Universität Hohenheim · 2010. 1. 7. · Triade im aktiven Zentrum (Siezen und Leunissen, 1997)....

Universität Hohenheim Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. Andreas Schaller

Charakterisierung der Subtilase LeSBT2

aus Lycopersicon esculentum

Diplomarbeit von Katrin Ullrich betreut von Dr. Anna Cedzich

Hohenheim, Februar 2006

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung............................................................................................. 1

1.1 Serin-Proteasen·········································································································1

1.2 Subtilasen ·················································································································3

1.3 Pflanzliche Subtilasen·······························································································6

1.3.1 Die Subtilasenfamilie in Tomate············································································8

1.4 Zielsetzung ·············································································································11

2 Material und Methoden.................................................................... 13

2.1 Material ··················································································································13

2.1.1 Verwendete Organismen······················································································13

2.1.1.1 Pflanzen........................................................................................................ 13

2.1.1.2 Bakterienstämme.......................................................................................... 13

2.1.2 Oligonukleotide ···································································································14

2.1.3 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien ··············································14

2.1.4 Laborgeräte··········································································································17

2.1.5 Puffer und Lösungen····························································································18

2.1.5.1 Oberflächensterilisation von Samen............................................................. 18

2.1.5.2 DNA-Isolation.............................................................................................. 18

2.1.5.2.1 Isolation genomischer DNA aus Pflanzen.......................................................... 18 2.1.5.2.1.1 Schnellmethode.................................................................................................. 18 2.1.5.2.1.2 CTAB-Methode ................................................................................................. 18

2.1.5.2.2 Plasmid-DNA-Minipräparation .......................................................................... 19

2.1.5.3 PCR - Polymerasekettenreaktion ................................................................. 19

2.1.5.4 Gelelektrophorese......................................................................................... 20

2.1.5.5 RNA-Isolation .............................................................................................. 20

2.1.5.6 Northern Blot................................................................................................ 21

2.1.5.7 Southern Blot................................................................................................ 21

2.1.5.8 Hybridisierung von Northern/Southern Blot mit radioaktiv markierten

Sonden.......................................................................................................... 22

2.1.5.9 SDS-PAGE................................................................................................... 22

II

2.1.5.10 Western Blot................................................................................................. 23

2.1.5.11 Immunologischer Nachweis der Proteine .................................................... 24

2.1.5.12 Coomassie-Färbung...................................................................................... 25

2.1.5.13 Lösungen für Dünnschnitte .......................................................................... 25

2.1.5.14 Histochemischer GUS-Test.......................................................................... 25

2.1.5.15 Samenclearing .............................................................................................. 26

2.1.6 Medien und sonstiges···························································································26

2.1.7 Stammlösungen····································································································27

2.1.8 Antikörper············································································································27

2.2 Methoden················································································································28

2.2.1 Anzucht der Pflanzen···························································································28

2.2.1.1 Anzucht der Pflanzen im Gewächshaus ....................................................... 28

2.2.1.2 Anzucht der Pflanzen auf MS-Medium ....................................................... 28

2.2.2 DNA-Isolation ·····································································································28

2.2.2.1 Isolation genomischer DNA aus Pflanzen ................................................... 28

2.2.2.1.1 Schnellmethode .................................................................................................. 28 2.2.2.1.2 CTAB-Methode.................................................................................................. 29

2.2.2.2 Gewinnung von Plasmid-DNA .................................................................... 29

2.2.2.2.1 Transformation von Bakterien............................................................................ 29 2.2.2.2.2 Isolation von Plasmid-DNA ............................................................................... 30

2.2.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ····································································30

2.2.4 Auftrennung und Sichtbarmachung von DNA ·····················································31

2.2.5 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren·············································31

2.2.6 RNA-Isolation aus Tomaten ················································································32

2.2.6.1 RNAse-freies Arbeiten................................................................................. 32

2.2.6.2 RNA-Isolation .............................................................................................. 32

2.2.7 Reverse Transkription··························································································33

2.2.8 Northern Blot ·······································································································33

2.2.8.1 RNA-Gelelektrophorese............................................................................... 33

2.2.8.2 RNA-Transfer auf Membranen .................................................................... 34

2.2.9 Southern Blot ·······································································································35

2.2.10 Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden ···············································35

2.2.11 Strippen von Membranen·····················································································36

2.2.12 Isolation apoplastischer Proteine··········································································37

III

2.2.13 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford ·········································37

2.2.14 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western

Blot ······················································································································37

2.2.14.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ....................................................... 37

2.2.14.2 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen.......................................... 38

2.2.14.3 Western Blot................................................................................................. 38

2.2.14.4 Immunologischer Nachweis der Proteine .................................................... 38

2.2.15 Histologische Methoden ······················································································39

2.2.15.1 Dünnschnitte................................................................................................. 39

2.2.15.2 Histochemischer GUS-Test.......................................................................... 39

3 Ergebnisse .......................................................................................... 40

3.1 Expression von LeSBT2 in Tomate ·········································································40

3.1.1 Überprüfung der LeSBT2-Primer Spezifität·························································40

3.1.2 Expression von LeSBT2 in verschiedenen Organen der Tomate ··························41

3.1.3 Expression von LeSBT2 in verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung ··········45

3.1.4 Expression von LeSBT2 während der Samenquellung und –keimung··················48

3.2 Charakterisierung der LeSBT2-RNAi Tomatenpflanzen ········································50

3.2.1 Identifizierung transgener Pflanzen der T1-Generation ········································50

3.2.2 Western Blot Analyse der Expression von LeSBT2·············································51

3.2.3 RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2····················································53

3.2.4 Northern Blot-Analyse der Expression von LeSBT2 ···········································54

3.2.5 Southern Blot-Analyse der LeSBT2-RNAi Pflanzen ···········································55

3.2.6 Identifizierung homozygoter LeSBT2-RNAi-Linien············································56

3.2.7 Phänotyp der LeSBT2-RNAi Pflanzen·································································56

3.2.7.1 Makroskopische Betrachtung....................................................................... 56

3.2.7.2 Mikroskopische Betrachtung der unteren Blattepidermis............................ 58

4 Diskussion .......................................................................................... 60

4.1 Expressionsanalyse von LeSBT2 in Tomatenpflanzen ············································60

4.2 Charakterisierung der LeSBT2-RNAi Tomatenpflanzen ········································63

4.3 Ausblick ·················································································································65

IV

5 Zusammenfassung............................................................................. 66

6 Abkürzungsverzeichnis .................................................................... 67

7 Literaturverzeichnis.......................................................................... 69

Eidesstattliche Erklärung.......................................................................................................... 77

Danksagung.............................................................................................................................. 78

1. Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Serin-Proteasen

Proteasen werden aufgrund ihrer aktiven Gruppen der katalytischen Zentren in fünf

Hauptklassen unterteilt: Serin-, Cystein-, Aspartat-, Threonin-, und Metalloproteasen.

Serinendo- und -exoproteasen sind gekennzeichnet durch ihre enorm weite Verbreitung und

ihre unterschiedliche Funktionen (Siezen und Leunissen, 1997). Man findet sie sowohl in

prokaryontischen als auch in eukaryontischen Organismen wie zum Beispiel Pflanzen,

Nematoden, Fischen und Säugetieren. Die verschiedenen Familien der Serinproteasen sind

unterteilt in 6 Gruppen, wobei die (Chymo-)Trypsin-ähnlichen und die Subtilisin-ähnlichen

die größten Gruppen darstellen.

Abb. 1.1: Darstellung der sekundären und tertiären Struktur des Subtilisins (PDB code 2SNI) mit der für die Serinproteasen typischen katalytischen Triade im aktiven Zentrum (Siezen und Leunissen, 1997).

Alle Serinproteasen besitzen, was das aktive Zentrum betrifft, den gleichen Aufbau.

Entscheidender Baustein der katalytischen Struktur ist die Ser-His-Asp-Triade, auch

katalytische Triade genannt (Abb.1.1). Sie wurde als erstes in Chymotrypsin entdeckt. Später

wurde eine identische Struktur in Trypsin (Huber et al., 1974 und Stroud et al., 1971) und

eine ebenfalls identische Struktur in der Elastase entdeckt (Watson et al., 1970), beides

Enzyme, die eng mit dem Chymotrypsin verwandt sind. Bedeutender war deshalb die

Entdeckung einer wiederum gleich aufgebauten katalytischen Triade in der Protease

Subtilisin, einem Enzym, dessen Struktur, bis auf das aktive Zentrum, vollständig von der des

1. Einleitung

2

Chymotrypsins abweicht (Kraut et al., 1977; Drenth et al., 1971). Diese Entdeckung zeigt,

dass es sich beim aktiven Zentrum der Serinproteasen um ein Beispiel konvergenter Evolution

handelt (Dodson und Wlodawer, 1998).

Nummeriert werden die drei Aminosäuren der katalytischen Triade nach dem Chymotrypsin,

da der Mechanismus hier erstmals beschrieben wurde (Blow, 1967). In der Tertiärstruktur

kommen sich His57, Asp102 und Ser195 bis auf Wasserstoffbindungsabstände nahe und

bilden ein sogenanntes Ladungsaustauschsystem (charge-relay-system). Das Serin wird stark

nukleophil, da das Proton der Ser195 OH-Gruppe vorübergehend von His57 und Asp102

gebunden wird. Es folgt der nukleophile Angriff am Carbonylatom des Substrates und eine

Protonenübertragung auf das N-Atom der Peptidbindung führt schließlich zur Spaltung der

Peptidbindung (Abb. 1.2, Dodson und Wlodawer, 1998).

Abb. 1.2: Nukleophiler Angriff der katalytischen Triade auf die Peptidbindung. Der Punkt stellt das nukleophile Atom dar (Dodson und Wlodawer, 1998).

1. Einleitung

3

1.2 Subtilasen

Die Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen, kurz Subtilasen, stellen die zweitgrößte Gruppe der

Serinproteasen dar. Über 200 Subtilasen sind momentan bekannt und bei mehr als 170 ist die

komplette Aminosäurenabfolge aufgeklärt (Siezen und Leunissen, 1997). Namensgebend für

Subtilasen ist das bakterielle Enzym Subtilisin Carlsberg aus Bacillus licheniformis.

Subtilasen waren lange nur in Prokaryonten bekannt. Später konnte dann auch in einem

eukaryontischen Organismus, der Hefe, Saccharomyces cerevisiae, eine Subtilase, die Kex2p-

Protease, identifiziert werden (Julius et al., 1984). Das Enzym erkennt spezifisch dibasische

Motive, eine Spezifität, die vorwiegend bei Proprotein Convertasen zu finden ist (Fuller et al.,

1989a; Brenner und Fuller, 1992). Aufgrund hoher Sequenzähnlichkeit mit dem katalytischen

Zentrum der Kex2p-Protease konnte 1989 die erste tierische Subtilase, das Furin, identifiziert

werden (Fuller et al, 1989b). Es folgten die Entdeckungen weiterer Subtilasen, die alle C-

terminal von dibasischen Motiven schneiden und in die Reifung von Peptidhormonen,

Neuropeptiden, Wachstumsfaktoren und Rezeptorproteinen involviert sind (Barr et al., 1991;

Seidah und Chrétien,1999). Sie stellen somit eine Klasse von Proprotein Convertasen (PCs)

dar. Die erste pflanzliche Subtilase Cucumisin wurde aus der Melonenfrucht Cucumis melo

isoliert, enzymatisch charakterisiert und anschließend kloniert (Kaneda und Tominaga, 1975;

Yamagata et al., 1989; Yamagata et al., 1994).

Anhand von Sequenzvergleichen der katalytischen Domänen, können die Subtilasen in sechs

Familien unterteilt werden (Siezen und Leunissen, 1997). Vertreter der Subtilisin-Familie

wurden bisher nur in Mikroorganismen entdeckt. Es handelt sich hierbei hauptsächlich um

Enzyme aus Bacillus, mit Untergruppen, bestehend aus dem echten Subtilisin,

hochalkalischen Proteasen und intrazellulären Proteasen. Enzyme, die der Thermitase-Familie

zugeordnet werden, konnten bisher ebenfalls nur in Mikroorganismen gefunden werden. Die

Proteinase K-Familie umfasst eine große Familie sektretorischer Endopeptidasen, die in

Pilzen, Hefen und gramnegativen Bakterien gefunden wurden. Eine kleine Anzahl

hochspezialisierter Endopeptidasen aus grampositiven Bakterien stellt die Familie der

lantibiotischen Peptidasen dar. Bei den Enzymen der Kexin-Familie handelt es sich

größtenteils um eukaryontische Proprotein Convertasen, die in der Prozessierung von aktiven

Peptidhormonen, Wachstumsfaktoren, viralen Proteinen etc. involviert sind (Siezen und

Leunissen, 1997). Sieben der neun bekannten Subtilasen aus Säugetieren gehören in diese

1. Einleitung

4

Familie (Seidah et al., 1999a; Sedan und Chrétien, 1999), während die verbleibenden zwei,

die Site-1-Protease und das Subtilisin-Kexin-Isozym-1, der Pyrolysin-Familie zugeordent

werden (Sakai et al., 1998; Seidah et al., 1999). Die Pyrolysin-Familie zeichnet sich durch

Heterogenität der verschiedenen Enzymgruppen aus, entstanden durch Insertionen und/oder

C-terminale Erweiterungen im aktiven Zentrum. In dieser Familie findet man alle bisher

identifizierten pflanzlichen Subtilasen (Abb. 1.3; Siezen und Leunissen, 1997).

1993 wurde von Rawlings und Barret ein neues Klassifkationssystem (MEROPS) eingeführt.

Sie gruppierten Peptidasen aufgrund Sequenzähnlichkeiten im aktiven Zentrum in Familien

und Familien mit gemeinsamem evolutionärem Ursprung und ähnlicher tertiärer Struktur in

Clans (Rawlings und Barret, 1998). Die Subtilasen werden in diesem Klassifkationssystem

der S8-Familie mit den Subfamilien S8A und S8B zugeordnet. Die meisten Subtilasen aus

Säugetieren gehören der S8B-Subfamilie an, während die pflanzlichen Subtilasen bis auf eine

Ausnahme der S8A-Subfamilie angehören. (Beers et al., 2004)

1. Einleitung

5

FamiliesA

B

E

F

C

D

Proteinase K

Lantibioticpeptidases

Pyrolysin

Kexin

Thermitase

SubtilisinFamilies

A

B

E

F

C

D

Proteinase K

Lantibioticpeptidases

Pyrolysin

Kexin

Thermitase

Subtilisin

Abb. 1.3: Klassifizierung von Subtilasen. Abb. 1.3A: Ein Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie basierend auf dem Sequenzvergleich der katalytischen Domänen; ein genereller Vergleich (Siezen und Leunissen, 1997). Abb. 1.3B: Detailliertes Dendrogramm der individuellen Familien. Die Abzweigungslänge ist umgekehrt proportional zum Grad der Sequenzähnlichkeit. Dieses Dendrogramm wurde konstruiert nach der Neighborjoining Methode (Saitou und Nei, 1993).

B

A

1. Einleitung

6

1.3 Pflanzliche Subtilasen

Erst nach der Entdeckung tierischer Subtilasen wurde auch in Pflanzen deren Existenz

nachgewiesen. Die Zahl der bekannten Subtilasen in Pflanzen übersteigt die der Säugetiere

bei weitem, aber nur von einigen wenigen wurde bis jetzt die Funktion aufgeklärt. Mithilfe

der Arabidopsis thaliana sdd1-1-Mutante (stomatal density and distribution1-1) wurde

gezeigt, dass die SDD1-Subtilase eine wichtige Rolle in der Steuerung der stomatären Dichte

und Verteilung übernimmt (Abb. 1.4; Berger und Altmann, 2000). In einer weiterführenden

Studie konnte die Expression des SDD1 in den stomatären Vorläuferzellen nachgewiesen

werden. Das SDD1-Protein wird von den Zellen vermutlich in den Apoplasten sezerniert, wo

es an der Prozessierung der für die Dichte und Verteilung der Stomata verantwortlichen

Proteine beteiligt sein könnte (von Groll et al., 2002).

Abb. 1.4: Phänotyp der sdd1-1-Mutante Makroskopische Betrachtung zeigt keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp (A) und der sdd1-1 Mutante (B). In der abaxialen Epidermis der Rosettenblätter sind Unterschiede in der stomatären Dichte zwischen der Wildtyp-Kontrolle (C) und der Mutante (D) erkennbar. Bei einer stärkeren Vergrößerung wird eine veränderte Verteilung der Stomata in der sdd1-1 Pflanze (F) verglichen mit dem Wildtyp (E) deutlich. Wie die Querschnitte zeigen, weist die innere Blattstruktur der Mutante (H) keine Unterschiede zu der des Wildtyps auf (G) (Berger und Altmann, 2000).

1. Einleitung

7

Eine weitere Arabidopsis thaliana Mutante führte zur Aufklärung der Funktion der ALE1-

Subtilase. Die ale1-Mutante (abnormal leaf shape) zeigt eine veränderte Oberflächenstruktur

der Epidermis im Embryo und in jungen Pflanzen, was einen enormen Wasserverlust und

Organfusionen zur Folge hat. Für das ALE1 Gen konnte mithilfe von in situ Hybridisierung

eine spezifische Expression während der Samenentwicklung im Endosperm und im jungen

Embryo nachgewiesen werden. Ein Fehlen des ALE1-Proteins in diesen Stadien führt zu

Defekten in der Kutikula. Dies lässt darauf schließen, dass ALE1 für die korrekte Bildung der

Oberflächenstruktur benötigt wird (Abb. 1.5). Das Endosperm wurde bisher hauptsächlich als

Nahrungsquelle betrachtet, welches das Wachstum und die Entwicklung des Embryos

unterstützt. Das Expressionsmuster der ALE1-Subtilase weist nun jedoch auf eine mögliche

zusätzliche Rolle des Endosperms bei der Bildung der Embryooberfläche hin (Tanaka et al.,

2001).

Anhand der sdd1-1- und ale1-Mutanten wird deutlich, dass zumindest einige Subtilasen

wichtige Funktionen in der Entwicklung der Pflanzen übernehmen.

Abb. 1.5: Phänotyp der ale1-Mutante Die Samen wurden auf Erde ausgesät und mit einem Deckel zugedeckt. Dieser wurde drei Tage nach der Vernalisation (DAV) entfernt. (A) Wildtyp, 7 DAV; (B,C) ale1-1 Pflanzen, 7 DAV; (D) Wildtyp, 12 DAV; (E) ale1-1 Pflanze, 12 DAV, (F) ale1-1 Pflanze, 16 DAV. Die weißen Pfeile zeigen die fusionierten Organe. (G, H) zeigen Querschnitte der Wildtyp- (G) und ale1-1- (H) Kotyledonen. (I) Querschnitt fusionierter Blätter (Tanaka et al., 2001).

1. Einleitung

8

Eine Reihe weiterer Subtilasen liefert zusätzliche Hinweise für die mögliche Beteiligung

dieser Enzyme an Entwicklungsprozessen und physiologischen Abläufen in Pflanzen, wie

zum Beispiel LIM9, ein Enzym aus Lilium longiflorum, das mit der Pollenentwicklung in

Verbindung gebracht werden konnte (Taylor et al., 1997). In Alnus glutinosa wurde die

Subtilase ag12 identifiziert, die während den frühen Stadien der Wurzelknöllchenentwicklung

exprimiert wird und dadurch einen Beitrag zur Symbiose mit Actinomyzeten liefern könnte

(Ribeiro et al., 1995). In Arabidopsis thaliana ist AIR3 möglicherweise in die Entwicklung

von Seitenwurzeln involviert (Neuteboom et al., 1999), XSP1 wird in Tracheen exprimiert

(Beers und Zhao, 2001) und bei SLP1 und SLP2 handelt es sich um stressinduzierte Gene

(Golldack et al., 2003).

1.3.1 Die Subtilasenfamilie in Tomate

Den ersten Hinweis für die Existenz von Subtilisin-ähnlichen Proteasen in Tomate lieferte die

Entdeckung des SBP50-Protein, das spezifisch mit Systemin interagierte und Kreuzreaktionen

mit einem Antiserum gegen eine Proprotein Convertase (PC) aus Drosophila aufwies

(Schaller und Ryan, 1994). Systemin ist ein Peptidhormon, das nach Verwundung aus

Prosystemin freigesetzt wird (McGurl et al., 1992), essentiell für die wundinduzierte

Akkumulation von Proteinaseinhibitoren ist (Orozco-Cardenas et al., 1993) und das dibasiche

Spaltmotiv Arg10-Asp11 aufweist, das typischerweise von Subtilasen der Kexin-Familie

erkannt wird.

In der letzten Zeit wurden weitere Subtilasen in Tomate entdeckt. Inzwischen umfasst die

Subtilasenfamilie in dieser Pflanze 15 Mitglieder, die aufgrund von Sequenzhomologien fünf

verschiedenen Unterfamilien zugeordnet werden können. Lediglich um Einzelgen-

Subfamilien handelt es sich bei tmp, LeSBT1 und LeSBT2. Dahingegen bestehen die

LeSBT3/4- und die P69-Unterfamilie aus fünf bzw. sechs Mitgliedern. Ein Vergleich der

Aminosäuresequenzen zeigt innerhalb einer Unterfamilie Sequenzidentitäten zwischen 79 und

98 %. Zwischen den einzelnen Unterfamilien beträgt die Sequenzidentität zwischen 34 und

54 % (Abb. 1.6; Meichtry et al., 1999).

1. Einleitung

9

Abb. 1.6: Phylogenetischer Baum der Subtilasenfamilie in Tomate. Dargestellt ist die phylogenetische Beziehung der Tomaten Subtilasefamilie, basierend auf dem Vergleich von Aminosäurensequenzen, die von der genomischen DNA und cDNA abgeleitet wurden. Die Zahlen stellen die PAM-Distanzen (accepted point mutations per 100 residues) zwischen den Sequenzen dar (Meichtry et al., 1999).

Mittels Southern Blot-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass bis auf tmp keines der

Subtilasengene Introns enthält (Meichtry et al., 1999). Weiterhin wurde anhand der

Sequenzanalysen festgestellt, dass alle Tomaten-Subtilasen als Präproproteine codiert werden.

Am N-terminus befindet sich eine Anhäufung hydrophobischer Aminosäuren, die

typischerweise in Signalpeptiden gefunden werden und die das Protein in das sekretorische

System leiten. Im Anschluss an das Signalpeptid folgt ein Propeptid, das möglicherweise bei

der Faltung des Proteins mitwirkt, oder als intramolekularer Inhibitor des Enzyms fungiert

(Siezen et al., 1995; Ujwal und Masayori, 1996). Innerhalb der katalytischen Domäne

befindet sich eine Protease-assoziierte Domäne, die vermutlich die spezifische Bindung des

Enzyms an sein Substrat erhöht (Abb. 1.7; Mahon und Bateman, 2000).

1. Einleitung

10

SP PDSP PD

Abb. 1.7: Schematische Darstellung der Subtilasen-Struktur. SP = Signalpeptid; PD = Prodomäne; PA = Protein-assoziierte Domäne; die blauen Rauten stellen die drei charakteristischen Aminosäuren der katalytischen Triade dar.

Die Expression der Tomaten-Subtilasen in verschiedenen Organen wurde mittels Northern

Blot-Analyse ermittelt Die Expression von tmp konnte in keinen Organen nachgewiesen

werden, was nicht weiter verwunderlich ist, da es sich hierbei um ein nahe verwandtes Enzym

von LIM9 aus der Lilie handelt, das nur in bestimmten Stadien der Pollenentwicklung

exprimiert wird. LeSBT3 ist in allen Geweben detektierbar. Die Subtilasen LeSBT1, LeSBT2

und LeSBT4 hingegen zeigen ein gewebespezifisches Expressionsmuster (Abb.1.8; Meichtry

et al., 1999).

Abb. 1.8: Organspezifische Expression der LeSBT-Subtilasen. Dargestellt ist ein Northern Blot der Expression von Subtilasen LeSBT1-3, LeSBT4A, P69 und tmp in unterschiedlichen Organen der Tomate (Meichtry et al., 1999).

1. Einleitung

11

Die P69-Unterfamilie wurde bis jetzt am besten charakterisiert. Bei ihren sechs Mitgliedern

handelt es sich um ca. 69 kDa große Proteine, die im extrazellulären Raum akkumulieren

(Tornero et al., 1996 und 1997). Detaillierte Analyse der einzelnen Gene ergab, dass ihre

Expression durch Umwelteinflüsse, entwicklungs- oder gewebespezifisch reguliert wird

(Jordá et al., 1999). Entwicklungs- und gewebespezifische Expressionsmuster wurden bei

P69A und P69D beobachtet, genauso wie auch bei P69E und P69F. P69A wird konstitutiv in

allen überirdischen vegetativen Teilen der Pflanze außer den Blüten exprimiert, dahingegen

tritt P69D in den Blüten und in jungen, sich im Wachstum befindenden Blättern auf (Jordá et

al., 1999). P69E konnte während allen Entwicklungsstadien in der Wurzel und P69F in den

Hydathoden detektiert werden. Aufgrund ihrer Lokalisation wird vermutet, dass sie eine Rolle

bei der frühen Abwehr von Pathogenen übernehmen (Jordá et al., 2000). Im Gegensatz dazu

werden P69B und P69C in keinem Stadium der Pflanzenentwicklung konstitutiv exprimiert,

sondern werden durch Infektion mit Pseudomonas syringae oder Behandlung mit Salicylsäure

induziert. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass auch diese beiden Enzyme eventuell in die

Pathogenabwehr involviert sind (Jordá et al., 2000).

Die biochemische Charakterisierung der LeSBT1-Subtilase ergab weitere Aufschlüsse über

die LeSBT-Unterfamilien. Die Untersuchungen zeigten, dass drei N-terminale

Prozessierungsschritte zur vollständigen Reifung der LeSBT1 Subtilase notwendig sind.

Zuerst kommt es beim Eintritt in das sekretorische System zur Abspaltung des Signalpeptids,

gefolgt von der Prozessierung der Prodomäne und einer pH-abhängigen Abspaltung der

autoinhibitorischen Domäne. Das pH-Optimum für diese Subtilase liegt im sauren Bereich

zwischen pH 4,0 und pH 5,0. Dies steht im Einklang mit der vermuteten apoplastischen

Lokalisation des Proteins. (Janzik et al., 2000).

1.4 Zielsetzung

Nach der biochemischen und funktionellen Charakterisierung tierischer Subtilasen soll dies

nun auch mit den pflanzlichen Subtilasen erfolgen. 15 Subtilasen wurden bis heute in der

Tomate identifiziert. Sie wurden aufgrund von Sequenzhomologie in fünf Unterfamilien

unterteilt. Für die Mitglieder der P69-Unterfamilie wurde eine entwicklungs- und

gewebespezifische Expression beschrieben und deren mögliche Beteiligung an der

Pathogenabwehr postuliert. Dem tmp konnte anhand der Homologie zu LIM9 eine potentielle

1. Einleitung

12

Funktion in der Pollenentwicklung zugeordnet werden. Dahingegen ist über die Funktion der

Mitglieder der LeSBT1-, LeSBT2- und LeSBT3/4-Unterfamilien wenig bekannt. Mittels

Northern Blot-Analyse konnte eine grobe Übersicht über deren organspezifisches

Expressionsmuster erhalten werden und in einer weiteren Studie wurden die biochemischen

Eigenschaften von LeSBT1 näher untersucht.

Im Rahmen dieser Arbeit soll nun eine Charakterisierung von LeSBT2 erfolgen. Bereits in

einer früheren Studie wurde die Expression von LeSBT2 in Blättern, Kotyledonen und in der

Zellkultur festgestellt (Abb.1.8; Meichtry et al., 1999). In vorliegender Arbeit soll nun eine

detaillierte Expressionsanalyse des LeSBT2 unter Anwendung von LeSBT2-Promotor::GUS

transformierten Pflanzen und RT-PCR-Analyse durchgeführt werden. Ein weiteres Ziel war

die molekulare und phänotypische Charakterisierung bereits transformierter RNAi-Pflanzen.

Die aus diesen Experimenten erhaltenen Ergebnisse sollen zur Aufklärung der Funktion von

LeSBT2 in planta beitragen.

2. Material und Methoden

13

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Verwendete Organismen

2.1.1.1 Pflanzen

Lycopersicon esculentum cv. UC82B ROYAL SLUIS (Holland)

HP-SBT2 Transgene Tomatenlinie; wurde durch

Transformation des Wildtyps (Lycopersicon

esculentum cv. UC82B) mit folgendem Konstrukt

erhalten:

35S-P sbt2-senseRB

PDK-Intron anitsense

ocsT nosP nptII LBnosTsbt2-

SBT2::GUS Transgene Tomatenlinie; wurde durch

Transformation des Wildtyps (Lycopersicon

esculentum cv. UC82B) mit folgendem Konstrukt

erhalten:

sbt2-P uidARB nosT nosP nptII LBnosT

Die Pflanzen wurden von Prof. Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt.

2.1.1.2 Bakterienstämme

Escherichia coli DH5α chemisch kompetente Zellen von Invitrogen mit

folgendem Genotyp:

F-φ80dlacZDM15D(lacZYA-argF) U 169 deo R rec

A1 end A1 pho A hsdR17(rk-mk+) snp E44λ-thi-1gyr

A96 rel A1


14

2.1.2 Oligonukleotide

Alle verwendeten Primer wurden von Operon hergestellt

Nachweis der Kanamycinkasette

nptII(367)for 5´-ATGATCCATCATGGCTGATGC-3´

nptIIR 5´-AAGAAGGCGATAGAAGGCGAT-3´

Nachweis des SBT2-RNAi-Fragments in sense- und antisense-Orientierung

pHann_F1 5´-AAGCAAGTGGATTGATGTGAC-3´

sbt2_2 5´-GGGAAGCTTGGTACCATGGTAGTACTGATTTTACG-3´

pHann_R2 5´-AAGGATCTGAGCTACACATGC-3´

RT-PCR (Actin- bzw. SBT2-spezifisch)

actinfor_RT 5´-TGTGGGAGATGAAGCTCAATCG-3´

actinrev_RT 5´-TCAAACTATCAGTGAGGTCACG-3´

SBT2for_RT 5´-CAGTACTACCATCTACAACAGAGG-3´

sbt2(686)rev-R 5´-TCTTGCTGCAATGATGCTTCTC-3´

Nachweis der Fusion zwischen SBT2-Promotor und uidA

SBT2, Prom-for 5´-GGAAACACATGGACATAGTCC-3´

GUS, rev 5´-CCAACGCTGATCATTCCACAG-3´

Primer für SBT2-Sonde

11ms31 5´-GATGGCTGGGTAGTTC...-3´

Ums51 5´-TCAGTACTACCATCTACAAC-3´

2.1.3 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien

1,4 Dithiothreitol; Roth, Karlsruhe

2-Mercaptoethanol; Serva, Heidelberg


15

2–Propanol; Roth, Karlsruhe

Acrylamid-Rotiphorese; Roth, Karlsruhe

Advantage® 2 Polymerase Mix; Clontech, Palo Alto

Agarose; Life Technologies, Eggenstein

alkalische Phosphatase aus Kälberdarm; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Ammoniumsulfat; Merck, Darmstadt

Ampicillin Natriumsalz; Duchefa, Haarlem

Bacto-Trypton; Difco Laboratories, Detroit

Bradford Reagenz (Protein Assay); BioRad, Hercules CA

Brilliant Blau R; Roth, Karlsruhe

Bromphenolblau; Serva, Heidelberg

Calciumchlorid; Fluka AG, St. Louis

Chloroform; Roth, Karlsruhe

CTAB; Roth, Karlsruhe

D(+)-Glucose; Fluka AG, St. Louis

D(+)-Saccharose; Roth, Karlsruhe

Diethylpyrocarbonat; Roth, Karlsruhe

di-Natriumhydrogenphosphat; Merck, Darmstadt

DMSO; Roth, Karlsruhe

DNAse, RNAse frei; Stratagene, Cedar Creek

dNTP-Mix; Bioline, London

EDTA; Fluka AG, St. Louis

Essigsäure; Roth, Karlsruhe

Ethanol; Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid; Roth, Karlsruhe

Formaldehyd, Roth, Karlsruhe

Fotofixierer; Kodak, Paris

Fotoentwickler; Kodak, Paris

GeneRuler™1kb DNA Ladder; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Glycerin; Roth, Karlsruhe

Glycin; Roth, Karlsruhe

Iso-Amylalkohol; Merck, Darmstadt

Kaliumacetat; Roth, Karlsruhe

Kaliumchlorid; Roth, Karlsruhe


16

Kaliumhexacyanoferrat(II)-Trihydrat; Merck, Darmstadt

Kaliumhexacyanoferrat(III); Serva, Heidelberg

Kanamycin A monosulfat; Duchefa, Haarlem

LB Broth Low Salt; Duchefa, Haarlem

Lithiumchlorid; Merck, Darmstadt

Magermilchpulver; Regilait, Saint Martin Belle Roche

Magnesiumchlorid; Fluka AG, St. Louis

Methanol; Roth, Karlsruhe

Murashige & Skoog Medium Basal Salt Mixture; Duchefa, Haarlem

Murashige & Skoog Medium including Vitamins; Duchefa, Haarlem

N,N-Dimethylformamid; Roth, Karlsruhe

Natriumhydroxid; Roth, Karlsruhe

Natriumacetat; Merck, Darmstadt

Natriumchlorid; Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat; Merck, Darmstadt

Natriumhypochlorid; Roth, Karlsruhe

Natriumlaurylsulfat; Roth, Karlsruhe

p-Cumarsäure; Roth, Karlsruhe

Phenol; Roth, Karlsruhe

Plant Agar; Duchefa, Haarlem

PPT; Duchefa, Haarlem

Proteinase K; Roth, Karlsruhe

Restriktionsenzyme und Buffer; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

RevertAIDTM M-MuLV Reverse Transcriptase; MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

Ribonuclease A; Roth, Karlsruhe

Salzsäure; Roth, Karlsruhe

Sarcosin; ICN, Aurorar

Technovit® 3040; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim

Technovit® 7100; Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim

TEMED; Roth, Karlsruhe

Thermostabile Taq-DNA-Polymerase; PEQLAB, Erlange

Tris; Roth, Karlsruhe

Tween 20; Roth, Karlsruhe

Wasserstoffperoxid; Fluka AG, St. Louis


17

X-Gluc; Duchefa, Haarlem

Xylene Cyanol; Serva, Heidelberg

Yeast Extract; Difco Laboratories, Detroit

Plastikverbrauchsmaterial wie Pipettenspitzen, Eppendorfcups und Petrischalen wurden von

der Firma Sarstedt bezogen.

2.1.4 Laborgeräte

Binokular Zeiss SV11

Blotting-Apparatur LKB-Bromma/Pharmacia

Computerprogramme SPOT RT Software v3.5

InfinityCapt, Vilber Lourmat

Digitalkamera Coolpix995, Nikon

Digitalkamera für Mikroskop und

Binokular

Visitron Systems

Elektrophoresegerät

(für Agarosegele)

EasyCast Electrophoresis Systems Owl Scientific, Inc.

Elektrophorese-Kammer

(für Proteingele)

BioRad

Mikroskop Zeiss Axioskop 2 plus

Mikrotom Lang

Mikrotommesser Heraeus

UV-Vis Spektrophotometer DU530, Beckmann

UV-Crosslinker UV-Stratalinker 1800, Stratagene

PCR-Maschine BioRad

Photometer bioPhotometer 6131, Eppendorf

Rotoren Eppendorf F 45-30-11

Eppendorf A 4-81

Schüttler Multitron HT Infors

Biometra wt12

Vakuumrotator Savant

Zentrifugen 5415R, Eppendorf

Microspin 24, Sorvall

5810R, Eppendorf


18

2.1.5 Puffer und Lösungen

2.1.5.1 Oberflächensterilisation von Samen

Bleach 2-4 Tropfen Tween 20

6 % Natriumhypochlorid

2.1.5.2 DNA-Isolation

2.1.5.2.1 Isolation genomischer DNA aus Pflanzen

2.1.5.2.1.1 Schnellmethode

DEX-Puffer 0,14 M Sorbitol

0,22 M Tris-HCl, pH 8,0

0,22 M EDTA, pH 8,0

0,8 M NaCl

0,8 % CTAB

1 % Sarcosin

2 % β-Mercaptoethanol

TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 8,0

1 mM EDTA

2.1.5.2.1.2 CTAB-Methode

CTAB-Extraktionspuffer 2 % (w/v) CTAB

100 mM Tris-HCl, pH 8,0

20 mM EDTA

1,4 M NaCl

CTAB-NaCl-Puffer 10 % CTAB

0,7 M NaCl


19

CTAB-Präzipitationspuffer 1 % (w/v) CTAB


10 mM EDTA

High-salt TE 10 mM Tris-HCl, pH 8,0

0,1 mM EDTA

1 M NaCl

2.1.5.2.2 Plasmid-DNA-Minipräparation

Lösung I 25 mM Tris/HCl, pH 7,5

50 mM Glucose

10 mM EDTA

Lösung II 0,2 N NaOH

1 % SDS

→ vor Gebrauch frisch ansetzen

Lösung III 60 ml 5 M Kaliumacetat

11,5 ml Eisessig

→ auf 100 ml mit ddH2O auffüllen

Lösung IV 3 M Natriumacetat

→ mit Essigsäure auf pH 5,2 einstellen

2.1.5.3 PCR - Polymerasekettenreaktion

PCR-Puffer 15 mM MgCl2

100 mM (NH4)2SO4

0,08 % Triton X-100

20 % DMSO

250 mM KCl



20

2.1.5.4 Gelelektrophorese

TAE-Puffer (50x) 242 g Tris-HCl

57,1 ml Essigsäure

100 ml 0,5 M EDTA

→ auf 1l mit ddH2O auffüllen

Ladepuffer (10x) 50 % Glycerin

1 mM EDTA

0,03 % Bromphenolblau oder Xylene Cyanol

2.1.5.5 RNA-Isolation

Extraktionspuffer 75 mM NaCl


25 mM EDTA

1 % SDS

1 M β-Mercaptoethanol

PClphenol 50 ml Phenol

24 ml Chloroform

1 ml Isoamylalkohol

PCl 50 ml Phenol

48 ml Chloroform

2 ml Isoamylalkohol


21

2.1.5.6 Northern Blot

MOPS-Puffer (10x) 0,4 M MOPS

100 mM Na-Acetat

10 mM EDTA

→ mit NaOH auf pH 7,0

RNA-Probenpuffer 1 µl MOPS-Puffer (10x)

3,5 µl Formaldehyd

10 µl Formamid

denaturierendes Gel 0,96 g Agarose

90 ml ddH2O

→ kurz aufkochen, bis die Agarose

vollständig geschmolzen ist

12,5 ml MOPS-Puffer (10x)

22,5 ml Formaldehyd

20x SSC 3 M NaCl

0,3 M Na-Citrat

2.1.5.7 Southern Blot

Denaturierungslösung 1,5 M NaCl

0,5 M NaOH

Neutralisierungslösung 1,5 M NaCl

0,5 M Tris-HCl, pH 7,2

1 mM EDTA


22

2.1.5.8 Hybridisierung von Northern/Southern Blot mit radioaktiv markierten

Sonden

50x Denhardt´s-Lösung 5 g Ficoll 400

5 g PVP

5 g BSA Fraktion V

→ auf 500 ml mit ddH2O auffüllen

Hybridisierungslösung 50 % Formamid

5x SSC

50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0

2x Denhardt´s

100 µg/ml ssDNA

0,5 % SDS

Waschlösung 1 1x SSC

0,5 % SDS

Waschlösung 2 0,2x SSC

0,5 % SDS

Waschlösung zum Strippen 0,04x SSC

0,04 % SDS

2.1.5.9 SDS-PAGE

SDS-Laufpuffer (10x) 0,25 M Tris-HCl

1 M Glycin

1 % SDS

Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

0,4 % SDS


23

Sammelgelpuffer (4x) 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

0,4 % SDS

Trenngel 4,2 ml 40 % (w/v) Acrylamidstammlösung

(9 % (w/v), zwei 1,5 mm Gele) 9,6 ml ddH2O

4,6 ml 4x Trenngelpuffer

200 µl 10 % (w/v) APS

20 µl TEMED

Sammelgel 1,1 ml 40% (w/v) Acrylamidstammlösung

(4,5 % (w/v),zwei 1,5 mm Gele) 6,3 ml ddH2O

2,5 ml 4 x Sammelgelpuffer

100 µl 10 % (w/v) APS

10 µl TEMED

SDS-Probenpuffer(3x) 1,35 ml ddH2O

1,5 ml 1M Tris-HCl, pH 6,8

3 ml Glycerin

3 ml 20 % SDS-Lösung

400 µl 1 % Bromphenolblau in H2O

6 % β-Mercaptoethanol

2.1.5.10 Western Blot

Kathodenlösung 40 mM 6-Aminohexansäure

20 % (v/v) Methanol

Anodenlösung 1 0,3 M Tris-HCl, pH 10,4

20 % (v/v) Methanol

Anodenlösung 2 25 mM Tris-HCl, pH 10,4

20 % (v/v) Methanol


24

2.1.5.11 Immunologischer Nachweis der Proteine

TBS-Puffer (2x) 40 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,4

54 ml 5 M NaCl


Blockierungslösung 1x TBS, pH 7,4

0,1 % Tween 20

6 % Milchpulver

Waschlösung 1 x TBS, pH 7,4

0,1 % Tween 20

ECL A 5 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,5

45 ml ddH2O

110 µl p-Cumarsäure (90mM)

250 µl Luminol (250 mM)

(3-Aminophthalhydrazid in DMSO)

→ dunkel und kühl (4°C) aufbewahren,

maximal 3 Wochen haltbar

ECL B 100 µl 30 % H2O2

900 µl ddH2O

ECL 10 ml ECL A

30 µl ECL B

→ frisch ansetzen


25

2.1.5.12 Coomassie-Färbung

Coomassie-Färbelösung 2,5 g Coomassie Brilliant Blue R 250

450 ml Methanol

100 ml Essigsäure


Entfärbelösung 300 ml Methanol

100 ml Essigsäure


2.1.5.13 Lösungen für Dünnschnitte

Fixierungslösung FAA 50 % EtOH

5 % Eisessig

3,7 % Formaldehyd

Infiltrationslösung 100 ml Basislösung Technovit

1 g Härter I

Polymerisationslösung 15 ml Infiltrationslösung

1 ml Härter II

2.1.5.14 Histochemischer GUS-Test

X-Gluc-Färbelösung 90,33 ml ddH2O

96 ml 0,2 M Na-Phosphatpuffer pH 7,2

0,161 g Kaliumhexacyanoferrat(II)

0,125 g Kaliumhexacyanoferrat(III)-

Trihydrat


26

1,92 ml 10 % Triton X-100

3,75 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0

→ 1 mg/ml X-Gluc

2.1.5.15 Samenclearing

Hoyer´s Medium 30 ml H2O

5 ml Glycerol

100 g Chloralhydrat

2,5 g Gum arabicum

2.1.6 Medien und sonstiges

Keimungsmedium 4,4 g MSMO

30 g Saccharose

6 g Agar

→ pH mit KOH auf 5,8 einstellen, auf 1l mit

ddH2O auffüllen, 20 min autoklavieren

nach Bedarf: 75 mg/l Kanamycin

TYNG 10 g Bacto-Trypton

5 g Hefe-Extrakt

5 g NaCl

0,2 g MgSO4

→ pH auf 7,5 einstellen, auf 1l mit ddH2O

auffüllen, 20 min autoklavieren


27

LB-Medium 20 g LB Broth

12 g Agar

→ auf 1l mit ddH2O auffüllen, 20 min

autoklavieren, nach Bedarf Antibiotika:

50 mg/l Kanamycin, 100 mg/l Ampicillin

2.1.7 Stammlösungen

X-Gluc-Stammlösung 100 mM X-Gluc in Dimethylformamid

→ Lagerung bei -20°C

Kanamycin-Stammlösung 100 mg/ml ddH2O, sterilfiltriert


Ampicillin-Stammlösung 50 mg/ml ddH2O, sterilfiltriert


RNAse, pankreatisch 10 mg/ml in TE-Puffer

→ zur Inaktivierung von DNasen 10min bei

85°C inkubieren, Lagerung bei -20°C

Proteinase K 10 mg/ml in ddH2O


2.1.8 Antikörper

anti-LeSBT2 polyklonal, aus Kaninchen; wurde von Prof.

Dr. A. Schaller zur Verfügung gestellt

anti-Kaninchen IgG/

Peroxidase-Konjugat

Calbiochem,Darmstadt


28

2.2 Methoden

2.2.1 Anzucht der Pflanzen

2.2.1.1 Anzucht der Pflanzen im Gewächshaus

Samen der jeweiligen Linien wurden 3 Tage im Kühlschrank bei 4°C vernalisiert,

anschließend wurden sie im Gewächshaus in frische Erde ausgesät.

2.2.1.2 Anzucht der Pflanzen auf MS-Medium

Hierfür wurden die Samen zuerst oberflächensterilisiert. Dazu wurde die benötigte

Samenmenge in ein Eppendorfgefäß gegeben und zunächst 3 min in 70 % Ethanol inkubiert.

Es folgte eine 10-minütige Inkubation der Tomatensamen in Bleach. Im Anschluss daran

wurden sie 4-mal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Samen wurden dann unter der

Sterilbank auf Keimungsmedium ausgelegt und für 2 Tage im Kühlraum aufbewahrt.

Anschließend wurden sie in den Kulturraum mit einer Photoperiode von 12 h und einer

Temperatur von 22°C gestellt.

2.2.2 DNA-Isolation

2.2.2.1 Isolation genomischer DNA aus Pflanzen

2.2.2.1.1 Schnellmethode

Um DNA von transgenen Pflanzen für die PCR-Analyse zu erhalten, wurde eine

Schnellmethode angewandt. Ca. 10 mg Blattmaterial wurden mit flüssigem Stickstoff und mit

der Hilfe eines gekühlten Pistills zu einem feinen Pulver zermörsert. Anschließend wurden

100 µl DEX-Puffer dazugegeben und kurz gevortext. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform

wurde die Probe 30 min lang bei 65°C inkubiert und anschließend zentrifugiert (Eppendorf

5415, 5 min, RT, max. Drehzahl). Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß

überführt. Die in dem Überstand befindliche DNA wurde mit 100 µl Isopropanol für 15 min

bei RT gefällt und danach abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 15 min, 4°C, max. Drehzahl). Das

Pellet wurde dann mit 70 % Ethanol gewaschen und nach einem weiteren


29

Zentrifugationsschritt (Eppendorf 5415, 10 min, 4°C, max. Drehzahl) in 30 µl TE gelöst. Für

die PCR wurde 1 µl DNA als Template verwendet. Der Rest wurde bei -20°C eingefroren.

2.2.2.1.2 CTAB-Methode

300 mg junges Blattmaterial wurden in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zerrieben.

Das Pulver wurde dann in 800 µl vorgewärmtem (65°C) CTAB-Extraktionspuffer

aufgenommen und nach Zugabe von 16 µl β-Mercaptoethanol (Endkonzentration 2 %) 30 min

bei 65°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gemisch mit einem Volumen Chloroform

extrahiert und anschließend abzentrifugiert (Sorvall Microspin 24, max. Drehzahl, 5 min,

RT). Die wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt, mit 80 µl

vorgewärmten CTAB-NaCl-Puffer versetzt, mehrmals invertiert, ein weiteres mal mit

Chloroform extrahiert und abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 5min, RT, max. Drehzahl). Die

obere Phase wurde dann in ein neues Eppendorfgefäß transferiert und das gleiche Volumen

CTAB-Präzipitationspuffer hinzupipettiert. Falls danach die DNA nicht sofort ausfiel, wurde

das Gemisch 30 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde dann abzentrifugiert (Eppendorf

5415, 5 min, RT, 1000 rpm), in 300 µl high-salt-TE gelöst und anschließend mit 0,6-fachem

Volumen Isopropanol ÜN bei RT gefällt. Am nächsten Tag wurde das Präzipitat

abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 5 min, 4°C, 10000 rpm) und das erhaltene Pellet mit 70 %

Ethanol gewaschen und getrocknet. Es folgte ein RNAse-Verdau, wobei das Pellet in 60 µl

TE-Puffer, versetzt mit RNAse, gelöst und 30 min bei 37°C inkubiert wurde. Dann wurde die

DNA mit 0,33-fachem Volumen NH4OAc und 2,5-fachem Volumen 99 % Ethanol 30 min auf

Eis gefällt und anschließend 20 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70 % Ethanol

gewaschen, im Vakuum für 5 min getrocknet und in 50 µl ddH2O aufgenommen.

2.2.2.2 Gewinnung von Plasmid-DNA

2.2.2.2.1 Transformation von Bakterien

Die Übertragung von Plasmid-DNA in chemisch kompetente Zellen erfolgte mittels

Hitzeschocks. Hierzu wurde ein 40 µl Aliquot chemisch kompetenter Bakterien auf Eis

aufgetaut und 100 ng des zu transformierenden Plasmids zugegeben. Diese Suspension wurde

für 1 h auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock 45 s bei 42°C durchgeführt.

Nach dem Hitzeschock wurde 1 ml TYNG-Medium in das Eppendorfgefäß hinzugegeben und


30

die Zellen für 60 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Bakterienzellen auf das

jeweilige Selektionsmedium ausplattiert und über Nacht im Brutschrank bei 37°C kultiviert.

2.2.2.2.2 Isolation von Plasmid-DNA

Die Bakterien wurden in 3 ml LB-Medium, versetzt mit dem entsprechenden Antibiotikum,

ÜN bei 37°C angezogen. 1,5 ml der ÜN-Kultur wurden in Eppendorfgefäße überführt und

abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 2 min, 4°C, max. Drehzahl). Das Medium wurde verworfen

und die Bakterien in 100 µl Lösung I resuspendiert. Um die Zellen aufzuschließen, wurden

150 µl Lösung II dazugegeben und das Ganze vorsichtig gemischt. Nach einer 5-minütigen

Inkubation auf Eis wurden 150 µl Lösung III dazupipettiert. Es wurde für weitere 5 min auf

Eis inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch für 5 min zentrifugiert (Eppendorf 5415, 5

min, 4°C, max. Drehzahl). Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt, mit

einem Volumen 99 % EtOH versetzt, für 30 min auf Eis inkubiert und anschließend

abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 15 min, 4°C, max. Drehzahl). Das erhaltene Pellet wurde

dann in 200 µl TE gelöst. Es wurde anschließend 1 µl RNAse hinzupipettiert und für 30 min

bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Ansatz mit 4 µl 10 % SDS-Lösung und 2 µl Proteinase

K versetzt und für weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde dann mittels

PCl-Extraktionen gereinigt und mit 1/10 Vol. Lösung IV und dem 2,5-fachem Volumen an 99

% EtOH für 30 min bei -20°C präzipitiert. Nach Zentrifugation (Eppendorf 5415, 15 min,

4°C, max. Drehzahl) wurde das Pellet mit 500 µl eiskaltem 70 % EtOH gewaschen, im

Vakuum getrocknet, anschließend in 30 µl TE gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

2.2.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Standard-PCR wurde in einem Volumen von 25 µl in Gegenwart von 5 µl 5x PCR-Puffer,

0,5 µl dNTPs (10 mM), 5 U Taq-DNA-Polymerase und je 10 µM Forward- und Reverse

Primer durchgeführt. Die Menge an Template-DNA variierte je nach Ausgangsmaterial

(Plasmid-DNA, genomische DNA, cDNA).


31

PCR-Programm

Funktion Temperatur Dauer Zyklen

Denaturierung 95°C 5 min 1 Zyklus

Denaturierung 95°C 30 s

Annealing Primerspezifisch 30 s

Elongation 72°C Produktspezifisch

25-30

Zyklen

Elongation 72°C 7 min 1 Zyklus

Annealingtemperatur Elongationszeit

Nachweis der Kanamycinkasette 58°C 45 s

Nachweis des LeSBT2-RNAi-

Fragments in sense- und antisense-

Orientierung

58 °C 45 s

RT-PCR

• Actin-spezifisch

• LeSBT2-spezifisch

58°C

64°C

45 s

45 s

Nachweis der Fusion zwischen

LeSBT2-Promotor und uidA 58°C 45 s

Herstellen der LeSBT2-Sonde 52°C 120 s

2.2.4 Auftrennung und Sichtbarmachung von DNA

Die isolierte DNA wurde in einem TAE-Agarosegels (1 % Agarose, 0,1 %

Ethidiumbromidlösung) aufgetrennt und sichtbar gemacht. Die Elektrophorese lief in 1x

TAE-Puffer bei 60-120 V. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 1/10 Volumen

Ladepuffer versetzt. Als Größenstandard wurden 6 µl DNA-Ladder aufgetragen. Nach der

Auftrennung der DNA konnte diese unter UV-Licht sichtbar gemacht und dokumentiert

werden

2.2.5 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren

Die Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren erfolgte am Photometer (Eppendorf

bioPhotometer 6131) bei einer Wellenlänge von 260 nm in UV-Küvetten. Zusätzlich wurde

auch die Absorption bei 280 nm gemessen. Das Verhältnis der Absorptionen bei 260 nm und


32

280 nm gibt Auskunft über die Reinheit der Nukleinsäuren und sollte bei Protein-freien

Lösungen zwischen 1,8 und 2,0 liegen.

2.2.6 RNA-Isolation aus Tomaten

2.2.6.1 RNAse-freies Arbeiten

Um RNAse-freie Lösungen zu erhalten, wurden diese mit 0,01 % DEPC versetzt, geschüttelt

und ÜN stehen gelassen. Anschließend wurden die Lösungen 45 min autoklaviert.

Eppendorfgefäße wurden aus neuen Beuteln mit Handschuhen entnommen und einmal für

45 min autoklaviert. Es wurden nur gestopfte Spitzen verwendet. Verwendete Mörser und

Glasgefäße wurden 6 h bei 200°C gebacken. Gelkammern, zugehörige Schlitten und Kämme

wurden ÜN in Spülmittel eingeweicht und direkt vor der Benutzung 30 min in 0,5 N NaOH

inkubiert, danach mit ddH2O ausgespült.

2.2.6.2 RNA-Isolation

Für die RNA-Isolation wurden 300 mg Blattmaterial zu einem feinen Pulver zerrieben.

Anschließend wurde das Pulver in ein Eppendorfgefäß überführt, mit 750 µl

Extraktionspuffer versetzt und gemischt. Dann wurden 750 µl PClphenol zugegeben und der

Ansatz gut gevortext. Das Gemisch wurde für 10 min zentrifugiert (Eppendorf 5415, 4°C,

max. Drehzahl). Die obere Phase wurde dann abgenommen, zweimal mit einem Volumen PCl

extrahiert und zentrifugiert (Eppendorf 5415, 10 min, 4°C, max. Drehzahl). Anschließend

erfolgte ein zusätzlicher Extraktionsschritt mit einem Volumen Chloroform. Das

Extraktionsgemisch wurde erneut abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 10 min, 4°C, max.

Drehzahl) und die wässrige Phase zur Fällung der RNA mit dem 0,25-fachem Volumen 10 M

LiCl versetzt und ÜN bei auf Eis inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Präzipitat

abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 30 min, 4°C, max. Drehzahl). Das RNA-Pellet wurde mit 70

% Ethanol gewaschen und in 400 µl DEPC-Wasser gelöst. Es folgte eine weitere Fällung mit

1/10 Volumen 3 M NaAc, pH 4,8 und dem 2,5-fachem Volumen an 99 % EtOH. Danach

wurde das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, für 5 min im Vakuumrotator getrocknet,

anschließend in DEPC-Wasser gelöst und bei -80°C aufbewahrt.


33

2.2.7 Reverse Transkription

Die reverse Transkriptionsreaktion wurde mit der RevertAIDTM M-MuLV Reverse

Transkriptase durchgeführt. Für die reverse Transkriptionsreaktion wurden 4 µg gesamt RNA

in einem Reaktionsgefäß vorgelegt und mit DEPC Wasser auf 14 µl aufgefüllt. Die RNA-

Lösung wurde mit 4 µl DNaseI (RNase-frei) und 2 µl 10x Puffer versetzt und für 30 min bei

37°C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der Ansatz mit 2 µl EDTA versetzt und zur

Inaktiverung der DNase einem Hitzeschritt, 15 min bei 70°C, unterzogen. Um die Integrität

der RNA zu überprüfen wurden 8 µl des Ansatzes auf ein Kontrollgel aufgetragen. War keine

Degradierung der RNA zu sehen, konnte weitergearbeitet werden. Für die reverse

Transkription wurde zu 10 µl der DNA-freien RNA (= 2µg) 1 µl oligo(dT) zugegeben und

das Gemisch für 5 min bei 70°C inkubiert. Anschließend wurde das Volumen mit 4 µl 5x

Reaktion-Puffer, 2 µl dNTP-Mix (10 mM) und 2 µl DEPC–Wasser auf 19 µl aufgefüllt und

der Ansatz für 5 min bei 37°C inkubiert. Zum Schluss wurden 200 U der Reversen

Transkriptase zugefügt. Nach einer 60-minütigen Inkubation bei 42°C wurde die Reaktion

durch einen Hitzeschritt, 15 min bei 70°C, gestoppt. Für die anschließende PCR wurde je 1 µl

cDNA als Template verwendet, der Rest wurde bei -20°C eingefroren.

2.2.8 Northern Blot

2.2.8.1 RNA-Gelelektrophorese

Für den Northern Blot wurden 2 identische Gele gebraucht, das eine für die

Ethidiumbromidfärbung, das andere für den Membrantransfer. Zuerst mussten diese

vorbereitet werden. Hierfür wurden 1,5 g Agarose in 90 ml ddH2O geschmolzen. Die Lösung

wurde dann ca. 5 min abgekühlt, unter ständigem Schwenken mit 12,5 ml MOPS-Puffer (10x)

und 22,5 ml Formaldehyd versetzt und das Gel zügig gegossen.

Im Anschluss daran wurden 11 µg RNA in einem Gesamtvolumen von 11 µl mit Probenpuffer

versehen (Endvolumen 40 µl), 15 min bei 65°C denaturiert, anschließend auf Eis

abgeschreckt und kurz anzentrifugiert. Es wurden dann 4 µl Ladepuffer hinzupipettiert. Die

Gele konnten nun mit je 20 µl der RNA-Proben (= 5µg RNA) beladen werden. Als Laufpuffer

wurde 1x MOPS-Puffer verwendet. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 60 V

durchgeführt und gestoppt, wenn die Laufmittelfront ca. 9 cm gewandert war.


34

2.2.8.2 RNA-Transfer auf Membranen

Nach der Elektrophorese wurden beide Gele zweimal 15 min in einem großen Volumen

Wasser geschwenkt.

Für die Ethidiumbromidfärbung wurde das eine Gel 30 min in Wasser, versetzt mit 1 µg/ml

Ethidiumbromid, inkubiert. Anschließend wurde es ÜN in einem großen Volumen Wasser

gewaschen. Am nächsten Tag konnte die RNA dann unter UV-Licht sichtbar gemacht und

fotografiert werden.

Das Gel für den Membrantransfer wurde 15 min in 10x SSC gewaschen. In dieser Zeit wurde

die Nitrocellulosemembran auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten und erst in ddH2O

anschließend in 10x SSC geschwenkt. Das 3MM Whatmann-Filterpapier wurde in 10x SSC

getränkt. Dann wurde der Blot entsprechend dem Schaubild luftblasenfrei in einer Glasschale

aufgebaut (Abb 2.1). Eventuelle Luftblasen zwischen den einzelnen Lagen wurden mit einer

sterilen Pipette „ausgerollt“.

Abb. 2.1: Aufbau des Northern Blots.

Damit der Kapillartransfer nur durch das Gel erfolgen konnte, wurde rund um das Gel

Parafilm gelegt. Der Transfer erfolgte ÜN.

Am nächsten Tag wurde der Blot abgebaut. Zuerst wurde das Papier entfernt und die Spuren

auf der Nitrocellulosemembran markiert. Anschließend wurde die Membran kurz in 2x SSC

geschwenkt und dann auf einem Stück 3MM Whatman Filterpapier mit der RNA-Seite nach

oben gerichtet so lange getrocknet, bis sie noch feucht war, aber keine Pfützen mehr sichtbar

2 Lagen 3MM Whatman Filterpapier GelNitrocellulosemembran

Glasschale

10x SSC

3 Lagen 3MM Whatman Filterpapier

Glasplatte

ca. 5 cm Papierhandtücher

Glasplatte

200 g


35

waren. Die RNA wurde dann durch UV-Crosslink auf der Membran fixiert, die anschließend

vollständig getrocknet und bis zur Hybridisierung bei RT gelagert wurde.

2.2.9 Southern Blot

Für den Southern Blot wurden 8,25 µg DNA mit 2 verschiedenen Restriktionsenzymen

verdaut. Hierzu wurde die entsprechende Menge DNA mit 9 µl 10x Puffer und ddH2O auf 90

µl aufgefüllt und für 2 h auf Eis gestellt. Danach wurden 1 µl 10x Puffer, 7 µl ddH2O und 2 µl

Enzym (50U/µl) hinzupipettiert und ÜN bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde

nochmals 1 µl Enzym zugegeben und der Ansatz für weitere 2 h bei 37°C inkubiert, um zu

gewährleisten, dass die komplette DNA verdaut wurde. Es folgte die Fällung der DNA mit

einem Volumen Isopropanol für 2 h bei -20°C. Anschließend wurde das Gemisch

abzentrifugiert (Eppendorf 5415, 20 min, 4°C, max. Drehzahl). Das Pellet wurde dann mit

70 % Ethanol gewaschen, im Vakuumrotator getrocknet und in 20 µl ddH2O gelöst. Um die

Vollständigkeit des Verdaus zu überprüfen, wurden 2 µl auf ein Kontrollgel aufgetragen. War

die DNA vollständig verdaut, wurde der Rest auf ein Ethidiumbromid-haltiges, 0,8 %iges

TAE-Gel aufgetragen und bei 20 V ÜN elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der

Elektrophorese wurde das Gel unter UV-Licht neben einem fluoreszierenden Lineal

fotografiert, um später den DNA-Größenmarker auf den entwickelten Röntgenfilm übertragen

zu können. Anschließend wurde das Gel für 20 min in 0,25 N HCl geschwenkt. Danach

wurde es unter leichtem Schütteln erst für 30 min in Denaturierungslösung und dann zweimal

15 min in Neutralisierungslösung inkubiert. Schließlich folgte der Blotaufbau, wie beim

Northern Blot beschrieben und gezeigt. Als Transferpuffer wurde hier jedoch 20x SSC

verwendet. Der Transfer erfolgte über Nacht.

2.2.10 Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden

Für die Hybridisierung wurde die Membran zuerst in ddH2O angefeuchtet und dann in eine

Schale mit 5x SSC überführt, wo sie mithilfe zweier steriler Pipetten aufgerollt und in eine

Hybridisierungsröhre überführt wurde. Die Röhre wurde dann mit ca. 10 ml

Hybridisierungslösung gefüllt. Anschließend wurde die Membran für mindestens 2 h bei 42°C

darin prähybridisiert. Die radioaktive Markierung der Sonde wurde unter Verwendung des

„RadPrime DNA Labeling System“-Kit der Firma Invitrogen durchgeführt.

30 ng DNA wurden in 21 µl H2O denaturiert, anschließend auf Eis abgekühlt und kurz

anzentrifugiert. Es wurden auf Eis zugefügt:


36

- 1 µl 500 µM dATP

- 1 µl 500 µM dTTP

- 1 µl 500 µM dGTP

- 20 µl 2,5x Random Primer Lösung

- 5 µl (50 µCi) [α-32P]-dCTP

- 1 µl Klenow-Fragment

Der Ansatz wurde gut gemischt, kurz anzentrifugiert und 10 min bei 37°C inkubiert. Die

Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µl Stop-Puffer beendet. Danach folgte die Reinigung der

Sonde über eine Bio-Spin-Column, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Hierfür

wurde die Säule unten geöffnet, in ein 2 ml Eppendorfgefäß gesetzt und der Deckel

abgenommen, um die Säulenflüssigkeit auslaufen zu lassen. Zur vollständigen Entfernung der

Flüssigkeit wurde das Säulchen 2 min bei 3500 rpm zentrifugiert. Die radioaktive Probe

wurde in die Mitte der Säule pipettiert und 4 min bei 3500 rpm zentrifugiert. Zur Überprüfung

der Einbaurate wurde dann die Aktivität der Sonde im Durchlauf bestimmt. Die Probe wurde

dann durch Erhitzen auf 100°C für 5 min denaturiert, auf Eis abgeschreckt und kurz

anzentrifugiert. Aus der Hybridisierungsröhre wurde die Prähybridisierungslösung entfernt,

durch 10 ml frischer Hybridisierungslösung ersetzt und die denaturierte Sonde dazupipettiert.

Die Hybridisierung erfolgte ÜN bei 42°C.

Am nächsten Tag wurde die Membran in mehreren Schritten gewaschen, um unspezifisch

gebundene Sonden zu entfernen. Zunächst wurde sie kurz mit Waschlösung 1 gespült und

dann 5 min in dieser Lösung gewaschen, während die Temperatur im Hybridisierungsofen auf

60°C erhöht wurde. Es folgte ein 30-minütiger Waschschritt bei 60°C in Waschlösung 1 und

danach ein ebenfalls 30-minütiger Waschschritt bei 60°C in Waschlösung 2. Nach dem

Waschen wurde die Membran zwischen Frischhaltefolie eingepackt und je nach Stärke der

erwarteten Signale 5-14 Tage gegen einen Röntgenfilm bei -80°C exponiert.

2.2.11 Strippen von Membranen

Etwa 400 ml der Waschlösung zum Strippen wurden in der Mikrowelle zum Kochen gebracht

und dann über die Membran gegossen. Anschließend wurde die Lösung mit der sich darin

befindenden Membran noch einmal 1 min in der Mikrowelle erhitzt und dann für ca. 30 min

auf dem Schüttler abgekühlt. Je nach Stärke der Markierung wurde der Waschvorgang 1-2-


37

mal wiederholt. Danach wurde die Membran auf 3MM Whatman Filterpapier getrocknet und

bei Raumtemperatur aufbewahrt.

2.2.12 Isolation apoplastischer Proteine

Etwa 3 g frisches Blattmaterial wurde in ca. 3-5 cm2 große Stücke geschnitten und 5-mal mit

kaltem ddH2O gewaschen. Anschließend wurden die Blattstücke mit 300 ml MES-Puffer (50

mM, pH 5,0) zweimal 2 min im Wasserstrahlvakuum bei 54 mbar infiltriert. Dann wurde das

Blattmaterial trocken getupft und in eine 20 ml-Injektionsspritze überführt, die mit wenig

Filterwatte gefüllt in einem 50 ml-Falcontube hing. Es folgte die Zentrifugation der

Blattstücke bei niedriger Umdrehungszahl (Eppendorf 5810R, 10 min, 4°C, 500 x g), um eine

Kontamination mit intrazellulären Proteinen zu vermeiden. Die erhaltene Proteinlösung

konnte dann direkt für SDS-PAGE und Western Blot eingesetzt werden

2.2.13 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradfort ist ein einfacher kolorimetrischer

Test für die Messung der Gesamtproteinkonzentration. Durch die Bindung von Proteinen an

Coomassie Brilliant Blue R-250 erfolgt eine Farbänderung, die bei einer Wellenlänge von 595

nm in einem UV/Vis Spektrophotometer gemessen wird. Bei den durchgeführten Versuchen

wurde ein Teil der zu bestimmenden Proteinlösung in 800 µl ddH2O gelöst und mit 200 µl

Bradford-Reagenz versetzt. Anschließend wurde die Absorption im UV/Vis

Spektrophotometer bei 595 nm gemessen und die Proteinkonzentration anhand einer BSA-

Eichgerade errechnet

2.2.14 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE)

und Western Blot

2.2.14.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung und Analyse von Proteingemischen erfolgte mittels SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE) im diskontinuierlichen Gelsystem nach Laemmli (1970).

Hierzu wurden die Proteinextrakte mit 3x SDS-Puffer versetzt, für 5 min im Wasserbad

gekocht und über ein Polyacrylamidgel in 1x SDS-Laufpuffer bei 100 V aufgetrennt. Als

Größenstandard wurden 4 µl „PageRulerTM Prestained Protein Ladder“ aufgetragen.


38

2.2.14.2 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen

Die Detektion der Proteinbanden in Gelen erfolgte mithilfe des Farbstoffs Commassie-

Brilliant Blue, der unspezifisch an kationische und hydrophobe Seitenketten des Proteins

bindet. Das Gel wurde dabei ÜN in der Coomassie-Färbelösung inkubiert und dann in

mehreren Schritten mit Entfärbelösung gewaschen.

2.2.14.3 Western Blot

Die in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine wurden nun im

Semi-Dry-Verfahren auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran wurde dafür

auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten und vor dem Blotten kurz in ddH2O angefeuchtet,

anschließend 10 min in Anodenlösung 1 inkubiert. Das Blotting-Papier wurde ebenfalls auf

die Größe der Membran zurechtgeschnitten und 10 min in den entsprechenden Puffern

inkubiert (6 Lagen in Anodenlösung 2, 3 Lagen in Anodenlösung 1, 6 Lagen in

Kathodenlösung). Die Graphitelektroden wurden ca. 60 min gewässert, anschließend

abgetrocknet und der Blot entsprechend dem Schaubild (Abb.2.2) luftblasenfrei aufgebaut.

Die elektrophoretische Übertragung erfolgte über 90 min bei 100 mA/Gel.

Abb. 2.2: Aufbau der Apparatur beim Western Blot.

2.2.14.4 Immunologischer Nachweis der Proteine

Zur immunologischen Detektion der Proteine wurde die Membran zunächst ÜN in

Blockierungslösung auf dem Schüttler inkubiert, um die freien Protein-Bindestellen

Kathode

6 Lagen Papier in Kathodenlösung

Gel

Membran3 Lagen Papier in Anodenlösung 1

6 Lagen Papier in Anodenlösung 2

Anode


39

abzusättigen. Am nächsten Tag folgte eine 2-stündige Inkubation mit dem primären

Antikörper (anti-LeSBT2, 1:1000 in Blockierungslösung). Durch die folgenden Waschschritte

(2 x 10 min 1 x TBS pH 7.4 / 0,1 % Tween und 1 x 10 min Blockierlösung) wurden die

unspezifisch gebundenen Antikörper entfernt. Anschließend wurde die Membran für 1 h mit

dem sekundären Antikörper (anti-Rabbit IgG, Peroxidase Conjugate), der 1:10.000 in

Blockierungslösung verdünnt wurde, inkubiert. Danach wurde die Membran 4-mal

gewaschen (3 x 10 min 1 x TBS pH 7.4 / 0,1 % Tween und 1 x 2 min 1 x TBS pH 7.4).

Während des letzten Waschschrittes wurde die ECL-Lösung angesetzt und die Membran

anschließend 1 min darin inkubiert. Danach wurde die Membran blasenfrei in Folie

eingepackt und für ca. 5-10 s gegen einen Röntgenfilm exponiert.

2.2.15 Histologische Methoden

2.2.15.1 Dünnschnitte

Das Pflanzenmaterial wurde für mindestens 1 h in FAA-Lösung fixiert und danach mit

ansteigenden Konzentrationen EtOH (50 %, 70 %, 85 % und 100 %) jeweils 12 h entwässert.

Nach dem Ende der Entwässerung folgte die Präinfiltration mit ansteigenden Konzentrationen

Technovit-Lösung 7100 (25 % Technovit in Ethanol, 50 % Technovit in Ethanol, 75 %

Technovit in Ethanol, 100 % Technovit; Inkubationszeit jeweils 12 h). Hierbei wurde das

EtOH durch ansteigende Konzentrationen der Technovit-Lösung 7100 ersetzt. Nun folgte die

Infiltration mit Technovit 7100 und Härter I. Die Polymerisation mit Härter II erfolgte ÜN.

Mit Techovit 3040 wurde das Polymerisationsprodukt am Histobloc befestigt.

2.2.15.2 Histochemischer GUS-Test

Das zu untersuchende Pflanzenmaterial wurde nach dem Abtrennen in X-Gluc-Färbelösung

überführt und im Vakuum für 3 min infiltriert. Nach diesem Schritt, wurde das Material ÜN

bei 37°C inkubiert und am nächsten Tag mit 70 % EtOH entfärbt.

3. Ergebnisse

40

3 Ergebnisse

3.1 Expression von LeSBT2 in Tomate

Für die Expressionsanalyse von LeSBT2 wurden zum einen LeSBT2-Promotor::GUS

transformierte Pflanzen verwendet, zum andern wurde aus verschiedenen Pflanzenorganen in

unterschiedlichen Entwicklungsstadien RNA isoliert und damit RT-PCR-Analysen mit

LeSBT2-spezifischen Primern durchgeführt.

3.1.1 Überprüfung der LeSBT2-Primer Spezifität

Bevor mit der RT-PCR begonnen werden konnte, musste die Spezifität der zu verwendenden

LeSBT2-Primer überprüft werden. Hierzu wurde eine PCR durchgeführt, bei der diese Primer

auf cDNAs von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 getestet wurden. Die Größe des

erwarteten PCR-Produkts betrug 399 bp. Anhand der Abbildung 3.1.1 wird ersichtlich, dass

nur auf der cDNA von LeSBT2 ein PCR-Produkt gebildet wurde. Es wurde somit davon

ausgegangen, dass die Primer für LeSBT2 spezifisch sind und im Folgenden für die RT-PCR

eingesetzt werden können

LeSB

T1Le

SBT2

LeSB

T3Le

SBT4

0-W

ert

750 bp500 bp

250 bp

1000 bp1500 bp2000 bp

Abb. 3.1.1: Spezifität der LeSBT2-Primer Abgebildet ist das Ergebnis der PCR auf cDNA von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 mit der für LeSBT2 spezifischen Primerkombination.

3. Ergebnisse

41

3.1.2 Expression von LeSBT2 in verschiedenen Organen der Tomate

RT-PCR-Analyse

Für diesen Versuch wurde eine ca. 6 Wochen alte Pflanze verwendet. Es wurden Proben von

folgenden Organen genommen: Wurzel, unterer und oberer Teil des Stängels, junge,

halbentwickelte und vollentwickelte Blätter, Blattstiele von jungen und vollentwickleten

Blättern und offene Blüten. Die RNA der verschiedenen Organe wurde isoliert und über

Reverse Transkription die cDNA gewonnen, die nun über PCR auf die Präsenz von SBT2

untersucht werden konnte. Um die Menge und Qualität der cDNA zu überprüfen, wurde

zuerst eine Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern durchgeführt. Wurden nach 25

Zyklen Unterschiede in der Intensität erhaltener Actin-Banden festgestellt, musste die Menge

an eingesetzter cDNA entsprechend korrigiert werden. Außerdem sollte mithilfe dieser

Kontroll-PCR die Kontamination der erhaltenen cDNA mit genomischer DNA überprüft

werden, da das SBT2-Gen im Gegensatz zum Actin-Gen keine Introns enthält und ein PCR-

Produkt basierend auf der Amplifikation genomischer DNA nicht von dem Ergebnis

vervielfältigter cDNA unterschieden werden kann. Die erwarteten Größen der PCR-Produkte

betrugen beim Actin auf der genomischen DNA 614 bp und auf der cDNA 410 bp. Die PCR

mit SBT2-spezifischen Primern wurde immer mit doppelter Menge cDNA und bei 30 Zyklen

durchgeführt. Die berechnete Größe des PCR-Produkts betrug 399 bp. Anhand der Abbildung

3.1.2 wird erkennbar, dass LeSBT2 in allen untersuchten Organen exprimiert wurde.

Allerdings ist die Expression in vollentwickelten Blättern und deren Blattstielen, in der

Wurzel, im unteren Teil des Stängels und in offenen Blüten nur sehr schwach. Eine höhere

Menge an LeSBT2 mRNA wurde in halbentwickelten Blättern, in Blattstielen junger Blätter

und im oberen Teil des Stängels detektiert. Die eindeutig höchste Expression dieses Gens

konnte in jüngsten Blättern nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte somit

festgestellt werden, dass insgesamt in jungen, grünen Organen LeSBT2 am stärksten

exprimiert wird. Die zusätzlich durchgeführte PCR mit Actin-spezifischen Primer zeigt, dass

in allen Reaktionsansätzen die gleiche Menge an cDNA eingesetzt wurde (nach 25 Zyklen)

und diese zudem frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (nach 30 Zyklen).

3. Ergebnisse

42

Actin

Actin

LeSBT2

Wur

zel

Stän

gel u

nten

Stän

gel o

ben

BS ju

nger

Blät

ter

BS vo

llent

w. B

lätte

r

Jüng

ste B

lätte

rVo

llent

wick

elte

Blät

ter

Blüt

en

Halbe

ntwi

ckelt

e Bl

ätte

rgD

NA0-

Wer

t

30Zyklen

25Zyklen

30ZyklenActin

Actin

LeSBT2

Wur

zel

Stän

gel u

nten

Stän

gel o

ben

BS ju

nger

Blät

ter

BS vo

llent

w. B

lätte

r

Jüng

ste B

lätte

rVo

llent

wick

elte

Blät

ter

Blüt

en

Halbe

ntwi

ckelt

e Bl

ätte

rgD

NA0-

Wer

t

30Zyklen

25Zyklen

30Zyklen

750 bp500 bp

250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

750 bp500 bp

250 bp

Abb 3.1.2: Expression von LeSBT2 in verschiedenen Organen der Tomate. Dargestellt ist das Ergebnis der RT-PCR mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. LeSBT2 wird am stärksten in jungen, grünen Organen der Tomate exprimiert (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primer zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten). BS = Blattstiel

3. Ergebnisse

43

Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression

Parallel zur Expressionsanalyse mittels RT-PCR wurde die histochemische Lokalisation der

LeSBT2-Promotor::GUS Expression in Blättern, Blattstielen und Stängeln durchgeführt. Für

diesen Versuch wurden von fünf unabhängigen Linien Pflanzen der T2-Generation verwendet.

Dabei konnte eine Aktivität der β-Glucuronidase nur in zwei Linien in den Schließzellen der

Stomata untersuchter Organe beobachtet werden. Die gezeigten Bilder stellen exemplarisch

die Färbung der Stomata in den Blättern dar (Abb. 3.1.3). Zur Bestätigung erhaltener

Resultate wurden weitere Pflanzen transformiert. Die bereits erhaltenen Ergebnisse konnten

in vier weiteren Linien verifiziert werden.

A B Abb. 3.1.3: Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression in Stomata Abgebildet ist die Unterseite eines Tomatenblatts mit GUS-Aktivität in den Schließzellen der Stomata in der Übersicht (A) und im Detail (B).

In zwei unabhängigen Linien, die eine besonders starke Aktivität der β-Glucuronidase

zeigten, konnte zusätzliche Blaufärbung der Trichome festgestellt werden (Abb. 3.1.4).

3. Ergebnisse

44

A

B

C

Abb. 3.1.4: : Histochemische Lokalisation der LeSBT2 Promotor::GUS Expression in Trichomen Abgebildet sind die Oberseite eines Blattes mit hoher GUS-Aktivität in der Aufsicht (A), die Blaufärbung in den Trichomen (B) und ein gefärbtes Trichom im Detail (C).

Blätter mit starker Aktivität der β-Glucuronidase wurden nach der Technovit-Methode

eingebettet, um Querschnitte anfertigen zu können. Die Blätter sollten so auf das

Vorhandensein der GUS-Aktivität in weiteren Komponenten untersucht werden. Wie die

Abbildung 3.1.5 zeigt, konnte in Querschnitten von Blättern die Blaufärbung in den Stomata

bestätigt werden. In einer Linie konnte zusätzlich im Leitbündelgewebe von der GUS-

Aktivität hervorgerufene Färbung beobachtet werden.

3. Ergebnisse

45

Abb. 3.1.5: Histochemische Lokalisation der SBT2 Promotor::GUS Expression in Blättern Abgebildet sind die Querschnitte zweier Blätter mit GUS-Aktivität in den Stomata (A) und im Leitbündelgewebe (B); S= Stomata, P= Palisadenparenchym, C= Cuticula, oE= obere Epidermis, X= Xylem, Ph= Phloem, uE= untere Epidermis, SP= Schwammparenchym

3.1.3 Expression von LeSBT2 in verschiedenen Stadien der

Blütenentwicklung

RT-PCR-Analyse

Nachdem eine schwache Expression von LeSBT2 in offenen Blüten festgestellt wurde

(Kapitel 3.1.2), trat die Vermutung auf, dass auch in diesen Organen LeSBT2 ein

entwicklungsspezifisches Expressionsmuster aufweisen könnte. Aus diesem Grund wurden

verschiedene Stadien der Blütenentwicklung genauer untersucht. Das Blütenmaterial wurde

dabei in fünf verschiedenen Entwicklungsstadien gesammelt: Stadium 1 stellt fünf Tage,

Stadium 2 drei Tage vor der Anthese dar, Stadium 3 beschreibt den Tag der Anthese, die

Stadien 4 und 5 bezeichnen die Tage 2 und 4 nach der Anthese (Abb. 3.1.6). Bei der

folgenden RT-PCR-Analyse wurde vorgegangen, wie bereits im Kapitel 3.1.2 beschrieben.

A B

S

P

oEC

SP

PhX

uE

3. Ergebnisse

46

12

34

5

12

34

5 Abb 3.1.6: Die fünf verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung. 1= 5 Tage vor der Anthese; 2= 3 Tage vor der Anthese; 3= Tag der Anthese; 4= 2 Tage nach der Anthese; 5= 4 Tage nach der Anthese

Die RT-PCR-Analyse ergab, dass auch in Blüten LeSBT2 entwicklungsabhängig exprimiert

wird. Die Abbildung 3.1.7 zeigt eine Abnahme der Expression von LeSBT2 vom Stadium 1

bis zum Stadium 3. In den Stadien 4 und 5 traten keine weiteren Veränderungen der LeSBT2

mRNA-Menge auf. Ähnlich wie in Blättern (Kapitel 3.2.1) nimmt auch in Blüten die

Expressionsrate von LeSBT2 mit fortschreitender Entwicklung stetig ab.

SBT2

Actin

Actin

Stad

ium

1St

adiu

m 2

Stad

ium

3St

adiu

m 4

Stad

ium

5gD

NA

0-W

ert

30Zyklen

25Zyklen

30Zyklen

750 bp500 bp

250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

Abb. 3.1.7: Expression von LeSBT2 in verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung Dargestellt ist das Ergebnis der RT-PCR mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. Die höchste Expressionsrate von LeSBT2 konnte im Stadium 1 nachgewiesen werden (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten).

LeSBT2

3. Ergebnisse

47


Für diesen Versuch wurden von T2-Pflanzen dreier unterschiedlicher Linien Blüten in

verschiedenen Entwicklungsstadien gesammelt und mithilfe der X-Gluc-Färbelösung

angefärbt. In lediglich einer Linie konnte Aktivität der β-Glucuronidase in Blüten

nachgewiesen werden. Anhand der Abbildung 3.1.8 wird ersichtlich, dass der LeSBT2-

Promotor in allen Entwicklungsstadien hauptsächlich in den Kelchblättern aktiv war.

Mikroskopische Betrachtung der Kelchblätter zeigte, dass auch hier die GUS-Aktivität in den

Stomata auftritt. Die beobachtete Blaufärbung in späteren Stadien der Blütenentwicklung

widerspricht nicht den Ergebnissen der RT-PCR, da die β-Glucuronidase eine hohe Stabilität

aufweist und wenn sie im Stadium 1 der Blütenentwicklung gebildet wird wahrscheinlich

auch zum späteren Zeitpunkt noch aktiv ist. Auffällig ist auch die zunehmende GUS-Aktivität

in der Stigmaoberfläche bis zum Stadium 4. Im Stadium 5 ist hier jedoch keine Färbung mehr

sichtbar, was möglicherweise mit beginnender Seneszenz der Blüte und dem damit

einhergehenden Abbau der Proteine erklärt werden kann.

Stadium 3

Stadium 5Stadium 4

Stadium 2Stadium 1

Fruchtknoten

Griffel

Stigma

KelchblattKronblatt

Pistill

Abb. 3.1.8: Histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression in verschiedenen Stadien der Blütenentwicklung Abgebildet sind Blüten in den Entwicklungsstadien 1-5. GUS-Aktivität konnte in allen Stadien hauptsächlich in den Kelchblättern nachgewiesen werden. Außerdem wurde eine zunehmende Aktivität der β-Glucuronidase in der Stigmaoberfläche bis zum Stadium 4 nachgewiesen werden, die allerdings im Stadium 5 vollkommen fehlt.

3. Ergebnisse

48

3.1.4 Expression von LeSBT2 während der Samenquellung und –keimung

RT-PCR-Analyse

Für diesen Versuch wurden 60 Samen, aufgeteilt auf drei Petrischalen, auf nassem

Filterpapier ausgelegt und im Brutschrank bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 24, 48 und

72 Stunden wurden je 20 vorgequollene Samen geerntet. Ferner wurden zehn Tage alte

Keimlinge, die steril im Kulturraum bei 22°C und einer Photoperiode von 12 Stunden

angezogen wurden, für die RT-PCR verwendet. Aus den vorgequollenen Samen, sowie

Wurzeln, Hypokotylen und Kotyledonen der Keimlinge wurde RNA isoliert und wie bereits

in Kapitel 3.1.2.1 beschrieben eine RT-PCR-Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse in der

Abbildung 3.1.9 zeigen, dass LeSBT2 bereits 24 h nach Beginn der Quellung sowie zu

späteren Zeitpunkten exprimiert wurde. Im Keimling war die Expression von LeSBT2 in

Hypokotylen und Kotyledonen erkennbar, nicht jedoch in der Wurzel.

Actin

Actin

LeSBT2

24h

48h

72h

Wur

zel

Hypo

koty

lKo

tyle

done

ngD

NA

0-W

ert

30Zyklen

25Zyklen

30Zyklen

750 bp

500 bp

250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

Abb. 3.1.9: LeSBT2-Expression während der Samenquellung und –keimung Abgebildet ist das Ergebnis der RT-PCR-Analyse mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. LeSBT2 wurde schon 24 h nach der Quellung, sowie zu späteren Zeitpunkten exprimiert. Im Keimling war Expression von LeSBT2 nur in Hypokotyl und Kotyledonen erkennbar (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten).

3. Ergebnisse

49


Für die histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS Expression wurden von drei

unabhängigen, homozygoten Linien Tomatensamen, wie bereits in 3.1.4.1 beschrieben,

vorgequollen und mit der X-Gluc-Färbelösung auf die Lokalisierung der β-Glucuronidase-

Aktivität untersucht. Von denselben Linien wurden auch 12 Tage alte Keimlinge auf die

Aktivität des LeSBT2-Promotors untersucht. Anhand der Abbildung 3.1.10 wird ersichtlich,

dass die GUS-Aktivität nach dem Aufbrechen der Samenschale im micropylaren Endosperm

nachgewiesen werden konnte. Dieses Ergebnis konnte in zwei unabhängigen Linien

beobachtet werden. Auch in Keimlingen zweier unabhängiger Linien konnte GUS-Aktivität

detektiert werden. Die Blaufärbung beschränkte sich hier auf Hypokotyl, Kotyledonen und

Primärblätter. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten somit die der RT-PCR-Analyse.

24h

48h

72h

Abb.3.1.10: Histochemische Lokalisation der LeSBT2 Promotor::GUS Expression während der Samenquellung und -keimung GUS-Aktivität wird nach dem Aufbrechen der Samenschale am micropylaren Endosperm detektierbar. Im Keimling kann die Aktivität der β-Glucuronidase in den oberirdischen Organen lokalisiert werden.

12 Tage

3. Ergebnisse

50

3.2 Charakterisierung der LeSBT2-RNAi Tomatenpflanzen

3.2.1 Identifizierung transgener Pflanzen der T1-Generation

Samen der T0-Generation von sieben Linien wurden auf Kanamycin-haltiges Medium

ausplattiert, lediglich bei zwei Linien sind Kanamycin-resistente Keimlinge gewachsen. Es

bestand die Möglichkeit, dass die Pflanzen zwar keine Resistenz mehr gegen Kanamycin

aufwiesen, das Transgen aber enthielten. Aus diesem Grund wurden von jeder Linie 20

Samen auf Erde ausgesät und die Keimlinge über PCR auf die Anwesenheit des nptII-Gens,

sowie des LeSBT2-RNAi-Fragments in sense- und antisense-Orientierung analysiert. Es

wurde dabei für das PCR-Produkt des nptII-Gens eine Größe von 445 bp erwartet, für die

Produkte der LeSBT2-RNAi- Fragmente in sense- und antisense-Orientierung wurden 323 bp

und 325 bp berechnet. Anhand der Abbildung 3.2.1 wird ersichtlich, dass in vier von

insgesamt sieben Linien das T-DNA-Konstrukt in das Genom integriert wurde. Je zwei

Pflanzen dieser Linien wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet.

pHannR2sbt2_2

pHannF1Sbt2_2

nptII(367)fornptIIR

wt1 wt2 1 51 64 55 56 57 51 52 53 54 50 52 53 54 50 51 52 54 +

#1 #7 #9 #10

750 bp500 bp250 bp

750 bp500 bp250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

35S-Psbt2-senseRB



0-W

ert

pHannR2sbt2_2

pHannF1Sbt2_2

nptII(367)fornptIIR

wt1 wt2 1 51 64 55 56 57 51 52 53 54 50 52 53 54 50 51 52 54 +

#1 #7 #9 #10

750 bp500 bp250 bp

750 bp500 bp250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

35S-Psbt2-senseRB



pHannR2sbt2_2

pHannF1Sbt2_2

nptII(367)fornptIIR

wt1 wt2 1 51 64 55 56 57 51 52 53 54 50 52 53 54 50 51 52 54 +

#1 #7 #9 #10

750 bp500 bp250 bp

750 bp500 bp250 bp

750 bp

500 bp

250 bp

35S-Psbt2-senseRB



35S-Psbt2-senseRB



0-W

ert

Abb. 3.2.1: Identifizierung transgener Pflanzen der T1-Generation Abgebildet sind die Ergebnisse der PCR-Analyse auf das Vorhandensein des nptII-Gens, des sense- und des antisense-LeSBT2-Fragments. Die verwendeten Primer pHannF1, sbt2_2, pHannR2, nptII(367)for und nptIIR sind in den entsprechenden Farben als Pfeile unterhalb des schematisch dargestellten Konstrukts eingezeichnet. Die roten Zahlen bezeichnen die Pflanzen, die für die weiteren Arbeiten verwendet wurden. + = Positiv-Kontrolle, hierfür wurde eine bereits als positiv identifizierte Pflanze verwendet

3. Ergebnisse

51

3.2.2 Western Blot Analyse der Expression von LeSBT2

Das Prinzip der RNA-Interferenz (RNAi) beruht auf posttranskriptioneller Hemmung der

Genexpression. Durch die Transkription der im T-DNA-Konstrukt enthaltenen LeSBT2-

Sequenzabschnitte mit Selbstkomplementarität kommt es nämlich zur Ausbildung

doppelsträngiger Fragmente der LeSBT2 mRNA, die zu 21-23 bp großen RNA-Fragmente, so

genannten siRNAs (small interfering RNA), zerschnitten werden. Ein Strang der gebildeten

siRNAs wird dann von einem Enzymkomplex, dem RISC-Komplex (RNAi-induzierter

Silencing-Komplex) integriert, was letztendlich zum Abbau der zelleigenen LeSBT2 mRNA

führt. Folgend wird auch kein LeSBT2-Protein gebildet.

Im Western Immunoblot mit dem anti-LeSBT2 Antikörper sollte nun das Fehlen des LeSBT2-

Proteins in transgenen Pflanzen überprüft werden. Hierzu wurden junge Blätter transgener

Pflanzen der T1-Generation geerntet und eine Extraktion der gesamten Proteine durchgeführt.

Die erhaltene Proteinlösung wurde dann in SDS-PAGE mit anschließendem Western Blot

analysiert. Es konnte jedoch in Proteinextrakten der Wildtyp-Pflanzen, die als Positiv-

Kontrolle dienten, kein LeSBT2 nachgewiesen werden. Es trat die Vermutung auf, dass

LeSBT2 im Gesamtproteinextrakt nicht in ausreichender Menge vorhanden war, um detektiert

werden zu können. Es ist bekannt, dass LeSBT2 ein Signalpeptid enthält und dadurch in den

Apoplasten sekretiert werden kann (Meichtry et al., 1999). Daher wurden nur apoplastische

Proteine aus Blätter isoliert und ebenfalls mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

Das LeSBT2-Protein, dessen Aminosäuresequenz ein berechnetes Molekulargewicht von

etwa 70 kDa beträgt, war nun als etwa 90 kDa große Bande detektierbar. Diese Diskrepanz

könnte möglicherweise auf posttranslationelle Proteinmodifikationen, wie z. B.

Glykosylierung, zurückgeführt werden. Wie allerdings in Abbildung 3.2.2 zu sehen ist,

konnte kein Unterschied zwischen RNAi- und Widtyp-Pflanzen festgestellt werden. In allen

Pflanzen wurden gleich hohe Mengen des LeSBT2-Proteins nachgewiesen. Als Ursache

hierfür könnte möglicherweise eine unzureichende Spezifität des polyklonalen anti-LeSBT2

Antikörpers genannt werden.

3. Ergebnisse

52

wt1

wt2

1/55

1/64 7/51

7/52

9/52

9/53

10/5

010

/51

130 kDa100 kDa70 kDa

A


A


50 kDa

40 kDa

B


50 kDa

40 kDa

B Abb. 3.2.2: Western Blot-Analyse der Expression von LeSBT2 in Blättern der T1-Generation transgener Pflanzen A: Dargestellt sind die Ergebnisse des Western Blots, inkubiert mit dem primären anti-LeSBT2-Antikörper. Pro

Spur wurden 3 µg apoplastischer Proteine aufgetragen. Die Proteinlösung aus Wildtyp-Pflanzen diente als Positiv-Kontrolle. Das LeSBT2-Protein konnte in allen Pflanzen als etwa 90 kDa Bande nachgewiesen werden.

B: SDS-PAGE-Polyacrylamidgel angefärbt mit Coomassie Blue zur Kontrolle des Proteinauftrags. Pro Spur wurden 5µg Protein aufgetragen.

3. Ergebnisse

53

3.2.3 RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2

Aufgrund der Ergebnisse im Western-Immunoblot wurden die RNAi-Pflanzen als nächstes

mittels RT-PCR auf der mRNA-Ebene analysiert. Es sollten so mögliche Unterschiede in der

Expression von LeSBT2 zwischen Wildtyp- und transgenen Pflanzen untersucht werden.

Hierzu wurde junges Blattmaterial geerntet und daraus RNA isoliert. Als Positivkontrolle

wurden RNA-Proben von Wildtyp-Pflanzen verwendet. Bei der RT-PCR-Analyse wurde

vorgegangen wie bereits im Kapitel 3.1.2 beschrieben. Die Abbildung 3.2.3 zeigt, dass in

allen RNAi-Pflanzen deutlich weniger LeSBT2 exprimiert wird als in Wildtyp-Pflanzen.

Zwischen, aber auch innerhalb der RNAi-Linien bestanden jedoch deutliche Unterschiede in

der Expressionsrate von LeSBT2. Während bei den Pflanzen 1/55 und 9/53 kaum Expression

feststellbar war, war in der Pflanze 7/51 deutlich exprimiertes LeSBT2 erkennbar. Das

Vorhandensein der LeSBT2 mRNA in allen untersuchten RNAi-Pflanzen weist allerdings

darauf hin, dass das „Silencing“ des LeSBT2 wahrscheinlich nicht vollständig war.

SBT2

Actin

Actin

wt1

wt2

1/55

1/64

7/51

7/52

9/52

9/53

10/5

010

/51

gDNA

0-W

ert

30Zyklen

25Zyklen

30Zyklen

750 bp500 bp

250 bp

750 bp500 bp

250 bp

750 bp500 bp

250 bp

Abb. 3.2.3: RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2 in den RNAi-Pflanzen Abgebildet ist das Ergebnis der RT-PCR-Analyse mit LeSBT2- und Actin-spezifischen Primern. In allen RNAi-Pflanzen ist eine deutlich reduzierte Expression von LeSBT2 erkennbar (oben). Die Kontroll-PCR mit Actin-spezifischen Primern zeigt, dass gleiche Mengen an cDNA eingesetzt wurden (Mitte) und dass diese frei von Kontaminationen mit genomischer DNA war (unten).

LeSBT2

3. Ergebnisse

54

3.2.4 Northern Blot-Analyse der Expression von LeSBT2

Die Ergebnisse der RT-PCR sollten nun im Northern Blot bestätigt werden. Hierfür wurde aus

jungem Blattmaterial der T1-Generation transgener Pflanzen RNA isoliert. Als

Positivkontrollen dienten wiederum Proben von Wildtyp-Pflanzen. Die RNA wurde

elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und dann mit einer

radioaktiv markierten LeSBT2-Sonde hybridisiert. Anhand der Abbildung 3.2.4 wird

ersichtlich, dass die RNAi-Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen einen deutlichen

Unterschied in der Expressionsrate von LeSBT2 zu den Wildtyp-Pflanzen aufwiesen. Die

Transkriptmenge war in den transgenen Pflanzen stark reduziert, allerdings immer noch

nachweisbar. Somit konnten die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse bestätigt werden.

wt1

wt2

1/55

1/64

7/51

7/52

9/52 9/53

10/5

010

/51

SBT2

Abb. 3.2.4: Northern Blot-Analyse der Expression von LeSBT2 in Blättern der T1-Generation transgener Pflanzen. Abgebildet ist das Ergebnis der Hybridisierung der Membran mit einer radioaktiv markierten LeSBT2-Sonde. In den LeSBT2-RNAi-Pflanzen ist im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen eine deutlich reduzierte Expressionsrate von LeSBT2 zu erkennen (oben). Kontrollgel, das den gleichmäßigen Auftrag der RNA zeigt (unten).

LeSBT2

3. Ergebnisse

55

3.2.5 Southern Blot-Analyse der LeSBT2-RNAi Pflanzen

Des Weiteren sollte über Southern Blot-Analyse getestet werden, ob es sich bei den vier

transgenen Linien um unabhängige Linien handelt. Hierzu wurde genomische DNA isoliert,

mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen, Hind III und Eco RI, verdaut, elektrophoretisch

aufgetrennt und dann auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Als Positivkontrolle für die

Hybridisierung mit der radioaktiv markierten nptII-Sonde wurde pART27, das zuvor mit

Not I geschnitten wurde, verwendet. Wie die Abbildung 3.2.5 zeigt, konnten drei unabhängige

Linien identifiziert werden. Die Linien 7 und 9 zeigten das gleiche Integrationsmuster, was

darauf schließen lässt, dass beide Linien aus dem selben Transformationsereignis entstanden

sind. Anhand der auftretenden Bandenzahl konnte die Zahl der integrierten Genkopien

bestimmt werden. Für die Linie 1 wurden vier und für die Linien 7, 9 und 10 mindestens zwei

Genkopien nachgewiesen.

wt 1/55

7/51

9/52

10/5

1

5000 bp4000 bp3500 bp

6000 bp

8000 bp10000 bp

wt 1/55

7/51

9/52

10/5

1

3000 bp2500 bp

2000 bp

1500 bp

wt 1/55

7/51

9/52

10/5

1

5000 bp4000 bp3500 bp

6000 bp

8000 bp10000 bp

wt 1/55

7/51

9/52

10/5

1

3000 bp2500 bp

2000 bp

1500 bp

+ +

Hind III Eco RI

Abb. 3.2.5: Southern Blot-Analyse der SBT2-RNAi Pflanzen Abgebildet sind die Ergebnisse der Southern Blot-Analyse. Die dafür verwendete genomische DNA wurde zum einen mit Hind III und zum anderen mit Eco RI verdaut. Die Membran wurde mit einer radioaktiv markierten nptII-Sonde hybridisiert. Es konnten drei unabhängige Linien identifiziert werden. + = Positiv-Kontrolle, Plasmid-DNA (pART27, geschnitten mit Not I); 100 und 30 pg

3. Ergebnisse

56

3.2.6 Identifizierung homozygoter LeSBT2-RNAi-Linien

Für die Identifizierung homozygoter Linien wurde eine Segregationsanalyse der

Nachkommen der T1-Generation durchgeführt. Es wurden hierfür je Linie von 12 Pflanzen

jeweils 30 Samen auf kanamycinhaltiges Medium ausplattiert (siehe Tabelle 3.2.1). Nach

etwa zwei Wochen wurde das Experiment ausgewertet. Waren alle Keimlinge einer Pflanze

gegen Kanamycin resistent, konnte davon ausgegangen werden, dass es sich um eine

homozygote Pflanze handelte. In der Linie 10 konnten vier homozygote Pflanzen gefunden

werden. Die Pflanzen der Linien 1, 7 und 9 konnten allerdings nicht auf diese Weise getestet

werden, da sie keine Kanamycinresistenz mehr aufwiesen. Sie mussten deshalb über PCR

getestet werden. Hierzu wurden pro Linie von jeweils acht T1-Pflanzen je 20 Samen auf Erde

ausgesät und nach der Keimung über PCR auf das Vorhandensein des LeSBT2-RNAi-

Fragments in sense-Orientierung getestet. Es konnte so in der Linie 9 eine und in der Linie 1

zwei homozygote Pflanzen identifiziert werden.

T0-Pflanze Anzahl getesteter Linien in

der T2-Generation

Anzahl homozygoter

Pflanzen der T1-Generation

1 8 2

7 8 0

9 8 1

10 12 4 Tabelle 3.2.1: Identifizierung homozygoter SBT2-RNAi-Linien Dargestellt sind die Ergebnisse der Segregationsanalyse zur Identifikation homozygoter Linien. In der Linie 1 konnten zwei, in der Linie 9 eine und in der Linie 10 vier homozygote T1-Pflanzen gefunden werden.

3.2.7 Phänotyp der LeSBT2-RNAi Pflanzen

3.2.7.1 Makroskopische Betrachtung

Nachdem eine deutlich reduzierte Expression von LeSBT2 in den transgenen Linien gezeigt

wurde, sollte nun die phänotypische Charakterisierung dieser Pflanzen erfolgen. Dabei wurde

deren Wuchsform analysiert. 6 Wochen alte RNAi-Pflanzen wurden mit gleichaltrigen

Wildtyp-Pflanzen verglichen. Betrachtet wurden vier Pflanzen je Linie. In der Linie 7 konnten

drei Pflanzen mit verzögertem Wachstum beobachtet werden. Bei den Linien 1 und 9 wiesen

alle untersuchten Pflanzen verzögertes Wachstum auf. Dagegen zeigte die Linie 10 keinen

3. Ergebnisse

57

Unterschied zu den Wildtyp-Pflanzen auf. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte die

genauere Betrachtung der Southern Blot-Analyse liefern. Es ist zu erkennen, dass die Linien

1, 7 und 9 je eine DNA-Bande gleicher Größe aufweisen, was bedeuten könnte, dass bei

diesen Linien eventuell eine Kopie des Transgens an derselben Position ins Genom eingefügt

wurde (Abb. 3.2.5). Es ist somit nicht auszuschließen, dass es sich hierbei um einen

Positionseffekt handeln könnte. Andererseits war die Zahl der betrachteten Pflanzen zu

gering, um eine sichere Aussage treffen zu können.

WT HP 10-51 WT HP 1-51

WT HP 9-52 WT HP 7-52 Abb. 3.2.6: Makroskopische Betrachtung der Phänotypen der SBT2-RNAi Pflanzen Zu sehen ist ein teilweise verzögertes Wachstum der RNAi-Pflanzen. Pro Linie wurden vier ca. sechs Wochen alte Pflanzen betrachtet. Von der Linie 7 wiesen drei, von den Linien 1 und 9 alle und von der Linie 10 keine der Pflanzen verzögertes Wachstum auf.

3. Ergebnisse

58

3.2.7.2 Mikroskopische Betrachtung der unteren Blattepidermis

Die histochemische Lokalisation der LeSBT2-Promotor::GUS-Expression in den

Schließzellen der Stomata ließ vermuten, dass LeSBT2 eine dem SDD1 ähnliche Funktion

übernehmen könnte. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, ist die Subtilase SDD1 in die

Steuerung der stomatären Dichte und Verteilung involviert (Berger und Altmann, 2000; von

Groll et al., 2002). Aus diesem Grund wurde die untere Blattepidermis der RNAi-Pflanzen

morphologisch untersucht. Die untere Epidermis halbentwickelter Tomatenblätter wurde

hierzu abgezogen, zur Anfärbung der Zellwandkomponenten mit Toulidinblau inkubiert und

mikroskopisch analysiert. Wie die Abbildung 3.2.7 zeigt, konnten jedoch weder in der Dichte,

noch in der Verteilung der Schließzellen Unterschiede zwischen RNAi-Pflanzen und Wildtyp

festgestellt werden. Die untere Blattepidermis der Pflanze HP 1-64 scheint eine veränderte

Oberflächenstruktur gegenüber der Wildtyp- und der HP 10-52-Pflanze zu haben. Dies ist

aber wahrscheinlich auf eine allmähliche Austrocknung des Präparats zurückzuführen. Da

auch in den Trichomen GUS-Aktivität detektierbar war (Abb. 3.1.4), wurden anschließend

auch diese mikroskopisch analysiert. Es konnten jedoch auch hier keine eindeutigen

Unterschiede bezüglich Dichte, Verteilung oder Morphologie festgestellt werden.

3. Ergebnisse

59

WT

HP 1-64 HP 10-52 Abb. 3.2.7: Mikroskopische Betrachtung der unteren Blattepidermis von SBT2-RNAi Pflanzen (HP 1-64, HP 10-52) Es konnten keine Unterschiede bezüglich Dichte und Verteilung der Stomata zwischen Wildtyp und RNAi-Pflanze festgestellt werden.

4. Diskussion

60

4 Diskussion Subtilisin-ähnliche Serinproteasen, kurz Subtilasen, sind eine Gruppe weit verbreiteter

Enzyme. Sie treten in prokaryontischen wie auch in eukaryontischen Organismen auf. In

Tomate konnten bisher 15 Mitglieder der Subtilasenfamilie identifiziert werden, die in fünf

Unterfamilien unterteilt werden: tmp, P69, LeSBT1, LeSBT2 und LeSBT3/4 (Meichtry et al.,

1999). Die P69-Unterfamilie wurde bislang am besten charakterisiert (Tornero et al., 1996

und 1997; Jordá et al., 1999 und 2000). Auch für tmp konnte aufgrund hoher

Sequenzähnlichkeit zu LIM9 eine potentielle Funktion in der Pollenentwicklung postuliert

werden (Taylor et al., 1997). Für die LeSBT-Unterfamilien liegen dagegen kaum

Informationen über mögliche Funktionen in der Pflanze vor.

Wie bereits in der Einleitung erwähnt, sollte im Rahmen dieser Arbeit eine nähere

Untersuchung der Subtilase LeSBT2 erfolgen. Hierzu sollte zum einen eine detaillierte

Expressionsanalyse dieses Gens in Tomate durchgeführt werden, zum anderen sollten

LeSBT2-RNAi-Pflanzen molekular und phänotypisch charakterisiert werden. Diese

Ergebnisse sollten Aufschluss über potentielle Funktionen von LeSBT2 geben.

4.1 Expressionsanalyse von LeSBT2 in Tomatenpflanzen

Die Analyse der Expression von LeSBT2 erfolgte einerseits unter Verwendung LeSBT2-

Promotor::GUS transformierter Pflanzen, anderseits über RT-PCR-Analyse verschiedener

Organe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Da die Subtilasen untereinander teilweise

hohe Sequenzähnlichkeiten aufweisen (Abb. 1.6, Meichtry et al., 1999), musste zu Beginn der

RT-PCR-Analyse die Spezifität der LeSBT2-Primer überprüft werden. Sie wurden hierzu

über PCR auf cDNAs von LeSBT1, LeSBT2, LeSBT3 und LeSBT4 getestet und haben sich

dabei als spezifisch erwiesen (Abb. 3.1.1). Somit konnten sie im Folgenden für die RT-PCR-

Analyse eingesetzt werden. Eine vorläufige Expressionsanalyse der verschiedenen

Tomatensubtilasen wurde bereits früher mittels Northern Blot-Analyse durchgeführt. Es

wurde dabei festgestellt, dass LeSBT2 in Kotyledonen, Blättern und in der Zellkultur, nicht

aber in Blüten und Wurzeln exprimiert wird (Abb.1.8; Meichtry et al., 1999). Diese

Ergebnisse führten zu der Vermutung, dass die Expression von LeSBT2 in der Pflanze

hauptsächlich in grünen Organen stattfindet. Aufgrund dieser Hypothese wurden besonders

4. Diskussion

61

diese Organe in der folgenden RT-PCR-Analyse näher untersucht. Die Untersuchung ergab,

dass LeSBT2 am stärksten in jüngsten Blättern exprimiert wird. Geringere LeSBT2 mRNA-

Mengen konnten in Blattstielen, offenen Blüten, Wurzeln und dem Stängel detektiert werden.

Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass mit zunehmendem Alter des Pflanzenmaterials

eine stetige Abnahme der Expression von LeSBT2 stattfand (Abb.3.1.2).

Unter Anwendung von LeSBT2-Promotor::GUS transformierten Pflanzen konnte GUS-

Aktivität in den Schließzellen der Stomata von Blättern, Blattstielen und Stängeln

nachgewiesen werden (Abb. 3.1.3). Außerdem wurde die GUS-Aktivität in Zellen des

Leitbündelgewebes und in Trichomen beobachtet (Abb. 3.1.4 und 3.1.5).

Die Abnahme der Expression von LeSBT2 mit fortschreitender Entwicklung der grünen

Organe und die beobachtete GUS-Aktivität in den Schließzellen der Stomata führten zu der

Vermutung, dass LeSBT2 in die Entwicklung der Stomata involviert sein könnte. LeSBT2

könnte somit Funktionshomologie zu SDD1 aus Arabidopsis aufweisen, das für die Steuerung

der stomatären Dichte und Verteilung benötigt wird (Berger und Altmann, 2000; von Groll et

al., 2002). Da die Stomata eine Verbindung zwischen dem Pflanzeninnern und der Außenwelt

darstellen, sind sie potentieller Eintrittsort für Pathogene. Es könnte daher auch sein, dass es

sich bei LeSBT2 um ein präinfektionell exprimiertes Protein handelt, das eine Funktion in der

Abwehr von Pathogenen übernimmt. Ähnliches konnte auch schon für P69E und P69F

gezeigt werden. Beide Enzyme werden konstitutiv in Wurzeln und Hydathoden exprimiert

und ebenfalls mit der Pathogenabwehr in Verbindung gebracht (Jordá et al., 2000).

Die RT-PCR-Analyse der Blüten in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigte ebenfalls eine

Abnahme der LeSBT2 mRNA mit fortschreitender Entwicklung (Abb. 3.1.7). Unter

Anwendung LeSBT2-Promotor::GUS transformierter Pflanzen konnte die Aktivität des

LeSBT2-Promotors in Blüten bestätigt werden. Blaufärbung zeigte sich vor allem in den

Stomata der Kelchblätter. Interessanterweise konnte aber auch eine zunehmende Aktivität der

β-Glucuronidase in der Stigmaoberfläche beobachtet werden.

Es ist bekannt, dass die Proteine der Stigmaoberfläche an unterschiedlichen Prozessen

beteiligt sind. Zum einen sind sie verantwortlich für die gametophytische

Selbstinkompatibilität monözischer Pflanzen (Clarke AE et al., 1989). Zum andern findet hier

nach der Bestäubung mit kompatiblem Pollen eine Degradation der Zellwände im

umliegenden Gewebe statt. Dies dient der Bildung longitudinaler Kanäle, durch die

anschließend der Pollenschlauch wachsen kann (Dumas et al., 1978; Janson et al., 1994). In

der Stigmaoberfläche von Tomate konnte das Vorhandensein von Polygalacturonasen gezeigt

4. Diskussion

62

werden, die vermutlich in die Initiation der longitudinalen Kanäle involviert sind (Hong et al.,

2000). Da LeSBT2 in der Stigmaoberfläche dasselbe Expressionsmuster wie die

Polygalacturonasen aufweist, könnte hier vielleicht eine Interaktion dieser Enzyme

stattfinden. Eine weitere denkbare Möglichkeit ist die Pathogenabwehr. Die Zellen der

Stigmaoberfläche geben ein Sekret ab, das reich an Proteinen, freien Aminosäuren, Fetten und

Kohlenhydraten ist (Kandasamy und Kristen, 1987). Dies stellt optimale

Wachstumsbedingungen für Pathogene dar. Es ist jedoch bekannt, dass eine Infektion des

Pistills nur selten vorkommt (Jung, 1956). Es könnte daher auch sein, dass LeSBT2 in der

Stigmaoberfläche bei der Pathogenabwehr benötigt wird. Interessanterweise konnte auch

schon die spezifische Expression von P69D im Narbengewebe beobachtet werden (Jordá et

al., 1999).

Bei der anschließenden RT-PCR-Analyse der Expression von LeSBT2 während der

Samenquellung und –keimung konnte in allen untersuchten Stadien (24 h, 48 h und 72 h nach

Beginn der Samenquellung) gleichmäßige Mengen an LeSBT2 mRNA nachgewiesen werden.

In LeSBT2-Promotor::GUS transformierten Pflanzen wurde in vorgequollenen Samen GUS-

Aktivität im Bereich des micropylaren Endosperms lokalisiert (Abb. 3.1.10). Dies gibt

Hinweise auf eine mögliche Beteiligung der LeSBT2 beim Aufbrechen der Samenschale, da

hierfür zunächst eine Degradation des micropylaren Endosperms stattfinden muss. Erst dann

kann die Wurzelspitze die Samenschale durchbrechen (Groot et al., 1988). Eine weitere

mögliche Funktion von LeSBT2 könnte auch hier in der Pathogenabwehr bestehen. Beim

Aufbrechen der Samenschale wird ein potentieller Angriffspunkt für Pathogene geschaffen,

der besonders wertvoll ist, da im Samen viele Nährstoffe enthalten sind. Es ist daher

außerordentlich wichtig, einen effektiven Schutz gegen Pathogene aufzubauen. Es ist bekannt,

dass während der Keimung hauptsächlich im Bereich des micropylaren Endosperms β-1,3-

Glucanasen und Chitinasen exprimiert werden (Morohashi und Matsushima, 2000; Wu et al.,

2000). Auch Polyphenoloxidasen konnten hier identifiziert werden (Morohashi 2002). Es

wurde vielfach belegt, dass diese Enzyme, entweder allein oder in Kombination mit anderen

Enzymen, in die Pathogenabwehr involviert sind (Simmons, 1994; Jach et al., 1995,

Jongedijk et al., 1995; Lozovaya et al., 1998; Gomez et al., 2002). Somit könnte auch

LeSBT2 in keimenden Samen in die Abwehr von Pathogenen involviert sein.

Im Keimling konnte in der RT-PCR-Analyse eine Expression des LeSBT2-Gens in

Hypokotylen und Kotyledonen gezeigt werden. Keine mRNA dieses Gens konnte in Wurzeln

4. Diskussion

63

detektiert werden (Abb. 3.1.9). In Keimlingen mehrerer Linien LeSBT2-Promotor::GUS

transformierter Pflanzen konnte festgestellt werden, dass der LeSBT2-Promotor in den

Stomata der Hypokotyle und der Kotyledonen aktiv war. Es wurde keine GUS-Aktivität in

der Wurzel 12 Tage alter Keimlinge detektiert (Abb. 3.1.10). Da aber LeSBT2 mRNA in

Wurzeln sechs Wochen alter Pflanzen detektierbar war (Kapitel 3.1.2) tritt die Vermutung

auf, dass LeSBT2 auch in der Wurzel entwicklungsabhängig exprimiert werden könnte,

allerdings nicht wie in den übrigen Organen mit abnehmender, sondern mit zunehmender

Expression in fortschreitender Entwicklung.

Ein ähnliches Expressionsmuster konnte auch schon bei At-SLP2, einem Enzym aus

Arabidopsis, das auf der Aminosäureebene 60 % Sequenzübereinstimmung zu LeSBT2

aufweist, gezeigt werden. At-SLP2 mRNA konnte in Wurzeln vier Wochen alter Pflanzen

nicht nachgewiesen werden, wohingegen in zehn Wochen alten Pflanzen eine recht starke

Expression des Gens beobachtet werden konnte (Golldack et al. 2003). Es besteht daher die

Möglichkeit, dass im Falle des LeSBT2 ein ähnliches Expressionsmuster vorliegt.

Insgesamt zeigte die Expressionsanalyse, dass LeSBT2 zum einen entwicklungsspezifisch,

zum andern an potentiellen Angriffsorten für Pathogene exprimiert wird. Es könnte somit

sein, dass LeSBT2 in der Entwicklung oder bei der Pathogenabwehr eine Rolle spielt.

4.2 Charakterisierung der LeSBT2-RNAi Tomatenpflanzen

Um weiteren Aufschluss über mögliche Funktionen von LeSBT2 zu erhalten, wurde die

molekulare und phänotypische Charakterisierung von LeSBT2-RNAi-Pflanzen durchgeführt.

Die Identifizierung von RNAi-Pflanzen der T1-Generation musste über PCR erfolgen, da nur

bei einer von sieben getesteten Linien Kanamycin-resistente Keimlinge gewachsen sind. Es

konnte schließlich in vier Linien das ins Pflanzengenom integrierte T-DNA-Konstrukt

nachgewiesen werden (Abb. 3.2.1).

Die Analyse der Expression von LeSBT2 in transgenen Pflanzen wurde zunächst auf der

Proteinebene mittels Western Blots durchgeführt. Wie viele andere Mitglieder der

Subtilasenfamilie besitzt auch LeSBT2 ein Signalpeptid, welches das Enzym in den

Apoplasten leitet (Meichtry et al, 1999). Aus diesem Grund wurden die apoplastischen

Proteine junger Blätter in SDS-PAGE mit anschließender Western Blot-Analyse eingesetzt.

Es konnte jedoch kein „Silencing“ des LeSBT2-Gens nachgewiesen werden, da in allen

4. Diskussion

64

Pflanzen eine gleich hohe Expression von LeSBT2 erkennbar war (Abb.3.2.2). Dies könnte

entweder bedeuten, dass kein „Silencing“ dieses Proteins auftritt, oder dass möglicherweise

der verwendete anti-LeSBT2 Antikörper mit anderen Proteinen kreuzreagiert.

Im nächsten Schritt wurde dann das „Silencing“ von LeSBT2 auf der mRNA-Ebene unter

Anwendung der RT-PCR-Analyse überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass in allen LeSBT2-

RNAi-Pflanzen eine deutlich geringere Expression von LeSBT2 beobachtet werden konnte als

in den Wildtyp-Pflanzen (Abb. 3.2.3). Es könnte sich somit um unvollständiges „Silencing“

des LeSBT2-Gens handeln. Die Resultate der RT-PCR-Analyse konnten mithilfe der Northern

Blot-Analyse bestätigt werden. Hier zeigten die Ergebnisse ebenfalls eine deutlich reduzierte

Expression von LeSBT2 in RNAi-Pflanzen (Abb. 3.2.4).

In der darauf folgenden Southern Blot-Analyse konnten innerhalb der vier transgenen Linien

drei unabhängige Linien identifiziert werden (Abb. 3.2.5)

Die makroskopische Analyse der Pflanzen auf Unterschiede in Wuchsform oder Entwicklung

zeigte verzögertes Wachstum bei Pflanzen der Linien 1, 7 und 9, nicht jedoch bei der Linie 10

(Abb. 3.2.6). Eine mögliche Erklärung dafür liefert eine genauere Betrachtung der Southern

Blot-Analyse. Diese zeigt, dass unter Umständen in den Linien 1, 7 und 9 je eines der Inserts

an der jeweils gleichen Position ins Genom integriert worden sein könnte. Möglicherweise

wurde hierbei die Sequenz eines anderen Gens unterbrochen, was zu verzögertem Wachstum

führen könnte. Weitere Unterschiede in der Morphologie der Pflanzen konnten nicht

festgestellt werden.

Die Resultate der Expressionsanalyse von LeSBT2 zeigten, dass dieses Enzym entwicklungs-

und gewebespezifisch exprimiert wird. Weiterhin konnte in verschiedenen Organen der

Pflanze die Aktivität des LeSBT2-Promotors hauptsächlich in den Schließzellen der Stomata

nachgewiesen werden. Diese Befunde führten zu der bereits erwähnten Hypothese, dass dem

LeSBT2 eine dem SDD1 ähnliche Funktion zugesprochen werden könnte. Wie jedoch in

Abbildung 3.2.7 zu erkennen ist, waren bei einem Vergleich der unteren Blattepidermis

transgener Pflanzen mit der von Wildtyp-Pflanzen weder in der Dichte, noch in der

Verteilung der Stomata Unterschiede festzustellen. LeSBT2 scheint somit keinen Einfluss auf

die korrekte Entwicklung der Stomata zu haben. Für die Aufklärung der Funktion der

LeSBT2-Protease sind deshalb weiterführende Studien notwendig.

4. Diskussion

65

4.3 Ausblick

Mit dem Ziel, die Funktion von LeSBT2 aufzuklären, sollten zukünftig zusätzliche

Untersuchungen des Phänotyps von LeSBT2-RNAi-Pflanzen stattfinden. Nicht beachtet

wurden bislang Querschnitte von Blättern der RNAi-Pflanzen. Auch der Phänotyp von

Pflanzen mit Überexpression von LeSBT2 wurde noch nicht analysiert. Des Weiteren sollten

Versuche unter Trockenstress durchgeführt werden, um eine mögliche Beeinträchtigung der

Reaktion der Schließzellen in RNAi-Pflanzen oder Pflanzen mit Überexpression von LeSBT2

zu überprüfen. Da LeSBT2 schon während der Samenquellung nachzuweisen ist, könnten

auch Keimungsversuche mit Samen der RNAi-Pflanzen und der Überexpressions-Pflanzen

Aufschlüsse über mögliche Funktionen des Enzyms liefern.

Ebenso könnte über eine Expressionsanalyse von LeSBT2 nach Pathogenbefall die potentielle

Beteiligung dieser Protease an der Pathogenabwehr untersucht werden.

Außerdem sollte die Aktivität des LeSBT2-Promotors in Stigmaoberfläche und

Leitbündelgewebe unter Anwendung von in situ Hybridisierung bestätigt werden. Eine

Bestätigung dieser Ergebnisse könnte weitere Hinweise auf die Funktionen dieses Enzyms

liefern. Darüber hinaus sollte auch die Expression von LeSBT2 in der Wurzel näher untersucht

werden. At-SLP2 aus Arabidopsis, das auf Aminosäureebene 60 % Sequenzidentität zu

LeSBT2 aufweist, wird in vollentwickelten Wurzeln stärker exprimiert als in jungen

(Golldack et al. 2003). Es besteht daher die Möglichkeit, dass auch in der Tomatenwurzel ein

entwicklungsabhängiges Expressionsmuster für LeSBT2 vorliegt. Außerdem sollte auch die

Lokalisation des Proteins in der Wurzel unter Verwendung LeSBT2-Promotor::GUS

transformierter Pflanzen analysiert werden.

Mit dieser Arbeit konnte eine detaillierte Expressionsanalyse von LeSBT2 erstellt werden.

Ferner konnte die molekulare Charakterisierung von LeSBT2-RNAi-Pflanzen abgeschlossen

und die phänotypische Analyse dieser Pflanzen begonnen werden. Die hier erzielten

Ergebnisse stellen die Grundlage weiterer Arbeiten zur Aufklärung der Funktion dieses

Enzyms in planta dar.

5. Zusammenfassung

66

5 Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine detaillierte Expressionsanalyse von LeSBT2 durchgeführt

werden. Ferner sollte die molekulare und phänotypische Charakterisierung von LeSBT2-

RNAi-Pflanzen erfolgen. Diese Ergebnisse sollten Aufschlüsse über potentielle Funktionen

dieser Protease liefern.

Über RT-PCR-Analyse konnte die Expression von LeSBT2 in allen Organen nachgewiesen

werden, wobei die höchsten Mengen an LeSBT2 mRNA in jungen, grünen Organen

detektierbar waren. Auch Blüten zeigten in frühesten Entwicklungsstadien die höchste

Transkritpmenge. Bei der Samenquellung und -keimung konnte in allen untersuchten Stadien

gleiche Mengen an LeSBT2 mRNA nachgewiesen werden. Im Keimling war die Expression

von LeSBT2 auf Hypokotyl und Kotyledonen beschränkt. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse

wurden LeSBT2-Promotor::GUS transformierte Pflanzen analysiert. Die Resultate zeigten,

dass in Blättern, Blattstielen, Stängeln und Kelchblättern in Stomata GUS-Aktivität auftrat.

Außerdem wurde die Promotoraktivität von LeSBT2 in Trichomen und Leitbündelgewebe der

Blätter und in der Stigmaoberfläche der Blüten gezeigt. In vorgequollenen Samen konnte

Aktivität des LeSBT2-Promotors im micropylaren Endosperm festgestellt werden.

Im Anschluss daran erfolgte die Charakterisierung der LeSBT2-RNAi-Pflanzen. Im Western

Immunoblot konnten keine Unterschiede in der Menge des vorhandenen LeSBT2-Proteins

zwischen Wildtyp- und RNAi-Pflanzen festgestellt werden Da die Ursache hierfür eine

unzureichende Spezifität des Antikörpers sein konnte, wurden die RNAi-Pflanzen

anschließend auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR untersucht. Es konnte im Vergleich zu

Wildtyp-Pflanzen eine deutlich reduzierte, allerdings immer noch nachweisbare Expression

von LeSBT2 in den transgenen Pflanzen gezeigt werden. Diese Ergebnisse konnten in der

Northern Blot-Analyse bestätigt werden. Die Southern Blot-Analyse ergab, dass von vier

transgenen Linien drei unabhängig sind. Makroskopische Betrachtung der RNAi-Pflanzen

zeigte verzögertes Wachstum in drei von vier untersuchten Linien, was aber eventuell auf

einen Positionseffekt des Transgens zurückzuführen sein könnte. Bei der Analyse der unteren

Blattepidermis wurden zwischen RNAi- und Wildtyp-Pflanzen keine Unterschiede in der

Dichte und Verteilung der Stomata festgestellt. Für die Aufklärung potentieller Funktion von

LeSBT2 sind daher weitere Studien notwendig.

6. Abkürzungsverzeichnis

67

6 Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius

Abb Abbildung

Asp Aspartat

bp Basenpaare

ca. Circa

cDNA complementary DNA

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOH Ethanol

F Forward

g Erdbeschleunigung

g Gramm

Gent Gentamycin

GUS β-Glucuronidase

h Stunde

His Histidin

kb Kilobasenpaare

kDa KiloDalton

Konz. Konzentration

LB Left Border

µ mikro (10-6)

m milli (10-3)

M molar (mol/Liter)

min Minute(n)

mRNA Messenger-RNA

PC Proprotein-Konvertase

PCR Polymerase Kettenreaktion

6. Abkürzungsverzeichnis

68

R Reverse

RB Right Border

RNA Ribnukleinsäure

RNase Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transkription-PCR

s Sekunden

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Ser Serin

t Zeit

TAE Triacetat-EDTA

TEMED Tetramethylendiamid

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

U Enzymeinheiten

ÜN über Nacht

UV Ultraviolett

v/v Volumenprozent

verd. verdünnt

Vol. Volumen

wt Wildtyp

w/v Gewichtsprozent

X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide

7. Literaturverzeichnis

69

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77

Eidesstattliche Erklärung

Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig angefertigt, keine

anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt und sowohl wörtliche, als auch sinngemäß

entlehnte Stellen als solche kenntlich gemacht habe.

Die Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde

vorgelegt und auch nicht veröffentlicht.

Hohenheim, 14. Februar 2006

78

Danksagung

Bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. A. Schaller dafür, dass er mir die Möglichkeit

gegeben hat, am Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen meine Diplomarbeit

durchzuführen und mir hierfür ein interessantes Thema überlassen hat.

Herrn Prof. Dr. J. Rassow danke ich, dass er die Zweitkorrektur übernimmt.

Mein Dank gilt auch Frau Dr. A. Cedzich für die tolle Betreuung und für die Vermittlung weit

reichender molekularbiologischer Kenntnisse.

Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts für die stetige

Hilfsbereitschaft und das angenehme Arbeitsklima. Besonders bedanken möchte ich mich hier

bei Frau Rösingh für die Unterstützung bei der Identifizierung homozygoter LeSBT2-RNAi-

Linien.

Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir mein Studium finanziert haben.

Universität Hohenheim · 2010. 1. 7. · Triade im aktiven Zentrum (Siezen und Leunissen, 1997)....

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