Vorlesung GMP&Zelltherapeutika WS 2014.15 Version 15.12.2014 · 2015. 3. 4. ·...
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Good Manufacturing Prac0ce (GMP)/ Zelltherapeu0ka
Ins$tut für Klinische Hämostaseologie & Transfusionsmedizin, Campus Homburg AG Klinische Zelltherapie Prof. Dr. Hermann Eichler Dr. Isabelle Müller Gebäude 1 DRK-‐Gebäude Tel. 06841/16-‐22530 06841/16-‐41124 [email protected] [email protected]
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ZHMB M.Sc. HuMB Advanced Modul II "Signalleitung und Transport” WS2014/15 Good Manufacturing Prac0ce (GMP)/ Zelltherapeu0ka
ArzneimiYelgesetz
¤ Defini0on ArzneimiYel ¤ § 2 ArzneimiYelbegriff
(1) ArzneimiYel sind Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, 1. die zur Anwendung im oder am menschlichen oder 0erischen Körper bes0mmt sind und als
MiYel mit Eigenscha`en zur Heilung oder Linderung oder zur Verhütung menschlicher oder 0erischer Krankheiten oder krankha`er Beschwerden bes0mmt sind oder
2. die im oder am menschlichen oder 0erischen Körper angewendet oder einem Menschen oder einem Tier verabreicht werden können, um entweder
a) die physiologischen Funk0onen durch eine pharmakologische, immunologische oder metabolische Wirkung wiederherzustellen, zu korrigieren oder zu beeinflussen oder
b) eine medizinische Diagnose zu erstellen.
¤ Anforderungen an die ArzneimiYel ¤ Herstellung von ArzneimiYeln ¤ Zulassung und Registrierung von Fer0garzneimiYeln ¤ Abgabe von ArzneimiYeln ¤ Schutz des Menschen bei der klinischen Prüfung ¤ Sicherung und Kontrolle der Qualität ¤ Beobachtung, Sammlung und Auswertung von ArzneimiYelrisiken ¤ Überwachung ¤ Ha`ung für ArzneimiYelschäden
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Gentherapeu$ka
Rekomb. Nukleinsäuren in:
-‐ Vektoren -‐DNA oder RNA -‐gene0sche veränderten
Zellen -‐Viren
ArzneimiYel für neuar0ge Therapien
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ATMP Advanced Therapy Medicinal Products
Soma$sche Zelltherapeu$ka
Entwickelte Zellen für
Krankheits-‐: -‐Behandlung -‐Präven0on -‐Diagnose
Biotechnologisch bearbeitete Gewebeprodukte
Entwickelte Zellen für Gewebe-‐: -‐Regenera0on, -‐Reparatur -‐Ersatz
Kombinierte ATMP
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Gentherapeu0kum
Biologisches ArzneimiYel zur Anwendung im oder am Menschen mit folgenden Merkmalen: ¤ enthält einen Wirkstoff, der eine rekombinante Nukleinsäure
enthält oder daraus besteht, der im Menschen verwendet oder ihm verabreicht wird, um eine Nukleinsäuresequenz zu regulieren, zu reparieren, zu ersetzen, hinzuzufügen oder zu enkernen.
und ¤ seine therapeu0sche, prophylak0sche oder diagnos0sche Wirkung
steht in unmiYelbarem Zusammenhang mit der rekombinanten Nukleinsäuresequenz, die es enthält, oder mit dem Produkt, das aus der Expression dieser Sequenz resul0ert.
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Soma0sches Zelltherapeu0kum
Biologisches ArzneimiYel zur Anwendung im oder am Menschen, das folgende Merkmale aufweist: ¤ besteht aus Zellen oder Gewebe, die substanziell* bearbeitet wurden, so dass
biologische Merkmale, physiologische Funk0onen oder strukturelle Eigenscha`en, die für die beabsich0gte klinische Verwendung relevant sind, verändert wurden.
oder ¤ besteht aus Zellen oder Gewebe, die im Empfänger im Wesentlichen nicht
der(n)selben Funk0on(en) dienen sollen wie im Spender, oder es enthält derar0ge Zellen oder Gewebe. Dieser Bes0mmungszweck wird auch „non-‐homologous use“ genannt.
und ¤ ihm werden Eigenscha`en zur Behandlung, Vorbeugung oder Diagnose von
Krankheiten durch pharmakologische, immunologische oder metabolische Wirkungen der enthaltenen Zellen oder Gewebe zugeschrieben und es wird zu diesem Zweck im Menschen verwendet oder ihm verabreicht.
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Biotechnologisch bearbeitetes Gewebeprodukt
Biologisches ArzneimiYel zur Anwendung im oder am Menschen, das folgende Merkmale aufweist: ¤ enthält biotechnologisch bearbeitete Zellen oder Gewebe oder es besteht aus ihnen. und ¤ Ihm werden Eigenscha`en zur Regenera$on, Wiederherstellung oder zum Ersatz menschlichen
Gewebes zugeschrieben. ¤ Zellen oder Gewebe gelten als biotechnologisch bearbeitet, wenn sie wenigstens eine der
folgenden Bedingungen erfüllen: ¤ Die Zellen oder Gewebe wurden substanziell* bearbeitet, so dass biologische Merkmale,
physiologische Funk0onen oder strukturelle Eigenscha`en, die für die beabsich0gte Regenera0on, Wiederherstellung oder den Ersatz relevant sind, erzielt werden.
oder ¤ Die Zellen oder Gewebe sind nicht dazu bes0mmt, im Empfänger im Wesentlichen dieselbe(n)
Funk0on(en) auszuüben wie im Spender (non-‐homologous use).
¤ Keine biotechnologisch bearbeiteten Produkte sind Produkte, die ausschließlich nicht lebensfähige menschliche oder 0erische Zellen und/oder Gewebe enthalten oder aus solchen bestehen und die nicht hauptsächlich pharmakologisch, immunologisch oder metabolisch wirken.
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Kombinierte ATMP
Als „kombiniertes ArzneimiYel für neuar0ge Therapien“ gilt ein ATMP, das folgende Voraussetzungen erfüllt: ¤ Es enthält als festen Bestandteil eines oder mehrere Medizinprodukte im
Sinne des Ar0kels 1 Absatz 2 Buchstabe a der Richtlinie 93/42/EWG oder eines oder mehrere ak0ve implan0erbare medizinische Geräte im Sinne des Ar0kels 1 Absatz 2 Buchstabe c der Richtlinie 90/385/EWG.
und ¤ Sein Zell-‐ oder Gewebeanteil muss lebensfähige Zellen oder Gewebe
enthalten. oder ¤ Sein Zell-‐ oder Gewebeanteil, der nicht lebensfähige Zellen oder Gewebe
enthält, muss auf eine Weise auf den menschlichen Körper einwirken können, die im Vergleich zu den genannten Produkten und Geräten als Hauptwirkungsweise betrachtet werden kann.
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Regulatorische Anforderungen nehmen mit Entwicklungsstufe zu
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¤ Unterschiedliche Stufen der Produktentwicklung fordern unterschiedliche Dossiers zur Bewertung durch unterschiedliche Behörden!
Phase I
Phase II GMP
Herstellung
Phase III
Herstellung-‐ erlaubnis Genehmigung für Klinische Studien
Länderebene Na0onal: PEI EMA/PEI
Zentrale EU Zulassung
EG 1394/2007 (ATMP-‐ Verordnung) § 13 AMG (Deutsches ArzneimiYelgesetz)
¤ Regulierung findet auf EU-‐Ebene staY; EU-‐Richtlinien sind im AMG umgesetzt
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ArzneimiYel von Forschung zur Zulassung
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Phase I
Methodenvalidierung, Wirksamkeit, Produktspezifika0on
Phase II
Forschung
Phase III
Labormaßstab
Präklinische Phase
Markt-‐ware
Produk0onsmaßstab
GMP
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Ethikkommission
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¤ Beurteilt, ob Vorhaben anhand der Normen, die durch Gesetze oder Richtlinien vorgegeben sind, ethisch vertretbar ist.
¤ Projekt muss hohe wissenscha`liche Qualität aufweisen. ¤ Einverständniserklärung: Jeder Studienteilnehmer muss sein freies,
informiertes Einverständnis geben. ¤ Risikominimierung
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Herstellung Tumorlysat • Resek0onsmaterial von Glioblastom-‐Pa0enten • mechanische Zerkleinerung, Homogenisierung,
Avitalisierung (6x Wechsel 5min LN2 -‐ 5min 56°C, 60 Gy), Bes0mmung Proteingehalt
• Nachweis Avitalität (Trypanblau-‐Färbung, ATP-‐Assay)
Gewinnung & Anreicherung der CD14+ Monozyten • Leukapherese
• Leukozyten (weiße Blutkörperchen) werden aus dem Blut getrennt.
• Dichte-‐Gradient-‐Zentrifuga0on (Elutria0on) • weißen Blutkörperchen werden von peripheren mononukleären Blutzellen getrennt
Generierung unreifer DC • In-‐vitro Konversion der Monozyten durch Zytokine GM-‐
CSF & IL-‐4 zu unreifen dendri0schen Zellen
Generierung reifer DC • Reifung durch Zytokine TNF-‐α & IL-‐1β und
Tumorbeladung in ak0ve, reife dendri0sche Zellen
Vakzinierung • Intradermale Injek0on der DC zurück in den Pa0ent • Ak0vierung der IA & Rückbildung Tumor
Soma$sche Zelltherapeu$ka -‐ ATMP Herstellung von autologe DC für die Immuntherapie -‐ Experimenteller Au{au
14 14
+ GM-‐CSF & IL-‐4
Tumor-‐lysat
DC-‐Zellkultur
+ TNF-‐α
& IL-‐1β
Tumorlysat-‐ beladene DC
Monozyten-‐Zellkultur
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GMP
¤ Good Manufacturing Prac0ce = Gute Herstellungspraxis ¤ Umsetzung von Gesetzen und pharmazeu0schen Regelwerken in die
Produk0onspraxis ¤ GMP ist eine Verordnung zur Qualitätssicherung bei der Herstellung
von ArzneimiYeln
¤ Was ist Qualität? ¤ Reproduzierbarkeit ¤ Eignung für einen vorgesehenen Zweck ¤ Jede Charge innerhalb festgelegter Grenzen gleich ¤ Qualität entsteht durch die Summe aller Tä0gkeiten in einem Prozess ¤ Kontrollierte und nachvollziehbare Abläufe
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Praxisbeispiel „GMP“: Kuchenbacken
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Qualitätsrelevante Parameter
Alltag
GMP
Rohstoffe Eier, Zucker, Mehl etc. im Laden kaufen
¨ Rohstoffspezifika0on erstellen ¨ Rohstoffe gegen Spezifika0on prüfen und
freigeben
Ausrüstung und Geräte
Backofen mit Ober-‐ und Unterhitze
Qualifizierter Backofen: ¨ Thermostat kalibrieren ¨ Temperaturverteilung mit Sensoren prüfen ¨ Gerät für Zweck freigeben
Teigherstellung
Rezept kann nach Belieben variiert werden
¨ festgelegte Herstellungsvorschri` ¨ jeder SchriY wird dokumen0ert und
quiert
Backen
ca. 60 min bei 160°C
¨ Festlegung Temperatur-‐Bereich (160 ± 2°C) ¨ kon0nuierliche Temperatur-‐Überwachung ¨ Dokumenta0on des Temperatur-‐Verlaufs
Abkühlen
Auf dem Küchen0sch ¨ definierte Raumbedingungen (Temperatur, Lu`feuch0gkeit, Keime)
¤ Was unterscheidet den Kuchen vom Arzneimi\el? Beim Arzneimi\el gefährden Abweichungen unmi\elbar die Qualität des Produkts und damit Sicherheit des Pa$enten!
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Verschiedene Aspekte von GMP
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Gebäude
GMP
Dokumen-‐ta0on
Rohstoffe Produk0ons-‐prozess
Personal
Qualitäts-‐kontrolle
Geräte/Anlagen/ Ausrüstung
Hygiene
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Hygiene
¤ Hygieia verkörperte im an0ken Griechenland die Präven0vmedizin ¤ Lehre von der Erhaltung der Gesundheit und der vorbeugenden
Verhütung von Krankheiten ¤ Hygiene dient dem Schutz des Produktes vor Kontamina$onen mit
Mikroorganismen oder Par0keln ¤ Besondere Bedeutung in der Biotechnologie
fer0ges Endprodukt ist in der Regel nicht sterilisierbar àAnwendung o` parenteral (Injek0on in Blutkreislauf)
¤ Personalhygiene ¤ Betriebshygiene:
¤ Herstellung pharmazeu0scher Produkte erfolgt in der Regel in Reinräumen
¤ Reinräume unterliegen einem festgelegten Hygieneprogramm
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Mögliche Kontamina0onsquellen
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Geräte und Anlagen
Kontamina$onen (Par$kel,
Mikroorganismen)
Wasser
Rohstoffe
Räume
Verpackungen
Lu`
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Reinraum-‐Anlage: Prinzipieller Au{au
¤ Definierte Lu`zufuhr über Hochleistungsfilter (Staubpar0kel tragen Bakterien)
¤ Überdruck zur Umgebung (+ 15 Pa pro Reinraumklasse) ¤ Reinraumklassen D -‐ A ¤ Reinraumgerechte Konstruk0on:
¤ GlaYe Oberflächen ¤ Wände und Decken kompleY verfugt ¤ Spezielle Fussböden ¤ Keine Öffnungen (z. B. Bodenabflüsse) ¤ Geschlossene Fenstersysteme
¤ Bauliche und organisatorische Maßnahmen (z.B. Personal-‐,Materialschleusen)
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Überwachung der Reinraum-‐Anlage: Reinraum-‐Monitoring
¤ Messung der Par0kelzahl in der Lu` mit Laser-‐Par0kel-‐Counter
¤ Messung der Lu`keimzahl ¤ Lu`keimsammler (Aufschleudern von Lu`
auf festen Nährboden) ¤ Sedimenta0onsplaYen
¤ Messung der Oberflächenkeimzahl mit KontaktplaYen
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Anforderungen der Reinraum-‐Klassen: Keimbelastung (EU-‐GMP-‐Leikaden)
¤ Keimverbreiter Nr. 1 im Reinraum ist der Mensch Ein gesunder Mensch gibt pro Tag ca. 29 Mio. Keime in seine Umgebung ab
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Klasse Lu`probe KBE/m3
Petrischalen (Durchm. 90mm) Abdruck KBE/4Std
Kontaktpla\en (Durchm. 55mm) KBE/Pla\e
Handschuh-‐Abdruck 5 Finger KBE/Handschuh
A
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Anforderungen der Reinraumklassen: Par0kelbelastung (EU-‐GMP-‐Leikaden)
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Zum Vergleich: ¤ Stadtlu` enthält ca. 500 – 1000 Mio. Par0kel ≥ 0,5 μm pro m3
¤ Berglu` (2000 m Höhe) enthält bis 30 Mio. Par0kel ≥ 0,5 μm pro m3
Klasse at rest in opera$on
Par0kel ≥ 0,5 μm pro m3
Par0kel ≥ 5 μm pro m3
Par0kel ≥ 0,5 μm pro m3
Par0kel ≥ 5 μm pro m3
A 3250 20 3250 20
B 3250 29 325 000 2 900
C 325 000 2 900 3 250 000 29 000
D 3 250 000 29 000 nicht festgelegt nicht festgelegt
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Personalhygiene: Reinraumkleidung
¤ Besteht aus „par0kelarmem“ Gewebe ¤ Schützt das Produkt vor
Kontamina0on ¤ Besteht entsprechend der
Reinraumklassifizierung aus – Overall oder zweiteiliger Reinraumanzug ¤ Reinraumschuhe ¤ Kop{edeckung ¤ Mundschutz ¤ Handschuhe
¤ Betreten des Reinraumes durch Personalschleusen: genaue Vorschri`en
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Verschiedene Aspekte von GMP
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Gebäude
GMP
Dokumen-‐ta0on
Rohstoffe Produk0ons-‐prozess
Personal
Qualitäts-‐kontrolle
Geräte/Anlagen/ Ausrüstung
Hygiene
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Dokumenta0on
¤ Good Manufacturing Prac0ce = Give me More Paper ¤ Ziele der Dokumenta0on:
¤ KompleYe Rückverfolgbarkeit ¤ Vollständige Nachvollziehbarkeit
Was nicht dokumen$ert ist, wurde nicht durchgeführt!
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Warum muss dokumen0ert werden?
¤ Nachvollziehbarkeit der Daten bei eventuellen Problemen mit der ArzneimiYelcharge (wer hat wann was und wie gemacht?)
¤ Vermeidung von Fehlern durch eindeu$ge Festlegung der Abläufe (z. B. Herstellungsanweisung)
¤ Reproduzierbare Steuerung von Prozessen (z. B. Wiegen, Sterilisieren etc.)
¤ Bestä0gung der Übernahme der Verantwortlichkeit durch Unterschri`en
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Dokumenta0onsarten im GMP-‐Betrieb
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Schulungs-‐protokolle
GMP-‐Dokumente
Hygiene-‐protokolle
Änderungs-‐dokumenta0on
Kalibrier-‐protokolle
Arbeitsan-‐weisungen (SOPs)
Logbücher von Geräten /MPB
Chargen-‐protokolle
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Medizinproduktebuch -‐ Logbuch
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Kalibrierung
Medizin-‐produkte-‐
buch Wartung
Belegung
Änderungen
Reparatur
Reinigung
Requali-‐fizierung
¤ jede Eintragung von einem Verantwortlichen visiert (abgezeichnet) ¤ Macht den „Lebenslauf“ eines Gerätes nachvollziehbar
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Verschiedene Aspekte von GMP
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Gebäude
GMP
Dokumen-‐ta0on
Rohstoffe Produk0ons-‐prozess
Personal
Qualitäts-‐kontrolle
Geräte/ Anlagen/ Ausrüstung
Hygiene
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Qualifizierung und Validierung
Qualifizierung
¤ Dokumen0erter Nachweis, dass Ausrüstungsgegenstände (Anlagen, Geräte, Räume etc.) für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, einwandfrei arbeiten und zu den erwarteten Ergebnissen führen
¤ Qualifizierung ist ausrüstungsbezogen !
Validierung
¤ Dokumen0erter Nachweis, dass Prozesse (z. B. DC-‐Herstellung )innerhalb festgelegter Grenzen zu den erwarteten Ergebnissen führen
¤ Validierung ist prozessbezogen !
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Grundlagen der Qualifizierung
Ziele der Qualifizierungstä0gkeiten ¤ Sicherstellen, dass das Gerät / die Anlage ein geeignetes Design für
den Einsatz im GMP-‐Umfeld besitzt ¤ Überprüfung, ob die Installa0on korrekt und gemäß der Planung
erfolgt ist ¤ Überprüfung der Funk0onalität
Frühzei0ges Erkennen von Mängeln oder Abweichungen Ablauf der Qualifizierung ¤ Designqualifizierung DQ (Design Qualifica0on) ¤ Installa0onsqualifizierung IQ (Installa0on Qualif.) ¤ Funk0onsqualifizierung OQ (Opera0onal Qualif.) ¤ Leistungsqualifizierung PQ (Performance Qualif.)
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ZHMB M.Sc. HuMB Advanced Modul II "Signalleitung und Transport” WS2014/15 Good Manufacturing Prac0ce (GMP)/ Zelltherapeu0ka
Au{au eines einzelnen Qualifizierungstests
¤ Testziel: Was soll getestet werden? ¤ Testbeschreibung: Wie soll der Test durchgeführt werden? ¤ Akzeptanzkriterien Eindeu$ge Festlegung
(nicht: „Ergebnisse entsprechen den Erwartungen“) ¤ Resultate: Dokumenta0on der Testergebnisse + Wer hat wann was
gemacht? ¤ Testbeurteilung: Test insgesamt erfüllt?
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Grundlagen der Validierung
¤ Validierung erfolgt vor Markteinführung des ArzneimiYels ¤ Teil der Zulassungsdokumenta0on
¤ Dokumen0erter Nachweis, dass der Herstellungsprozess innerhalb festgelegter Grenzen reproduzierbar zum erwarteten Ergebnis führt
¤ Z.B. drei Validierungschargen mit erhöhtem Kontrollaufwand ¤ ErmiYlung von Art und Umfang der Kontrollpunkte durch eine
Risikoanalyse ¤ Beispiele
¤ Herstellungsprozesse ¤ Sterilabfüllung von Produktlösung ¤ Analysenmethoden/ Assays ¤ Reinigung von Geräten ¤ Kühltransport temperaturempfindlicher Substanzen
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Development of a GMP-‐compliant produc0on process for autologous, tumor-‐lysate pulsed dendri0c cells (ATMP) A prerequisite for the processing of clinically applicable cell based medicinal products is a fine-‐grained GMP validation protocol
1.
Methods & Results
1.
Methods
DC-‐generation protocol using ficollized PBMC followed by plate
adherence
The exact procedure of performed clinical process validation is
coordinated in advance with
supervisory authority
Generated quality data were used to
apply for the manufacturing
authorization based on pharmaceutical law, and details of clinical process validation were
agreed in advance with the local drug
authority. All production steps, were validated and finally approved.
1.
Transfer into a closed system using large-‐scale monocyte
isolation techniques with GMP-‐compatible
reagents
day 0*
day 7* day 9* day2* day 4* day 6* day > 9 *
Apheresis & Enrichment of monocytes & differentation
cytokines
Manufacturing steps
Medium & differentation
cytokines Vaccination of DC Vaccination of cryoconserved DC
Tumor lysate & maturing cytokines
Preclinical process validation
day < 0*
Medium & differentation
cytokines
Differentiation cytokines Preparation
Clinical process validation
Clinical patient study
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Verschiedene Aspekte von GMP
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Gebäude
GMP
Dokumen-‐ta0on
Rohstoffe Produk0ons-‐prozess
Personal
Qualitäts-‐kontrolle
Geräte/ Anlagen/ Ausrüstung
Hygiene
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ZHMB M.Sc. HuMB Advanced Modul II "Signalleitung und Transport” WS2014/15 Good Manufacturing Prac0ce (GMP)/ Zelltherapeu0ka
Wissenscha`liche Herausforderungen
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Nicht-‐klinische Aspekte
¨ Verfügbare & relev. Tiermodelle ¨ Toxikologie
¨ Pharmakovigilanz ¨ Biodistribu8on ¨ Tumorigenität
¨ Immunogenität ¨ Prolifera0ons-‐/Differenzierungskapazität
¨ Manipula0onslevel: in vitro/ex vivo Vermehrung/ Ak0vierung
ATMP
Ausgangsmaterial ¨ Materialzuverlässigkeit
¨ Spendertestung ¨ Mikrobiolog. Sicherheit der Gewinnung ¨ Herkun` der Zellinie (allogen -‐ autolog)
¨ Variabilität
Qualitätsaspekte ¨ Charakterisierung
¨ Iden0tät ¨ Sterilität ¨ Reinheit
¨ Verunreinigungen ¨ Potency
Transport zum Hersteller ¨ KühlkeYe
¨ Lebensfähigkeit der Zellen ¨ Chemikalien für Kryonservierung
¨ Sterilität
¨ adäquater Nachweis der Wirkung („proof of concept“) ¨ Interak0on zwischen Produkt und umgebendem Gewebe ¨ Begründung für gewählten Dosierungen und Häufigkeit ¨ Sekundäre Pharmakodynamik zur Bes0mmung anderer
physiologischer Effekte als dem therapeu0schen Effekt. ¨ Expression biologisch ak0ver Substanzen
Klinische Aspekte ¨ Sichere ini0ale Dosis
¨ Art der Anwendung (lokal, systemisch..) ¨ Reak0on im Menschen
¨ Nachverfolgung ¨ Wirksamkeit
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Grundsätze zum Design eines Produk0onsprozesses
Schon bei der Entwicklung im Labormaßstab beachten: ¤ Auswahl der Rohstoffe (Herkun`, Preis, TSE-‐Risiko) ¤ Prozess muss Scale-‐up-‐fähig sein (z. B. kein Wachstum auf festen
Kulturmedien) ¤ Möglichst einfache Prozesse ¤ Robuste Prozesse ¤ Kühlbedingungen vermeiden ¤ Keine An0bio0ka im Fermenta0onsmedium
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Herstellungsphasen: Präklinische Phase
¤ Durchführung von Versuchen an isolierten Zellen, Zellkulturen, Organen sowie Tierversuche
¤ Tierversuche werden durchgeführt, um das biologische Geschehen in einem Lebewesen nachzuvollziehen (z. B. Bioverfügbarkeit), daher kann nicht gänzlich darauf verzichtet werden (gesetzliche Vorgaben)
¤ Der neue Arzneistoff wird dem Tier verabreicht: ¤ 1) Wie toxisch ist die Substanz ¤ 2) TriY der erwartete und erwünschte Effekt auf? ¤ Verläu` die Reak0on posi0v gemäß den Erwartungen folgt eine detaillierte
Untersuchung. ¤ Detaillierte Untersuchung: Testung auf Verträglichkeit und eventuelle
Nebenwirkungen, Risiko auf Erbgutschädigung, Missbildungsauslösung und Krebserzeugung.
¤ Von 10.000 Substanzen bleiben ca. 10 übrig, die für geeignet zur Weiterentwicklung befunden werden
¤ + 3 klinische Phasen ¤ Bis zur Zulassung sind in der Regel ca. 11-‐ 12 Jahre vergangen!
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Development of a GMP-compliant production process for autologous, tumor-lysate pulsed dendritic cells (ATMP) 1.
Methods & Results
day 0*
day 7* day 9* day2* day 4* day 6* day > 9 *
Apheresis & Enrichment of monocytes & differentation
cytokines Manufacturing steps
Medium & differentation
cytokines Vaccination of DC Vaccination of cryoconserved DC
Tumor lysate & maturing cytokines
Preclinical process
validation
phenotype vitality vitality
protein quantification
avitalization
day < 0*
Medium & differentation
cytokines
Differentiation cytokines
solutions
Preparation
FBS
ATP-‐Assay, SIA, CASY & trypan blue
batch controls
migration assay Storage stability of the DC preparation
vitality
allogenic tumor lysate
Clinical process
validation
leucapheresis & elutriation
MediaFill test
3 bags mycoplasma& endotoxine
batch controls
protein quantification
avitalization ATP-‐Assay & trypan blue
sterility
sterility
sterility
cell count phenotype vitality sterility
cell count phenotype vitality sterility
cell count phenotype vitality sterility
sterility Storage stability of the DC
preparation
infection serology
sterility sterility sterility
migration assay
HSA
allogenic tumor lysate
G M P
2
1
solutions: sterility
vitality phenotype phenotype phenotype
cell count
Quality after cryopreservation
cell count phenotype vitality sterility
autologous T-‐cell-‐stimulation assay
Quality after cryopreservation
Migratory capacity of matured DCs towards CCL19 + CCl21 in transwell assay Viability of fresh or cryoconserved mature DC in final product container
CD86, CD80, HLA-‐DR and CD80 as surrogate markers for DC maturation after cryoconservation
Characterization of cryoconserved matured DCs
Finally, mature DCs were cryopreserved and thawed without significant loss of both vitality and function as shown by migration, marker expression as well as additional stability tests in the final product container.
Leukocytes depletion chamber + ficoll
cell count cell count cell count
mycoplasma& endotoxine
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Valida0on of a non-‐vital tumor lysate (cTL) Trypan blue staining
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B A
C
Trypan blue staining is a tool to differen0ate viable from non-‐viable par0cles within TL.
Müller, I., et al. Transfusion and Medicine Hemotherapy. 2014
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Valida0on of a non-‐vital tumor lysate (cTL) CASY TTC cell counter
B
C
D
A A
B
lTC (median diameter 18-‐20 µm; 87.5% of cells > 10µm) were significantly larger than par0cles detected in cTL (78.7% of par0cles < 10µm).
Short coming: no interpreta0on of larger par0cles (>10 µm)
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A B Ø
10
100
1000
10000
100000
1000000
abso
lute
luci
fera
se u
nits
PBMCs /complete avitalized tumor
ATP-‐release assay reliably detects the absence of viable, metabolically ac0ve cells, but requires large amounts of 0ssue
Valida0on of a non-‐vital tumor lysate (cTL) ATP-‐Assay Valida0on of a non-‐vital tumor lysate: ATP-‐Assay
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A C
D B
SIA is an effec0ve tool to confirm complete destruc0on of cells within cTL based on size, shape and morphology with a very small amount of cTL
Valida0on of a non-‐vital tumor lysate: ATP-‐Assay
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Verschiedene Aspekte von GMP
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Gebäude
GMP
Dokumen-‐ta0on
Rohstoffe Produk0ons-‐prozess
Personal
Qualitäts-‐kontrolle
Geräte/Anlagen/ Ausrüstung
Hygiene
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Daten zur Qualität
¤ Herstellungserlaubnis = Definiertes, (validiertes), GMP-‐konformes Herstellungsverfahren
¤ Endprodukt-‐Spezifika0on: ¤ Begründete Spezifika0onen für
¤ Wirkstoff, Verunreinigungen, Reinheit, Zellzahl/Vitalität ¤ Zellsubstrat, Medien, Reagenzien, Proteine, DNA, Spezifische Gene/
Onkogene ¤ Mikrobielle Sicherheit ¤ Virussicherheit/TSE ¤ Stabilität ¤ Spezifische Ak0vität (Potency)
¤ Auf Basis der Charakterisierungsstudien definiert ¤ Begrenzt durch Produktmenge & Zeitspanne bis zur Freigabe
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