Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. u. exp. Path. 257, 230--256 (1967)

Verschiedene Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung

yon Anilin und N-Athylanilin bei Kaninchen*

GERHARD LANGE

Pharmakologisches Institut der Universit~t Mfiuchen

Eingegangeu am 28. Februar 1967

DiJ/erent Stimulation oJ the Microsomal N- and p-Hydroxylation o/ Aniline and N-Ethylaniline in Rabbits

Summary. The treatment of rabbits with chlorophenothane or phenobarbital stimnlated the NADPH-de1)endent hydroxylations of aniline and N-ethylanlline by isolated liver microsomes to a different degree. The ~q-hydroxylation of •-ethyl- anfline was not stimulated. The p-hydroxylation of aniline was increased only to a small degree. The N-hydroxylation of aniline and the 1)-hydroxylation of N-ethyl- aniline were multi1)tieated many times. The dealkylation of N-ethylaniline was stimulated by treatment with phenobarbital only, not by chlorophenothane.

Ethionine injected during the 1)retreatment prevented the stimulating action of ehloro1)henothane and 1)henobarbital. Simultaneous injection of chloram1)henicol diminished the stimulating effect of a single dose of phenobarbital, simultaneous injection of actinomycin D abolished it completely.

Addition of 1 mYVI chlorophenothane or phenobarbital to microsomes of un- treated animals in vitro neither inhibited the N-hydroxylation of N-ethylaniline nor stimulated the dealkylation and the 1)-hydroxylation of N-ethylanlline and the 1)- and N-hydroxylations of aniline.

Addition of 0.17 mM 1)henylhydroxylamine to our reaction mixtures with microsomes of untreated animals did not influence the dealkylation of N-ethyl- aniline and diminished the 1)-hydroxylation of this substrate only slightly. Addition of 0.5 m~5 1)-amino1)henol did not influence the N-hydroxylation of aniline.

Added 1)henylhydroxylamine was reduced only to a small extent using concen- trations of 1)henylhydroxylamine corresponding to those achieved in our reaction mixtures with aniline as substrate. The degree of reduction was the same for micro- somes of untreated and chlorophenothane-treated animals.

The ratio of 1)-hydroxylation to N- hydroxylation of aniline or N-ethylaniline was independent of the microsomal content in the reaction mixtures. The ratio was the same in reaction mixtures with or without nicotinamide. The ratio was just the same after 10 or 40 min incubation and was not influenced by triplicating the concen- tration of the NADPH-generating system.

These results su1)1)ort the assumption of different enzymes catalyzing the hydro- xylations investigated in this paper.

Key-Words: Enzyme stimulation -- Mierosomal hydroxylases -- Drug metabolism -- Aromatic amines

* Eiu Teil der Ergebnisse wurde auf tier 7. Friihjahrstagung der Deutschen Pharmakologisehen Gesellschaft in Mainz (1966) vorgetragen.

Induktion der mikrosomalen lq- und p-Hydroxylierung yon Anilin 231

Zusammen/assung. Die Behandlung yon Kaninchen mit Chlorphenothan oder Phenobarbital steigerte die NADPH-abh~ngigen Hydroxylierungen yon Anilin und N-Athylanilin durch isolierte Lebermikrosomen ungleich. Die ~¢-Hydroxylierung yon ±N-Athylanilin wurde gar nicht und die p-Hydroxylierung yon Anilin nur wenig gesteigert. Die ~N-Hydroxylierung yon Anilin und die p-ttydroxylierang yon N- Athylanilin nahmen um das Mehrfaehe zu, Die Dealkylierung yon N-Athylanilin zu Anilin wurde nur dureh die Behandlung mit Phenobarbital vermehrt.

Athionin -- w/ihrend der Vorbehandlung verabreicht -- verhinderte die indu- zierende Wirkung yon Chlorphenothan und Phenobarbital Gleichzeitige Gabe yon Chloramphenicol verminderte die Wirkung einer einmaligen Phenobarbital-Injek- tion, gleichzeitige Gabe yon Actinomycin D hob sie auf.

Zusstz yon 10-sin Chlorphenothan oder Phenobarbital zu Mikrosomen unbe- handelter Tiere in vitro hemmte weder die N-Hydroxylierung yon N-Athylanilin, noch steigerte er die Dealkylierung und die p-Hydroxylierung yon N-J~thylanilin und die p- und die N-Hydroxylierung yon Anilin.

Zus~tz yon 1,7 • 10 -4 m Phenylhydroxylamin zu Versuchsans~tzen mit Mikro- somen unbehandelter Tiere beeinttuBte nicht die Dealkylierung yon N-]xthylanilin und verminderte dessen p-Hydroxylierung nur gering. Znsatz yon 5-10 -5 m p-Aminophenol hatte keinen EinfluB auf die N-Hydroxylierung von Anilin.

Phenylhydroxylamin wurde in Konzentrationen, welehe in denVersuchsans~tzen aus Anilin gebildet wurden, nur zu einem sehr geringen Tell zu Anilin reduziert. Dss AusmaB der Reduktion war bei Mikrosomen unbehandelter und mit Chlorphenothan behandelter Tiere gleich.

Das Verh/iltnis yon p-Hyclroxylierung zu N-Hydroxylierung yon Anilin oder N-Athylanilin war unabh~ngig yore Mikrosomengehalt im Versuehsansatz. Es war in Ans~tzen ohne Nicotins~ureamid ebenso groB wie in Ans~tzen mit Nicotinsgure- amid, n~ch 10 rain Inkubation ebenso groB wie naeh 40 rain Inkubation und wurde such nieht verandert (lurch Verdreifachung der Konzentration des NADPH-bilden- den Systems.

Die Ergebnisse spreehen daffir, dal3 die untersuehten Hydroxylierungen dureh versehiedene Enzyme bewirkt werden.

Schliisselw6rter: Enzyminduktion -- Mikrosomale Hydroxylasen -- Arzneimittel- Stoffwechsel -- Aromatische Amine

Die groBe Zahl u n d die Verschiedenheit der Stoffe, welche im mikro- somalen E n z y m s y s t e m u m g e b a u t werden, legen die A n n a h m e nahe, dab dieses E n z y m s y s t e m auBerordentl ich unspezifisch ist. Zahlreiche Befunde der le tz ten Jahre weisen jedoeh da rau f hin, dab die Mikrosomen mehrere Enzymsys t eme entha l ten , u n d zwar E n z y m e ftir verschiedene l~eaktionen, wahrscheinlich aber aueh verschiedene Enzyme, welche den gleiehen Reak t ions typ katalysieren. F/Jr das Vorhandense in mehrerer Enzymsys t eme in den Mikrosomen spreehen: das verschiedene Verh/£1t- nis der Gesehwindigkei ten zweier Reak t ionen mi t demselben Substra t - molekfil (z. B. o- u n d p -Hydroxy l ie rung yon Acetanil id) oder das ver- schiedene Verh/~ltnis der Geschwindigkei ten von t~eaktionen des gleichen Typs mi t verschiedenen Subs t ra ten (z. B. O-Dealkyl ierung yon p-Xthoxy° acetani l id u n d Codein) bei verschiedenen Species (AxEL]~OD, 1956a; GAUDETTE 11. BRODIE; I~OSNER et &l. ; TAKEMORI U. MANNERIIVG), ver-

16 Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path., Bd. 257

232 G. LANGE :

schiedene Hemmbarkeit versehiedener Reaktionen oder derselben Reak- tion mit verschiedenen Substraten (Ax]~L~O]), 1956a, b ; BAUER U. KI]~S]~ ; FOUTS u. B~ODIE, 1955, 1956; GAUDETTE U. BRODIE; HENDERSON U. MAZ]~L; HO~ITA; KAMPFFMEYW~ U. KIES~, 1963, 1964a; MACHINIST et al. ; M e M n o N ; O~ME-JOHNSON U. ZIWGLw~ ; 0S~IINO et al. ; POSN~R et al. ; TAKEMOI~I U. MANNERING; ZIEGLER U. PETTIT), verschiedene Abnahme der Aktivitat yon Mikrosomenenzymen mit dem Alter der isolierten Mikrosomen (BAUER U. KIESE), Trennung der in LSsung gebrachten Enzyme (IwATsuBo), versehiedene Abh/~ngigkeit der Enzymaktivi taten vom Sauerstoff- bzw. CO-Partialdruck (KAMPFFMEYER U. •IESE, 1964b, 1965; 0sHnvo et al.) und versehiedene Abh/~ngigkeit der Enzymaktivi- ta ten von bestimmten Vorbehandlungen der Tiere, z. B. mit Adrenalin oder Noradrenalin (DIXON et al., 1964; FOUTS), Alloxan (Dixon et al., 1961, 1963; GILET~E U. DAV~,NPORT), Thyroxin (CocH1-N U. SOKOLOFF; CONNEr U. GA~V~N), Morphin (AxELROD, 1956C; H ~ E N et al. ; KATO U. ONODA; MANNERING U. TAKEMORI; REMMER, 1962a), l typothermie (INscow u. AXEL~OD), Hypoxie, ACTH, Formalin (KATo n. GIL~TTE, 1965b), Fasten (Dixon et al., 1960; KATO U. GILV~TTE, 1965a) sowie yon der Vorbehandlung mit sogenannten Enzyminduktoren. Zahlreiche Unter- sueher haben gezeigt, dal~ Behandlung yon Tieren mit ganz versehieden- artigen k5rperfremden Stoffen die Aktivitat verschiedener mikrosomaler Enzyme verstarkt, seltener vermindert (siehe ~)bersichten yon CONN~Y u. BURNS; GILETTE; REMM]~R, 1962b). Solche Enzyminduktoren ver- mehren (oder vermindern) die Aktivitat der mikrosomalen Enzyme oft nieht zur gleiehen Zeit oder im gleichen AnsmaB (siehe die oben zit. Ubersiehten sowie CONNF~Y et al., 1959, 1960, 1965; CR]~AVEN et al., 1966a, b; GHAZAL et al.; HA~T U. FORTS, 1965a, b; HENDERSON U. MAZEL; HORITA; NETTER; TAKEMORI U. MANNERING; POSNER et al.; VA~DZ_~IS; W~SON u. FouTs). Die einzelnen Induktoren beeinflussen meist ein eharakteristisehes Spektrum yon Enzymaktivitaten, wobei aueh sehr nahe verw~ndte enzymatische Reaktionen verschieden stark betroffen sein kSnnen. CR~AVEN et al. (1966b) zeigten z .B. , dab die Behandlung von jungen Rat ten und Mausen mit Phenobarbital, Niketh- amid oder Meprobamat die 4-Hydroxylierung yon Biphenyl steigerte, wahrend die 2-Hydroxylierung kaum beeinflul~t wurde. Im Gegensatz dazu vermehrte Behandlung mit 3,4-Benzpyren, 20-Methylcholanthren oder 1,2,5,6-Dibenzanthrazen vorzugsweise die 2-Hydroxylierung. M e M n o N untersuchte die N-Demethylierung yon drei Paaren sekun- darer und tertiarer Amine. Behandlung yon Rat ten mit Phenobarbital steigerte die Demethylierung der tertiaren Amine, jedoeh nicht die der entspreehenden sekundaren Amine. SHIMAZ~Y beobachtete bei Unter- suchungen fiber den Einflul~ yon Hypothalamusschadigung auf die induzierende Wirkung von 20-Methylcholanthren, dab Behandlung yon

Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung yon Anilin 233

R a t t e n mi t diesem I n d u k t o r die Acetani l id-4-Hydroxyl ie rung 2,5 real s tarker vermehr te als die Anfl in-4-Hydroxyl ierung.

Als wit pri ifen wollten, wie s tark der Einflul~ einer mehrt~gigen Be- hand lung mi t Chlorphenothan oder Phenobarb i t a l auf die Akt iv i t~ t der mikrosomalen E n z y m e in der Leber yon K a n i n e h e n ist, f anden wir, dal3 sowohl die p- u n d die N-Hydroxy l i e rung yon Ani l in (bzw. N-J~thylanilin) - - also Hydroxy l i e rungen in verschiedenen Posi t ionen eines Molekfils - -

verschieden s tark induzier t wurden, als aueh die p -Hydroxyl ie rung (bzw. die N-Hydroxyl ie rung) yon Ani l in u n d seinem N-~ thy ]de r iva t - - also Hydroxy l ie rungen in derselben Posi t ion yon zwei nahe ve rwand ten Molekfilen.

Methoden

1. Behandlung der Tiere M~nnliche und weibliche Kaninchen einer Mischrasse wurden mehrere Tage

mit Chlorphenothan oder Phenobarbital bzw. deren L6sungsmitteln behandelt. l~fir die Versuche mit Chlorphenothan wurden Tiere mit einem mittleren Ge-

wieht yon ca. 750 g (-~ junge Tiere) und Tiere mit einem mittleren Gewieht yon ca. 3000 g (= erwachsene Tiere) verwendet. Diese Tiere erhielten an vier aufein- anderfolgenden Tagen morgens eine Injektion yon 200 mg Chlorphenothan (p,p'- Diehlor-diphenyl-trichlor~than p.a.) in 2,5 ml Oliven61 DAB 6/kg i.p. Die Kontroll- tiere bekamen vier Tage lang 2,5 ml Oliven61 DAB 6/kg i.p. 72 Stunden nach der letzten Injektion wurden Mikrosomen aus der Leber isoliert.

Fiir die Untersuehung des Einflusses yon J~thionin auf die Wirkung yon Chlor- phenothan wurden Kaninchen mit einem mittleren Gewicht yon ca. 1000 g (= junge Tiere) verwendet. Diese Tiere erhielten an vier aufeinanderfolgenden Tagen mor- gens und abends eine Injektion yon 50 mg dl-Athionin in 3 ml isotoner NaC1- L5sung/kg s.c. dl-J~thionin wurde in warmer NaC1-L6sung gel6st und mit NaOtt auf ein pH yon etwa 7,4 gebracht. Die zus~tzlich mit Chlorphenothan behandelten Tiere erhielten 1 Std nach der morgendlichen ~thionin-Injektion 200 mg Chlor- phenothan in 2,5 ml Oliven61/kg i.p., die Kontrollen 2,5ml Oliven6]/kg i.p. 24 Std naeh der letzten Chlorphenothan-In~ektion wurden Mikrosomen aus der Leber isoliert.

Ffir die Versuche mit Phenobarbital ~mrden Kaninchen mit einem mittleren Gewicht yon ca. 1300 g verwendet. Diese Tiere erhielten an ffinf bzw. acht auf- einanderfolgenden Tagen morgens eine Injektion yon 40 mg Phenobarbital-Natrium in 4 ml isotoner NaC1-L6sung/kg s.c. Die Injektionsl6sung wurde mit ItC1 auf ein pH von etwa 7,4 gebracht. Ausgefallenes Phenobarbital wurde dutch Erw~rmen kurz vor der Injektion wieder gel6st. Die Kontrolltiere bekamen ffinf bzw. aeht Tage lang 4 ml isotone NaC1-L6sung/kg s.c. 24 Std nach der letzten Injektion wurden Mikrosomen aus der Leber isoliert.

Ffir die Untersuchung des Einflusses yon -~thionin auf die Wirkung yon Pheno- barbital wurden Kaninchen mit einem mittleren Gewicht yon ca. 900 g verwendet. Diese Tiere erhielten an fiinf aufeinanderfolgenden Tagen morgens und abends eine Injektion yon 25 mg dbAthionin in 3 ml isotoner NaC1-L6sung/kg s.c. di-Athi- onin wurde in warmer NaC1-LSsung gel6st und mlt NaOH auf ein pi t yon etwa 7,4 gebraeht. 1 Std nach der morgendlichen Athionin-Injektion bekamen die Tiere entweder die oben angegebene Menge Phenobarbital-L6sung oder isotone NaC1- L6sung/kg s.c. 24 Std nach der letzten Phenobarbital-Injektion wurden Mikro- somen aus der Leber isoliert.

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234 G. LANov,:

Der EinfluB yon Actinomycin D 1 und Chloramphenicol ~ auf die Wirkung yon Phenobarbital wurde bei Tieren mit eint~giger Phenobarbital-Behandlung unter- sucht (mittleres Gewicht der Tiere, welche mit Actinomycin D behandelt wurden

ca. 1200 g; mittleres Gewieht der Tiere, welche mit Chloramphenicol behandelt wurden ~ ca. 1400 g). Die Tiere erhielten einmal 300 ~g Aetinomycin D in 5 ml isotoner NaC1-L6sung/kg i. p. (unmittelbar vor der Injektion warm gel6st) bzw. 250 mg Chloramphenicol in 1,25 ml Aqua dest./kg i.p. 1 Std naeh diesen Injektio- hen bekamen die Tiere entweder 40 mg Phenobarbital-Natrium in 4 ml isotoner NaC1-L6sung/kg s.c. (L6sung mit HC1 auf ein psi yon etwa 7,4 gebracht) oder 4 ml isotone NaC1-L6sung/kg s.c. 24 Std nach der letzten ]Enjektion wurden Mikrosomen aus des Leber isoliert.

2. Isolierung der Mikrosomen aus Lebern von Kaninchen Die Kaninehen wurden durch Nackenschlag get6tet und nach Durchtrennung

der Carotiden entblutet. Sofort nach dem Entbluten wurde die Leber entnommen und mit Eis gekiihlt. 25--50 g Leber (bei ]ungen Tieren zu gleichen Teflen yon zwei Lebern) wurden yon Bindegewebe und gr6~eren Gef~Ben ffeipr~ipariert, mit einer Schere in Stiicke geschnitten und dutch ein Sieb mit 1 mm weiten L6ehern gepreBt (v. JxGow et al.). Der Prel3saft wurde mit 2 Volumina eiskaltem 0,1 m Na- Phosphatpuffer pH 7,4 verdiinnt und zur Entfernung grSberer Partikel 20 rain bei -b 3 ° C mit 9000 × g zentrifugiert. Aus dem ~berstand wurden die Mikrosomen in der Uttrazentrifuge Spineo 5~odell L 50 als Niederschlag nach 60 rain Zentrifugieren bei 78 000 × g erhalten. Dieser Niedersehlag wurde zur Entfernung yon Enzymen der 16slichen Zellfraktion zweimal mit der dem ~berstand entsprechenden Menge 0,1 m Na-Phosphatpuffer pH 7,4 gewasehen. Der letzte Niederschlag wurde in 0,1 m Na-Phosphatpuffer pH 7,4 suspendiert (aufgeffillt auf 3/5 des Prei~saft-Volumens) und bei ~- 3 ° C aubewahrt.

Diese Mikrosomenpr~parate enthielten -- gemessen an der Enzymaktivit~t -- ein Drittel der durch dreifaehes Rehomogenieren des 9000 × g-Niederschlags ins- gesamt extrahierbaren Mikrosomen. Dieser Anteil war bei den unbehandelten und den mit Chlorphenothan oder Phenobarbital behandelten Tieren gleich.

3. Messung der Aktivit~t der mikrosomalen Enzyme Die Aktivit~t der isolierten Mikrosomen wurde stets 24 Std nach dem T6ten

der Tiere untersucht. Die Ans~tze zur Messung der Aktivit~t enthielten: Mikrosomen aus 0,11 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer pSI 7,4 (-~ 1,5 bis

3 mg Protein]ml) bei Verwendung yon N-Athylanilin als Substrat odes Mikro- somen aus 0,33 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer pH 7,4 ( : 4,5--9 mg Protein/ ml) bei Verwendung yon Anilin als Substrat, NADP (TPN) 0,24 ~ / m l , Glucose- 6-Phosphat 5 ~M/ml, Nicotins~ureamid 12 ~zM]ml, Magnesiumchlorid 6 ~M]ml, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase 20 Biicher-Einheiten/ml, ~-_&thylanilin 1 ~tM/ ml oder Anilin 1 ~M/ml.

Die Ans~tze wurden unter Luft in einem Wasserbad von 37°C geschiittelt. Die Reaktionen warden durch Zugabe des Substrats gestartet. Nach 40 min Inku- bation wurden gemessen:

a) die Dealkylierung von N-Athylanilin zu Anilin: Bestimmung des gebildeten Anilins naeh BRODI]~ und AXELROD,

1 Fiir die ~berlassung yon Actinomycin D danke ich tier Fa. Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey.

2 Ffir die ~berlassung yon Chloramphenicol danke ich der :Fa. C.F. Boehringer & Soelme G,m.b.H., 1Viannheim/Waldhof.

Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung yon Anilin 235

b) die p-Hydroxylierung yon N-J~thylanilin zu N-Athyl-p-Aminophenol: Be- stimmung des gebilde~en N-Athyl-p-Aminophenols nach BnODIE und AXELnOD unter Berficksichtigung der gegeniiber p-Aminopheno] geringeren Geschwindigkeit der Indophenol-l~eaktion (KA~VFFMEYE~ U. KIESE 1964a),

c) die N-Hydroxylierung yon N-J~thyl~nilin zu Phenylhydroxylamin: Bestim- mung des gebildeten Phenylhydroxylamins nach der Methode yon ttEmZ und ~ESE,

d) die p-Hydroxylierung yon Anilin zu p-Aminophenol (Bestimmung wie b), e) die l~-Hydroxylierung yon Anilin zu Phenylhydroxylamin (Bestimmung

wie c). Der ProteingehMt der Mikrosomenpr~parate wurde in Suspensionen gemessen,

welche Mikrosomen aus 0,44 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer pH 7,4 enthiel- ten (Bestimmung nach GORNXLL, ]~ARDAWILL U. DAVID). Der Gehalt der Pr~pa- rate an Gesamtfett wurde in Suspensionen gemessen, welche Mikrosomen aus 2,2 g Leber/ml 0,1 m Na-Phosphatpuffer enthielten (Bestimmung nach FOLCH, L~.ES u. S~ANLEY).

Ergebnisse 1. Ein/lufi einer viertiigigen Behandlung erwachsener Kaninchen mit Chlorphenothan au] Dealkylierung, p. und N-Hydroxylierung yon N-~thylanilin und au/ p- und N-Hydroxylierung yon Anilin

dutch isolierte Lebermikrosomen Nach viert~giger Behandlung erwaehsener Kaninchen mit 200 mg

Chlorphenothan/kg blieb das relative Lebergewicht unveriindert (T~b. 1, Zefle al). Die in Tab. 1 angegebenen ~nderungen im Gehalt der N[ikro- somenpr~parate an Protein und Gesamtfett sind statis~isch nicht ge- siehert.

Die ~imderungen der Enzymaktivit~ten, welehe dureh die viert~gige Behandlung mit Chlorphenothan verursacht wurden, sind in Tab.2, Zefle a, zusammengestellt. Die Dealkylierung yon N-A'thylanilin zu Anilin blieb unver~ndert. Die p-Hydroxylierung von N-_~thylanilin zu N-~thyl-p-Aminophenol nahm -- bezogen auf Gramm Leberfeucht- gewicht -- aufs Dreifache zu, wi~hrend die N-Hydroxylierung yon N- J~thylanilin zu 1)henylhydroxylamin nieht vermehrt, sondern eher etwas vermindert wurde. Im Gegensatz dazu nahm die N-Hydroxylierung yon Anilin zu Phenylhydroxylamin -- bezogen auf Gramm Leberfeueht- gewicht -- aufs Dreffache zu, wiihrend die p-Hydroxylierung zu p-Amino- phenol unver~ndert blieb.

2. Ein/lu[3 einer viertggigen Behandlung ]unger Kaninchen mit Chlorphenothan au/ Dealkylierung, p- und N-Hydroxylierung

yon N-A'thylanilin und au/ p- und N-Hydroxylierung yon Anilin dutch isolierte Lebermikrosomen

Nach viert/~giger Behandlung junger Kaninchen mit 200 mg Chlor- phenothan/kg nahm -- im Gegensatz zu den erwachsenen Tieren -- das relative Lebergewieht um 31 °/o zu (Tab. 1, Zefle a2). Die in der Tabelle

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N- und p-Itydroxylierung yon Anflin 237

angegebene Anderung des Protein- gehalts der Mikrosomenpri~parate ist statistisch nicht gesichert. Alle Enzym- aktivit~ten lagen bei den jungen un- behandelten Tieren niedriger als bei den erwachsenen; die Anderungen der Enzymaktiviti~ten, welche durch die viertKgige Behandlung mit Chlor- phenothan bewirkt wurden, waren aber i~hnlich wie bei diesen (Tab.2, Zeile b).

3. Ein/lufi einer viert~gigen Behandlung ]unger Kaninchen mit Chlorphenothan au] die Reduktion von Phenylhydroxyl- amin zu Anilin durch isolierte Leber-

mikrosomen

An isolierten Mikrosomen yon acht unbehandelten und acht mit Chlorphenothan behandelten jungen Tieren wurde geprfift, ob das bei der N-Hydroxylierung yon Anflin bzw. N-~thylanilin entstehende Phenyl- hydroxylamin w~hrend der 40 rain dauernden Inkubation zum Tell zu Anilin reduziert werden kann und ob das AusmaB der Reduktion durch Behandiung der Tiere mit Chlor- phenothan ver~ndert wird. Bei diesen Versuchen wurden den Mikrosomen- ansKtzen (Mikrosomen aus 0,33 g Le- ber/ml) 4,59.10-SMol Phenylhydroxyl- amin/ml ( : 5 ~g/ml) als Substrat zu- gesetzt, d.h. ca. das Doppelte der Konzentration, die in den Ans~tzen mit Mikrosomen yon jungen Tieren, welche mit Chlorphenothan behandelt worden waren, in 40 rain dutch N- Hydroxylierung yon Anilin entstand. Die Mikrosomen yon unbehandelten Tieren bildeten 0,16 ~: 0,04 • 10-SMol Anilin/ml Ansatz/40 min, d. h. sie redu- zierten nur 3,5°/0 des zugesetzten

238 G. LANGE :

Tabelle 2. f~nderungen der Dealkylierung, p- und N-Hydroxylierung yon N-~thyl- nach 4tiigiger Behandlung erwachsener und ]unger Kanincheu mit 200 mg Chlor-

Substrat 10 -a m N-Jkthy]anflin Reaktion Dealkylierung p-Hydroxylierung Metabolit Anilin ~-~thyl-p-Aminophenol

Behandlung der Tiere 10 -s Mol/ Anderung (Anzahl der g Leber/ 10 -s Mol/ Jknderung

Mikrosomenpri~parate) 40 rain g Leber/40 rain

a OlivenS1, er- wachsene Tiere (10) Chlorphenothan in OlivenS1, er- wachsene Tiere (10)

OlivenS1, junge Tiere (8) Chlorphenothan in OlivenS1, junge Tiere (8)

34,9 ± 3,3

39,1 =L 5,8

23,3 =L 4,2

31,6 ± 4,2

+ 12°/o

-1- 36°/o

54,8 =L 4,9

157,8 =~ 18,1

31,2 ~: 3,3

138,6 :k 11,5

+ 188°/o (p < 0,0005)

+ 344°/0 ( < 0,0005)

Phenylhydroxylamins. Die Mikrosomen yon Tieren, welche mit Chlor- phenothan behandelt worden waren, bildeten 0,20 ~ 0,03.10-SMol Anilin/ml Ansatz/40 rain, d .h . sie reduzierten auch nur 4,40/0 des zu- gesetzten Phenylhydroxylamins. Die Reduktion yon Phenylhydroxyl- amin zu Anilin wurde demnach durch viert/~gige Behandlung mit Chlorphenothan nicht gesteigert.

4. Ein]lufi yon Chlorphenothan au] Dealkylierung, p- und ~.Hydroxylierung von N-_~thylanilin und au] p- und N-Hydroxylierung yon Anilin in vitro

Ans~tzen yon Mikrosomen acht unbehandelter Tiere wurde 10-3m Chlorphenothan zugesetzt. Das Chlorphenothan wurde in 0,1 ml Aceton gel6st zu 9,9 ml Ansatz gegeben. Die Vergleichsans/~tze erhielten 0,1 ml Aceton zu 9,9 ml Ansatz. Zusatz yon 10-am Chlorphenothan in vitro hat te keinen wesentliehen EinfluB auf die yon uns gemessenen enzymati- schen Reaktionen (siehe Tab. 3, Zeile a).

5. Ein]lufi yon JSthionin au/ die induzierende Wirkung yon Chlorphenothan

Bei gleichzei~iger Behandlung der Kaninchen mit Chlorphenothan und ~thionhl inder ten sich das relative Lebergewicht und der Gehalt der Mikrosomenpr~parate an Protein und Gesamtfe~t nicht gegeniiber Tieren, welche nut J~thionin bekommen hat ten (Tab. 1, Zefle c). Keine der yon uns gemessenen Enzymaktiviti~ten nahm zu, die p-Hydroxy- lierung yon )7-~thylanflin sogar ab (Tab. 4, Zefle a).

Induktion der mikrosomalen N- und p-Itydroxylierung yon Anilin 239

anilin und der p- und N-Hydroxylierung yon Anilin durch isolierte Lebermikrosomen phenothan/kg. Die Zahlen sind Mittelwerte ± mittlerer Fehler des Mittelwerts

10 -0 m N-Athylanilin 10 -0 m Anilin

N-IIydroxylierung p-Itydroxylierung N-Hydroxylierung

Phenylhydroxylamin p -Aminophenol Phenylhydroxylamin

i J~nderung 10 -s Mol/ 10 -s Mol/ ~ d e r u n g 10 -s Mol/ Leber/ Anderung g Leber/40 rain g Leber/40 min g 40 rain

19,0 ± 1,5

13,9 4- 2,2

8,0 4- 0,73

6,6 4- 0,58

- - 270/0 (p < 0,05)

- -17~o

11,7 ~_ 0,69

9,6 4- 1,38

8,9 4- 0,69

10,3 4- 0,69

--18Yo

+ 1 5 %

2,9 ± 0,44

8,8 ± 1,46

2,2 4- 0,22

6,6 -4- 0,66

q- 2030/o @ < 0,0025)

÷ 200°/o (p < 0,0O05)

Tabelle 3. Ein/lufl von lO-am Chlorphenothan oder lO-am Phenobarbital au/ Dealkylierung, p- und N-Hydroxylierung yon N-A'thylanilin und au/ p- und N- Hydroxylierung yon Anilin dutch isolierte Mikrosomen aus Lebern yon unbehandelten Kaninchen in vitro. Die Zahlen sind Mittelwerte 4- mittlerer Fehler des Mittelwerts; sie bedeuten prozentuale A'nderung der Metabolitbildung dutch Zusatz yon Chlorpheno-

than bzw. Phenobarbital. Inkubation der Mikrosomenansiitze : 40 rain bei 37 ° C

Substrat 10 -a m N-Xthylanilin 10 - am Anilin

Reaktion Dealky- p-tIydroxy- N-Hydroxy- lierung lierung lierung

Zusatz

a 10 -am Chlor- -- 10,3~ 2,5 - -5 ,7~ 4,1 phenothan (p < 0,01)

b -- 1,8j: 2,1 10 -am Pheno- barbital

- 5,6±4,2

[-- 2 3 , 6 i 2,9 I (p< 0,005)

p-IIydroxy- N-tIydroxy- lierung lierung

--13,34-2,4 +7,14-2,0 (p< 0,005) (p< 0,02)

--11,64-2,7 4-0 ±3 ,6 (p< 0,02)

- 12,2± 3,0 (p< 0,02)

6. Ein/lufl yon /i~n]- bzw. achttdigiger Behandlung ]unger Kaninchen

mit Phenobarbital au/ Dealkylierung, p. und N-Hydroxylierung yon N-A'thylanilin und au] p- und N-Hydroxylierung yon Ani l in dutch

isolierte Lebermikrosomen

Naeh acht t / tg iger Behand lung m i t 40 mg P h e n o b a r b i t a l - N a t r i u m / k g n a h m e n das re la t ive Lebergewich t u m 34 °/0 u n d der Geha l t der Mikro-

240 G. LA~OE:

Tabelle 4. Einflufi yon ~thionin au] die induzierende W irkung von Chlorphenothan bzw. phenothanflcg und 2 × 50 mg dl-Athionin/kg und b) 5 Tage lang gleichzeitig mit 40 mg erhielten die entsprechende Dosis ~thionin und das L6sungsmittel vo~ Chlorphenothan

Substrat 10 -3 m N-_~thylanilin

Reaktion Dealkylierung p-tIydroxylierung

Metabolit Anilin N-~thyl-p-Aminophenol

Behandlung der Tiere 10 -s Mol/ ! (Anzahl der g Leber/ .~nderung 10 -s 5~ol/

Mikrosomenpr~parate) 40 rain g Leber/40 rain ~nderung

a

b

_~thionin q- OlivenS1 (3) J(thionin q- Chlorphenothan in Oliven61 (3)

_h_thionin -[- iso- tone NaC1-L6- sung (3) ~thionin q- Phenobarbital in isotoner NaC1- L6sung (3)

11 ± 0,7

7 ~ 1,5 -- 360/0

11 ± 0,9

14 ± 4,0 4 2 7 %

3 2 ± 4

1 8 ± 2

3 3 ± 0,3

44:l :10,0

- 440/0 (p < 0,025)

~-33°~

Tabelle 5. ~nderungen der Dealkylierung, p- und N-Hydroxylierung yon N- ~thylanilln ]i2n/- bzw. achtt~igiger Behandlung ~unger Kaninchen mit 40 mg Phenobarbital.

Substrat 10 -a m N-~thylanilin

Reaktion Dealkylierung p-Hydroxylierung

Metabolit Anilin N-_~thyl-p-Aminophenol

Behandlung der Tiere 10 -8 Mol/ ~mderung (Anzahl der g Leber/ 10 -8 Mol/ _~nderung

• ~¢IikrosomenprEparate) 40 rain g Leber/40 rain

Isotone NaC1- L6sung, 8 Tage (8)

Phenobarbital in isotoner •aC1- LSsung, 5 Tage (4)

Phenobarbital in isotoner NaC1- LSsung, 8 Tage (5)

14,1 :~ 1,7

64,8 ± 4,2

72,3 ± 4,2

q- 360°/t (P <

0,0005)

-}-413°/o (P <

0,0005)

29,0 ~= 3,8

309,1 ± 12,1

328,8 :[: 9,9

q- 9660/0 (P <

0,0005)

~- 1034o/0 (P <

0,0005)

Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung yon Anilin 241

Phenobarbital. Junge Kaninchen wurden a) d Tage lang gleichzeitig mit 200 mg Chlor- Phenobarbital-Natrium/kg und 2 × 25 mg dl-~thionin/kg behandelt. Die Kontrolltiere bzw. Phenobarbital. Die Zahlen sind Mittelwerte -~ mittlerer Fehler des Mittelwerts

10 -a m N-Athylanilin 10 -a m Anilin

p-IIydroxylierung IN-Hydroxylierung

p-Aminophenol Phenylhydroxylamin

N-Hydroxylierung

l~henylhydroxylamin

T10-S,M,°I/. ~nderung Anderung 10-SM°l/ 10 -s Mol/ Leber/ Jimderung g Leber/40 min 40 rain g ~eoer/~u mm I g

/

i

4,5 ~ 0,4 1,7 :J: 0,5 5,9 :~ 0,8

5,1 ± 0,9 -- 11°/o

6 ~ 0,7

6 ± 2,0 ± 0%

3,9 =k 0,2

6 ± 0,8

5 ± 1,0

-- 13°/o

- 1 7 o/o

0,9 ± 0,3

1,5 =k 0,3

1,1 :t= 0,2

- -47o~

-- 27o~

und der p- und N-Hydroxylierung von Anilin durch isolierte Lebermikrosomen nach Natrium/kg. Die Zahlen sind Mittelwerte ± mittlerer Fehler des Mittelwerts

10 -a m N-Athylanilin 10 -3 m Anilin

1N-Hydroxylierung p-Hydroxylierung N-IIydroxylierung

Phenylhydroxylamin p-Aminophenol Phenylhydroxylamin

10 -s Mol/ 10 -s Mol/ ~mderung 10 -8 Mol/ Anderung g Leber/ _~mderung

g Leber/40 rain g Leber/40 rain 40 rain

8,3 :t: 0,7

15,8 ~: 0,7 + 900/0 (p <

0,0005)

]

15,2 i 2,8 n a 830/0 ! (P <

0,025)

5,8 ~ 1,0

5,1 :~ 0,6 -- 12o/o

4,4 ~ 1,2 -- 25o10

1,3 ~ 0,3

21,9 -t- 2,9 q- 1585% (P <

0,0005)

25,6 ± 2,2 q- 1869% (P <

0,0005)

242 G. LA~G~:

Tabelle 6. Einflufl von Actinomycin D bzw. Chloramphenicol au/ die induzierende Phenobarbital-2Vatrium/kg und 300 #g Actinomycin D/kg und b) gleichzeitig mit Kontrollen erhielten Actinomycin D bzw. Chloramphenicol und isotone NaCI-L6sung.

sind MitteIwerte ~= mittlerer

Substrat ) 10 -am N-Athylanilin l~eaktion ] Dealkylierung p-Hydroxylierung Metabolit Anilin N-J~thyl-p-Aminophenol

Behandlung der Tiere (Anzahl der

Mikrosomenpriiparate)

Actinomycin D + isotone NaC1- LSsung (4) Actinomycin D + Phenobarbital in isotoner l~aC1- LSsung (4)

Ckloramphenicol + isotone NaC1- LSsung (7) Ckloramphenicol + Phenobarbital in isotoner NaC1- LSsung (6)

Phenobarbital in isotoner NaC1- L5sung, 1 Tug (7)

10 -s Mol/ g Leber/ 40 mill

16,4 =k 6,8

~aderung 10 -s Mol/ Jknderung g Leber/40 rain

21,2 =k 5,4 + 290/0_

16,6 =L 1,2

29,4 =k 3,8 + 77°/0 p<__ 0,05)

116°/o 58,6 ± 6,4

32,1 ! 5,4

34,8 ± 8,9

25,1 =k 3,9

80,4 =k 10,7

133,0 =k 18,1

+ 8°/o

+ 220°/o (p < 0,0005)

+ 359°/o 1 (p <

0,0005) 1 ~mderung gegeniiber Tieren, welche nur mit isotoner I~TaC1-LSsung behandelt

worden waren (siehe Tab.5).

somenpr/~parate an Gesamtfett um 97°/0 zu (Tab. 1, Zeile b). Die in der Tabelle angegebene J~nderung im Proteingehalt der Mikrosomenpri~pa- rate ist statistisch nicht gesichert.

Die ~nderungen der Enzymaktivit/~ten, welche durch f/inf- bzw. acht- t/~gige Behandlung mit Phenobarbital verursacht wurden, sind in Tab. 5 zusammengestellt. Die Dealkylierung yon N.Jf thylanil in stieg -- bezogen auf Gramm Leberfeuchtgewicht -- auf das Ffinffache. Die p-Hydroxy- lierung yon N-Athylanilin nahm auf das Elffache zu, die l~-Hydroxy- lierung dagegen eher etwas ab. Im Gegensatz dazu wurde die I~-Hydroxy- lierung yon Ani l in auf das 17- bzw. 20fache vermehrt, die p-Hydroxy- lierung aber nur auf das Doppelte.

Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung yon Anilin 243

Wi@ung von Phenobarbital. Junge Kaninchen wurden a) gleichzeitig mit dO mg 40 m9 Phenobarbital-Natrium/kg und 250 mg Chloramphenicol/kg behandelt. Die 24 Std nach den In]ektionen wurden Mikrosomen aus der Leber isoliert. Die Zahlen Fehler des Mittelwerts

10 -3 m N-Athylanilin N-ttydroxylierung

Phenylhydroxylamin

10 -s ~ o l / g Leber/40 min

6,5 ± 2,0

5,1 ± 1,1

7,1 ~= 0,7

7,7 ± 2,0

9,2 ~ 1,1

~_nderung

- - 220/0

+ 8°/o

~- 590/01 (p < 0,025)

10 .3 m Anilin

p-ttydroxylierung p-Aminophenol

10 -s Mol/ Xnderun~ g Leber/40 rain

6,2 ~ 1,7

5,7 ~: 1,3 -- 80/(

6,3 i 0,6

8,8 ___ 1,7 + 40%

10,2 ~ 1,0 + 230/01

N-Hydroxylierung Phenylhydroxylamin

10 -s Mol/ g Leber/ 40 rain

1,6 ~ 0,3

1,7 :k 0,3

1,7 4-- 0,2

2,5 ± 0,2

5,7 :k 0,6

Jmderung

-t- 6o/0

+ 47 °I0 (p < o,o125)

@ 3380/01 (p <

0,0005)

7. Ein/lu/3 von Phenobarbital au/ Dealkylierung, p- und N-Hydroxylierung yon N-~thy lani l in und au/ p- und N-Hydroxylierung yon An i l in in vitro

Ans/~tzen yon Mikrosomen zehn unbehande l te r Tiere wurde 1 0 - ~ m Phenobarb i t a l zugesetzt . Die Ergebnisse sind in Tab. 3, Zeile b, zusam- mengestel l t . Phenobarb i t a l ha t t e in dieser Konzen t r a t i on keinen EinfluB a u f die N-Hydroxy l i e rung yon N-J~thylanil in und Anilin. Die p - H y d r o x y - l ierung beider Subs t ra te wurde e twas ve rminder t ; die Dealkyl ierung yon N-~ thy lan i l in n a h m u m 24 °/o ab.

8. Ein/lufi yon A'thionin au] die induzierende Wirkung yon Phenobarbital

Kaninchen wurden 5 Tage lang gleichzeitig mi t Phenobarb i t a l und ~ th ion in behandel t . Als Kont ro l l en dienten Tiere, welche nur Athionin erhieltcn. Bei der gleichzeitigen Anwendung yon J~thionin/~nderte Pheno-

244 G. L~GE:

barbital das relative Lebergewicht und den Proteingehalt der Mikro- somenpri~parate nieht. Dagegen nahm der Gehalt an Gesamtfet~ in den Mikrosomenpri~paraten gegenfiber den Priiparaten der Tiere, welche nur mit ~thionin behandelt worden waren, um 600/0 zu (Tab. 1, Zefle d). Die durch die Phenobarbital-Behandlung verursaehte Vermehrung des Fett- gehalts der Mikrosomenpr~parate wurde also durch )kthionin kaum beeinfluBt.

Die induzierende Wirkung yon Phenobarbital wurde dureh die gleieh- zeitige Behandlung mit ~thionin aufgehoben. Die kleinen ~mderungen der Enzymaktivit~ten, welche nach dieser Behandlung noch beobachtet wurden, sind statistisch nicht gesichert (Tab. 4, Zeile b).

9. Einllufi yon Actinomycin D bzw. Chloramphenicol au/ die induzierende Wirlcung von Phenobarbital

Der Einflul~ yon Actinomyein D bzw. Chloramphenicol wurde bei Tieren mat eint~giger Phenobarbital-Behandlung untersucht. Einmalige Behandlung mit 40 nag Phenobarbital-Natrium/kg beeinflufite innerhalb yon 24 Std die yon uns gemessenen Enzymaktiviti~ten deutlich (Tab. 6, Zefle c). Durch gleichzeitige Behandlung mit 300 ~g Actinomycin D/kg wurde die induzierende Wirkung einer einmaligen Phenobarbital-Injek- tion aufgehoben (Tab.6, Zeile a). Die gleichzeitige Gabe yon 250 mg Chloramphenicol/kg verminderte die induzierende Wirkung yon Pheno- barbital, hob sie aber nieht ganz auf (Tab. 6, Zeile b). Das relative Leber- gewicht und der Gehalt der Mikrosomenpriiparate an Protein und Ge- samtfett wurden weder durch die einmalige Iniektion yon Phenobarbital noeh durch die gleichzeitige Gabe von Aetinomycin D oder Chlorampheni- col beeinflul~t.

Zusatz yon 10-3m Chloramphenicol zu Ans~tzen mit Mikrosomen unbehandelter Tiere hat te entweder keinen EinfluB auf die yon uns gemessenen Enzymaktiviti~ten oder hemmte sie maximal um 20°/0 (Messungen an drei Mikrosomenpr/~paraten).

10. Abhiingigkeit der Enzymalctivitiiten vom Mikrosomengehalt der Versuchsansiitze

Um zu priifen, ob das Verhi~ltnis der von uns gemessenen Enzym- aktivit~ten zueinander yore Mikrosomengehalt der Versuehsans~tze abh~ngt, bestimmten wir das Verhitltnis der Dealkylierung zur p-Hydro- xylierung, der Dealkylierung zur N-Hydroxylierung und der p-Hydroxy- lierung zur N-Hydroxylierung yon N-~thylanilin und das Verh~ltnis der p-Hydroxylierung zur N-Hydroxylierung yon Anilin bei drei ver- schiedenen Mikrosomenkonzen~rationen. Da der Proteingehalt der Mikro- somenpr~parate sowohl yon Tier zu Tier als auch zwisehen unbehandel-

Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung von Anilin 245

Tabelle 7. VerMdtnis yon Dealkylierung:p.Hydroxylierung, von Dealkylierung:2V- Hydroxylierung und yon p-Hydroxylierung : N-Hydroxylierung yon N.A'thylanilin und VerMiltnis yon p-Hydroxylierung : N-Hydroxylierung yon Anilin bei drei verschiedenen Mikrosomen]conzenlrationen. Die Verh(dtniszahlen, welche mit den unter ,,Methoden" angegebenen Milcrosomenkonzentrationen bestimmt wurden, sind fleich 100 °/o gesetzt. Die Verhi~ltniszahlen, welche mit 1/3 oder dem Drei/achen dieser Mikrosomenkonzen- trationen bestimmt wurden, sind in °/o dieses Wertes ausgedriickt. Die Zahlen sind Mittelwerte 4- mittlerer JFehler des Mittelwerts. Mikrosomen aus Lebern yon Kaninchen, welche 8 Tage mit 40 mg Phenobarbital-]gatrium/kg behandelt worden waren. Inkubation der Mikrosomenansdtze bei den beiden ersten Mikrosomenkonzentrationen 40 rain

bei 37°C bei der dritten Mikrosomenkonzentration 10 rain bei 37°C

Substrat 10 -3 m N-J~thylanilin 10 .3 m Anilin

Verhtfltnis Dealky- ]ierung

p-Hydro- xylierung

Dealky- lierung

N-ttydro- xylierung

p-Hydro- xylierung N-Hydro- xylierung

Verh~ltnis

Mikrosomen- Mikrosomen - konzentration konzentration

Mikrosomen ~ U S :

0,11 g Leber/mI 0,037 g Leber/ml 0,33 g Leber/ml

p-Hydro- xyliermlg N-Hydro- xylierung

1O0,0

93,04- 3,6

97,8 q- 6,4

100,0

101,7 4- 7,2

114,0 4- 4,7

100,0

10i,0 ± 5,5

108,3 4- 4,1

Mikrosomen ~ l l S :

0,33 g Leber/ml 0,i1 g Leber/ml 0,99 g Leber/ml

100,0

97,0 ± 9,6

111,84-4,4

ten und bchandelten Tieren nicht sehr stark verschieden war, w/~hlten wir folgende drei Mikrosomenkonzentrationen:

a) die unter ,,Methoden" angegebene Konzentration, b) ein Drittel dieser Konzentration, c) das Dreifache dieser Konzentration.

Die Ergebnisse gibt Tab.7 wieder. Die VerMltnisse der von uns gemessenen Enzymaktivit/~ten zueinander wurden durch Drittelung oder Verdreifachung der/iblicherweise verwendeten Mikrosomenkonzen- trationen nicht verandert.

11. Einflufi yon Phenylhydroxylamin au/ Dealkylierung und p-Hydroxylierung yon N-J )hy lan i l i n und Ein/lufl von p-Aminophenol

au/ N-Hydroxylierung von Ani l i~ durch isolierte Lebermikrosomen

Durch die Behandlung mit Phenobarbital wurde die p-Hydroxy- lierung yon N-J, thylanilin wesentlich stt~rker vermehrt als die p-Hydroxy- lierung von Anilin. Andererseits nahm nur die N-Hydroxylierung yon Anilin sehr stark zu, die N-Hydroxy]ierung von N-J~thylanflin dagegen

246 G. LARGE:

Tabelle 8. Ein]lufl von 1,7.10 -4 m Phenylhydroxylamin au/ die Dealkylierung und die p-Hydroxylierung von N-~thylanilin und Ein/lufl yon 5 • 10 -~m p-Aminophenol au/ die N-Hydroxylierung yon Anilin dutch Lebermikrosomen von Kaninchen, welche 8 Tage mit Phenobarbital behandelt worden waren. Die Zahlen Bind Mittelwerte :~ mittlerer Fehler des Mittelwerts; sie bedeuten prozentuale ~nderung der Metabolit- bildung durch Zusatz yon Phenylhydroxylamin bzw. p-Aminophenol. Inkubation

der Mikrosomenans~tze: 40 rain bei 37°C

Substrat 10 -a m N-Athylanilin 10 -3 m Anflin Reaktion Dealkylierung p-Hydroxylierung N-Hydroxylierung

Zusatz

1,7 - 10 -am Phenylhydroxylamin

5 • 10 -4 m p-Aminophenol

- - 3 ,0 ~ 5,7 - - 15,4 ± 5,7 (p< 0,05)

4,0 :j: 3,7

nicht. U m zu entscheiden, ob die versehiedene Zunahme der p- und Iq- Hydroxylierung bei diesen beiden Substraten dadurch bedingt sein kSnnte, dab p- und N-Hydroxylierung mit versehiedener Gesehwindig- keit ablaufen und der jeweilige Metabolit der schnelter ablaufenden Hydroxylierung die langsamer abl~ufende Reaktion hemmt, setzten wit den Ans/~tzea mit N-Athylanilin so viel Phenylhydroxylamin zu, wie unter unseren Bedingungen in 40 rain aus Anilin gebfldet wurde, und den Ans~tzen mit Anilin so viel p-Aminophenol, wie unter unseren Be- dingungen in 40 min aus N-•thylanilin gebfldet wurde. Die Ergebnisse sind in Tab. 8 dargestellt. Die Dealkylierung yon l~-~thylanilin wurde dureh Phenylhydroxylamin nicht beeinflul~t. Die p-tIydroxylierung yon N-~thylani l in wurde durch Phenylhydroxylamin nur wenig vermindert ; die ~q-Hydroxylierung von Anflin wurde durch p-Aminophenol nieht ver/~ndert.

12. Einflufl yon Nicotinsiiureamid auf Deallcylierung, p. und 2V-Hydroxylierung yon N-~ thy lan i l in und au/ p. und N-Hydroxylierung

von An i l in dutch Mikrosomen yon Tieren, welche mit Phenobarbital

behandelt worden waren

Bei Verwendung eines NADPH-bildenden Systems in den Mikro- somenans/itzen mul~ Nicotins/~ureamid zugesetzt werden, weft Mikro- somen NADP rasch zerstSren, nieht jedoch NADPH. Unsere Versuehs- ans/~tze enthielten eine verh/~ltnism/titig hohe Konzentrat ion an Nieotin- s/~ureamid (12 • 10 -a m), welches mit mikrosomalen Enzymen reagieren kann ( C A ~ et al.). U m auszusehliel3en, dal3 Nicotins/iureamid die von uns gemessenen Hydroxylierungen verschieden stark konkurrierend beeinflu~t, wurden Versuehe ohne Nicotins/~ure~mid durehgefiihrt. Da bei Weglassen yon Nicotins~ureamid die Konzentrat ion an NADP sinkt,

Induk~ion der mikrosomMen N- und p-Hydroxylierung yon Anili~ 247

zeigl~en diese Versuehe zugleieh, ob NADP, welches die oxyda- ~ive Demethylierung yon Amino- pyrin durch Lebermikrosomen yon R~tten s~rk kompe~it, iv hemmt~ ( E ~ s T ~ u. O~zmus) , einen EiafluB auf die yon uns gemessenen Enzymak~ivit~en b~t~o. Die Ergebnisse der Ver- suehe ohne Nico~ins/~ureamid sind in T~b. 9 wiedergegeben. Bei 10 rain Inkubation der Ans/i~ze waren die Enzymaktivit~ten mi~ und ohne Nicotins~ureamid gteich. Bei 40rain Inkubat, ion waren die Ak~ivit~en in den N- Athylan///n-Ans/~zen ohne Nioo- tins/~ureamid kaum vermindert. Die p- und N-Hydroxylierung yon Anflin batten nach 40rain ]:akubation gegen/iber den An- s~zen mi~ Nico~ins/h~reamJd um mehr Ms die H~,lfSe abgenommen. Das VerhgI~nis yon p- zu N- I-Iydroxyliemng wurde dadurch abet n/c.h~ ge/~nder~.

Die Vermindemng der p- und N-Hydroxylierung yon Anitin dureh Wegtassen yon Nieotin- s~ureemid war abh/~ngig yon der Proteinkonzentration in den Ans~zen. Sie wurde bei Er- hShtmg der Pro~einkonzentra.tion st4rker und war bei Erniecbigung der Proteinkonzentration auf ein Drit, tet nur noeh sehr gering.

13. Messung der Enzymaktiviti~ten. nach 10 und gOmin dauernder In- k~,Sation der Mikrosomenan4iitze

Diese Versuche warden durch. geffi,hr~, um auszuschlie/3en, dab das Fehlen einer Steigerung der

a

. ~

11

17 ~aunyn-Schmiedeborgs Arch. Pha r rnak , exp. Pa th . , Bd. 257

v-~ at~

~, ~ v + ~

u~ r-- + I

248 G. LARGE:

N-Hydroxylierung yon lq-Athylanilin und die geringe Zunahme der p- t tydroxylierung yon Anflin dureh relativen Substratmangel bedingt war. Wenn Anilin eine h6here Affiniti~t zum N-hydroxylierenden l~eaktionszentrum h/~tte als zum p-hydroxylierenden, oder wenn die l~-Hydroxylierung wesentlich schneller abliefe als die p-Hydroxy- lierung, k6nnte naeh einiger Zeit fiir die p-Hydroxylierung der Be-

Tabelle 10. Messung der Enzymaktivitiiten nach 10 und 40 min dauernder Inkubation der Mikrosomenansdtze. ~nderung der Dealkylierung, der p- und N-Hydroxylierung yon N-~thylanilin und ~nderung der p- und 1V-Hydroxylierung yon Anilin dutch isolierte Lebermikrosomen nach ]i~nf- bzw. achttiigiger Behandlung yon Kaninchen mit 40 mg Phenobarbital-Natrium/kg. Die Zahlen geben Viel/ache der Werte yon Mikro-

8omen unbehandelter Tiere an

Substrat 10 -a m N-J~thylanilin 10 -a m Anilin

Reaktion

Metabolic

)ealky- lierung

Anilin

p-Hy- N-Hy- droxy- droxy- lierung lierung

N-~thyl- Phenyl- p-Amino- hydroxyl-

phenol amin

p-Hy- N-Hy- droxy- droxy- lierung lierung

p-Amino- Phenyl- phenol hydroxyl-

amin

5 Tage Phenobarbital 10 rain Inkubation 5 Tage Phenobarbital 40 min Inkubation 8 Tage Phenobarbital 10 min Inkubation 8 Tage Phenobarbital 40 min Inkuba¢ion

5,2

4,6

5,2

5,1

13,4

10,7

16,8

11,3

1,0

0,9

0,9

0,8

2,1

1,9

2,6

1,8

13,9

16,9

22,0

19,7

reich der Substrats/ittigung unterschrit ten werden. Entsprechendes wfirde fiir N-~thylanfl in nut im umgekehrten Verhi~ltnis der beiden Hydroxylierungen zueinander gelten. In Tab.10 sind die J~nderungen der yon uns gemessenen Enzymaktivit/~ten dureh ffinf- bzw. aehtti~gige Be- handlung mi t Phenobarbital - - gemessen naeh 10 bzw. 40 rain dauernder Inkubat ion - - angegeben. Die Jtmderungen, welehe nach 10 min gemessen wurden, lagen in derselben Gr6Benordnung wie die, welehe naeh 40 min Inkubat ion gemessen wurden.

Erh6hung der unter ,,Methoden" angegebenen Konzentrat ionen der einzelnen Bestandtefle des IqADPH-bfldenden Systems auf das Dreifaehe hat te auch keinen wesentliehen EinfluB auf die yon uns gemessenen Enzymaktivi t~ten, sowohl bei 10 rain wie auch bei 40 rain dauernder Inkubat ion der Mikrosomenansi~tze, so dab die Verh~ltnisse der einzelnen Aktivit/iten zueinander auch dadurch nieht veriindert wurden.

Induktion der mikrosomalen N- und p-Hydroxylierung yon Anilin 249

Diskussion Die Behandlung yon Kaninchen mit Chlorphenothan bzw. Phenobarbi-

tal steigerte die NADPIt-abh/~ngigen t tydroxylierungen yon Anflin und N-Athylanilin dureh isolierte Lebermikrosomen ungleieh. Die p-Hydroxy- lierung yon N-Athylalfilin nahm um ein Mehrfaehes zu, wghrend die N-ttydroxylierung dieses Substrats nicht vermehrt, sondern eher ver- mindert wurde. Im Gegensatz dazu nahm die hT-Itydroxyliertmg yon Anflin wesentlieh starker zu als dessen p-Hydroxylierung. Die Dealky- lierung yon N-Athylanflin zu Anilin wurde durch Chlorphenoth~n k~um beeiniiul~t, dutch Phenobarbital mehrfaeh gesteigert.

Da Chlorphenothan die Dealkylierung yon N-fi~thylanilin nicht ver- mehrte, kSnnte man annehmen, dab eine Steigerung der N-Hych-oxy- lierung yon N-Athylanilin ausblieb, weft die Dealkylierung ffir diese Reaktion ]imitierend ist. Gegen diese Annahme spricht jedoeh, da~ nach Behandlung mit Phenobarbital, welche die De~lky]ierung mehrfaeh steigerte, die N-Hydroxylierung yon ~--J~thylanilm ebenfalls nicht zunahm.

Die verschiedene Beeinflussung der p- und der N-Hydroxylierung yon Anilin und yon N-Athylanilin ]egen die Frage nahe, ob es sich bei den beobachteten Anderungen um eine Enzyminduktion oder um eine andersartige Beeinflussung der Enzymaktivit~ten handelt:

Zusatz yon 10-sin Chlorphenothan zu Ans~tzen mit Mikrosomen unbehandelter Tiere steigerte weder eine der yon uns gemessenen Enzym- ~ktivit£ten, noch hemmte dieser Zusatz die dureh die Vorbehandlung der Tiere nicht oder wenig stimulierten Reaktionen, n£mlich die N- t tydroxylierung yon N-Athylanflin oder die p-tIydroxylierung yon Anilin in nennenswertem MaSe. Das gleiche grit ffir den Zusatz yon 10-3m Phenobarbital zu Ans~tzen mit Mikrosomen unbehandelter Tiere. Die ~nderungen der Enzymaktivit~ten naeh Behandlung der Tiere mit Chlorphenothan oder Phenobarbital kSnnen also weder dureh die Wir- kung yon eventuell noeh an die Mikrosomen gebundenem Chlorpheno- than oder Phenobarbital erkl~rt werden, noch kSnnen sie dadureh wesentlieh beeinflul3t worden sein. Um den Einflul~ yon eventuell an die Mikrosomen gebundenem Chlorphenothan oder Phenobarbital mSglichst klein zu halten, wurden die Lebermikrosomen erst 72 Std naeh der ]etzten Chlorphenothan-In]ektion bzw. 24 Std naeh der ]etzten Pheno- barbital-Injektion isoliert.

Ffir einen Induktionsprozel3 fiber Neubfldung yon Enzymen sprieht die t Iemmung der induzierenden Wh~kung yon Chlorphenothan oder Phenobarbital dureh gleichzeitige Behandlung der Tiere mit Athionin, Aetinomyein D oder Chloramphenicol.

~[thionin hemmt die Proteinsynthese in der Leber durch Verminderung des Gehalts an Adenosintriphosphat (B~T~LS u. ttO~OIZST; VILLA-TR~wNo et al.).

17'

250 G. L i ~ :

Actinomyein D hemmt die Synthese der Ribonueleinsgure und damit die Protein- synthese (s. ~bersieht yon D~ws). Chloramphenicol verhindert bei Bakterien entweder die Bindung yon m-RNS an Ribosomen oder es inaktiviert m-RNS naeh deren Bindung, so dab die Ribosomen nieht mehr mit den s-RNS-Aminoazyl- komplexen reagieren kSnnen (s. L~bersicht bei DRv.WS). S~ugetierzellen sind gegen Chloramphenicol sehr viel weniger empfindlieh als Bakterien, da sie im allgemeinen fiber eine 2elativ stabile m-RNS und damit fiber einen Vorrat yon Polyribosomen vefffigen, die als Funk~ionseinheiten dutch Chloramphenicol nicht oder nut bei Einwirkung fiber lange Zeit und in sehr hoher Konzentration beeinfluBt werden. Daft aueh Siugetierzellen, die lebhaft Protein synthetisieren, dureh Chloram- phenieol gesch~digt werden kSnnen, zeigen die Aplasien des Knochenmarks, welche naeh langdauernder Behandlung mit hohen Dosen Chloramphenicol beobachtet wurden (s. DRaws). AuBer der Wirkung auf die Proteinsynthese hut Chloram- phenicol auch eine hemmende Wirkung auf einige Enzyme in vitro (s. ~bersieht yon HVNTER U. LOWRY; DIxo~ u. FOV~S 1962; H]sr~oN~N). Die yon uns ge- messenen Enzymaktivititen wurden jedoch dureh 10-am Chloramphenicol in vitro nicht oder nur sehr wenig gehemmt. Die Verminderung der induzierenden Wirkung yon Phenobarbital kSnnte also durch gemmung einer gesteigerten Pro- teinsynthese in vivo zustande gekommen sein.

Wenn es sich auch um einen echten Induktionsprozess handelt, so kSnnten die Xnderungen der Enzymakt iv i t~ten doch zum Tail dadurch vorgetguseht oder zumindest beeinfluBt worden sein, dab die einzelnen Reaktionen eine versehiedene Abh~ngigkeit yon der Proteinkonzentra- tion in den Ans~tzen haben. Die Verh~ltnisse der yon uns gemessenen Enzymakt iv i tg ten zueinander wurden jedoch durch Drittelung oder Verdreifachung der in dieser Arbeit iiblieherweise verwendeten Mikro- somenkonzentrationen nicht ver~ndert.

Der Unterschied zwischen der geringen Stimulierung der p-Hydroxy- lierung von Anilin und der vieffach st~rkeren Stimulierung der p-Hydro- xylierung yon N-Xthylanilin kSnnte sehlieBlich auch dadureh bedingt sein, dab durch Mikrosomen induzierter Tiere Phenylhydroxylamin aus Anilin rascher gebfldet wird als aus N-Xthylaniliu und die grSBere Kon- zentration an Phenylhydroxylamin die l~ing-Hydroxylierung in p- Stellung hemmt. Zusatz yon Phenylhydroxylamin zu den Ans~tzen mit N-Xthylanflin als Substrat hat te jedoeh kaum einen EinfluB auf die Hydroxylierung in p.Stellung. Entsprechend zeigten die Versuehe mit Zusatz von p-Aminophenol zu Ansi tzen mi t Anflin als Substrat, daft p-Aminophenol nieht die Bfldung yon Phenylhydroxylamin hemmt. Die fehlende Stimulierung der N-Hydroxylierung yon N-Xthylanilin kann demnach nieht dadurch vorge~iuscht sein, dab rasch gebfldetes p-Amino- phenol die Hydroxylierung am N hemmt.

Kompet i t ive Beeinflussung einzelner Enzymakt ivi t~ten dureh die in dan Ansatzen zum Schutz des NADP vorhandene, rel~tiv hohe Konzen- t ra t ion an Nieotinsgureamid kann ebenfalls nieht zur Deutung der Unter- schiede in der Aktivit~tssteigerung durch die Behandlung mit Chlor- phenothan oder Phenobarbital herangezogen werden. Bei Weglassen

Induktion der mikrosom~len N- and p-ttydroxylierung yon Anilin 251

yon Nicotins~ureamid aus den Ans~tzen wurden dieselben Aktivit~ten bzw. dieselben Verh~ltnisse zwisehen den Aktivit~ten gefunden.

Die verschiedene Beeinflussung der Enzymaktivit~ten kann aueh nieht durch relativen Substratmangel oder durch Mangel an NADPH erkl~rt werden. Wenn Anilin eine hShere A~finit~t zum N-hydroxylieren- den Reaktionszentrum h~tte als zum p-hydroxylierenden, oder wenn die N-I{ydroxylierung wesentlieh schneller abliefe als die p-Hydroxylierung, kSnnte zwar nach einiger Zeit ffir die p-ttydroxyliertmg der Bereich der Substrats~ttigung unterschritten werden. Entsprechendes wiirde ffir N-J~thylanilin nur im umgekehrten Verhaltnis der beiden I{ydrexy- lierungen zueinander gelten. Die Verh~ltnisse der Reaktionen zueinander waren aber bei 10 rain dauernder Inkubation die gleichen wie bei 40 rain Inkubation, und sie blieben ~uch bei Verdreffachung der Konzentration des NADPH-bfldenden Systems unver~ndert.

Alle Befunde sprechen also dafiir, dab die beobaehteten ~nderungen der Enzymaktivit~ten naeh Behandlung der Tiere mit Chlorphenothan oder Phenobarbital dutch Enzyminduktion bedingt sind. Diese ~nderun. gen sind aber nieht durch die Annahme einer einfaehen Vermehrung eines Enzyms zu erkl~ren.

Die erste M6gliehkeit f~r eine Erkl~rung ist, da]~ die yon uns gemesse- nen l~eaktionen dutch versehiedene Enzyme katalysiert werden. Zahl- reiche Befunde (siehe Einleitung) spreehen fiir das Vorhandensein mehre- rer mikrosomaler Enzyme. Da]3 N-Hydroxylierung yon Anilin und N- ~thylanilin verschieden sind yon der p-Hydroxylierung dieser Substrate, zeigten Y~Es~, u. Mitarb. (siehe Kiv, sv,, 1965): Die p-Hydroxylierungen waren CO-empfindlich, die N-Hydroxylierungen nieht. Die p-Hydroxy- lasen hatten eine wesentlich h6here Sauerstoffaffinit~t als die N-Hydroxy- lasen, abet auch die Sauerstoffabh/~ngigkeit der N-Hydroxylierung yon N-~thylanflin und die der N-Hydroxylierung yon Anilin waren voneinan- der versehieden. K~]~sv. u. Mitarb. (siehe KIEs]~, 1965) fanden noch weitere Untersehiede zwisehen N- und p-Hydroxylierung yon Anflin und N- J~thylanilin: Die N-Hydroxylierung yon Anilin und N-J~thylanflin und die p-Itydroxylierung yon Anilin zeigten versehiedene Abh~ngigkeit der Reaktionsgesehwindigkeiten yon der Substratkonzentration. Die N- und p-Hydroxylierung yon Anilin batten ihre max]male Reaktionsgeschwin- digkeit zwisehen pI-I 7 und 8; die N-Hydroxylierung yon N-~thylanilin nahm dagegen zwisehen pH 8,5 und 6,5 stetig zu. Die N-Hydroxylierung yon N-~thylanilin wurde aul3erdem dureh Stt-Gruppen-bloekierende und metallbindende Hemmstoffe anders beeinttul]t a]s die N-Hydroxy- lierung oder die p-I-fydroxylierung yon Anflin. Aber aueh N-ttydroxy- lierung und p-Itydroxylierung yon Anflin wurden dureh einige Substanzen verschieden stark gehemmt.

252 G. LANGE :

Die verschiedene Induzierbarkeit dieser Reaktionen, welche in der vorliegenden Arbeit beschrieben wurde, w£re ein weiterer Hinweis ffir das Vorhandensein versehiedener Enzyme. Aufgrund der versehiedenen Induktion mfil~te fiir jede der gemessenen Reaktionen ein eigenes Enzym angenommen werden.

Die zweite M6gliehkeit fiir eine Erkl~rung der versehiedenen Aktivi- t~ts~nderungen ist, dal~ das (die) induzierte(n) hydroxylierende(n) Enzym(e) nieht identiseh ist (sind) mit dem (den) Enzym(en) unbehandel- ter Tiere. Diese MSgliehkeit ist mit den Ergebnissen dieser Arbeit weder zu beweisen noeh zu widerlegen.

Dasselbe grit aueh fiir die dritte Erkl~rungsmSglichkeit, dab nieht das (die) Enzym(e) ver~ndert wird (werden), sondern Faktoren, welehe die Zug~ngliehkeit der reaktiven Gruppen ffir ihre Substrate bzw. die I{ydroxylierung des gleiehen Substrats in verschiedenen Positionen des Molekiils beeinflussen.

Beide MSgliehkeiten sind vorerst nieht auszusehliel3en. Einige Be- obaehtungen spreehen sogar daffir. Die Hemmbarkeit und die schein- baren Substratkonstanten der yon uns gemessenen Enzymaktivi t£ten waren bei Mikrosomen yon Tieren, welche Phenobarbital erhalten batten, und bei Mikrosomen unbehandelter Tiere zum Tefl ungleich (VerSffent- liehung in Vorbereitung). Aueh NET~E~ land eine ~mderung der sehein- baren Substratkonstante ffir die N-Demethylierung yon N-Monomethyl- p-nitranilin durch die Vorbehandlung von M~tusen mit Phenobarbital. K s war bei Mikrosomen unbehandelter Tiere : 0,715 • 10 -4, bei Mikro- semen der behandelten Tiere : 1,89 • 10 -*. C o ~ E ¥ et al. (1961) beobaeh- teten, dab ein 15sliehes Enzym der Rattenleber, Uridindiphosphat- Glueose-Dehydrogenase, bei Tieren, welehe mit Chlorbutano] behandelt worden waren, gegen Alterung stabfler war als das Enzym unbehandelter Tiere, dessen Aktivit£t beim Stehenlassen (7 Tage bei 4°C) raseh abfiel. LUNDKVIST trennte versehiedene Esterasen aus Fraktionen yon Ratten- leber-Mikrosomen dureh Immunelektrophorese. Vorbehandlung der Tiere mit Phenobarbital vermehrte die Aktivit~t der Esterasen und ~nderte deren Substratspezifit~t. McMA~o~ u. SULLIVA~ fanden, daB sich dureh Vorbehandlung yon Rat ten mit Phenobarbital die Stereo- spezifit£t bei der mikrosomalen Hydroxylierung von ~thylbenzol zu Methylphenylcarbinol £nderte. Lebermikrosomen unbehandelter Tiere bfldeten 67 °/o d- und 33 °/o 1-Methylphenylearbinol, Mikrosomen der mit Phenobarbital behandelten Tiere 50°/o der d- und 50°/0 der 1-Konfigura- tion. SLAD]~K U. MANNE~G (1966 a) untersnehten die N-Demethylierung yon 3-Methyl-4-Monomethylaminoazobenzol dureh Lebermikrosomen unbehandelter und mit Methyleholanthren behandelter Ratten. Die N-Demethylierung durch Mikrosomen der Tiere, welehe Methyleholan- thren erhalten hatten, war im Gegensatz zur Demethylierung dureh

Induktion der mikrosomalen 2¢- und p-Hydroxylierung von Anilin 253

Mikrosomen unbehandel~er und mi~ Phenobarbi ta l behandel ter Tiere nicht dureh S K F 525 A hemmbar . Aul3erdem n a h m die Demethyl ierung durch die Behandlung der Tiere mi t Methyleholanthren nicht im gleichen Verhiiltnis zu wie die optische Dichte im Absorp t ionsmaximum 450 mEz des CO-Differenz-Spektrums, sondern wie die optisehe I)iehte im Ab- sorp t ionsmaximum 455mtz dos J~thylisoeyanid-Differenz-Spektrums (Sr~ADV, K U. M A ~ R I N G , 1966b). Diese ~ n d e r u n g wird yon den Autoren als Bfldung eines neuen tt~moloroteins bzw. die Zustands~nderung eines mikrosomalen H/imoproteins gedeutet .

Alle diese Befunde spreehen daffir, dab w/ihrend des Induk~ions- prozesses nieht nur quant i ta t ive , sondern auch quali tat ive ~nderungen stattf inden. Diese Jtmderungen betreffen entweder die E n z y m e selbst oder aber die L ipo idmembranen des endoplasmatischen Reticulums. Das mikrosomale E n z y m s y s t e m ist nur rol l funktionsf/ihig, solange diese Membranen in tak t sind. ~nde rungen der Eigensehaften dieser Membranen k6nnten die Zug~nglichkeit der reakt iven Gruppen f/ir ihre Subst ra te oder don Abs tand zwischen reakt iven Zentren beeinflussen.

Frl. H ~ v , W~w~, Frau G~s]~Lx N ~ t r ~ und Frl. t ~ o s ~ Kv, s]~R danke ich ffir ihre Mitarbeit.

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Priv.-Doz. Dr. G. L ~ Pharmakologischcs Institut der Universitiit 8000 Mfinchen 15, Nul~baumstraBe 26