Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

und der Klinik für Wiederkäuer

der Ludwig-Maximilians-Universität München ______________________________________________________

Untersuchungen zu frühen Erreger-Wirts-

Interaktionen bei der Mastitis des Rindes

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines

DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Wolfram Petzl

aus Köln

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth Prof. Dr. med. vet. Holm Zerbe 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 2005 Gefördert im Rahmen des DFG-Projektes SCHU 1108/2-1/2 (Struktur boviner TOLL-like Re-zeptoren und ihre Bedeutung für die Modulation der Makrophagenaktivität bei Entzündungen des mammären und endometrialen Gewebes beim Rind) durch Personal- und Sachmittel.

Für Nadine

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen............................................................................................... 8

1 Einleitung und Zielsetzung ........................................................................................................11

2 Literaturübersicht ........................................................................................................................13

2.1 Die Mastitis des Rindes ..............................................................................................................13

2.2 Abwehrmechanismen im Euter.................................................................................................15

2.2.1 humorale Faktoren............................................................................................................15

2.2.2 zelluläre Faktoren..............................................................................................................18

2.3 Sexualsteroide im peripartalen Zeitraum .................................................................................23

2.4 Experimentelle Mastitis-Modelle ..............................................................................................25

2.5 Erkennung von Erregern und deren Bestandteilen durch Komponenten des angeborenen Immunsystems .....................................................................................................26

2.5.1 Erregermuster ....................................................................................................................26

2.5.2 Erregermusterrezeptoren .................................................................................................28

2.5.3 Funktionelle Konsequenzen einer Toll-like-Rezeptor (TLR) vermittelten Stimulation von Makrophagen........................................................................................31

3 Geräte, Material und Methoden ................................................................................................33

3.1 Geräte............................................................................................................................................33

3.2 Material .........................................................................................................................................34

3.2.1 Klinikbedarf .......................................................................................................................34

3.2.2 Laborbedarf........................................................................................................................34

3.2.3 Reagenzien .........................................................................................................................35

3.2.4 Versuchstiere......................................................................................................................36

3.2.4.1 Versuchstiere im Rahmen des Mastitis-Modells ....................................................36

3.2.4.2 Spendertiere zur Blutgewinnung ..............................................................................36

3.2.5 Bakterienstämme...............................................................................................................37

3.2.6 Verwendete Antikörper....................................................................................................38

3.2.6.1 Monoklonale Antikörper (Primärantikörper).........................................................38

3.2.6.2 Konjugierte Antikörper .............................................................................................38

3.2.7 Kulturmedien, Puffer und Lösungen .............................................................................39

3.2.7.1 Zellkulturmedien und Zusätze .................................................................................39

3.2.7.2 Material für die Separation von Zellen....................................................................40

3.2.7.3 Reagenzien für die Messung der Arginase-Aktivität .............................................41

3.2.7.4 Reagenzien für die Messung der Nitrat- und Nitrit-Produktion .........................42

3.2.7.5 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen.......................43

3.2.7.6 Lösung für die Fixierung boviner Suspensionszellen ...........................................43

3.2.7.7 Lösungen zur Gewinnung von RNA aus bovinen Leukozyten ..........................43

3.2.7.8 Puffer für die Gewinnung von Monozyten mittels MACS..................................43

3.2.7.9 Lösungen für die Durchflusszytometrie .................................................................43

3.3 Methoden......................................................................................................................................44

3.3.1 Gewinnung von venösem Blut .......................................................................................44

3.3.2 Gewinnung von Serum aus peripherem Blut................................................................44

3.3.3 Gewinnung boviner Leukozyten ....................................................................................44

3.3.4 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen..................................................................44

3.3.5 Gewinnung neutrophiler Granulozyten.........................................................................45

3.3.5.1 Dichtegradientenzentrifugation................................................................................45

3.3.5.2 Isolierung neutrophiler Granulozyten mittels Transmigrationskammer............45

3.3.6 Gewinnung von Monozyten aus dem peripheren Blut ...............................................46

3.3.7 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten durch In-vitro-Reifung .........47

3.3.8 Durchflusszytometrie .......................................................................................................48

3.3.9 Herstellung von Referenzzellen ......................................................................................48

3.3.10 Vitalitätsbestimmung von Zellen....................................................................................49

3.3.10.1 Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung und Quantifizierung nach Acridin-Orange/Ethidiumbromid-Färbung .........................................................................49

3.3.10.2 Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie .................................49

3.3.11 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode)......................................................................................................49

3.3.12 Bestimmung der Konzentration verschiedener Steroidhormone ..............................49

3.3.13 Methoden in einem Mastitis-Infektionsmodell.............................................................50

3.3.13.1 Tierschutzantrag .........................................................................................................50

3.3.13.2 Modellbedingungen und Voruntersuchung der Probanden ................................50

3.3.13.3 Präparation der Infektionsdosis ...............................................................................50

3.3.13.4 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel ...................................................50

3.3.13.5 Erhebung und Beurteilung allgemeiner klinischer Parameter .............................51

3.3.13.6 Klinische Labordiagnostik ........................................................................................52

3.3.13.7 Gewinnung von Milchproben ..................................................................................52

3.3.13.8 Aufarbeitung und Analyse von Milchproben.........................................................53

3.3.13.9 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)........................................................54

3.3.13.10 Gewinnung von Gewebeproben..............................................................................55

3.3.14 Methoden zur Untersuchung des Einflusses von weiblichen Sexualsteroiden auf PAMP vermittelte Effekte boviner Makrophagen und mononukleärer Zellen in vitro ........................................................................................56

3.3.14.1 Präparation boviner Leukozyten zur immunhistologischen Untersuchung auf Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren ..............................................................................................56

3.3.14.2 Präparation der RNA aus bovinen Leukozyten zur Untersuchung auf Östrogenrezeptoren ...................................................................................................56

3.3.14.3 Präparation der RNA aus bovinen MdM zur Untersuchung auf Expression von Toll-like Rezeptoren......................................................................57

3.3.14.4 Kultivierung boviner Leukozyten in vitro ..............................................................57

3.3.14.5 Kokultivierung von Makrophagen und mononukleären Zellen mit Granulozyten in vitro.................................................................................................57

3.3.15 Untersuchungen zum Argininstoffwechsel boviner Makrophagen und mononukleärer Zellen ......................................................................................................58

3.3.15.1 Bestimmung der Arginase-Aktivität ........................................................................58

3.3.15.2 Nitrit- und Nitratbestimmung mittels Griess-Reagenz ........................................58

3.3.16 Statistische Verfahren.......................................................................................................59

4 Ergebnisse ....................................................................................................................................60

4.1 Etablierung eines experimentellen Mastitis-Modells mit E. coli und S. aureus ....................60

4.1.1 Klinische Parameter experimentell infizierter Tiere.....................................................60

4.1.1.1 Körpertemperatur ......................................................................................................60

4.1.1.2 Milchleistung ...............................................................................................................61

4.1.1.3 Allgemeine klinische Symptome ..............................................................................61

4.1.1.4 Differentialblutbild.....................................................................................................62

4.1.2 Bakteriologische Befunde ................................................................................................63

4.1.3 Somatische Zellzahl der Milch (SCC) im Infektionsverlauf .......................................65

4.1.3.1 Veränderung des SCC im Verlauf einer experimentellen Mastitis mit E. coli..................................................................................................................................65

4.1.3.2 Veränderung des SCC im Verlauf einer experimentellen Mastitis mit S. aureus .............................................................................................................................67

4.1.3.3 Veränderungen des Differentialzellbildes im Eutersekret....................................69

4.1.3.4 Morphologische Veränderungen neutrophiler Granulozyten .............................72

4.1.3.5 Zelluläre Zusammensetzung der Anfangs- und Endgemelke..............................74

4.1.4 Pathologisch-anatomische und -histologische Befunde..............................................76

4.1.5 Toll-like-Rezeptor- und Defensingenexpression..........................................................80

4.1.5.1 Milchdrüsengewebe....................................................................................................80

4.1.5.2 Lymphknoten..............................................................................................................87

4.1.5.3 Somatische Zellen der Milch ....................................................................................93

4.1.5.4 Leukozyten und Thrombozyten des Blutes............................................................98

4.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf das Makrophagen- und MNC-vermittelte Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro .....................................................................101

4.2.1 Voruntersuchungen ........................................................................................................101

4.2.1.1 Untersuchungen zum Vorkommen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren in bovinen Leukozyten...................................................101

4.2.1.2 Östrogen- und Progesteronkonzentrationen in verwendeten Medien und Zusätzen und im Blutplasma der Spendertiere ............................................103

4.2.2 Einfluss verschiedener Konzentrationen von Progesteron und Östradiol-17-β auf die Absterberate der PMN nach Stimulation der Gesamtleukozyten mit PAMPs in vitro .......................................................................103

4.2.3 MNC-vermittelte Effekte auf die Vitalität autologer PMN und deren Beeinflussung durch Progesteron und Östradiol-17β ...............................................104

4.2.4 Makrophagenvermittelte Effekte auf die Vitalität autologer PMN und deren Beeinflussung durch Progesteron und Östradiol-17β ...............................................107

4.2.4.1 Hormonregulation der TLR-2-, -4- und β-Defensingenxpression in bovinen in-vitro-generierten Makrophagen (MdM)............................................107

4.3 LPS-vermittelte Effekte auf den Arginin-Stoffwechsel von Makrophagen und mononukleären Zellen in vitro................................................................................................109

5 Diskussion ..................................................................................................................................111

5.1 Der Arginin-Stoffwechsel boviner Makrophagen ................................................................111

5.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf Makrophagen und MNC in vitro ......................112

5.3 Frühe Erreger-Wirts-Interaktionen nach experimenteller intramammärer Infektion .....................................................................................................................................115

5.3.1 Etablierung eines Mastitis-Infektionsmodells .............................................................115

5.3.2 Einfluss einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus auf die Expression von Toll-like Rezeptoren und β-Defensinen .........................................119

6 Zusammenfassung.....................................................................................................................123

7 Summary .....................................................................................................................................126

8 Literaturverzeichnis...................................................................................................................128

Erklärung .....................................................................................................................................................167

Danksagung.................................................................................................................................................168

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) µ mikro (x 10-6) BNBD4 Bovines β-Defensin 4 BNBD5 Bovines β-Defensin 5 BSA Bovines Serumalbumin bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise C1 Komplementkomponente C1 C1q Fragment der Komplementkomponente C1 C3b opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C3 CD Cluster of Differentiation CO2 Kohlenstoffdioxid COX Cyclooxigenase CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin CXCL6 Granulocyte Chemotactic Protein 2 CXCL8 Interleukin-8 DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli EBD enteric beta-Defensin EDTA Ethylendiamintetraacetat ERα Östrogenrezeptor-α ERβ Östrogenrezeptor-β et al. et alii (lateinisch: und andere) FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der

Firma Becton Dickinson, Heidelberg) Fc Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy-terminales Frag-

ment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung) FCM Flow Cytometer (Durchflusszytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz

FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)

FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®

g Gramm G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) GM-CSF Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-

Makrophagen-Wachstumsfaktor) GPI Glycosylphosphatidylinositol h hora (lateinisch: Stunde) HSP Heat Shock Protein (Hitze-Schock Protein) i.d.R in der Regel i.m. intra muskulär i.p. intra peritoneal I10F+Strep Iscové-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10% FCS ICAM Intercellular Adhesion Molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin iNOS induzierbare Stickoxid Synthetase iNOS induzierbare Stickstoffoxid Synthetase

IRF3 IFN Regulatory Factor 3 ISPF Isonitrosopropiophenon JNK c-JUN N-terminal Kinase kg Kilogramm l Liter LAP Lingual Antimicrobial Peptide LBP Lipopolysaccharid-Binding Protein LDL Low Density Lipoprotein (Lipoprotein geringer Dichte) LFA Leukozyten Funktions Antigen Lnn. Lymphonodi (lateinisch: Lymphknoten) LPS Lipopolysaccharid LTA Lipoteichonsäure LTB4 Leukotrien B4 m milli (x 10-3) mAk monoklonale(r) Antikörper MBL Mannose Binding Lectin (Mannose bindendes Lektin) MdM Monocyte derived Macrophages (aus Monozyten gewonnene Makrophagen) MEC Milchdrüsenepithelzelle MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz Min. Minute(n) MIP Macrophage Inflammatory Protein (Makrophagen inflammatorisches Protein) MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) MyD88 Myeloid Differentiation Factor 88 (myeloider Differenzierungsfaktor 88) mRNA Messenger RNA mU Milliunit MW arithmetischer Mittelwert n nano (x 10-9) n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid) Nr. Nummer ODN Oligodeoxynukleotide P Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengrup-

pen PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) PbMEC Primäre bovine Milchdrüsenepithelzelle PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PD Phosphodiester PE Phycoerythrin PECAM Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen PGE2 Progesteron E2 PGN Peptidoglycan PI Propidiumiodid PMN Polymorphonuclear Leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) PR Progesteronrezeptor PRR Pattern Recognition Receptor (Muster Erkennungs Rezeptor) PS Phosphatidylserin PT Phosphorothioat ROS Reactive Oxigen Species (Reaktive Sauerstoffspezies) RT Raumtemperatur

S Standardabweichung S. aureus Staphylococcus aureus s.c. subkutan SCC Somatic Cell Count (Somatische Zellen in der Milch) sCD 14 Soluble CD 14 (lösliches CD 14) SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A Sek. Sekunde(n) SEM Standard Error of the Mean (Standardfehler des Mittelwertes) sog. sogenannte(r) spp. Spezies SR- Scavenger-Receptor SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Th1, Th2 Bezeichnet den Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2 TIR Toll Interacting Receptor TIRAP TIR-Domain-Containing Adapter Protein TLR Toll-like-Receptor (Toll-like-Rezeptor) TNF Tumor Necrosis Factor (Tumornekrosefaktor) TOLLIP Toll interacting Protein TRAF6 TNF-Receptor-Associated Factor 6 TRAMP TNF-Receptor Related Apoptosis Mediating Protein TRIF TIR-domain-containing adaptor inducing IFN-β u.a. unter anderem uDef Universelles Defensin (integriert LAP, EBD, BNBD4, BNBD5 als auch ein

BNBD5- und LAP-artiges Protein ) v.a. vor allem v/v Volumen pro Volumen VAG Viertelanfangsgemelk VEG Viertelendgemelk vgl. vergleiche w/v Gewicht pro Volumen x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil

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1 Einleitung und Zielsetzung Die Euterentzündung (Mastitis) ist die teuerste Einzelerkrankung des Rindes in der Milchwirt-schaft (Miller et al. 1993). Die maßgeblich beteiligten Mastitiserreger sind zum einen Staphylococcus aureus (S. aureus), welcher vor allem langwierige, schwer zu therapierende, jedoch mild verlaufende Mastitiden verursacht. Im Gegensatz dazu werden akute, z.T. schwerwiegende klinische Mastiti-den häufig durch Escherichia coli (E. coli) hervorgerufen (Bannermann et al. 2004). Der immunologische Hintergrund für die unterschiedliche Abwehrfähigkeit des Wirtes gegen-über verschiedenen Euterpathogenen ist noch weitgehend ungeklärt. Insbesondere gilt dies für sehr frühe Ereignisse und Mechanismen nach einer Infektion. Die Erkennung eines pathogenen Erregers durch einen Wirt erfolgt durch zellständige Rezepto-ren, die charakteristische pathogene molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) binden. Diese Rezeptorbindung führt über eine Kaskade weitergeleiteter Signale hin zur Zellaktivierung (Underhill und Ozinsky 2002). Daraus folgt letztendlich die koordinierte Expres-sion früher Abwehrsysteme und die Rekrutierung sowie Funktionsmodulation von Effektorzellen mit dem Ziel einer effektiven Keimeliminierung. Eine Hypothese für die unterschiedliche Anfäl-ligkeit von Kühen für Mastitiserreger und den unterschiedlichen Verlauf von S. aureus und E. coli-Infektionen lautete, dass die initiale Expression der Erkennungsrezeptoren unterschiedlich war oder im Verlauf einer Infektion unterschiedlich reguliert wird. Um sich der Analyse dieser Ereig-nisse mittelfristig nähern zu können, bedurfte es eines klar definierten Infektionsmodells. Hierfür sollte in vivo ein Mastitis-Modell erstellt werden, um initiale Mechanismen während einer Euterinfektion unter standardisierten Bedingungen untersuchen zu können. Isolierte euterpatho-gene Stämme von S. aureus und E. coli wurden in bestimmten Dosen Tieren definierten Alters und Laktationsstadiums ins Euter intrazisternal appliziert. Hierzu gab es bereits eine Reihe etab-lierter Tiermodelle (u.a. Kremer et al. 1993, Pyörälä et al. 1994, Kornalijnslijper et al. 2003), je-doch galt es, verbessert im Vorfeld auf strenge, reproduzierbare Modellgrenzen zu achten. Ein-gehende, wiederholte Untersuchungen der Allgemeingesundheit, niedriger Milchzellzahlen und Freiheit von Mastitiserregern sollten gleiche Ausgangsbedingungen der Probanden schaffen. Das Tiermodell sollte weiterhin als Ausgangspunkt für prä- und postmortal gewonnene Blut-, Milch-sekret- und Gewebeproben dienen. Neben der Quantifizierung von Entzündungszellen im Sekret und deren durchflusszytometrischer Differenzierung im Infektionsverlauf sollte der analytische Schwerpunkt auf der Expressionsmessung von Rezeptoren für pathogene molekulare Muster (Toll-like Rezeptoren, TLR) und von Effektormolekülen der Abwehr am Beispiel der β-Defensine mittels quantitativer RT-PCR liegen. Unter den TLRs, von denen bei Maus und Mensch mittlerweile 11 Vertreter bekannt sind (Zhang et al. 2004) erkennen TLR-4 und TLR-2 jeweils Bestandteile Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien. Diese Rezeptoren sollten im Vergleich zu weiteren TLRs analysiert werden, die erregerübergreifende PAMPs erkennen (TLR-9) oder nicht im Zusammenhang mit S. aureus- oder E. coli-spezifischen PAMPs in Erscheinung treten (TLR-6, TLR-3). Diese deskriptiven Analysen des Infektionsgeschehens wurden in einem zweiten Teil der Arbeit um funktionelle Analysen ergänzt. Hier stand ebenfalls die These einer unterschiedlich regulierten TLR-Expression im Vordergrund. Ein gehäuftes Auftreten von Mastitiden im geburtsnahen Zeit-raum lässt auf eine Dysregulation von Abwehrvorgängen in der Milchdrüse mit Beginn der Lak-tation schliessen. Makrophagen stellen wichtige Zellen für die initiale Erkennung von Erregern über TLRs und die folgende Einleitung einer Immunantwort dar (McGuire et al. 2005). Während der Gravidität produzieren die Gewebs-residenten Makrophagen vermehrt anti-inflammatorische Mediatoren. Der postpartal verstärkte Kontakt mit pathogenen Erregern erfordert jedoch ein

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schnelles „Umschalten“ zu einer initial pro-inflammatorischen Immunantwort. Postuliert wurde hier ein nicht adäquates Expressionsmuster von TLRs. Es wurde zudem hypothetisiert, dass die TLR-Expression hormonell gesteuert wird, basierend auf der starken Dynamik der Sexualsteroide Progesteron und Östrogen um den Geburtstermin. Für beide Hormone wurden bereits immun-modulatorische Eigenschaften beschrieben (Wessendorf et al. 1998, Scheibl und Zerbe 2000). Modellhaft sollten in-vitro-generierte Makrophagen bezüglich ihrer Regulierbarkeit über die ge-nannten Hormone untersucht werden. Um zu prüfen, ob nach Stimulation der generierten Zellen mit Erregermustern eine eher pro- oder anti-inflammatorische Reaktion folgt, wurde der zelluläre Arginin-Stoffwechsel analysiert. Aus dem murinen System ist bekannt, dass eine pro-inflammatorische Reaktionslage durch eine Aktivierung der induzierbaren Stickoxidsynthase (i-NOS) gekennzeichnet ist, während sich eine anti-inflammatorische Reaktionslage durch die Akti-vierung der Arginase darstellt. Ob und wie in-vitro-generierte bovine Makrophagen vergleichbar reagieren war nicht bekannt. Diese Analysen wurden ergänzt durch den Einfluss hormonell regu-lierter und PAMP-stimulierter Makrophagen auf die bei der Mastitis wesentlichen Effektorzellen, die neutrophilen Granulozyten. Differenzierte Kenntnisse über die Expression und Regulation von TLRs im Verlauf der Mastitis des Rindes und über funktionelle Konsequenzen einer unterschiedlichen Expression für immu-nologische Effektormechanismen fehlten bisher weitestgehend. Die vorliegende Arbeit soll zum Verständnis initialer Immunmechanismen in der Milchdrüse beitragen und damit Wege zur prophylaktischen Modulation des wirtseigenen Immunsystems aufzeigen. Mittel- bis langfristig kann dies zur Entwicklung neuer diagnostischer, therapeutischer und züchterischer Ansätze für den Krankheitskomplex Mastitis führen.

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2 Literaturübersicht

2.1 Die Mastitis des Rindes Die Entzündung der Milchdrüse (Mastitis) gilt als eine der häufigsten und kostspieligsten Erkran-kungen in Milchviehherden (Fourichon et al. 2001, Miller et al. 1993, Rajala-Schultz und Gröhn 1999): In den USA verursacht sie in der Milchindustrie jährlich wirtschaftliche Verluste von etwa 2 Milliarden US-Dollar (National Mastitis Council 1999). Pro Einzelfall einer klinischen Mastitis liegt der Milchproduktionsausfall im Durchschnitt bei ca. 375 kg (5% der Leistung einer Laktati-on) (Seegers et al. 2003). Die Behandlung von Mastitiden mit Antibiotika wird weiterhin als effek-tivstes und kostengünstigstes Konzept bewertet (Shim et al. 2004), ist jedoch wirtschaftlich und bezüglich des Verbraucherschutzes als problematisch einzuschätzen (Krabisch et al. 1999). Bakterien sind die häufigsten Mastitiserreger, gefolgt von Hefen und Pilzen (Tolle 1975). Von Fällen akuter, klinischer Mastitiden werden am häufigsten Gram-negative Keime isoliert. Die durch Escherichia spp., Klebsiella spp. und Enterobacter spp. hervorgerufene Mastitis wird auch als „co-liforme Mastitis“ bezeichnet (Koneman et al. 1983). Weitere mastitisrelevante, Gram-negative Bakterien beim Rind sind Serratia spp., Pseudomonas spp. und Proteus spp. (Hogan und Smith 2003). Bei allen diesen Bakterien handelt es sich um opportunistische, umweltassoziierte Mastitiserreger, die sich annähernd in der gesamten Umgebung der Tiere nachweisen lassen und wie im Falle von Escherichia coli (E. coli) der Magen-Darm-Flora zuzuordnen sind (Hogan et al. 1999). Obwohl eine hämatogene Besiedlung des Euters möglich ist, findet eine intramammäre Infektion mit E. coli vermutlich überwiegend über das Eindringen durch den Zitzenkanal und eine Vermeh-rung im Lumen der Milchdrüse statt. Es bedarf weder einer Adhärenz am Drüsenepithel noch besonderer Virulenzfaktoren zur Manifestation einer intramammären Infektion mit E. coli (Frost et al. 1977, Opdebeeck et al. 1988). Die Eigenschaft, sich im Eutersekret zu vermehren, ist aus-reichend. Voraussetzung ist die Lactoseverwertung und das Wachstum unter nahezu anaeroben Bedingungen. Die Schwere klinischer Symptome scheint dabei mit der Höhe der Keimzahl in der Milch zu korrelieren (Hogan und Smith 2003). Intramammäre Infektionen mit E. coli führen fast immer zu akuten Mastitiden, die meist durch einen schwerwiegenden Verlauf gekennzeichnet sind. Häufig beobachtet man eine hochgradige Störung des Allgemeinbefindens, die bis zur Septikämie und vereinzelten Todesfällen führen kann. Ebenso wie das rasche Auftreten, findet aber auch oftmals eine zügige Heilung statt (Smith und Hogan 1993). So dauert eine „Coli-Mastitis“ in der Regel während der Laktation weniger als zehn Tage (Todthunter et al. 1991) und wird durch den Einsatz von Antibiotika nicht wesentlich verkürzt (Smith et al. 1985). Die am häufigsten durch Übertragung während des Melkvorgangs ausgelösten kuhassoziierten „Kokken-Mastitiden“ repräsentieren etwa 80-90 % aller subklinschen Fälle (Tolle 1982). Neben Streptococcus agalactiae und Streptococcus dysgalactiae ist Staphylococcus aureus (S. aureus) ein weiterer über-aus wichtiger Mastitiserreger. Er ist der häufigste Auslöser der Mastitis beim Rind (de Haas et al. 2004) und ist neben der großen Anzahl subklinischer Fälle auch ursächlich bei mehr als 30 % der klinischen Fälle beteiligt (Pyörälä und Pyörälä 1997). S. aureus gehört zu den Gram-positiven, fa-kultativ pathogenen Bakterien, die als Kommensalen auf Haut und Schleimhäuten vorkommen, jedoch auch lebensbedrohliche Erkrankungen wie bspw. Wundinfektionen, Toxisches Schock-syndrom, Endocarditis oder Sepsis auslösen können. Die Pathogenität von S. aureus beruht auf der Wirkung verschiedener Virulenzfaktoren, die sich aus sekretorischen Produkten und struktu-rellen Komponenten ergeben (Kerro Dego et al. 2002). Sie begünstigen eine Infektion durch die Produktion antiphagozytotischer Faktoren wie dem Protein A oder einer Kapselbildung (Coster-ton et al. 1981, Baselga et al. 1994, Sutra und Poutrel 1994). Des weiteren können sie an Milchdrüsenepithelzellen haften (Almeida et al. 1996, Hensen et al. 2000), besitzen die Fähigkeit,

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in Makrophagen (Hébert et al. 2000) und Epithelzellen (Lammers et al. 1999) zu überleben und produzieren eine Reihe von Exotoxinen, Superantigenen und Proteasen (Bramley et al. 1989, Cifrian et al. 1996, Larsen et al. 2000, Stephan et al. 2001, Arvidson und Tegmark 2001). Obwohl der Wirkmechanismus einzelner Virulenzfaktoren bereits bekannt ist, sind ihr Zusammenspiel und ihre Regulation bisher wenig verstanden (Novick 2003). Ein wesentlicher Bestandteil der Zellwand Gram-positiver Erreger ist die Lipoteichonsäure (LTA, lipoteichoic acid). Über sie werden, ähnlich dem Lipopolysacharid (LPS) Gram-negativer Keime, immunmodulatorische Prozesse induziert (von Aulock et al. 2003). Im Gegensatz zur intramammären Infektion mit E. coli verlaufen die durch S. aureus hervorgeru-fenen Mastitiden meist weniger schwer, resultieren aber sehr häufig in chronischen Infektionen, die lebenslang bei dem betroffenen Individuum persistieren können (Sutra und Poutrel 1994). Dabei kommt es nicht selten zur subklinischen Mastitis, die im Gegensatz zur klinisch manifesten Verlaufsform nicht durch eine grobsinnliche Symptomatik, jedoch durch einen bakteriologisch positiven Befund und erhöhte Milchzellzahlen (SCC, somatic cell count) gekennzeichnet ist (Ha-mann und Fehlings 2002). Betroffene Tiere stellen somit ein ständiges Erregerreservoir in der Herde dar (Robertson et al. 1994). Man geht davon aus, dass meist das Zusammenwirken mehrerer Faktoren (v.a. mangelnde Melk-hygiene, Fütterungs- und Haltungsmängel, Stress) die Entstehung einer Mastitis begünstigt (Ha-mann und Fehlings 2002). Mastitiden treten präferentiell in der Trockenstehzeit und im periparta-len Zeitraum auf. So wurde gezeigt, dass 65% aller „coliformen Mastitiden“ (v.a. durch E. coli), die in den ersten zwei Monaten der Laktation auftreten, auf eine Infektion in der Trockenstehpe-riode zurückgehen und sich erst mit Beginn der Laktation zu klinischen Mastitiden entwickeln (Smith et al. 1985). Gründe hierfür scheinen die Steigerung verfügbarer Nährstoffe aus der Milch, als auch ein Absinken antimikrobieller Faktoren wie bspw. Laktoferrin zu sein (Todthunter et al. 1990). Von einer ähnlichen Situation wird auch bei Mastitiden durch Kuh-assoziierte, Gram-positive Erreger ausgegangen (Huszenicza et al. 2004). In Milchviehbetrieben mit gutem Mana-gement ist eine Abnahme der Inzidenz von Mastitiden durch Gram-positive Erreger zu beobach-ten, bei gleichzeitigem Anstieg Gram-negativ bedingter Infektionen (Myllys et al. 1998, Erskine 2000). Mit zunehmender Laktationsdauer nimmt die Inzidenz von „Coli-Mastitiden“ ab (Husze-nicza et al. 2004), mit zunehmendem Alter und Anzahl der Laktationen hingegen zu (Hogan und Smith 2003, Burvenich et al. 2003). Die Inzidenz der durch Gram-positive Erreger hervorgerufe-nen Mastitiden nimmt mit zunehmender Laktationszahl ab (Huszenicza et al. 2004). Die kritische peripartale Phase ist durch massive metabolische und hormonelle Veränderungen gekennzeichnet. So wird die pathogenetische Bedeutung erhöhter Plasmaketokörperkonzentrati-onen einerseits (Suriyasathaporn et al. 1999) und die immunmodulatorische Potenz der peripartal stark veränderlichen Steroidhormone (Östrogene, Progesteron, Kortikosteroide) diskutiert (Wes-sendorf et al. 1998, Scheibl und Zerbe 2000, Zdunczyk et al. 2001). Interessanterweise ist zu beo-bachten, dass eine „Coli-Mastitis“ im peripartalen Zeitraum meist als schwere Erkrankung mit teilweise irreparablen Schäden für das betroffene Euterviertel verläuft (Vandeputte-Van Messom et al. 1993). Dagegen sind in der späteren Laktation meist moderate, oft schnell selbstheilende Verläufe zu beobachten (Hill 1991). Auch dies lässt auf einen entscheidenden Einfluss Kuh-assoziierter peripartaler Faktoren auf frühe Erreger-Wirts-Interaktionen schliessen.

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2.2 Abwehrmechanismen im Euter

2.2.1 humorale Faktoren Lösliches CD14 (sCD14)

Das membranständige, im Wesentlichen auf Monozyten und Makrophagen exprimierte CD14 (cluster of differentiation 14, siehe 2.5.2) dient als Erkennungsrezeptor für bakterielles LPS (En-dotoxin) und wird durch Proteasen als lösliches CD14 (sCD14, soluble CD14) freigesetzt. Diese lösliche Form kann in beträchtlicher Menge in Milch und Kolostrum vorkommen (Wang et al. 1997, Labeta et al. 2000, Filip et al. 2001). Lösliches CD14 erleichtert die Neutralisation von frei-en Endotoxinen und Lipoproteinen, welche durch Teilung und Absterben von Bakterien freige-setzt werden (Soler-Rodriguez et al. 2000). Wird sCD14 intramammär infundiert, unterstützt die Bindung von LPS die akute Entzündungsantwort über die Sensibilisierung und Aktivierung CD14-negativer Zellen (in der Milchdrüse die Milchdrüsenepithelzelle). So scheint sCD14 bei niedriger Endotoxinkonzentration freie Endotoxine abzufangen und die akute Entzündungsant-wort zu initiieren: Ein hierdurch hervorgerufenes frühes Einwandern neutrophiler Granulozyten (siehe 2.2.2) sorgt dafür, dass eine Immunantwort ausgelöst wird, bevor ein nennenswertes Bak-terienwachstum stattfinden kann. Von beiden Funktionen des löslichen CD14 nimmt man an, dass sie entscheidend für eine schnelle Eliminierung intramammärer Infektionen mit Gram-negativen Keimen sind und dadurch einem systemischen Schock und Agalaktie vorbeugen (Bur-ton und Erskine 2003). In neueren Studien wurde sCD14 zudem als das erste natürlich vorkom-mende lösliche Protein dargestellt, das in der Lage ist, bei isolierten B-Zellen Wachstum und Dif-ferenzierung zu induzieren (Filip et al. 2001). Es hemmt überdies die Interleukin-2- (IL-2-), Inter-feron-γ- (IFN- γ) und die IL-4-Produktion aktivierter humaner T-Zellen (Rey Nores et al. 1999). Damit reguliert und beeinflusst sCD14 lokale, angeborene und adaptive Immunantworten. Eine therapeutische Anwendung dieser Moleküle gilt als denkbar (Burton und Erskine 2003).

Komplement

Das Komplementsystem bildet das wichtigste humorale Effektorsystem der angeborenen Immu-nität. In der Milch spielt vor allem seine direkte Aktivierung durch verschiedene mikrobielle Be-standteile eine bedeutende Rolle. Diese führt letztendlich zu einer Opsonisierung von Erreger-bestandteilen und dadurch zu einer Förderung der Phagozytoseaktivität. Das biologisch aktivste Komplementfragment in der Milch ist C5a. Dieses Fragment führt als chemotaktische Kompo-nente zu einem vermehrten intramammären Einstrom von Neutrophilen. Einzelne Kühe unter-scheiden sich erheblich in der initialen Konzentration von C5 in der Milch und demnach eben-falls in ihrer Möglichkeit, C5a im Rahmen einer initialen Entzündungsreaktion zu generieren (Rainard und Poutrel 2000). Somit scheint bei Kühen mit einer niedrigen Konzentration von C5 in der Milch das Komplementsystem von minimalem Wert für die initiale Aktivierung von Leu-kozyten zu sein (Kehrli und Harp 2001). Auch die Art der Infektion scheint beeinflussend zu wirken: so konnte nach intramammärer Infektion mit E. coli deutlich mehr C5a nachgewiesen werden als nach einer Infektion mit S. aureus (Riolet et al. 2000). Neben C5a als chemotaktischer Komponente in der Milch stellt C3b einen wichtigen Opsonisierungsfaktor für die Phagozytose von Mikroorganismen dar. Werden Pathogene mit großen Mengen solcher aktivierten Komple-ment-Komponenten opsonisiert, wird die Erkennung und Phagozytose durch Neutrophile stark gefördert (Targowski 1983, Mueller et al. 1983).

Zytokine und Chemokine

Zytokine sind biologische Botenstoffe, die Signale zwischen Zellen übermitteln. Es sind kleine, lösliche Proteine, die von einer Zelle gebildet werden und entweder die eigenen Eigenschaften, die einer benachbarten oder entfernten Zelle rezeptorvermittelt verändern. Sie werden von vielen

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Zellen, nicht nur denen des Immunsystems, freigesetzt. Eine besondere Gruppe der Zytokine stellen die Chemokine dar: Sie veranlassen spezifisch Zellen, zur Quelle der Chemokinausschüt-tung zu wandern (Janeway et al. 2002). Durch pro- und anti-inflammatorische Eigenschaften (siehe Tabelle 1) spielen sie als Immunmo-dulatoren eine große Rolle bei der Mastitisabwehr (Sordillo et al. 1991). So wiesen Untersuchun-gen im Kolostrum eine niedrige IL-2-Konzentation auf, was sowohl mit einer herabgesetzten Funktion der zellulären Abwehr als auch einer hohen Inzidenz an Mastitiden korrelierte (Sordillo und Streicher 2002). Untersuchungen zu einem möglichen therapeutischen Einsatz von IL-2 im Rahmen der Mastitisbekämpfung sind beschrieben (Daley et al. 1993). Aus der Gruppe der Ko-lonie-stimulierenden Faktoren (colony stimulating factors, CSF) konnte rekombinanter humaner Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (rhG-CSF) nach subkutaner Applikation beim Rind die Anzahl zirkulierender PMN erhöhen (Cullor et al. 1990). Rekombinanter boviner Granulozy-ten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (rbGM-CSF) hingegen zeigte nach intramam-märer Applikation keinen signifikanten Effekt auf die somatische Zellzahl, steigerte jedoch die Fähigkeit residenter PMN zur Produktion von Superoxiden (Daley et al. 1993). Während einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus konnte eine vergleichbare Steigerung von IL-1, IFN-γ, und IL-12 im Milchsekret beobachtet werden. Eine E. coli-Mastitis induzierte zudem eine deutliche Freisetzung von TNF-α und IL-8. (Bannerman et al. 2004).

Tabelle 1: Effekte von Zytokinen und Chemokinen auf die Immunantwort im Euter (modifi-ziert nach Sordillo und Streicher 2002)

Zytokin Eigenschaft, Beobachtungen IL-1 Akut pro-inflammatorisch; steigert die Anzahl Neutrophiler und deren phagozytierende und

bakterizide Eigenschaften.

IL-2 Steigert die Proliferation mononukleärer Zellen des Euters; verbessert cytotoxische und bakterizide Lym-phozytenaktivität; erhöht die Anzahl von Plasma-Zellen; aktiviert NK-Zellen.

IL-8 Entzündungseinleitend, potent chemoattraktiv; bewirkt das Einwandern und die Induktion von endothelialen Bindungsstellen auf Neutrophilen.

G-CSF Steigert sowohl die Anzahl von Blut- und Milch-Neutrophilen als auch deren phagozytierende und bakterizide Eigenschaften; erhöht den SCC.

GM-CSF Erhöht die Anzahl an Phagozyten, steigert chemotaktische und bakterizide Eigenschaften von Neutrophilen, vergrößert cytotoxische Aktivität.

M-CSF Reguliert Differenzierung und Proliferation von Makrophagen; potent chemoattraktiv für Makrophagen.

IFN-γ Steigert phagozytierende und bakterizide Eigenschaften von Neutrophilen; steuert immunsuppres-siven Effekten in der Milch entgegen.

TNF-α Akut pro-inflammatorisch; steigert phagozytierende und bakterizide Eigenschaften von Neutrophilen, verstärkt die Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle.

IL = Interleukin, G-CSF = Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, GM-CSF = Granulozy-ten/Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, M-CSF = Makrophagen-Kolonie-stimulierender Fak-tor, IFN-γ = Interferon-γ und TNF-α = Tumor Nekrose Faktor- α, SCC = somatische Zellzahl.

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Antikörper

Die in der Milch vorhandenen und dominierenden Antikörperisotypen unterscheiden sich je nach Laktationsstadium. Im Kolostrum findet man eine hohe Konzentration von IgG1 und eine rela-tiv niedrige von IgA, während sich das Verhältnis in der späteren Laktation zu Gunsten von IgA verschiebt. Die Bindung von Antikörpern an Bakterien, alleine oder in Verbindung mit Kom-plementkomponenten, ist notwendig für die Opsonisierung von Pathogenen. Einigen Studien zufolge gilt IgM als ein wichtiges Opsonin für die Phagozytose durch bovine Neutrophile (Hill et al. 1983, Miller et al. 1988, Watson 1989, Hogan et al. 1992). Im Gegensatz zu IgM-Antikörpern benötigen Antikörper des Istotyps IgG2 keine Komplementbindung zur wirkungsvollen Opsoni-sierung (Colditz und Watson 1985, Rainard et al. 1988): Bovine Neutrophile exprimieren bei Einwanderung in infiziertes Gewebe verstärkt hochaffine, spezifische Fc-Rezeptoren für patho-gengebundene IgG2-Moleküle jedoch keine Fc-Rezeptoren für IgG1- oder IgA-Antikörper (Las-celles 1979, McGuire et al. 1979, Howard et al. 1980, Worku et al. 1994, Tao et al. 1995, Paape et al. 2000). IgG1 ist der vorherrschende Antikörperisotyp in normaler Milch (Guidry et al. 1980), vermutlich, um eine passive Immunität für das Kalb zu gewährleisten. IgG1-Antikörper wie auch IgM-Antikörper neutralisieren Endotoxine, blockieren die bakterielle Kolonisation und fördern die Phagozytose durch Komplement-Bindung (Rainard und Boulard 1992, Tyler et al. 1992, Tomita et al. 1995).

Laktoferrin und Lysozym

Laktoferrin ist ein eisenbindendes Glykoprotein welches in den sekundären Granula der PMN und in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere der Milch, vorkommt (Farnaud und Evans 2003). Es zeigt in vitro bakteriostatische Wirkung und in vivo eine Schutzfunktion gegen ver-schiedenste Mikroorganismen (van Hooijdonk et al. 2000, Kutila et al. 2003), die bei dem Spalt-produkt Laktoferricin noch stärker ausgeprägt sein sollen (Wakabayashi et al. 2003). Diese Wir-kung beruht auf einer ausgeprägten Fähigkeit zur Eisenbindung, wodurch Bakterien mit hohem Eisenstoffwechsel nicht mehr genügend Eisen zur Verfügung steht. Die höchsten Konzentratio-nen sind während der Trockenstehzeit messbar (Reiter und Oran 1967). Aber auch bei Mastitiden ist der Spiegel in der Milch erhöht (Hagiwara et al. 2003). Lysozym ist ein Enzym, das an der Zellwand Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien haf-tet. Durch Zerstörung der Bindungen in Bestandteilen bakterieller Zellmembranen (Mureine) wirkt es bakteriolytisch. Da es beim Rind in erheblich geringerer Konzentration als beim Men-schen vorkommt, bietet es bei ersteren vermutlich nur wenig Schutz (Sordillo und Streicher 2002).

Beta-Defensine

Defensine sind Cystein- und Arginin-reiche, weit verbreitete bakterizide und fungizide Peptide (Schroder 1999, Zasloff 2002). Sie werden in drei Unterfamilien eingeteilt: α-, β- und θ-Defensine. Bei den β-Defensinen handelt es sich um kationische, amphiphile Moleküle, die aus 38-42 Aminosäuren bestehen. Sie werden in Epithelzellen und besonders in neutrophilen Granu-lozyten synthetisiert. Ihre Wirksamkeit ist pathogenspezifisch und die Expression einer Reihe dieser Gene wird durch Pathogene induziert (Diamond et al. 1996, Diamond et al. 2000). Als Effektormoleküle der neutrophilen Granulozyten macht ihr Anteil bis zu 15 % des Gesamtei-weißgehaltes dieser Zellen aus (Boman 1995). Die Expression des Gens für β-Defensin-2 beim Menschen geschieht über Toll-like-Rezeptor-2 und -4 (siehe 2.5.2) vermittelte Nuklear Faktor-kappa B (NF-κB) -Aktivierung (Birchler et al. 2001, Vora et al. 2004). Darüber hinaus wurde ge-zeigt, dass β-Defensin-1 in der Milch der Frau in bakterizider Konzentration vorkommt (Jia et al. 2001).

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Beim Rind sind bisher 16 β-Defensingene und 2 Pseudogene beschrieben (Roosen et al. 2004). Einige davon wurden in der Milchdrüse des Rindes nachgewiesen. Bereits vor mehr als 30 Jahren wurde von einer β-Defensin-ähnlichen bakteriziden Aktivität in der Zitze des Rindes berichtet (Hibbit et al. 1971). Kürzlich konnte jedoch erstmals mittels In-situ-Hybridisierung gezeigt wer-den, dass die Milchdrüsenepithelzelle der dominierende Expressionsort für β-Defensin-5 (BNBD5) im infizierten Euter ist (Goldammer et al. 2004). Aufgrund der geringen Sauerstoff-spannung im infizierten Euterviertel gewinnen sauerstoffunabhängige Mechanismen, wie die der Defensine, zum Abtöten von Bakterien durch neutrophile Granulozyten an Bedeutung (Paape et al. 2003). Raj et al. (2000) ist die Synthese eines Defensin-Moleküls namens „Dodekapeptid“ aus bovinen neutrophilen Granulozyten gelungen, welches eine antimikrobielle Wirkung ähnlich der der natürlichen Defensine zeigt.

2.2.2 zelluläre Faktoren Leukozyten

In der Milch klinisch gesunder Milchdrüsen sind zwischen 20.000 und 100.000 somatische Zellen (SCC) pro ml Milch nachweisbar. Die Festlegung dieser Zellzahlgrenzwerte beruht auf Untersu-chungen, in denen der Zellgehalt aus Viertelanfangsgemelken (VAG) ungeschädigter Euter von Erstkalbinnen untersucht wurde (Doggweiler und Hess 1983). Der Modalwert (Maximum der Häufigkeitsverteilung) betrug 20.000 Zellen/ml, die zweifache Standardabweichung, die in der Medizin übliche Sicherheitsgrenze der Norm, umfasste als obersten Wert 100.000 Zellen/ml. Oberhalb eines SCC-Wertes von 100.000 Zellen pro ml Milch ändert sich die chemische Zu-sammensetzung der Milch (u.a. der Fett- und Eiweißgehalt), und es verringert sich die Milchleis-tung, was in der Summe zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen führt (Kitchen 1981, Hamann 1992). Die Zellen der Milch setzen sich aus lymphoiden Zellen, Makrophagen, neutrophilen Granulozy-ten und Epithelzellen zusammen. Die Zusammensetzung ist äußerst variabel: So wurden Anteile für Makrophagen von 13% bis 95% der Gesamtleukozytenzahl beschrieben. Für Granulozyten schwanken die Werte zwischen 0% und 37% sowie für lymphoide Zellen zwischen 5% und 28 % (Paape et al. 1981, Concha 1986, Wever und Emanuelson 1989, Leitner et al. 2000). Diese erheb-lichen Schwankungen gelten ebenso für lymphozytäre Subpopulationen (B-Zellen, αβ-T-Zellen, γδ-T-Zellen) (Paape et al. 2000, Park et al. 2004) und hängen unter anderem vom Laktationssta-dium sowie der Gemelksfraktion ab (Miller et al. 1991, Östenson 1993). Generell gehen die Meinungen bezüglich der Bedeutung initial vor Erregerkontakt in der Milch befindlicher Zellen auseinander. Ihr Vorhandensein und ihre Zusammensetzung kann als Aus-druck der Aktivität residenter Milchdrüsenepithelzellen angesehen werden, die möglicherweise über physiologische Faktoren (z.B. Hormone) gesteuert werden. Ob in der Milch befindliche Zellen an ersten immunologischen Induktionsprozessen nach Erreger-Kontakt maßgeblich teil-nehmen, ist nicht bekannt.

Milchdrüsenepithelzelle (MEC)

Die Bedeutung der MEC für die Abwehrleistung des Euters ist bisher nicht nachhaltig untersucht worden. Erst neuerdings mehren sich die Hinweise, dass den alveolaren Epithelzellen der Milch-drüse eine wesentliche Funktion bei der Infektionsabwehr zukommt. Anhand genomweiter Transkriptomanalysen wurde im murinen Milchdrüsengewebe gezeigt, dass die Abschaltung der Milchbildung während der Milchdrüseninvolution zu einer Aufregulierung einer ganzen Reihe immunrelevanter Gene führt (Stein et al. 2004, Clarkson et al. 2004). Beide Arbeiten weisen aus, dass in der Milchdrüse der Maus Gene exprimiert werden, die für verschiedene Immunglobulin-Ketten, Akute Phase Proteine, CD14, Lipopolysaccharid-Bindungsprotein (LBP) sowie für ver-schiedenste Zytokine kodieren. An primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen (pbMEC) konnte exemplarisch gezeigt werden, dass diese nach Stimulation mit S. aureus oder LPS zur Synthese von Laktoferrin, TNF-α, Serum Amyloid A und IL-8 angeregt werden (Wellnitz und Kerr 2004).

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Neben der oben bereits angesprochenen Induktion bakterizider β-Defensine (siehe 2.2.1) konnte auch eine erhöhte mRNA- Expression von TLR-2 und -4 bei der Mastitis des Rindes gezeigt werden (Goldammer et al. 2004). Es ist also bisher festzuhalten, dass die MEC ein ganzes Reper-toire immunologisch relevanter Faktoren exprimieren kann, deren Synthese durch pro-inflammatorische Faktoren stimuliert wird. Einige dieser Faktoren werden nicht systemisch, son-dern lokal begrenzt induziert, wie beispielhaft für die Mastitis-abhängige Induktion der β-Defensinsynthese im Euter gezeigt werden konnte (Yang et al. 2005).

Neutrophile Granulozyten

Unter dem Einfluss hämatopoetischer Faktoren reifen die neutrophilen Granulozyten über Zwi-schenstufen aus myeloischen Stammzellen des Knochenmarks heran und werden in den Blut-kreislauf freigesetzt (Roitt et al. 1991). Die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zählen gemeinsam mit dem vielgestaltigen, polymorphen Kern zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter, neutrophiler Granulozyten. Andere Bezeichnungen lauten „Neutrophile“ oder „polymorphkernige Granulozyten“ (PMN, polymorphonuclear cells) (Janeway et al. 2002). Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrola-sen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen. Sekundäre Granula enthalten zudem noch Laktoferrin und Kollagenasen (Gemsa 1991, Klein 1991). Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark etwa um das Zehnfache. Ihre Überlebensdauer beträgt bei Mensch und Ratte etwa zwei bis drei Tage (Roitt et al. 1991, Hildebrandt 1998), kann aber durch lokal produzierte, anti-apoptotische Media-toren (Bliss et al. 1999) oder durch Einwanderung in Entzündungsgebiete verlängert werden (Watson et al. 1997). Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morpho-logisch denen anderer Spezies ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes beim Rind, und ihre Halbwertzeit außerhalb des Knochenmarks beträgt durchschnittlich 8,9 Stunden (Carlson und Kaneko 1975). Neben an den Blutgefäßen adhärenten zirkulieren ca. 100 Milliarden PMN bei einer gesunden, laktierenden Kuh im Blutgefäßsystem (Paape et al. 1979). Zusätzlich zu anderen Spezies besitzen bovine neutrophile Granulozyten eine dritte Art zytoplasmatischer Granula, die größer sind und kationische, selektiv bakterizide Proteine, wie z.B. Baktenecin (Romeo et al. 1988), Indolicin und β-Defensin enthalten (Selstedt et al. 1993). Bovinen Neutrophilen fehlt das Lysozym, eine Hauptkomponente der humanen azurophilen Granula. Im Gegensatz zu anderen Spezies besit-zen bovine Neutrophile jedoch offensichtlich Fc-Rezeptoren für IgM (Pastoret et al. 1998). Neutrophile Granulozyten gelten als Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems bei bakteriellen Infektionen der Milchdrüse (Paape et al. 2003). Hierbei kommt der Geschwindigkeit ihrer Rekrutierung, ihrer Anzahl und ihrer lokalen Überlebensdauer eine entscheidende Bedeu-tung für das Haften der Infektion und den Krankheitsverlauf zu. In-vitro-Studien konnten bele-gen, dass sich sowohl mammäre als auch uterine PMN von autologen Blut-PMN in ihrer bakteri-ziden Aktivität unterscheiden (Zerbe et al. 2000, Mehrzad et al. 2001). Als Ursache für die migra-tionsbedingten Modulationen der PMN-Charakteristika werden Interaktionen mit lokalen Makrophagen vermutet, jedoch fehlen entsprechende Studien bisher gänzlich. Aufgrund der star-ken interindividuellen Variabilität der funktionellen Kapazität von PMN aus dem Euter juveniler Rinder wurde vorgeschlagen, die phagozytische und die bakterizide Kapazität der Neutrophilen als Marker für die Resistenz gegenüber Euterinfektionen anzuwenden (Rysanek et al. 2001). Entzündungsmediatoren (z.B. Interleukin-8, C5a, Leukotrien B4) wirken chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten. Sie induzieren innerhalb weniger Stunden die Expression der Adhäsi-onsmoleküle E-Selektin (CD62E) und P-Selektin (CD62P) auf Endothelzellen. Wechselwirkun-gen mit dem L-Selektin der Leukozyten führen zu einer lokalen Verlangsamung der PMN im Blutstrom (Margination), sowie zu einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäß-wand. IL-8 bewirkt eine Konformationsänderung der physiologischer Weise schwach bindenden

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Leukozyten-Integrine LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1, CD11a/ CD18) und CR3 (Komplementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt). Deren Affinität zu ihren Liganden, den interzellulären Zelladhäsionsmolekülen (ICAM-1, intercellular cell adhesion mole-cule), der Endothelzellen, wird dadurch deutlich erhöht, was eine Immobilisation der Zellen zur Folge hat. Als Verstärkung der Bindung dient das Immunglobulin ähnliche Molekül CD31 (auch PECAM, platelet endothelial cell adhesion molecule), das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (Janeway et al. 2002). So akti-vierte Neutrophile können zwischen die Endothelzellen und Blutgefäßmatrixproteine migrieren (Diapedese) und gelangen entlang eines Konzentrationsgradienten zum Entstehungsort der Ent-zündungsmediatoren. Die durch Migration aktivierten Neutrophilen phagozytieren rezeptorvermittelt infektiöse Patho-gene und internalisieren sie in den Phagosomen. Nach Verschmelzung mit Lysosomen zu den Phagolysosomen werden mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme/Polypeptide die aufgenommenen Mikroorganismen inaktiviert und getötet (Djeu und Blanchard 1987, Jackson et al. 1995, Cassatella 1996, Belaaouaj et al. 1998, Burton und Erskine 2003). Einen Schutz vor der Selbstschädigung des lokalen Gewebes v.a. durch reaktive Sau-erstoffmetaboliten bieten protektive Enzyme, wie z.B. Superoxiddismutase und Katalase (Jane-way et al. 2002).

Zelltod neutrophiler Granulozyten

Je nach Bedarf der Situation in vivo kann durch unterschiedliche Mechanismen die Schädigung des Gewebes durch Hemmung der Neutrophilen verhindert oder die Aktivität der Neutrophilen verstärkt werden (Tsuchida et al. 1995). Bei akuten inflammatorischen Prozessen ist es meist von Vorteil, die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten zu verlängern, damit bakterielle Erreger effi-zienter phagozytiert und abgetötet werden können. Später im inflammatorischen Geschehen gilt es den Influx von Neutrophilen ins Gewebe und deren Lebensdauer vor Ort zu begrenzen, um Gewebeschädigungen zu vermeiden. Ein kontrolliertes Absterben von Neutrophilen durch A-poptose kann dann eine effektive Möglichkeit sein, potentiell gewebeschädigende Zellen un-schädlich zu „entsorgen“. Somit ist die Apoptose als ein regulativer Kontrollmechanismus anzu-sehen (Fanning et al. 1999). Die Apoptose der Neutrophilen wird größtenteils über Zytokine und Chemokine gesteuert (Tsu-chida et al. 1995). Die Induktion der Apoptose verschiedener myeloider Zelllinien durch Makrophagen und membranständiges TNF-α, jedoch nicht durch lösliches TNF-α, konnte nach-gewiesen werden (Aliprantis et al. 1996, Meszaros et al. 2002). Neutrophile sind hochempfindlich gegenüber der Induktion einer CD95-(Fas)-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas. Durch die konstitutive Koexpression von Fas und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche besteht darüber hinaus die Möglichkeit der autokrin induzierten Apoptose. Durch die Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α oder Dexamethason kann die Fas-vermittelte Apoptose gehemmt werden (Liles et al. 1996).

Makrophagen

Makrophagen entwickeln sich aus myeloischen Stammzellen des Knochenmarks, zirkulieren als Monozyten im Blut und wandern ins Gewebe, wo sie zu Makrophagen ausdifferenzieren (Zem-bala und Asherson 1989). Mikroskopisch stellen sich Makrophagen als zytoplasmareiche, stark granulierte Zellen mit cha-rakteristischen Ausläufern dar und sind mit einem Durchmesser von ungefähr 20 µm deutlich größer als Granulozyten oder Lymphozyten (Hildebrandt 1998). Als funktionell bedeutsame Struktur weist die Plasmamembran von Makrophagen MHC-Klasse-II-Moleküle auf, deren Expressionsdichte stark vom Aktivierungszustand der Zelle abhängt. MHC-Klasse-II-Moleküle dienen der Präsentation von Antigenen und der Interaktion der

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Makrophagen mit T-Helfer-Lymphozyten. Daneben exprimieren Makrophagen Komplementre-zeptoren, Fc-Rezeptoren und Adhäsionsmoleküle. Außerdem weisen Makrophagen auf ihrer Oberfläche spezielle Moleküle zur Erkennung häufig auftretender mikrobieller Bestandteile auf, die auf anderen, wirtseigenen Zellen nicht oder nur geringgradig exprimiert sind. Dazu gehören CD14, Mannose-Rezeptoren, Scavenger-Rezeptoren und Toll-like Rezeptoren (siehe 2.5.2). Die Bindung an Toll-like Rezeptoren führt nachweislich zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, die wiederum die Bildung pro-inflammatorischer Zytokine unterstützen. Makrophagen gehören zu den stark phagozytierenden Zellen. Ebenso wie PMN vermögen sie Pathogene in Phagosomen aufzunehmen und diese im Zellinneren mit Lysosomen zu fusionie-ren. Nach der Fusion können dann die Pathogene und Noxen durch Veränderung des pH-Wertes, bakterizide Enzyme, toxische Sauerstoffderivate, toxische Stickstoffoxide, antimikrobielle Peptide und Kompetitoren unschädlich gemacht werden (Diment und Stahl 1985, Janeway et al. 2002). Wie bei PMN ist die Phagozytose nicht opsonisierter Pathogene möglich, sie wird jedoch durch Opsonisierung mit Immunglobulinen oder Komplementfaktoren deutlich verstärkt. Bovine Makrophagen bilden wie PMN im Rahmen des „respiratory burst“ toxische Sauerstoff-metaboliten (Bounous et al. 1992, Forman und Torres 2002), wenn auch in schwächerer Ausprä-gung (Ohmann und Babiuk 1984, Goff et al. 1996). Besonders gegenüber sehr großen extrazellulären Pathogenen können Makrophagen durch die exozytotische Freisetzung der in den Lysosomen enthaltenen Faktoren zytotoxisch wirken (Jane-way et al. 2002). Bei Kontakt mit Bakterien sezernieren sie zahlreiche, vor allem pro-inflammatorische Zytokine, wie z.B. TNF-α, Makrophagen-inflammatorisches Protein (MIP), IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 und Transforming growth factor β (TGFβ), die zur Eigenstimulation, zur Anlockung weiterer Leukozyten, zur Aktivierung bestimmter Lymphozytensubpopulationen und auch zu systemischen Effekten wie z.B. Fieber führen (Akira und Kishimoto 1996, Janeway et al. 2002, Norimatsu et al. 2003). Ein Teil der von Makrophagen initiierten Entzündungsreaktionen resultiert in der Anlockung von PMN. So zeigen neutrophile Granulozyten gerichtete Migration zu einigen der von stimulierten Makrophagen freigesetzten Zytokine (z.B. IL-8). Dies konnte auch für bovine Makrophagen gezeigt werden (Henricks et al. 1990).

Makrophagen und das Th1/Th2-Konzept

Makrophagen oder dendritische Zellen interagieren mit Lymphozyten und können durch Aus-schüttung pro- und anti-inflammatorischer Zytokine den Charakter einer Immunantwort beein-flussen. Auf diese Weise entwickeln sich naive T-Zellen entweder zu einer Th1-(T-Helfer-1) oder zu einer Th2-Zelle, die sich funktionell unterscheiden (Abbas et al. 1996). Die Art und Weise, wie Makrophagen den nachfolgenden Typ der adaptiven Immunantwort oder die Dominanz eines bestimmten T-Helferzell-Phänotyps steuern, ist maßgeblich pathogenabhän-gig (Chakkalath et al. 1994, Pulendran et al. 1999, Rissoan et al. 1999). So sezernieren Makropha-gen bspw. nach dem Kontakt mit vielen mikrobiellen Produkten das pro-inflammatorische IL-12, welches als das bedeutendste Th1-induzierende Zytokin gilt (Trinchieri 1997). Die generierten Th1-Zellen schütten nun wiederum grosse Mengen IFN-γ aus, welches die Makrophagen akti-viert und weiterhin zur erhöhten IL-12-Ausschüttung veranlasst. IL-10 hemmt eine Differenzie-rung in Richtung Th1. Dieses Zytokin kann von Makrophagen aber z.B. auch Th2-Zellen sezer-niert werden (Janeway et al. 2002). Die Entwicklung einer T-Helfer-Zelle in eine der beiden Richtungen ist nicht irreversibel. Im sogenannten Th1/Th2-Switch kann sich eine generierte Th-Zell-Population bedingt in die andere umwandeln (Perez et al. 1995, Nakamura et al. 1997). Betrachtet man dieses Phänomen vor dem Hintergrund des peripartalen Zeitraumes, so drängt sich die Frage nach einer möglichen hormo-nellen Beeinflussung einer Th1- oder Th2-Antwort auf: Progesteron, das während der Gravidität vorherrschende Sexualhormon, induziert eine erhöhte Prostaglandin E2 (PGE2)-Produktion endometrialer Zellen. Dies bewirkt in den Makrophagen eine erhöhte Interleukin-10-Produktion (Kuroda et al. 2001). Uterine Makrophagen produzieren somit weniger sog. pro-

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inflammatorische, Th1-induzierende Zytokine, sondern mehr Zytokine und Mediatoren, die eine Immunantwort in Richtung Th2 polarisiert (Dealtry et al. 2000). Diese Reaktionsweise uteriner Makrophagen ist für die Aufrechterhaltung einer normalen Gravidität offensichtlich essentiell (Elovitz et al. 2003). Ob und wie nach der Geburt eine Veränderung dieser Reaktionsweise uteri-ner Makrophagen erfolgt, und ob mammäre Makrophagen in ähnlicher Art und Weise beeinflusst werden, ist bisher unbekannt.

Die Bedeutung des Arginin-Stoffwechsels bei Makrophagen

Im Rahmen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies können Makrophagen große Mengen an to-xischem Stickoxid (NO) bilden, das schnell in weitere reaktive Stickstoffverbindungen umgesetzt wird. Die NO-Bildung wird durch die induzierbare Stickoxid Synthase (iNOS) katalysiert, die auch beim Rind nachgewiesen ist (Adler et al. 1994, Aldwell et al. 1997, Stich et al. 1998). Als Substrat dient die Aminosäure L-Arginin, welche alternativ durch das Enzym Arginase abgebaut werden kann. Es zeigte sich, dass beide genannten Enzyme einer reziproken Regulation unterlie-gen, welche möglicherweise auch beim Rind von Bedeutung für das Immunsystem ist. Die Stickoxid-Synthase, von der drei Isoformen existieren, kann Arginin über das Zwischenpro-dukt NG-Hydroxy-L-Arginin zu Citrullin und NO verstoffwechseln. Zwei der Isoformen, die neuronale und die endotheliale Form, synthetisieren Calcium-abhängig kleine Mengen an NO, welches als Botenstoff bei vielen physiologischen Prozessen (wie z.B. Vasoregulation oder Darmperistaltik) beteiligt ist. Die induzierbare NO-Synthase, welche die dritte Isoform darstellt, wird Calcium-unabhängig durch transkriptionelle Induktion reguliert (Macmicking et al. 1997), wobei vor allem von Makrophagen große Mengen an NO über lange Zeiträume synthetisiert werden können. NO und weitere reaktive Folgeprodukte (z.B. Peroxynitrit) interagieren dann mit Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren und sind so an zytotoxischen, antibakteriellen und antivi-ralen Abwehrmechanismen beteiligt. In einem alternativen Stoffwechselweg kann Arginin mittels Hydrolyse durch das in zwei Isofor-men vorliegende Enzym Arginase zu den Produkten Ornithin und Harnstoff abgebaut werden. Aus der Aminosäure Ornithin kann durch die mitochondriell gelegene Ornithin-Aminotransferase Prolin synthetisiert werden, welches eine zentrale Komponente des Kollagens darstellt. Durch das Enzym Ornithin-Decarboxylase wird Ornithin zu den Polyaminen Putrescin, Spermidin und Spermin abgebaut, welche u.a. bei der Zellreplikation von Bedeutung sind (Tabor und Tabor 1984). Je nach Expression der konkurrierenden Enzyme iNOS oder Arginase verschiebt sich folglich die Homöostase des Immunsystems entweder in Richtung Inflammation (Generierung reaktiver Stickstoffverbindungen durch die iNOS) oder Anti-Inflammation (Reparaturprozesse, Kollagen-synthese durch Arginase) (Bogdan 2001). Murine Makrophagen zeigen modulationsabhängig sowohl hohe Arginase- als auch iNOS-Aktivität (Corraliza et al. 1995, Modolell et al. 1995, Munder et al. 1999). Während Lipopolysac-charid Gram-negativer Bakterien gleichzeitig beide Enzyme des Argininstoffwechsels induziert (Wang et al. 1995), findet eine selektive Induktion eines der beiden Enzyme im Rahmen zytokin-vermittelter Immunreaktionen statt: Typische Th1-Zytokine (TNF-α, IFN-γ) induzieren die Ex-pression der iNOS und hemmen die Arginase. Umgekehrt bewirken typische Th2-Zytokine (IL-4, IL-10, IL-13) die Expression der Arginase und Hemmung der iNOS. Auch in zellulären Inter-aktionen mit polarisierten Th1-und Th2- T-Zell-Klonen zeigt sich eine ausgeprägte Polarisierung des resultierenden Arginin-Stoffwechsels muriner Makrophagen (Munder et al. 1998).

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iNOSArginase

Arginin

Ornithin + Harnstoff

Prolin

Th2-Zytokine(IL-4, IL-10, IL-13)LPS

Th1-Zytokine(IFN- , TNF- , TNF-LPS

γ α β

Kollagen Polyamine

NO2

NO + Citrullin

NO3

(Putrescin, Spermidin, Spermin)

= agonistisch = antagonistisch

Abbildung 1: Alternative Wege des Argininstoffwechsels (modifiziert nach Doschko 2004)

Die Zwischen- und Endprodukte der jeweiligen Stoffwechselwege sind ebenfalls an der dichoto-men Regulation beteiligt. So hemmt Nitrit, ein stabiles Produkt von NO, die Arginase (Boucher et al. 1994, Hrabak et al. 1996), während das Polyamin Spermin (Southan et al. 1994) und Harn-stoff (Prabhakar et al. 1997) die iNOS hemmen. In murinen Krankheitsmodellen konnte gezeigt werden, dass die Polarisierung des Argininstoff-wechsels für den Phänotyp der Immunantwort von Bedeutung ist: Die dichotome Regulation des Argininstoffwechsels korreliert mit dem inflammatorischen Phänotyp und dem Verlauf von bspw. Wundheilung oder Sepsis (Shearer et al. 1997, Carraway et al. 1998). Inwiefern bovine Makrophagen die Arginase exprimieren und inwieweit eine vergleichbare rezip-roke Regulation stattfindet ist bisher noch nicht bekannt. Im Vergleich zu Ziegen und Büffeln zeigen bovine PMN jedoch einen signifikant höheren Gehalt an Arginase (Sahoo et al. 1998). Die bovine iNOS wird in ihrer Aktivität scheinbar unterschiedlich zu anderen Spezies reguliert, denn im Gegensatz etwa zur murinen iNOS konnte weder die Expression des Enzyms noch seine Ak-tivität (NO-Bildung) durch homologes IFN-γ allein gesteigert werden. Dass die bovine iNOS jedoch in ihrer Expression und auch in der NO-Bildung stimuliert werden kann, ist anhand von LPS und Salmonellen (S. dublin) gezeigt worden (Adler et al. 1995, Jungi et al. 1996).

2.3 Sexualsteroide im peripartalen Zeitraum Der peripartale Zeitraum ist gekennzeichnet durch eine starke Dynamik der weiblichen Sexual-hormone (Östrogene, Progesteron). Eine hohe Inzidenz an Mastitiden kurz nach der Abkalbung, lassen eine immunmodulatorische Wirkung dieser Hormone und eine damit verbundene patho-genetische Bedeutung vermuten. Progesteron ist beim Rind essentiell zur Aufrechterhaltung der Gravidität und wird v.a. im Corpus luteum graviditatis aber auch in der Plazenta gebildet. Die mittleren Progesteronkonzentrationen im peripheren maternalen Blut steigen beim Rind mit der Anbildung des Trächtigkeitsgelbkörpers, erreichen maximale Werte um 38-45 nmol/ml Serum im ersten Drittel der Gravidität und weisen im mittleren und letzten Drittel der Trächtigkeit einen leichten Konzentrationsabfall auf. Der

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steile antepartale Abfall auf Basalniveau erfolgt innerhalb der letzten 24-36 Stunden der Gravidi-tät (Henricks et al. 1971, Hoffmann et al. 1973, Schallenberger et al. 1985, Birgel et al. 1996). Die wichtigsten endogenen Östrogene beim weiblichen Rind in der Reihenfolge ihrer Wirksam-keit sind Östradiol-17β, Östron und Östradiol-17α (Döcke 1994, Buddecke 1994). Während der Brunst werden sie in den reifenden Ovarfollikeln und während der Gravidität in der Plazenta und vom Trophoblasten gebildet. Es ist jedoch auch beschrieben, dass freies Östradiol-17β antepartal im Euter synthetisiert wird (Maule-Walker et al. 1983, Janowski et al. 2000). Der Zeitraum der ersten Nachweisbarkeit graviditätsspezifischer Östrogene im peripheren maternalen Blutplasma erstreckt sich vom 50.-110. Graviditätstag. Ab dem 110. Graviditätstag ist dann ein deutlicher Konzentrationsanstieg sowohl im maternalen Plasma als auch in Kot und Urin nachweisbar. Im Blutplasma handelt es sich hierbei überwiegend um konjugiertes Östron. Die Konzentration frei-er, rezeptoraktiver Östrogene nimmt dagegen erst in den letzten 20-30 Tagen ante partum zu, besonders deutlich in der letzten Woche. Sie erreichen Maximalwerte im unmittelbaren periparta-len Zeitraum, wobei freies Östron in deutlich höheren Konzentrationen vorliegt als freies Östra-diol-17β oder Östradiol-17α (Robertson und King 1975, Robertson und King 1979, Möstl et al. 1985, Hoffmann et al. 1997). Nach der Abkalbung fallen die Östrogenwerte innerhalb kurzer Zeit auf Basalniveau. Die klassischen Wirkungen von Östrogenen und Progesteron werden durch spezifische Rezepto-ren vermittelt, welche zur Gruppe der Rezeptoren für hydrophobe Ringmoleküle gehören. Zu dieser Rezeptor-Superfamilie gehören neben den Rezeptoren für Sexualsteroide auch die Rezep-toren für Kortikoide, Schilddrüsenhormone, Vitamin D3 und Retinolsäure (Evans 1988). Nach neueren immunhistologischen Untersuchungen, befindet sich die überwiegende Mehrzahl der Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Zellkern. Da Steroide jedoch aufgrund ihres lipophilen Charakters die Zellmembran ungehindert passieren, können sie dort an die spezifischen Rezepto-ren binden (King und Greene 1984, Renoir et al. 1990). Rezeptoren für Sexualsteroide finden sich zwar vorwiegend in den primären und sekundären Geschlechtsorganen, sie sind jedoch dar-über hinaus in einer ganzen Reihe weiterer Organe nachweisbar. Offensichtlich unterliegen je-doch nicht nur ausschließlich Zellen mit einem nachweisbaren Besatz an Rezeptoren für Sexual-steroide deren Regulation, da auch Zellen ohne entsprechende Rezeptoren ihren Funktionszu-stand in Abhängigkeit von Sexualsteroidspiegeln ändern: Dies trifft bei den Östrogenen v.a. auf bestimmte Epithelzellen zu. In diesen Fällen werden Steroid-Effekte offensichtlich durch be-nachbarte, rezeptorpositive Stromazellen über parakrine Mediatoren vermittelt (Brenner et al. 1990, Cooke et al. 1997). Neben den rezeptorvermittelten Wirkungsweisen sind auch nicht-genomische Steroidwirkungen bekannt, die sich z. B. unspezifisch bei sehr hohen Steroidhor-monkonzentrationen durch Effekte auf die Zellmembranen ergeben (Schumacher 1990). Im Eu-ter wurde ausschließlich der „klassische” Östrogenrezeptor-α (ERα) nachgewiesen (Gustafsson 1999), welcher lange Zeit als der einzige galt und dort Wachstum sowie Differenzierung vermit-telt. Ein weiterer Östrogenrezeptor (ERβ) wurde auf einem anderen Chromosom bei verschiede-nen Spezies, u.a. dem Rind, gefunden und charakterisiert (Rosenfeld et al. 1999). Der Progeste-ronrezeptor (PR) ist in seiner Struktur den Östrogenrezeptoren sehr ähnlich. Hinsichtlich ihrer Regulation wurde in vielen der untersuchten Zielzellen und -geweben festge-stellt, dass Östrogene sowohl die Expression ihres eigenen Rezeptors (Varriale und Tata 1991, Ing und Tornesi 1997) als auch die des Progesteronrezeptors induzieren (Kraus und Katzenel-lenbogen 1993). Es wird aber auch über die Suppression des Östrogenrezeptors durch seinen Liganden berichtet (Borras et al. 1997). Das PR-Gen gilt allgemein als ER-abhängig (Savouret et al. 1991, Kraus et al. 1994), was voraussetzt, dass für rezeptorvermittelte Gestagenwirkungen zuvor ein „Östrogen-Priming” stattgefunden hat. Die Expression des Progesteronrezeptors steht jedoch nicht unter alleiniger Kontrolle von Östrogenen. Sie unterliegt einer multifaktoriellen Kontrolle, die sich aus dem Crosstalk des ER mit intrazellulären Signalübertragungswegen ergibt. Progesteron unterdrückt im allgemeinen die Expression von Östrogenrezeptoren (Evans und Leavitt 1980) sowie die Expression seines eigenen Rezeptors durch ER-vermitteltes Hochregulie-

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ren (Kraus und Katzenellenbogen 1993). Die Mechanismen der Suppression gelten jedoch nicht als vollständig geklärt. Über das Vorkommen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren in bovinen Leukozyten gibt es bisher fast keine Angaben. Winters et al. (2003) konnten bei bovinen PMN keine spezifische An-färbbarkeit des ERα und des PR nachweisen, während Stefano et al. (2000) das Vorkommen von Östrogenrezeptoren in humanen Granulozyten nachweisen konnten. Es ist jedoch eine Reihe von Sexualsteroid-Effekten auf das Immunsystem beim Rind bekannt (Wessendorf et al. 1998, Scheibl und Zerbe 2000): Den Östrogenen wird diesbezüglich überwie-gend eine Funktionsstimulierung attestiert, wie die Steigerung der Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten in Blut und Milch (Saad und Aström 1988), als auch der ROS-Bildung und der ungerichteten Migration (Roth et al. 1983, Hoedemaker et al. 1992). Angaben zur Modu-lation boviner Makrophagen durch Östrogene fehlen. Bei Mäusen gibt es hingegen widersprüch-liche Ergebnisse über eine funktionelle Beeinflussung dieser Zellen (Dean et al. 1986, Baranao et al. 1992, Chao et al. 1994). Ähnlich heterogen stellen sich Resultate zu Progesteroneffekten dar (Chao et al. 1994, Miller und Hunt 1998), dessen immunsuppressive Wirkungen jedoch (v.a. am Uterus) im Vordergrund ste-hen. Beobachtungen über einen möglichen Einfluss von Sexualhormonen auf eine erhöhte Inzidenz von Mastitiden liegen seit längerem vor (Brookbanks et al. 1969, Guidry et al. 1975). Untersu-chungen in jüngerer Zeit zeigten auf, dass Östrogen-Applikationen das Auftreten von Mastitiden begünstigen (Zdunczyk et al. 2001). Hohe Östrogenkonzentrationen gehen mit einer vermehrten Zellzahl in der Milch, als auch der Aktivierung subklinischer zu klinischen Mastitiden einher (Guidry et al. 1975, Schulz 1994).

2.4 Experimentelle Mastitis-Modelle Modellhafte Untersuchungen zu pathogenetischen Fragestellungen und Erfolgsaussichten pro-phylaktischer sowie therapeutischer Ansätze bei der Mastitis des Rindes werden schon seit meh-reren Jahrzehnten durchgeführt (z. B. Schalm et al. 1964). Die beim spontan erkrankten Patienten schwer kontrollier- und interpretierbaren Ausgangsbedingungen können im Modell bewusst vor-gegeben werden. Ganz entscheidend für die Qualität eines Tiermodells ist die Strenge der Mo-dellgrenzen. Bei Betrachtung der in den letzten 15 Jahren eingesetzten Mastitismodelle für E. coli- und S. au-reus-Infektionen sind stark heterogene Standards erkennbar. Zentrale Bedeutung bei der Auswahl der Tiere muss die Somatische Zellzahl der Milch (SCC) einzelner Euterviertel haben, da es z.B. für die E. coli-Mastitis allgemein akzeptiert ist, dass die Einwanderungszeit neutrophiler Granulo-zyten nach Infektion in das Euter entscheidenden Einfluss auf den Krankheitsverlauf hat (Bur-venich et al. 2003) und im Sekret vorhandene PMN im Modell funktionell nicht zu vernachlässi-gen sind. Die Angaben über präexperimentelle SCC-Werte variieren von <20.000 bis <600.000 somatischen Zellen/ml für S. aureus (Hensen et al. 2000, Ebling et al. 2001), und <30.000 bis <500.000 für E. coli (Scaletti et al. 2003, Bannerman et al. 2004). Üblicherweise liegt die obere Grenze jedoch zwischen <150.000 und <250.000 (Lohuis et al. 1990, Kremer et al. 1993, Pyörälä et al. 1994, Kornalijnslijper et al. 2003, Persson Waller et al. 2003, Vangroenweghe et al. 2004), zum Teil fehlen aber auch jegliche Angaben (Barrett et al. 1997, Tomita et al. 1998, Middleton et al. 2004). In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass bereits ab einem Wert von >100.000 Zellen/ml davon auszugehen ist, dass die normale zelluläre Abwehr in eine entzündliche Reakti-on übergeht (Hess und Egger 1969, Reichmuth 1975, Doggweiler und Hess 1983). Auch zu Bakterienstamm und Infektionsdosis sind unterschiedliche Angaben zu finden. Für die Induktion einer E. coli-Mastitis scheint die Wahl des Bakterienstammes eine geringere Rolle zu spielen, da es sich hier um ubiquitär vorkommende Umweltkeime handelt, die über die Faeces der Tiere ausgeschieden werden (Jones 1990) und als Opportunisten eine Infektion jederzeit

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möglich machen. Auch hinsichtlich der Schwere des Mastitisverlaufes scheint E. coli keine Hauptbedeutung zu besitzen (Bramley 1991). Die Infektionsdosis schwankt in den bisherigen Modellen zwischen 30 und 10.000 CFU / Euterviertel (Kornalijnslijper et al. 2003, Vangroen-weghe et al. 2004) und hat dadurch Auswirkungen auf die Zeitkinetik des bakteriellen Wachstums und das Erreichen von Maximalwerten koloniebildender Einheiten in der Milch nach experimen-teller Infektion. Während in den meisten Modellen die natürliche Barriere des Strichkanals um-gangen und direkt intrazisternal infiziert wird, sind entsprechend der Fragestellungen Versuchs-anordnungen bekannt, bei denen die Erreger lediglich mit der Zitzenhaut in Berührung kommen (Boddie und Nickerson 2002, Leslie et al. 2005). Zur gezielten Untersuchung von spezifischen Teilaspekten der E. coli-Mastitis wird zur Stimulation auch LPS eingesetzt (Schmitz et al. 2004, Prin-Mathieu et al. 2002). In den meisten Untersuchungen wird angegeben, dass die eingesetzten Euterviertel bei ein- oder mehrmaliger Voruntersuchung frei von zumindest den gängigen bakteriellen Mastitiserregern waren. Die Angaben über Infektions- und Versuchsdauer differieren von 96 Stunden (Kornalijns-lijper et al. 2003) bis zu 21 Tagen (Lohuis et al. 1990) für E. coli und 72 Stunden bis 48 Tage für S. aureus (Middleton et al. 2004, Shoshani et al. 2000). Somit sind die Resultate verschiedener Modelluntersuchungen nur bedingt vergleichbar. Außer-dem fällt bei der Analyse bisheriger Modelluntersuchungen auf, dass die Voruntersuchung und Auswahl der Tiere auf sehr unterschiedlichem Niveau stattfand. In den selteneren Fällen wurden die Versuchstiere streng nach Laktationszeitpunkt, Anzahl bisheriger Laktationen, niedriger SCC-Zahlen und wiederholt bakteriologisch negativen Befunden ausgewählt (z.B. Schukken et al. 1999). Meist wurde jedoch ein deutlich geringerer Aufwand betrieben. Die Modelle wurden zur Bearbeitung unterschiedlichster Fragestellungen eingesetzt, wie bspw. Effekte auf die Milchleistung, den klinischen Verlauf der Erkrankung, die Bakterienvermehrung und SCC-Zahlen. Dazu kommt eine ganze Reihe von Messparametern auf der Ebene humoraler oder zellulärer Immunkomponenten in der Milch und im peripheren Blut, wie die Funktionalität und der Immunphänotyp von Blut- und Milchleukozyten als auch Zytokinprofile und Enzymak-tivitäten in Serum und Milch. Mastitismodelle dienten weiterhin zur Evaluierung von Vakzinie-rungs- (Tomita et al. 1998) und Therapiekonzepten (Persson Waller et al. 2003, Kutila et al. 2003) sowie zur Analyse von genetischen Einflüssen auf das Mastitisrisiko (Schukken et al. 1994).

2.5 Erkennung von Erregern und deren Bestandteilen durch Komponenten des angeborenen Immunsystems

Ein erster Kontakt von Wirtszellen mit mikrobiellen Krankheits-Erregern bedarf bereits einer adäquaten Reaktion durch den Wirt. Aufgrund des Fehlens Antigen-spezifischer Rezeptoren auf diesen Zellen (z.B. Makrophagen, Epithelzellen, dendritische Zellen, Keratinozyten), verfügen sie über eine Reihe spezifischer, genetisch determinierter Rezeptoren. Diese Mustererkennungsre-zeptoren (PRR, pattern recognition receptors) erkennen auf mikrobiellen Erregern phylogene-tisch hochkonservierte molekulare Muster (PAMPs, pathogen associated molecular patterns). Die Interaktion zwischen PRRs und PAMPs leiten Reaktionen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems ein.

2.5.1 Erregermuster Lipopolysaccharid (LPS)

LPS (Endotoxin) ist eine hitzestabile strukturelle Komponente der Zellwand Gram-negativer Bakterien und gilt als Schlüsselmolekül bei der Pathogenese der E. coli-Mastitis (Carroll et al. 1964). Es ist aus drei makromolekularen Anteilen aufgebaut: Der extrazelluläre Anteil, das O-Antigen, gegen das häufig Antikörper gebildet werden, besteht aus drei bis zwanzig Hexosemole-külen, die für die Speziesspezifität des LPS verantwortlich sind. Das O-Antigen bedingt die Hyd-rophilie der Oberfläche. Der zweite Anteil ist das Kernpolysaccharid, welches aus zwei Unterein-heiten zusammengesetzt ist und bei vielen Gram-negativen Bakterien identisch ist. Von den bei-

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den Anteilen (innerer und äußerer) ist der äußere (ein spezifischer Zucker: Keto-desoxy-oktonat) für die Funktion der Zellmembran unentbehrlich. Der für die Virulenz entscheidende Anteil des LPS ist das Lipid A. Es dient als Verankerung in der Zellwand. Lipid A ist amphiphil, was durch die hydrophile β-1-6-glykosidische Verknüpfung von N-acetyl-Glucosamin-Molekülen und die hydrophobe 4-hydroxy-Fettsäurekette begründet ist (Hahn et al. 1999). Bei der Mastitis setzt E. coli aufgrund von Vermehrung, Absterben und Lyse, LPS im Euter frei und verursacht so lokale (erhöhte Gefäßpermeabilität, Zellinflux) wie systemische (Fieber, Leu-kopenie, Schock) Veränderungen (Burvenich et al. 2003). Es konnte jedoch anhand von Infekti-onsmodellen gezeigt werden, dass mehr als ein Toxin an der Pathogenese der E. coli-Mastitis be-teiligt ist (Brooker et al. 1981), was auch den, im Vergleich zu einer mittels LPS induzierten Mastitis unterschiedlichen Verlauf, zumindest teilweise erklärt. LPS wird über CD14, LBP und MD-2 an den TLR-4 (siehe 2.5.2) auf Zellen gebunden und sti-muliert über eine intrazelluläre Reaktionskaskade deren Aktivierung. Die Stimulation durch LPS resultiert unter anderem in B-Zellproliferation, vermehrter Produktion von Akut-Phase-Proteinen (Wong et al. 2000) sowie der Sekretion verschiedener Zytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12) in Makrophagen und Monozyten (Cleveland et al. 1996, Hoshino et al. 1999). Insbe-sondere TNF-α scheint eine zentrale Rolle für die Ausprägung systemischer Effekte zu spielen („Mediatorschock“), was oft als Zeichen einer Endotoxämie bewertet wird. Letztere gilt eher als Ausnahme (Burvenich et al. 2003).

CpG-Motive

Als CpG-Motiv bezeichnet man einzelsträngige DNA-Sequenzen, die in 5’-3’-Richtung ein Cyto-sin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotid besitzen. Im Gegensatz zur DNA von Vertebraten findet man nichtmethylierte CpG-Motive im Genom von Bakterien, Viren und Parasiten in hoher Fre-quenz (Krieg 2002). Da am C5-Atom des Cytosins keine Methylgruppe gebunden ist, gelten sie als nichtmethyliert, während im Vertebratengenom die Cytosin Moleküle zumeist methyliert sind (Bird 1987). Weiterhin werden CG-Dinukleotide in Vertebraten soweit unterdrückt, dass sie nur in einem Viertel der erwarteten Häufigkeit vorkommen. Während natürlich gewonnene DNA aus Bakterien, Viren und Parasiten ein Phosphodiester (PD) Rückgrat besitzen (Karlin et al. 1994, Krieg et al. 1995), findet man bei synthetischen CpG-enthaltenden Oligodeoxynukleotiden (ODNs) ein Phosphorothioat (PT) Rückgrat, das den schnellen Abbau durch ubiquitär vorkom-mende Nukleasen hemmt (Zhao et al. 1993) und die Aufnahme verbessert (Sester et al. 2000). Hinsichtlich der immunmodulatorischen Eigenschaften von CpG-Motiven definierter Sequenzen bestehen deutliche Speziesunterschiede (Krieg 1999, Pontarollo et al. 2002). Synthetisierte ODNs erweisen sich als vielversprechend in ihrer Anwendung als Adjuvantien in Vakzinen sowie auch zur Behandlung von allergischen, infektiösen und neoplastischen Erkrankungen (Krieg 2002). In CpG-stimulierten Zellen werden innerhalb von 10-15 Minuten verschiedene Folgeprozesse aktiviert. Zu ihnen gehören die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, die Induktion der iNOS (Sweet et al. 1998, Shoda et al. 2001a), die Aktivierung von NF-κB (Stacey et al. 1996), der AP-1-Transkriptionsfaktoren (Hacker et al. 1998) sowie der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAP-Kinase) (Yi und Krieg 1998). Die Erkennung von CpG-Motiven erfolgt durch den TLR-9 (siehe unten). Anders als bei den meisten bekannten TLR-Liganden werden CpG-Motive durch TLR-9 nicht auf der Zelloberfläche erkannt, sondern auf der Endosomenmembran (Takeshita 2001). Eine Interaktion mit CpG-Motiven erfolgt somit erst nach Endozytose. Obwohl bisher keine direkte Bindung von CpG-Motiven an den TLR-9 gezeigt wurde, konnten mikroskopische Stu-dien eine gemeinsame Lokalisation von CpG-Motiven, TLR-9 und MyD88 (myeloid differentia-tion primary response gene 88) in Endosomen nachweisen (Ahmad-Nejad et al. 2002). Die Auf-nahme und endosomale Reifung von CpG-Motiven ist somit essentiel für eine weitere Signaltransduktion (Takeshita 2001). Neuerdings wird ein weiterer, alternativer Signalweg als der über TLR-9 für CpG-DNA diskutiert (Verthelyi und Zeuner 2003).

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2.5.2 Erregermusterrezeptoren

CD14

Das CD14 ist ein auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten exprimierter, membrange-bundener Rezeptor (Yang et al. 1995), der in der Milch in hohen Konzentrationen auch solubili-siert vorliegt (siehe 2.2.1). Er ist Bestandteil des TLR-4-Komplexes, dem Rezeptor für LPS (siehe unten). CD14 ist über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) in der Zellmembran verankert, besitzt jedoch in Ermangelung eines zytoplasmatischen Anteils keine Fähigkeit zytoplasmatische Signale zu transduzieren (Ulevitch und Tobias 1995). Nach der Bindung des LPS-CD14-Komplexes an TLR-4 wird eine Enzymkaskade in Gang gesetzt, in deren Folge verschiedene Zytokine und O-berflächenmoleküle verstärkt exprimiert werden (Dentener et al. 1993, Schumann et al. 1996). Weiterhin ist CD14 für die Erkennung und Beseitigung apoptotischer und nekrotischer Zellen von Bedeutung (Schlegel et al. 1999). Für den Menschen und die Maus wurde beschrieben, dass sich LPS mit in Serum befindlichem LBP (Lipopolysaccharid Bindungsprotein) kreuzvernetzen muss, um an CD14 binden zu können (Aderem und Ulevitch 2000). LBP ist ein Akut-Phase-Protein der Leber, dessen Konzentration während systemischer Infektionen und der Akut-Phase-Antwort signifikant ansteigt. Es ist für die Monomerisierung von LPS-Vesikeln und den an-schließenden Transport zu den membranständigen CD14-Rezeptoren zuständig (Schumann et al. 1996, Lamping et al. 1998). Im Gegensatz zum murinen und humanen System scheint dies im bovinen System nicht notwendig zu sein (Jungi et al. 1997).

Scavenger-Rezeptoren

Die als Scavenger-Rezeptoren bezeichneten phagozytischen Rezeptoren erkennen bestimmte anionische Polymere und auch acetylierte Lipoproteine geringer Dichte (LDL, low density li-poproteins) und werden von myeloiden Zellen und einigen Endothelzellen exprimiert. Sie bilden eine strukturell heterogene Gruppe in der mindestens sechs verschiedene Molekülformen vor-kommen (Janeway et al. 2002). Neben endogenen Liganden wie bspw. veränderten Wirtszellen, erkennen sie auch mikrobielle Bestandteile und sind in der Lage sie zu internalisieren. So wurde gezeigt, dass der Scavenger-Rezeptor-A (SR-A) an das Lipid A des Lipopolysaccharids binden kann (Hampton et al. 1991). Auch Gram-positive Bakterien (Dunne et al. 1994), Lipoteichonsäu-re (LTA) (Greenberg et al. 1996) und bakterielle CpG-DNA bindet an den SR-A (Zhu et al. 2001). Eine Beteiligung des SR-A an der Antigenpräsentation ist nachgewiesen (Singh et al. 1998, Nicoletti et al. 1999).

Mannose bindendes Lektin (MBL)

Mannose bindendes Lektin (MBL) gehört zu der Protein-Familie der Kollektine. Es besteht aus Oligomeren, die jeweils aus drei Peptidketten, mehreren Lektin-Domänen, kollagenen Strukturen und einer Cystein-reichen N-terminalen Region aufgebaut sind (Sastry et al. 1989, Taylor et al. 1989). Es ist ein Ca2+-abhängiges Lektin, das an 3- und 4-Hydroxylgruppen verschiedener Zu-cker z.B. auf mikrobiellen Oberflächen bindet (Drickamer 1992, Weis et al. 1992). Nicht nur strukturell, sondern auch funktionell ist MBL dem C1q, einem Fragment der Komplementkom-plemente C1, sehr ähnlich. Beide Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Komplementaktivie-rung, der Opsonisierung und Phagozytose sowohl mikrobieller Bestandteile als auch apoptoti-scher Zellen. MBL vermittelt einen dritten Weg der Komplementaktivierung, der parallel zu dem klassischen Weg über C1q und dem alternativen Weg über Properdin/ Faktor-D läuft.

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Toll-like-Rezeptoren (TLRs)

Die ursprünglich bei der Fruchtfliege Drosophila identifizierten TOLL-Rezeptoren (Gay und Keitz 1991) dienen der spezifischen Erkennung von Pathogenen und der Aktivierung des konstitutiven Immunsystems. Aufgrund der hohen Homologie in Struktur und Gensequenz zu diesen TOLL-Rezeptoren konnten bei Mensch und Maus mindestens 11 verschiedene Toll-like-Rezeptoren identifiziert werden (Zhang et al. 2004). Die spezifischen TLR-Liganden gehören alle zur Gruppe der PAMPs, besitzen Strukturen mit höchst konserviertem Aufbau und kommen in einem sehr großen Spektrum von Mikroorganis-men vor (Medzhitov et al. 1997). Zu ihnen gehören z.B. LPS, LTA, Lipoprotein, Flagellin, un-methylierte DNA-Motive (CpG-Motive) aus Nicht-Vertebraten, sowie Mannane und Mannopro-teine aus Hefen. Als Transmembranrezeptoren bestehen TLRs aus einer extrazellulären Leukin-reichen Region, einer transmembranalen Region und einem intrazellulären Bereich, der dem des IL-1-Rezeptors ähnlich ist und den Namen TIR (Toll/Interleukin-1 Rezeptor) trägt (Gay und Keitz 1991). Alle diese Rezeptoren, bis auf TLR-7, -8 und -9 befinden sich an der Oberfläche der Zellen (Armant und Fenton 2002, Crozat und Beutler 2004). TLRs gelten als ein Bindeglied zwischen den Erken-nungsmechanismen von konstitutivem und adaptivem Immunsystem. Nach der Bindung an ihre Liganden führen sie durch ähnliche, intrazellulär ablaufende Mechanismen die Bildung von NF-κB oder JNK (c-JUN N-terminal kinase) herbei. Daraus resultierend kann es zur Freisetzung von Zytokinen und zur Expressionsmodulierung von Oberflächenmolekülen kommen (Medzhitov und Janeway 1997).

TLR-4

Von der gesamten Familie der TLRs ist TLR-4 am besten charakterisiert (Aderem und Ulevitch 2000). Er wird stark auf Zellen des peripheren Blutsystems und Makrophagen exprimiert, kann aber auch auf anderen Zellen vorkommen (Medzhitov et al. 1997). Sein Hauptligand ist das LPS aus der Zellmembran Gram-negativer Bakterien. LPS ist allein über die Bindung an TLR-4 in der Lage, Zellen in geringem Ausmaße anzuregen. Dieser Effekt kann jedoch durch Bindung von LPS an LBP und CD14 verstärkt werden. Für eine starke Aktivierung der Zelle ist zusätzlich noch die Bindung des Proteins MD-2 notwendig (Shimazu et al. 1999, Akashi et al. 2000). Die genaue Bindung an den TLR-4 ist jedoch derzeit noch nicht geklärt. TLR-4 ist auch in der Lage, das respiratorische Synzytialvirus über das Fusionsprotein F zu erkennen (Kurt-Jones et al. 2000). Taxol, HSP60 und Fibronectin EDA (Extra Domain A) sind körpereigene Substanzen, die eben-falls durch TLR-4 erkannt werden. Taxol benötigt ebenso wie LPS einen TLR-4-MD-2-Komplex (Kawasaki et al. 2001). Die Bindung durch HSP60 an den TLR-4 scheint ebenfalls MD-2 abhän-gig zu sein. HSP60 ist jedoch nicht spezifisch für TLR-4, sondern kann auch durch TLR-2 er-kannt werden (Vabulas et al. 2001). Fibronectin EDA entsteht durch alternatives Splicing bei Gewebsverletzungen. Dieses ruft über TLR-4 in monozytoiden Zellen inflammatorische Reakti-onen hervor, was zu der Vermutung geführt hat, dass dieser Mechanismus bei Gewebsschädi-gungen für die inflammatorische Wirkung in vivo zuständig ist (Okamura et al. 2001).

TLR-2, TLR-1 und TLR-6

Ähnlich dem LPS als Ligand für TLR-4, erkennt TLR-2 hauptsächlich Bestandteile Gram-positiver Bakterien (Muzio und Mantovani 2001), wie Lipoproteine, Lipoteichonsäure und Pepti-doglykane (PGN) (Werling und Jungi 2003). So zeigten Versuche mit TLR-2-defizienten Mäusen, dass TLR-2 essentiell für eine Immunantwort auf PGN ist (Takeuchi et al. 1999, Takeuchi et al. 2001). Weitere Liganden sind Zymosan und ausnahmsweise auch LPS von Porphyromonas gingivalis und Leptospira interrogans. Diese Bindung scheint ebenfalls CD14-abhängig zu sein (Hirschfeld et al. 2001). LTA sowohl von Streptococcus pneumoniae als auch Staphylococcus aureus bindet über LBP und CD14 an TLR-2, nicht aber an TLR-4. MD-2 hat keine Auswirkungen auf die Effektivität

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der LTA-Stimulation (Schröder et al. 2003). Auch prokaryotisches GPI (Glycosylphosphatidyli-nositol) als Ankermolekül für die Bindung vieler Proteine an die Membran von Trypanosoma cruzi ist ein spezifischer Ligand für TLR-2 (Campos et al. 2001). Durch strukturelle Unterschiede zwi-schen Säuger-GPI und dem prokaryotischen GPI von Mikroorganismen ist eine differentielle Erkennung durch TLR-2 möglich. TLR-2 vermag nach Bindung seines Liganden nicht alleine eine Zelle zu aktivieren. Um dies zu erreichen, ist es unabdingbar, dass sich ein Heterodimer aus TLR-2 mit TLR-6 oder mit TLR-1 bildet (Underhill und Ozinsky 2002). Durch eine einseitige Blockade von TLR-2 oder TLR-6 konnte die Aktivierung muriner Makrophagen durch Gram-positive Bakterien sowie Zymosan verhindert werden (Ozinsky et al. 2000, Haijar et al. 2001). Für die Aktivierung von Zellen durch triazylierte bakterielle Proteine ist keine Heterodimerbildung notwendig (Ozinsky et al. 2000).

TLR-9

TLR-9 bindet spezifisch DNA-Sequenzen. Sowohl DNA-Motive mit einem zentralen CG-Dinukleotid (CpG-Motive) als auch DNA-Motive mit einem reversen, zentralen Motiv (GpC-Motive) ligieren mit dem TLR-9 und werden endosomal bzw. lysosomal internalisiert (Hacker et al. 1998). Während in der Regel keine Zellaktivierung durch die reversen GpC-Sequenzen bei Mensch und Maus nachgewiesen wurde, konnten Schuberth et al. (2004) dies für das Rind zeigen. CD14, MD-1 und MD-2 haben keine Auswirkung auf die Aktivierung von Zellen durch TLR-9 (Bauer et al. 2001). Es wurde gezeigt, dass unterschiedliche CpG-Motive für Maus und Mensch eine optimale Aktivierung der Zellen hervorrufen (Hartmann et al. 2000, Bauer et al. 2001). Zur Aktivierung ist keine Kreuzvernetzung verschiedener TLRs nötig. Die Signalkaskade des TLR-9 scheint nicht identisch mit dem des IL-1 Rezeptors zu sein, da durch die Blockierung des MyD88 zwar die NF-κB Induktion durch DNA-Sequenzen, nicht aber die Aktivierung durch IL-1 oder TNF inhibiert werden konnte. TLR-9 gehört mit TLR-7 und –8 einer intrazellulär gelegenen Sub-familie an (Crozat und Beutler 2004). Die Erkennung seines Liganden erfolgt endosomal und die Signaltransduktion lässt sich durch Chloroquin hemmen. Dies legt nahe, dass die endosomale Azidifizierung für eine erfolgreiche Ligand-Rezptor-Bindung und Signalgebung notwendig ist (Perry et al. 2005).

TLR-3

Doppelsträngige, virale RNA wurde als ein Ligand für TLR-3 identifiziert (Alexopoulou et al. 2001).

TLR-5

Als Ligand für TLR-5 gilt bisher nur das Flagellin, welches von den meisten Bakterien produziert wird und dessen Bindung über die Aktivierung von NF-κB die Bildung von TNF-α induziert (Hayashi et al. 2001). Der TLR-5 wurde bisher auf myelomonozytoiden Zellen (Muzio et al. 2000) und basolateral auf Darmepithelien nachgewiesen (Gewirtz et al. 2001).

TLR-7, TLR-8

Eine Aktivierung von TLR-7 und TLR-8 durch kleine, anti-virale Bestandteile wie Imidazoquino-line konnte gezeigt werden (Hemmi et al. 2002). Die Aktivierung erfolgt ebenfalls über die MyD88-abhängige Signalkaskade. Wie beim murinen TLR-7 soll der humane TLR-8 virale Ein-zelstrang-RNA als natürlichen Liganden erkennen (Heil et al. 2004). Ihre Lokalisation ist wie bei TLR-9 ebenfalls intrazellulär (Crozat und Beutler 2004).

TLR-10

Ein spezifischer Ligand für TLR-10 konnte bislang nicht identifiziert werden (Hasan et al. 2005).

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TLR-11

Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Profilin von Toxoplasma gondii dendritische Zellen über TLR-11 aktiviert und in vivo die Produktion von IL-12 induziert (Yarovinsky et al. 2005).

Bovine TLRs

Bisher sind wenige Sequenzen für bovine TLRs bekannt (Werling und Jungi 2003). Das Gen zu TLR-4 liegt auf Chromosom 8, das für TLR-2 auf Chromosom 17 (White et al. 2003). Zudem sind die Gensequenzen von TLR-3, TLR-9 und MD-2 bekannt. TLR-2 und TLR-4 scheinen von Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert zu werden (Werling und Jungi 2003). Im Gegensatz zu Makrophagen zeigen dendritische Zellen unterschiedliche Reaktionen auf TLR-2-/-4-Liganden (Werling et al. 2004). Die Studien über TLR-9 beschränken sich haupt-sächlich auf Wirkungsanalysen von CpG-Motiven für Lymphozyten, Monozyten und Makropha-gen. Hier dienten die Zytokinproduktion, die Proliferationsreaktion und die Induktion von iNOS als Kriterien der Aktivierung (Brown et al. 1998, Shoda et al. 2001, Pontarollo et al. 2002). Es ist noch nicht bekannt, ob CpG-Motive über TLR-9 oder einen anderen Weg dendritische Zellen stimulieren, obwohl eine gesteigerte IL-12, TNF-a und NO-Produktion beobachtet wurde (Wer-ling und Jungi 2003). Im Zusammenhang mit der Mastitis des Rindes konnte eine gesteigerte Expression von TLR-2 und TLR-4 im Eutergewebe gezeigt werden (Goldammer et al. 2004).

2.5.3 Funktionelle Konsequenzen einer Toll-like-Rezeptor (TLR) vermittelten Stimulation von Makrophagen

Die Signaltransduktion von den TLR-Rezeptoren hin zur Expression von Effektorgenen beinhal-tet die Aktivierung einer Reihe unterschiedlicher Faktoren: Nach Bindung der spezifischen Li-ganden können zwei unterschiedliche Wege der Aktivierung eingeschlagen werden. Es erfolgt eine Aktivierung entweder von NF-κB oder den zur AP-1-Familie der Transkriptionsfaktoren gehörenden Proteine JUN und FOS. Signale von TLR-3 werden durch den Faktor IRF3 (IFN regulatory factor 3) auf den Zielpromotor übertragen (Akira und Takeda 2004). NF-κB ist ein wesentlicher Transkriptionsfaktor für die Aktivierung immunrelevanter Gene, besonders für die induzierte Synthese von entzündungsvermittelnden Zytokinen, wie TNF-α und IL-1 (Hatada et al. 2000), sowie bakterizider Radikale, wie z.B. NO (Sweet et al. 1998, Shoda et al. 2001a). Ent-scheidend für die erfolgreiche TLR-Signalvermittlung ist das Hinzutreten der Adaptoren MyD88 oder TRIF (TIR-domain-containing adaptor inducing IFN-β). Die Signaltransduktion wird in MyD88-abhängige und MyD88-unabhängige Signalwege unterteilt. TRIF ist entscheidend für die MyD88-unabhängige Syntheseaktivierung der inflammatorischen Zytokine IFN-α und -β, die als Folge viraler Aktivierung des TLR-3 gebildet werden. Eine Inaktivierung der beiden Adaptoren MyD88 und TRIF blockiert die bekannten Wege TLR-vermittelter Signalweiterleitung vollständig (Akira und Takeda 2004). Letztlich kann TLR-vermittelt ein großes Spektrum an Zytokinen, unter anderen IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α als auch die Apoptose induziert werden (Krutzik et al. 2001). Während zumeist über die Spezifität einzelner mikrobieller Bestandteile, ihre Bindung und Effekte an defi-nierte TLRs berichtet wird, liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit jedoch ein Zusammenspiel mehre-rer mikrobieller Bestandteile eines Erregers über verschiedene TLRs an einer Zelle vor, die je nach Ligand in angepasste, leicht unterschiedliche Reaktionen münden können (Underhill und Ozinsky 2002). Eine Heterodimerisierung unterschiedlicher TLRs kann bspw. zur Veränderung der Ligandenspezifität der TLRs führen, was an der Interaktion von TLR-2 mit TLR-6 gezeigt werden konnte (Ozinsky et al. 2000, Takeuchi et al. 2001). Eine zentrale Fragestellung in Studien zur Makrophagenaktivierung durch TLR-Liganden ist die Induktion von Zytokinen. So konnte sie für IL-1β, IL-10, IL-12 und TNF-α nachgewiesen wer-den (Brightbill et al. 1999, Su et al. 2000, Campos et al. 2001, Jones et al. 2001, Werling et al. 2004). Auch die Induktion der iNOS wurde in Makrophagen nach TLR-Stimulation nachgewie-

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sen (Campos et al. 2001, Werling et al. 2004). LPS-stimulierte Makrophagen zeigten über die TLR-4 vermittelte Aktivierung von NF-κB eine Steigerung der induzierbaren Cyclooxygenase-2 (COX-2) (Rhee und Hwang 2000), darüber hinaus scheinen bestimmte TLR-Liganden in der Lage zu sein, die MHC-Klasse-II-Expression und die Antigenprozessierung herabzuregulieren (Noss et al. 2001). TLRs unterliegen einer Expressionsmodulation sowohl durch Pathogene als auch durch Zytoki-ne. So wurde TLR-2 nach Infektion von murinen Makrophagen mit Mycobacterium avium heraufre-guliert, während die Expressionsdichte von TLR-4 sank. Die Induktion einer gesteigerten TLR-2-Expression auf Makrophagen gelang auch nach Inkubation der Zellen mit verschiedenen Zytoki-nen wie TNF-α, IL-1α, GM-CSF, jedoch nicht IFN-γ (Wang et al. 2000). Bovine, in vitro gereifte Makrophagen exprimieren TLR-2 und TLR-4 stärker als Monozyten, jedoch nicht TLR-3 und TLR-9 (Werling et al. 2004). Rekombinantes bovines IFN-γ besitzt hier ebenfalls keinen Einfluss auf die Expressionsdichte. Während eine Stimulation mit LPS und abgetöteten Gram-negativen Bakterien keine Steigerung der IL-12-Produktion zur Folge hatte, konnte ein starker Anstieg der TNF-a-, IL-10- und NO-Produktion gezeigt werden (Werling et al. 2004). Eine Stimulation mit CpG-DNA führte hingegen lediglich zu einer schwachen NO-Produktion. Dies deckt sich mit Daten von Dahnke (2003), wo allenfalls eine schwache NO-Bildung von Makrophagen nach CpG-Stimulation festgestellt wurde. Hier konnte jedoch gezeigt werden, dass in vitro gereifte bovine Makrophagen nach Stimulation mit PAMPs effizient zu einem selektiven Vitalitätsverlust von Neutrophilen führen können. Dieses Phänomen wurde schon in früheren Studien zum Su-perantigen-vermittelten Absterben boviner Neutrophiler festgestellt (Schuberth et al. 2000), wo-bei eine Beteiligung von TNF-α, das Fas-Molekül, NO, PGE2 oder die durch Brefeldin A zu hemmenden Zytokine ausgeschlossen wurde (Krüger 2001). Obgleich der genaue Mechanismus bisher nicht geklärt wurde, scheinen lösliche Faktoren eine entscheidende Rolle zu spielen, da ein direkter Zell-Zell-Kontakt nicht essentiell für das akzelerierte Absterben der Neutrophilen war. Für den pathogenen Organismus kann es einen Vorteil darstellen, über seine Erregermuster Ef-fektorzellen zu eliminieren, ebenso bleibt denkbar, dass dieses Phänomen eine Schutzreaktion des Wirtes gegen zu viele und zu stark aktivierte Neutrophile darstellt (Dahnke 2003).

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3 Geräte, Material und Methoden

3.1 Geräte 10-Well-Transmigrationskammer 400 µl/285 µl (Fa. Cytogen (442000), Ober-Mörlen) Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anla-

ge, „Typ RO 50/14SMB TypI“ (Wasser und Regenerierstation, Bars-

büttel) Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser

System Typ SG-RS90-4 UF“ (Wasser und Regenerierstation, Bars-

büttel) Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden) Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 (Heraeus, Hanau) Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Wartewig (6.001.000), Göttingen) Centricon®– Filtrationssystem (Amicon, Beverly/MA, USA) CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Kohlensäurewerke Hannover, Han-

nover) Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel pressure

vessel“ (Alloy Products

(XX670053)Wisconsin, USA) Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen) Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan®,

mit angeschlossener Computereinheit (Becton Dickinson, Heidelberg)

Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und Pha-senkontrasteinrichtung

(Zeiss (476250-9901), Oberkochen)

Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau) Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen) Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hoch-

geschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor (Heraeus Instruments, Osterode)

Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz) Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin) Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen) MACS MultiStand

(Miltenyi Biotec (130-090-753), Ber-gisch Gladbach)

MACS Separation columns (LS) (Miltenyi Biotec (130-042-401), Ber-gisch Gladbach)

Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen) MidiMACS (Miltenyi Biotec (130-042-302), Ber-

gisch Gladbach) Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader Dy-

natech MR 5000 (Dynatech, Denkendorf, Kontakt:

Dynex Technologies, USA) Photometer (Eppendorf, Hamburg) Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer (170710), Tuttlingen) Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µl) (Brand (09U2539), Wertheim) Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µl, 10-100 µl,

20-200 µl, 100-1000 µl) (Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)

Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Brand (26404), Wertheim) Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel) Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) (Heraeus-Christ. Osterode) Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus-Christ, Hanau) Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ (ASID, Unterschleißheim) Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ (ASID, Unterschleißheim) Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ (Dynatec, Zug/Schweiz)

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Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Ru-mo100“

(Heidolph (52100), Schwabach)

Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor (Wifug (10209), Bradford/England) Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ (Hermle, Gosheim) Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ (GFL, Hannover) Zählkammer nach Bürker (Brand, Wertheim) Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (Heraeus instruments, Osterode)

3.2 Material

3.2.1 Klinikbedarf Bovivet CMT-Test (Heiland (730-910), Hamburg) Einmalspritzen Luer steril, 10 ml (AMEFA (302020), Limburg) Einmalspritzen Luer steril, 5 ml (AMEFA (302010), Limburg) Einmalspritzen Luer steril, 50 ml „Plastipak®“ (Becton Dickinson (300865), Droghe-

da/Irland) Einmal-Untersuchungshandschuhe „Gentle Skin® sen-sitive“

(Meditrade® (1221R), Kiefersfelden)

Estrumate® (Wirkstoff: Cloprostenol-Natriumsalz) (Fa. Essex Tierarznei, München) Kanülen 1,80 x 40 mm, steril „TSK STERIJECT“ (TSK-Supra, Tochigi/Japan) Oxytosel (Oxytocin) (Selectavet, (89396) Weyarn-Holzolling) PAXgene® blood DNA tube (Qiagen (769989), Hilden) Staukette nach Witte (Eickemeyer (442015), Tuttlingen) Testschale (Heiland (730-911), Hamburg) Vacutainer Brand Luer Adapters (Becton Dickinson (367300), Heidel-

berg) Vacutainerröhrchen, 10 ml, EDTA-K2 (18 mg) (Becton Dickinson (367525), Heidel-

berg) Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU)

(Becton Dickinson (368480), Heidel-berg)

Vacutainerröhrchen, 10 ml, ohne Zusatz (Becton Dickinson (368430), Heidel-berg)

Zitzenkanülen, steril (Heiland (760-208), Hamburg)

3.2.2 Laborbedarf Combitips, 1,25 ml (Eppendorf (0030069.420), Hamburg) Combitips, 2,5 ml (Eppendorf (0030069.447), Hamburg) Drigalski-Glasspatel (Labo-Tech (1.141.010), Biel-Benken) Einmal-Filter, 0,2 µm (Renner (26146040), Hanau) Einmal-Küvetten 2,5 ml makro PMMA (Brand, Wertheim) Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld (Merck (612F1767), Darmstadt) Eppendorf-Reaktionsgefäß, 0,5 ml (Sarstedt (72699), Nürnbrecht) Eppendorf-Reaktionsgefäß, 1,5 ml (Greiner (616201), Frickenhausen) Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen

(Biochrom (P92960), Berlin)

Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml (VWR international (215L1516), Han-nover)

Mikrobank-System “Cryobank™” (Mast Diagnostika (291609), Reinfeld) Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas (Brand (747720), Wertheim) Pipettenspitzen, gelb und blau (Sarstedt (70/762002) (70/760002),

35

Frickenhausen) Polycarbonat-Membran 25 x 80 mm, 3 µm Porengröße, PVP Membranen

(Fa. Cytogen (155812), Ober-Mörlen)

RNeasy® Mini Kit (Qiagen (74106), Hilden) Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml (Becton Dickinson (352008), Heidel-

berg) Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Greiner (Corning (430791), New York/ USA) Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen

(Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz)

Saugpipetten, 10 ml (Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht) Tesafilm-Klebeband (Einzelhandel) Tiegelzange, 400 mm (Fisher Scientific (9310240), Schwerte) Transwell Membraneinsätze (permeabel), 3 µm Porengröße

Fa. Costar GmbH (3402), Bodenheim

Zellkulturflaschen, 200 ml (Nunc (156499), Wiesbaden) Zellkulturflaschen, 75 ml (Nunc (136196), Wiesbaden) Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen (Falcons, steril)

(Corning (430829), Wiesbaden)

3.2.3 Reagenzien Accutase (PAA (L11-007), Linz/Österreich) Acridin-Orange (Sigma (A6014), Steinheim) Antipain (Sigma (A6191), Steinheim) Aprotinin (Sigma (A4529), Steinheim) CD14 MicroBeads, human (Miltenyi Biotec (130-050-201), Ber-

gisch Gladbach) Columbia Schafsblut-Agar (Oxoid (PB5008A), Wesel) D(+)-Glucose (wasserfrei) (Fluka (49140), Buchs/Schweiz) Ethanol 641, absolut, vergällt (CG Chemikalien, Laatzen) Ethanol, absolut (Baker (8228), Deventer/Holland) Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim) Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA) (Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim) Fetales Kälberserum (FCS), Virus und Mykoplasmen getestet

(Biochrom (S0 113/431B), Berlin)

Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim) Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran® (Roth (49794.1), Karlsruhe) Hirn-Herz-Bouillon, brain-heart-infusion-broth (BHI) (Sigma (B 7403), Steinheim) Interferon-gamma, bovin, rekombinant (rbIFN-γ) (Serotec (PBP001), Düsseldorf) Interleukin-4 (IL-4) (Biozol (30354-01), Eching) Interleukin-8, human, rekombinant (rhIL-8) Iscové®-Trockenmedium (Biochrom (T04610), Berlin) Isonitrosopropiophenon (ISPF) (Sigma (I3502), Steinheim) Kaliumchlorid (KCl), kristallin (Biochrom (T046-10), Berlin) Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3) (Merck (3852), Darmstadt) Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat (Roth (8174.1), Karlsruhe) L-Arginin (Sigma (A5131), Steinheim) L-Glutamin (Biochrom (K0283), Berlin) Lipopolysacharid von Escherichia coli Serotyp O55:B5 (Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim) Lipopolysacharid von Salmonella typhimurium (Sigma-Aldrich (L-2262), Steinheim) Lymphozytenseparationsmedium (PAA Laboratories (J15-004),

Linz/Österreich)

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Manganchlorid (MnCl2) (Fluka (M3634), Buchs/Schweiz) Natriumazid (NaN3), 10%ig (Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim) Natriumchlorid (NaCl) (Roth (9265.2), Karlsruhe) Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei (Sigma-Adrich (S-5881), Steinheim) Oligodeoxynucleotid (CpG 2007) (MWG Biotech (6ZJF), München) Östradiol-17-beta (1,3,5[10]-Östratrien-3,17beta-diol) (Sigma (E 8875), Steinheim) Penicillin(-G)-Streptomycin (Biochrom (A2213), Berlin) Pepstatin (Sigma (P 5318), Steinheim) PercollTM (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) (Pharmacia (17089101), Freiburg) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, ohne Ca++/Mg++

(Biochrom (L18210), Berlin)

Pre-Separation Filters, 30 µm (Miltenyi Biotec (130-041-407), Ber-gisch Gladbach)

Progesteron (4-Pregene-3,20-dion) (Sigma (P 0130), Steinheim) Propidiumiodid (PI) (Calbiochem (537059), Bad Soden) RNAlater (Sigma (R0901), Steinheim) Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) (Baker (6081), Deventer/Holland) Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert (Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim) Streptomycin (-Sulfat) (Biochrom (A331-27), Berlin) Tri-Natriumcitrat (2 x H2O) (Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim) Tris (Sigma (T5941), Steinheim) Triton X-100 (Sigma (T8532), Steinheim) Trizol LS Reagent (Invitrogen (15596-026), Karlsruhe) Trypton-Soja-Agar, trypticase-soy-agar (TSA) (Sigma (T 4536), Steinheim) Trypton-Soja-Bouillon, trypticase-soy-broth (TSB) (Sigma (T 8907), Steinheim) β-Mercaptoethanol (J. T. Baker (8683), Groß Gerau)

3.2.4 Versuchstiere

3.2.4.1 Versuchstiere im Rahmen des Mastitis-Modells

Alle 14 Tiere, die im Rahmen des experimentellen Mastitis-Modells verwendet wurden, waren klinisch gesund, 26-30 Monate alt, in der 1. Laktation, und hatten 3-5 Monate zuvor gekalbt. Sie entstammten einer Herde des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf. Sechs bis sieben Wochen vor Versuchsbeginn wurden Viertelanfangsgemelkpro-ben der Tiere dreimal in einem Abstand von 7 Tagen auf den Gehalt somatischer Zellen (SCC) als auch auf Vorhandensein bakterieller Mastitiserreger untersucht. Des weiteren wurden nach Aufstallung der Tiere in der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in den 3 Wochen vor Versuchsbeginn täglich zweimal die Milchleistung, die Futteraufnahme und die rektal gemessene Temperatur dokumentiert. Zusätzlich wurde vor jedem Melkvorgang eine semiquantitative Bestimmung der somatischen Zellzahl mittels „California-Mastitis-Test“(CMT, siehe 3.2.3) durchgeführt.

3.2.4.2 Spendertiere zur Blutgewinnung

Für In-vitro-Versuche zu Effekten weiblicher Sexualsteroide auf Leukozyten, standen nicht lak-tierende, ovarektomierte Tiere zur Verfügung. Es handelte sich um zwei Kühe der Rassen „Deut-sche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian und ein Tier der Rasse „Deutsche Rotbunte“. Ihr Alter lag zwischen 1,5 und 2,5 Jahren. Weitere Tiere, deren Blut zur Zellgewinnung insbesondere für methodische Vorversuche und Etablierungsarbeiten diente, stammten entweder aus der Klinik für Rinder oder der Arbeitsgrup-pe Immunologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

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3.2.5 Bakterienstämme Die verwendeten Stämme E. coli 1303 und S. aureus 1027 wurden jeweils aus dem Eutersekret von an klinischer Mastitis erkrankten Kühen in der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hoch-schule Hannover isoliert. Die Stammhaltung der Bakterien in Glycerinstocks und die biochemische Charakterisierung er-folgte freundlicherweise im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Prof. Valentin-Weigand. Der E. coli-Stamm wurde nach der für Enterobacteriaceae zusammengestellten „Bunten Reihe“ (Burkhardt 1992) charakterisiert (siehe Tabelle 2). Die benötigten Testmedien wurden im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule hergestellt.

Tabelle 2: Biochemisches Reaktionsspektrum des verwendeten E. coli-Stamms 1303

- Kligler (H2S-Nachweis) + Methylrot + Indolbildung - Voges-Proskauer-Reaktion - Citrat + Glukose - Urease + Gasbildung - Malonat + Laktose - Phenylalanindecarboxylase - Saccharose + Lysindecarboxylase + Adonit - Ornithindecarboxylase + Rhamnose - Gelatinase + Oxidativer Glukoseabbau - Motilität + Fermentativer Glukoseabbau

+ = positiver Nachweis; - = kein Nachweis

Bei dem S. aureus-Stamm 1027 konnte kulturell-biochemisch die Mannitspaltung, der Clumping Faktor (gebundene Koagulase) sowie die freie Koagulase (Röhrchenkoagulase) nachgewiesen werden. Zu den biochemischen Eigenschaften wurden zusätzlich Antibiotika-Resistenztestungen mittels Agargel-Diffusion in der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der fachli-chen Anleitung von Frau Dr. Schröder durchgeführt:

38

Tabelle 3: Antibiotika-Resistenzprofil der verwendeten Stämme E. coli 1303 und S. aureus 1027 Antibiotika E. coli S. aureus Amoxicillin/Clavulansäure S S Ampicillin S S Apramycin S - Cefquinom S S Cephalothin R - Cefazolin - S Cefaperazon - S Colistin S - Enrofloxacin S - Erythromycin R I Gentamycin S S Neomycin S - Tetracyclin/Oxytetracyclin R S Trimethoprim/Sulphamethoxazol S - Pirlimycin/Lincomycin - S Penicillin G - S Oxacillin/Cloxacillin - S

S = sensibel; R = resistent; I = Intermediär; - = nicht untersucht

3.2.6 Verwendete Antikörper

3.2.6.1 Monoklonale Antikörper (Primärantikörper)

Tabelle 4: Monoklonale Antikörper zur Charakterisierung zellulärer Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz und zur Herstellung von Referenzzellen für die absolute Zell-zahlbestimmung

Name Spezifität Donor/ Iso-

typ

Finale Verdün-

nung

Referenz

VPM65 bovines CD14 Maus/IgG1 1:10 Berthon und Hopkins 1996

Bo 116 bovine neutrophile

Granulozyten

Maus/IgM 1:1 Rönsch 1992

Bo 139 bovine MHC-Klasse-

II-Moleküle

Maus/IgG3 1:1 von der Osten 1990

Bo 1 bovine MHC-Klasse-

I-Moleküle

Maus/IgG1 1:1 Schuberth et al. 1991

3.2.6.2 Konjugierte Antikörper

Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (siehe 3.3.13.9) diente ein affinitätschromatographisch gereinigter, polyklonaler Antikörper: Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten). Er lag mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugiert (Dianova,

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Hamburg, Nr. 15116146) vor und war gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine absor-biert. Die eingesetzte Verdünnung betrug 1:100 (in MIF-Puffer, siehe 3.2.7.2.7). Zur Herstellung von Referenzzellen (siehe 3.3.9) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt.

3.2.7 Kulturmedien, Puffer und Lösungen Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest. angesetzt. Die Einzelreagenzien sind unter 3.2.3 aufgeführt.

3.2.7.1 Zellkulturmedien und Zusätze

Die Grundmedien wurden als Trockensubstanz bezogen, in Aqua tridest. gelöst und sterilfiltriert (0,2 µm Porenweite). Um Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene My-koplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, siehe 4.2.3) bei 56°C für eine Stunde inkubiert. Da für die Untersuchungen zum Einfluss weiblicher Sexualsteroide auf bovine Leukozyten definierte steroidhormonelle Milieus erforderlich waren, wurde zur Vermei-dung störender Einflüsse das FCS einem Kohleextraktionsverfahren unterzogen (Meyer 2003). Dazu wurde es über einen Zeitraum von 24 h mit 20 g/l Aktivkohle versetzt und bei Raumtem-peratur auf einem Rüttler inkubiert. Anschliessend wurde das Gemisch mindestens viermal ab-zentrifugiert (3000 x g, 30 Min., Raumtemperatur, ohne Bremse) bis alle Aktivkohle-Anteile rest-los entfernt waren. Zum Abschluß wurde das FCS erneut sterilfiltriert (0,2 µm) und gemeinsam mit Kulturmedien in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Aufgetaute Medien wurden nicht länger als zehn Tage im Kühlschrank aufbewahrt.

3.2.7.1.1 I10F Medium (siehe 3.2.3):

- Für die Untersuchungen zu Arginase und iNOS (siehe 3.3.15)

Iscove-Trockenmedium nach Herstellerangaben mit:

Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v)

L-Glutamin 4 mmol

Streptomycin 10 mg

Aqua tridest. ad 1000 ml

- Für die Versuche zum Einfluss von weiblichen Sexualsteroiden auf Makrophagen und MNC

(siehe 3.3.14):

Iscove-Trockenmedium nach Herstellerangaben mit:

Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert, steroidextrahiert) 10% (v/v)

L-Glutamin 4 mmol

Streptomycin 10 mg

Aqua tridest. ad 1000 ml

3.2.7.1.2 Progesteron-Stammlösung

Aus der Festsubstanz wurde mit Ethanol (absolut) unter Schütteln eine 0,05 mol/l Lösung herge-stellt. Nach vollkommener Lösung erfolgte ein weiterer Verdünnungsschritt mit PBS (1:1000). Die angestrebte Konzentration der Stammlösung von 100 nmol/l wurde durch einen weiteren Verdünnungsschritt mit I10F (1:500) erreicht. Die finale Konzentration in den funktionellen Tests betrug 25 nM. Aliquote Teile wurden bei –20°C gelagert.

3.2.7.1.3 Östradiol-17-beta-Stammlösung

Aus der Festsubstanz wurde mit Ethanol (absolut) unter Schütteln eine 0,02 mol/l Lösung herge-stellt. Nach vollkommener Lösung erfolgte ein Verdünnungsschritt mit PBS (1:1000). Die ange-

40

strebte Konzentration der Stammlösung von 40 nmol/l wurde durch einen weiteren Verdün-nungsschritt mit I10F (1:500) erreicht. Die finale Konzentration in den funktionellen Tests be-trug 10 nmol/l. Aliquote Teile wurden bei –20°C gelagert.

3.2.7.1.4 Progesteron- und östrogenfreie Kontrolllösung

Um einer möglichen Verfälschung der Ergebnisse durch das Ethanol als Lösungsvermittler (siehe 3.2.7.1.2 und 3.2.7.1.3) vorzubeugen, wurde Ethanol (96%) im Verhältnis 1:1000 mit PBS ver-dünnt. Ein weiterer Verdünnungsschritt (1:500) folgte mit Medium (I10F). Dieses Medium wurde im Weiteren als „hormonfrei“ verwendet. Aliquote Teile wurden bei –20°C gelagert.

3.2.7.1.5 LPS-Stammlösung

Stocklösungen von LPS wurden in I10F+Strep auf die siebenfache Finalverdünnung (7 µg/ml) ein-gestellt. Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 100-500 µl bei -20°C gelagert.

3.2.7.1.6 Stammlösung der DNA-Motive

Das DNA-Motiv CpG 2007 (5‘-tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3‘) (Hartmann et al. 2000) wurde zur Stimu-lation von PMN, Gesamtleukozyten und Kokulturen aus PMN/MNC sowie PMN/MdM einge-setzt. Die Herstellung des DNA–Motivs wurde bei MWG Biotech, München in Auftrag gegeben. Die Festsubstanz wurde in Aqua tridest. gelöst, sterilfiltriert (0,2 µm Porenweite) und mit Kultur-medium auf die achtfache der Endkonzentration verdünnt. Die finale Konzentration des in den funktionellen Tests eingesetzten CpG-Motivs betrug 2,5 µg/ml. Die Stammlösung wurden in aliquoten Teilen bei -20°C vorrätig gehalten.

3.2.7.2 Material für die Separation von Zellen

3.2.7.2.1 Lymphozytenseparationsmedium

Lymphozytenseparationsmedium (siehe 3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdi-atrizoat und eines hochmolekularen Zuckers mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Iso-paque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet.

3.2.7.2.2 Percoll

Bei Percoll (siehe 3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/ml bei 20°C. Durch Zugabe von 0,9 g NaCl pro Liter Percoll wurde die Isotonie erreicht (100%iges, isotones Per-coll). Für die Separation reiner PMN (siehe 3.3.5.1) wurde die 100%ige Stammlösung mit phy-siologischer NaCl-Lösung (0,9%ig) zu einer 70%gen Lösung verdünnt.

3.2.7.2.3 Rekombinantes humanes Interleukin-8

Interleukin-8 übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozy-ten aus. Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren, siehe 3.2.3), das in PBS mit 0,1% BSA auf 1 µg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötig-te Endkonzentration (0,1 µg/ml) mit PBS eingestellt.

3.2.7.2.4 Natriumchloridlösung, 0,9%

NaCl 8,77 g

Aqua tridest. ad 1000 ml

41

3.2.7.2.5 Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA

Die PBS-Trockensubstanz (siehe 3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Bestandteile lagen in den folgenden Konzentrationen vor.

NaCl 8,0 g

KCl 1,24 g

Na2HPO4 0,2 g

KH2PO4 0,2 g

Aqua tridest. ad 1000 ml

Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.2.6 Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)

Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt (siehe auch 3.2.7.2.5) und mit Aqua tridest. auf 1000 ml ergänzt.

3.2.7.2.7 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer)

bovines Serumalbumin 5,0 g

Natriumazid 0,1 g

PBS ad 1000 ml

Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.3 Reagenzien für die Messung der Arginase-Aktivität

3.2.7.3.1 Triton-Lysepuffer (0,1%)

Triton X-100 100 µl

Pepstatin 10 mg

Aprotinin 10 mg

Antipain 10 mg

Aqua tridest. ad 100 ml

Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.

3.2.7.3.2 Tris/HCl-Puffer (50 mmol/l)

Tris 3,03 g

Aqua tridest. ad 500 ml

Ein pH-Wert von 7,5 wurde mit 5 mol/l HCl eingestellt. Die Lagerung erfolgte bei Raumtempe-ratur.

3.2.7.3.3 Manganchlorid-Lösung (10 mmol/l)

MnCl2 0,19 g

Aqua tridest. ad 100 ml

Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.

3.2.7.3.4 L-Arginin-Lösung (0,5 mol/l)

L-Arginin 10,53 g

Aqua tridest. ad 100 ml

Ein pH-Wert von 9,7 wurde mit 5 mol/l NaOH eingestellt. Aliquots wurden bei –20°C gelagert.

42

3.2.7.3.5 Säuregemisch

Aqua tridest. 320 ml

H3PO4 (85%) 135 ml

H2SO4 (97%) 45 ml

Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.3.6 Isonitrosopropiophenon (ISPF)-Lösung (6%)

ISPF 3 g

Ethanol (absolut) ad 50 ml

Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.3.7 Harnstoff-Stammlösung (600 µg/ml)

Harnstoff 60 mg

Aqua tridest. ad 100 ml

Aliquots wurden bei –20°C gelagert.

3.2.7.4 Reagenzien für die Messung der Nitrat- und Nitrit-Produktion

3.2.7.4.1 Griess-Reagenz

SULF

Sulfanilamid 2 g

HCl (5%) ad 100 ml

NEDD

N-(1-Naphthyl-)Ethylen-

diamin-Dihydrochlorid 0,1 g

Aqua tridest. ad 100 ml

Die Reagenzien wurden im Dunkeln bei 4°C und nicht länger als eine Woche gelagert.

3.2.7.4.2 Gesättigte VCl3-Lösung

VCl3 400 mg

HCl (1 mol/l) ad 50 ml

Nach Filtration nicht gelöster Bestandteile wurde die blaue Lösung bei 4°C unter Lichtabschluss gelagert (bis zu 2 Wochen). Bei Entfärbung wurde sie verworfen.

3.2.7.4.3 Nitrat-Stammlösung (200 µmol/l)

Nitrat 1,7 mg

Aqua tridest. ad 100 ml

3.2.7.4.4 Nitrit-Stammlösung (200 µmol/l)

Nitrit 1,38 mg

Aqua tridest. ad 100 ml

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3.2.7.5 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen

3.2.7.5.1 Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen

Paraformaldehyd 40 mg

PBS ad 1000 ml

Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.5.2 Acridin-Orange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung

Acridin-Orange 250 mg

Ethidiumbromid 250 mg

PBS ad 100 ml

Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.6 Lösung für die Fixierung boviner Suspensionszellen

Formol (ca. 35%) 100 ml

NaH2PO4 4 g

NA2HPO4 6,5 g

Aqua tridest. ad 1000 ml

3.2.7.7 Lösungen zur Gewinnung von RNA aus bovinen Leukozyten

3.2.7.7.1 Guanidinium-iso-thiocyanat-Lösung

Guanidinium-iso-

thiocyanat 4 mmol/l

Na-N-Laurylsarkosin 0,5 % (w/v)

Na-Citrat 25 nmol/l

β-Mercaptoethanol 0,1 nmol/l

3.2.7.8 Puffer für die Gewinnung von Monozyten mittels MACS

3.2.7.8.1 Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit EDTA (2 mmol/l)

EDTA 292 mg

PBS ad 500 ml

Die Lagerung erfolgte bei 4°C.

3.2.7.9 Lösungen für die Durchflusszytometrie

Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit sterilfiltriertem Aqua tridest. (0,2 µm) und 1%iger Natriumhypochlorit-Lösung gespült.

3.2.7.9.1 Trägerflüssigkeit (Sheath fluid)

Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet.

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3.2.7.9.2 Propidiumiodid-Stammlösung

Die Stammlösung von 100 µg/ml Propidiumiodid gelöst in Trägerflüssigkeit wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechen-de Teile der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 µg/ml zu erreichen.

3.2.7.9.3 Acridin-Orange-Stammlösung

Eine Stammlösung von 0,5 µg/ml Acridin-Orange, gelöst in Trägerflüssigkeit (siehe 3.2.7.9.1), wurde in aliquoten Teilen bei 4°C gelagert. Vor jedem Einsatz wurde sie auf das Vorhandensein von ausgefällten Anteilen überprüft und nötigenfalls verworfen. Entspechende Teile der Stamm-lösung wurden Milchzellsuspensionen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2,5 pg/ml zu erreichen.

3.3 Methoden

3.3.1 Gewinnung von venösem Blut Das Blut wurde durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung der Vene mit einer Staukette nach Witte (siehe 3.2.1) gewonnen. Zur Blutentnahme wurde das Vacutainer-system mit heparinisierten (Natrium-Heparinat) Vacutainern (siehe 3.2.1) für die Gewinnung von MNC und EDTA beschichteten Vacutainern für die Gewinnung von PMN verwendet. Zur Ge-winnung von Serum wurden Vacutainer ohne Zusatz verwendet. Zur Gewinnung von RNA aus Vollblut wurde das PAXgene®-Vacutainersystem verwendet: Die weitere Aufarbeitung und RNA-Messungen erfolgten im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf unter der Leitung von Prof. Dr. H. M. Seyfert.

3.3.2 Gewinnung von Serum aus peripherem Blut Das Blut wurde bei Raumtemperatur stehengelassen bis eine deutliche Koagulation sichtbar war. Die Verbindung zwischen der Röhrchenwand und dem Koagulat wurde mit Hilfe einer Pasteur-pipette gelöst. Dann wurden die Röhrchen 15 Min. mit 2000 x g bei Raumtemperatur zentrifu-giert. Um noch verbliebene korpuskuläre Bestandteile zu entfernen, wurde der Überstand ge-wonnen und bei 3500 x g für 10 Min. zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein Röhrchen überführt und vorübergehend bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

3.3.3 Gewinnung boviner Leukozyten Zehn ml gerinnungsgehemmtes (EDTA) Vollblut wurde in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen über-führt. Alle anschließenden Schritte wurden auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Die Erythrozyten des Vollblutes wurden hypoton lysiert, indem 20 ml Aqua tridest. in das Zentrifugenröhrchen ge-geben wurden. Nach 20 sekündigem Schwenken wurden 20 ml doppelt konzentriertes PBS (2 x PBS, siehe 3.2.7.2.6) hinzugefügt und das Zentrifugenröhrchen erneut geschwenkt. Nach der Zentrifugation bei 220 x g für 8 Min. wurde der Überstand abgegossen, das Pellet resuspendiert und der Lyseschritt wiederholt (Lysezeit 10 Sek.). Nach erneuter Zentrifugation (siehe oben) schloss sich ein Waschschritt an. Hierzu wurde das Pellet in 20 ml PBS resuspendiert und dann bei 220 x g für 8 Min. zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes wurde der Waschschritt wiederholt. Schließlich wurde das Pellet erneut in PBS resuspendiert und auf die gewünschte Zellkonzentration mit Medium eingestellt.

3.3.4 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen Das frisch gewonnene heparinisierte Blut wurde im Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt und in 50 ml Röhrchen auf Lymphozytenseparationsmedium® (siehe 3.2.7.2.1) überschichtet. Die anschlie-ßende Zentrifugation (30 Min., bei 4°C) wurde bei 1100 x g ohne Bremse durchgeführt. Bei der hier angewendeten Dichteseparation trennen sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer

45

spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht wurde durch das Plasma gebildet. Zwischen dem Plasma und dem Lymphozytenseparationsmedium befand sich die so genannte Interphase mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide Zellen, Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozy-tenfraktion. Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® lagen die gepackten Erythrozyten und die polymorphkernigen Granulozyten. Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegtem PBS (10 ml) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 30 ml schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 Min., 4°C; 500 x g, 250 x g und 80 x g), um die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen. Zwischen den einzelnen Zentrifugationen wurden die Zellen durch Aufschütteln aus dem Pellet gelöst und in 40 ml PBS resuspendiert. Mit dieser Methode konnten zwischen 1,5 und 3 x 106 MNC/ml Vollblut gewon-nen werden.

3.3.5 Gewinnung neutrophiler Granulozyten

3.3.5.1 Dichtegradientenzentrifugation

Die Blutgewinnung wurde unter Zuhilfenahme von EDTA beschichteten Vacutainern (siehe 3.2.1) durchgeführt. Zehn bis 15 ml des Vollblutes wurden in 50 ml Zentrifugenröhrchen über-führt. Durch zweimalige hypotone Lyse konnten die Erythrozyten entfernt werden: Im Vollblut erfolgte nach Zugabe von 15 ml Aqua tridest. eine Inkubation für 20 Sek. (erste Lyse) und 10 Sek. (zweite Lyse) unter ständigem Schwenken. Um die Lyse zu stoppen, schloss sich die Zugabe der gleichen Menge an zweifach konzentriertem PBS (siehe 3.2.7.2.6) an. Nach beiden Lyseschritten erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C für 8 Min. bei 220 x g mit Bremse. Die Überstände wurden dekantiert, die Zellpellets durch Rütteln der Röhrchen gelöst und in 10 ml PBS resuspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension über 4 ml 70 %iges isotones Percoll (siehe 3.2.7.2.2) in 15 ml Zentrifugenröhrchen geschichtet. Die Zentrifugation erfolgte bei Raumtemperatur für 20 Min. bei 750 x g. Nach der Zentrifugation befanden sich die neutrophilen Granulozyten als Pellet am Boden des Gefäßes, restliche MNC und eosinophile Granulozyten befanden sich in der In-terphase. Der Überstand, die Interphase und das Separationsmedium wurden mit einer Pipette abgesaugt. Es schlossen sich zwei Waschschritte (je 10 ml PBS, 4°C, 8 Min., 220 x g) an. Das letzte Zellpellet wurde in Kulturmedium (I10Fstrep) aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Durch dieses Verfahren konnten Populationen neutrophiler Granulozyten mit 80 bis 98 %iger Reinheit separiert werden. Der Anteil an eosinophilen Granulozyten lag bei <5 %. Lag der Anteil kontaminierender MNC an den kernhaltigen Zellen bei >10 % wurde die Zellsuspension nicht verwendet.

3.3.5.2 Isolierung neutrophiler Granulozyten mittels Transmigrationskammer

Aufgrund der unregelmäßig auftretenden Kontamination der PMN-Suspensionen mit MNC in dem unter 3.3.5.1 beschriebenen Verfahren, wurden bei bestimmten Experimenten neutrophile Granulozyten mittels einer Transmigrationskammer aus dem Blut separiert. Die 10-Well-Transmigrationskammer (siehe 3.1) besteht aus einer Acrylbodenplatte (50 x 101 x 11 mm), einer Acryldeckplatte (50 x 101 x 6 mm), einer Silikondichtungsmatte und 6 Schrau-benmuttern. In die Bodenplatte sind 10 Rundboden-Vertiefungen mit einem Volumen von 415 µl eingelassenen. Sie korrespondieren mit den durchgehenden Bohrungen der Deckplatte. Beim Zusammenbau werden die Kompartimente der Boden- und der Deckplatte durch eine zwischen-gelegte Polycarbonatmembran (siehe 3.2.2) getrennt, die somit den Boden für die Vertiefungen der Deckplatte bildet. Die entsprechend den Bohrungen der Acrylplatten mit Löchern ausgestat-tete Silikonmatte wird zwischen beide Platten platziert und dient der Abdichtung. In der Boden-platte sind sechs Gewindestangen verankert, die beim Zusammenlegen durch entsprechende Ein-sparungen der Silikonmatte und der Deckplatte führen. Mit Hilfe der Schraubenmuttern werden die beiden Acrylplatten mäßig fest aneinander gepresst. Die Polycarbonatmembran (siehe 3.2.2) ist 25 x 80 mm groß und etwa 10 µm dick. Bei einer Porengröße von 3 µm befinden sich 2 x 106

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Poren auf einem Quadratzentimeter der Membran. Die Membran weist eine glänzende weniger adhärente und eine matte stärker adhärente Seite auf. Zum Reinigen der Acrylplatten der Transmigrationskammer wurde eine 1 mol/l Natriumhydro-xyd-Lösung verwendet. Hierfür wurden 22 g Natriumhydroxyd-Pellets (siehe 3.2.3) in 550 ml Aqua tridest. gelöst. Diese Lösung wurde bei 4°C aufbewahrt und bis zum Auftreten einer leichten Trübung mehrfach verwendet. Ansonsten kam nur Aqua tridest. zum Spülen und Waschen der Kammerteile zum Einsatz. Direkt vor der Durchführung wurden die Acrylanteile der Kammer in 1 mol/l Natriumhydroxyd-Lösung und die Silikondichtung in Aqua tridest. gelegt (60°C, 30 Min.). Um einer Schädigung der Silikondichtung vorzubeugen, muss der Kontakt mit Natriumhydro-xyd-Lösung unbedingt vermieden werden. Danach wurden die Kammeranteile dreimal mit steri-lem Aqua tridest. gespült und dann etwa 30 Min. bei 37°C an einem sterilen Arbeitsplatz getrock-net. In die „blinden“ Vertiefungen des unteren Kammerteils wurden 315 µl Medium mit einem Zu-satz von 0,1 µg/ml rhIL-8 (siehe 3.2.7.2.3) gegeben. Diese Flüssigkeit wurde mit 100 µl 100 %i-gem isotonen Percoll® unterschichtet. Dadurch soll die Adhärenz der gewanderten Zellen am Boden der Vertiefungen vermindert werden. Die zehn Vertiefungen des unteren Kammerteils wurden nun mit einer Polycarbonatmembran bedeckt. Dabei ist es bedeutsam, dass sich unter der Membran keine Luftblasen ansammeln. Erreicht wurde das durch ein exaktes Einhalten des Flüs-sigkeitsvolumens von 415 µl in der unteren Vertiefung. Auf die Membran wurde die Silikondich-tung und darüber der obere Kammerteil platziert und mittels Schraubenmuttern fixiert. In die Vertiefungen des oberen Kammerteils wurden abschließend jeweils 200 µl der Zellsuspension gegeben (2 x 107 Leukozyten/ml I10Fstrep). Die Inkubation der Transmigrationskammern erfolgte in einer Feuchtkammer über einen Zeit-raum von 2 Stunden bei 37°C und 5% CO2 in Luft. Nach der Inkubation wurden die Zellsuspensionen der oberen Vertiefungen (= nicht gewanderte Zellen) sorgfältig abpipettiert. Dabei war auf Unversehrtheit der Polycarbonatmembran zu ach-ten. Es wurden je Ansatz 100 µl Zellsuspension entnommen und in vorgekühlte, mit 100 µl Trä-gerflüssigkeit (siehe 4.2.7.9.1) befüllte Durchflusszytometer (FCM, flow cytometry) -Röhrchen überführt. Nach Entfernung der Schraubenmuttern wurde der obere Teil der Kammer waage-recht abgehoben, wobei sich Silikonmatte und Membran gleichzeitig mit ablösten. Nach guter Durchmischung der Zellsuspension der „blinden“ Vertiefung wurde sie in einem 15 ml Zentrifu-genröhrchen zusammengeführt, mit PBS aufgefüllt und bei 250 x g, 4°C, 10 Min. ohne Bremse abzentrifugiert. Zur Entfernung von restlichen Percoll®-Bestandteilen wurde nach Verwerfen des Überstandes das Zellpellet resuspendiert und erneut mit PBS gewaschen (250 x g, 4°C, 10 Min. ohne Bremse). Die Reinheit der Zellpopulation wurde durchflusszytometrisch geprüft. Nach der Durchführung wurden die Kammerteile gründlich mit Wasser gespült und in Aqua tridest. gelegt (30 Min., Raumtemperatur). Danach wurden sie mit einem Tuch abgetrocknet und trocken gelagert.

3.3.6 Gewinnung von Monozyten aus dem peripheren Blut Ausgangspunkt für die Anreicherung von Monozyten waren Dichtegradient-separierte mono-nukleäre Zellen des Blutes (siehe 3.3.2). Dem nach diesem Arbeitsschritt eingesetzten PBS wurde EDTA zugesetzt (2 mmol/l, PBS-EDTA). Das gewonnene Zellpellet wurde in 5 ml PBS-EDTA resuspendiert und über einen 30 µm Ny-lon-Filter (siehe 3.1) filtriert, um Aggregate zu entfernen. Der Filter wurde zweimal mit je 5 ml PBS-EDTA gespült und die Zellsuspension zentrifugiert (70 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 200 µl PBS resuspendiert und die An-zahl vitaler Zellen bestimmt (siehe 3.3.10.1). Zur Zellsuspension wurden 20 µl CD14 Micro-Beads® (siehe 3.2.3) gegeben (pro 107 Zellen) und der Ansatz für 15 Minuten bei 6°C inkubiert. Danach wurde mit 15 ml PBS aufgefüllt und zentrifugiert (250 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in 3 ml PBS-EDTA resuspendiert.

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Die Separationssäule des MACS-Systems (siehe 3.1) wurde vor Beschicken mit markierten Zellen mit 3 ml PBS-EDTA gewaschen. Danach wurde die Zellsuspension langsam über die Säule gege-ben. Der Durchlauf mit depletierten Zellen wurde aufgefangen. Anschließend wurde die Säule dreimal mit 3 ml PBS-EDTA gewaschen. Nach dem Herausnehmen der Säule aus dem Ständer wurden die positiv selektierten Zellen mit dreimal 5 ml PBS durch Einsetzen des Kolbens aus der Säule gewaschen und separat aufgefangen. Selektierte wie depletierte Zellsuspensionen wurden mit PBS-EDTA auf 15 ml aufgefüllt und durchflusszytometrisch auf Reinheit analysiert (siehe Abbildung 2).

Vorwärtsstreulicht

Sei

twär

tsst

reul

icht

0

0

1023

1023

0

0

1023

1023

0

0

1023

1023

A B C

lymphoide Zellen

Monozyten

Abbildung 2: Durchflusszytometrische Analyse boviner MNC und MACS-separierter bo-viner Monozyten

Vorwärts- gegen Seitwärtsstreulicht-Dotplots mononukleärer Zellen: A) MNC nach Dichtegradientense-paration , B) depletierte Zellen und C) Zellen nach Positiv-Anreicherung mit anti-CD14-beschichteten paramagnetischen beads (Reinheit: >99% Monozyten).

3.3.7 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten durch In-vitro-Reifung Makrophagen, die aus Blutmonozyten in vitro generiert wurden (bMdM, blood monocyte derived macrophages), werden im Weiteren als „MdM“ bezeichnet . Für die MdM-Generierung in Zellkulturflaschen wurde pro Tier 150 ml heparinisiertes Blut ge-wonnen (siehe 3.3.1). Die Bearbeitung der Zellen geschah unter sterilen Bedingungen unter einer Reinluftarbeitsbank mit autoklavierten Mehrweg- und sterilen Einwegmaterialien. Das Blut wurde mit PBS verdünnt (1:2) und in 50 ml Röhrchen im Verhältnis 1:3 über Lymphozytenseparati-onsmedium® (siehe 3.2.7.2.1) geschichtet. Nach der Zentrifugation (1100 x g, 30 Min., 4°C ohne Bremse) schloss sich die vorsichtige Entnahme der Interphase mit Überführung in 50 ml Röhr-chen (mit 10 ml vorgelegtem PBS) an. Nach dreimaligem Waschen (siehe 3.3.4) wurden die Zell-pellets in einem Röhrchen zusammengefasst und in I10FStrep aufgenommen, auf 5 x 106 Zellen/ml eingestellt, 30 ml davon in Zellkulturflaschen (200 ml) überführt und für sieben Tage inkubiert bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft). Nach zwei Tagen wurden 20 ml frisches Medium zugegeben und am vierten sowie sechsten Tag das Medium durch vorsichtiges Absaugen und Zugabe fri-schen Mediums ersetzt. Vor der Ernte der Zellen fand eine Kontrolle der Ansätze im Invertmikroskop auf mögliche Kontamination mit Bakterien oder Hefen sowie auf Adhärenz der Makrophagen statt. Der Inhalt kontaminierter Flaschen wurde nicht verwendet. Die Ernte der Zellen erfolgte unter sterilen Kautelen. Das Medium mit nicht adhärenten Zellen wurde abgegossen. Vier Waschschritte mit 25 ml 37°C warmen PBS (Zugabe, schwenken und

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abgießen) schlossen sich zur Entfernung der restliche Bestandteile des Mediums und des Zell-detritus an. Den Flaschen wurde je 1 ml auf 37°C erwärmte Accutase®-Lösung (siehe 3.2.3) zuge-fügt, durch Schwenken (10 Sek.) über die Oberfläche verteilt und wieder abgegossen. Anschlie-ßend wurden 4 ml der Accutase® zugegeben und für 10 Min. bei 37°C inkubiert. Die Ablösung der Zellen vom Boden konnte durch Klopfen mit den Fingern am Boden der Flaschen nach 5 Min. unterstützt werden. Zumeist konnten ca. 80% der adhärenten Zellen (nach mikroskopischer Einschätzung) abgelöst werden. Die Zellsuspension wurde in 50 ml Röhrchen überführt. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Die Zellen wurden zentrifugiert (250 x g, 4°C, 7 Min.), in 2 ml Medium (I10FStrep) resuspendiert und gezählt.

3.3.8 Durchflusszytometrie Bei dieser Methode werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer speziellen Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als sogenanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC), erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflä-chenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstel-lungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert (Omerod 1990, Radbruch 1992). Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (siehe 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren Fluoreszenzlicht-Emissionen in drei verschiedenen Wel-lenlängenbereichen (FL-1=Grünfluoreszenz: 515-545 nm; FL-2=Orangefluoreszenz: 564-606 nm; FL-3=Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jeder Partikel wird folglich durch fünf ver-schiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert und als ein Messereignis fest-gehalten. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (Trotter 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden mehrparametrisch als korrelierte Punkte- oder Dich-tediagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängt, wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung softwaregestützt elektronische „Fenster“ (sog. „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft.

3.3.9 Herstellung von Referenzzellen Zur Färbung wurden jeweils 2 x 107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80 x g für 5 Min. sowie 4°C abzentrifugiert. Nach dem Ab-gießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert und mit demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen Antikörpers Bo1 (siehe 3.2.6.1) für 15 Min. bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 ml MIF-Puffer (siehe 3.2.7.2.7), eine Zentrifugation (7 Min., 80 x g, 4°C) und das Verwerfen des Überstandes. Das resuspendierte Zellpellet wurde nun mit 100 µl des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus Anti-körpers (siehe 3.2.6.2) versetzt und 20 Min. unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 50 ml PBS resuspendiert und erneut abzentrifugiert. Zur Fixierung wurden die Zellen in 30 ml einer 4 %igen Paraformaldehyd-Lösung resuspendiert. Die Zellen inkubierten 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss, worauf sie an-schließend für 15 Min. bei Raumtemperatur abzentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in PBS gewaschen wurden. Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PI-haltigen Trägerflüs-sigkeit aufgenommen (2 µg/ml PI) und auf 4 x 105 Zellen/ml eingestellt. Die Konzentration wur-de vor Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Referenzzellen waren charakterisiert durch ihre Morphologie (mononukleäre Zellen), ihre Rotfluoreszenz und ihre Grünfluoreszenz.

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3.3.10 Vitalitätsbestimmung von Zellen

3.3.10.1 Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung und Quantifizierung nach Acridin-Orange/Ethidiumbromid-Färbung

Zellsuspensionen wurden zu gleichen Teilen mit einer Acridin-Orange/Ethidiumbromid-Lösung (siehe 3.2.7.5.2) versetzt, in einer Bürker-Zählkammer gezählt und deren Vitalität beurteilt. Acri-din-Orange dringt in die Zelle ein und interkaliert mit der doppelsträngigen DNA. Der Kern erscheint unter Zuhilfenahme eines Fluoreszenzmikroskops (siehe 3.1) mit UV-Anregung grün-fluoreszierend. Das rot-fluoreszierende Ethidiumbromid kann nur in Zellen mit geschädigter Membran eindringen, wo es dann ebenfalls mit der DNA interkaliert. Die Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert in toten Zellen die Grünfluoreszenz des Acridin-Orange.

3.3.10.2 Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie

Weist die Zellmembran Schädigungen auf, so kann das Fluorochrom Propidiumiodid (PI) in die Zelle eindringen und mit der DNA interkalieren. Tote Zellen sind nach durchflusszytometrischer Analyse im FL-3-Kanal (Rotfluoreszenz) erfassbar und können dadurch von ungeschädigten Zel-len unterschieden werden. Zellen wurden nach Separation oder Kultivierung in FCM-Röhrchen überführt, in denen Trägerflüssigkeit mit PI (2 mg/ml final) vorgelegt war.

3.3.11 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode)

Das Prinzip besteht darin, eine definierte Anzahl Partikel (Referenzzellen, siehe 3.3.9), die sich bei gleichen Geräteeinstellungen von den zu untersuchenden vitalen Zellen unterscheiden, den Proben zuzugeben. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zahl vitaler Zellen pro Ansatz ermittelt werden. Üblicherweise wurden kultivierte Zellen aus den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vollständig entnommen und in FCM-Röhrchen überführt, in dem 100 µl Trägerflüssigkeit mit PI (2 µg/ml) vorgelegt waren. Dazu wurden 50 µl einer Suspension mit 5 x 104 Referenzzellen pipettiert. An-gestrebt wurde eine Verhältnis von Referenzzellen zu Kulturzellen von ca. 1:1. Waren höhere oder niedrigere Zahlen der Kulturzellen zu erwarten, wurde die Zahl eingesetzter Referenzzellen entsprechend angepasst. Nach durchflusszytometerischer Erfassung errechneten sich die Zahlen vitaler Kulturzellen nach der Formel:

gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl Referenzellen

gemessene Ereignisse ReferenzzellenAnzahl Kulturzellen =

3.3.12 Bestimmung der Konzentration verschiedener Steroidhormone Plasma-Östrogen- und Plasma-Progesteronkonzentrationen wurden freundlicherweise durch Frau E. Berger aus dem Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztli-che Hochschule Hannover durchgeführt. Die Bestimmungen erfolgten mit Hilfe von Radioim-munoassays (Hoffmann et al. 1973). Im Test zur Bestimmung von Östrogen wurde Östron zu 100%, Östradiol-17 β zu 68,5%, Östradiol-α zu 22,4% und Östriol zu 10% gebunden. Intra- und Interassay-Varaianz betrugen jeweils 7,2 % bzw. 8,6%. Im Test zur Bestimmung von Progesteron wird dieses zu 100% gebunden. Die Intra-und Interassay-Varianz betrug jeweils 6,6 % bzw. 8 %. Alle anderen geprüften strukturähnlichen Stoffe wurden in den zwei Tests nur in zu vernachlässi-gendem Maße detektiert.

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3.3.13 Methoden in einem Mastitis-Infektionsmodell

3.3.13.1 Tierschutzantrag

Bei den Tierversuchen zur experimentellen Mastitis handelte es sich um ein am 12.06.03 durch die Bezirksregierung Hannover genehmigtes Versuchsvorhaben: Frühe Erreger-Wirts-Interaktionen während der Mastitis, Nr.: 509.6-42502-03/678.

3.3.13.2 Modellbedingungen und Voruntersuchung der Probanden

Die experimentell infizierten Tiere waren zweieinhalb Jahre alte Kühe der Rasse deutsche Schwarzbunte, die vorberichtlich nie an Mastitis erkrankt waren und sich in der Mitte ihrer ersten Laktation (3-5 Monate post partum) befanden. Sie wurden dreimal alle 7 Tage klinisch untersucht und Milchproben zur Analyse entnommen. Innerhalb dieses Zeitraumes mussten alle vier Euter-viertel klinisch gesund und bakteriologisch negativ sein und durften einen SCC-Wert von 100.000/ml nicht überschreiten. Die Laktationsleistung sollte zwischen 15 und 25 l/Tag betra-gen. Zur Vermeidung möglicher zyklusabhängiger Einflüsse wurden die Tiere zyklussynchroni-siert. Hierzu wurden die Probanden mit Hilfe von 2-maliger Injektion des Prostaglandin-F2α (PGF2α)-Analogons Cloprostenol-Natriumsalz (Estrumate

®, siehe 3.2.1) im Abstand von 12 Ta-gen synchronisiert und im brunstnahen Zeitraum infiziert.

3.3.13.3 Präparation der Infektionsdosis

Präparationen der für die Infektionsversuche eingesetzten E. coli- und S. aureus-Stämme wurden aus dem Milchsekret klinisch an Mastitis erkrankter Kühe (Patienten der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) isoliert (siehe 4.2.5) und lagen kryokonserviert vor (Mikrobank-System “Cryobank™”, siehe 3.2.2). Nach dem Ausplattieren auf einem Trypton-Soja-Agar (trypticase-soy-agar, TSA, siehe 3.2.3) folgte eine Inkubation über Nacht bei 37°C. Am nächsten Tag wurden mehrere Kolonien mittels einer Öse in 10 ml Hirn-Herz-Bouillon (brain-heart-infusion-broth, BHI, siehe 3.2.3) überführt, gut durchmischt und 6 Stunden bei 37°C inku-biert. Nach erneutem eingehenden Mischen wurden 100 µl dieser Suspension in 9,99 ml Trypton-Soja-Agar (trypticase-soy-broth, TSB, siehe 3.2.3) überführt, gut durchmischt und über 18 Stun-den bei 37°C inkubiert. Um eine definierte Anzahl Kolonie-bildender Einheiten (KBE) zu erlan-gen, wurde die photometrisch bestimmte optische Dichte einer Bouillon mit der Keimzahlbe-stimmung durch das Spatelverfahren verknüpft. Dazu wurde zunächst eine Verdünnungsreihe in Zehnerschritten mit 0,9 %iger NaCl-Lösung bis zu einer Stufe von 10-8 hergestellt. 100 µl der Verdünnungsstufen 10-4 - 10-8 wurden daraufhin als Triplikate auf Blutagarplatten (siehe 3.2.3) mit einem Drigalski-Glasspatel ausgestrichen. Nach kurzem Antrocknen wurden die Platten bei 37°C über 24 h inkubiert. Platten, die zwischen 3 und 300 Kolonien aufwiesen, wurden ausgezählt und rechnerisch die Anzahl KBE in der Bouillion ermittelt. Diese Zahl wurde nun ins Verhältnis mit der photometrisch bestimmten optischen Dichte (OD) der ersten Verdünnungsstufe (10-1) ge-setzt. Durch wiederholt reproduzierbare Werte nach Ausplattieren konnte eine Eichkurve erstellt werden, die es ermöglichte, durch Ermittlung der optischen Dichte (OD) der ersten Verdün-nungsstufe bei einer Wellenlänge von 600 nm auf die Zahl Koloniebildender Einheiten in der Bouillon zu schliessen. Mit ihrer Hilfe wurde danach mittels Bestimmung der OD in der Bouilli-on die entsprechende Bakterienkonzentration in KBE errechnet. Die angestrebte Infektionsdosis von 250 KBE/ml für E. coli und 5000 KBE/ml für S. aureus wurde mit entsprechenden Teilen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung eingestellt und durch Ausplattieren und Inkubation bei 37°C über Nacht kontrolliert.

3.3.13.4 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel

Nach erfolgter Milchprobenahme (siehe 3.3.13.6) und Applikation von 20 I.E. Oxytocin i.v. (sie-he 3.2.1), wurde das Euter zunächst maschinell und anschließend manuell sorgfältig ausgemolken. Nach gründlicher Reinigung und Desinfektion der Zitzen mit in 70 %igem Ethanol (siehe 3.2)

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getränkten Haushaltspapier, wurde die Infektionsdosis in einem Volumen von 2 ml mittels einer Einwegspritze und einer Zitzenkanüle in die Zitzenzisterne instilliert. Ein Zusammendrücken des Strichkanals mit zwei Fingern verhinderte ein Zurücklaufen, während die andere Hand durch dorsal gerichtetes Ausstreichen der Zitzenzisterne die instillierte Flüssigkeit in Richtung Drüsen-körper bewegte. Abschließend wurde das betroffene Euterviertel über 30 Sek. massiert. In das Kontrollviertel wurden 2 ml steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung im gleichen Verfahren instilliert. Tiere die mit E. coli infiziert wurden, erhielten zunächst zu Versuchsbeginn vorne rechts eine Infusion mit E. coli bei gleichzeitiger Applikation vorne links einer Placebo-Infusion mit NaCl-Lösung (Kontrollviertel). Weitere Infusionen mit E. coli folgten 12 Stunden (hinten rechts) und 18 Stunden (hinten links) nach Versuchsbeginn. Bei den Tieren, die über 24 Stunden mit S. aureus infiziert wurden, wurde analog vorgegangen. Tiere, die über 72 Stunden mit S. aureus infiziert wurden, erhielten zu Versuchsbeginn in beide rechten Viertel eine Infusion mit S. aureus, bei gleichzeitiger Placebo-Infusion vorne links (Kontrollviertel). Bei 4 von 6 Tieren wurde zwölf Stunden vor Versuchsende das verbleibende Viertel (hinten links) infiziert.

3.3.13.5 Erhebung und Beurteilung allgemeiner klinischer Parameter

Der klinische Status der Tiere wurde regelmäßig mindestens alle 12 Stunden von ummittelbar vor einer Infektion bis zum Versuchsende untersucht und dokumentiert. Dies umfasste im Einzelnen folgende Parameter: Körpertemperatur, Milchleistung, Sekretbeschaffenheit, Euterpalpationsbe-fund und Allgemeinbefinden. Körpertemperatur: Die Körpertemperatur aller Versuchstiere wurde bereits ab 3 Wochen vor Versuchsbeginn bis zum Versuchsende alle 12 Stunden gemessen und dokumentiert. Vor Ver-suchsbeginn wurde bei keinem Versuchstier ein Wert außerhalb des physiologischen Bereichs (37,8-39,2°C) beobachtet. Zusätzlich wurde bei eingehenden Allgemeinuntersuchungen (Rosen-berger 1990) während des Versuches alle 12 Stunden Körperhaltung, Verhalten, klinischer Ge-samteindruck, Habitus, Atemfrequenz, und Pulsfrequenz festgestellt, dokumentiert und hinsicht-lich des Grades einer Störung bewertet. Milchleistung und -beschaffenheit: Die Sekretbeschaffenheit der einzelnen Viertelanfangsge-melke und die Milchleistung wurden zu jeder Melkzeit beurteilt und ab 3 Wochen vor Versuchs-beginn bis zum Versuchsende fortlaufend dokumentiert. Euterpalpation: Die manuelle Palpation des Eutergewebes als Hinweis auf entzündliche Verän-derungen wurde ab Versuchsbeginn jeweils am ausgemolkenen Euter zu jeder Melkzeit (alle 12 Stunden) durchgeführt. Die in Tabelle 5 dargestellte Einteilung diente dazu, den Grad der Verän-derungen in Stufen einzuteilen. Eine Veränderung des Palpationsbefundes von bspw. Grad II zu V würde 3 Stufen entsprechen.

Tabelle 5: Dokumentation des Euterpalpationsbefundes (Grunert 1990)

o.B. Insgesamt feinkörnig und weich (ausgemolken) I Insgesamt grobkörnig, aber weich II Allgemein grobkörnig-derb mit einzelnen Knoten III Allgemein grobknotig IV Grobknotig mit einzelnen diffusen Verhärtungen V Insgesamt diffus verhärtet VI Akut geschwollen, vermehrt warm und schmerzhaft

Zur Objektivierung wurden die erhobenen Befunde nach einem dafür vorgesehenen Schema (siehe Tabelle 6) abschliessend beurteilt.

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Tabelle 6: Punkteschema zur Feststellung der Ausprägung ausgesuchter klinischer Parameter nach experimentell induzierter Mastitis

Bewertet wurde jeweils die maximale Ausprägung einer klinischen Veränderung pro Tier während einer 24- oder 72-stündigen Versuchsdauer. 1 graduelle Abweichung vom Palpationsbefund vor der Infektion (siehe Tabelle 5)

3.3.13.6 Klinische Labordiagnostik

Das rote Blutbild und das Differentialblutbild wurde im klinischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover angefertigt. Untersucht wurde zunächst unmit-telbar nach Aufstallung der Tiere. Des weiteren wurden die Tiere mit 24-stündiger Versuchsdauer zum Infektionszeitpunkt wie 12, 18 und 24 h post infectionem untersucht. Tiere, die über 72 h infi-ziert waren, wurden alle 12 h untersucht.

3.3.13.7 Gewinnung von Milchproben

Es wurde jedes Euterviertel der Versuchstiere unmittelbar vor der Melkzeit beprobt. Die Milch-proben wurden durch Handmelken gewonnen und umgehend ins Labor gebracht, wo sie bis zum Beginn der Zellseparation bei 4°C gelagert wurden. Der Transport der Proben erfolgte mit Kühl-elementen in einer Kühlbox. Die ersten ca. 5 ml des Milchsekrets (Vorgemelk) wurden aus dem grob gereinigten Euterviertel in eine Schale ermolken und nach makroskopischer Begutachtung unschädlich entsorgt. Nach trockener Reinigung des Euters und der Zitzen mit Haushaltspapier folgte eine gründliche Desinfektion besonders der Zitzenkuppe mit Haushaltspapier, das mit 70%-igem Ethylalkohol getränkt war. Anschließend wurden 10 ml Milch (Viertelanfangsgemelk, VAG) in ein steriles Probengefäß zur Bestimmung des SCC und der bakteriologischen Kontamination ermolken. Weitere 10 ml wurden zur späteren durchflusszytometrischen Bestimmung der Zellzusammen-setzung in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegten 40 ml PBS (steril, 4°C) ermol-ken.

Punkte 0 (keine Verände-rung)

1 (ggr. Verände-rung)

2 (mgr. Verände-rung)

3 (hgr. Verände-rung)

Rektale Temperatur (°C) 37,8-39,2 39,3-40 40-41 >41

Sekret o.B.

Milchcharakter erhalten, einige kleine bis wenige grobe Flocken

Milchcharakter erhalten, viele kleine und grobe Flocken

Verlust des Milchcharakters

Veränderungen des Euter-palpationsbefundes1

0 1 2-3 >4

Verlust der Milchleistung

<20% 21-40% 41-80% >80%

Allgemeinbefinden o.B. Ggr. gestört Mgr. gestört Hgr. gestört

Summe der Bewertungen: 0-3 4-7 8-11 12-15

Klinische Beurteilung: Keine Verände-rungen

Ggr. Verände-rungen

Mgr. Verände-rungen

Hgr. Verände-rungen

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Nach dem darauf folgenden maschinellen Ausmelken wurden 10 ml Milch (Viertelendgemelk, VEG) in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegten 40 ml PBS (steril, 4°C) ermol-ken. Die Gewinnung des VEG erfolgte zur durchflusszytometrischen Analyse möglicher Unter-schiede in der Zellzusammensetzung zwischen VAG und VEG.

3.3.13.8 Aufarbeitung und Analyse von Milchproben

Die Aufarbeitung der Milchproben erfolgte stehts auf Eis und unmittelbar nach ihrer Gewin-nung. Für die durchflusszytometrische Analyse wurde das mit PBS verdünnte VAG (siehe oben) zentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Anschließend wurde der abgesetzte Rahm vorsichtig entfernt und der flüssige Überstand unter Schonung des Zellpellets abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 50 ml PBS resuspendiert und erneut abzentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden 100 µl mit ca. 2 x 106 Zellen in ein FCM-Röhrchen überführt in dem 200 µl Trägerflüssigkeit (4 µg/ml PI) und 15 µl Acridin-Orange-Lösung (siehe 3.2.7.9.3) vorgelegt waren. Um die Anzahl nicht kernhaltiger Ereignisse bei der Erfassung zu minimieren, wurden die Pro-ben zunächst im Seitwärtsstreulicht (SSC) gegen Grünfluoreszenz (FL-1) erfasst und ein Fenster („live-gate“) auf die grün-fluoreszierenden, Acridin-Orange-positiven Ereignisse gesetzt (R1, sie-he Abbildung 3 B, C). Nach Erfassung dieser Ereignisse wurde im FL3/SSC Punktediagramm ein Fenster auf Propidiumjodid-negative Ereignisse gesetzt (R2, siehe Abbildung 3 D) und von diesen die morphologisch als Zellen erkennbaren Ereignisse in einem weiteren Fenster (R3, siehe Abbildung 3 E) identifiziert. Einzelne Zellsubpopulationen wurden im Punktediagramm FSC/SSC anhand ihrer morphologischen Charakteristika identifiziert (R4 = PMN, R5 = lymphoide Zellen, R6 = Makrophagen, Epithelzellen) und relativ quantifiziert (siehe Abbildung 3 F). Aus der Verrechnung mit der Zahl somatischer Zellen (SCC) wurden die absoluten Zahlen der einzelnen Zellpopulationen pro ml Milch ermittelt.

FSC

R3

FL-3

R2R2

FSC

R4

R5

R6

FL-1

R1

FL-1FSC

SS

CS

SC

A B C

D E F

Abbildung 3: Durchflusszytometrische Bestimmung einzelner vitaler Milchzellpopulatio-nen anhand ihrer Anfärbbarkeit und Morphologie

Dargestellt sind Punktediagramme nach Erfassung von 20.000 Ereignissen im Durchflusszytometer. A: Darstellung der Morphologie (Größe gegen Komplexität). B: (Grünfluoreszenz gegen Komplexität) R1:

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Identifizierung Fluoreszenz-postiver, kernhaltiger Ereignisse. C: Erfassung der Ereignisse aus B (R1) mit einem life gate. D: (Rotfluoreszenz gegen Komplexität) Identifizierung der PI-negativen Ereignisse (vitale Zellen) in Region R2. E: (Größe gegen Komplexität) Darstellung der Zellen aus D (R2) und Identifikation morphologisch als Zellen zu identifizierender Ereignisse (R3). F: (Größe gegen Komplexität) Identifizie-rung einzelner Zellsubpopulationen. R4: neutrophile Granulozyten. R5: lymphoide Zellen. R6: „large cells“ (Makrophagen, Epithelzellen).

Zur Separation somatischer Zellen aus der Milch zur RNA-Gewinnung wurde das mit PBS-verdünnte VAG (siehe oben) zentrifugiert (250 x g, 15 Min., 4°C, ohne Bremse). Anschlies-send wurde der abgesetzte Rahm vorsichtig entfernt und der Überstand unter Schonung des Zellpellets abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) überführt. Nach erneutem Abzentrifugieren (250 x g, 15 Min., 4°C, ohne Bremse) wurden 750 µl des Überstandes verworfen und das Zellpellet in den verbleibenden 250 µl resuspendiert. Dazu wurden 750 µl Trizol LS Reagent® (siehe 3.2.3) pipettiert und durch Auf- und Abpipettieren gut durchmischt. Zur erleichterten Lyse der Zellen wurde anschließend mit einer 1 ml Einwegspritze die Lösung bis zum Erreichen vollkommener Transparenz durch eine aufgesetzte 0,9 mm Kanüle auf und ab gezogen. Die Proben wurden 5 Min. bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend bei –80°C gelagert. Die weitere Aufarbeitung und RNA-Messungen erfolgten im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fach-bereich Molekularbiologie, Dummerstorf unter der Leitung von Prof. Dr. H. M. Seyfert. Die mikrobiologische Untersuchung wurde freundlicherweise im mikrobiologischen Labor der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch des Zentrums für Lebensmittelwis-senschaften der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Frau Dr. Schröder durchgeführt. Nach Durchmischung der Probe wurden mit einer Einmalöse 10 µl Milch auf einer halben Blutagarplatte mit Äskulinzusatz ausgestrichen. Die Platten wurden nach 24 und 48 Stunden beurteilt. Wenn es für die Differenzierung nötig war, wurden Subkulturen einzelner Bakterienkolonien angelegt. Die Bestimmung der somatischen Zellzahl (SCC) erfolgte mit dem Gerät Fossomatic® im Zentrum für Tiergesundheit, Milch und Lebensmittelanalytik des Ahlemer Instituts der Landwirt-schafskammer Hannover. Dazu wurde jede Probe mit Ethidiumbromid versetzt und die Zahl der Zellen/ml fluoreszenzoptisch bestimmt.

3.3.13.9 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)

Die indirekte Membranimmunfluoreszenz ist ein Verfahren zum Nachweis der Expression von Oberflächenstrukturen auf Zellen. Hierbei binden spezifische Antikörper an Strukturen, die ih-rerseits von einem zweiten, Fluorochrom-markierten Antikörper erkannt werden. Pro Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte wurden 2 x 105 Zellen frisch separierter oder in-vitro-kultivierter Zellen pipettiert. Platten mit kultivierten Zellen wurden 10 Min. auf Eis inkubiert um adhärente Zellen leichter herauspipettieren zu können. Die Zellen wurden zentrifu-giert (200 x g; 4 Min., 4°C) und die Überstände dekantiert. Anschließend wurden die Zellen in 175 µl MIF-Puffer (siehe 3.2.7.2.7) gewaschen: Resuspension, Zentrifugation, Abschlagen der Überstände, Resuspension des Bodensatzes. Nach Zugabe von 25 µl des verdünnten spezifischen primären Antikörpers (siehe 3.2.6) erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei 4°C. Danach wurden die Zellen zweimal mit 175 µl MIF-Puffer gewaschen, mit 25 µl des sekundären FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers versetzt und unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 Min. inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 150 µl Trägerflüssigkeit (2 µg/ml PI) aufgenommen, in FCM-Röhrchen überführt und durchflusszytometrisch erfasst. Da es zu unspezifischen Bindungen des sekundären Antikörpers kommen kann, wurden sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt, bei denen den Zellen an Stelle des ersten An-

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tikörpers 25 µl MIF-Puffer bzw. ein irrelevanter monoklonaler Antikörper des gleichen Isotyps wie der spezifische Primärantikörper zugesetzt wurde. Mittels der Membranimmunfluoreszenz konnten einzelne Milchzellpopulationen differenziert werden (siehe Abbildung 4).

Abbildung 4: Durchflusszytometrische Differenzierung somatischer Milchzellen

Dargestellt sind Punktediagramme (Grünfluoreszenz gegen Komplexität) nach Erfassung von 20.000 Ereignissen im Durchflusszytometer. Die in der Kontrolle (A, nur Sekundärantikörper, FITC-markiert) gekennzeichnete Zellpopulation (Ellipse) sind lymphozytäre Zellen. PMN sind durch einen hohen SSC-Wert und die Anfärbung durch den mAk Bo116 gekennzeichnet (B). Makrophagen stellen sich als CD14- und teilweise MHC-Klasse-II-positive Zellen (C, D) mit relativ großem und stark streuendem SSC dar.

3.3.13.10 Gewinnung von Gewebeproben

Die Teilsektion der Versuchstiere wurde im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter Leitung von Herrn PD Dr. Wohlsein durchgeführt. Die Tiere wur-den je nach Versuchsaufbau 24 oder 72 Stunden nach Infektionsbeginn durch Betäubung mit Bolzenschuss und anschließendem Blutentzug getötet. Innerhalb von 15 Min. nach der Tötung wurden Eutergewebe- und Lymphknotenproben unter sterilen Kautelen gewonnen. Für die Gewinnung von Milchdrüsengewebe wurde ein 5 x 5 x 5 cm großes Stück aus einem tiefer gelegenen Teil des Drüsengewebes ca. 10 cm dorsal der Drüsenzisterne entnommen. Nach Wechseln des Präparationsbestecks wurden hieraus ein 2 x 2 x 2 cm großes Stück zur Anferti-gung von Gewebeschnitten und ein 0,5 x 0,5 x 0,5 cm großes Stück zur RNA-Gewinnung her-auspräpariert.

D

Bo 139

B

Bo 116

A

Kontrolle

C

VPM 65

SS

C

56

Für die Gewinnung von Lymphknotengewebe wurden die Lnn. mammarii (Euterlymphknoten), als auch die Lnn. cervicales superficiales (Buglymphknoten) frei präpariert. Hier wurde ebenfalls je-weils ein 2 x 2 x 2 cm großes Stück zur Anfertigung von Gewebeschnitten und ein 0,5 x 0,5 x 0,5 cm großes Stück zur RNA-Gewinnung herauspräpariert. Die Herstellung der Gewebeschnitte als auch die pathologisch-histologischen Untersuchungen wurden im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durch Herrn PD Dr. Wohlsein durchgeführt. Die Proben zur RNA-Gewinnung wurden jeweils in ein 15 ml Röhrchen mit 8 ml RNAlater® (siehe 3.2.3) überführt, zweimal geschwenkt, über 24 h bei 6°C aufbewahrt und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –80°C tiefgefroren. Die Aufarbeitung und Messungen mittels quantitativer RT-PCR (Goldammer et al. 2004) erfolgten unter der Leitung von Prof. Dr. H. M. Seyfert im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf.

3.3.14 Methoden zur Untersuchung des Einflusses von weiblichen Sexualsteroiden auf PAMP vermittelte Effekte boviner Makrophagen und mononukleärer Zellen in vitro

3.3.14.1 Präparation boviner Leukozyten zur immunhistologischen Untersuchung auf Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren

Bovine MNC, Monozyten, PMN und MDM wurden wie unter 3.3.1 beschrieben separiert bzw. generiert. Zellen (ca. 1 x 107 –1 x 108) wurden in ein 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, zentrifugiert (250 x g, 4°C, 10 Min., ohne Bremse), der Überstand vorsichtig abpipettiert und das Zellpellet mit 4%igem neutral gepufferten Formol (siehe 3.2.7.6) fixiert. Die weitere Aufarbeitung und Durchführung immunhistologischer Verfahren (Schuler 2000) erfolgte freundlicherweise durch PD Dr. Gerhard Schuler, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Giessen. Eingesetzt als Primärantikörper wurden spezifische monoklonale Antikörper aus der Maus gegen den Progesteronrezeptor wie den Ös-trogenrezeptor-β. Als Sekundärantikörper diente ein biotinylierter Pferd-anti-Maus-IgG-Antikörper. In der Negativkontrolle wurde ein irrelevanter Antikörper vom gleichen Isotyp des Primärantikörpers an dessen Stelle eingesetzt.

3.3.14.2 Präparation der RNA aus bovinen Leukozyten zur Untersuchung auf Östrogen-rezeptoren

Verwendet wurde das RNeasy Kit® der Firma Quiagen (siehe 3.2.2). In Anlehnung an Hersteller-angaben wurden 400 µl Puffer RLT und 4 µl β-Mercaptoethanol in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, 1 x 106 Zellen in 50 µl PBS zugegeben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt. Danach wurden 400 µl 70 %iges Ethanol zur Probe hinzugefügt und erneut gut durchmischt. Die RNeasy-Säule wurde in ein 2 ml Auffanggefäß gegeben und mit 700 µl des Probenansatzes beladen. Es wurde bei 7500 x g über 15 Sek. zentrifugiert. Anschließend wurde der verbliebene Rest des Probenansatzes auf die RNeasy-Säule gegeben und wiederum 15 Sek. bei 7500 x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde jeweils verworfen. 700 µl Puffer RW1 wurden auf die RNeasy-Säule aufgebracht und bei 7500 x g 15 Sek. zentrifugiert. Durchfluss und Auf-fanggefäß wurden verworfen und die RNeasy-Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben. 500 µl Puffer RPE wurden zugegeben und bei 7500 x g 15 Sek. zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Es erfolgte eine erneute Zugabe von 500 µl Puffer RPE. Danach wurde 2 Min. bei 14000 x g zentrifugiert, um den Puffer RPE vollständig zu entfernen. Die RNeasy-Säule wurde anschließend vorsichtig in ein steriles 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. 50 µl RNase-freies Wasser wurden auf die RNeasy-Säule pipettiert und 1 Min. bei 14000 x g zentrifugiert. Die weite-re Aufarbeitung und Durchführung der PCR (Schuler et al. 2002) erfolgte freundlicherweise durch PD Dr. Gerhard Schuler, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Giessen.

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3.3.14.3 Präparation der RNA aus bovinen MdM zur Untersuchung auf Expression von Toll-like Rezeptoren

Bovine Makrophagen wurden wie unter 3.3.7 beschrieben gewonnen. Ihre 7-tägige Reifung er-folgte in einem steroidhormonfreien Milieu (siehe 3.2.7.1.4), als auch in Medium mit 10 nmol/l Östradiol-17β (siehe 3.2.7.1.3) oder 25 nmol/l Progesteron (siehe 3.2.7.1.2). Das Medium wurde alle zwei Tage gewechselt. Die so gewonnenen Zellen wurden auf 5 x 105 Zellen eingestellt. Das Medium wurde durch zweimaliges Waschen mit PBS (250 x g, 4°C, 10 Min., ohne Bremse) ent-fernt und das Zellpellet mit 1 ml Guanidinium-iso-thiocyanat-Lösung (siehe 3.2.7.7.1) resuspen-diert und die Lyse der Zellen durch Auf- und Abziehen in einer 0,9 mm Kanüle mittels Einweg-spritze unterstützt. Die weitere Aufarbeitung und Messung der Proben erfolgte freundlicherweise durch Prof. Dr. Hans-Martin Seyfert, Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf.

3.3.14.4 Kultivierung boviner Leukozyten in vitro

Separierte Leukozyten (siehe 3.3.3) wurden in 96-Well-Rundboden-Mikrotiterplatten kultiviert: Dazu wurden 2 x 105 Zellen (in 200 µl I10Fstrep) pro Vertiefung (well) pipettiert. Die Kultivierun-gen erfolgten in verschiedenen hormonellen Milieus (siehe Tabelle 7). Pro Milieu wurden die Zel-len mit final 1 µg/ml LPS oder 2,5 µg/ml CpG-Motiv oder der Kombination aus LPS und CpG-Motiv stimuliert. Als Kontrollansatz diente Medium. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Inku-biert wurde für 24 h bei 38,5°C und 5 % CO2 in einer Feuchtkammer. Es schloss sich eine durch-flusszytometrische Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode (siehe 3.3.11) an.

Tabelle 7: Hormonelle Milieus zur Kultivierung von bovinen Leukozyten in vitro

Konzentration (nmol/l) Östradiol-17β 0,5 50 5000 Progesteron 1,25 125 12500

Kontrolle (0)

3.3.14.5 Kokultivierung von Makrophagen und mononukleären Zellen mit Granulozyten in vitro

Die Kokultivierungen erfolgten in 96-Well-Rundboden-Mikrotiterplatten: 1 x 105 neutrophile Granulozyten (in 100 µl) (siehe 3.3.5.2) wurden mit 1 x 105 allogenen MNC (50 µl) oder 5 x 104 allogenen MdM (in 50 µl) pro Vertiefung eingesäht. Die MdM waren zuvor über 7 Tage in steroi-dextrahiertem Medium, in Medium mit Zusatz von 10 nmol/l Östradiol-17β oder 25 nmol/l Progesteron gereift. Ansätze mit 1 x 105 neutrophilen Granulozyten allein dienten zur Kontrolle. Während einer Kokultur mit PMN wurde das jeweilige Hormonmilieu beibehalten. Die hormo-nellen Milieus wurden ebenfalls für die PMN-Monokulturen und PMN/MNC-Kokulturen ver-wendet. Alle Ansätze (Permutationen) erfolgten in Triplikaten. Stimuliert wurden die Kokulturen, wie oben beschrieben, mit LPS, mit CpG-Motiv oder der Kombination aus LPS+CpG-Motiv. Kulturmedium (25 µl) anstelle der Stimuli (jeweils 25 µl) diente zur Kontrolle. Das Gesamtvolu-men pro Vertiefung betrug 200 µl. Die Inkubation erfolgte für 24 h bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft). Danach wurde die Zahl vitaler Zellen durchflusszytometrisch quantifiziert (siehe 3.3.11). Hierfür wurden nach der Inkubationszeit die Mikrotiterplatten für 15 Min. auf Eis gelagert, um adhärente Zellen zu lösen. Eine Durchmischung und nahezu vollständige Ablösung (nach mikro-skopischer Kontrolle) der Zellen wurde durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren erreicht. Die Ansätze wurden in FCM-Röhrchen überführt in denen 150 µl Trägerflüssigkeit mit 2 µg/ml PI vorgelegt war.

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3.3.15 Untersuchungen zum Argininstoffwechsel boviner Makrophagen und mo-nonukleärer Zellen

Makrophagen (5 x 104, siehe 3.3.7) oder MNC (1 x 106, siehe 3.3.2), wurden in Hexaplikaten für 48 Stunden in 96-Well-Flachboden Mikrotiterplatten kultiviert. Die Stimulation von Makropha-gen und MNC erfolgte mit 1 µg/ml LPS.

3.3.15.1 Bestimmung der Arginase-Aktivität

Falls nicht anders beschrieben, wurden die Zellen zur Bestimmung der Arginase-Aktivität für 48 Stunden in 96-Well-Flachboden Mikrotiterplatten kultiviert und stimuliert. Nach Prüfung der Kulturen im Invertmikroskop auf mögliche Kontamination wurde der Überstand durch vorsich-tiges Abpipettieren zur Bestimmung des NO-Gehaltes gewonnen (siehe 3.3.15.2). Anschliessend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen (400 x g, 8 Min. Raumtemperatur). Zur Lyse der Zellen wurden 25 µl 0,1%iger Triton-X100 Lysepuffer (siehe 3.2.7.3.1) pro Vertiefung eingesetzt und anschließend 45 Min. bei Raumtemperatur auf einem Rüttler inkubiert. Nun wurden 25 µl 10 mmol/l MnCl2 –Lsg. (siehe 3.2.7.3.3) und 25 µl Tris-HCl-Puffer (siehe 3.2.7.3.2) hinzugegeben. Nach Zusammenführen der Triplikate in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) und an-schließender Inkubation in einem Thermoblock (10 Min., 55°C), wurden 50 µl Lysat und 50 µl 0,5 mol/l Arginin-Lsg (siehe 3.2.7.3.4) zusammen in einem weiteren Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) über 60 Min. bei 38,5°C und 5% CO2 inkubiert. Zum Stoppen der enzymatischen Reak-tion wurden 400 µl Säuregemisch (siehe 3.2.7.3.5) hinzupipettiert. Zum Erstellen einer Standard-kurve wurde eine Harnstoff-Verdünnungsreihe in Zweier-Schritten zwischen 0,46 µg/ml und 30 µg/ml aus der Stammlösung (siehe 3.2.7.3.7) hergestellt. Zu Proben und Standards wurden 25 µl α-Isonitrosopropiophenon-Lösung (siehe 3.2.7.3.6) hinzugegeben. Nach 45-minütiger Inkubati-on in einem Thermoblock bei 100°C und anschließendem Abkühlen über 10 Min. bei Dunkelheit wurden jeweils 200 µl im abgedunkelten Raum zügig in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte pipettiert und anschließend die Absorption bei 570 nm (Referenzwellenlänge 630 nm) in einem ELISA-Reader (siehe 3.1) gemessen. Eine Einheit an Arginase-Enzymaktivität ist definiert durch die Bildung von 1 nmol Harnstoff/Min.

3.3.15.2 Nitrit- und Nitratbestimmung mittels Griess-Reagenz

Zum simultanen Nachweis von Nitrit und Nitrat, zweier Oxidationsprodukte von Stickoxid (NO), wurde eine modifiziertes Verfahren des NO-Nachweises mittels Griess-Reagenz eingesetzt (Miranda et al. 2001). Aus den Nitrat- und Nitrit-Stammlösungen (siehe 3.2.7.4.3 u. 3.2.7.4.4) wurden zunächst Standards von 200-1,56 µmol/l in Halbierungsschritten hergestellt. Jeweils 100 µl der Standards (Triplikate) und der zu messenden Zellkulturüberstände (Hexaplikate) wurden in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte pipettiert. Zur Reduktion des Nitrats zu Nitrit in den Nitrat-Standards als auch in drei der jeweiligen Proben-Hexaplikate wurden 100 µl der VCl3-Lösung (siehe 3.2.7.4.2) hinzupipettiert. Nun wurden 50 µl NEDD und 50 µl SULF (siehe 3.2.7.4.1) hinzugegeben und 45 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption wurde bei 570 nm (Referenzwellenlänge 630 nm) in einem ELISA-Reader erfasst. Aus den durch das VCl3 reduzierten Proben wurde der Gehalt an Nitrat und Nitrit ermittelt (Gesamt-NO), während aus den ohne Reduktionsschritt gemessenen Proben der Nitritgehalt hervorging. Der Nitratgehalt wurde sodann rechnerisch ermittelt.

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3.3.16 Statistische Verfahren Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurde der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test (Steel und Torrie 1980) eingesetzt. Im Falle nicht normal verteilter Werte, besonders bei kleinen Datengruppen, wurde der Mann-Whitney Rangsummentest eingesetzt. Um festzustellen, inwieweit ein Merkmal vom anderen abhängig ist, erfolgte die Berechnung des Korrelationskoeffizienten mittels linearer Regression. Die Interassayvarianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Daher wurden in dieser Arbeit Interassayvarianzen nur punktuell bestimmt. Die Intraassayvarianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der Messwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die Messwerte bei mehrfa-cher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen voneinander abweichen. Für die mit der Referenzzellmethode ermittelte Gesamtzahl vitaler Zellen (siehe 3.3.11) ergab sich für die Einzelansätze von Triplikaten innerhalb eines Ansatzes ein Varianzkoeffizient zwischen 2% bis 10%.

60

4 Ergebnisse

4.1 Etablierung eines experimentellen Mastitis-Modells mit E. coli und S. aureus

Ein Kernpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Mastitismodells für das Rind. Unter streng definierten Bedingungen sollten damit die frühe Phase einer akuten klinischen (E. coli) sowie einer subklinisch bis chronischen (S. aureus) Mastitis simuliert werden. Das Modell soll-te die Analyse der Expression von Pathogen-Erkennungs-Rezeptoren und ausgesuchter immuno-logischer Effektormechanismen der Milchdrüse ermöglichen.

4.1.1 Klinische Parameter experimentell infizierter Tiere Um zu dokumentieren, wie sich klinische Parameter im Rahmen experimenteller Euterinfektio-nen in Abhängigkeit vom verwendeten Keim entwickeln und ausprägen, wurden regelmäßig die Körpertemperatur, die Milchleistung, die Eutersekretbeschaffenheit, der Euterpalpationsbefund, das Allgemeinbefinden und das Differentialblutbild dokumentiert.

4.1.1.1 Körpertemperatur

Die rektale Körpertemperatur wurde in der Regel alle 12 Stunden ermittelt (siehe Abbildung 5). Alle mit E. coli infizierten Tiere reagierten innerhalb der ersten 12 h nach Infektion mit einer sig-nifikanten Erhöhung der Körpertemperatur über die Fiebergrenze von 39,2° C (Stunde 0: 38,7 ± 0,12 °C; Stunde 12: 40,0 ± 0,25 °C; P < 0,01). Ein Maximum von 40,4° C wurde zwischen 12 und 18 h post infectionem erreicht. In diesen Zeiträumen ließ sich im Mittel bei den mit S. aureus über 24 h oder 72 h infizierten Tieren keine signifikante Erhöhung der Körpertemperatur fest-stellen. Lediglich ein Tier (1159) zeigte nach 12 h kurzfristig eine Erhöhung auf 39,4°C (siehe Abbildung 5).

0 24 48 72

38

39

40

41

0 6 12 18 24

38

39

40

41

0 6 12 18 24

38

39

40

41

Tier 490 Tier 491 Tier 435 Tier 475

Kör

perte

mpe

ratu

r(°C

)

Tier 1054 Tier 1055 Tier 1161 Tier 1162

Tier 1056 Tier 1057 Tier 1159 Tier 1160

Zeit (h)

Abbildung 5: Verlauf der Körpertemperatur nach experimentell induzierter Mastitis mit E. coli und S. aureus

Dargestellt ist der Verlauf der rektal gemessenen Körpertemperatur von jeweils 4 Tieren nach experimen-tell induzierter Mastitis mit E. coli und S. aureus über einen Zeitraum von 24 h und mit S. aureus über 72 h. Alle Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h zum ersten Mal in einem (E. coli und S. aureus 24 h) oder zwei (S. aureus 72 h) Eutervierteln infiziert. Weitere Infektionen in verbleibenden Vierteln wurden nach 12 und 18 h (E. coli und S. aureus 24 h) oder nach 60 h (S. aureus 72 h) vorgenommen. Der physiologische Tempera-turbereich ist grau unterlegt.

61

4.1.1.2 Milchleistung

Die tägliche Milchleistung sank sowohl bei Tieren die mit E. coli als auch bei Tieren die mit S. aureus infiziert wurden. Während eine Infektion mit E. coli innerhalb der ersten 12 h zu keinem signifikanten Abfall der Milchleistung führte, konnte hingegen nach 24 h ein hochsignifikanter Abfall von durchschnittlich 84 % festgestellt werden. Wurden Tiere mit S. aureus infiziert, konnte bereits nach 12 h ein signifikanter Abfall um 24 % (Experiment über 72 h) und 45 % (Experi-ment über 24 h) festgestellt werden. Bei S. aureus-infizierten Kühen, die über 72 h verfolgt wur-den, blieb die Milchleistung um durchschnittlich 24,1 % herabgesetzt (siehe Abbildung 6).

-48 -24 0 24 48 720

4

8

12**

*

-48 -24 0 240

4

8

12

**

*

***

-48 -24 0 240

4

8

12*

***

Zeit (h)

Milc

hlei

stun

g (l)

Abbildung 6: Einfluss einer experimentellen Infektion mit E. coli und S. aureus auf die Gesamtmilchleistung

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Milchleistung (l) zu jeder Melkzeit vor und nach experimentel-ler Infektion mit E. coli (n = 4) und S. aureus (n = 4) über einen Zeitraum von 24 h und mit S. aureus (n = 4) über 72 h. Die Erstinfektion erfolgte jeweils zum Zeitpunkt 0 h. Tiere der Gruppe E. coli und S. aureus 24 h wurden zusätzlich zu den Zeitpunkten 12 h und 18 h infiziert; Tiere der Gruppe S. aureus 72 h zum Zeitpunkt 60 h. Bei jeweils zwei Tieren, die mit E. coli oder S. aureus über 24 h infiziert wurden, wurde aufgrund ungleicher Melkintervalle die tägliche Milchleistung vor Infektionsbeginn gemittelt. * = P<0,05; ** = P<0,01; *** = P<0,001.

4.1.1.3 Allgemeine klinische Symptome

Alle mit E. coli infizieren Tiere wirkten bei der Untersuchung nach 12 h etwas matt (geringgradige Störung des Allgemeinbefindens). Deutlich ausgeprägt waren die hochgradigen Veränderungen des Eutersekretes (Flocken, Verlust des Milchcharakters), als auch eine hochgradige entzündliche Schwellung betroffener Euterviertel (siehe Tabelle 8). Der mittlere klinische Score lag bei 10,75 ± 0,5. Tiere, die mit S. aureus infiziert wurden, zeigten hingegen keine bis geringgradige klinische Anzeichen einer Euterentzündung. In der Tiergruppe, die über einen Zeitraum von 24 h mit S. aureus infiziert wurde, zeigten 3 von 4 Kühen keinerlei abweichende klinische Symptome. Ledig-lich ein Abfall in der Milchleistung war bei 3 von 4 Tieren festzustellen (klinischer Score: 2,75 ± 1,26). In der Tiergruppe, die über einen Zeitraum von 72 h mit S. aureus infiziert wurde, zeigten 3 von 4 Tieren geringgradige klinische Symptome, die durch zunehmende Flockenbildung in der Milch bei erhaltenem Milchcharakter geprägt waren (klinischer Score: 4,25 ± 0,96).

62

Tabelle 8: Allgemeine klinische Symptome im Verlauf einer experimentell induzierten Mastitis mit E. coli oder S. aureus

Experimentelle Mastitis mit E. coli über einen Zeitraum von 24 h

Tier 1054 1055 1161 1162 Körpertemperatur 1 1 2 1 Eutersekretbefund 3 3 3 3 Euterpalpationsbefund 3 3 3 3 Milchleistungsabfall 3 2 2 3 Störung des Allgemeinbe-finden

1 1 1 1

klinischer Score 11 10 11 11

Experimentelle Mastitis mit S. aureus über einen Zeitraum von 24 h

Tier 1056 1057 1159 1160 Körpertemperatur 0 0 1 0 Eutersekretbefund 1 0 0 0 Euterpalpationsbefund 1 0 0 1 Milchleistungsabfall 2 1 2 2 Störung des Allgemeinbe-finden

0 0 0 0

klinischer Score 4 1 3 3

Experimentelle Mastitis mit S. aureus über einen Zeitraum von 72 h

Tier 490 491 435 475 Körpertemperatur 0 0 0 0 Eutersekretbefund 1 1 2 2 Euterpalpationsbefund 1 1 1 1 Milchleistungsabfall 2 1 2 2 Störung des Allgemeinbe-finden

0 0 0 0

klinischer Score 4 3 5 5

Ausgesuchte klinische Parameter wurden im Verlauf der experimentellen Mastitis erhoben und zur Ein-schätzung der Schwere nach dem unter 3.3.13.5 beschriebenen Schema bewertet. Dargestellt sind die Er-gebnisse einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus über 24 h als auch mit S. aureus über 72 h (klinischer Score: 0-3 = keine klinischen Veränderungen, 4-7 = geringgradige klinische Veränderungen, 8-11 = mittelgradige klinische Veränderungen, 12-15 = hochgradige klinische Veränderungen).

4.1.1.4 Differentialblutbild

Bei allen Tieren, die mit E. coli infiziert wurden, war nach 12 h eine signifikante Leukopenie zu beobachten (siehe Abbildung 7), die sowohl PMN (Abfall auf 22,1%) als auch Lymphozyten (Ab-fall auf 53,7%) umfasste. Nach 18 h wurde die maximale Leukopenie erreicht. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus wurden keine signifikanten Veränderungen der Zahl zirkulierender PMN und Lymphozyten beobachtet. Hingegen kam es während einer 72-

63

stündigen Infektion zu einem transienten, signifikanten Abfall der PMN 48 h post infectionem (siehe Abbildung 7).

0 12 24 36 48 60 720

2000

4000

6000

*

0 6 12 18 240

2000

4000

6000

0 6 12 18 240

2000

4000

6000

*

***

**

*** ***

Lymphozyten PMNZeit (h)

Zel

len

(/µ

l)

Abbildung 7: Einfluss einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus auf ausge-suchte Parameter des Differentialblutbildes

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (je n = 4) der Lymphozyten- und PMN-Zahlen/µl Blut während einer 24-stündigen experimentellen Mastitis mit E. coli oder S. aureus und einer 72-stündigen experimentellen Mastitis mit S. aureus. * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.

4.1.2 Bakteriologische Befunde Zur Überprüfung der Manifestation der experimentell induzierten Mastitis wurden alle Viertelan-fangsgemelke auf das Vorhandensein von Mastitiserregern getestet (siehe 3.3.13.8). Es wurde jeweils nur die Keimspezies nachgewiesen, mit der infiziert worden war. Exemplarisch wurde zudem bei je zwei der mit E. coli und mit S. aureus infizierten Tiere das Plasmidmuster der infundierten, wie der reisolierten Bakterienstämme verglichen. Es gab jeweils keine Abweichun-gen zwischen Inokulat und Reisolat (freundlicherweise durchgeführt von Prof. S. Schwarz, FAL, Mariensee, Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse der semiquantitativen Analyse der reisolierten Keime sind in Tabelle 9 A, B und C zusammengefasst. Bei allen 4 Tieren, die mit E. coli zum Zeitpunkt 0 h in einem Viertel infiziert worden waren, ließ sich 12 h später ein hochgradiger Gehalt an E. coli nachweisen. Der hohe Keimgehalt blieb in diesem Viertel weitere 12 h bestehen. Die Euterviertel, die 12 h nach der ersten Infektion infiziert wurden, zeigten ebenfalls 12 h später einen hohen Gehalt an E. coli. Nach einer 6 stündigen In-fektion (Infektion zum Zeitpunkt 18 h) konnten gering- bis mittelgradige Keimgehalte nachge-wiesen werden. In einem der insgesamt 4 Kontrollviertel ließ sich 24 h nach Infektion des kontra-lateralen Viertels ein geringgradiger Gehalt an E. coli nachweisen. Jedes Tier, welches mit S. aureus infiziert worden war, zeigte mindestens einmal einen positiven bakteriologischen Befund im Milchsekret, während alle Kontrollviertel durchgehend bakteriolo-gisch negativ blieben. Insgesamt stellten sich die Befunde der S. aureus-infizierten Viertel sehr viel heterogener dar als die der E. coli-infizierten Viertel: So zeigten z.B. Tier 1056 (siehe Tabelle 9 B) und Tier 490 (siehe Tabelle 9 C) nach 12 h bereits einen positiven bakteriologischen Befund, der auch weiterhin be-stehen blieb. Andere Tiere (z.B. 475, siehe Tabelle 9 C) hingegen zeigten erst nach 72 h ein posi-tives bakteriologisches Ergebnis oder blieben in einem der infizierten Viertel gar bakteriologisch negativ (Tier 1159, siehe Tabelle 9 B, Tier 435, siehe Tabelle 9 C).

64

Tabelle 9: Kulturelle Reisolierung von E. coli und S. aureus aus dem Milchsekret experimentell infizierter Tiere

A Tiernummer

Euterviertel Zeit nach Infektion des ersten Viertels 1054 1055 1161 1162

Kontrollviertel 0 h - - - - 12 h - - - - 24 h + - - -

24 h Infektion ► 0 h - - - - 12 h +++ +++ +++ +++ 24 h +++ +++ +++ +++

12 h Infektion 0 h - - - - ► 12 h - - - -

24 h +++ +++ +++ ++

6 h Infektion 0 h - - - - 12 h - - - -

► 24 h ++ + +++ +

B

Tiernummer Euterviertel

Zeit nach Infektion des ersten Viertels 1056 1057 1159 1160

Kontrollviertel 0 h - - - - 12 h - - - - 24 h - - - -

24 h Infektion ► 0 h - - - - 12 h ++ + - - 24 h +++ + - +

12 h Infektion 0 h - - - - ► 12 h - - - -

24 h +++ - ++ -

6 h Infektion 0 h - - - - 12 h - - - -

► 24 h ++ + +++ +

65

C

Tiernummer Euterviertel

Zeit nach Infektion des ersten Viertels 490 491 435 475

Kontrollviertel 0 h - - - - 12 h - - - - 24 h - - - - 36 h - - - - 48 h - - - - 60 h - - - - 72 h - - - -

72 h Infektion v. ► 0 h - - - - 12 h - - - - 24 h ++ - - - 36 h +++ - - - 48 h ++ - + - 60 h ++ - + -

72 h +++ - + -

72 h Infektion h. ► 0 h - - - - 12 h + + - - 24 h ++ + - - 36 h ++ + - - 48 h ++ (+) - - 60 h ++ + - - 72 h + - - ++

12 h Infektion 0 h - - - - 12 h - - - - 24 h - - - - 36 h - - - - 48 h - - - -

► 60 h - - - - 72 h - - ++ -

Dargestellt sind die semiquantitativen Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen aus Viertelan-fangsgemelken, die während drei verschiedener Mastitis-Infektionsversuche gewonnen wurden: 0 h = Zeitpunkt der ersten Infektion; 24 h = 24 h nach der ersten Infektion. A: 500 KBE E. coli infiziert (24 h Versuchsdauer) B: 10.000 KBE S. aureus infiziert (24 h Versuchdauer) C: 10.000 KBE S. aureus infiziert (72 h Versuchsdauer). Jeweils ein Viertel diente bei allen Tieren als Kontrollviertel. ►zeigt den Zeitpunkt der Infektion des jeweiligen Viertels an. v = vorderes Euterviertel, h = hinteres Euterviertel der ipsilatera-len Seite. + = geringgradig, ++ = mittelgradig, +++ = hochgradig.

4.1.3 Somatische Zellzahl der Milch (SCC) im Infektionsverlauf

4.1.3.1 Veränderung des SCC im Verlauf einer experimentellen Mastitis mit E. coli In Vierteln, die 24 h mit E. coli infiziert waren, liess sich ein hochsignifikanter Anstieg (P<0,001) der somatischen Zellzahl 12 Stunden post infectionem von 3.7 ± 0.1 auf 5.9 ± 0.3 log SCC/ml fest-stellen (siehe Abbildung 8 B). Bei 3 von 4 Individuen stieg der SCC nach weiteren 12 h leicht, nicht signifikant an. Eine leichte Erhöhung der somatischen Zellzahl im Kontrollviertel nach 24 h (siehe Abbildung 8 A) erwies sich ebenso als nicht signifikant (P = 0,09).

66

In den Vierteln, die 12 h vor der Sektion, und in den Vierteln, die 6 h vor der Sektion infiziert wurden (siehe Abbildung 8 C, D) konnte kein Anstieg der somatischen Zellzahl beobachtet wer-den.

Tier 1054 Tier 1055 Tier 1161 Tier 1162 = Infektionszeit

Zeit (h)

log

(SC

C/m

l)

C

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

D

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

A

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

B

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

***

Abbildung 8: Entwicklung der Somatischen Zellzahl (log SCC/ml) nach konsekutiver experimenteller Infektion von Eutervierteln mit 500 KBE E. coli über einen Zeitraum von 24 Stunden

A) In die Kontrollviertel (kontralateral zum infizierten Viertel) wurde das äquivalente Volumen (2 ml) einer sterilen 0,9 %ige NaCl-Lösung infundiert. B) 24 h infizierte Viertel C) 12h infizierte Viertel, D) 6 h infizierte Viertel.

67

4.1.3.2 Veränderung des SCC im Verlauf einer experimentellen Mastitis mit S. aureus Nach einer 12 stündigen Infektion liess sich eine signifikante Zellzahlerhöhung von 4.1 ± 0.32 auf 5.2 ± 0.21 log SCC/ml feststellen (P<0,05; siehe Abbildung 9 B). Das Kontrollviertel zeigte jedoch ebenfalls eine signifikante SCC-Erhöhung von 4.1 ± 0.32 auf 5.1 ± 0.23 log SCC/ml, (P<0,05, siehe Abbildung 9 A). In den Vierteln, die 12 h vor der Sektion, und in den Vierteln, die 6 h vor der Sektion infiziert wurden (siehe Abbildung 9 C, D) konnte hingegen kein Anstieg der somatischen Zellzahl beobachtet werden.

Abbildung 9: Entwicklung der Somatischen Zellzahl (log SCC/ml) nach konsekutiver experimenteller Infektion von Eutervierteln mit 10.000 KBE S. aureus über einen Zeit-raum von 24 Stunden

A) In die Kontrollviertel (kontralateral zum infizierten Viertel) wurde das äquivalente Volumen (2 ml) einer sterilen 0,9 %ige NaCl-Lösung infundiert. B) 24 h infizierte Viertel, C) 12h infizierte Viertel, D) 6 h infizierte Viertel.

Tier 1056 Tier 1057 Tier 1159 Tier 1160 = Infektionszeit

Zeit (h)

log

(SC

C/m

l)

A

*

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

B

*

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

D

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

C

0 6 12 18 24

4

5

6

7

8

68

Im Folgenden sollte geprüft werden, ob eine Zellzahlerhöhung erst nach einer längeren Infekti-onsdauer mit S. aureus nachweisbar wird. Hierfür wurden Euterviertel von 6 Tieren infiziert und über einen Zeitraum von 72 h beobachtet. Die Zellzahlentwicklung ließ 3 Verlaufstypen erkennen: jeweils zwei Tiere (491, 475) reagierten bereits nach 12 h mit einer signifikanten SCC-Erhöhung. Bei zwei weiteren Tieren (490, 8193), stieg die Zellzahl kontinuierlich bis 48 h post infectionem auf signifikante Werte an. Bei den anderen beiden Tieren (8448, 435) ließ sich kein signifikanter Anstieg des SCC-Wertes beobachten (siehe Abbildung 10). In den Kontrollvierteln war 12 h nach Infektion des kontralateralen Viertels im Mittel eine signifikante Zunahme der Zellzahl von 4.2 ± 0.14 log SCC/ml auf 4.9 ± 0.18 log SCC/ml (P = 0,017) zu verzeichnen.

Infektion

-300 -200 -100 0 24 48 723

4

5

6

7

8

-300 -200 -100 0 24 48 723

4

5

6

7

8

*

Zeit (h)

log

(SC

C/m

l)lo

g (S

CC

/ml)

Kontrollviertel

72 h infiziertes Viertel

Tier 490 Tier 491

Tier 475 Tier 435

Tier 8448 Tier 8193

Abbildung 10: Entwicklung der Somatischen Zellzahl (log SCC/ml) nach experimenteller Infektion mit 10.000 KBE S. aureus über einen Zeitraum von 72 Stunden

69

Vorherige Seite: In die Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen (2 ml) einer sterilen 0,9 %igen NaCl-Lösung infundiert.

Bei 4 den in Abbildung 10 gezeigten Tieren wurde 60 h nach Infektion eines Viertels ein weiteres Viertel infiziert und nach 12 weiteren Stunden beprobt. Hier zeigte sich im Mittel ein hochsigni-fikanter und bei 3 von 4 Tieren homogener Anstieg der SCC-Werte (siehe Abbildung 11). Ledig-lich Tier 475 zeigte eine schwächer ausgeprägte Reaktion. Dieses Tier zeigte jedoch im Viertel, welches vorangehend für 72 h infiziert worden war, den deutlichsten Anstieg des SCC-Wertes (vgl. Abbildung 10).

Abbildung 11: Entwicklung der Somatischen Zellzahl (log SCC/ml) nach experimenteller Infektion mit 10.000 KBE S. aureus über einen Zeitraum von 12 Stunden, 60 Stunden nach Erstinfektion

Zum Zeitpunkt 0 h waren bereits zwei Euterviertel infiziert worden. Eine weitere Infektion wurde 60 Stunden später bei einem Viertel der kontralateralen Seite durchgeführt.

4.1.3.3 Veränderungen des Differentialzellbildes im Eutersekret

Die Auswirkung einer Infektion mit unterschiedlichen Erregern auf das Differentialzellbild der Milch wurde durchflusszytometrisch analysiert (siehe 3.3.13.8). In beiden Fällen (Infektion mit E. coli oder S. aureus) stieg der Anteil neutrophiler Granulozyten in der Milch und blieb im weiteren Verlauf der Infektion erhöht (siehe Abbildung 12 D, E, F), während lymphoide Zellen und die nicht näher differenzierten Makrophagen/Epithelzellen („lar-ge cells“) in Relation auf sehr niedrigem Niveau blieben. In den Kontrollvierteln konnte ebenfalls eine Dynamik beobachtet werden: 12 h nach Infektion des kontralateralen Viertels mit E. coli nahm der Anteil der PMN zu, um sich nach insgesamt 24 h wieder der Ausgangssituation zu nähern (siehe Abbildung 12 A). Bei den über 72 h mit S. aureus-infizierten Tieren stieg ebenfalls der Anteil neutrophiler Granulozyten zunächst an, um sich dar-

Zeit (h)

log

(SC

C/m

l)

InfektionInfektionszeitpunktder kontralateralenEuterviertel

Tier 490 Tier 491

Tier 475 Tier 435

-300 -200 -100 0 24 48 723

4

5

6

7

8

70

aufhin kontinuierlich wieder dem Ausgangswert zu nähern, ohne ihn zu erreichen (siehe Abbildung 12 C).

0 24 48 720

50

100

0 12 240

50

100

0 12 240

50

100

Infiziertes ViertelA

ntei

l der

Ze

llpo

pula

tion

an

den

som

atis

chen

Milc

hzel

len

(%

)

Zeit (h)

E. coli

S. aureus(24 h)

S. aureus(72 h)

0 12 240

50

100

0 12 240

50

100

0 24 48 720

50

100

Kontrollviertel

PMN (%) lymphoide Zellen (%) large cells (%)

A D

E

F

B

C

Abbildung 12: Einfluss einer intramammären Infektion mit E. coli und S. aureus auf die Zusammensetzung des Differentialzellbildes der Milch

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der prozentualen Anteile einzelner Zellpopulationen im Viertelan-fangsgemelk experimentell infizierter Tiere: PMN = neutrophile Granulozyten; „large cells“ = morpholo-gisch als grosse Zellen zu indentifizieren, überwiegend Makrophagen und Epithelzellen. Jeweils 4 Tiere wurden über einen Zeitraum von 24 h mit 500 KBE E. coli (D) oder 10.000 KBE S. aureus (E) infiziert. Weitere 4 Tiere wurden über 72 h mit 10.000 KBE S. aureus (F) infiziert. Nicht-infizierte Kontrollviertel erhielten das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung (A, B, C).

Aus dem SCC-Wert und den relativen Anteilen zellulärer Subpopulationen wurden absolute Zah-len (pro ml Milch) für die Zelltypen errechnet. Nach Korrelationsanalysen, in denen nach der Beziehung zwischen Gesamtzellzahl und einzelnen Zellpopulationen gefragt wurde, erwies sich in allen Infektionsversuchen die Korrelation zwischen SCC-Wert und PMN-Zahl als mit R = 0,98

71

bis R = 1,00 als sehr hoch (siehe Abbildung 13). Dies galt ebenso für die Beziehungen SCC-Wert zu Makrophagen/Epithelzellen in den Infektionsversuchen mit S. aureus. Diese Korrelation war in den E. coli-Infektionsversuchen mit R= 0,8 schwächer ausgeprägt. Die Zahl der lymphoiden Zellen war generell am schwächsten positiv mit dem SCC-Wert korreliert, insbesondere nach Infektionen mit E. coli (siehe Abbildung 13).

1 10 100 1000 10000

1

10

100 R = 0,96

1 10 100 1000 10000

1

10

100 R = 0,80

R = 1,00

1 10 100 1000 10000

1

10

100

1000

10000

1 10 100 1000 10000

1

10

100

1000

10000

1 10 100 1000 10000

1

10

100

1000

10000

1 10 100 1000 10000

1

10

100

1 10 100 1000 10000

1

10

100

SCC (*1000/ml)

PMN

A

B

C

R = 0,98

P = >0,0001

P = >0,0001

P = >0,0001

P = >0,0001 P = >0,0001

P = >0,0001 P = >0,0001

R = 0,53

R = 0,79

R = 0,99

1 10 100 1000 10000

1

10

100 R = 0,79

lymphoide Zellen Makrophagen/Epithelzellen

1 10 100 1000 10000

1

10

100 R = 0,93

P = >0,0001 P = >0,0001 P = >0,0001

Abbildung 13: Korrelationen der Somatischen Zellzahl (SCC) mit der Zahl einzelner Milchzell-Populationen

In die Korrelationen gingen die Daten aller Viertelanfangsgemelke der infizierten Tiere ein. A: Tiere, die experimentell mit E. coli infiziert wurden (n = 48 Viertelanfangsgemelke). B: Tiere, die experimentell mit S. aureus über 24 h infiziert wurden (n = 48 Viertelanfangsgemelke). C: Tiere, die experimentell mit S. aureus über 72 h infiziert wurden (n = 112 Viertelanfangsgemelke). Y-Achse: PMN (*1000/ml), lymphoide Zellen (*1000/ml), Makrophagen/Epithelzellen (*1000/ml). X-Achse: SCC (*1000/ml).

Für eine 24-stündige Infektion mit E. coli war die positive Korrelation zwischen SCC und lymphoiden Zellen mit R = 0,82 deutlich höher, wenn nur SCC-Werte <100.000/ml in die Kor-

72

relation eingingen (siehe Abbildung 14 A). SCC-Werte >100.000/ml waren hingegen mit R = 0,53 schwach positiv korreliert (siehe Abbildung 14 B).

Abbildung 14: Korrelation zwischen unterschiedlich hohen SCC-Werten und der Zahl lymphoider Zellen in der Milch nach experimentell induzierter Mastitis mit E. coli

In die Korrelationen gingen die Daten aller Viertelanfangsgemelke der experimentell mit E. coli infizierten Tiere ein (n = 48 Viertelanfangsgemelke). Linkes Diagramm: Dargestellt sind Werte mit einem SCC<100.000/ml. Rechtes Diagramm: Dargestellt sind Werte mit einem SCC>100.000/ml.

4.1.3.4 Morphologische Veränderungen neutrophiler Granulozyten

Neben einer einheitlichen Zunahme der Anzahl und -zusammensetzung der Zellen in der Milch, konnten morphologische Alterationen der neutrophilen Granulozyten nach durchflusszytometri-scher Darstellung beobachtet werden (siehe Abbildung 15). Bei 3 von 4 Tieren, die mit E. coli infiziert wurden, konnten abnehmende Werte im Seitwärts-streulicht festgestellt werden. Betrachtet man die Viertelanfangsgemelke aus infizierten Vierteln einzelner Tiere 12 h und 24 h post infectionem, so fällt auf, dass sie sich innerhalb der Versuchs-gruppe morphologisch unterscheiden (siehe Abbildung 15). Bei Tier 1162 waren morphologische Veränderungen der PMN nach 12 und 24 h einer Infektion kaum ausgeprägt. Bei den Tieren 1054 und 1055 erfolgte die Abnahme der Komplexität nach 24-stündiger Infektion. Bei Tier 1161 trat dies in stärkerer Ausprägung bereits 12 h post infectionem auf. Die Morphologie der Zellen in den Viertelanfangsgemelken unterschied sich nicht von der der Viertelendgemelke (Daten nicht gezeigt).

1 10 100 1000 10000

1

10

100R = 0,53

1 10 100 1000 10000

1

10

100R = 0,82P = <0,0001 P = 0,0001

A (n=33) B (n=15)

lym

phoi

de Z

elle

n (*

1000

/ml)

SCC (*1000/ml)

73

Vorwärtsstreulicht

Tier 1162

0 h 12 h 24 h

Tier 1054

Tier 1055

Tier 1161

Sei

twär

tsst

reul

icht

Abbildung 15: Durchflusszytometrische Analyse morphologischer Veränderungen neutrophiler Granulozyten während des Infektionsverlaufes mit E. coli

Dargestellt als durchflusszytometrische Dichte-Diagramme sind Ereignisse aufgereinigter Milchzellen aus Viertelanfangsgemelken infizierter Euterviertel. Vier Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 500 KBE E. coli intrazisternal infiziert. Eine durchflusszytometrische Analyse der Milchzellen im Vorwärtsstreulicht (Grös-se) gegen Seitwärtsstreulicht (Komplexität) wurde unmittelbar vor der Infektion (0 h) als auch 12 h und 24 h nach der Infektion durchgeführt. Durch die Ellipsen ist der für die PMN zu erwartende Bereich ge-kennzeichnet.

Eine experimentelle Infektion von Eutervierteln mit 500 KBE E. coli führte innerhalb von 12 h zu einer massiven Zunahme neutrophiler Granulozyten in der Milch (siehe Abbildung 15 und Abbildung 16 links). Wurde ein weiteres (ipsilaterales) Euterviertel 12 h nach der ersten Infektion mit der gleichen Dosis infiziert, so blieb eine vergleichbare Reaktion aus (siehe Abbildung 16 rechts).

74

Abbildung 16: Milchdifferentialzellbilder in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Infektion

Dargestellt als durchflusszytometrische Dichte-Diagramme sind Ereignisse aufgereinigter Milchzellen aus Viertelanfangsgemelken infizierter Euterviertel von 2 Tieren. Diagramme links: Die Euterviertel wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 500 KBE E. coli intrazisternal infiziert. Diagramme rechts: Ipsilaterale Euterviertel der selben Tiere wurden zum Zeitpunkt 12 h mit 500 KBE E. coli intrazisternal infiziert. Eine durchfluss-zytometrische Analyse der Milchzellen im Vorwärtsstreulicht (Grösse) gegen Seitwärtsstreulicht (Komple-xität) wurde unmittelbar vor (0 h) als auch 12 h wie 24 h nach der ersten Infektion durchgeführt.

4.1.3.5 Zelluläre Zusammensetzung der Anfangs- und Endgemelke

Um aufzuklären, inwieweit das Differentialzellbild der Milch von der Gemelksfraktion abhängig ist, wurden neben den üblicherweise untersuchten Viertelanfangsgemelken ebenfalls die Vierte-lendgemelke untersucht. Dazu wurden 4 Gruppen gebildet: niedrigzellige und normalzellige Milch, als auch Milch mit erhöhtem Zellgehalt und sehr hohem Zellgehalt (siehe Tabelle 10 und Tabelle 11). Es konnten keine signifikanten Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen untersuchten Viertelanfangs- und –endgmelken nachgewiesen werden. Dies galt sowohl für Tiere nach experimenteller Mastitis mit E. coli, als auch mit S. aureus.

75

Tabelle 10: Zellzusammensetzung von Anfangs- und Endgemelken in Milch mit unterschiedli-chem Zellgehalt nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit E. coli

SCC (*1000/ml)

PMN (%) LYM (%) „large cells“ (%)

A E A E A E 1-50 n=28

47±20 50±25 43±21 40±23 10±7 9±5

51-100 n=3

41±20 41±17 47±14 38±12 12±6 21±21

101-500 n=5

89±4 93±2 4±3 4±2 7±2 3±1

501-9999 n=7

81±25 83±23 8±10 7±8 11±16 10±15

Mittelwerte ± s der Anteile von Zellsubpopulationen in Viertelanfangs- und -endgemelken von Tieren, die mit E. coli infiziert wurden. Die SCC-Werte wurden in 4 Klassen eingeteilt. A: Viertelanfangsgemelk, E: Viertelendgemelk. PMN = neutrophile Granulozyten; LYM = lymphoide Zellen; „large cells“ morpholo-gisch als grosse Zellen zu identifizieren (überwiegend Makrophagen und Epithelzellen).

Tabelle 11: Zellzusammensetzung von Anfangs- und Endgemelken in Milch mit unterschiedli-chem Zellgehalt nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus

SCC (*1000/ml) PMN (%) LYM (%) „large cells“ (%)

A E A E A E 1-50 n=10

53±21 51±15 37±21 42±17 9±3 7±3

51-100 n=7

73±14 69±17 17±13 26±17 9±2 6±2

101-500 n=22

83±6 85±10 9±5 11±10 9±3 5±1

501-9999 n=1

86±0 89±0 8±0 7±0 6±0 4±0

Mittelwerte ± s der Anteile von Zellsubpopulationen in Viertelanfangs- und -endgemelken von Tieren, die mit S. aureus infiziert wurden. Die SCC-Werte wurden in 4 Klassen eingeteilt. A: Viertelanfangsgemelk, E: Viertelendgemelk. PMN = neutrophile Granulozyten; LYM = lymphoide Zellen; „large cells“ morpholo-gisch als grosse Zellen zu identifizieren (überwiegend Makrophagen und Epithelzellen).

76

4.1.4 Pathologisch-anatomische und -histologische Befunde Während der Teilsektionen am Ende der Mastitismodellversuche wurden Euter und Euter- sowie Buglymphknoten der experimentell infizierten Tiere pathologisch-anatomisch untersucht und Proben zur pathologisch-histologischen Befundung gewonnen (siehe 3.3.13.10). Euterviertel, die mit E. coli über einen Zeitraum von 24 h infiziert worden waren, zeigten im Ge-gensatz zu den jeweiligen Kontrollvierteln ein mittel- bis hochgradiges Ödem des interstitiellen und subkutanen Bindegewebes, eine diffus gerötete Drüsenschnittfläche und eine deutliche Ver-größerung. Bei mit S. aureus infizierten Tieren unterschieden sich infizierte Viertel dagegen nur geringgradig vom Kontrollviertel. Sie waren leicht vergrößert und geringgradig rötlich verfärbt. Die pathologisch-histologischen Befunde des Milchdrüsengewebes wie auch von lokalen und peripheren Lymphknoten sind in Tabelle 12, 13 und 14 zusammengefasst: Besonders traten akute, eitrig-entzündliche Prozesse in den Vordergrund, die in pathogeneti-schem Zusammenhang mit der experimentellen Mastitis standen. Sie waren bei allen mit E. coli infizierten Tieren in hohem Maße in den über 24 h infizierten Eutervierteln zu finden. Teilweise konnte das Auftreten von Nekrosen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu standen die Befunde bei den Tieren, die mit S. aureus infiziert wurden: Hier waren zwar mindestens in einem der betroffenen Viertel akute, eitrig-entzündliche Prozesse zu finden, jedoch nur meist in geringradiger Ausprägung. Die meist hochgradige interstitielle Öde-matisierung der mit E. coli infizierten Viertel fehlte oder war weniger stark ausgeprägt bei den Tieren, die mit S. aureus infiziert wurden. Lymphozytär, interstitiell entzündliche Prozesse, konn-ten vor allem bei mit S. aureus infizierten Vierteln beobachtet werden. Darüber hinaus wurden chronische lymphozytär, interstitielle Veränderungen v.a. bei Tier 1055 (E. coli) in drei der vier Euterviertel nachgewiesen, die in keinem pathogenetischen Zusammenhang zur experimentellen Mastitis standen. Neben dem Milchdrüsengewebe wurden ebenfalls regionale wie periphere Lymphknoten verglei-chend untersucht. Die Euterlymphknoten (Lnn. mammarii) der länger infizierten Euterseite (24 oder 72 h) waren bei allen Tieren am stärksten durch eitrig-entzündliche Prozesse gekennzeich-net. Auch die kontralateralen Euterlymphknoten, die einer Infektion kürzer ausgesetzt waren (6 oder 12 h), zeigten akute, eitrig-entzündliche Veränderungen, wenn auch in schwächerer Ausprä-gung. Wie bereits im Drüsengewebe zu sehen, waren auch hier wieder die Veränderungen bei den Tieren, die mit E. coli infiziert worden waren, stärker ausgeprägt als bei denen, die mit S. aureus infiziert worden waren. Die Buglymphknoten (Lnn. cervicales superficiales) wiesen neben einer z.T. stark ausgeprägten Hyperplasie bis auf eine Ausnahme keine eitrigen Veränderungen auf.

Tabelle 12: Pathologisch-histologische Befunde des Eutergewebes und regionaler sowie peripherer Lymphknoten nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit E. coli über einen Zeitraum von 24 h

Eutergewebe: Euterviertel (Infektionsdauer)

Tier Akute, eitrig-entzündliche Prozesse

lymphozytär, interstitielle entzündliche Prozesse

Interstitielle Ödematisierung

1054 - - - 1055 - +* - 1161 - - -

Kontrollviertel

1162 - - -

1054 + + + - + + + 1055 + + (+) - + + 1161 + + - + (+)

24 h Infektion

1162 + + + - +

1054 - +* - 1055 - +* - 1161 + + - +

12 h Infektion

1162 - +* -

1054 - +* - 1055 - +* - 1161 - - -

6 h Infektion

1162 - - -

Lymphknoten:

Tier Follikuläre Hyperplasie

Akute eitrige Lymphadenitis

1054 + + + + + 1055 + + + + + 1161 - + + +

Euterlymphknoten (a) (Einzugsgebiet: 24 h und 12 h infiziertes Viertel) 1162 - + + +

1054 + + + + 1055 + + + 1161 + + + 1162 + +

Euterlymphknoten (b) (Einzugsgebiet: 6 h infiziertes Viertel und Kontrollviertel)

1054 + + + - 1055 + + + - 1161 + + -

Buglymphknoten (gleiche Seite wie a)

1162 + + (+) -

1054 + + - 1055 + + (+) - 1161 + + -

Buglymphknoten (gleiche Seite wie b)

1162 + + -

Aufgelistet sind die pathologisch-histologischen Befunde von 4 Tieren, die experimentell mit 500 KBE E. coli intrazisternal infiziert wurden. Die Euterviertel wurden zu 3 unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert, so dass zum Zeitpunkt der Sektion die Euterviertel 24, 12 und 6 h lang infiziert waren. In das verbleibende Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen 0,9 %iger NaCl-Lösung instilliert. Grad der Veränderung: + = geringgradig; + + = mittelgradig; + + += hochgradig. * = chronisch entzündliche Prozesse.

Tabelle 13: Pathologisch-histologische Befunde des Eutergewebes und regionaler sowie peripherer Lymphknoten nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über einen Zeitraum von 24 h

Eutergewebe: Euterviertel (Infektionsdauer)

Tier Akute, eitrig- entzündliche Prozesse

lymphozytär, interstitielle entzündliche Prozesse

Interstitielle Ödematisierung

1056 + + - 1057 - +* - 1159 - - -

Kontrollviertel

1160 - +* -

1056 + + + 1057 + +* + + 1159 + + -

24 h Infektion

1160 + - -

1056 + + (+) - 1057 - + - 1159 - + -

12 h Infektion

1160 + + -

1056 + + + - 1057 - + - 1159 + + + -

6 h Infektion

1160 - +* -

Lymphknoten:

Tier Follikuläre Hyperplasie

Akute eitrige Lymphadenitis

1056 + + (+) - 1057 + + (+) - 1159 + + -

Euterlymphknoten (a) (Einzugsgebiet: 24 h und 12 h infiziertes Viertel) 1160 + + + +

1056 + + - 1057 + + - 1159 + + (+) - 1160 + + + -

Euterlymphknoten (b) (Einzugsgebiet: 6 h infiziertes Viertel und Kontrollviertel)

1056 + (+) - 1057 + + - 1159 + + -

Buglymphknoten (gleiche Seite wie a)

1160 + + (+) -

1056 + + + - 1057 + + - 1159 + + -

Buglymphknoten (gleiche Seite wie b)

1160 + + -

Aufgelistet sind die pathologisch-histologischen Befunde von 4 Tieren, die experimentell mit 10.000 KBE S. aureus intrazisternal infiziert wurden. Die Euterviertel wur-den zu 3 unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert, so dass zum Zeitpunkt der Sektion die Euterviertel 24, 12 und 6 h lang infiziert waren. In das verbleibende Kontroll-viertel wurde das äquivalente Volumen 0,9 %iger NaCl-Lösung instilliert. Grad der Veränderung: + = geringgradig; + + = mittelgradig; + + += hochgradig. * = chro-nisch entzündliche Prozesse.

Tabelle 14: Pathologisch-histologische Befunde des Eutergewebes und regionaler wie peripherer Lymphknoten nach experimenteller Infektion von Eu-tervierteln mit S. aureus über einen Zeitraum von 72 h

Aufgelistet sind die pathologisch-histologischen Befunde von 4 Tieren die experimentell mit 10.000 KBE S. aureus intrazisternal infiziert wurden. Die Euterviertel wur-den zu 2 unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert, so dass zum Zeitpunkt der Sektion zwei Euterviertel 72 und eins 12 h lang infiziert waren. In das verbleibende Kon-trollviertel wurde das äquivalente Volumen 0,9 %iger NaCl-Lösung instilliert. Grade der Veränderungen: + = geringgradig; + + = mittelgradig; + + + = hochgradig).

Eutergewebe: Euterviertel (Infektionsdauer)

Tier Akute, eitrig- entzündliche Prozesse

lymphozytär, interstitielle entzündliche Prozesse

Interstitielle Ödematisierung

490 - + - 491 - + - 435 - + -

Kontrollviertel

475 - - -

490 + (+) + + 491 - + - 435 - + -

72 h Infektion (vorderes Euterviertel)

475 + - -

490 + (+) + - 491 + - - 435 + - -

72 h Infektion (hinteres Euterviertel)

475 + - -

490 + + + + - 491 + (+) - - 435 + - -

12 h Infektion

475 - + -

Lymphknoten:

Tier Follikuläre Hyperplasie

Akute eitrige Lymphadenitis

490 + + + 491 + + + 435 + + (+) +

Euterlymphknoten (a) (Einzugsgebiet: beide 72 h infizierten Viertel) 475 + + + -

490 + + - 491 + + + 435 + + + 475 + + -

Euterlymphknoten (b) (Einzugsgebiet: 12 h infiziertes Viertel und Kontrollviertel)

490 + + - 491 + + + 435 + + + -

Buglymphknoten (gleiche Seite wie a)

475 + + -

490 + + - 491 + - 435 + + + -

Buglymphknoten (gleiche Seite wie b)

475 + + -

80

4.1.5 Toll-like-Rezeptor- und Defensingenexpression Im Rahmen des Mastitismodells sollte mittels quantitativer PCR untersucht werden, inwieweit ausgesuchte bovine TLRs im Eutergewebe exprimiert werden und inwiefern eine infektionsab-hängige Modulation ihrer Expression stattfindet. Repräsentativ für Effektormoleküle der angebo-renen Immunität wurde die Expression von β-Defensinen untersucht.

4.1.5.1 Milchdrüsengewebe

Toll-like-Rezeptoren

Milchdrüsengewebe wurde, wie unter 3.3.13.10 beschrieben, gewonnen und aufgearbeitet. Bei allen drei Versuchsgruppen (E. coli 24 h, S. aureus 24 h, S. aureus 72 h) wurden TLR-2, -3, -4 und –6 untersucht. Grundsätzlich konnte die Expression aller 4 TLRs in allen untersuchten Eutervierteln nachgwie-sen werden. Eine signifikante Hochregulation ihrer Expression konnte für TLR-2 und –4 nach einer 24-stündigen Infektion mit E. coli gezeigt werden (siehe Abbildung 17). Ein scheinbar schwaches Heraufregulieren von TLR-2 bereits nach 12 h als auch von TLR-6 nach 24 h war nicht statistisch zu sichern. Bei der TLR-3-Expression konnte keine Expressionsmodulation fest-gestellt werden. Tiere, die mit S. aureus über einen Zeitraum von 6 bis 24 h infiziert worden waren, zeigten keine Expressionsänderung der untersuchten TLRs (siehe Abbildung 18). Auch bei einer 72-stündigen Infektion, die in allen Fällen zu einer klinischen Mastitis geführt hatte, konnte keine Modulation der TLR-Expression beobachtet werden (siehe Abbildung 19). In keinem Fall führte die experimentelle Infektion zu einer statistisch signifikanten TLR-Expressionsverminderung im Vergleich zum Kontrollviertel.

81

0

4

8

TLR 6

0

4

8

TLR 3

fold

indu

ctio

n

Euterviertel

vorne links(Kontrolle)

vorne rechts(24 h Infektion)

hinten rechts(12 h Infektion)

hinten links(6 h Infektion)

0

4

8

TLR 2

*

0

4

8

TLR 4

**

Abbildung 17: Expression von TLRs im Milchdrüsengewebe nach experimenteller Infek-tion von Eutervierteln mit E. coli über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von TLRs im Milchdrüsengewebe bezogen auf das Kontrollviertel (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experi-mentell mit 500 KBE E. coli zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema). In das Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung zeitgleich mit der ersten Infektionsdosis infundiert. Die Bestimmung der TLR-Expression erfolgte mittels quantitativer PCR.* = P<0,05; ** = P<0,01

82

fold

indu

ctio

n

0

4

8

TLR 2

0

4

8

TLR 30

4

8

TLR 4

0

4

8

TLR 6

Euterviertel

vorne links(Kontrolle)

vorne rechts(24 h Infektion)

hinten rechts(12 h Infektion)

hinten links(6 h Infektion)

Abbildung 18: Expression von TLRs im Milchdrüsengewebe nach experimenteller Infek-tion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM einer Expressioninduktion von TLRs im Milchdrüsengewebe bezogen auf das Kontrollviertel (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Eutervier-tel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema). In das Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung zeitgleich mit der ersten Infektionsdosis infundiert. Die Bestimmung der TLR-Expression erfolgte mittels quantita-tiver PCR.

83

fold

indu

ctio

n

Euterviertel

vorne links(Kontrolle)

vorne rechts(72 h Infektion)

hinten rechts(72 h Infektion)

hinten links(12 h Infektion)

0

4

8

TLR 2

0

4

8

TLR 30

4

8

TLR 4

0

4

8

TLR 6

Abbildung 19: Expression von TLRs im Milchdrüsengewebe nach experimenteller Infek-tion von Eutervierteln mit S. aureus über 72 h

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM einer Expressioninduktion von TLRs im Milchdrüsengewebe bezogen auf das Kontrollviertel (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Eutervier-tel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema). In das Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung zeitgleich mit der ersten Infektionsdosis infundiert. Die Bestimmung der TLR-Expression erfolgte mittels quantita-tiver PCR.

84

β-Defensine

Hinsichtlich der Defensingenexpression wurde im einzelnen das β-Defensin 5 (BNBD5) unter-sucht. Im Weiteren wurde die Expression summarisch mit einem universellen Primer (uDef) für LAP (lingual antimicrobial peptide, β-Defensin), EBD (enteric beta-Defensin), BNBD5, BNBD4, als auch ein BNBD5- und LAP-artiges Protein untersucht. Eine signifikante Expressionssteigerung konnte für BNBD5 bei Eutervierteln gezeigt werden, die 24 h zuvor mit E. coli infiziert worden waren. Das Phänomen deutete sich für uDef ebenfalls an. Die Unterschiede waren dort jedoch statistisch nicht signifikant (siehe Abbildung 20). Bei mit S. aureus über 24 h infizierten Eutervierteln war keine statistisch sicherbare Modulation der unter-suchten Defensine nachweisbar (siehe Abbildung 21 und Abbildung 22). Allerdings zeigten sich bei den Infektionsversuchen über 72 h statistisch nicht signifikante Expressionssteigerungen so-wohl bei BNBD5 als auch bei uDef (siehe Abbildung 22).

fold

indu

ctio

n

0

5

400

800

BNBD50

5

400

800

uDef

*

Euterviertel

vorne links(Kontrolle)

vorne rechts(24 h Infektion)

hinten rechts(12 h Infektion)

hinten links(6 h Infektion)

Abbildung 20: Defensingenexpression nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit E.coli über 24 h

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM einer Expressioninduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) als auch universellem Defensin (uDef) im Milchdrüsengewebe bezogen auf das Kontrollviertel (= 1). Als Proban-den standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 500 KBE E. coli zu unter-schiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema). In das Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung zeitgleich mit der ersten Infektionsdosis infundiert. Die Bestim-mung der Defensingenexpression erfolgte mittels quantitativer PCR.* = P<0,05

85

fold

indu

ctio

n

0

5

10

15

20

BNBD50

5

10

15

20

uDefEuterviertel

vorne links(Kontrolle)

vorne rechts(24 h Infektion)

hinten rechts(12 h Infektion)

hinten links(6 h Infektion)

Abbildung 21: Defensingenexpression nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM einer Expressioninduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) als auch universellem Defensin (uDef) im Milchdrüsengewebe bezogen auf das Kontrollviertel (= 1). Als Proban-den standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu un-terschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema). In das Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung zeitgleich mit der ersten Infektionsdosis infundiert. Die Bestim-mung der Defesingenexpression erfolgte mittels quantitativer PCR.

86

fold

indu

ctio

n

0

5

10

15

20

uDef0

5

10

15

20

BNBD5

Euterviertel

vorne links(Kontrolle)

vorne rechts(72 h Infektion)

hinten rechts(72 h Infektion)

hinten links(12 h Infektion)

Abbildung 22: Defensingenexpression nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 72 h

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM einer Expressioninduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) als auch universellem Defensin (uDef) im Milchdrüsengewebe bezogen auf das Kontrollviertel (= 1). Als Proban-den standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu un-terschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema). In das Kontrollviertel wurde das äquivalente Volumen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung zeitgleich mit der ersten Infektionsdosis infundiert. Die Bestim-mung der Defesingenexpression erfolgte mittels quantitativer PCR.

87

4.1.5.2 Lymphknoten

Toll-like-Rezeptoren

Zur Untersuchung der lokalen Begrenzung oder systemischen Ausbreitung der entzündlichen Reaktionen infolge der lokalen mammären Infektion wurden auch die Expressionsmuster von TLRs und Defensinen in jeweils beiden Euter- und Buglymphknoten analysiert. Der kontralateral zum primär infizierten Euterviertel (immer rechte Seite) gelegene linke Buglymphknoten diente als Bezugsgröße. Der jeweils rechte Euterlymphknoten assoziierte dabei in allen Experimenten mit den länger infi-zierten Vierteln (24 h-Versuche: 12 und 24 h Infektionszeit; 72 h-Versuche: 2 mal 72 h Infekti-onszeit). Der linke Euterlymphknoten war dagegen mit den kürzer infizierten (6 h bzw. 12 h) und dem Kontrollviertel assoziiert. Nach intramammärer Infektion mit E. coli war eine signifikante Expressionssteigerung von TLR-2 und TLR-4 im rechten Euterlymphknoten nachweisbar (siehe Abbildung 23). Auch im kontra-lateralen Euterlymphknoten kam es zu einer geringgradigen Expressionssteigerung von TLR-2 und –4, die jedoch statistisch nicht zu sichern war. Entsprechende Effekte waren bei der Unter-suchung der Buglymphknoten nicht nachweisbar. Die Expression von TLR-3, -6 und –9 blieb in allen untersuchten Lymphknoten auf Basalniveau. Nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h oder 72 h liess sich kei-nerlei Expressionsmodulierung der untersuchten TLRs (-2, -3, -4, -6, -9) in Euter- oder Bug-lymphknoten nachweisen (siehe Abbildung 24 und Abbildung 25).

88

fold

indu

ctio

n

RechtsLinks

BuglymphknotenBuglymphknoten

EuterlymphknotenEuterlymphknoten

0

10

20

TLR 60

10

20

TLR 2

0

10

20

TLR 30

10

20

TLR 4

0

10

20

TLR 9

*

*

Abbildung 23: TLR-Expression in Euter- und Buglymphknoten nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit E. coli über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von TLRs in Euter- und Buglymphknoten bezogen auf den linken Buglymphknoten (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 500 KBE E. coli zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema Abbildung 17). Die Bestimmung der TLR-Expression erfolgte mittels quantitativer PCR. * = P<0,05

89

0

10

20

TLR 9

fold

indu

ctio

n

0

10

20

TLR 3

0

10

20

TLR 60

10

20

TLR 2

0

10

20

TLR 4

RechtsLinks

BuglymphknotenBuglymphknoten

EuterlymphknotenEuterlymphknoten

Abbildung 24: TLR-Expression in Euter- und Buglymphknoten nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von TLRs in Euter- und Buglymphknoten bezogen auf den linken Buglymphknoten (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema Abbildung 18). Die Bestimmung der TLR-Expression erfolgte mittels quantitativer PCR.

90

fold

indu

ctio

n

0

10

20

TLR 2

0

10

20

TLR 30

10

20

TLR 4

0

10

20

TLR 6

0

10

20

TLR 9

RechtsLinks

BuglymphknotenBuglymphknoten

EuterlymphknotenEuterlymphknoten

Abbildung 25: TLR-Expression in Euter- und Buglymphknoten nach experimenteller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 72 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressiosinduktion von TLRs in Euter- und Buglymphknoten bezogen auf den linken Buglymphknoten (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema Abbildung 19). Die Bestimmung der TLR-Expression erfolgte mittels quantitativer PCR.

91

β-Defensine

Hinsichtlich der β-Defensine, war bei den mit E. coli infizierten Eutervierteln im rechten Euter-lymphknoten der 12 und 24 h infizierten Euterviertel eine signifikante Expressionssteigerung von BNBD5 wie auch uDef nachweisbar (siehe Abbildung 26). Wie bei TLR-2 und –4 (siehe Abbildung 23) deutet sich eine kontinuierliche Zunahme der Expression mit Zunahme der Infek-tionsdauer an. Dieser Effekt war statistisch jedoch nicht zu sichern. Bei den Infektionsversuchen mit S. aureus über 24 h waren keine statistisch sicherbaren Expressi-onmodulationen darstellbar. Allerdings deuten sich hier Expressionssteigerungen von BNBD5 und uDef in beiden Euterlymphknoten an (siehe Abbildung 27) Bei den Infektionsversuchen von Eutervierteln mit S. aureus über 72 h waren signifikante Expres-sionssteigerungen für uDef in den Gewebeproben beider Euterlymphknoten festzustellen (siehe Abbildung 28). Die rechten Buglymphknoten zeigten in allen Experimenten keine deutlichen Expressionsunter-schiede im Vergleich zur Kontrolle (linker Buglymphknoten; siehe Abbildung 26-28)

fold

indu

ctio

n

0

10

20

30

40

uDef0

10

20

30

40

BNBD5

RechtsLinks

BuglymphknotenBuglymphknoten

EuterlymphknotenEuterlymphknoten

*

*

Abbildung 26: Defensingenexpression in Euter- und Buglymphknoten nach experimen-teller Infektion von Eutervierteln mit E. coli über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) und universel-lem Defensin (uDef) in Euter- und Buglymphknoten bezogen auf den linken Buglymphknoten (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 500 KBE E. coli zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema Abbildung 20). Die Bestimmung der De-fensingenexpression erfolgte mittels quantitativer PCR. * = P<0,05

92

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

BNBD50

1

2

3

uDef

RechtsLinks

BuglymphknotenBuglymphknoten

EuterlymphknotenEuterlymphknoten

Abbildung 27: Defensingenexpression in Euter- und Buglymphknoten nach experimen-teller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) und universel-lem Defensin (uDef) in Euter- und Buglymphknoten bezogen auf den linken Buglymphknoten (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema Abbildung 21). Die Bestimmung der Defensingenexpression erfolgte mittels quantitativer PCR.

93

fold

indu

ctio

n

0

1

2

3

BNBD50

1

2

3

uDef

RechtsLinks

BuglymphknotenBuglymphknoten

EuterlymphknotenEuterlymphknoten

*

*

Abbildung 28: Defensingenexpression in Euter- und Buglymphknoten nach experimen-teller Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 72 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) und universel-lem Defensin (uDef) in Euter- und Buglymphknoten bezogen auf den linken Buglymphknoten (= 1). Als Probanden standen vier Tiere zur Verfügung, deren Euterviertel experimentell mit 10.000 KBE S. aureus zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert wurden (siehe Schema Abbildung 22). Die Bestimmung der Defensingenexpression erfolgte mittels quantitativer PCR. * = P<0,05

4.1.5.3 Somatische Zellen der Milch

Im Folgenden sollte untersucht werden, inwieweit TLRs und β-Defensine durch somatische Zel-len der Milch exprimiert werden und welchen Einfluss eine experimentell induzierte Mastitis auf die Expression besitzt. Somatische Zellen der Milch wurden, wie unter 3.3.13.8 beschrieben, ge-wonnen und aufgearbeitet.

Toll-like-Rezeptoren

In Abbildung 29 und 30 sind die Resultate der TLR-Analysen dargestellt. In den Milchproben der E. coli-infizierten Versuchsgruppe zeigte sich eine stärkere Modulation der TLR-Expression in somatischen Zellen der Milch als in der S. aureus-Versuchsgruppe. Wie bereits im Milchdrüsen- und Lymphknotengewebe beobachtet (siehe Abbildung 17 und 23), wurden nach intramammärer Infektion mit E. coli auch bei den somatischen Zellen der Milch vor allem TLR-2 und TLR-4 heraufreguliert. Statistisch signifikante Veränderungen waren 12 h nach Infektion nachweisbar (siehe Tabelle 15). TLR-6 verbleibt bei 3 von 4 Tieren auf Basalniveau, und TLR-9 zeigt bei 3 von 4 Tieren einen nicht signifikanten Expressionsanstieg (siehe Abbildung 29). In den Kontrollvierteln der Tiere 1054 und 1162 ist keinerlei Modulation der TLR-Expression sichtbar. Bei Tier 1055 (TLR-2, -4 und -9), aber auch bei Tier 1161 (TLR-6)

94

kommt es im Kontrollviertel zu Expressionserhöhungen im Verlauf des E. coli- Infektionsexpe-rimentes über 24 h.

Tabelle 15: Induktion der Expression von TLR-2 und -4 in somatischen Zellen der Milch 12 h nach Infektion mit E. coli

Infektionsbeginn (T0) 12 h Infektion (T12) TLR-2 1,0 52,50 P = <0,05 TLR-4 1,0 131,25 P = <0,05

Dargestellt sind die Medianwerte einer Expressionsinduktion für TLR-2 und -4 in somatischen Zellen der Milch unmittelbar vor Infektionsbeginn (T0 = 1) und 12 h später (T12). Vier Tiere wurden zum Zeitpunkt T0 mit 500 KBE E.coli in einem Euterviertel infiziert. Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergeb-nisse resultieren aus einem Einsatz von 100 ng RNA.

Tier 1054

Zeit (h)

log

indu

ctio

nfo

ld

Tier 1055 Tier 1161 Tier 1162

TLR 2 TLR 4 TLR 6 TLR 9

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

A

B

Abbildung 29: TLR-Expression in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer expe-rimentellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli über 24 h

Dargestellt ist die logarithmische Expressionsinduktion von TLR-2, -4, -6 und -9 in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer experimentellen Infektion mit E. coli bei vier Tieren. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 500 KBE E.coli in einem Euterviertel infiziert (A). Als Kontrolle wurde das äquivalente Volumen sterile 0,9 %ige NaCl-Lösung in das kontralaterale Euterviertel infundiert (B). Die dargestellte Induktion zeigt die Ergebnisse von Einzeltieren und bezieht sich auf den Zeitpunkt 0 h (=1). Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergebnisse resultieren aus einem Einsatz von 100 ng RNA.

95

Bei den mit S. aureus infizierten Tiere wiesen die somatischen Zellen der Milch keine Unterschie-de zwischen infizierten Vierteln und Kontrollvierteln bezüglich ihrer TLR-Expression auf. Ledig-lich die somatischen Milchzellen von Tier 1057 zeigten in dem über 24 h infizierten Viertel und im Kontrollviertel eine leichte Heraufregulation von TLR-2, -4 und –9, jedoch nicht von TLR-6. Bei Tier 1159 konnte eine verringerte Expression der untersuchten Faktoren 24 h nach Infekti-onsbeginn beobachtet werden.

Tier 1056

Zeit (h)

log

indu

ctio

nfo

ld

Tier 1057 Tier 1159 Tier 1160

TLR 2 TLR 4 TLR 6 TLR 9

A

B

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

0 12 24

0

2

4

6

Abbildung 30: TLR-Expression in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer expe-rimentellen Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h

Dargestellt ist die logarithmische Expressionsinduktion von TLR-2, -4, -6 und -9 in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer experimentellen Infektion mit S. aureus bei vier Tieren. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 10.000 KBE S. aureus in einem Euterviertel infiziert (A). Als Kontrolle wurde das äqui-valente Volumen sterile 0,9 %ige NaCl-Lösung in das kontralaterale Euterviertel infundiert (B). Die darge-stellte Induktion zeigt die Ergebnisse von Einzeltieren und bezieht sich auf den Zeitpunkt 0 h (=1). Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergebnisse resultieren aus einem Einsatz von 100 ng RNA.

β-Defensine

Die Defensingenexpression war in den somatischen Zellen der Milch nach E. coli-Infektion indi-viduell sehr unterschiedlich. Ähnlich der TLR-Expression zeigte sich bei Tier 1054 die stärkste Induktion in den Zellen aus dem mit E. coli infizierten Viertel. Bei Tier 1055 hingegen wurden im Kontrollviertel wiederum höhere Werte erzielt als im infizierten Viertel (siehe Abbildung 31). Bei den Tieren, die mit S. aureus infiziert wurden, war keine deutliche Modulation der β-Defensingenexpression zu beobachten (siehe Abbildung 32).

96

Tier 1054

Zeit (h)

log

indu

ctio

nfo

ldTier 1055 Tier 1161 Tier 1162

BNBD5 uDef

A

B

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

Abbildung 31: Defensingenexpression in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer experimentellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli über 24 h

Dargestellt ist die logarithmische Expressionsinduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) und universellem Defensin (uDef) in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer experimentellen Infektion mit E. coli bei vier Tieren. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 500 KBE E. coli in einem Euterviertel infiziert (A). Als Kontrolle wurde das äquivalente Volumen sterile 0,9 %ige NaCl-Lösung in das kontralaterale Euterviertel infundiert (B). Die dargestellte Induktion zeigt die Ergebnisse von Einzeltieren und bezieht sich auf den Zeitpunkt 0 h (=1). Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergebnisse resultieren aus einem Einsatz von 100 ng RNA.

97

Tier 1056

Zeit (h)

log

indu

ctio

nfo

ldTier 1057 Tier 1159 Tier 1160

BNBD5 uDef

A

B

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

0 12 24-6

-3

0

3

6

Abbildung 32: Defensingenexpression in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer experimentellen Infektion von Eutervierteln mit S. aureus über 24 h

Dargestellt ist die logarithmische Expressionsinduktion von β-Defensin 5 (BNBD5) und universellem Defensin (uDef) in somatischen Zellen der Milch im Verlauf einer experimentellen Infektion mit S. aureus bei vier Tieren. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 10.000 KBE S. aureus in einem Euterviertel infi-ziert (A). Als Kontrolle wurde das äquivalente Volumen sterile 0,9 %ige NaCl-Lösung in das kontralaterale Euterviertel infundiert (B). Die dargestellte Induktion zeigt die Ergebnisse von Einzeltieren und bezieht sich auf den Zeitpunkt 0 h (=1). Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergebnisse resultieren aus einem Einsatz von 100 ng RNA.

98

4.1.5.4 Leukozyten und Thrombozyten des Blutes

Wie unter 4.1.1.4 beschrieben, änderten sich im Verlauf einer experimentellen Euterinfektion die absoluten und relativen Zahlen der Leukozyten im Blut. Im Folgenden war zu prüfen, ob es durch die mammäre experimentelle Infektion zu Effekten auf die TLR- und Defensingenexpres-sion in Zellen des Blutes kommt. Entsprechende Untersuchungen wurden bei den über 24 h dauernden Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus an Zellsuspensionen durchgeführt, die aus Vollblut mittels PAXgene®-Vacutainern gewonnen worden waren (siehe 3.3.1).

Toll-like Rezeptoren

Eine E. coli-Infektion führte zu einer nichtsignifikanten Heraufregulation der Expression von TLR-2 und –4 in den Zellen mit Maximalwerten 12 und 18 h post infectionem (siehe Abbildung 33). Interessanterweise verringerte sich die Expression der beiden TLRs 24 h nach Infektionsbeginn wieder. Anders verhielt es sich bei TLR-6 und –9, die 12 und 18 h post infectionem keine Modulati-onen zeigten, für die jedoch 24 h post infectionem eine schwache, nichtsignifikante Hochregulation sichtbar wurde. Bei TLR-3 wurden keine deutlichen Modulationseffekte durch eine mammäre Infektion mit E. coli beobachtet. Eine experimentelle Euterinfektion mit S. aureus über 24 h führte in keinem Fall zu einer deutlichen Expressionsmodulation von TLR-2, -3, -4, -6 oder –9 (siehe Abbildung 33).

99

Abbildung 33: TLR-Expression in Blutzellen im Verlauf einer experimentellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli und S. aureus über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von TLR 2, -3, -4, -6 und -9 in Blutzellen im Verlauf einer experimentellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli und S. aureus bei jeweils vier Tie-ren. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 500 KBE E.coli oder 10.000 KBE S. aureus in einem Euter-viertel infiziert. Als Kontrolle wurde das äquivalente Volumen sterile 0,9 %ige NaCl-Lösung in das kontra-

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

12

16

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

0 12 240

4

8

fold

indu

ctio

n

Zeit (h)

E. coli

TLR 2

TLR 4

TLR 6

TLR 3

TLR 9

S. aureus

Zeit (h)

100

laterale Euterviertel infundiert. Die dargestellte Induktion bezieht sich auf den Zeitpunkt 0 h (=1). Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergebnisse resultieren aus einem Einsatz von 50 ng RNA.

β-Defensine

Während einer experimentell induzierten E. coli-Mastitis stiegen die Werte für die Expression von BNBD5 in Blutzellen innerhalb von 24 h post infectionem signifikant an (siehe Abbildung 34). Auch die Werte für uDef stiegen an, jedoch waren die Unterschiede statistisch nicht signifikant. Eine experimentelle Euterinfektion mit S. aureus über 24 h führte in keinem Fall zu einer signifikanten Expressionsmodulation von BNBD5 und uDef (siehe Abbildung 34).

fold

indu

ctio

n

Zeit (h)

E. coli

BNBD5

uDef

S. aureus

Zeit (h)

0 12 24

0

12

24*

0 12 24

0

12

24

0 12 24

0

12

24

0 12 240

12

24

Abbildung 34: Defensingenexpression in Blutzellen im Verlauf einer experimentellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli und S. aureus über 24 h

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM der Expressionsinduktion von BNBD5 und universellem Defensin (uDdef) in Blutzellen im Verlauf einer experimentellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli und S. aureus bei jeweils vier Tieren. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 500 KBE E.coli oder 10.000 KBE S. au-reus in einem Euterviertel infiziert. Als Kontrolle wurde das äquivalente Volumen sterile 0,9 %ige NaCl-Lösung in das kontralaterale Euterviertel infundiert. Die dargestellte Induktion bezieht sich auf den Zeit-punkt 0 h (=1). Die mittels quantitativer PCR gemessenen Ergebnisse resultieren aus einem Einsatz von 50 ng RNA. * = P<0,05

101

4.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf das Makrophagen- und MNC-vermittelte Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro

Im folgenden Teil wurde geprüft, ob Progesteron und Östradiol-17β das Reaktionsverhalten von MNC und in-vitro-generierten Makrophagen (MdM) nach Stimulation durch TLR-Liganden ver-ändern. Als Spendertiere zur Gewinnung der Blutzellen standen hierfür ovarektomierte Tiere zur Verfügung, deren Zellen somit weitestgehend von weiblichen Sexualhormonen unbeeinflusst waren. Als ein funktionelles Testsystem wurde das bereits beschriebene akzelerierte Absterben autologer neutrophiler Granulozyten nach PAMP-vermittelter Stimulation der MNC oder MdM gewählt (siehe auch 3.3.14.5).

4.2.1 Voruntersuchungen

4.2.1.1 Untersuchungen zum Vorkommen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren in bovinen Leukozyten

Im Folgenden sollte geprüft werden, ob die während der in-vitro-Versuche eingesetzten bovinen Leukozyten spezifische Rezeptoren für Progesteron und Östrogene besitzen. Das gewählte Verfahren des immunhistologischen Nachweises (siehe 3.3.14.1) birgt den Vorteil einer eindeutigen topographischen Charakterisierung der rezeptortragenden Zellpopulation. In allen hier untersuchten bovinen Leukozyten konnte durch spezifische Anfärbung des Zellkerns sowohl der Progesteronrezeptor als auch der Östrogenrezeptor-β nachgewiesen werden (siehe Abbildung 35).

102

Kontrolle positivKontrolle positiv

MdM

MNC

PMN

Positiv-Kontrolle

Monozyten

Östrogenrezeptor-β Progesteronrezeptor

Abbildung 35: Immunhistologischer Nachweis von Östrogenrezeptor-β und Progesteron-rezeptor in verschiedenen Präparationen boviner Leukozyten

103

Vorherige Seite: Alle Zellpräparationen (bis auf die Positiv-Kontrolle) entstammten ovarektomierten Spendertieren. Monozyten, PMN und MNC wurden unmittelbar nach ihrer Gewinnung fixiert. MdM reiften aus MNC über 7 Tage in steroidhormonfreiem Medium. Als Positiv-Kontrolle wurde endometria-les Stroma-Gewebe eingesetzt. Zellkerne der Leukozyten und Stromazellen sind positiv angefärbt (rot-braun). In der Negativ-Kontrolle (irrelevanter Primärantikörper) erscheinen sie blau. Die Durchführung immunhistologischer Verfahren erfolgte freundlicherweise durch PD Dr. Gerhard Schuler, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gies-sen.

4.2.1.2 Östrogen- und Progesteronkonzentrationen in verwendeten Medien und Zusät-zen und im Blutplasma der Spendertiere

Um die Versuchsbedingungen bestmöglich zu standardisieren, wurden ovarektomierte Spender-tiere ohne relevante Mengen an Progesteron oder Östrogenen im Blutplasma zur Blutzell-Gewinnung eingesetzt. Die im fetalen Kälberserum verwendeter Kulturmedien enthaltene Ge-samtöstrogen-Konzentration (1467,4 pg/ml) konnte durch das unter 3.2.7.1 beschriebene Kohle-Extraktionsverfahren um den Faktor 1000 verringert werden (siehe Tabelle 16).

Tabelle 16: Progesteron- und Östrogengehalte im Zellkulturmedium, im fetalen Kälberserum und im Blutplasma adulter Spendertiere

Quelle Progesteron (nmol/l) Gesamtöstrogene (pg/ml) FCS1 (hitzeinaktiviert) 0,64 1467,4 FCS (hitzeinaktiviert und steroidextrahiert2) 0,19 1,3 Iscové-Medium3 0,19 4,5 Blutplasma 1 (ovarektomiert) 0,83 6,2 Blutplasma 2 (ovarektomiert) 0,80 8,1 Blutplasma 3 (ovarektomiert) 0,70 7,4

1 FCS: fetal calf serum; 2 Kohle-Extraktionsverfahren, siehe 3.2.7.1; 3 Kulturmedium, siehe 3.2.7.1.1.

4.2.2 Einfluss verschiedener Konzentrationen von Progesteron und Östradiol-17-β auf die Absterberate der PMN nach Stimulation der Gesamtleukozyten mit PAMPs in vitro

Um konzentrationsabhängige Effekte von Progesteron und Östradiol-17β auf bovine Leukozyten zu untersuchen, wurden die Zellen nach Zusatz von Hormonen (Progesteron: 0-12500 nmol/l; Östradiol-17β: 0 – 5000 nmol/l) mit PAMPs stimuliert. Sowohl Progesteron, als auch Östradiol-17β führten zu einer dosisabhängigen Hemmung des CpG-induzierten, beschleunigten Sterbens neutrophiler Granulozyten (siehe Abbildung 36).

104

Progesteron(nmol/l)

01,2

512

512

500

100

0

100

0

100

0

0

100vi

tale

PM

N (%

)

Östradiol-17(nmol/l)

β

0 0,5 5050

00

0

100

0

100

0

100

0

100

Medium

LPS

CpG

LPS+

CpG

* ***

Abbildung 36: Einfluss von Progesteron und Östradiol-17β auf die Absterberate der PMN nach Stimulation von Blut-Leukozyten mit PAMPs in vitro

Leukozyten (2 x 105) wurden mit LPS (1 µg/ml), CpG (2,5 µg/ml) oder der Kombination aus beiden in vitro für 24 h stimuliert. Die Zahl vitaler PMN wurde durchflusszytometrisch ermittelt. PMN-Zahlen in den hormonfreien, unstimulierten Medium-Kontrollen wurden gleich 100% gesetzt und die PMN-Zahlen aller anderen Ansätze darauf prozentual bezogen. Zahl der Ansätze jeweils n=6. * = P<0,05; *** = P<0,001.

4.2.3 MNC-vermittelte Effekte auf die Vitalität autologer PMN und deren Beein-flussung durch Progesteron und Östradiol-17β

Die Versuche mit Leukozyten berücksichtigten noch nicht, dass neutrophile Granuloyzten in vivo während einer Transmigration mit residenten Makrophagen oder mononukleären Zellen in Kontakt treten. Daher wurden nachfolgende, definierte Kokulturexperimente zwischen MNC und PMN oder MdM und PMN mit hochaufgereinigten PMN nach einer In-vitro-Transmigration (siehe 3.3.5.2) durchgeführt.

105

Über das Verfahren der In-vitro-Transmigration konnten hochsignifikant reinere Granulozyten-populationen als nach Dichtegradientenzentrifugation gewonnen werden (siehe Tabelle 17).

Tabelle 17: Einfluss unterschiedlicher Separationsverfahren auf den Reinheitsgrad boviner PMN

Dichtegradient-separierte PMN Transmigrierte PMN Reinheit (%) 91,3±5,1 98,3±1,1 n 7 18

P<0,001

Angeführt sind die Mittelwerte ± s der durchflusszytometrisch ermittelten Reinheitsgrade (%) separierter PMN. Als Separationsverfahren wurde die Dichtegradientenzentrifugation mittels 70 %igen, isotonen Percolls® (siehe 3.3.5.1) und ein Transmigrationsverfahren (siehe 3.3.5.2) mit rhIL-8 eingesetzt.

Um zu überprüfen, ob Hormone Einfluss auf die konstitutive Absterberate unstimulierter PMN nehmen, wurden Dichtegradient-separierte und mittels Transmigrationskammer gewonnene PMN über 24 h in hormonfreiem Milieu, als auch unter 25 nmol/l Progesteron oder 10 nmol/l Östradiol-17β kultiviert. Die Zahl der PMN, die nach 24 h in hormonfreiem Medium noch vital blieben, wurde gleich 100 % gesetzt. Wurden dem Medium Östradiol-17β zugesetzt, so sank der Anteil vitaler PMN bei den Dichtegradient-separierten Zellen, nicht jedoch bei den transmigrier-ten Zellen (siehe Abbildung 37). Ein vergleichbarer Effekt war bei Progesteron nicht zu beobach-ten.

50

100

Transmigrierte

PMN

Dichtegradient-se

parierte PMN

*

50

100

Transmigrie

rte PMN

Dichtegradient-se

parierte PMN

rela

tive

Vita

litt (

%)

ä

Progesteron Östradiol-17β Abbildung 37: Einfluss des Separationsverfahrens auf die Vitalität boviner PMN nach 24-stündiger Kultivierung mit Progsteron und Östradiol-17β

Dargestellt ist der prozentuale Anteil vitaler PMN nach 24-stündiger Kultivierung unter 25 nmol/l Pro-gesteron und 10 nmol/l Östradiol-17β. Der hormonfreie Parallelansatz wurde gleich 100 % gesetzt. Un-tersucht wurden PMN, die mittels zweier verschiedener Separationverfahren gewonnen wurden: Trans-migrierte PMN (n = 18) und über Percoll®-Dichtegradient gewonnene PMN (n = 6). * = P<0,05

106

Im hormonfreien Medium blieben von 100.000 eingesetzten (transmigrierten) PMN ca. 65 % am Leben. Sowohl Progesteron als auch Östradiol-17β hatten auf diese konstitutive Absterberate keinen Einfluss (siehe Tabelle 18).

Tabelle 18: Einfluss von Progesteron und Östradiol-17β auf die konstitutive Absterberate von PMN über 24 h

hormonfrei Progesteron Östradiol-17β vitale PMN (%) nach 24 h 63,9 ± 4,11 66,0 ± 4,7 65,8 ± 3,8 n 18 15 21

Angeführt sind die Mittelwerte ± SEM neutrophiler Granulozyten in % nach einer 24-stündigen Kultivie-rung. Die Anzahl eingesetzer Zellen (105) wurde gleich 100 % gesetzt. Die Kultivierung erfolgte in hor-monfreiem Medium, als auch unter 25 nmol/l Progesteron oder 10 nmol/l Östradiol-17β.

Wurden die so hochaufgereinigten, transmigrierten Granulozyten in Kokultur mit MNC in unter-schiedlichen hormonellen Milieus stimuliert, zeigten sich keine (verglichen mit den hormonfreien Ansätzen) Progesteron- oder Östradiol-17β-vermittelten Einflüsse auf die Absterberate nach Stimulation mit PAMPs (siehe Abbildung 38 ). Lediglich in der Mediumkontrolle führte der Ein-fluss von Östradiol-17β zu einem signifikant verstärkten MNC-vermittelten Absterben der PMN, verglichen mit dem hormonfreien Ansatz.

B

MedLPS

CpG

LPS+CpG0

50

100

A

vita

le P

MN

(%

)

hormonfrei Progesteron Östradiol-17β

MedLPS

CpG

LPS+CpG0

50

100

*

Abbildung 38: Einfluss von Progesteron und Östradiol-17β auf ein MNC-vermitteltes Neutrophilen-Sterben nach Stimulation mit PAMPs

PMN (1 x 105) wurden entweder alleine (A, n=18) oder gemeinsam mit 1 x 105 autologen MNC (B, n=6) durch LPS (1 µg/ml), CpG (2,5 µg/ml) oder der Kombination aus beiden für 24 h in vitro stimuliert. Als Kontrolle dienten Ansätze ohne Stimulans (Med=Medium). Die Kultivierung erfolgte in hormonfreiem Medium, in Medium mit 25 nmol/l Progesteron oder Medium mit 10 nmol/l Östradiol-17β. Die Zahl vitaler PMN wurde in allen Ansätzen durchflusszytometrisch ermittelt, wobei die Zahl in unstimulierten Mediumkontrollansätzen in Abwesenheit von Hormonen gleich 100 % gesetzt wurde. * = P<0,05.

107

4.2.4 Makrophagenvermittelte Effekte auf die Vitalität autologer PMN und deren Beeinflussung durch Progesteron und Östradiol-17β

Während Progesteron keinen Einfluss auf die Zahl reiner, vitaler PMN nach Stimulation mit PAMPs nahm (im Vergleich zu hormonfreien Ansätzen), starben tendenziell mehr PMN in An-wesenheit des Hormons, wenn Kokulturen von PMN und MdM mit LPS oder der Kombination aus LPS und einem CpG-Motiv stimuliert wurden (siehe Abbildung 39). Östradiol-17β hingegen verstärkte hochsignifikant das LPS-induzierte, MdM-abhängige Sterben der PMN (siehe Abbildung 39 B), nicht jedoch das durch LPS und CpG-Motiv additiv induzierte Sterben.

Abbildung 39: Einfluss von Progesteron und Östradiol-17β auf ein Makrophagen-vermitteltes Neutrophilen-Sterben nach Stimulation mit PAMPs

PMN (1 x 105) wurden entweder alleine (A, n=18) oder gemeinsam mit 5 x 104 autologen MdM (B, hor-monfrei n=9; Progesteron n=6, Östrogen-17β n=9) durch LPS (1 µg/ml), CpG (2,5 µg/ml) oder der Kombination aus beiden für 24 h in vitro stimuliert. Als Kontrolle dienten Ansätze ohne Stimulans (Med=Medium). Die Kultivierung erfolgte in hormonfreiem Medium, in Medium mit 25 nmol/l Progeste-ron oder Medium mit 10 nmol/l Östradiol-17β. Die Zahl vitaler PMN wurde in allen Ansätzen durch-flusszytometrisch ermittelt, wobei die Zahl in unstimulierten Mediumkontrollansätzen in Abwesenheit von Hormonen gleich 100 % gesetzt wurde. ** = P<0,01.

4.2.4.1 Hormonregulation der TLR-2-, -4- und β-Defensingenxpression in bovinen in-vitro-generierten Makrophagen (MdM)

In-vitro-gereifte Makrophagen exprimierten nachweislich den TLR-2, den TLR-4 und β-Defensin 5 (BNBD5) (siehe Abbildung 40). Reiften die Blutmonozyten in verschiedenen hormonellen Mi-lieus zu Makrophagen heran, so wurde die Expressionsstärke der 3 untersuchten Gene tenden-ziell durch 10 nmol/l Östradiol-17β, nicht jedoch durch 25 nmol/l Progesteron negativ beein-flusst. Der Östradiol-17β-Effekt war allerdings nicht signifikant.

B

MedLPS

CpG

LPS+CpG0

50

100

A

vita

le P

MN

(%

)

hormonfrei Progesteron Östradiol-17β

**100

MedLPS

CpG

LPS+CpG0

50

100

108

Abbildung 40: Expression von TLR-2, TLR-4 und BNBD5 in bovinen MdM nach Rei-fung in unterschiedlichen hormonellen Milieus

Dargestellt ist die Expression von TLR-2, –4 und BNBD5 in bovinen MdM (monocyte derived mac-rophages) von 3 Individuen nach 7-tägiger Reifungszeit im hormonfreien, Progesteron-haltigen (25 nmol/l) oder Östradiol-17β-haltigem (10 nmol/l) Milieu. Die mittels quantitativer PCR gemessenen Er-gebnisse resultieren aus einem Einsatz von 100 ng RNA.

109

4.3 LPS-vermittelte Effekte auf den Arginin-Stoffwechsel von Makropha-gen und mononukleären Zellen in vitro

Während der Gravidität produzieren die Gewebs-residenten Makrophagen vermehrt anti-inflammatorische Zytokine (Th2-Zytokine). Der postpartal verstärkte Kontakt von Makrophagen mit pathogenen Erregern erfordert ein schnelles „Umschalten“ von einer anti- zu einer initial pro-inflammatorischen Reaktionslage. Geprüft werden sollte, ob der Arginin-Stoffwechsel, vermittelt über die differentiell induzierba-ren Enzyme Arginase (anti-inflammatorisch) und induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS, pro-inflammatorisch) einen brauchbaren Hinweis auf die Reaktionslage in-vitro-gereifter Makropha-gen geben kann. Frisch separierte mononukleäre Zellen wiesen mit 1,28 ± 0,45 mU/106 Zellen die geringste, messbare Arginase-Aktivität auf. Über 7 Tage gereifte MdM hatten direkt nach der Gewinnung aus der Zellkulturflasche eine basale Arginase-Aktivität von 10,89 ± 0,95 mU/106 Zellen. Allein die Kultivierung beider Zelltypen in vitro für 48 h steigerte deren Arginase-Aktivität signifikant um das 20fache (MNC) oder das 3fache (MdM, siehe Abbildung 41). Dies liess sich in MdM nach deren Stimulation mit LPS leicht, jedoch nicht signifikant steigern, nicht jedoch in MNC-Kulturen.

nach Gewinnung Medium 1 µg/ml LPS

MNC MdM

0

20

40

60

80

n = 5

n = 5 n = 5

**

**

0

20

40

60

80

n = 3

**

**

n = 8

n = 8

Arg

inas

e-A

ktiv

ität (

mU

/10

Zel

len)

6

Abbildung 41: Modulation der Arginase-Aktivität von MdM und MNC durch Kultivie-rung mit und ohne LPS

Dargestellt ist die Arginase-Aktivität (mU/106 Zellen) von 3 Individuen bei 5 x 104 MdM (Versuchsansät-ze n=8) und 2 x 105 MNC (Versuchsansätze n=5). Die Arginase-Aktivität wurde unmittelbar nach deren Gewinnung oder nach 48-stündiger Kultivierung mit und ohne Stimulation durch 1 µg/ml LPS gemessen. * = P< 0,05; ** = P< 0,01

Aus dem murinen System ist bekannt, dass Arginase und iNOS reziprok reguliert werden kön-nen. Um einen möglichen Zusammenhang der Regulation der Arginase und der iNOS im bovi-nen System zu untersuchen, wurde die Arginase-Aktivität der MdM und der NO-Gehalt der Kul-turüberstände nach LPS-Stimulation der Zellen gemessen. In den Kontrollansätzen ohne Stimu-lus lag die Arginase-Aktivität zwischen 22,8 und 59,8 mU/ml. Die Gesamt-NO-Konzentration im Kulturüberstand lag zwischen 3,8 und 28,7 µmol/l. Die Korrelation zwischen der zellulären Arginaseaktivität und dem NO-Gehalt im Medium war hochsignifikant positiv (R=0,82, Abbildung 42). Nach LPS-Stimulation der Zellen stieg sowohl die Arginaseaktivität der MDM,

110

allerding nicht signifikant, auf 55,4 ± 7,0 mU/ml, als auch der NO-Gehalt (signifikant) auf 34,3 ± 4,8 µmol/l (siehe Abbildung 42). In diesen Stimulationsansätzen bestand keine Korrelation zwi-schen der Arginasae-Aktivität und der NO-Menge im Überstand (siehe Abbildung 42).

0

50

100

Medium 1 µg/ml LPS

n = 8

n = 8

0

30

60 N

O (

µm

ol/l)

n = 8

n = 8

*

NO(µmol/l)

0

50

100

0 30 60

LPSR = -0,17

0

50

100

0 30 60

MedR = 0,82

Arg

inas

e-A

ktiv

ität (

mU

/10

Zel

len)

6

Abbildung 42: Einfluss von LPS auf die Arginase-Aktivität und die NO-Produktion von MdM

Dargestellt ist die Arginase-Aktivität (mU) gegen NO-Produktion (µmol/l) von 106 MdM. Die Werte ergeben sich aus jeweils 8 Ansätzen in denen parallel die Arginase-Aktivität als auch die NO-Produktion bestimmt wurde. Die Zellen wurden mit 1 µg/ml LPS stimuliert, als Kontrolle diente Medium. * = P<0,05

111

5 Diskussion Die Mastitis des Rindes gilt als eine der bedeutendsten Einzeltiererkrankungen in der Milchwirt-schaft. Ein gehäuftes Auftreten von Mastitiden im geburtsnahen Zeitraum lässt auf eine Dysregu-lation von Abwehrvorgängen in der Milchdrüse mit Beginn der Laktation schliessen. Differen-zierte Kenntnisse über die Expression und Regulation von wichtigen Pathogen-Erkenungs-Rezeptoren im Verlauf der Mastitis des Rindes und über funktionelle Konsequenzen einer unter-schiedlichen Expression für immunologische Effektormechanismen fehlten bisher weitestge-hend. Zu dieser Fragestellung wurde in vivo ein Mastitis-Infektionsmodell etabliert. Es wurde zudem hypothetisiert, dass die TLR-Expression hormonell gesteuert wird, basierend auf der star-ken Dynamik der Sexualsteroide Progesteron und Östrogen um den Geburtstermin. Um zu prü-fen, ob nach Stimulation der generierten Zellen mit Erregermustern eine eher pro- oder anti-inflammatorische Reaktion folgt, wurde der zelluläre Arginin-Stoffwechsel analysiert. Ob und wie in-vitro-generierte bovine Makrophagen vergleichbar reagieren war nicht bekannt. Diese Analy-sen wurden ergänzt durch den Einfluss hormonell regulierter und PAMP-stimulierter Makropha-gen auf die bei der Mastitis wesentlichen Effektorzellen, die neutrophilen Granulozyten.

5.1 Der Arginin-Stoffwechsel boviner Makrophagen Konzeptionelle Überlegungen

Die Bedeutung des Arginin-Stoffwechels in Makrophagen für den Phänotyp und Verlauf der sich entwickelnden Immunantwort konnte in murinen Krankheitsmodellen gezeigt werden (Shearer et al. 1997, Hesse et al. 2001, Iniesta et al. 2001, Stempin et al. 2004). Die typischen Th2-Zytokine IL-4 und IL-10 bewirken im murinen System eine Expression der Arginase in Makrophagen (Munder et al. 1998). In dieser Arbeit sollten daher neue Erkenntnisse zur Regulation der Argina-se boviner in-vitro-gereifter Makrophagen gewonnen werden. Insbesondere sollte die Regulation der Arginase im Rahmen von Inflammation und Anti-Inflammation studiert werden: Bekannter-maßen sezernieren Gewebs-residente Makrophagen während der Trächtigkeit vermehrt anti-inflammatorische (Th2-) Zytokine (Dealtry et al. 2000, Kuroda et al. 2001). Unmittelbar post par-tum erfordert jedoch der verstärkte Kontakt mit pathogenen Erregern eine pro-inflammatorische, Th1-dominierte Immunantwort. Anhand der im murinen Modell streng dichotom regulierten Enzyme Arginase und iNOS sollte geprüft werden, inwieweit der Immunphänotyp in-vitro-gereifter Makrophagen des Rindes anhand des Arginin-Stoffwechsels charakterisiert werden kann.

Expression der Arginase in bovinen Zellen

In murinen myeloischen Zellen (Makrophagen, Dendritische Zellen, Granulozyten) lässt sich die Arginase-Aktivität induzieren. Im Gegensatz dazu exprimieren humane Monozyten, Makropha-gen und dendritische Zellen nachweislich keine Arginase, hier enthielten ausschließlich PMN das Enzym (Doschko 2004). Für Leukozyten des Rindes wurde bisher ebenfalls nur eine vergleichs-weise hohe Aktivität in PMN nachgewiesen (Sahoo et al. 1998). In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigten MNC unmittelbar nach ihrer Separation aus dem Blut eine basale Aktivität, die sich nach einer 48-stündigen Kultivierung in vitro signifikant steigern ließ (siehe Abbildung 41). Dies lässt vermuten, dass allein durch die Kultivierungsbedin-gungen (Medien, Kontakt zu Plastikoberflächen, etc.) eine Aktivierung der Zellen stattfand. Ein ähnliches Phänomen konnte sogar bei aus Monozyten gereiften Makrophagen (MdM) beobachtet werden. Sie zeigten nach 7-tägiger Reifung in vitro ebenfalls eine basale Aktivität der Arginase, die sich durch eine weitere 48-stündige Kultivierung ebenfalls signifikant steigerte. Somit konnte erstmals die Arginase-Aktivität in bovinen MNC und auch in in-vitro-gereiften Makrophagen nachgewiesen werden. Um zu klären, ob es sich bei der Arginase-Aktivität der MNC möglicher-weise um durch Kontamination mit PMN verursachte falsch positive Ergebnisse handelte, wurde die Arginase ebenfalls in Präparationen hochaufgereinigter Monozyten gemessen. Diese Zellen

112

zeigten Arginase-Aktivität (Daten nicht gezeigt), ihr Anteil an den MNC machte zwischen 4-11 % aus. Inwieweit bovine lymphoide Zellen (oder evtl. bestimmte Subpopulationen) über Arginase verfügen wurde nicht näher geklärt.

Arginase und iNOS werden in bovinen MdM nicht reziprok reguliert

Entscheidend war die Frage, ob MdM nach PAMP-Stimulation die Arginase-Aktivität und die NO-Produktion abhängig voneinander regulieren. Hierüber sollten simultane Bestimmungen der Arginase-Aktivität sowie der NO-Gehalte in den Kulturüberständen LPS-stimulierter Makropha-gen Aufschluss geben. Eine Stimulation mit LPS bewirkte einen leichten, jedoch nicht signifikan-ten Anstieg der Arginase-Aktivität. Eine signifikante Steigerung der iNOS konnte hingegen ge-zeigt werden (siehe Abbildung 42). Dies deckt sich mit bereits bekannten Daten (Werling et al. 2004). Damit war diesbezüglich sichergestellt, dass bovine MdM durch LPS stimulierbar sind. Die Ergebnisse lassen ferner darauf schließen, dass nach MdM-Stimulation mit LPS präferentiell die iNOS aktiviert wird, was einen Hinweis auf eine pro-inflammatorische Reaktionslage der einge-setzten Zellen geben kann. Allerdings ließ sich keine klare dichotome Regulation nachweisen, da die Arginase-Aktivität und die Bildung von NO nicht korrelierten (R=-0,17, siehe Abbildung 42). Damit konnte für bovine MdM keine streng dichotome Regulation wie bei der Maus gezeigt wer-den. Dies deckt sich mit Untersuchungen im humanen System, wo ebenfalls keine abhängige Regulation der beiden Enzyme in humanen Makrophagen gefunden werden konnte (Doschko 2004). Eine Anwendung der Arginase und iNOS-Bestimmung für in vitro gereifte Makrophagen konnte somit im Weiteren nicht modellhaft für die Charakterisierung einer stattgefundenen Pola-risierung der Immunantwort eingesetzt werden.

5.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf Makrophagen und MNC in vitro

Konzeptionelle Überlegungen

Makrophagen reagieren auf die Stimulation über Toll-like Rezeptoren (TLR) i.d.R. mit einer in-flammatorischen, Th1-dominierten Antwort (Trinchieri 1997). Dazu gehört u.a. die Bildung von pro-inflammatorischen Zytokinen, sowie die Generierung von NO (Norimatsu et al. 2003). Al-lerdings wurde für uterine Makrophagen gezeigt, dass sie während der Trächtigkeit Th2-spezifische Zytokine (z.B. IL-10) in dominanter Art und Weise produzieren (Kuroda et al. 2001). Inwiefern Sexualsteroide – v.a. im peripartalen Zeitraum – die Th1/Th2-Balance modulieren ist nicht bekannt. Das Modell des Arginin-Stoffwechsels eignet sich zur Klärung dieser Fragestellung nicht (siehe 5.1). Ein sehr empfindlicher Parameter zur Charakterisierung der Makrophagen-Funktionalität ist de-ren Fähigkeit nach Stimulation mit bakteriellen TLR-Liganden, ein akzeleriertes Absterben neutrophiler Granulozyten zu induzieren. Dies konnte bereits für bovine MdM und MNC gezeigt werden (Dahnke 2003). Ob diese Zellen in ihrer Fähigkeit, das Neutrophilen-Sterben zu modulie-ren, ebenfalls über Hormone beeinflusst werden, sollte in dieser Arbeit geprüft werden. Bei den in vorausgegangenen Untersuchungen verwendeten PMN handelte es sich um Dichte-gradient-separierte Zellen. Aufgrund z.T. hoher inter- und intraindividueller Schwankungen in Anzahl und vor allem Reinheit gewonnener PMN, wurden Wege gesucht, die Zellen in hoher Reinheit zu gewinnen, um Effekte kontaminierender MNC zu minimieren. Dazu bot sich eine von Frank (2000) für das Rind etablierte In-vitro-Transmigrationstechnik an. In vivo werden PMN anhand chemoattraktiver Substanzen durch das Endothel aus den Blutgefäßen in Richtung Infektionsgeschehen gelockt (Janeway et al. 2002). In der Transmigrationskammer wandern PMN durch eine Membran in Richtung eines chemotaktischen Gradienten (rhIL-8). Die so gewonne-nen PMN wiesen einen sehr hohen, reproduzierbaren Reinheitsgrad auf. Der Vorteil des Einsat-zes solcher Zellen ist darin zu sehen, dass sie – wie auch in vivo – vor direktem Kontakt mit Ge-

113

webs-residenten Zellen bereits auf einen chemotaktischen Stimulus hin gewandert sind. Dass die so gewonnenen Zellen funktionell in vitro allerdings nicht vollständig einer Situation in vivo ent-sprechen, konnte modellhaft im Vergleich uteriner PMN mit PMN nach In-vitro-Transmigration gezeigt werden (Zerbe et al. 2003). Das Vorhandensein spezifischer Rezeptoren ist die Vorraussetzung für die Bindung eines Hor-mons und die Vermittlung seiner genomischen Wirkung auf zellulärer Ebene (Kohtes 1998). Für bovine Leukozyten sind bisher kaum Angaben zum Vorkommen von Steroidhormonrezeptoren gemacht worden. Winters et al. (2003) konnten bspw. keinen Progesteronrezeptor und Östrogen-rezeptor-α in bovinen PMN nachweisen. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse dieser Arbeit, die zeigen, dass neben den Monozyten, den MNC und den in-vitro-gereiften Makrophagen auch die PMN eine spezifische Anfärbbarkeit des Zellkerns für den Progesteronrezeptor als auch für den Östrogenrezeptor-β aufweisen (siehe Abbildung 35). Damit kann prinzipiell die These aufge-stellt werden, dass die Zellen durch diese Hormone in ihrer Funktionalität moduliert werden können. Ein qualitativer Nachweis des Östrogenrezeptor-α konnte mittels PCR für Monozyten, MNC und MdM erbracht werden (Daten nicht gezeigt), PMN wurden nicht untersucht. Im Rahmen der geplanten In-vitro-Experimente sollte der Einfluss hoher physiologischer Plas-ma-Konzentrationen von Progesteron und Östrogenen geprüft werden. Die Konzentrationen des Progesterons liegen während der Gravidität um ca. 15-25 nmol/l (Döcke 1994). Deshalb wurden Konzentrationen von 25 nmol/l standardmäßig während der In-vitro-Versuche einge-setzt. In einer internen Kontrolle konnte diese Konzentration im verwendeten Medium nachge-wiesen werden (Daten nicht gezeigt). Für Östradiol-17β sind unmittelbar antepartal Werte von ca. 1,8 nmol/l angegeben (Döcke 1994). Dem Zellkulturmedium wurden standardmäßig für die In-vitro-Versuche 10 nmol/l zugegeben. Als freies und damit rezeptoraktives Östradiol-17β wa-ren danach 1,72 nmol/l intern nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Vermutlich lag die Differenz in konjugierter Form vor. Eine möglicherweise sehr viel höhere lokale Konzentration von Östradi-ol-17β im Milchdrüsengewebe (Janowski et al. 2002), als auch die Berücksichtigung einer gesamt-östrogenen Wirkung aller vorkommenden Östrogene beim Rind wurden hier vernachlässigt. Um den Einfluss endogener Sexualsteroide auszuschließen, wurden ovarektomierte Spendertiere mit nachweislich niedrigen Progesteron- und Östrogenwerten verwendet. Kontrollmessungen beleg-ten, dass die Hormonkonzentrationen in vitro über den Kultivierungszeitraum konstant blieben (Daten nicht gezeigt).

Östradiol-17β zeigt stärkere Effekte als Progesteron auf ein PAMP-vermitteltes Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro

Zunächst wurde überprüft, inwieweit die eingesetzten Steroidhormone einen Einfluss auf die konstitutive Absterberate der PMN besitzen. Hier konnte kein Effekt für Progesteron und Östradiol-17β auf transmigrierte PMN gezeigt werden (siehe Tabelle 18). Anders verhielt es sich mit PMN, die mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurden. Hiervon starben signifi-kant mehr PMN unter dem Einfluss von Östradiol-17β im Gegensatz zu transmigrierten (siehe Abbildung 37) PMN. Dahnke (2003) forderte für Dichtegradient-separierte PMN einen Anteil kontaminierender MNC <10 %, um MNC-vermittelte Effekte auszuschließen. Bei einer durch-schnittlichen Reinheit der PMN von 91,3 % konnten wir in hormonfreiem Medium ebenfalls keine Unterschiede zu hochreinen PMN (98,3 %) entdecken. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Östradiol-17β bereits bei einem Anteil von MNCs <10 %, Effekte auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten ausüben kann. Eine Stimulation boviner Leukozyten mit einem CpG-Motiv im Milieu deutlich über den physiologischen Werten liegenden Dosen von Progesteron und Östra-diol-17β führte zu einem verlangsamten Absterben der anteiligen PMN (siehe Abbildung 36). Diese Wirkung trat hochsignifikant bei hohen Dosen (5000 nmol/l Östradiol-17β) hervor, jedoch auch schwach signifikant bei Progesteron (12500 nmol/l). Für LPS als Stimulus war kein ver-gleichbarer Effekt zu sehen. Steroidhormone können in hohen Konzentrationen sog. nicht-genomische Effekte durch Interkalierung mit der Zellmembran bewirken (Schumacher 1990).

114

Möglicherweise wurde dadurch die endosomale Aufnahme des CpG-Motivs verhindert, so dass keine Bindung an TLR-9 stattfand. Dies könnte in der Folge zu einer verringerten TLR-vermittelten Produktion proapoptotischer Faktoren geführt haben. Verglichen mit den Werten, die in einer Kokultur mit MNC erzielt wurden, schien LPS bei Makrophagen einen größeren Effekt auf das Neutrophilen-Sterben zu besitzen als das eingesetzte CpG-Motiv (siehe Abbildung 39). Dies lässt vermuten, dass die beiden Zelltypen unterschiedlich mit entsprechenden Erregerrezeptoren ausgestattet sind und damit auch unterschiedlich auf ent-sprechende Reize reagieren können. Gestützt wird dies durch Beobachtungen von Werling et al. (2004), die zeigten, dass MdMs mehr TLR-2 und TLR-4 exprimieren als Monozyten des periphe-ren Blutes. Eine Beeinflussung durch die eingesetzten Steroidhormone auf ein MNC-vermitteltes akzelerier-tes Absterben neutrophiler Granulozyten nach Stimulation mit PAMPs blieb aus. MdM im Milieu von Östradiol-17β beschleunigten nach Stimulation mit LPS jedoch signifikant ein Absterben der neutrophilen Granulozyten. Dies zeigt, dass dieses Hormon in der Lage ist, die Reaktionsfähig-keit bestimmter Zellen auf Erregermuster zu beeinflussen. Ob dies auf der Ebene der TLR-Expressionsmodulation erfolgt oder auf der Induktion bestimmter Zytokine/Mediatoren beruht ist unklar. Immunmodulatorische Eigenschaften von Östrogenen konnten bereits in früheren Studien fest-gestellt werden, wie die Steigerung der Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten in Blut und Milch (Saad und Aström 1988), als auch der ROS-Bildung und der ungerichteten Migration (Roth et al. 1983, Hoedemaker et al. 1992). Im Wesentlichen handelte es sich hierbei um Funkti-ons-stimulierende Wirkungen. Dahnke (2003) konnte keinen zyklusabhängigen Einfluss der Spendertiere auf das MNC- und MdM-vermittelte Neutrophilen-Sterben in vitro beobachten. Hierbei ist jedoch einschränkend anzuführen, dass diese Zellen, anschließend an ihre Gewinnung, nicht unter definierten hormonellen Bedingungen kultiviert wurden. Winters et al. (2003) konnte keinen Einfluss von Östradiol-17β und Östron auf die ROS-Bildung von PMN in vitro zeigen. In dieser Arbeit vermittelten LPS-stimulierte Makrophagen stärker den Zelltod von PMN unter Östrogen-Einfluss als im hormonfreien Medium. Angaben zur Modulation boviner Makrophagen durch Östrogene fehlen bisher. Inwieweit diese Beobachtung sich auf eine Situation in vivo über-tragen lassen, bleibt demnach spekulativ. Eine initiale Steigerung der Vitalität neutrophiler Granu-lozyten würde jedenfalls die Abwehr gegenüber eindringenden bakteriellen Erregern verbessern (Tsuchida et al. 1995). Fraglich bleibt somit, ob Östrogene in diesem Zusammenhang die Funkti-on von PMN, vermittelt über Makrophagen, im frühen Entzündungsgeschehen herabsetzen. Untersuchungen in vivo konnten belegen, dass Östrogen- Applikationen das Auftreten von Mastitiden begünstigen (Zdunczyk et al. 2001). Neben dieser eigentlich immunsuppressiven Wir-kung der Östrogene könnte das beobachtete Phänomen ebenso bedeuten, dass Gewebs-residente Makrophagen als Regulativ eingesetzt werden, um Gewebeschädigungen einer unkontrolliert hohen zytotoxischen Wirkung Neutrophiler vorzubeugen. Aufgrund der beobachteten MdM-vermittelten Effekte durch LPS und Östradiol-17β stellte sich ferner die Frage, inwieweit diese Modulation durch eine Veränderung des TLR-Expressionsmusters beeinflusst wird. Besondere Beachtung verdient hier TLR-4 als LPS-Rezeptor. Aufgrund bereits beobachteter Koregulation von TLR-4 mit TLR-2 und BNBD5 (Goldammer et al. 2004) wurden die beiden letztgenannten Faktoren mituntersucht. Die Beo-bachtung, dass TLR-2 und TLR-4 in bovinen MdM exprimiert werden (siehe Abbildung 40), deckt sich mit Angaben von Werling et al. (2004). Eine signifikante, hormonabhängige Modulati-on ihrer Expression konnte in der vorliegenden Arbeit auf mRNA-Ebene allerdings nicht gezeigt werden. Tendenziell schien die Expression unter Östrogeneinfluss jedoch leicht herabgesetzt. Da es sich bei TLRs um transmembranale Rezeptoren handelt, sollte bei zukünftiger Verfügbarkeit entsprechender Antikörper das Expressionsmuster auf Produktebene in diesem Zusammenhang untersucht werden.

115

5.3 Frühe Erreger-Wirts-Interaktionen nach experimenteller intramammä-rer Infektion

5.3.1 Etablierung eines Mastitis-Infektionsmodells Zu zahlreichen Fragestellungen wurden innerhalb der letzten dreißig Jahre Euter-Infektionsmodelle beim Rind eingesetzt. Untersuchungen zur Expression und Regulation von Pathogen-Erkennungs-Rezeptoren blieben in diesem Zusammenhang bisher jedoch aus. Es wur-de hypothetisiert, dass einer dysregulierten Expression entscheidender Toll-like Rezeptoren, schwerwiegend verlaufende Mastitiden folgen können. Differenzierte Kenntnisse über die Regu-lation der TLR-Expression im Verlauf einer Mastitis sind daher essentiell, um mittel- und lang-fristig Strategien zur Infektionsprävention entwickeln zu können. Hinsichtlich ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und ihrem stark differierenden Krankheitsbild wurden E. coli und S. aureus als Mastitiserreger ausgewählt. Ein besonderer Schwerpunkt sollten streng definierte Modellgrenzen hinsichtlich der Euter- so-wie der Allgemeingesundheit darstellen. Eine unterschiedliche lokale wie systemische Ausgangssi-tuation der Abwehrbereitschaft könnte zu mangelnder Vergleichbarkeit der Ergebnisse führen. Auffallend waren in diesem Zusammenhang die stark divergierenden Modellbedingungen der bisher eingesetzten Mastitis-Infektionsmodelle. Im hier verwendeten Modell sollten nur allge-mein-, wie eutergesunde Tiere gleichen Alters und Laktationsstadiums eingesetzt werden. Beach-tung verdiente insbesondere die initiale Anzahl somatischer Zellen in der Milch, da gezeigt wer-den konnte, dass erhöhte SCC-Werte einen protektiven Einfluss auf die Schwere einer natürli-chen wie experimentellen Mastitis besitzen (Nickerson et al. 1990, Shuster et al. 1996). Der SCC ist unter Praxisbedingungen ein wichtiger Indikator für die Eutergesundheit (Pyörälä 2003). Es ist davon auszugehen, dass bereits ab einem Wert von >100.000 Zellen/ml die normale zelluläre Abwehr in eine entzündliche Reaktion übergeht (Doggweiler und Hess 1983). Dies gab Anlass, in dieser Höhe bewusst die Maximalgrenze initial vorhandener Milchzellen zu wählen. Sie lag damit deutlich niedriger als in den meisten eingesetzten Mastitis-Infektionsmodellen. Eine viermalige Untersuchung der Viertelanfangsgemelke über einen Zeitraum von 3 Wochen vor, bis hin zum Versuchsbeginn sollten neben einem niedrigen SCC-Wert ebenso die Freiheit der Milch von jeglichen bakteriellen Kontaminationen garantieren. Aufgrund beobachteter starker interindividueller Unterschiede im Differentialzellbild der Milch bereits bei einem SCC-Wert <100.000 Zellen/ml (siehe Tabelle 10 und 11) sollte zukünftig die Maximalgrenze auf 50.000 Zellen/ml herabgesetzt werden. Somit könnte eine größtmögliche Freiheit von entzündlichen Veränderungen garantiert werden, da Köß (2004) bereits feststellen konnte, dass sich das Differentialzellbild in der Milch bereits ab >50.000 Zellen/ml zugunsten der PMN verschiebt. Dies kann bereits als Hinweis auf eine entzündliche Veränderung gewertet werden. Darüber hinaus könnte es sich zur weiteren Standardisierung des Modells als sinnvoll erweisen, nur noch Tiere mit einer ähnlichen Zellzusammensetzung in der Milch innerhalb einer Versuchsgruppe experimentell zu infizieren. Den prozentualen Anteil neutrophiler Granulozyten als Indikator für entzündliche Veränderungen heranzuziehen wurde bereits vorgeschlagen (Ha-mann und Krömker 1997). Dies kann aufgrund der hier erhobenen Daten bestätigt werden, die zeigen, dass der Anteil von PMN während einer entzündungsbedingten Zunahme der Zellzahl stark mit dieser korreliert (siehe Abbildung 14). Da bekanntermaßen der Verlauf einer Mastitis sehr starke Unterschiede in seiner Ausprägung aufweist, beeinflusst durch Wirts-, Erreger- und Umweltfaktoren, war es zunächst wichtig, den Verlauf klinischer Symptome zu erfassen. Es ist bekannt, dass ein Großteil subklinischer Mastiti-den aufgrund fehlender Anzeichen unerkannt bleibt und somit die betroffenen Tiere ein ständi-ges Reservoir für Mastitiserreger im Bestand bilden. Erst augenscheinlich auftretende Verände-rungen wie Flocken in der Milch, Euterschwellung oder Störung des Allgemeinbefindens führen

116

zum Aufdecken erkrankter Kühe. Somit diente die Erfassung klinischer Parameter hier als Kon-trolle hinsichtlich einer sich etablierenden Infektion. Weiterhin konnte der Schweregrad der Aus-prägung näher charakterisiert werden. Veränderungen der absoluten und relativen Zahl zirkulierender Leukozyten im Blut wurden als Indikator für stattfindende entzündliche Prozesse herangezogen. Bei einer klinischen Mastitis lassen sich neben einer erhöhten Zellzahl im Viertelanfangsgemelk ebenfalls Mastitiserreger nachweisen (Hamann und Fehlings 2002). Auf die nähere Untersuchung von pathogenen Me-chanismen seitens des Erregers wurde im Rahmen dieser Arbeit verzichtet.

Tiere reagieren einheitlich nach experimenteller Infektion mit E. coli:

Die durch E. coli hervorgerufenen Mastitiden weisen meist einen akuten bis perakuten Verlauf mit deutlich ausgeprägten klinischen Symptomen auf (Burvenich et al. 2003). Wie bereits bei Bannermann et al. (2004) beobachtet reagierten alle hier experimentell mit E. coli infizierten Tiere nach 12 h mit Fieber. Eine beschriebene hgr. Störung des Allgemeinbefindens, wie sie bei durch E. coli hervorgerufenen Mastitiden auftreten können, blieb aus. Lediglich eine geringgradige Stö-rung des Allgemeinbefindens war zu bemerken. In diese Betrachtung muss mit hineinfließen, dass die klinische Ausprägung der E. coli-Mastitis mit fortgeschrittenem Laktationsstadium ab-nimmt und schwerwiegende Erkrankungen meist nur im postpartalen Zeitraum auftreten (Bur-venich et al. 2003). Die hier verwendeten Tiere befanden sich alle in der Mitte ihrer ersten Lakta-tion. Das Einstellen der Milchproduktion konnte bei allen Tieren beobachtet werden. Dies deckt sich mit bereits bekannten Beobachtungen (Lohuis et al. 1990). Auch die nichtinfizierten Euterviertel zeigten bekanntermaßen eine deutliche Reduktion der Milchleistung (Shuster et al. 1996). Ver-antwortlich hierfür werden lokale Pathogen-abhängige Mechanismen gemacht, die zur Einstel-lung der Milchproduktion führen (Burvenich et al. 2003). Dies beruht u.a. darauf, dass im akuten entzündlichen Geschehen unterschiedlich Gene aktiviert und unterdrückt werden können, die die Milchleistung beeinflussen: So konnte gezeigt werden, dass bei den in dieser Arbeit experimentell mit E. coli infizierten Tieren Remethylierungsvorgänge die Synthese des αS1-Kaseins hemmen (Vanselow et al. 2005, in Vorbereitung). Auch eine lokale Gewebeschädigung führt zum Verlust syntheseaktiver Zellen (Heyneman et al. 1990). Weiterhin können im Falle klinisch schwerwie-gender Verläufe Störungen der Magen-Darm-Motilität als auch die Einstellung der Nahrungsauf-nahme durch einen Mangel verfügbarer Nährstoffe die Milchleistung kurzfristig beeinflussen (Lohuis et al. 1988). Hinsichtlich zirkulierender Blutzellen konnte bereits 12 h post infectionem eine deutliche Neutrope-nie und Lymphopenie beobachtet werden. Hierbei handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um einen durch LPS-vermittelten Effekt: Durch eine intravenöse Verabreichung von 50 – 500 µg E. coli-Endotoxin (LPS) bei Rindern, konnte eine starke Neutropenie hervorgerufen werden, hö-here Dosen resultierten in einer zusätzlichen Lymphopenie und Fieber (Jain und Lasmanis 1978). Eine initiale Neutropenie könnte dadurch erklärt werden, dass Entzündungszellen, allen voran die neutrophilen Granulozyten, die Blutbahn verlassen und in entzündetes Gebiet einwandern (Paape et al. 1974). Obwohl hier eine beschriebene zeitliche Korrelation zwischen dem Einstrom neutrophiler Granulozyten in die Milch und einem gleichzeitigen Verlust im Blut bestand (siehe auch Bannerman et al. 2004), so konnte die Gesamtzahl der in der Milch befindlichen PMN nur einen Bruchteil der aus dem Blut reduzierten Zahl repräsentieren. Anzunehmen ist, dass ein Großteil der PMN in entzündetes Milchdrüsengewebe einwandert und dort verbleibt. Weiterhin ist davon auszugehen, dass die Neutrophilen im Gewebe, in der Milch und im Blut verstärkt in Apoptose übergehen und im Milchsekret und peripheren Blut nicht mehr detektiert werden. Yagi et al. (2002) konnten eine signifikante, wenn auch transiente Zunahme apoptotischer PMN in der Eutervene 4 h nach intramammärer LPS-Infusion feststellen. Dabei handelt es sich höchstwahr-scheinlich nicht um einen direkten LPS-vermittelten Effekt, da LPS nicht im Blut detektiert wer-den konnte. In diesem Zusammenhang wird TNF-α als proapoptotischem Mediator eine wichtige Rolle beigemessen. Eine LPS-vermittelte Sekretion von TNF-α induziert Apoptose in PMN (Ta-

117

keda et al. 1993). Auch bei der Apoptose von Lymphozyten spielt TNF-α eine zentrale Rolle (Norimatsu et al. 1995, Sanchez-Cordon et al. 2005), was die beobachtete Lymphopenie erklären könnte. Maximalwerte für TNF-α konnten nach experimenteller E. coli-Mastitis in der Milch 16 h post infectionem gemessen werden (Bannermann et al. 2004). Im Blut ist TNF-α nach 8-16 h post infectionem nachweisbar (Hoeben et al. 2000). Minimalwerte der zirkulierenden PMN im Blut konnten in dem hier verwendeten Modell 18 h post infectionem registriert werden.

Tiere reagieren unterschiedlich auf eine experimentelle Infektion mit S. aureus

Tiere, die mit S. aureus infiziert wurden, zeigten keine Erhöhung ihrer Körpertemperatur oder Störung des Allgemeinbefindens. Lediglich ein Abfall der Milchleistung war bei allen Tieren zu registrieren. Eine Infektion mit S. aureus führte bei 4 Tieren innerhalb von 24 h zunächst zu kei-ner signifikanten Zellzahlerhöhung in der Milch. Da aus Vorversuchen bekannt war (Daten nicht gezeigt), dass Tiere, deren Euter experimentell mit S. aureus über mehrere Tage infiziert wurde, möglicherweise erst zu einem späteren Zeitpunkt mit einer stärkeren Erhöhung der Zellzahl rea-gieren, wurden Euterviertel weiterer 6 Tiere über einen Zeitraum von 72 h infiziert: Diese Tiere zeigten im Gegensatz zu den mit E. coli infizierten Tieren ein uneinheitliches Bild in ihrer Zell-zahlentwicklung: Während manche Tiere innerhalb der ersten zwölf Stunden bereits mit einer starken Zellzahlerhöhung reagierten, zeigten andere wiederum eine kontinuierliche Zunahme über einen Zeitraum von 48 h und wiederum 2 Tiere reagierten nicht. Diese Heterogenität belegt indirekt, dass neben den in dieser Arbeit gewählten Standardisierungskriterien noch weitere, nicht untersuchte, Faktoren des Wirtes für den Infektionsverlauf ausschlaggebend sein können. Hier sei nur kurz auf die humoralen Faktoren in der Milch verwiesen (siehe 2.2.1), oder auf Unter-schiede in der funktionellen Kapazität bereits vorhandener Milchzellen. Aufgrund der hier beobachteten, stark interindividuell abweichenden Reaktionen auf eine expe-rimentelle Mastitis mit S. aureus, sollte erwogen werden, einzelne Aspekte der Pathogenese zu beleuchten. Hierzu böte sich bspw. an, anhand intramammärer Infusionen mit hochreinen LTA-Präparationen die Bedeutung des TLR-2-Liganden im Rahmen der S. aureus-Mastitis zu untersu-chen. Aus der Literatur ist bekannt, dass Tiere auf eine experimentelle Infektion von Eutervierteln mit S. aureus erst 24 h post infectionem mit einer SCC-Erhöhung reagieren (Bannermann et al. 2004) und damit deutlich später als Tiere, die mit E. coli infiziert wurden. In vielen angewendeten Euterin-fektionsmodellen für S. aureus handelte es sich jedoch um Verlaufsstudien über einen längeren Zeitraum. Hier wurden häufig die Probenintervalle auf einige Tage ausgedehnt, so dass Aussagen zur Zellzahlentwicklung unmittelbar nach experimenteller Infektion gänzlich fehlen (Schukken et al. 1994, Shoshani et al. 2000, Ebling et al. 2001). Dass E. coli und S. aureus nach experimenteller Infektion von Eutervierteln eine unterschiedliche Immunantwort hervorrufen wurde in vivo gezeigt (Bannermann et al. 2004). Obwohl die Bildung von IL-1, IFN-γ, IL-12, sCD14 und LBP vergleichbar verlief, induzierte eine E. coli-Mastitis eine deutliche C5a-, TNF-α- und IL-8-Freisetzung in der Milch, wobei S. aureus nur niedrige Spiegel an C5a, TNF-α und IL-8 hervorrief (Bannerman et al. 2004). In vitro konnte kürzlich gezeigt wer-den, dass LPS und LTA beide eine Expressionssteigerung von IL-8, TNF-α, IL-1β und dem Chemokin CXCL6 (granulocyte chemotactic protein 2) in primären, bovinen Milchdrüsenepithel-zellen nach 2-4 h hervorrufen (Strandberg et al. 2005). Während die Werte für LPS-stimulierte Zellen erhöht blieben, sanken sie bei LTA-stimulierten bereits nach 8-16 h wieder auf Ausgangs-niveau. Diese begrenzte Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine könnte erklären, warum eine Mastitis mit S. aureus eher als mit E. coli klinisch schwächer ausgeprägt ist und zu einer chro-nischen Verlaufsform neigt. Während bei einer experimentellen Infektion mit E. coli alle infizierten Viertel zu jedem gemesse-nen Zeitpunkt einen bakteriologisch positiven Befund zeigten, konnte nicht in jedem der mit S. aureus infizierten Viertel ein bakteriologisch positiver Befund erhoben werden (siehe Tabelle 9): Tiere, bei denen zwei Viertel über 72 h infiziert wurden, zeigten bspw. nur in einem der beiden

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Viertel einen bakteriologisch positiven Befund. Schukken et al. (1999) berichteten sogar, dass von 48 bakteriologisch negativen Eutervierteln nach einer experimentellen Infektion mit S. aureus 18 Viertel weiterhin bakteriologisch negativ blieben. Auch ein signifikanter SCC-Anstieg konnte für letztere Viertel nicht gezeigt werden. Im hier verwendeten Modell scheint sich ein anderer Zu-sammenhang zwischen der Kinetik des SCC in der Milch und den bakteriologischen Befunden einzelner infizierter Euterviertel zu ergeben: Während bspw. Tier 490 und Tier 8193 mit einer langsamen Zunahme der Milchzellen über 48 h auf eine Infektion reagierten, zeigten Tier 491 und 475 innerhalb von 12 h einen raschen Anstieg (siehe Abbildung 10). Interessanterweise zeig-ten die Tiere mit einem raschen Zell-Influx invariant einen bakteriologisch negativen Befund ihrer Viertelanfangsgemelke. Tier 490 (siehe Tabelle 9) und Tier 8193 (Daten nicht gezeigt) zeig-ten bei einer langsamen Zunahme des SCC durchgehend einen positiven Befund für S. aureus in der Milch. Somit erscheint es naheliegend, dass eine rasche Zunahme der Zellzahl zur Eliminie-rung von S. aureus in der Milch führen kann. Ein bakteriologisch negatives Ergebnis ist in Hin-sicht auf eine Euterinfektion mit S. aureus vorsichtig zu bewerten, da der Erreger erfahrungsge-mäß z.T. nur intermittierend nachgewiesen wird. Verantwortlich hierfür ist seine Eigenschaft, an Milchdrüsenepithelzellen zu haften (Almeida et al. 1996, Hensen et al. 2000), als auch intrazellulär in Makrophagen (Hébert et al. 2000) und Epithelzellen (Lammers et al. 1999) zu überleben.

Eine sequentielle Infektion beeinflusst die Reaktionsweise benachbarter Euterviertel

In diesem Mastitis-Modell sollte u.a. untersucht werden, inwiefern zu unterschiedlichen Zeit-punkten infizierte Euterviertel bei der Teilsektion verschiedene Stadien einer Infektion repräsen-tieren. Eine sequentielle Infektion des Euters wurde in dieser Form bisher nicht durchgeführt. Dazu wurden die Euterviertel 24 h, 12 h und 6 h vor der Sektion der Tiere mit E. coli oder S. aureus infiziert. Zusätzlich wurden Tiere 72 h und 12 h vor der Sektion mit S. aureus infiziert. Vor-aussetzung einer getrennten Betrachtung der Infektionsstadien einzelner Euterviertel wäre der Ausschluss einer gegenseitigen Beeinflussung durch systemische Faktoren. Es zeigte sich jedoch, dass ein initial infiziertes Viertel Einfluss auf die Dynamik der Zellzahl-Entwicklung nachfolgend infizierter Viertel nahm (siehe Abbildung 8 und 11). Diese Beobachtung legt nahe, dass sich die Euterviertel im Rahmen der Infektion gegenseitig durch Mediatoren beeinflussen. Eine starke Zunahme des SCC, wie initial bei durch E. coli-induzierter Mastitis beobachtet, hatte zur Folge, dass 12 h und 18 h später infizierte Viertel keinen signifikanten Anstieg des SCC zeigten. Auch im durchflusszytometrischen Bild zeigte eine Erstinfektion einen massiven relativen und absolu-ten Anstieg der PMN im Viertelanfangsgemelk. Dagegen blieb im gleichen Tier durch eine 12 h später erfolgende Infektion mit gleicher Infektionsdosis dieser Effekt aus. Eine mögliche Ursache könnte die bestehende Neutropenie (siehe oben) der Tiere darstellen. Dies erscheint jedoch eher unwahrscheinlich, da trotz reduzierter Anzahl der PMN im Blut, nach wie vor ca. 1,2 x 1010 PMN im Blut zirkulierten. In Anbetracht der erheblichen Auswirkungen einer Infektion auf die Zahl zirkulierender Leukozyten (siehe Abbildung 7) ist es wahrscheinlicher, dass die Infektion zu einer massiven Zytokin/Mediatorbildung geführt hat, welche die Reaktionsfähigkeit und Funktionalität von Zellen in den benachbarten Vierteln moduliert hat. Auch bei einer intramammären Infektion mit S. aureus scheint eine vorangegangene Infektion Einfluss auf nachfolgende Infektionen zu nehmen: Hier resultierte eine primäre Infektion mit interindividuell heterogener Zellzahl-Entwicklung in der Milch. Eine weitere Infektion 60 h spä-ter in einem kontralateralen Viertel hatte eine rasche und sehr viel homogenere Reaktion inner-halb von 12 h zur Folge (siehe Abbildung 11). Dies erscheint gegensätzlich zu den Ergebnissen, die während einer experimentellen Infektion von Euterviertel mit E. coli erzielt wurden: Während dort eine initial starke Reaktion eine schwächere Reaktion bei nachfolgenden Infektionen beding-te, konnte eine erste Infektion mit S. aureus die Reaktionsbereitschaft der Tiere auf eine nachfol-gende Infektion erhöhen. Einschränkend muss angemerkt werden, dass das Intervall zwischen den Infektionen bei S. aureus länger gewählt wurde, was einen direkten Vergleich beider Phäno-mene erschwert.

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Im Rahmen einer experimentellen Mastitis mit E. coli oder S. aureus änderte sich neben der abso-luten Anzahl von Zellen in der Milch auch deren relative Zusammensetzung. Ein rascher Influx neutrophiler Granulozyten in hoher Zahl ist entscheidend für den weiteren Verlauf der Erkran-kung (Paape et al. 2003). In den zuerst infizierten Vierteln nahm der Anteil neutrophiler Granu-lozyten stark zu und stellte nach 12 h die dominierende Zellpopulation dar (siehe Abbildung 12). Im weiteren Verlauf blieben diese Werte erhöht. Die Kontrollviertel reagierten dagegen mit einer transienten Erhöhung neutrophiler Granulozyten. Dies spricht wiederum für die Beeinflussung benachbarter Euterviertel z.B. durch Mediatoren. Nach 24 h hatte die Zellzusammensetzung aber wiederum ihre Ausgangswerte erreicht (E. coli 24 h) oder hatte sich ihnen angenähert (S. aureus 72 h). Die Kinetik der Rekrutierung kann sich je nach beteiligtem Keim (E. coli oder S. aureus) deutlich unterscheiden (Bannerman et al. 2004), allerdings gehen die Aussagen hierüber, je nach verwen-detem Modell, in der Literatur weit auseinander. Die in der Gesamtheit an der Chemotaxis betei-ligten Faktoren, deren relative Bedeutung und über die Kinetik ihrer Induktion ist wenig bekannt. Dem Chemokin CXCL8 (Interleukin-8) wird eine tragende Rolle zugesprochen (Rambeaud und Pighetti 2005). Daneben ist belegt, dass die Konzentration des chemotaktisch wirksamen Kom-plementfaktors C5a im Rahmen einer E.-coli-induzierten Mastitis ansteigt (Rainard und Poutrel 2000, Bannermann et al. 2004). Für CXCL6 konnte in vitro eine Expressionssteigerung in Milchdrüsenepithelzellen gezeigt werden (Strandberg et al. 2005), was eine mögliche Bedeutung für die Anlockung Neutrophiler ins Euter nahe legt. Andere Mediatoren, bspw. Leukotrien B4 (LTB4), oder auch die chemotaktisch wirksamen Mastzell-Proteasen (Tryptase, Chymase) wurden bisher in ihrer Bedeutung für die Neutrophilen-Chemotaxis in die Milchdrüsen-Alveole nicht untersucht. Untersuchungen in vivo belegen, dass LTB4 ein potentes Chemotaktikum für bovine Neutrophile darstellt (Zerbe et al. 1996).

Morphologische Veränderungen der PMN im Infektionsverlauf

Morphologische Veränderungen der PMN (Verlust der Granularität, Größenzunahme) waren im Verlauf einer Infektion mit E. coli (siehe Abbildung 15) als auch mit S. aureus (Daten nicht ge-zeigt) zu beobachten. Es ist beschrieben, dass die pro-inflammatorischen Mediatoren Platelet-Activating Factor (PAF) und TNF-α eine Größenzunahme boviner PMN bewirken (McClenahan et al. 2000). Eine Stimulation mit PAMPs in vitro führte zu einer Verminderung der Granularität von PMN (Dahnke 2003, eigene Untersuchungen). Dieser Granularitätsverlust kann als Parame-ter einer Zellaktivierung interpretiert werden, die sich in der Verschmelzung der Granula mit der Zellmembran zur Abgabe der Inhalte in den Extrazellularraum äußert (Dahnke 2003). Neben einer Aktivierung kann auch die Induktion der Apoptose zu morphologischen Veränderungen neutrophiler Granulozyten führen. Ein apoptosebedingter Verlust der Granula und eine Verrin-gerung der Zellorganellen boviner PMN aus dem Eutergewebe in vitro ähneln morphologischen Alterationen in vivo (Sladek und Rysanek 2005). Die morphologischen Veränderungen lassen sich in Anfangs- und Endgemelken registrieren, was darauf schliessen lässt, dass alle im Eutersek-ret befindlichen PMN sich morphologisch ähneln und die Veränderungen nicht spezifisch für Zellen sind, die entweder intraalveolar oder intrazisternal lokalisiert sind.

5.3.2 Einfluss einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus auf die Ex-pression von Toll-like Rezeptoren und β-Defensinen

Das Vorkommen mehrerer TLRs im Genom der Säuger wird dadurch erklärt, dass es dem ange-borenen Immunsystem des Wirts ermöglicht, die Art des Pathogens genauer zu identifizieren und im Folgenden eine gegenüber dem Pathogen „maßgeschneiderte“ Immunantwort zu initiieren (Underhill und Ozinsky 2002). Eine Aktivierung der TLRs kann somit zu einer Polarisierung der Immunantwort in Richtung Th1 oder Th2 führen. Eine Th1 gesteuerte Ausschüttung von Zyto-kinen und Chemokinen ist essentiell für eine erfolgreiche Abwehr gegen eindringende Pathogene

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im Euter (Dosogne et al. 2002). Eine Th2 dominierte Immunantwort führt hingegen, aufgrund einer vorangegangenen Trächtigkeit, zu einer unzureichenden Reaktion, wie sie häufig während der frühen Phase der Laktation beobachtet wird. Inwieweit TLRs im Rahmen einer experimentel-len Mastitis mit E. coli und S. aureus moduliert werden, sollte hier untersucht werden, um mehr Aufschluss über ihre Bedeutung in der Einleitung einer frühen Abwehrreaktion zu geben.

Toll-like-Rezeptor-2 und –4 als auch β-Defensine werden selektiv heraufreguliert nach einer experimen-tellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli

Eine zentrale Beobachtung war, dass 24 h nach einer experimentellen Infektion mit E. coli die Expression der Pathogen-spezifischen Rezeptoren TLR-2 und –4 nahezu invariant in allen unter-suchten Geweben und Zellen heraufreguliert wurden (siehe Abbildung 17 und 23). Neben diesen Rezeptoren für bakterielle Strukturen wurden auch die Gene der β-Defensine mit heraufreguliert. Von diesen antibakteriellen Peptiden wurde das β-Defensin 5 (BNBD5) und summarisch für eine Reihe verschiedener β-Defensine das universelle Defensin (uDef) untersucht. Für weitere untersuchte TLRs mit natürlichen bakteriellen Liganden (TLR 6 und –9) konnte kei-ne signifikante Expressionssteigerung gemessen werden. Ebenfalls TLR 3, als Vertreter der TLRs für virale Strukturen, erfuhr keinerlei Modulation. Diese Beobachtungen legen nahe, dass ein Heraufregulieren von Pathogen-spezifischen Rezeptoren bei der Mastitis des Rindes selektiv und Erreger-spezifisch verläuft. Warum im Falle einer experimentellen Mastitis mit E. coli insbesonde-re der TLR-2 mitreguliert wird, bleibt zunächst fraglich, da TLR-2 ein klassischer Rezeptor für Bestandteile Gram-positiver Erreger darstellt (Underhill und Ozinsky 2002). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass TLR-2 essentiell für eine inflammatorische Antwort auf LPS einiger weniger Gram-negativer Erreger ist (Hirschfeld et al. 2001). Dies lässt Raum für Spekulationen, ob die Anwesenheit von E. coli hier über eine direkte Bindung an TLR-2 seine verstärkte Expression bedingte, oder ob es sich dabei um eine konzertierte Regulation gemeinsam mit TLR-4, dem klas-sischen PRR für LPS, handelt. Letzteres wurde bereits als Vermutung geäußert (Goldammer et al. 2004). Hier konnte ein gemeinsames Heraufregulieren von TLR-2 und TLR-4 im Euter mastiti-serkrankter Kühe beobachtet werden. Dabei handelte es sich jedoch um Tiere, über deren Krankheitsgeschichte nichts bekannt war, so dass mögliche Fremdeinflüsse nicht ausgeschlossen werden konnten. Im Weiteren ist zu erwähnen, dass in dem Zusammenhang nicht nur Tiere mit einem nachweislich positiven Befund für E. coli im Euter eine verstärkte Expression von TLR-2 und -4 zeigten: Im Gegensatz zu unseren Untersuchungen, zeigten Tiere mit nachweislicher Be-teiligung von S. aureus an einer Mastitis ebenfalls eine signifikante Steigerung von TLR-2, -4 und BNBD5. Dies lässt Spekulationen zu, dass es bei einer intramammären Infektion mit S. aureus möglicherweise erst sehr viel später zu einer Heraufregulation von besagten TLRs und Defensi-nen kommt. Unterstüzt wird dies durch die Beobachtung, dass wir nach einer 72-stündigen In-fektion mit S. aureus bereits eine signifikante Expressionssteigerung für uDef im regionalen Lymphknoten beobachten konnten (siehe Abbildung 28), während dies bei einer 24-stündigen Infektion ausblieb (siehe Abbildung 27). Die Messung einer TLR- und Defensingenexpression in Blutzellen und somatischen Zellen der Milch war im vorliegenden Euterinfektionsmodell eine Möglichkeit, die Modulation dieser Fakto-ren im Infektionsverlauf zu messen. In den somatischen Zellen der Milch konnte gezeigt werden, dass wie im Gewebe beobachtet die Expression von TLR-2 und -4 nach experimenteller Infekti-on mit E. coli signifikant anstieg (siehe Tabelle 15). Die stark heterogenen Befunde zeigten jedoch Grenzen zum Einsatz dieser Methode auf. Ebenso für die Zellen des Blutes: Hier konnte für BNBD5 ein signifikanter Anstieg nach experimenteller Mastitis mit E. coli gezeigt werden (siehe Abbildung 34). Ein tendenzieller Anstieg für TLR-2 und –4 war aufgrund sehr hoher Standard-abweichungen nicht signifikant. Über die Zellpopulationen, die zu einer Steigerung der TLR-Expression führen, kann bislang noch keine Aussage gemacht werden. Die bisherigen Versuche einer näheren topographischen Charakterisierung mittels In-situ-Hybridisierung im infizierten Euter waren nicht ausreichend

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(Goldammer et al. 2004). Naheliegend wäre es, dass es sich vor allem um Zellen handelt, denen eine Wächterfunktion im Euter zukommt. Hier sind allen voran professionelle Antigen-Präsentierende Zellen (APC) zu nennen, wie Makrophagen und Dendritische Zellen. So konnte kürzlich der Nachweis einer Expression von TLR-2 und –4 in bovinen Monozyten, als auch aus Monozyten gereiften Makrophagen und Dendritischen Zellen erbracht werden (Werling et al. 2004). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Makrophagen 8 Mal stärker TLR-2 und 1,5 Mal stärker TLR-4 exprimieren als Monozyten. Dendritische Zellen hingegen zeigten eine schwächere Expression beider Faktoren als Monozyten. Des weiteren muss auch die Immunkompetenz der Milchdrüsenepithelzelle Beachtung finden: Epithelzellen stellen oftmals Grenzgewebe dar, was einen häufigeren Kontakt mit Krankheitserregern bedingt. Toll-like-Rezeptoren sind bspw. ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems auf Darmepithelien (Abreu 2003). Eine TLR-2 und –4-abhängige Aktivierung der β-Defensingen-2-Expression konnte in Darmepithelien gezeigt werden (Vora et al. 2004). Renale Epithelzellen zeigten eine entzündungsbedingte He-raufregulation von TLR-2 und –4 (Wolfs et al. 2002). An primären bovinen Milchdrüsenepithel-zellen (pbMEC) konnte exemplarisch gezeigt werden, dass diese nach Stimulation mit S. aureus oder LPS zur Synthese von Laktoferrin, TNF-α, Serum Amyloid A und IL-8 angeregt werden (Wellnitz und Kerr 2004), was ihre Beteiligung an immunologischen Vorgängen im Euter unter-streicht. Auch genomweite Transkriptomanalysen im murinen Milchdrüsengewebe zeigten auf, dass die Abschaltung der Milchbildung während der Milchdrüseninvolution zu einer Aufregulie-rung einer ganzen Reihe immunrelevanter Gene führt (Stein et al. 2004, Clarkson et al. 2004). Der Beweis einer induzierten Expression von Toll-like-Rezeptoren in Milchdrüsenepithelien während eines inflammatorischen Geschehens muss zukünftig noch erbracht werden. Für BNBD5 konnte dies bereits gezeigt werden (Goldammer et al. 2004, Strandberg et al. 2005). Auch neutrophile Granulozyten könnten an einer Expressionssteigerung von TLRs im Euter beteiligt sein. Sie stellen eine dominierende Zellpopulation im infizierten Euter dar. Für humane PMN konnte gezeigt werden, dass sie TLR-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 und 10 exprimieren (Hay-ashi et al. 2003). Als Effektormoleküle machen β-Defensine einen Anteil von bis zu 15 % des Gesamteiweißgehaltes der neutrophilen Granulozyten aus (Boman 1995). Die Vermutung, dass das massive Einwandern Neutrophiler Granulozyten proportional die Expressionssteigerung von TLRs und Defensinen im Milchdrüsen- und Lymphknotengewebe anhebt, kann nicht bestätigt werden. Es zeigte sich bspw. im Blut bei vorherrschender Neutropenie trotzdem eine Zunahme der Expression von TLR-2,–4 und BNBD5. Auch Tiere, die mit S. aureus über 72 h infiziert wur-den, zeigten sowohl einen massiven Einstrom an Neutrophilen in die Milch und ins Milchdrü-sengewebe resultierend in eitrigen Veränderungen im Gewebe als auch im Lymphknoten. Eine Zunahme der TLR-Expression blieb jedoch aus.

Mögliche funktionelle Konsequenzen einer TLR-Expressionssteigerung

Inwieweit eine selektive Steigerung der Toll-like-Rezeptor- und Defensingenexpression Auswir-kungen auf Mechanismen einer Abwehr im Euter hat, ist bislang nicht geklärt. Möglicherweise kann eine Veränderung des TLR-Expressionsmusters eine differentielle Immunantwort bedingen. Somit könnte ein anderes Mediator-Spektrum erzeugt werden, welches sich funktionell auf den Phänotyp der Immunantwort auswirkt. Es handelt sich hierbei jedoch um Beobachtungen auf Expressionsebene der mRNA. Dies gibt uns Aufschluss darüber, dass im Rahmen einer experi-mentellen Mastitis, Gene aktiviert werden können, die zur Erkennung und Bekämpfung von Er-regern dienen. Über die Bedeutung einer verstärkten, sowie verminderten Expression von TLRs ist bisher wenig bekannt. Neben einer Blockierung der TLR-Signaltransduktion gilt ein Herabregulieren der TLR-Expression als ein Mechanismus bakterieller Erreger, eine TLR-vermittelte Immunantwort zu hemmen (Alvarez 2005). Diese Mechanismen könnten möglicherweise die zunächst ausbleibende Modulation von TLRs während einer experimentellen Mastitis mit S. aureus erklären. Zwar konn-te hier nicht gezeigt werden, dass die TLR-Expression negativ beeinflusst wurde. Möglicherweise wurde jedoch eine Heraufregulation innerhalb der ersten 72 h einer Infektion gebremst. Bekann-

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termaßen zeigten Tiere mit nachweislicher S. aureus-Mastitis über einen längeren Zeitraum erhöh-te Werte für TLR-2 und –4 im Euter (Goldammer et al. 2004). Spekulativ bleibt bisher der Um-kehrschluss, ob eine verstärkte Expression eine verbesserte Erkennung von Pathogenen zur Fol-ge hat. Hayashi et al. (2003) konnten eine Zunahme der TLR-2- und –4-Expression nach Be-handlung mit GM-CSF in Neutrophilen Granulozyten beobachten. Eine verbesserte Reaktions-bereitschaft auf eine daraufhin folgende TLR-Stimulation konnte zumindest zu einem Teil durch die erhöhte TLR-Expression erklärt werden. Fraglich bleibt jedoch, welchen Zweck während einer experimentellen Mastitis die beobachtete Hochregulation erst nach Erregerkontakt erfüllt. Denkbar wären protektive Mechanismen in Hinsicht auf den Verlauf der Infektion. Gelänge es dem Wirt nicht, die eingedrungenen Pathogene innerhalb kürzester Zeit zu eliminieren, so könnte der daraufhin verstärkte Rezeptorbesatz eine verstärkte Reaktion hervorbringen. Werden die Er-reger jedoch initial eliminiert, so könnte eine verstärkte, potentiell gewebeschädigende Reaktion ausbleiben. Eine transiente Abnahme von TLR-2 und-4 nach LPS-Stimulation konnte auf Monozyten und Granulozyten gezeigt werden (Marsik et al. 2003). Anschliessend wurde die Expression von TLR-2 signifikant gesteigert. Das beim Menschen von Beeson (1947) zuerst beschriebene „LPS-Toleranz-Phänomen“ führt zu einer vorrübergehenden, kurzfristigen Sekretionshemmung pro-inflammatorischer Zytokine nach wiederholter Exposition gegenüber LPS. Versuche, dies durch eine vorrübergehende Herabregulation von TLR-4 zu erklären, waren bislang jedoch nicht erfolg-reich (Wittebole et al. 2005). Ein Heraufregulieren von TLR-2 in renalen Epithelzellen wird über IFN-γ und insbesondere TNF-α vermittelt (Wolfs et al. 2002). Die TLR-4-Expression scheint hingegen besonders durch IFN-γ verstärkt zu werden. Dies könnte Untersuchungen stützen, die aufzeigten dass eine Interferon-Behandlung die Reaktionsbereitschaft gegenüber LPS heraufsetzt (Hayes et al. 1995). Inwieweit sowohl die Heraufregulation von TLR-2, -4 und β-Defensinen im Rahmen eine akuten E. coli-Mastitis, als auch das Ausbleiben einer Expressionszunahme dieser Faktoren bei einer durch S. aureus hervorgerufenen Mastitis für die Pathogenese entscheidend ist, wird sich dann besser klären lassen, wenn zukünftig genomweite Transkriptom- und Proteomanalysen die Fülle an regulierten Genen und Genprodukten darstellen.

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6 Zusammenfassung Wolfram Petzl

Untersuchungen zu frühen Erreger-Wirts-Interaktionen bei der Mastitis des Rindes

Die Mastitis ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzelerkrankung in der Rinderproduktion, für die es bisher nur unbefriedigende Prophylaxe- und Therapiekonzepte gibt. Als Teil eines wissen-schaftlichen Gesamtkonzeptes trägt die vorliegende Arbeit dazu bei, Mechanismen aufzuklären, die an der Pathogenese der Mastitis beteiligt sind. Dabei stehen Ereignisse und Mechanismen im Mittelpunkt des Interesses, die in der frühen Phase der Erreger-Wirts-Interaktionen eine Rolle spielen. Mastitiden treten vermehrt in der peripartalen Phase des Rindes auf und werden in diesem Zeit-raum oft durch die Erreger Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) hervorgeru-fen. Deshalb wurde in dieser Arbeit geprüft, ob Bestandteile der beiden Erreger (sog. PAMPs) unter dem Einfluss peripartal relevanter Sexualsteroide, die Funktionalität in-vitro-generierter Makrophagen beeinflussen. Ein sehr empfindlicher Parameter zur Charakterisierung der Funkti-onalität von Makrophagen stellt deren Eigenschaft dar, nach Stimulierung mit PAMPs, Faktoren zu sezernieren, welche zum Absterben neutrophiler Granulozyten führen. In allen untersuchten bovinen Leukozytenpräparationen (neutrophile Granulozyten [PMN], mo-nonukleäre Leukozyten [MNC], Monozyten, in-vitro-generierte Makrophagen [MdM]) konnten immunhistologisch und oder mittels PCR sowohl der Progesteronrezeptor als auch die Östrogen-rezeptoren-α und –β nachgewiesen werden. Progesteron und Östradiol-17β führten hochdosiert zu einer signifikanten Senkung der Absterberate anteiliger PMN von einer CpG-stimulierten Ge-samtleukozytenpopulation. LPS-stimulierte MdM konnten unter dem Einfluss von Östradiol-17β ein Absterben von PMN verstärken. Während Progesteron keinen Einfluss auf die Zahl reiner, vitaler PMN nach Stimulation mit PAMPs nahm, starben tendenziell mehr PMN in Anwesenheit des Hormons, wenn Kokulturen der Zellen mit MdM und LPS oder der Kombination von LPS und einem CpG-Motiv stimuliert wurden. Östradiol-17β hingegen verstärkte hochsignifikant das LPS-induzierte, MdM-abhängige Sterben der PMN, nicht aber das durch LPS und durch das CpG-Motiv additiv induzierte Sterben. MdM exprimieren die Erregerrezeptoren TLR-2 und TLR-4 (Toll-like-Rezeptor-2, -4) sowie das bovine β-Defensin 5 (BNBD5). Im Gegensatz zu Progesteron senkte Östradiol-17β nicht signifikant die Expression aller drei mittels quantitativer PCR untersuchter Gene. Damit konnte gezeigt werden, dass Hormone die Reaktionsfähigkeit von Immunzellen auf Erregerbestandteile modulieren können. Um zu prüfen, ob bovine Makrophagen in ihrem Immunphänotyp polarisiert sein können, wurde der Arginin-Metabolismus näher analysiert. Erstmals wurde das Enzym Arginase in bovinen MdM und MNC nachgewiesen. Eine Induktion seiner Aktivität erfolgte bereits während der Kultivierung und ließ sich durch Stimulation mit LPS nicht signifikant stei-gern. Eine abhängige Regulation konnte für bovine MdM nicht gezeigt werden: Während LPS eine signifikante Steigerung der NO-Produktion hervorrief, zeigten sich keine Korrela-tionen der Arginase-Aktivität. Während im murinen System die Regulation der alternativen Schlüsselenzyme induzierbare NO-Synthase (pro-inflammatorisch) und Arginase (anti-inflammatorisch) meist streng dichotom erfolgt, galt dies nicht für bovine Zellen. Der Ar-ginin-Metabolismus beim Rind kann daher nicht als Hinweis auf einen vorherrschenden Immunphänotyp dienen.

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Ein Kernpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Mastitis-Infektionsmodells für das Rind. Unter streng definierten Bedingungen soll damit die frühe Phase (24-72 h) einer akuten klinischen (E. coli) sowie einer subklinisch bis chronischen (S. aureus) Mastitis simuliert werden. Die anschließende Quantifizierung von Entzündungszellen im Sekret zu unterschiedlichen Zeiten der Infektion, deren durchflusszytometrische Erfassung und Differenzierung, sowie die Messung der TLR-Expression und β-Defensingenexpression im Eutergewebe und in Lymphknoten mittels quantitativer RT-PCR sollten Mechanismen der frühen Infektionsabwehr näher charakterisieren. Die Qualität des entwickelten Mastitismodells begründet sich einerseits im straffen Vorabscree-ning der Versuchstiere (Rasse: Holstein-Friesian, 1. Laktation, 3.-5. Laktationsmonat, Freiheit von Mastitiserregern sowie somatische Zellzahl in der Milch [SCC] <100.000 Zellen/ml über mindestens zwei Wochen vor Versuchsbeginn). Andererseits wurden während der simulierten Mastitis regelmäßig die Körpertemperatur, die Milchleistung, die Eutersekretbeschaffenheit, der Euterpalpationsbefund, das Allgemeinbefinden und das Differentialblutbild dokumentiert. Erste mit Hilfe des Modells erhobene Daten waren: Alle mit E. coli infizierten Tiere reagierten mit Fieber innerhalb von 12 h. Bei den mit S. aureus über 24 und 72 h infizierten Tieren war keine signifikante Erhöhung der Körpertemperatur fest-zustellen. Die tägliche Milchleistung sank sowohl bei Tieren, die mit E. coli als auch mit S. aureus infiziert wurden signifikant entsprechend der Versuchszeiträume. Alle mit E. coli infizierten Tiere zeigten innerhalb des 24-stündigen Experiments geringgradige Störungen des Allgemeinbefin-dens, hochgradige Veränderungen des Eutersekretes (Flocken, Verlust des Milchcharakters) und eine hochgradige entzündliche Schwellung betroffener Euterviertel. Tiere, die mit S. aureus infi-ziert wurden, zeigten hingegen keine bis geringgradige klinische Anzeichen einer Mastitis. Im Gegensatz zu den 24-stündigen Infektionen mit S. aureus, zeigten die über 72 h infizierten Tiere i.d.R. deutlichere Symptome einer klinischen Mastitis (zunehmende Flockenbildung in der Milch bei erhaltenem Milchcharakter). Bei allen Tieren, die mit E. coli infiziert wurden, war bereits nach 12 h eine signifikante Leukope-nie, mit Neutropenie und Lymphopenie zu beobachten. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus wurden keine signifikanten Veränderungen der Zahl zirkulierender Leukozyten beo-bachtet. Hingegen kam es bei einer 72-stündigen Infektion zu einem transienten, signifikanten Abfall der PMN 48 h post infectionem. Sowohl E. coli als auch S. aureus konnten aus den zuvor infizierten Eutervierteln reisoliert werden. Nach Infektion mit E. coli ließ sich ein markanter, signifikanter Anstieg des SCC bereits 12 h post infectionem feststellen. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus war eine nur schwache, jedoch signifikante SCC-Erhöhung in Versuchs- und Kontrollvierteln nachzuweisen. Bei den über 72 h dauernden Infektionen mit S. aureus war die SCC-Dynamik sehr heterogen: Bei vier Tieren war ein signifikanter SCC-Anstieg zu beobachten, bei zwei Tieren nicht. Nach Infektion mit E. coli oder S. aureus stieg der Anteil neutrophiler Granulozyten in der Milch und blieb im weiteren Verlauf der Infektion erhöht. Es wurde eine starke positive Korrelation zwischen SCC-Wert und absoluter PMN-Zahl in der Milch gefunden. Es konnten keine signifi-kanten Unterschiede der Zusammensetzung zwischen untersuchten Viertelanfangs- und –endgemelken nachgewiesen werden. Eine sequentielle Infektion konnte aufzeigen, dass eine vorangegangene Infektion die Reaktions-bereitschaft auf nachfolgende Infektionen beeinflusst. Eine zweite Infektion nach 12 h mit E. coli konnte keine Erhöhung der Zellzahl herbeiführen. Ein zunächst heterogener SCC-Anstieg nach Infektion mit S. aureus verursachte 60 h später eine verbesserte, einheitliche Reaktionsbereit-schaft. Grundsätzlich konnte die Expression der TLR-2, -3, -4, -6 sowie auch boviner β-Defensine (ins-besondere des BNBD5) in allen untersuchten Eutervierteln, sowie in Euter- und Buglymphkno-ten nachgewiesen werden. Eine signifikante Hochregulation der Expression konnte für TLR-2 und –4, sowie für bovine β-Defensine nach Infektion mit E. coli in den infizierten Eutervierteln, den Euterlymphknoten und teilweise in den somatischen Zellen des Milchsekrets gezeigt werden.

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S. aureus bewirkte erst nach 72-stündiger Infektion und lediglich bei den β-Defensinen eine signi-fikante Expressionssteigerung in den Euterlymphknoten beider Seiten. Mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit erstellten Mastitismodells wurden orientierte Daten zur Einschätzung der Bedeutung von Erreger-Erkennungs-Rezeptoren für frühe Erreger-Wirts-Interaktionen in der Milchdrüse erlangt. Nach Erweiterung des Untersuchungsspektrums steht damit ein Instrument zur Verfügung, das zur Klärung einer ganzen Reihe spezifischer Fragestel-lungen zur Pathogenese von Mastitiden eingesetzt werden kann. Folgeexperimente dieser Arbeit werden vor allem Problemstellungen zur Bedeutung unterschiedlich hoher Milchzellzahlen auf die frühen Erreger-Wirts-Mechanismen, die Krankheitsverläufe nach Einsatz von Erregerstäm-men mit unterschiedlichen Pathogenitätseigenschaften, aber vor allem auch molekularen Grund-lagen von Infektions- und initialen Abwehrmechanismen in der Milchdrüse anhand Transkrip-tom- und Proteomanalysen beinhalten. Erworbene Erkenntnisse werden als Grundlage zur Defi-nition neuer Parameter für das Merkmal „Eutergesundheit“ dienen. Langfristig sollen neue Kan-didatengene für die Zucht von Kühen mit verbessertem Immunschutz identifiziert und funktio-nell validiert werden.

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7 Summary Wolfram Petzl Investigations on early host-pathogen interactions during bovine mastitis Mastitis is the most important disease in dairy production in terms of economic impact. How-ever, concepts for prophylaxis and therapy are still unsatisfactory. This work is part of a scientific framework project and deals with mechanisms participating in the pathogenesis of mastitis. We focus especially on events and mechanisms during the early phase of the host defense. Mastitis occurs rather frequently during the periparturient period, often due to Staphylococcus aureus or Escherichia coli infection. Thus, it was tested whether pathogen associated molecular patterns (PAMPs) of these bacterial species influence the function of in vitro generated macrophages (MdM) in the context of relevant sexual steroid hormones. The accelerated killing of cocultured neutrophilic granulocytes by secreted factors of stimulated MdM was taken as a very sensitive read-out system. All studied leukocyte populations (polymorphonuclear neutrophils [PMN], mononuclear cells [MNC], monocytes and MdM) contained progesterone and estrogen (α, β) receptors as proven by immune-histological assessment or PCR. Progesterone and estradiol-17β, at high concentrations, significantly inhibited the induced killing of PMN in a CpG-stimulated leukocyte population. LPS-stimulated MdM enhanced the killing of PMN under the influence of estradiol-17β. Proges-terone had no effect on the number of pure and viable PMN after PAMP stimulation. More PMN died in the presence of progesterone if cocultures of PMN and MdM were stimulated with LPS or the combination of LPS and a CpG motif. Estradiol-17β also enhanced significantly the LPS-induced, MdM-dependend killing of PMN, but not the killing induced by LPS or LPS+CpG motif. MdM expressed the pattern recognition receptors TLR-2 and TLR-4 (Toll like receptor-2, -4) and the bovine β-defensin 5 (BNBD5). In contrast to progesterone, estradiol-17β did not reduce significantly the expression of all three genes, as determined by quantitative RT-PCR. In summary, it could be shown that the tested hormones are able to modulate the response of im-mune cells to PAMPs. A possible polarization of the immune phenotype of bovine MdM was analyzed by investigating the arginine metabolism. For the first time the enzyme arginase could be detected in bovine MdM and MNC. Arginase was already induced during cell culturing and the activity was not or irregularly enhanced after LPS stimulation. In contrast, LPS significantly induced an enhanced NO production. In the murine system the regulation of the alternative key enzymes inducible nitric oxide synthase (iNOS, pro-inflammatory) and arginase (anti inflammatory) is strictly di-chotomic. This seems not to be the case for bovine cells and thus, the bovine arginase metabo-lism cannot serve as an indicator for a dominating immune phenotype or the immune polariza-tion of a cell type. One main part of this work was the development of a mastitis infection model in cattle aiming to simulate the early phase (24-72 h) of an acute clinical (E. coli) and a subclinical to chronic (S. aureus) mastitis under strictly defined conditions. Mechanisms of the early immune defense were characterized by quantification of inflammatory cells in the milk at different times after infection, their flow cytometrical differentiation, and the measurement of TLR and β-defensin expression in udder tissue and lymphnodes with quantitative RT-PCR. The quality of the mastitis model is based on the pre screening of the animals (Holstein-Frisian, first lactation, 3rd-5th month of lac-tation, free from mastitis pathogens and somatic milk cell counts [SCC] <100.000 cells/ml for at least two weeks before challenge). During the simulated mastitis, the body temperature, the milk yield, the consistency of the udder secretions, the palpational findings of the udder tissue, the

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general condition and the differential blood counts were regularly documented. The data gener-ated with this model can be summarized as follows: All animals infected with E. coli had fever within 12 h. In contrast, no animal infected with S. aureus responded with fever. The daily milk yield dropped significantly in both animal groups. All animals infected with E. coli had a slightly impaired general condition within a 24 h experiment, high degree changes of the milk secretions (flakes, loss of milk character) and a profound in-flammatory swelling of the affected quarter of the udder. Animals infected with S. aureus showed no or only modest clinical signs of mastitis. In opposition to the group examined 24 h after infec-tion, the 72 h group exhibited more drastic symptoms of clinical mastitis (increasing number of flakes but maintaining the milk character). In all heifers infected with E. coli a significant leuko-penia, with neutropenia and lymphopenia was observed 12 h after host contact. However, infec-tion with S. aureus did not lead to such a significant drop in the white blood cell count. Only 72 h post infectionem a transient decline of circulating leucocytes was detected. E. coli as well as S. aureus could be reisolated from previously infected udder quarters. After infection with E. coli, a significant increase of the SCC could be noted already 12 h post infec-tionem. During a 24 h infection period with S. aureus only a weak but significant raise in SCC in the infected and control quarters was seen. Infections with S. aureus for 72 h resulted in a heteroge-neous SCC dynamic. In four animals, the SCC increase was significant, in two animals it was not. After E. coli or S. aureus infection the percentage of milk neutrophilic granulocytes increased and stayed at higher levels during the infection period. The correlation between SCC and absolute milk PMN counts was strong positive. With respect to cell composition there were no significant differences in probes taken at beginning and end of milking. The sequential infection of quarters showed, that previously infected quarters influence the reac-tion of subsequently infected quarters. A second infection, 12 h after the first infection, did not result in a SCC increase. And, a heterogeneous increase in SCC after S. aureus infection turned to a homogenous reaction when adjacent quarters were infected 60 h later. Basically, expression of TLR-2, -3, -4, -6 and bovine β-defensins (especially BNBD5) could be demonstrated in all investigated udder quarters, in lnn. mammarii and lnn. cervicales superficiales. A significant upregulation could be shown for TLR-2, –4, and bovine β-defensins after E. coli infec-tion in the infected quarter tissues, the lnn. mammarii and partially in the somatic milk cells. S. aureus induced a significant upregulation of β-defensin expression in both lnn. mammarii only 72 hours after infection. Using the established mastitis model, preliminary data were generated to estimate the meaning of pathogen recognition receptors for early host pathogen interactions in the udder. After extending the investigation spectrum this model can serve as a useful instrument for the clarification of a whole set of specific questions regarding the pathogenesis of mastitis. Follow-up experiments will focus mainly on the meaning of varying milk cell numbers on the early host pathogen mechanisms, the development of the disease after using pathogen strains of different pathogenicity, and the molecular basics of initial defense mechanisms after an infection by means of transcriptome and proteome analysis. The acquired knowledge will help to define new parameters for the term “udder health”. On a long-term basis new candidate genes are to be identified and validated functionally for the breed-ing of cows with improved immune protection.

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Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Untersuchungen zu frühen Erreger-Wirts-Interaktionen bei der Mastitis des Rindes“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: 1. Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie und der Klinik für Rinder

der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.

2. Die Herstellung der Gewebeschnitte als auch die pathologisch-histologischen Untersuchungen wurden freundlicherweise im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durch Herrn PD Dr. Wohlsein durchgeführt.

3. Die Messung der TLR- und Defensingenexpression erfolgte freundlicherweise unter der Lei-tung von Prof. Dr. H. M. Seyfert im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf.

4. Bakteriologische Untersuchungen von Viertelanfangsgemelken wurden freundlicherweise im mikrobiologischen Labor der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover un-ter der Leitung von Frau Dr. Schröder durchgeführt.

5. Die Stammhaltung der Bakterien und die biochemische Charakterisierung erfolgte freundli-cherweise im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Prof. Valentin-Weigand.

6. Eine Untersuchung der Plasmidmuster infundierter wie reisolierter Bakterienstämme wurde freundlicherweise von Prof. S. Schwarz, FAL, Mariensee, durchgeführt.

7. Die Bestimmung der Konzentration von Steroidhormonen wurde durch das Endo- krinologi-sche Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchge-führt.

8. Der Nachweis von Steroidhormonrezeptoren erfolgte freundlicherweise durch PD Dr. Ger-hard Schuler, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Giessen.

9. Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft in Form von Personal- und Sachmittelspenden angefertigt (DFG SCHU 1108/2-1/2).

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

1. Arbeitsgruppe Immunologie und Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Han-nover.

2. Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Hannover, den 28.8.2005 Wolfram Petzl

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Danksagung Zunächst möchte ich mich ganz herzlich bei meinen beiden Betreuern Herrn Prof. Dr. Holm Zerbe und Herrn Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth bedanken. Als Vertreter von Klinik und Paraklinik haben sie synergistisch zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Ihr großes Engage-ment, ihr allzeit bereites Ohr und Verständnis für meine Belange und Ihre Fähigkeit die Dinge aus unterschiedlichsten Blickwinkeln zu betrachten, waren unübertroffen. Herrn Prof. Dr. Wolfgang Leibold danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes. Weiterhin danke ich unseren Kooperationspartnern für Ihre konzeptionelle Zusammenarbeit und die Durchführung von Untersuchungen. Insbesondere seien hier erwähnt Herr Prof. Dr. Seyfert und Frau Deike, des Weiteren Herr PD Dr. Wohlsein, Frau Dr. Schröder, Herr Prof. Dr. Valen-tin-Weigand, Herr PD Dr. Schuler und Prof. Dr. Schwarz. Ich danke Frau Prof. Dr. Martina Hoedemaker für die genaue Durchsicht dieser Arbeit und ihre konstruktiven Anmerkungen. Ein ganz großer Dank gilt unseren Laboranten Herrn Udo Rabe, Frau Silke Schöneberg wie auch Frau Sonja Kordex für ihre Unterstützung zu jeder Zeit und die hervorragende Einarbeitung in die Geheimnisse der Laborarbeit. Darüber hinaus möchte ich mich bei allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Immunologie für die gute Stimmung bei der Arbeit und danach bedanken. Ich danke den Tierpflegern der Klinik für Rinder, allen voran Herrn Michael Sachs und Herrn Frank Kreißer, für Ihre Unterstützung während unserer Infektionsversuche. Im Kampf gegen den Fehlerteufel waren mir dankbarerweise Frau Stefanie Klenner und mein Vater Georg Petzl eine große Hilfe. Liebe Nadine, Dir vielen Dank nicht nur fürs Korrigieren, sondern auch für die monatelange Unterstützung, die Du mir gegeben hast. Und diesen Leuten danke ich nicht: Herrn Edward Aloysius Murphy Jr. (* 1917, †1990) für die Formulierung seiner Gesetze, Herrn Bill Gates (* 1955) für seine schlampige Programmierung diverser Anwendungen und zu allerletzt Gott Chronos für seine erbarmungslose Beeinflussung der Uhrzeit.