Zur R e i n k u l t u r v o n Dunaliella Von K l a u s - J f i r g e n G g t t i n g

Biologische Anstalt Helgoland, Meeresstation auf Helgoland

(Mit 7 Tabellen und 9 Abbildungen im Text)

I n h a l t s i i b e r s i c h t

0 EinIeitungen .S. 404 -- 1 Methodik S. 404 -- 2 Bisherige Ergebnisse S. 405 -- 3 Eigene Unter- suchungen S. 408 -- 31 Vorversuche S. 408 -- 32 Hauptversuche S. 411 -- 321 Einflug von Vitamin Bt2 S. 411 -- 322 Einflug yon fl-Indolylessigsfiure S. 412 -- 32.3 Einflug yon Gib- berellins/iure S. 413 -- 324 Einflug von Maleinhydrazid S. 416 -- 325 Vitaminkombinationen und praezipitatfreie N/ihrl6sung S. 417 -- 326 Vitaminkombination und Spurenelemente S. 418 -- Zusammenfassung S. 422 -- Angefiihrte Schriften S. 422.

0 E i n l e i t u n g

Aufgabe der vorl iegenden Untersuchung war es, ffir die Anlage von Zooplankton-Kul turen und fiir sp~itere strahlenbiologische Arbeiten die opti- malen Bedingungen fiir Kulturen einzelliger Grfinalgen im Labora tor ium zu untersuchen.

Die Arten der Gat tung Dunaliella haben sich ffir die Bearbeitung wissen- schafilicher Fragestel lungen und als Fut terorganismen schon in einigen marin- biologischen Insti tuten bewfihrt. Daher wurde fiir die Versuche D u n a l i e l l a euchlora LERCHE, 1937 h erangezogen.

Es war von vornherein nicht beabsichtigt, sterile Kulturen anzulegen, je- doch wurde die Zahl der Bakterien in Grenzen gehalten, in denen ein spfir- barer Einflut~ auf den Entwicklungsverlauf der Kultur nicht anzunehmen war.

Der Begriff ,,Reinkultur" ist in dem yon SCnREIBER (1927) definierten Sinne gebraucht: ,Eine ,Reinkultur' enth/itt konventionell auger dem kultivierten Organismus nur noch un- sdlfidliche Bakterien, die Bezeichnung ,absolute Reinkultur' schlieflt auch Bakterien aus."

Den Herren Dr. H. J. AuRm~, List, und Dr. P. KORN~ANN, Helgoland, danke ich fiir wertvolle Literaturhinweise, letzterem aueh ffir die ~berlassung des Impfmaterials yon Duna- Iielta.

Mit diesen Untersuchungen wird an der Biologischen Anstal t Helgoland eine Tradi t ion wiederaufgenommen, die auf E. SCHREIBER zuriickgeht, der bereits in den zwanziger Jahren auf Helgoland marine Diatomeen und eine Chlorophycee kultivierte.

1 M e t h o d i k

Das Ansetzen der N/ihrlSsungen erfotgte auf der Grundlage natfirlichen Seewassers, das der Seewasserleitung der Biologischen Anstal t entnommen

Bd. VIII, H. 4: GStting, Zur Reinkultur von DuT~aliella 405

wurde. Dieses Wasser kommt durch eine Pumpleitung von der NO-Mole aus der freien See. GrSbere Partikel kgnnen in den Tiefbeh/iltern sedimentieren. Vor Gebrauch wurde dieses Wasser durch eine Seitz-K1/irscheibe Nr. 5 gefiltert. Bei den ersten Versuchen erhitzten wir anschliegend nur bis 650 C, weil Beden- ken bestanden, dag es bei st/irkerer Erwfirmung zu Ausf/illungen im Seewasser und dadurch zu unerwfinschten Nebenwirkungen kommen kSnnte. Diese Be- denken erwiesen sich jedoch als nicht gerechtfertigt, so dag sp/iter nicht nur gekocht, sondern sogar autoklaviert wurde. Eventuelle Ver/inderungen im Seewasser fanden in einer Richtung bzw. in einem Ausmage start, die die Kulturen nicht ungfinstig beeinflut~ten.

Es wurde streng darauf geachtet, ffir die Versuchsserien stets nur Seewas- ser aus einer bestimmten Vorratsflasche zu verwenden, um so einheitliche Be- schaffenheit zu gew/ihrleisten.

Als Kulturgeffige dienten Rundkolben yon 500 ml Inhalt, mit der angege- benen Menge geffillt. Bei einigen Versuchen wurden 700-ml-Scheidetrichter, 12-1-Vollglasaquarien und 55-1-Glasballons verwendet.

Die Kulturen entwickelten sich bei Dauerlicht von ungef/ihr 2200 Lux und einer Temperatur von 22-+ 2°C. Eine TageslichtrShre vom Typ Sylvania F 40 T 12/D, 40 W lieferte das Licht.

Ffir NfihrlSsungen mit Erdextrakt bereiteten wir ein Dekokt auf folgende Weise: Die Erde wird mit der zwei- bis dreifachen Wassermenge etwa zwei Stunden gekocht. In dieser Zeit verdampft ein grot~er Teil des Wassers, so dat~ man nach Erkalten etwa so viel Filtrat erh/ilt, wie vorher Erde eingemessen wurde.

Zur Ausz/ihlung der Kulturdichte erwiesen sich Blutz/ihlkammern mit Netzteilung nach Buerker am zweckm/igigsten. Von den neun vorhandenen Gruppenquadraten wurden im allgemeinen zehnmal die ffinf ausgez/ihlt, die sich nur mit einer Ecke berfihren, so dag jeder Punkt der Kurven das Mittel aus 50 Einzelwerten darstellt.

Die Ergebnisse der Z/ihlungen wurden statistisch ausgewertet (vgl. LINDER 1953). Dazu waren von vornherein einige Voraussetzungen einzuhalten: 1. die Versuche wurden mehrfach wiederholt, 2. die Zuteilung der Verfahren erfolgte zuffillig, 3. wurden die Versuche zu B15cken zusammengefat;t.

Bei der Auswertung zeigte sich zuerst durch den ~2-Test, ob die Grund- gesamtheiten dieselbe Streuung ~ 2 hatten. War das der Fall, so erschlog sich damit der Weg ffir die Anwendung von F- und t-Test. Der F-Test ergab, ob fiberhaupt signifikante Differenzen zwischen den Gruppenmitteln vorhanden waren und der t-Test zeigte an, wo diese Differenzen liegen. Die t-Werte sind in den folgenden Tabellen mitaufgeffihrt.

2 B i s h e r i g e E r g e b n i s s e

Die Geschichte der Anlage von Kulturen einzelliger mariner Algen ist verkniipft mit der Geschichte der Sfigwasseralgenkulturen. Viele wertvolle Erfahrungen, gewonnen vor allem an Chlorella- und Scenedesmus-Arten, lie- t~en sich sinnentsprechend fibertragen. PRINGSHEIM (1954) hat einen Grogteil dieser Erfahrungen in einer Kulturanleitung zusammengefat~t.

M~QUEL (1890/93) publizierte zuerst Ergebnisse fiber Diatomeen-Kulturen, ALLEY & NF.LSON (1907) entwickelten darauf aufbauend eine NfihrlSsung, mit

406 Helgollinder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

der sie unter anderem bei Chaetoceras, Biddulphia, Skeletonema und Coscino- discus gute Erfolge erzielten. Die Rezepte dieser und weiterer N/ihrl5sungen sind bei PROVASOLI, McLAt~GHHN & DROOP (1957) iibersichtlich und verglei- chend dargestellt.

Der LSsung yon MIQUEL /ihnlich ist die von HOUGHTON GILL (VAN HEURCR 1893/96, 1897), das yon RICHTER (1903, 1904) angegebene Medium ist beson- ders fiir Diatomeen geeignet (MANGERET & CHABERT 1953). STAGNO D'ALCON- TRES, LAMONICA, POLIM~NI CONTI & LINO (1960) verwenden noch in jfingster Zeit fiir ihre Massenkultur eine Mineralsalz-Spurenelemente-Kombination des gleichen Prinzips.

Ein groger Schritt vorw/irts war die Einffihrung yon Erdextrakt als Zu- satz zum Kulturmedium durch FOYN (1934) auf der Grundlage der NfihrlSsung yon SCnREIBER (1927). Diese ,,ErdschreiberlSsung" hat sich fiir eine Vielzahl yon Algen sehr gut bew/ihrt und liefert auch jetzt noch die hgchsten Popula- tionsdichten. Sie ist besonders geeignet ffir die Anlage yon Massenkulturen (WISELY & PURDAY 1961).

Der Nachteil dieser mit ErdschreiberlSsung versetzten Kulturen ist in der weitgehend unbekannten Zusammensetzung des Erdextraktes begriindet. Viel- leicht tiegt der Grund ffir seine besondere Wirksamkeit in dem Gehalt an komplexen Metallverbindungen, vielleicht im Vitamingehalt. In beiden Rich- tungen sind eine Reihe von Untersuchungen vorgenommen wor,den.

Anstell~e yon Erdextrakt setzte SWEENEY (1954) als Chelatbildner Athylen- diamintetraessigs/iure (~DTE) zu, aui~erdem Vitamin Ble. Diese LSsung ist fiir den Dinoflagellaten Gymnodinium splendens und viete andere Einzeller gut geeignet. Nach PROVASOLI & PINTNER (1953) mfissen jedoch Zn-, Mn-, Cu- und Co-Salze zugeffigt werden, um den Verlust an freien Ionen durch ~ D T E auszugleichen. Vitamin B12 wird von vielen niederen und hSheren Algen ge- braucht. Von 2:5 Algen enthielten 23 grSl;ere Mengen B1,,,. Am st~irksten ist die Konzentration nach unseren bisherigen Kenntnissen bei Uaucheria dichotoma mit 2,8 ~ pro g Trockenmasse (LuNDIN & ERICSON 1955). Als Prim/irquelle dienen wahrscheinIich epiphytische Bakterien: yon 34 isolierten Bakterienarten konnten 24 B~ produzieren, und zwar erzeugten Bakterien yon Bae-armen Algen wenig Ble, Bakterien yon Ble-reichen Algen viel. Das Vitamin wird vor allem in der Zellwand gespeichert: die einzellige Grfnalge Ualonia enth/ilt in der Wand 0,2 y By2 pro g Trockengewicht, im Protoplasma dagegen weniger als 0,001 ~:. Der Bedarf an Vitamin B12 ist bei vielen Arten hoch. Darauf auf- bauend konnten HAMILTON, HUTNER & PROVASOLI (1952) eine biologische Be- stimmungsmethode mit Hilfe von Chrysomonaden f/it dieses Vitamin vor- schlagen. Phototrophe Arten verlangen im allgemeinen nur Vitamin B12, Thia 2 rain und Biotin (PRovAsoLI 1960). Dunaliella macht eine Ausnahme: sie braucht kein BI~ (PRovASOLI 1956).

Eine weitere ErhShung der Ausbeute ist mit pflanzlichen Wuchshormonen versucht worden, vor allem an hSheren Algen. ALGEUS konnte durch [3-Indolyl- essigs/iure die Zellzahl erhShen, nicht aber die ZellgrSge (zitiert nachTmMANN & BETH 1959). Mit Gibberellin:sfiure konnten BURDETT & TURNBULL (1960) bei Chlamydomonas moewusii zun/ichst die Zellzahl steigern, die ZellgrSf~e er- reichte nach etwa neun Tagen die der Zellen im Kontrollversuch. Demgegen- fiber soll die Biomasse bei Verwendung yon Substanzen der Auxingruppe nach P~NEVICH & VERZILIN (1961) trotz ErhShung der Zellzahl abnehmen. Malein- hydrazid in optimalen Konzentrationen (10 -2 bis 10 °I mg/l fiir Chlorella pyre-

Bd. VIII, H. 4: G6tting, Zur Reinkultur von Dunaliella 407

noidosa) hat nach Angabe derselben Autoren diese nachteilige Wirkung nicht, sondern erhght Photosynthese- und Atmungsaktivitfit und die Trockensub- stanzspeicherung. Normaterweise sind Chlorophyll- und Stickstoff-Gehalt in grSgeren Zellen geringer (Carnegie ... Publ. 600, 1953).

Bei Chlorella lieg sich die Besatzdichte mittels Durchlfiftung um 500/o steigern, noch etwas mehr bei Zusatz yon 50/o CO2 zum Luftstrom (Carne- gie ... Publ. 600, 1953). Das ist ffir die Ausnutzung industrieller Abgase in Massenkulturen wichtig (KETCHUM, LILLICK & REDFIELD 1949, MEFFERT & STRATMANN 1951, MYERS, PHILLIPS & GRAHAM 1951, ENEBO & JOHNSSON 1956, FOGG, SMITH & MILLER 1959, WISELY & PURDAY 1961). Die Besiedlungsdichte ist nach Untersuchungen yon YON DENVFER (1950) an Nitzschia palea aus- schliet~li& v o n d e r Konzentration tier N~ihrst0ffe abhfingig, w~ihrend Tempe- ratur, Lichtintensit~t und Zahl der eingeimpfien Zellen nur die Geschwindig- keit bestimmen, mit der der Endzustand erreicht wird. Die erzielbare Zellkon- zentration ist bei Sfit~wasseralgen wesentlich hSher als bei marinen. Als Bei- spiel sei angeffihrt, dab bei Chlorella in 20 Tagen eine Dichte yon 950- 106 Zellen/ml (Carnegie ... Publ. 600) erreicht wurde, bei Dunaliella tertiolecta (Chloroph.) in 28 Tagen 3,1 • 105, bei Isochrysis galbana (Chrysoph.) in 30--35 Tagen 2" 108 Zellen (WISELY gC PURDAY 1961).

Massenkulturen sind aus zwei Grfinden angelegt worden: eimnal, um Material zu gewinnen ffir Untersuchungen, die die direkte Nutzung der Algen ffir den Menschen zum Ziele haben, zum anderen, urn Futter ffir Zooplankter zu erhalten. Der Nfihrwert von 17 verschiedenen Algenarten ffir Austernveli- get wurde yon WALNE (1956) bestimmt, fihnliche Beobachtungen sind yon DAVIS gc GUILLARD (1958) angestellt worden. Die Wachstumsleistung yon Algen ffir Copepoden soll bei etwa 70O/o liegen (HARVEY 1950).

Ffir Stoffwechsel-und andere Untersuchungen ist es unter Umst/inden notwendig, yon einer absoluten Reinkultur auszugehen. Das Impfmaterial wird fiber Agar-Plattenkulturen und/oder Verwendung von Antibiotika ffir die Sterilisierung der Kulturen gewonnen (FELF/SLDY & KALK6 1959). In letzterem Falle muf~ mit einer nachteiligen Wirkung auf die Alge beziehungsweise ein- zelne Zellbestandteile gerechnet werden (PRovASOLI, HUTNER ~C PINTNER 1951, WILLIAMS 1960). Werden bakterienfreie Algen-Einkulturen verffittert, so kSn- hen sie beim Konsumenten zu Unfruchtbarkeit oder hoher Larvensterblichkeit ffihren. Ein Mischfutter aus zwei Arten wird dagegen gut vertragen (PRovA- SOLI, SHIRAISHI ~ LANCE 1959).

Die Arten der Gattung Dunaliella sind weitgehend eurySk. Sie sind nicht sehr empfindlich gegen pH-Verschiebungen, wie sie in den Kulturen stattfinden (BAGHDIANTZ 1952), Dunaliella salina vertrfigt starke Salzgehaltsschwankun- gen (MARRE, SERVETTAZ & ALBERGONI 1958).

Zum Ausz/ihlen der Populationsdichten haben sich die fiblichen Blutz/ihl- kammern bew~ihrt. Das Ausz/ihlen ist mfihsam, liefert aber zuverl/issigere Werte als die Zelldichtebestilnmung dutch Messung der Lichtdurchl/issigkeit einer kleinen Kulturmenge, da der Gehalt an Chlorophyll nicht konstant ist, sondern in grgt~eren Zellen geringer wird (Carnegie . . . Publ. 600). Diesen Nachteil vermeidet der elektronische Partikelz/ihler yon MALONEY, DONOVAN & ROBINSON (1962).

408 Helgol/inder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

3 E i g e n e U n t e r s u c h u n g e n

F/fr eine intensive Kultur von Dunaliella war zuniichst eine Reihe von Voraussetzungen zu prfifen. Dazu wurden zum Teit qualitative, zum Teil quantitative Vorversuche angestellt. Die quantitativen Hauptversuche sotlten schliet~lich den Wert verschiedener Substanzen f/fr eine ErhShung der Popu- lationsdichte kl/iren.

31 V o r v e r s u c h e

Die ersten Kulturen wurden mit den N/ihrlSsungen von ALLEN & NELSON (1907) und SCHREIBER (1927) angesetzt. Damit erzielten wir unter den gege- benen Bedingungen (22 ± 2 o C, 2200 Lux) Konzentrationen von etwa 1,5 • 106 Zellen/ml. Ffir eine weitere Steigerung des Ertrages ohne Zusatz von Erd- extrakt sollte eine LSsung gefunden werden, die bei einfacher Zusammenset- zung das bestmSgliche Ergebnis liefert. Ausgehend von den chemischen Analy- sen von Seewasser und Meeresorganismen (VINOGRADOV 1953, DIETRICH ~: KALLE 1957) wurde ausgerechnet, welche Mengen an Salzen dem Medium zu- gesetzt werden miissen, um in 1 Liter Kulturfl/issigkeit 100 g Organismen EntwicklungsmSglichkeit zu geben. Danach fehlt es an Nitrat, Phosphat, Eisen und Zink (und f/fr Diatomeen an Silikat). Es ist zwar unwahrscheinlich, 100 g Dunaliella in einem Liter N/ihrlSsung zu erhalten, diese Zahl wurde aber mit Absicht so hoch angesetzt, um ein Minimum an N/ihrstoffen auszuschliet~en. Die hohe Konzentration bringt natiirlich die Gefahr mit sich, auf ,die Algen toxisch zu wirken oder stSrend in die osmotischen Beziehungen einzugreifen. Dementsprechend mutate die n/ichste Aufgabe darin bestehen, verschiedene Verdfinnungen der errechneten LSsung herzustellen und die optimale Konzen- tration auszuprobieren. Auf diese Wei.se wurde eine L6sung erhalten (im fol- genden als N/ihrlSsung G 1 bezeichnet), die bei den sp~iteren Versuchen zu- grundegelegt wurde. Sie setzt sich so zusammen:

1 1 Seewasser, filtriert und autoklaviert 0,08 g NaNO3 0,03 g Na~HPO4- 12 H20 0,004 g ZnSO4" 6 H20

10 ml FeCL~ • 6 H-20, l°/oige LSsung. Diese LSsung bildet ein Praecipitat wie alle bisher bew/ihrten Lgsungen (PRovASOLI, McLAUGHLIN gc DROOP 1957), das abfiltriert wurde.

Die Wirkung yon verd/fnntem Seewasser auf die Entwicklung der Kultur ergab keinen statistisch gesicherten Unterschied (Tab. 1). Daher wurde das Seewasser f/fr alle folgenden Versuche in seiner nat/frlichen Konzentration (32--33 °/00) verwendet.

Line Reihe nicht quantitativer Versuche zeigte, dat~ die L6sung G 1 den erw'/ihnten N/ihrlgsungen von ALLEN ~; NELSON und SCHREIBER zum mindesten ebenb/frtig, wenn nicht gar fiberlegen ist. Daraufhin wurden auch quantitative Versuche angestellt. Das Ergebnis des Vergleichs yon Schreiberlgsung (ohne Erdextrakt) u~d G 1 zeigt die graphische Darstellung der Abb. 1. Auf der Ordinate ist - - wie bei allen weiteren Abbildungen - - der Faktor aufgetragen, um den sich die Kultur im angegebenen Zeitraum vervielfacht hat. Es best~- tigt sich die alte Erfahrung, daf~ eine geringe N/ihrstoffkonzentration (in die-

Bd. VIII, H. 4: G6tting, Zur Reinkultur von Dunaliella 409

sem Fall in der Schreiberl6sung) eine gfinstigere Ausgangsbasis bildet als eine konzentriertere (G 1) (VON DENFFER 1950), obwohl die Differenz in diesem Falle gering ist. Schnell hat die konzentriertere ,die andere iiberfliigelt, nach zwei Tagen weist sie bereits eine h6here Zelldlchte auf. Nach vier Tagen ist die Wachstumsphase abgeschlossen, die Speicherphase beginnt.

Zus/itze organischer Verbindungen wie Harnstoff, Pepton und Natrium- acetat haben sich nicht bew/ihrt. Sie erfordern steriles Arbeiten, da sonst die Bakterienentwicklung enorm ist und die Dunaliella-Kultur zum Zusammen- bruch bringt.

Ahnliche Schwierigkeiten ergeben sich bei der Anlage yon Kulturen in offenen Geffigen wie flachen Wannen und Vollglasaquarien, die sehr schnell verunreinigt werden. Glasballons yon ca. 50 1 Inhalt haben diesen Nachteil zwar nicht, dafiir ist aber die Schichtdicke zu grog und die L/isung der Frage

2O 18 • • •

16

14 • 0 O

12 10: o

8- 0

6~

44 2

O. 1, 2. 3. 4. 5. 6. Tag

Abb. 1. Wachstum von Dunaliella in Schreiberl6sung (weige Kreise) und N~ihrl6sung G 1 (schwarze Kreise). Auf der Ordinate ist der Zuwachsfaktor aufgetragen

der zweckm/ig'igsten Beleuchtung schwierig. Die beste Lichtausnutzung erzielt man durch eine eingetauchte Leuchtr/ihre. In unseren Versuchen wurden die Glasballons von augen mit 2 )< 60 W beleuchtet und damit Zelldichten yon 0,8" 106 Zellen/ml erreicht.

Dunaliella ist gut beweglich. Es i st daher keine Vorrichtung notwendig, die eine Wasserumw~ilzung in der Kultur bewirkt. Die Versuchskolben wurden lediglich einmal am Tag vorsichtig geschfittelt.

Einige Kulturen setzten wir in Scheidetrichtern an und durchstrgmten sie yon unten mit Pregluft. Es wurde sowohl ein grog- als auch ein feinblasiger Lufistrom eingestellt, um verschiedene Grade der Dur&lfiftung und Umwfil- zung zu erzielen. Die Entwicklung von DunalieIla erwies sich in alien F/illen als ungiinstiger als in den Kolben mit .stehender N/ihrlgsung.

Der pH-Wert war unmittelbar nach dem Beimpfen der N~ihrlgsung etwa der des Seewassers. p~I-Werte von 8,0--8,5 sind die optimalen. Wfihrend der ersten Tage verschiebt sich die H-Ionenkonzentration zum alkalischen Bereich (Abb. 2). Diese Verschiebung finder wiihrend der Wachstumsphase statt und ist wohl begriindet in der CO2-Assimilation durch die Algen. Der pH-Wert bleibt im weiteren Verlauf bei etwa 9,6. Ein Abfall in der Speicherphase, wie er yon VON D~NFFER (1950) ffir 3[itzschia paIea beschrieben wurde, war erst

410 Helgolfinder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

sp/iter festzustellen. Die in der Speicherphase einsetzende Fettbildung ist mit hoher CO~=Ahspaltung verbunden. So wird z. B. bei der Umwandlung einer bestimmten Molzah.1 Hexose in Stearins~iure die doppelte Molzaht CO~ frei. Der l[Iberschug an CO~ miigte zu einer Erniedrigung des pH-Wertes fiihren. Das ist jedoch erst nach ca. 8 Tagen der Fall; woraus zu schliegen ist, dab das CO2 fiir die Assimilation wieder verbraucht wird. Es stellt sich ein Gleich- gewicht ein, der pii-Wert bleibt fiir einige Zeit fast konstant. Nach etwa acht Wochen liegt er bei 8. Das weitere Absinken auf etwa 7,8 ist verbunden mit gelblicher Verffirbung der Zellen. Zum vglligen Zusammenbru& der Kultur kommt es nur in seltenen Ffillen, unter besonders ungiinstigen Bedingungen (Verdunkelung, Temperaturabfall, Fremdinfektion).

E r l / i u t e r u n g zu d e n T a b e l l e n

Tabelle a enth/ilt jeweils die Versudlsergebnisse mit Angabe der Zahl der Einzelz/ihlungen und Versuchswiederholungen.

Tabelle b gibt die berechneten Werte yon SQ, DQ, Z s und F.

Tabelle c gibt die Streuungswerte und t.

~ M

m

N n

n l

n 2

SQ DQ Z 2

Z20,05 F F0,05 t to,05 K S 2

S +

Es werden einheitlich folgende Abkiirzungen benutzt:

ist der Zuwachsfaktor am Ende des Versuchszeitraumes, das Mittel aus m - N Ein- zelwerten innerhalb der Gruppe. 2 ist ein Relativwert, bezogen auf eine Anfangs- konzentration yon 1. ist das Mittet aus den ~2 aller Gruppen. Anzahl der Z/ihlungen pro Versuch. Anzahl der Versuche innerhalb der Gruppe. Zahl der Freiheitsgrade, Zahl der Freiheitsgrade zwischen den Gruppen. Zahl der Freiheitsgrade innerhalb der Gruppen. Summe der Quadrate. Durchschnittsquadrat. aus den Versuchsergebnissen berechneter Wert yon Z ~. theoretischer Wert yon Z ~ fiir die Sicherheitsschwelle 0,05.

sind die entsprechenden Werte von F u n d t.

Kontrollversuch (Nfihrl6sung ohne Zusfitze). Streuung. mitttere quadratis~le Abweichung. in der letzten Spalte der Tabetle c bedeutet, dat~ die Unterschiede zwischen den Gruppen signifikant sind, daft sie nicht signifikant sind.

Ist Z ~ % Z%,o5, so kann man annehmen, dag die Grundgesamtheiten alle dieselbe Streu- ung o 2 haben. Damit ist die Voraussetzung erfiillt ffir die Anwendung des F- und des t-Tests.

Ist F > Fo,05, so bestehen zwischen den Durchschnittswerten der Gruppen gesicherte Un- terschiede. Zwischen w e l c h e n Gruppen diese liegen zeigt der t-Test. Der Unterschied ist signifikant, wenn t ;> to,05. Ergeben sich Z 2 ~ Z%,05 oder F ~ Fo.05, so f/illt Tabelle c sinn- gem/ig weg.

Fiir die Berechnung der einzelnen Gr6gen sei auf LINDER (I953) verwiesen. Die Mengenangaben der zugesetzten Substanzen beziehen sich stets auf 1 Liter Kultur-

flfisslgkeit.

l a

Bd. VI I I , H. 4: G6tting, Zur Reinkultur von Dunaliella

Tabelle 1

Unterschiede in der Wi rkung von natfirllchem und verdfinntem Seewasser auf die Kultur yon Dunaliella

411

Gruppe 1 2

80 °/oiges Seewasser Seewasser

2~1

68,0 66,2 m 25 25 N 5 5 m • N 125 125

67,1

l b

Streuung n SQ DQ

zwischen den Gruppen 1 1803,70 1803,70 innerhalb der Gruppen 8 225,06 28,13

insgesamt 9 2028,76 225,42

Z ~ = 1,59 n = 1

Z~O,O5 = 3,84

1 c

Gruppen s 2 s t

1 und 2 28,133 5,304 0,536 - -

n == 8 t0.05 = 2,306

8,5 9'018,0 . . . . ~ " " - ' - - - - ~ " ~ "'~-~

1; ~; ~3.T,g Abb. 2. Ver~inderung des pt{-Wertes in Dunaliella-Kulturen

32 H a u p t v e r s u c h e

Ausgehend von der angegebenen Nfihrlgsung als Grundlage ergibt sida die Frage, durch welche Zus/itze die Zelldichte in der Kuttur erhght werden kann. Ein bew/ihrtes Mittel ist Erdextrakt. Aus den im Abschnitt 2 genannten Gr/inden sollten Substanzen gefunden werden, die mindestens den gleichen Effekt auf die Produktionsfreudigkeit der Algen erzielen.

321 Einfluf~ von V i t a m i n B12

Wie bereits erl/iutert, ist das Vitamin B~ fiir eine grot~e Zahl mariner Organismen yon Bedeutung. Dunaliella schien nach den Untersuchungen yon PROVASOLI (1956) eine Ausnahme zu machen.

4t2 Helgol/ inder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

Das Ergebnis unserer Versuche geht aus Abb. 3 und Tab. 2 hervor. Da- nach ist Vitamin BJ2 ohne jeden Einflut~ auf die Entwicklung der Kultur. Die um ein geringes hShere Populationsdichte bei Zusatz yon 2 7 B1JI ist stati- stisch nicht zu sichern. Dieses Resultat wurde durch mehrere Versuchswieder- holungen best/itigt.

Man vergleiche mit dieser Anspruchslosigkeit hinsichtlich des B12-Gehaltes z.B. das Massenauftreten von Gonyaulax vor der amerikanischen Kfiste, das vom Vorhandensein yon Bl2 weitgehend abhfingig ist und sich verheerend auswirken kann, indem ganze Fischschw/irme vergiftet werden. Angeffihrt seien auch Gymnodinium splendens (SWEENEY 1954), Monochrysis lutheri, Prymnesium parvum und Syracosphaera elongata (DRooP 1955) als Beispiele fiir B~ benStigende Organismen.

322 E in f lu !g v o n ~ - I n d o l y l e s s i g s / i u r e

Zusatz von [3-Indolylessigs/iure (IES) hat einen deutlich wahrnehmbaren Effekt. Optimal ist eine Konzentration yon 2 7/1 (Abb. 3, 3, Tab. 2). Die wirk- same Menge liegt damit bedeutend niedriger als bei Gibberellins/iure (vgl. 323). BENTI.EY (1959) gibt fiir Skeletonema costatum in synthetischem Kultur-

2 a

Tabel le 2

Einfluig von Vi tamin BI2 und {]-Indolylessigs/iure auf die Kultur von Dunaliella

Gruppen 1 2 3 4 5 K I 7 B~2 2 7 Bte 2 7 tES 4 7 IES X~t

2 36,99 32,76 42,66 60,81 41,67 m 25 25 25 25 25 N 8 3 4 4 4 m ' N 200 75 100 100 100

2 b

Streuung n SQ DQ

zwischen den Gruppen 4 1879,31 469,83 innerhalb der Gruppen t8 2194,80 121,93

insgesamt 22 4074, t 1 18.5,22

Z "2 = 5,50 F = 3,85 n = 4 nl ~ 4

Z%,05 = 9,49 n2 = 18 Fo~o5 ~ 2,93

2 e Gruppen s 2 s t

42,98

1 und 2 100,92 10,05 0,622 - - 1 und 3 102,33 10,12 0,915 - - 1 und 4 180,23 13,43 2,897 + 1 und 5 88,05 9,38 0,814 - - 2 und 3 63,69 7,98 1,626 - - 4 und 5 178,30 13,35 2,027 - -

n = 22 t0,05 = 2,074

Bd. VIII , H. 4: G6tting, Zur Reinkultur yon Dunaliella 4 1 3

70.

60:

50,

40-

3O'

2O" ,0j 0

t 2

/ /

J J J J J J J J J J J J J J J J

3 7 /

J J J J J J J S J J J J J J

Abb. 3. Einflug von Vitamin B~2 und IES auf Dunaliella. Z~ihlung am 10. Tag 1: Kontrolle, 2 : 1 7 B12./I, 3 : 1 ;~ 1ESJt

medium als gfinstigsten Wert 0,1--0,01 y/1 an. Kettenlfinge und Zellzahl dieser Diatomee werden vergr6t~ert. JI-FANo & YING-FANC~ (1959) erhielten bei DunalieUa salina kein positives Ergebnis bei Zusatz yon IES. Ihre Resultate sind jedoch nicht statistisch gesichert.

323 E in f lu t~ v o n G i b b e r e l l i n s / i u r e

Die Gibberellins/iure A~ (Merck) wurde, ausgehend von den Erfahrungen bei h6heren Pflanzen, zun/ichst in geringeren Konzentrationen verwendet (100 bis 500 ~,/1). Es zeigte sich, dag gr6f~ere Mengen nicht nur unsch/idlich, sondern sogar f/~rderlich waren. Das Ergebnis von 3 quantitativen Gruppenversuchen (22 Einzelversuchen) ist folgendes:

W/ihrend der Wachstumsphase fibt die Gibberellins~iure einen deutlich positiven Einflug aus. Die Zelldichte w/ichst mit der Konzentra.tion des Wuchs- stoffes. Nach acht Tagen ist die Wachstumsphase abgeschlossen. Gleichzeitig holen die Kulturen mit geringerer Gibberellins/iuremenge und die Kontroll- versuche auf. Am 11. Tag wird zum erstenmal die bisher streng gibberel!in- mengenbedingte Reihenfolge durchbrochen und yon nun an ist kein Gibberel- lineinflug mehr zu erkennen (Abb. 4). Die Unterschiede in der Zellkonzentra- tion am 7. Tag sind - - mit Ausnahme des Wertes ffir 100 y/1 - - gesichert (Tab. 3).

Deutlich wird vor allem, dat~ die Algen wesentlich h6here Gaben an Gib- berellins/iure vertragen und fordern als phanerogame Kulturpflanzen. Die bisher als am empfindlichsten bekannte Testpflanze ist eine japanische Trich- terwinde (Pharbitis nil), die bereits auf Mengen von 0,0005 y Gibberellins/iure reagiert (KNAPr 1962 a, 1962 b). PROVASOLI (1958) gibt Ulva 0,1-- 1 mg/1.

Die Konzentration erreicht ffir DunalieIla optimale Werte bei 4 mg/1 (Abb. 5, Tab. 4). Zu abweichenden Ergebnissen kamen Jr-FANG & YING-FANG (1959) bei Dunaliella salina. In ihrer, leider nur chinesisch abgefal;ten, Ver- 6ffentlichung geben sie Werte yon ca. 0,6 rag/1 als besonders gfinstig an. Die

414 Helgol / inder Wissenschaf t l iche M e e r e s u n t e r s u c h u n g e n

Tabe l le 3

Einf lug verschiedener M e n g e n Gibberel l ins / iure au f die Ku l tu r von Dunaliella 3 a

G r u p p e n 1 2 3 4

K 0,1 m g 0,5 m g 1 m g 2M

15,60 18,45 24,96 35,42 m 25 25 25 25 N 4 4 4 4 m . N 100 100 100 100

3 b

S t r e u u n g n SQ DQ

zwischen den G r u p p e n 3 928,36 309,45 i nne rha l b der G r u p p e n 12 78,57 6,55

in sgesamt 15 1006,93 67,12

Z 2 = 2,87 F = 47,24 n = 3 n l = 3

Z%,O5 = 7,82 n2 = 12 Fo,o5 = 3,49

23,6I

3 c

G r u p p e n s ~ s t

I u n d 2 3,918 1,980 2,036 - - 1 und 3 4,943 2,223 5,952 ÷ 1 u n d 4 5,517 2,349 11,933 + 2 u n d 3 7,578 2,753 3,343 + 2 und 4 8,152 2,855 8,405 + 3 und 4 9,177 3,029 4,883 +

n = 15 t0,05 = 2,t31

100-

50-

30-

20-

10-

5-

3-

2-

8 Q

/x

o

A

o

• 1, 2. 3 . . . . 7. 8. . 10. 11. 1 . 13. 1/4.Tag

Abb. 4. Einf lug von Gibberell ins~iure au f die En twick lung der Kul tu ren . W e i g e s Dreieck: Kontrol le , s&warzes Dreieck: 100 v/l, weiger Kreis : 500 )'/1, schwarzer Kreis: 1 mg/ l

Bd. VI I I , H. 4: G6t t ing , Z u r Re inku l tu r von Dunaliella 415

abgebildeten Kurven der Konzentrationen liegen unregelm/iflig und lassen keinen eindeutigen Schluf zu.

Worauf beruht die Wirkung der Gibberellins/iure? Ist die Substanz nach acht Tagen verbraucht oder beschrfinkt sich ihre Einwirkm6glichkeit a,uf die Wachstumsphase? Zur Kl~rung dieser Frage diente folgender Versuch: vier Kulturkolben mit N~hrlgsung und 2 rag/1 Gibberellins/iure wurden be- impft. Nach 8 Tagen erhielten zwei der Kulturen eine weitere Gabe von 2 rag/1 Gibberellinsfiure. Nach weiteren 5 Tagen wurde die Zelldichte wiederum be- stimmt. Die zweite Gibbevellingabe ist ohne fSrderlichen Einfluf. Daraus ist zu schliegen, daft sich die Wirkung auf die Zeit der Wachstumsphase be- schr/inkt.

3

80- 4 5 70-

60-

i

5o~

40, 6

30.

20,

lO-

0

Abb. 5. ~ ' i r k u n g verschiedener Gibbere l l ins / iu rekonzen t ra t ionen au f die Dunaliella-Kulturen. Z~ihlung a m 8. Tag . 1: Kontrol le , 2: I rag/l, 3 : 2 rag/l, 4 : 3 rag/I, 5 : 4 rag/l, 6 : 5 rag/1

4 a

Tabe l l e 4

Einf lug h6here r Gibbere t l in s / iu remengen au f die Ku l tu r von Dunaliella

G r u p p e n 1 2 3 4 5 6 x ~ K 2 m g 4 m g 6 m g 8 m g 10 m g

30,78 30,55 81,27 77,04 51,33 37,67 m 25 25 25 25 25 25 N 4 4 4 4 4 4 m - N 100 100 100 100 100 100

4 b

51,44

S t r euung n SQ DQ

zwischen den G r u p p e n 5 10392,16 2078,43 i nne rha l b der G r u p p e n 18 567,42 31,52

in sgesamt 23 10959,58 476,46

Z 2 = 12,95 F = 65,94 n = 5 nl = 5

Z%,Ol = 15,09 n2 = 18 Fo,05 = 2,77

416 Helgol/inder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

4 c

Gruppen s e s t

1 und 2 9,31 3,051 0,107 - - • 1 und 3 46,75 6,837 10,444 + 1 und 4 8,96 2,993 21,858 ÷ 1 und 5 20,t3 4,487 6,477 + 1 und 6 40,76 6,384 1,526 - - 2 und 3 40,39 6,355 11,287 4- 3 und 4 40,04 6,328 0,944 - - 4 und 5 13,42 3,663 9,926 + 5 und 6 45,22 6,725 2,873 +

n - - 23 t0,o5 - 2,069

324 E i n f l u f von M a l e i n h y d r a z i d

Als letzter Wuchsstoff wurde den Kulturen Maleinhydrazid zugesetzt. Die Deutung der Ergebnisse erwies sich als schwieriger als vorauszusehen war. Es ergab sich in keinem Fall ffir einen der Konzentrationswerte eine statistische Sich.erung gegenfiber der Kontrolle. Auffatlend war jedoch, daft die Zugabe von 50 "~/1 eine Steigerung der Zellzahl des 6fteren vermuten fiet;. Aus diesem

2 0 0

100

50

2O

I0

5

3

2

• v

v o

v

• v V

l l I i i l i 1 I I 110. , O, 1, 2. 3. 4. 5. 6, 7. 8. 9. 11. Tag

Abb. 6. Einflug von Maleinhydrazid auf die Kulturen. Weil~es Dreie&: Kontrolle, weifles Rechteck: 5 7/1, schwarzes Dreie&: 25 7/1, schwarzer Kreis: 50 7/1, weiger Kreis: 100 7/1

Grunde wurde die angegebene Menge bei der Zusammenstellung der endgfil- tigen N/ihrl6sung zugesetzt. Auf alle Ffille ist der Schlug zu ziehen, da f das Maleinhydrazid, wenn fiberhaupt, so doch nur einen/iugerst geringen Einflut~ ausiibt.

Es sei an dieser Stelle ausdrficklich darauf hingewiesen, da f stets nut die Z e l l z a h l ermittelt wurde, nicht aber die Biomasse. Eine Erhghung der Zell- zahl mug nicht unbedingt auch eine Erhghung der Masse bedeuten. Die Unter- suchung des Massenzuwachses mut~ weiteren Versuchsreihen vorbehalten btei- b e n .

Bd. VI I I , H. 4: GStting, Zur Reinkultur yon DunaIiella 417

325 V i t a m i n k o m b i n a t i o n und p r a e c i p i t a t f r e i e N ~ h r l g s u n g

Nach dem negativen Ergebnis der Versuche mit Vitamin Bjs wurde die Einwirkung mehrerer Vitamine gleichzeitig untersucht. In Frage kamen die wasserl6slichen Vitamine, denn nur sie kgnnen im Buchenerdextrakt enthalten sein. Verschiedene Kombinationen wurden zusammengestellt und den Kulturen zugesetzt. Das zun/ichst rein qualitative Ergebnis war, dag folgende Vitamine die Entwicklung der Algen positiv beeinflussen:

Thiamin NicotinsSureamid Ca-D-pantothenat Riboflavin Fols~ure Ascorbins~iure

Insbesondere scheint das Riboflavin wichtig zu sein. Schon eingangs wurde erw/ihnt, daft das verwendete Kulturmediuln wie

fast alle in der Literatur aufgefiihrten N~ihrlSsungen Praecipitate bildet, die aus mehreren Grfinden unerwfinscht sind. Einmal ist nicht kontrollierbar, wel- che Substanzmengen in der L/isung werbleiben, zum anderen mug noch einmal filtriert werden, da .sich DunalieUa gem an flockigen Niederschl~igen festsetzt. Dadureh entstehen Verklumpungen, die eine quantitative Auswertung sehr erschweren oder gar unmgglich machen. Die Niederschlfige enthalten Eisen und Phosphat. Mit Hilfe yon Chelatbildnern wurde versucht, einen stabilen Eisen- komplex herzustellen. Die Nthylendiamintetraessigs/iure hat sich ffir diesen Zweck nicht bew~ihrt. Ein besseres Ergebnis lieferte Natriumcitrat in Verbin- dung mit einer geringeren Menge Eisensulfat. Das Eisensulfat hat gegeniiber dem Eisenchlorid den VorteiI, dat~ es leichter abzuwiegen ist. Die beste LSsung ist aber die Verwendung von Na-[3-glyzerophosphat als Phosphorquelle.

Um rationell arbeiten zu k6nnen, werden die Nfihrsalze (auger Eisensul- fat) in konzentrierten L/3sungen vorrfitig gehalten.

NfihrlSsung G 2

27 Meeresuntersuchungen Bd. VIII. H. 4

Seewasser 1 1 NaNO3 0,25 ml 32 °/oige LSsung (~80 rag) Na-[3-glyzerophosphat 0,25 ml 22 °/oige L/Jsung (~55 rag) ZnSO4.7 HsO 0,25 ml 1,5 °/oige LSsung (~ 3,8 rag) FeSO4-7 H~O 0,25 ml 1 °/eige LSsung (~ 2,5 rag) Thiaminiumdichlorid 2 ml 0,025o/oige L~isung (~ 0,5 mg) Nicotinsfiureamid 2 ml 0,4 °/oige Lgsung (Z'~ 8 rag) Ca-D-pantothenat 2 ml 0,125°/oige L6sung (l?',, 2,5 mg) Riboflavin 2 ml 0,04 °/0ige LSsung (~ 0,8 rag) FolsSure 2 ml 0,006°/oige L~sung (~ 0,12 mg) Ascorbins~iure 2 ml 1,25 °/oige LSsung (~25 mg) [3-Indolylessigs~iure 0,05 ml 0,004°/oige L/Ssung (~ 2 y) Gibberellins~iure (A~) 10 ml 0,04 %ige L6sung (~\ 4 mg) Maleinhydrazid 0,15 ml 0,033o/oige L6sung (2x50 "t)

418 Helgot/inder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

326 V i t a m i n k o m b i n a t i o n u n d S p u r e n e l e m e n t e

M i t d e r N S h r l S s u n g G 2 d u r c h g e f t i h r t e Versuche ze igen , daft z w a r d ie E r g e b n i s s e besse r w a r e n als be i V e r w e n d u n g y o n G 1, a b e t doch be i w e i t e m nicht d i e mi t t e l s Z u s a t z y o n B u c h e n e r d e x t r a k t e r z i e l t en Z e l l d i c h t e n e r re ich ten .

D ie V e r m u t u n g l a g nahe , daf~ d e r M a n g e l a n S p u r e n e l e m e n t e n d e r G r u n d f f r d i e sen Unter . schied ist. Es w u r d e e ine L S s u n g angese tz t , d i e in 1 ml fo l - g e n d e Salze enth / i l t :

0,05 m g 0,005 m g

1 m l w i r d zu 1 L i t e r Ku l tu r f l i i s s i gke i t

3 m g H3B O.~ 0,3 m g CuCls • 2 HzO 0,2 m g M n C l s • 4 H 2 0 0,4 m g COC12- 6 Hs.O 0,2 m g Na2MoO~- 2 t lsO

N a F

N a J O ~ zugese tz t .

Tabelle 5

Vergleich der Wirkung yon Erdextrakt und Vitamin-Spurenelemente-Kombination

Gruppen: 1.: Kontrolle 2: Kontrolle, Zusatz von Spurenelementen am 5. Versuchstag 3: Buchenerdextrakt (10 ml/1 Kultur) 4: vitaminhaltige N/ihrl6sung 5'. vitarninhaltige N/ihrlSsung, Zusatz yon Spurenelementen am 5. Versuchstag

5 a

Gruppen t 2 3 4 5 XM

5,82 16,55 95,57 7,16 26,50 30,32 m 25 25 25 25 25 N 4 4 8 2 4 m • N 100 100 200 50 100

5b

Streuung n SQ DQ

zwlschen den Gruppen 4 38 351,06 9 587,77 innerhalb der Gruppen 17 1 207,38 71,02

insgesamt 21 39 558,44 1 883,91

Z 2 = 53,24 F = 135,00 n = 4 nl ~ 4

Z%,05 -- 9,45! n2 = 17 Fo,o5 = 2,97

5 c

Gruppen s 2 s t

1 und 2 0,488 0,699 21,71 1 und 4 0,3t5 0,561 2,76 2 und 4 0,483 0,695 15,60 2 und 5 5,327 2,308 6,09 3 und 5 120,432 10,974 10,28

n = 21

t0,05 = 2,08

+ + + + +

Bd. VIII , H. 4: G6tting, Zur Reinkultur von Dunaliella 419

100"

50-

40"

30"

20"

10"

5

3

2- o @

A o A 1. 2.

o o

/x A

Abb, 7. Vergleich der Wirkung von Buchenerdextrakt, Vitaminen und Spurenelementen auf die Kulturen. Zusatz der Spurenelemente nach dem 5. Tag. Weiges Dreie&: Kontrolle, weit~es Rechte&: Vitamin-Kombination, schwarzer Kreis: Erdextrakt, weit~er Kreis: Kontrolle mit

Zusatz yon Spurenelementen, schwarzes Dreieck: Vitamin-Kombination mit Zusatz yon Spurenelementen

Aus Abb. 7 sind die Ergebnisse des Versuches zu erkennen: von den drei Gruppen Kontrolle-Vitaminzusatz-Buchenerdextrakt hat der Erdextrakt die anderen weit fiberfliigelt Nach dem 5. Versuchstag wird einem Teil der Kon- troll- und der Vitaminversuche die Spurenelemente-LSsung zugesetzt. Sofort erhght sich in diesen Kulturen die Zellzahl betr/ichtlich. Selbst die Kontrolle mit Spurenelementen iiberholt die nut vitaminhaltige N/ihrlSsung. Das bedeu- tet, dab die Spurenelemente fiir DunalieUa fSrderlicher sind als die Vitamine. Der Buchenerde am n/ichsten kommt in der Wirkung die Kombination yon Vitaminen und Spurenelementen.

Tabelle 6

Vergleich der Wirkung von Erdextrakt und Vitamin-Spurenelemente-Kombination bei gleichzeitigem Start

Gruppen: 1: Extrakt yon Buchenerde, 10 ml/1 2: Vitamin-Spurenelemente-Kombination 3: Vitamin-,Spurenelemente-Kombination, am 7. Tag nochmaliger Zusatz yon

Spurenelementen 6 a

Gruppen 1 2 3 ~5~

48,40 40,96 39,24 42,87 m 25 25 25 N 8 4 4 m • N 200 100 100

420

6 b

Helgol~inder Wissens&aftliche Meeresuntersuchungen

Streuung n SQ DQ

zwischen den Gruppen 2 311,96 155,98 innerhalb der Gruppen 13 214,68 16,51

insgesamt 15 526,64 35,09

Z ~ = 3,51 F =~ 9,45 n = 13 nl = 2

Ze0,05 = 5,99 n~ = t3 F0,05 = 3,81

6 c

Gruppen s ~ s t

1 und 2 20,49 4,53 2,68 + 1 und 3 18,54 4,31 3,48 + 2 und 3 6,51 2,55 0,95 --

n = 15 t0,05 = 2,13

50-

40-

30-

20

10

5- 0

4- •

3-

2- 0

O

Abb. 8. Vergleich der Wirkung yon Erdextrakt, Vitaminen und Spurenelementen bei gleich- zeitigem Start. Schwarzer Kreis: Erdextrakt, weit~er Kreis: Vitamine und Spurenelemente, schwarzes Dreieck: nochmaliger Zusatz yon Spurenelementen zur Vitamin-Spurenelemente-

Kombination nach dem 7. Tag

Ein n/ichster Versuch sollte kl~iren, ob die Vi tamin-Spurenelemente-Kom- bination mit dem Erdextrakt bei gleichzeitigem Start konkurrieren kann (Abb. 8). W/ihrend der ersten drei Tage geht die Vermehrung in der syntheti- schen L/Ssung etwas sehnetler vor sich als in dem erdextrakthal t igen Medium. Vom 4 .Tag an kehren sich die Verh/iltnisse um. Erneuter Zusatz yon Spuren- elementen bewirkt keine Verschiebung zugunsten des kiinstlichen Mediums, ein Zei&en daffir, dat~ die Spurenelemente no& in ausreichender Menge vor- handen sind. A m 11. T a g ist die Differenz zwischen den N/ihrlgsungen gering, der Unterschied ist aber signiflkant (Tab. 6). Das synthetische Medium l~6t sich durchVer/ inderungen in der Konzentrat ion einzelner Bestandteile in seiner

Bd. VIII, H. 4: G6tting, Zur Reinkultur yon Dunaliella 421 : = =

Tabelle 7

Vergteich verschiedener Vitamin-Spurenelemente-Kombinationen

Oruppen: 1: Vitamlne und Spurenelemente 2: Vitamine und halbe Menge Spurenelemente 3: Vitamine und halbe Menge Spurenelemente und 2 7/1 BI2 4: Vitamine und Spurenelemente, jedoch nur die halbe Menge B, Cu und F

7a

Gruppen 1 2 3 4 ~ t

x 115,32 1 t 1,44 121,82 114,77 115,84 m 25 25 25 25 N 4 4 4 4 m • N 100 100 100 100

7b

Streuung n SQ DQ

zwischen den Gruppen 3 226,12 75,37 innerhalb der Gruppen 12 416,55 34,7l

insgesamt 15 642,67 42,64

Z 2 = 9,94 F = 2,17 n = 12 n l - 3

Z~0,ol = 11,35 n2 = I2 F0,o5 = 3,49

100- , , / 2 -4 "-'~~-4 ""t - 3

..-3-4 50- ~ ' 1 - 2

@4 30-

20- ~1-2

10- @2 5-

3"

2. ~...3 /~-~-3 1-2

" 4

O. 1. , . 4. 5. 6. 7, 8, . 1 . 11. 12. 13. 14. 15, 16, 12 ]9. O. Tag

Abb. 9. ~¢Virkung yon Vitamin-Spurenetemente-Kombinationen in verschiedenen Konzentra- tionen. 1: Vitamine und Spurenelemente, 2: Vitamine und halbe Menge Spurenelemente, 3: Vitamine und halbe Menge Spurenelemente und 2 7/1 BI-2, 4: Vitamine trod Spuren-

elemente, jedoch nur die halbe Menge an B, Cu und F

Wirksamkeit nicht verbessern (Abb. 9, Tab. 7). Die Menge der Spurenele- mente ins gesamt oder nur die Zugabe yon Bor, Kupfer und Fluor wurde auf die H/ilfte herabgesetzt. Auch ein Zusatz yon Vitamin BI~ vermochte keinen besseren Effekt zu erzielen. Immerhin lassen sich Zelldichten erreichen, die denen von erdextrakthaltiger Nfihrl6sung entsprechen. Nach 20 Tagen sind es

422 Helgol/inder Wissenschaftliche Meeresuntersu&ungen

z.B. beim letzten Versuch (Abb. 9) etwa 2" 106 Zellen/ml. Zwar steigt die Zellzahl noch weiter an, aber so langsam, dag der Zuwachs in keinem Ver- hfiltnis zum Zeit- und Energ ieaufwand steht. Kulturen, die speziell ffir die rationelle Gewinnung -~on Algensubstanz betrieben werden, sollten also unter den angegebenen Bedingungen nicht filter als 14--20 Tage werden.

Z u s a m m e n f a s s u n g

Nach einer Darstel lung der bisherigen Ergebnisse bei der Kultur einzelli- ger mariner Grfinalgen wird der Einflut~ verschiedener Substanzen auf die Produktionsleistung yon DunalieUa untersucht. [3-Indolylessigs/iure und Gib- berellinsfiure in optimalen Konzentrat ionen steigern den Ertrag, Vitamin Bls und Male inhydraz id haben keinen nachweisbaren Effekt. Ffir das Gedeihen der Kulturen ist in erster Linie das Vorhandensein yon Spurenelementen wich- tig. Das vorgeschlagene Rezept ffir eine praezipitatfreie Nfihrl6sung enthfilt auger den fibtichen Nfihrsalzen 6 Vitamine, 3 Wuchsstoffe und 7 Spurenele- mente. Damit lassen sich Zelldichten erreichen, die den unter Verwendung yon Erdextrakt erzielten entsprechen.

S u m m a r y

The intluence of various substances on the productive capacity of Duna- liella is examined following a description of results obtained so far in cultu- ring unicellular marine green algae. Opt imum concentrations of indol-3-acetic acid and gibberellic acid increase the yield, vi tamin BI~ and maleic acid hydraz ide failed to give evidence of any effect. I f cultures are to grow well, it is, above all, important, that trace elements be present. The prescription pro- posed for a culture medium free from precipitation comprises, apart f rom the usual nutrit ive salts, 6 vitamins, 3 growth substances and 7 trace elements. The cellular growth dimensions thus obtained correspond to those resulting from employment of soil extract.

A n g e f i i h r t e S c h r i f t e n

A 11 e n, E. J., & N e 1 s o n, E. W., 1907: On the artificial culture of marine plankton orga- nismus. -- J. mar. biol. Ass. U. K., N. S. 8, 1,421--474.

B a g h d i a n t z, A., 1952: L'evolution du PIt de divers milieux de cultures liquides, inocul~s par Pseudomonas fluoreseens (Flfigge-Migula). - - Archives de Sciences 5, 1.

B e n t 1 e y, J. A., 1959: Plant hormones in marine phytoplankton, zooplankton and sea water. - - Int. Oceanographic Congress, Preprints, 910--911.

B u r d e t t , R. M., & T u r n b u l l , L. P., 1960: The effect of gibberellic acid on the growth of Chlamydomonas moewusii Gerl. - - Brit. Phyeol. Bull. 2, 1, 13.

Carnegie Institution of Washington Publication 600 (1953). D a v i s, H. G., 8: G u i 11 a r d, R. R., 1958: Relative value of ten genera of microorganisms

as food for oyster and clam larvae. - - Fish. Bull. Fish Wildlife Serv. 58, 293--304. Den f fe r, D. v., 1950: Die pIanktische Massenkultur pennater Grunddiatomeen. -- Arch.

Mikrobiol. 14, 159--202. D i e t r i e h, G., k K a 11 e, K., 1957: Allgemeine Meereskunde. -- Borntraeger, Berlin. D r o o p, M. R., 1955: A pelagic marine diatom requiring cobalamin. -- J. mar. biol. Ass.

U. K. 34, 229--231.

Bd. VII I , H. 4: G6tt ing, Zur Reinkul tur von Dunaliella 4 2 3

D r o o p , M. R., 1959: Chemical and ecological considerat ions in the design of synthet ic culture media for mar ine algae (Abstract) . - - Proc. IX. Int. Bot. Congr. 2, 96--97.

E n e b o , L., & J o h n s s o n , E., 1956: Outdoor cul t ivat ion of Chlore l la dur ing the summer 1954. - - Iva 27, 4, 165--172.

F e 1 f 6 1 d y , L. J. M., & K a Ik 6 , Z. F., 1959: Some methodica l observat ions on the use of antibiotics for p repa r ing bac ter ia - f ree algal cultures. - - Aeta Biol. Acad. Se. Hung. 10, 1, 95--99.

F o g g , G. E., S m i t h , W. E. E., 8c M i I l e r , J. D. A., t959: A n a p p a r a t u s for the cul ture of algae under control led condit ions. - - J. Biochem. Microbiol . Techn. Eng. 1, 59--76.

F o y n , B , 1934: Lebenszyklus, Cytologic und Sexualitfit der Chlorophycee C ladophora Suhr iana Kiitzing. - - Arch. Pro t i s tenkunde 83, 1, 6.

H a m i l t o n , L. D., H u t n e r , S. H. & P r o v a s o l i , L., I952: The use of protozoa in analysis. - - T h e Ana lys t 77, 920, 618--628.

H a r v e y , H. W. , 1950: On the product ion of l iving mat te r in the sea off Plymouth. - - J. mar. biol. Ass. U. K. 29, 97--137,

H e u r c k , H. v a n , 1893/96: Notice b iographique sur C. Hough ton Gill. - - Le Diatomis te 11, 125.

H e u r c k , t{. v a n , 1897: Culture des Diatom~es. Z. angew. Mikrosk. 3. J i - f a n g , G., & Y i n g - f a n g , Z h., 1959: (Effects of gibberel l ic acid and indole-3-acet ic

acid on mar ine unicel lular alga, Dunal ie l la salina) (chines.). - - Kexue Tongbao 6, 201 his 202.

K e t e h u m , B. H., L i l l i c k , L., & R e d f i e l d , A. C., 1949: The growth and opt imum yields of unicel lular algae in mass culture. - - J. Cell. Comp. Physiol . 33, 267.

K n a p p , R., 1962a: Neue Ergebnisse yon Untersuchungen fiber Gibberel l ine. - - Umschau 62, 17, 538--541.

K n a p p , R., I962b: Eigenschaften und Wi rkungen der Gibberel l ine . - - Springer . L e r c h e , W., 1937: Untersuchungen fiber En twi&lung und For tpf lanzung in der Ga t tung

Dunaliel la. - - Arch. Prot is tenk. 88, 236--268. L i n d e r , A., 1953: P lanen und Auswer ten yon Versuchen. - - Birkh/iuser, Basel. L u n d i n , H., & E r i c s o n , L.-E., t955: On the occurrence of v i tamins in mar ine algae. - -

Second Int. Seaweed Symposimn, Trondhe im. M a l o n e y , T. E., D o n o v a n j r . , E. J., & R o b i n s o n , E. L., 1962: De te rmina t ion of

numbers and sizes of alga ! cells wi th an electronic part icle counter. - - Phycologia 2, 1. M a n g e r e t , P., & C h a b e r t , G., 1953: Cultures de diatom~es. - - Archives de Sciences

5, 4. M a r r ~ , E., S e r v e t t a z , O., & A 1 b e r g o n i , F., 1958: Sul meecanismo di ada t t amen to

a condizioni osmotiche estreme in Dunal ie t la salina. I. Reazioni fisiologiche a var iazioni de l l ' ambiente osmotieo. - - Rendieont i de l l 'Accad. Nazionate dei Lincei, C1. Seienze fisiche, mat. e natural i , se r . VII I , 25, 6.

M e f f e r t , M. E., & S t r a t m a n n , H., 1951: Algen-Grot~kul turen im Sommer 1951. - - Forschungsber. Wirtschafts- und Verkehrsminis te r ium N o r d r h e i n - W e s t f a l e n 8.

M i q u e 1, P., 1890/93: De la culture artificielle des diatom~es. - - Le Diatomis te 1. M y e r s , J., P h i l l i p s , J. N., & G r a h a m , J. R., 1951: On the mass culture of algae. - -

P lan t Physiol. 26, 539. P i n e v i c h , V. V., k V e r z i l i n , N. N , 1961: (The effect of maleic acid hydraz ide on

certain protococcal algae) (russ.). - - Doklad. Akad. Nauk SSSR 137, 1230--1232. P r i n g s h e i m , E. G., 1954: Algenre inkul turen , ihre Hers te l lung und Erhal tung. - - VEB

Fischer, Jena . P r o v a s o 1 i , L., t956: Aleune considerazioni sui cara t ter i morfotogici e fisiologici delle

Alghe. - - Boll. Zool. Agra r i a Bachicoltura 22. P r o v a s o l i , L., 1958: Effect of p lan t hormones on Ulva . - - Biol. Bull. 114, 3, 375--384. P r o v a s o 1 i , L., 1960: Micronut r ien ts and he te ro t rophy as possible factors in bloom pro-

duction in na tura l waters . - - Transact . Seminar on Algae and Met ropol i t an Wastes . U. S. Public Hea l th Serv., R. A. Taft Engineer ing Center .

P r o v a s o l i , L., H u t n e r , S. H., & P i n t n e r , I. J., 1951: Dest ruct ion of chloroplasts by s t reptomycin. - - Cold Spr ing Harbor Syrup. on quant i ta t ive Biol., 16.

P r o v a s o l i , L., M c L a u g h l i n , J. J. A., & D r o o p , M. R., 1957: The deve lopment of artificial media for mar ine algae. ~-- Arch. Mikrobiol . 25, 392--428.

P r o v a s o l i , L., & P i n t n e r , I. J., 1953: Ecological implicat ions of in vitro nutr i t ional requirements of algal flagellates. - - Ann. New York Acad. Sc. 56, 5, 839--851.

424 Helgol/inder Wissenschaftliche Meeresuntersuchungen

P r o v a s o l i , L., S h i r a i s h i , K., & L a n c e , J. R., 1959: Nutritional idiosyncrasies of Artemia and Tigriopus in monoxenic culture. - - Ann. New York Acad. Sc. 77, 2,250--261.

R i c h t e r , O., 1903: Reinkulturen yon Diatomeen. - - Ber. deutsch, but. Ges. 21. R i c h t e r , O., 1904: Uber Reinkulturen yon Diatomeen und die Notwendigkeit der Kiesel-

s/iure ffir Nitzsehia palea (Kiitz.). - - Verh. Ges. deutsch. Naturf. Arzte, Breslau, 2. S c h r e i b e r , E., 1927: Die Reinkultur yon marinem Phytoplankton und deren Bedeutung

fiir die Erforschung der Produktionsf~ihigkeit des Meerwassers. - - Wiss. Meeresunters., N. F. 16, 2.

S t a g n o d ' A l c o n t r e s , G., L a m o n i c a , G., P o l i m e n i C o n t i , M., & L i n o , A., 1960: Cultura massiva di alghe. - - Atti Soc. Peloritana 6.

S w e e n e y , B. M., 1954: Gymnodinimn splendens, a marine dinoflage]late requiring BJ2. - - Amer. J. But. 41, 821--824.

T h i m a n n , K. V., & B e t h , K., 1959: Action of auxins on Acetabularia and the effect of enueleation. - - Nature 183, 946--948.

V i n o g r a d o v , A. P., 1953: The elementary chemical composition of marine organisms. - - Memoir Sears Foundation for marine Research 2.

W a I n e , P. R., 1956: Experimental rearing of the larvae of Ostrea edulis L. in the labo- ratory. - - Fish. Invest. Ser. It, 20, 9, 1--23.

W i 11 i a m s , L. G., 1960: Uptake of Cesium-137 by cells and detritus of Euglena and Chlo- rella. - - Limnol. Oceanogr. 5, 3, 301--311.

W i s e l y , B., & P u r d a y , C., 1961: An algal mass-culture unit for feeding marine inver- tebrate larvae. - - Div. Fish. Oceanogr., Techn. Paper 12, Commonwealth Sc. Indnstr. Research Org, Melbourne.