest einschränken sollte.

MIDDLETON et al. (2001) stellten allerdings fest, dass die Trennung von Milchkühen

in Gruppen während des Melkens Neuinfektionen mit S. aureus nicht verhindern

konnte.

5.2.2.3.2 Entwicklung in den verschiedenen Impfgrup pen

Die Entwicklung der S. aureus-Prävalenz nahm bei den subkutan geimpften Tieren

beider Betriebe einen stark an den Gesamtbestand erinnernden Verlauf. Dies lag

sicherlich auch daran, dass der jeweils überwiegende Teil der Tiere dieser

Impfgruppe angehörte. In der Impfgruppe i.z. des Betriebes B kam es trotz der

wesentlich geringeren Tierzahl zu einem ebenfalls ähnlichen Verlauf wie im

Diskussion

125

Gesamtbestand, während sich im Betrieb A ein deutlich abweichendes Bild bot. Hier

zeigte sich ein zunächst konstanter Verlauf der S. aureus-Prävalenz. Lediglich die

Entwicklung nach der Lammung glich mit einem deutlichen, teilweise trotz der

geringen Tierzahl signifikanten Prävalenzanstieg der Entwicklung in der Impfgruppe

s.c..

Vergleicht man die S. aureus-Prävalenzen in den verschiedenen Impfgruppen der

jeweiligen Betriebe, so fällt auf, dass die für die intrazisternal geimpften Tiere

ermittelten Werte fast immer über denen der subkutan geimpften lagen. Allerdings

waren signifikante Unterschiede nur in Betrieb A vorzufinden. Bei der Bewertung

dieser Prävalenzen ist allerdings zu bedenken, dass die Ausgangswerte bei den

intrazisternal geimpften Tieren in beiden Betrieben mit 13,3% (A) bzw. 35,7% (B)

jeweils über denen der subkutan geimpften Tiere (A: 3,7%, B: 17,4%) lagen, was

jedoch keinem signifikanten Unterschied entsprach. Diese nicht beabsichtigte

Situation entstand, weil zum Zeitpunkt der Erstimpfung der S. aureus-Status der

Tiere noch nicht bekannt war. Da sich im Versuchsverlauf im Betrieb A signifikante

Unterschiede zwischen den Impfgruppen ergaben, kann davon ausgegangen

werden, dass die intrazisternale Applikation den Tieren weniger Schutz bot als die

subkutane. Dies widerspricht den Ergebnissen von MCDOWELL und WATSON

(1974), die Schafe a.p. mit einer Vakzine bestehend aus inaktivierten S. aureus und

Toxoid entweder intramuskulär oder intrazisternal impften und 30 Tage p.p.

experimentell infizierten. Sie kamen aufgrund einer höheren Milchleistung und

geringerer klinischer Symptomatik bei den intrazisternal geimpften Tieren zu dem

Schluss, dass die intrazisternale Applikation der Vakzine mehr Schutz vor einer

S. aureus-Mastitis bot als die intramuskuläre. Auch DERBYSHIRE (1961) sowie

DERBYSHIRE und SMITH (1969) waren der Ansicht, die intrazisternale Impfung von

Ziegen mit inaktivierten S. aureus liefere bei anschließender experimenteller Infektion

gute Ergebnisse. Eine mögliche Erklärung für diese abweichenden Ergebnisse liefert

der Impfzeitpunkt der Tiere, da diese in der vorliegenden Untersuchung -anders als

in den genannten Studien- während der Laktation geimpft wurden.

Diskussion

126

5.2.2.3.3 Entwicklung bei den verschiedenen Tierart en

Da im Betrieb A nur Ziegen in den Versuch eingebunden waren, ist dieser Punkt

prinzipiell nur für den Betrieb B relevant. Es sollen allerdings auch Parallelen

zwischen den Ziegen des Betriebes A und denen des Betriebes B aufgezeigt

werden.

Zunächst verlief die Entwicklung der S. aureus-Prävalenz sowohl bei den Schafen

als auch bei den Ziegen des Betriebes B ähnlich wie im Gesamtbestand, jedoch

ohne signifikante Unterschiede zwischen den jeweiligen Beprobungszeitpunkten. Im

weiteren Verlauf und insbesondere nach der Lammung zeigte sich jedoch, wenn

auch nicht durch einen signifikanten Prävalenzunterschied, dass bei den Ziegen so

genannte Dauerausscheider zu finden waren, während aus keiner der Milchproben

von Schafen ein S. aureus-Nachweis gelang. Diese Dauerausscheider konnten auch

unter den Ziegen des Betriebes A identifiziert werden, was dafür spricht, dass Ziegen

möglicherweise häufiger über einen längeren Zeitraum S. aureus ausscheiden als

Schafe. Eine weitere mögliche Erklärung wäre, dass durch die stallspezifische

Vakzine weniger Spontanheilungen bei Ziegen als bei Schafen induziert werden

konnten. Auch ALEANDRI et al. (1993) konnten in ihren Untersuchungen Ziegen als

Dauerausscheider von S. aureus identifizieren. DEUTZ et al. (1995) identifizierten

zwar S. aureus mit 63,8% als häufigsten Erreger chronischer Schafmastitiden,

lieferten allerdings keine Daten zur Dauer der Infektion. Vergleichende

Untersuchungen zur Dauer einer S. aureus-Mastitis bei Schafen und Ziegen liegen

meines Wissens nach nicht vor.

Aufgrund der spärlichen Literatur zu Impfversuchen gegen S. aureus-Mastitiden bei

der Ziege kann hier keine Aussage darüber getroffen werden, ob üblicherweise

Schafe oder Ziegen mit einer größeren Anzahl an Spontanheilungen auf solche

Impfversuche reagieren. Dies müsste noch näher untersucht werden.

Diskussion

127


5.2.2.4.1 Ausgangssituation in den Betrieben

Bei der Betrachtung der Entwicklungen des Gehaltes an somatischen Zellen in den

beiden Betrieben ist es wichtig, die jeweilige Ausgangssituation, d.h. die vor der

Vakzination zu Versuchsbeginn ermittelten Zellgehalte zu berücksichtigen. Diese

lagen im Betrieb B deutlich niedriger als im Betrieb A (Median 940.000 Zellen/ml

Milch in Betrieb A vs. 50.000 Zellen/ml Milch in Betrieb B), was eine Erklärung für

ermittelte Unterschiede zwischen den Entwicklungen der Zellzahlen in beiden

Betrieben sein könnte. Warum die Ausgangszellgehalte in beiden Betrieben so stark

voneinander abwichen, kann hier nur vermutet werden. Eine mögliche Begründung

liefern die unterschiedlichen Tierarten im Versuch, denn während in Betrieb A

ausschließlich Ziegen in den Versuch eingebunden waren, wurden in Betrieb B

sowohl Schafe als auch Ziegen untersucht. Gegen diese Begründung spricht

allerdings, dass die Ziegen des Betriebes B zu Versuchsbeginn mit einem Median

von 28.500 Zellen/ml Milch sogar noch niedrigere Zellgehalte aufwiesen als die

Schafe (Median 67.000 Zellen/ml Milch), so dass der Unterschied zu den Ziegen des

Betriebes A noch gravierender ausfiel. Wahrscheinlicher ist, dass die

Ausgangszellzahlen durch das Management, insbesondere was die Melkhygiene und

Melktechnik betrifft, beeinflusst wurden. Während in Betrieb B die Melker stets

Handschuhe trugen und die Zitzen nach dem Melken mit einem Jod-Glyzerin-

Präparat gedippt wurden, wurde im Betrieb A auf diese Maßnahmen verzichtet. Wie

Untersuchungen von BARNOUIN et al. (2004) und SHAILJA und SINGH (2002)

zeigten, führte das Zitzendippen nach dem Melken zu niedrigeren Zellzahlen im

Vergleich mit Tieren, deren Zitzen nicht gedippt wurden.

Die Melktechnik wurde hier nicht überprüft, so dass ihr Einfluss auf die Zellgehalte

nicht näher charakterisiert werden kann.


Auch die Entwicklung des Gehaltes an somatischen Zellen verlief wie die der

S. aureus-Prävalenz in den Betrieben A und B während der ersten

Diskussion

128

Beprobungszeitpunkte eher gegensätzlich. Während im Betrieb A auf die

Erstimpfung bis zur Zweitimpfung ein signifikantes Absinken der Zellzahlen folgte,

stiegen die Werte im Betrieb B nach der Erstimpfung zunächst signifikant an, um zur

Zweitimpfung wieder deutlich abzusinken. Allerdings lag der Gehalt an somatischen

Zellen bei der Zweitimpfung im Betrieb B immer noch deutlich über den

Ausgangswerten. Im Betrieb A stiegen die Zellgehalte nach der Zweitimpfung wieder

signifikant an, so dass sie nur noch geringfügig unter den Werten vor der

Zweitimpfung lagen.

Der Anstieg der somatischen Zellgehalte im Betrieb B kann als Reaktion auf die

Erstimpfung interpretiert werden, da schon ANDERSON (1978) der Ansicht war, eine

Impfung gegen Mastitis würde zunächst grundsätzlich mit einer milden Mastitis

einhergehen und somit zu einer Erhöhung der Zellzahl führen. Gleiches gilt für den

Zellzahlanstieg im Betrieb A nach der Zweitimpfung. Auch NORDHAUG et al.

(1994b) erwarteten einen Anstieg der somatischen Zellgehalte nach einer Impfung

gegen S. aureus-Mastitis. Bei Ziegen kann sogar davon ausgegangen werden, dass

jede Vakzination zunächst zu einer Erhöhung der Zellzahl führt (LERONDELLE et al.

1992; BERGONIER et al. 1993). Dies widerspricht allerdings der beobachteten

Entwicklung im Betrieb A nach der Erstimpfung. Auch in einigen anderen

Untersuchungen zur Vakzination gegen S. aureus-Mastitis bei Rindern ohne

experimentelle Infektion der Tiere wurde von niedrigeren Zellzahlen in der Impf-

verglichen mit der Kontrollgruppe berichtet (NORDHAUG et al. 1994a; TENHAGEN

et al. 2001; LEITNER et al. 2003b), jedoch handelte es sich hier eher um einen lang-

denn mittelfristigen Effekt, wie er in der vorliegenden Untersuchung auftrat.

CALZOLARI et al. (1997) beobachteten ebenfalls ein Absinken des somatischen

Zellgehalts im Vergleich zum Ausgangswert bei geimpften Kühen, allerdings nur

unter der Voraussetzung, dass der Zellgehalt vor der Impfung unter 500.000

Zellen/ml Milch lag. Da sich die physiologischen somatischen Zellgehalte von Ziegen

und Kühen relativ stark unterscheiden (siehe Kapitel 2.5.2.1), ist dieser Grenzwert

sicherlich nicht ohne weiteres auf die Ziegen des Betriebes A zu übertragen. Es fällt

allerdings auf, dass der Median der Zellgehalte von Beprobungszeitpunkt 1 bis 3

zwar von 940.000 auf 368.000 Zellen/ml Milch absank, gleichzeitig jedoch der

Diskussion

129

jeweilige maximale Wert von 5,3 auf 7,1 Millionen Zellen/ml Milch anstieg (siehe

auch Tabelle 9.23). Andere Autoren konnten in Feldversuchen an Milchrindern keine

Unterschiede bezüglich der Zellzahl zwischen Impf- und Kontrollgruppe und somit

keinen positiven Effekt der Vakzine auf den Zellgehalt ermitteln (HOEDEMAKER et

al. 2001; MIDDLETON et al. 2009).

Die CMT-Werte sanken im Betrieb A zum Trockenstellen hin kontinuierlich ab,

während sie im Betrieb B vom Beprobungszeitpunkt 5 zu Zeitpunkt 6

(Trockenstellen) anstiegen. Der beobachtete Anstieg der Werte im Betrieb B ist als

Hinweis auf steigende Zellzahlen zum Ende der Laktation insbesondere für Ziegen

als physiologisch zu bezeichnen (BERGONIER et al. 1993; DE CRÉMOUX et al.

1993). Demnach verlief die Entwicklung der CMT-Werte im Betrieb A

entgegengesetzt zur physiologischen Entwicklung. Dies könnte als positiver

Langzeiteffekt der Vakzination interpretiert werden, der auch - wie bereits erwähnt -

von NORDHAUG et al. (1994a), TENHAGEN et al. (2001), LEITNER et al. (2003b)

und CALZOLARI et al. (1997) beobachtet wurde. Die sehr unterschiedliche

Entwicklung in beiden Betrieben könnte einerseits in den unterschiedlichen Tierarten

im Versuch (nur Ziegen vs. Schafe und Ziegen) oder aber, wie in Kapitel 5.2.2.4.1

bereits beschrieben, in den sehr unterschiedlichen Zellzahlen bereits zu

Versuchsbeginn (Median 940.000 Zellen/ml Milch in Betrieb A vs. 50.000 Zellen/ml

Milch in Betrieb B) begründet sein.

Nach der Lammung konnten in beiden Betrieben wesentlich niedrigere CMT-Werte

ermittelt werden als zuvor. Dies lässt sich wiederum durch den physiologischen

Verlauf der Zellgehalte insbesondere bei Ziegen während der Laktation erklären

(BERGONIER et al. 1993; DE CRÉMOUX et al. 1993). Die niedrigsten Ergebnisse

wurden im Betrieb B beim zweiten Beprobungstermin nach der Lammung erzielt,

wohingegen die Werte im Betrieb A zu diesem Zeitpunkt bereits wieder deutlich

angestiegen waren. Der Grund hierfür könnten Variationen des Abstandes zwischen

der Lammung und der ersten Beprobung p.p. sein, da diese lediglich innerhalb der

ersten 14 Tage stattfinden sollte. Möglicherweise fand diese Beprobung im Betrieb B

durchschnittlich früher nach der Lammung statt, so dass der somatische Zellgehalt

aufgrund der Kolostralphase noch erhöht war (MADSEN et al. 2004) und erst

Diskussion

130

anschließend absank. So berichteten BERGONIER et al. (1993), dass bei Schafen

der somatische Zellgehalt physiologischerweise sogar mindestens bis zum 45. Tag

der Laktation absinkt.

Der deutlich höhere CMT-Wert im Betrieb A bei der zweiten Beprobung nach der

Lammung im Vergleich zum Beprobungszeitpunkt 8 könnte mit der ebenfalls deutlich

angestiegenen S. aureus-Prävalenz zusammenhängen (MORONI et al. 2005a; HALL

u. RYCROFT 2007). Denkbar ist aber natürlich auch ein Zellzahlanstieg als Reaktion

auf die vorhergehende Boosterimpfung (s.o.).

5.2.2.4.3 Entwicklung in den verschiedenen Impfgrup pen

Wie sich schon im Hinblick auf die S. aureus-Prävalenz zeigte, spiegelten auch

bezüglich des Gehaltes an somatischen Zellen die Verläufe bei den subkutan

geimpften Tieren beider Betriebe die jeweiligen Entwicklungen im Gesamtbestand

wider. Auch hier ist wieder zu bedenken, dass diese jeweils den Großteil der Tiere

des Bestandes umfassten. Ebenfalls wie schon bei der S. aureus-Prävalenz glich

auch die Entwicklung der Zellzahl in der Impfgruppe i.z. des Betriebes B dem Verlauf

im Gesamtbestand, es waren allerdings gegenüber denen in der Impfgruppe s.c.

teilweise signifikant erhöhte CMT-Werte festzustellen.

In der Impfgruppe i.z. des Betriebes A hingegen bot sich, wiederum analog zur

Entwicklung der S. aureus-Prävalenz, ein abweichendes Bild. Die Gehalte an

somatischen Zellen stiegen hier nach der Erstimpfung zum Beprobungszeitpunkt 3

hin signifikant an, während sie in der Impfgruppe s.c. im gleichen Zeitraum signifikant

absanken. Dies führte zu einem signifikanten Unterschied zwischen beiden

Impfgruppen zum Beprobungszeitpunkt 3. Nach der Zweitimpfung sank der Gehalt

an somatischen Zellen in der Impfgruppe i.z. des Betriebes A wieder etwas ab. Die

Entwicklung der CMT-Werte verlief in beiden Gruppen des Betriebes A parallel,

wobei die Werte in der Impfgruppe i.z. ausgenommen bei der ersten Beprobung nach

der Lammung stets über denen in der Impfgruppe s.c. lagen. Signifikant war dieser

Unterschied nur zum Beprobungszeitpunkt 9, d.h. der zweiten Beprobung nach der

Lammung.

In beiden Betrieben deutet die etwas ausgeprägtere Reaktion in Form eines

Zellzahlanstiegs auf die Erstimpfung in der Impfgruppe i.z. verglichen mit der

Diskussion

131

Impfgruppe s.c. auf eine stärkere Aktivierung der lokalen Abwehr, d.h. die

Entwicklung einer Mastitis bei den Tieren der Impfgruppe i.z. hin (ANDERSON

1978). Für Untersuchungen, in denen bei Kühen und bei Schafen die Auswirkungen

von intrazisternaler und systemischer Applikation von Vakzinen gegen S. aureus-

Mastitis verglichen wurden, wurde stets die Trockenstehphase zur Impfung gewählt,

so dass keine Aussage zur Entwicklung der Zellzahl als unmittelbare Reaktion auf

die Verabreichung der jeweiligen Vakzine getroffen werden konnte (MCDOWELL u.

WATSON 1974; WATSON u. LASCELLES 1975). GÓMEZ et al. (1998) konnten

allerdings bei während der Laktation intrazisternal geimpften Mäusen keinen Anstieg

des somatischen Zellgehalts beobachten.

Dass die CMT-Werte der Impfgruppe i.z. des Betriebes A zum Beprobungszeitpunkt

9 signifikant über denen der Impfgruppe s.c. lagen kann einerseits durch die

ebenfalls signifikant höhere S. aureus-Prävalenz in dieser Gruppe begründet sein

(s.o.), andererseits aber auch Ausdruck einer erneuten starken Aktivierung der

lokalen Abwehrmechanismen als Reaktion auf die Boosterimpfung gewesen sein.

5.2.2.4.4 Entwicklung bei den verschiedenen Tierart en

Insgesamt fiel der auf die Erstimpfung folgende Zellzahlanstieg bei den Schafen des

Betriebes B wesentlich weniger deutlich aus als bei den Ziegen desselben Betriebes.

Allerdings ist hierbei zu bedenken, dass die Ziegen mit einem Median von 28.500

Zellen/ml Milch gegenüber 67.000 Zellen/ml Milch bei den Schafen in den Proben

des Zeitpunktes 1 die niedrigeren Zellzahlen aufwiesen. Dies ist in sofern

bemerkenswert, als in der Literatur für Ziegen meist höhere physiologische Gehalte

an somatischen Zellen angegeben werden als für Schafe (ZENG u. ESCOBAR 1993;

BERGONIER u. BERTHELOT 2003). Der initiale S. aureus-Status kommt hier nicht

als Ursache in Frage, da die Prävalenzen bei Schafen und Ziegen zu keinem

Zeitpunkt signifikante Unterschiede aufwiesen. Denkbar wäre allerdings eine höhere

Infektionsrate - mit anderen Erregern als S. aureus - der Schafe verglichen mit den

Ziegen. Dies kann aufgrund der Klassifizierung der Tiere als S. aureus-negativ auch

bei Nachweis von beispielsweise CNS in den Milchproben nicht ausgeschlossen

werden. Dass auch CNS erhöhte Zellgehalte bei Schafen auslösen können zeigten

ARIZNABARRETA et al. (2002).

Diskussion

132

Dem stärkeren Anstieg nach der Erstimpfung folgte zwar ein Absinken der

Zellgehalte der Ziegen zum Zeitpunkt 3, die Werte blieben aber im Vergleich zu den

Werten der Schafe, wenn auch nicht signifikant, erhöht. Insgesamt deutet der

stärkere Anstieg der somatischen Zellgehalte bei den Ziegen auf eine stärkere

Reaktion auf die Impfung hin. Da Ziegen allerdings in der Regel deutlicher als Schafe

auf jede Impfung sowie Behandlung bzw. andere Stressereignisse mit einer

steigenden Zellzahl reagieren (LERONDELLE et al. 1992; BERGONIER et al. 1993;

BERGONIER et al. 2003), bleibt fraglich, ob es sich um einen spezifischen Effekt auf

die stallspezifische Vakzine handelte.

Die CMT-Werte der Ziegen lagen mit Ausnahme des Beprobungszeitpunktes 8 stets

signifikant über denen der Schafe. Außerdem war hier zum Trockenstellen hin eine

gegensätzliche Entwicklung zu beobachten. Während es Hinweise auf ein Absinken

der Werte der Ziegen gab, wie es auch bei den Ziegen des Betriebes A der Fall war,

stiegen die Werte bei den Schafen leicht an. Diese Entwicklung deutet wiederum auf

einen Effekt der Vakzine auf die somatischen Zellgehalte von Ziegen hin, da der

erwartete Anstieg der Zellzahl im Laufe der Laktation (DE CRÉMOUX et al. 1993;

PAAPE et al. 2007) nahezu umgekehrt wurde. Allerdings ist hier zu bedenken, dass

die Bestimmung der somatischen Zellgehalte zu diesem Zeitpunkt semiquantitativ

mittels CMT erfolgte. Zwar wurde die Vergleichbarkeit von Zellgehalt und CMT von

vielen Autoren auch bei Ziegenmilch als gut beschrieben (HARRER 2006; MAURER

u. SCHAEREN 2007b), jedoch konnten BOSCOS et al. (1996) bei Ziegen keinen

Einfluss des Laktationsstadiums auf die CMT-Werte feststellen.

Der leichte Anstieg der CMT-Werte der Schafe zum Trockenstellen hin ist nach

BERGONIER et al. (1993) als physiologisch zu betrachten. Sie beschrieben einen

Zellzahlanstieg vom 105. bis 225. Tag der Laktation. PAAPE et al. (2007) konnten

hingegen keinen Einfluss des Laktationsstadiums auf die Zellgehalte von Schafmilch

feststellen. Die Vakzination hatte in diesem Zeitraum keinen offensichtlichen Einfluss

auf den somatischen Zellgehalt der Schafe.

Nach der Lammung wurden aus den bereits genannten Gründen sowohl bei Schafen

als auch bei Ziegen wiederum die niedrigsten CMT-Werte ermittelt.

Diskussion

133

5.2.2.4.5 Entwicklung in Abhängigkeit vom S. aureus -Nachweis

Die Gehalte der somatischen Zellen in den S. aureus-negativen Milchproben beider

Betriebe entwickelten sich analog zu den Zellzahlen des jeweiligen

Gesamtbestandes. Dies liegt sicherlich daran, dass stets bei der Mehrzahl der Tiere

kein S. aureus nachgewiesen wurde.

In den positiven Milchproben des Betriebes B ähnelte der Verlauf der somatischen

Zellgehalte prinzipiell ebenfalls dem Verlauf im Gesamtbestand. Nach der

Erstimpfung stieg der Zellgehalt in den positiven Milchproben ausgehend von

ähnlichen Werten allerdings signifikant stärker an als in den negativen Milchproben.

Zur Zweitimpfung sanken die Zellzahlen zwar wieder deutlich ab, lagen aber noch

immer geringfügig über denen der negativen Milchproben. Auch im Betrieb A

unterschieden sich die somatischen Zellgehalte S. aureus-positiver und -negativer

Proben erst nach der Erstimpfung signifikant. Im Gegensatz zu den Zellgehalten der

negativen Proben erfolgte bei den positiven nach der ersten Vakzination ein

geringgradiger Zellzahlanstieg. Auf die Zweitimpfung folgte dann eine noch

wesentlich deutlichere Erhöhung der somatischen Zellgehalte. Der jeweils

deutlichere Zellzahlanstieg in den S. aureus-positiven Milchproben als Reaktion auf

die Vakzination legt die Vermutung nahe, dass die Impfung bei den infizierten

Euterhälften eine stärkere lokale Reaktion, d.h. eine ausgeprägtere Rekrutierung von

Leukozyten in das Euter, hervorrief als bei denen, die frei von S. aureus waren

(ANDERSON 1978).

Bemerkenswert ist auch, dass sich die somatischen Zellgehalte der S. aureus-

positiven und -negativen Milchproben vor der Impfung nicht signifikant

unterschieden. Dies wird bestätigt durch Untersuchungen von MAURER und

SCHAEREN (2007b), die feststellten, dass 16,7% der mit S. aureus infizierten

Ziegen im CMT negativ reagierten. Ebenso ermittelten MIN et al. (2007) bei

subklinisch mit S. aureus infizierten Ziegen einen Gehalt an somatischen Zellen, der

nicht über den bei subklinischen Mastitiden anderer Ätiologie gemessenen Werten

lag. MORONI et al. (2005a) sowie HALL und RYCROFT (2007) stellten jedoch die

deutlich höchsten somatischen Zellgehalte bei S. aureus-positiven Ziegen fest. Die

Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung legen nahe, dass nach der Vakzination

Diskussion

134

eine verbesserte Unterscheidung S. aureus-positiver und -negativer Euterhälften

mittels somatischen Zellgehalts bzw. CMT möglich ist.

Die CMT-Werte der S. aureus-positiven Milchproben lagen in beiden Betrieben

zumeist signifikant über denen der -negativen Proben. Nach der Lammung konnten

in den S. aureus-positiven Proben der Tiere des Betriebes A zunächst niedrigere

CMT-Werte ermittelt werden als vor dem Trockenstellen. Dies entspricht den

Aussagen von BARKEMA et al. (2006), die postulierten, dass der somatische

Zellgehalt bei Milchkühen nach dem Kalben sowohl in gesunden als auch in mit

S. aureus infizierten Vierteln absänke. Bei der zweiten Beprobung nach der

Lammung, d.h. nach der Boosterimpfung wurden jedoch bereits wieder fast

identische Werte erreicht wie vor der Lammung. Dies könnte Ausdruck einer

erneuten Aktivierung der lokalen Abwehrmechanismen und eines daraus folgenden

erhöhten Einstroms an Leukozyten in das Euter sein (ANDERSON 1978). Im Betrieb

B hingegen wurden nach der Lammung stets CMT-Werte von 3 für die S. aureus-

positiven Milchproben ermittelt. Hierzu ist zu sagen, dass es sich bei diesen positiven

Proben anders als im Betrieb A ausschließlich um Proben von zwei

Dauerausscheiderinnen handelte. Die CMT-Werte dieser chronisch mit S. aureus

infizierten Ziegen waren möglicherweise höher als die der unter anderem auch akut

und erst seit kurzem an S. aureus-Mastitis erkrankten Tiere des Betriebes A

(FTHENAKIS 1994; MORONI et al. 2005b).

5.3 Zusammenfassende Beurteilung und Ausblick

Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, dass die verwendeten

stallspezifischen Vakzinen einen Effekt auf die geimpften Tiere hatten. Dies lässt sich

schlussfolgern, weil keine zusätzlichen Maßnahmen in den Betrieben ergriffen

wurden und es zu keinerlei Änderungen im Betriebsablauf abgesehen von der

Vakzinierung und der regelmäßigen Beprobung der Tiere kam. Über die gesamte

Versuchsperiode betrachtet führte die Vakzine zwar nur in einem der Betriebe zu

einer deutlichen Reduktion der S. aureus-Prävalenz, allerdings konnten in beiden

Betrieben im Laufe einer Laktation die S. aureus-positiven Milchproben auf die so

genannten Dauerausscheider eingegrenzt werden. Durch die in der Folgelaktation im

Diskussion

135

Betrieb A beobachtete Entwicklung der Prävalenz wurde deutlich, dass die alleinige

Vakzinierung die Tiere jedoch nicht vor Neuinfektionen mit dem Impfstamm schützen

konnte.

Auch in Bezug auf die Gehalte an somatischen Zellen konnte nur in einem der

beiden Betriebe im Laufe der Laktation der gewünschte Effekt im Sinne einer

Reduktion der Zellgehalte nachgewiesen werden. Allerdings ist hierzu zu sagen,

dass die Tiere des Betriebes A vor der Vakzination die deutlich höheren Zellgehalte

aufwiesen, so dass vermutet werden kann, dass nur bei bestimmten

Ausgangswerten bzgl. der Zellzahlen mit einer Reduktion zu rechnen ist. Der zumeist

aufgetretene initiale Zellzahlanstieg nach der Vakzination kann als Aktivierung der

lokalen Immunität gedeutet werden.

Die erprobte intrazisternale Applikation der stallspezifischen Vakzine kann nach den

hier vorgestellten Ergebnissen nicht empfohlen werden. Insbesondere die

Ergebnisse bezüglich der S. aureus-Prävalenz lassen auf eine schlechtere

Wirksamkeit im Vergleich mit der subkutanen Applikation schließen. Die zusätzlich

wesentlich aufwändigere Applikationstechnik sowie das mit ihr verbundene

Infektionsrisiko unterstützen diese Einschätzung.

Mit den Ergebnissen anderer Feldversuche zur Impfung gegen S. aureus-Mastitis

sind die Ergebnisse dieser Untersuchung in Ermangelung einer Kontroll- und einer

Impfgruppe nur begrenzt vergleichbar. Des Weiteren wurden alle diese Versuche an

Rindern durchgeführt. HOEDEMAKER et al. (2001) konnten keinen signifikanten

Einfluss der Impfung mit einer stallspezifischen Vakzine auf die S. aureus-Prävalenz

sowie den somatischen Zellgehalt in einer Milchkuhherde mit hoher S. aureus-

Prävalenz feststellen. Hingegen beobachteten CALZOLARI et al. (1997) und

NORDHAUG et al. (1994a) in ihren Untersuchungen jeweils eine Reduktion der

S. aureus-Prävalenz bei geimpften Tieren. Zusätzlich stellten CALZOLARI et al.

(1997) ein Absinken des somatischen Zellgehalts um 30 bis 50% bei geimpften

Tieren fest, sofern sie vor der Impfung einen Zellgehalt von unter 500.000 Zellen/ml

Milch aufgewiesen hatten. NORDHAUG et al. (1994a) verzeichneten unter den

Impflingen wesentlich weniger Tiere mit einem somatischen Zellgehalt über 500.000

Zellen/ml Milch verglichen mit den Kontrolltieren. Auch WATSON et al. (1996)

Diskussion

136

konnten mit ihrer Vakzine das Vorkommen von klinischen und subklinischen

Mastitiden bei anfangs hoher S. aureus-Herdenprävalenz reduzieren.

Die in der vorliegenden Arbeit getestete PCR erwies sich als der kulturellen

Untersuchung nicht deutlich überlegen. Zur Verbesserung der mit dieser Technik

erzielten Ergebnisse wären z.B. eine vorhergehende Anreicherungskultur zur

Verdünnung der Inhibitoren (GILLESPIE u. OLIVER 2005) oder eine vorhergehende

Entfernung der somatischen Zellen aus den Milchproben (KUBOTA et al. 2007)

denkbar. Jedoch bleibt fraglich, ob die Ergebnisse den Arbeitsaufwand rechtfertigen.

Hinsichtlich der Überprüfung des Impferfolges ist zu überlegen, ob eine Kontrolle der

Phagozytose-Kapazität und des „Respiratory burst“ der neutrophilen Granulozyten in

der Milch geimpfter Tiere möglicherweise eine größere Sicherheit bieten könnte als

der bislang meist praktizierte Nachweis spezifischer Antikörper (siehe Kapitel 5.1).

BURTON und ERSKINE (2003) beschrieben neutrophile Granulozyten und

insbesondere deren schnelle Rekrutierung in das Euter als wichtigsten Faktor für die

Immunität der Milchdrüse, opsonisierende Antikörper unterstützen sie in ihrer

Funktion. PICCININI et al. (1999) stellten fest, dass sowohl die Anzahl als auch die

Aktivität der neutrophilen Granulozyten in der Milch die Empfänglichkeit von Kühen

für S. aureus-Mastitiden beeinflussen. In ihren Untersuchungen zu einer trivalenten

S. aureus-Vakzine an Kühen testeten LEE et al. (2005) die Phagozytoserate von

neutrophilen Granulozyten, die mit Serum geimpfter Tiere inkubiert worden waren.

Dieses erhöhte die Phagozytose-Kapazität der neutrophilen Granulozyten nur

geringfügig. Dies zeigt, dass die positiven Wirkungen der spezifischen Serum-

Antikörper nur begrenzt sind und in zukünftigen Impfversuchen auch die

unmittelbaren Wirkungen der Vakzine auf die Aktivität der neutrophilen Granulozyten

untersucht werden sollten.

Zusammenfassend lässt sich über die Auswirkungen einer stallspezifischen Vakzine

gegen S. aureus-Mastitiden sagen, dass ihr Einsatz bei konsequenter Eliminierung

von Dauerausscheidern in Kombination mit gezielter Diagnostik die Sanierung von

Schaf- und Ziegen-Problembeständen unterstützen kann. Das soll heißen, dass die

alleinige Verabreichung der Vakzine, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt,

sicherlich nicht zur Erregerfreiheit führen kann. Allerdings scheinen sich nach der

Diskussion

137

Vakzination einige Tiere zu Dauerausscheidern von S. aureus zu entwickeln,

während andere offensichtlich in der Lage sind, den Erreger zu eliminieren. Ob diese

Unterschiede genetischen Ursprungs sind, müsste noch untersucht werden. Die

Dauerausscheider sollten zum Ende der Laktation identifiziert und aus dem Bestand

eliminiert werden. Eine Identifizierung sollte nach Einsatz der stallspezifischen

Vakzine mittels einmaliger kultureller Untersuchung einer Milchprobe mit größerer

diagnostischer Sicherheit möglich sein als bei ungeimpften Tieren. Da die wenigsten

Schaf- und Ziegenhalter in der Lage bzw. gewillt sein werden, aseptisch

entnommene Milchproben aller Tiere ihres Bestandes kulturell untersuchen zu

lassen, sollte aus Kostengründen zur Selektion der zu beprobenden Tiere bei allen

Tieren möglichst mehrfach ein CMT durchgeführt werden. Die Verwendung des

somatischen Zellgehalts zur Selektion „infektionsverdächtiger“ Tiere wurde auch

schon von VESTWEBER (1994) und HOEDEMAKER (2001) für Kühe

vorgeschlagen. Diese Methode scheint nach den gezeigten Ergebnissen im

Anschluss an die Vakzination sinnvoller als zuvor, da die Gehalte an somatischen

Zellen in S. aureus-positiven Milchproben als Reaktion auf die Impfung deutlich

anstiegen. Die Funktionalität und Durchführbarkeit der vorgeschlagenen Maßnahmen

müsste noch in weiteren Studien untersucht werden, könnte aber eine gute

Alternative zum antibiotischen Trockenstellen insbesondere für ökologisch

wirtschaftende Betriebe mit einer S. aureus-Mastitis-Problematik darstellen.

Zusammenfassung

138

6 Zusammenfassung

Julia Jokiel (2009):

Untersuchungen zur Sanierung von Staphylococcus aureus -Mastitiden mittels

stallspezifischer Vakzinen in Schaf- und Ziegenherd en

Staphylococcus aureus ist als einer der wichtigsten Mastitiserreger bei Schafen und

Ziegen zu bezeichnen. Neben der Beeinträchtigung des betroffenen Tieres und den

wirtschaftlichen Einbußen durch geringere Milchleistung besitzen insbesondere die

subklinischen Mastitiden eine besondere lebensmittelhygienische Relevanz, da das

Ausscheiden von S. aureus bei klinisch unauffälligem Euterbefund und

unverändertem Sekret insbesondere durch Rohmilch und –produkte zu

Lebensmittelinfektionen und –intoxikationen beim Verbraucher führen kann.

Hauptziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss einer stallspezifischen Vakzine auf

das Vorkommen von S. aureus sowie die Gehalte an somatischen Zellen in zwei

Milchziegen- bzw. Milchschafbeständen zu untersuchen sowie zu prüfen, ob eine

Sanierung von Milchschaf- und Milchziegenbeständen mit bestehender S. aureus-

Mastitis-Problematik mit Hilfe stallspezifischer Vakzinen möglich ist.

Nachdem der Impfstoff auf seine Verträglichkeit insbesondere auch bei

intrazisternaler Applikation getestet worden war, wurden die Milchziegen (Betrieb A)

bzw. Milchschafe und -ziegen (Betrieb B) zweier ökologisch wirtschaftender Betriebe

in Niedersachsen geimpft. Ihnen wurde während der Laktation zweimal im Abstand

von vier Wochen die jeweilige stallspezifische Vakzine entweder subkutan oder

intrazisternal verabreicht. Die Boosterimpfung wurde in den ersten 14 Tagen nach

der folgenden Lammung per subkutaner Applikation durchgeführt. Den Tieren

wurden zu sieben (Betrieb A) bzw. sechs (Betrieb B) Beprobungszeitpunkten bis zum

Trockenstellen sowie zweimal nach der folgenden Lammung aseptisch Milchproben

entnommen und kulturell bzw. mittels spezifischer PCR auf das Vorhandensein von

S. aureus untersucht. Des Weiteren wurde die Milch auf ihren Gehalt an somatischen

Zusammenfassung

139

Zellen bzw. semiquantitativ mittels CMT untersucht sowie Resistenztests mit den

isolierten S. aureus durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Typisierung der jeweils für

die Vakzinen verwendeten sowie einiger weiterer (nach der Vakzination

identifizierter) S. aureus-Isolate aus den Betrieben durchgeführt.

Die hier durchgeführte S. aureus-spezifische PCR erwies sich im Vergleich mit der

kulturellen Untersuchung als dieser nicht überlegen.

In der Typisierung der S. aureus-Isolate wurde in beiden Betrieben und im Betrieb B

bei beiden Tierarten überwiegend derselbe Stamm nachgewiesen. Es handelte sich

nicht um MRSA, denn es wurden keine entsprechenden Gene und im Resistenztest

keine Antibiotika-Resistenzen nachgewiesen.

Die Effekte der Vakzination waren sehr unterschiedlich. Während im Betrieb B

(Milchschafe und –ziegen im Versuch) nach der Vakzination auch in der

Folgelaktation eine deutliche Reduktion der S. aureus-Prävalenz erreicht werden

konnte, stieg die Prävalenz im Betrieb A (nur Milchziegen im Versuch) nach der

Lammung wieder stark an. Während die ursprünglich hohen somatischen Zellgehalte

der Milch im Betrieb A im Laufe der Laktation reduziert werden konnten, blieben sie

im Betrieb B auf niedrigem Niveau relativ konstant.

Die S. aureus-Prävalenz und der somatische Zellgehalt lagen bei den intrazisternal

geimpften Tieren beider Betriebe fast immer über denjenigen der subkutan geimpften

Tiere. Aufgrund dieser Ergebnisse sowie des höheren Aufwandes und

Infektionsrisikos kann die intrazisternale Applikation der stallspezifischen Vakzine

nicht empfohlen werden.

Zwischen den Schafen und Ziegen des Betriebes B konnten keine signifikanten

Differenzen hinsichtlich der S. aureus-Prävalenz festgestellt werden. Es gab

allerdings Hinweise darauf, dass Ziegen häufiger als Schafe zu „Dauerausscheidern“

von S. aureus werden. Nach der Vakzination wiesen die Ziegen im Vergleich zu den

Schafen höhere somatische Zellgehalte auf.

Die somatischen Zellgehalte in den S. aureus-positiven Milchproben lagen in beiden

Betrieben erst im Anschluss an die Vakzination signifikant über denen der -negativen

Proben.

Zusammenfassung

140

Insgesamt ist zu erwarten, dass eine stallspezifische Vakzine die Sanierung von

Schaf- und Ziegenbeständen mit bestehender S. aureus-Mastitis-Problematik

unterstützen kann, sofern gleichzeitig eine gezielte Diagnostik und eine konsequente

Eliminierung von Dauerausscheidern erfolgen. Die Applikation einer stallspezifischen

Vakzine allein führt allerdings nicht zur Erregerfreiheit. Der Vergleich beider Betriebe

zeigt, dass auch melkhygienische Maßnahmen entscheidenden Einfluss auf Zellzahl

und Sanierungserfolg haben.

Summary

141

7 Summary

Julia Jokiel (2009):

Trials on eradication of Staphylococcus aureus -mastitis by means of

autogenous bacterins in dairy sheep and goats

Staphylococcus aureus is one of the most important causative organisms in case of

mastitis in goats and sheep. In addition to the impairment of the animal and financial

losses due to reduced milk yield for the farmer, especially subclinical mastitis goes

along with a special relevance for food hygiene. As S. aureus can be shed from

clinically healthy udders and thus be present in normal milk, especially raw milk and

–products can lead to food-borne infections and intoxications in consumers.

Therefore, the main aim of the present study was to investigate the influence of an

autogenous bacterin on the prevalence of S. aureus-mastitis as well as on somatic

cell counts in two flocks of dairy sheep and goats, and to investigate whether it is

possible to eradicate S. aureus from farms with established infections based on

autogenous bacterins.

After the vaccine had been tested for adverse effects when administered via the teat

canal, the goats (flock A) or goats and ewes (flock B), respectively of two organic

dairy farms in the federal state of Lower Saxony received two doses of autogenous

bacterin at four week intervals during lactation. Vaccines were administered either

subcutaneously or intramammarily via the teat canal. A subcutaneous booster

vaccination was performed during the first 14 days post partum, i.e. at the beginning

of the next lactation cycle. Milk samples were collected aseptically seven (flock A) or

six (flock B) times prior to the end of lactation and additionally twice at the beginning

of the next lactation cycle. They were cultured for bacteria, an S. aureus specific

PCR was performed on some samples, and somatic cell counts or CMT-scores were

determined. Antimicrobial susceptibility testing was performed on isolated S. aureus.

Summary

142

The vaccine strains of S. aureus as well as several strains isolated from milk samples

after vaccination, were subjected to molecular typing by DNA Microarray.

The PCR performed in this study did not prove to be superior to the bacterial culture

of milk samples.

Molecular typing predominantly revealed the same strain of S. aureus in both flocks

and in both sheep and goats. This strain did not demonstrate features of MRSA and

was susceptible to almost all antimicrobials tested.

Effects of vaccination differed very much depending on the flock. In flock B, where

both goats and ewes were vaccinated, the vaccination led to a distinct reduction of

S. aureus which lasted until the end of the study. On the contrary, in flock A (only

goats vaccinated) the prevalence of S. aureus increased after the onset of the new

lactation period. Over the course of lactation, the originally high somatic cell counts in

flock A were reduced whereas they remained at consistently low levels in flock B.

Intramammary vaccination typically resulted in increased prevalence of S. aureus

and increased somatic cell counts as compared to subcutaneous vaccination.

Consequently, this route of application for autogenous bacterins cannot be

recommended.

Concerning S. aureus prevalence, no significant differences could be detected

between goats and ewes in flock B. However, it seems that goats are more likely to

become “long-term shedders” than ewes. Following vaccination, somatic cell counts

of goats generally exceeded those of sheep.

Somatic cell counts in milk samples containing S. aureus considerably increased

after vaccination and stayed on a rather high level compared to S. aureus negative

samples.

It can be concluded that an autogenous bacterin can support eradication of S. aureus

mastitis from small ruminant dairies if targeted diagnostics and culling of long-term

shedders are carried out consequently. Application of an autogenous bacterin alone

does not lead to the elimination of S. aureus from a flock. Comparison of the two

investigated flocks showed that milking hygiene strongly influences somatic cell

counts and the outcome of a sanitation program involving autogenous bacterins.

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Anhang

164

9 Anhang

9.1 Angaben zu Tierzahlen und –bewegungen in den Be trieben

9.1.1 Betrieb A

Tabelle 9.1 und Tabelle 9.2 zeigen die Anzahl der zu den jeweiligen Zeitpunkten im

Betrieb A vorhandenen und beprobten Tiere bzw. Euterhälften. Etwaige

Diskrepanzen zwischen der Anzahl der Euterhälften und der doppelten Tierzahl

waren durch Tiere mit nur einer funktionstüchtigen Euterhälfte bedingt.

Tabelle 9.1: Anzahl der Tiere im Betrieb A zu den jeweiligen Beprobungszeitpunkten

1 2 3 4 5 6 7 8 9gesamt 69 70 71 69 69 68 68 79 78

Impfgruppe s.c. 54 55 56 56 56 56 56 68 67Impfgruppe i.z. 15 15 15 13 13 12 12 11 11

Tabelle 9.2: Anzahl der untersuchten Euterhälften im Betrieb A zu den jeweiligen

Beprobungszeitpunkten

1 2 3 4 5 6 7 8 9gesamt 138 140 141 136 136 134 134 156 154

Impfgruppe s.c. 108 110 111 110 110 110 110 134 132Impfgruppe i.z. 30 30 30 26 26 24 24 22 22

Tabelle 9.3 zeigt den S. aureus-Status der Tiere, die den Betrieb zur Schlachtung

verließen oder verendeten, zum Zeitpunkt ihres Abgangs.

Anhang

165

Tabelle 9.3: S. aureus-Status und Zeitpunkt des Abgangs von Tieren (Euterhälften)

durch Schlachtung oder Verenden im Betrieb A

Zeitpunkt*S.aureus pos. S.aureus neg. S.aureus pos. S.aureus neg.

1/2 0 1 0 22/3 1 1 1 33/4 0 3 0 64/5 0 0 0 05/6 1 0 1 16/7 0 0 0 07/8 1 1 1 38/9 1 0 2 0

Anzahl Tiere Anzahl Euterhälften

*Gemeint ist hier der Zeitraum zwischen den jeweiligen Beprobungszeitpunkten, d.h.

der Abgang eines Tieres zum Zeitpunkt 1/2 erfolgte im Zeitraum zwischen der

Erstimpfung und dem Beprobungszeitpunkt 2.

9.1.2 Betrieb B

Tabelle 9.4 und Tabelle 9.5 zeigen die Anzahl der zu den jeweiligen Zeitpunkten im

Betrieb B vorhandenen und beprobten Tiere bzw. Euterhälften. Etwaige

Diskrepanzen zwischen der Anzahl der Euterhälften und der doppelten Tierzahl

waren durch Tiere mit nur einer funktionstüchtigen Euterhälfte bedingt. Die Summe

der Tiere in den beiden Impfgruppen ist nicht immer mit der Gesamtanzahl der Tiere

identisch, weil drei Tiere zunächst subkutan und anschließend intrazisternal geimpft

wurden. Diese beiden Schafe und eine Ziege wurden in den Gruppen Schafe bzw.

Ziegen allerdings trotzdem berücksichtigt. Jeweils ca. ein Viertel der Schafe und

Ziegen gehörte der Impfgruppe i.z. an, die restlichen drei Viertel der Impfgruppe s.c..

Tabelle 9.4: Anzahl der Tiere im Betrieb B zu den jeweiligen Beprobungszeitpunkten

1 2 3 4 5 6 7 8gesamt 63 63 63 63 51 51 45 42Schafe 39 39 39 39 27 27 24 21Ziegen 24 24 24 24 24 24 21 21

Impfgruppe s.c. 46 46 46 46 40 40 34 31Impfgruppe i.z. 14 14 14 14 9 9 9 10

Anhang

166

Tabelle 9.5: Anzahl der untersuchten Euterhälften im Betrieb B zu den jeweiligen

Beprobungszeitpunkten

1 2 3 4 5 6 7 8gesamt 125 125 125 125 101 101 90 84Schafe 78 78 78 78 54 54 48 42Ziegen 47 47 47 47 47 47 42 42

Impfgruppe s.c. 92 92 92 92 80 80 68 62Impfgruppe i.z. 27 27 27 27 17 17 18 20

Tabelle 9.6 zeigt den S. aureus-Status der Tiere, die den Betrieb zur Schlachtung

verließen oder verendeten, zum Zeitpunkt ihres Abgangs.

Tabelle 9.6: S. aureus-Status und Zeitpunkt des Abgangs von Tieren (Euterhälften)

durch Schlachtung oder Verenden im Betrieb B

Zeitpunkt*S.aureus pos. S.aureus neg. S.aureus pos. S.aureus neg.

1/2 0 0 0 02/3 0 0 0 03/4 0 0 0 04/5 1 11 1 235/6 0 0 0 06/7 0 6 0 117/8 0 4 0 8


*Gemeint ist hier der Zeitraum zwischen den jeweiligen Beprobungszeitpunkten, d.h.

der Abgang eines Tieres zum Zeitpunkt 1/2 erfolgte im Zeitraum zwischen der

Erstimpfung und dem Beprobungszeitpunkt 2.

Anhang

167

9.2 Tabellen zu S. aureus-Prävalenzen

9.2.1 Betrieb A

9.2.1.1 Gesamtbestand

Tabelle 9.7: Anzahl und Prozentsatz S. aureus-positiver bzw. -negativer Tiere sowie

Euterhälften des Betriebes A zu den jeweiligen Zeitpunkten bei Betrachtung

ausschließlich der zu allen Zeitpunkten beprobten Tiere

ZeitpunkteS.aureus pos. S.aureus neg. S.aureus pos. S.aureus neg.

1 (1.Impfung) 3 (5,1%) 56 (94,9%) 3 (2,5%) 115 (97,5%)2 14 (23,7%) 45 (76,3%) 15 (12,7%) 103 (87,3%)

3 (2.Impfung) 2 (3,4%) 57 (96,6%) 2 (1,7%) 116 (98,3%)4 2 (3,4%) 57 (96,6%) 2 (1,7%) 116 (98,3%)5 2 (3,4%) 57 (96,6%) 2 (1,7%) 116 (98,3%)6 1 (1,7%) 58 (98,3%) 1 (0,9%) 117 (99,1%)7 2 (3,4%) 57 (96,6%) 2 (1,7%) 116 (98,3%)

8 (Lammung) 3 (5,1%) 56 (94,9%) 3 (2,5%) 115 (97,5%)9 9 (15,3%) 50 (84,7%) 10 (8,5%) 108 (91,5%)



Euterhälften des Betriebes A zu den verschiedenen Zeitpunkten bei Betrachtung aller



1 (1.Impfung) 4 (5,8%) 65 (94,2%) 4 (2,9%) 134 (97,1%)2 19 (27,1%) 51 (72,9%) 21 (15,0%) 119 (85,0%)

3 (2.Impfung) 5 (7,0%) 66 (93,0%) 6 (4,3%) 135 (95,7%)4 5 (7,3%) 64 (92,7%) 7 (5,2%) 129 (94,8%)5 5 (7,3%) 64 (92,7%) 6 (4,4%) 130 (95,6%)6 3 (4,4%) 65 (95,6%) 4 (3,0%) 130 (97,0%)7 4 (5,9%) 64 (94,1%) 5 (3,7%) 129 (96,3%)

8 (Lammung) 4 (5,1%) 75 (94,9%) 5 (3,2%) 151 (96,8%)9 10 (12,8%) 68 (87,2%) 12 (7,8%) 142 (92,2%)


Anhang

168

9.2.1.2 Impfgruppe s.c.


Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes A zu den jeweiligen Zeitpunkten bei

Betrachtung ausschließlich der zu allen Zeitpunkten beprobten Tiere


1 (1.Impfung) 1 (2,1%) 47 (97,9%) 1 (1,0%) 95 (99,0%)2 12 (25,0%) 36 (75,0%) 13 (13,5%) 83 (86,5%)

3 (2.Impfung) 0 (0,0%) 48 (100,0%) 0 (0,0%) 96 (100,0%)4 0 (0,0%) 48 (100,0%) 0 (0,0%) 96 (100,0%)5 0 (0,0%) 48 (100,0%) 0 (0,0%) 96 (100,0%)6 0 (0,0%) 48 (100,0%) 0 (0,0%) 96 (100,0%)7 0 (0,0%) 48 (100,0%) 0 (0,0%) 96 (100,0%)

8 (Lammung) 1 (2,1%) 47 (97,9%) 1 (1,0%) 95 (99,0%)9 4 (3,4%) 44 (96,6%) 4 (4,2%) 92 (95,8%)



Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes A zu den verschiedenen Zeitpunkten

bei Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe s.c. angehörenden Tiere


1 (1.Impfung) 2 (3,7%) 52 (96,3%) 2 (1,9%) 106 (98,1%)2 16 (29,1%) 39 (70,9%) 17 (15,5%) 93 (84,5%)

3 (2.Impfung) 1 (1,8%) 55 (98,2%) 1 (0,9%) 110 (99,1%)4 1 (1,8%) 55 (98,2%) 2 (1,8%) 108 (98,2%)5 1 (1,8%) 55 (98,2%) 2 (1,8%) 108 (98,2%)6 1 (1,8%) 55 (98,2%) 2 (1,8%) 108 (98,2%)7 1 (1,8%) 55 (98,2%) 2 (1,8%) 108 (98,2%)

8 (Lammung) 2 (2,9%) 66 (97,1%) 3 (2,2%) 131 (97,8%)9 5 (7,5%) 62 (92,5%) 6 (4,5%) 126 (95,5%)


Anhang

169

9.2.1.3 Impfgruppe i.z.


Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes A zu den jeweiligen Zeitpunkten bei



1 (1.Impfung) 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)2 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)

3 (2.Impfung) 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)4 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)5 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)6 1 (9,1%) 10 (90,9%) 1 (4,5%) 21 (95,5%)7 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)

8 (Lammung) 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)9 5 (45,5%) 6 (54,5%) 6 (27,3%) 17 (72,7%)



Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes A zu den verschiedenen Zeitpunkten

bei Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe i.z. angehörenden Tiere


1 (1.Impfung) 2 (13,3%) 13 (86,7%) 2 (6,7%) 28 (93,3%)2 3 (20,0%) 12 (80,0%) 4 (13,3%) 26 (86,7%)

3 (2.Impfung) 4 (26,7%) 11 (73,3%) 5 (16,7%) 25 (83,3%)4 4 (30,8%) 9 (69,2%) 5 (19,2%) 21 (80,7%)5 4 (30,8%) 9 (69,2%) 4 (15,4%) 22 (84,6%)6 2 (16,7%) 10 (83,3%) 2 (8,3%) 22 (91,7%)7 3 (25,0%) 9 (75,0%) 3 (12,5%) 21 (87,5%)

8 (Lammung) 2 (18,2%) 9 (81,8%) 2 (9,1%) 20 (90,9%)9 5 (45,5%) 6 (54,5%) 6 (27,3%) 16 (72,7%)


Anhang

170

9.2.2 Betrieb B



Euterhälften des Betriebes B zu den jeweiligen Zeitpunkten bei Betrachtung

ausschließlich der zu allen Zeitpunkten beprobten Tiere


1 (1.Impfung) 9 (23,1%) 30 (76,9%) 9 (11,5%) 69 (88,5%)2 4 (10,3%) 35 (89,7%) 4 (5,1%) 74 (94,9%)

3 (2.Impfung) 7 (18,0%) 32 (82,0%) 8 (10,3%) 70 (89,7%)4 4 (10,3%) 35 (89,7%) 5 (6,4%) 73 (93,6%)5 2 (5,1%) 37 (94,9%) 2 (2,6%) 76 (97,4%)6 2 (5,1%) 37 (94,9%) 2 (2,6%) 76 (97,4%)

7 (Lammung) 2 (5,1%) 37 (94,9%) 2 (2,6%) 76 (97,4%)8 2 (5,1%) 37 (94,9%) 3 (3,9%) 75 (96,1%)



Euterhälften des Betriebes B zu den verschiedenen Zeitpunkten bei Betrachtung aller



1 (1.Impfung) 14 (22,2%) 49 (77,8%) 14 (11,2%) 111 (88,8%)2 5 (7,9%) 58 (92,1%) 5 (4,0%) 120 (96,0%)

3 (2.Impfung) 13 (20,6%) 50 (79,4%) 15 (12,0%) 110 (88,0%)4 5 (7,9%) 58 (92,1%) 6 (4,8%) 119 (95,2%)5 2 (3,9%) 49 (96,1%) 2 (2,0%) 99 (98,0%)6 3 (5,9%) 48 (94,1%) 4 (4,0%) 97 (96,0%)

7 (Lammung) 2 (4,4%) 43 (95,6%) 2 (2,2%) 88 (97,8%)8 2 (4,8%) 40 (95,2%) 3 (3,6%) 81 (96,4%)


Anhang

171



Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes B zu den jeweiligen Zeitpunkten bei



1 (1.Impfung) 5 (16,7%) 25 (83,3%) 5 (8,3%) 55 (91,7%)2 2 (6,7%) 28 (93,3%) 2 (3,3%) 58 (96,7%)

3 (2.Impfung) 4 (13,3%) 26 (86,7%) 5 (8,3%) 55 (91,7%)4 2 (6,7%) 28 (93,3%) 2 (3,3%) 58 (96,7%)5 1 (3,3%) 29 (96,7%) 1 (1,7%) 59 (98,3%)6 1 (3,3%) 29 (96,7%) 1 (1,7%) 59 (98,3%)

7 (Lammung) 1 (3,3%) 29 (96,7%) 1 (1,7%) 59 (98,3%)8 1 (3,3%) 29 (96,7%) 1 (1,7%) 59 (98,3%)



Euterhälften der Impfgruppe s.c. des Betriebes B zu den verschiedenen Zeitpunkten

bei Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe s.c. angehörenden Tiere


1 (1.Impfung) 8 (17,4%) 38 (82,6%) 8 (8,7%) 84 (91,3%)2 3 (6,5%) 43 (93,5%) 3 (3,3%) 89 (96,7%)

3 (2.Impfung) 7 (15,2%) 39 (84,8%) 8 (8,7%) 84 (91,3%)4 2 (4,4%) 44 (95,6%) 2 (2,2%) 90 (97,8%)5 1 (2,5%) 39 (97,5%) 1 (1,3%) 79 (98,7%)6 2 (5,0%) 38 (95,0%) 3 (3,8%) 77 (96,2%)

7 (Lammung) 1 (2,9%) 33 (97,1%) 1 (1,5%) 67 (98,5%)8 1 (3,2%) 30 (96,8%) 1 (1,6%) 61 (98,4%)


Anhang

172



Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes B zu den jeweiligen Zeitpunkten bei



1 (1.Impfung) 4 (50,0%) 4 (50,0%) 4 (25,0%) 12 (75,0%)2 2 (25,0%) 6 (75,0%) 2 (12,5%) 14 (87,5%)

3 (2.Impfung) 3 (37,5%) 5 (62,5%) 3 (18,8%) 13 (81,2%)4 2 (25,0%) 6 (75,0%) 3 (18,8%) 13 (81,2%)5 1 (12,5%) 7 (87,5%) 1 (6,3%) 15 (93,7%)6 1 (12,5%) 7 (87,5%) 1 (6,3%) 15 (93,7%)

7 (Lammung) 1 (12,5%) 7 (87,5%) 1 (6,3%) 15 (93,7%)8 1 (12,5%) 7 (87,5%) 2 (12,5%) 14 (87,5%)



Euterhälften der Impfgruppe i.z. des Betriebes B zu den verschiedenen Zeitpunkten

bei Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt der Gruppe i.z. angehörenden Tiere


1 (1.Impfung) 5 (35,7%) 9 (64,3%) 5 (18,5%) 22 (81,5%)2 2 (14,3%) 12 (85,7%) 2 (7,4%) 25 (92,6%)

3 (2.Impfung) 5 (35,7%) 9 (64,3%) 5 (18,5%) 22 (81,5%)4 3 (21,4%) 11 (78,6%) 4 (14,8%) 23 (85,2%)5 1 (11,1%) 8 (88,9%) 1 (5,9%) 16 (94,1%)6 1 (11,1%) 8 (88,9%) 1 (5,9%) 16 (94,1%)

7 (Lammung) 1 (11,1%) 8 (88,9%) 1 (5,6%) 17 (94,4%)8 1 (10,0%) 9 (90,0%) 2 (10,0%) 18 (90,0%)


Anhang

173

9.2.2.4 Schafe


sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den jeweiligen Zeitpunkten bei Betrachtung

ausschließlich der zu allen Zeitpunkten beprobten Schafe


1 (1.Impfung) 4 (22,2%) 14 (77,8%) 4 (11,1%) 32 (88,9%)2 1 (5,6%) 17 (94,4%) 1 (2,8%) 35 (97,2%)

3 (2.Impfung) 2 (11,1%) 16 (88,9%) 2 (5,6%) 34 (94,4%)4 1 (5,6%) 17 (94,4%) 1 (2,8%) 35 (97,2%)5 0 (0,0%) 18 (100,0%) 0 (0,0%) 36 (100,0%)6 2 (11,1%) 16 (88,9%) 2 (5,6%) 34 (94,4%)

7 (Lammung) 0 (0,0%) 18 (100,0%) 0 (0,0%) 36 (100,0%)8 0 (0,0%) 18 (100,0%) 0 (0,0%) 36 (100,0%)



sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den verschiedenen Zeitpunkten bei

Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt im Bestand vorhandenen Schafe


1 (1.Impfung) 9 (23,1%) 30 (76,9%) 9 (11,5%) 69 (88,5%)2 2 (5,1%) 37 (94,9%) 2 (2,6%) 76 (97,4%)

3 (2.Impfung) 8 (20,5%) 31 (79,5%) 9 (11,5%) 69 (88,4%)4 2 (5,1%) 37 (94,9%) 2 (2,6%) 76 (97,4%)5 0 (0,0%) 27 (100,0%) 0 (0,0%) 54 (100,0%)6 3 (11,1%) 24 (88,9%) 4 (7,4%) 50 (92,6%)

7 (Lammung) 0 (0,0%) 24 (100,0%) 0 (0,0%) 48 (100,0%)8 0 (0,0%) 21 (100,0%) 0 (0,0%) 42 (100,0%)


Anhang

174

9.2.2.5 Ziegen


sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den jeweiligen Zeitpunkten bei Betrachtung

ausschließlich der zu allen Zeitpunkten beprobten Ziegen


1 (1.Impfung) 5 (23,8%) 16 (76,2%) 5 (11,9%) 37 (88,1%)2 3 (14,3%) 18 (85,7%) 3 (7,1%) 39 (92,9%)

3 (2.Impfung) 5 (23,8%) 16 (76,2%) 6 (14,3%) 36 (85,7%)4 3 (14,3%) 18 (85,7%) 4 (9,5%) 38 (90,5%)5 2 (9,5%) 19 (90,5%) 2 (4,8%) 40 (95,2%)6 0 (0,0%) 21 (100,0%) 0 (0,0%) 42 (100,0%)

7 (Lammung) 2 (9,5%) 19 (90,5%) 2 (4,8%) 40 (95,2%)8 2 (9,5%) 19 (90,5%) 3 (7,1%) 39 (92,9%)



sowie deren Euterhälften im Betrieb B zu den verschiedenen Zeitpunkten bei

Betrachtung aller zum jeweiligen Zeitpunkt im Bestand vorhandenen Ziegen


1 (1.Impfung) 5 (20,8%) 19 (79,2%) 5 (10,6%) 42 (89,4%)2 3 (12,5%) 21 (87,5%) 3 (6,4%) 44 (93,6%)

3 (2.Impfung) 5 (20,8%) 19 (79,2%) 6 (12,8%) 41 (87,2%)4 3 (12,5%) 21 (87,5%) 4 (8,5%) 43 (91,5%)5 2 (8,3%) 22 (91,7%) 2 (4,3%) 45 (95,7%)6 0 (0,0%) 24 (100,0%) 0 (0,0%) 47 (100,0%)

7 (Lammung) 2 (9,5%) 19 (90,5%) 2 (4,8%) 40 (95,2%)8 2 (9,5%) 19 (90,5%) 3 (7,1%) 39 (92,9%)


Anhang

175

9.3 Tabellen zu somatischen Zellgehalten und CMT-We rten

9.3.1 Betrieb A


Tabelle 9.23: Median, oberes und unteres Quartil sowie Maximum und Minimum der

somatischen Zellgehalte x 1000/ml (Zeitpunkt 1 bis 4) bzw. der CMT-Werte

(Zeitpunkt 5 bis 9) der Milch aller Tiere des Betriebes A

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 940 1621,3 535,75 5283 45

2 737 1668 311 4173 143 (2.Impfung) 368 999,5 194 7113 13

4 658 1323,5 239,25 5991 435 3,0 3,0 2,5 3,0 0,06 2,5 3,0 2,0 3,0 0,07 2,5 3,0 1,0 3,0 0,0

8 (Lammung) 0,5 2,0 0,0 3,0 0,09 1,5 2,5 0,5 3,0 0,0




(Zeitpunkt 5 bis 9) der Milch in der Impfgruppe s.c. des Betriebes A

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 938 1553 547,75 5283 71

2 737 1545,5 316,5 4173 143 (2.Impfung) 307,5 737 139,25 4967 13

4 723 1290 193 5991 435 3,0 3,0 2,5 3,0 0,06 2,5 3,0 2,0 3,0 0,07 2,5 3,0 1,0 3,0 0,0

8 (Lammung) 0,5 1,5 0,0 3,0 0,09 1,0 2,0 0,5 3,0 0,0

Anhang

176




(Zeitpunkt 5 bis 9) der Milch in der Impfgruppe i.z. des Betriebes A

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 1029,5 1715,75 332,25 3588 45

2 761 2541 208 3875 693 (2.Impfung) 1459,5 2695 887 7113 178

4 534 3664 305,25 5552 1695 3,0 3,0 2,125 3,0 1,06 3,0 3,0 2,125 3,0 0,57 2,5 3,0 2,0 3,0 0,0

8 (Lammung) 0,3 2,0 0,0 3,0 0,09 2,5 3,0 1,5 3,0 0,0

9.3.1.4 S. aureus-negative Milchproben



(Zeitpunkt 5 bis 9) der S. aureus-negativen Milchproben des Betriebes A


2 709 1601,75 284,5 4173 143 (2.Impfung) 372 953 188 7210 13

4 610 1327 255 5991 435 3,0 3,0 2,5 3,0 0,06 2,5 3,0 2,0 3,0 0,07 2,5 3,0 1,0 3,0 0,0

8 (Lammung) 0,5 2,0 0,0 3,0 0,09 1,3 2,0 0,5 3,0 0,0

Anhang

177

9.3.1.5 S. aureus-positive Milchproben



(Zeitpunkt 5 bis 9) der S. aureus-positiven Milchproben des Betriebes A

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 1042,5 2261,75 595,5 4862 312

2 1174 2378 1025 5125 1533 (2.Impfung) 1221 1512,25 944,75 1557 901

4 2680 3877,5 2232,5 4968 5585 3,0 3,0 3,0 3,0 3,06 3,0 3,0 3,0 3,0 3,07 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

8 (Lammung) 1,0 2,0 1,0 3,0 0,59 3,0 3,0 2,0 3,0 0,0

9.3.2 Betrieb B




(Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch aller Tiere des Betriebes B


2 149 630 74,5 5723 333 (2.Impfung) 101,5 192,5 71,75 4901 26

4 1,0 3,0 0,0 3,0 0,05 1,0 3,0 0,0 3,0 0,06 1,0 3,0 0,5 3,0 0,0

7 (Lammung) 0,25 1,125 0,0 3,0 0,08 0,0 0,5 0,0 3,0 0,0

Anhang

178




(Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch in der Impfgruppe s.c. des Betriebes B


2 130 450 72,25 5723 333 (2.Impfung) 97,5 181,25 70,25 3454 26

4 1,0 3,0 0,0 3,0 0,05 0,5 3,0 0,0 3,0 0,06 1,0 3,0 0,5 3,0 0,0

7 (Lammung) 0,5 1,0 0,0 3,0 0,08 0,0 0,5 0,0 3,0 0,0




(Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch in der Impfgruppe i.z. des Betriebes B


2 275,5 1103,75 87 3989 463 (2.Impfung) 139,5 419,25 96,25 4901 65

4 1,0 3,0 0,375 3,0 0,05 1,25 3,0 0,5 3,0 0,06 2,0 3,0 1,0 3,0 0,0

7 (Lammung) 0,0 2,625 0,0 3,0 0,08 0,5 1,0 0,0 3,0 0,0

Anhang

179

9.3.2.4 Schafe



(Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch der Schafe des Betriebes B

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 67 101 46 4046 19

2 85 178,25 48,75 3371 333 (2.Impfung) 95 141,75 76,5 4901 43

4 0,0 1,0 0,0 3,0 0,05 0,5 1,0 0,0 3,0 0,06 0,5 1,5 0,5 3,0 0,0

7 (Lammung) 0,0 0,0 0,0 3,0 0,08 0,0 0,375 0,0 2,0 0,0

9.3.2.5 Ziegen



(Zeitpunkt 4 bis 8) der Milch der Ziegen des Betriebes B

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 28,5 99,25 13 811 1

2 279,5 881,75 138,75 5723 543 (2.Impfung) 111 225,75 59,25 1817 26

4 3,0 3,0 1,0 3,0 0,05 2,25 3,0 0,5 3,0 0,06 2,25 3,0 0,5 3,0 0,0

7 (Lammung) 1,0 1,5 0,0 3,0 0,08 0,0 1,0 0,0 3,0 0,0

Anhang

180

9.3.2.6 S. aureus-negative Milchproben



(Zeitpunkt 4 bis 8) der S. aureus-negativen Milchproben des Betriebes B


2 114,5 457,25 62,75 6874 293 (2.Impfung) 96 222 62 5462 26

4 1,0 2,5 0,0 3,0 0,05 1,0 3,0 0,0 3,0 0,06 1,0 3,0 0,5 3,0 0,0

7 (Lammung) 0,0 1,0 0,0 3,0 0,08 0,0 0,5 0,0 3,0 0,0

9.3.2.7 S. aureus-positive Milchproben



(Zeitpunkt 4 bis 8) der S. aureus-positiven Milchproben des Betriebes B

Zeitpunkte Median Oberes Quartil Unteres Quartil Maximum Minimum1 (1.Impfung) 67,5 355 45,25 811 1

2 1355 3973 1268 5723 923 (2.Impfung) 105 158 86,5 1817 27

4 3,0 3,0 3,0 3,0 0,05 3,0 3,0 3,0 3,0 3,06 2,0 3,0 0,75 3,0 0,0

7 (Lammung) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,08 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Danksagung

181

Danke…

…Herrn Prof. Dr. M. Ganter, für die Kreation und Überlassung des Themas,

Beratung und Hilfestellung bei Problemen sowie für den Telefonjoker beim

Auftauchen mysteriöser Krankheiten in den Versuchsbetrieben.

…den MitarbeiterInnen des Milchlabors im Institut für Lebensmittelqualität und

-sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, für die Bestimmung des

somatischen Zellgehalts und die kulturelle Untersuchung unendlich vieler

Milchproben, für die Durchführung der Resistenztests sowie für die schnelle

Übermittlung der Ergebnisse und Hilfestellung bei weiteren labortechnischen Fragen

und Problemen.

…der Fa. WDT in Garbsen und insbesondere den MitarbeiterInnen des Serumwerks

Memsen für die kostenlose Herstellung der stallspezifischen Vakzinen, Bereitstellung

der Isolate und für zahlreiche nette Telefonate.

…Herrn Dr. S. Monecke, Institut für Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen

Fakultät Carl Gustav Carus der TU Dresden sowie Herrn Dr. H. Hotzel, Friedrich-

Löffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit in Jena, für die

Typisierung der S. aureus-Isolate mittels Microarray und die schnelle Übermittlung

der Ergebnisse.

…den BetriebsleiterInnen und MitarbeiterInnen der Betriebe, in denen dieser

Versuch durchgeführt wurde, für Ihre Kooperation und Geduld, wenn sich die Dauer

einer Melkzeit mal wieder verdoppelte oder gar verdreifachte.

…Frau V. Dziadek aus dem Labor der Klinik für kleine Klauentiere, für die nette und

gründliche Einweisung in die Geheimnisse der PCR.

Danksagung

182

…den TierärztInnen der Klinik für kleine Klauentiere, für die unkomplizierte und

immer lustige Zusammenarbeit, die Betreuung von Skèttla und Micheline sowie

deren Lämmern und für die vielen netten Kaffee- bzw. Tee- und Kekspausen.

…den TierpflegerInnen der Klinik für kleine Klauentiere, für die Betreuung und

insbesondere das Melken von Skèttla und Micheline.

…meinen MitdoktorandInnen, insbesondere Christina Schleifer und Dina Rittershaus,

für viel geteiltes Leid, reichlich Hilfestellung, Tipps und Tricks am Computer, ständige

gute Laune, schmackhafte Snacks und Entertainment im Doktorandenzimmer. Ein

besonderer Dank geht an Christina, für das Einspringen in Visite, Morgenbehandlung

oder Übungen bei „Personenschäden“ oder „defekten Triebwagen“.

…allen bisher nicht genannten MitarbeiterInnen der Klinik für kleine Klauentiere, für

ständige Hilfsbereitschaft, eine super Arbeitsatmosphäre und eine ganz tolle Zeit.

…meinen Eltern, für die andauernde finanzielle Unterstützung und dafür, dass Ihr

mich noch so lange zu Hause ertragen habt.

… meinem Freund Frank, für die Geduld und moralische Unterstützung und den

Glauben daran, dass ich irgendwann doch mal Geld verdienen werde.

…allen, die mich bei Probennahmen und Impfungen in den Betrieben unterstützt

haben.

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