This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Zur Biochemie der Thiamintriphosphorsäure II. Mitt.: Der fermentative Abbau des Thiamintriphosphorsäureesters durch Myosin

V o n H E L M U T G R E I L I N G u n d L U T Z K I E S O W

Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Freien Universität Berlin ( Z . Natur f o r s chg . 12 b , 6 7 2 — 6 7 5 [ 1 9 5 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 10. Jul i 1957)

TTP wird durch Myosin zu TDP und Orthophosphat abgebaut. Die Reaktion wird durch Ca++

aktiviert, durch Mg++ gehemmt und hat zwei pn-Optima (pn 6,5 und PH 9).

Den fermentativen Abbau des TTP mit Kartof-fel-apyrase studierten V E L L U Z 1 und K I E S S L I N G 2 . Da-bei fand K I E S S L I N G , daß die Apyrase bei 0 ° C die Hydrolyse des v-P katalysiert, während bei 40 C y- und ß-P abgespalten werden.

R O S S I - F A N E L L I et al.3 beobachteten einen T T P -

Abbau durch mit Alkali gewaschener Hefe. Im Gegensatz hierzu wurde im tierischen Gewebe

bisher kein Ferment gefunden, das TTP hydrolytisch spaltet.

In Untersuchungen von V E L L U Z 1 war eine A T P -

ase-aktive Myosinpräparation gegen TTP unwirk-sam.

Wir fanden dagegen in unseren Experimenten eine fermentative Spaltung des chromatographisch reinen TTP durch Myosin, über die wir hier berich-ten.

Material und Methoden 1. S u b s t r a t

32P-markierte TTP und TDP wurden in chromato-graphisch reiner Form nach dem von uns angegebenen Verfahren4 hergestellt.

2. F e r m e n t e a) Das Myosin erhielten wir nach der Methode von

P E R R Y 5 aus Kaninchenmuskel. Das Ferment wurde drei-mal umkristallisiert.

b) Wir benutzten Myokinase aus Muskel (Präparat der Firma Boehringer und Söhne, Mannheim).

3. N a - S a l z d e r ADP Ba-Salz der ADP wurde mit der Na-Form des Ionen-

austauschers JR 120 in das Na-Salz übergeführt*. Wir benutzen folgende Abkürzungen:

TTP = Thiamintriphosphorsäure-ester, TDP = Thiamindiphosphorsäure-ester, TMP = Thiaminmonophosphorsäure-ester, ATP = Adenosintriphosphat, ITP = Inosintriphosphat,

UTP = Uridintriphosphat, Tris = Tris-hydroxvmethylaminomethan.

1 L. VELLUZ , G. A M I A R D U . J. BARTOS , J. biol. Chemistry 180, 1137 [1949].

4. D i e B e s t i m m u n g d e r f e r m e n t a t i v e n S p a l t u n g v o n TTP d u r c h M y o s i n

Die Reaktionstemperatur betrug bei allen Versuchen 25° C. Die Hemmung der Reaktion erfolgte durch Tri-chloressigsäure mit einer Endkonzentration von 10 Pro-zent. Von der enteiweißten Lösung wurde ein aliquoter Teil zur Papierchromatographie aufgetragen.

Die Entwicklung der Chromatogramme erfolgte im Lösungsmittelgemisch: Isopropanol : Wasser : Trichlor-essigsäure (20-proz.) : Ammoniak (25-proz.) = 35,5 : 4,5 : 10,0 : 0,15 nach 1. c. 4 im Kälteraum bei +10° C.

Die quantitative Auswertung der Chromato-gramme wurde wie schon mitgeteilt4 durchgeführt.

Ergebnisse

1. D e r z e i 11 i c h e V e r 1 a u f d e r T T P - S p a l t u n g d u r c h M y o s i n

Das Ergebnis des TTP-Abbaus durch Myosin zei-gen die Abb. 1 und 2 sowie Tab. 1, aus der hervor-geht, daß unter Einwirkung von Myosin TDP und P04 aus TTP nach der folgenden Reaktionsgleichung gebildet werden:

TTP + H 2 0 - ~ " TDP + H3P04 . (1) Danach wird nur das y — P des TTP abgespalten.

Substanz 0 5 10 15 t [min]

TTP 100,0 67,0 50,8 41,6 i n % TDP 0,0 22,3 31,6 38,0 der TMP 0,0 0,0 0,0 0,0 Gesamt-PO4 0,0 10,7 17,6 20,4 aktivität

Tab. 1. Aktivitätsverteilung beim fermentativen Abbau von TTP durch Myosin. Der Versuchsansatz enthielt: 0,05 ml 0,1-m. CaCl, ; 0,5 ml Puffer-Substrat (0,1-m. Tris-Puffer

+ 0,2 /cMol TTP; pn 9,1) ; 0,1 ml Enzymlösung.

2 K. H. KIESSLING. Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 20. 293 [1956].

3 A . R O S S I - F A N E L L I , N . S I L I P R A N D I . D . SILIPRANDI U. P . C I C C A R O N E , Arch. Biochem. Biophysics 58, 237 [1955].

4 H. GREILING U. L . K I E S O W , Z. Naturforschg. 12 b. 606 [1957]. 5 S. V. PERRY, Methods in Enzymology, S. 582, New York

1955. * Wir danken der Firma Dr. G. Henning, Chem.-pharm. Werk

G.m.b.H. Berlin, für die Überlassung des Ba-Salzes der ADP.

J 20

t

- > - >

1

2

70 20 30 W 50 60 t [min] *•

Abb. 1. Zeitlicher Verlauf des TTP-Abbaus durch Myosin. Der Versuchsansatz enthielt: 0,05 ml 0,l-/n. CaCl2-Lösung, 0,85 ml Puffer-Substratlösung (0,1-m. Tris-Puffer+0,7 p,

Mole TTP; pn 9,1) ; Kurve 1 mit 0 ,1ml Enzymlösung, Kurve 2 ohne Enzym.

m

I * m

10

PO^

TDP

TTP

20 t[min]

Abb. 2. Fermentative Hydrolyse von TTP durch Myosin bei PH 9,1. Autoradiochromatogramm nach Chromatographie in

Lösungsmittel nach I, 4.

2. D i e A b h ä n g i g k e i t d e r R e a k t i o n s -g e s c h w i n d i g k e i t d e r T T P - S p a l t u n g

d u r c h M y o s i n v o m p n - W e r t .

Die in Abb. 3 gezeigte pH-Aktivitätskurve ist zweigipfelig. Die maximale Fermentaktivität der TTP-Spaltung liegt etwa bei pn 9,1. Einen zweiten Gipfel finden wir bei pn 6,5, der nur 1/s der Aktivi-tät bei pn 9 hat.

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|«5 r

0.0 6J0 70 6.0 PH

9p

Abb. 3. Die Abhängigkeit der Fermentaktivität vom pH-Wert. Die Reaktionsgemische enthielten: 0,05 ml 0,1-m. CaCl.,-Lö-sung, 0,3 ml einer wäßrigen TTP-Lösung ( = 0,2 ^MoleTTP) , 0,5 ml 0,1-m. Puffer-Lösung, 0,1 ml Enzymlösung. Als Puffer wurden Tris-Puffer bzw. Glykokoll-NaOH-Puffer verwendet;

der PH-Wert der Versuchsansätze wurde mit der Glaselektrode gemessen.

3. D i e A b h ä n g i g k e i t d e r R e a k t i o n s -g e s c h w i n d i g k e i t v o n d e r

S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n

Sie wird in Abb. 4 wiedergegeben.

i.o

2.0 3.0-10' [ S j ' f m o / r ]

Abb. 4. Die Abhängigkeit der Reaktions-Geschwindigkeit von der Substratkonzentration. Die Versuchsansätze enthielten: 0,05 ml 0,1-m. CaCl2-Lösung; 0,5 ml Substrat-Puffer-Lösung (0,1-m. Tris-Puffer+variierte TTP-Menge; PH 9,1) ; 0 ,1ml

Enzym-Lösung.

4. D e r E i n f l u ß v o n Ca++ u n d Mg++ a u f d i e R e a k t i o n s g e s c h w i n d i g k e i t d e r T T P -

S p a l t u n g d u r c h M y o s i n

Die Ca-Aktivierung und Mg-Hemmung der Reak-tion geht aus Abb. 5 hervor. Dem Versuchsansatz mit der Ca++-Konzentration O haben wir 0,5 «Mole

Äthylenglykol-bis-/?-aminoäthyl-A,A''-tetraessigsäure* zugesetzt, um im Präparat vorhandene Ca++-Spuren zu binden. Wir finden dabei noch eine geringe Fer-mentaktivität, die merkwürdigerweise in Abwesen-heit von Äthylenglykol-bis-/?-aminoäthyl-A,A,'-tetra-essigsäure nicht mehr vorhanden ist.

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Abb. 5. Ca++-Aktivierung und Mg++-Hemmung der fermen-tativen TTP-Spaltung. Die Ansätze enthielten: 0,5 ml Puffer-Substratlösung (0,1-m. Tris-Puffer+0,5 fx MoleTTP, pn 9,1) ; 0,05 ml der jeweiligen CaCl2-Lösung bzw. MgCl2-Lösung;

0,1 ml Enzymlösung.

5. Ü b e r d i e R e a k t i o n v o n T D P m i t M y o s i n u n d M y o k i n a s e

Die Spaltung der TDP wird, wie Tab. 2 zeigt, durch Myosin nicht katalysiert.

Substanz 0 60 t [min]

T D P TMP

118 5

118 6

[ y - P ] [ y - P ]

Tab. 2. Einwirkung von Myosin auf TDP. Das Reaktions-gemisch enthielt: 0,05 ml 0,1-m. CaCU ; 0,85 ml Puffer-Sub-strat (0,1-m. Trie-Puffer + 1,9 ,aMole TDP; PH 9,1) ; 0,1 ml

Enzymlösung.

Eine Reaktion des TDP im Sinne der Einwirkung von Myokinase auf ADP können wir ebenfalls nicht beobachten (Tab. 3) . Danach erfolgt keine Bildung von TTP und TMP aus TDP durch Myokinase.

Substanz 0 60 t [min]

TTP T D P TMP

0 0 0 - P ] 129 130 [y-P]

5 ' 5 [y—P]

Tab. 3. Einwirkung von Myokinase auf TDP. Die Reaktions-bedingungen entsprechen denen deF Tab. 2. Der Ansatz ent-

hält 0,5 mg Myokinase.

6. D e r E i n f l u ß v o n A D P a u f d i e f e r m e n t a t i v e T T P - S p a l t u n g d u r c h

M y o s i n

Die Abb. 6 zeigt die Hemmung des TTP-Abbaus durch ADP, die bei einer ADP-Konzentration von 10 - 3 -m. fast quantitativ war.

10

t 's h I r

5

O

Abb. 6. Hemmung der fermentativen TTP-Spaltung durch ADP. Die Versuchsbedingungen entsprechen denen der Tab. 1.

Kurve 1 ohne, Kurve 2 mit 10 - 3 -m. ADP.

Diskussion

Aus unseren Versuchen geht die Spaltung der TTP durch Myosin hervor. Das steht im Wider-spruch zu den Befunden von V E L L U Z 1, die allerdings nicht mit chromatographisch gereinigter TTP erhal-ten wurden. Wir konnten dieses negative Ergebnis von V E L L U Z bei Verwendung des uneinheitlichen, umgefällten Synthesegemisches4 bestätigen. Diese Präparate enthalten beträchtliche Mengen an Pyro-phosphat, das die für die TTP-Spaltung durch Myo-sin notwendigen Ca-Ionen komplex binden könnte.

Die TTP-Spaltung und die Nucleosidtriphosphat-Spaltung durch Myosin sind einander ähnlich:

1. Die pn-Aktivitätskurven von TTP und ATPP

stimmen überein. 2. Myosin spaltet sowohl aus Nucleosidtriphos-

phaten, als auch aus TTP ausschließlich ^'-ständiges Phosphat ab.

* Wir danken Herrn Professor G. SCHWARZENBACH, Zürich, für die freundliche Überlassung des Präparates.

0 V. A. ENGELHARDT, Advances in Enzymology VI. S. 163, New York 1946.

[Mg**]'[moir1] —

10 20 30

t [min]—5

3. Die Aktivierung der Reaktion durch Ca-Ionen findet bei TTP und bei ATP6 , UTP und ITP7 statt.

4. Der TTP-Abbau und die Spaltung von ATP, UTP und ITP7 werden durch Mg-Ionen gehemmt.

5. Die TTP-Spaltung wird durch ADP gehemmt. ADP ist für die Spaltung von ATP nur ein schwa-cher, für die von ITP dagegen ein starker Inhibi-tor7.

7 J.J.BLUM, Arch. Biochim. Biophysics 55, 486 [1955].

Eine Umphosphorylierung von TTP auf ADP wird durch die starke ADP-Hemmung der Myosin-TTP-ase unwahrscheinlich.

Aus der Transphosphorylierung von ADP durch TTP würde ATP hervorgehoben. Die nachfolgende Spaltung wäre dann eine reine ATP-ase Reaktion, die die für ADP beschriebene schwache Hemmung zeigen müßte. Wir fanden aber eine fast quanti-tative ADP-Hemmung des TTP-Abbaus durch Myo-sin.

Uber die Wirkung einiger Pyrazolon-Derivate auf die menschliche Magensekretion

V o n F R A N C E S C O T E S T O N I , P I E T R O D E B O N I S u n d A N N A T O M M A S E L L I

Aus dem Institut Patologia Medica und Metodologia Clinica der Universität Rom (Direktor: Prof. Dr. L U I G I CONDORELLI)

( Z . Natur f o r s chg . 12 b, 6 7 5 — 6 7 8 [ 1 9 5 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 15. A p r i l 1957)

Beim gesunden Menschen bewirkt die intravenöse Einführung von Pyramidon, Antipyrin und Novalgin in einmaliger Dosis eine konstante und deutliche Erhöhung der Magensaftsekretion. Die Deutung dieser Reizwirkung wird der histaminergischen Wirkung der obenerwähnten Präparate zugeschrieben.

Der therapeutische Wirkungsmechanismus anti-rheumatischer Medikamente wurde in den letzten Jahren von zahlreichen Forschern im Lichte unserer heutigen Kenntnisse über die hormonale Patho-genese rheumatischer Erkrankungen betrachtet.

Die klassischen Deutungsweisen schreiben diese therapeutische Wirkung einerseits einer direkten spe-zifischen Wirkung dieser Substanzen auf einen bak-teriellen Erreger 1, anderseits einem antiallergischen oder antiexsudativen Effekt 2' 3 und schließlich einer Antihyaluronidase-Wirkung zu.

Außerdem besteht auch die Theorie, daß ein cor-tison-ähnlicher Einfluß besteht, der auf einer direk-ten Reizung des Hypophysen-Nebennierensystems beruht 4.

Diese Anschauung, gestützt auf die Beobachtung, daß in einem mit Acetylsalicylsäure behandelten Patienten der klinische Symptomkomplex des Hyper-corticalismus auftrat wird bestärkt durch die Be-

1 L. CONDORELLI , Riv. Clin. Med., suppl. 11°, 49, 5 [ 1 9 4 9 ] , 2 A. M E Y E R u. K. V . M E Z E Y , Klin. Wschr. 1 6 , 1 0 4 8 [ 1 9 3 7 ] ; A.

M E Y E R U . C. R A G A N , Science [New York] 1 0 8 , 2 8 1 [ 1 9 4 8 ] , 3 P. DANIELOPOLU , M. POPESCO u. D . C R I V E T Z , Presse med. 54,

497 [1946]. 4 J . R O S K A M u. H . V A N CAUWENBERGE , Presse med. 6 0 , 1 3 4 4

[ 1 9 5 2 ] . 5 J . B. COCHRAU, R . P . W A T S O N u. C . R E I D , Brit. Med. J . 3 ,

1 4 1 1 [ 1 9 5 0 ] .

obachtung einer Hyperfunktion der Nebenniere bei Versuchstieren, die mit antirheumatischen Mitteln behandelt worden waren. Diese Befunde bestehen in der Reduktion der Ascorbinsäure der Nebenniere 6, in der Abnahme der Lipide der „zona fasciculata", in der Kernpyknose der lymphatischen Organe und der Thymusdrüse 7 sowie in der Eosinopenie des zir-kulierenden Blutes8; diese Symptome sollen jedoch an Tieren mit vorausgegangener Entfernung der Hypophyse ausbleiben.

Diese Identifizierung der therapeutischen Wirkung antirheumatischer Präparate mit der Nebenproduk-tion des hypophysären corticotropen Hormons und somit von glycoaktivem cortico-ähnlichem Hormon, stieß jedoch auf Widerspruch, sei es vom doktrinä-ren und klinischen Standpunkt aus 9, sei es aus ex-perimentellen Gründen, weil andere Forscher die obengenannten Befunde nicht vollständig bestätigen konnten, nicht einmal bei erheblich größeren Men-

B B. S. H E T Z E L u. D. C . H I N E , Lancet 261, 94 [1951]. 7 H. VAN CAUWENBERGE, Lancet 261, 374 [1951]. 8 J . R O S K A M , H . V A N CAUWENBERGE u. A. M U T S E R S , Lancet 261,

375 [1951]. 9 V. PATRONO, Ormoni e malattie reumatiche, in „Trattato

di Reumatologia" von T. LUCHERINI u. E. CECCHI , Vallardi, Milano 1954.