Aus der Klinik für kleine Haustiere

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Untersuchungen zur Pharmakokinetik, gerinnungsphysiologischen

Wirkung und Immunogenität von rekombinantem humanen

Faktor VIIa bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden

I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N

Zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Bernd Dörsch

aus Wuppertal

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. R. Mischke 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2004

Gewidmet

Anke, meiner Verlobten

und

Erika, meiner Mutter

Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 7

1 Einleitung 9

2 Literaturübersicht 10

2.1 Theorie der Blutgerinnung und Rolle des Faktors VII 10

2.2 Hereditärer Faktor VII-Mangel (einschließlich Therapie) 12

2.2.1 Mensch 12

2.2.2 Hund 15

2.3 Rekombinanter humaner Faktor VIIa 17

2.3.1 Chemische Struktur 17

2.3.2 Pharmakokinetik 17

2.3.2.1 Mensch 17

2.3.2.2 Hund 18

2.3.3 Klinische Anwendung 19

2.3.3.1 Mensch 19

2.3.3.1.1 Indikationen außer Faktor VII-Mangel 19

2.3.3.1.2 Faktor VII-Mangel 23

2.3.3.1.3 Laborkontrolle der Anwendung beim Menschen 25

2.3.3.2 Hund 28

3 Eigene Untersuchungen 31

3.1 Material, Tiere und Methoden 31

3.1.1 Material 31

3.1.1.1 Geräte und Bezugsquellen 31

3.1.1.2 Reagenzien und Bezugsquellen 31

3.1.1.3 Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen 33

3.1.2 Tiere 33

3.1.3 Methoden 35

3.1.3.1 Versuchsaufbau 36

3.1.3.2 Vorbereitung der Patienten 36

3.1.3.3 Blutentnahme und Probenbehandlung 36

3.1.3.4 Labormethoden 37

3.1.3.4.1 Hämatokrit und Thrombozytenzahl 36

3.1.3.4.2 Poolplasma 37

3.1.3.4.3 Prothrombinzeit 37

3.1.3.4.4 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit 39

3.1.3.4.5 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII-Aktivität 39

3.1.3.4.6 Bestimmung der humanen Faktor VIIa-Antigen-Konzentration 40

3.1.3.4.7 Nachweis der kaninen Antikörperbildung gegen rekombinanten

humanen Faktor VIIa 44

3.1.4 Pharmakokinetische Berechnungen 48

3.1.5 Statistische Auswertung 48

4 Ergebnisse 50

4.1 Klinische Verträglichkeit 50

4.2 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII-Aktivität 50

4.3 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor

VII:C-Aktivität 51

4.4 Konzentration des humanen Faktor VIIa-Antigens 52

4.5 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor

VIIa-Antigen-Konzentration 54

4.6 Prothrombinzeit 56

4.7 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit 58

4.8 Thrombozytenzahl 59

4.9 Hämatokrit 60

4.10 Kanine Antikörperbildung gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa 61

5 Diskussion 62

6 Zusammenfassung 69

7 Summary 72

8 Literaturverzeichnis 74

Tabellarischer Anhang 96

Abkürzungsverzeichnis:

α = initiale Verteilungsgeschwindigkeitskonstante

a = aktiviert (bei Gerinnungsfaktorennamen)

Abb. = Abbildung

Ak = Antikörper

aPTT = Aktivierte Partielle Thromboplastinzeit

Aqua bidest. = Aqua bidestillata

AUC = Area under the curve

β = Eliminationskonstante

C0-ber = berechnete Anfangskonzentration

C0-gem = gemessene Anfangskonzentration

Ca2+-Ionen = Kalzium-Ionen

Cltot = totale Clearance

DBA-Puffer = Diäthylbarbiturat-Acetat-Puffer

DIG = Disseminierte intravasale Gerinnung

DNA = Desoxyribonukleinsäure

DTI = Dauertropfinfusion

∆% = korrigierte Aktivität (nach Subtraktion des Nullwertes)

e = Eulersche Zahl

EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA = Enzymelinked Immunosorbent Assay

F = Faktor (Gerinnungsfaktor)

FVII:C = Faktor VII (koagulometrisch gemessen)

FVII:Ag = Faktor VII-Antigen

FVIIa:Ag = Faktor VII-aktiviert-Antigen

x g = Vielfaches der Erdbeschleunigung

g = Gramm

h = Stunde

IE = Internationale Einheiten

IgG = Immunglobulin G

IgM = Immunglobulin M

iv = intravenös

kDa = Kilodalton

KM = Körpermasse

ln (2) = natürlicher Logarithmus

MC = Mikrochip-Nummer

min = Minute

mmol = Millimol

µg = Mikrogramm

µl = Mikroliter

n = Anzahl

N = Normalität

ng = Nanogramm

nm = Nanometer

PAP = Plättchenarmes Plasma

pt = p-Wert des paarigen t-Tests

PT = Prothrombinzeit

PTMT = Prothrombinzeit (modifizierter Test)

PTST = Prothrombinzeit (Standardtest)

rhFVIIa = rekombinanter humaner Faktor VIIa

Rt = Raumtemperatur

s = Standardabweichung

sec = Sekunden

t50 = Halbwertszeit

Tab. = Tabelle

TMB = 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin

% v/v = Volumenprozent

Vdβ = Verteilungsvolumen auf der Basis der Eliminantionskonstante β

VWF = von Willebrand-Faktor

= arithmetischer Mittelwert

9

1 Einleitung

Rekombinanter Humaner Faktor VIIa (rhFVIIa, NovoSeven, Novodisk, Dänemark) wird

beim Menschen als Therapeutikum bei Blutungskrisen infolge Hämophilie A und B

(insbesondere Hemmkörperhämophilien), Faktor VII-Defizienz sowie anderen hereditären

Gerinnungsfaktormängeln, disseminierter intravasaler Gerinnung (DIG), Thrombozytopenien

und -pathien sowie schweren lebensbedrohlichen Blutungen anderer Ursache eingesetzt

(LINDLEY et al. 1994, BECH et al. 1995, WHITE et al. 1999a, HEDNER 2000,

MOSCARDO et al. 2001). Er birgt für die Anwendung beim Menschen den Vorteil, daß er

aus einem virusfreien Vermehrungsmedium gewonnen wird, und beinhaltet somit nicht die

Risiken die bei konventionell aus Plasma gewonnenen Faktorkonzentraten bestehen,

insbesondere die häufig vorkommenden Virusinfektionen. Rekombinanter Faktor VIIa wurde

beim Menschen in zahlreichen klinischen Studien in den verschiedenen

Anwendungsbereichen auf seine Wirksamkeit und Sicherheit überprüft (LINDLEY et al.

1994, HEDNER 2000), jedoch sind nach wie vor verschiedene Fragen, wie z.B. die Sicherheit

bei DIG und der Wirkmechanismus bei Thrombozytopenie, ungeklärt (CHUANSUMRIT et

al. 2000, POON et al. 2000, MOSCARDO et al. 2001, KRISTENSEN et al. 2003).

Der Hund stellt für verschiedene Fragestellungen ein gutes Tiermodell für die

Grundlagenforschung der Hämostase sowie klinische Hämostaseforschung beim Menschen

dar (HOVIG et al. 1967, SPURLING et al. 1974, MISCHKE und NOLTE 1999). Es liegt eine

orientierende Studie beim Hund vor, in der rhFVIIa bei einzelnen Patienten mit Hämophilie

A, Hämophilie B und der von Willebrand-Erkrankung mit ersten tendenziell positiven

Ergebnissen zur Anwendung gelangte (BRINKHOUS et al. 1989). Allerdings liegen bislang

keinerlei systematische Untersuchungen zur Pharmakokinetik und -dynamik vor. Vor diesem

Hintergrund soll das vorliegende Projekt die Pharmakokinetik und Einflüsse auf das

Gerinnungssystem von rhFVIIa bei gerinnungsphysiologisch gesunden und Faktor VII-

defizienten Hunden erarbeiten und dadurch die Grundlagen für tierexperimentelle

Untersuchungen liefern. Obgleich der hohe Preis zur Zeit die Möglichkeiten eines klinischen

Einsatzes limitiert, werden damit gleichzeitig die Grundlagen für die klinische Anwendung

beim Hund geschaffen.

10

2 Literaturübersicht

2.1 Theorie der Blutgerinnung und Rolle des Faktors VII

Der Prozeß der Blutgerinnung beinhaltet eine Anzahl von vernetzten biochemischen

Reaktionen, deren Faktoren neben ihren Eigennamen gewöhnlich mit römischen Zahlen in der

Reihenfolge ihrer Entdeckung bezeichnet werden. Die Blutgerinnung kann nach der

klassischen Lehre auf zwei Wegen initiiert werden: dem endogenen Weg (endogenes System,

Intrinsic System) oder dem exogenen Weg (exogenes System, Extrinsic System), beide

münden in der Aktivierung des Faktors X zu Faktor Xa (a= aktiviert) im gemeinsamen Weg

(EDER 1987, TROY 1988, DODDS 1997).

Das endogene System wird aktiviert, wenn Blut mit Fremdoberflächen (körperfremdes

Material, subendotheliales Gewebe, pathologisch verändertes Gefäßendothel, Zellfragmente)

in Kontakt kommt. Dadurch werden der Kontaktfaktor Faktor XII und Präkallikrein zu Faktor

XIIa bzw. Kallikrein aktiviert, und dadurch mit Hilfe des Kofaktors hochmolekulares

Kininogen der Faktor XI zu Faktor XIa aktiviert (MISCHKE und NOLTE 1999). Dieser

Kontaktaktivierung kommt nach aktuellen Vorstellungen bei der In-vivo-Gerinnung keine

wesentliche Bedeutung zu (ALLEN et al. 2002). Faktor XIa bewirkt die Aktivierung von

Faktor IX zu Faktor IXa, der dann mit dem durch Thrombin aktivierten Faktor VIIIa und

Kalzium-Ionen (Ca2+) auf der Phospholipidschicht der Thrombozytenmembran einen

Komplex bildet, der auch als Tenase-Komplex bezeichnet wird (BOUDREAUX 1996,

DODDS 1997). Dieser Komplex aktiviert dann Faktor X zu Faktor Xa.

Das exogene System startet, wenn Blutzellen oder geschädigte Gewebe

Gewebsthromboplastin freisetzen. Hierbei handelt es sich um einen Protein-Phospholipid-

Komplex, der zur Aktivierung von Faktor VII zu Faktor VIIa führt. Gewebsthromboplastin

bildet mit Faktor VIIa und Kalzium-Ionen (Ca2+-Ionen) einen Komplex, der dann zur

Aktivierung von Faktor X (TROY 1988, DODDS 1997, MISCHKE und NOLTE 1999) führt.

Die Faktor X-Bildung erhöht ihrerseits die Faktor VII-Aktivierung um das 900fache über eine

positive Rückkopplungsschleife (DODDS 1997).

Der gemeinsame Weg wird zunächst durch das exogene System initiiert (INGERSLEV et al.

2000, ALLEN et al. 2002). In dem gemeinsamen Weg aktiviert der Faktor Xa den Faktor V

und bildet mit diesem unter Beteiligung von Ca2+-Ionen einen sogenannten

11

Prothrombinaktivator-Komplex (EDER 1987), der Prothrombin zu Thrombin aktiviert.

Thrombin spaltet vom Fibrinogen kleine Peptide (Fibrinopeptide A und B) ab, so daß lösliche

Fibrinmonomere entstehen, die dann durch den ebenfalls durch Thrombin aktivierten Faktor

XIII in Gegenwart von Kalzium-Ionen zu vernetztem Fibrin verbunden werden, das den

Plättchentrombus stabilisiert (EDER 1987, DODDS 1997). Thrombin führt auch über eine

Aktivierung der Faktoren V, VIII und XI zu einer positiven Rückkopplung (McCONNELL

2000).

Das klassische Modell stellt diese Reaktionen als hintereinander ablaufende Kaskade dar

(EDER 1987, MISCHKE 1999, ALLEN 2002). Dieses Modell ist auch gut geeignet, um die

Ergebnisse der Prothrombinzeit und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit zu

interpretieren (MISCHKE 1999, ALLEN 2002). Neben dem oben angegebenen vereinfachten

Schema kommt es aber in vivo zu zahlreichen Nebenreaktionen und 2

Rückkopplungsschleifen. So können z.B. aktivierte Thrombozyten bei Anwesenheit von

Kallikrein die Kontaktaktivierung von Faktor XII umgehen und direkt den Faktor XI zu

Faktor XIa aktivieren. Ebenso wird Faktor IX auch von Faktor VIIa über die sogenannte

Josso-Schleife bzw. „Josso Pathway“ (JENSEN et al. 1976, XI et al. 1989, MISCHKE und

NOLTE 1999) oder „Alternate Pathway“ (WEISSBACH, 1991a) aktiviert. Dies verdeutlicht

die wesentliche Bedeutung von Faktor VII für die physiologische Blutgerinnung.

Diese Vernetzungen der Reaktionen des endogenen und exogenen Weges des klassischen

Modells, und nicht zuletzt die neuen Aspekte, die sich durch die Anwendbarkeit von rhFVIIa

bei thrombozytären Blutstillungsstörungen ergaben, haben neuerdings in der

humanmedizinischen Literatur zu einem zellbasierten Modell der Gerinnung geführt (POON

et al. 2000, HOFFMAN und MONROE 2001, MARTINOWITZ et al. 2001, ALLEN et al.

2002, MARTINOWITZ et al. 2002). Dieses Modell wurde in der veterinärmedizinischen

Literatur erstmals von KRISTENSEN et al. (2003), im Zusammenhang mit dem möglichen

Einsatz von rhFVIIa, erwähnt. Bei diesem Modell wird auch die Bedeutung der

Gewebsthromboplastin-enthaltenden Zellen und Thrombozyten als Plattform für die

biochemische Reaktionen der bisher sogenannten „plasmatischen Gerinnung“ betont (Abb. 1).

Die Reaktionsschritte der Blutgerinnung werden in Initiation, Amplifikation und Propagation

unterteilt (ALLEN et al. 2002). Nach diesem Modell kommt dem Faktor VIIa-

Gewebsthromboplastin-Komplex bei der Initiation der Hämostase die entscheidende

12

Bedeutung zu (HOFFMAN und MONROE 2001, ALLEN et al. 2002). Der in geringen

Mengen auch ohne Aktivierung der Gerinnung kursierende Faktor VIIa bildet bei einer

Blutung einen Komplex mit Gewebsthromboplastin, das auf der Oberfläche von geschädigten

Zellen des Blutes oder verletzten Gewebes vorhanden ist (HOFFMAN und MONROE 2001,

MARTINOWITZ et al. 2002). Hierdurch werden kleine Mengen Thrombin über die auf der

Zelloberfläche ablaufenden weiteren Aktivierungsreaktionen der Faktoren X, V und II

gebildet und ins Plasma abgegeben. Parallel dazu wird ebenfalls auf der

Gewebsthromboplastin-enthaltenden Zelle über die oben beschriebene Josso-Schleife Faktor

IX aktiviert und ins Plasma abgegeben. Bei der Amplifikation trennt und aktiviert das

gebildete Thrombin den an von Willebrand-Faktor gebundenen Faktor VIII, aktiviert Faktor

XI und führt zu einer Aktivierung der Thrombozyten mit Formänderung und anschließender

Ausschleusung und Aktivierung des Faktors V. Diese aktivierten Faktoren befinden sich dann

auf der Oberfläche der aktivierten Thrombozyten (HOFFMAN und MONROE 2001, ALLEN

et al. 2002). Bei der Propagation wird der in der Initiation und lokal durch

thrombozytenständigen Faktor XIa gebildete Faktor IXa in den Tenase-Komplex eingebunden

und über den Prothrombinkomplex in großen Mengen Thrombin gebildet (ALLEN et al.

2002).

2.2 Hereditärer Faktor VII-Mangel (einschließlich Therapie)

2.2.1.1 Mensch

Beim hereditären Faktor VII-Mangel handelt es sich beim Menschen um einen autosomal-

rezessiv vererbten Defekt (ROBERTS und HOFMANN 1995, ROBERTS und BINGHAM

1998, MADLENER und PÖTZSCH 1999). Ursache ist eine Mutation der kodierenden

Gensequenz auf Chromosom 13. Es sind über 20 Mutationen innerhalb des Faktor VII-Gens

bekannt (MADLENER und PÖTZSCH 1999). Basierend auf Unterschieden in

Radioimmunoassays, Neutralisationstests und der In-vitro-Aktivität von Faktor VII nach

Abb. 1 (S. 13): Darstellung des verschiedenen Phasen der Gerinnung bis zur massiven

Vermehrung des Thrombins nach dem zellbasierten Model der Gerinnung modifiziert nach

ALLEN et al. (2002).

13

Initiation: Amplifikation: Propagation:

F= Faktor; a (bei Faktorennamen)= aktiviert; vWF= von Willebrand-Faktor

Zelle mit Gewebsthromboplastin

FVIIa

FXa

FXa FVa

FX FIIFIIa

FVIIa

FIX FIXa

aktivierter Thrombozyt

FXIa Tenase-Komplex

FVIIIa

FIX

Prothrombin-Komplex

FX

FII

FIIa

FIIa

FIIa

FVIII/vWF FVIIIa

vWF

FIIa Thrombozyt aktivierter

Thrombozyt

FXIa

FXIa

FVIIIa FVa

FVa

14

Aktivierung mit verschiedenen Gewebsthromboplastinen sind mehrere Varianten beschrieben

worden (ROBERTS und HOFMANN 1995, ROBERTS und BINGHAM 1998).

MADLENER und PÖTZSCH (1999) geben auch zwei Typen an: Einen Typ I-Mangel, bei

dem eine Verminderung der koagulometrisch gemessenen Faktor VII(FVII:C)-Aktivität und

Faktor VII-Antigen(FVII:Ag)-Konzentration vorhanden ist, wogegen sich der Typ II-Mangel

durch eine verminderte FVII:C-Aktivität bei nur leicht reduzierter Plasmakonzentration von

FVI:Ag auszeichnet. Weltweit sind bisher bei sechs Fällen natürliche Autoantikörper

festgestellt worden (KAMIKUBO et al. 2000, ROBERTS und WHITE 2001). Sehr selten

treten auch als erworbene Form Alloantikörper nach Gabe von Faktor VII-Präparaten auf

(ROBERTS und WHITE 2001).

Der angeborene Faktor VII-Mangel ist beim Menschen selten, als geschätzte Inzidenz wird

von ROBERTS und HOFMANN (1995) sowie MADLENER und PÖTZSCH (1999)

1:500000 angegeben, während WEISSBACH eine Erkrankungshäufigkeit von 1:2 Millionen

beschreibt (1991b). BECH et al. (1995) geben die geschätzte absolute Zahl der Patienten mit

schwerer Blutungssymptomatik weltweit mit 100 bis 250 an. Männer und Frauen sind

gleichermaßen betroffen (ROBERTS und HOFMANN 1995).

Heterozygote Individuen sind klinisch asymptomatisch oder haben nur eine milde

Blutungssymptomatik. Homozygote Individuen mit 1-10% FVII:C-Aktivität haben meist nur

milde Symptome, bei weniger als 1% Aktivität können aber Blutungsepisoden wie bei

schwerer Hämophilie A oder B auftreten. Diese äußern sich in Form von rezidivierenden

Gelenkblutungen, chronischen Arthropathien, Hämatomen, Epistaxis, Menorrhagie,

Hämaturie, Blutungen in den Magen-Darm-Trakt und Zahnfleischblutungen (RAGNI et al.

1981, ROBERTS und BINGHAM 1998, HANDIN 2001). Die Schwere der Blutungsneigung

korreliert beim Menschen nicht immer mit der FVII:C-Aktivität, sondern ist auch von der Art

des genetischen Defektes abhängig (HERRMANN und WULF 1998, ROBERTS und

BINGHAM 1998, HANDIN 2001).

Bei Routine-Labortests fallen eine verlängerte Prothrombinzeit (PT) bei normaler aktivierter

partieller Thromboplastinzeit (aPTT), normaler Thrombinzeit und normalem Russels Viper

Venom Test (Screening-Test zur Bestimmung der Prothrombin-Aktivität) auf (WEISSBACH

1991, ROBERTS und HOFMANN 1995, MADLENER und PÖTZSCH 1999). Der Faktor

VII-Mangel ist die einzige erbliche Erkrankung mit dieser Kombination von Gerinnungstest-

15

Ergebnissen (WEISSBACH 1991, ROBERTS und HOFMANN 1995). Die

Einzelfaktoranalyse zeigt eine isoliert verminderte FVII:C-Aktivität auf (WEISSBACH

1991, ROBERTS und HOFMANN 1995).

Therapeutisch werden beim Menschen bei schweren Blutungsepisoden Frischplasma-

Präparate, Prothrombinkomplex-Präparate und rekombinante Faktor VII- und Faktor-VIIa-

Präparate eingesetzt (ROBERTS und HOFMANN 1995, ROBERTS und BINGHAM 1998,

HANDIN 2001).

2.1.2 Hund

Der spontane hereditäre Faktor VII-Mangel ist außer beim Menschen nur beim Hund

beschrieben worden (DODDS 1997). Bei Mäusen konnte dieser hereditäre Defekt

experimentell durch Deletion der kompletten kodierenden Gensequenz für diesen Faktor

erzeugt werden (ROSEN et al. 1997). Beim Hund ist diese Erkrankung v. a. bei Beagles in

verschiedenen Teilen der Welt gefunden worden (MUSTARD et al. 1962, SPURLING 1980,

SPURLING 1988, DODDS 1997). Beim Beagle ist einerseits ein autosomal-rezessiver

Erbgang beschrieben worden (SPURLING et al. 1974, SPURLING 1988, DODDS 1997,

McPHERSON et al. 1999), während andererseits GREEN und THOMAS (1995) und

LITTLEWOOD (2000) für dieselbe Spezies einen autosomal-dominanten Erbgang mit

inkompletter Dominanz angeben. Es wurde eine inkomplette Deletion der Faktor VII-

Synthese gezeigt (SPURLING 1986). WILHELM et al. (2001) konnten den Gendefekt bei

Faktor VII-defizienten Beagles charakterisieren. Es handelt sich um eine Punktmutation an

Nukleotid 443 mit einer Substitution von Guanin durch Adenin, was einen Austausch der

Aminosäure Glycin gegen Glutaminsäure im Faktor VII-Protein an Stelle 96 bewirkt. Diese

defekten Faktor VII-Moleküle werden zwar normal sezerniert, haben aber eine reduzierte

Gerinnungsaktivität. Damit übereinstimmend hat SPURLING (1988) beschrieben, daß beim

Faktor VII-defizienten Beagle die Werte für die FVII:C-Aktivität niedriger als die FVII:Ag-

Konzentration sind Neben dem Beagle ist der Faktor VII-Mangel vereinzelt auch bei

Bulldoggen, einem Wurf Alaskan Malamutes und einem Mischlingshund beschrieben worden

(SPURLING 1980, DODDS 1997, McPHERSON 1999). Der Vererbungsmodus ist bei diesen

Rassen noch nicht belegt.

16

Beim Hund sind bei heterozygoten Faktor VII-Mangel-Tieren keine und bei homozygoten

meist keine oder nur milde Symptome beschrieben worden, wie kleine Hämatome nach

Kämpfen (GREEN und THOMAS 1995, HOVIG et al. 1967, SPURLING 1974b). So werden

Faktor VII-defiziente Hunde teilweise nur per Zufall entdeckt (SPURLING et al. 1974b).

Auch Operationen können meist ohne abnorme Blutungen durchgeführt werden (SPURLING

et al. 1974b, WHEELER et al. 1984). Erst bei FVII:C-Aktivitäten < 5% treten teilweise auch

stärkere Symptome auf, wie Hämatome, starke Blutungen bei Operationen, steifer Gang

infolge Hämarthrose, exzessive Blutung nach Abort, anhaltende vaginale und uterine

Blutungen und exzessive Blutung nach Leberruptur (SPURLING 1974b, WHEELER et al.

1984, McPHERSON et al. 1999). Beim Hund ist auch eine Prädisposition für die

generalisierte Demodikose beschrieben worden (DODDS 1997). Auf der anderen Seite

konnten bei Hunden mit hereditärem Faktor VII-Mangel Anzeichen für eine verringerte

Empfindlichkeit für einen Endotoxin-Schock gefunden werden (GARNER und EVENSEN

1974).

Die Laborergebnisse entsprechen denen des Menschen (SPURLING 1986, MISCHKE et al.

2003). Homozygote Hunde haben meist eine FVII:C-Aktivität von 1-5 %, teilweise bis 15 %,

während heterozygote eine FVII:C-Aktivität von 15-65 % aufweisen (POLLER et al. 1971,

SPURLING 1980, DODDS 1997). Auch bei schweren Fällen sind bei Hunden immer geringe

Aktivitäten an FVII:C im Plasma nachweisbar (SPURLING, 1986).

Bei blutenden Hunden mit hereditärem Faktor VII-Mangel wurden, wenn nötig, lokale

blutstillende Maßnahmen wie Kauterisation sowie eine Substitutionsbehandlung mit

Transfusionen von Vollblut oder gefrorenem Frischplasma eingesetzt (SPURLING et al.

1974b, WHEELER et al. 1984, DODDS 1997). WHEELER et al. (1984) berichteten über die

viermalige Transfusion von 500 ml Vollblut im Abstand von 12 – 24 Stunden (h) bei einer

13,2 kg schweren Hündin mit vaginaler Blutung. Aber erst eine Operation mit Kauterisation

des kleinen Defekts erzielte einen langfristigen Effekt. SPURLING et al. (1974b) berichteten

über eine Beagle-Hündin, deren Gewicht nicht angegeben wurde, die bei anhaltenden

Blutungen nach der Geburt eine zweimalige Transfusion von jeweils 100 ml Vollblut im

Abstand von 24 h erhielt. Nach der zweiten Transfusion war der Effekt zufriedenstellend.

Auch humane Faktor VIIa-Konzentrate sind beim Faktor VII-defizienten Hund grundsätzlich

einsetzbar (CHABBAT et al. 1988), ihre Verwendung bei Faktor VII-defizienten Hunden ist

17

bisher aber noch nicht beschrieben worden. Weitere Therapien der Faktor VII-Defizienz beim

Hund sind in der zugänglichen Literatur nicht beschrieben worden.

2.3 Rekombinanter humaner Faktor VIIa

2.3.1 Chemische Struktur

Beim humanen Faktor VIIa handelt es sich um ein Glykoprotein-Enzym, das zu den Serin-

Proteasen gehört (THIM et al. 1988, WILDGOOSE et al. 1999). Er hat ein Molekulargewicht

von 50 Kilodalton und er gehört elektrophoretisch zu den β-Globulinen (EDER 1987,

WILDGOOSE et al. 1999). In der Leber wird das weniger aktive Zymogen Faktor VII als

einsträngiges Molekül Vitamin K-abhängig gebildet, um dann im Blut hydrolytisch in zwei

Ketten, eine leichte Kette mit 152 Aminosäuren und eine schwere Kette mit 254

Aminosäuren, gespalten zu werden, die durch Disulfid-Brücken verbunden sind (THIM et al.

1988, WILDGOOSE et al. 1999). Diese Spaltung erfolgt ohne Peptidverlust (WEISSBACH

1991a). Das N-terminale Ende ist, wie die anderen Vitamin K-abhängigen

Gerinnungsfaktoren, durch eine Glutaminsäure-Region gekennzeichnet, was für die γ-

Carboxylierung wichtig ist (THIM et al. 1988, WILDGOOSE et al. 1999).

Rekombinanter humaner Faktor VIIa wird aus dem Zellüberstand von kultivierten Baby-

Hamster-Nierenzellen, die mit der codierenden humanen DNA transfiziert wurden,

gewonnen. Er hat sich bei Aminosäure-Sequenzierung, chromatographisch und bezüglich der

biologischen Aktivität als weitgehend übereinstimmend mit dem humanen Faktor VIIa

erwiesen (THIM et al. 1988).

2.3.2 Pharmakokinetik

2.3.2.1 Mensch

Zur Pharmakokinetik von rhFVIIa liegt für den Menschen nur eine Studie vor (LINDLEY et

al. 1994) (Tab. 1). In dieser Studie wurden nach intravenöser (iv) Gabe von 17,5, 35 und 70

µg/kg Körpermasse (KM) als Bolus Clearance, mittlere Verweilzeit, Verteilungsvolumen im

Steady-State-Zustand, Halbwertszeit und Wiederfindungsrate untersucht. Diese Studie wurde

an Patienten mit Hämophilie A und B, mit und ohne Hemmkörpern sowie mit und ohne

Blutungsepisoden durchgeführt, während der zugänglichen Literatur keine

18

pharmakokinetischen Daten für gesunde Menschen entnommen werden können. Das in dieser

Studie ermittelte Verteilungsvolumen entsprach bei blutenden Patienten im Mittel 103,2

ml/kg KM und bei Patienten ohne Blutung 106,5 ml/kg KM. Die mittlere Halbwertszeit lag in

Abhängigkeit davon, ob Blutungen vorlagen oder nicht, bei 2,41 bzw. 2,89 h und bei

getrennter Auswertung der Dosierung bei 2,59 h (17,5 µg/kg KM), 2,57 h (35,0 µg/kg KM)

und 2,81 h (17,5 µg/kg KM). Die Wiederfindungsrate war bei Patienten ohne Blutung 43,5

und bei Patienten mit Blutungen 45,6 %.

Tab. 1: Mittelwerte der pharmakokinetischen Daten für die intravenöse Injektion von

rekombinantem humanen Faktor VIIa beim Menschen (nach LINDLEY et al. 1994).

KM= Körpermasse; ml= Milliliter; kg= Kilogramm; h= Stunden

2.3.2.2 Hund

Bei den Versuchen zur Anwendung von rhFVIIa beim Hund sind pharmakokinetische

Parameter an jeweils zwei Hunden mit Hämophilie A und mit Hämophilie B bei

unterschiedlichen Dosierungsregimen untersucht worden (BRINKHOUS et al. 1989). Bei

dieser Studie wurden verschiedene Dosierungen bei variabler Anzahl von Injektionen in

unterschiedlichen Zeitintervallen gegeben (siehe Kapitel 2.3.3.2, Tab. 4). Hierbei zeigte sich

bei den zwei Hunden mit Hämophilie A bei drei- bzw. viermaligen Injektionen von

Dosierungen zwischen 49 bis 219 µg/kg Körpermasse (KM) eine mittlere Wiederfindungsrate

von 34 % und eine Halbwertzeit für die FVII:Ag-Konzentration von 2,8 ± 0,5 h für die

Status der Patienten bzw. Dosierungen

ohne Blutungen

mit Blutungen

17,5 µg/kg KM

35 µg/kg KM

70 µg/kg KM

Verteilungsvolumen im Steady-State Zustand [ml/kg] 106,5 103,2 97,8 112,9 107,8

Mittlere Verweilzeit [h] 3,44 2,70 3,30 3,27 3,31

Clearance [ml kg-1h-1] 31 32,6 27,8 31,1 32,2

Mittlere Halbwertzeit [h] 2,89 2,41 2,59 2,57 2,81

Wiederfindungsrate im Plasma [%]

45,6 43,5 47,76 46,13 38,55

Maximale Konzentration (Einheiten/ml)

9,3 7,8 4,5 9,8 17,95

19

FVII:C-Aktivität 2,1 ± 0,6 h, die annähernd den Verhältnissen beim Menschen entsprachen.

Bei zwei Hunden mit Hämophilie B ergaben Injektionen mit Dosierungen zwischen 57-199

µg/kg KM eine mittlere Wiederfindungsrate von 44 %.

2.3.3 Klinische Anwendung

2.3.3.1 Menschen

2.3.3.1.1 Indikationen außer Faktor VII-Mangel

Rekombinanter Faktor VIIa wurde als Medikament für unstillbare Blutungen bei an

Hämophilie A und B erkrankten Menschen, speziell mit Hemmkörper-Hämophilie, entwickelt

(HEDNER et al. 1988, HEDNER 1999). Aufgrund seiner hervorragenden blutstillenden

Eigenschaften wird dieses Medikament seitdem aber auch immer häufiger als universelles

Hämostyptikum in anderen Anwendungsbereichen eingesetzt (HEDNER 2000). Die

Einsatzmöglichkeiten beim Menschen werden in Tabelle 2 summarisch dargestellt. Es zeigte

sich, daß bei Hämophilie A und B bei der Mehrheit der Studien eine Dosierung von 70 bis 90

µg/kg KM alle 2 h als Bolus effektiver als niedrigere Dosierungen war, und eine

Weiterführung mit 30 bis 35 µg/kg KM als Dauertropfinfusion (DTI ) in den meisten Fällen

ausreichend war (HEDNER 1996, LUSHER 1998, SHAPIRO et al 1998, ARKIN et al. 2000).

Ähnliche Dosierungsregimes wurden bei schwereren Funktionsstörungen der primären

Hämostase wie Thrombozytopenie (GEROTZIAFAS et al. 2002), von Willebrand-

Erkrankung (FRIEDRICH et al. 2002), Glanzmann-Thrombasthenie (KIM et al. 1999) und

Bernard-Soulier-Syndrom (PETERS und HEIBOER 1998) eingesetzt. Bei Faktor XI-Mangel

mit Inhibitor oder prophylaktischer Anwendung vor Operationen mit hohem Blutungsrisiko

waren bei zufriedenstellendem Erfolg nur Dosierungen von ca. 30 µg/kg KM als Bolus

eingesetzt worden (AL DOURI et al. 2000, BILLON et al. 2001). Bei der disseminierten

intravasalen Gerinnung wurden 40 bis 180 µg/kg KM als Bolus und 16,5 bis 33 µg/kg KM als

DTI erfolgreich angewendet (CHUANSUMRIT et al. 2000). Bei schweren Blutungen und

schweren Blutungen durch Leberinsuffizienz waren zwischen 20 und 90 µg/kg KM rhFVIIa,

z.T. wiederholt als Bolus, effektiv (BERNSTEIN et al. 1997, ZIETKIEWITZ et al. 2002).

20

Tab. 2: Anwendungsbereiche für rekombinanten humanen Faktor VIIa beim Menschen (ohne

hereditären Faktor VII-Mangel) mit Berücksichtigung von Dosierung für intravenöse

Applikation, Dosierungsintervall, Art der Applikation und klinischem Effekt

Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route, Anzahl der Fälle (n)

klinischer Effekt Literaturstellen

35 bzw. 70 µg/kg KM als Bolus in Intervallen von 2-3 Stunden (n= 84)

Klinischer Effekt bei Hemmkörper-Hämophilien bei beiden Dosierungen ähnlich, ohne Hemmkörper besser bei 70µg/kg

LUSHER et al. 1998

2 Gruppen mit 35 (n= 15) bzw. 90 µg/kg KM (n= 14) als Bolus alle 2 Stunden für 2 Tage, dann alle 2-6 Stunden für weitere 3 Tage

Ausreichende intraoperative Hämostase bei 28 von 29 Patienten; bessere Ergebnisse bei 90 µg/kg KM

SHAPIRO et al. 1998

90-110 µg/kg KM alle 2 Stunden in den ersten 24 Stunden (n= 23)

Sistieren von 82 % der Muskel- und 89 % der Gelenkblutungen

ARKIN et al. 2000

90-110 µg/kg KM alle 2 Stunden in den ersten 24 Stunden, dann 70-90 µg/kg alle 2 Stunden (n= 9)

Effektive Beherrschung der Blutungen

BRACKMANN et al. 2000

Protokoll I: Initialdosis 90 µg/kg KM als Bolus, dann 15-16 µg/kg KM als DTI über 12 Stunden (n= 6) Protokoll II: Initialdosis 160-180 µg/kg KM als Bolus, dann 30 µg/kg als DTI über 6 Stunden (n= 2)

Klinischer Effekt nahezu gleich (71% bzw. 75% klinischer Erfolg), aber die Blutung stoppte bei Protokoll II schneller (0 von 58 bzw. 27 von 36 Blutungsepisoden innerhalb der ersten 6 Stunden)

KENET et al. 2000

Hämophilie A und B, mit und ohne Hemmkörper

Bei 5 von 6 Patienten zuerst 90-200 µg/kg KM als Bolus, bei allen 12-49 µg/kg/h als DTI (n= 6)

Bei 4 Patienten Reduktion von Blutungen, zweimal Therapieversagen

MCPHERSON et al. 2000

21

Fortsetzung Tab. 2 Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route,

Anzahl der Fälle (n) klinischer Effekt Literaturstellen

erworbener Faktor X-Mangel bei Amyloidose

90 µg/kg KM alle 3 Stunden als Bolus (n= 1)

Keine Komlikationen bei der Splenektomie

BOGGIO und GREEN 2001

Faktor XI-Mangel mit Inhibitor

30 µg/kg KM 2mal im Abstand von 4 Stunden als Bolus (n= 1)

Stoppen der Blutung BILLON et al. 2001

In 52 % von 105 Applikationen bei nicht blutenden Patienten erfolgte eine dosisunab-hängige Verkürzung der Blutungszeit; bei 8 blutenden Patienten erfolgte eine Reduktion (n=2) oder ein Sistieren der Blutung (n=6)

KRISTENSEN et al. 1996

50 oder 100 µg/kg KM als Bolus

Stoppen der Blutungen (n=1)

VIDARSSON et al. 2000

Blutung stoppte (n=1)

MEIJER et al. 1998

Sisitieren der Blutung (n=1)

REVESZ et al. 1998

Thrombozytopenie oder Thrombozytopathie unbekannter Genese

90 µg/kg KM als Bolus

Blutungen stoppten (n=2)

GEROTZIAFAS et al. 2002

90 µg/kg KM als Bolus initial, dann 17,5 µg/kg/h KM als DTI (n= 1)

Blutungen gestoppt FRIEDRICH et al. 2001

80-82 µg/kg KM als Bolus alle 2-3 h (n= 1)

Blutungen sistierten MEIJER et al. 2001

von Willebrand-Erkrankung

200 µg/kg KM als Bolus dann 90 µg/kg KM (n= 1)

Stoppen der Blutungen

TARANTINO und ABERLE 2001

22

Fortsetzung Tab. 2

Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route, Anzahl der Fälle (n)

klinischer Effekt Literaturstellen

110 µg/kg KM als Bolus alle 1,5-3 Stunden (n= 1)

Sistieren des Nasenblutens

TENGBORN und PETRUSON 1996

90, 180 und 270 µg/kg KM als Bolus bei 3 Episoden im Abstand von Monaten (n= 1)

Kein Effekt bei 90 µg/kg; keine Normalisierung der Blutungszeit, aber klinischer Effekt nach 180 µg/kg; optimaler Effekt in beiden Kategorien nach 270 µg/kg

CHUANSUMRIT et al. 1999

90µg/kg KM als Bolus alle 2 Stunden

Gute Kontrolle der Blutung (n= 1)

KIM et al. 1999

Glanzmann-Thrombasthenie

Stoppen der Blutung (n=1) Stoppen der Blutung (n=1)

MATHEW et al. 2000

Bernard-Soulier-Syndrom

77 µg/kg KM alle 4 Stunden über 1 Tag als Bolus (n= 1)

Sistieren des Nasenblutens

PETERS und HEIBOER 1998

40-180 µg/kg KM als Bolus, dann 16,5-33 µg/kg/h als DTI (n= 1)

Sistieren der Blutungen

CHUANSUMRIT et al. 2000

Disseminierte intravasale Gerinnung

90 µg/kg KM als Bolus alle 3 Stunden (n= 1)

Sistieren der Blutungen

MOSCARDO 2001

5, 20 und 80 µg/kg KM als Bolus im Abstand von 7 Tagen (n= 13)

Bei 13 Patienten Normalisierung der PT

BERNSTEIN et al. 1997

Leberzirrhose und Lebertransplantation

80 µg/kg KM als Bolus einmalig (n= 6)

Geringerer intra-operativer Blutverlust bei 6 Patienten

HENDRICKS et al. 2001

schweres Trauma 120 ± 89 µg/kg KM als Bolus, 1-3malig (n= 19)

Sistierende Blutung bei 15 von 19 (79%) Schwerst-verwundeten

KENET et al. 1999, MARTINOWITZ et al. 2001, MARTINOWITZ et al. 2002

23

Fortsetzung Tab. 2

DTI= Dauertropfinfusion; KM= Körpermasse; µg= Mikrogramm; PT= Prothrombinzeit;

2.3.3.1.2 Faktor VII-Mangel

Über den klinischen Einsatz von rhFVIIa bei Blutungen bei Menschen mit hereditärem Faktor

VII-Mangel gibt es einzelne Berichte. BECH et al. (1995), BAUER et al. (1996) und

MARIANI et al. (1998) untersuchten die Anwendung bei Patienten mit spontanen Blutungen.

BECH et al. (1995) geben die Ergebnisse von insgesamt 21 Anwendungen bei 10 Faktor VII-

defizienten Patienten mit 15-30 µg/kg KM alle 4-6 Stunden als Bolus iv an. Die Effizienz

Anwendungsbereiche Dosierung, Intervall, Route, Anzahl der Fälle (n)

klinischer Effekt Literaturstellen

Blutungen bei Überdosierung von Antikoagulantien vom Cumarintyp

Experimentell bei freiwilligen Probanden verschiedene Dosierungen von 5-320 µg/kg KM als Bolus; therapeutisch: 80 µg/kg KM als Bolus (n= 12)

Experimentell: außer bei 5 µg/kg KM, eine Besserung der International Normalized Ratio (INR), ab 120 µg/kg KM Normalisierung der INR für 12 Stunden; therapeutisch: Blutungen stoppten

BERNTORP et al. 2000

90 µg/kg KM als Bolus, Wiederholung nach 2 Stunden (n=2)

Sofortiges Stoppen der Blutungen

WHITE et al. 1999b

60 µg/kg KM als Bolus, 2mal im Abstand von 12 Stunden (n= 1)

Nach der 1. Injektion Reduktion, nach der 2. Injektion: Stoppen der Blutung

KAMPHUISEN et al. 2002

Schwere, mit anderen Maßnahmen nicht kontrollierbare Blutungen

20 bzw. 30 µg/kg KM als Bolus 2 mal im Abstand von 4 Stunden (n= 1)

Nach der 1. Injektion Reduktion, nach der 2. Aufhören der Blutung

ZIETKIEWICZ et al. 2002

Schwere, mit anderen Maßnahmen nicht kontrollierbare Blutungen

90 µg/kg KM als Bolus, Wiederholung nach 2 Stunden (n=2)

Sofortiges Stoppen der Blutungen

WHITE et al. 1999b

24

wird mit 95% angegeben. Antikörperbildung trat nur bei einem Säugling mit angeborenem

Faktor VII-Mangel nach Gabe einer akzidentell hohen Dosis von 800 µg/kg KM auf.

BAUER (1996) berichtet über die Gabe von rhFVIIa an 2 Faktor VII-Mangelpatienten in

einer Dosierung von 10 µg/kg KM einmalig als Bolus intravenös (iv) und ermitteltete die

Veränderungen der Prothrombinzeit (PT), FVII:C-Aktivität und FVII:Ag-Konzentration in

bestimmten Zeitintervallen. Hierbei zeigte sich eine Erhöhung der FVII:C-Aktivität von <1

auf 168 % (Patient 1) bzw. von 3 auf 128 % (Patient 2) und eine Steigerung der FVII:Ag-

Konzentration von 0,2 auf 15,2 % bzw. von 17,5 auf 36,0 %. Bei einer weiteren Gabe

mehrere Wochen später von 20 µg/kg KM einmalig als Bolus iv ergab sich ein Anstieg der

FVII:C-Aktivität von < 1 auf 200 % bzw. von 3 auf 180 % und eine Erhöhung der FVII-:Ag-

Konzentration von 0,2 auf 29,1 % (Patient 1) und von 17,5 auf 42,2 % (Patient 2).

In einer weiteren Studie von MARIANI et al. (1998) betrug die Einzeldosierung bei Faktor

VII-Mangel-Patienten 9 bis 71 µg/kg KM, im Mittel 20 µg/kg KM, bei 2- bis 112maliger

Anwendung. Bei 14 von 15 Hämarthrose-Blutungen war das Ergebnis gut bis sehr gut, bei der

niedrigsten Dosierung jedoch nur teilweise effektiv. Bei 5 von 6 anderen Blutungs-Episoden

war das Ergebnis gut, bei einem Patienten mit einer hohen Dosierung entwickelten sich

schnell Antikörper.

INGERSLEV et al. (1997) wandten das Medikament bei zwei Patienten mit schwerem Faktor

VII-Mangel prophylaktisch bei Operationen in einer Dosierung von 17,6-18,5 µg/kg KM als

Bolus alle 6 h an. Es traten keine Blutungskomplikationen während insgesamt sieben

Operationen auf. Das Medikament wurde gut vertragen und postoperativ waren keine

Symptome für ein thrombotisches Geschehen sichtbar. Die Werte der PT normalisierten sich

nach 10 min und waren auch 6 h später noch deutlich unter dem Ausgangswert. Ebenso lag

auch die nach 10 min deutlich angestiegene Faktor VII-Aktivität noch nach 6 h über dem

Ausgangswert.

WHITE et al. (1999a) beschrieben den Verlauf einer rhFVIIa-Therapie eines Leukämie-

Patienten mit erworbenem Faktor VII-Mangel und Lungenblutungen sekundär zu einer

Aspergillus-Pneumonie. Die anderen Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren waren

unverändert und es konnten auch keine Hemmkörper gefunden werden. Es wurden zweimal

90µg/kg KM als Bolus im Abstand von zwei Stunden iv gegeben mit sofortiger Verringerung

25

der Blutung. Die gleiche Dosis wurde einen Tag später erneut gegeben, worauf keine weiteren

Lungenblutungen mehr auftraten.

Die in der Literatur beschriebenen Anwendungen von rhFVIIa bei Menschen mit Faktor VII-

Defizienz sind summarisch in Tabelle 3 dargestellt.

Tab. 3: Literaturübersicht zur Anwendung von rekombinantem humanen Faktor VIIa bei

hereditärem Faktor VII-Mangel des Menschen mit Berücksichtigung der Dosierung für die

intravenöse Applikation (jeweils als Bolus), Dosierungsintervall und klinischem Effekt.

Dosierung, Intervalle klinischer Effekt Literaturzitat 95 %iger Erfolg der Blutstillung bei 21 Blutungsepisoden von 10 Patienten

BECH et al. 1995,

15-30 µg/kg KM alle 4-6 Stunden

Normalisierung der Gerinnungsparameter bei 2 Patienten ohne Blutungen

BAUER 1996

17,6-18,5 µg/kg KM alle 6 Stunden

keine Komplikationen bei Operationen

INGERSLEV et al. 1997

9 bis 71 µg/kg KM gute klinische Wirkung bei 26 von 27 Blutungsepisoden, einmal Therapieversagen

MARIANI et al. 1998

90 µg/kg KM im Abstand von 2 Stunden

Stoppen des blutigen Hustens bei einem Patienten

WHITE et al. 1999a*

* erworbener Faktor VII Mangel bei Leukämie 2.3.3.1.3 Laborkontrolle der Anwendung beim Menschen

Zur Überwachung der rhFVIIa-Gabe beim Menschen wurden verschiedene Parameter

benutzt, teilweise abhängig von der Indikation. Allerdings wurden nur von wenigen Autoren

konkrete Angaben zu genauen Messwerten, dazugehörigen Dosierungen und Zeitdauer des

Effektes gemacht. Ebenso erlauben Arbeiten, in denen sowohl Bolusinjektionen als auch DTI

gegeben wurden, keine Aussage über den zeitabhängigen Effekt einer Bolusinjektion allein.

Am häufigsten fand zum Monitoring des rhFVIIa-Effektes die PT Anwendung. Hierbei lieβ

sich – naturgemäβ – beim hereditären Faktor-VII-Mangel ein besonders deutlicher Effekt

erzielen, wo sich nach Dosierungen von 10-20 µg/kg KM rhFVIIa die initial deutlich

verlängerten Werte von 24-42 sec auf 7-11 sec verkürzten (BAUER 1996 (siehe Tab. 4, Seite

29), INGERSLEV et al. 1997). Der Therapieerfolg war auch bei 10 Patienten mit

Leberzirrhose an einer auffälligen Reduktion der PT von initial im Mittel 20 sec auf 12 bzw.

26

10 sec nach der vor Gabe von 20 bzw. 80µg/kg (BERNSTEIN et al. 1997). Auch bei einem

blutenden Menschen mit DIG bewirkte die Injektion von 90 µg/kg KM rhFVIIa eine

darstische Reduktion der PT von 27 sec auf 12 sec bei einer Dosierung, die durch

Folgeinjektionen im Abstand von 3 h auf diesem Niveau gehalten werden konnte

(MOSCARDO et al. 2001). MARTINOWITZ et al. (2001) fanden bei 7 Trauma-Patienten

nach Bolusinjektionen von 40 bis 120 µg/kg ebenfalls eine signifikante Verkürzung der PT

von im Mittel 24 sec auf 10 sec. Bei blutenden hämophilen Menschen verkürzte sich die

initial normale PT hingegen nach Dosierungen von 17,5-70 µg/kg in wesentlich geringerem

Umfang von im Mittel 11,2 auf 8,9 sec (LINDLEY et al. 1994). Bei einer Blutung bei einem

Urämie-Patienten konnte nach Gabe von 90 µg/kg KM rhFVIIa trotz sofortigen Sistierens der

Blutung keine Veränderung der PT verzeichnet werden (REVESZ et al. 1998).

BAUER (1996) stellte bei zwei Patienten mit hereditärem Faktor VII-Mangel bei Applikation

von 10 und 20µg/kg KM rhFVIIa nach 15 min eine Verkürzung der PT um 60 bis 75 % fest

(siehe Tab. 4, Seite 29). INGERSLEV et al. (1997) beschrieben eine Verkürzung bei zwei

Patienten mit hereditärem Faktor VII-Mangel nach Bolusinjektion von 20 µg/kg KM rhFVIIa

von ursprünglich 29 sec auf 8 sec (Patient 1) bzw. von initial 28 sec auf 10sec (Patient 2).

Daneben wird zum Monitoring der rhFVIIa-Therapie die Messung der FVII:C-Aktivität

empfohlen (INGERSLEV et al. 2000), die dosisabhängig ansteigt (LINDLEY et al. 1994,

BERNSTEIN et al. 1997, INGERSLEV et al. 1997, HENDRICKS et al. 2001). Auch die

niedrigeren, in Verbindung mit hereditärem Faktor-VII-Mangel eingesetzten Dosierungen

führen hierbei nach der Therapie zu einer VII:C-Aktivität, die deutlich über den normalen

Verhältnissen liegt. So fanden INGERSLEV et al. (1997) nach Bolusinjektion mit 20 µg/kg

KM rhFVIIa bei einem Patienten eine Erhöhung der FVII:C-Aktivität von initial 0,01

Internatitonale Einheiten (IE)/ml (1 IE/ml entspricht 100 % FVII:C-Aktivität in der

konventionellen Einheit) auf 5,5 IE/ml nach 10 min und 0,45 IE/ml nach 6 h. Bei dem

zweiten von diesen Autoren beschriebenen Patienten war nach Gabe von 20 µg/kg KM

rhFVIIa eine Veränderung von 0,01 IE/ml auf 7,7 IE/ml nach 10 min und 0,64 IE/ml

festgestellt worden. Auch BAUER (1996) bestimmte bei 2 Patienten mit hereditärem Faktor

VII-Mangel die FVII:C-Aktivität und fand eine Steigerung von <3 % der Norm auf Werte

über 100 % der Norm 15 min nach Gabe von 10 bzw. 20 µg/kg KM (siehe Tab. 4, S. 29).

27

Bei anderen Dosierungen werden noch drastischere Erhöhungen der physiologischen FVII:C-

Aktivität erzielt. BERNSTEIN et al. (1997) fanden bei Patienten mit Leberzirrhose 10 min

nach rhFVIIa-Gabe in verschiedenen Dosierungen eine FVII:C-Aktivitätssteigerung von 0

IE/ml auf 2 (5µg/kg KM), 6 (20 µg/kg KM) bzw. 30 IE/ml (80 µg/kg KM). Von 6 Patienten

mit schweren Lebererkrankungen wurde 30 min nach rhFVIIa-Bolusinjektion mit 60µg/kg

KM ein Anstieg der FVII:C-Aktivität von initial <0,5 IE/ml auf 20-27 IE/ml festgestellt

(HENDRICKS et al. 2001). Analoge Werte werden bei den hämophilen Menschen erzielt, wo

LINDLEY et al. (1994) 5 min nach Gabe von 17,5 µg/kg KM rhFVIIa gemittelt über alle

Patienten nach 17,5 µg/kg rhFVIIa eine Steigerung der FVII:C-Aktivität um 5 IE/ml, nach 35

µg/kg um 10 IE/ml und nach 70 µg/kg um 19 IE/ml feststellten.

Auch die Änderung der Faktor VII/VIIa-Antigen-Konzentration wurde von BAUER (1996)

bei diesen 2 Patienten anhand von 2 verschiedenen Dosierungen (10 und 20µg/kg KM) von

rhFVIIa untersucht (siehe Tab. 4).

Zur Dokumentation (oder Kontrolle) der rhFVIIa-Wirkung wurde weiterhin die aktivierte

partielle Thromboplastinzeit (aPTT) eingesetzt, z.B. von BERNSTEIN et al. (1997) bei

Patienten mit Leberzirrhose. Die Autoren fanden eine Reduktion der aPTT 10 min nach Gabe

von 80 µg/kg von 43 % auf 35 %, und von 40 % auf 38% nach Gabe von 20 µg/kg rhFVIIa.

MARTINOWITZ et al. (2002) fanden nach rhFVIIa-Gaben in Dosierungen von 40 bis 120

µg/kg KM bei Trauma-Patienten eine signifikante aPTT-Verkürzung von 71 ± 38,9 sec auf

42,2 ± 24 sec. Bei einem hämophilen Patienten fanden LUSHER et al. (1998) eine

Verkürzung der aPTT nach Gabe von 70 µg/kg von 70 auf 31sec. Die Thrombozytenzahl

wurde vor allem bei Thombozytopenie (VIDARSSON et al. 2000, GEROTZIAFAS et al.

2002) gemessen. GEROTZIAFAS et al. (2002) konnten nach Injektion von 90 µg/kg KM

rhFVIIa eine moderate Steigerung am Tag nach der Injektion feststellen. VIDARSSON et al.

(2000) konnten zwar durch mehrmalige rFVIIa-Injektionen von 100 µg/kg bei einem

Leukämie-Patienten die Blutungen stoppen, aber über einen Zeitraum von 81 Tagen bis zum

Tode der Patientin keine Besserung der Thrombozytopenie erreichen.

Der Hämatokrit wurde von einigen Autoren bestimmt, aber genaue Daten wurden nur von

BERNTORP et al. (2000) und ohne Angabe der dazugehörigen Dosierung angeben. Die

Autoren stellten bei Warfarin-behandelten Probanden eine geringgradige Reduktion des

28

Hämatokrits von im Mittel 36 % vor Gabe von rhFVIIa auf 35 % nach 10 min und 33 % nach

30 min fest.

Tab. 4: Prothrombinzeit (PT, in Sekunden), koagulometrisch gemessene Faktor VII-Aktivität

(FVII:C, in % der Norm) und Faktor VII/VIIa-Antigen-Konzentration (in % der Norm) bei

zwei Menschen mit hereditärem Faktor VII-Mangel vor und nach intravenöser Gabe zweier

verschiedener Dosierungen (10 bzw. 20 Mikrogramm pro Kilogramm (µg/kg) Körpermasse)

von rekombinantem humanen Faktor VIIa zu den jeweiligen Probenentnahmezeitpunkten (in

Stunden, h) nach BAUER (1996).

Patient 1 Patient 2

10µg/kg rhFVIIa 20µg/kg rhFVIIa 10µg/kg rhFVIIa 20µg/kg rhFVIIa

Zeitp

unkt

(h)

PT sec

FVII:Ag (%)

FVII:C (%)

PT (sec)

FVII:Ag(%)

FVII:C(%)

PT sec

FVII:Ag(%)

FVII:C(%)

PT sec

FVII:Ag (%)

FVII:C(%)

0 38,4 0,2 <1 41,5 0,2 <1 23,8 17,5 3 23,7 17,5 3

0,25 9,1 15,2 168 10,5 29,1 200 9,1 36,0 128 9,2 42,2 180

0,5 9,1 13,2 140 9,1 25,3 136 9,3 31,2 100 9,4 40,8 136

1 10,2 13,1 54 9,2 23,2 100 9,8 31,1 57 9,1 36,7 98

2 11,9 9,9 29 10,6 16,9 45 11,0 30,3 26 9,7 36,0 74

4 15,2 7,3 11 12,5 15,5 18 13,2 23,5 13 10,8 - 40

6 17,3 5,2 4 15,0 7,0 7 14,5 22,0 8 12,4 31,6 12

12 19,9 2,9 2 14,0 3,1 2,5 19,9 17,7 4 17,5 20,7 4

24 38,6 0,5 <1 35,7 0,6 1,7 24,6 18,1 3,5 23,7 17,8 2,5

2.3.3.2 Hund

Für Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel läßt sich der zugänglichen Literatur bislang

keine Anwendung von rhFVIIa entnehmen. BRINKHOUS et al. (1989) setzten rhFVIIa bei 5

Tieren mit Hämophilie A oder B oder von Willebrand-Erkrankung ein. Bei zwei Hunden mit

Hämophilie A wurde rhFVIIa in Dosierungen von 49, 60 und 219 µg/kg KM (Hund 1) bzw.

51, 64 und 193 µg/kg KM (Hund 2) als Bolus in Intervallen von ein bis drei Tagen angewandt

(Tab. 5). Ebenso wurden bei zwei Hunden mit Hämophilie B rhFVIIa in Dosierungen von 67,

196 und 199 µg/kg KM (Hund 3) bzw. 153 µg/kg KM (Hund 4) als Bolus in Intervallen von 1

29

bis 3 Tagen (Hund 3) bzw. einmalig (Hund 4) eingesetzt. Ein Hund mit von Willebrand-

Erkrankung bekam 257 und 550 µg/kg KM als Bolus an zwei aufeinanderfolgenden Tagen.

Die FVII:C-Aktivität wurde mit Plasma gesunder Hunde als Standard bestimmt. Ein Enzyme

linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Bestimmung der FVIIa-Antigenkonzentration,

mittels zweier gegen verschiedene Epitope des Faktor VII-Moleküls gerichteter monoklonaler

Antikörper, wurde von den Autoren selbst hergestellt. Auf eine ELISA-Platte wurde ein

Antikörper gebunden, dann das Probenplasma des Patienten hinzugefügt, und mittels eines

zweiten Maus-Anti-Faktor VII-Antikörpers und eines peroxidasekonjugierten Anti-Maus-

Antikörper die Konzentration bestimmt. Auch zur Bestimmung der Bildung von Antikörpern

gegen rhFVIIa bei den Hunden wurde von den Autoren ein ELISA entwickelt. Hierzu wurde

rhFVIIa an eine ELISA-Platte gebunden, Probenserum hinzugefügt, und vorhandene

Antikörper gegen rhFVIIa mittels peroxidasekonjugiertem Kaninchen-Anti-Hunde-

Antikörper bestimmt, wobei Plasma unbehandelter Hunde als Negativkontrolle diente.

Genauere Angaben über die Durchführung der beiden ELISA-Testsysteme wurden nicht

gemacht.

Vier Tiere zeigten nach einmaliger (Hund 4) oder wiederholter (Hund 2, 3 und 5) Applikation

vorübergehende Urtikaria, ansonsten wurde das Medikament gut vertragen. Die FVII:C-

Aktivität und FVII:Ag-Konzentration stiegen bei allen 5 Hunden deutlich an und die

Blutungszeit und aPTT verkürzten sich deutlich. Alle Tiere hatten ein bis zwei Wochen nach

Applikation Antikörper gegen den rhFVIIa. Ein Tier (Hund 2) hatte einen Antikörpertiter von

1:100, die anderen vier von maximal 1:1000. Die Antikörper persistierten bei Hund 1 29

Wochen, Hund 2 2 Wochen, Hund 3 und 4 je 10 Wochen und Hund 5 22 Wochen nach

Applikation.

30

Tab. 5: Zusammenfassung der Ergebnisse der Versuche von BRINKHOUS et al. (1989) an 5

Hunden mit Hämophilie A, B oder von Willebrand-Erkrankung mit der an den

entsprechenden Tagen applizierten Dosis an rekombinantem humanen Faktor VIIa,

koagulometrisch gemessener Faktor VII:C (FVII:C)-Aktivität, erwarteter und tatsächlich

gemessener Faktor VII-Antigen (FVII:Ag)-Konzentration sowie aktivierter partieller

Trombolastinzeit (aPTT) vor und nach Applikation.

Nr.= Nummer des Hundes im Versuch; µg=Mikrogramm, kg=Kilogramm; KM=Körpermasse; ng=Nanogramm; ml=Milliliter; sec=Sekunden

FVII:Ag-Konzentration (ng/ml)

aPTT (sec) Nr. Erkrankung Tag und Dosis (µg/kg KM) erwartete tatsächliche

FVII:C-Aktivität (Einheiten/ml) vorher nachher

Tag 0: 60 1206 512 7,3 52 43 Tag 1: 60 1206 473 7,9 54 44 Tag 2: 49 993 450 7,2 55 42

1 Hämophilie A

Tag 5: 219 4397 1210 9,4 52 46 Tag 0: 64 1277 228 3,7 64 48 Tag 1: 51 3016 545 8,1 58 30

2 Hämophilie A

Tag 2: 193 3859 1867 11,2 59 35 Tag 0: 67 1344 468 8,3 78 46 Tag 1: 196 3925 1810 14,0 49 34

3 Hämophilie B

Tag 2: 199 3978 1813 30,7 69 36 4 Hämophilie B Tag 0: 153 3067 1490 22,9 60 37

Tag 0: 257 5147 2855 42,5 33 30 5 von Willebrand- Erkrankung

Tag 1: 550 11029 4925 64,0 33 25

31

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Material, Tiere und Methoden

3.1.1 Material

3.1.1.1 Geräte und Bezugsquellen

1. Halbautomatisches Zell-Zählgerät F 820, Firma Sysmex Deutschland GmbH,

Norderstedt

2. IKA-Mikrotiterplattenschüttler MTS 4, Firma IKA Labortechnik, Janke und Kunkel

GmbH & Co. KG, Staufen

3. Koagulometer nach Schnitger und Gross, Firma Trinity Biotech, Lemgo (früher Firma

Amelung GmbH, Lemgo)

4. Kühlzentrifuge, Typ GPKR, Firma Beckmann Instuments GmbH, München

5. Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader, Dynex 500, Firma Dynatech,

Denkendorf

6. Mikrotiterplatten-Wasch-Absauggerät, Dynatech MRW, Firma Dynatech, Denkendorf

7. Pipetten, einstellbar 10-100 µl, Firma Eppendorf, Hamburg

8. Pipetten, einstellbar 100-1000 µl, Firma Eppendorf, Hamburg

9. Rolling Mixer RM 810, Firma Sysmex Medical Electronics GmbH, Norderstedt

10. Umkehrosmoseanlage Typ RO 50/14 SMB, Firma SG, Barsbüttel

3.1.1.2 Reagenzien und Bezugsquellen

1. Aqua bidestillata, hergestellt in der hauseigenen Umkehrosmoseanlage

2. Diethylbarbiturat-Acetat-Pufferlösung (DBA-Puffer, pH 7,6), Firma Dade Behring

Diagnostics GmbH, Marburg

3. Dimethylsulfoxid (DMSO), Nr. 7157, Firma Merck, Darmstadt

4. di-Natriumhydrogenphosphat-monohydrat (Na2HPO4 x H2O), Nr. 6577, Firma Merck,

Darmstadt

5. di-Natriumhydrogenphosphat-heptahydrat, (Na2HPO4 x 7 H2O), Nr. 6579, Firma Merck,

Darmstadt

6. Humanes Fibrinogen, plasminogenfrei, Firma Haemochrom Diagnostica GmbH, Essen

7. Isotone Natriumchlorid-Lösung (NaCl) 0,9 %, 500 ml, Firma Baxter, Unterschleißheim

32

8. Kalziumchlorid-Lösung (CaCl2-Lösung) 25 mmol, Firma Roche Diagnostics GmbH,

Mannheim

9. Monoklonaler Maus-Anti-humaner Faktor VIIa (MabHFVIIa-5), Firma Haemochrom

Diagnostica GmbH, Essen

10. Natriumcarbonat-monohydrat (Na2CO3 x H2O), Nr. 6392, Firma Merck, Darmstadt

11. Natriumchlorid (NaCl), Nr. 9265.2, Firma Carl Roth, Karlsruhe

12. Natriumcitrat-Probenröhrchen (0,11 mol/l), 5ml, 57 x 16 mm, Firma Sarstedt, Nümbrecht

13. Natrium-di-hydrogenphosphat-monohydrat (NaH2PO4 x H2O), Nr. 6346, Firma Merck,

Darmstadt

14. Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), Nr. 342 K2136829, Firma Carl Roth, Karlsruhe

15. Natriumhydroxid (NaOH), wasserfrei, Nr. S-5881, Firma Sigma, Deisenhofen

16. NovoSeven®, eptacog alfa (aktiviert), rhFVIIa, 600 µg/ml, Firma Novo Nordisk,

Bagsvaerd, Dänemark

17. Pathromtin®, Reagenz zur Messung der aPTT, Firma Dade Behring Diagnostics

GmbH, Marburg

18. Peroxidasemarkierter monklonaler Ziegen-Anti-Hund-IgG-Antikörper (H+L), Firma

Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, USA

19. Peroxidasemarkiertes polyklonales Schaf-Anti-humaner Faktor VII-IgG (SAFVII-HRP),

Firma Haemochrom Diagnostica, Essen

20. Salzsäure (HCl), konzentriert (37%), Nr. 6081, Firma J. T. Baker, Groß-Gerau

21. STA Factor VII-Mangelplasma, Firma Stago-Haemodiagnostica, Roche Diagnostics

GmbH, Mannheim

22. 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin (TMB), Nr. t-2885, Firma Sigma, Deisenhofen

23. Thromborel® S, Reagenz zur Messung der PT, Firma Dade Behring Diagnostics

GmbH, Marburg

24. Tween 20 (Polyoxyethylensorbitan-monolaurat), Nr. P 1379, Firma Sigma, Deisenhofen

25. Wasserstoffperoxid 3%ig (H2O2), Firma Sigma-Aldrich, Steinheim

26. Zitronensäure-monohydrat (C6H8O7 x H2O), Nr. 200.14, Firma Sigma, Deisenhofen

33

3.1.1.3 Verbrauchsmaterialien und Bezugsquellen

1. Braunüle Vasofix 18 G, 1 ¼ (1,3 x 33 mm), Firma Braun, Melsungen

2. Einmal-Injektionskanülen, Neolus, 18 G 1,2 x 40 mm, Firma Terumo, Braunschweig

3. Einmalspritzen BD Discardit II, 5, 10 und 20 ml, Firma Becton Dickinson, Braunschweig

4. F96-Maxisorb-ELISA-Platten, Nunc GmbH und Co KG, Wiesbaden

5. Kunststoffprobengefäß, 1,5 ml, Firma Eppendorf, Hamburg

6. Probengefäße mit Kalium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 1,6 mg/ml), 1,3 ml,

Firma Sarstedt, Nümbrecht

7. Probengefäße mit Natrium-Citrat (0,11 mol/ml), 1,3 ml, Firma Sarstedt, Nümbrecht

8. Pipettenspitzen 2-100 µl, gelb, Firma Brand Plastibrand GmbH und Co, Wertheim

9. Pipettenspitzen 50-1000 µl, blau, Firma Brand Plastibrand GmbH und Co, Wertheim

10. Probengefäß zur Serum-Gewinnung, 10 ml, 95 x 16,8 mm, Firma Sarstedt, Nümbrecht

11. Teströhrchen für Koagulationsmessungen, 3,5 ml, 55 x 12 mm, Nr. 55484, Firma Sarstedt,

Nümbrecht

3.1.2 Tiere

Die für die Versuche verwendeten Beagles (n=22) stammten aus der Klinik für kleine

Haustiere (n=21) bzw. aus dem Institut für Reproduktionsmedizin (n=1) der Tierärztlichen

Hochschule Hannover (Tab. 6). Es handelte sich um 12 klinisch und gerinnungsphysiologisch

gesunde Hunde und 10 Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel.

34

Tab. 6: Laufende Nummer im Versuch, Gruppenzugehörigkeit, Tätowier- bzw. Mikrochip-

Nr. (MC, angegeben sind die letzten sieben Ziffern, denen in allen Fällen die Ziffern

27609810 vorangehen), Geschlecht, Alter, Körpermasse (KM), Prothrombinzeit-modifizierter

Test (PTMT) und Faktor VII-Aktivität (FVII:C) der verwendeten Beagle-Hunde bei Eintritt in

die Studie. Der Hund Nr. 13 stammt aus dem Institut für Reproduktionsmedizin.

* Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

Hund-Nr.

Gruppe* Tätowier-/bzw. Mikrochip-Nr.

Geschlecht

Alter KM [kg]

PTMT [%]

FVII:C [%]

1 I 9104 weiblich 10 Jahre 12,3 77 85 2 I 9103 männlich-kastriert 10 Jahre 13,9 90 80 3 II 909 weiblich 11 Jahre 14,5 20 10 4 I 904 weiblich 11 Jahre 15,1 66 75 5 I 902 weiblich-kastriert 11 Jahre 13,7 75 106 6 II 15893 männlich-kastriert 12 Jahre 14,8 25 13 7 II 15894 männlich-kastriert 12 Jahre 19,3 20 18 8 II 906/6 männlich-kastriert 11 Jahre 13,8 20 11 9 III 15895 männlich-kastriert 13 Jahre 15,0 66 115 10 III 9011 weiblich-kastriert 12 Jahre 16,3 72 98 11 III (MC)...1356821 männlich-kastriert 2 Jahre 21,6 75 115 12 III (MC)...0253540 weiblich 2 Jahre 16,4 74 104 13 IV FH1 163 männlich 9 Jahre 21,5 37 5 14 II (MC)...1459622 weiblich-kastriert 9 Monate 10,6 39 8 15 IV (MC)...0251451 männlich-kastriert 1 Jahr 17,5 34 5 16 II (MC)...1042155 männlich-kastriert 1 Jahr 11,8 30 5 17 IV (MC)...1458253 männlich 9 Monate 10,8 25 5 18 I (MC)...1459122 männlich 11 Monate 15,0 58 83 19 I (MC)...1357604 männlich 9 Monate 14,2 64 64 20 III (MC)...1456190 männlich 11 Monate 15,3 74 70 21 IV (MC)...1462350 männlich 11 Monate 15,5 38 28 22 III (MC)...1042014 männlich-kastriert 14 Monate 15,7 60 73

35

3.1.3 Methoden

3.1.3.1 Versuchsaufbau

Die Beagles wurden für den Versuch, abhängig davon, ob sie Faktor VII-defizient waren oder

nicht und ob sie mit 100 oder 500 µg/kg KM rhFVIIa behandelt wurden, in vier Gruppen

eingeteilt (siehe Tab. 6). Die Gruppen I bis III bestanden aus jeweils sechs Tieren, während

die Gruppe IV vier Tiere umfasste.

Die Blutentnahmen wurden zu folgenden Zeitpunkten durchgeführt: vor der rhFVIIa-Gabe

(= Zeitpunkt 0), sowie 2, 5, 10, 15, 30 min, 1, 1,5 , 2, 3, 4, 6, 8, 12 und 24 h danach. Bei

jedem Blutentnahmezeitpunkt wurde Blut in mit Citrat bzw. EDTA beschichtete

Probengefäße entnommen zur Messung folgender Meßgrößen: Hämatokrit,

Thrombozytenzahl, Prothrombinzeit-Standardtest (PTST) und Prothrombinzeit-modifizierter

Test (PTMT), aPTT, FVII:C-Aktivität und Faktor VIIa:Ag-Konzentration. Blut zur

Bestimmung der Antikörperbildung gegen rhFVIIa wurde vor der rhFVIIa-Gabe sowie 2, 4

und 12 Wochen danach in Probengefäße zur Serumgewinnung entnommen.

3.1.3.2 Vorbereitung der Patienten

Für diesen Versuch wurden die Hunde am Tag des Versuchs isoliert gehalten. Die Tiere

wurden beginnend 12 h vor der Applikation nüchtern gehalten und erst 12 h nach der

Applikation des Medikaments gefüttert, Trinkwasser stand ad libitum zur Verfügung.

Über den Punktionsstellen der Vena cephalica antebrachii und Vena saphena lateralis wurde

das Fell geschoren. Danach wurde eine Venenverweilkanüle plaziert, über die zur

Überprüfung des korrekten Sitzes zunächst 5 ml isotone Natriumchlorid-Lösung und dann

rhFVIIa über 1 min injiziert wurden. Anschließend wurden 1 ml Blut aspiriert und reinjiziert

und 5 ml isotone Natriumchlorid-Lösung nachgegeben, um sicherzustellen, daß das

Medikament vollständig in den Tierkörper gelangte. Die angegebenen Proben-

entnahmezeitpunkte beziehen sich auf die Mitte des Injektionszeitraumes. Die Tiere wurden

nach der Injektion innerhalb der ersten 3 h halbstündlich und danach zu den

Probenentnahmezeitpunkten einer kurzen allgemeinen klinischen Untersuchung unterzogen.

36

3.1.3.3 Blutentnahme und Probenbehandlung

Die Punktionsstelle wurde mit Alkohol desinfiziert. Der erste ml frei fließendes Blut nach

Punktion der Vene wurde in Kalium-EDTA enthaltende Probengefäße, die folgenden 5 ml in

mit Natriumcitrat beschickte Probengefäße aufgefangen und die Gefäße unverzüglich

geschwenkt, um eine Durchmischung von Blut und Antikoagulanz zu gewährleisten. Zur

Serumgewinnung zu ausgewählten Zeitpunkten wurden 2 ml Blut in Probengefäße zur

Serumgewinnung entnommen.

Die Citratblut-Proben wurden innerhalb von 10 min in die Kühlzentrifuge gebracht und bei

2000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand abpipettiert, in ein

Kunststoffprobengefäß verbracht und erneut in gleicher Weise zentrifugiert. Der Überstand

nach der zweiten Zentrifugation wurde als plättchenarmes Plasma (PAP) abpippetiert und bis

zur Bearbeitung bei -28 °C eingefroren. Für die Messungen wurde das PAP kurz in einem

Wasserbad mit 37 °C aufgetaut und sofort untersucht.

Das Blut im mit Kalium-EDTA beschichteten Probengefäß wurde bis zur Untersuchung von

Thrombozytenzahl und Hämatokrit auf einen Rollenmischer gelegt und innerhalb von 30 min

nach Probenentnahme untersucht.

Serum-Proben für die Autoantikörpermessung wurden 30 min bei Raumtemperatur

erschütterungsfrei stehen gelassen, um eine vollständige Gerinnung zu gewährleisten und bei

2000 x g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der nach Zentrifugation aus dem

Kunststoffprobengefäß abpippettierte Überstand wurde bei -28 °C eingefroren. Zur Messung

wurde das Serum ebenfalls kurz in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und dann

untersucht.

3.1.3.4 Labormethoden

3.1.3.4.1 Hämatokrit und Thrombozytenzahl

Zur Messung des Hämatokrits und der Thrombozytenzahl wurden die Proben nach

Herstelleranweisung mit dem halbautomatischen Zell-Zählgerät untersucht. Es mißt nach

dem Widerstandsänderungsprinzip. Die dargestellten Ergebnisse entsprechen Mittelwerten

aus Doppelmessungen. Die Eichung der Hämatokritmessung wurde mit Hundeblutproben

vorgenommen, deren Hämatokrit mit dem Mikrohämatokrit-Verfahren gemessen wurde. Die

37

Thrombozytenzahl wurde wie die anderen Meßgrößen des Gerätes mit einem kommerziellen

Kontrollblut des Herstellers in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Messungen erfolgten nur

dann, wenn die Werte in den angegebenen Vertrauensbereichen lagen.

3.1.3.4.2 Poolplasma

Zur Herstellung eines Poolplasmas für die Anfertigung der Referenzkurven für die PTMT und

die FVII:C-Aktivität wurde 20 gesunden Hunden verschiedener Rassen 5 ml Blut in mit

Natriumcitrat beschickte Probengefäße entnommen und wie oben für Plasma-Proben

beschrieben, zentrifugiert und portioniert eingefroren. Zur Herstellung des Poolplasmas

wurde jeweils eine Portion des Plasmas dieser Hunde im Wasserbad bei 37 °C kurz aufgetaut

und dann in einem Probengefäß gemischt.

3.1.3.4.3 Prothrombinzeit

Prinzip:

Bei der PT wird zum PAP Gewebsthromboplastin hinzugefügt, was zur Aktivierung des

exogenen Gerinnungssystems und damit letztendlich zur Fibrinbildung führt. Im

Koagulometer wird die Zeit bis zur Fibrinbildung gemessen. Die Prothrombinzeit erfaßt die

Aktivität der Faktoren VII, X und Prothrombin, weniger sensitiv des Faktors V und die

Fibrinogenkonzentration. Da bei dem PTMT humane Fibrinogenlösung zugegeben wird, erfaßt

dieser Test nicht die Fibrinogenkonzentration.

Durchführung:

Neben dem Test nach Herstelleranleitung (PTST) wurde auch ein modifizierter Test nach

MISCHKE und NOLTE (1997) durchgeführt, da der PTST beim Hund nur eine geringe

Einzelfaktorempfindlichkeit besitzt. Bei dem PTMT wurde das Ergebnis mit einer

Referenzkurve verglichen, die mit Poolplasma erstellt wurde.

Die Tests wurden im Koagulometer nach Schnitger und Gross als Doppelbestimmung

durchgeführt. PT-Reagenz wurde nach Herstellerangaben aufgelöst und vor der Messung 15

min bei 37 °C erwärmt.

38

a) Prothrombinzeit-Standardtest:

Das Teströhrchen im Koagulometer wurde mit 100 µl Probenplasma befüllt und eine Minute

bei 37 °C inkubiert. Zum Starten der Reaktion wurden 200 µl PT-Reagenz hinzugegeben und

gleichzeitig die Stoppuhr im Koagulometer gestartet. Nach kurzem Schwenken des

Testansatzes wurde der Elektrodenhalter in das Gerät eingesetzt und die Zeit bis zur

Fibrinbildung automatisch gemessen (BARTHELS et al. 1987).

b) Prothrombinzeit-modifizierter Test:

Humanes Fibrinogen wurde in steriler isotone Natriumchlorid-Lösung gelöst (2 g/l) und bis

zur Verwendung im PTMT portioniert eingefroren. Zur Vorbereitung des PTMT wurde das PAP

in einem Kunststoffprobengefäß 1:20 mit DBA-Puffer verdünnt (50 µl PAP + 950 µl DBA-

Puffer). In das im Koagulometer befindliche Teströhrchen wurden 100 µl Probenverdünnung

mit 100 µl humaner Fibrinogen-Lösung (2 g/l) 2 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde

durch Zugabe von 100 µl PT-Reagenz in Gang gesetzt und zeitgleich die Stoppuhr des

Koagulometers gestartet. Nach kurzem Schwenken des Testansatzes wurde der

Elektrodenhalter in das Gerät eingesetzt und die Gerinnungszeit automatisch gemessen

(MISCHKE und NOLTE 1997).

Zur Erstellung der Referenzkurve, die eine Umrechnung der Sekundenwerte in Prozent

Aktivität ermöglichte, wurde Poolplasma in mehreren Verdünnungsstufen in DBA-Puffer

verdünnt. Der Anteil an Poolplasma in den Verdünnungsstufen entsprach 5, 10, 15, 20, 25,

33, 50, 75, 100, 125, 150 und 200 % des PAP im Testansatz. Dann wurde für jede

Verdünnungsstufe die PTMT ermittelt und die Ergebnisse wurden grafisch in einer Kurve

dargestellt. Bei Sekundenwerten, die unter der 200 % entsprechenden Zeit lagen, wurde der

Test mit einer höheren PAP-Verdünnung wiederholt so daß das Sekunden-Ergebnis über

diesem Grenzwert lag. Der zusätzliche Verdünnungsfaktor wurde dann bei der Ermittlung der

Gerinnungsaktivität berücksichtigt.

39

3.1.3.4.4 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit

Prinzip:

Durch Zugabe einer Reagenzlösung mit Oberflächenaktivatoren (hier Kaolin) und partiellen

Thromboplastinen in Form von gerinnungsaktiven Phospholipiden zu PAP wird eine

Kontaktaktivierung der Faktoren XII und XI des intrinsischen Systems hervorgerufen. Die

Substitution von Kalzium-Ionen (Ca2+-Ionen) startet die weitere Gerinnung bis zur

Fibrinbildung. Gemessen wird die Zeit von der Zugabe des Kalziums bis zur Fibrinbildung

(PROCTOR und RAPAPORT 1961). Dieser Test erfaßt vor allem die Aktivität der Faktoren

XII, XI, IX und VIII, und auch der Faktoren X, V, weniger von Prothrombin und Fibrinogen.

Durchführung:

Die Messung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) wurde im Koagulometer

nach Schnitger und Gross als Doppelbestimmung durchgeführt. In die in das Koagulometer

eingesetzten Teströhrchen wurden 100 µl PAP mit 100 µl aPTT-Reagenz exakt 2 min lang

inkubiert. Als Startreagenz wurden 100 µl einer CaCl2-Lösung (25 mmol) zugegeben,

zeitgleich die in das Gerät eingebaute Stoppuhr gestartet, der Testansatz durch Schwenken

kurz durchmischt und der Elektrodenhalter in den Testansatz eingesetzt sowie die Zeit bis zur

Fibrinbildung gemessen.

3.1.3.4.5 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII-Aktivität

Prinzip:

Da der Faktor VII zum exogenen System gehört, wird ein Test auf der Basis des PT-

Testsystems verwandt. Dem verdünnten Probenplasma wird humanes Faktor VII-

Mangelplasma zugefügt, so daß der Faktor VII-Gehalt der Probe der bestimmende Faktor ist.

Wie bei der PT-Messung wird durch Zugabe von Gewebsthromboplastin und Ca2+-Ionen das

exogene System aktiviert und die Zeit bis zur Fibrinbildung gemessen (MISCHKE 1994b,

MISCHKE 2001).

Durchführung:

Auch die FVII:C-Aktivität wurde mit dem Koagulometer nach Schnitger und Gross ermittelt.

Die Plasmaprobe wurde zuvor 1:40 mit DBA-Puffer verdünnt (25 µl Probe + 975 µl DBA-

40

Puffer). Von dieser Probenverdünnung wurden 50 µl in ein Kunststoffprobengefäß gegeben

und mit 50 µl humanem Faktor VII-Mangelplasma versetzt und dann 2 min inkubiert. Durch

Zugabe von 200 µl PT-Reagenz wurde die Reaktion zur Fibrinbildung gestartet und – wie

oben beschrieben – die Gerinnungszeit automatisch gemessen.

Auch hier wurde – analog zu der Beschreibung bei der PTMT-Bestimmung – eine

Referenzkurve mit Poolplasma erstellt, um anhand des gemessenen Sekundenwertes die

Aktivität in Prozent der Norm angeben zu können. Lag der Sekundenwert unterhalb der

Grenzzeit des 200 %-Aktivitätswertes, so erfolgten Wiederholungsmessungen bei höheren

Verdünnungen und Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors für die Ergebnisermittlung.

3.1.3.4.6 Bestimmung der humanen Faktor VIIa-Antigen-Konzentration

Prinzip:

Der ELISA zur Messung der Faktor VIIa-Antigen-Konzentration (FVIIa:Ag) folgt dem

Prinzip eines sogenannten Sandwich-ELISAs. Er ist asymmetrisch, denn Fänger- und

Detektionsantikörper sind voneinander verschieden. Eine ELISA-Platte wird mit einer Lösung

mit Fänger-Antikörpern (hier monoklonale anti-humaner Faktor VIIa-Antikörper) beschichtet.

In einer längeren Inkubation binden die Antikörper an die Platte bei 4°C. Dann wird die

Lösung mit nichtgebundenen Antikörpern durch mehrere Waschschritte entfernt.

Anschließend wird das zu untersuchende Plasma hinzugegeben und die Platte für eine

bestimmte Zeit inkubiert. In dieser Zeit kann vorhandenes Antigen (hier humaner Faktor

VIIa) an die plattengebundenen Antikörper binden. Nach abermaligen mehrmaligen

Waschschritten wird eine Lösung mit enzymgekoppelten Detektionsantikörpern (hier

polyklonale anti-humaner Faktor VII-Antikörper) hinzugegeben und der Testansatz für eine

weitere Periode inkubiert. Danach wird eine Lösung mit einem Substrat hinzugegeben, das

spezifisch vom Enzym des Detektionsantikörpers umgesetzt wird. Die Umsetzung des

Substrates ist gekoppelt mit einer Veränderung des pH-Wertes. Ein Farbindikator zeigt diese

pH-Wert-Änderung durch Farbveränderung an, die proportional zum vorhandenen Antigen ist

und photometrisch gemessen wird. Anhand von auf der gleichen Platte mitgetesteten

Referenzverdünnungen mit verschiedenen Konzentrationen von rhFVIIa wird das Ergebnis

quantifiziert.

41

Durchführung:

Die Bestimmung der FVII:Ag-Konzentration mittels des ELISA-Tests wurde im Labor der

Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

Zunächst wurden die Pufferlösungen vorbereitet.

Für den „A-Puffer“ wurden 0,795 g Na2CO3 x H2O (15 mmol/l) zusammen mit 1,470 g

NaHCO3 (35 mmol/l) in 500 ml Aqua bidestillata gelöst. Die Lösung wurden – falls

notwendig – mittels konzentrierter Salzsäure (37 %) oder 3 N Natronlauge auf einen pH-Wert

von 9,6 eingestellt.

Der „B-Puffer“ bestand aus 1,725 g NaH2PO4 x H2O (2,5 mmol/l), 5,325 g Na2HPO4 x 7 H2O

(7,5 mmol/l), 42,369 g NaCl (145 mmol/l) in 5 l Aqua bidestillata gelöst und dann mit 5 ml

Tween 20 (0,1% v/v) versetzt. Die Lösung wurde wie oben beschrieben auf einen pH-Wert

von 7,2 eingestellt.

Der „C-Puffer“ wurde durch Lösung von 3,199 g C6H8O7 x H2O (33 mmol/l) und 4,733g

Na2HPO4 x 2 H2O (66,7 mmol/l) in 500 ml Aqua bidestillata hergestellt und der pH-Wert wie

oben dargestellt auf 5,0 eingestellt.

Zuerst wurde in einem Vorversuch untersucht, welche Vorverdünnungen des rhFVIIa in „B-

Puffer“ bzw. in Hunde-Poolplasma mit diesem ELISA adäquate Resultate lieferten. Dabei

wurden Verdünnungsstufen des rhFVIIa ausgeschlossen, deren Testergebnisse am oberen

oder unteren meßtechnischen Limit lagen, da die Resultate keine genaue Zuordnung zu

bestimmten Konzentrationen erlaubten. So wurden jeweils drei Konzentrationen für rhFVIIa

in „B-Puffer“ bzw. das Plasma der mit rhFVIIa behandelten Hunde zu den entsprechenden

Probenentnahmezeitpunkten ermittelt (Daten des Vorversuchs: siehe Tab. TA1, tabellarischer

Anhang).

Um festzustellen, ob der Antikörper auch kaninen Faktor VIIa erkennt, wurde ein weiterer

Vorversuch durchgeführt. Dazu wurde mit dem ELISA-Testsystem Hunde-Poolplasma mit

verschiedenen Konzentrationen von rhFVIIa und einem Leerwert verglichen. Hierbei zeigte

das Hunde-Poolplasma ein Signal in der gleichen Größenordnung wie der Leerwert, während

die rhFVIIa-Verdünnungen sehr hohe Werte ergaben. Dies zeigte, daß der ELISA den Faktor

VIIa des Hundes nicht detektiert (Ergebnisse des Vorversuchs: Siehe Tab. TA1).

Zum Beschicken der Platten für den Hauptversuch wurde in jede Vertiefung einer F96

Maxisorb ELISA-Platte 75 µl einer Lösung des monoklonalen Maus-anti-humaner Faktor

42

VIIa-Antikörpers in „A-Puffer“ mit einer Endkonzentration von 2,5 µg/ml gegeben. Dann

wurde die Platte 12 h bei 4 °C stehen gelassen. Die überstehende Lösung wurde dann durch

5 Wasch-Schritte mit „B-Puffer“ entfernt. Die PAP-Proben der Hunde der verschiedenen

Probenentnahmen-Zeitpunkte wurden auf 1:100, 1:1000, 1:10000 mit „B-Puffer“ verdünnt,

dann wurden die Verdünnungen auf die Platte verbracht. Neben den PAP-Proben wurden als

Standard Verdünnungen von rhFVIIa in „B-Puffer“ 1:100000, 1:300000, 1:1000000

aufgebracht. Alle Verdünnungen wurden als Doppelansatz aufgetragen. Anschließend wurde

1 h auf dem Rüttler inkubiert. Erneut wurden weitere fünf Waschschritte mit „B-Puffer“

angeschlossen. Danach wurde eine Lösung mit Peroxidase-konjugiertem polyklonalen Schaf-

anti-humaner Faktor VII-Antikörper in „B-Puffer“ (Endkonzentration 2 µg/ml) zugegeben

und 60 min auf dem Rüttler inkubiert. Der Überstand mit ungebundenen Antikörpern wurde

durch 5 Waschschritte mit „B-Puffer“ entfernt und jede Vertiefung mit 75 µl einer

organischen Wasserstoffperoxid-Lösung (1 ml TMB, 1,5 mg/ml Dimethylsulfoxid + 10 ml

„C-Puffer“ + 40 µl 3%ige Wasserstoffperoxid-Lösung) beschickt, sowie für 10 min im

Dunkeln stehen gelassen. Danach wurde die Reaktion mit 50 µl 1N H2SO4 pro Vertiefung

gestoppt und im ELISA-Lesegerät Dynex 500 bei 450 nm als Testfilter und 630 nm als

Referenzfilter wurden die optischen Dichten photometrisch gemessen. Die Belegung der

ELISA-Platten wird schematisch in Tabelle 7, die Durchführung in Tabelle 8 dargestellt.

43

Tab. 7: Schematische Darstellung der Mikrotiterplattenbelegung zur Durchführung des

ELISAs zum Nachweis der humaner Faktor VIIa-Antigen-Konzentration mit den verdünnten

Citratplasmaproben eines Hundes, dem rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa)

injiziert wurde. Angegeben sind die Reihen A bis H und die Spalten 1 bis 12 und die

Probenbelegung mit den entsprechenden Verdünnungen der plättchenarmen Plasmen der

entsprechenden Probenentnahmezeitpunkte. Die Standardverdünnungen von rhFVIIa als

Referenz sind grau unterlegt.

Probe 1-15 = Blutprobenentnahmen zu den Zeitpunkten vor und 2, 5, 10,15, 30 min, 1, 1,5 , 2, 3, 4, 6, 8 ,12 und 24 h nach Injektion von rhFVIIa

Tab. 8: Schematische Darstellung der Durchführung des ELISAs zum Nachweis der

Konzentration des Faktor VIIa-Antigens (FVIIa:Ag) im Hundeplasma.

Schritt Zugegebenes Reagenz (siehe Text)

Volumen pro Vertiefung

Inkubationsdauer und -temperatur

1. Beschichtung Maus-Anti-humaner Faktor VIIa-Antikörper in „A-Puffer“

75 µl 12 h bei 4 °C

2. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 3. Probenzugabe Patientenplasma 75 µl 60 min bei Rt 4. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 5. Detektionsantikörper Schaf-Anti-humaner

FVII-Antikörper in „B-Puffer“

75 µl 60 min bei Rt

6. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 7. Detektionssubstrat 3 % H2O2 + TMB in „C-

Puffer“ 75 µl 10 min im Dunkeln

bei Rt

A-B C-D E-F G-H 1 1: 100000 1: 100 1: 100 1: 100 2 1: 300000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 3

rhFVIIa

1:1000000

Probe 4

1:10000

Probe 8

1:10000

Probe 12

1:10000 4 1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 5 1: 1000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 6

Probe 1

1:10000

Probe 5

1:10000

Probe 9

1:10000

Probe 13

1:10000 7 1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 8 1: 1000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 9

Probe 2

1:10000

Probe 6

1:10000

Probe 10

1:10000

Probe 14

1:10000 10 1: 100 1: 100 1: 100 1: 100 11 1: 1000 1: 1000 1: 1000 1: 1000 12

Probe 3

1:10000

Probe 7

1:10000

Probe 11

1:10000

Probe 15

1:10000

44

Fortsetzung Tab. 8 Schritt Zugegebenes Reagenz

(siehe Text) Volumen pro Vertiefung

Inkubationsdauer und -temperatur

8. Reaktionsstop 1 N H2SO4 50 µl sofort 9. Photometrische Messung der optischen Dichte bei 450 gegen 630 nm Rt = Raumtemperatur; TMB= 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin; sec = Sekunden

Die Konzentrationen an Faktor VIIa in den Plasmaproben wurden anhand von

Standardkurven bestimmt, die durch die optischen Dichtewerte der verschiedenen

Verdünnungsstufen der Faktor VIIa Lösung (600 µg/ml) generiert wurden.

Für die Berechnung der FVIIa:Ag-Konzentrationen aus den gewonnen Daten zur optischen

Dichte wurden zunächst für das Referenzserum dessen logarithmierte Verdünnungen (X-

Achse) gegen die logarithmierten optischen Dichten (Y-Achse) aufgetragen und im linearen

Bereich der Dosis-Wirkungskurve die Steigung sowie der Schnittpunkt mit der X-Achse

(Verdünnung) bestimmt. Steigung („slope“) sowie Schnittpunkt der Kurve („intercept“)

gingen anhand folgender Formel in die Computer-gestützte Berechnung der Gehalte (mg/ml)

in den Testproben ein:

rumReferenzse

rumReferenzseProbe

ProberumReferenzseProbe

slope10 intercept)log(OD

Verdünnung x mg/ml = ng/ml−

3.1.3.4.7 Nachweis von kaninen Antikörpern gegen rekombinanten humanen Faktor

VIIa

Zum Nachweis von Antikörpern gegen den rhFVIIa im Hundeserum wurde ein ELISA-

Testsystem mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Hunde-IgG angewandt (BRINKHOUS et al.

1989). Die von BRINKHOUS et al. (1989) angegebene Methode wurde dahingehend

modifiziert, daß Ziegen- statt Kaninchen-Anti-Hunde-IgG verwendet wurde.

Prinzip:

Zur Messung von Antikörpern wird eine Trägerplatte mit dem Antigen überschichtet und

längere Zeit zum Binden des Antigens (hier rhFVIIa) an die Platte bei 4 °C gelagert. Nach

mehreren Waschschritten wird das Patientenserum hinzugegeben und der Testansatz einige

Zeit inkubiert, um eventuell darin befindlichen antigenspezifischen Antikörpern Gelegenheit

45

zur Bindung zu geben. Nach weiteren Waschschritten zur Entfernung des Überstandes werden

enzymkonjugierte Detektionsantikörper hinzugegeben, die spezifisch an eventuell vorhandene

Antikörper aus dem Patientenserum binden. Danach wird ein Substrat zugegeben, das vom

Enzym des Detektionsantikörpers umgesetzt wird und eine Änderung des pH-Wertes

herbeiführt. Die Änderung des pH-Wertes wird mittels eines Farbindikators photometrisch

messbar gemacht und ist proportional zum umgesetzten Substrat und damit zur Menge der

rhFVIIa-spezifischen Antikörper im Patientenserum.

Durchführung:

Die Bestimmung der kaninen Antikörper gegen rhFVIIa mittels des ELISA-Tests wurde im

Labor der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.

Es wurden die gleichen Lösungen von „A-Puffer“, „B-Puffer“ und „C-Puffer“, wie unter

3.1.3.4.6 beschrieben, verwendet. Zur Ermittlung jeweils einer Konzentration für den rhFVIIa

in „A-Puffer“ und den Peroxidase-konjugierten Ziege-Anti-Hund-Antikörper in „B-Puffer“

wurden verschiedene Konzentrationen dieser beiden Lösungen in einem Vorversuch

verglichen. Jeweils vier Verdünnungen der Positivkontrolle (Serum von Patient 10, 2 Wochen

nach rhFVIIa-Gabe), einer Negativkontrolle (Serum von Patient 3 vor rhFVIIa-Gabe), und

einem Leerwert wurden mittels dieses ELISA-Testsystems verglichen. Es wurde für den

Hauptversuch die Kombination von rhFVIIa-Verdünnung und Detektions-Antikörper-

Verdünnung verwendet, bei denen die Ergebnisse proportional zu den jeweiligen Serum-

Verdünnungen waren (Ergebnisse des Vorversuchs: Siehe Tab. TA2)

Für den Hauptversuch wurde jede Vertiefung einer F96 Maxisorb ELISA-Platte mit 75 µl

einer Lösung von rhFVIIa in „A-Puffer“ mit einer Endkonzentration von 4 µg rhFVIIa/ml

beschichtet. Dann wurde die Platte 12 h bei 4 °C stehen gelassen. Danach wurde die Lösung

mit ungebundenen Antikörpern durch 5 Wasch-Schritte mit „B-Puffer“ entfernt. Neben den

Patienten-Seren wurden nun Vergleichs-Seren von gesunden unbehandelten Hunden und

Patient 3 (vor rhFVIIa-Gabe) als Negativkontrollen und Serum von Patient 10 (2 Wochen

nach Behandlung) als Positivkontrolle verwendet. Die Seren der Patienten vor der

Behandlung und die Negativ-Kontrollen wurden auf 1: 4000, 1: 8000, 1: 16000 und 1:32000

mit „B-Puffer“ verdünnt. Nach Ergebnissen des Vorversuchs wurden die Seren, die den

Patienten 2, 4 und 12 Wochen nach rhFVIIa-Gabe abgenommen wurden und die

46

Positivkontrolle (Serum des Patienten 10, 2 Wochen nach rhFVIIa-Gabe) in höheren

Verdünnungen von 1: 40000, 1: 80000, 1: 160000 und 1:320000 in „B-Puffer“ eingesetzt.

Von den verdünnten Seren wurden 75 µl pro Vertiefung auf die Platte verbracht und 1 h auf

dem Rüttler inkubiert. Nach weiteren 5 Waschschritten mit „B-Puffer“ zur Entfernung des

Überstandes von ungebundenen Antikörpern wurde eine Lösung mit Peroxidase-konjugierten

Ziege-Anti-Hund-Antikörpern in „B-Puffer“ (6 µl Antikörper-Lösung auf 15 ml Puffer)

zugegeben und 45 min auf dem Rüttler inkubiert. Erneut wurde der Überstand mit

ungebundener Antikörper-Lösung durch 5 Waschschritte mit „B-Puffer“ entfernt und

anschließend mit 75 µl pro Vertiefung einer TMB-Lösung in „C-Puffer“ mit 3 % H2O2 (siehe

1.3.4.5.) für 10 min im Dunkeln stehen gelassen. Die Reaktion wurde zuletzt mit 50 µl 1N

H2SO4 pro Vertiefung gestoppt und im ELISA-Lesegerät bei 450 nm als Testfilter gegen 630

nm als Referenzfilter photometrisch gemessen. Die Belegung der ELISA-Platten wird

schematisch in Tabelle 9, die Durchführung in Tabelle 10 dargestellt. Für die Berechnung des

Antikörpergehaltes einer Probe wurde ein Serum, welches 2 Wochen nach Faktor VIIa

Applikation gewonnen wurde (Patient 10, 2 Wochen), als Referenzserum definiert und dessen

Gehalt an Antikörpern gegen Faktor VIIa mit 100 ELISA-Units definiert. Dieses Serum

wurde auf allen Mikrotiterplatten in mehreren Verdünnungen eingesetzt, um aus der Steigung

der Kurve („slope“) und dem errechneten Schnittpunkt mit der X-Achse (Kurve:

log(Verdünnung) vs. log(OD)) die Gehalte der anderen zu prüfenden Seren nach der

folgenden Formel zu errechnen.

rumReferenzse

rumReferenzseProbe

ProbeProbe

slope10 intercept)log(OD

Verdünnung x 100 = Units−

47

Tab. 9: Anordnung der Proben auf der F96 Maxisorb-ELISA-Platte zur Messung von kaninen

Antikörpern gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa). Angegeben sind die

Reihen A bis H und die Spalten 1 bis 12, die Probenbelegung der Bereiche in den

entsprechenden Verdünnungen jeweils als Doppelmessung. Alle Kontrollproben-

verdünnungen sind grau unterlegt, die übrigen Probenverdünnungen sind vom jeweils zu

untersuchenden Patienten vor und 2, 4 und 12 Wochen nach rhFVIIa-Gabe.

Negativkontrollen: Patient 3 (0-Wert), 4 gesunde Hunde 1-4 Positivkontrolle: Patient 10 (2 min-Wert)

Tab. 10: Schematische Darstellung der Arbeitsschritte zur Durchführung des ELISAs zum

Nachweis von kaninen Anikörpern gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa).

Schritt zugegebene Reagenz (siehe Text)

Volumen pro Vertiefung

Inkubationsdauer und -temperatur

1. Beschichtung rhFVIIa 4µg/ml in „A-Puffer“ 75 µl 12 h bei 4 °C 2. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 3. Probenzugabe Patientenserum 75 µl 60 min bei Rt 4. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 5. Detektionsantikörper Ziegen-Anti-Hunde IgG

Antikörper in „B-Puffer“ 75 µl 45 min bei Rt

6. Waschen „B-Puffer“ 5 x 200µl 5 x 15 sec bei Rt 7. Detektionssubstrat 3 % H2O2 + TMB in „C-

Puffer“ 75 µl 10 min im

Dunkeln bei Rt 8. Reaktionsstop 1 N H2SO4 50 µl sofort 9. Photometrische Messung bei 450 gegen 630 nm Rt = Raumtemperatur; TMB= 3,3´,5,5´-Tetramethyl-Benzidin; sec = Sekunden

1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 Patient 3:

0-Wert Patient 10: 2 Wochen

Referenz- Hund 1

Referenz- Hund 2

Referenz- Hund 3

Referenz- Hund 4

A 1: 4.000 1: 40.000 1: 4.000 1: 4.000 1: 4.000 1: 4.000 B 1: 8.000 1: 80.000 1: 8.000 1: 8.000 1: 8.000 1: 8.000 C 1: 16.000 1:160.000 1: 16.000 1: 16.000 1: 16.000 1: 16.000 D 1: 32.000 1:320.000 1: 32.000 1: 32.000 1: 32.000 1: 32.000 Patient

0-Wert Patient 2 Wochen

Patient 4 Wochen

Patient 12 Wochen

Leerwert Leerwert

E 1: 4.000 1: 40.000 1: 40.000 1: 40.000 0 0 F 1: 8.000 1: 80.000 1: 80.000 1: 80.000 0 0 G 1: 16.000 1:160.000 1:160.000 1:160.000 0 0 H 1: 32.000 1:320.000 1:320.000 1:320.000 0 0

48

3.1.4 Pharmakokinetische Berechnungen

Die pharmakokinetischen Berechnungen wurden im Institut für Pharmakologie der

Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Mit einem Software-Programm (Top FIT

2,0, Springer-Verlag, Berlin) wurden basierend auf den FVII:C-Aktivitäten und den humanen

FVIIa:Ag-Konzentrationen Daten zur Pharmakokinetik ermittelt. Die Berechnungen wurden

gemäß den Angaben von KOCH und RITSCHEL (1986) durchgeführt. Bei den Berechnungen

basierend auf der FVII:C-Aktivität wurde von jedem Aktivitätswert der Plasmaproben nach

Injektion der Ausgangswert abgezogen, um isoliert den exogen zugeführten humanen FVIIa

zu erfassen. Bei den Berechnungen auf der Basis der FVII:C-Aktivitäten wurden Werte unter

20 %, bei Berechnungen basierend auf der FVIIa:Ag-Konzentration Werte unter 2 ng/ml

ausgeschlossen, um testimmanente unspezifische Reaktionen zu minimieren. Bei den

Berechnungen basierend auf der rhFVIIa:Ag-Konzentration wurde das Einkompartment-

Modell verwendet und die Berechnungen basierend auf der FVII:C wurden mit dem

Zweikompartment-Modell durchgeführt.

Die Plasmakonzentration von rhFVIIa gehorcht im Einkompartment-Modell der Formel:

teAC ×−×= α (A ist ein Koeffizient)

Die Plasmakonzentration von rhFVIIa gehorcht im Zweikompartment-Modell der Formel:

tt eBeAC ×−×− ×+×= βα (A und B sind Koeffizienten)

Die terminale Halbwertszeit (t50) wurde berechnet mit der Formel:

t50 =β

)2ln( =β693,0

Die Berechnung der Fläche unter der Kurve (Area under the curve, AUC) erfolgte mit der

Formel:

AUCβ

txtx

C=∞→

Das Verteilungsvolumen auf der Basis der Eliminationskonstante β (Vdβ) wurde mit folgender

Formel berechnet:

Vdβ=β×AUC

Dosis

49

3.1.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Meßergebnisse wurde mit dem GFA-Statistik-

Programmpaket von BUSCHER, ENGELS und KRAUTH durchgeführt. Für die annähernd

standardnormalverteilten Meßergebnisse jeder Gruppe wurde zu jedem Meßzeitpunkt der

Mittelwert ( ) und die Standardabweichung (s) berechnet. Die Meßergebnisse innerhalb der

Gruppen wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit Meßwiederholung auf

Unterschiede zwischen verschiedenen Zeitpunkten geprüft. Zudem wurden die Ergebnisse

nach der Injektion mittels des paarigen t-Tests gruppenintern mit dem Initialwert verglichen.

Ergänzend wurde für die Gruppen mit den gesunden Hunden (Gruppe I und III) eine

zweifaktorielle Varianzanalyse berechnet. Da sich die Gruppen mit den Faktor VII-

defizienten Hunden (Gruppe II und IV) in der Anzahl der Tiere unterschieden und kein

entsprechendes Auswertungsprogramm zur Verfügung stand, wurde hier auf eine

zweifaktorielle sowie insgesamt auf eine dreifaktorielle Auswertung verzichtet. Die

pharmakokinetischen Daten der einzelnen Gruppen wurden mit t-Test verglichen. Eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 wurde als signifikant angesehen.

50

4 Ergebnisse

4.1 Klinische Verträglichkeit

Das Medikament wurde von allen Tieren gut vertragen, lediglich ein gesunder Hund (Hund

Nr. 5), der 100 µg/kg rhFVIIa erhielt, zeigte 2 h nach Injektion inguinal eine leichte

Quaddelbildung ohne Zeichen von Pruritus, die ohne medikamentelle Intervention nach 30

min verschwunden war.

4.2 Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII:C-Aktivität

Mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse war für die FVII:C-Aktivität ein deutlicher

dosisabängiger Unterschied zwischen den Gruppen mit den gesunden Hunden (Gruppe I und

III) festzustellen (p<0,0001). Auch zwischen den Zeitpunkten war ein deutlicher Unterschied

erkennbar (Faktor B, p<0,0001) und zwischen diesen beiden Faktoren war eine deutliche

Wechselwirkung zu demonstrieren (Faktor AB, p<0,0001). Bei allen 4 Untersuchungsgruppen

waren mit der einfaktoriellen Varianzanalyse deutliche Unterschiede zwischen den

Probenentnahmezeitpunkten feststellbar (p<0,0001). Die Aktivitäten des FVII:C stiegen 2

min nach rhFVIIa-Injektion bei allen Tieren deutlich an (Tab. 11, Einzelwerte: Siehe Tab

TA3, tabellarischer Anhang) (p-Wert t-Test, pt<0,05). Das Maximum des Gruppenmittels

wurde in den ersten drei Gruppen nach 5 min (Gruppe I: 451 ± 24,9 %, Gruppe II: 465 ± 27,5

%, Gruppe III: 2196 ± 138 %) und in Gruppe IV bereits nach 2 min erreicht (1912 ± 127 %).

Abgesehen von Gruppe IV wurde das Ausgangsniveau nach 24 h wieder erreicht (p<0,05).

51

Tab. 11: Koagulometrische Bestimmung der Faktor VII:C-Aktivität in Prozent, Mittelwerte

( ) und Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen

rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten

Hunden.

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

86 446* 451* 424* 412* 368* 326* 302* 272* 206* 169* 134* 118* 98* 86I s 9,8 25,0 24,9 14,9 28,4 33,1 20,7 19,9 15,1 24,4 21,1 22,7 21,2 12,9 15,5 13 441* 465* 447* 422* 388* 323* 275* 221* 156* 105* 74* 43* 25* 14II

s 4,8 27,2 27,5 30,3 22,8 14,4 20,7 19,9 17,4 14,9 11,5 11,3 17,1 12,6 2,8 92 2143* 2196* 2189* 1864* 1612* 1413* 976* 514* 415* 331* 240* 163* 109* 98III

s 15,7 204 138 167 187 111 161 93,8 43,8 47,6 54,7 37,8 27,5 8,1 11,9 15 1912* 1816* 1740* 1584* 1382* 1237* 1001* 661* 433* 337* 271* 122* 54* 17*IV

s 12,3 127 29,1 35,0 46,5 64,3 111 57,7 146 74,5 67,3 63,1 20,1 18,1 11,9 * = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden 4.3 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor VII:C-Aktivität Die Mittelwerte der aus der FVII:C-Aktivität errechneten relativen Ausgangskonzentrationen

(C0-ber) lagen bei 430 ∆% (Gruppe I) und 509 ∆% (Gruppe II), und bei den Gruppen mit der

höheren Dosierung bei 2345 ∆% (Grupppe III) und 2047 ∆% (Gruppe IV) (Tab. 12,

Einzelwerte: Siehe Tab TA4, tabellarischer Anhang). Die gemessene Ausgangskonzentration

(C0-gem) lag im Mittel nur geringgradig unter der C0-ber. Die t50 lag im Mittel mit 98,3 (Gruppe

I), 98,7 min (Gruppen II) und 96,7 min (Gruppe IV) deutlich höher als in der Gruppe mit den

gesunden Hunden und der höheren Dosierung (Gruppe III: 66,3 min). Die Mittelwerte der

AUC lagen in den Gruppen I und II bei 52083 bzw. 65783 ∆% x min, während sie in den

Gruppen mit der höheren rhFVIIa-Dosierung 205667 ∆% x min (Gruppe III) und 242750 ∆%

x min (Gruppe IV) betrugen. Die Cltot lag bei den niedrigdosierten Gruppen auffällig unter

den höher dosierten, ohne deutliche Beeinflussung durch den Faktor-VII-Status. Das

Verteilungsvolumen (Vdβ) lag im Mittel in den Gruppen I, III und IV mit 0,234 l (Gruppe I)

52

0,215 l (Gruppen III) und 0,241 l (Gruppe IV) etwas höher als in Gruppe II: (0,199 l)

(p<0,05). Die Eliminationskonstante β war gleich in den Guppen I, II und IV (0,0070/min),

und mit 0,0105/min höher in der Gruppe III mit gesunden Tieren, denen 500µg/kg KM

rhFVIIa verabreicht wurden.

Tab. 12: Mit einem pharmakokinetischen Programm anhand der koagulometrisch bestimmten

Faktor VII-Aktivität errechneten Mittelwerte und Standardabweichungen der Ergebnisse der

Gruppen von gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden nach Injektion von verschiedenen

Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa, siehe Legende). Dargestellt

sind die berechnete Anfangskonzentration (C0-ber), gemessenen Anfangskonzentration (C0-gem)

(∆%: korrigierte Aktivität (Substraktion des Nullwertes ≙ endogenen Faktor VII-Aktvität) in

%), Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC),

Verteilungsvolumen (Vdβ) und Eliminationskonstante (β) nach Injektion von rhFVIIa sowie

Ergebnisse des statistischen Gruppenvergleiches.

Rechenwert C0-ber C0-gem t50 Cltot AUC Vdβ β Einheit (∆%/ml) (∆%/ml) (min) (ml/min) (∆% x min) (l) (1/min)

430 413 98,3 0,0019 52083 0,234 0,0070 Gruppe I s 36 31 1,22 0,0001 4192 0,020 0,0000 509 495 98,7 0,0015 65783 0,199 0,0070 Gruppe II s 53 43 0,46 0,0001 3705 0,022 0,0000 2345 2245 66,3 0,0244 205667 0,215 0,0105 Gruppe III s 310 202 3,10 0,0016 12628 0,024 0,0005 2048 2003 96,7 0,0207 242750 0,241 0,0070 Gruppe IV s 99 77 4,55 0,0007 9179 0,014 0,0000

Statistischer Gruppenvergleich (p-Werte, t-Test) Gruppe I/II 0,0933 0,0017 0,7799 0,0001 0,0007 0,0080 0,7995 Gruppe I/III <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,0776 <0,0001Gruppe I/IV <0,0001 <0,0001 0,7862 <0,0001 <0,0001 0,2811 0,0536 Gruppe II/III <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,1281 <0,0001Gruppe II/IV <0,0001 <0,0001 0,8497 <0,0001 <0,0001 0,0051 0,9638 Gruppe III/IV 0,05269 0,02698 0,2137 0,0005 0,0005 0,0409 0,0459 = Mittelwert; s= Standardabweichung Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

53

4.4 Konzentration des humanen Faktor VIIa-Antigens

Zwischen den beiden Gruppen (I und III) mit gesunden Tieren zeigte die zweifaktorielle

Varianzanalyse für die FVIIa:Ag-Konzentration einen deutlichen Unterschied zwischen den

zwei Dosierungsgruppen (Faktor A, p<0,0001). Es war ebenfalls ein deutlicher Unterschied

zwischen den Zeitpunkten (Faktor B, p<0,0001) sowie eine deutliche zeitpunktabhängige

Wirkung zwischen den beiden Faktoren (AB, p<0,0001) festzustellen. Das Ergebnis der

einfaktoriellen Varianzanalyse zeigte auffällige Unterschiede der FVIIa:Ag-Konzentration

zwischen den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten in allen Gruppen (Gruppe I-III:

p<0,0001, Gruppe IV: p=0,0002). Die Werte der FVIIa:Ag-Konzentration stiegen 2 min nach

rhFVIIa-Gabe in allen Gruppen deutlich an (pt<0,05) und erreichten im Maximum Werte von

29,0 (Gruppe 1), 35,7 (Gruppe 2), 145 (Gruppe 3) und 142 ng/ml (Gruppe 3) (Tab. 13,

Einzelwerte: Siehe Tab. TA5, tabellarischer Anhang).

Tab. 13: Bestimmung der Faktor VII-Antigen-Konzentration, Mittelwerte ( ) und

Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten

humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

0,5 26,9* 29,0* 21,9* 17,1* 12,2* 9,0* 7,9* 4,8* 2,9* 2,4* 1,9* 1,4* 0,9 0,7*I s 0,3 3,1 3,4 1,1 2,1 2,0 2,0 2,3 2,1 1,3 1,2 1,6 1,2 0,7 0,4 0,5 32,9* 35,7* 27,2* 20,2* 15,5* 11,8* 9,0* 7,3* 4,5* 3,6* 1,9* 1,2* 0,9* 0,8*II

s 0,3 3,5 4,5 3,8 5,8 4,4 3,6 3,4 3,4 1,6 1,4 1,3 0,9 0,6 0,5 0,7 145* 145* 134* 114* 82,4* 50,9* 48,1* 34,1* 27,1* 21,9* 6,9* 3,3* 1,6* 0,8 III

s 0,2 12,0 7,7 8,7 10,2 14,4 7,2 7,6 5,6 3,9 2,8 4,6 1,7 1,1 0,5 0,6 142* 141* 120* 76,6* 52,2* 33,7* 22,3* 19,0* 14,1* 10,1* 4,6* 3,1* 2,2* 0,9*IV

s 0,0 7,6 4,0 12,9 2,4 3,5 6,5 3,0 2,1 1,3 4,1 1,2 1,0 1,1 0,3 * = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

54

4.5 Pharmakokinetische Berechnungen basierend auf der Faktor VIIa-Antigen-

Konzentration

Die berechnete Ausgangskonzentration (C0-ber) lag bei 34,9 ± 4,4 ng/ml (Grupppe I) und 48,6

± 10,2 ng/ml (Gruppe II), und nach Gabe der höheren Dosierung bei 163 ± 11,8 ng/ml

(Grupppe II) und 167 ± 17,6 ng/ml (Gruppe IV) (Tab. 14, S. 55, Originalwerte: Siehe Tab.

TA6, tabellarischer Anhang). Die gemessene Ausgangskonzentration (C0-gem) lag im Mittel

nur geringgradig unter der C0-ber. Die t50 lag in allen Gruppen im Mittel zwischen 80 und 90

min ohne wesentliche Unterschiede zwischen den Dosierungen und der Frage ob es sich um

gesunde oder Faktor-VII-defiziente Hunde handelte. Die Mittelwerte der AUC lag in den

Gruppen I und II bei 1982 ± 497 bzw. 2558 ± 774 ng/ml x min, während sie in den Gruppen mit

der höheren rhFVIIa-Dosierung 13038 ± 1661 ng/ml x min (Gruppe III) und 8513 ± 1459 ng/ml

x min (Gruppe IV) betrugen. Der t-Test zeigte deutliche Unterschiede zwischen den

verschiedenen Dosierungsgruppen beim Vergleich der Gruppe I mit III, I mit IV, II mit III

sowie II mit IV (in allen Fällen pt=0,0000). Die Mittelwerte der Vdβ betrugen in allen

Gruppen zwischen 2,13 und 3,02 l, wobei die höheren Dosierungen mit einem höheren Vdβ als bei mit 100 µg/kg behandelten FVII-Mangel-Hunden (Gruppe II), nicht aber den gesunden

Hunden (Gruppe I) verbunden waren. Beim Vergleich mit dem t-Test zeigte sich nur ein

deutlicher Unterschied zwischen der Gruppe II und den beiden Gruppen mit der höheren

Dosierung (p<0,01). Die Mittelwerte des Koeffizienten β lagen bei 0,0082 ± 0,0013/min in

Gruppe I, 0,0113 ± 0,0096/min in Gruppe IV, und 0,0082 ± 0,0019/min bzw. 0,0085 ±

0,0037/min in den Gruppen II und III.

55

Tab. 14: Mit einem pharmakokinetischen Programm anhand der Faktor VII-Antigen-

Konzentration errechnete Mittelwerte und Standardabweichungen der Ergebnisse der

Gruppen von gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden nach Injektion von verschiedenen

Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) (siehe Legende). Dargestellt

sind die berechnete Anfangskonzentration (C0-ber), gemessene Anfangskonzentration (C0-gem),

Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC), Verteilungsvolumen

(Vdβ) und Eliminationskonstante (β) nach Injektion von rhFVIIa sowie Ergebnisse des

statistischen Gruppenvergleichs.

= Mittelwert; s= Standardabweichung Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

Rechenwert C0-ber C0-gem t50 AUC Cltot Vdβ β Einheit (ng/ml) (ng/ml) (min) (ng/ml x min) (ml/min) (l) (1/min)

34,9 33,8 86,6 1982 53,1 2,9 0,0082Gruppe I s 4,34 3,97 13,8 497 12,7 3,0 0,0013 48,6 46,0 88,1 2558 42,3 2,13 0,0082Gruppe II s 10,2 8,5 17,4 774 13,6 0,41 0,0019 163 160 89,6 13038 37,9 3,02 0,0085Gruppe III s 11,8 10,9 22,8 1661 6,18 0,29 0,0037 167 163 81,0 8513 63,6 3,00 0,0113Gruppe IV s 17,6 15,2 35,4 1459 15,3 0,32 0,0097

Statistischer Gruppenvergleich (p-Werte, t-Test) Gruppe I/II 0,0063 0,0046 0,4360 0,0779 0,9076 0,9960 0,8266Gruppe I/III <0,0001 <0,0001 0,3955 <0,0001 0,9876 0,2903 0,8200Gruppe I/IV <0,0001 <0,0001 0,6818 <0,0001 0,0534 0,3472 0,7006Gruppe II/III <0,0001 <0,0001 0,4514 <0,0001 0,7542 0,0008 0,4299Gruppe II/IV <0,0001 <0,0001 0,7029 <0,0001 0,0099 0,0038 0,1801Gruppe III/IV 0,2919 0,3765 0,7128 0,9997 0,0010 0,5355 0,2165

56

4.6 Prothrombinzeit

a) Prothrombinzeit-Standardtest

Das Ergebnis der zweifaktoriellen Varianzanalyse für die PTST-Werte der Gruppen I und III

mit gesunden Tieren zeigte weder deutliche Unterschiede zwischen den beiden Dosierungen

(Faktor A, p=0,9384), noch einen zeitpunktabhängigen Effekt (Wechselwirkung AB,

p=0,0592). Es war nur ein deutlicher Unterschied zwischen den Zeitpunkten (Faktor B,

p=0,0000) erkennbar. Die einfaktorielle Varianzanalyse der PTST zeigte in allen Gruppen

deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten auf (Gruppe

I: p=0,0002, Gruppe II: p<0,0001, Gruppe III: p=0,0001, Gruppe IV: p=0,0002). (Tab. 15).

Lokale Vergleiche mittels t-Test zeigten, daß die PTST-Werte in allen Gruppen 2 min nach

rhFVIIa-Gabe sich deutlich verkürzten (pt<0,001) und den Ausgangswert bis zum Ende des

Versuchs (24 h) nicht mehr erreichten (pt<0,05) (Einzelwerte und Original pt-Werte: Siehe

Tab. TA7, tabellarischer Anhang).

Tab. 15: Prothrombinzeit-Standardtest in Sekunden, Mittelwerte ( ) und Standardabweichung

(s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa

(rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.

* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

6,75 3,93* 3,98* 4,11* 4,03* 4,13* 4,33* 4,25* 4,43* 4,53* 4,81* 4,83* 5,05* 5,16* 5,40* I s 1,01 0,10 0,16 0,23 0,3 0,39 0,48 0,36 0,36 0,56 0,62 0,66 0,31 0,52 0,94 16,50 3,98* 3,98* 4,06* 3,93* 4,02* 4,12* 4,10* 4,43* 4,50* 4,98* 5,68* 6,18* 8,37* 14,70*II

s 1,20 0,18 0,12 0,22 0,21 0,24 0,16 0,20 0,31 0,31 0,25 0,18 0,38 0,78 1,53* 7,01 4,10* 4,17* 4,15* 4,15* 4,15* 4,18* 4,20* 4,21* 4,30* 4,53* 4,57* 4,81* 5,25* 6,18 III

s 0,73 0,25 0,34 0,29 0,29 0,20 0,26 0,28 0,31 0,19 0,12 0,15 0,31 0,61 0,95 14,68 4,03* 4,03* 3,95* 3,95* 4,02* 4,18* 4,10* 4,22* 4,45* 4,55* 4,67* 5,40* 6,58* 10,95*IV

s 1,57 0,13 0,17 0,17 0,26 0,13 0,15 0,14 0,31 0,33 0,44 0,69 0,70 0,80 1,38

57

b) Prothrombinzeit-modifizierter Test

Die zweifaktorielle Varianzanalyse zwischen den beiden Gruppen mit gesunden Tieren (I und

III) ergab für den PTMT einen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Dosierungsgruppen

(Faktor A, p=0,0035). Es war ebenfalls ein deutlicher Unterschied zwischen den Zeitpunkten

(Faktor B, p<0,0001) sowie eine deutliche zeitpunktabhängige Wirkung zwischen den beiden

Faktoren (AB, p<0,0001) festzustellen. Das Ergebnis der einfaktoriellen Varianzanalyse von

der PTMT zeigte auffällige Unterschiede zwischen den verschiedenen

Probenentnahmezeitpunkten in allen Gruppen (Gruppe I: p<0,0001, Gruppe II: p=0,0001,

Gruppe III: p=0,0005, Gruppe IV: p=0,0147). Die PTMT-Werte stiegen 2 min nach rhFVIIa-

Gabe in allen Gruppen deutlich an (Tab. 16) (pt<0,05) und erreichten im Maximum Werte

von 155 % (Gruppe I), 144 % (Gruppe II), 249 % (Gruppe III) und 209 % (Gruppe IV).

Abhängig von Dosis und dem Vorhandensein eines Faktor-VII-Mangels wurde das

Ausgangsniveau nach 12-24 h wieder erreicht (pt>0,05). (Einzelwerte und Original pt-Werte:

Siehe Tab. TA8, tabellarischer Anhang).

Tab. 16: Prothrombinzeit-modifizierter Test in Prozent der Norm, Mittelwerte ( ) und

Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten

humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

71.7 155* 145* 143* 143* 135* 129* 123* 117* 116* 110* 105* 88,2* 80,0 73,8I s 11,4 21,8 20.9 15,2 10,9 11,1 15,2 12,4 14,1 12,2 15,7 26,3 12,2 10,8 9,1 25,7 144* 144* 146* 143* 140* 134* 123* 117* 96,0* 78,7* 67,5* 54,0* 40,3* 26,7II

s 7,7 15,5 15,4 14,6 19,0 16,4 17,0 7,8 13,2 8,7 20,0 19,1 11,5 5,2 8,3 73,5 227* 235* 249* 182* 195* 179* 168* 163* 153 142 131* 113* 95,2* 74,7III

s 2,16 10,3 31,3 32,8 40,5 36,7 21,6 27,7 29,8 24,6 21,1 23,7 19,9 10,0 8,0 33,5 193* 205* 209* 206* 199* 180* 169* 165* 150* 122* 111* 89,8* 66,5* 44,3IV

s 5,9 102,7 49,7 42,2 45,5 21,0 12,1 20,8 24,4 32,6 37,8 30,8 20,3 15,3 18,4 * = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

58

4.7 Aktivierte partielle Thromboplastinzeit

Die zweifaktorielle Varianzanalyse zwischen den Gruppen mit gesunden Tieren ergab für die

aPTT einen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Dosierungen (Faktor A, p=0,0015).

Der Unterschied war auch deutlich zwischen den Zeitpunkten (Faktor B, p<0,0001) sowie

deutlich zeitpunktabhängig zwischen den beiden Faktoren (AB, p<0,0002). Mit der

einfaktoriellen Varianzanalyse ließen sich für die aPTT bis auf Gruppe III keine deutlichen

Unterschiede zwischen den einzelnen Probenentnahmezeitpunkten nachweisen (Gruppe I:

p=0,4245, Gruppe II: p=0,1833, Gruppe IV: p=0,3128) (Tab. 17). Das Resultat der

Varianzanalyse brachte eine deutliche Verkürzung der aPTT bei den gesunden Hunden, die

500 µg/kg rhFVIIa (Gruppe III: p=0,0098) erhalten hatten, zum Ausdruck. Dies hielt

mindestens 1,5 h an (p<0,01). Lokale Vergleiche mit t-Test zeigten während der ersten 30

min nach rhFVIIa-Injektion auch in den übrigen Gruppen partiell eine Verkürzung an

(Einzelwerte und Original p-Werte des t-Tests: Siehe Tab. TA9, tabellarischer Anhang).

Tab. 17: Aktivierte partielle Thromboplastinzeit in Sekunden, Mittelwerte ( ) und

Standardabweichung (s) nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten

humanen Faktors VIIa (rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

16,90 15,90* 16,38* 16,13 16,17 16,13 16,02* 16,82 16,22* 16,08 16,52 16,55 16,33* 16,40 16,41 I s 1,44 1,04 1,46 1,11 1,08 1,12 0,86 2,26 1,24 1,52 1,41 1,30 1,19 0,97 0,74

15,30 15,07 14,73* 14,87* 14,96 15,13 14,26 14,71 14,53 14,63 15,78 15,25 15,40 15,87* 16,35*II

s 0,54 0,79 0,46 0,46 0,78 0,93 1,32 2,03 1,30 1,53 1,83 0,88 1,16 0,92 1,11

14,68 12,97* 13,20* 13,03* 13,28* 13,37* 13,78* 13,98* 14,30 14,25 15,05 14,70 15,08 14,81 14,90 III s 0,27 0,35 0,41 0,42 0,41 0,53 0,56 0,53 0,84 0,88 1,34 1,23 1,28 1,07 0,98

15,22 14,28 14,28 14,18 14,20* 14,32* 14,60 14,55 14,70 14,78 14,88 14,78 14,83 14,75 14,83 IV s 1,28 1,97 1,61 1,91 1,92 1,75 1,69 1,74 1,98 1,52 1,30 1,36 1,34 1,34 1,14

* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

59

4.8 Thrombozytenzahl

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der Thrombozytenzahl der Gruppen I und III (gesunde

Tiere) zeigte keine deutlichen Unterschiede zwischen den beiden Dosierungen (Faktor A,

p=0,2831), sowie keine zeitpunktabhängigen Unerschiede zwischen den beiden Faktoren

(AB, p=0,0910). Ein deutlicher Unterschied war zwischen den Zeitpunkten (Faktor B,

p<0,0001) sichtbar. Die einfaktorielle Varianzanalyse zeigte keine deutlichen Unterschiede

bei der Thrombozytenzahl in den Gruppen I, II und IV (Gruppe I: p=0,1898, Gruppe II:

p=0,5050, Gruppe IV: p=0,1351). Entsprechend dem Ergebnis der einfaktoriellen

Varianzanalyse (p=0,0225) lag die mittlere Thrombozytenzahl beim überwiegenden Teil der

Meßzeitpunkte in Gruppe III hingegen deutlich unter dem Ausgangswert (p<0,05, t-Test).

Eine mit dem t-Test nachweisbare Verminderung der Thrombozytenzahl gegenüber dem

Ausgangswert (p<0,05, t-Test) war in Gruppe I auf die Zeitpunkte 2 und 5 min sowie 6 und

12 h nach rhFVIIa-Injektion begrenzt und trat in den übrigen Gruppen (II und IV) nur

sporadisch auf (Tab. 18) (Einzelwerte und Original p-Werte des t-Tests: Siehe Tab. TA10

tabellarischer Anhang).

Tab. 18: Thrombozytenzahlen in Tausend/µl, Mittelwerte ( ) und Standardabweichung (s)

nach Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa

(rhFVIIa) bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.

* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

304 272* 276* 277 263 278 278 279 284 297 284 251* 252* 247* 294 I s 29 26 13 25 35 24 21 36 25 31 30 45 58 47 24 362 343 341 350 346 326* 347 341 339 340 324 329 334 330 347 II

s 60 90 60 62 76 51 64 77 66 57 53 64 82 76 65 332 278* 293* 319 307* 320 312* 305 296* 300* 294 272* 260* 273* 256*III

s 45 67 42 42 30 44 46 48 45 44 35 27 37 54 48 360 319 367 334 401* 404 374 406 344 341 342 313 309 330 340 IV

s 134 141 109 107 128 153 135 173 89 102 81 91 95 75 96

60

4.9 Hämatokrit

Die zweifaktorielle Varianzanalyse der Hämatokrit-Werte der beiden Gruppen mit gesunden

Tieren (I und III) ergab keinen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Dosierungen

(Faktor A, p=0,6512). Es war aber ein deutlicher Unterschied zwischen den Zeitpunkten

(Faktor B, p<0,0001) sowie ein deutlicher zeitpunktabhängiger Unterschied zwischen den

beiden Faktoren (Wechselwirkung AB, p<0,0001) zu erkennen (Tab.19). Die einfaktorielle

Varianzanalyse des Hämatokrits der Hunde zeigte während des Versuchs in den meisten

Gruppen nur geringe Schwankungen (Gruppe I: p=0,2136, Gruppe II: p=0,3882, Gruppe IV:

p=0,4092). In der einfaktoriellen Varianzanalyse ließ sich lediglich in Gruppe III (gesunde

Hunde, 500µg/kg rhFVIIa) ein Unterschied zwischen einzelnen Zeitpunkten nachweisen

(Gruppe III: p=0,0441). Dies brachte zum Ausdruck, daß in dieser Gruppe zwischen 1,5 und 8

h nach rhFVIIa-Injektion auffällig niedrigere Hämatokritwerte als initial vorlagen (p<0,05, t-

Test) (Einzelwerte und Original p-Werte des t-Tests: Siehe Tab. TA11 tabellarischer

Anhang).

Tab. 19: Hämatokritwerte in Prozent, Mittelwerte ( ) und Standardabweichung (s) nach

Injektion von verschiedenen Dosierungen rekombinanten humanen Faktors VIIa (rhFVIIa)

bei gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden.

* = signifikant im Vergleich zum Ausgangswert; Gr.= Gruppe; = Mittelwert; s= Standardabweichung

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion Gr. 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

41,1 39,9 42,1 40,4 40,3 41,0 42,2 44,5* 42,5 43,2 41,5 41,8 41,5 41,6 43,0 I s 2,2 1,7 3,0 2,0 1,4 1,4 3,6 4,5 5,0 3,3 3,2 1,7 1,5 2,1 4,0

39,3 38,0 38,1 38,1 38,1 37,9 40,5 38,9 38,7 39,2 38,1 40,6 39,4 39,9 40,7 II s 5,0 3,7 3,9 3,8 2,1 3,8 2,7 3,3 3,2 5,2 5,8 5,9 4,9 3,1 6,5 45,5 43,2 43,4 43,4 43,0 43,4 42,9* 41,6* 40,8* 41,9* 40,2* 40,8* 41,9* 44,0 39,7* III

s 3,0 4,3 4,6 4,0 4,8 3,6 1,4 2,2 2,4 1,7 3,1 3,2 3,1 2,8 2,1 40,7 37,2 40,3 38,3 39,8 38,1 39,3 38,7 40,2 40,1 40,6 40,7 40,2 40,6 39,4 IV

s 7,5 4,0 5,1 5,2 6,0 5,3 5,7 5,6 5,0 4,2 4,7 3,8 4,2 4,6 4,0

61

4.10 Kanine Antikörperbildung gegen rekombinanten humanen Faktor VIIa

Es ließen sich bei allen Hunden Antikörper gegen rhFVIIa feststellen, jedoch mit individuell

sehr starker Schwankungsbreite. (Tab. 20, Einzelwerte: siehe Tab. TA11, tabellarischer

Anhang). Hunde denen 500µg/kg KM rhFVIIa injiziert (Gruppen III und IV) wurde, zeigten

generell einen höheren Antikörpertiter als Tiere denen 100µg/kg KM injiziert wurde (Gruppe

I und II). Die meisten Hunde wiesen nach 2 Wochen die höchsten Antikörperspiegel auf, was

sich auch am Verlauf des Medians widerspiegelte.

Tab. 20: Verlauf der Antikörperbildung (IgG) gegen rekombinantem humanen Faktor VIIa

(rhFVIIa) (in relativen ELISA-Einheiten) bei vier Gruppen von Hunden (s.u.) zu

verscheidenen Zeitpunkten nach rhFVIIa-Injektion. (Die Nullwerte lagen jeweils < 0,25)

2 Wochen 4 Wochen 12 Wochen t Gr. Median Min. Max. Median Min. Max. Median Min. Max. I 16 4 400 15 7 227 4,5 1 22II 9 1 353 5 0 11 0 0 6III 158 12 304 103 22 264 7,5 0 128IV 93 42 168 49 9 138 28 1 124 Gr.= Gruppe, t= Probenentnahmezeitpunkt Min.= Minimum; Max.= Maximum;

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rekombinanter humaner Faktor VIIa (rhFVIIa) injiziert wurden Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden

62

5 Diskussion

Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, pharmakokinetische Daten für rhFVIIa und den

Einfluß auf das Blutstillungssystem sowie die Verträglichkeit bei gesunden Hunden und

Hunden mit hereditärem Faktor-VII-Mangel zu überprüfen. Der Hund stellt für viele

hämostaseologische Fragestellungen ein hervorragendes Tiermodell dar (SPURLING 1980,

TINLIN et al. 1993, MISCHKE 2001). Auch zur Anwendung von rhFVIIa liegen erste Daten

für die Anwendung beim Hund vor (BRINKHOUS et al. 1989). Der Hund wäre daher gut

geeignet, um die noch offenen Fragen u.a. zur Sicherheit bei DIG und zum

Wirkungsmechanismus bei Thrombozytopenie näher zu untersuchen. Unabhängig davon

lassen sich generell der Literatur auch für den Menschen bislang nur spärliche Informationen

zur Pharmakokinetik von rhFVIIa entnehmen, so daß alleine schon die Erarbeitung

pharmakokinetischer Daten von Nutzen für den Menschen erscheint.

Neben der Dosierung von 100 µg/kg, die der beim Menschen für viele Indikationen geltenden

Standarddosierung von 90-110 µg/kg KM entspricht (SHAPIRO 1998, ARKIN et al. 2000,

HEDNER 2000), kam in der vorliegenden Studie auch eine wesentlich höhere Dosierung zur

Anwendung (500 µg/kg). Die Grundlage für diese hohe Dosierung lieferte einerseits die

Überlegung, daß auch bei ausgewählten Indikationen beim Menschen (z.B. Glanzmann-

Thrombasthenie, Blutung nach Überdosierung von Antikoagulanzien vom Cumarintyp) sehr

hohe Dosierungen im Bereich von zumindest 300 µg/kg verabreicht werden

(CHUANSUMRIT et al. 1999; BERNTORP et al. 2000). Faktor VIIa ist in physiologischen

Konzentrationen nach dem zell-basierten Modell der Hämostase primär für die Initiation und

Faktor VIIIa und IXa für die Propagation, also der massierten Produktion von Thrombin,

zuständig (POON et al. 2000, HOFFMAN und MONROE 2001, ALLEN et al. 2002,

MARTINOWITZ et al. 2002). Die Gabe von rhFVIIa in Dosen, die deutlich über den

physiologischen Konzentrationen von Faktor VII und VIIa liegen, ist auch unabhängig von

Gewebsthromboplastin in der Lage, Faktor X zu aktivieren und diese massierte Thrombin-

Produktion hervorzurufen, ohne eine DIG auszulösen (TELGT et al. 1989, RAO und

RAPOPORT 1990, HOFFMAN et al. 1994).

Ein zweiter Grund für die Untersuchungen mit dieser hohen Dosierung war die Tatsache, daß

beim homozygoten Hund mit von Willebrand-Erkrankung Typ III wie auch beim hämophilen

63

Hund offensichtlich eine wesentlich höhere Dosierung von Faktor VIIa erforderlich ist, um

klinisch effektiv zu wirken (BRINKHOUS 1989, eigene unveröffentlichte Daten).

Vergleicht man die C0-FVII:C-Werte, die sich mit einer definierten rhFVIIa-Dosis bei Hund

und Mensch erzielen lassen, so wird eine Diskrepanz deutlich. Beim Menschen führen

Injektionen von 60-80 µg/kg rhFVIIa zu einem 20 bis 30fachen Anstieg der physiologischen

FVII:C-Aktivität (LINDLEY et al. 1994, BERNSTEIN et al. 1997, HENDRICKS et al.

2001). Die eigenen Daten zeigen hingegen nach 100 µg/kg einen nur etwa 4fachen und nach

500 µg/kg einen 20fachen Anstieg derselben beim Hund. Der Unterschied ist leicht zu

erklären, beziehen sich die beim Hund gemessenen Aktivitäten auf eine Kalibration gegen

einen Hundepool, der etwa die vierfache Faktor VII-Aktivität im Vergleich zum normalen

Humanplasma besitzt (MISCHKE 2001).

Bei den rhFVIIa:Ag-Werten fällt auf, daß die Werte 2 min nach der Injektion deutlich unter

den im Plasma bei einem Hämatokrit von etwa 40 % maximal zu erwartenden

Konzentrationen von 1,67 µg/ml bei Gabe von 100µg/kg rhFVIIa bzw. 8,33µg/ml bei Gabe

von 500µg/kg lagen. Dies kann einerseits dadurch erklärt werden, daß es zu einer Anlagerung

der rhFVIIa-Moleküle an Gefäß-Endothelzellen oder Blutbestandteile kommt, was die

Konzentration im Plasma verringert. Andererseits kann es in vivo teilweise zu einer

Transformation des Moleküls kommen, die die Bindung an einen monoklonalen Antikörper

verhindert, und damit ein mit einem monoklonalen Antikörper arbeitendes Testsystem

beeinflußt. So berichtet MORISSEY (1999) auch von einer deutlichen Differenz zwischen

koagulometrisch ermittelten und mittels ELISA bestimmten absoluten Konzentrationen von

Faktor VIIa beim Menschen. Der Autor erklärt dies mit einer möglichen C-terminalen

Transformation des FVIIa-Moleküls in vivo, die die Antikörperbindung verhindert, die

Gerinnungsaktivität jedoch nicht verändert.

BRINKHOUS et al. (1989) gaben basierend auf ihren Untersuchungen an einzelnen Hunden

mit Hämophilie für Dosierungen von 50-220 µg/kg eine Halbwertzeit für das FVII:Ag-

Konzentration von 2,8 ± 0,5 h und für die FVII:C-Aktivität von 2,1 ± 0,6 h an. Diese Daten

liegen deutlich über den selbst für die anhand der FVIIa:Ag-Konzentration und der FVII:C-

Aktivität errechneten Werten. Möglicherweise ist der von BRINKHOUS et al (1989)

eingesetzte unspezifischere ELISA, der im Gegensatz zu der vorliegenden Studie auch nicht

aktivierten Faktor VII detektierte, eine Ursache für die Diskrepanz. Da die Ausgangswerte für

64

FVII:Ag vor rhFVIIa-Gabe bei den von BRINKHOUS et al. (1989) beschriebenen Hunden

deutlich über „Null“ lagen, ist zudem davon auszugehen, daß dieser Test auch FVII- und/oder

FVIIa:Ag des Hundes miterfaßte. Hingegen wurde die Spezifität des eigenen Testsystems in

Vorversuchen detailliert untersucht. Weitere Vergleichsdaten für pharmakokinetische

Berechnungen basierend auf der FVII:Ag (bzw. FVIIa:Ag)-Konzentration, die eine

Relativierung erlaubten, lassen sich der zugänglichen Literatur auch für den Menschen nicht

entnehmen. Hier findet sich nur das Zitat von LINDLEY et al. (1994), die ebenfalls auf der

Basis der FVII:C-Aktivität bei Dosierungen von 17,5, 35 und 70 µg/kg rhFVIIa bei

hämophilen Menschen mittlere Halbwertszeiten von 2,57 bis 2,81 h finden.

Interessant ist die in der vorliegenden Studie die für die FVII:C-Aktivität erarbeitete kürzere

Halbwertszeit der höheren Dosierung bei gesunden Hunden. Eine plausible Erklärung wäre

eine schnelle Elimination des aktivierten Faktors aus der Zirkulation durch Bindung an

Zelloberflächen (v.a. Thrombozyten), die in diesen hohen Dosierungen zum Tragen kommt.

Dies könnte auch eine Aktivierung der Thrombozyten erklären, was sich anhand der deutlich

verminderten Thrombozytenzahl nach der Injektion von 500µg/kg KM rhFVIIa in gesunde

Hunde andeutete. So berichteten in der humanmedizinischen Literatur mehrere Autoren

(CHUANSUMRIT et al. 1999, VIDARSSON et al. 2000, GEROTZIAFAS et al. 2002), daß

hochdosierte rhFVIIa-Gaben zu einer erhöhten Aktivität der Thrombozyten führt, was

therapeutisch bei Thrombozytopenien und Störungen der Plättchenfunktion ausgenutzt wird.

Die Faktor VIIa-Injektion führte bereits in der Dosierung von 500µg/kg KM bei allen Hunden

zu einer deutlichen Verkürzung der PT bei Messung mit dem PTST. Die hierbei erreichten

Werte im Bereich von 4 sec stellen die Grenze des Meßbereiches dar, bedingt durch das

Mischen des Testansatzes und Einsetzen des Elektrodenhalters. Sie sind überwiegend als

artifiziell anzusehen und zeigen die Grenzen des konventionellen, für den Menschen

optimierten Tests bei der Messung von Hundeplasma auf. Bedingt durch die deutlich höhere

Faktor V- und Faktor VII-Aktivität des Hundes liegt bereits die PT (PTST) des gesunden

Hundes mit 6-8 sec sehr nahe dieser methodischen Grenze (MISCHKE und NOLTE 1997).

Beim Menschen ist hingegen mit dem PTST auch bei zuvor unverändertem Wert (z.B.

hämophiler Patient) der rhFVIIa-Effekt kontrollierbar (LINDLEY et al. 1994).

Differenziertere Aussagen waren mit dem PTMT möglich, der für den Hund optimiert wurde

(MISCHKE 1999, MISCHKE und NOLTE 1997) und auch für die Überwachung der

65

rhFVIIa-Therapie besser geeignet erscheint. Beim Faktor-VII-defizienten Menschen führen in

der Regel bereits sehr viel niedrigere Dosierungen (10-20 µg/kg rhFVIIa) als in die in der

vorliegenden Arbeit verwendeten zu einem an der PT ablesbaren Effekt. Aufgrund der

deutlich höheren Faktor VII-Aktivität des gesunden Hundes können diese Verhältnisse nicht

unkritisch auf den Hund Übertragen werden. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten PT-

Effekte zeigten jedoch wie die korrespondierenden FVII:C-Resultate, daß für eine klinische

Anwendung beim FVII-Mangel-Hundes eine wesentlich geringere Dosierung als 100 µg/kg

rhFVIIa effektiv sein müßte.

Die aPTT zeigte in Gruppe III (gesunde Hunde, die 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert

bekamen) eine deutliche Verkürzung innerhalb der ersten 1,5 h nach rhFVIIa-Injektion. Auch

in den anderen Gruppen war eine partielle Verkürzungen der aPTT innerhalb der ersten 15

min nach rhFVIIa-Injektion nachweisbar. Beim Menschen sind Verkürzungen der aPTT

schon bei Dosierungen von 20 µg/kg (BERNSTEIN et al. 2001) und ab 40 µg/kg KM

(MARTINOWITZ et al. 2002) festgestellt worden. Auch LINDLEY et al. (1994) sowie

TELGT et al. (1989) beschrieben eine signifikante Verkürzung der aPTT in allen Plasma-

Proben exklusive bei Faktor X und V-defizientem Plasma. Sie führten dies auf eine

Gewebsthromboplastin-unabhängige direkte Aktivierung von Faktor X bei hohen

Konzentrationen von rhFVIIa zurück. Dieses Phänomen wird durch die Aktivierung des

Faktors IX durch Faktor VIIa über die sogenannte Josso-Schleife erklärt (JENSEN et al.

1976, XI et al. 1989, TELGT et al. 1989, LINDLEY et al. 1994). Da die aPTT von

Konzentrationen des Faktors VII und Faktors VIIa unabhängig ist, eignet sie sich andererseits

kaum zum Monitoring der rhFVIIa-Therapie (TELGT et al. 1989, HEDNER 1996,

INGERSLEV et al. 2000).

Das – im Gegensatz zu den anderen Gruppen – deutliche Absinken der Thrombozytenzahl bei

den gesunden Hunden, die 500 µg/kg KM rhFVIIa bekommen hatten, könnte eventuell durch

einen Verbrauch eines Teils der Thrombozyten durch Aktivierung mit anschließender

Verklumpung im Gefäßsystem durch die hohe Dosis rhFVIIa erklärbar sein. Dies könnte ggf.

auch zu einem erhöhten Verbrauch von Erythrozyten führen und den leichten

Hämatokritabfall in dieser Gruppe erklären. Zwar ließ sich ein analoger Effekt für die Faktor-

VII-Mangel-Tiere nicht sichern, was aber zumindest teilweise mit der geringen Tierzahl (n=4)

dieser Gruppe zu erklären sein könnte.

66

Hohe Dosen von rhFVIIa sind in der Lage, die Thrombozyten über einen Thrombin-

abhängigen Weg zu aktivieren (POON et al. 2000, WILBOURN et al. 2003). Dies wird im

zell-basierten Modell der Koagulation berücksichtigt (POON et al. 2000, HOFFMAN und

MONROE 2001, MARTINOWITZ et al. 2001, ALLEN et al. 2002, MARTINOWITZ et al.

2002). Therapeutisch wird dieser Effekt – wie bereits oben erwähnt – bei der Behandlung von

Thrombozytopenien und -pathien genutzt (KRISTENSEN 1996, POON et al. 2000, POON et

al. 2001). Untersuchungen über Hämatokritveränderung nach rhFVIIa-Applikation bei

Menschen ohne Blutung wurden bei größeren Studien beim Menschen z. B. bei LINDLEY et

al. (1994), nicht gemacht. Nach Literaturhinweisen konnte jedoch bei blutenden Menschen

durch rhFVIIa, allerdings in der deutlich geringeren Standarddosierung für den Menschen, der

Hämatokrit stabil gehalten und die Anzahl der notwendigen Blutkonserven reduziert werden

(MARTINOWITZ et al. 2001, KAMPHUISEN et a. 2002, MARTINOWITZ et al. 2002).

BERNTORP et al. (2000) geben bei Warfarin-behandelten Patienten ein geringfügiges

Absinken des Hämatokrits von 36 auf 35 % 5 min nach der rhFVIIa-Injektion an, ohne aber

die zugehörige Dosierung zu nennen.

Rekombinanter humaner Faktor VIIa ist von KRISTENSEN et al. (2003) zum Einsatz bei

Hunden mit Trauma, massiven Blutungen, DIG, Thrombozytopenie, Vergiftungen mit

Antikoagulantien vom Cumarin-Typ, Leber-Erkrankungen, gastrointestinalen Blutungen,

chirurgischen Eingriffen und hereditären Gerinnungsfaktormängeln propagiert worden.

Allerdings limitiert derzeit der Preis (über 2500 € für eine Behandlung eines 20 kg schweren

Hundes mit 100 µg/kg KM rhFVIIa) den klinischen Einsatz in der Veterinärmedizin. Von

größerer Bedeutung erscheint derzeit der Einsatz des Hundes als Tiermodell z.B. zur

Untersuchung des nach wie vor nicht vollständig geklärten Wirkungsmechanismus bei

plättchen-induzierten Blutungen. Mögliche „Hundemodelle“ sind weiterhin die Hämophilie A

und B mit und ohne Inhibitoren sowie der auch in der vorliegenden Arbeit untersuchte Faktor

VII-Mangel (BRINKHOUS et al. 1989, MERTENS et al. 1990, TINLIN et al. 1993).

Sowohl im Hinblick auf einen klinischen Einsatz in der Zukunft als auch im Hinblick auf

mögliche Tiermodelle ist bedeutsam, daß die selbst untersuchten Hunde das Medikament gut

vertrugen. Nur bei einem von 22 Tieren war vorübergehend lokalisierte Quaddelbildung zu

sehen, die aber unbehandelt nach kurzer Zeit verschwand. Die geringe Inzidenz von adversen

Reaktionen bei der Anwendung von rhFVIIa beim Hund widerspricht den Erfahrungen von

67

BRINKHOUS et al. (1989). Von den 5 von BRINKHOUS et al. (1989) mit rhFVIIa

behandelten Hunden entwickelten 4 (davon einer nach wiederholter Injektion) Symptome

einer Typ-I-Überempfindlichkeit in Form von Quaddelbildung. Schwerere adverse

Reaktionen traten allerdings auch in dieser Studie nicht auf. Da es sich bei BRINKHOUS et

al. (1989) um Hunde mit Hämophilie A oder B bzw. von Willebrand-Erkrankung handelte,

die eine deutliche Blutungsneigung aufwiesen und unter experimentellen Bedingungen

gehalten wurden, liegt eine Immunisierung durch Vorbehandlung mit homologen oder

heterologen Plasmaprodukten nahe. Die aufwendige Präparation mit chromatographischen

Techniken und Immunabsorption läßt hingegen das Verbleiben von potenziell immunogenen

Kontaminationen aus der Zellkultur gering erscheinen. Hinweise auf andere immunogene

Zusätze zur Faktor VIIa Lösung (z.B. Stabilisatoren wie Humanalbumin) lassen sich den

methodischen Angaben von BRINKHOUS et al. (1989) nicht entnehmen. Da die Dosierung

von rhFVIIa in der vorliegenden Arbeit und in der Studie bei BRINKHOUS et al. (1989; 49-

550 µg/kg) in der gleichen Größenordnung lagen, können Dosierungsunterschiede hingegen

nicht als Erklärung herangezogen werden.

Die eigenen Beobachtungen passen in den Zusammenhang von Untersuchungsergebnissen

zur Anwendung von konventionell hergestelltem humanem Faktor VIIa-Konzentraten beim

Hund. CHABBAT et al. (1988) wandten dieses bei vier gesunden Hunden und vier Hunden

mit Hämophilie A in vier verschiedenen Dosierungen an aufeinanderfolgenden Tagen an,

ohne daß unerwünschte Wirkungen auftraten. MERTENS et al. (1990) berichten über die

einmalige Verabreichung einer sehr niedrigen Dosierung (0,5µg/kg) eines hochgereinigten

konventionell hergestellten FVII-Kozentrates an gesunde Hunde und Hunde mit Hämophilie

A ohne klinische Auffälligkeiten. Auch bei Hunden die mit rekombinantem humanen Faktor

IX behandelt wurden, war die Verträglichkeit gut (KEITH et al. 1994).

Alle selbst untersuchten Hunde zeigten eine Antikörperbildung 14 Tage nach der Injektion.

Auch BRINKHOUS et al. (1989) fanden eine Antikörperbildung bei allen mit rhFVIIa

behandelten Hunden ein bis zwei Wochen nach der Verabreichung. Es zeigte sich eine

Abhängigkeit von der Dosierung: Die höhere Dosierung verursachte auch höhere

Antikörpertiter. Bei BRINKHOUS et al. (1989) waren die Titerhöhen und die Persistenz der

Antikörper unterschiedlich und ohne erkennbaren Bezug zu Erkrankung, Dosierung oder

Anzahl der Applikationen. Inwiefern die Antikörperbildung die Einsetzbarkeit für

68

mehrmalige therapeutische Anwendungen dieses Medikaments beim Hund beeinflußt, bedarf

noch weiterer Untersuchung. Es traten bei Injektion von konventionellem humanen Faktor

VII-Konzentrat in Hunde an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen keine Komplikationen auf

(CHABBAT et al. 1988). Beim Menschen ist die Antikörperbildung gegen rhFVIIa eine

seltene Komplikation (NICOLAISEN 1996). Bei einem Kleinkind waren nach akzidenteller

Überdosierung Antikörper nachweisbar (MARIANI et al. 1998). Auch 3 von 4 gesunden

Beagles, die mit rekombinantem humanen Faktor IX über 28 Tage (n=4) sowie 3 von 4

gesunden Beagles, die einem konventionellen humanen Faktor IX-Konzentrat über 14 Tage

(n=4) behandelt wurden, bildeten Antikörper gegen die Präparate, die die Halbwertszeit der

Präparate deutlich verminderten (KEITH et al. 1994).

Die vorliegende Studie liefert grundlegende Daten zur Pharmakokinetik und –dynamik von

rhFVIIa beim gesunden und Faktor-VII-defizienten Hund, die für den Menschen einerseits im

Hinblick auf einen direkten vergleichenden Aspekt und auch im Hinblick auf mögliche

tierexperimentelle Ansätze von Interesse sein dürften. Interessant ist in diesem

Zusammenhang, daß in jüngster Zeit wurden noch aktivere Varianten des rhFVIIa gefunden

(PERSSON et al. 2001, LISMAN et al. 2003). Erste In-vitro-Tests mit Plasma von Patienten

mit Hämophilie lassen eine höhere Aktivität als der herkömmliche rhFVIIa erkennen

(LISMAN et al. 2003). Bei höherer Wirksamkeit könnte die Dosis mit diesen Varianten

niedriger gewählt werden, was eventuell den Preis senken und die Bildung von Antikörpern

reduzieren könnte. Ebenso dürften – wie oben ausgeführt – in Abhängigkeit von der

Indikation (insbesondere hereditärer Faktor VII-Mangel) durchaus schon geringere

Dosierungen des derzeit kommerziell erhältlichen rhFVIIa effektiv sein.

69

6 Zusammenfassung

Bernd Dörsch

Untersuchungen zur Pharmakokinetik, gerinnungsphysiologischen Wirkung und

Immunogenität von rekombinantem humanen Faktor VIIa bei gesunden und Faktor

VII-defizienten Hunden

Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war, die Pharmakokinetik und Einflüsse auf das

Gerinnungssystem von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) bei

gerinnungsphysiologisch gesunden und Faktor VII-defizienten Hunden zu erarbeiten und

dadurch die Grundlagen für tierexperimentelle Untersuchungen zu liefern.

Die Untersuchungstiere wurden auf die folgenden Untersuchungsgruppen verteilt:

Gruppe I = gesunde Tiere, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden,

Gruppe II = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 100 µg/kg KM rhFVIIa

injiziert wurden,

Gruppe III = gesunde Tiere, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa injiziert wurden und

Gruppe IV = Tiere mit hereditärem Faktor VII-Mangel, denen 500 µg/kg KM rhFVIIa

injiziert wurden.

Blutentnahmen erfolgten vor der rhFVIIa-Gabe sowie 2, 5, 10, 15, 30 min, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8,

12 und 24 h danach. Zu allen Zeitpunkten wurden koagulometrisch gemessene Faktor

VII(FVII:C)-Aktivität, Faktor VIIa-Antigen(FVIIa:Ag)-Konzentration, Prothrombinzeit–

Standardtest (PTST), Prothrombinzeit-modifizierter Test (PTMT), aktivierte partielle

Thromboplastinzeit (aPTT), Hämatokrit und Thrombozytenzahl gemessen. Darüber hinaus

erfolgten Blutprobenentnahmen vor sowie 2, 4 und 12 Wochen nach der rhFVIIa-Gabe zum

Nachweis kaniner Antikörper gegen rhFVIIa.

Die wesentlichsten Ergebnisse waren wie folgt:

Bis auf eine leichte temporäre Hautreaktion bei einem gesunden Hund zeigte keines der Tiere

Anzeichen einer Unverträglichkeit. Die FVII:C-Aktivität stieg in allen Gruppen 2 min nach

der Injektion signifikant von im Mittel 86 auf 446 % (in Gruppe I), von 13 auf 441 % (in

Gruppe II), von 92 auf 2143 % (in Gruppe III) und von 15 auf 1912 % (in Gruppe IV) und

erreichte nach 24 h jeweils wieder den Ausgangswert (p>0,05). Die FVIIa:Ag-Konzentration

70

betrug 2 min nach rhFVIIa-Gabe 26,9 ± 3,12 ng/ml (Mittelwert und Standardabweichung,

Gruppe I), 32,9 ± 3,54 ng/ml (Gruppe II), 144,7 ± 11,95 ng/ml (Gruppe III) und 142,0 ± 7,55

ng/ml (Gruppe IV).

Die aus den FVII:C-Werten errechneten Halbwertszeiten stimmten in den Gruppen I, II und

IV sehr gut überein (Gruppe I: 98,3 min, Gruppe II: 99,0 min, Gruppe IV: 96,3 min), lagen

interessanterweise bei der Gruppe mit gesunden Hunden und hoher Dosierung niedriger

(Gruppe III: 66,3 min). Für die Halbwertszeit der FVIIa:Ag-Konzentration bestand mit

Mittelwerten von 81 bis 90 min kein deutlicher Unterschied zwischen den Gruppen.

Korrespondierend zeigte sich für die FVII:C-Aktivität eine um ein Vielfaches höhere totale

Clearance für die höhere Dosierung (Gruppe III: 0,0244 ml/min; IV: 0,0207 ml/min) im

Vergleich zur niedrigeren Dosierung (Gruppe I: 0,0019 ml/min; Gruppe II: 0,0015 ml/min),

während die Unterschiede für die FVII:Ag-Konzenatration hier weniger deutlich ausfielen

(Gruppenmittel: 38-64 ml/min).

Die rFVIIa-Behandlung bewirkte eine auffällige Verkürzung der PTST, die von Werten um 7

sec bei den gesunden Hunden (Gruppe I und III) und Werten um 15 sec bei den Faktor VII-

defizienten Hunden in allen Gruppen auf Werte um 4 sec (als methodenspezifischer unterer

Meßbereich) sank und in keiner der Gruppen nach 24 h den Ausgangswert erreichte.

Hingegen stieg die mit dem PTMT gemessene PT-Aktivität in Abhängigkeit von der Dosis bei

gesunden Hunden von im Mittel 72 auf 155 % (Gruppe I) bzw. 74 auf 227 % (Gruppe III) und

bei Faktor VII-defizienten Hunden von im Mittel 26 auf 144 % (Gruppe II) bzw. von 34 auf

193 % (Gruppe IV) an. Eine auffällige Verkürzung der aPTT war vor allem auf die Gabe von

500 µg/kg KM bei gesunden Hunden beschränkt.

Interessant war, daß nach Verabreichung von 500 µg/kg rhFVIIa bei den gesunden Hunden

ein signifikanter Abfall der Thrombozytenzahl und des Hämatokritwertes auftrat. Bei allen

Hunden konnte 2 Wochen nach einmaliger Behandlung mit rhFVIIa die Bildung von

Antikörper gegen rhFVIIa nachgewiesen werden Die Höhe der Antikörpertiter war

dosisabhängig und variierte interindividuell sehr stark.

Die Ergebnisse dieser Studie liefern die Grundlagen für den Einsatz des Hundes als

Tiermodell für die Therapie mit rhFVIIa. Obgleich derzeit wegen der immensen Kosten nicht

praktikabel, zeigt sich die prinzipielle Effizienz der rhFVIIa-Behandlung beim Faktor VII

defizienten Hund anhand der deutlichen PT-Verkürzung (Anstieg der PTMT-Aktivität) und

71

Anstieg der FVII:C-Aktivität. Da hierbei weit über den physiologischen Verhältnissen

liegende FVII:C-Aktivitäten erzielt wurden, sind für die Behandlung des Faktor-VII-Mangel

Hundes deutlich unter 100 µg/kg liegende rhFVIIa-Dosierungen ausreichend.

72

7 Summary

Bernd Dörsch

Investigations on pharmacokinetics, coagulatory effects and immunogenity of

recombinant human factor VIIa in healthy and factor VII deficient dogs

The aim of this study was to determine pharmacokinetic data and the influence on the

coagulation system of recombinant human factor VIIa (rhFVIIa) in dogs with inherited factor

VII-deficiency and dogs without coagulation disorders. This work should establish

preliminary data for further investigation in animal models.

The animals of this study were put into following groups:

Group I = healthy animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body mass

Group II = factor VII-deficient animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body

mass

Group III = healthy animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body mass

Group IV = factor VII-deficient animals, who received 100 µg rhFVIIa per kg body

mass

Blood was taken before and 2, 5, 10, 15, 30 min, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 and 24 hours after

application of rhFVIIa. At all times the coagulometric-measured factor VII(FVII:C)-activity,

the factor VII-antigen(FVIIa:Ag)-concentration, the prothrombin time-standard test (PTST),

the prothrombin time-modified test (PTMT), the activated partial thromboplastin time (aPTT),

the haematocrit, and the platelet count were examined. Furthermore, blood was drawn before

and 2, 4 and 12 weeks after application of rhFVIIa to determine if these animals produced

antibodies against rhFVIIa.

The most important results are: Apart from a temporary skin reaction in one healthy dog none

of the dogs showed adverse reactions. The FVII:C activity rised significantly 2 min after

injection of rhFVIIa in all groups from mean values of 86 to 446 % (in group I), from 13 to

441 % (in group II), from 92 to 2143 % (in group III), and from 15 to 1912 % (in group IV).

24 h later the values were not significantly different from initial values (p>0,05). The

73

FVIIa:Ag concentration values 2 min after the rhFVIIa injection were 26.9 ± 3.12 ng/ml

(mean value + standard deviation, group I), 32.9 ± 3.54 ng/ml (group II), 144.7 ± 11.95 ng/ml

(group III) and 142.0 ± 7.55 ng/ml (group IV).

Whereas mean half-life calculated from FVII:C values was longer in groups I, II and IV

(group I: 98,3 min; group II: 99,0 min, group IV: 96,7 min) compared to the group with

healthy animals and higher dosage (group III: 66,3 min), half-lifes calculated based on

FVII:Ag concentrations did not show remarkable group differences (mean values: 81 to 90

min). Correspondingly, based on factor VII:C activity higher dosages were associated with a

manyfold higher total clearance (group III: 0,0244 ml/min; group IV: 0,0207 ml/min) when

compared to the lower dosage (group I: 0,0019 ml/min; group II: 0,0015 ml/min). Less

distinct group differences of the total clearance were found when calculated based on

FVIIa:Ag values (mean values of groups: 38-64 ml/min).

The rhFVIIa-treatment caused a significant shortening of the PTST from initial values of

approx. 7 sec in healthy dogs (groups I and III) or 15 sec in factor VII deficient dogs,

respectively, to values around 4 sec (corresponding to the method specific lower measurement

range) in all groups. The initial values were not reached after 24 h in any of the groups. The

coagulation activity measured with the PTMT increased dose-dependent in healthy dogs from

mean values of 72 to 155 % (group I) and from 74 to 227 % (group III). In factor VII-

deficient dogs mean values increased from 26 to 144 % (group II) or from 34 to 193 % (group

IV). A significant shortening of the aPTT was mainly restricted to the healthy dogs receiving

the high dose of 500 µg/kg KM.

Interestingly, the injection of 500 µg/kg rhFVIIa in healthy dogs induced a significant

decrease in platelet count and haematocrit. Two weeks after rhFVIIa treatment, all the dogs

developed antibodies against rhFVIIa. The amount of antibodies was dose-dependent and

varied remarkably between individual dogs.

The results of the present study deliver the basis of the use of dogs as an animal model for

rhFVIIa treatment. Efficacy of rhFVIIa treatment in factor VII deficient dogs was

demonstrated by significant shortening of PTST (increase of PTMT activity), although high

costs limit its use under clinical conditions at present. Due to the fact that factor VII:C

activities were achieved which were significantly above the physiological situation, dosages

below 100 µg/kg are adequate for the treatment of dogs with inherited factor VII-deficiency.

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Tabellarischer Anhang:

Tab. TA1: Ergebnisse aus dem Vorversuch zum ELISA zur Bestimmung der Faktor

humanen VIIa-Antigen-Konzentration – Verdünnungsfaktor in A-Puffer und Mittelwerte von

Doppelmessungen der optischen Dichte bei einem Testfilter von 450 nm gegen einen

Referenzfilter von 630 nm.

Probe Rekombinanter humaner Faktor VIIa

Verdünnungsfaktor 1: 8 1:32 1:64 1:103 1:104 1:105 1: 3x105 1:106

Optische Dichte 2162 1999 2008 1980 1998 1435 752 329

Probe Kanines Poolplasma

Verdünnungsfaktor 1: 20 1: 40 1: 80 1: 160

Optische Dichte 0,16 0,20 0,18 0,17

Tab. TA2: Ergebnisse aus den Vorversuchen zur Antikörperbildung gegen rekombinanten

humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) - Verdünnungsfaktor in A-Puffer und Mittelwerte von

Doppelmessungen der optischen Dichte bei einem Testfilter von 450 nm gegen einen

Referenzfilter von 630 nm.

Probe Serum von Patient 3 vor rhFVIIa-Gabe

Verdünnungsfaktor 1: 200 1:600 1:800 1:1000 1:3200 1:6400

Optische Dichte 2296 2175 1945 2061 1553 553

Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000

Optische Dichte 650 415 296 181

Probe Serum von Referenzhund 1, unbehandelt

Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000

Optische Dichte 441 267 172 117 Probe Serum von Referenzhund 2, unbehandelt Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000 Optische Dichte 326 185 116 84 Probe Serum von Referenzhund 3, unbehandelt Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000 Optische Dichte 451 285 185 116

97

Fortsetzung Tab. TA2 Probe Serum von Referenzhund 4, unbehandelt Verdünnungsfaktor 1:4000 1:8000 1:32000 1:64000 Optische Dichte 348 205 152 94 Probe Serum von Patient 10, 2 Wochen nach rhFVIIa-Gabe

Verdünnungsfaktor 1: 8000 1: 32000 1:40000 1:80000 1:320000 1:640000

Optische Dichte 2065 1998 1847 1434 956 561

98

Tab. TA3: Verlauf der Faktor VII-Aktivität (FVII:C) (% der Norm) nach Injektion von

rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte,

arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den statistischen

Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor

VII-Mangel.

Nr Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 85 432 444 429 420 412 342 305 268 218 178 110 105 102 752 85 460 452 434 412 362 320 300 290 178 142 119 103 96 894 80 488 492 443 452 397 340 328 282 233 201 170 146 96 935 104 444 452 416 419 371 342 315 281 225 170 149 115 120 113

18 85 435 450 419 402 341 321 292 257 205 174 136 141 88 7219 75 417 414 401 365 324 289 270 252 175 150 118 95 83 76

86 446 451 424 412 368 326 302 272 206 169 134 118 98 86s 9,8 25,0 24,9 14,9 28,4 33,1 20,7 19,9 15,1 24,4 21,1 22,7 21,2 12,9 15,5

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0017 0,0098 0,0017 0,4403

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 14 476 500 484 448 412 356 288 236 158 103 73 43 19 136 16 395 416 401 386 372 314 250 203 145 93 67 55 22 187 19 452 476 443 440 390 310 273 228 178 103 92 62 50 178 15 443 464 476 431 396 340 307 243 143 104 77 52 20 15

14 11 429 465 432 408 382 302 268 213 144 100 58 16 17 1116 5 450 470 444 417 378 315 265 202 170 127 76 31 19 12

13 441 465 447 422 388 323 275 221 156 105 74 43 25 14s 4,8 27,2 27,5 30,3 22,8 14,4 20,7 19,9 17,4 14,9 11,5 11,3 17,1 12,6 2,8

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0016 0,0226 0,2409

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 100 2002 2182 2304 1776 1560 1476 936 552 450 345 282 171 103 100

10 95 2364 2400 2340 1824 1776 1548 1020 512 458 411 276 176 102 9511 110 2184 2280 2364 2124 1668 1476 1104 484 390 322 240 185 107 11212 103 2136 2184 2040 1740 1668 1548 936 449 385 290 210 185 118 10820 73 1829 1987 1980 1657 1507 1160 834 569 347 255 184 144 121 7822 73 2340 2141 2104 2064 1490 1269 1024 516 461 360 248 116 105 96

92 2143 2196 2189 1864 1612 1413 976 514 415 331 240 163 109 98s 15,7 204 138 167 187 111 161 93,8 43,8 47,6 54,7 37,8 27,5 8,1 11,9

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0001 0,0000 0,0424 0,0808

99

Fortsetzung Tab. TA3

Tab. TA4: Auf der Basis der Faktor VII-Aktivität (FVII:C) (% der Norm) errechnete

pharmakokinetische Daten des rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) beim Hund

nach intravenöser Injektion verschiedener Dosierungen in gesunde Hunden bzw. Hunden mit

hereditärem Faktor VII-Mangel: Berechnete (C0-ber) und gemessene Anfangskonzentration

(C0-gem), Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC)

Verteilungsvolumen (Vdβ) und Eliminationskonstante (β).

Rechenwert C0-ber C0-gem t50 Cltot AUC Vdβ β Einheit (∆%) (∆%) (min) (ml/min) (∆% x min) (l) (1/min)

Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 1 383 381 98,80 0,0018 54400 0,261 0,0070 2 444 423 99,00 0,0019 52300 0,225 0,0070 4 484 465 99,00 0,0017 58800 0,206 0,0070 5 400 386 99,00 0,0020 49900 0,250 0,0070

18 447 422 98,20 0,0019 50500 0,224 0,0071 19 423 399 95,90 0,0021 46600 0,237 0,0072

430 413 98,32 0,0019 52083 0,234 0,0070 s 36 31 1,22 0,0001 4192 0,020 0,0000

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 518 511 99,00 0,0014 70700 0,193 0,0070 6 421 419 98,90 0,0017 60000 0,238 0,0070 7 525 507 98,90 0,0015 65600 0,190 0,0070 8 478 476 98,80 0,0015 68100 0,209 0,0070

14 573 540 97,80 0,0016 63600 0,174 0,0071 16 536 517 99,00 0,0015 66700 0,187 0,0070

509 495 98,73 0,0015 65783 0,199 0,0070 s 53 43 0,46 0,0001 3705 0,022 0,0000

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 16 1980 1824 1776 1644 1356 1200 920 600 494 356 295 109 34 1815 7 1750 1778 1699 1596 1428 1332 1056 584 481 424 345 106 57 1017 5 1877 1848 1723 1554 1440 1320 1006 580 330 288 247 150 47 621 32 2040 1814 1760 1541 1303 1096 1020 880 428 280 198 121 77 33

15 1912 1816 1740 1584 1382 1237 1001 661 433 337 271 122 54 17s 12,3 127 29,1 35,0 46,5 64,3 111 57,7 146 74,5 67,3 63,1 20,1 18,1 11,9

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0000 0,0012 0,0000 0,0016 0,0029 0,0019 0,0061 0,0177

100

Fortsetzung Tab. TA4

Rechenwert C0-ber C0-gem t50 Cltot AUC Vdβ β Einheit (∆%) (∆%) (min) (ml/min) (∆% x min) (l) (1/min)

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 2310 2280 71,20 0,0238 210000 0,217 0,0097

10 2320 2130 66,30 0,0225 222000 0,215 0,0104 11 2340 2330 61,40 0,0241 207000 0,213 0,0113 12 2110 2100 66,20 0,0248 201000 0,237 0,0105 20 2060 2040 66,50 0,0272 184000 0,234 0,0104 22 2930 2590 66,30 0,0238 210000 0,171 0,0104

2345 2245 66,32 0,0244 205667 0,215 0,0105 s 310 202 3,10 0,0016 12628 0,024 0,0005

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 1980 1970 99,00 0,0207 241000 0,252 0,0070 15 1980 1930 99,00 0,0196 256000 0,253 0,0070 17 2190 2110 89,90 0,0213 235000 0,229 0,0077 21 2040 2000 99,00 0,0210 239000 0,229 0,0077

2048 2003 96,73 0,0207 242750 0,241 0,0070 s 99 77 4,55 0,0007 9179 0,014 0,0000

101

Tab. TA5: Verlauf der humanen Faktor VIIa-Antigen-Konzentration (ng/ml) nach Injektion

von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen –

Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den

statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit

hereditärem Faktor VII-Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 0,5 25,8 28,4 22,4 17,2 12,5 10,2 10,1 8,0 3,9 3,8 3,3 2,3 1,2 1,02 0,3 27,3 29,9 21,2 16,7 12,2 8,6 8,4 3,7 2,7 1,9 1,6 1,3 0,9 0,54 0,3 29,5 32,0 22,2 18,4 12,8 8,6 7,9 3,1 1,9 1,3 0,4 0,4 0,3 0,45 0,3 28,7 31,1 22,0 17,0 12,6 8,2 7,2 3,5 1,8 1,2 0,1 0,2 0,2 0,2

18 0,9 29,1 30,1 23,3 19,8 14,5 12,1 10,0 7,0 5,0 4,0 4,2 3,4 2,0 1,319 0,6 21,2 22,5 20,1 13,5 8,5 6,2 3,7 3,3 2,2 2,4 1,7 0,9 0,6 0,6

0,5 26,9 29,0 21,9 17,1 12,2 9,0 7,9 4,8 2,9 2,4 1,9 1,4 0,9 0,7s 0,26 3,14 3,42 1,13 2,10 2,00 1,99 2,33 2,14 1,29 1,20 1,61 1,21 0,68 0,40

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,0016 0,0014 0,0023 0,0292 0,0342 0,0511 0,0363

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 0,2 33,4 36,7 28,0 22,3 16,7 13,7 9,6 6,4 3,7 3,0 1,1 0,6 0,5 0,66 0,2 31,8 35,0 30,0 23,7 17,8 13,9 7,1 6,2 3,1 2,0 0,2 0,3 0,2 0,27 0,8 35,6 37,9 32,5 26,7 21,0 16,8 14,4 13,0 7,0 5,7 2,3 0,9 0,8 0,98 0,6 34,8 39,0 25,2 21,6 14,3 9,9 10,8 8,8 4,1 3,0 1,7 1,5 1,3 1,0

14 0,8 35,5 38,5 21,8 16,6 15,1 9,4 7,7 6,8 5,9 5,0 4,0 2,7 1,9 1,616 0,4 26,3 27,1 25,9 10,5 7,9 7,1 4,4 2,6 3,3 2,9 2,2 1,4 0,9 0,7

0,5 32,9 35,7 27,2 20,2 15,5 11,8 9,0 7,3 4,5 3,6 1,9 1,2 0,9 0,8s 0,26 3,54 4,45 3,78 5,81 4,38 3,59 3,45 3,44 1,59 1,42 1,27 0,87 0,60 0,48

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0002 0,0002 0,0003 0,0008 0,0020 0,0004 0,0007 0,0109 0,0363 0,0222 0,0214

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 0,6 146,6 143,5 122,2 96,6 82,4 50,7 55,8 33,3 33,5 26,4 4,7 2,8 1,9 0,6

10 0,4 150,6 147,1 132,0 110,5 55,6 39,6 37,0 25,2 21,7 17,9 3,1 1,3 0,8 0,211 0,6 155,0 153,2 142,2 117,9 81,0 57,9 53,1 39,1 28,6 22,1 4,1 2,5 1,2 0,912 1,1 155,4 151,5 146,1 127,4 88,7 46,5 40,8 30,3 24,6 22,0 13,6 5,9 3,8 1,020 0,9 135,2 140,0 131,8 117,7 88,9 51,9 48,4 37,1 27,0 20,6 12,1 4,7 0,9 1,622 0,7 125,6 132,6 130,5 115,2 97,9 58,9 53,3 39,3 27,3 22,6 4,2 2,4 1,2 0,7

0,7 144,7 144,7 133,9 114,2 82,4 50,9 48,1 34,1 27,1 21,9 6,9 3,3 1,6 0,8s 0,23 11,95 7,67 8,72 10,23 14,44 7,22 7,60 5,58 3,95 2,76 4,62 1,72 1,14 0,48

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0092 0,0047 0,0405 0,2773

102

Fortsetzung Tab. TA5

Tab. TA6: Auf der Basis der Faktor VIIa-Antigen-Konzentration (FVIIa:Ag) (ng/ml)

errechnete pharmakokinetische Daten zur berechneten (C0-ber) und der gemessenen

Anfangskonzentration des rekombinanten humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) (C0-gem),

Halbwertszeit (t50), totale Clearance (Cltot), Area under the curve (AUC), Verteilungsvolumen

(Vdβ ) und Eliminationskonstante (β) nach intravenöser Injektion des rhFVIIa in Gruppen mit

verschiedenen Dosierungen und gesunden Hunden bzw. Hunden mit hereditärem Faktor VII-

Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 0,6 138,1 137,1 129,3 77,6 56,8 31,4 24,1 21,1 14,0 6,8 4,1 2,4 1,6 1,315 0,6 143,5 145,9 113,8 78,2 52,3 37,8 23,2 19,5 15,7 15,0 5,8 4,2 2,3 0,717 0,7 151,8 142,3 104,7 73,0 51,4 39,8 24,2 19,1 14,4 12,1 5,4 3,8 3,7 0,821 0,6 134,4 138,5 131,8 77,5 48,3 25,6 17,8 16,1 12,6 6,6 3,2 2,2 1,2 1,1

0,6 142,0 141,0 119,9 76,6 52,2 33,7 22,3 19,0 14,1 10,1 4,6 3,1 2,2 0,9s 0,05 7,55 3,96 12,89 2,41 3,52 6,45 3,04 2,09 1,28 4,12 1,20 0,98 1,10 0,26

pt 0,0000 0,0000 0,0002 0,0000 0,0000 0,0010 0,0004 0,0002 0,0001 0,0096 0,0033 0,0071 0,0306 0,0343

Rechenwert C0-ber C0-gem t50 AUC Cltot Vdβ β Einheit (ng/ml) (ng/ml) (min) (ng/ml x min) (ml/min) (l) (1/min)

Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 1 36,7 35,2 99 2460 40,7 2,73 0,0070 2 40,4 38,4 70,2 1770 56,6 2,47 0,0099 4 34,2 33,4 73,9 1790 55,8 2,92 0,0094 5 33,2 32,5 78,6 1770 56,5 3,01 0,0088

18 37 36,3 99,0 2710 37,0 2,66 0,0070 19 27,6 26,9 99,0 1390 72,1 3,62 0,0070

34,9 33,8 86,6 1982 53,1 2,90 0,0082 s 4,34 3,97 13,8 497 12,7 2,98 0,0013

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 47,4 45,4 73,6 2490 40,1 2,11 0,0094 6 41,7 40,6 59,3 2230 44,8 2,4 0,0117 7 45,5 44,2 98,9 3870 25,9 2,2 0,0070 8 53,4 50,5 99,0 2710 36,9 1,87 0,0070

14 66,1 60,1 99,0 2560 39,0 1,51 0,0070 16 37,2 35,7 98,9 1490 67,0 2,69 0,0070

48,6 46,1 88,1 2558 42,3 2,13 0,0082 10,18 8,46 17,4 774 13,64 0,41 0,0020

103

Fortsetzung Tab. TA6

Rechenwert C0-ber C0-gem t50 AUC Cltot Vdβ β Einheit (ng/ml) (ng/ml) (min) (ng/ml x min) (ml/min) (l) (1/min)

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 171 167 99 13700 36,5 2,92 0,0070

10 168 166 98,5 12500 33,7 2,61 0,0069 11 178 175 99 14200 35,3 2,81 0,0070 12 160 159 43 9930 50,3 3,12 0,0161 20 156 154 99 13500 37 3,2 0,0070 22 145 144 99 14400 34,7 3,45 0,0070

163 160 89,6 13038 37,9 3,02 0,0085 s 11,8 10,9 22,8 1661 6,18 0,29 0,0037

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 146 144 99 5500 90,9 3,43 0,0265 15 165 161 26,1 8620 58 3,03 0,0070 17 188 180 99 8450 59,2 2,66 0,0076 21 174 169 91,6 6960 71,8 2,88 0,0070

167 163 81,1 8513 63,6 3,00 0,0113 s 17,6 15,2 35,4 1459 15,3 0,32 0,0097

104

Tab. TA7: Verlauf der Standard-Prothrombinzeit (PTST) (sec) nach Injektion von

rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte,

arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p-Wert für den statistischen

Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor

VII-Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 5,6 4,0 4,1 4,5 4,6 4,9 5,3 4,9 5,1 5,3 5,7 5,5 5,5 5,7 7,12 6,8 3,8 3,8 3,8 3,8 4,1 4,1 4,1 4,3 4,2 4,3 4,5 4,7 5,0 6,34 6,3 4,0 4,2 4,0 3,9 3,8 4,3 4,2 4,4 4,2 4,7 4,3 4,9 4,3 5,95 6,0 4,0 3,8 4,2 3,8 4,0 4,1 3,9 4,1 4,0 4,1 4,0 4,8 5,0 6,0

18 7,5 4,0 4,0 4,1 4,0 4,0 4,1 4,0 4,2 5,2 5,4 5,6 5,3 5,4 7,019 8,3 3,8 4,0 4,1 4,1 4,0 4,1 4,4 4,5 4,3 4,7 5,1 5,1 5,6 8,1

6,75 3,93 3,98 4,11 4,03 4,13 4,33 4,25 4,43 4,53 4,81 4,83 5,05 5,16 5,40s 1,01 0,10 0,16 0,23 0,3 0,39 0,48 0,36 0,36 0,56 0,62 0,66 0,31 0,52 0,94

pt 0,0007 0,0011 0,0006 0,0009 0,0018 0,0036 0,0015 0,0023 0,0030 0,0057 0,0028 0,0054 0,0056 0,0394

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 17,5 4,0 4,1 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,2 4,4 5,1 5,9 6,5 8,7 16,36 17,0 3,8 3,8 4,5 3,6 3,7 4,1 4,0 4,9 5,1 4,8 5,7 5,6 8,0 16,87 15,3 4,0 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,4 5,1 5,5 6,0 7,4 14,28 17,5 4,0 4,0 4,0 3,8 4,0 4,0 3,9 4,5 4,5 5,0 5,5 6,0 7,7 14

14 14,7 4,3 4,1 4,0 4,0 4,1 4,2 4,4 4,5 4,2 5,3 5,9 6,6 9,1 14,116 17,0 3,8 3,9 4,1 4,2 4,4 4,4 4,3 4,5 4,4 4,6 5,6 6,4 9,3 12,8

16,50 3,98 3,98 4,06 3,93 4,02 4,12 4,10 4,43 4,50 4,98 5,68 6,18 8,37 14,70s 1,20 0,18 0,12 0,22 0,21 0,24 0,16 0,20 0,31 0,31 0,25 0,18 0,38 0,78 1,53

pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0218

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 6,8 4,0 4,0 4,0 4,1 4,0 3,8 4,0 4,0 4,2 4,6 4,5 4,5 5,0 5,5

10 6,1 3,8 3,8 3,8 3,8 4,0 4,1 4,0 4,0 4,0 4,6 4,4 5,0 5,0 5,711 6,6 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,3 4,3 4,5 4,5 4,7 5,512 6,8 4,5 4,6 4,5 4,5 4,2 4,5 4,5 4,5 4,5 4,6 4,8 4,8 5,0 5,820 7,8 4,0 4,0 4,1 4,0 4,2 4,3 4,1 4,0 4,3 4,5 4,5 4,8 5,4 6,722 8,0 4,3 4,6 4,5 4,5 4,5 4,4 4,6 4,7 4,5 4,6 4,7 5,3 6,4 7,9

7,01 4,10 4,17 4,15 4,15 4,15 4,18 4,20 4,21 4,30 4,53 4,57 4,81 5,25 6,18s 0,73 0,25 0,34 0,29 0,29 0,20 0,26 0,28 0,31 0,19 0,12 0,15 0,31 0,61 0,95

pt 0,0001 0,0001 0,0000 0,0001 0,0000 0,0001 0,0001 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0218

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 14,5 3,9 3,8 3,7 3,6 4,0 4,1 4,0 3,8 4,0 4,0 4,2 5,8 6,9 11,915 16,8 4,0 4,0 4,1 4,2 4,2 4,4 4,3 4,5 4,5 4,6 4,5 5,2 6,8 12,317 14,4 4,0 4,2 4,0 3,9 3,9 4,1 4,0 4,4 4,8 5,0 5,7 6,1 7,2 10,22 13 4,2 4,1 4,0 4,1 4,0 4,1 4,1 4,2 4,5 4,4 4,3 4,5 5,4 9,4

14,68 4,03 4,03 3,95 3,95 4,02 4,18 4,10 4,22 4,45 4,55 4,67 5,40 6,58 10,95s 1,57 0,13 0,17 0,17 0,26 0,13 0,15 0,14 0,31 0,33 0,44 0,69 0,70 0,80 1,38

pt 0,0005 0,0005 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0007 0,0006 0,0005 0,0015 0,0005

105

Tab. TA8: Verlauf der Prothrombinzeit-modifizierter Test (PTMT) (Prozent der Norm) nach

Injektion von rekombinantem humanen Faktor VIIa in verschiedenen Dosierungen –

Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den

statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit

hereditärem Faktor VII-Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 77 121 153 129 138 129 123 119 119 105 98 78 72 66 682 90 174 144 153 153 140 124 129 104 105 106 88 84 83 794 66 140 149 149 134 134 134 120 112 120 108 106 84 85 795 75 153 150 153 155 147 150 144 144 136 140 154 109 95 82

18 58 178 167 155 129 116 105 113 110 108 97 100 88 69 5819 64 165 105 119 150 142 136 110 113 121 110 102 92 82 77

71.67 155,17 144,67 143,00 143,17 134,67 128,67 122,50 117,00 115,83 109,83 104,67 88,17 80,00 73,83

s 11,43 21,79 20.92 15,18 10,91 11,09 15,17 12,41 14,09 12,22 15,70 26,28 12,21 10,77 9,11pt 0,0003 0,0003 0,0001 0,0000 0,0000 0,0002 0,0001 0,0008 0,0010 0,0017 0,0217 0,0364 0,1003 0,3188

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 20 130 130 145 155 160 140 112 140 90 73 57 49 35 206 25 201 169 174 163 159 160 120 112 88 48 44 41 40 287 20 150 150 146 155 140 140 124 124 97 82 64 55 38 208 20 129 132 140 143 125 110 133 105 92 73 60 46 38 20

14 39 153 151 137 113 124 129 129 109 97 87 96 60 41 4016 30 150 132 133 128 130 124 117 109 112 109 84 73 50 32

25,67 144,00 144,00 145,83 142,83 139,67 133,83 122,50 116,50 96,00 78,67 67,50 54,00 40,33 26,67

s 7,65 15,45 15,43 14,63 19,04 16,38 17,02 7,76 13,21 8,65 20,02 19,05 11,45 5,16 8,26pt 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0004 0,0003 0,0004 0,0013 0,0553

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 76 207 194 197 150 165 163 140 140 140 120 113 113 97 78

10 72 240 220 235 161 174 153 153 128 124 128 113 84 80 7211 75 236 251 257 186 204 178 182 174 167 166 159 129 104 8012 74 213 203 220 144 163 172 163 174 170 156 154 134 107 8420 74 232 311 325 253 260 211 216 211 186 160 144 124 95 6122 70 235 228 262 197 204 197 151 151 132 121 105 95 88 73

73,5 227,3 234,5 249,3 181,8 195,0 179,00 167,50 163,00 153,17 141,83 131,33 113,17 95,17 74,67

s 2,16 10,25 31,31 32,76 40,47 36,74 21,58 27,65 29,81 24,60 21,05 23,69 19,91 10,03 8,04pt 0,0000 0,0003 0,0002 0,0007 0,0002 0,0000 0,0002 0,0003 0,0002 0,0002 0,0008 0,0017 0,0009 0,3634

106

Fortsetzung Tab. TA8

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 37 186 202 225 235 218 194 160 144 128 107 96 77 64 5115 34 193 205 190 194 205 184 200 200 184 146 136 100 52 3217 25 176 186 186 172 169 165 154 154 116 76 74 69 62 2721 38 218 228 234 224 204 178 163 163 170 159 136 113 88 67

33,5 193,3 205,3 208,8 206,3 199 180,25 169,25 165,25 149,50 122,00 110,50 89,75 66,50 44,25s 5,91 102,65 49,71 42,22 45,48 20,99 12,12 20,83 24,43 32,63 37,79 30,78 20,32 15,26 18,35

pt 0,0129 0,0012 0,0010 0,0013 0,0001 0,0000 0,0005 0,0009 0,0022 0,0066 0,0053 0,0035 0,0086 0,1103

107

Tab. TA9: Verlauf der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) (sec) nach Injektion

von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen –

Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den

statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit

hereditärem Faktor VII-Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 15,3 15,2 14,9 15,6 15,2 15,0 15,3 16,0 15,8 15,0 15,7 16,2 15,5 15,8 16,12 18,3 16,7 17,8 17,8 14,5 16,4 15,9 15,3 15,9 15,1 17,3 17,2 17,6 17,3 17,54 18,6 16,8 17,8 16,5 16,8 17,0 16,8 18,7 18,3 18,7 18,7 18,8 17,9 17,0 16,85 17,5 17,0 17,5 16,8 17,5 17,8 17,3 20,5 17,0 17,0 17,0 16,2 16,3 17,4 16,6

18 16,3 15,0 15,4 15,3 15,1 15,4 15,7 15,6 15,4 15,9 15,5 15,8 15,8 15,9 16,219 15,4 14,7 14,9 14,8 15,0 15,2 15,1 14,8 14,9 14,8 14,9 15,1 14,9 15,0 15,3

16,90 15,90 16,38 16,13 16,17 16,13 16,02 16,82 16,22 16,08 16,52 16,55 16,33 16,40 16,41s 1,44 1,04 1,46 1,11 1,08 1,12 0,86 2,26 1,24 1,52 1,41 1,30 1,19 0,97 0,74

pt 0,0073 0,0053 0,0301 0,0487 0,0539 0,0392 0,4607 0,0709 0,0771 0,0697 0,1716 0,0142 0,0764 0,1201

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 16,3 14,8 14,8 15,0 15,1 14,9 15,0 16,5 14,1 15,5 16,6 16,5 17,1 17,0 17,36 16,0 15,5 14,5 15,3 14,4 14,0 14,1 14,3 15,4 15,0 14,6 14,6 15,1 16,2 16,37 15,1 14,4 14,5 14,4 14,6 15,4 15,0 16,0 15,3 15,5 19,0 15,5 16,1 15,8 17,08 15,1 16,0 14,5 15,0 16,0 16,5 11,8 11,0 12,3 11,7 14,3 14,5 14,1 15,5 16,6

14 15,8 15,7 15,8 15,3 15,7 15,7 15,5 16,0 15,9 15,8 15,9 16,0 15,8 16,4 16,716 14,5 14,0 14,3 14,2 14,0 14,3 14,2 14,5 14,2 14,3 14,3 14,4 14,2 14,3 14,2

15,30 15,07 14,73 14,87 14,96 15,13 14,26 14,71 14,53 14,63 15,78 15,25 15,40 15,87 16,35s 0,54 0,79 0,46 0,46 0,78 0,93 1,32 2,03 1,30 1,53 1,83 0,88 1,16 0,92 1,11

pt 0,1819 0,0217 0,0036 0,1789 0,3633 0,0539 0,2532 0,0770 0,1516 0,2808 0,4479 0,4165 0,0413 0,0191

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 15,1 13,5 13,6 13,7 13,8 14,2 14,3 14,5 15,1 15,3 16,0 15,7 16,1 15,8 15,8

10 14,8 13,2 13,0 13,2 13,5 13,4 14,1 14,3 15,0 14,9 16,8 16,0 16,6 16,3 16,011 14,4 12,7 13,0 12,4 12,8 12,7 13,8 14,1 14,5 14,5 15,5 15,5 15,5 14,9 15,512 14,8 12,9 13,8 12,9 13,5 13,0 14,3 14,3 14,7 14,4 15,0 14,5 15,2 14,5 14,320 14,4 12,5 13,1 13,0 12,8 13,7 13,2 13,6 13,2 13,0 13,5 13,2 13,5 13,7 13,822 14,6 13,0 12,7 13,0 13,3 13,2 13,0 13,1 13,3 13,4 13,5 13,3 13,6 13,7 14,0

14,68 12,97 13,20 13,03 13,28 13,37 13,78 13,98 14,30 14,25 15,05 14,70 15,08 14,81 14,90s 0,27 0,35 0,41 0,42 0,41 0,53 0,56 0,53 0,84 0,88 1,34 1,23 1,28 1,07 0,98

pt 0,0000 0,0001 0,0000 0,0000 0,0004 0,0017 0,0050 0,1128 0,0966 0,2450 0,4861 0,2140 0,3691 0,2853

108

Fortsetzung Tab. TA9

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 14,1 12,5 13,1 12,5 12,8 12,9 13,5 13,5 13,8 14,3 15,0 14,4 15,0 14,3 14,915 15,3 15,5 15,4 15,4 15,2 15,3 15,5 15,6 15,8 15,5 15,6 15,3 15,3 15,4 15,517 17,0 16,4 15,9 16,2 16,4 16,3 16,5 16,4 16,8 16,4 15,9 16,3 16,0 16,2 15,721 14,5 12,7 12,7 12,6 12,4 12,8 12,9 12,7 12,4 12,9 13,0 13,1 12,9 13,1 13,2

15,22 14,28 14,28 14,18 14,20 14,32 14,60 14,55 14,70 14,78 14,88 14,78 14,83 14,75 14,83s 1,28 1,97 1,61 1,91 1,92 1,75 1,69 1,74 1,98 1,52 1,30 1,36 1,34 1,34 1,14

pt 0,0667 0,047 0,0505 0,0498 0.0446 0,0951 0,1076 0,2067 0,1848 0,2907 0,1606 0,2485 0,1508 0,3289

109

Tab. TA10: Verlauf der Thrombozytenzahl (x 103/µl) nach Injektion von rekombinantem

humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte, arithmetischer

Mittelwert ( ), Standardabweichung (s) und p-Wert für den statistischen Vergleich mit dem 0-

Wert (t-Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 305 245 252 310 274 266 291 285 265 279 285 267 274 169 3092 275 276 277 305 309 314 298 322 323 355 337 279 149 245 3274 304 246 283 258 235 248 238 214 260 274 252 231 226 229 2575 313 285 274 272 294 296 288 279 278 274 258 269 267 252 292

18 272 269 275 246 218 262 277 274 270 291 290 289 274 274 28119 352 313 292 273 247 282 278 301 306 309 283 271 320 311 298

304 272 276 277 263 278 278 279 284 297 284 251 252 247 294s 29,2 25,6 13,3 25,4 35,4 24,2 21,3 36,4 25,2 31,4 30,2 44,7 58,5 47,5 24,0

pt 0,0168 0,0263 0,0798 0,0846 0,0851 0,129 0,1228 0,3764 0,3764 0,1963 0,0420 0,0180 0,0157 0,2910

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 337 231 245 263 270 284 275 268 263 271 236 243 229 220 2736 414 406 390 375 379 313 418 459 422 421 370 421 442 426 4627 382 373 362 387 373 360 367 357 338 337 323 341 313 308 3118 267 281 295 304 277 278 313 271 282 302 288 286 277 288 333

14 339 292 351 336 306 307 291 294 316 318 362 310 327 356 32616 431 473 400 434 469 412 420 398 414 392 363 374 418 381 375

362 343 341 350 346 326 347 341 339 340 324 329 334 330 347s 60,1 90,3 59,6 61,5 76,3 51,3 63,6 77,3 66,4 56,5 53,1 63,6 81,8 76,3 65,5

pt 0,2048 0,1338 0,2449 0,1697 0,0340 0,2016 0,1327 0,0784 0,1069 0,0611 0,0571 0,1242 0,1161 0,2822

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 381 353 359 392 326 391 386 374 378 380 338 313 308 368 333

10 386 343 279 349 352 348 352 297 314 322 311 275 297 293 26711 295 205 320 275 315 312 278 284 276 283 318 232 236 243 20312 318 256 258 272 292 267 280 246 275 276 260 269 270 232 23820 338 203 298 341 287 304 300 351 261 258 246 256 224 221 21422 275 308 244 282 271 297 273 279 270 280 292 286 227 279 279

332 278 293 319 307 320 312 305 296 300 294 272 260 273 256s 45,1 66,6 42,3 42,3 29,6 43,6 45,7 48,0 44,5 44,3 35,4 27,4 36,7 54,3 47,9

pt 0,0338 0,0396 0,1131 0,0431 0,1951 0,0222 0,0908 0,0207 0,0368 0,0547 0,0076 0,0005 0,0141 0,0058

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 281 167 304 243 312 301 283 296 294 268 259 230 254 275 26215 469 363 434 403 487 429 399 413 389 417 391 344 349 354 38117 478 494 480 449 534 611 555 648 444 438 429 427 422 426 45721 211 250 248 242 272 274 259 267 249 239 288 249 210 266 260

360 319 367 334 401 404 374 406 344 341 342 313 309 330 340s 134 141 108 107 128 153 135 173 88,6 101 81,2 91,2 95,2 75,1 96,4

pt 0,1892 0,6522 0,1501 0,0135 0,1568 0,3434 0,2001 0,2944 0,1786 0,3150 0,1257 0,0702 0,2360 0,2655

110

Tab. TA11: Verlauf der Hämatokritwerte (%) nach Injektion von rekombinantem humanen

Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen – Einzelwerte, arithmetischer Mittelwert

( ), Standardabweichung (s) und p- Wert für den statistischen Vergleich mit dem 0-Wert (t-

Test, pt) – in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel.

Nr. Minuten nach Injektion Stunden nach Injektion 0 2 5 10 15 30 1 1,5 2 3 4 6 8 12 24 Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde)

1 42,9 40,7 46,8 42,1 39,2 42,2 47,2 47,6 39,9 42,8 40,5 40,1 43,2 41,6 43,72 42,5 42,8 43,2 43,2 42,7 42,3 45,2 51,2 51,7 49,3 46,8 41,6 41,8 39,8 49,44 42,8 40,2 43,5 40,7 39,7 39,5 40,5 45,7 43,2 43,2 41,7 42,7 39,8 43,5 43,55 41,5 38,3 38,9 39,7 39,2 39,1 42,5 42,8 41,2 42,3 41,7 44,6 40,0 40,6 37,7

18 39,2 38,3 40,5 37,9 41,2 41,9 37,4 39,8 42,1 41,9 41,5 41,3 43,3 44,5 43,819 37,7 39,2 39,7 38,8 40,0 40,7 40,5 39,9 37,1 39,5 36,8 40,3 41,0 39,4 40,1

41,10 39,92 42,10 40,40 40,33 40,95 42,22 44,50 42,53 43,16 41,50 41,77 41,52 41,57 43,03s 2,16 1,72 2,96 2,01 1,37 1,41 3,55 4,52 4,96 3,27 3,20 1,68 1,52 2,05 3,97

pt 0,0862 0,1509 0,1256 0,2530 0,4462 0,1764 0,0186 0,2232 0,0508 0,3543 0,2559 0,3640 0,3513 0,1272

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 45,5 41,6 43,4 42,4 39,6 43,9 42,6 39,9 37,6 41,8 40,9 45,1 39,6 42,6 49,36 31,9 31,5 32,8 31,1 34,6 32,2 40,0 38,5 37,5 35,5 33,6 35,0 36,9 38,0 35,17 41,9 38,4 36,0 39,6 39,0 38,4 40,8 40,9 39,9 42,4 39,5 42,3 41,5 42,5 42,68 42,7 40,7 42,0 40,1 40,2 38,5 44,1 43,6 44,7 46,9 47,6 49,4 48,0 42,9 46,5

14 36,8 39,2 37,3 37,5 36,6 38,2 36,8 36,0 35,6 33,9 34,0 35,4 34,7 36,9 33,016 36,9 36,4 37,3 38,1 38,6 36,0 38,6 34,5 37,1 34,8 32,7 36,5 35,6 36,3 37,4

39,28 37,97 38,13 38,13 38,10 37,87 40,48 38,90 38,73 39,22 38,05 40,62 39,38 39,87 40,65s 4,97 3,65 3,92 3,84 2,11 3,82 2,65 3,32 3,23 5,24 5,77 5,93 4,92 3,12 6,52

pt 0,1128 0,1614 0,0897 0,2035 0,0843 0,2360 0,4131 0,3885 0,4817 0,2283 0,1660 0,4786 0,3258 0,1529

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 41,7 35,7 36,0 36,2 34,0 37,6 40,5 37,7 36,3 40,2 36,6 34,8 36,2 40,1 39,2

10 49,5 48,4 48,8 44,0 42,9 44,1 43,0 41,1 40,7 44,1 39,9 41,5 41,2 43,6 41,011 44,8 45,2 47,7 47,2 48,5 48,8 44,4 43,5 42,2 40,5 41,6 40,8 43,5 44,4 42,012 47,8 42,5 41,8 42,0 44,0 42,0 44,1 41,6 42,0 43,7 43,1 44,0 45,0 46,7 41,120 46,4 42,2 42,9 44,5 43,7 44,2 42,7 41,7 40,6 40,9 36,5 41,3 41,9 41,9 36,122 42,9 44,9 43,0 46,5 45,0 43,8 42,8 43,7 42,8 41,9 43,5 42,4 43,5 47,4 39,0

45,52 43,15 43,37 43,40 43,02 43,41 42,91 41,55 40,77 41,88 40,20 40,80 41,88 44,02 39,73s 2,96 4,28 4,59 3,99 4,83 3,63 1,38 2,17 2,35 1,67 3,10 3,15 3,09 2,79 2,13

pt 0,0683 0,0974 0,1376 0,1197 0,1205 0,0250 0,0163 0,0059 0,0029 0,0111 0,0036 0,0187 0,1787 0,0035

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 39,2 34,6 39,3 40,0 40,5 38,4 42,2 41,0 40,0 42,3 44,7 42,0 42,3 43,1 43,015 51,0 41,5 47,5 43,5 47,1 44,2 42,1 41,8 43,4 39,7 42,3 43,9 42,0 41,1 40,917 32,9 33,1 35,7 31,1 32,4 31,2 30,7 30,3 33,2 34,5 33,7 35,2 33,9 34,0 33,721 39,5 39,6 38,7 38,7 39,0 38,7 42,1 41,6 44,0 44,0 41,5 41,6 42,7 44,1 39,8

40,65 37,20 40,30 38,33 39,75 38,13 39,28 38,68 40,15 40,13 40,55 40,68 40,23 40,58 39,35s 7,54 3,99 5,05 5,23 6,03 5,33 5,72 5,59 4,96 4,15 4,76 3,79 4,23 4,56 3,99

pt 0,1158 0,4025 0,1442 0,2341 0,0890 0,3270 0,2541 0,4284 0,4472 0,4879 0,4961 0,4464 0,4918 0,3486

111

Tab. TA12: Antikörperbildung (in ELISA-Einheiten) vor sowie 2, 4 und 12 Wochen nach

Injektion von rekombinantem humanen Faktor VIIa (rhFVIIa) in verschiedenen Dosierungen

in gesunde Hunde bzw. Hunde mit hereditärem Faktor VII-Mangel.

nach Injektion Hund vor Injektion 2 Wochen 4 Wochen 12 Wochen

Gruppe I (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 1 0,27 4 16 3 2 0,42 8 14 22 4 0,22 8 7 1 5 0,41 23 30 4

18 0,09 62 12 5 19 0,02 400 227 11

Median (Min-Max.)

0,25 (0,02-0,42)

16 (4-400)

15 (7-227)

4,5 (1-22)

Gruppe II (rhFVIIa: 100 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 3 0,01 353 5 0 6 1,09 25 11 2 7 nicht auswertbar 8 0,00 7 0 0

14 0,00 1 0 0 16 0,43 9 8 6

Median (Min-Max.)

0,01 (0,00-1,09)

9 (1-353)

5 (0-11)

0 (0-6)

Gruppe III (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / gesunde Hunde) 9 0,00 12 41 14

10 0,00 193 83 0 11 0,02 153 122 128 12 0,06 163 264 10 20 0,13 304 141 5 22 0,00 78 22 0

Median (Min-Max.)

0,01 (0-0,13)

158 (12-304)

103 (22-264)

7,5 (0-128)

Gruppe IV (rhFVIIa: 500 µg/kg Körpermasse / Faktor VII-defiziente Hunde) 13 0,00 168 138 124 15 0,02 42 36 55 17 0,00 75 9 1 21 0,00 111 61 1

Median (Min-Max.)

0,00 (0,00-0,02)

93 (42-168)

49 (9-138)

28 (1-124)

112

Danksagung Ein besondere Dank gilt Herrn Prof. Dr. R. Mischke für die Überlassung des interessanten

Themas und den unermüdlichen Ansporn zur Anfertigung der Arbeit.

Ein ganz besonderer Dank gilt Meike Diedrich, die mit mir lange Zeit eine Leidensgenossin

war, und mir dankenswerterweise einen Teil ihres Themas überließ.

Ein weiterer Dank geht an Prof. Dr. H. J. Schuberth, der mir bei der Durchführung der

ELISA-Tests jederzeit aufmunternde Hilfestellung gab.

Auch bei Prof. Dr. M. Kietzmann möchte ich mit bedanken für die sehr freundliche

Unterstützung bei den pharmakokinetischen Berechnungen und die anregenden Gespräche.

Bedanken möchte ich mich auch bei Prof. Dr. A. Günzel-Apel für die Möglichkeit einen der

Beagles ihres Institus für die Studie verwenden zu dürfen.

Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei Ruth Höinghaus und Jens Rohwer für die

Unterstützung in normalen und extremen Krisenzeiten.

Ein herzlicher Dank geht auch an die Mitarbeiter der Klinik für kleine Haustiere, die mit bei

den Probenentnahmen und auch sonst tatkräftig zur Seite gestanden haben.

Besonderen Dank schulde ich auch Brigitte Schäffner, Dirk Menzel, Ingrid Luther-Thomas

und Detlef Kemmesies für die fachliche und moralische Unterstützung bei den Arbeiten im

Labor.

Ferner möchte ich mich bei Prof. Dr. W. Leibold und seinen Assistenten Julia Heselhaus,

Katrin Langner, Anja Wege, Dimitrij Bessonov, Alexeij Dronov, Rimantas Stakauskas und

Giedrus Guzys, sowie bei Silke Schöneberg und Udo Rabe für ihre fachliche Hilfe und die

sehr freundliche Aufnahme in ihrer Runde und die hochinteressanten Gespräche während des

Wartens auf den ELISA bedanken.