VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail · 2019-03-20 2 / 16 1018383DE Rev A FT0700-415j IM...

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VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail800-604308314373001

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VERWENDUNGSZWECKDer VENTANA HER2 Dual ISH DNAProbe Cocktail dient der Bestimmungdes HER2-Genstatus durch Auszählungdes Verhältnisses des HER2-Gens zumChromosom 17 mittelsLichtmikroskopie. Die HER2- undChromosom 17-Sonden werden mittelszweifarbiger chromogener In-Situ-Hybridisierung (ISH) in formalinfixiertenparaffineingebetteten menschlichenBrust- und Magenkarzinomproben,einschließlich des gastroösophagealenÜbergangs, im Anschluss an eineFärbung auf BenchMark IHC/ISH-

Geräten detektiert.VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ist als Hilfsmittel bei der Auswahl vonPatienten indiziert, für die eine Therapie mit Herceptin (Trastuzumab) in Betracht gezogenwird. Dieses Produkt muss von einem qualifizierten Pathologen in Verbindung mithistologischen Untersuchungen, klinisch relevanten Informationen und geeignetenKontrollen interpretiert werden.Dieses Produkt ist für die In-vitro-Diagnostik (IVD) bestimmt.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGHER2/neu (HER2) gehört zu einer Familie von vier transmembranösen Rezeptor-Tyrosinkinasen, die am Wachstum, an der Differenzierung und am Überleben von Zellenbeteiligt sind.1,2 Das HER2-Gen kodiert das HER2-Protein,2,3 und die Überexpressiondes HER2-Proteins und die Amplifikation des HER2-Gens treten in ca. 15 bis 25 Prozentder Brustkarzinome einzeln oder gemeinsam auf und deuten auf aggressivesTumorverhalten hin.4,5 Der VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail beinhaltetHER2-Sonden (markiert mit Hapten Dinitrophenyl oder DNP) und Chromosom 17-Sonden(markiert mit Hapten Digoxigenin oder DIG), die in einem Puffer auf Formamidbasisenthalten sind. Die Sonden dienen dem Nachweis der Amplifikation des HER2-Gens beiinvasiven Brust- und Magenkarzinomen. Die HER2 DNA-Sonde ist ein Gemisch ausOligosonden, die spezifisch auf das HER2-Gen (auch bekannt als ERBB2 und NEU)ausgerichtet sind, welches sich auf dem menschlichen Chromosom 17 (17q12) befindet.Die Chromosom 17-Sonde ist ein Gemisch aus Oligosonden, die auf Sequenzen innerhalbder Centromer-Region abzielen, und dient als Referenzpunkt für Aneusomie. Die Anzahlder Kopien beider Sonden wird nach Tumorkernen errechnet und die Ergebnisse werdenim Verhältnis HER2/Chromosom 17 angegeben, um den HER2-Amplifikationsstatus zuermitteln (ein HER2/Chromosom 17-Verhältnis von ≥ 2,0 gilt als amplifiziert, während einVerhältnis von < 2,0 als nicht amplifiziert gilt).In vielen klinischen Studien wurde gezeigt, dass eine Amplifikation bzw. Überexpressionvon HER2 mit einem schlechten klinischen Verlauf für Patienten mit invasivem Brustkrebsin Zusammenhang steht und mit mehreren negativen prognostischen Variablen, wie z. B.negativem Status des Estrogen Receptor (ER), hoher S-Phasenfraktion, positivemNodalstatus, mutiertem p53 und hohem nukleären Grad korreliert.6,7 In mehreren Studienhaben Patienten mit invasivem Brustkrebs (sowohl knotenpositiv als auch -negativ) miteinem amplifizierten HER2-Genstatus eine reduzierte Gesamtüberlebensrate sowie einehöhere Rate an Rezidiven gezeigt.1,8-11 Ergebnisse aus klinischen Studien, in denen dieÜberexpression des HER2-Proteins mittels Immunhistochemie ermittelt wurde, waren mitden Ergebnissen, die mittels der Amplifikation des HER2-Gens ermittelt wurden,vergleichbar.9,11-13 Die Kenntnis des HER2-Gen- und/oder Proteinstatus ermöglicht esÄrzten bei Patienten mit invasivem Brustkrebs, präzisere Entscheidungen zu treffen, umdie gesamte Behandlung dieser Patienten verbessern zu können.

Trastuzumab (Herceptin) ist ein humanisierter, monoklonaler Antikörper gegen dieextrazelluläre Domäne von HER2 und hat sich bei Patienten mit HER2-positivemBrustkrebs als wirkungsvoll erwiesen.14-19 Der Nachweis der Amplifikation des HER2-Gens und/oder der Protein-Überexpression ist unerlässlich bei der Auswahl von Patientenfür die Trastuzumab-Therapie. Klinische Studien haben gezeigt, dass Brustkrebspatientenmit hoher HER2-Protein-Überexpression und/oder Gen-Amplifikation am besten aufTrastuzumab ansprechen.20 Der Nachweis der HER2-Gen-Amplifikation und/oder Protein-Überexpression ist bei Patienten mit invasivem Brustkrebs erforderlich, bei denen dieTrastuzumab-Therapie in Erwägung gezogen wird. Vergleichbare Ergebnisse wurden inklinischen Studien beim Magenkarzinom erbracht.21 Eine Trastuzumab-Therapie ist beiPatienten mit positiver HER2-Überexpression oder -Amplifikation klinisch indiziert.

VERFAHRENSPRINZIPDer VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail wurde für die Verwendung mitVENTANA Silver ISH DNP Detection Kit, VENTANA Red ISH DIG Detection Kit undzusätzlichen Reagenzien auf einem BenchMark IHC/ISH-Instrument optimiert.Das Nachweiskit enthält einen Primärantikörper und einen enzymmarkiertenSekundärantikörper, der an Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase(AP) konjugiert ist, die als chromogenes Enzym dienen. Während des Färbeverfahrensmittels Dual In-situ-Hybridisierung (Dual ISH) werden die mit DNP und DIG markiertenSonden an ihre jeweiligen spezifischen Ziel-DNA-Sequenzen innerhalb der Zellkerneco-hybridisiert. Für den Nachweis der mit DNP markierten HER2-Sonde, wird zuerst dasVENTANA Silver ISH (SISH) DNP Detection Kit verwendet, das die folgenden Spenderenthält: primärer anti-DNP-Mausantikörper, markiert mit Hydroxychinoxalin (HQ),sekundärer anti-HQ-Mausantikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP),Chromogen A (Silver A), Chromogen B (Silver B) und Chromogen C (Silver C). Nachder Inkubation mit dem HQ-markierten primären anti-DNP-Mausantikörper und demsekundären anti-HQ-HRP-Antikörperkonjugat erfolgt die SISH-Reaktion. Kurz gesagt, wirddiese Reaktion durch die aufeinander folgende Zugabe von Chromogen A (Silberacetat),B (Hydrochinon) und C (H2O2) erreicht. Hier werden die Silberionen (Ag+) durchHydrochinon zu metallischen Silberatomen (Ag0) reduziert. Diese Reaktion wird durch dasSubstrat für HRP, Hydrogenperoxid (Chromogen C), verstärkt. Das Silberpräzipitat wird inden Zellkernen abgelagert und eine einzelne Kopie des HER2-Gens wird als schwarzerPunkt visualisiert. Abbildung 2 zeigt die SISH-Reaktion.Nach dem SISH-Nachweis von HER2 wird die mit DIG markierte Chromosom 17-Sonde mitdem VENTANA Red ISH DIG Detection kit nachgewiesen. Dieses Kit enthält die folgendenSpender: einen primären anti-DIG-Mausantikörper, markiert mit Nitropyrazol (NP), einensekundären anti-NP-Mausantikörper, konjugiert an Alkaline Phosphatase (AP), pH Enhancer,Naphthol und Fast Red. Nach der Entstehung des SISH-Signals wird der Objektträger mitdem primären NP-markierten anti-DIG-Mausantikörper inkubiert, der sich an DIG-Hapten aufder Chromosom 17-Sonde bindet. Der primäre anti-Hapten-Antikörper wird mit dem an AP-Enzym konjugierten anti-NP-Mausantikörper nachgewiesen. Der Objektträger wird mit derpH Enhancer-Lösung inkubiert, die die geeigneten Salzkomponenten und -konzentrationenund gepufferten pH-Werte für eine optimale AP-Enzym-Leistung liefert. Als Nächstes wirdNaphthol-Phosphat zugefügt, das als Substrat für das AP-Enzym (AP dephosphoryliertNaphthol) dient. Fast Red, das dem Objektträger im nächsten Schritt hinzugefügt wird,kombiniert sich mit dem dephosphorylierten Naphthol und bildet ein rotes Präzipitat, dasdurch Lichtmikroskopie leicht erkennbar wird. Abbildung 3 zeigt die Red ISH-Reaktion. DieProbe wird anschließend mit Hematoxylin II zur Interpretation mithilfe der Lichtmikroskopiegegengefärbt.Das Färbeprotokoll umfasst mehrere Schritte, bei denen Reagenzien über einefestgelegte Zeitdauer bei bestimmten Temperaturen inkubiert werden. Am Ende jedesInkubationsschritts spült das BenchMark IHC/ISH-Instrument die Schnitte, um nichtgebundenes Material zu entfernen, und trägt einen Liquid Coverslip-Film auf, der dieVerdunstung der wässrigen Reagenzien vom Objektträger minimiert. Die Interpretationder Ergebnisse erfolgt mit einem Lichtmikroskop mit 20x-, 40x- und/oder 60x-Objektiven.

Abbildung 1. Amplifizierter HER2-Status mit dem VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail-Assay,Brustkarzinom.

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IM LIEFERUMFANG ENTHALTENES REAGENZDer VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Spender enthält ausreichendeReagenzien für 30 Tests.Ein 6-ml-Spender des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail enthältca. 14 μg/mL der HER2-Sonden, markiert mit Dinitrophenyl (DNP), und 0,24 μg/ml derChromosom 17-Sonde, markiert mit Digoxigenin (DIG), die in einem Hybridisierungspufferauf Formamidbasis enthalten sind. Beide Sonden werden für den Nachweis des HER2-Genstatus verwendet (d. h. Verhältnis von HER2/Chromosom 17).

REKONSTITUTION, MISCHUNG, VERDÜNNUNG, TITRIERUNGDer VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail wurde für die Verwendung aufBenchMark IHC/ISH-Instrumenten optimiert. Es ist keine Rekonstitution, Mischung,Verdünnung oder Titrierung der Sonde erforderlich.

NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTENE ERFORDERLICHEMATERIALIENFärbereagenzien wie z. B. VENTANA-Nachweiskits und Zusatzkomponenten sind nicht imLieferumfang enthalten.Möglicherweise sind nicht alle in der Packungsbeilage aufgeführten Produkte in allenRegionen verfügbar. Wenden Sie sich an den zuständigen Kundendienstvertreter.Die folgenden für die Färbung benötigten Reagenzien und Materialien sind nicht imLieferumfang enthalten:1. VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit (Art.-Nr. 760-516 / 08318883001)2. VENTANA Red ISH DIG Detection Kit (Art.-Nr. 760-512 / 08318832001)3. HybReady Solution (Art.-Nr. 780-4409 / 05917557001)4. ISH Protease 3 (Art.-Nr. 780-4149 / 05273331001)5. Hematoxylin II (Art.-Nr. 790-2208 / 05277965001)6. Bluing Reagent (Art.-Nr. 760-2037 / 05266769001)7. Reaction Buffer Concentrate (10X) (Art.-Nr. 950-300 / 05353955001)8. SSC (10X) (Art.-Nr. 950-110 / 05353947001)9. EZ Prep Concentrate (10X) (Art.-Nr. 950-102 / 05279771001)10. ultraView Silver Wash II (Pre-dilute) (Art.-Nr. 780-003 / 05446724001)11. Speziell für die Verwendung mit BenchMark GX- und XT-Instrumenten benötigte

Vorratsreagenzien:· Cell Conditioning Solution 1 (CC1) (Pre-dilute) (Art.-Nr. 950-124 /

05279801001)· Cell Conditioning Solution 2 (CC2) (Pre-dilute) (Art.-Nr. 950-123 /

05279798001)· Liquid Coverslip (LCS) (Pre-dilute) (Art.-Nr. 650-010 / 05264839001)

12. Speziell für die Verwendung mit dem BenchMark ULTRA-Instrument benötigteVorratsreagenzien:· ULTRA CC1 (Pre-dilute) (Art.-Nr. 950-224 / 05424569001)· ULTRA CC2 (Pre-dilute) (Art.-Nr. 950-223 / 05424542001)· ULTRA LCS (Pre-dilute) (Art.-Nr. 650-210 / 05424534001)

13. BenchMark IHC/ISH-Instrument14. Barcode-Etiketten15. Objektträger, positiv geladen (Superfrost Plus oder vergleichbar)16. Xylol (für die Histologie)17. Entionisiertes oder destilliertes Wasser18. Dauerhaftes Einbettmedium**19. Cover Slip in ausreichender Menge zur Abdeckung des Gewebes20. Coverslip-Automat (z. B. Tissue-Tek SCA Coverslip-Automat)21. Färbetröge oder -wannen22. Ofen, der dauerhaft 60 °C aufrechterhalten kann23. Timer24. Lichtmikroskop mit 20x-, 40x- und oder 60x-Objektiven25. Mildes Geschirrspülmittel26. HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (Art.-Nr. 783-4422 / 05640300001) können

bei Bedarf zur Fehlerbehebung verwendet werden.**In Tabelle 24 finden Sie kompatible Einbettmedien für diesen Test.

LAGERUNGBei Annahme und wenn nicht verwendet bei 2–8 °C lagern. Nicht einfrieren.Um die ordnungsgemäße Zuführung und Stabilität der Sonde zu gewährleisten, nachGebrauch Spender-Verschlusskappen wieder aufsetzen und Spender in aufrechterPosition in den Kühlschrank stellen.Jeder Sondenspender ist mit einem Verfallsdatum versehen. Bei korrekter Lagerung istdas Reagenz bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum stabil. Das Reagenzdarf nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwendet werden.

PROBENPRÄPARATIONEntsprechend der Laborroutinemethode aufgearbeitete, formalinfixierteparaffineingebettete (FFPE) Gewebeproben sind zur Verwendung mit dieser Sondegeeignet, wenn sie in Verbindung mit einem BenchMark IHC/ISH-Instrument eingesetztwerden. Empfohlen wird die Fixierung in 10%igem neutral gepuffertem Formalin (NBF)über 6 bis 72 Stunden22. Neben den VENTANA-Assays haben Studien gezeigt, dass die

Abbildung 3. VENTANA Red ISH DIG Detection für Chromosom 17

Chromosom 17-Centromer-Region

DIG

Chromosom 17-DNA-Sonde (DIG-markiert)

APMaus-anti-NP

NP-markierterMaus-anti-DIG

pH EnhancerNaphtholFast Red

Rotes Signal

NPNP

Silver ASilver BSilver C

HRP

Maus-anti-HQ

Schwarzes Signal

HQ-markierter Maus-anti-DNP

Abbildung 2. VENTANA Silver ISH DNP Detection für HER2

HER2-Zielsequenz-Region

DNP

HER2 DNA-Sonde(mit DNP markiert)

HQHQ

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Mehrzahl ergebnisloser Bestimmungen des HER2-Genstatus mittels FISH aufpräanalytische Faktoren wie Unter- und Überfixierung 23 sowie auf verzögerte Fixierungzurückzuführen sind.24 Die strikte Einhaltung des Fixierungsprotokolls (z. B. durchVerwendung eines dedizierten Prozessors zwecks Einhaltung einer Mindestfixierzeitvon 6 Stunden) führte in diesen Studien zu einer 68,5%igen Reduktion der Anzahl nichteindeutiger Fälle (von 10,8 % auf 3,4 %). Proben, die < 6 Stunden in Formalin fixiertwurden, können einen Signalverlust oder zu starke Zellkernandauung zur Folge haben,so wie es bei blasser/schwacher Hematoxylinfärbung beobachtet wurde. Es wirdausschließlich die Fixierung in 10%igerm NBF empfohlen, da einige Fixiermittel bei ISH-basierten Assays (einschließlich Bouin’s und Alkohol-Formalin-Essigsäure (AFA)) einevariable Färbung erzeugen.21

Die Präparate sollten umgehend eingefärbt werden, da die Qualität der Nukleinsäurezielein Gewebeschnitten mit der Zeit abnehmen kann. Interne Studien haben gezeigt, dassObjektträger mit Brust- und Magengewebeschnitten bei einer Lagerungstemperatur von2–8 ˚C 12 Monate lang stabil bleiben können. Positiv geladene Objektträger könnenanfällig für umweltbedingte Belastungen sein und dadurch zu unangemessener Färbungeines ISH-Assays führen (zum Beispiel fehlender Färbung oder Gegenfärbung auf demGewebe). Bitten Sie Ihren Roche-Vertreter um ein Exemplar des Informationsblattes„Impact of environmental stress on various histology slide types“ (Auswirkungumweltbedingter Belastungen auf verschiedene Histologie-Objektträgertypen),um besser zu verstehen, wie diese Art von Objektträgern zu verwenden ist.Jeder Schnitt muss die für den Assay geeignete Dicke aufweisen (4 µm) und auf einenpositiv geladenen Mikroskop-Objektträger (Superfrost Plus oder vergleichbar) aufgebrachtwerden. Die Objektträger abtropfen lassen oder abtrocknen, um Wasser zwischen demObjektträger und der Gewebeprobe zu entfernen.Schnitte, die dicker als 4 μm sind, benötigen möglicherweise eine stärkereProteasebehandlung als die empfohlene und können darüber hinaus aufgrund vonübermäßigem Paraffin im Gewebe mehr Artefakte („nuclear Bubbling“) zeigen als dünnereSchnitte. Bei den Artefakten handelt es sich um große oder kleine Luftblasen oderVakuolen in den Kernen. Eine Luftblasenbildung in den Kernen kann sich aufverschiedene Arten auf die SISH- und Red ISH-Signale auswirken. Es kann zu folgendenEffekten kommen: 1) Kerne mit Luftblasen, in denen die SISH- und Red ISH-Signalegenerell immer noch zentral lokalisiert sind und 2) Kerne mit Luftblasen, in denen dieSISH- und Red ISH-Signale in die Peripherie verdrängt werden. In beiden Fällen kann derFall ausgezählt werden, wenn die SISH- und Red ISH-Signale deutlich abgrenzbar sind,durch nichts anderes verfälscht werden und immer noch zählbar sind. Gelegentlich kanneine starke Luftblasenbildung im Kern jedoch die SISH- und Red ISH-Signale verfälschenoder dazu führen, dass sie nicht mehr abgrenzbar sind und eine exakte Zählung nichtmöglich ist. Das passiert häufiger, wenn die SISH- und Red ISH-Signale in dieKernperipherie verdrängt werden. Sollte das eintreten, sind Zellkerne, die zählbar sind,öfters anderswo in der Probe zu finden und der Fall kann ausgezählt werden. Wenn es imKern zu so starker Luftblasenbildung kommt, dass nicht genügend Kerne vorhanden sind,in denen die SISH- und Red ISH-Signale genau gezählt werden können, sollte der Fallnicht ausgezählt werden. Luftblasenbildung im Zellkern kann auch bei Unterfixierungauftreten (1–3 Stunden in Formalin). Hier handelt es sich um weniger diskrete Blasen.Bei einer Fixierung von 3 Stunden kann das mit einer veränderten Zellkonditionierung/Proteasebehandlung behoben werden. Bei einer Fixierung von 1 Stunde kann daswahrscheinlich nicht mehr behoben werden.Der VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay wurde mit zusätzlichenVorbehandlungsoptionen ausgestattet, die zur Optimierung der Testdurchführung inverschiedenen Laboratorien und anschließender Fehlerbehebung bei bestimmtenGeweben/Objektträgern dienen können, die eine suboptimale Färbung aufweisen.Ventana Medical Systems, Inc. („Ventana“) empfiehlt, dass in jedem Labor ersteDurchläufe mit repräsentativen Kontrollproben durchgeführt werden, die unter dengleichen Bedingungen vorbereitet wurden wie die zu prüfenden klinischen Proben.Auf diese Art werden die spezifischen Färbebedingungen einzelner Labore optimiert,bei denen sich die genauen Vorbereitungsverfahren der Proben unterscheiden können.Unterschiedliche Ergebnisse können aufgrund von präanalytischen Faktoren auftreten,die von den Empfehlungen abweichen. Proben, deren präanalytische Vorbereitung unteranderen Bedingungen abläuft als von Ventana empfohlen, weisen mit dem Assaymöglicherweise niemals geeignete Färbeergebnisse auf.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN1. Für die In-vitro-Diagnostik (IVD).2. Nur zur professionellen Verwendung.3. ACHTUNG! In den USA ist der Verkauf dieses Produkts laut Bundesgesetz nur

durch einen Arzt oder auf Anordnung eines Arztes zulässig. (Rx Only)

4. Achtung! Produkt enthält Formamid. Formamid ist giftig bei Inhalation undleicht giftig bei Verschlucken. Es führt zu Entzündungen der Haut, Augen undSchleimhäute und wird durch die Haut absorbiert. Es kann das ungeborene Kindschädigen. Bei der Arbeit mit den Reagenzien angemessene Vorsichtsmaßnahmentreffen. Bei der Handhabung von mutmaßlich krebserregenden oder toxischenSubstanzen Einweg-Handschuhe und geeignete Schutzkleidung tragen.

5. Der Abfallbehälter muss leer sein, bevor ein Durchlauf mit dem Gerät gestartet wird.Wird diese Vorsichtsmaßnahme außer Acht gelassen, kann der Abfallbehälterüberlaufen und der Benutzer läuft Gefahr, auszurutschen und zu stürzen. Auf denBenchMark XT- und GX-Instrumenten startet der Lauf nicht, bevor derAbfallbehälter geleert wurde.

6. Materialien menschlichen oder tierischen Ursprungs müssen entsprechend denVorschriften für potentiell gefährliche Materialien behandelt und mit dennotwendigen Vorsichtsmaßnahmen entsorgt werden.

7. Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhäuten vermeiden. Bei Kontakt vonReagenzien mit empfindlichen Körperteilen mit reichlich Wasser spülen. Einatmender Reagenzien vermeiden.

8. Mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermeiden, da dies zu falschenErgebnissen führen würde.

9. Informationen über die ordnungsgemäße Entsorgung sind bei den zuständigenBehörden zu erfragen.

10. Weitere Sicherheitshinweise finden Sie im Sicherheitsdatenblatt dieses Produktsund im Leitfaden zu Symbolen und R-Sätzen unter www.ventana.com.

FÄRBEVERFAHRENVENTANA-Sonden wurden zur Verwendung mit einem BenchMark IHC/ISH-Instrument inKombination mit VENTANA-Nachweiskits und Zubehör entwickelt. Die Färbeverfahren fürdas BenchMark IHC/ISH-Instrument mit dem VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit unddem VENTANA Red ISH DIG Detection Kit sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die empfohlenenFärbeprotokolle sind in Tabelle 2 aufgeführt.Die Parameter für die automatisierten Verfahren können entsprechend dem imBenutzerhandbuch des Instruments beschriebenen Verfahren angezeigt, gedrucktund bearbeitet werden.Tabelle 1. Ein VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay auf BenchMarkIHC/ISH-Instrumenten ist anhand der folgenden Färbeverfahren durchzuführen.

Instrumentenplattform Färbeverfahren

BenchMark GX GX VENTANA HER2 DISH DNA PRB CKT

BenchMark XT XT VENTANA HER2 DISH DNA PRB CKT

BenchMark ULTRA U VENTANA HER2 DISH DNA PRB CKT

Tabelle 2. Empfohlene Färbebedingungen für den VENTANA HER2 Dual ISH DNAProbe Cocktail-Assay auf BenchMark IHC/ISH-Instrumenten.

Färbebedingung Brust Magen

Erhitzen Nicht ausgewählt Nicht ausgewählt

Cell Conditioning 1 16 Min. 16 Min.

Cell Conditioning 2 24 Min. 16 Min.

ISH Protease 3 20 Min. 16 Min.

Temperatur für stringentesReinigen

76 °C bei BenchMarkGX/XT-Instrumenten

76 °C bei BenchMarkGX/XT-Instrumenten

74 °C beimBenchMark ULTRA-

Instrument

74 °C beimBenchMark ULTRA-

Instrument

Aufgrund von Schwankungen bei Gewebefixierung und -verarbeitung sowie denallgemeinen Laborgeräten und Umweltbedingungen kann es notwendig sein, dieZellenkonditionierung oder Protease-Vorbehandlung basierend auf individuellen Probenzu erhöhen oder zu senken.

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Starten eines Durchlaufs auf den BenchMark IHC/ISH-Instrumenten1. Die entsprechenden Barcode-Etiketten für das vorgesehene Sonden-Protokoll

anbringen.2. Den VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, Reagenzien vom VENTANA

Red ISH DIG und VENTANA Silver ISH DNP Detection Kits und die erforderlichenzusätzlichen Reagenzien in das Reagenzienkarussell laden.Reagenzienkarussell(s) in das Instrument einsetzen.

3. Flüssigkeitsstände und Abfallbehälter prüfen.4. Die Reaktionspufferflaschen müssen voll sein.5. Der Abfallbehälter muss vor dem Durchlauf leer sein.6. Objektträger in das Instrument einsetzen.7. Färbedurchlauf starten.8. Nach Abschluss des Färbedurchlaufs Objektträger aus dem Instrument nehmen.

Auf den gefärbten Objektträgern befinden sich Reste der Pufferlösung sowie derDeckglaslösung. Mit dem Spülen und Entwässern fortfahren (siehe unten).

DehydrierungAnmerkung: Das Fast Red-Chromogen ist in Alkohol und Aceton löslich. GefärbteObjektträger, die Alkohol oder Aceton ausgesetzt werden, können zum Verlust einesspezifischen Signals führen.1. Zur Entfernung der flüssigen Eindecklösung, die Objektträger nacheinander in

2 Lösungen aus mildem Geschirrspülmittel abspülen (kein Spülmittel fürSpülmaschinen verwenden).

2. Objektträger mit destilliertem Wasser ca. 1 Minute lang gut ausspülen.Überschüssiges Wasser abschütteln.

3. Objektträger in einem Ofen (45–60 °C) oder an der Luft bei Umgebungstemperaturtrocknen. In einem Ofen liegen die Trocknungszeiten zwischen 10 Minuten undeiner Stunde (das Trocknen von gefärbten Objektträgern über einen längerenZeitraum scheint die Färbungsergebnisse nicht zu beeinflussen). Vor dem Auftragender Coverslip-Lösung sicherstellen, dass die Objektträger vollständig getrocknetsind, da Restwasser auf den Objektträgern das Coverslip-Verfahren beeinträchtigenund zu Blasenbildung führen kann.

4. Objektträger ca. 30 Sekunden lang in Xylolbad einlegen.5. Einbettmedium auf den Objektträger auftragen.6. Objektträger abdecken. Beachten Sie, dass einige Einbettmedien mit dem Assay

nicht kompatibel sind und daher nicht verwendet werden sollten (siehe Abschnitteüber Einschränkungen und Problembehebung).

VERFAHREN ZUR QUALITÄTSKONTROLLE

PositivkontrollprobeNormale HER2- und Chromosom 17-Signale (1 bis 2 Kopien pro Zelle) dienen als internepositive Kontrollen und müssen in der Probe mit 20x-, 40x- und/oder 60x-Objektivensichtbar sein. Aufgrund biologischer Heterogenität weisen jedoch nicht alle Zellen eineeinzelne Genkopie auf. Die spezifische nukleäre Färbung kann sich in unterschiedlichenZellen zeigen, z. B. Stromafibroblasten, Endothelzellen, Lymphozyten und nicht-neoplastischen Epithelzellen. Wenn die positiven Kontrollen keine positive Färbungzeigen, kann das auf ein Problem mit dem Reagenz oder Instrument hinweisen. Da jedeProbe eine interne Positivkontrolle hat (d. h. entsprechende ISH-Färbung in normalenZellen), fungiert dies als wahre Positivkontrolle.Mit jedem Färbedurchlauf kann eine laborspezifische, positive Probenkontrolle mitlaufen.Die Kontrollproben können aus frischem Gewebe einer Biopsie bestehen und aufidentische Weise wie das Patientengewebe präpariert werden. Diese Kontrollproben sindnützlich zur Überwachung aller Verfahrensschritte von der Probenpräparierung bis zurFärbung. Durch Verwendung einer Probe, die auf andere Weise als das Testpräparatvorbereitet worden ist, können die Reagenzien, das Gerät und die Verfahrensschrittekontrolliert werden, nicht aber die Fixierung und Probenverarbeitung. Ergebnisse mit denTestproben sollten im gleichen Durchlauf analysiert werden.Xenograft-ProbeXenograft-Objektträger können für eine vorläufige Validierung der Methode hilfreich sein,die für das Färben von Objektträgern mit dem VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail-Assay verwendet wird. Sie werden auch als Hilfsmittel zur Fehlerbehebungempfohlen, wenn sie in Durchläufen mit klinischen Proben verwendet werden.Weitergehende Informationen finden Sie in der entsprechenden Packungsbeilagezu den Xenograft-Objektträgern.

Unerklärliche AbweichungenAbweichungen bei Kontrollergebnissen, für die es keine stichhaltige Erklärung gibt, müssenumgehend der lokalen Ventana-Niederlassung vorgelegt werden. Wenn die Ergebnisse derQualitätskontrolle die Spezifikationen nicht erfüllen, sind die Patientenergebnisse ungültig.Siehe Abschnitt „Fehlerbehebung“ in dieser Beilage. Identifizieren und korrigieren Sie dasProblem, wiederholen Sie anschließend die Patientenproben.Assay-VerifizierungVor der ersten Verwendung einer Sonde oder eines Färbesystems in einemDiagnoseverfahren muss die Spezifität der Sonde überprüft werden. Zu diesem Zweckwird die Sonde an einer Reihe von Gewebeproben mit bekannten ISH-Merkmalen getestet(siehe Packungsbeilage der Sonde und die Empfehlungen zur Qualitätskontrolle desCollege of American Pathologists Laboratory Accreditation Program Anatomic PathologyChecklist25 oder die CLSI Approved Guideline26 oder beide Dokumente). Diese Verfahrenzur Qualitätskontrolle müssen für jede neue Charge oder jedes neue Reagenz und beijeder Änderung der Versuchsparameter wiederholt werden.

INTERPRETATION DER ERGEBNISSEDas zelluläre Färbemuster für den VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assayist nukleär.Ein mit der mikroskopischen Interpretation von anatomischen Pathologieproben, ISH-Verfahrenund der Erkennung einzelner und amplifizierter HER2- und Chromosom 17 (Chr17)-Kopienvertrauter Ableser (durch mikroskopische Untersuchung mit 20x-, 40x- und/oder 60x-Objektiven)muss zunächst die Kontrollen auswerten, bevor die Ergebnisse interpretiert werden können.Anmerkung: Die Verwendung eines 100x-Objektivs wird nicht empfohlen. Alle im Rahmender Tests zur Designverifizierung und -validierung erfolgten Ablesungen vonGewebeobjektträgern wurden mit 20x-, 40x-, und/oder 60x-Objektiven durchgeführt.Bei der Objektträgerauswertung muss der VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailzusammen mit dem Interpretation Guide VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail[P/N 1018386] verwendet werden.In den folgenden Abschnitten wird die Interpretation und Bewertung von Objektträgernbeschrieben. Tabelle 3 illustriert die Zählung der diskreten Signale.Definitionen1. HER2-Genstatus. Der HER2-Genstatus ergibt sich aus dem Verhältnis der Anzahl

der Kopien des HER2-Gens zur Anzahl der Kopien des Chromosom 17 (Chr17) proZelle bei einem invasiven Brust- oder Magenkarzinom. Der HER2-Genstatus wirdunter Verwendung der folgenden Richtlinien klassifiziert.a. HER2/Chr17-Verhältnis ≥ 2,0 ist amplifiziertb. HER2/Chr17-Verhältnis < 2,0 ist nicht amplifiziert

2. Eignung der Objektträger. Ein VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Objektträger muss drei Kriterien erfüllen, um als geeignet für die Zählung betrachtetzu werden. Wenn der Objektträger diese Kriterien nicht erfüllt, kann er für dieZählung nicht verwendet werden und das Ergebnis gilt als unzulänglich.

3. Interne Positivkontrolle. Normale HER2- und Chr17-Signale (1 bis 2 Kopien proZelle) dienen als interne positive Kontrollen und müssen in der Probe sichtbar sein.Diese nukleäre Färbung kann sich in unterschiedlichen nicht neoplastischen Zellenzeigen, z. B. Stromafibroblasten, Endothelzellen, Lymphozyten und nichtneoplastischen Epithelzellen.

4. Neoplastische Zellen. Bei Verwendung von 20x-, 40x- und/oder 60x-Objektivenmuss der invasive Aspekt des Tumors ein zählbares Feld von SISH- und Red ISH-Signalen aufweisen.

5. Hintergrundfärbung. Jede sich aus einem SISH- oder einem Red-ISH-Nachweissystem ergebende Hintergrundfärbung muss ausgewertet werden, um zuermitteln, ob sie die Auszählung der jeweiligen SISH- oder Red-ISH-Signale stört.Der SISH-Hintergrund erscheint in der Regel als SISH-„Staub“, der sich vomjeweiligen Signal abhebt. Rote Hintergründe können als roter Schleier oder inseltenen Fällen als unspezifische Signale erscheinen, die eine im Verhältnis zumjeweiligen Signal geringere Farbintensität aufweisen.

6. Zielbereiche für die Signalzählung. Ein akzeptabler Zielbereich innerhalb des invasivenKarzinoms weist ein zählbares Feld von SISH- und Red ISH-Signalen auf. DieSignalzählung sollte nicht in Bereichen durchgeführt werden, die ein schwaches SISHoder Red ISH-Signal, komprimierte oder überlappende Zellkerne oder Nekroseaufweisen. Wenn ein Zielbereich als unzureichend für die Zählung befunden wird, ist esoft möglich, andere Zielbereiche auf dem gleichen Objektträger zu finden, die geeignetsind. Dies kann anhand der Gegenwart normaler Zellen ermittelt werden, die eineangemessene SISH- und Red ISH-Färbung in oder neben dem Zielbereich aufweisen.

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Zusätzliche Beobachtungen bei HER2 und Chromosom 17Weitere Beobachtungen sollten im Bericht des Pathologen als Kommentare eingefügtwerden.1. Heterogenität: In manchen Fällen können Karzinomgewebebereiche enthalten sein,

die bezüglich der Anzahl der HER2-Kopien genetisch heterogen sind(d. h.möglicherweise liegt eine Mischung aus nicht amplifizierten und amplifiziertenKernen oder eine Mischung aus Kernen mit verschiedenen HER2-Kopien vor). Dieskann unter Karzinomzellen im Zielbereich selbst oder zwischen zwei verschiedenenZielbereichen beobachtet werden.

2. Aneusomie ist jeder Zustand, bei dem ein Organismus zusätzliche oder wenigerChromosome als normalerweise hat, d. h. ein bestimmtes Chromosom (in diesemFall Chromosom 17) ist nicht zweimal vorhanden. Bei Polysomie können anstatt derzwei erwarteten Kopien drei oder mehr Kopien des Chromosoms vorhanden sein.Bei Monosomie enthalten Tumorzellen möglicherweise nur eine Kopie vonChromosom 17. Es gibt Berichte über erkennbare „Amplifizierung“, Clusterbildungoder Polysomie von Chromosom 17 (mit oder ohne HER2 SISH-Cluster).27 InFällen von HER2- und Chromosom 17-Clustern muss darauf geachtet werden, sienicht in einem Verhältnis von ~1,0 zu betrachten. Der Pathologe sollte in diesenFällen die IHC für die Analyse der Überexpression des HER2-Proteinsberücksichtigen, da die Mehrzahl eine Tendenz zu 3+ aufweist.

3. Monoallele Deletion: Die Deletion des HER2-Gens aus Chromosom 17 in denTumorzellen führt zu einem HER2/Chr17-Verhältnis < 1,0.

SignalvisualisierungSISH- und Red ISH-Signale werden wie folgt visualisiert:1. Einzelkopie. Ein einzelner schwarzer Punkt (SISH) wird als einzelne Kopie

von HER2 gezählt. Einzelne Punkte, die in den Zellkernen der internen (nichtneoplastischen) Kontrolle visualisiert werden, stellen die Größe einer einzelnenKopie in invasiven Karzinomzellen für das SISH-Signal (schwarz) dar. Für Red ISH-Signale wird jedes diskrete Signal als eine Kopie gezählt. Es ist zu beachten, dassdas Red ISH-Signal von Chr17 länger als die SISH-Signale erscheinen kann undmanchmal eine länglichere Form aufweist. Ein möglicherweise auftretenderpinkfarbener Schleier darf nicht als Signal fehlinterpretiert werden. Rote Signale, dieim Vergleich mit dem Signal der Zellkerne der internen Positivkontrolle und demgenerellen Färbemuster eine sehr helle Farbe aufweisen, sollten nicht gezähltwerden, da sie möglicherweise nicht spezifisch sind. Spezifische rote Signale habendiskrete Ränder, wie in Tabelle 3 aufgezeigt.

2. Mehrere Kopien. Einzelne diskrete SISH-Signale, die in den Zellkernen der internenPositivkontrolle visualisiert werden, stellen die Größe einer einzelnen HER2-Kopiein invasiven Karzinomzellen dar. Die Größe des einzelnen SISH-Signals dient alsBezugsgröße zur Bestimmung der relativen Anzahl amplifizierter Kopien in denZellkernen der Krebszellen. Für Red ISH-Signale wird jedes diskrete Signal alseine Kopie gezählt.

3. Cluster. Vorliegen von mehreren überlappenden Signalen in den Kernen, die nichtgezählt werden können. Unter einem Cluster versteht man eine Vielzahl einanderüberlappender SISH-Signale im Zellkern, die nicht eindeutig voneinanderabgegrenzt werden können. HER2-Cluster können vom Pathologen nur geschätztwerden. Ein großer Cluster mit mehreren SISH-Signalen kann z. B. auf 12 Kopiengeschätzt werden, während kleinere Cluster auf 6 Kopien geschätzt werden können.Die Schätzung beruht auf den einzelnen SISH-Kopien in den Zellkernen derPositivkontrolle. Auf dem Auszählungsbogen wird vermerkt, dass HER2-Clustervorliegen.

4. Überlappende Zellkerne, Zellkerne mit nur einer präsenten Farbe und Proben mitnichtspezifischer Färbung werden nicht gezählt. Alle Kerne mit überlappenden RedISH- und SISH-Signalen, die nicht unterschieden werden können, sollten beihöheren Vergrößerungen visualisiert werden, um die beiden Signale unterscheidenzu können, oder sie sollten nicht gezählt werden. Kerne mit scheinbaren Luftblasensollten nicht gezählt werden.

Auszählung der SISH- und Red ISH-Signale zur Bestimmung des HER2-GenstatusUntersuchen Sie den mit H&E angefärbten Objektträger, um Bereiche mit invasiven Brust-oder Magenkarzinomzellen zu lokalisieren. Untersuchen Sie den dem H&E-Objektträgerentsprechenden, mit HER2 Dual ISH angefärbten Objektträger und ermitteln Sie eineninvasiven Brust- oder Magenkarzinom-Zielbereich. Vor der Auszählung von HER2- undChromosom 17-Signalen zur Bestimmung des HER2-Genstatus ist es wichtig, zubestimmen, ob der invasive Zielbereich (das Läsionsgewebe) entsprechend gefärbt istund die oben beschriebenen Kriterien für die Eignung des Objektträgers (sieheDefinitionen im Abschnitt oben, 2. Eignung der Objektträger) erfüllt.

Ventana hat einen Scoring-Algorithmus für den Assay entwickelt, der die Genauigkeit unddie Effizienz der Auszählung maximiert. Zwanzig Zellkerne, von denen jeder rote (RedISH) und schwarze (SISH) Signale enthält, sollten ausgezählt werden.Kriterien für die ZellauswahlEs werden nur Zellkerne mit einem Durchmesser gezählt, der repräsentativ für diedurchschnittliche Population der invasiven Karzinomkerne im Zielbereich ist. Es werdenkeine Signale in Zellkernen gezählt, die:1. im Durchmesser viel größer als die durchschnittliche Größe der Karzinomzellkerne

sind2. im Durchmesser viel kleiner als die durchschnittliche Größe der Karzinomzellkerne

sindEs werden nur Zellkerne gezählt, die repräsentativ für die Population der invasivenKarzinomzellkerne mit der höchsten durchschnittlichen Anzahl von Signalen (sowohl SISHals auch Red ISH) sind.In Zielbereichen, die genetisch heterogen bezüglich der Anzahl der HER2-Kopien sind,werden nur Zellkerne gezählt, die repräsentativ für die Population der invasivenKarzinomzellkerne mit der höchsten durchschnittlichen Anzahl von Signalen (sowohl SISHals auch Red ISH) sind. Auf dem Auszählungsbogen ist zu vermerken, dass Heterogenitätvorliegt.Tabelle 3. Signalvisualisierung.

Bei Kernüberlappung nicht zählen.

Nicht zählen, wenn kein Signal vorhanden ist.

Nicht zählen, wenn nur ein Signal einer Farbe vorhandenist.

Nicht zählen, wenn Signale außerhalb des Kerns sind.

Als 1 schwarzes (HER2) und 1 rotes (Chr17) Signal zählen.

Als 2 schwarze (HER2) und 2 rote (Chr17) Signale zählen.

Als 1 schwarzes (HER2) und 2 rote (Chr17) Signale zählen.Das schwarze Signal ist ein „Doublet“. Zwei benachbarteSignale derselben Farbe, wenn der Abstand zwischen denSignalen genauso groß oder größer als der Durchmessereines einzelnen Signals ist.

Kleine SISH-Cluster können nur auf Grundlage der Größeeines einzelnen Referenzsignals geschätzt werden.Verwenden Sie Stromazellen (kleinere Zelle), um dieSignalgröße zu bestimmen. Dieser Cluster könntebeispielsweise auf sechs (6) SISH-Signale geschätzt werden,was zusammen mit den anderen beiden isolierten Signaleneine Gesamtzahl von acht (8) schwarzen Signalen ergibt.Als 2 rote Signale zählen. Auf dem Auszählungsbogen istzu vermerken, dass HER2-Cluster vorliegen.

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Den großen Cluster schätzen. Hier kann der Cluster auf12 schwarze Signale geschätzt werden. Zusammen mit den4 isolierten Signalen ergibt sich so eine Gesamtzahl von 16.Rote Signale als 2 Kopien von Chr17 zählen. Auf demAuszählungsbogen ist zu vermerken, dass HER2-Clustervorliegen.

Ein rotes Signal in der Nähe eines schwarzen Signals sollteals ein rotes Signal und ein schwarzes Signal gezähltwerden. Für die Erkennung ist möglicherweise eine60-fache Vergrößerung erforderlich. Deshalb als4 schwarze (HER2) und 2 rote (Chr17) Signale zählen.Sollten überlappende Signale nicht unterscheidbar sein,diesen Zellkern nicht zählen.

Ein Cluster von schwarzen Punkten verdeckt rote(s)Signal(e). Eventuell muss eine stärkere Vergrößerung (60x)verwendet werden, um die An- oder Abwesenheit einesroten Signals/von roten Signalen zu bestätigen; sonst nichtzählen: immer Zellkerne mit klaren roten Signalen zählen.Auf dem Auszählungsbogen ist zu vermerken, dass SISH-Cluster vorliegen. Liegen in Zellkernen mit SISH-Clusternrote Signale in größerer Anzahl vor, sind vorzugsweisediese Zellkerne auszuzählen.

Sollte sich in den Zellkernen eine Hintergrundfärbung inForm von SISH-„Staub“ zeigen, dürfen diese nur ausgezähltwerden, wenn die spezifischen schwarzen SISH-Signaleeindeutig vom Hintergrund abgrenzbar sind.

Ein möglicherweise auftretender pinkfarbener Schleier darfnicht als Signal fehlinterpretiert werden. Möglicherweisesind kleine, schwache Red ISH-Signale zu sehen, die eineunspezifische Bindung der Chr17-Sonde an andereChromosomen darstellen könnten. Diese Abbildung zeigtzwei (2) diskrete rote (Chr17) und zwei (2) schwarzeSignale (HER2).

HER2-Genstatus: Scoring-Algorithmus für den VENTANA HER2 Dual ISH DNAProbe CocktailZwanzig Zellkerne (jeder enthält rote (Chr17) und schwarze (HER2) Signale) solltenausgezählt werden. Der Bericht der Endergebnisse für den HER2-Status basiert auf demVerhältnis, das sich durch Division der Summe der HER2-Signale für alle 20 Zellkernedurch die Summe der Chromosom 17-Signale für alle 20 Zellkerne ergibt. DerAmplifikationsstatus gilt als Amplified (amplifiziert) bei einem HER2/Chr17-Verhältnis ≥ 2,0und als Non-Amplified (nicht amplifiziert) bei einem HER2/Chr17-Verhältnis < 2,0. Beieinem HER2/Chr17-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2 (einschließlich) sollten zusätzliche20 Zellkerne ausgezählt werden. Auf Basis aller 40 Zellkerne sollte ein neues Verhältnisberechnet werden und der Bericht zum Amplifikationsstatus sollte, wie bereitsbeschrieben, erstellt werden.

KontrollenNormale Zellen im oder neben dem Zielbereich dienen als interne Kontrollen derFärbung. Normale Zellkerne sollten durchschnittlich 1–2 einzelne schwarze Punkte und1–2 einzelne rote Punkte enthalten. Wenn keine einzelne Genkopie in normalen Zellenauf einem Objektträger des Durchlaufs erfasst wird, weist das darauf hin, dass derentsprechende Objektträger für die Zählung ungeeignet ist. Positivkontrollproben oderXenograft Slides sind ein Hilfsmittel zur Fehlerbehebung von potenziellen Problemen mitdem Instrument und/oder Reagenzien.

EINSCHRÄNKUNGEN

Allgemeine Einschränkungen1. ISH ist ein aus mehreren Schritten bestehendes Diagnoseverfahren, das eine

besondere Schulung hinsichtlich der Wahl der geeigneten Reagenzien sowiebezüglich Probenpräparation, Aufbereitung und Präparation der ISH-Objektträgerund der Interpretation der Färbeergebnisse erfordert.

2. Die Färbeergebnisse eines Gewebes sind abhängig von sachgemäßer Behandlungund Aufbereitung des Gewebes vor dem Färben. Unsachgemäßes Fixieren,Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen oder Schneiden oder eineKontamination mit anderen Geweben oder Flüssigkeiten können zu Artefakten,Reagenz-Trapping, falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen führen.Inkonsistente Ergebnisse können auf Abweichungen bei den Fixierungs- undEinbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten im Gewebe selbst beruhen.

3. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die korrekte Interpretationder Ergebnisse beeinträchtigen.

4. Die klinische Interpretation der Gewebefärbung muss anhand derKrankengeschichte, Morphologie und sonstiger histopathologischer Kriterienerfolgen. Es liegt in der Verantwortung eines erfahrenen Pathologen, mit demFärbeverfahren und der Vorbereitung der Objektträger vertraut zu sein. Die Färbungmuss in einem zertifizierten und lizenzierten Labor unter Aufsicht eines Pathologenvorgenommen werden, der für die Überprüfung der gefärbten Objektträger sowie dieGewährleistung der adäquaten Kontrollen verantwortlich ist.

Ungeeignet.Färbung mit neuem

Objektträgerwiederholen

HER2/Chr17Gefärbter

Objektträger

GeeigneterObjektträger?

HER2- und Chromosom 17-Signale in 20 Zellkernen zählen

Nein

Ja

Das HER2/Chr17-Verhältnis durch Division derGesamtzahl der HER2-Signale in Zielbereich 1

durch die Gesamtzahl der Chr17-Signale inZielbereich 1 berechnen

Ja

Start

Zielbereich identifizieren und auswählen

Ergebnisse berichtenNon-AmplifiedHER2/Chr17 < 2,0AmplifiedHER2/Chr17 ≥ 2,0

Nein

Ist1,8 ≤ HER2/Chr17 ≤ 2,2

?

Zusätzliche 20 Zellkernezählen

Das HER2/Chr17-Verhältnis durch Divisionder Gesamtzahl der HER2-Signale in

Zielbereich 1 und 2 durch die Gesamtzahlder Chr17-Signale in Zielbereich 1 und

2 berechnen

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5. Ventana Reagenzien haben die optimale Gebrauchsverdünnung, wenn sie gemäßGebrauchsanweisung verwendet werden. Abweichungen von den empfohlenenTestverfahren können die erwarteten Ergebnisse ungültig machen. Anwender,die von den empfohlenen Testverfahren abweichen, tragen die Verantwortung fürdie Interpretation der Patientenergebnisse.

6. Aufgrund von Abweichungen bei der Probenverarbeitung kann es erforderlich sein,die Behandlungsdauer der ISH-Protease entweder zu verlängern oder zu senken.Die Verlängerung oder Senkung der Zellenaufbereitungszeit wirkt sich auf dieFärbeergebnisse aus. Solche Veränderungen müssen vom Benutzer validiertwerden. Benutzer, die von den empfohlenen Testverfahren abweichen, sind dafürverantwortlich, dass die Patientenergebnisse unter den geänderten Bedingungeninterpretiert werden.

7. Bei Gewebe, das im Vorfeld nicht getestet wurde, können unerwartete Reaktionenmit den verwendeten Reagenzien auftreten. Aufgrund der biologischenSchwankungen bei Geweben können unerwartete Reaktionen auch bei getestetenGewebegruppen nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Bei dokumentiertenunerwarteten Reaktionen bitte den zuständigen Kundendienstvertreter verständigen.

Spezifische Einschränkungen1. Es sind nicht alle Fixiermittel mit dem Assay kompatibel. Ventana empfiehlt die

Verwendung von 10%igem NBF über 6 bis 72 Stunden.2. Der VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay wurde zur Färbung von

Gewebeschnitten entwickelt, die eine Dicke von ~4 μm aufweisen.28 Bei Schnitten,die dicker sind als 4 μm kann es zu Gewebeverlust kommen.

3. Es sind möglicherweise nicht alle Assays auf jedem Instrument registriert. Bittewenden Sie sich für weitere Informationen an Ihren Roche-Vertreter vor Ort.

4. Oxidierung, Ausbleichen und/oder Verschwinden des SISH-Signals kann durchEinbettmedien bestimmter Hersteller bedingt sein. Informationen zur Kompatibilitätvon Einbettmedien finden Sie in Tabelle 24.

5. Um zu verhindern, dass sich ein Red ISH-Signal auflöst, dürfen gefärbteObjektträger für die Dehydrierung nicht in Alkohol- oder Acetonbäder gelegt werden.Es wird Lufttrocknung oder die Trocknung in einem Ofen empfohlen. DieObjektträger müssen vor dem Auftragen der Coverslip-Lösung vollständiggetrocknet sein.

6. Wie bei jedem Test bedeutet ein negatives Ergebnis lediglich, dass das spezifischeZiel nicht nachgewiesen wurde, aber nicht, dass das spezifische Ziel in denuntersuchten Zellen/Geweben nicht vorhanden ist.

7. Diese Sonde wurde für die Verwendung mit VENTANA-Reagenzien auf BenchMarkIHC/ISH-Instrumenten optimiert. Benutzer, die von den empfohlenen Testverfahrenabweichen, sind dafür verantwortlich, dass die Patientenergebnisse unter dengeänderten Bedingungen interpretiert werden.

LEISTUNGSMERKMALEDie Leistungsfähigkeit des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail wurde inStudien zu Empfindlichkeit, Spezifität und Wiederholbarkeit überprüft. Sofern nicht andersangegeben, wurden alle Färbungen auf BenchMark IHC/ISH-Instrumenten unterAnwendung des in Tabelle 1 aufgeführten VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail-Protokolls durchgeführt.Methodenvergleichsstudie: VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auf demBenchMark ULTRA-Instrument versus Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe KitZur Beurteilung der klinischen Empfindlichkeit und Spezifität des VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail-Assays bei der Bestimmung des HER2-Genstatus beiminvasiven Brustkarzinom wurde eine multizentrische Methodenvergleichsstudie mit demAbbott/Vysis PathVysion HER-2 FISH Kit als Vergleichsgerät durchgeführt. An derUntersuchung des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail nahmen dreiZentrallabors teil. Es wurden 636 Fälle eines menschlichen invasiven Brustkarzinoms vondrei klinischen Studienzentren zur potenziellen Aufnahme in die Studie auf Grundlage derzuvor mittels IHC festgestellten HER2/neu-Proteinexpression zur Verfügung gestellt. DerStudiensponsor stellte 133 weitere Fälle zur Verfügung. Die Zentrallabors, an denen derVENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay und der PathVysion HER-2 FISH-Assay durchgeführt wurden, waren gegenüber dem IHC-Status und der ursprünglichenFallidentifikation verblindet, um Verzerrungen (Bias) bei der Beurteilung der Proben zuvermeiden. In einem Zentrallabor wurde die IHC-Färbung bei allen Proben mithilfe desPATHWAY HER2/neu (4B5)-Assays für die weiteren Analysen durchgeführt. DieFärbeergebnisse des FISH- und VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assayswurden durch Zählung von mindestens 20 Zellkernen in jeder Probe ausgezählt. DieErgebnisse wurden wie folgt dokumentiert: HER2/Chr 17-Verhältnis ≥ 2,0 amplifiziert;

HER2/Chr 17-Verhältnis < 2,0 nicht amplifiziert. Von den 678 Fällen, die sowohl mittelsFISH- als auch VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay gefärbt wurden,waren 605 Proben von beiden Assays auszählbar und wurden infolgedessen in dieAnalyse der Übereinstimmungsraten einbezogen.Primäre ErgebnisseBei der Primäranalyse wurden die positiven und negativen Übereinstimmungsratenverglichen, um die Vergleichbarkeit der Leistung des VENTANA HER2 Dual ISH DNAProbe Cocktail-Assays und des PathVysion HER-2 FISH-Assays nachzuweisen. Diegepoolten Daten der amplifizierten und nicht amplifizierten klinischen Beurteilungen allerZentren werden nachfolgend in einer 2x2-Tabelle gemeinsam mit den prozentualenpositiven und negativen Übereinstimmungsraten dargestellt, wobei PathVysion HER-2FISH als Referenzassay verwendet wurde. Als Akzeptanzkriterium für den Nachweis derVergleichbarkeit der Leistung dieser beiden Assaymethoden bei Verwendung desBenchMark ULTRA-Instruments wurde als Untergrenze des zweiseitigen 95%-Konfidenzintervalls für die gepoolten Daten aller drei Zentren 85 % oder höher festgelegt.Diese Akzeptanzkriterien wurden erfüllt (Tabelle 4). Auch betrugen die positiven undnegativen Übereinstimmungsraten je Zentrum allesamt mehr als 85 % (Tabelle 5).Tabelle 4. Übereinstimmung von VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailund Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit bei einer Kohorte menschlicherBrustkarzinomproben.

PathVysion HER-2 FISH-Ergebnis

VENTANA HER2Dual ISH DNA

Probe Cocktail-Ergebnis Amplified Non-Amplified Gesamt

Amplified 270 12 282

Non-Amplified 32 291 323

Gesamt 302 303 605

n/N % (95%-Anzahl-CI)

Prozentuale positiveÜbereinstimmung 270/302 89,4 (85,4; 92,4)

Prozentuale negativeÜbereinstimmung 291/303 96,0 (93,2; 97,7)

Tabelle 5. Zusammenfassung der negativen, positiven und gesamtenÜbereinstimmungsraten des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail undAbbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit bei menschlichen Brustkarzinomproben,dargestellt nach Zentrum.

VENTANAHER2 Dual ISHDNA ProbeCocktail versusPathVysionHER-2 FISH

ProzentualepositiveÜbereinstimmung

ProzentualenegativeÜbereinstimmung

ProzentualeGesamtüberein-stimmung

Zentrum A: n/N(%) (95%-CI)

92/100 (92,0 %)(85,0; 95,9)

92/93 (98,9 %)(94,2; 99,8)

184/193 (95,3 %)(91,4; 97,5)

Zentrum B: n/N(%) (95%-CI)

93/103 (90,3 %)(83,0; 94,6)

108/119 (90,8 %)(84,2; 94,8)

201/222 (90,5 %)(86,0; 93,7)

Zentrum C: n/N(%) (95%-CI)

85/99 (85,9 %)(77,7; 91,4)

91/91 (100,0 %)(95,9; 100,0)

176/190 (92,6 %)(88,0; 95,6)

Diese Daten deuten auf eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen dem VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays und dem PathVysion HER-2 FISH Kit beimNachweis des HER2-Genstatus bei menschlichen Brustkarzinomproben hin.

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Sekundäre ErgebnisseDie prozentuale Gesamtübereinstimmung von VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail und PathVysion HER-2 FISH Kit und deren zweiseitiges 95%-Anzahl-CI für diegepoolten Daten aller klinischen Zentren betrug 92,7 % (90,4; 94,5).Sekundäre Ergebnisse: IHC versus ISH beim HER2-StatusDie Methodenvergleichsstudie zum Vergleich des VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail und des PathVysion FISH war so konzipiert, dass auch Fälle auf Grundlage ihrerIHC-Scores der HER2-Proteinwerte beurteilt wurden. Dies ermöglichte eineSekundäranalyse zum Vergleich beider ISH-Assays mit der IHC in Hinblick auf dieÜbereinstimmungsraten bei der Bestimmung des HER2-Status. Die Assays wurden aufGrundlage der FDA-Richtlinien verglichen, laut denen 2+/3+-Fälle als positiv in Hinblickauf eine HER2-Überexpression gelten. Zunächst wurden, basierend auf den FDA-Scoringrichtlinien, PathVysion HER-2 FISH als Referenzstandard verwendet, umnachzuweisen, dass die positive Übereinstimmungsrate und das 95%-Anzahl-Konfidenzintervall für PATHWAY HER2/neu (4B5) im Vergleich mit FISH 91,1 %(87,4; 93,8) betrug (Tabelle 6). Wurde VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailals Referenzstandard verwendet, war die positive Übereinstimmungsrate für PATHWAYHER2/neu (4B5) im Vergleich mit VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ähnlichund betrug 93,2 % (89,6; 95,7) (Tabelle 7).Tabelle 6. IHC auf dem BenchMark ULTRA-Instrument versus FISH; Vergleich gemäßFDA-Richtlinien: Gepoolte Daten aller Zentren.

PathVysion HER-2 FISH-Ergebnis

AmplifiedNon-

Amplified Gesamt

PATHWAYHER2/neu(4B5)-Ergebnisse

Positiv(2+/3+ Fälle)

277 63 340

Negativ(0/1+)

27 238 265

Gesamt 304 301 605


Prozentuale positiveÜbereinstimmung

277/304 91,1 (87,4; 93,8)

Tabelle 7. IHC auf dem BenchMark ULTRA-Instrument versus VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail-Assay; Vergleich gemäß FDA-Richtlinien: Gepoolte Daten allerZentren.

VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Ergebnis

AmplifiedNon-

Amplified Gesamt

PATHWAYHER2/neu(4B5)-Ergebnisse

Positiv(2+/3+ Fälle)

248 78 326

Negativ(0/1+)

18 253 271

Gesamt 266 331 597


Prozentuale positiveÜbereinstimmung

248/266 93,2 (89,6; 95,7)

Methodenvergleichsstudie: VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assayauf dem BenchMark ULTRA-Instrument versus Dako HER2 IQFISH pharmDx™ Kit-AssayZur Beurteilung der klinischen Empfindlichkeit und Spezifität des VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail-Assays zur Bestimmung des HER2-Genstatus beimMagenkarzinom wurde eine Methodenvergleichsstudie durchgeführt, bei der das Dako

HER2 IQFISH pharmDx™ Kit für die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung verwendet wurde(FISH). Die Vergleichbarkeit des Assays bei Magenproben und Proben desgastroösophagealen Übergangs wurde durch einen Vergleich der Färbeergebnisse beiderAssays bestimmt (Tabelle 8). Es wurden 134 menschliche Magenproben und 12 Probendes gastroösophagealen Übergangs (eine Mischung aus amplifizierten und nichtamplifizierten Fällen) mithilfe des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail gefärbt.Dieselbe Kohorte wurde auch mit dem Dako HER2 IQFISH pharmDx™-Assay gefärbt. DieErgebnisse in Tabelle 8 und Tabelle 9 zeigen die negative, die positive und die gesamteÜbereinstimmungsrate für die 146 klinischen Proben dieser Kohorte, die mit dem DakoHER2 IQFISH pharmDx™-Assay und dem VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail-Assay ausgezählt werden konnten.Tabelle 8. Übereinstimmung zwischen dem VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail und dem Dako HER2 IQFISH pharmDx™-Assay bei einer Kohorte menschlicherMagenkarzinomproben.

VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail-Amplifikationsstatus

Dako HER2 IQFISH pharmDx™-AssayAmplifikationsstatus

Amp Non-Amp

Amp 49 8

Non-Amp 5 84

Tabelle 9. Zusammenfassung der negativen, positiven und gesamtenÜbereinstimmungsraten des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail und DakoHER2 IQFISH pharmDx™ bei menschlichen Magenkarzinomproben.

NegativeÜbereinstimmungsrate

PositiveÜbereinstimmungsrate

GesamteÜbereinstimmungsrate

Rohdaten/Anzahl von

Fällen

Prozent(95%-

Anzahl-CI)

Rohdaten/Anzahl von

Fällen

Prozent(95%-

Anzahl-CI)

Rohdaten/Anzahl von

Fällen

Prozent(95%-

Anzahl-CI)

VENTANAHER2Dual ISHDNAProbeCocktail

84/9291,3

(83,8–95,5)

49/5490,7

(80–196,0)133/146

91,1(85,4–94,7)

Wiederholbarkeit und Präzision des BenchMark IHC/ISH-Instruments beimBrustkarzinomDie Wiederholbarkeit und Präzision des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailwurden auf den BenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instrumenten in Kombination mit demVENTANA Silver ISH DNP Detection Kit und dem VENTANA Red ISH DIG Detection Kit.geprüft.Die Intra-Durchlauf-Wiederholbarkeit wurde mithilfe von 28 Brustkarzinomproben (BC))beurteilt. Hierfür wurden zwei Objektträger-Replikate von jeder BC-Probe mit VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auf einem einzigen BenchMark ULTRA-, XT- oderGX-Instrument gefärbt. Für die Analyse der Daten der BenchMark XT- und GX-Instrumente wurden die Fälle mit grenzwertigem Verhältnis entsprechend ihrer Prävalenzgewichtet.Die Inter-Tages-Laborpräzision wurde ebenfalls mithilfe von BC-Proben beurteilt. Hierfürwurden Objektträger-Replikate von allen 28 Proben an 5 nicht aufeinander folgendenTagen mit VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auf einem BenchMark ULTRA-,XT- und GX-Instrument gefärbt. Für die Analyse der Daten der BenchMark XT- und GX-Instrumente wurden die Fälle mit grenzwertigem Verhältnis entsprechend ihrer Prävalenzgewichtet.Die Intra-Durchlauf-Wiederholbarkeit wurde anhand der durchschnittlichen positivenÜbereinstimmung (APA), der durchschnittlichen negativen Übereinstimmung (ANA) undder prozentualen Gesamtübereinstimmung (OPA) bestimmt. Die Inter-Tages-Laborpräzision wurde anhand der positiven prozentualen Übereinstimmung (PPA), dernegativen prozentualen Übereinstimmung (NPA) und der gesamten prozentualenÜbereinstimmung (OPA) bei allen Beobachtungen der auswertbaren Population bestimmt.Eine Zusammenfassung der Ergebnisse beider Studien ist in Tabelle 10 zu finden.

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Tabelle 10. Intra-Durchlauf-Wiederholbarkeit und die Inter-Tages-Laborpräzision desBenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instruments

PlattformWiederhol-

barkeit/Präzision

KlinischerStatus

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

ULTRA

Intra-Durchlauf-Wiederhol-barkeit

Amplified APA 146/146 100 (97,4; 100)

Non-Amplified ANA 188/188 100 (98,0; 100)

Gesamt OPA 167/167 100 (97,8; 100)

ULTRA Inter-Tages-Laborpräzision

Amplified PPA 144/144 100 (97,4; 100)

Non-Amplified NPA 189/191 99,0 (96,7; 100)

Gesamt OPA 333/335 99,4 (98,2; 100)

XT


Amplified APA 128,8/128,8 100 (97,1; 100)

Non-Amplified ANA 151,2/

151,2 100 (97,5; 100)

Gesamt OPA 140,0/140,0 100 (97,3; 100)

XT Inter-Tages-Laborpräzision

Amplified PPA 128,8/128,8 100 (97,1; 100)

Non-Amplified NPA 151,2/

151,2 100 (97,5; 100)

Gesamt OPA 280,0/280,0 100 (98,6; 100)

GX


Amplified APA 128,8/128,8 100 (97,1; 100)


151,2 100 (97,5; 100)

Gesamt OPA 140,0/140,0 100 (97,3; 100)

GX Inter-Tages-Laborpräzision

Amplified PPA 128,8/128,8 100 (97,1; 100)


151,2 100 (97,5; 100)

Gesamt OPA 280,0/280,0 100 (98,6; 100)

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methodeberechnet; bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die WilsonScore-Methode verwendet. In die Studie wurden vier Fälle mit grenzwertigem Statusaufgenommen.

Inter-Instrumente-Laborpräzision beim BrustkarzinomDie Inter-Instrumente-Laborpräzision von BenchMark IHC/ISH und VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail wurde durch Färbung von Objektträger-Replikaten von 28 BC-Proben auf 3 BenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instrumenten mit dem VENTANA HER2Dual ISH DNA Probe Cocktail unter Verwendung des VENTANA Silver ISH DNPDetection Kit und des VENTANA Red ISH DIG Detection Kit bestimmt. Die Inter-Instrumente-Laborpräzision wurde anhand der PPA, NPA und OPA über alleBeobachtungen aus der auswertbaren Population bestimmt. Die grenzwertigen Fällewurden entsprechend ihrer Prävalenz gewichtet. Eine Zusammenfassung der Ergebnissedieser Studie ist in Tabelle 11 zu finden.

Tabelle 11. Inter-Instrumente-Laborpräzision der BenchMark IHC/ISH-Instrumente

Plattform Präzision KlinischerStatus

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

ULTRAInter-Instrumente-Laborpräzision

Amplified PPA 72,0/72,0 100 (94,9; 100)


96,0 97,9 (95,8; 100)

Gesamt OPA 166,0/168,0 98,8 (97,6; 100)

XTInter-Instrumente-Laborpräzision

Amplified PPA 77,3/77,3 100 (95,3;

100,0)


90,7 100 (95,9;100,0)

Gesamt OPA 168,0/168,0 100 (97,8;

100,0)

GXInter-Instrumente-Laborpräzision

Amplified PPA 76,2/76,2 100 (95,2; 100)


90,7 100 (95,9; 100)

Gesamt OPA 166,9/166,9 100 (97,8; 100)


Intra-Ableser- und Inter-Ableser-Präzision beim BrustkarzinomDie Intra-Ableser- und Inter-Ableser-Präzision von BenchMark IHC/ISH und VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail wurde von 3 Ablesern bestimmt und auf Grundlageder Auswertung von 28 BC-Proben, die mit dem VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail unter Verwendung des VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit und desVENTANA Red ISH DIG Detection Kit auf dem BenchMark ULTRA gefärbt wurden,durchgeführt. Für die Bestimmung der Intra-Ableser-Präzision wurde ein und derselbeSatz Objektträger zweimal im Abstand von mindestens zwei Wochen abgelesen. Die Intra-Ableser und Inter-Ableser-Präzision wurde anhand der APA, ANA und OPA über alleBeobachtungen der auswertbaren Population bestimmt. Eine Zusammenfassung derErgebnisse dieser Studie ist in Tabelle 12 zu finden.Tabelle 12. Intra-Ableser- und Inter-Ableser-Präzision von BenchMark ULTRA

Präzision KlinischerStatus

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Ableser

Amplified APA 146/158 92,4 (90,2; 94,7)

Non-Amplified ANA 166/178 93,3 (90,7; 95,7)

Gesamt OPA 156/168 92,9 (90,5; 95,2)

Intra-Ableser

Amplified APA 76/78 97,4 (95,0; 100,0)


Gesamt OPA 82/84 97,6 (95,2; 100,0)

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methodeberechnet; bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die WilsonScore-Methode verwendet.

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Inter-Plattform-Präzision beim BrustkarzinomDie Inter-Plattform-Präzision von BenchMark IHC/ISH und VENTANA HER2 Dual ISHDNA Probe Cocktail erfolgte durch Auswertung von 28 BC-Proben, die mit demVENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail unter Verwendung des VENTANA SilverISH DNP Detection Kit und des VENTANA Red ISH DIG Detection Kit auf BenchMarkULTRA-, XT- und GX-Instrumenten gefärbt wurden. Die Inter-Plattform-Präzision wurdeanhand der PPA, NPA und OPA über alle Beobachtungen aus der auswertbarenPopulation bestimmt. Die grenzwertigen Fälle wurden entsprechend ihrer Prävalenzgewichtet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Studie ist in Tabelle 13 zufinden.Tabelle 13. Inter-Plattform-Präzision der BenchMark IHC/ISH-Instrumente


Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Plattform-Präzision

Amplified PPA 230,8/230,8 100 (98,4; 100)


272,2 99,6 (98,3; 100)

Gesamt OPA 501,8/502,9 99,8 (99,2; 100)


Wiederholbarkeit von BenchMark IHC/ISH und Präzision bei MagenkarzinomenDie Wiederholbarkeit und Präzision des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailwurden auf den BenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instrumenten in Kombination mit demVENTANA Silver ISH DNP Detection Kit und dem VENTANA Red ISH DIG Detection Kitgeprüft.Die Intra-Durchlauf-Wiederholbarkeit wurde mithilfe von 14 Magenkarzinomproben (GC)beurteilt. Hierfür wurden zwei Objektträger-Replikate von jeder GC-Probe mit VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auf einem einzigen BenchMark ULTRA-, XT- oderGX-Instrument gefärbt. Die grenzwertigen Fälle wurden entsprechend ihrer Prävalenzgewichtet.Die Inter-Tages-Laborpräzision wurde ebenfalls mithilfe von GC-Proben beurteilt. Hierfürwurden Wiederholungsobjektträger von jeder der 14 Proben an 5 nicht aufeinanderfolgenden Tagen mit VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail auf einemBenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instrument gefärbt. Die grenzwertigen Fälle wurdenentsprechend ihrer Prävalenz gewichtet.Die Intra-Durchlauf-Wiederholbarkeit wurde anhand der durchschnittlichen positivenÜbereinstimmung (APA), der durchschnittlichen negativen Übereinstimmung (ANA) undder prozentualen Gesamtübereinstimmung (OPA) bestimmt. Die Inter-Tages-Laborpräzision wurde anhand der positiven prozentualen Übereinstimmung (PPA), dernegativen prozentualen Übereinstimmung (NPA) und der gesamten prozentualenÜbereinstimmung (OPA) bei allen Beobachtungen der auswertbaren Population bestimmt.Eine Zusammenfassung der Ergebnisse beider Studien ist in Tabelle 14 zu finden.Tabelle 14. Intra-Durchlauf-Wiederholbarkeit und die Laborpräzision zwischen Tagen desBenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instruments

PlattformWiederhol-

barkeit/Präzision

KlinischerStatus

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

ULTRAIntra-Durchlauf-Wiederhol-barkeit

Amplified APA 70,0/70,0 100 (94,8; 100)


70,0 100 (94,8; 100)

Gesamt OPA 70,0/70,0 100 (94,8; 100)

PlattformWiederhol-

barkeit/Präzision

KlinischerStatus

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

ULTRA Inter-Tages-Laborpräzision

Amplified PPA 70,0/70,0 100 (94,8; 100)


70,0 100 (94,8; 100)

Gesamt OPA140,0/140,0

100 (97,3; 100)

XTIntra-Durchlauf-Wiederhol-barkeit

Amplified APA 70,0/70,0 100 (94,8; 100)


70,0 100 (94,8; 100)

Gesamt OPA 70,0/70,0 100 (94,8; 100)

XT Inter-Tages-Laborpräzision

Amplified PPA 70,0/70,0 100 (94,8; 100)


70,0 100 (94,8; 100)


100 (97,3; 100)

GX


Amplified APA 64,6/65,1 99,1 (95,9; 100)


70,6 99,2 (95,2; 100)

Gesamt OPA 67,3/67,9 99,2 (96,9; 100)

GX Inter-Tages-Laborpräzision

Amplified PPA 67,3/67,9 99,2 (96,5; 100)


70,0 100 (94,8; 100)


99,6 (98,5; 100)

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methode berechnet;bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die Wilson Score-Methodeverwendet. In die Studie wurden zwei Fälle mit grenzwertigem Status aufgenommen.

Inter-Instrumente-Laborpräzision beim MagenkarzinomDie Inter-Instrumente-Laborpräzision von BenchMark IHC/ISH und VENTANA HER2 DualISH DNA Probe Cocktail wurde durch Färbung von Wiederholungsobjektträgern von28 GC-Proben auf 3 BenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instrumenten mit dem VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail unter Verwendung des VENTANA Silver ISH DNPDetection Kit und des VENTANA Red ISH DIG Detection Kit bestimmt. Die Inter-Instrumente-Laborpräzision wurde anhand der PPA, NPA und OPA über alleBeobachtungen aus der auswertbaren Population bestimmt. Die grenzwertigen Fällewurden entsprechend ihrer Prävalenz gewichtet. Eine Zusammenfassung der Ergebnissedieser Studie ist in Tabelle 15 zu finden.

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Tabelle 15. Inter-Instrumente-Laborpräzision der BenchMark IHC/ISH-Instrumente

Plattform Präzision KlinischerStatus

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

ULTRAInter-Instrumente-Laborpräzision

Amplified PPA 42,0/42,0 100 (91,6; 100)


42,0 100 (91,6; 100)

Gesamt OPA 84,0/84,0 100 (95,6; 100)

XTInter-Instrumente-Laborpräzision

Amplified PPA 40,4/40,9 98,6 (94,1; 100)


40,9 100 (91,4; 100)

Gesamt OPA 81,3/81,9 99,3 (97,5; 100)

GXInter-Instrumente-Laborpräzision

Amplified PPA 40,9/40,9 100 (91,4; 100)


42,0 100 (91,6; 100)

Gesamt OPA 82,9/82,9 100 (95,6; 100)

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methodeberechnet; bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die WilsonScore-Methode verwendet. In die Studie wurden zwei Fälle mit grenzwertigem Statusaufgenommen.

Intra-Ableser- und Inter-Ableser-Präzision beim MagenkarzinomDie Intra-Ableser- und Inter-Ableser-Präzision von BenchMark IHC/ISH und VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail wurde von 3 Ablesern durchgeführt und erfolgte aufGrundlage der Auswertung von 28 GC-Proben, die mit dem VENTANA HER2 Dual ISHDNA Probe Cocktail unter Verwendung des VENTANA Silver ISH DNP Detection Kit unddes VENTANA Red ISH DIG Detection Kit auf dem BenchMark ULTRA gefärbt wurden.Alle Objektträger wurden randomisiert und gegenüber der Falldiagnose verblindet. Für dieBestimmung der Intra-Ableser-Präzision wurde ein und derselbe Satz Objektträgerzweimal im Abstand von mindestens zwei Wochen abgelesen. Die Intra-Ableser-Präzisionund die Inter-Ableser-Präzision wurde anhand der APA, ANA und OPA über alleBeobachtungen der auswertbaren Population bestimmt. Eine Zusammenfassung derErgebnisse dieser Studie ist in Tabelle 16 zu finden.Tabelle 16. Intra-Ableser- und Inter-Ableser-Präzision von BenchMark ULTRA


Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Ableser

Amplified APA 80/84 95,2 (90,5; 100,0)


Gesamt OPA 80/84 95,2 (90,5; 100,0)

Intra-Ableser

Amplified APA 82/84 97,6 (95,2; 100,0)


Gesamt OPA 82/84 97,6 (95,2; 100,0)

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methodeberechnet; bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die WilsonScore-Methode verwendet.

Inter-Plattform-Präzision beim MagenkarzinomDie Bestimmung der Inter-Plattform-Präzision von BenchMark IHC/ISH und VENTANAHER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail erfolgte durch Auswertung von 14 GC-Proben,die mit dem VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail unter Verwendung desVENTANA Silver ISH DNP Detection Kit und des VENTANA Red ISH DIG Detection Kitauf BenchMark ULTRA-, XT- und GX-Instrumenten gefärbt wurden. Die Inter-Plattform-Präzision wurde anhand der PPA, NPA und OPA über alle Beobachtungen aus derauswertbaren Population bestimmt. Die grenzwertigen Fälle wurden entsprechend ihrerPrävalenz gewichtet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Studie ist inTabelle 17 zu finden.Tabelle 17. Inter-Plattform-Präzision der BenchMark IHC/ISH-Instrumente


Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Plattform-Präzision

Amplified PPA 123,3/123,9 99,5 (98,1; 100)

Non-Amplified NPA 124,9/124,9 100 (97,0; 100)

Gesamt OPA 248,2/248,8 99,8 (99,2; 100)

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methodeberechnet; bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die WilsonScore-Methode verwendet. In die Studie wurden zwei Fälle mit grenzwertigemStatus aufgenommen.

Inter-Chargen-Präzision beim BrustkarzinomDie Inter-Chargen-Präzision wurde durch Testen von 3 Produktionschargen desVENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, VENTANA Silver ISH DNP Detection Kitund VENTANA Red ISH DIG Detection Kit auf BenchMark ULTRA-Instrumentenbestimmt. Hierfür wurden 28 BC-Fälle mit jeder Sonde und jedem Nachweiskit gefärbt.Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Inter-Chargen-Präzision des Assays ist inTabelle 18 aufgeführt.Tabelle 18. Inter-Chargen-Präzision


Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Chargen

Amplified PPA 121/121 100 96,9; 100

Non-Amplified NPA 123/123 100 97,0; 100

Gesamt OPA 244/244 100 98,5; 100

Anmerkung: Die 95%-CIs wurden mithilfe der Perzentil-Bootstrap-Methode berechnet;bei Instanzen mit einer Punktschätzung von 100 % wurde die Wilson Score-Methodeverwendet. In die Studie wurden vier Fälle mit grenzwertigem Status aufgenommen.

Studie zur Inter-Labor-Wiederholpräzision des BenchMark ULTRA-Instrumentsbei Brust- und MagenkarzinomenZur Beurteilung der Wiederholpräzision von VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail bei der Bestimmung des HER2-Genstatus wurde eine Studie zur Inter-Labor-Wiederholpräzision bei Brust- und Magenkarzinomgewebe durchgeführt, das auf demBenchMark ULTRA-Instrument in Kombination mit dem VENTANA Silver ISH DNPDetection Kit und dem VENTANA Red ISH DIG Detection Kit. gefärbt wurde.Hierfür wurden 28 FFPE Brust- und Magenkarzinomgewebeproben verwendet;ungefähr die Hälfte der Fälle war in Hinblick auf den HER2-Expressionsstatusamplifiziert, die andere Hälfte war nicht HER2-amplifiziert.Von jeder Probe wurden mehrere Gewebeschnitte entnommen und an 3 Studienzentrenübergeben. Jedes Zentrum färbte über einen Zeitraum von mindestens 20 Tagen28 Brustkarzinomfälle und 28 Magenkarzinomfälle an 5 nicht aufeinanderfolgendenTagen. Nach der Färbung auf dem BenchMark ULTRA-Instrument wurden die einzelnenObjektträger von einem Ableser ausgewertet und der HER2-Genstatus zugeordnet.

2019-03-20 12 / 16 1018383DE Rev AFT0700-415j

Die Ergebnisse der Studie sind nachfolgend in Tabelle 19 und Tabelle 20zusammengefasst. Die Daten wurden über alle Beobachtungen hinweg in Hinblick aufdie prozentuale positive Übereinstimmung (PPA) und die prozentuale negative (NPA)Übereinstimmung analysiert. Für jeden Fall wurden alle auswertbare Beobachtungen(amplifiziert versus nicht amplifiziert) mit dem modalen Ergebnis jedes einzelnen Fallsverglichen. Die grenzwertigen Fälle wurden entsprechend ihrer Prävalenz gewichtet.Diese Vergleichsergebnisse aller Zentren und Tage wurden gepoolt; anschließendwurden die Daten aller Fälle kumuliert.Tabelle 19. ILR: Übereinstimmungsraten auf dem BenchMark ULTRA-Instrument beimBrustkarzinom

Inter-Labor-Wiederholpräzision

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Einrichtungs-Präzision(3 Zentren)

PPA 208,9/208,9 100 (98,2; 100,0)

NPA 198,1/200,3 98,9 (96,8; 100,0)

OPA 407,0/409,3 99,5 (98,4; 100,0)

Inter-Tages-Präzision(5 nichtaufeinanderfolgendeTage)

EinrichtungA

PPA 72/74 97,3 (92,3; 100,0)

NPA 63/63 100 (94,3; 100,0)

OPA 135/137 98,5 (95,6; 100,0)

EinrichtungB

PPA 70/70 100 (94,8; 100,0)

NPA 63/64 98,4 (95,8; 100,0)

OPA 133/134 99,3 (97,8; 100,0)

EinrichtungC

PPA 70/70 100 (94,8; 100,0)

NPA 69/69 100 (94,7; 100,0)

OPA 139/139 100 (97,3; 100,0)

Tabelle 20. ILR: Übereinstimmungsraten auf dem BenchMark ULTRA-Instrument beimMagenkarzinom

Inter-Labor-Wiederholpräzision

Übereinstimmung

Typ n/N % 95%-CI

Inter-Einrichtungs-Präzision(3 Zentren)

PPA 206,8/206,8 100 (98,2; 100,0)

NPA 208,4/208,9 99,7 (99,2; 100,0)

OPA 415,1/415,7 99,9 (99,6; 100,0)

Inter-Tages-Präzision(5 nichtaufeinanderfolgendeTage)

EinrichtungA

PPA 70/70 100 (94,8; 100,0)

NPA 69/70 98,6 (96,0; 100,0)

OPA 139/140 99,3 (97,9; 100,0)

EinrichtungB

PPA 67/67 100 (94,6; 100,0)

NPA 69/69 100 (94,7; 100,0)

OPA 136/136 100 (97,3; 100,0)

EinrichtungC

PPA 70/70 100 (94,8; 100,0)

NPA 70/70 100 (94,8; 100,0)

OPA 140/140 100 (97,3; 100,0)

Analytische Empfindlichkeit/SpezifitätDie analytische Spezifität (Hybridisierungswirksamkeit) des VENTANA HER2 Dual ISHDNA Probe Cocktail-Assays wurde durch Färbung normaler menschlicherMetaphasenplatten auf einem BenchMark XT-Instrument ermittelt. Von 125 analysiertenMetaphasenplatten wiesen 100 % eine spezifische Doppelhybridisierung mit den HER2-und den Chromosom 17-Sonden auf.Die analytische Empfindlichkeit bestimmt die Leistungsfähigkeit der Sonde beim Nachweisihres spezifischen Ziels, während die Spezifität die Leistungsfähigkeit bei der Unterscheidungdes Ziels von anderen Sequenzen in der Probe bezeichnet. Der Assay verfügt über eineintegrierte Kontrolle der analytischen Empfindlichkeit und der Spezifität für jedes menschlicheGewebe. Normale menschliche Zellen (einschließlich Stromafibroblasten, Endothelzellen,Lymphozyten und nicht neoplastische Brustepithelzellen) sollten 1–2 Kopien von HER2 undChr17 enthalten. Daher weist das Vorliegen von 1–2 Kopien von HER2 und Chr17 innormalen menschlichen Zellen darauf hin, dass die Sonden ihr jeweiliges spezifisches Zielnachweisen (Bestimmung der Empfindlichkeit). Das Vorliegen von 1–2 Kopien von HER2 undChr17 in normalen Zellen weist außerdem darauf hin, dass die Sonde nur ihre spezifischenZiele nachweist (Bestimmung der Spezifität). Die erste Durchlaufrate des VENTANA HER2Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays bei 40 Brustgewebeproben, die entsprechend denASCO CAP-Richtlinien fixiert wurden (10%ige NBF über 6 bis 72 Stunden) betrug 100 %(91,2–100) auf BenchMark ULTRA-Instrumenten, 100 % (91,2–100) auf BenchMark XT-Instrumenten und 97,5 % (87,1–99,6) auf BenchMark GX-Instrumenten. Die Spezifität beidenselben 40 Brustgewebeproben ohne Sondenkontrolle betrug 100 % (91,2–100) aufBenchMark ULTRA-Instrumenten.Die erste Durchlaufrate des VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assays bei39 Magengewebeproben, die entsprechend den ASCO CAP-Richtlinien fixiert wurden(10%ige NBF über 6 bis 72 Stunden) betrug 97,4 % (86,8–99,5) auf BenchMark ULTRA-Instrumenten, 97,4% (86,8–99,5) auf BenchMark XT-Instrumenten und 100% (91–100)auf BenchMark GX-Instrumenten.Die analytische Empfindlichkeit und Spezifität wurden außerdem durch Färbung mehrererFälle von normalem und neoplastischem menschlichen Gewebeproben mit demVENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Assay, dem VENTANA Silver ISH DNPDetection Kit und dem VENTANA Red ISH DIG Detection Kit beurteilt. Die Ergebnissesind in Tabelle 21 und Tabelle 22 aufgeführt. Beim VENTANA HER2 Dual ISH DNA ProbeCocktail-Assay wurde keine unerwartete Färbung des normalen und neoplastischenGewebes beobachtet. * Die Anzahl der invasiven Brustkarzinome und Magen-Adenokarzinome beinhaltet die oben beschriebenen Studien.Tabelle 21. Die analytische Empfindlichkeit/Spezifität des VENTANA HER2 Dual ISHDNA Probe Cocktail-Assays wurde durch das Testen von normalen FFPE-Gewebeschnitten bestimmt.

Gewebe

Anzahlakzeptabler/aller Fälle Gewebe

Anzahlakzeptabler/aller Fälle

Nebenniere 3/3 Lunge 3/3

Blase 3/3 Lymphknoten 3/3

Knochenmark 3/3 Mesothel 3/3

Eierstock 3/3 Bauchspeicheldrüse 3/3

Brust 3/3 Nebenschilddrüse 3/3

Kleinhirn 3/3 Periphere Nerven 3/3

Großhirn 3/3 Prostata 3/3

Zervix 3/3 Skelettmuskulatur 3/3

Dickdarm 3/3 Haut 3/3

Endometrium 3/3 Milz 3/3

Speiseröhre 3/3 Magen 3/3

Herz 3/3 Hoden 3/3

Hypophyse 3/3 Thymus 3/3

2019-03-20 13 / 16 1018383DE Rev AFT0700-415j

Gewebe

Anzahlakzeptabler/aller Fälle Gewebe

Anzahlakzeptabler/aller Fälle

Darm 3/3 Schilddrüse 3/3

Niere 3/3 Zunge/Speicheldrüse 3/3

Leber 3/3 Mandeln 3/3

Tabelle 22. Die analytische Empfindlichkeit/Spezifität des VENTANA HER2 Dual ISHDNA Probe Cocktail-Assays wurde durch das Testen verschiedener neoplastischer FFPE-Gewebeschnitte bestimmt.

Pathologie

Anzahlakzeptabler/

aller Fälle

Glioblastom (Großhirn) 3/3

Meningeom (Großhirn) 1/1

Oligodendrogliom (Großhirn) 1/1

Endometriumkarzinom (Eierstock) 1/1

Adenokarzinom (Eierstock) 1/1

Neuroendokrines Neoplasma (Pankreas) 1/1

Adenokarzinom (Pankreas) 1/1

Seminom (Hoden) 1/1

Embryonalkarzinom (Hoden) 1/1

Medulläres Karzinom (Schilddrüse) 1/1

Papilläres Karzinom (Schilddrüse) 1/1

Duktales In-Situ-Karzinom (Brust) 1/1

Kleinzelliges Karzinom (Lunge) 1/1

Plattenepithelkarzinom (Lunge) 1/1

Adenokarzinom (Speiseröhre) 1/1

Plattenepithelkarzinom (Speiseröhre) 1/1

Adenokarzinom (Magen) 1/1

Adenokarzinom (gastroösophagealer Übergang) 1/1

Adenokarzinom (Dünndarm) 1/1

Gastrointestinaler Stromatumor (GIST) (Dünndarm) 1/1

Gastrointestinaler Stromatumor (GIST) (Dickdarm) 1/1

Adenokarzinom (Dickdarm) 1/1

Adenokarzinom (Rektum) 1/1

Gastrointestinaler Stromatumor (GIST) (Rektum) 1/1

Hepatoblastom (Leber) 1/1

Hepatozelluläres Karzinom (Leber) 1/1

Klarzellkarzinom (Niere) 1/1

Adenokarzinom (Prostata) 2/2

Leiomyom (Gebärmutter) 1/1

Pathologie

Anzahlakzeptabler/

aller Fälle

Endometrioides Adenokarzinom (Uterus) 1/1

Klarzelliges Karzinom (Gebärmutter) 1/1

Plattenepithelkarzinom (Zervix) 2/2

Embryonales Rhabdomyosarkom (quergestreifte Muskulatur) 1/1

Plattenepithelkarzinom (Haut) 1/1

Basaliom (Haut) 1/1

Neurofibrom (Lende) 1/1

Neuroblastom (Retroperitoneum) 1/1

Mesotheliom (Peritoneum) 1/1

B-Zellen-Lymphom, NNB (Lymphknoten) 2/2

Hodgkin-Lymphom (Lymphknoten) 3/3

Anaplastisches großzelliges Lymphom (Lymphknoten) 1/1

Leiomyosarkom (Blase) 1/1

Urothelialkarzinom (Blase) 1/1

Osteosarkom 1/1

Mesotheliom (Peritoneum) 1/1

Leiomyosarkom (glatte Muskulatur) 1/1

MÖGLICHE FEHLERURSACHEN UND IHRE BEHEBUNGTabelle 23. Lösungen zur Fehlersuche.

Problem Lösung

Fehlende oderschwacheSISH-Färbung

1. Vergewissern Sie sich, dass die Reagenzspenderordnungsgemäß funktionieren (d. h. nicht verstopft oderleer sind) und die Vorratslösungen aufgefüllt wurden.Die Aktivierungskammer oder den Meniskus desReagenzspenders auf Fremdkörper oder Partikel prüfen,wie z. B. Fasern oder Präzipitate. Einen verstopften Spendernicht verwenden; in diesem Fall den zuständigenKundendienstvertreter verständigen. Andernfalls denSpender reaktivieren, indem er über einen Abfallbehältergehalten, die Düsenkappe entfernt und von oben auf denSpender gedrückt wird. Bleibt die Färbung noch immer ausoder ist sie zu schwach, befolgen Sie Schritt 2.

2. Vergewissern Sie sich, dass Fixierungstyp und -dauer unddie Schnittdicke für ISH-basierte Assays geeignet sind.

3. Vergewissern Sie sich, dass ein SISH-kompatiblesEinbettmedium (siehe Tabelle 24) zur Konservierung desSISH-Signals verwendet wurde. Bleibt die Färbung nochimmer aus oder ist sie zu schwach, befolgen Sie Schritt 4.

4. Erhöhen Sie die CC1-Dauer auf > 16 Min.5. Erhöhen Sie die CC2-Dauer auf > 16 Min bei

Magenkarzinomen bzw. auf > 24 Min. bei Brustkarzinomen.6. Erhöhen Sie die ISH Protease 3-Dauer auf > 16 Min. bei

Magenkarzinomen bzw. > 20 Min. bei Brustkarzinomen,wenn die nukleäre Morphologie intakt ist.

2019-03-20 14 / 16 1018383DE Rev AFT0700-415j

Problem Lösung

Fehlende oderschwacheRot-Färbung

1. Vergewissern Sie sich, dass die Reagenzspenderordnungsgemäß funktionieren (d. h. nicht verstopft oder leersind) und die Vorratslösungen aufgefüllt wurden. Bleibt dieFärbung noch immer aus oder ist sie zu schwach, befolgenSie Schritt 2.

2. Vergewissern Sie sich, dass keine Xylol-Bäder zurDehydrierung von angefärbten Objektträgern verwendetwerden, da diese die Red-ISH-Signale beeinträchtigen.Bleibt die Färbung noch immer aus oder ist sie zu schwach,befolgen Sie Schritt 3.

3. Vergewissern Sie sich, dass Fixierungstyp und -dauer unddie Schnittdicke für ISH-basierte Assays geeignet sind.

4. Erhöhen Sie die CC1-Dauer auf > 16 Min.5. Erhöhen Sie die CC2-Dauer auf > 16 Min bei

Magenkarzinomen bzw. auf > 24 Min. bei Brustkarzinomen.6. Erhöhen Sie die ISH Protease 3-Dauer auf > 16 Min. bei

Magenkarzinomen bzw. > 20 Min. bei Brustkarzinomen,wenn die nukleäre Morphologie intakt ist.

UnspezifischerRed-ISH-Hintergrund

1. Vergewissern Sie sich, dass positiv geladene Objektträgerverwendet werden und dass die Gewebeprobe entsprechendden Vorgaben für ISH-basierte Assays fixiert undgeschnitten wurde.

2. Hebt sich der Red-ISH-Hintergrund vom spezifischen Red-ISH-Signal ab, zählen Sie den Objektträger aus, ohne dieunspezifischen Red-ISH-Signale zu zählen.

3. Beeinträchtigt der Red-ISH-Hintergrund im Zellkern dieAuszählung, wiederholen Sie die Färbung bei einerStringency-Wash-Temperatur von 76 °C oder 78 °C.Eine Verringerung der Protease-Inkubationszeit oderZellenaufbereitungszeit verringert ebenfalls roteHintergründe.

UnspezifischerSISH-Hintergrund

1. Vergewissern Sie sich, dass positiv geladene Objektträgerverwendet werden und dass die Gewebeprobe entsprechendden Vorgaben für ISH-basierte Assays fixiert undgeschnitten wurde.

2. Hebt sich der SISH-Hintergrund vom spezifischen SISH-Signal ab, zählen Sie den Objektträger aus, ohne dieunspezifischen Signale zu zählen.

3. Beeinträchtigt der SISH-Hintergrund im Zellkern dieAuszählung, wiederholen Sie die Färbung mit einerkürzeren Protease-Behandlung oder verringern Siedie Zellaufbereitungszeit.

Präzipitate 1. Beeinträchtigen Präzipitat-Artefakte die Auszählung,wiederholen Sie die Färbung. Hebt sich der SISH-Hintergrund vom spezifischen SISH-Signal ab, zählen Sieden Objektträger aus, ohne die unspezifischen Signale zuzählen.

2. Vergewissern Sie sich, dass die Barcode-Etiketten auf demObjektträger zentriert und ohne Überstand aufgebracht sind.Vermeiden Sie eine doppelte Etikettierung oder ein erneutesAnbringen der Barcode-Etiketten.

Bubbling Beeinträchtigt „nuclear Bubbling“ die Auszählung, vergewissernSie sich, dass die präanalytischen Verfahren und die Probendickeden Empfehlungen entsprechen.

Gewebe wirdvon denObjektträgerngewaschen.

Überprüfen, ob die verwendeten Objektträger positiv geladen sind.

Tabelle 24. Kompatibilität der Einbettmedien mit Assays die auf SISH basieren.

Einbettmedien HerstellerTyp (Xylol,Alkohol,wässrig)

Kompatibilitätmit SISH

Entellan Merck Xylol Nein

Entellan New Merck Xylol Nein

Eukitt EMS Xylol Nein

HSR Sysmex Xylol Nein

Malinol Muto Chemical Xylol Nein

Acrytol SurgiPath Xylol Ja

Alcolmount Diapath Alkohol Ja

BioMount 2 BBInternational Xylol Ja

Cytoseal 60 Richard Allan Scientific Xylol Ja

Diamount Diapath Xylol Ja

DPX BDH: Raymond Lamb Xylol Ja

FloTexx Lerner Labs Xylol Ja

Gel Mount Biomeda Wasserhaltig Ja

Histomount Raymond Lamb Xylol Ja

MicroMount SurgiPath Xylol Ja

MM24 SurgiPath Xylol Ja

Mountex Histolab Xylol Ja

MountQuick Daido Sangyo Co. Wasserhaltig Ja

Paramount Protaqs Quartett: Dako Xylol Ja

Permount Fisher Xylol Ja

Pertex Cell Path Xylol Ja

Shandon Consulmount

Thermo Scientific Xylol Ja

Softmount WAKO Lemasol A Ja

SureMount Triangle BiomedicalSciences

Xylol Ja

Thermo EZ Mount Thermo Scientific Xylol Ja

Ultramount Dako Xylol Ja

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Anhang A: VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-Auszählungsbogen

1. Fall-ID / Patienten-ID: 2. Ist dieser Fall auszählbar? 2a. Ja, weiter mit Nr. 3. 2b. Nein, Nr. 3 überspringen. Weiter mit Nr. 4.

3. Liegt Tumorheterogenität vor? 3a. Ja, Nr. 4 überspringen. Weiter mit Nr. 5. 3b. Nein, Nr. 4 überspringen Weiter mit Nr. 5.

4. Dieser Fall ist nichtauszählbar, weil (ALLESZutreffende markieren)

4a. Auf dem gefärbten ISH-Objektträger war kein Gewebemehr vorhanden.

4b. Auf dem gefärbten ISH-Objektträger war kein invasivesKarzinom im Gewebevorhanden.

4c. Die nukleäre Morphologie istinakzeptabel; Unterscheidung derstrukturellen Gewebeelemente vonnormalen Zellen und Zielkarzinomzellennicht möglich.

4d. Hintergrundfärbung inakzeptabel;Auswertung des ISH-Objektträgersbeeinträchtigt

HER2 Chr 174e. Signal der internenPositivkontrolle nicht detektierbar

HER2 Chr 17

4f. ISH-Färbung der Zielzellenschwach/nicht vorhanden; nichtauswertbar

HER2 Chr 17

4g. Sonstiges (bitte erläutern):

5. Auszählung Zielbereich 1: HER2-Signal und Chr17-Signal in allen 20 Zellkernen zählen. Gezählte HER2-Signale addieren. Gezählte Chr17-Signale addieren. Verhältnis des Genstatus durchDivision der GESAMTZAHL der HER2-Signale durch die GESAMTZAHL der Chr17-Signale ermitteln. Auf erste Dezimalstelle aufrunden. Dokumentieren, ob Signal-Cluster gezählt wurden.

SIGNALZÄHLUNG ZIELBEREICH 1–20 ZELLKERNE5a 5b 5c 5d 5e 5f 5g 5h 5i 5j 5k 5l 5m 5n 5o 5p 5q 5r 5s 5t 5u 5v 5w 5x Kommentare

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GESAMT VERHÄLTNIS Liegen Clustervor?

HER2 Ja NeinChr17 Ja Nein

6. Ergebnis aus 20 Zellkernen: 6a. Nicht amplifiziert: HER2/Chr17 < 2,0 oder 6b. Amplifiziert: HER2/Chr17 ≥ 2,0Bei einem HER2/Chr17-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2 sollten weitere 20 Zellkerne ausgezählt werden.

7. Auszählung Zielbereich 2: HER2-Signal und Chr17-Signal in allen 20 Zellkernen zählen. Gezählte HER2-Signale addieren. Gezählte Chr17-Signale addieren. Dokumentieren, ob Signal-Clustergezählt wurden.

. SIGNALZÄHLUNG ZIELBEREICH 2–WEITERE 20 ZELLKERNE (falls Verhältnis von Zielbereich 1 zwischen 1,8 und 2,2 liegt)7a 7b 7c 7d 7e 7f 7g 7h 7i 7j 7k 7l 7m 7n 7o 7p 7q 7r 7s 7t 7u 8w 8x Kommentare

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 GESAMT Liegen Clustervor?

HER2 Ja NeinChr17 Ja Nein

8. Ergebnis aus allen 40 Zellkernen:8a. HER2 Zielbereich 1 __________ + HER2 Zielbereich 2 __________ = Gesamt-HER2 _________ 8c. Verhältnis: Gesamt-Her2/Gesamt-Chr17 (aus Feld 5u) (aus Feld 7u)

8b. Chr17 Zielbereich 1 __________ + Chr17 Zielbereich 2 ___________ = Gesamt-Chr17 _________ ______________ (aus Feld 5u) (aus Feld 7u)

8d. Endgültiges Ergebnis aus 40 Zellkernen: Nicht amplifiziert: HER2/Chr17 < 2,0 oder Amplifiziert: HER2/Chr ≥ 2,0

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VENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail · 2019-03-20 2 / 16 1018383DE Rev A FT0700-415j IM...

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