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Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung Nadja Zfle pdiatrische Onkologie und Hmatologie, CVK

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Transfektionsmethoden Nadja Zfle pdiatrische Onkologie und Hmatologie, CVK

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Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien Transiente Expression Vorbergehende Expression z. B: Verlust bei Zellteilung (Verdnnung) Definitionen

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Transfektionmethoden Methoden: 1.Retroviraler Gentransfer (eigentliche Bezeichnung: Transduktion) 2.Lipofektion 3.Elektroporation 4.CaPO4-Transfektion 5.Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

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Transfektionsmethoden Methoden: 1.Retroviraler Gentransfer dauerhafte Expression 2.Lipofektion transiente 3.Elektroporation Expression 4.CaPO4-Transfektion 5.Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

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Retroviraler Gentransfer Retroviraler Lebenyzyklus: RNA-Strang Infektion & Enthllung RNA DNA Reverse Transkription Integration

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus)

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt)

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt) Einbringen des Plasmids durch Transfektion

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation fr das leere Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= Virusinhalt) Einbringen des Plasmids durch Transfektion Virusproduktion

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion Reverse Transkription

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Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion Integration Reverse Transkription

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Lipofektion Prinzip der Lipofektion: DNA + liposomales Reagenz Inkubation Liposomen endozytotische Aufnahme Transient vernderte Zelle

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Kvette zwischen Elektroden positionieren

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Spannung und Kapazitt einstellen

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Puls auslsen

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellen Puls auslsen

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Elektroporation Prinzip der Elektroporation: DNA Zellen Aufnahme der DNA

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CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

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CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

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CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

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CaPO 4 -Transfektion Prinzip der CaPO 4 -Transfektion:

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Transfektionsoptimierung am Beispiel der CaPO 4 -Transfektion Nadja Zfle pdiatrische Hmatologie und Onkologie, CVK

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Optimierung 1.Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf

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Optimierung 1.Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf 2.Welche Parameter sind wichtig? Zelldichte DNA-Menge CaPO 4 -Menge pH-Wert des Puffers Inkubationszeit andere (Temperatur der Reagenzien, Handhabung, Mengenverhltnisse, )

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Optimierung 3. Ansatztabelle Nr.Zell- dichte DNACaPO4pH Puffer Inkuba- tionszeit Transfektions- effizienz 13 * 10 6 20 g250 l7,135 MinIm FACS auswerten 23 * 10 6 30 g250 l7,135 Min 33 * 10 6 40 g250 l7,135 Min

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Optimierung 3. Ansatztabelle Nr.Zell- dichte DNACaPO4pH Puffer Inkuba- tionszeit Transfektions- effizienz 13 * 10 6 20 g250 l7,135 MinIm FACS auswerten 23 * 10 6 30 g250 l7,135 Min 33 * 10 6 40 g250 l7,135 Min 4. Plasmid-DNA Zur Optimierung ein Plasmid mit Reportergen z.B. GFP gute Auswertbarkeit im FACS

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Optimierung Protokoll Tag 0Ausaat 24 h vor der Transfektion Zellen splitten und mit der gewnschten Zelldichte aussen (z.B. 3*10 6 Zellen auf einer 10 cm Platte)

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Optimierung Protokoll Tag 1Transfektion Zutaten pro Ansatz je ein 10 ml Tube 250 l steriles Wasser DNA (z.B. 40 g fr 3*10 6 Zellen) 500 l HBS 250 l 0,5 M CaCl 2 1 ml Plastikpipette Vortexer (so nah wie mglich an der Sterilbank oder sogar drunter) Alle Reagenzien: Raumtemperatur!

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Optimierung Protokoll Tag 1 Transfektion 250 l steriles Wasser 250 l CaCl2-Lsung Mischen durch Pipettieren DNA (z.B. 40 g)

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Optimierung Protokoll Tag 1 Transfektion 250 l steriles Wasser 250 l CaCl2-Lsung Mischen durch Pipettieren DNA (z.B. 40 g) Krftig vortexen dabei 500 l 2fach HBS- Lsung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde!

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Optimierung Protokoll Tag 1 Transfektion 250 l steriles Wasser 250 l CaCl2-Lsung Mischen durch Pipettieren Krftig vortexen dabei 500 l 2fach HBS- Lsung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! dann 35 Min. inkubieren bei RT DNA (z.B. 40 g)

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Optimierung Protokoll Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchfhren warmes Medium!

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Optimierung Protokoll Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchfhren warmes Medium! Protokoll Tag 3 -Auswertung Auswertung der Zellen im FACS Anteil der lebenden Zellpopulation, die das GFP produziert? Anteil der berlebenden Zellen?