Veränderung der Mikrozirkulation nach experimenteller ... · Die SAB kann spontaner oder...

Aus dem Institut für Chirurgische Forschung der Ludwig-Maximilians-Universität

München

Vorstand: Prof. Dr. med. Ulrich Pohl

Dissertation

"Veränderung der Mikrozirkulation nach experimentel ler

Subarachnoidalblutung (SAB): Kinetik, Bedeutung und

Identifikation von Mechanismen"

Zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie an der Medizinischen Fakultät der

Ludwig-Maximilians-Universität zu München

Vorgelegt von

Diplom Biochemiker Herrn Ari Christian da Fonseca Dienel

aus

Portimão/Portugal

Jahr

2016

Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät

der Universität München

Berichterstatter: Prof. Dr. med. Nikolaus Plesnila

Mitberichterstatter:

Prof. Dr. med. Andrej Khandoga Prof. Dr. med. Frank Christ

Mitbetreuung durch den promovierten Mitarbeiter:

PD. Dr. med. Karsten Schöller Dr. med. Nicole Terpolilli

Dekan: Tag der mündlichen Prüfung:

Prof. Dr. med. dent. Reinhard Hickel 13.09.2016

III

Inhaltsverzeichnis

Inhalt

Inhaltsverzeichnis ................................ ................................................................... III

Abkürzungsverzeichnis ............................. ............................................................ VII

1. Einleitung ..................................... ....................................................................... 10

1.1 Epidemiologie und Ätiologie ................................................................................................... 11

1.1.1 Aneurysmata ..................................................................................................................... 13

1.2 Klinische Beurteilung der SAB ............................................................................................... 15

1.2.1 Klinische Symptomatik ..................................................................................................... 15

1.2.2 Skalen zur Schweregradeinteilung ................................................................................ 15

1.2.3 Diagnose der Subarachnoidalblutung ........................................................................... 18

1.2.4 Therapie der Subarachnoidalblutung ............................................................................ 19

1.3 Pathophysiologie des Hirnschadens nach Subarachnoidalblutung ................................. 20

1.3.1 Frühe- und verzögerte Hirnschädigung ......................................................................... 22

1.3.1.1 Verzögerter Vasospasmus ........................................................................................... 25

1.3.1.2 Vasospasmen in der zerebralen Mikrozirkulation..................................................... 26

1.4 Stickstoffmonoxid (NO) ........................................................................................................... 27

1.4.1 Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) ................................................................................. 29

1.5 NO im Gehirn ............................................................................................................................ 31

1.5.1 NO in der frühen Hirnschädigung nach SAB ................................................................ 32

1.5.2 NO-Donatoren ................................................................................................................... 33

1.5.3 Inhaliertes NO ................................................................................................................... 34

1.5.4 Rolle des NOs in der zerebralen Autoregulation ......................................................... 35

1.6 Rolle von Endothelin und Endothelin-Rezeptoren nach SAB ........................................... 36

1.7 Ziel der Arbeit ........................................................................................................................... 39

2. Material & Methoden............................. .............................................................. 40

2.1 Material ...................................................................................................................................... 40

2.1.1 Geräte ................................................................................................................................. 40

2.1.2 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................................... 42

2.1.3 Inhalationsgase ................................................................................................................. 43

2.1.4 Chemikalien ....................................................................................................................... 43

IV

2.1.5 Intravitalmikroskop-Ausstattung ..................................................................................... 44

2.1.6 Software ............................................................................................................................. 45

2.1.7 Versuchstiere..................................................................................................................... 46

2.2 Methoden .................................................................................................................................. 48

2.2.1 Anästhesie und Antagonisierung.................................................................................... 48

2.2.2 Mechanische Beatmung .................................................................................................. 49

2.2.3 Regelung der Körpertemperatur ..................................................................................... 50

2.2.4 Messung des intrakraniellen Drucks (ICP) ................................................................... 50

2.2.5 Messung der zerebralen Durchblutung (CBF) ............................................................. 50

2.2.6 Induktion einer Subarachnoidalblutung (SAB) ............................................................. 51

2.2.7 Jugularis-Katheter ............................................................................................................. 52

2.2.8 Quantifizierung der Mikrozirkulation .............................................................................. 52

2.2.8.1 Analyse des zerebralen Gefäßbaums anhand des Strahler-Schemas ................. 52

2.2.8.2 Quantifizierung von Gefäßdurchmesser und Mikrovasospasmus ......................... 53

2.2.9 Intravitalmikroskopie ......................................................................................................... 54

2.2.9.1 Venöse und arterielle Katheterisierung der Maus .................................................... 54

2.2.9.2 Kranielles Fenster ......................................................................................................... 55

2.2.9.3 Intravitalmikroskopie zerebraler Mikrogefäße ........................................................... 56

2.2.10 Inhalation ......................................................................................................................... 56

2.2.10.1 Stickstoffmonoxid-Inhalation (iNO) ........................................................................... 56

2.2.10.2 Kohlendioxid-Inhalation .............................................................................................. 56

2.2.11 Anwendung von Clazosentan ....................................................................................... 56

2.2.12 Versuchsprotokolle ......................................................................................................... 58

2.2.12.1 Stickstoffmonoxid-Inhalation (iNO) ........................................................................... 58

2.2.12.2 Hemmung von Endothelin-1-Rezeptoren mit Clazosentan .................................. 59

2.2.12.2.1 Dosisfindung von Clazosentan .............................................................................. 59

2.2.12.2.2 Gabe von Clazosentan nach SAB ......................................................................... 60

2.2.12.3 Untersuchung der Rolle der NOS-Isoformen bei Vermittlung der CO2-Reaktivität zerebraler Gefäße....................................................................................................................... 61

3. Ergebnisse ..................................... ..................................................................... 62

3.1 Effekt von inhaliertem NO (iNO) auf die zerebrale Mikrozirkulation nach experimenteller Subarachnoidalblutung ...................................................................................... 62

3.1.1 Induktion der SAB ............................................................................................................. 62

V

3.1.2 Einfluss des inhalierten Stickstoffmonoxids auf die zerebrale Mikrozirkulation nach SAB ............................................................................................................................................... 63

3.1.2.1 Systemischer arterieller Blutdruck .............................................................................. 63

3.1.2.2 Physiologische Parameter ........................................................................................... 64

3.1.3 Einfluss von NO auf die arteriellen Gefäßdurchmesser ............................................. 64

3.1.4 Einfluss der NO-Inhalation auf die zerebralen Mikrovasospasmen .......................... 66

3.1.5 Räumliche Verteilung der Mikrovasospasmen ............................................................. 68

3.1.6 Effekt der NO-Inhalation auf den Grad der Mikrovasospasmen ............................... 70

3.1.7 Einfluss der NO-Inhalation auf Durchmesser zerebraler Venolen ............................ 72

3.2 Effekt der Endothelin-Rezeptor-Blockade auf die zerebrale Mikrozirkulation nach experimenteller Subarachnoidalblutung ...................................................................................... 72

3.2.1 Dosisfindung Clazosentan ............................................................................................... 72

3.2.2 Einfluss der ET1-Rezeptor-Blockade auf die zerebrale Mikrozirkulation ................. 74

3.2.2.1 MAP ................................................................................................................................. 74

3.2.2.2 Blut-Gas-Analyse ........................................................................................................... 74

3.2.2.3 Einfluss von 10 mg/kg KG/h Clazosentan auf den Durchmesser von zerebralen Arteriolen (9,5-55 µm) ................................................................................................................ 75

3.2.2.4 Effekt der ET1-Rezeptorblockade auf die posthämorrhagischen Mikro-vasospasmen .............................................................................................................................. 76

3.2.2.5 Effekt der ET1-Rezeptorblockade auf die Anzahl und den Konstriktionsgrad der Mikrovasospasmen..................................................................................................................... 78

3.3 Rolle der NO-Synthasen bei der CO2-induzierten Vasodilatation zerebraler Gefäße ... 80

3.3.1 Physiologische Parameter ............................................................................................... 80

3.3.2 Einfluss der NOS-Isoformen auf die CO2-Gefäßreaktivität ........................................ 80

3.3.3 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie - Wildtyp-Mäusen .............................. 82

3.3.4 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie – iNOS-defiziente Mäuse ................. 83

3.3.5 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie – nNOS-defiziente Mäuse ................ 84

3.3.6 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie – eNOS-defiziente Mäuse ................ 85

3.3.7 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie der NOS-Isoformen in kleinen Arteriolen ...................................................................................................................................... 86

3.3.8 Mögliche Rolle der NOS bei der Formation von Mikrovasospasmen ....................... 86

4. Diskussion ..................................... ..................................................................... 89

4.1 Diskussion der Methoden ....................................................................................................... 89

4.1.1 Auswahl der Versuchstiere ............................................................................................. 89

4.1.2 Anästhesie ......................................................................................................................... 90

VI

4.1.3 Beatmung der Versuchstiere .......................................................................................... 91

4.1.4 Messung der zerebralen Durchblutung ......................................................................... 91

4.1.5 Wahl des SAB-Modells .................................................................................................... 92

4.1.6 Intravitalmikroskopie ......................................................................................................... 93

4.2. Diskussion der Ergebnisse .................................................................................................... 94

4.2.1 Hämodynamische Veränderungen nach SAB .............................................................. 94

4.2.2 Effekt von iNO und den Endothelin-Rezeptor-Blocker auf den systemischen Blutdruck nach SAB ................................................................................................................... 95

4.2.3 Veränderung der zerebralen Mikrozirkulation nach SAB ........................................... 96

4.2.3.1 Mikrovasospasmen ....................................................................................................... 96

4.2.3.2 Effekt von iNO ................................................................................................................ 97

4.2.3.3 Effekt der ET-1-Rezeptorblockade ............................................................................. 98

4.2.4 Rolle der NOS-Isoformen in der zerebralen Mikrozirkulation nach SAB ................. 99

5. Zusammenfassung ................................ ........................................................... 101

6. Literaturverzeichnis ........................... .............................................................. 102

A. Danksagung ..................................... ................................................................ 142

B. Lebenslauf ..................................... ................................................................... 143

VII

Abkürzungsverzeichnis

AA

ADMA

ATP

aSAB

AU

BH4

BBB

CA

CBF

CCT

CONSCIOUS

CT

cGMP

CI

CO2

CPP

CSF

CTA

CVS

CWp

DCI

DBI

DIND

DSA

EBI

EDRF

Arachidonsäure

Asymmetrisches Dimethylarginin

Adenosintriphosphat

Aneurysmatische Subarachnoidalblutung

Arbitrary Units, Perfusionseinheiten

Tetrahydrobiopterin

Blood Brain Barrier, Blut-Hirn-Schranke

Cerebral Autoregulation, Zerebrale Autoregulation

Cerebral Blood Flow, Zerebrale Durchblutung

Craniale Computertomographie

Clazosentan to Overcome Neurological Ischemia and Infarct

Occurring after Subarachnoid Hemorrhage

Computertomographie

Cyclic Guanosin Monophosphat, Zyklisches Guanosin-

Monophosphat

Confidence Interval, Konfidenzintervall

Kohlenstoffdioxid

Cerebral Perfusion Pressure, Zerebraler Perfusionsdruck

Cerebral Spinal Fluid, Liquor Zerebrospinalis

Computertomographische Angiographie

Cerebral Vasospasms, Zerebrale Vasospasmen

Circle Wilisii Perforation

Delayed Cerebral Ischämie, Verzögerte Zerebrale Ischämie

Delayed Brain Injury, Verzögerte Hirnverletzung

Delayed Ischemic Neurological Deficit, Verzögert Auftretendes

Ischämisches Neurologisches Defizit

Digitale Subtraktionsangiographie

Early Brain Injury, Frühe Hirnverletzung

Endothelium Derived Relaxing Factor

VIII

EEG

eNOS

ET

ETA

EtCO2

FITC

GCS

GMP

GSNO

GTN

GTP

ICP

iNO

iNOS

IVM

ISAT

LDF

LP

MAP

MCA

MMF

MMP

MRT

MVS

MW

n

NADPH

NAPSAH

7-NI

nNOS

NO

NOD

Elektroenzephalographie

Endotheliale NO-Synthase

Endothelin

Endothelin-Rezeptor-Antagonist

Endexpiratorisches (end tidal-) Kohlendioxid

Fluoresceinisothiocyanate

Gasgow Coma Scale

Guanosinmonophosphat

S-Nitrosoglutathion

Glyceryl Trinitrate (Nitroglycerin), Nitroglyzerin

Guanosintriphosphat

Intra Cranial Pressure, Intrakranieller Druck

Inhaliertes Stickstoffmonoxid

Induzierbare NO-Synthase

Intravitalmikroskopie

International Subarachnoid Aneurysma Trial

Laser-Doppler-Fluxmetrie

Lumbalpunktion

Middle Arterial Pressure, Mittlerer Arterieller Druck

Middle Cerebral Arterie, Arteria Cerebri Media

Medetomidin-Midazolam-Fentanyl

Matrix-Matalloprotease

Magnetische Resonanz Tomographie

Mikrovasospasmen

Mittelwert

Anzahl

Reduzierte Form des Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

Non Aneurysmal Perimensephalic SAH, Nicht Aneurysmatische

Perimensephalische SAB

7-Nitroindazol

neuronale NO-Synthase

Stickstoffmonoxid

NO-Donator

IX

NOS

ONOO-

O2

O2-

p

PAASH

PARP

PDE

pETCO2

pH

PKC

ppm

ROI

ROS

SAB

SEM

sGC

SMTC

SNP

TCD

VEGF

WFNS

Stickstoff-Monoxid-Synthase

Peroxinitrit

Sauerstoff

Superoxid-Anion

Value of Probability, Signifikanzwert

Prognosis on Admission of Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage

Scale

Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase

Phosphodiesterase

Endtidaler Kohlenstoffdioxid-Partialldruck

pH-Wert

Protein-Kinase-C

part per million

Region of Interest

Reactive Oxygen Species, Reaktive-Sauerstoff-Spezies

Subarachnoidalbutung

Standardfehler des Mittelwerts

Soluble Guanylat Cyclase, Löslische Guanylatcyklase

S-Methyl-L-Thiocitrullin

Sodium Nitroprusside, Natriumnitroprussid

Transkranielle Dopplersonographie

Vascular Endothelial Growth Factor ,Vaskulärer Endothelialer

Wachstumsfaktor

World Federation Neurological Surgeons

1. Einleitung

1. Einleitung

Die World Health Organisation (WHO) definiert den Schlaganfall als ein

Krankheitsbild, bei dem sich die klinischen Zeichen einer fokalen oder globalen

Störung zerebraler Funktionen rasch bemerkbar machen, mindestens 24 Stunden

anhalten oder zum Tode führen und offensichtlich nicht auf andere als vaskuläre

Ursachen zurückgeführt werden können.1 Demnach setzen akute fokale (oder globale)

neurologische Defizite ein aufgrund einer umschriebenen (oder globalen) Durchblu-

tungsstörung im Gehirn. Eine Durchblutungsstörung kann sowohl durch einen

Durchblutungsmangel oder eine Blutung hervorgerufen werden. Globale Hirndurchblu-

tungsstörung treten z. B. im Rahmen eines Herzstillstandes oder eines „Beinahe-

Ertrinkens“ auf. Generell unterscheidet man zwischen ischämischen Schlaganfällen,

spontanen intrazerebralen Hämatomen, Subarachnoidalblutungen sowie Hirnvenen-

und Sinusvenenthrombosen.2 Die Subarachnoidalblutung (SAB) ist ein relativ seltener

Subtyp des Schlaganfalls, der dadurch gekennzeichnet ist, dass Blut in den mit Hirn-

flüssigkeit (Liquor cerebrospinalis) gefüllten Subarachnoidalraum gelangt. Diese

Blutung wird häufig durch eine Aneurysmaruptur hervorgerufen.3,4 Der Subarach-

noidalraum wird begrenzt durch die Spinnenhaut (Arachnoidea mater) und die innere

Hirnhaut (Pia Mater), die das Hirnparenchym direkt bedeckt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Schädel s mit den entsprechenden Regionen die

nach SAB beeinträchtigt sind.

1. Einleitung

11

Die SAB kann spontaner oder traumatischer Natur sein.3,5 Die spontan auftretende

SAB macht etwa 5 % aller Schlaganfälle aus und wird zu 80-85% durch die Ruptur

eines intrakraniellen Aneurysmas hervorgerufen.3,5,6,6-8 Aufgrund deutlicher Verbesse-

rungen der mikrochirurgischen- und radiologisch-interventionellen Therapie-Verfahren

in den letzten Jahrzehnten, und der spezialisierten neurointensiv-medizinischen

Behandlung der aneurysmatischen Subarachnoidalblutung (aSAB), ist die Mortalitäts-

rate nach SAB zwar aktuell rückläufig,9-11 das Krankheitsbild hat jedoch noch immer

eine hohe Morbidität und Mortalität.4

1.1 Epidemiologie und Ätiologie

In den Vereinigten Staaten von Amerika sind Schlaganfälle die dritthäufigsten

Todesursachen. Jährlich erleiden circa 795.000 Menschen einen Schlaganfall, davon

610.000 erstmalig.12 In circa 5% der Fälle handelt es sich um eine Subarachnoidal-

blutung.3 Diese weist die schlechteste Prognose aller Schlaganfälle auf, sowohl was

das Überleben als auch die neurologischen Funktionsausfälle betrifft. Im europäischen

Raum ist eine ähnliche Inzidenz (7 bis 10 Fälle pro 100.000 Personen) wie in

Nordamerika zu finden.3,13-15 Die höchste Inzidenz wird jedoch für Finnland und Japan

dokumentiert, 20-30 Fälle pro 100.000 Personen jährlich.16-19 Auch Alter und

Geschlecht beeinflussen die Inzidenz der SAB. In der Altersgruppe von 25-45 Jahren

weisen vor allem Männer eine erhöhte SAB-Inzidenz auf, während in der Altersgruppe

von 55 bis 85 Jahren, die SAB-Inzidenz bei Frauen deutlich höher ist.3,15,20

1. Einleitung

12

Tabelle 1: SAB-Inzidenz: Alter und Relation weiblic h zu männlich (nach N.K de Rooij et al., J Neurol.

Neurosurg. Psychiatry, 2007).

Die Prävalenz intrakranieller Aneurysmen wird mit ca. 2% angegeben.21,22 Bei bis zu

ein Drittel der SAB-Patienten ist von multiplen Aneurysmen auszugehen.23 In der

Gruppe der spontan verlaufenden SAB’s, die vor allem durch Ruptur von Aneurysmen

charakterisiert werden, machen nicht-aneurysmatische SAB‘s ca. 10% aus.24 Zu

dieser SAB-Art gehören z.B. die perimensephalen SAB‘s (NAPSAH), die keine

erkennbaren Blutungsquellen aufweisen und eine gute Prognose haben.25,26 Die

Mortalität der Subarachnoidalblutung ist hoch und wird in den ersten sechs Monaten

mit 50 bis 60% angegeben.15 Ein Drittel der Todesfälle ereignet sich innerhalb der

ersten 30 Tage nach Blutung.27 12-15% der aSAB-Erkrankten sterben bevor eine

klinische Versorgung möglich ist.6,28,29 Ca. 50-60% der Überlebenden haben schwere

neurologische Ausfälle und benötigen lebenslang Betreuung.30,31 Selbst Patienten mit

einem guten neurologischen Outcome (Selbstversorger) haben häufig neurokognitive

und psychosoziale Einschränkungen.32-34 Ein Überblick über Schwere und Dramatik

des Krankheitsverlaufs siehe Tabelle 2.6,30,31,35

1. Einleitung

13

Tabelle 2: Mortalität und Morbidität der SAB im Spo ntanverlauf (nach Bederson et al., Stroke,

2000; Hop et al., Stroke, 1998; Huang et al., Neurosurgery, 2002 und van Gijn et al., Lancet, 2007 )

Risikofaktoren die zu einer aneurysmatischen Subarachnoidalblutung beitragen

können sind arterielle Hypertonie, Hyperlipidämie, Zigarettenkonsum (Nikotinabusus),

Kokain-Missbrauch, exzessiver Alkoholkonsum und einige angeborene Bindegewebe-

störungen, wie z.B. das Ehlers-Danlos-Syndrom, das Marfan-Syndrom, Osteogenesis

imperfecta und Pseudoxanthoma elasticum.36-40 Einige Patienten weisen eine familiäre

Prädisposition für Aneurysmata und Subarachnoidalblutungen auf,41 dabei sind

Frauen vier Mal häufiger betroffen als Männer.42-44 Die Familienanamnese der

polyzystischen Nierenerkrankung22 und Hypertension36,45 scheinen u.a. das Risiko

einer SAB zu erhöhen. 5-20% der SAB-Patienten weisen eine positive Familien-

anamnese auf.46

1.1.1 Aneurysmata

Bei Aneurysmata handelt es sich um Aussackungen von Gefäßabschnitten, meist von

Arterien; sie sind spindel- oder sackförmig und entstehen infolge angeborener oder

erworbener Gefäßwandveränderungen. Aneurysmata sind wahrscheinlich das Ergeb-

nis einer Kombination von genetischen, hämodynamischen, oder durch Nikotin- oder

1. Einleitung

14

Alkoholmissbrauch induzierten Strukturfehler, die zu einer Abnahme der mittleren

Muskelschicht und der Tunica media, der Arterienwand, führen. Außerdem können

chronische hämodynamische induzierte intravaskuläre Schubspannungen für die

Bildung von aneurysmatischen Ausstülpungen in den Subarachnoidalraum

verantwortlich sein.37,47,48 Auch die Rolle von oxidativen Stress bei der Bildung und

Ruptur von Aneurysmata ist nicht zu unterschätzen.49 Aneurysmata entwickeln sich

meist in Gefäßgabelungen großer Gefäße, da turbulente Strömungen sich dort

bevorzugt entwickeln. Am häufigsten sind intrakranielle Aneurysmata an der A.

communicans anterior und der A. cerebri anterior lokalisiert (40%), gefolgt von der A.

carotis interna (30%, hauptsächlich am intraduralen supraklinoidal gelegenen Anteil).

In 20% der Fälle befinden sie sich an der A. cerebri media (MCA), d.h., dass sich die

überwiegende Mehrzahl von Aneurysmata (80-90%) im vorderen Teil der basalen

Hirnarterien befindet.21 Die restlichen 10-20% sind im hinteren Abschnitt des Circulus

arteriosus Willisii, bestehend aus A. basilaris und A. vertebralis, gelegen.50,51 Selten

werden intrazerebrale Aneurysmata durch Infektionen (sog. mykotische Aneurysmata)

oder traumatische Gefäßwandschädigung verursacht. Mit dem Anstieg der Größe des

Aneurysmas wird die Wandspannung erhöht, wodurch das Aneurysma zunehmend

anfällig für eine Ruptur wird. Nach dem Laplace’schen Gesetz verändert sich die

Wandspannung proportional zu der vierten Potenz des Aneurysmaradius, und dieser

ändert sich wiederum proportional zum arteriellen Druck. Deswegen erhöht sich das

Rupturrisiko durch Zunahme der Aneurysma-Größe drastisch.

Th = Pt x r i/h (N/m 2)

(Th = über die Gefäßwanddicke integrierte Wandspannung ; Pt = transmuraler Druck; r i =

Innenradius des Gefäßlumens; h = Wanddicke des Gefä ßes)

Als „kritischer Durchmesser“ gelten 4-10 mm.52-63 Zufällig diagnostizierte Aneurys-

mata über diese Größe sollten deswegen therapiert werden.63 Aneurysmata können

Durchmesser von mehr als 2,5 cm erreichen (Riesen- oder Giant- Aneurysma).64

1. Einleitung

15

1.2 Klinische Beurteilung der SAB

1.2.1 Klinische Symptomatik

Das Hauptsymptom der Subarachnoidalblutung ist der akute, schlagartig einsetzende

und sehr starke „Vernichtungs-Kopfschmerz“8,65 der bei ca. 80% der SAB-Patienten

beschrieben wird66 und der maximal innerhalb von einer Minute nach Blutungsbeginn

auftritt.67 Je nach Intensität und Lokalisation der Blutung können diese Kopfschmerzen

von Übelkeit, Erbrechen, Nackensteifigkeit und einer Bewusstseinseintrübung bis zum

Koma begleitet sein.6 Jeder zweite SAB-Patient leidet unter Hirnhautreizung (Menin-

gismus), in bestimmten Fällen aber ist der Meningismus um einige Stunden verzögert.

Die Meningen werden dann durch Blutabbauprodukte gereizt.48 In 25% der SAB-Fälle

treten subhyaloidale Glaskörperblutungen, das Terson-Syndrome, auf.68,69 Fokale

neurologische Defizite in der Initialphase oder epileptische Anfälle sprechen für ein

intrazerebrales Hämatom.70 Bei 10–30% der Patienten tritt als initiale Symptomatik

eine mildere Form des akuten Kopfschmerzes auf, die differentialdiagnostisch als

Migräne, akutes Zervikalsyndrom, hypertensive Krise oder Meningitis fehlinterpretiert

werden kann. Diese als „warning headache“ beschriebene Symptomatik kann bis zu

drei Wochen vor dem eigentlichen Blutungsereignis auftreten. Ursache ist meist eine

gedeckte Blutung aus dem später rupturierten Aneurysma.71-74

1.2.2 Skalen zur Schweregradeinteilung

Vigilanz/Grad der Bewusstlosigkeit, Alter und Blutvolumen in der initialen kranialen

Computertomographie (CCT) sind die Faktoren, die nach bisherigen Erkenntnissen

den größten Einfluss auf das Outcome von Patienten haben.75-77 Eine Vielzahl von

Skalen zur Graduierung der SAB wurden entwickelt.77 Im Jahr 1968 erschien die

Einteilung von Hunt und Hess, die eine modifizierte Form des 1956 entwickelten

Systems von Botterell darstellt.78 Ein Vorteil dieser Graduierung ist, dass sie weit

verbreitet und außerdem sehr einfach anzuwenden ist.79 Anhand der Hunt und Hess

Einteilung kann das operative Risiko in Bezug auf den Zustand des Patienten zum

Zeitpunkt der Operation abgeschätzt werden.80 Der Nachteil ist, dass sie eine

schwache Inter-Beobachter-Variabilität aufweist. Im Vergleich weisen Graduierungs-

skalen wie die WFNS (World Federation of Neurological Surgeons) und die PAASH

1. Einleitung

16

(Prognosis on Admission of Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage) eine starke Inter-

Beobachter-Variabilität auf.81 Im Jahr 1974 beschrieben Teasdale und Jennett die

Glasgow Coma Scale (GCS), ein Bewertungssystem zum Einschätzen einer

Bewusstseinsstörung, die ursprünglich bei traumatischen Kopfverletzungen zum

Einsatz kam und erst sekundär für die Beurteilung von Patienten nach Subarachnoidal-

blutung verwendet wurde.82 Im Gegensatz zu der Einteilung nach Hunt und Hess, wird

jede Rubrik einzeln graduiert. Es gibt drei verschiedene Rubriken, in die der Behandler

die Patienten einstuft, um dann am Ende die Punkte zu addieren.81 Es hat sich jedoch

als nachteilig erwiesen, dass die verbale Reaktion des Patienten so stark in das

Ergebnis einfließt, da Patienten mit Subarachnoidalblutung oft intubiert und so in ihrer

verbalen Kommunikation eingeschränkt sind.79 Im Jahr 1988 wurde unter dem Vorsitz

von Charles Drake die World Federation of Neurological Surgeons (WFNS) Scale

definiert. Es ist eine Fünf-Grad-Einteilung die an der Glasgow Coma Scale angelehnt

ist und beinhaltet zusätzlich das Vorhandensein eines fokalen neurologischen

Defizites.79,83 Die Prognosis on Admission of Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage

(PAASH) ist eine andere Fünf-Grad-Einteilugsskala die ausschließlich in Anlehnung

zur GCS entwickelt wurde.84 WFNS und PAASH verfügen über einen guten

prognostischen Wert im Hinblick auf Patienten Outcome, wirken übereinstimmend bei

der Beurteilung des überlappenden CI (Konfidenzintervall) und weisen eine ähnliche

Inter-Beobachter-Zuverlässigkeit auf. Trotzdem ist die PAASH-Skala leichter

anwendbar und zuverlässiger bei der Beurteilung eines schlechten Outcomes bei

SAB-Patienten als WFNS. Deswegen ist PAASH die geeignetste Skala für Beurteilung

eines klinischen Zustandes eines SAB-Patienten.81,85

1. Einleitung

17

Tabelle 3: Klinische Schweregradeinteilung nach HUN T und HESS, World Federation of

Neurological Surgeons (WFNS) und Prognosis on Admission of Aneurysmal Subarachnoid

Hemorrhage Scale (PAASH) (nach Degen et al., Stroke, 2011).

Wie in Tabelle 4 dargestellt, erlaubt die Einteilung nach Fisher (1980) eine

Klassifizierung in vier Gruppen anhand der computertomografischen Morphologie der

Subarachnoidalblutung.86 Die Graduierung erfolgt nach Menge an Blut im initialen

CCT. Diese Klassifizierung ist leicht anzuwenden und soll mit dem Vorkommen von

verzögertem Vasospasmus korrelieren.87,88

Tabelle 4: Klassifikation des Ausmaßes der Subarach noidalblutung in der Computertomo-

graphie (nach Fisher, Neurosurgery, 1980)

1. Einleitung

18

1.2.3 Diagnose der Subarachnoidalblutung

Bei klinischem Verdacht auf eine SAB wird meist eine kraniale Computertomografie

veranlasst, in der das subarachnoidale Blut hyperdens zur Darstellung kommt (Abbil-

dung 2) und die Blutung bewiesen werden kann.

Abbildung 2: Die native CCT zeigt eine ausgedehnte basal betonte SAB Fisher° III

Darüber hinaus lassen sich in der CCT eine intraparenchymatöse Blutungskom-

ponente oder ein Liquoraufstau erkennen. In vielen Fällen gibt bereits die Blut-

verteilung in der nativen CCT Hinweise auf die Lokalisation der Blutungsquelle. In der

akuten Phase ist die Magnetresonanztomografie (MRT) unter Verwendung geeigneter

Sequenzen zum Nachweis einer SAB genauso geeignet wie die CCT. Mit

zunehmender zeitlicher Latenz zum Blutungsereignis nimmt die Dichte der Blutung in

der CCT ab, dann ist die MRT der CCT zum Nachweis hämorrhagischer Residuen

sogar deutlich überlegen.89 Bei fehlendem Blutnachweis in der Bildgebung sollte etwa

sechs bis zwölf Stunden nach Einsetzen des Kopfschmerzes eine Lumbalpunktion

(LP) durchgeführt werden, bei der nicht der Nachweis des Blutes selbst, sondern ein

xanthochromer Überstand nach Zentrifugation als sicherster Nachweis einer SAB

gilt.6,90 Da das Timing der LP in Bezug auf den Beginn der SAB die Ergebnisse der

Analyse beeinflussen kann, werden ein paar Methoden zur Unterscheidung von

traumatischer und aneurysmatischer SAB vorgeschlagen wie z.B. den "drei

Röhrchentest", den Öffnungsdruck, und die visuelle Inspektion der Xanthochromie.91,92

Wird bildgebend, oder in der Liquordiagnostik eine Subarachnoidalblutung diagnosti-

ziert, muss die Blutungsquelle identifiziert werden; Mittel der Wahl bzw. Goldstandard

1. Einleitung

19

ist hierbei die digitale Subtraktionsangiografie (DSA). Sie liefert neben der

Aneurysmalokalisation wichtige Informationen bezüglich der Aneurysmakonfiguration

und der Lagebeziehung zu angrenzenden Gefäßen, welche die Auswahl des

therapeutischen Verfahrens zur Aneurysmaausschaltung entscheidend beeinflussen.

Die CT-Angiografie (CTA) ist mittlerweile in der Detektion von Blutungsquellen ähnlich

sensitiv und spezifisch wie die konventionelle Angiografie und aufgrund ihrer höheren

Verfügbarkeit sowie der nicht-invasiven und schnellen Anwendung sehr nützlich. Sie

ist jedoch bei der Darstellung kleiner Aneurysmen (< 3 mm) der DSA unterlegen.93,94

Lässt sich angiografisch keine Blutungsquelle nachweisen, sollte die Untersuchung ein

bis zwei Wochen nach dem Blutungsereignis wiederholt werden. Bei erneut fehlendem

Nachweis einer Blutungsquelle sollte dann eine MRT von Schädel und Halswirbelsäule

mit der Frage nach einem (teil-)thrombosiertem Aneurysma oder einer spinalen

Blutungsursache erfolgen.

1.2.4 Therapie der Subarachnoidalblutung

SAB-Patienten sollten in spezialisierten Zentren, die sowohl in Bezug auf die

intensivmedizinische Versorgung als auch auf die operative oder interventionelle

Ausschaltung der Blutungsquelle große Erfahrung haben, behandelt werden bzw.

verlegt werden, wenn der Allgemeinzustand es zulässt.15,66,95 Alle Patienten mit

gesicherter SAB müssen intensivmedizinisch betreut werden.15,96 Das Hauptrisiko in

der Frühphase der Subarachnoidalblutung ist die Nachblutung,15 die 15% der SAB-

Patienten erleiden97 und zu 70% tödlich enden.66 Deswegen sollte in der Akutphase

der systolische Blutdruck unter 140 mmHg gehalten werden. Es können hierfür

antihypertensive Substanzen wie Labetalol und Nicardipin intravenös verabreicht

werden.77,98,99 Eine Hyperglykämie, die die 10 mmol/l Grenze übersteigt, kommt bei

ein Drittel der SAB-Patienten vor und ist mit einer schlechten klinischen Prognose

assoziiert.100-103 Hyperthermie (Körpertemperatur über 38,3 °C) 100 ist nach

aneurysmatischen SAB ebenso mit einer schlechten Prognose assoziiert,104 ca. 50%

der SAB-Patienten entwickeln diesen Zustand,104 der medizinisch und physikalisch

behandelt werden sollte.15 Pharmakologisch kann eine SAB mit der Triple-"H"-

Therapie, Magnesium, Statinen, Fasudil, Erythropoietin, Nicardipine, Sildenafil,

Endothelin-Rezeptor-Antagonisten, NO-Donatoren (Nitroglyzerin, Nitroprusside) und

1. Einleitung

20

Nimodipine behandelt werden. Von den genannten Mitteln hat allerdings nur Nimodipin

einen durch klinische Studien nachgewiesenen positiven Effekt auf das Outcome nach

SAB.105-109 Zur Versorgung eines rupturierten Aneurysmas stehen die mikrochirur-

gische Versorgung mittels Clipping und die endovaskuläre Ausschaltung mit Coils

(Coiling) zur Verfügung. Die endovaskuläre Versorgung von Aneurysmata ist seit etwa

24 Jahren eine Alternative zur chirurgischen Versorgung.110 Coils sind Platinspiralen,

die mit Hilfe eines Katheters im Aneurysma platziert werden. Dort lösen sie eine lokale

Thrombose aus und trennen das Aneurysma vom Blutkreislauf. Der Zeitpunkt der

Aneurysmabehandlung hat Einfluss auf den weiteren Krankheitsverlauf. So kamen

mehrere klinische Studien zu dem Ergebnis, das eine frühe chirurgische Behandlung

des Aneurysmas die Reblutungsrate senkt.111 Auch erleichtert eine frühe Behandlung

des rupturierten Aneurysmas die Behandlung von Komplikationen wie zerebralen

Vasospasmen.112 Im International Subarachnoid Aneurysm Trial (ISAT) wurden

Patienten mit rupturierten Aneurysmata, deren Aneurysmata gleichermaßen für eine

neurochirurgische und endovaskuläre Versorgung geeignet waren, in zwei Gruppen

randomisiert.113,114 Die Aneurysmata der Patienten der einen Gruppe wurden mit Clips

und die Aneurysmata der Patienten der anderen Gruppe mit Coils versorgt. Für

Patienten, deren Aneurysma endovaskulär mit Coils versorgt wurde, ergab sich in

signifikant mehr Fällen eine bessere neurologische Erholung. Das Epilepsierisiko war

in dieser Gruppe ebenfalls niedriger. In der neurochirurgisch durch Clips behandelten

Patientengruppe war das Reblutungsrisiko geringer. Die Entscheidung für eine

chirurgische oder endovaskuläre Behandlung des Aneurysmas hängt aber von

mehreren Faktoren ab: Patientenalter, Aneurysmalokalisation und -morphologie, und

Allgemeinzustand des Patienten spielen ebenfalls eine Rolle.115

1.3 Pathophysiologie des Hirnschadens nach Subarach noidal-

blutung

Im Rahmen der Subarachnoidalblutung tritt Blut in den Subarachnoidalraum aus. Die

Menge ist abhängig von der Blutungsquelle und dem arteriellen Blutdruck. Das

zusätzliche Volumen führt im geschlossenen System des Neurokraniums zu einer

plötzlichen Erhöhung des intrakraniellen Drucks.116 Die Folgen einer solchen Druck-

erhöhung werden von der Monro-Kellie-Doktrin vorhergesagt, die feststellt, dass die

1. Einleitung

21

Summe der drei Komponenten in der Schädelkalotte, Gehirnparenchym, (arterielles

und venöses) Blut und Liquor cerebrospinalis stets gleich bleiben muss, um den

intrakraniellen Druck konstant zu halten (Abbildung 3). Kommt es zur Volumen-

zunahme im Subarachnoidalraum (wie z. B. bei einer SAB) können zunächst Blut und

Liquor verdrängt werden. Bis zu einem gewissen Grad kann so der intrakranielle Druck

im Normalbereich gehalten werden. Sind jedoch die Reservekapazitäten aufgebraucht

führt jede weitere Volumenzunahme zu einem linearen Anstieg des ICP.

Abbildung 3: Monro-Kellie-Doktrin

Die schlagartige Drucksteigerung durch das zusätzliche Blutvolumen bei der SAB

lässt den intrakraniellen Druck (Normalwert von 5-15 mmHg) auf deutlich erhöhte

Werte (28 mmHg bei kleinen Hämatomen, bis 80 mmHg bei großen Hämatomen)

ansteigen.117-120 Dies, sowie der Kontakt von Blut bzw. Blutbestandteilen mit der

schmerzempfindlichen Dura mater, sind die Ursachen des pathognomonischen,

schlagartig auftretenden starken Kopfschmerzes.8,65 Übersteigt der intrakranielle

Druck (auch nur kurzfristig) den systemischen Blutdruck, kann kein Blut nach

intrakraniell gelangen, was zur Minderdurchblutung bzw. zum Durchblutungsstillstand

(globale Ischämie) des Gehirnes führt. Aufgrund der kurzen Ischämietoleranz des

Gehirns118,121 kann in der Folge rasch ein Bewusstseinsverlust eintreten. Bleibt der ICP

dauerhaft erhöht, ist der Bewusstseinsverlust dauerhaft und führt in schneller Folge

r

1. Einleitung

22

zum irreversiblen Hirnschaden und zum Tod. Sinkt die intrakranielle Hypertension

nach einer initialen Druckspitze wieder ab und wird die zerebrale Durchblutung wieder

ermöglicht, kann das Bewusstsein schnell wiedererlangt werden. Eine weitere Folge

der initialen Blutung ist der Hydrozephalus. Entweder kann es durch Verschluss der

Liquorabflußwege durch Hämatome (v. a. im Bereich des Aquaeductus cerebri) zum

Hydrozephalus occlusivus kommen oder durch Hemmung der Resorption im Bereich

der Pacchionini Granulation50,122 zum Hydrozephalus aresorptivus. Eine weitere

Komplikation der SAB ist das Auftreten eines Hirnödems. Das Hirnödem wird

traditionell in zwei große Subtypen eingeteilt, in das zytotoxische und vasogene

Hirnödem. Von diesen weist vor allem das zytotoxische Hirnödem besondere

Resistenz gegenüber jegliche medizinische Behandlung auf.123 Durch immer weiter

steigendem Hirndruck wird die Perfusion des Gehirns weiter eingeschränkt, und es

kommt zur globalen Ischämie mit begleitenden disseminierten kortikalen und

hypothalamischen Läsionen.124-126 Die Blutung führt sowohl beim Menschen als auch

im experimentellen Modell zu einer sofortigen und andauernden Reduktion der

zerebralen Durchblutung.127-131 Es wird vermutet, dass die Menge und Lokalisation des

Blutes nach Subarachnoidalblutung verantwortlich für die Entstehung von zerebralen

Vasospasmen ist, und mit der Lokalisation und Ausprägung der Spasmen korreliert.50

1.3.1 Frühe- und verzögerte Hirnschädigung

Der Begriff "Frühe Hirnschädigung" (Early Brain Injury, EBI) wird seit ca. 2004

verwendet. Er fasst die akuten pathophysiologischen Vorgänge, die innerhalb der

ersten 72 Stunden nach SAB-Blutung auftreten, zusammen.129,130 Eine schematische

Übersicht bietet Abbildung 4a. Zu den Ereignissen, die durch die Subarachnoidal-

blutung hervorgerufen werden, gehören die Beeinträchtigung der zerebralen

Autoregulation,132 die Störung der Blut-Hirn-Schranke,132 die Aktivierung von

Entzündungswegen und Apoptose,132 Exzitotoxizität und oxidativer Stress.132 Diese

Vorgänge werden zu gewissen Zeitpunkten durch Blut und Blutbestandteile und durch

transiente zerebrale Ischämie hervorgerufen.133-136 Bereits Sekunden nach der SAB

sind Veränderungen der zerebralen Physiologie (ICP-Anstieg, CPP- Verringerung,

CBF-Verringerung, Blutdruck-Anstieg), der Ionen-Homöostase und der elektrischen

Hirnaktivität (EEG-Amplitude) nachzuweisen.132 Ab der ersten Stunde nach SAB

1. Einleitung

23

treten folgende Ereignisse auf: Konstriktionen von kleinen und großen Gefäßen,137

Abbau von Kollagen-IV (größtes Protein der Basal Lamina),138 die Gefäßpermeabilität

erhöht sich während die Gefäßperfusion geringer wird,139 Zelltodsignalwege werden

aktiviert,132 Erhöhung der Glutamat-Konzentration in der zerebralen interstitiellen

Flüssigkeit,140 Anstieg des Hirnwassergehalt,141 der ICP stabilisiert sich auf einem

neuen Plateau, das über dem basalen Wert liegt,127,130 der CPP erholt sich,127 die

zerebrale Durchblutung und Autoregulation bleiben beeinträchtigt,142 und es entstehen

Veränderungen auf molekularer Ebene (starke Verringerung der NO-Konzentration,143

Thrombozyten-Aktivierung und intraluminale Aggregation,144 Anstieg der ET-1-

Konzentration,145 Anstieg des oxidativen Stresses,146,147 Erhöhung der Zytokin-

Expression).132 Der Begriff verzögerte Hirnverletzung (Delayed Brain Injury, DBI)

beschreibt pathophysiologische Mechanismen, die sich in der späteren Phase nach

SAB (3-21 Tage) ereignen und zu einer sekundären Schädigung des Hirngewebes

führen. Diese Vorgänge sind direkte Folge des EBI und können zu einer verzögert

auftretenden zerebralen Ischämie (Delayed Cerebral Ischemia, DCI) führen.148 DCI

wird in bis zu 30% der Fälle für schlechtes Outcome oder Tod von Patienten, deren

Aneurysma erfolgreich behandelt werden konnte, verantwortlich gemacht.149 Die

Ursachen sind noch nicht völlig geklärt, aber man vermutet, dass DCI u. a. durch

verzögert auftretende Vasospasmen, Thrombose, Dysfunktion der Mikrozirkulation

und Cortical Spreading Ischemia verursacht wird (Abbildung 4b). Diese Prozesse

werden wahrscheinlich durch Mechanismen der frühen Hirnschädigung ausgelöst bzw.

mitverursacht.133

1. Einleitung

24

Abbildung 4a: Mechanismen der frühen Hirnschädigung (EBI) nach SAB (Modifiziert nach Sehba,

F., et al., Mol Neurobiol, 2011).

Abbildung 4b: Mechanismen der verzögerten Hirnschäd igung (DBI) nach SAB (Cossu, G., et al.,

BioMed Research Int., 2014).

1. Einleitung

25

1.3.1.1 Verzögerter Vasospasmus

Zerebrale Vasospasmen, die erstmalig durch Robertson (1949), Ecker und Riemen-

schneider (1951) nach einer Subarachnoidalblutung beschrieben wurden,150,151 sind

Verengungen von zerebrale Arterien,122,152,153 die auch durch andere intrakraniellen

Blutungen hervorgerufen werden können.154,155,156,157 Verzögerte zerebrale Vasos-

pasmen treten frühestens drei Tage nach SAB auf. Sie erreichen den Höhepunkt ihrer

Inzidenz zwischen dem 6. und 11. Tag und können bis zu 3 Wochen nach der Blutung

vorherrschen.158 Im klinischen Alltag wird der Vasospasmus meist nicht per Angiogra-

phie, sondern mit Hilfe der transkraniellen Dopplersonographie (TCD) diagnostiziert.159

Mit diesem nicht invasiven Verfahren kann die Blutfließgeschwindigkeit in den

größeren Hirngefäßen bestimmt werden.159 Die zugrunde liegenden patho-

physiologischen Mechanismen sind bisher nicht völlig geklärt. Ein wichtiger Faktor für

die Entstehung eines verzögerten Vasospasmus scheint der Abbau von Erythrozyten

im Subarachnoidalraum zu sein. Dadurch werden Kalium- und vor allen Eisen-Ionen

freigesetzt, die zu einer erhöhten Expression von leistungsstarken Vasokonstriktoren

wie Thromboxan, Endothelin-1, Serotonin, Plättchen-Aktivierender-Faktoren, und 20-

Hydroxyeicosatetraenoid-Säure, die in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) führen

können.160,161 Der intrazelluläre Calcium-Anstieg in den glatten Muskelzellen, und die

ionische Veränderung, wie z.B. der Anstieg des Kalium- und Verringerung des

Magnesium-Spiegels im Serum, sind weitere Faktoren die die Vasospasmenbildung

fördern.133 Ein großer Teil der Forschung wurde von der Annahme beeinflusst, dass

CVS für die verzögerte zerebrale Ischämie (DCI) verantwortlich ist. Heute ist es

allgemein anerkannt, dass nicht alle Patienten mit CVS DCI entwickeln. Umgekehrt

kann DCI oder DIND in Abwesenheit von CVS auftreten.133,135,162-166 Daher ist

anzunehmen, dass CVS nicht die einzige Ursache für die Entstehung von DCI

darstellt.167,168 Mechanismen die für die Pathogenese des DCI und für dessen

schlechte Prognose nach SAB beitragen, sind die frühe Hirnverletzung,132 Cortical

Spreading Depression,168,169 Entzündungen,170-173 Mikrothromben132,174 sowie CVS.175

Obwohl bei ca. 70% der SAB-Patienten angiographisch zerebrale Vasospasmen

nachgewiesen werden können, entwickeln nur 30% ein verzögertes neurologisches

Defizit (DIND).176 Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Outcome nach SAB

durch eine pharmakologische Hemmung der Vasospasmusentstehung nicht

verbessert werden kann.177,178 Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Spasmen der

1. Einleitung

26

großen Hirngefäße nicht die einzige Ursache für die hohe Mortalität und

Morbiditätsrate der SAB beim Menschen sind.133 Dies legt die Vermutung nahe, dass

die zerebrale Mikrozirkulation eine entscheidende Rolle für die nach SAB

beobachteten Durchblutungsstörungen spielen könnte.179,180

1.3.1.2 Vasospasmen in der zerebralen Mikrozirkulat ion

Herz und Mitarbeiter konnten bereits 1975 zeigen, dass die Applikation von Blut auf

piale Mikrogefäße zu einer sofortigen Vasokonstriktion führt.181 Dass dieser Effekt

auch bei SAB-Patienten auftritt, wurde 2003 mittels orthogonal polarization spectral

imaging nachgewiesen: SAB-Patienten, die innerhalb von drei Tagen operiert wurden,

zeigten eine deutlich verringerte Kapillar-Dichte, außerdem wiesen kleine Arterien und

Arteriolen der Kortex-Oberfläche perlenschnurartige Einengungen, also Vasospas-

men, auf.182 Uhl et al. postulierten in ihrer Studie, dass diese Vasospasmen der

zerebralen Mikrozirkulation möglicherweise zur klinischen Symptomatik beitragen, und

diese den postoperativen Verlauf beeinflussen können.182 Pennings et al. zeigten

2004 bei SAB-Patienten mit ähnlicher Methodik nach Hyperventilation eine verstärkte

kontraktile Reaktion pialer Mikroarteriolen, sowie die Ausbildung von Spasmen dieser

Gefäße mit perlenschnurartigem Muster.183 Diese Veränderungen zeigten sich

lediglich bei Patienten, die früh nach SAB operiert wurden. Patienten die nach 48 Std.

operiert wurden, wiesen dieses Muster nicht auf.183 Um das Phänomen der früh

auftretenden Spasmen der zerebralen Mikrozirkulation genauer zu untersuchen,

wurde in unserer Arbeitsgruppe ein experimentelles Modell der SAB entwickelt, mit

dem die zerebrale Mikrozirkulation in vivo mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie zu

unterschiedlichen Zeitpunkten nach SAB untersucht werden konnte. Mit diesem Modell

konnten gezeigt werden, dass drei und sechs Stunden nach SAB ca. 70% der Gefäße,

die von der MCA stammten, mikroarterioläre Kontraktionen aufwiesen, während nach

72 Stunden die Konstriktionshäufigkeit auf 56% gesunken war.184 Dieses Phänomen

wurde Mikrovasospasmus genannt und könnte für die frühe Störung der

Mikrozirkulation nach SAB mitverantwortlich sein. Die Ursachen bzw. Mechanismen,

die zum Mikrovasospasmus führen, sind noch unbekannt.167,180

1. Einleitung

27

1.4 Stickstoffmonoxid (NO)

Stickstoffmonoxid ist ein bioaktives Molekül, das mit anderen Molekülen sowohl

Redoxreaktionen als auch additive Reaktionen eingehen kann.185,186 Aufgrund seiner

geringen Größe kann es in kurzer Zeit biologische Membranen durchqueren und lokal

verschiedene Funktionen ausüben.187,188 Ende der 1970er Jahre bewiesen Furchgott

und Zawadzki et al., dass der sogenannte Endothelium derived relaxing factor (EDRF)

Stickstoffmonoxid ist.189-191 Ein Gas mit kurzer Halbwertszeit (t1/2 = 3-5 Sekunden),189

dass an der Regulation einer Vielzahl von biologischen und physiologischen

Vorgängen wie Modulation der Neurotransmission (z.B. Freisetzung von Dopamin im

Striatum192), am Immunsystem (z.B. MMP sezerniert durch Makrophagen193) und an

Lern- und Gedächtnis-Prozessen beteiligt ist.194-196,197 NO wird von der Isoenzym-

gruppe der NO-Synthasen (NOS) aus der semiessentiellen Aminosäure L-Arginin

synthetisiert.197,198 Im Hirngewebe gibt es alle drei Isoformen, die endotheliale

(eNOS),199-201 neuronale- (nNOS)202-204 und induzierbare NO-Synthase

(iNOS).201,205,206 Die NO-Synthasen katalysieren unter Mitwirkung von Tetrahydro-

biopterin (BH4), O2 und Kofaktoren wie NADPH die Umsetzung von L-Arginin zu L-

Citrullin und NO198 (Abbildung 5).

Abbildung 5: Vereinfachte Darstellung der NO-Synthe se.

1. Einleitung

28

Das endogen gebildete NO wirkt auf Gefäße stark vasodilatierend,189,190 indem es die

Aktivität der löslichen Guanylat-Cyclase (sGC) erhöht, was gleichzeitig zu einem

Anstieg des intrazellulären cGMP-Spiegels führt.207 In Abbildung 6 wird der NO-sGC-

cGMP-Signaltransduktionsweg erläutert: Stickstoffmonoxid (NO) wird enzymatisch

aus der Aminosäure L-Arginin durch drei Isoformen der NO-Synthase (eNOS, nNOS

und iNOS), gewonnen. Geringe Mengen endogen produziertes oder exogen

verabreichtes NO aktiviert die lösliche Guanylatzyklase (sGC), die GTP in zyklische

GMP konvertiert, was verschiedene physiologische und gewebeprotektive Effekte

vermittelt. Der Abbau von cGMP in GMP wird durch mehrere Phosphodiesterase

(PDE) Familien katalysiert. Exzessive Mengen von NO, gebildet unter pathologischen

Bedingungen und assoziiert mit erhöhtem Entzündungsgrad sowie oxydativem Stress

im Gewebe, können stark mit Superoxid-Anion (O2- •) reagieren, das zu Peroxynitrit

(ONOO-) wird. Peroxynitrit, gemeinsam mit anderen Oxidationsmitteln, induziert

Zellschäden durch Lipidperoxidation und ist verantwortlich für die Inaktivierung von

Enzymen und anderen Proteinen durch Oxidation und Nitrierung. Es aktiviert die

Matrix-Metalloproteasen (MMP) und das nukleare Enzym Poly-(ADP-Ribose)-

Polymerase (PARP), das letztendlich zu zelluläre Dysfunktion und Tod führt. Der NO-

sGC-cGMP-Signalweg kann durch Verringerung der Bioverfügbarkeit von NO (z.B.

durch chemische Wechselwirkung von NO mit O2•) oder durch Veränderung des

Redox-Zustandes der sGC selbst beeinträchtigt werden (beispielsweise durch

oxydativen Stress oder die Wirkung durch Peroxynitrit), wodurch es nicht mehr auf

endogenes NO oder NO-freisetzende Arzneimittel reagiert.208

1. Einleitung

29

Abbildung 6. Der NO-sGC-cGMP-Signalübertragungsweg (Modifiziert nach Evgenov et al., Nature Reviews, 2006).

1.4.1 Stickstoffmonoxidsynthase (NOS)

Die NOS ist ein Isoenzym, das in drei Formen vorliegt: endotheliale NOS (eNOS oder

NOS3), neuronale NOS (nNOS oder NOS1) und induzierbare NOS (iNOS oder NOS2).

Diese Namen reflektieren den Gewebetyp, in dem die NOS-Enzyme zum ersten Mal

beschrieben worden sind. Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass jede dieser Isoformen

auch in einer Vielzahl anderer Gewebe exprimiert werden kann.209 Die drei Isoformen

sind sich ähnlich in Bezug auf Struktur und katalytische Mechanismen.198 eNOS wird

durch ein Gen kodifiziert, das auf Chromosom 7 lokalisiert ist. Es ist ein 135 kDa

Protein, das aus 1294 Aminosäuren besteht. Es wurde das erste Mal in

Gefäßendothelzellen identifiziert210,211 und später in andere Zelltypen vorgefunden,

1. Einleitung

30

wie z.B. in humanen neuronalen Zellen,212 humanen und Ratten-Astrozyten,213,214

humanen T-Zellen,215 humanen Knochenmarkzellen, humanen Osteoblasten und

Osteoklasten,216 humanen dermalen Fibroblasten,217 Ratten-Kardiomyozyten,218

Ratten-Hepatozyten219 und Kaninchen-Dickdarmzellen.220 Es wird konstitutiv

exprimiert und existiert sowohl in einer membrangebundenen als auch in einer

zytosolischen Form.198 Obwohl eNOS im Wesentlichen ein durch Kalzium-Calmodulin-

Komplex aktiviertes Enzym ist, wird es zusätzlich an endotheliale Rezeptoren,221-223

wie z.B. den M3-Muskarinrezeptor oder B1-Brandykininrezeptor,221 durch

Hypoxie,222,223 "Shear stress"221,224,225 und Hormone wie z.B. Östrogen226 stimuliert.

Durch die Stimulierung der Rezeptoren kommt es zu einer Erhöhung des Kalzium-

Einstroms in die Endothelzellen. Dies bewirkt die Phosphorylierung, und damit die

Aktivierung von membrangebundener und zytosolischer eNOS. Das so im Endothel

produzierte NO diffundiert in die glatten Gefäßmuskelzellen und induziert dort die

Gefäßrelaxation. Außerdem entfaltet es eine aggregationshemmende Wirkung auf

Thrombozyten und beeinflusst so die Durchblutung sowie den Gefäßtonus.221,227 Die

durch eNOS verursachte Vasodilatation ist in Arterien deutlich größer als in Venen.228

Die physiologische Konzentration des von eNOS produziertem NO liegt im

picomolaren (< 1nM),239 oder sub nanomolaren Bereich (ca.1-30 nM),229 und wird zur

Signaltransduk-tion nur in kurzen Schüben hergestellt.230 Die neuronale NOS, ein 160

kDa Protein,231,232 welches auf Chromosom 12 kodiert wird,234 ist eine konstitutive NO-

Synthase, die ähnlich dem eNOS abhängig von Ca2+ ist.198 Immunhistochemische

Untersuchungen haben nNOS in bestimmten Hirnregionen nachgewiesen wie Bulbus

olfactorius, Lamina tecti, Gyrus dentatus des Hippocampus, Stria terminalis,

diagonales Band von Broca, Hypophysenvorder- und -hinterlappen, Retina,

Cerebellum und Hypothalamus, dort insbesondere in den Nuclei supraopticus und

Nuclei paraventricularis.233,234 Darüber hinaus enthalten auch das Nebennierenmark

und periphere Darmnerven nNOS. Letztere werden auch als „nitrerge Nerven“

bezeichnet.235 Es übernimmt auch die Funktion eines Neurotransmitters, der die

Aktivität des sympathischen Nervensystems reguliert.236,237 Es ist auch an der

Regulation von gastrointestinaler Motilität, Kontrolle glatter Muskulatur sowie

neuroendokriner Prozesse beteiligt.237 Im Hirnstamm hemmt NO den Sympathikotonus

und kann dadurch Blutdruck und Herzfrequenz senken.238,239

1. Einleitung

31

Das iNOS-Gen ist lokalisiert auf Chromosom 17.198 iNOS ist im Gegensatz zu den

konstitutiven Isoformen eNOS und nNOS nicht ständig in aktiver Form im Gewebe

vorhanden, sondern induzierbar.198,240 iNOS wurde erstmalig aus Makrophagen isoliert

und wird in zahlreichen Geweben und Zellen exprimiert, wie z.B. Lunge, Muskelzellen,

Epithelien und Leukozyten. Im Gehirn wird iNOS in Endothelzellen, Mikroglia und

Astrozyten synthetisiert.198,241-245 iNOS ist Kalzium unabhängig und besitzt Calmodulin

als prothetische Gruppe.200 Es ist permanent aktiviert und kann NO für längere

Zeiträume erzeugen.229 Es ist ein Teil der unspezifischen Immunabwehr.246 Hier

fungiert das von diesem Enzym produziertes NO als zytotoxischen Agens gegen

Tumorzellen, Bakterien, Pilze und Protozoen.229,247 Dabei sind unzählige Stickstoff-

und Sauerstoffverbindungen entscheidend für die Herstellung des zytotoxischen

Milieus. Die Superoxide, die von der NADPH-Oxidase des Phagozyten hergestellt

werden, reagieren mit NO unter Bildung von Peroxynitrit.229,248 Studien berichten von

der Beteiligung von iNOS an der Regulation der renalen Funktion und des arteriellen

Blutdrucks.249 Auch nach Verletzungen soll iNOS an der Gefäßerweiterung mit

konsekutiver Hyperperfusion beteiligt sein.250 Die wesentliche Rolle der iNOS wird bei

iNOS-Knockoutmäusen erkannt, die vor allem anfälliger für Infektionen sind.251 Eine

Hyperaktivität der iNOS kann bei verschiedenen Erkrankungen (z.B. Morbus Crohn)

beobachtet werden. Im septischen Schock ist es verantwortlich für den ausgeprägten

Blutdruckabfall aufgrund gesteigerter Vasodilatation und Multiorganversagen.252

Anders als nNOS und eNOS, ist iNOS ein Enzym, dass über einen längeren Zeitraum

NO in höheren Konzentrationen synthetisiert.229 Diese Konzentration befindet sich im

nanomolaren (> 100 nM) Bereich.229,240

1.5 NO im Gehirn

Das Gehirn verbraucht ca. 20 % der körpereigenen Energie, obwohl es nur 2% der

Gesamtmasse des Körpers ausmacht. Eins der wichtigsten Aufgaben der zerebralen

Zirkulation ist das Gehirn mit Sauerstoff und Glukose zu versorgen, denn die neuronale

Aktivierung erfordert große Mengen an Energie, um den Ionenstrom zu regulieren, der

durch Depolarisation entsteht. Daher ist eine streng regulierte Durchblutung

essentiell.253 Der NO-Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der

zerebralen Durchblutung. Das Verständnis der Mechanismen, die diese Prozesse

1. Einleitung

32

steuern, können nützliche Einblicke in die CBF-Veränderung geben, die während einer

Hirnverletzung auftreten. Zwei große Mechanismen liegen der Regulation des CBF

zugrunde, die Autoregulation und die neurovaskuläre Kopplung.253 eNOS-NO hat eine

Schlüsselrolle inne bei der Autoregulation, wogegen das nNOS produzierte NO

entscheidend bei der neurovaskulären Kopplung ist.253 Nach Hirnschädigung sind

diese NOS-Isomere in ihrer Funktionalität beeinträchtigt.254 Im Gehirn wird eNOS im

vaskulären Endothel und Plexus choroideus exprimiert. Das NO, das vom eNOS

stammt (eNOS-NO), spielt eine Schlüsselrolle für die Aufrechterhaltung der

Mikrozirkulation,254 fördert die Vasodilatation, erhöht die zerebrale Durchblutung,

hemmt die Thrombozyten-Aggregation und -Adhäsion,132,254,264 hemmt die

Leukozytenadhäsion,255,256 verringert die Proliferation der glatten Muskulatur und hat

u.a. eine antioxidative Wirkung,254,263 Das neuronale NO (nNOS-NO) agiert als ein

wichtiger Neurotransmitter, der die neuronale Plastizität, Gedächtnisbildung, zerebrale

Nerven, Systemdurchblutung, Übertragung von Schmerzsignale und Neurotrans-

mitter-Freisetzung, Schlaf-Wach-Zyklus und Hormonausschüttung (z.B. Östrogen)

reguliert. 257,258,262,270 Anders als eNOS und nNOS, wird die Exprimierung von iNOS

durch Makrophagen, Gliazellen und Tumorzellen in Anwesenheit von Zytokinen,

Endotoxinen und anderen inflamatorischen Agenzien bestimmt.259 Durch iNOS-

Aktivierung werden große Mengen (100-1000 Fach höher) an NO, im Vergleich zu

eNOS und nNOS, synthetisiert.260 Das aktivierte iNOS produziert kontinuierlich NO,

bis das Enzym abgebaut ist.261 Die NO-Funktion von eNOS und nNOS wird durch den

NO-sGC-cGMP-Signalweg vermittelt.

1.5.1 NO in der frühen Hirnschädigung nach SAB

Pathologische Veränderung im Stickstoffmonoxid (NO)/Stickstoffmonoxid-Synthase

(NOS)-Weg treten früh nach SAB auf.140,143,262 Experimentelle Versuche deuten auf

ein Mangel an NO hin, der nicht durch eine beeinträchtigte NO-Synthese zu erklären

ist, da die gesamte NOS-Aktivität, während der ersten 90 Minuten nach SAB

unverändert bleibt.263 Daher wird vermutet, dass die frühe Verringerung der zerebralen

NO-Konzentration nach SAB deshalb zustande kommt, weil NO durch Oxyhämo-

globin,264-266 durch Reaktion mit freien Radikalen,267 und der Reduzierung zu Nitriten268

deaktiviert wird. Dieser Effekt ist mit der Verringerung der zerebralen Durchblutung

1. Einleitung

33

vergesellschaftet.269 Daher werden dringend neue Therapien benötigt, die das

zerebrale NO-Defizit und die dadurch bedingte Abnahme der zerebralen Durchblutung

nach SAB verringern.270

1.5.2 NO-Donatoren

Stickstoffmonoxid-Donatoren (NOD) sind eine heterogene Gruppe von Medikamenten,

deren gemeinsames Merkmal die Fähigkeit ist, NO oder eine NO-verwandte Spezies,

wie das Nitrosonium-Kation (NO+) oder Nitroxyl-Anion (NO-), in vitro oder in vivo,

freizusetzen.271 Die Wirkung folgender NODs wurde experimentell oder klinisch nach

SAB untersucht: Organische Nitrate (z.B. Nitroglycerin, Isosorbid-5-Mononitrat,

Nicorandil, Pentaerythrittetranitrat); S-Nitrosothiole (z.B. S-Nitroso-N-

acetylpenicillamin und S-Nitroso-Glutathion); Sydnonimine (z.B. Molsidomin, SIN-1);

NONOate (JS-K, SPERMIN-NONOat und Proli-NONOat), anorganische Nitrate

(Natriumnitroprussid) und NO-Gas.272,273 Klassische NO-Donatoren, wie

Natriumnitroprussid (SNP) und Nitroglycerin (GTN), können nicht als Routine-

Therapeutika eingesetzt werden, da sie schwerwiegende Nebenwirkungen

besitzen.272 Zwar verursachte SNP im Tierversuch eine effektive Vasodilatation

zerebraler Gefäße, diese Wirkung war jedoch mit Hypotension und Hirnödem

vergesellschaftet.274,275 Intrathekale Behandlung mit SNP ruft, in der Mehrzahl der

Fälle, neben der positiven Wirkung auf Gefäßdurchmesser, Übelkeit, Erbrechen,

Migräne, Kopfschmerzen, Herzrhythmusstörung, unkontrollierten Anstieg der

zerebralen Durchblutung (CBF) und Zyanid-Vergiftung als Nebenwirkung hervor.276

GTN ist ein NO-Donator, der häufig zur Behandlung von Angina pectoris verwendet

wird. Nach SAB bei Primaten führte GTN zur Auflösung von Makrovasospasmen.277

Transdermale Verabreichung von GTN bei Menschen erhöhte nach SAB die

transkranielle Doppler (TCD) Geschwindigkeit und den CBF.278 Auch das klinische

Outcome verbesserte sich, und das DIND reduzierte sich.279 In allen Studien trat

allerdings eine ausgeprägte systemische Hypotension als Nebenwirkung auf. Dies

schränkt den klinischen Einsatz dieser vielsprechenden Substanz erheblich ein.272 Die

intrathekale Verabreichung von GTN führte experimentell zu einer vasodilatativen

Wirkung, ohne dass dadurch eine systemische Hypotonie hervorgerufen wurde.280

Allerdings wurde die Sicherheit und Wirksamkeit intrathekaler Anwendung am

1. Einleitung

34

Menschen noch nicht getestet.272 Die genannten Eigenschaften und Mängel der

klassischen NO-Donatoren veranlassten die Suche nach neuen NO-Donatoren

(NONOate, S-Nitrosothiole, Natriumnitrite, Sydnoniminen, NO-Gas), die in experimen-

tellen und klinischen Studien hinsichtlich ihres Potentials zur Vasospasmus

Behandlung, nach SAB, getestet werden.272 S-Nitrosothiole (z.B. S-Nitrosogluthation)

weisen nach experimenteller SAB, eine vasodilatative Wirkung auf zerebrale Arterien

auf. Außerdem hat dieser NO-Donator keinen Effekt auf de ICP und CPP. Jedoch weist

es Nebenwirkungen bzgl. systemische Blutdruckverminderung auf.140 Auch NANOate

weist eine relaxierende Wirkung auf die verengten zerebralen Gefäße auf.281,282 Als

Nebenwirkung wird durch NANOate die systemische Hypotension,283 und die

Hepatokarzinogenität, durch N-Nitrosopyrrolidine, gefördert.284 Experimentelle Stu-

dien zeigen, dass Sydnonimine, wie z.B. Molsidomin, einen gefäßrelaxierenden und

einen antithrombotischen Effekt auf die Mikrozirkulation aufweist. Auch hier zeigte sich

allerdings eine ausgeprägte Hypotension (um ca. 18,5 mmHg).285 Natriumnitrit, dass

für die Phase-2a an aSAB-Patienten untersucht wird, ist ein Medikament, das

zerebrale Vasospasmen verbessert.286 Es weist jedoch in klinischen Studien ebenfalls

für NO-Donoren typische Nebenwirkungen auf.287

1.5.3 Inhaliertes NO

Inhaliertes NO (iNO) wird seit 1991 als selektiver pulmonaler Vasodilatator verwendet,

um pulmonale Hypertonie zu behandeln.288,289 Der Vorteil von iNO liegt in der

sofortigen relaxierenden Wirkung auf pulmonale Widerstandsgefäße, so dass es

keinen systemischen hypotonen Nebeneffekt hervorruft.290-293 iNO hat auch

extrapulmonale Effekte, z.B. verringert es den ischämischen Reperfusionsschaden im

mesenterialen und myokardialen Gewebe.294,295 In experimentellen296-298 und

klinischen299 Studien wurden keine Veränderungen der zerebralen Durchblutung

(CBF) und der zerebralen Perfusion (CPP) an gesunden Tieren und Menschen

dokumentiert.300 Jedoch verursacht iNO nach experimenteller zerebraler Ischämie,

eine selektive Erweiterung der zerebralen Gefäße der ischämischen Penumbra, ohne

dass dabei der systemische Blutdruck abfällt. Es steigert die zerebrale Durchblutung,

verbessert das neurologische Outcome, und verhindert den ischämischen Zelltod.270

Aufgrund des Wirkmechanismus von iNO, könnte es möglicherweise eine vielverspre-

1. Einleitung

35

chende Behandlungsstrategie zur Vorbeugung des frühen Hirnschadens nach SAB

darstellen.301

1.5.4 Rolle des NOs in der zerebralen Autoregulatio n

Die Zerebrale Autoregulation (CA) ist ein homöostatischer Prozess bei dem

Widerstandsgefäße erweitert oder verengt werden, um die zerebrale Durchblutung

(CBF) konstant zu halten.302,303 Es werden zwei Haupttypen von CA unterschieden: a)

Stoffwechselregulation, die durch Veränderungen der Hirnstoffwechselrate angetrie-

ben wird304 und b) Druckregulation, die durch eine Antwort des CBF auf arterielle

Blutdruck-Veränderungen charakterisiert wird.305-309

Bei gesunden Erwachsenen wirken sich Veränderungen des systemischen Blutdrucks

(MAP), zwischen 60-160 mmHg, geringfügig oder gar nicht auf den CBF aus.302,310,335

Sobald der MAP ansteigt, konstringieren die kleinen zerebralen Arterien und Arteriolen

und sorgen dadurch für eine Aufrechterhaltung des CBF.311 Umgekehrt, dilatieren die

zerebralen Widerstandsgefäße sobald der systemische Blutdruck abfällt. Auch

dadurch wird der CBF konstant gehalten. Jenseits der autoregulatorischen Grenzen,

hängt die CBF direkt von MAP/CPP ab; eine arterielle Hypotonie führt zur

Mangeldurchblutung des Gehirns und ggf. Bewußtseinsverlust, während eine

ausgeprägte arterielle Hypertonie zur Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und zum

Hirnödem führen kann.311

Die metabolische Regulation der Hirndurchblutung erfolgt über den arteriellen

pCO2.312,313 Bei gesunden Erwachsenen steigt im Bereich zwischen 25-75 mmHg der

CBF linear um 2-4% pro mmHg PaCO2 an und die zerebralen Gefäße dilatieren.335,336

Veränderungen in der zerebralen Zirkulation treten bei gesunden Menschen unter den

genannten Bedingungen innerhalb weniger Sekunden ein.312

Nach SAB sind autoregulatorische Mechanismen der zerebralen Durchblutung häufig

beeinträchtigt. Die Druckregulation, die Fähigkeit des CBF auf den veränderten

systemischen Blutdruck zu reagieren, wie auch die CO2-Reaktivitätsfähigkeit der

zerebralen Gefäße bleiben aus.128,131,132,142,314,315 Experimentell tritt eine schwere

autoregulatorische Störung innerhalb von zwei bis drei Stunden nach SAB auf und hält

bis zu drei Monate an.126 Klinisch tritt diese Beeinträchtigung in den meisten Fällen

innerhalb der ersten 72 Stunden nach aneurysmatischer SAB auf und korreliert in ihrer

1. Einleitung

36

Ausprägung mit der Schwere der SAB.315 Die genauen Mechanismen der

aufgehobenen CO2 -Reaktivität nach SAB sind nicht bekannt. Diskutiert wird u.a. eine

Entkoppelung der eNOS.316-318 Die funktionelle Entkopplung des eNOS vom Kofaktor

Tetrahydrobiopterin (BH4) geschieht unter ischämischen Bedingungen und ist für die

Erzeugung von Superoxid, anstatt NO, verantwortlich.319,320 Das Superoxid reagiert mit

NO zu toxischem Formperoxynitrit. Durch diese NO-Depletion verschärft sich die

Verringerung der zerebralen Durchblutung nach SAB und der neuronale Schaden wird

verstärkt. Die Gabe von L-Arginin- oder Pravastatin haben einen positiven Effekt auf

die zerebrale Autoregulation nach SAB.321,322 Weitere Untersuchungen müssen

zeigen, wie die gestörte Autoregulation nach SAB erfolgreich behandelt werden kann.

1.6 Rolle von Endothelin und Endothelin-Rezeptoren nach SAB

Endothelin wurde 1988 von Yanagisawa und Mitarbeiter entdeckt.323 Es wurde von

Aortenendothelzellen vom Schwein Isoliert, charakterisiert und kloniert.323 Endotheline

sind Oligopeptide, die in drei Isoformen auftreten: ET-1, ET-2 und ET-3.324 Sie

bestehen aus 21 Aminosäuren und werden hauptsächlich in Endothelzellen

hergestellt. Endothelin-1 (ET-1) ist der stärkste bisher bekannte Vasokonstriktor.325 Die

ET-1-Synthese wird reguliert durch physikalisch-chemische Faktoren326 (z.B.

Hypoxie), durch Vasokonstriktoren,327,328 Wachstumsfaktoren (z.B. VEGF),329 pH,391

Zytokine330 und Adhäsionsmoleküle.331 Diese induzieren die Transkription von ET-1-

mRNA und damit die innerhalb von Minuten einsetzende Synthese und Sekretion von

ET-1. Die Halbwertszeit der ET-1-mRNA beträgt etwa 15-20 Minuten und die

Plasmahalbwertszeit für ET-1 beträgt 4-7 Minuten.332 Diese schnelle Regulation

erlaubt den Endothelzellen, die ET-1-Syntheserate rasch zu verändern und somit den

Gefäßtonus schnell zu regulieren. Endothelzellen sezernieren 75-90% ihrer ET-1-

Produktion in das abluminale Interstitium,333,334 wo es mit Endothelinrezeptoren auf

den Gefäßmuskelzellen und perivaskulären Nervenzellen interagiert. Nur 25% der ET-

1 Gesamtproduktion wird in die Blutbahn sezerniert. Die Plasma-Konzentration von

ET-1 liegt im picomolaren Bereich,335 während die Schwellen-Konzentration für die ET-

1 induzierten Vasokonstriktionen meist im nanomolaren Bereich liegt.336 Seine

Wirkung wird über drei Rezeptoren vermittelt: Der ETA-, ETB1- und ETB2-Rezeptor.337

Diese Rezeptoren sind an die Phopsholipase-C via GTP-Binding-Protein gekoppelt.338

1. Einleitung

37

Die Vasokonstriktion wird vor allem durch ETA-Rezeptoren vermittelt, die besonders

stark in glatten Gefäßmuskelzellen exprimiert werden, während ETB1-Rezeptoren auf

Endothelzellen exprimiert werden, und eine durch NO vermittelte Vasodilatation

bewirken. ETB2-Rezeptoren, die in einem sehr geringen Umfang in glatten Gefäß-

muskelzellen exprimiert werden, vermittelt ebenso wie die ETA-Rezeptoren eine

Vasokonstriktion (Abbildung 7).338,339,382,340

Big ET-1 = Big Endothelin-1; ECE = Endothelin Conve rting Enzym

Abbildung 7: Vaskuläre Wirkung von Endothelin-1 (ET -1) (Modifiziert nach Agapitov et al., Jraas,

2002).

Der Signaltransduktionsweg für die ETA-Rezeptoren führt über eine Aktivierung hetero-

trimerischer G-Proteine (Gq/11) und Phospholipase-C (PLC) zu einer Freisetzung von

Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG). IP3 aktiviert IP3-Rezeptoren (IP3R),

die sich in den Membranen des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) befinden. Wird

IP3 an diese Membranproteine gebunden, wirken sie wie Ca2+-Kanäle und Ca2+ fließt

1. Einleitung

38

seinem Konzentrationsgradienten folgend aus dem SR in das Zytosol. Der daraus

resultierende Anstieg der Ca2+-Konzentration im Zytosol aktiviert die Calmodulin

(CaM) abhängige Myosin-Leichteketten-Kinase (MLCK), die über eine

Phosphorylierung der regulatorischen leichten Ketten des Myosins (MLC20) die

Konstriktion einleitet.341,342 Für eine schematische Verfolgung des ETA-Rezeptor-

Transduktionsweges siehe Abbildung 8.

Abbildung 8: Postuliertes Modell der Signaltransduk tionswege von ET A-Rezeptoren an glatten

Gefäßmuskelzellen.

AA = Arachidonsäure; PLA2 = Phospholipase A2; BK = Ca2+

- aktivierte K+-Kanäle; DAG = Diacylglycerol;

IP3 = Inositol Triphosphat; IP3R = IP3-Rezeptor; L-type = L-type Ca2+

-Kanäle; PLC = Phospholipase C;

RyR = Ryanodine Rezeptor; SERCA = sarkoplasmatische Ca2+

-ATPase.

Eine Reihe von Untersuchungen, die in den letzten Jahren durchgeführt wurden

zeigen, dass Endothelin-1 (ET-1) maßgeblich an der Pathogenese von zerebralen

Vasospasmen nach aneurysmatischer Subarachnoidalblutung (aSAB) bei Patienten

beteiligt ist.343-347 Weitere Studien zeigen, dass die Expression von ET-1 vor allem in

1. Einleitung

39

den ersten 72 Stunden nach SAB, verstärkt stattfindet.343,348,349 Dieses Ereignis wird

durch Thrombin und Oxyhämoglobin gefördert.350,351 Auch ist ein erhöhter ET-1-

Spiegel möglicherweise für die Beeinträchtigung der NO-Produktion nach SAB

verantwortlich. Diese Beeinträchtigung wird über die isoformspezifischen Protein-

Kinase-C (PKC)-vermittelte Hemmung der eNOS-Expression vermittelt.352 Präklinis-

che Studien legen nahe, dass ETA-selektive Antagonisten, wie z.B. Clazosentan,

Makrovasospasmen nach SAB auflösen können. Dies konnte auch in einer

randomisierten Phase-II-Studie an aSAB-Patienten gezeigt werden,353,354,355 In den

darauffolgenden Multizenterstudien zeigte sich allerdings keine signifikante Reduktion

von DIND, sowie keine Verbesserung des neurologischen Outcomes.178,353,354,356-359

Die Ergebnisse legen nahe, dass der verzögert auftretenden Makrovasospasmus nach

SAB keine kausale Rolle für die post-hämorrhagische Ischämie spielt, sondern

möglicherweise andere Mechanismen, wie z.B. eine Störung der zerebralen

Mikrozirkulation hier eine weit wichtigere Rolle einnimmt. Ob ET-1 möglicherweise

auch an Störungen der zerebralen Mikrozirkulation nach SAB beteiligt ist, ist bisher

allerdings völlig unklar.

1.7 Ziel der Arbeit

Das Ziel der Arbeit ist die Untersuchung der Ätiologie der zerebralen Mikrozirkulations-

störung nach experimenteller Subarachnoidalblutung. Die von unserer Arbeitsgruppe

erstmalig systematisch untersuchten Mikrovasospasmen sind ein in der Frühphase

nach Blutung auftretendes Phänomen, das sowohl beim Patienten, als auch nach

experimenteller Blutung auftritt, und das wahrscheinlich entscheidend zur frühen

mikrozirkulatorischen Dysfunktion und somit zum posthämorrhagischen ischämischen

Hirnschaden nach SAB beiträgt. Wie oben erläutert, könnten der Stickstoff-Monoxid-

Stoffwechsel, sowie Endothelin eine Schlüsselrolle in der Entwicklung der mikro-

arteriellen Konstriktion spielen. Deswegen wurde im Rahmen der vorliegenden

Dissertation nach experimenteller Subarachnoidalblutung der Einfluss von inhaliertem

Stickstoffmonoxid, sowie die Endothelin-Rezeptor-Blockade auf die zerebrale Mikrozir-

kulation untersucht.

2. Material & Methoden


Die Experimente und Datenanalyse wurden von Januar 2011 bis März 2014 am

Walter-Brendel-Zentrum für Experimentelle Medizin durchgeführt. Alle tierexperimen-

ellen Protokolle wurden von der zuständigen Behörde genehmigt (Regierung von

Oberbayern, Tierversuchsantrag: 55.2-1-54-2531-66/08). Die Planung, Ausführung,

Auswertung und Dokumentation der Versuche erfolgte nach den ARRIVE-

Richtlinien.360 Die Randomisierung erfolgte mittels Los-Zug, alle Versuche wurden von

einem verblindeten Untersucher durchgeführt und ausgewertet.

2.1 Material

Die Hersteller aller verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien in der vorliegen-

den Arbeit sind in der Folge aufgelistet.

2.1.1 Geräte

Tabelle 5: Geräte

Bezeichnung Hersteller

Gefäß-Kauterisierer

Blut-Gas-Analysator

Bohrer-Ansatz

Diamantbohrer zur Trepanation

OP-Mikroskop

Druckwandler

Fine Scientific Tool GmbH, Heidelberg, D

Rapilab 1265, Global Siemens Healthcare

Headquarters, Siemens AG, Erlangen, D

Aeskulap GD 8730 R, 0,5 x 5,1 mm, B.

Braun Melsungen AG, Melsungen, D

Rewatronik Products; Wald Michelbach, D

Carl Zeiss AG; Oberkochen, D

DTX-Plus DT-XX, Becton-Dickinson,

Medical, Heidelberg, D


41

Heizplatte

ICP-Monitor

ICP-Sonde (Codmann Microsensor)

Inkubator

IVM-Mikroskop

Kleintierrespirator

Laserdoppler

Mikrokapnometer

Mikrokapnometer-Sonden

(10 und 20 ml)

Multi Gas Monitor zur NO-Messung

Perfusor secura

Perfusor (Sp 100i, Syringe pump)

Sauerstoffgehaltmesser

Signal-Transducer-Gerät

Signalanschlussbox

Stereotaktische Halterung

Waage

FHC, Bowdoinham, ME, USA

Codmann, Boston, USA

Codman, Norderstedt, D

Modell 7510, Drägerwerk AG Lübeck,

Lübeck, D

Modell MST 49, Leica Microsystems CMS

GmbH, Wetzlar, D

Mini Vent Typ 845, Hugo Sachs Elektronik,

March, D

Perimed Instruments GmbH, S

CI 240, Columbus Instruments, Ohio, USA

CI 240, Columbus Instruments, Ohio, USA

Industrial Scientific Corporation, Dortmund, D

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D

Corcom, USA

Oxidig, Drägerwerk AG Lübeck, Lübeck, D

Hugo Sachs Elektronik, March, D

Bedo Elektronik GmbH, Krefeld, D

Mod. 51600, Stoeting Co., Wood Dale, IL,

USA

Ohaus Corporation, CH


42

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 6: Verbrauchsmaterialien


Nahtmaterial zur Hautnaht

Faden zur Perforation

Katheter (Außendurchmesser: 0,61

mm & Innendurchmesser:0,28 mm)

Kleberhärter (Insta-Set)

Knochenzement (Poly-Plus Bondex)

Mikrochirurgische Gefäßclips

OP-Besteck

Sekundenkleber (Maxi-Cure)

Skalpell (N°11 & N°20)

Hemodynamic Monitoring System

Tubus (zur Intubation)

Gewebekleber - 3 M Vetbond

(Tissue Adhesive)

Ethibond 5-0, Ethicon, Norderstedt, D

Prolene 5-0, Ethicon, Norderstedt, D

Smiths Medical, Keene, USA

Drechsel & Mehr, Weiden, D

Engmann, Viernheim, D

Dentsply Dentry, Konstanz, D

Peter Lazig GmbH, Tuttlingen, D

FST, Berlin, D

Drechsel & Mehr, Weiden, D

Feather Safety Razorco.LTD, Okasaka, J

Spectramed, Deutschland

InsyteR, Decton Dickinson, USA

3 M Animal Care Products, St. Paul, USA


43

2.1.3 Inhalationsgase

Tabelle 7: Inhalationsgase


CO2 (10 %ig, 10,0 L), UN 1956 Linde AG, Pullach, D

CO2 (99%, 13,4 L) UN 1013 Linde AG, Pullach, D

NO in N2 (Prüfgas, 268 mg/m3

Stickstoffmonoxid (200 ppm), Rest

Stickstoff); 10,0 L, RAL 6018

Linde AG, Pullach, D

2.1.4 Chemikalien

Tabelle 8: Chemikalien


Atipamezolhidrochlorid

(2,5 mg/kg KG)

Bepanthen (Augen & Nasensalbe)

Clazosentan

D-PBS (mit CaCl2 und MgCl2)

Fentanyl

FITC-Dextran (Mw: 150.000 Da)

Flumazenil

Heparin

Orion Pharma GmbH, Hamburg, D

Bayer Vital, Leverkusen, D

Actelion, Allschwil, CH

Gibco, Invitrogen Life Technologies, Grand

Island , NY, USA

Jan Seen Cilag, Neuss, D

Sigma Chemicals, Deisendorf, D

Hikma Pharma GmbH, Niederolm, D

Rathiopharm GmbH, Ulm, D


44

Isofluran

Knochenzement (Poly-Plus Bondex)

Knochenzement (Aqualox)

Medetomidin

Midazolam

NaCl – 0,9% Lösung –

Naloxon-HCl

Abbot GmbH & Co. KG; Wiesbaden, D

Engmann, Viernheim, D

Dentsply Dentry, Konstanz, D

Voco, Cuxhaven, D

Orion Pharma GmbH, Hamburg, D

Roche, Basel, CH

Braun AG; Melsungen, D

Baxter, Lessines, B

PharmaSelect, Hannover, D

2.1.5 Intravitalmikroskop-Ausstattung

Tabelle 9: Intravitalmikroskop-Ausstattung


Filter: Anregungsfilter (Bandpassfilter:

450-490 nm) und Reflektionspassfilter

(510 nm)

Leitz, München, D

Bewegungsregulator (Mikroskoptisch)

- Phytron IX - C - T

Fluoreszenzepiluminatoren (L3,

Poemopak)

Hitzefilter (7 mm)

Kamera SIT (Restlichtkamera),

C2400-08

Phytron Elektron Elektrik GmbH,

Gröbenzell, D

Leica, München, D

Leitz, München, D

Hamamatsu Photonics, Heersching, D


45

Kreutztisch

Objektive (5 x, 20 x)

Sperrfilter

(Bandpassfilter: 520-525 nm)

Xenon-Lampe (75 W) – XBO 75 W/2

Leitz, München, D

Leitz, Wetzlar, D

Leitz, München, D

Leitz, München, D

2.1.6 Software

Tabelle 10: Software

Anwendungsgebiet Programm/Hersteller

Leica - Bildbearbeitung /- Analyse,

Video-Aufnahme an

Intravitalmikroskop

FlexPro - Auswertung von zerebraler

Durchblutung (CBF) und Intrakra-

niellem Druck (ICP), graphische

Auswertung

Graphische Darstellung, Statistik

Aufnahme von ICP, LDF und MAP

Bildbearbeitung

Statistische Auswertung, schriftliche

Bearbeitung, Präsentation

Leica Application Suite (LAS),

Leica Microsystems,Wetzlar, D

FlexPro, Weisang, D

SigmaPlot 12, Erkrath, D

DaisyLab 5.0, meas X, Mönchengladbach ,

D

Adobe Photoshop 7.0, Adobe Systems

GmbH, München, D

Excel, Word, PowerPoint (Microsoft Office

2007, 2010), Redmond, WA, USA


46

Feinbewegung des Mikroskoptisches,

1µm Intervall steuerbar

Messaufnahmesystem (LDF,

MAP,ICP)

Alpha com V3.4.2 (Phyntron Elektron),

Gröbenzell, D

DASYLab ,National Instruments, München, D

2.1.7 Versuchstiere

Für die Versuchsreihen zur Untersuchung von inhaliertem NO und dem Endothelin-

Rezeptor-Inhibitor Clazosentan wurden männliche C57 bl/6 Mäuse mit einem Gewicht

von 20-24g und einem Alter von 6-8 Wochen verwendet (Charles River Laboratories,

Kisslegg, D). Zur Untersuchung der Rolle der NOS wurden homozygot transgene

nNOS-/- (NOS-1, Stamm Nummer 2633, genaue Bezeichnung: B6; 129S4

Nos1tm1Plh/J), iNOS-/- (NOS2, Stamm Nummer 2609, genaue Bezeichnung:

B6.129P2-Nos2tm1Lau/J) und eNOS-/-- (NOS-3, Stammnummer 2684, genaue

Bezeichnung: B6.129P2-Nos3tm1Unc/J) Zuchtpaare gekauft (Jackson Laboratories,

Maine, USA). Alle Mutationen wurden in Sv129-Zellen induziert, die resultierenden

transgenen Tiere wurden 10 Generationen in C57 bl/6 Mäuse zurückgekreuzt. Eine

Übersicht über die genauen Mutationen sowie den resultierenden Phänotyp gibt

Tabelle 11. Die Zucht erfolgte homozygot. Die Tiere wurden nach dem vom Hersteller

empfohlenen Protokoll genotypisiert. Als Kontrolltiere wurden männliche C57 bl/6

Mäuse verwendet. Die Haltung der Tiere erfolgte im Walter-Brendel-Zentrum,

entsprechend den erforderlichen speziellen Hygienebedingungen (FELASA

erweitert).361 Die Mäuse wurden bei einer Raumtemperatur von 22 ± 2°C in Standard

Makrolon Käfigen (Gruppenhaltung bei Tieren mit > 20 g KGW = 5 Tiere / Käfig Typ II

Iong) mit freiem Zugang zu Wasser und Futter bei einem Tag-Nachtrhythmus von 12

Stunden gehalten. Eine Stunde vor dem geplanten Versuchsbeginn wurden die Tiere

in Einzelkäfigen nüchtern gestellt; die postoperative Haltung erfolgte in Einzelkäfigen.


47

Tabelle 11.: Übersicht über Mutation, Genotyp und P hänotyp der NOS-Knockout-Mäuse

Detailanalyse NOS-1 NOS-2 NOS-3Symbol Nos-1 Tm1Plh Nos-2tm1Lau Nos-3tm1Unc

NameStickstoffmonoxid-Synthase-1,

neuronale Zellen; gezielte Mutation 1, Paul L Huang

Stickstoffmonoxid-Synthase-2, induzierbare Zellen; gezielte Mutation 1, Victor E Laubach

Stickstoffmonoxid-Synthase-3, endotheliale Zellen; gezielte

Mutation 1, University of North Carolina

Synonyme alphaNOS1, Kn, N2KO, nNOS-,

nNOS-, nNOS KO, NOSdeltaiNOS-, iNOS KO, NOS2-,

Nos2tm1Lau, NOS2tm/LauecNOS-, eNOS-, eNOSKO,

NOS3-

Gene

Lokalisierung: Chr5:117781032-117958840 bp, +

Strang, genetische Position: Chr5, 57.29 cM,

cytoband F


Strang, genetische Position: Chr11, 46.74 cM


Strang, genetische Position: Chr5, 11.32 cM

Eltern-Zelllinie J1 (ES Cell) E14TG2a (ES Cell) E14TG2a (ES Cell)Herkunft der Belastung 129S4/SvJae 129P2/OlaHsd 129P2/OlaHsd

Genotyp Homozygot 2 (hm2) Homozygot 2 (hm2) Homozygot 2 (hm2)

Allelzusammensetzung Nos1tm1Plh/Nos1tm1Plh Nos2tm1Lau/Nos2tm1Lau Nos3tm1Unc/Nos3tm1Unc

Genetischer Hintergrund B6.129S4-Nos1tm1Plh/J B6.129P2-Nos2tm1Lau/J B6.129P2-Nos3tm1Unc/J

Herz-Kreislauf-System

verringerte vaskuläre endotheliale Zellzahl, anomaler systemischer

arterieller Blutdruck, Verringerung der Herzmuskelkontraktilität, , anormale Angiogenesis, u.a.

Zellular

erhöhte fetale Herzmuskelzell-Apoptose, erhöhte Nieren-

Apoptose, verringerte Nierenzellproliferation, abnorme

RedoxaktivitätEndokrine / Exokrinen

Drüsenabnorme Eierstock-Morphologie,

kleinen EierstockWachstum / Größe /

KörperphänotypAbnahme des Körpergewichts fetale Wachstumsverzögerung

Hämatopoetischen Systems

abnorme Osteoklasten Physiologie

Homöostase / Stoffwechsel

glomeruläre Kapillarthrombose, Anstieg des

Serumharnstoffspiegels, erhöhter zirkulierender

Kreatinkinasespiegel, Zyanose, u.a.

Immunsystem verminderte entzündliche Reaktionanormale Entzündungsreaktion,

verminderte entzündliche Reaktion

abnorme Osteoklasten- Physiologie, erhöhte Entzündungsreaktion,

Nierenentzündung

Sterblichkeit / Altern partielle neonatale Letalität, teilweise postnatale Letalität

Muskel

vermindertes Skelettmuskelgewicht,

beeinträchtigte Kontraktilität der Skelettmuskulatur, Muskelermüdung

verringerte Herzmuskelkontraktionsfähigkeit,

erhöhte Herzkammer- Muskelkontraktilität

Nervensystem anormales Gehirnwellenmuster

Nieren / Harnwege

erhöhte Nierentubuli Apoptose, Albuminurie,

Nierenmikroaneurysma, Mesangiolysis, abnorme

glomeruläre Kapillarendothel- Morphologie, u.a.

Fortpflanzungsorgane verminderte Befruchtungsfrequenz

Atmungssystem anormale Tensid-Physiologie

Lungenblutungen , abnormalen Lungengefäß-Morphologie,

Lungengefäßstaus, abnorme Tensidsekretion, u.a.

Verhalten/Neurologisch anormaler Tagesrhythmus, anormales Schlafmuster

Skelett

abnorme Osteoklastenphysiologie,

verringerte Knochendichte, erhöhte Knochendichte, erhöhte

kompakte Knochendicke, abnormale Osteoblasten-

Physiologie


48

2.2 Methoden

2.2.1 Anästhesie und Antagonisierung

Die Mäuse werden nach einem Dosierungsplan (siehe Tabelle 12) gewichtsadaptiert

intraperitoneal mit einer Kombinationsanästhesie aus Medetomidin (0,5 mg/kg KG),

Midazolam (5 mg/kg KG) und Fentanyl (0,05 mg/kg KG) narkotisiert, da diese

Kombination die zerebrale Vasomotorik nicht verändert.362 Das Versuchstier gilt als

betäubt, sobald der Standreflex ausfällt und an der Hinterpfote keine Schmerzreaktion

ausgelöst werden kann. Zur Aufrechterhaltung der Narkose wird alle 60 Minuten ein

Drittel der initialen Dosis intraperitoneal appliziert. Zur Beendigung der Narkose wird

die Anästhesie mit Atipamezol (2,5 mg/kg KG), Flumazenil (0,5 mg/kg KG) und

Naloxon (1,2 mg/kg KG) antagonisiert (siehe Tabelle 13). Für die Intravitalmikroskopie

werden die Tiere erneut intraperitoneal mit der oben beschriebenen 3-Fach-

Kombinations-Anästhesie betäubt.

Tabelle 12: Dosisplan einer gewichtsadaptierten int raperitonealen Kombinationsanästhesie

Medetomidin Domitor

Midazolam Dormicum

Fentanyl Fentanyl

Medetomidin Domitor

Midazolam Dormicum

Fentanyl Fentanyl

Gesamt

mg/ml 1 1 0.05 mg/kg KG

0.5 5 0.05

g mg Mg mg ml ml ml ml 20 0.0100 0.1000 0.0010 0.0100 0.100 0.0200 0.1300 21 0.0105 0.1050 0.0011 0.0105 0.105 0.0210 0.1365 22 0.0110 0.1100 0.0011 0.0110 0.110 0.0220 0.1430 23 0.0115 0.1150 0.0012 0.0115 0.115 0.0230 0.1465 24 0.0120 0.1200 0.0012 0.0120 0.120 0.0240 0.1560 25 0.0125 0.1250 0.0013 0.0125 0.125 0.0250 0.1625 26 0.0130 0.1300 0.0013 0.0130 0.130 0.0260 0.1690 27 0.0135 0.1350 0.0014 0.0135 0.135 0.0270 0.1755 28 0.0140 0.1400 0.0014 0.0140 0.140 0.0280 0.1820 29 0.0145 0.1450 0.0015 0.0145 0.145 0.0290 0.1885 30 0.0150 0.1500 0.0015 0.0150 0.150 0.0300 0.1950 31 0.0155 0.1550 0.0016 0.0155 0.155 0.0310 0.2015 32 0.0160 0.1600 0.0016 0.0160 0.160 0.0320 0.2080 33 0.0165 0.1650 0.0017 0.0165 0.165 0.0330 0.2145 34

0.0170 0.1700 0.0017 0.0170 0.170 0.0340 0.2210

1000 0.5000 5.0000 0.0500 0.5000 5.000 1.0000 6.5000


49

Tabelle 13: Dosisplan einer gewichtsadaptierten int raperitonealen Antagonisierung

2.2.2 Mechanische Beatmung

Zur Aufrechterhaltung physiologischer Bedingungen erfolgt nach der Anästhesie die

Intubation mit einer speziell angefertigten Kanüle (20G) mit Silikonmanschette zur

Abdichtung der Stimmritze. Die Intubation erfolgt unter direkter visueller Kontrolle mit

einem Mikroskop. Die korrekte Tubuslage wird mittels Mikrokapnometrie verifiziert.

Nach erfolgreicher Intubation wird das Tier mit einem Kleintier-Respirator verbunden

und mit einem Gasgemisch aus 30% O2 und 70% Stickstoff kontrolliert beatmet

(Atemfrequenz: 140-200/min, Atemzugvolumen: 200-225 µl). Die Sauerstoffkonzen-

tration, die Beatmungsparameter und der endexspiratorische CO2-Partialdruck

(pETCO2) werden kontinuierlich überwacht, die Atemparameter ggf. angepasst.

Angestrebt wird ein pETCO2-Wert zwischen 35-45 mmHg. In einer vorherigen

Publikation unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die pETCO2-Werte

sehr gut mit dem im Blut gemessenen pCO2-Werten übereinstimmen, sodass dass

über die gesamte Versuchsdauer ein physiologischer pCO2 vorherrschte.362

Atipamezol Antisedan

Flumazenil Anexate

Naloxon Naloselect

Atipamezol Antisedan

Flumazenil Anexate

Naloxon Naloselect

Gesamt

mg/ml 5 0.1 0.4 mg/kg KG

2.5 0.5 1.2

g mg mg mg ml ml ml ml 20 0.0500 0.0100 0.0240 0.0100 0.1000 0.0600 0.1700 21 0.0525 0.0105 0.0252 0.0105 0.1050 0.0630 0.1785 22 0.0550 0.0110 0.0264 0.0110 0.1100 0.0660 0.1870 23 0.0575 0.0115 0.0276 0.0115 0.1150 0.0690 0.1955 24 0.0600 0.0120 0.0288 0.0120 0.1200 0.0720 0.2040 25 0.0625 0.0125 0.0300 0.0125 0.1250 0.0750 0.2125 26 0.0650 0.0130 0.0312 0.0130 0.1300 0.0780 0.2210 27 0.0675 0.0135 0.0324 0.0135 0.1350 0.0810 0.2295 28 0.0700 0.0140 0.0336 0.0140 0.1400 0.0840 0.2380 29 0.0725 0.0145 0.0348 0.0145 0.1450 0.0870 0.2465 30 0.0750 0.0150 0.0360 0.0150 0.1500 0.0900 0.2550 31 0.0775 0.0155 0.0372 0.0155 0.1550 0.0930 0.2635 32 0.0800 0.0160 0.0384 0.0160 0.1600 0.0960 0.2720 33 0.0825 0.0165 0.0396 0.0165 0.1650 0.0990 0.2805 34

0.0850 0.0170 0.0408 0.0170 0.1700 0.1020 0.2890

1000 2.5000 0.5000 1.2000 0.5000 5.0000 3.0000 8.5000


50

2.2.3 Regelung der Körpertemperatur

Die Körpertemperatur der Maus wird mit einer rektalen Temperatur-Sonde gemessen

und mit Hilfe einer rückgekoppelten Heizmatte konstant auf 37°C gehalten. Bei

chronischen Versuchen werden die Tiere nach Versuchsende bis zu 24 Stunden in

einem auf 34°C aufgewärmten Inkubator gehalten, um eine Hypothermie zu vermei-

den.

2.2.4 Messung des intrakraniellen Drucks (ICP)

Die ICP-Sonde wird zunächst in physiologischer Kochsalzlösung geeicht. Nach

Induktion der Narkose wird das Versuchstier in Bauchlage positioniert und die

Kopfhaut medial ca. 1 cm längs inzidiert. Nach Entfernen der Galea aponeurotica wird

der rechte Musculus temporalis dargestellt, inzidiert und stumpf nach lateral gedrängt.

Orientierend wird die durchschimmernde Arterie cerebri media aufgesucht. Caudal

davon erfolgt eine Bohrlochtrepanation mit einem Präzisions-Diamantenbohrer.

Anschließend wird die ICP-Sonde epidural eingebracht. Die Sonde wird mit Knochen-

zement fixiert und es erfolgt die Aufzeichnung einer Baseline über 10 bis 30 Minuten,

bevor der Versuch fortgesetzt wird.

2.2.5 Messung der zerebralen Durchblutung (CBF)

Die regional zerebrale Durchblutung (regionale cerebral blood flow, rCBF), wird nicht-

invasiv durch die intakte Schädeldecke mit Laser-Doppler-Fluxmetrie gemessen.363,364

Dazu wird das Versuchstier in Bauchlage positioniert und der linke Musculus

temporalis freigelegt. Dieser wird im Bereich der Ansatzsehne inzidiert und stumpf

nach lateral gedrängt. Anschließend wird die LDF-Sonde in einem 90° Winkel zur

Kalotte über dem Versorgungsgebiet der A. cerebri media angesetzt und mit

Gewebekleber befestigt. Die Laser-Doppler-Fluxmetrie misst über den Dopplershift die

Geschwindigkeit der zerebralen Durchblutung. Durch die Absorption des

eingestrahlten Laserlichtes wird die Erythrozytenkonzentration im jeweiligen

Messvolumen bestimmt.365 Das Produkt aus beiden Werten wird in Perfusions-

einheiten (Arbitrary Units, UA) angegeben. Es wurde zunächst unter Ruhebedin-

gungen zehn Minuten eine Baseline aufgezeichnet. Diese wurde mit 100%


51

gleichgesetzt; die weiteren CBF-Werte wurden dann in Relation zu dieser

Ruhedurchblutung als Prozent des Ausgangswertes dargestellt.315,316,365

2.2.6 Induktion einer Subarachnoidalblutung (SAB)

Die SAB wird durch Fadenperforation der A. cerebri media induziert. Es handelt sich

hierbei um ein modifiziertes Modell welches 1995 zum ersten Mal von Bederson für

die Ratte beschrieben und in unserer Arbeitsgruppe reproduzierbar auf die Maus

übertragen wurde.127 Hierfür wird auf der linken Seite in der Medioclavikularlinie ein

Hautschnitt ab dem oberen Teil des Sternums bis zur Mandibula ausgeführt. Im

Hautschnittbereich ist die Glandula sublingualis zu erkennen, diese wird stumpf

abpräpariert, um die A. carotis communis darzustellen. Nach Darstellung der Carotis-

Bifurkation wird zunächst die A. thyroidea ligiert. Anschließend wird die Arteria carotis

externa ca. 0,3 cm distal der Bifurkation ligiert. Dann wird ein Ligaturfaden ca. 0,1 cm

distal der Bifurkation vorgelegt. Nach temporären Clipping der Arteria carotis

communis wird die A. carotis externa mit einer Mikroschere zwischen den beiden

Ligaturen geöffnet und ein 3,0 cm monofiler Faden eingeführt. Anschließend wird

dieser Perforationsfaden mit der vorgelegten Ligatur fixiert und das Gefäß damit

abgedichtet. Nach Entfernung des Clips wird der Perforationsfaden über die Arteria

carotis externa in die Arteria carotis interna vorgeschoben. Unter kontinuierlicher

Kontrolle der zerebralen Durchblutung und des intrakraniellen Drucks wird der Faden

innerhalb der A. carotis interna nach intrakraniell vorgeschoben, bis er an der Media-

Bifurkation das Gefäß perforiert. Die Auslösung der Blutung wird bestätigt durch einen

abrupten massiven ICP-Anstieg (> 30 mmHg) und eine gleichzeitige drastische

Verringerung der zerebralen Durchblutung (CBF) auf weniger als 30% des

Ausgangswert. Nur wenn beide Kriterien erfüllt sind gilt die Blutung als erfolgreich

ausgelöst.366 Hiernach wird der Perforationsfaden bis in die Arteria carotis externa

zurückgezogen, und dieses Gefäß mit Hilfe der vorgelegten Ligatur anschließend

verschlossen. Nach der SAB-Induktion erfolgte eine Beobachtungsphase von 15

Minuten, in denen der intrakranielle Druck und die zerebrale Durchblutung aufge-

zeichnet wurden. Dann erfolgt der Wundverschluss mit monofilem Faden in

Einzelknopfnaht-Technik. Bei der Sham-Operation werden alle Schritte außer der

Perforation der A. cerebri media durchgeführt. Die Narkose wird antagonisiert, das Tier


52

nach Wiedererlangen der Reflexe extubiert und zur Weiterführung des Versuchs im

Inkubator bei 34°C und 25% Luftfeuchtigkeit gehalte n.

2.2.7 Jugularis-Katheter

Nach Positionierung des Versuchstiers auf dem Rücken wird mit der Pinzette auf der

linken Seite in der Medioclavicular-Linie ein ca. 1 cm langer Hautschnitt durchgeführt.

Die V. jugularis interna wird freipräpariert und möglichst weit cranial mit einem

Seidenfaden ligiert. Die Zuflüsse zur Vene werden ligiert bzw. kauterisiert. Ein

Haltefaden wird vorgelegt und das Gefäß nah am Übergang zur Vena subclavia

temporär geklippt. Das Gefäß wird nun zwischen Clip und Ligatur inzidiert. Ein mit

steriler Kochsalzlösung oder Therapiesubstanz vorgefüllter Katheter wird in das

Lumen platziert und mit der Halteligatur fixiert. Nach Öffnen des Clips wird einmalig

aspiriert, um die intravasale Lage des Katheters zu beweisen. Dann wird der Katheter

mit einer weiteren Ligatur und mit Fibrinkleber fixiert. Der Katheter wird nun mittels

subkutanter Tunnelung dorsal im Bereich des Nackens ausgeleitet, die Hautwunde mit

monofilem Faden in Einzelknopfnaht-Technik verschlossen.

2.2.8 Quantifizierung der Mikrozirkulation

2.2.8.1 Analyse des zerebralen Gefäßbaums anhand de s Strahler-Schemas

Das Strahler-System wurde ursprünglich zur Quantifizierung der Geomorphologie von

Tälern und Flusssystemen entwickelt.367 Heute wird es auch in den Biowissenschaften

angewendet, um z. B. neuronale Netzwerke, Gefäßsysteme oder auch Bronchial-

verzweigungen zu kategorisieren,368-372 also, um komplexe Systeme in vergleichbare

Kategorien einzuteilen. Dieses System wurde an unsere Fragestellung angepasst,184

um eine statistische Auswertung der Häufigkeit bzw. Anzahl von Mikrovasospasmen

an Gefäßen zu ermöglichen. Die Gefäße, die sich nicht weiter aufteilen, werden als

Kapillaren/(Gefäß-)Kategorie 0 bezeichnet, was einen Durchmesser von 5,0 bis 9,0

µm entspricht. Die Arteriolen (Gefäßdurchmesser 9,5-15 µm), aus welchen Kapillaren

entstammen, werden als Kategorie 1 bezeichnet usw. Eine Übersicht sowie ein

Echtbild zeigt Abbildung 9. Auf diese Weise werden für die vorliegende Studie nach

dem Strahler-Schema alle Gefäße am Anfang der Versuchsreihe kategorisiert. Nach


53

Applikation des Fluoreszenzfarbstoffs und der Identifizierung der arteriellen Gefäße

mittels der Flussrichtung werden zunächst die Kapillaren identifiziert. Danach werden

diese retrograd bis hin zu den Gefäßen der Kategorie 6 (Gefäßdurchmesser: 55-65

µm) verfolgt. Die Buchstaben sollen die Gefäßabschnitte und die tiefgestellten Zahlen

die Anzahl der Gefäßabschnitte einer einzelnen Kategorie definieren. Der gesamte

Gefäßbaum im freipräparierten Fenster wird digital aufgezeichnet. Die weitere

Auswertung erfolgte offline mit der Leica Application Suite (LAS) Software.

Strahler-Schema Zerebrale Mi krozirkulation in vivo

Abbildung 9: (a) zeigt eine schematische Darstellun g eines Gefäß-Baums nach Strahler-

Kategorien. (b) zeigt eine IVM-Übersichts-Aufnahme der zerebralen Mikrozirkulation. Die gelben

Zahlen bezeichnen die Gefäßkategorien, die Buchstab en die Gefäßabschnitte und die

tiefgestellten Zahlen die Anzahl der Gefäßabschnitt e einer einzelnen Kategorie.

2.2.8.2 Quantifizierung von Gefäßdurchmesser und Mi krovasospasmus

Nach der Quantifizierung der einzelnen Gefäßabschnitte nach dem Strahler-Schema,

folgt die Quantifizierung des Gefäßdurchmessers (Leica Application Suite (LAS), Leica

Microsystems). In Bildern mit 20x Vergrößerung wird ein Gefäßabschnitt in

a b

5x


54

ganzer Länge gescannt, um kontrahierte und nicht kontrahierte Bereiche zu

identifizieren. Abschnitte mit minimalem und maximalem Durchmesser werden dann

markiert und im Abstand von 1 µm dreimalig gemessen. Aus diesen Messungen wird

der Mittelwert gebildet. Der Grad der Konstriktion wird dann als Prozentwert der nicht-

kontrahierten Gefäßabschnitte angegeben (Abbildung 10).

Arteriole

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Bestimmung eines Vasos pasmus an einer Arterio-

le. Die vertikalen Linien repräsentieren die Messpunkte zur Bestimmung des Gefäßdurchmessers im

nicht kontrahierten und im kontrahierten Bereich. Als Konstriktionsgrad wird das Verhältnis beider

Durchmesser bezeichnet.

2.2.9 Intravitalmikroskopie

2.2.9.1 Venöse und arterielle Katheterisierung der Maus

Die intravitalmikroskopische Untersuchung der zerebralen Zirkulation erfolgt drei

Stunden nach Induktion der SAB. Vor Beginn der Intravitalmikroskopie wird zur

kontinuierlichen Messung des arteriellen Blutdrucks die A. femoralis am linken Bein

mit einem heparinisierten Kunststoffkatheter (Außendurchmesser: 0,61 mm;

Innendurchmesser: 0,28 mm) kannuliert, der an einem Drucktransducer angesch-

lossen wird. Dieser wird vor Versuchsbeginn mit einem Quecksilber-Manometer

geeicht. Der Katheter wird kontinuierlich mit 0,9% NaCl-Kochsalzlösung (0,4 ml/h)

gespült, die Daten kontinuierlich aufgezeichnet. Am Ende eines jeden Versuchs wird

eine Blut-Gas-Analyse durchgeführt. Zur intravenösen Applikation des Fluoreszenz-

farbstoffs Fluoresceinisothiocyanat–Dextran (FITC-Dextran) und oder anderer Medi-

kamente wird die linke V. femoralis in gleicher Art und Weise katheterisiert.


55

2.2.9.2 Kranielles Fenster

Das Versuchstier wird auf den Bauch gelegt und mittels Gaumenplatte in einem

stereotaktischen Rahmen fixiert. Nach medianem Hautschnitt wird die Galea

aponeurotica abpräpariert und das Periost entfernt. Mit einem Diamant-

Präzisionsbohrer wird unter kontinuierlicher Kühlung mit isotoner Kochsalzlösung zur

Vermeidung von Hitzeentwicklung links parietal über dem Stromgebiet der A. cerebri

media ein 2 x 2 mm großes kranielles Fenster präpariert. Eine schematische

Darstellung zeigt Abbildung 11. Bei der Trepanation wird besondere Sorgfalt darauf

verwendet, die Dura mater nicht zu verletzen; Versuchstiere mit verletzter Dura mater

werden vom Versuch ausgeschlossen, da durch Extravasation von Fluoreszenz-

farbstoff eine Darstellung der zerebralen Gefäße erschwert bzw. unmöglich gemacht

wird. Die Kopfhaut wird dann mittels vier Haltefäden nach oben trichterförmig

aufgespannt. Danach wird sterile physiologische Kochsalzlösung aufgebracht, um ein

Flüssigkeitsresevoir herzustellen, der für die Immersionsmikroskopie erforderlich ist.

Abbildung 11: Schematische Darstellung eines intrak raniellen Fensters links parietal über dem Stromgebiet der A. cerebri media.


56

2.2.9.3 Intravitalmikroskopie zerebraler Mikrogefäß e

Nach der Positionierung unter dem Mikroskop wird zunächst unter 5x Vergrößerung

eine Übersichtsaufnahme durchgeführt. Es folgt die Einteilung der Gefäße nach dem

Strahler-Schema. Untersucht werden piale Mikrogefäße (Arteriolen zwischen 9,5 und

65 µm und Venolen). Hiernach werden in höherer Vergrößerung (20x) mehrere

Regions of Interest (ROI) identifiziert und aufgezeichnet. Die Positionen werden

anhand der Tischkoordinaten und anhand der Anatomie markiert. Die fluoreszenz-

mikroskopischen Aufnahmen werden digital aufgezeichnet und für die weitere

Auswertung gespeichert. Die Gefäße werden mit der Gabe von 150-200 µl 0,5%ige

FITC-Dextran-Lösung (FITC-Dextran gelöst in 0,9%igen NaCl) visualisiert. Im Falle

eines Verlustes der Anfärbeintensität des Farbstoffes während der IVM, wird 1/3 des

initialen FITC-Dextran-Lösungsvolumen hinzugefügt.

2.2.10 Inhalation

2.2.10.1 Stickstoffmonoxid-Inhalation (iNO)

Stickstoffmonoxid (268 mg/m3 in Stickstoff) wird mit Atemgas (30% O2 und 70%

Stickstoff) gemischt, so dass das Versuchstier mit einer Endkonzentration von 50 ppm

beatmet werden kann. Die NO-Konzentration wird vor Beatmung des Versuchstieres

mit einem elektrochemischen Gasmonitor (Multi Gas Monitor zur NO-Messung,

Industrial Scientific Corporation, Dortmund, D) geprüft.

2.2.10.2 Kohlendioxid-Inhalation

Kohlenstoffdioxid (10% in Stickstoff) wird mit Atemgas (30% O2 und 70% Stickstoff)

gemischt, so dass das Versuchstier mit einer 7,5%igen Kohlenstoffdioxid-

Endkonzentration beatmet werden kann. Die CO2-Konzentration im Atemgas wird mit

Hilfe eines Sauerstoffgehaltmessers (Oxidig, Drägerwerk AG Lübeck, Lübeck, D)

kontinuierlich verfolgt.

2.2.11 Anwendung von Clazosentan

Clazosentan, (Ro 61-1790 / AXV-034343A / VML 588; Chemischer Name: [5-Methyl-

Pyridin-2-Sulfonsäure 6- (2-Hydroxy-Ethoxy) -5- (2-Methoxy-Phenoxy)-2-(2-1H-


57

Tetrazol-5-yl-Pyridin-4-yl)Pyrimidin-4-ylamid Dinatrium-Salz]; Molekulargewicht:

621,53 g/mol; Molekulare Formel: C25H21N9Na2O6S), ist ein gelb-weißes Pulver. Es

wird trocken gelagert und verdünnte Lösungen sollen vor Licht geschützt werden. Es

ist leicht wasserlöslich bis zu 4,8 mg/100 ml beim pH = 5,9 und 25 g/100 ml bei einem

pH-Wert über 7. Es ist eine schwache Disäure mit pKa-Werten von 3,3 und 4,5. Die

aktive Dosierung liegt in vitro bei 10-10 - 10-6 M und in vivo bei 3-10 mg/kg i.v. als Bolus

oder 3-10 mg/kg/h i.v. als Infusion. Es hat eine Plasma-Halbwertszeit von weniger als

eine Stunde in Ratten und Hunden. Clazosentan hat einen teratogenen Einfluss in

höheren Dosen und sollte nicht von schwangeren Frauen eingenommen werden.

Abbildung 12 stellt die Strukturformel von Clazosentans da.373

Abbildung 12: Chemische Struktur von Clazosentan

Clazosentan ist ein selektiver Endothelin-A (ETA) Rezeptorantagonist, der zu einer

Klasse von trifunktionellen Heteroarylsulfonamido Pyrimidinen gehört.373-375 Es wurde

durch Weiterentwicklung von Bosentans, dem ersten in klinischen Studien

verwendeten nichtpeptid ET-Rezeptor-Antagonisten,376 bindungsaffiner und wasser-

löslicher gemacht.373 Clazosentan fehlt jegliche Agonisten-Aktivität und ist 1000-fach

selektiver für die Hemmung des ETA- als für ETB- vermittelte Kontraktion.373 Aufgrund

der hohen Wasserlöslichkeit von Clazosentans eignet es sich besonders gut zur

parenteralen Anwendung.375 Studien zeigen, dass Clazosentan Vasospasmen in


58

großen zerebralen Gefäßen, nach experimenteller und klinischer Subarachnoidal-

blutung, umkehrt.373,377 Die Versuchsmäuse werden randomisiert und einer

Behandlung mit Clazosentan oder Vehikel (0,9%igen NaCl) unterzogen. Die

Behandlung erfolgt intravenös.

2.2.12 Versuchsprotokolle

2.2.12.1 Stickstoffmonoxid-Inhalation (iNO)

Bei männlichen C57 bl/6 Mäusen (n = 5 pro Gruppe) wird wie oben beschrieben eine

SAB induziert. Drei Stunden nach Subarachnoidalblutung wird die zerebrale

Mikrozirkulation mittels IVM untersucht, die Messungen erfolgen im Abstand von 10

Minuten. Nach intravenöser Bolusinjektion von FITC Dextran erfolgt eine

Quantifizierung des Gefäßbaums nach dem Strahler-Schema. Dann wird 30 Minuten

lang die Gefäßdurchmesser sowie Anzahl und Schwere der Mikrovasospasmen in

allen Gefäßabschnitten dokumentiert. Anschließend wird die iNO-Gruppe 40 min lang

mit 50 ppm NO zusätzlich zum normalen Atemgas behandelt. Die Zuschaltung des

Gases erfolgt randomisiert und die Kontrollgruppe wird weiter mit dem normalen

Atemgas (30% O2, 70% Stickstoff) beatmet. Alle 10 Minuten wird die zerebrale

Mikrozirkulation erneut quantifiziert. 30 Minuten nach Beendigung der NO-Inhalation

erfolgt die letzte Messung. Eine schematische Darstellung des Versuchsablaufs gibt

Abbildung 13. Während des gesamten Versuchs wird kontinuierlich der mittlere

arterielle Blutdruck aufgezeichnet. Am Ende des Versuchs wurde allen Versuchstieren

150 µl Blut zur Blut-Gas-Analyse entnommen.


59

Abbildung 13: Versuchsprotokoll für die NO-Inhalation-Versuchsrei he. (a) Kontrollgruppe und (b) iNO-Gruppe.

2.2.12.2 Hemmung von Endothelin-1-Rezeptoren mit Cl azosentan

2.2.12.2.1 Dosisfindung von Clazosentan

Da Clazosentan in der Literatur bisher nur bei Ratten378-380 verwendet wurde, wurde in

einer ersten Versuchsreihe im Rahmen einer Dosisfindung die wirksame Clazosentan-

Dosis ermittelt. Hierfür wird der Effekt von unterschiedlichen Clazosentan-

Konzentrationen (1 mg/kg KG/h, 3 mg/kg KG/h, 10 mg/kg KG/h, 20 mg/kg KG/h) auf

den systemischen Blutdruck und die zerebrale Durchblutung unter physiologischen

Bedingungen untersucht. Dafür wird gesunden C57 bl/6 Mäusen (n = 3 pro Gruppe)

nach Aufzeichnung einer zehn-minütigen Baseline-Messung die jeweilige Dosis

Clazosentan als i.v.-Dauerinfusion über 180 Minuten verabreicht. MAP und CBF

werden kontinuierlich über 180 Minuten aufgezeichnet. Als Dosis für die weiteren

Versuche wird die höchste Clazosentan-Dosis, die keinen Einfluss auf die gemesse-

nen Parameter zeigt, gewählt.

a. Kontrollgruppe

b. iNO-Gruppe


60

2.2.12.2.2 Gabe von Clazosentan nach SAB

Drei Stunden nach Induktion der SAB wird bei männlichen C57 bl/6 Mäusen (n = 6 pro

Gruppe) mittels IVM die zerebrale Mikrozirkulation untersucht. Nach Aufzeichnung der

Baseline (zwei Messungen im Abstand von 10 Minuten) beginnt die intravenöse

Clazosentan-Gabe (10 mg/kg KG/h bzw. 0,01 ml/min) über 30 Minuten. Die

Kontrolltiere erhalten Vehikelsubstanz in gleicher Menge. Alle 10 Minuten erfolgt eine

IVM-Messung wie oben beschrieben. Nach Ende der Infusion werden noch zwei

weitere IVM-Messungen durchgeführt (siehe Abbildung 14 für eine schematische

Übersicht). Zusätzlich wird während der gesamten Versuchsdauer der mittlere

arterielle Blutdruck aufgezeichnet. Am Ende des Versuchs wird allen Versuchstieren

150 µl Blut zur Blut-Gas-Analyse entnommen.

Abbildung 14: Versuchsprotokoll für die Clazosentan-Versuchsreihe während IVM. (a) Kontroll-gruppe und (b) Clazo-Gruppe.

a. Kontrollgruppe

b.Clazo-Gruppe


61

2.2.12.3 Untersuchung der Rolle der NOS-Isoformen b ei Vermittlung der CO 2-

Reaktivität zerebraler Gefäße

Männliche C57 bl/6 Mäuse (n = 15), eNOS-/- (n = 8), nNOS-/- (n = 8), iNOS-/- (n = 8),

werden narkotisiert und für die Intravitalmikroskopie vorbereitet. MAP und CBF werden

nach Messung einer Baseline kontinuierlich aufgezeichnet. Alle 10 min wird die

zerebrale Mikrozirkulation wie oben beschrieben aufgezeichnet. Vor jeder IVM-Phase

wird erneut ein Bolus FITC-Dextran i.v. appliziert. Die Untersuchung der CO2-

Inhalationsphase beginnt ab der 30. Minute 20 Minuten lang. 10 Minuten später erfolgt

eine abschließende Messung. Eine schematische Darstellung des Versuchsablaufs

gibt Abbildung 15. Am Ende des Versuchs wird allen Versuchstieren 150 µl Blut zur

Blut-Gas-Analyse entnommen.

Abbildung 15: Versuchsprotokoll für die CO 2-Inhalations-Versuchsreihe während IVM. (a) Kon-trollgruppe und (b) iNOS -/--, nNOS-/--, eNOS-/--Gruppe.

a. Kontrollgruppe

b. iNOS-/--, nNOS-/--, eNOS-/--Gruppe

3. Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1 Effekt von inhaliertem NO (iNO) auf die zerebra le Mikrozirkula-tion nach experimenteller Subarachnoidalblutung

3.1.1 Induktion der SAB

Vor SAB wiesen die Mäuse einen normalen intrakraniellen Druck zwischen 3 und 7

mmHg auf. Nach Induktion der Blutung stieg der ICP abrupt auf Werte von 92,3 ± 8,3

mmHg an. Während der nächsten Minuten sank der ICP-Wert und blieb jedoch zum

Zeitpunkt 15 Minuten (27,3 ± 3,5 mmHg) signifikant erhöht (Abbildung 16 a).

Gleichzeitig zeigte sich eine drastische Reduktion der regionalen zerebralen

Durchblutung auf 16,8% ± 4,2 % des Ausgangswertes, die sich ebenfalls während der

nächsten Minuten langsam zurückbildete. Am Ende der Beobachtungs-zeit, 15

Minuten nach SAB, erholte sich die zerebrale Durchblutung auf ca. 79,7% ± 10,1%

des Ausgangswertes (Abbildung 16 b). Dies entspricht den Werten, die in

vorangegangenen Studien der Arbeitsgruppe erhoben wurden.127 Aufgrund der gerin-

gen Abweichung kann in allen Gruppen von einer vergleichbar starken Blutung

ausgegangen werden.

Abbildung 16: (a) Intrazerebraler Druck (ICP) und (b) zerebrale D urchblutung (rCBF), vor,

während und nach der SAB Induktion.

Zeit [min]-10 -5 0 5 10 15 20

ICP

[mm

Hg

]

0

20

40

60

80

100

120 ICP (n=10) +/- SEM*p<0,05

SAB

vor SAB nach SAB

*

Zeit [min]-10 -5 0 5 10 15 20

rCB

F [%

]

0

20

40

60

80

100

120

rCBF (n=10) +/- SEM*p<0,05

SAB

vor SAB nach SAB

*

3. Ergebnisse

63

3.1.2 Einfluss des inhalierten Stickstoffmonoxids a uf die zerebrale Mikrozir-

kulation nach SAB

3.1.2.1 Systemischer arterieller Blutdruck

Der mittlere arterielle Blutdruck wurde kontinuierlich aufgezeichnet. Die NO-Inhalation

hatte keinen signifikanten Einfluß auf den MAP weder im Vergleich zu den Werten vor

NO-Gabe (vor iNO: 72,6 ± 10,5 mmHg und nach 40 min iNO: 72,0 ± 7,5 mmHg) noch

im Vergleich zur Kontrollgruppe (30. Min: 74,7 ± 4,7 mmHg und 70. Min: 61,6 ± 3,09

mmHg) (Abbildung 17).

Abbildung 17: Die Stickstoffmonoxid-Inhalation hat keinen Einfluss auf den systemischen

Blutdruck (gemessen in der A. femoralis).

Zeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

MA

P [m

mH

g]

0

20

40

60

80

100

120 Kontrolle (SAB)SAB + iNO

MW +/- SEMn = 5 pro Gruppe*p<0,05 vs 30 min

iNO (50 ppm)

3. Ergebnisse

64

3.1.2.2 Physiologische Parameter

Während des gesamten Versuchs wurde der arterielle pCO2 durch entsprechende

Anpassung der Beatmungsparameter im physiologischen Bereich gehalten. Am Ende

des Versuchs zeigte sich in Bezug auf pO2, pCO2 kein Unterschied zwischen den

Versuchsgruppen (Tabelle 14).

Tabelle 14: Tabellarische Darstellungen des pCO 2 und pO 2 nach 100 min Versuch.

MW ± SEM [SAB (n = 5); SAB + iNO (n = 5)]

3.1.3 Einfluss von NO auf die arteriellen Gefäßdurc hmesser

Direkt nach Beginn der NO-Inhalation (ab der 30. min) kam es in den kleinen und

kleinsten Arteriolen (Gefäßdurchmesser 9,5 bis 25 µm) zu einer signifikanten Dilatation

(Abbildung 18 b und c, in Kategorie 1: nach 30 min iNO: 126% ± 3,03%, nach 40 min

iNO: 126% ± 4,11% und 30 min nach iNO-Stopp: 134% ± 5,3%. In Kategorie 2 nach

40 min iNO: 117% ± 1,52% und 30 min nach iNO-Stopp: 122% ± 1,45%; p<0,05).

Dieser gefäßerweiternde Effekt blieb auch nach Beendigung der NO-Inhalation

erhalten und war bis zum Ende des Untersuchungszeitraums nachweisbar. In

Kapillaren (Durchmesser 5,0-9,0 µm, Kategorie 0, Abbildung 18 a) zeigte sich

trendmäßig die gleiche Veränderung. In den größeren Gefäßen (Kategorie 4-5,

Abbildung 18 e und f) zeigte sich kein Effekt der NO-Inhalation auf die Gefäßweite.

3. Ergebnisse

65

Abbildung 18: Einfluss der NO-Inhalation auf den Du rchmesser zerebraler Kapillaren (5,0-9,5 µm)

und Arteriolen (9,5-65 µm).

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90 100

Kap

illar

en D

urch

mes

ser

[%]

0

80

100

120

140


MW +/- SEMn = 5 pro Gruppe*p< 0,05 vs 30 min

Gefäßdurchmesser 5,0 - 9,5 µm

iNO (50 ppm)

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90 100

Art

erio

len

Durc

hmes

ser

[%]

0

80

100

120

140

160Kontrolle (SAB) SAB + iNO

*

iNO (50 ppm)


Gefäßdurchmesser 9,5 - 15 µm

* *

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90100

Art

erio

len

Dur

chm

esse

r [%

]

0

80

100

120

140

160Kontrolle (SAB)SAB + iNO

**


Gefäßdurchmesser 15 - 25 µm

iNO (50 ppm)

Zeit [min]0 30 40 50 60 70 80 90 100

Art

erio

len

Dur

chm

esse

r [%

]

0

80

100

120

140




iNO (50 ppm)

Zeit [min]0 30 40 50 60 70 80 90 100

Art

erio

len

Dur

chm

esse

r [%

]

0

80

100

120

140

160Kontrolle (SAB)SAB + iNO


iNO (50 ppm)


Zeit [min]0 30 40 50 60 70 80 90 100

Art

erio

len

Dur

chm

ess

er

[%]

0

80

100

120

140



iNO (50 ppm)


3. Ergebnisse

66

3.1.4 Einfluss der NO-Inhalation auf die zerebralen Mikrovasospasmen

Drei Stunden nach SAB zeigte sich in der zerebralen Mikrozirkulation eine signifikante

Anzahl von mikrovaskulären Kontraktionen (siehe Beispielbild in Abbildung 19).

Anzahl, Intensität und Verteilung entsprachen den Befunden in vorangegangenen

Studien.184

Abbildung 19: Mikrovaskuläre Kontraktionen von Arte riolen der Kategorie 1 und 2 drei Stunden

nach SAB.

3. Ergebnisse

67

Vor Beginn der NO-Inhalation zeigte sich in beiden Gruppen eine gleiche

durchschnittliche Anzahl an Spasmen pro Gefäßabschnitt. Sofort nach Induktion von

iNO kam es zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl der Spasmen. Diese

Reduktion hielt auch nach Beendigung von iNO an (Abbildung 20, nach 10 min iNO:

38% weniger MVS, nach 20 min iNO: 67% weiniger MVS, nach 30 min iNO: 73%

weniger MVS, nach 40 min iNO:81,5% weniger MVS und 30 min nach iNO-Stopp:

77,4% weniger MVS pro Gefäßabschnitt).

Abbildung 20: Durchschnittliche Anzahl von Mikrovas ospasmen pro Gefäßabschnitt mit und

ohne NO-Inhalation.

Betrachtet man die Gesamtzahl von Spasmen in allen Gefäßkategorien (Abbildung

21), zeigt sich dieser Effekt noch deutlicher: Bereits kurz nach Beginn von iNO sank

die Zahl deutlich ab und reduzierte sich gegen Ende der 40-minütigen Inhalation auf

16% des Ausgangswertes. Diese signifikante Reduktion ist auch 30 Minuten nach

Beendigung der NO-Inhalation noch nachweisbar.

Zeit [min]0 30 40 50 60 70 80 90 100

Mik

rova

sosp

asm

us p

ro G

efäß

absc

hnitt

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0Kontrolle (SAB)SAB + iNO

* * * *iNO (50 ppm)


3. Ergebnisse

68

Abbildung 21: Gesamtanzahl von Mikrovasospasmen in allen Gefäßkategorien mit und ohne

NO-Inhalation.

3.1.5 Räumliche Verteilung der Mikrovasospasmen

Vasospasmen zeigten sich in der vorliegenden Versuchsserie vor allem in Arteriolen

mit einem Kaliber von 9,5 bis 25 µm (Abbildung 22 b und 22 c). Hier zeigte sich

wiederum die signifikante Reduktion der Zahl der Spasmen durch die NO-Inhalation

(Abbildung 22 b und c, Kategorie 1: nach 10 min iNO: 50% weniger MVS, nach 20

min iNO: 78% weiniger MVS, nach 30 min iNO: 77% weniger MVS, nach 40 min

iNO:86,5% weniger MVS und 30 min nach iNO-Stopp: 85,6% weniger MVS. In

Kategorie 2 nach 10 min iNO: 41% weniger MVS, 20 min nach iNO: 68,5% weniger

MVS, 30 min nach iNO: 73,5% weniger MVS, 40 min nach iNO: 89% weniger MVS

und 30 min nach iNO-Stopp: 67% weniger MVS; p<0,05). In Gefäßen höherer

Kategorie (Durchmesser 25-45 µm, Abbildung 22 d, e) zeigten sich sehr wenige bis

keine Spasmen, auch hier hat iNO keinen signifikanten Effekt.

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90 100

Mik

rova

sosp

asm

en [%

]

0

20

40

60

80

100

120

SAB + iNO (n = 5)Kontrolle (SAB; n = 5)

n=112 n=114n=108

n=116

n=126

n=113

n=86

n=58

n=30n=24

n=14n=20

n = Gesamt Mikrovasospasmen

iNO (50 ppm)

3. Ergebnisse

69

Abbildung 22: Räumliche Verteilung der Mikrovasospa smen (pro Gefäßabschnitt).

Gefäßdurchmesser 9,5-15 µm

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90100

Mik

rova

sosp

asm

us p

ro G

efä

ßab

sch

nitt

[n]

0

1

2

3

4

5

6 Kontrolle (SAB) SAB + iNO

* * **

MW +/- SEMn = 5 pro Gruppe*p<0.05 vs 30 min

iNO (50 ppm)

Gefäßdurchmesser 15-25 µm

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90100

Mik

rova

sosp

amus

pro

Gef

äßa

bsch

nitt

[n]

0

1

2

3

4

5


* * * **


iNO (50 ppm)


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90 100

Mik

rova

sosp

asm

us p

ro G

efäß

absc

hnitt

[n]

0

1

2

3

4

5


iNO (50 ppm)



Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90100

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro G

efäß

absc

hnitt

[n]

0

1

2

3

4

5



iNO (50 ppm)

Gefäßdurchmesser 5,0-9,0 µm

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90100

Mik

rova

sosp

asm

en

pro

Gefä

ßab

schn

itt [n

]

0

1

2

3

4

5


*

iNO (50 ppm)


3. Ergebnisse

70

3.1.6 Effekt der NO-Inhalation auf den Grad der Mik rovasospasmen

Die überwiegende Mehrzahl der Spasmen ist leicht- bis mittelgradig, d. h. die Gefäße

wiesen einen Konstriktionsgrad zwischen 10 und 40% der Baseline auf. Höhergradige

Konstriktionen waren selten (Abbildung 23 a). Die NO-Inhalation führt zu einer raschen

Erweiterung der verengten Arteriolen, insbesondere der am häufigsten auftretenden

Spasmen mit einen Konstriktionsgrad zwischen 10-20% (Abbildung 23 c: p = 0,032, d:

p = 0,016 und Abbildung 23 e: p = 0,008). Auch hier lässt sich 30 Minuten nach Ende

der Therapie weiterhin ein signifikanter Effekt nachweisen (Abbildung 23 f).

3. Ergebnisse

Abbildung 23: Effekt der NO-Inhalation auf dem Mikr ovasospasmus im Hinblick auf den

Konstriktionsgrad. Die NO-Inhalation vermindert bzw. verhindert v. a. leicht- bis mittelgradige

Spasmen (10-30%), die jedoch die Mehrzahl aller Spasmen ausmachen.

Baseline - Vor NO-Inhalation (0-30 min)

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

51-60

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10


MW +/- SEMn = 5 pro Gruppe*p<0,05 vs SAB

Nach 10 min NO-Inhalation

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

51-60

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10



*


Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

51-60

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10


**

* *



Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

51-60

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10


*

*

*



Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

51-60

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10


* *


Baseline - 30 min nach NO-Inhalation

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

51-60

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10


**


3. Ergebnisse

3.1.7 Einfluss der NO-Inhalation auf Durchmesser ze rebraler Venolen

Zerebrale Venolen zeigten unter der NO-Inhalation keine Änderung ihres Durchmessers (Abbildung 24).

Abbildung 24: Kein Einfluss von iNO auf den Durchme sser von zerebralen Venolen.

3.2 Effekt der Endothelin-Rezeptor-Blockade auf die zerebrale

Mikrozirkulation nach experimenteller Subarachnoida lblutung

3.2.1 Dosisfindung Clazosentan

Da bisher keine Untersuchungen zur Verwendung des ET-1-Rezeptor-Antagonisten

Clazosentan in der Maus vorlagen, führten wir zunächst eine Vorstudie mit

unterschiedlichen Dosierungen des Medikaments durch. Zum Ausschluss signifikanter

Nebenwirkungen auf zerebrale Durchblutung und den systemischen Blutdruck wurde

Clazosentan in den Dosen 1, 3, 10 und 20 mg/kg KG/h über 180 Minuten kontinuierlich

intravenös über einen V. femoralis-Katheter appliziert. Abbildung 25 zeigt die

graphische Darstellung von MAP (a) und CBF (b). Im beobachteten Zeitraum kam es

zu keinen signifikanten Veränderungen von MAP oder CBF. Die Gruppe mit der

höchsten Dosierung zeigte jedoch über die Zeit einen tendenziellen MAP-Abfall. Als

Dosis für die weiteren Versuche wurde deswegen die nächstgeringere Dosis, welche

keinen MAP-Effekt hatte, eingesetzt: 10 mg/kg KG/h.

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80 90 100

Ven

olen

Dur

chm

esse

r [%

]

0

100

120

140


iNO (50 ppm)


3. Ergebnisse

73

Abbildung 25: Clazosentan-Dosisfindung: Effekt unte rschiedlicher Dosen von Clazosentan auf

den systemischen arteriellen Blutdruck (MAP, a) und die regionale zerebrale Durchblutung

(rCBF, b). Die untersuchten Dosierungen 1 mg/Kg, 3 mg/Kg, 10 mg/Kg und 20 mg/Kg hatten keinen

signifikanten Effekt auf die untersuchten Parameter.

Clazosentan Dosisfindung CBF-Vergleichskurve

Zeit [min]

-50 0 50 100 150 200

rCB

F [%

]

0

20

40

60

80

100

120

140Clazosentan 1 mg/kgClazosentan 3 mg/kgClazosentan 10 mg/kgClazosentan 20 mg/kg

MW +/- SEMn = 3 pro Gruppe*p< 0,05

Clazosentan Dosisfindung MAP-Vergleichskurve

Zeit [min]

-50 0 50 100 150 200

MA

P [m

mH

g]

0

20

40

60

80

100

120

140

160 Clazosentan 1mg/kgClazosentan 3mg/ kgClazosentan 10 mg/kgClazosentan 20 mg/kg

MW +/- SEMn = 3 pro Gruppe*p< 0,05

3. Ergebnisse

74

3.2.2 Einfluss der ET1-Rezeptor-Blockade auf die ze rebrale Mikrozirkulation

3.2.2.1 MAP

Der systemische Blutdruck fiel mit der Zeit in beiden Gruppen tendenziell ab. Zwischen

der Kontroll- und der Clazosentan-Gruppe zeigte sich jedoch kein Unterschied

(Abbildung 26).

Abbildung 26: MAP während der IVM mit und ohne Claz osentan-Gabe. Unter Infusion von 10 mg/kg

KG/h zeigte sich der MAP im Vergleich zur Kontrollgruppe unverändert.

3.2.2.2 Blut-Gas-Analyse

Die physiologischen Parameter am Ende des Untersuchungszeitraums waren in

beiden Gruppen vergleichbar (Tabelle 15).


MW ± SEM [SAB (n = 6); SAB + iNO (n = 6)]

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

MA

P [m

mH

g]

0

20

40

60

80

100

120 Kontrolle (SAB)Clazo SAB

Clazosentan

MW +/- SEMn = 6 pro Gruppep< 0,05 vs SAB

3. Ergebnisse

75

3.2.2.3 Einfluss von 10 mg/kg KG/h Clazosentan auf den Durchmesser von

zerebralen Arteriolen (9,5-55 µm)

Unter Clazosentan-Infusion zeigte sich in den Arteriolen von 9,5 bis 35 µm (Abbildung

27 a-c) keine signifikante Vasodilatation, die ET1-Rezeptor-Blockade führte lediglich

zu geringen Schwankungen des Gefäßdurchmessers.

Abbildung 27.: ET-Rezeptorblockade durch Clazosenta n führt in kleineren pialen Arteriolen zu

keiner signifikanten Vasodilatation. Die Werte der Clazosentan-Gruppe wurden auf die

Kontrollgruppe normalisiert (Durchmesser vor Beginn der Infusion entspricht 100%).

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Du

rchm

esse

r vo

n A

rter

iole

n [%

]

0

80

100

120

140

Clazo SAB / SAB

Clazosentan



Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Dur

chm

esse

r vo

n A

rter

iole

n [%

]

0

80

100

120

140

Clazo SAB / SAB

Clazosentan

Gefäßdurchmesser 9,5 - 15 µm

MW +/- SEMn = 6 pro Gruppe*p< 0,05 vs SAB

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Dur

chm

esse

r vo

n A

rter

iole

n [%

]

0

80

100

120

140

Clazo SAB / SAB

Clazosentan



3. Ergebnisse

76

Größere Gefäße bzw. Arteriolen mit einem Durchmesser von 35-45 µm reagierten auf

10 mg/kg KG/h Clazosentan mit einer signifikanten Vasodilatation in der 50. Minute

(126,6% ± 2,0%, p = 0,015). Diese ist jedoch rasch reversibel nach Ende der

Medikamentengabe (Abbildung 28 a). Arteriolen mit einem Durchmesser von 45-55

µm weisen in der 30. Minute nach Clazosentan-Infusion eine signifikante Erweiterung

der Gefäße von 121,01% ± 2,2% bei p = 0,03. Anschließend ist eine Verengung der

Gefäße zu beobachten (Abbildung 28 b).

Abbildung 28: ET-1-Rezeptorblockade mit Clazosentan (10 mg/kg KG/ h) auf größere zerebrale

Arteriolen. Unter Clazosentan-Infusion kommt es zu einer kurzfristigen signifikanten Vasodilatation bei

Arteriolen mit einem Durchmesser von 35-45 µm (a) und 45-55 µm (b).

3.2.2.4 Effekt der ET1-Rezeptorblockade auf die pos thämorrhagischen Mikro-

vasospasmen

Die Clazosentan-Infusion führte ab der 20. Min zur einen tendenziellen Verringerung

von Vasospasmenzahl bis zur 70. Min in Arteriolen der Kategorie 1 (Abbildung 29 a).

Arteriolen der Kategorie 2 (Abbildung 29 b) zeigten eine signifikante Verringerung der

MVS-Zahl gegenüber der Kontrolle in der 50. Min (die MVS-Zahl verringerte sich um

50% ± 3,5%, p = 0,041). In der Kategorie 3 (Abbildung 29 c) sind signifikante

Verringerungen bzgl. der MVZ-Zahl in der 50. Min (MVS-Zahl verringerte sich um 30%

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Du

rchm

esse

r vo

n A

rter

iole

n [%

]

0

80

100

120

140

Clazo SAB / SAB

Clazosentan


MW +/- SEMn = 6 pro Gruppep< 0,05 vs SAB*

**

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Du

rchm

esse

r vo

n A

rter

iole

ns

[%]

0

80

100

120

140

Clazo SAB / SAB

Clazosentan



*

3. Ergebnisse

77

± 8,0%, p = 0,008), 70. Min (MVS-Zahl verringerte sich um 75% ± 0%, p = 0,015) und

80. Min (MVS-Zahl verringerte sich um 46,05% ± 0%, p = 0,015) zu verifizieren.

Abbildung 29: Effekt der ET1-Rezeptorblockade auf d ie Anzahl an Mikrovasospasmen. Unter

Clazosentan-Infusion kommt es zu einer signifikanten Mikrovasospasmenzahl Reduzierung bei

Arteriolen mit einem Durchmesser von 15-25 µm(b) und 25-35 µm (c).

Gefäßdurchmesser 15 -25 µm

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Mik

orv

asos

pas

me

n p

ro G

efäß

absc

hn

itt [%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

SABClazo SAB

Clazosentan

*


Gefäßdurchmesser 25 -35 µm

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Mik

rova

sosp

asm

en

pro

Ge

fäß

absc

hnitt

[%]

0

50

100

150

200SABClazo SAB

Clazosentan


** *

Gefäßdurchmesser 9,5 -15 µm

Zeit [min]

0 20 40 60 80 100

Mik

orva

sosp

asm

en

pro

Gef

äß

abs

chn

itt [%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200SABClazo SAB

Clazosentan


3. Ergebnisse

78

3.2.2.5 Effekt der ET1-Rezeptorblockade auf die Anz ahl und den Konstrik-

tionsgrad der Mikrovasospasmen

Die überwiegende Mehrzahl der Spasmen ist mittelgradig ausgeprägt. Die Gefäße

wiesen vor allem MVS mit einen Konstriktionsgrad zwischen 10 und 30% der Baseline

auf. Höhergradige Konstriktion der Gefäße sind selten (Abbildung 30 a). Die Clazosen-

tan-Infusion (10 mg/kg KG/h) führt zu einer Erweiterung der Spasmen die einen

Konstriktionsgrad zwischen 10-30% aufweisen. 30 min nach Therapie bleiben MVS,

die einen Konstriktionsgrad zwischen 21-30% aufweisen, signifikant verringert

(Abbildung 30 f).

3. Ergebnisse

Nach 30 min Clazosentan-Infusion

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10

12

14

16SABClazo SAB

MW +/- SEMn = 6 pro Grupppe*p< 0,05 vs SAB

* *

Baseline - 20 min nach Clazosentans-Infusion

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10

12

14

16SABClazo SAB


* *

Baseline - 30 min nach Clazosentans-Infusion

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10

12

14

16SABClazo SAB


*

Abbildung 30: Effekt der ET-1-Rezeptorblockade auf die Anzahl und Konstriktionsgrad von

Mikrovasospasmen. Die Clazosentan-Infusion vermindert bzw. verhindert v. a. leicht- bis mittelgradige

Spasmen (10-30%), die jedoch die Mehrzahl aller Spasmen ausmachen

Baseline - Vor Clazosentan-Infusion (10-20 min)

Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10

12

14

16SABClazo SAB

MW +/- SEMn = 6 pro Gruppe*p< 0,05 vs SAB*


Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

Mic

rova

sosp

asm

s / M

ouse

(n)

0

2

4

6

8

10

12

14

16SABClazo SAB


*

*


Konstriktion [%]

10-2021-30

31-4041-50

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10

12

14

16SABClazo SAB


**

d

e f

3. Ergebnisse

3.3 Rolle der NO-Synthasen bei der CO 2-induzierten Vasodilatation

zerebraler Gefäße

3.3.1 Physiologische Parameter

Am Ende der Beobachtungszeit waren die physiologischen Parameter in allen

Gruppen vergleichbar.


MW ± SEM, Wildtyp (n = 8); eNOS-/- (n = 8); nNOS-/- (n = 8); iNOS-/- (n = 8)

MW ± SEM [Wildtyp (n = 8); eNOS-/- (n = 8); nNOS-/- (n = 8); iNOS-/- (n = 8)]

3.3.2 Einfluss der NOS-Isoformen auf die CO 2-Gefäßreaktivität

Unter physiologischen Bedingungen zeigten sich bei allen Versuchstieren

vergleichbare Werte; der MAP war im physiologischen Bereich, lediglich die eNOS-

defizienten Mäuse wiesen zu Beginn der Untersuchung einen erhöhten arteriellen

Blutdruck auf (Abbildung 31b, weiße Kreise). Dies entspricht den Ergebnissen

vorangegangenen Studien unserer und anderer Arbeitsgruppen.381-387 Nach Induktion

einer Hyperkapnie (durch Inhalation eines 7,5%igen CO2-Atemgasgemisches) kam

es in der Kontrollgruppe zu der erwarteten physiologischen Reaktion: es zeigte sich

ein signifikanter Anstieg der zerebralen Durchblutung (Abbildung 31 a, schwarze

Kurve). Der MAP blieb in dieser Phase konstant, bzw. fiel sogar gering (nichtsignifi-

kant) ab (Abbildung 31 b, schwarze Kurve). iNOS-transgene Tiere zeigten einen

ähnlichen Verlauf wie die Kontrolltiere auf (Abbildung 31, weiße Quadrate). Auch hier

kam es zu einem signifikanten CO2-induzierten CBF-Anstieg. Der MAP der iNOS-/--

Mäuse verhielt sich während der CO2-Inhalation, ähnlich der Kontrollgruppe, d.h.

relativ Konstant. nNOS-/--Mäuse zeigen eine deutlich reduzierte CBF Reaktion auf die

Hyperkapnie, es kam zu lediglich einer geringgradigen und nichtsignifikanten

Erhöhung des CBF auf maximal 106,38% ± 2,86% (Abbildung 31, weiße Dreiecke).

eNOS-/--Mäuse zeigten interessanterweise unter Hyperkapnie keinerlei Anstieg der

zerebralen Durchblutung, über die Zeit nahm der CBF sogar (nichtsignifikant) ab

3. Ergebnisse

81

(Abbildung 31 a, weiße Kreise). Der, initial im Vergleich zu den anderen Gruppen, eher

erhöhte arterielle Blutdruck sank während der Phase der CO2-Erhöhung deutlicher ab

als in den anderen Gruppen (Abbildung 31 a, weiße Kreise).

Abbildung 31: CO 2-Gefäßreaktivität in Wildtyp- und NOS-transgenen Mä usen. Während induzierter

Hyperkapnie (rot schraffierter Bereich) zeigten nur Wt und iNOS-transgene Mäuse den erwarteten CBF-

Anstieg. Er war in nNOS-defizienten Tieren deutlich reduziert. In eNOS-Knockout-Tieren blieb die

Reaktion vollständig aus.

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80

rCB

F [%

]

0

60

80

100

120

140

160

Wildtyp

eNOS-/-

nNOS-/-

iNOS-/-

iCO2 (7,5 %)

#

*#

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppewt (n = 13)

$#*p< 0,05 vs 30 min

$ $

**

*

* *

Zeit [min]

0 30 40 50 60 70 80

MA

P [m

mH

g]

0

60

80

100

Wildtyp

eNOS-/-

nNOS-/-

iNOS-/-iCO2 (7,5 %)

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppewt (n = 15)*p< 0,05 vs 30 min

*

*

3. Ergebnisse

82

3.3.3 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie - Wildtyp-Mäusen

Auf der Ebene der Mikrozirkulation zeigte sich, dass die Vasodilatation nach Induktion

von Hyperkapnie im Wildtyp-Tier vor allem in den kleinen Gefäßen (Durchmesser 9,5

- 35 µm) stattfindet. Die ausgeprägteste Erweiterung lag bei 9,5-15 µm: 131% ± 0,8%

vs. Baseline in der 50. Min (Abbildung 32 a), während bei größeren Arteriolen

(Durchmesser 35-65 µm) die Gefäßerweiterung zwar nachweisbar, jedoch deutlich

schwächer ausgeprägt war (Abbildung 32 b). Der beobachtete durchblutungsstei-

gernde Effekt von CO2 im Gehirn wird also hauptsächlich durch die kleinen Gefäße

mediiert.

.

Abbildung 32: Vasodilatation unter induzierter Hype rkapnie – Wildtyp-Mäuse . (a) In Arteriolen mit

9,5-35 µm Durchmesser zeigt sich eine signifikante Vasodilatation (Maximum: 9,5-15 µm: 131% ± 0,8%,

15-25 µm: 123% ± 0,4%, 25-35 µm: 123% ± 0,7%, 20 min nach iCO2). (b) Auch in größeren Gefäßen

(35-65 µm) ist eine Vasodilatation nachweisbar, diese ist jedoch hier deutlich geringer ausgeprägt.


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

riole

n D

urch

mes

ser [

%]

0

80

100

120

140

16035 - 45 µm45 - 55 µm55 - 65 µm

Wildtyp *MW +/- SEMn = 15 pro Gruppe*p< 0,05 vs 30 min

iCO2 (7,5 %)

*


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

riole

n D

urch

mes

ser [

%]

0

80

100

120

140

1609,5 - 15 µm15 - 25 µm25 - 35 µm

Wildtyp

MW +/- SEMn = 15 pro Gruppe*#+p< 0,05 vs 30 min

iCO2 (7,5 %)

* *

*

##

#

+

+

*

+

3. Ergebnisse

83

3.3.4 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie – iNOS-defiziente Mäuse

iNOS-/--defiziente Mäuse zeigten unter erhöhtem pCO2 Bedingungen ein ähnliches

Verhalten wie Kontrolltiere. Auch hier zeigte sich die ausgeprägteste Vasodilatation in

den kleinen Arteriolen (145% ± 1,3% vs. Baseline, in der 40. Min, Abbildung 33 a); in

größeren Gefäßen war der Effekt sehr viel schwächer ausgeprägt, die Gefäße waren

jedoch im Vergleich zur Baseline dennoch signifikant erweitert zur Baseline (Abbildung

33 b).

Abbildung 33: Vasodilatation unter induzierter Hype rkapnie – iNOS-defiziente Mäuse . (a) In

Arteriolen mit 9,5-35 µm Durchmesser zeigt sich eine signifikante Vasodilatation (Maximum: 9,5-15 µm:

145% ± 1,3% 10 min nach iCO2, 15-25 µm: 136% ± 1,7% 20 min nach iCO2, 25-35 µm: 128% ± 2,0%,

10 min nach iCO2). (b) Auch in größeren Gefäßen (35-65 µm) ist eine signifikante Vasodilatation

nachweisbar (Maximum: 35-45 µm: 115% ± 1,3% und 45-55 µm: 120% ± 2,0%, 10 min nach iCO2),

diese ist jedoch wie bei den Wt-Tieren deutlich geringer ausgeprägt als in den kleineren Gefäß-

kategorien.


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

rioen

Dur

chm

esse

r [%

]

0

100

120

140

160 9,5 - 15 µm15 - 25 µm 25 - 35 µm

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppe*#+p< 0,05 vs 30 min

iNOS -/- (n = 8)

iCO2 (7,5 %)

*

*

#

#

#

++

+

*

*#


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

riole

n D

urch

mes

ser [

%]

0

100

120

140

160

35 - 45 µm45 - 55 µm55 - 65 µmMW +/- SEM

n = 8 pro Gruppe*#p< 0,05 vs 30 min

iNOS -/-

iCO2 (7,5 %)

*

*# #

#

3. Ergebnisse

84

3.3.5 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie – nNOS-defiziente Mäuse

Die nNOS-/--Mäuse wiesen unter erhöhtem pCO2 (7,5 % iCO2) eine im Vergleich zur

Kontrollgruppe deutlich verminderte CO2-induzierte Vasodilatation auf (15-25 µm: p =

0,006 nach 10 min iCO2, p = 0,049 nach 20 min iCO2: und p = 0,002 10 min nach iCO2,

25-35 µm: p = 0,022 nach 10 min iCO2). Im Vergleich zu den iNOS-/-- Mäusen war

ebenso eine verminderte CO2-induzierte Vasodilatation zu erkennen (15-25 µm: p =

0,033 10 min nach iCO2). Nur die kleineren Arteriolen mit einem Durchmesser von 9,5-

25 µm wiesen eine geringe, jedoch im Vergleich zur Baseline signifikante

Vasodilatation auf (116% ± 1,0% bei Kategorie 1 und 108% ± 1,1% bei Kategorie 2,

Abbildung 34 a). Bei größeren Arteriolen (von 35-65 µm) war der vasodilatative Effekt

nahezu nicht nachweisbar (Abbildung 34 b). Der Anteil von nNOS an der CO2-

induzierten Vasodilatation erscheint also vor allem in kleineren Gefäßen wichtig.

Abbildung 34: Vasodilatation unter induzierter Hype rkapnie – nNOS-defiziente Mäuse . Die CO2-

bedingte zerebrale Vasodilatation war in nNOS-Knockout-Mäusen signifikant erhöht und deutlich

geringer ausgeprägt als in der Kontrollgruppe, vor allem im Kaliber 15-25 µm. (a) In Arteriolen mit 9,5-

25 µm Durchmesser zeigt sich eine geringe Vasodilatation (Maximum: 9,5-15 µm: 116% ± 2% 20 min

nach iCO2 und 15-25 µm: 108% ± 1,0% 10 min nach iCO2), während in größeren Gefäßen (b) eine

Vasodilatation nahezu komplett ausblieb.


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

riole

n D

urch

mes

ser [

%]

0

80

100

120

140

1609,5 - 15 µm15 - 25 µm25 - 35 µm

nNOS -/-

iCO2 (7,5 %)

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppe*#p< 0,05 vs 30 min

*

*

##

#


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

riole

n D

urch

mes

ser [

%]

0

80

100

120

140

160 35 - 45 µm45 - 55 µm55 - 65 µm

nNOS -/-

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppep< 0,05 vs 30 min

iCO2 (7,5 %)

3. Ergebnisse

85

3.3.6 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie – eNOS-defiziente Mäuse

Die auffälligsten Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten sich, wie in

der CBF-Messung, auch auf der Ebene der Mikrozirkulation bei den eNOS-/--Mäusen.

Vor allem war die Reaktion kleiner Arteriolen der eNOS-/--Mäuse im Vergleich zur

Kontrollgruppe besonders verringert (15-25 µm: p = 0,005 nach 10 min iCO2, p = 0,049

nach 20 min iCO2: und p = 0,022 10 min nach iCO2). Auch im Vergleich zu iNOS-/--

Mäusen war der Gefäßdurchmesser deutlich geringer (9,5-15 µm: p = 0,05 nach 10

min iCO2; 15-25 µm: p = 0,001 nach 10 min iCO2, p = 0,038 nach 20 min iCO2; 25-35

µm: p = 0,028 nach 10 min iCO2). Bei größeren Arteriolen (von 35-65 µm) war der

vasodilatative Effekt bei eNOS-/--Mäusen auch verringert (35-45 µm: p = 0,026 nach

20 min iCO2 im Verglich zur Kontrolle und p = 0,003 nach 10 min iCO2 im Vergleich

zu iNOS-/--Mäusen). In den Arteriolen mit 25-35 µm Durchmesser kam es zu einer

geringfügigen Vasodilatation (117% ± 1,0%, Abbildung 35 a), die auch nur zu einem

Zeitpunkt (50 min) im Vergleich zur Baseline statistisch signifikant war. Der Anteil von

eNOS an der CO2-induzierten Vasodilatation erscheint also vor allem in kleineren

Gefäßen wichtig.

Abbildung 35: Vasodilatation unter induzierter Hype rkapnie – eNOS-defiziente Mäuse . Die CO2-

bedingte zerebrale Vasodilatation war deutlich geringer ausgeprägt als bei Wildtyp-Mäusen. Lediglich

in Gefäßen der Kategorie 3 kam es zu einer geringen Vasodilatation (a), In größeren Arteriolen (b) hat

iCO2 nur eine ganz schwache Wirkung auf die Gefäße.


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Art

erio

len

Dur

chm

esse

r [%

]

0

80

100

120

140

16035 - 45 µm 45 - 55 µm 55 - 65 µm

eNOS-/-

iCO2 (7,5 %)

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppep< 0,05 vs 30 min


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Art

erio

len

Dur

chm

esse

r [%

]

0

80

100

120

140

1609,5 - 15 µm15 - 25 µm25 - 35 µm

eNOS-/-

iCO2 (7,5 %)


*

*

3. Ergebnisse

86

3.3.7 Vasodilatation unter induzierter Hyperkapnie der NOS-Isoformen in klei-

nen Arteriolen

Abbildung 36 zeigt für jeden Genotyp die Gefäßkategorie mit der ausgeprägtesten

vasodilatatorischen Reaktion, d. h. Arteriolen mit einem Durchmesser zwischen 9,5 -

15 µm. Es ist deutlich erkennbar, dass die Arteriolen der Wildtyp- und iNOS-/--Gruppe

im Vergleich zu nNOS- und vor allem eNOS-transgenen Tieren eine deutlich

ausgeprägtere CO2-Reaktivität zeigen.

Abbildung 36: Einfluss der NOS- auf die CO2-induzie rte Vasodilatation, Gefäße mit einem

Durchmesser von 9,5-15 µm.

3.3.8 Mögliche Rolle der NOS bei der Formation von Mikrovasospasmen

Bei der Untersuchung der zerebralen Mikrozirkulation im Rahmen der Untersuchung

der CO2-Reaktivität fielen bereits unter physiologischen Bedingungen charakteris-

tische Gefäßveränderungen bei den NOS-transgenen Mäusen auf: die Arteriolen

wiesen segmentale Konstriktionen auf, die an die Mikrovasospasmen, wie sie nach


Zeit [min]

0 30 40 50 60 70

Arte

riole

n D

urch

mes

ser [

%]

0

100

120

140

160 Wildtyp

eNOS-/-

nNOS-/-

iNOS-/-

iCO2 (7,5 %)

* *

#

#

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppewt (n = 15)*+#p< 0,05 vs 30 min

#

*

#

*

+

+

3. Ergebnisse

87

Subarachnoidalblutung auftreten, erinnerten. Beispielbilder zeigt Abbildung 37. Neben

den Versuchsgruppen ist in Abbildung 37 f beispielhaft, wie der Befund drei Stunden

nach SAB zeigt. Daraufhin wurde das IVM-Protokoll angepasst und die zerebrale

Mikrozirkulation der NOS-defizienten Tiere basierend auf den Versuchen nach SAB

untersucht und ausgewertet. Für die Analyse wurden lediglich die ersten 10 min von

der Baseline (insgesamt sind es 30 min Baseline) herangezogen.

Abbildung 37: Beginnend mit einer Gesamtübersicht des zerebralen Mikrogefäßbaumes durch IVM,

konnte mit einer 20 fachen Vergrößerung (Immersionsobjektiv) Arteriolen, 9,5-35 µm, besichtigt und

analysiert werden. Die Häufigkeit von MVS ergab sich wie folgt: SAB > eNOS -/- > nNOS-/- > iNOS-/-. Die

Wildtyp-Mäuse dienten als Kontrolle. Die weißen Pfeile weisen auf MVS hin.

a b

c d

e f

3. Ergebnisse

eNOS-/--Mäuse wiesen insbesondere eine signifikante Anzahl von MVS in Arteriolen

auf, mit Durchmessern von 15-25 µm. Dies gilt auch nNOS-/--Mäuse. Im Vergleich zu

Wt-Tieren, die dieses Phänomen nur sehr vereinzelt zeigen, handelt es sich um einen

signifikanten Unterschied (Abbildung 38 a). Die Ausprägung erinnert an das

Vorkommen von Spasmen nach SAB, ist jedoch etwas geringer ausgeprägt. Die

vorkommenden mikroarteriolären Konstriktionen sind – ebenfalls wie beim posthä-

morrhagischen MVS – hauptsächlich leicht- bis mittelgradig (10-40%).

Abbildung 38: Vorkommen und Ausprägung von Mikrovasospasmen bei N OS-defizienten

Mäusen. ( a) eNOS-/-- und weniger stark ausgeprägt die nNOS-defizienten Mäuse zeigen eine signifi-

kante Anzahl von MVS v.a. in den kleinen Gefäßarteriolen (ähnlich wie bei SAB). (b) Die Spasmen sind,

ebenfalls wie nach SAB, vor allem gering bis mittelgradig (10-40%).

Konstriktion [%]

10-20 21-30 31-40 41-50

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

1

2

3

4

5

6

7Wildtyp

eNOS-/-

nNOS-/-

iNOS-/-

*

*

**

*

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppewt (n = 15)*p< 0,05 vs Wildtyp

Arteriolen Durchmesser [µm]

9,5-15 15-25 25-35 35-45

Mik

rova

sosp

asm

en p

ro M

aus

[n]

0

2

4

6

8

10Wildtyp

eNOS-/-

nNOS-/-

iNOS-/-

*

* *

MW +/- SEMn = 8 pro Gruppewt (n = 15)*p< 0,05 vs Wildtyp

*

4. Diskussion

4. Diskussion

4.1 Diskussion der Methoden

4.1.1 Auswahl der Versuchstiere

Nagetiere, insbesondere Mäuse, sind die am häufigsten verwendete Spezies in der

Schlaganfallforschung, da sie aufgrund ihrer schnellen Reproduktionsfähigkeit, sowie

ihrer kleinen Körpergröße kostengünstig und schnell gezüchtet werden können. Sie

haben ein robustes Herz-Kreislauf-System, das die komplikationslose Durchführung

von Langzeit-Narkosen ermöglicht. Ein Nachteil bei der Verwendung von Mäusen ist

die Schwierigkeit der Durchführung von operativen Eingriffen. Das Problem kann

jedoch durch die Anwendung mikrochirurgischer Techniken sowie die Verwendung

entsprechend dimensionierter Instrumente (Mikroskop, Mikrosonden) behoben

werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass Mäuse kein gyrencephales Gehirn besitzen,

was die Übertragbarkeit mancher Ergebnisse auf den Menschen nicht sicher

gewährleistet. Ein großer Vorteil der Maus ist jedoch die Möglichkeit zur genetischen

Manipulation durch die Verwendung von transgenen Mausmodellen, z.B. die

Züchtung von Mäusen mit spezifischen Gendeletionen (Knock-Out-Maus). Wichtige

Vorteile der Verwendung von Knockoutmäusen sind, dass das Deaktivieren eines

Gens eine umfassendere und präzisere Ausschaltung ermöglicht als eine

medikamentöse Blockade, zudem ist eine genetische Manipulationen oft der einzige

Weg zur Bestimmung der genauen Funktion eines Gens.388 NOS-Inhibitoren weisen

eine geringe Selektivität bzgl. der verschiedenen NOS-Isoformen auf, aufgrund der

schlechten Interaktionsfähigkeit der Inhibitoren mit der Arginin-Bindungsstelle.389 So

ist die inhibitorische Potenz von 1400 W, NAP und L-VNIO für nNOS und eNOS

schwach ausgeprägt.389-393 Lediglich für iNOS gibt es genügend selektive Inhibitoren,

wie z.B. 1400 W, Aminoguanidin, Isothiourea. Ein weiterer Grund für die Verwendung

eines Mausmodells in der vorliegenden Studie ist, dass die dünne Dura Mater und der

schmale Subarachnoidalraum der Maus Epifluoreszenzmikroskopie bei intakter Dura

erlaubt.127 Dies ist von Vorteil, da hierdurch operationsbedingte Artefakte minimiert

werden. Bei größeren Versuchstieren wie z.B. Ratten ist dies nicht möglich.394 Hier

muss die Dura Mater entfernt werden und das Gehirn während der Messungen

konstant mit einem künstlichem Liquor gespült werden.394 Dies ist sehr störanfällig,

außerdem besteht die Gefahr der Entwicklung eines Hirnödems.

4. Diskussion

90

4.1.2 Anästhesie

Um Aussagen über die zerebrale Mikrozirkulation und insbesondere über dessen

Veränderungen machen zu können, muss sichergestellt werden, dass die

Untersuchungen unter physiologischen Bedingungen stattfinden. Veränderungen von

systemischem Blutdruck, Körpertemperatur, pCO2 und pO2 können zu einer

Beeinflussung der zerebralen Durchblutung führen. Deswegen ist wichtig, dass diese

Parameter im Laufe eines Versuchs engmaschig überwacht und kontrolliert werden.

In der vorliegenden Studie wurden die Versuchstiere mechanisch beatmet, die

Temperatur konstant gehalten, die Atemparameter wurden kontinuierlich und

nichtinvasiv mittels Mikrokapnometrie überwacht und angepasst. In einer vorange-

gangenen Studie362 konnte gezeigt werden, dass mit dem in der Studie verwendeten

Setup auch über eine längere Narkosedauer physiologische Parameter eingehalten

werden können. Mehrfache Blutentnahmen zur Blutgasanalyse, welche aufgrund des

geringen Blutvolumens der Maus schnell zur Hypotension führen können, werden so

vermieden. Auch die Narkoseform kann die Versuchsergebnisse signifikant

beeinflussen. Isofluran, das am häufigsten tierexperimentell meist verwendete volatile

Betäubungsmittel395,396 entfaltet in vielerlei Hinsicht eine ähnliche Wirkung wie

Halothan,397 das vasodilatativ wirkt.398 Isofluran führt dosisabhängig zu einer globalen

CBF-Erhöhung sowie zum systemischen Blutdruckabfall und es beeinträchtigt die

zerebrale Autoregulation.399 Isofluran kann auch neuroprotektiv wirken400,401 indem es

nach zerebraler Ischämie die Infarktgröße,402 die neuronale Apoptose (durch

Hochregulierung von antiapoptotischen Faktoren wie MAP-Kinase),403-405 die

Exzitotoxizität,29,183 das Hirnödem,406 und das neurologische Defizit vermindert406

sowie die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke verringert.405 Ähnliche neuroprotektive

Effekte lassen sich auch nach SAB nachweisen.407,408 Da auch andere volatile

Anästhetika wie Sevofluran, Desfluran und Enfluran ähnliche Wirkungen wie Isofluran

ausüben,395 wurde in der vorliegenden Studie für die intravitalmikroskopischen

Untersuchungen, kein volatiles Anästhetikum, sondern eine Injektionsanästhesie aus

Medetomidin, Fentanyl und Midazolam (MMF) verwendet. Die intraperitoneale

Applikation dieser Kombination bei Nagern ist ein weitverbreitetes Verfahren in der

Veterinärmedizin, das gut steuerbar ist und eine große therapeutische Breite aufweist.

Entscheidend für diese Arbeit war allerdings, dass dieses Narkoseprotokoll keinen,

bzw. nur einen geringen Einfluss auf die zerebrale Mikrozirkulation hat.362 Auch für die

4. Diskussion

91

MMF-Narkose gibt es einige wenige Hinweise auf eine neuroprotektive Wirkung; so

wurde gezeigt, dass es nach Retinaischämie unter MMF zu einer Zunahme der Zahl

überlebender Ganglienzellen um etwa 40% des Ausgangswertes kommt,409 zudem

wurde berichtet, dass die Narkose mit Medetomidin und alpha-2-Adrenorezeptor-

Agonisten die Größe der Nekrose nach fokaler zerebraler Ischämie verringern

kann,410,411 Midazolam scheint aber eine geringe neuroprotektive Wirkung zu haben.412

Die dargestellten Nebenwirkungen von MMF sind jedoch im Vergleich zu volatilen

Anästhetika und anderen Injektionsnarkotika wie Propofol (fördert Blutdruckabfall und

Atemdepression) und Ketamin (Blutdruck- und Herzfrequenzsteigernd) als gering

einzuschätzen.

4.1.3 Beatmung der Versuchstiere

Das in der aktuellen Studie verwendete Narkoseprotokoll beinhaltet ein Opiat. Da

Opiate atemdepressiv wirken, mussten die Versuchstiere intubiert und kontrolliert

beatmet werden.413 Die kontrollierte Beatmung hat Auswirkungen auf den Säure-

Basen-Haushalt und die Blutgase des Versuchstieres. Die Beatmung muss daher so

gesteuert werden, dass die Zielgrößen sich im physiologischen Bereich befinden, da

Abweichungen vom Normbereich Auswirkungen auf die zerebrale Mikrozirkulation

haben würden. Zielgrößen, die während des Versuchs besonders beachtet werden

müssen sind Sauerstoffpartialdruck (pO2), und Kohlendioxidpartialdruck (pCO2), der

mittels Mikrokapnometrie gemessen wird.362,414,415 Das Hauptziel der mechanischen

Beatmung ist, den Erhalt des physiologischen paCO2 im Blut, sowie eine ausreichende

Gewebeoxygenierung für das Versuchstier zu garantieren.

4.1.4 Messung der zerebralen Durchblutung

Die Laser-Doppler-Flowmetrie ist eine nicht-invasive Methode zur Messung der

lokalen zerebralen Durchblutung. Die Technik basiert auf dem Prinzip, dass

monochromatisches Licht seine Wellenlänge ändert, wenn es von bewegten Objekten

(wie z.B. Erythrozyten) reflektiert wird (Doppler-Effekt). Die Menge und die

Frequenzänderung des reflektierten Lichts sind abhängig von der Anzahl und der

Geschwindigkeit der im Gewebe zirkulierenden Blutzellen. So kann mit der LDF

4. Diskussion

92

zuverlässig jede dynamische Veränderung der zerebralen Durchblutung detektiert

werden.416-421 Insgesamt ist die LDF für die Studie angemessen, weil sie a) nicht-

invasiv ist b) eine zusätzliche Applikation von Tracern (z.B. Radionuklide) nicht

erforderlich ist und c) ICP- und IVM-Messungen gleichzeitig zur CBF-Messung

durchgeführt werden können. Zudem erfordern die Untersuchungen der vorliegenden

Studie, dass schnelle kortikale Durchblutungsveränderungen verfolgt werden können;

hierbei sind vor allem Änderungen im Vergleich zur Baseline von Interesse. Absolute

Werte sind daher erforderlich. Nachteile der LDF-Methode liegen in der begrenzten

Eindringtiefe. Andere Techniken, die für die Messung der zerebralen Durchblutung

verwendet werden können, sind die Autoradiographie, die absolute CBF-Werte

ermöglicht. Diese Methode ist allerdings technisch sehr aufwendig und erlaubt nur die

Messung einzelner Messzeitpunkte da das Versuchstier für die Messung getötet

werden muss.422 Alle anderen Methoden zur Bestimmung der zerebralen Durch-

blutung, wie z.B. Perfusions-CT, Magnetresonanztomographie, oder Thermodilution,

können wegen mangelnder Auflösung oder Größe der Sonden nicht bei Mäusen

eingesetzt werden.

4.1.5 Wahl des SAB-Modells

Die Subarachnoidalblutung kann im Mausmodell entweder durch ein- oder mehrmalige

Injektion von Blut in die Cisterna Magna,423-425 Perforation einer intracisternalen

Vene426 oder Faden-Perforation der A. cerebri media127,427,428 vorgenommen werden.

Das Cisterna-Magna-Injektions-Modell und das Venen-Dissektions-Modell können

schnell durchgeführt werden, sind gut reproduzierbar und führen zu einem akuten

Anstieg des ICP sowie zu einer Abnahme der CBF.423-426 Diese Veränderungen sind

jedoch im Gegensatz zu den Vorgängen nach SAB im Patienten innerhalb kurzer Zeit

nach Injektion reversibel. Negativ für die vorliegende Studie ist die bei beiden Modellen

notwendige Verletzung der Dura mater, die die Intravitalmikroskopie behindern oder

verfälschen kann. Beiden Modellen fehlt jedoch der plötzliche, heftige Blutungsbeginn

und der endotheliale Schaden, die charakteristisch für die aneurysmatische SAB

sind.267 Daher ist das MCA-Perforations-Modell aktuell das geeigneste Modell zur

Erforschung der Pathophysiologie der SAB,427 da es die Folgen einer aneurys-

matischen Subarachnoidalblutung (verzögerte zerebralen Vasospasmen,429-434 frühe

4. Diskussion

93

Vasospasmen in der Mikrozirkulation,133,184,435 neurologische Dysfunktionen,429,431-

433,436,437 Hirnödem, 436,437 Hydrocephalus,438,439 eine klinisch relevante Mortalität von

ungefähr 30%,127,429,436,437 ICP-Anstieg127,184 und CBF-Abfall127,184) am besten

reproduziert und eine gute Standardisierbarkeit ermöglicht.427 Durch eine gleichzeitige

und kontinuierliche Messung von ICP und CBF am MCA-Perforations-Modell wird

kontrolliert, dass die Subarachnoidalblutung standardisiert ausgelöst werden kann.127

Außerdem ist für unsere Studie die Tatsache von Vorteil, dass keine Öffnung der Dura

Mater nötig ist und daher die Intravitalmikroskopie gut durchgeführt werden kann.

Nachteile dieses Modells sind das nicht direkt kontrollierbare austretende Blutungsvo-

lumen und die komplexe OP, die viel Erfahrung verlangt.

4.1.6 Intravitalmikroskopie

Die Visualisierung des Plasmas und somit der zerebralen pialen Mikrogefäße erfolgte

durch repetitive i.v. Injektionen von Fluoresceinisothiocyanat-Dextran (FITC-

Dextran).363,440 Ein Vorteil der i.v. Farbstoff-Injektion ist, dass eine Verletzung der Blut-

Hirn-Schranke durch Extravasation des Farbstoffes sofort offensichtlich ist.

Versuchstiere, bei denen dies der Fall war, wurden von der Analyse ausgeschlossen,

da bei traumatischer Präparation eine artifizielle Beeinflussung der Versuchs-

ergebnisse nicht auszuschließen bzw. wahrscheinlich ist. Eine Alternative zur

Verwendung eines i.v. Farbstoffs wäre eine Maus (tie2GFP-Maus), das Green-

Fluorescence-Protein (GFP) in Endothelzellen exprimiert.441,442 In so einer Maus

könnte eine Hämodilution durch Injektion des Farbstoffs sowie mögliche systemische

oder lokale Effekte des Farbstoffs vermieden werden. Der Nachteil einer tie2GFP-

Maus in einem SAB-Model könnte in der zusätzlichen genetischen Manipulation

liegen, die den natürlichen Zustand der Mikrogefäße des Versuchstieres beeinflussen

könnte sowie deren im Vergleich zum Farbstoff geringere Verfügbarkeit.

Die Eindringtiefe des Intravitalmikroskops liegt bei 50 µm. Damit können piale Gefäße,

die für unsere Studie relevant waren, mit hoher optischer und zeitlicher Auflösung

untersucht werden. Nichtinvasive, bildgebende Verfahren, wie die Computertomo-

graphie oder Magnetresonanztomographie, die in der klinischen Anwendung weit

verbreitet sind, und auch in Tierversuchen zum Einsatz kommen, bieten zwar eine

zunehmend bessere räumliche Auflösung, jedoch erlaubt nur die Intravitalmikroskopie

4. Diskussion

94

eine hochauflösende Analyse der Veränderung der zerebralen Mikrozirkulation in

Echtzeit.

4.2. Diskussion der Ergebnisse

Da viele Patienten nach SAB in der frühen und nur wenige in der verzögerten

Hirnschädigungsphase, in der Spasmen der großen Hirngefäße auftreten, sterben, ist

das Ziel der vorliegenden Arbeit zu untersuchen inwiefern die zerebrale

Mikrozirkulation an der Frühmortalität nach SAB beteiligt ist und welche Mechanismen

dieser Schädigung zugrundeliegen. Fast zwei Drittel der Todesfälle (ca. 61%) treten

in den ersten 48 Stunden nach SAB auf.443 25% der SAB Patienten443 erreichen nicht

das Krankenhaus während 33-36% der SAB-Patienten behandelt werden aber

dennoch an den Folgen der frühen Hirnschädigung nach SAB sterben.443,444 Der

pathologische Zustand in den ersten 72 Stunden nach SAB wird durch Beeinträch-

tigung der zerebralen Autoregulation,132 Störung der Blut-Hirn-Schranke,132 Aktivie-

rung von Entzündungswegen und Apoptose,132 Exzitotoxizität und oxidativer Stress,

gestörte Kalzium Homöostase, Vasospasmen132 und durch Dysfunktion der zerebralen

Mikrozirkulation182-184 charakterisiert. Diese Vorgänge werden zu gewissen Zeitpunk-

ten in der frühen Hirnschädigungsphase durch Blut, und dessen Bestandteile, durch

Aktivierung von Thrombozyten und durch transiente zerebrale Ischämie hervorgeru-

fen.133-136,144

4.2.1 Hämodynamische Veränderungen nach SAB

Nach Auslösung der SAB mittels dem MCA-Perforations-Modell zeigte sich ein

massiver intrakranieller Druckanstieg (von 3 auf 100 mmHg) mit einem gleichzeitigen

starken Abfall der regionalen zerebralen Durchblutung um ca. 85 % im Vergleich zum

Ausgangswert.127 Der intrakranielle Druckanstieg stoppte als dieser den systemi-

schen-arteriellen Blutdruck erreichte.127,130 Durch die nun beginnende Verteilung des

Blutes im gesamten Subarachnoidalraum fiel der ICP innerhalb von 5-8 min bis auf ca.

20 mmHg, während die zerebrale Durchblutung sich auf bis zu 80% des Ausgangs-

wertes erholte. Auf diesem Niveau hielten sich der ICP und die CBF auch danach noch

Konstant. Ähnliche Werte werden auch bei SAB-Patienten die eine Re-Blutung erlitten

4. Diskussion

95

beobachtet. Dies legt nahe dass es bei der Maus und beim Menschen zu einem

vergleichbaren Zeit- und Druckverlauf kommt.445

4.2.2 Effekt von iNO und den Endothelin-Rezeptor-Bl ocker auf den systemi-

schen Blutdruck nach SAB

Eine arterielle Hypotension ist mit einer deutlichen Verschlechterung der Prognose von

SAB-Patienten vergesellschaftet.446 Daher der MAP in dem Bereich zwischen 70 und

110 mmHg gehalten werden sollte.447 Die Verabreichung der NO-Vorstufe L-

Arginin448,449 oder des NO-Donators S-Nitrosoglutathion (GSNO),140 rufen eine

deutliche Reduktion des Hirnschadens nach experimenteller SAB hervor. Allerdings

verursacht GSNO einen drastischen, wenn auch vorübergehenden, Abfall des

systemischen Blutdrucks.140 Dieses Phänomen tritt auch nach der Anwendung von L-

Arginine auf.450,451 Dagegen hat die NO-Inhalation, ein zugelassenes Verfahren zur

Behandlung von pulmonaler Hypertonie, weder am Versuchstier noch beim Menschen

eine nachteilige Wirkung auf den systemischen Blutdruck.452-454,270,455,456,457 Hohe iNO-

Dosen wirken jedoch Blutdrucksenkend,458,459 vor allem ab Konzentrationen von 300

ppm.459 In unserer Studie, in der maximal 50 ppm inhaliertes NO appliziert wurden,

konnte kein Effekt auf den systemischen Blutdruck nachgewiesen werden. Vielmehr

tendiert der MAP bei den Kontrolltieren (mit induzierter SAB) um ca. 10 mmHg geringer

zu sein als bei der iNO-Gruppe.

Clazosentan ist ein selektiver Endothelin-Rezeptor-Blocker,373-375 der experimentell

und klinisch erfolgreich zur Behandlung von Spätvasospasmen nach SAB eingesetzt

wurde.373,377 Nach der CONSCIOUS-1-Studie waren die Nebenwirkungen, die bei der

Behandlung durch Clazosentan auftraten, u.a. Hypotonie.354 Die ET-1-Rezeptor-

Blockade durch Clazosentan soll experimentell jedoch eine kontinuierliche

Verringerung der zerebralen Durchblutung verhindern.379 In unsere Studie zeigte die

ET-Rezeptor-Blockade bei gesunden Wildtyp-Mäusen, innerhalb von drei Stunden,

keinen signifikanten Effekt auf den systemischen Blutdruck373 oder den CBF. Auch

unterscheidet sich nach SAB der MAP der mit Clazosentan behandelten Tieren nicht

von den Kontrolltieren.

4. Diskussion

96

4.2.3 Veränderung der zerebralen Mikrozirkulation n ach SAB

4.2.3.1 Mikrovasospasmen

Der Vasospasmus und die daraus resultierende zerebrale Ischämie, sind die meist

gefürchteten Komplikationen nach SAB. Frühere Untersuchungen waren vor allem auf

den verzögerten zerebralen Makrovasospasmus fokussiert. Jedoch ist seit einigen

Jahren bekannt, dass in den ersten 72 Stunden nach SAB auch die zerebrale

Mikrozirkulation beeinträchtig ist und damit zerebrale Mikrovasospasmen auftre-

ten.182-184 Aufgrund der technischen Möglichkeiten werden in der Klinik nur qualitative

Aussagen über den Durchmesser der großen Gefäße, wie der A. cerebri media und

der A. cerebri anterior, getroffen. Eine Reduktion des Gefäßdurchmessers in einem

dieser Gefäße kann jedoch durch eine ausreichende Kolateralisierung kompensiert

werden. Die Frage, ob nicht auch die kleinen Widerstandsgefäße in Form von

Arteriolen von Mikrovasospasmen betroffen sind, stand immer zur Debatte.460-462

Gestützt wurde dies durch die Tatsache, dass der diagnostizierte Vasospasmus der

großen Gefäße keinen positiven prädiktiven Wert bzgl. der neurologischen Defizite

nach SAB aufweist. 2003 konnten von Uhl et al. erstmals der Nachweis erbracht

werden, dass Mikrovasospasmen auch beim Menschen auftreten.182 Am Patienten war

es jedoch nicht möglich, zu verschiedenen Zeitpunkten und an denselben Stellen

qualitative und quantitative Aussagen über die entstandenen Mikrovasospasmen zu

treffen. Somit ergab sich die Aufgabe, für die nähere Erforschung der Mikrovaso-

spasmen ein Tiermodell zu etablieren. So konnten wir 2012 das erste Mal die Existenz

von Mikrovasospasmen nach experimenteller SAB nachweisen.184 Diese Befunde

konnten in der aktuellen Arbeit reproduziert werden: 3-5 Stunden nach SAB treten

akute Vasokonstriktionen überwiegend in Arteriolen geringen Durchmessers (9,5-25

µm) auf. Kapillaren hingegen wiesen fast keine Mikrovasospasmen auf, während

Venolen überhaupt keine Vasospasmen aufwiesen. Die überwiegende Mehrzahl der

arteriolären Mikrovasospasmen ist mittelgradig, zwischen 10-40%. Freies Hämoglobin

ist eine mögliche Ursache für diese Mikrovasokonstriktion.463 Abbildung 39 stellt

schematisch die Ursachen der Mikrovasospasmenbildung dar.

4. Diskussion

97

Abbildung 39: Mögliche Ursachen zur Mikrovasospasme n-Bildung

4.2.3.2 Effekt von iNO

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein endogener Vasodilator der direkt auf die glatten

Gefäßmuskelzellen wirkt und zur Gefäßrelaxierung führt.282 Damit es zur

Gefäßrelaxierung kommt, wird unter physiologischen Bedingungen der NO-sGC-

cGMP-Signaltrans-duktionsweg aktiviert.208 Nach SAB ist der NO/NOS-Weg

gestört137,140,261 und dies könnte für die Genese und Entwicklung der frühen

Hirnschädigung entscheidend sein.464-471 Blutabbauprodukte, vor allem das

Hämoglobin, sind für die Depletion von NO aus dem zerebrovaskulären System

verantwortlich. Die NO-Depletion verursachte eine Verringerung der Expression von

sGC,472 sowie ein Anstieg der Hydrolyse-Rate von cGMP.473 Diese Beobachtungen

stehen im Einklang mit der Beeinträchtigung der NO vermittelten Vasodilatation nach

SAB.473 In der vorliegenden Studie soll der durch SAB verursachte NO-Mangel durch

iNO wieder hergestellt werden. Drei bis fünf Stunden nach SAB, weist iNO einen

vasodilatativen Effekt auf spastische Arteriolen (9,5-25 µm) auf. Der vasodilatatorische

4. Diskussion

98

Effekt findet sofort nach Beginn der iNO statt. Nach 40 Minuten NO-Inhalation waren

die MVS fast komplett verschwunden und 30 Minuten nach iNO-Stopp war die Zahl

der Vasospasmen praktisch gleich gering geblieben. Während iNO verschwinden vor

allem MVS, die einen Konstriktionsgrad zwischen 10-40% aufweisen. 30 Minuten nach

iNO-Stopp blieb die Anzahl der leichten und mittelstarken MVS konstant gering. Durch

unsere Studie erkennt man, dass die Beeinträchtigung der zerebralen Mikrozirkulation,

mit Hilfe des inhalierten NO (50 ppm) aufgehoben werden kann. Das Inhalieren von

50 ppm NO hat keine negative Auswirkung auf den systemischen Blutdruck.270 Frühere

Untersuchungen haben außerdem gezeigt, dass die NO-Inhalation nach SAB die

Mortalität und das Hirnödem senkt.127,270 Die vorliegende Studie deutet darauf hin,

dass diese Neuroprotektion durch eine Verbesserung der zerebralen Mikrozirkulation

durch Reduktion des Mikrovasospasmus verursacht wird. Deswegen ist die NO-

Inhalation eine vielverspre-chende Therapieoption in der frühen Phase nach

Subarachnoidalblutung weil es die Homöostase der zerebralen Mikrozirkulation

wiederherstellt.

4.2.3.3 Effekt der ET-1-Rezeptorblockade

ET-1 ist eines der stärksten Vasokonstriktoren in der zerebralen Zirkulation. Es wirkt

hauptsächlich durch Andocken an den ETA-Rezeptor.435,540 Clazosentan, ein selektiver

ETA-Rezeptor-Antagonist reduziert die Entwicklung von zerebralen Makrovasos-

pasmen nach SAB.474,475 In der aktuellen Studie zeigte die ET1-Rezeptorblockade

durch Clazosentan (10 mg/kg KG) einen präventiven Effekt auf die zerebrale

Mikrozirkulation. Die ET-1-Rezeptor-Blockade führte zur Erweiterung von zerebralen

Mikrogefäßen, vor allem von Arteriolen mit einem Kaliber zwischen 35-55 µm. Die

kleineren Arteriolen (9,5-35 µm) wiesen keine signifikante Gefäßrelaxierung auf. Eine

deutliche Abnahme von MVS findet sich vor allem in größere Arteriolen. 30 min nach

Beendigung der Clazosentan-Gabe bleiben die Anzahl der MVS mit einem

Konstriktionsgrad zwischen 21-30% deutlich reduziert. Auch eine Behandlung mit

einem Endothelin-Rezeptor-Antagonisten scheint die Homöostase der zerebralen

Mikrozirkulation wieder herstellen zu können. Der Effekt beschränkt sich im Vergleich

zu iNO allerdings auf die größeren Arteriolen.

4. Diskussion

99

4.2.4 Rolle der NOS-Isoformen in der zerebralen Mik rozirkulation nach SAB

Die Regulation der Durchblutungsverteilung zwischen verschiedenen Hirnarealen ist

entscheidend für die Kopplung von Gewebedurchblutung und Stoffwechsel. Auf der

lokalen Ebene ist bekannt, dass Stickstoffmonoxid eine Schlüsselrolle bei der

Modulation des mikrovaskulären Tonus und somit der lokalen Durchblutung des

Gehirns spielt.228,476 Stickstoffmonoxid tritt mit anderen lokalen vasoaktiven

Mediatoren (z.B. Prostaglandin und Endothelin) und mit dem neuronalen Netzwerk in

Wechselwirkung, die für die Festlegung des Gefäßtonus und Durchblutung verant-

wortlich sind. 246,534 Obwohl es drei verschiedene Isoformen der NO-Synthase (eNOS,

nNOS, iNOS) gibt, ist allgemein akzeptiert, dass die lokale Regulation des Gefäßtonus

hauptsächlich durch die Freisetzung von NO durch eNOS vermittelt wird. 534,477 In

dieser Arbeit sollte geklärt werden, welche NOS-Isoformen (endotheliale, neuronale

oder induzierbare), insbesondere in der zerebralen mikrovaskulären Regulation

beteiligt sind, und welche nach SAB beeinträchtigt wird.

Es ist bekannt, dass ein hyperkapnisches Milieu die NO Freisetzung aktiviert, und so

die selektive Relaxation zerebraler Gefäße bei gesunden Tieren und Menschen

induziert.313,478,479 Nach SAB reagierten die zerebralen Arteriolen jedoch nicht auf CO2.

Dieser Mangel an CO2-Reaktionsfähigkeit wurde durch einen vollständigen Verlust von

CO2-induzierter Hyperämie begleitet. Darüber hinaus zeigen Daten aus unserer

Arbeitsgruppe, dass eine Erhöhung des arteriellen CO2-Partialdrucks nicht in der Lage

ist, spastische Mikrogefäße zu dilatieren, und die zerebrale Duchblutung nach SAB zu

erhöhen.480 Ähnliche Befunde wurden auch bei SAB-Patienten erhoben.182,183

Auch in der aktuellen Arbeit konnte durch Inhalation von 7,5% CO2 die Hirndurch-

blutung bei Wildtyp-Mäusen signifikant erhöht werden. Auch iNOS-defiziente-Mäuse

zeigten im hyperkapnischen Milieu, deutlich erhöhte CBF-Werte. bei eNOS-/-- und

nNOS-/--Mäusen zeigten nach Inhalation von CO2 allerdings keine wesentliche

Erhöhung der zerebralen Durchblutung.

Während der CO2-Inhalation sind die Arteriolen mit einem Kaliber zwischen 9,5 und 45

µm vor allem bei Wildtyp-, wie auch bei iNOS-/--Mäusen deutlich erweitert. eNOS- und

nNOS-defiziente Mäuse zeigten dagegen im hyperkapnischen Milieu (7,5% iCO2) eine

schwache CO2-Reaktivität der Arteriolen.

4. Diskussion

100

Interessanterweise zeigten NOS-defiziente-Mäuse bereits unter Kontrollbedingungen

Mikrovasospasmen. Diese traten vor allem in eNOS-/--defizienten Mäusen auf, gefolgt

von nNOS-/--Mäusen und zuletzt iNOS-/--Mäusen. Ein ähnliches Bild ist auch bei SAB-

Mäusen zu finden. In den drei erwähnten Knockoutmäusegruppen waren die MVS

leicht oder mittelgradig (10-40%). Die Ähnlichkeit zwischen den bei eNOS und nNOS

defizienten Tieren und nach SAB beobachteten Mikrovasospasmen läßt darauf

schließen, dass NO möglicherweise an der Bildung von Mikrovasospasmen nach SAB

beteiligt ist. Diese Annahme wird dadurch unterstützt, dass inhaliertes NO zu einer

massiven Verminderung der Mikrovasospasmen nach SAB führt.

Der Grund für die erwähnten pathologischen Veränderungen der zerebralen

Mikrozirkulation nach SAB liegen daher aller Wahrscheinlichkeit nach in der gestörten

Funktionalität von endothelialen NOS und neuronalen NOS. Ein möglicher molekularer

Mechanismus ist die funktionelle Entkopplung der eNOS vom ihrem Co-Faktor

Tetrahydrobiopterin (BH4). Diese geschieht unter ischämischen Bedingungen, und hat

zur Folge, dass die eNOS statt NO Superoxidanion produziert.319,320,200,481,482 Ausser-

dem könnte das asymmetrische Dimethylarginin (ADMA), ein endogener eNOS-

Inhibitor, der in der zerebrospinalen Flüssigkeit von SAB-Patienten vorkommt,468 auch

für die Entstehung von Mikrovasospasmen verantwortlich sein. Ein erhöhter ET-1

Spiegel im Gehirn, nach SAB, ist auch verantwortlich für die Beeinträchtigung der NO-

Produktion. Diese Beeinträchtigung wird verursacht über die isoformspezifische

Protein-Kinase-C-vermittelte Hemmung der eNOS-Expression.352

Bemerkenswert ist, dass nach Applikation von S-Methyl-L-Thiocitrullin (SMTC) —

einem nNOS-Inhibitor —, die Durchblutung des menschlichen Unterarms abnahm.483

Dadurch zeigen Capettini et al., dass nicht nur die eNOS, sondern auch die nNOS eine

wichtige Rolle in der Vasorelaxation spielt.484 Da die nNOS, der eNOS in Aufbau,

Struktur und Regulation sehr ähnlich ist, könnte ein ähnliches Entkopplungs-

phänomen wie bei eNOS auch bei der nNOS stattfinden und zu einer dysfunktionellen

zerebralen Mikrogefäßregulation führen. Diese Annahme wird unterstützt durch die

Beobachtung, dass die pharmakologische Hemmung der nNOS durch den selektiven

Inhibitor 7-Nitroindazol (7-NI), eine starke Entkopplung der hämodynamischen von der

neuronalen Aktivität zur Folge hat.485

5. Zusammenfassung

5. Zusammenfassung

Die frühe Beeinträchtigung der zerebralen Mikrozirkulation ist entscheidend für die

Pathophysiologie der Subarachnoidalblutung (SAB). Das Vorkommen von Vasospas-

men in zerebralen Mikrogefäßen ist wahrscheinlich einer der Mechanismen, der für

posthämorrhagische Ischämie bei SAB-Patienten verantwortlich ist.182 Auch in dieser

Arbeit konnte gezeigt werden, dass Vasospasmen ab der vierten Stunde nach SAB

vor allem in zerebralen Arteriolen vermehrt vorkommen. Die Gabe von inhaliertem

Stickstoffmonoxid (iNO) konnte die Anzahl von zerebralen Mikrovasospasmen nach

SAB um 85% reduzieren. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass Spasmen der

zerebralen Mikrozirkulation maßgeblich an der Perfusionsstörung nach SAB beteiligt

sind. Damit wurde auch die Hypothese bestätigt, dass post-hämorrhagische

Mikrovasospasmen auf dem Boden einer lokalen NO-Depletion entstehen. Dies wurde

durch Untersuchungen an eNOS defizienten Tieren bestätigt, die bereits unter

Kontrollbedingungen ausgeprägte Mikrovasospasmen aufzeigen. Auf Grund seiner

ausgesprochen positiven Wirkung auf die zerebralen Mikrovasospasmen, seines gut

definierten und niedrigen Nebenwirkungsprofils und seiner einfachen Anwendbarkeit,

könnte die Inhalation von NO ein potentes Mittel zur Behandlung der post-

hämorrhagischen Ischämie sein. Die Endothelin-Rezeptor-Blockade durch Clazosen-

tan, die bisher Anwendung in der verzögerten Phase bei SAB-Patienten fand, um

Arterien zu relaxieren und Vasospasmen zu reduzieren, zeigt auch in der Frühphase

nach SAB, eine gefäßrelaxierende Wirkung, vor allem in Arteriolen mit einem Kaliber

zwischen 35-55 µm. Eine deutliche Reduzierung von MVS kann man vor allem in den

größeren Arteriolen beobachten. Diese Befunde bestätigen die nicht signifikante

Wirkung von Clazosentan auf das Outcome von SAB-Patienten und könnten darauf

hinweisen, dass iNO oder die Kombination von iNO und Clazosentan eine

vielversprechendere Therapieform der SAB darstellen könnte.

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A. Danksagung

A. Danksagung

Für die Aufnahme in das Walter-Brendel-Zentrum für experimentelle Medizin möchte

ich mich bei Prof. Dr. med. U. Pohl herzlich bedanken.

Mein außerordentlicher Dank gilt meinem Doktorvater und Betreuer Prof. Dr. med.

Nikolaus Plesnila für das Dissertationsthema und die sehr gute Betreuung. Mit seiner

fachlichen Kompetenz und seiner persönlichen Zuverlässigkeit hat er mich stets

unterstützt und motiviert.

Von Herzen danke ich auch meiner Mitbetreuerin, Frau Dr. med. Nicole Terpolilli, die

mich in meiner Dissertation von Anfang an begleitet hat, mir jederzeit geduldig zur

Seite stand und mich durch ihre Leidenschaft am Forschen und Heilen immer wieder

motiviert hat. Von Ihr habe ich viel gelernt.

Ganz herzlich bedanke ich mich auch bei meinem Mitbetreuer PD. Dr. med. Karsten

Schöller, der mich als Doktorand engagiert hat. Er hat mich in seiner Zeit in München

stets unterstützt und aktiv begleitet.

Für die tatkräftige und freundschaftliche Unterstützung bei der Durchführung der

chirurgischen Experimente und Beschaffung der erforderlichen Materialien danke ich

in besonderer Weise Nicole Heumos.

Dr. biol. hum. Jürgen Peters danke ich herzlich für seine Hilfestellung und Offenheit in

Fragen zur Statistik und Computertechnik. Gerne erinnere ich mich an unsere

weltanschaulichen und philosophischen Gespräche.

Zum Schluss denke ich auch dankbar an meinen Eltern und meine Geschwister die

mich immer motivierten.

Laudate Dominum

B. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Ari Christian da Fonseca Dienel

Geburtsdatum: 04.07.1979

Geburtsort: Portimão/ Portugal

Nationalität: Deutsch/Portugiesisch

Aktuelle Beschäftigung

01.2011 – 04.2015 Doktorand am Walter-Brendel-Zentrum (AG Plesnila), Institut

für Chirurgische Forschung, Ludwig-Maximilians-Universität zu

München: Thema der Dissertation “ Veränderung der Mikrozir-

kulation nach experimenteller Subarachnoidalblutung (SAB):

Kinetik, Bedeutung und Identifikation von Mechanismen”.

Wissenschaftliche Projekte

10.2010 – 11.2010 Molekularbiologische Projektarbeit am Paul-Flechsig-Institut, in

Leipzig. Thema: „Untersuchung von Zellzyklus Inhibitoren, P16

(Tumorsupressor Protein/Gen), im Alzheimer-Hirn“

08.2010 – 10.2010 Projektarbeit am Paul-Flechsig-Institut, Hirnforschungszentrum,

in Leipzig. Thema „Analyse des Vorhandenseins und der

potentiellen Sekretion von Matrix-relevanten Molekülen in

verschiedenen Zelllinien (MDCK, N2A, COS, SY5Y, GT1-7)“

B. Lebenslauf

144

03.2008 – 09.2008 Diplomarbeit am Paul-Flechsig-Institut in Leipzig (Alzheimer-

Forschungszentrum) Thema: “Einfluss der Pseudophospho-

rylierung auf die Tau-Phosphorylierungsmuster, Zytoskelett-

stabilität und Zellvitalität in N2a Neuroblastomazellen”

02.2006 – 04.2006 Projektarbeit am Paul-Flechsig-Institut, in Leipzig (Alzheimer-

Forschungszentrum).Thema: „Einfluss der Dimerisierung auf

die Phosphorylierung von Tau-Proteinen in murinen Neuroblas-

tomazellkulturen (N2a)“.

07.2004 – 10.2004 Projektarbeit am Biotechnologie-Zentrum in Leipzig. Thema:“

Kultivierung und Charakterisierung von embryonalen Kardio-

myozyten aus dem Huhn, für Anwendung auf Micro-Elektrode-

Arrays (MEAs)“

Bildung

10.2000 – 09.2008 Diplom in Biochemie an der Universität Leipzig

10.1999 – 03.2000 Sprachkurs "Deutsch als Fremdsprache (DAF)" an der

Universität Trier.

09.1995 – 07.1998 Sekundarschule in Silves / Portugal; Abschluss: Abitur

B. Lebenslauf

145

Wehrdienst/Bundeswehr

11.1998 – 09.1999 Wehrdienst als Sanitätssoldat in Rennerod und Idar-Oberstein

(Dienstgrad: OG)

Andere Aktivitäten

06.08.2013 Simultanübersetzung aus dem Brasilianischen ins Deutsche für einen Dokumentarfilm „Der verlorene Vater“ im Bayerischer Rundfunk

05.2010 – 06.2010 Verkauf von Gesundheits- und ökologische Gartenanbau Lite-ratur als selbstständiger Verkäufer in Schweden.

05.2000 – 09.2000

02.2001 – 03.2001 Elektrikerhelfer in der Firma Elektro-Schmitz, in Trier

11.2008 – 04.2010

07.2001-09.2001 Sitzfertigung bei Mercedes-Benz für die E-Klasse,

07.2002-09.2002 in Sindelfingen

Eidestattliche Versicherung

Ich, Ari Christian da Fonseca Dienel, erkläre hiermit an Eides statt,

dass ich die vorliegende Dissertation mit dem Thema

„Veränderung der Mikrozirkulation nach experimenteller Subarachnoidal-

blutung (SAB): Kinetik, Bedeutung und Identifikation von Mechanismen“

selbständig verfasst, mich außer der angegebenen keiner weiteren Hilfsmittel bedient

und alle Erkenntnisse, die aus dem Schrifttum ganz oder annähernd übernommen

sind, als solche kenntlich gemacht und nach ihrer Herkunft unter Bezeichnung der

Fundstelle einzeln nachgewiesen habe.

Ich erkläre des Weiteren, dass die hier vorgelegte Dissertation nicht in gleicher oder

in ähnlicher Form bei einer anderen Stelle zur Erlangung eines akademischen

Grades eingereicht wurde.

München, 13.09.2016

Veränderung der Mikrozirkulation nach experimenteller ... · Die SAB kann spontaner oder...

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