Vorlesung: FortpflanzungWintersemester 2006/7, 5. Fachsemester

- Follikulogenese, Ovulation, Oogenese, IVM und IVF, frühembryomale Entwicklung

Das Leben kommt auf alle Fälle aus einer Zelle.

Doch manchmal endet´s auch bei Strolchen in einer solchen.

Heinz Erhardt

Follikulogenese

Wachstum und Differenzierung von Follikeln

1. Einwanderung von Primordialkeimzellen in die Gonadenanlage

2. Primordialfollikeln

3. Primärfollikeln

4. Sekundärfollikeln

5. Tertiärfollikeln- präovulatorischer Tertiärfollikel (Graafscher Follikel)

- Zunahme der Granulosazellen- Differenzierung der Granulosazellen- Aufbau der Zona pellucida- Wachstum und Reifung der Eizelle

Blutgefäß

Basalmembran

murale Granulosazellen

intermediäre Granulosazellen

antrale Granulosazellen

Eizelle

Zona pellucida

Zellkern

Thekazellen Fibroblasten

Cumuluszellen

- Synthese der Follikelflüssigkeit- Formierung der Follikelhöhle

Die Follikelflüssigkeit bildet das Milieu, in dem die Eizelle reift.

Steigt Fällt

- Glukose - Laktat - ß-HBA - Harnstoff - Cholesterol - Kalium, Chlorid - pH-Wert - Triglyzeride

Harnstoff

NEFA

Eizellqualität

Granulosazell-funktion

Die Stoffwechsellage des Individuums beeinflusst die Zusammensetzung der Follikelflüssigkeit – Bedeutung für die Fertilität teilweise noch unklar.

Grundlagen der Follikelentwicklung

gonadotropin-unabhängig

gonadotropin-abhängig

LH-Impuls

- kontinuierlicher Übertritt vom Ruhepool in die Wachstumsphase

- Selektionsprozess führt zur Dominanz

- Entwicklung des Tertiärfollikels dauert mehrere WochenEndphase bis zur Ovulation nur wenige Tage

Grundlagen der Follikelentwicklung

Die maximale Zahl der Follikel ist vor der Geburt festgelegt. Je älter das Muttertier wird, desto „älter“ sind die Follikel.

Follikelreifung während des Zyklus

- mehrere Follikel beginnen zu wachsen (Kohorte)

- mit zunehmendem Follikeldurchmesser nimmt die Östrogensynthese zu. Dies wirkt negativ rückkoppelnd auf die LH- und FSH–Ausschüttung (negatives Feedback, tierartliche Unterschiede)

- zusätzlich Wirkung von Inhibin aus dem Follikel

- Durch die fallende FSH-Konzentration beginnen kleinere Follikel zu atresieren - „Kampf um das FSH“

- Die steigenden Östrogenkonzentrationen führen zu einer Umschaltung vom negativem auf ein positives Feedback

- Östrogene bewirken eine schlagartige Freisetzung von LH/(FSH)

- „LH-Peak“ wirkt als ovulationsauslösendes Signal

Präovulatorischer LH-Anstieg

Hypothalamus

Follikelwachstum

Glandotrope Zellen des Hypophysenvorderlappen:

• erhöhte GnRH-Rezeptor-Expression

• Sensibilisierung der GnRH-Rezeptoren

• Wechsel von LH-Speicherung zu LH-Freisetzung

• veränderte LH-Glykosilierung

Steigerung der Östrogensynthese

+

+

LH-Ausschüttung mit hoher biologischer Aktivität

Ovulation

Induzierte Ovulation

- auslösender Reiz ist der Paarungsakt

- Rezeptoren in der Vagina führen zur Ausschüttung von gonadotropen Hormonen

Katze: - LH- für multiple Ovulationen sind wiederholte Bedeckungen notwendig

Andere Beispiele: Kaninchen, Frettchen, Kameliden

Tierartliche Unterschiede

Follikelwachstum bis zur präovulatorischen Größe im Interöstrus möglich bei Rind, Pferd, Schaf und Ziege

Praktische Konsequenz?

Ovulation

Fol

likel

durc

hmes

ser

Zyklus

Tierartliche Unterschiede

Follikelwachstum im Interöstrus nur beschränkt möglich bei Schwein, Ratte und Primaten

Praktische Konsequenz?

Ovulation

Fol

likel

durc

hmes

ser

Zyklus

Ovulation nur möglich wenn Progesteron ↓

Ovulation

Fol

likel

durc

hmes

ser

Zyklus

- Luteolyse: Fehlt das Signal des Embryos kommt es zum Abbau des Gelbkörpers

Das endogene Luteolysin ist endometriales PGF2

Ovulation

Fol

likel

durc

hmes

ser

Zyklus

Luteolyse beim Wiederkäuer

Östrogene induzieren die Synthese von Oxytozinrezeptoren im Endometrium

Oxytozin aus dem Gelbkörper bindet an die Endometriumrezeptoren

Induktion der Prostaglandinsynthese im Endometrium

Luteolyse

Oxytozin stellt einen wesentlichen Faktor für die Luteolyse beim Wiederkäuer dar

Ovulation

- Freisetzung der Eizelle und der sie umgebendensomatischen Zellen aus dem Follikel

- Endokrines Signal ist der LH-Peak

- Follikelwand reißt ein (unter Vermittlung verschiedener Entzündungsmediatoren: z. B.: Prostaglandine)

- Die Granulosa- und Thekazellen differenzierenzu Luteinzellen.

- Die Luteinzellen synthetisieren Progesteron.

- Teilweise präovulatorische Luteinisierung(vgl. Deckzeitpunktbestimmung Hündin)

20 Std. vor der Ovulation 6 Std. vor der Ovulation

Strukturelle Follikelwandveränderungen gehen der Ovulation voraus.Der Follikel springt nicht, er fliesst aus.

Prinzipien der Oogenese

- Reduktion des diploiden auf den haploiden Chromosomensatz2n zu n

- Neukombination der maternalen und paternalen Erbsubstanz

Meiose

- Erlangung der Befruchtung- und Entwicklungskompetenz

- Beginn der Meiose in der Fetalperiode- 1. meiotische Arretierung in der 1. Prophase (meist vor der

Geburt oder wenig später)- Wachstumsphase- Wiederaufnahme der Meiose- 2. meiotische Arretierung in der Metaphase 2

LH-Peak

Elektrische Stimulation

Chemikalien

Ovulation: Eizelle im 2. meiotischen Arrest (Metaphase 2, außer Caniden)

Beendigung der Meiose nacherneuter Aktivierung

Isolation aus dem Follikel

Eizelle im 1. meiotischen Arrest

Spermium

Elektrische Stimulation

Chemikalien

Zeitlicher Ablauf der Meiose nach LH-Peak in Stunden

Tierart Latenzphase Metaphase 2(Ovulationsstadium)

Rind 10 - 12 24

Schaf 10 - 11 24

Schwein 17 - 18 40

Oogenese

Eizellreifung oder Maturation

Primordialkeimzelle

Fetus

Post natum

Oogonie

Oozyte

Wachstumsphase

Ovulation

ZygoteBeendigung der Meiose

Eintritt in die Meiose

1. Arretierung

2. Arretierung

Gonadotropinimpuls

Zwischen der 1. meiotischen Arretierung und der Wiederaufnahme der Meiose erlangt die Eizelle ihre meiotische Kompetenz.

Eizellreifung oder Maturation

- induziert durch den präovulatorischen LH-Peak

- Die Eizelle erlangt ihre Befruchtungs- und Entwicklungskompetenz

Kernreifung zytoplasmatische Reifung

Kernreifung Zytoplasmareifung

Auflösung der Kernmembran

Aufbau des Spindelapparates

Chromosomenkondensation

Umorganisation von Zellorganellen

Zunahme von Lipidtropfen

Aktivierung spezifischer Enzyme (MAPK, MPF)

Kernreifung Zytoplasmareifung

Auflösung der Kernmembran

Aufbau des Spindelapparates

Chromosomenkondensation

Umorganisation von Zellorganellen

Zunahme von Lipidtropfen

Aktivierung spezifischer Enzyme (MAPK, MPF)

MPF

MAPK

Abbildung einer ovulierten Eizelle1. Eizellkern (Germinalvesikel) 7. Mikrovilli2. Speichervesikel 8. Zona pellucida3. Mitochondrien 9. + 10. Corona radiata4. Golgifeld5. Kortikalgranula6. Lipidtropfen

Zona pellucida

- extrazelluläre Matrix, welche die Eizelle umgibt

- aufgebaut aus Glykoproteinen

- löst sich tierartlich unterschiedlich zwischen dem 6. und 12. Tag nach der Befruchtung auf

Funktion:

- Gameteninteraktion (Gametenerkennung, Auslösung der Akrosomenreaktion)

- zonaler Polyspermieblock

- Schutz der Eizelle

- Schutz des jungen Embryos

In-vitro-Maturation (IVM)

- Verlegung der Vorgänge der Eizellmaturation in die Kultur

- Folgende Schritte:

- Gewinnung von Eizellen- Kultivierung von Eizellen- nach geschaltete Prozesse (z. B. In-vitro-Fertilisation)

In-vitro-Maturation (IVM) In-vitro-Kapazitation

In-vitro-Fertilisation(IVF)

In-vitro-Embryonen

In-vitro-Maturation (IVM) - Gewinnung von Eizellen

- selektiv- Stimulation von Donatoren- Punktion einzelner Follikel (Laparotomie, Ovum-Pick-up)Vorteil: Abschnitte der Reifung erfolgen in vivo, daher

bessere EntwicklungskompetenzNachteil: aufwendig, teuer

- unselektiv- Sammeln von Ovarien auf dem Schlachthof- Punktion einzelner Follikel oder SplicenVorteil: kostengünstig, viel MaterialNachteil: niedrigere Entwicklungskompetenz

In-vitro-Maturation (IVM) - Gewinnung von Eizellen

Kumulus-Oozyten-Komplex

In-vitro-Maturation (IVM) – Kultivierung von Eizellen

Kultivierung als Kumulus-Oozyten-Komplex

Komplexe Medien mit Zusatz von fetalem Kälberserum

Hormonzusätzemeist LH, FSH, Östradiol

Labor- bzw. Arbeitsgruppen-spezifische Zusätzez.B.: östrisches Kuhserum

Hormoneller Stimulus auf die somatischen Zellen

Effizienz der In-vitro-Befruchtung von in vitro gereiften Rinderoozyten

% von 100 kultivierten Eizellen

Effizienz (%)

Eizellreifung 80 80

Spermienpenetration 64 80

Ausbildung von 2 Vorkernen

51 80

Entwicklung bis zur Morula/Blastozyste

15 30

Gravidität nach Transfer

9 60

Geborene Kälber 7 80

Aus: Niemann, Meinecke, 1994

Probleme der IVM/IVF

- noch nicht ausgereifte Kultivierungsbedingungen für die Eizellen

- noch nicht ausgereifte Kultivierungsbedingungen für die frühen Embryonen

- große Variationen in der In-vitro-Befruchtungspotenz unterschiedlicher Vatertiere

Bisher wurden Nachkommen von verschiedenen Tierarten über IVM/IVF generiert. Die meisten Erfahrungen liegen vom Rind und Schaf vor.

Beim Schwein ergeben sich unter anderem aufgrund der hohen Polyspermierate Probleme in der Anwendung.

Large-calf-syndrome besser Large-offspring-syndrom

DefinitionErscheinung, dass Nachkommen, die aus In-vitro-Techniken stammen, häufig deutlich größer sind, als Individuen, die ohne manipulative Massnahmen generiert wurden.

Folgen- verlängerte Trächtigkeit- erhöhte Dystokierate- erhöhte neonatale Morbidität und Mortalität

Ursachen- Unterschiede im zeitlichen Genexpressionsmotiv ?

Vorgänge vor der Befruchtung

- Position von Spermien im Genitale (Bedeckung, Besamung)

- Spermientransport

- Spermienkapazitation

- Gameteninteraktion (Spermatozoon-Eizell-Interaktion)

- Gametenfusion

- Poylspermieblock

- Vorkernbildung

- Zygotenbildung

Vorlesung Andrologie

Gameteninteraktion (Spermatozoon-Eizell-Interaktion)

- Ein kapazitiertes Spermium bindet an die Zona pellucida(primäre Bindung, Protein-Kohlenhydrat-Bindung)

- Die Bindung löst die Akrosomenreaktion aus:- Exostose von Enzymen aus dem Akrosom- Herausbildung einer fusinogenen Region im Bereich des Äquartorialsegmentes

- Sekundäre Bindung

- Enzymatische Proteolyse in Verbindung mit der Motilität des Spermiums führen zur Penetration der Zona pellucida

fusinogene Region

Akrosomenreaktion

Gametenfusion

- Das Spermium gelangt in den perivitellinen Raum und lagert sich seitlich an die Eizelle

- Das Spermium wird in die Eizelle aufgenommen.

- Die Fusion führt zu einer periodischen Depolarisation der Eizellmembran – Fusionsblock für weitere Spermien

- Überwindung der 2. meiotischen Arretierung der Eizelle, Beendigung der Meiose, Abschnürung des 2. Polkörperchens

Polyspermieblock

- Schneller Polyspermieblock:Depolarisation der Eizellplasmamenbran

- Langsamer Polyspermieblock:Depolarisation führt zur Exocytose der kortikalen Granula in den perivitellinen Raum.Dies bewirkt eine strukturelle Veränderung

der Zona pellucida – Zonablock.

Frühe embryonale Entwicklung

- Blastozytenformation: - äußere Zellen

- Trophoblast- Embryoblast

- inner cell mass, Embryonalknoten- Ektoderm, Mesoderm, Endoderm

- Zona-Schlupf

- ElongationNach dem Schlupf aus der Zona kommt es zum massiven

Größenwachstum bei Schaf und Schwein (11. Tag) und Kuh (Tag 13).

Schwein: 2 mm sphäroid am 10. Tag10 mm tubulär am 11. – 12. Tag

Frühe embryonale Entwicklung

- intrauterine Migration

- Implantation

- Plazentation

Der Eileiter ist der Ort

- der Befruchtung- der frühembryonalen Entwicklung- an dem Transport der

Gameten und des Embryos stattfindet

- der an der Regulation der Spermienfreisetzung

beteiligt ist

Erkrankungen des Eileiters können zur Sub- und Infertilität führen.