ISBN 978-3-86345-151-6
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de
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nov
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013
Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-151-6
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
www.dvg.de
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Tierärztliche Hochschule Hannover
Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
Fokale Substanzapplikation und Neurotransplantation zur Therapie
pharmakoresistenter Epilepsien
These
zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY
- PhD-
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Sonja Christina Bröer
Bremen
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Professor Dr. Wolfgang Löscher (Supervisor)
Professor Dr. Gerd Bicker
Professor Dr. Konstantin Wewetzer
1. Gutachten: Professor Dr. Wolfgang Löscher
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Professor Dr. Gerd Bicker
Institut für Tierökologie und Zellbiologie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Professor Dr. Konstantin Wewetzer
Institut für Funktionelle und Angewandte
Neuroanatomie
Medizinische Hochschule Hannover
2. Gutachten: Professorin Dr. Angelika Richter
Institut für Pharmakologie, Pharmazie und
Toxikologie
Veterinärmedizinische Fakultät Leipzig
Tag der mündlichen Prüfung: 12. April 2013
unterstützt durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des deutschen Volkes e.V.
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, L. GEY, M. GERNERT und
W. LÖSCHER (2012).
Vigabatrin for focal drug delivery in epilepsy: bilateral microinfusion into the subthalamic
nucleus is more effective than intranigral or systemic administration in a rat seizure model.
Neurobiol Dis 46: 362-76.
Für weitere Veröffentlichungen und Kongressbeiträge s. Publikationsverzeichnis (Ab-
schnitt 11).
Die Arbeit wurde im Rahmen des PhD-Studiengangs „Systems Neuroscience“ des Zentrums
für Systemische Neurowissenschaften Hannover angefertigt und Teile der Arbeit gehören zu
Teilprojekt 5 der DFG-Forschergruppe „Neurodegeneration und -regeneration bei ZNS-
Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).
für meine Eltern
I
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung ...................................................................................... 9
2. Stand der Forschung .................................................................. 11
2.1. Epilepsie .................................................................................................................... 11
2.1.1. Definition und Bedeutung .................................................................................. 11
2.1.2. Alternative Therapien ......................................................................................... 12
2.1.3. Tiermodelle ........................................................................................................ 13
2.2. Zielregionen für fokale Therapie ............................................................................... 14
2.2.1. Basalganglien - Anatomie und Physiologie ....................................................... 14
2.2.2. Das nigrale inhibitorische System ...................................................................... 16
2.2.3. Der Hippokampus – Anatomie und Physiologie ................................................ 17
2.3. Studie I: Fokale Substanzapplikation ........................................................................ 19
2.3.1. Substanzen für fokale Therapie .......................................................................... 19
2.3.2. Fokale Substanzapplikation in Basalganglienregionen ...................................... 21
2.3.3. Fokale Substanzapplikation in den Hippokampus ............................................. 24
2.4. Studie II: Neurotransplantation ................................................................................. 26
2.4.1. Zelltransplantation bei Epilepsie ........................................................................ 26
2.4.2. Neurotransplantation in den Hippokampus ........................................................ 27
2.4.3. Neurotransplantation in Basalganglienregionen ................................................ 28
2.4.4. Zellen für die Neurotransplantation ................................................................... 29
3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen .......................................... 35
3.1. Studie I: Fokale Substanzapplikation ........................................................................ 35
3.2. Studie II: Neurotransplantation ................................................................................. 36
4. Material und Methoden ............................................................. 39
4.1. Tiere ........................................................................................................................... 39
4.2. Akutes Anfallsmodell ................................................................................................ 41
4.2.1. Ablauf des PTZ-Tests ......................................................................................... 42
4.2.2. Vorabstudie: Einfluss unterschiedlicher Anästhetika auf die Anfallsschwelle .. 43
4.2.3. Einfluss des Zyklusstadiums auf die PTZ-Anfallsschwelle ............................... 43
II
4.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin ........................................................... 44
4.3.1. PTZ-Anfallsschwellen ........................................................................................ 44
4.3.2. Systemische Administration von Vigabatrin ...................................................... 45
4.3.3. Fokale Applikation von Vigabatrin .................................................................... 45
4.3.4. Verhaltensbeobachtung auf Nebenwirkungen ................................................... 49
4.3.5. Fokale Vigabatrin-Applikation nach Status epileptikus ..................................... 49
4.4. Studie Ib: Fokale Applikation von Botulinumtoxin .................................................. 50
4.4.1. PTZ-Anfallsschwellen ........................................................................................ 50
4.4.2. Botulinumtoxin ................................................................................................... 51
4.4.3. Convection-enhanced delivery ........................................................................... 51
4.4.4. Fokale Applikation von Botulinumtoxin B ........................................................ 52
4.4.5. Verhaltensversuche ............................................................................................ 55
4.4.6. Aufzeichnung des Elektroenzephalogramms (EEG) .......................................... 56
4.5. Studie II: Neurotransplantation ................................................................................. 57
4.5.1. PTZ-Anfallsschwellen ........................................................................................ 57
4.5.2. Studie IIa: Gewinnung und Kultivierung von GABAergen Vorläuferzellen ..... 57
4.5.3. Studie IIb: Kultivierung von NT2-Zellen ........................................................... 62
4.5.4. Zelltransplantation .............................................................................................. 63
4.5.5. Ablauf der Zelltransplantation ........................................................................... 64
4.5.6. Nachfolgestudie zu Studie IIa: Vorbehandlung der Zellen ................................ 66
4.5.7. In-vitro Studie .................................................................................................... 67
4.5.8. In-vivo Studie ..................................................................................................... 68
4.6. Histologie................................................................................................................... 68
4.7. Dekapitation............................................................................................................... 69
4.7.1. Botulinumtoxin ................................................................................................... 69
4.7.2. Neurotransplantation .......................................................................................... 70
4.8. Mikroskopie ............................................................................................................... 70
4.9. Immunhistologie ........................................................................................................ 71
4.9.1. GABAerge Vorläuferzellen ................................................................................ 71
4.9.2. NT2-Zellen ......................................................................................................... 73
4.9.3. Konfokale Mikroskopie ...................................................................................... 74
III
4.9.4. Quantitative Auswertung .................................................................................... 74
4.10. Statistische Auswertung ......................................................................................... 75
5. Ergebnisse .................................................................................... 76
5.1. Vorab-Studie: Einfluss des Anästhetikums auf die PTZ-Schwelle ........................... 76
5.2. Einfluss des Zyklusstadiums auf die Anfallsschwellen ............................................. 77
5.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin ........................................................... 77
5.3.1. Auswirkungen von Vigabatrin auf die PTZ-Anfallsschwelle ............................ 77
5.3.2. Nebenwirkungen ................................................................................................ 90
5.3.3. Spezifität der Zielregionen bei fokaler Applikation ........................................... 93
5.3.4. Akute fokale Applikation von Vigabatrin nach Status epileptikus .................... 95
5.4. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B ................................. 97
5.4.1. Schwellenänderungen nach Botulinumtoxin B .................................................. 97
5.4.2. Nebenwirkungen ................................................................................................ 99
5.4.3. Verhaltenstests ................................................................................................. 100
5.4.4. EEG-Aufnahmen .............................................................................................. 101
5.5. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen ............................... 104
5.5.1. Gewinnung, Kultivierung und Transplantation ................................................ 104
5.5.2. Tiergruppen ...................................................................................................... 104
5.5.3. Schwellenmessungen nach Transplantation ..................................................... 105
5.5.4. Verhaltensbeobachtung nach Transplantation ................................................. 107
5.5.5. Histologie ......................................................................................................... 107
5.5.6. Immunhistologie ............................................................................................... 109
5.5.7. Transplantation nach Status epileptikus ........................................................... 113
5.5.8. Nachfolgestudie: Vorbehandlung der GABAergen Vorläuferzellen ............... 115
5.6. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen ................................................... 119
5.6.1. Schwellenmessungen nach Transplantation von NT2-Zellen .......................... 119
5.6.2. Verhaltensbeobachtungen ................................................................................ 121
5.6.3. Histologie ......................................................................................................... 122
5.6.4. Immunhistologie ............................................................................................... 123
6. Diskussion .................................................................................. 124
6.1. Studie Ia: Fokale Substanzapplikation von Vigabatrin ........................................... 124
IV
6.1.1. Der subthalamische Nukleus als geeignete Zielregion für fokale Therapie ..... 124
6.1.2. Zeitverlauf der antikonvulsiven Wirkung ........................................................ 126
6.1.3. Spezifität der beobachteten Effekte auf die untersuchten Hirnregionen .......... 127
6.1.4. Gewähltes Anfallsmodell ................................................................................. 130
6.1.5. Vor- und Nachteile fokaler gegenüber systemischer Therapie ........................ 132
6.2. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B ............................... 134
6.2.1. Gewählte Zielregion ......................................................................................... 134
6.2.2. Gewähltes Anfallsmodell ................................................................................. 136
6.2.3. Gewählte Dosierung und Infusion .................................................................... 136
6.2.4. Convection-enhanced delivery ......................................................................... 137
6.2.5. Die gewählte Substanz ..................................................................................... 138
6.2.6. Verhaltensänderungen und epileptische Anfälle /EEG-Veränderungen .......... 139
6.3. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen ............................... 141
6.3.1. Transplantation von GABAergen Zelllinien in Basalganglienregionen .......... 141
6.3.2. Transplantation GABAerger Vorläuferzellen .................................................. 142
6.3.3. Wahl der Zielregion für die Transplantation .................................................... 143
6.3.4. Herkunft der transplantierten Zellen ................................................................ 145
6.3.5. Überleben der transplantierten Zellen .............................................................. 146
6.3.6. Differenzierung der transplantierten Zellen ..................................................... 147
6.4. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen ................................................... 149
6.4.1. Transplantation von NT2-Zellen bei Epilepsien .............................................. 149
6.4.2. Transplantation von NT2-Zellen in experimentellen Tiermodellen ................ 150
6.5. Probleme der Zelltransplantation und ihrer Translation .......................................... 152
6.6. Ausblick fokale Therapien ....................................................................................... 154
7. Zusammenfassung .................................................................... 156
8. Summary ................................................................................... 158
9. Literaturverzeichnis ................................................................. 160
10. Anhang ....................................................................................... 197
10.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien ...................................................................... 197
10.2. Medien für die Zellkultur ..................................................................................... 201
V
10.3. Antikörper ............................................................................................................ 202
10.4. Puffer und Lösungen ............................................................................................ 203
10.4.1. Stereotaktische Operation ............................................................................. 203
10.4.2. Perfusion ....................................................................................................... 203
10.4.3. Zellkultur ...................................................................................................... 204
10.4.4. Histologie...................................................................................................... 204
10.4.5. Immunhistologie ........................................................................................... 205
10.5. Färbeprotokolle .................................................................................................... 206
10.5.1. Histologische Färbungen .............................................................................. 206
10.5.2. Immunhistologische Färbungen ................................................................... 207
11. Publikationen ............................................................................ 210
12. Danksagung ............................................................................... 213
VI
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A Ampere
Abb. Abbildung
ac anteriore Kommissur
ANOVA „Analysis of Variance“; Varianzanalyse
Aqua dest. destilliertes Wasser
aSNr anteriore Substantia nigra pars reticulata
BHS Blut-Hirn-Schranke
BSA bovines Serumalbumin
BTX Botulinumtoxin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
CED „convection-enhanced delivery“
CM Creatinmonohydrat
cm2 Quadratzentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
cp zerebraler Pedunkel
Cy2/ Cy3 Carbocyanin 2/ Carbocyanin 3
DAB 3,3’-Diaminobenzidin
d.h. das heißt
EEG Elektroenzephalogramm
EPN entopedunkulärer Nukleus
g Gramm
GABA Gamma-Aminobuttersäure
GAD Glutaminsäuredecarboxylase
GFAP „Glial Fibrillary Acidic Protein“
ic interne Kapsel
i.d.R in der Regel
KCl Kaliumchlorid
kg Kilogramm
LGE laterale ganglionische Eminenz
M molar
mA Milliampere
VII
mfb mediales Vorderhirnbündel
mg Milligramm
MGE mediale ganglionische Eminenz
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mM millimolar
ms Millisekunde
NaCl Natriumchlorid
NT2 Ntera-2
NT2/29 NT2-Zellen, die eine Woche geprimt wurden
NT2/31 NT2-Zellen, die einen Tag geprimt wurden
O2 Sauerstoff
OP Operation
PBS Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung
PLH pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus
pSNr posteriore Substantia nigra pars reticulata
PTZ Pentylentetrazol
RA Retinsäure
s. siehe
sek Sekunde
SEM Standardfehler des Mittelwerts
SNr Substantia nigra pars reticulata
STN subthalamischer Nukleus
Tab. Tabelle
TBS tris-gepufferte Saline
VPA Valproat
VPM ventraler posteromedialer thalamischer Nukleus
VGB Vigabatrin
z.B. zum Beispiel
ZID dorsaler Teil der Zona incerta
ZIV ventraler Teil der Zona incerta
µl Mikroliter
µM mikromolar
VIII
Einleitung
9
1. EINLEITUNG
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit neuen Therapieansätzen für Epilepsien, den
häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems bei Mensch, Hund und
Katze (LÖSCHER 1994; THOMAS 2010). Epilepsien sind durch spontan auftretende,
wiederkehrende Anfälle zentralen Ursprungs charakterisiert. Üblicherweise werden Epilepsie-
patienten lebenslang mit sogenannten Antiepileptika behandelt. Dieser Begriff ist nicht ganz
korrekt, da diese Medikamente Anfälle zwar symptomatisch unterdrücken, aber nicht ursäch-
lich verhindern können. Nachteile einer Dauermedikation sind Nebenwirkungen wie Müdig-
keit, Konzentrationsschwierigkeiten, Übelkeit, ein eingeschränktes Sehvermögen oder Haut-
veränderungen (CRAMER 2012). Trotz intensiver Forschung werden unter Therapie mit mo-
dernsten Antiepileptika etwa 30 % der Patienten nicht anfallsfrei; bei ihnen treten weiterhin
unkontrollierbare schwere Anfälle auf (SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; ROGAWSKI u.
HOLMES 2009; SHORVON 2009; BRODIE 2010; LÖSCHER u. SCHMIDT 2011). Sie wer-
den als pharmakoresistent eingestuft. Bei der häufigsten Epilepsieform des Menschen, der
Temporallappenepilepsie, liegt der Anteil pharmakoresistenter Patienten etwa bei 60-70 %
(LEPPIK 1992). Bei Hunden werden etwa 70 % der an Epilepsie leidenden Tiere nicht
anfallsfrei (SCHWARTZ-PORSCHE et al. 1985; RIECK 2002; RIECK et al. 2006). Neuere
Therapieansätze untersuchen Alternativen zur Dauermedikation mit Antiepileptika: Vielver-
sprechend ist die fokale, gerichtete Behandlung, bei der das Therapeutikum direkt auf die
Hirnregionen beschränkt wird, die bei der Anfallsentstehung oder -weiterleitung eine tragende
Rolle spielen. Neben dem epileptischen Fokus, aus dem die Anfallsaktivität hervorgeht,
stellen vor allem die Basalganglien Schlüsselregionen bei der Anfallsweiterleitung und -
modulation dar (GALE 1988; GALE et al. 2008). Wichtige Neurotransmitter sind hier u.a. die
inhibitorisch wirkende Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und der exzitatorische Transmitter
Glutamat. Daher habe ich in meiner Arbeit zwei unterschiedliche therapeutische Strategien
verfolgt, denen gemeinsam ist, dass durch die vermehrte Freisetzung von GABA das bei Epi-
lepsie bestehende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender Neurotransmission
(BOUILLERET et al. 2000; SCHARFMAN 2007) ausgeglichen werden soll. In beiden Stu-
dien wurde eine sehr selektiv auf das GABAerge System wirkende therapeutische Interven-
tion mit einer weniger spezifischen verglichen: In der ersten Strategie haben wir die Effekti-
Einleitung
10
vität einer intrazerebralen Applikation von Vigabatrin mit der bisher üblichen systemischen
Administration dieses Antiepileptikums verglichen (Studie Ia). Die fokale Applikation er-
folgte hierbei in Basalganglienregionen, genauer in die Substantia nigra pars reticulata und
den subthalamischen Nukleus. Vigabatrin verhindert irreversibel den Abbau von GABA, mit
der Konsequenz, dass die GABA-Konzentration im Gehirn steigt (SCHECHTER 1989; BEN-
MENACHEM et al. 1993; LÖSCHER u. HÖRSTERMANN 1994; PETROFF et al. 1996).
Vergleichend hierzu haben wir in Studie Ib fokusnah Botulinumtoxin injiziert, welches
weniger selektiv wirkt und durch eine Inhibition der Neurotransmission an der präsynap-
tischen Membran die Ausschüttung verschiedener Transmitter, u.a. Glutamat, hemmt
(MCMAHON et al. 1992). COSTANTIN und Kollegen (2005) konnten zeigen, dass durch die
Hemmung glutamaterger Neurone ebenfalls epileptische Anfallsaktivität inhibiert werden
kann.
In einem zweiten therapeutischen Ansatz haben wir neuronale GABAerge Vorläuferzellen aus
der Ratte in die genannten Hirnregionen transplantiert (Studie IIa). Analog der fokalen Appli-
kation von Vigabatrin sollten die Transplantate die intrazerebrale GABA-Konzentration erhö-
hen und somit antikonvulsiv wirken. Als Vergleich diente hier die Transplantation von huma-
nen NT2-Vorläuferzellen und ausdifferenzierten NT2-Neuronen (Studie IIb). Bei NT2-Zellen
handelt es sich um eine Zelllinie, die 1984 aus einem Hodentumor eines Menschen isoliert
wurde und die sich in adulte Nervenzellen unterschiedlichen Phänotyps differenzieren lässt,
u.a. in GABAerge, cholinerge, serotonerge oder dopaminerge Neurone (ANDREWS et al.
1984; ANDREWS 1984; LEE u. ANDREWS 1986; PLEASURE et al. 1992; PODRYGAJLO
et al. 2009).
Ziel dieser Arbeit war es, zu testen, welche der untersuchten Hirnregionen sich am besten für
fokale therapeutische Manipulationen eignen, als auch zu evaluieren, ob die fokale Interven-
tion der systemischen Administration von Substanzen überlegen ist. Außerdem sollte über-
prüft werden, ob eine selektive Manipulation des GABAergen Systems effektiv ist, hierfür
dient jeweils der Vergleich mit einem weniger spezifisch wirkenden Eingriff. Zudem sollte
geklärt werden, ob mit der Transplantation GABAerger Zellen ein langfristiger antikonvul-
siver Effekt zu erzielen ist. In den folgenden Kapiteln referiere ich jeweils getrennt zu diesen
beiden Studien als Studie I: Fokale Substanzapplikation und Studie II: Neurotransplantation.
Stand der Forschung
11
2. STAND DER FORSCHUNG
2.1. Epilepsie
2.1.1. Definition und Bedeutung
Epilepsien sind durch wiederkehrende, spontane Anfälle zentralen Ursprungs charakterisiert.
Ein epileptischer Anfall ist in der Regel eine vorübergehende Phase abnormaler, übermäßiger
oder synchroner Aktivität im Gehirn (FISHER et al. 2005). Diese kann sich je nach Anfalls-
fokus im Gehirn und der lokalen oder generalisierten Ausbreitung der Anfallsaktivität im
zentralen Nervensystem unterschiedlich darstellen. Eine präzise Klassifizierung des Anfalls-
typs, der Ursache, des Alters des Patienten bei Erstauftreten der Anfälle, auslösender Faktoren
und elektroenzephalographischer Befunde ist für die erfolgreiche Therapie unerlässlich. Man
unterscheidet fokale von generalisierten Anfällen (BERG et al. 2010). Fokale Anfälle treten
nur in definierten Hirnregionen auf, während sich bei primär generalisierten Anfällen die epi-
leptische Aktivität von Anfang an über beide Hirnhemisphären ausbreitet. Etwa 60 % der neu
diagnostizierten Epilepsien sind durch fokale Anfälle charakterisiert, oft kommt es jedoch
während eines fokalen Anfalls zu einer sekundären Generalisierung (HAUSER et al. 1993;
BANERJEE u. HAUSER 2008). Man unterscheidet weiterhin einfach-fokale Anfälle mit Er-
halt des Bewusstseins von komplex-fokalen Anfällen mit Bewusstseinsbeeinträchtigung. Ein
Anfall hat klinisch verschiedene Erscheinungsbilder, neben Krämpfen, die sich als atonisch,
myoklonisch, tonisch, klonisch oder tonisch-klonisch darstellen, treten auch sogenannte
Absencen auf, bei denen lediglich eine kurze Bewusstseinspause mit anschließender,
vorübergehender Amnesie zu beobachten ist (WESTBROOK 2000).
Um die Diagnose Epilepsie bei einem Patienten zu stellen, genügt ein epileptischer Anfall in
Kombination mit weiteren Befunden, die auf eine Prädisposition für Epilepsie hinweisen
(FISHER et al. 2005). Sowohl beim Menschen als auch beim Hund kommen Epilepsien mit
einer Prävalenz von etwa 1 % in der Bevölkerung bzw. der Hundepopulation vor (ENGEL et
al. 2003; LÖSCHER 1997). Die Ursachen für epileptische Anfälle können vielfältig sein. Sie
reichen von symptomatischen Epilepsien, bei denen die Entstehung der Epilepsie auf eine
Grunderkrankung, wie etwa einen Gehirntumor, zurückzuführen ist, über idiopathische Epi-
lepsien, bei denen genetische Faktoren als Auslöser der Epilepsie diskutiert werden. Des
Stand der Forschung
12
Weiteren bezeichnet man Epilepsien als kryptogen, wenn weder eine pathologische noch eine
genetische Ursache festgestellt werden kann (ENGEL 2006).
2.1.2. Alternative Therapien
In der Regel ist die erste therapeutische Intervention die systemische Einnahme von Anti-
epileptika. Wie eingangs erwähnt, ist neben dem Auftreten von Nebenwirkungen die Pharma-
koresistenz, die bei mindestens einem Drittel der Patienten auftritt, ein stark limitierender
Faktor für den Erfolg der Behandlung (SCHMIDT u. LÖSCHER 2005; ROGAWSKI u.
HOLMES 2009). Pharmakoresistenz bedeutet, dass der Patient nach Behandlungsversuchen
mit zwei verschiedenen Antiepileptika, in Monotherapie oder in Kombination, keine
anhaltende Anfallsfreiheit erreicht (KWAN et al. 2010). Mit dem Einsatz moderner
Antiepileptika kann bei 10-20 % der zuvor als pharmakoresistent eingestuften Patienten
Anfallsfreiheit erreicht werden (LUCIANO u. SHORVON 2007). Trotzdem kann der
Mehrheit der pharmakoresistenten Epilepsiepatienten noch nicht mit medikamenteller
Therapie geholfen werden. Die Konsequenzen sind schwerwiegend: Beim Hund führt eine
pharmakoresistente Epilepsie aufgrund mangelnder Therapiemöglichkeiten häufig zur
Euthanasie und damit zu einer verminderten Lebenserwartung (BERENDT et al. 2007). Beim
menschlichen Patienten treten neben Einschränkungen im Alltag, wie etwa beim Führen von
Kraftfahrzeugen, gehäuft Komorbiditäten wie Depressionen und Angststörungen auf
(TELLEZ-ZENTENO et al. 2007). Zusätzlich kommt es bei einem Teil der Patienten zu Ver-
haltensauffälligkeiten oder Lern- und Gedächtnisdefiziten (POST 2004). Die Lebenserwar-
tung sinkt (RYVLIN u. KAHANE 2003).
Die bislang erfolgreichste Behandlung neben der Pharmakotherapie besteht in der
chirurgischen Resektion des Anfallsfokus: Seit 2001 ist durch eine randomisierte Langzeit-
studie belegt worden, dass die resektive Chirurgie der rein medikamentösen Therapie überle-
gen ist (WIEBE et al. 2001). Hierfür wurden 80 pharmakoresistente Patienten in zwei Grup-
pen eingeteilt; eine Gruppe wurde medikamentös behandelt, die anderen Patienten unterzogen
sich einer Fokusresektion mit anschließender (geringerer) Einnahme von Antiepileptika. In
der Medikamentengruppe erreichten nach einem Jahr lediglich 8 % Anfallsfreiheit gegenüber
58 % in der Operationsgruppe. Zusätzlich stuften die operierten Patienten ihre Lebensqualität
signifikant höher ein. Aufgrund der mit diesem schwerwiegenden Eingriff verbundenen Risi-
Stand der Forschung
13
ken oder wegen eines multifokalen Ursprungs der epileptischen Anfälle ist allerdings nicht
jeder Patient für diese Therapie geeignet (NILSEN u. COCK 2004).
Eine weitere, erst kürzlich zugelassene Option ist die tiefe Hirnstimulation des anterioren
Thalamus. Die tiefe Hirnstimulation geeigneter Hirnregionen wird bereits seit Jahren erfolg-
reich in der Therapie von Schmerz- und Bewegungsstörungen eingesetzt (NGUYEN et al.
2011; FASANO et al. 2012).
Neben der zentralen Stimulation wird klinisch auch die periphere Stimulation des 10. Hirn-
nervs (Nervus vagus) durchgeführt. Diese Behandlungen können bei bis zu 40 % der Patien-
ten zu einer deutlichen Senkung der Anfallsfrequenz führen (BOON et al. 2009; NITSCHE u.
PAULUS 2009; FISHER et al. 2010). Die vagale Stimulation führt auch beim pharmakoresis-
tenten Hund zu einer Anfallsreduktion um etwa 35 % (MUNANA et al. 2002). Allerdings ist
noch relativ wenig zu Risiken einer solchen Behandlung als Dauertherapie bekannt, und es
mangelt an verblindeten, groß angelegten klinischen Studien. Ein Problem stellt zum Beispiel
die Verblindung bei Vagusstimulation dar, da die Patienten die Impulse wahrnehmen können.
Sowohl die tiefe Hirnstimulation als auch die Stimulation des Nervus vagus sind in ihrer
Effektivität gegenüber der konventionellen medikamentösen Therapie nicht überlegen
(LÖSCHER 2009b).
Die ketogene Diät, eine sehr fettreiche, kohlenhydratarme Ernährung, die vor allem bei Kin-
dern eingesetzt wird, kann etwa bei einem Drittel der Patienten eine bis zu 90 %ige Anfalls-
reduktion hervorrufen (KOSSOFF u. RHO 2009). Diese Diät ist allerdings eher als
komplementäre denn als alleinige Therapie einsetzbar; sie ist mit viel Verzicht und gesund-
heitlichen Risiken verbunden (GROESBECK et al. 2006; ENGEL u. MOSHÉ 2009). Alle
weiteren Ansätze, wie etwa die Untersuchung von anderen, effektiveren Applikationsrouten
alternativ zur systemischen Gabe von Antiepileptika, Zell- und Gentherapie oder auch
hormonelle Intervention befinden sich noch im experimentellen Stadium. In meiner Arbeit
habe ich mich mit der fokalen bzw. gerichteten Therapie beschäftigt.
2.1.3. Tiermodelle
Neue therapeutische Ansätze werden u.a. in Versuchstiermodellen getestet, da die komplexe
Verschaltung epileptischer Anfallsaktivität und ihre vielfältigen endo- und exogenen Ein-
flüsse oft nicht zufriedenstellend in alternativen Systemen wie etwa Zellkulturmodellen nach-
Stand der Forschung
14
zubilden sind (RAOL u. BROOKS-KAYAL 2012; STEWART et al. 2012). Die in der
Epilepsieforschung verwendeten Tiermodelle lassen sich grob in zwei Hauptgruppen unter-
teilen: Zum einen werden schnelle und sehr sensitive Screening-Methoden verwendet, um
beispielsweise das antikonvulsive oder prokonvulsive Potential bestimmter Substanzen in der
Wirkstoffentwicklung zu testen (LÖSCHER 2011). Diesen Modellen ist gemeinsam, dass
epileptische Anfälle i.d.R. akut ausgelöst werden, d.h. die Versuchstiere zeigen keine sponta-
nen Anfälle und keine pathologischen Veränderungen des Gehirns (LÖSCHER 1999). An-
fälle werden mithilfe systemisch oder fokal verabreichter, prokonvulsiv wirkender Substanzen
oder durch elektrische Stimulation ausgelöst. Ein viel verwendetes, akutes Anfallsmodell ist
der Pentylentetrazol-Anfallsschwellentest, kurz PTZ-Test (LÖSCHER 2009a; LÖSCHER
2011), der in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde (s. Abschnitt 4.2). Weiterhin sind Mo-
delle etabliert, die möglichst genau die klinische Situation des Epilepsiepatienten widerspie-
geln sollen. Hierfür ist neben dem Auftreten wiederholter, spontaner Anfälle mit einem Anteil
pharmakoresistenter Tiere auch eine Pathologie der beteiligten Hirnregionen ein Kriterium
(s. Abschnitt 2.2.3.), um die Translation gewonnener Erkenntnisse im Tiermodell auf den
humanen Patienten übertragen zu können (COULTER et al. 2002). Modelle, mit denen dies
zum Teil erreicht wird, nutzen einen selbsterhaltenden Status epileptikus als Hirninsult, der
elektrisch oder chemisch, mithilfe prokonvulsiver Substanzen, induziert wird und nach einer
gewissen Latenzzeit zu spontanen Anfällen führt (LÖSCHER 1997). Bisher steht kein Modell
zur Verfügung, das alle Kriterien zufriedenstellend erfüllt (SLOVITER 2008; SLOVITER
2009; RUBIO et al. 2010; LÖSCHER 2011). Für die Überprüfung der Wirksamkeit eines
neuen Therapieansatzes, in diesem Fall der fokalen Therapie, ist auch die Determination einer
geeigneten Applikationsroute entscheidend. Um fokal therapieren zu können, müssen zu-
nächst geeignete Hirnregionen als Zielstrukturen identifiziert werden.
2.2. Zielregionen für fokale Therapie
2.2.1. Basalganglien - Anatomie und Physiologie
Ausgehend vom epileptischen Anfallsfokus spielen zahlreiche weitere Hirnregionen eine
Rolle bei der Ausbreitung der Anfallsaktivität bis hin zur sekundären Generalisierung
(LÖSCHER u. EBERT 1996). Seit Jahren ist bekannt, dass besonders den Basalganglien hier-
Stand der Forschung
15
bei eine tragende Rolle zukommt (GALE 1988). Die Basalganglien sind unter der Hirnrinde
(subkortikal) angelegte Kerngebiete des Vorder- und Mittelhirns. Zu den Basalganglien gehö-
ren die Substantia nigra, das Striatum (bestehend aus Nucleus caudatus und Putamen), der
Globus pallidus (anatomische Bezeichnung bei der Ratte, beim Menschen als Globus pallidus
externus bezeichnet), der entopedunkuläre Nucleus (Ratte, beim Menschen Globus pallidus
internus) sowie der subthalamische Nukleus. Diese Regionen sind anatomisch und funktionell
untereinander und mit dem limbischen System verbunden (s. Abb. 1). Bei Defekten innerhalb
der Basalganglien kann es zu komplexen neuropsychiatrischen Symptomen, kognitiven Ver-
änderungen, Verhaltensänderungen und zu hypo- oder hyperkinetischen Bewegungsstörungen
kommen. Die bekanntesten motorischen Symptome treten bei Morbus Parkinson und Chorea
Huntington auf. Charakteristische, pathologische Änderungen der Motorik sind hier Tremor,
Bewegungsarmut, eine gebeugte Körperhaltung und erhöhter Muskeltonus (Parkinson’sche
Krankheit), sowie überschießende, unwillkürliche Bewegungen (Huntington) (DELONG
2000). Physiologisch üben die Basalganglien eine Filterfunktion aus, das sogenannte
„Gating“: die Selektion aktuell gewollter Bewegungsmuster und die Inhibition der momentan
nicht erwünschten Aktivierungsmuster.
Die Verschaltung der Basalganglien besteht aus parallel verlaufenden Regelschleifen, die vom
Kortex über die Basalganglien zum Hirnstamm und Thalamus und vom Thalamus wieder zum
Kortex verlaufen. Die Eingangsstruktur der Basalganglien ist das Striatum, welches Eingänge
aus verschiedenen Bereichen des Kortex (assoziativ, sensorimotorisch und limbisch), des
Thalamus und der Substantia nigra pars compacta (SNc) erhält (DELONG 2000). Aus-
gangstrukturen sind die Substantia nigra pars reticulata (SNr) und der entopendunkuläre
Nukleus (Ratte, beim Menschen Globus pallidus internus), die über motorische Kerngebiete
des Thalamus, den rostralen Colliculus (Mensch: superiorer Colliculus) und den pedun-
kulopontinen Nukleus Informationen weiterleiten (BOLAM et al. 2000). Besonders die
Substantia nigra ist einer der am besten untersuchten Kerne der Basalganglien und in der Ver-
gangenheit sehr gut hinsichtlich ihrer Rolle bei der Weiterleitung und Ausbreitung epilep-
tischer Anfallsaktivität untersucht worden (vgl. GALE et al. 2008).
Stand der Forschung
16
2.2.2. Das nigrale inhibitorische System
Die Substantia nigra besteht zum einen Teil aus einer Pars compacta (SNc) mit dicht gepack-
ten, dopaminergen Neuronen. Diese sind bei Morbus Parkinson degenerativen Prozessen aus-
gesetzt und aus diesem Grund Gegenstand intensiver Forschung (DELONG 2000; YUAN et
al. 2010). Der zweite Teil ist die Pars reticulata (SNr). Ihr wird bei der Anfallsweiterleitung
und -modulation eine „seizure gating function“ zugeschrieben (GALE 1988; GALE et al.
2008).
Die etwa zu 90 % GABAergen Neurone der SNr erhalten Input aus dem Striatum auf zwei
Wegen: Eine Hemmung nigraler Neurone wird direkt, monosynaptisch, durch hauptsächlich
GABAerge Projektionsneurone des Striatums (medium-sized spiny neurons) erreicht
(HATTORI et al. 1973; FONNUM et al. 1978). Eine Aktivierung nigraler Neurone erfolgt
dagegen über einen indirekten, polysynaptischen Input über drei Stationen (s. Abb. 1). Hier
projizieren die „medium-sized spiny neurons“ des Striatums zum Globus pallidus (externus),
von dort über eine GABAerge Projektion zum subthalamischen Nukleus und über eine dritte,
glutamaterge Projektion vom subthalamischen Nukleus (STN) zur SNr (ALEXANDER u.
CRUTCHER 1990; ROBLEDO u. FEGER 1990; SHEN u. JOHNSON 2006; DENIAU et al.
2007). Von der SNr aus verlaufen inhibitorische Efferenzen zu verschiedenen Hirnregionen
im Hirnstamm und Mittelhirn. Im Falle einer Hemmung dieses „nigralen inhibitorischen
Systems“ werden die nachgeschalteten Regionen enthemmt und erhöhen so die Schwelle zur
Auslösung eines Anfalls. Ein antikonvulsiver Effekt kann demzufolge neben der direkten
Hemmung der SNr ebenso mit einer indirekten Hemmung erreicht werden, wenn ihre exzita-
torische Afferenz, der subthalamische Nukleus, gehemmt wird (ROBLEDO u. FEGER 1990;
FEGER u. ROBLEDO 1991). Des Weiteren verlaufen von der SNr reziproke Verbindungen
zum limbischen System, so dass rückwirkend auch der Anfallsfokus unabhängig von der ge-
nauen Lokalisation der Anfallsentstehung sowie des Anfallstyps über eine Manipulation der
SNr zu erwirken ist (DEPAULIS et al. 1994; LÖSCHER et al. 2008; GALE et al. 2008).
Stand der Forschung
17
Abb. 1: Schematische Darstellung der Generalisierung epileptischer Anfallsaktivität bei Temporallappen-
epilepsie. Die Ausbreitung epileptischer Anfallsaktivität verläuft entlang spezifischer anatomischer Bahnen, die
im physiologischen Zustand an der Vermittlung motorischer Aktivität beteiligt sind. Der epileptische Fokus liegt
zumeist im limbischen System (lila). Im Falle einer Generalisierung erfolgt die Ausbreitung der Anfallsaktivität
über den Kortex (blau), die Basalganglien (gelb), sowie deren Zielregionen (grün). In diesem epileptischen
Netzwerk sind verschiedene Transmitter involviert, vor allem aber GABA (rote Pfeile) und Glutamat (blaue
Pfeile). Modifiziert nach LÖSCHER et al. 2008.
2.2.3. Der Hippokampus – Anatomie und Physiologie
Vergleichend zur fokalen Applikation in Basalganglienregionen haben wir eine weitere Sub-
stanz, Botulinumtoxin B, in den Gyrus dentatus des Hippokampus injiziert. Der Hippokampus
gehört zum limbischen System, in welchem bei einem Großteil der Epilepsiepatienten der
Anfallsfokus liegt (ENGEL et al. 1993). Pathologische Veränderungen bei Epilepsien werden
zumeist in Form einer Sklerose im Hippokampus charakterisiert (MARGERISON u.
CORSELLIS 1966; SLOVITER 1994; KÄLVIÄINEN et al. 1998). Eine partielle Resektion
des Temporallappens kann in Anfallsfreiheit resultieren (ENGEL et al. 1993; WIEBE et al.
2001), was die Hypothese stützt, dass auch fokale, therapeutische Manipulationen direkt im
Stand der Forschung
18
Anfallsfokus zu einem Erfolg führen können (EDER et al. 1997a; EDER et al. 1997b;
ROGAWSKI 2009).
Der Hippokampus besteht aus dem Subiculum, dem Ammonshorn und dem Gyrus dentatus
(MCINTYRE u. SCHWARTZKROIN 2008). Der Gyrus dentatus ist die Haupteingangs-
struktur des Hippokampus und erhält Eingänge aus dem entorhinalen Kortex. Er besteht
hauptsächlich aus glutamatergen Neuronen, deren Zellsomata im sogenannten Körnerzellband
liegen (Stratum granulare), ihren Dendriten, die im Stratum moleculare lokalisiert sind und
dem Hilus, in dem sowohl glutamaterge Neurone, die aufgrund ihres Erscheinungsbildes so-
genannten Mooszellen, als auch GABAerge Interneurone liegen (AMARAL 1978; FÖRSTER
et al. 2006). Obduktionen an Patienten mit Temporallappenepilepsie haben gezeigt, dass so-
wohl exzitatorische als auch inhibitorische Neurone degenerieren können, vornehmlich findet
allerdings eine Reduktion der GABAergen Interneurone im Hilus des Gyrus dentatus statt
(DE LANEROLLE et al. 1989; WITTNER et al. 2001). Im Kindling-Modell konnte gezeigt
werden, dass sich durch Kindling die elektrophysiologischen Eigenschaften der glutamatergen
Körnerzellen verändern, und dass eine hohe metabolische Aktivität der Region mit der Ge-
neralisierung von Anfällen einhergehen kann (LOTHMAN 1994). Die enge Verschaltung der
hippokampalen Strukturen untereinander und mit der kontralateralen Hemisphäre kann durch
die hauptsächlich exzitatorischen, glutamatergen Verbindungen Anfallsaktivität amplifizieren
(RIBAK et al. 1985; MCINTYRE u. SCHWARTZKROIN 2008). Der Hippokampus ist wohl
die am besten untersuchte Hirnregion im Hinblick auf die Entstehung epileptischer Anfalls-
aktivität.
Stand der Forschung
19
2.3. Studie I: Fokale Substanzapplikation
2.3.1. Substanzen für fokale Therapie
2.3.1.1. Vigabatrin
Um die effektivste Zielregion innerhalb der Basalganglien für die fokale Substanzapplikation
bzw. die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen zu determinieren, haben wir zunächst
ein Strukturanalogon von GABA, Vigabatrin (4-Aminohex-5-ensäure, Gamma-Vinyl-GABA,
s. Abb. 2), als Modellsubstanz lokal in verschiedene
Hirnareale von Ratten mikroinjiziert und dann mit
etablierten Methoden die Anfallsschwelle bestimmt.
Vigabatrin hemmt irreversibel die GABA-
Aminotransferase. Dieses Enzym ist für den Abbau von
GABA zuständig. Wird es durch die systemische
Administration von Vigabatrin gehemmt, so steigt die
intrazerebrale GABA-Konzentration (SCHECHTER
1989; SABERS u. GRAM 1992).
In der Literatur ist beschrieben, dass Vigabatrin außerdem die GABA-Freisetzung fördern
kann (BEN-MENACHEM 2002). Vigabatrin ist ein Antiepileptikum, das in über 50 Ländern
als „Add-on“-Therapeutikum bei Patienten mit refraktären komplex-partiellen Anfällen als
auch als Monotherapie bei Kindern mit infantilen Spasmen zugelassen ist (WILLMORE et al.
2009). Das Arzneimittel (Handelsname Sabril®) wird oral eingenommen und fast komplett
resorbiert. Die Elimination erfolgt renal (BEN-MENACHEM 2002). Bei systemischer
Einnahme treten vorrangig Nebenwirkungen wie sedative Effekte oder Gewichtszunahmen
auf (SABERS u. GRAM 1992; BEN-MENACHEM 2007; WILLMORE et al. 2009).
Vigabatrin-spezifische Nebenwirkungen, die beim menschlichen Patienten auftreten, sind mit
einer Prävalenz von unter 1 % Psychosen und mit einer Prävalenz von 25-50 %
Gesichtsfeldeinschränkungen (SABERS u. GRAM 1992; THOMAS et al. 1996; WERTH u.
SCHADLER 2006; BEN-MENACHEM 2007; WILLMORE et al. 2009). Aus diesem Grund
wurde Vigabatrin in den USA erst 2009 als Antiepileptikum unter der Prämisse zugelassen,
dass ein sehr strenges Monitoring der Patienten auf Gesichtsfeldeinschränkungen vor,
Abb. 2 Strukturformeln von A GABA
und B Vigabatrin
Stand der Forschung
20
während und nach Vigabatrin-Behandlung erfolgen muss (TOLMAN u. FAULKNER 2011).
Eine Möglichkeit, Nebenwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren ist die lokale
Verabreichung eines Therapeutikums direkt in die Schlüsselregionen der Anfallsentstehung
und –weiterleitung (FISHER u. HO 2002; NILSEN u. COCK 2004; ROGAWSKI 2009; AL-
OTAIBI et al. 2011).
2.3.1.2. Botulinumtoxin
Im Gegensatz zu Vigabatrin ist der Wirkmechanismus von Botulinumtoxinen im Zentralner-
vensystem weniger spezifisch. Botulinumtoxine sind Neurotoxine, die ihre Wirkung durch
Hemmung der synaptischen Transmission erreichen. Sie gehören zu den giftigsten Proteinen
überhaupt (JOHNSON 1999; ROSSETTO et al. 2006). Durch das Auftreten von Lähmungen
(Paralyse) nach dem Verzehr von belastetem Fleisch wurden die ersten Intoxikationen durch
Botulinumtoxine bereits im 18. Jahrhundert in Deutschland beschrieben (DICKSON 1918),
und Anfang des 19. Jahrhunderts wurde ein Toxin als Ursache für die auftretenden Symptome
von Botulismus identifiziert, die von Kopf- und Gliederschmerzen zu Beginn über Mund-
trockenheit, Lähmungen der Augenmuskeln, Schlundmuskeln, Miktionsstörungen, Obstipa-
tion bis zum Tod der Betroffenen reichten (KERNER 1817; KREYDEN et al. 2000). Es han-
delt sich um bakterielle Toxine (Toxovaren A-G), die unter anaeroben Bedingungen von
grampositiven Clostridien, vornehmlich Clostridium botulinum gebildet werden (VAN
ERMENGEM 1897; SIMPSON 2004; SELBITZ 2011). Seit vielen Jahren ist bekannt, dass
Botulinumtoxine die Vesikelfusion an der präsynaptischen Membran verhindert, indem es
toxovarabhängig bestimmte Fusionsproteine (SNARE, engl. für soluble N-ethylmaleimide-
sensitive-factor attachment receptor) spaltet (HUMEAU et al. 2000). Die peripheren Wirkun-
gen von Botulinumtoxin sind sehr gut untersucht: Die Hemmung der Acetylcholin-Ausschüt-
tung ist für die paralytische Wirkung von Botulinumtoxin verantwortlich. Die auf diesem
Wege inhibierte Neurotransmission resultiert in einer klinisch manifesten, schlaffen Läh-
mung, einer Paralyse. Diese Wirkung wird neben der Anwendung für kosmetische Zwecke
auch klinisch bei verschiedenen Indikationen genutzt, bei denen eine pathologische, unkon-
trollierte, periphere cholinerge Aktivität vorliegt (SIMPSON 2004), u.a. in der Ophthalmolo-
gie, bei Bewegungsstörungen, Hypersekretionsstörungen und Schmerz (LIM u. SEET 2007).
Ziel einer Behandlung mit Botulinumtoxin in sehr geringen Dosen ist nicht die vollständige
Stand der Forschung
21
Hemmung der exzessiven neuronalen Aktivität, sondern die Reduktion auf ein normales Maß
(JANKOVIC u. BRIN 1991; BELL et al. 2000).
In Deutschland gibt es 4 zugelassene Arzneimittel mit Wirkstoffen aus Botulinumtoxinen
(DRESSLER 2012). Botulinumtoxin hemmt nicht nur die cholinerge Transmission, sondern
u.a. auch die glutamaterge (MCMAHON et al. 1992). Somit war anzunehmen, dass durch die
Hemmung zentraler, glutamaterger Neurone epileptische Anfallsaktivität inhibiert werden
kann. Botulinumtoxin A und E erwirken in-vitro erwiesenermaßen eine selektive Hemmung
der glutamatergen Transmission; es wird kein Effekt auf GABAerge Synapsen ausgeübt
(CAPOGNA et al. 1997; VERDERIO et al. 2004). Botulinumtoxine sind Peptide und über-
winden aufgrund ihrer Molekülgröße und Polarität nicht die Bluthirnschranke (SIMPSON
2004). Eine fokale Applikation von Botulinumtoxin in das Zentralnervensystem stellt die ein-
zige Option dar, einen therapeutischen Nutzen bei Epilepsie zu überprüfen. Aus diesem
Grund wurde Botulinumtoxin in der vorliegenden Arbeit in das glutamaterge Körnerzellband
des Gyrus dentatus injiziert.
2.3.2. Fokale Substanzapplikation in Basalganglienregionen
Insgesamt gestaltet sich die lokale Verabreichung eines Therapeutikums, sei es eine Substanz
oder ein Transplantat, als weit spezifischer als die systemische Gabe (BOISON 2007).
Bereits vor 30 Jahren konnte gezeigt werden, dass die Mikroinjektion von Vigabatrin lokal in
das Mittelhirn in einem Ratten-Anfallsmodell antikonvulsiv wirksam ist (IADAROLA u.
GALE 1982). Für eine genauere Lokalisierung der Hirnregion, die für die beobachteten
Wirkungen verantwortlich war, wurde der GABAA-Rezeptor-Agonist Muscimol verwendet
und die SNr als Wirkort identifiziert (GALE 1985). Sie ist an epilepsie-induzierten,
plastischen Netzwerkveränderungen beteiligt, die auch im experimentellen Tiermodell (Kind-
ling als Modell für die Temporallappenepilepsie) hervorgerufen werden (GERNERT et al.
2004; TÖLLNER et al. 2011). Während und bereits vor einem generalisierten Anfall sind
nigrale Nervenzellen vermehrt aktiv (ENGEL et al. 1978; NEHLIG et al. 1998; DUBÉ et al.
2000a). In unterschiedlichen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass eine vermehrte Hem-
mung nigraler Neurone zu einer Reduktion bzw. Unterdrückung von experimentell ausgelös-
ten Anfällen führt (GALE u. IADAROLA 1980; LE GAL LA SALLE et al. 1983a;
MCNAMARA et al. 1984; DEPAULIS et al. 1988; ZHANG et al. 1991; BLOMS-FUNKE u.
Stand der Forschung
22
LÖSCHER 1996; WINDELS u. KIYATKIN 2004; NOLTE et al. 2006). Neben Arbeiten im
Kindling-Modell (LE GAL LA SALLE et al. 1983a; MCNAMARA et al. 1984; LÖSCHER et
al. 1987) wurde eine antikonvulsive Wirkung GABA-potenzierender Substanzen auch in che-
misch-induzierten, akuten Anfallsmodellen, in denen Anfälle z.B. mithilfe von Antagonisten
des GABAA-Rezeptors ausgelöst werden, belegt. So konnte eine antikonvulsive Wirkung
GABA-potenzierender Substanzen im systemischen Bicucullin-Modell (GARANT u. GALE
1986) bzw. im Flurothyl-Modell (XU et al. 1991; GARANT et al. 1995) gezeigt werden.
Auch nach systemischer und fokaler Auslösung eines Anfalls mit dem Parasympatho-
mimetikum Pilokarpin konnte durch intranigrale Administration von Vigabatrin ein protekti-
ver Effekt erzielt werden (TURSKI et al. 1986; SMOLDERS et al. 1997). Pilokarpin wird
weltweit in der tierexperimentellen Epilepsieforschung genutzt, um sowohl akute Anfälle als
auch einen selbst-erhaltenden Status epileptikus als primären Hirninsult und infolgedessen
nach einer Latenzzeit von einigen Wochen eine chronische Epilepsie auszulösen (TURSKI et
al. 1987; CAVALHEIRO 1995; LÖSCHER 2002; SCORZA et al. 2009). Auch bei genetisch
veränderten Ratten, die spontan Absencen zeigen, konnten diese durch Injektion von GABAA-
Agonisten in die SNr unterdrückt werden (DEPAULIS et al. 1988). Bisher gibt es jedoch
kaum Untersuchungen, die direkt die Wirksamkeit fokaler und systemischer Applikation in
einem Epilepsiemodell miteinander verglichen haben. Neuere Versuche haben zudem gezeigt,
dass die SNr auf lokale Manipulationen nicht einheitlich in ihrer anfallsmodulierenden Eigen-
schaft reagiert. Unterschiede zeigen sich bei der Ratte zwischen dem vorderen (anterioren)
und hinteren (posterioren) Teil der SNr. Beispielsweise führte eine Mikroinjektion von Viga-
batrin in der posterioren SNr (pSNr) zu prokonvulsiven Effekten im Flurothyl-Modell, in der
anterioren SNr (aSNr) hingegen zu einer antikonvulsiven Wirkung (VELÍŠKOVÁ et al.
1996a). Ursächlich für diese widersprüchlichen Ergebnisse könnten unter anderem ein Unter-
schied in der Rezeptorexpression (VELÍŠKOVÁ et al. 1998), subregionen-spezifische
Efferenzen, das verwendete Tiermodell, das Alter sowie Geschlecht der verwendeten Tiere
sein (SHEHAB et al. 1996; GERNERT u. LÖSCHER 2001). Wir führen daher sowohl die
fokale Substanzapplikation als auch die später beschriebene Neurotransplantation an
mehreren Loci der SNr durch.
Im Vergleich zur SNr ist der subthalamische Nukleus (STN) in seiner Bedeutung für die
Weiterleitung epileptischer Anfallsaktivität weitaus weniger gut untersucht. Der STN liefert
Stand der Forschung
23
monosynaptischen, glutamatergen und damit exzitatorischen Input in die SNr. Folgerichtig
senkte die Injektion des GABAA-Rezeptor-Agonisten Muscimol in den STN die metabolische
und elektrophysiologische Aktivität der Zielstrukturen des STN, und somit u.a. in der SNr
(FEGER u. ROBLEDO 1991). Analog zu den Untersuchungen in der SNr zeigte sich nach
Mikroinjektion von Muscimol in den STN eine antikonvulsive Wirkung im Kindling-Modell
(DERANSART et al. 1998), bei systemisch und fokal appliziertem Bicucullin (DYBDAL u.
GALE 2000), nach Flurothyl-Inhalation (VELÍŠKOVÁ et al. 1996b) und bei genetisch-
bedingten Absencen (DERANSART et al. 1996). Dies belegt, dass sowohl die Hemmung des
direkten striatonigralen als auch des indirekten Pfades bei der Ausbreitung epileptischer An-
fallsaktivität eine Rolle spielen (DEPAULIS et al. 1994; GALE et al. 2008). Konträr zu Stu-
dien an der SNr gibt es keine Untersuchungen zur Wirksamkeit von Vigabatrin nach Appli-
kation in den STN.
Bisher ist die antikonvulsive Wirksamkeit einer Substanz auf die Hemmung des direkten und
indirekten nigrostriatalen Weges nicht miteinander verglichen worden, so dass nicht doku-
mentiert ist, welcher Weg den größten Nutzen für eine fokale, antikonvulsive Therapie haben
könnte. Diese Arbeit soll helfen aufzuklären, welche Hirnregion der Basalganglien potenziell
für die gerichtete, fokale Therapie am erfolgversprechendsten ist. Es gibt mehrere Gründe die
Basalganglien und nicht direkt den Anfallsfokus als Zielregion für eine gerichtete, fokale
Therapie auszuwählen. Einerseits könnte so auch Patienten geholfen werden, deren Anfalls-
fokus operativ nicht zugänglich ist oder die mehrere Foci haben. Somit wird auch die Patien-
tengruppe erreicht, für die eine Fokusresektion als therapeutische Intervention nicht in Frage
kommt. Die Basalganglien, insbesondere der subthalamische Nukleus, werden klinisch für
therapeutische Neurostimulation bei anderen neurologischen Erkrankungen wie beispiels-
weise Morbus Parkinson oder Dystonie bereits genutzt (BENABID et al. 2001; BENABID
2007; AL-OTAIBI et al. 2011), so dass die chirurgische Zugänglichkeit dieser Region kli-
nisch etabliert ist. Tatsächlich wurde auch bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten bereits
erfolgreich im subthalamischen Nukleus stimuliert (CHABARDES et al. 2002). Zusätzlich
spricht für die experimentelle Erforschung der Basalganglien als Zielregion für fokale Thera-
pie, dass teilweise die Fokusdiagnostik ungenau bzw. beim Hund noch nicht etabliert ist, so
dass die Manipulation von gemeinsamen „Endstrecken“ verschiedener Anfallstypen eine
vielversprechende Option darstellt.
Stand der Forschung
24
2.3.3. Fokale Substanzapplikation in den Hippokampus
Der Gyrus dentatus wird analog zur SNr als „Tor zur hippokampalen Erregbarkeit“ bezeich-
net (HEINEMANN et al. 1992). Elektrophysiologische Messungen belegen eine verminderte
GABA-vermittelte Hemmung im Gyrus dentatus von humanen Epilepsiepatienten
(WILLIAMSON et al. 1999). In akuten, experimentellen Anfallsmodellen kommt es analog
nach Injektion von GABAA-Rezeptor-Antagonisten in die Region CA1 des Ammonshornes
zu fokalen und sekundär generalisierenden Anfällen (ANSCHEL et al. 2004). Durch eine
vorausgehende, prophylaktische Injektion von GABA-potenzierenden Substanzen wie Benzo-
diazepinen oder GABA-Agonisten wie Muscimol lassen sich diese Anfälle unterdrücken
(KOHANE et al. 2002; ANSCHEL et al. 2004). Ebenso lassen sich chronische Veränderun-
gen im EEG, die durch systemische Pilokarpin-Injektion bzw. fokale Kobaltchlorid-
Administration ausgelöst wurden, durch eine Diazepam-Injektion in die CA1 des Hippokam-
pus reduzieren (EDER et al. 1997b). Die mögliche Einflussnahme auf die Anfallsaktivität
durch eine Manipulation des GABAergen Systems, sowie die beschriebene pathologische
Reduktion GABAerger Inhibition innerhalb des Hippokampus bei einer manifesten Epilepsie,
lassen vermuten, dass im Umkehrschluss auch eine Reduktion der Glutamat-Freisetzung zu
verminderter Suszeptibilität gegenüber prokonvulsiven Substanzen führt. In-vitro schützt eine
herabgesetzte Glutamat-Freisetzung vor Übererregbarkeit der Neurone und übermäßiger Neu-
rotransmitter-Sekretion (BANCILA et al. 2004). Absicht unserer Studie war es, durch die
Mikroinjektion von Botulinumtoxin die glutamaterge Transmission im Gyrus dentatus in-vivo
zu hemmen und auf diesem Weg antikonvulsive Effekte zu erzielen. Für die Toxovare A, B
und E konnten im Kindling antikonvulsive Eigenschaften nachgewiesen werden
(ROGAWSKI 2009; COSTANTIN et al. 2005). Auch nach fokaler oder systemischer, akuter
Anfallsinduktion sowie nach chronischer Epilepsieinduktion durch Kainsäure kann durch
Injektion von Botulinumtoxin E in die CA1 und CA3 des Hippokampus die Anfallsfrequenz
reduziert werden (COSTANTIN et al. 2005; ANTONUCCI et al. 2009). Zudem ist für
Botulinumtoxin E eine neuroprotektive Wirkung gegenüber Epilepsie-induzierter Neurode-
generation nachgewiesen worden, die auf einer verminderten Aktivität proapoptischer
Proteine beruht, die wiederum durch eine Herabregulation glutamaterger Neurotransmission
bedingt sein könnte (MANNO et al. 2007; CALEO u. SCHIAVO 2009). Der Einsatz von
Toxinen gegenüber herkömmlichen Antiepileptika könnte einen entscheidenden Vorteil
Stand der Forschung
25
haben: Antiepileptika sind kleinmolekülige Substanzen, die bei fokaler Applikation ins Hirn-
gewebe vom Injektionsort in das umliegende Gewebe diffundieren. Botulinumtoxin hingegen
diffundiert aufgrund seiner molekularen Eigenschaften kaum (GASIOR et al. 2007;
ROGAWSKI 2009), und wirkt bis die vom Toxin gespaltenen Vesikelproteine neu synthe-
tisiert werden (RACIBORSKA u. CHARLTON 1999; MEUNIER et al. 2002). Die beobach-
teten antikonvulsiven Effekte halten einige Wochen; im Vergleich liegt die Wirkung nach
Mikroinjektion herkömmlicher Antiepileptika, die i.d.R. nach wenigen Tagen aufgehoben ist,
deutlich darunter (EDER et al. 1997b; ROGAWSKI 2009; unveröffentlichte Daten aus der
AG Rogawski). Fokale Therapieansätze würden für Epilepsiepatienten generell mindestens
einen neurochirurgischen Eingriff bedeuten, der von der chronischen oder intermittierenden
Applikation der antikonvulsiven Substanz gefolgt würde. Im Falle einer klinischen Anwen-
dung der fokalen Therapie mit Botulinumtoxin könnte aufgrund der länger andauernden Wir-
kung eventuell seltener behandelt werden als mit herkömmlichen Antiepileptika
(ROGAWSKI 2009). Generell handelt es sich bei der fokalen Injektion von Substanzen um
einen neurochirurgischen Eingriff mit folgender chronischer Behandlung, bei der das Thera-
peutikum intermittierend oder kontinuierlich freigesetzt werden müsste.
Stand der Forschung
26
2.4. Studie II: Neurotransplantation
Eine weitere Strategie, langanhaltende, antikonvulsive Effekte zu erreichen, könnte die fokale
Transplantation GABAerger Vorläuferzellen darstellen (LÖSCHER et al. 2008). Erste Trans-
plantationsstudien wurden bereits in den 1980er Jahren bei rein neurodegenerativen Erkran-
kungen mit selektivem Zellverlust wie der Parkinson’schen Erkrankung durchgeführt. In den
ersten Studien wurden sowohl fetale Zellen aus der Ratte als auch Zellen, die aus humanen,
abortierten Feten gewonnen wurden, in einem Rattenmodell für Morbus Parkinson transplan-
tiert (BRUNDIN et al. 1985; BRUNDIN et al. 1986). In jenen und darauffolgenden Unter-
suchungen konnte gezeigt werden, dass die transplantierten dopaminergen Vorläuferzellen zu
einer Aufhebung der zuvor induzierten motorischen Asymmetrie führen und die dopaminer-
gen Vorläufer ausdifferenzieren und funktionell in die Zielregion (Striatum) des Empfänger-
tieres integriert werden (BRUNDIN et al. 1985; CLARKE et al. 1988; WICTORIN et al.
1992; OLSSON et al. 1997; BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Diese vielversprechenden
Ergebnisse führten dazu, dass bereits klinische Studien an Parkinson-Patienten durchgeführt
wurden, die diese Ergebnisse bestätigten (KORDOWER et al. 1995; SCHUMACHER et al.
2000). Allerdings waren diese weder verblindet noch Placebo-kontrolliert oder multizentrisch
angelegt (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Diesbezüglich wurden Bedenken geäußert,
jedoch aufgrund der langanhaltenden, positiven Effekte, die 5 bis 10 Jahre anhielten, wieder
verworfen (BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Neuere Placebo-kontrollierte Studien
konnten diese Effekte nicht reproduzieren (OLANOW et al. 2009b).
2.4.1. Zelltransplantation bei Epilepsie
Der Ersatz von Nervenzellen wäre auch für das epileptische Gehirn eine vielversprechende
Strategie (LÖSCHER et al. 2008). Auch die Neurotransplantation sollte direkt auf Hirn-
regionen beschränkt werden, die bei der Entstehung bzw. Weiterleitung von Anfällen eine
Rolle spielen. Nach TURNER und SHETTY (2003) sollte das perfekte Transplantat folgende
Eigenschaften in sich vereinen: Es sollte 1. eine Überlebensrate der transplantierten Zellen
von mindestens 20 %, 2. eine ausreichende, aber nicht übermäßige Ausbreitung und Migra-
tion der Zellen, um die geschädigten Areale zu ersetzen, 3. eine physiologische Zellent-
wicklung inklusive Regions-spezifischer Dendriten, Synapsen und intrinsischer Eigenschaften
aufweisen, 4. lokale und Regions-übergreifende axonale Verbindungen zu den Wirtszellen
Stand der Forschung
27
bilden und 5. Afferenzen der Wirtszellen aufnehmen. In den letzten Jahren wurden diverse
Transplantationsstudien in verschiedenen Epilepsiemodellen durchgeführt. In den Unter-
suchungen wurden sowohl unterschiedliche Zelltypen als auch Zielregionen im Gehirn ver-
wendet (für eine ausführliche Übersicht s. LÖSCHER et al. 2008); mehrheitlich wurde aller-
dings der Hippokampus als Zielstruktur ausgewählt.
2.4.2. Neurotransplantation in den Hippokampus
Während der Epileptogenese und der manifesten Temporallappenepilepsie finden progressive
Umstrukturierungen innerhalb des epileptischen Netzwerkes statt. Das epileptische Gehirn ist
nicht in der Lage, die funktionellen Defizite, die u.a. durch Degeneration GABAerger Inter-
neurone im Gyrus dentatus des Hippokampus entstehen, durch endogene Neubildung von
Nervenzellen auszugleichen (SHETTY u. HATTIANGADY 2007a). Obwohl seit einigen
Jahren bekannt ist, dass Neurogenese innerhalb des Gyrus dentatus auch im adulten Gehirn
verschiedener Spezies, u.a. bei Mensch und Ratte, stattfindet (KUHN et al. 1996; ERIKSSON
et al. 1998; RAO u. SHETTY 2004; CURTIS et al. 2012), ist die regenerative Kapazität bei
Epilepsie stark eingeschränkt. Bei Vorliegen einer chronischen Epilepsie findet signifikant
weniger Nervenzellentwicklung statt, dies konnte sowohl in Rattenmodellen für Temporal-
lappenepilepsie als auch in humanen Patienten belegt werden (MATHERN et al. 2002;
HATTIANGADY et al. 2004; PIRTTILÄ et al. 2005; FAHRNER et al. 2007). Die
Neurotransplantation kann hier im Sinne einer „cell replacement“-Strategie eingreifen und so
die funktionelle Reparatur der geschädigten Areale ermöglichen (TURNER u. SHETTY
2003; RAEDT et al. 2007; LÖSCHER et al. 2008). Durch Transplantation fetaler, hippokam-
paler Zellen in die CA3 des Hippokampus konnte in einem Rattenmodell für Temporal-
lappenepilepsie (TLE) die pathologisch reduzierte Anzahl an Interneuronen wieder auf das
Ausgangsniveau von Kontrolltieren ohne TLE erhöht werden, was durch den immunhistolo-
gischen Nachweis typischer Marker für GABAerge Interneurone wie Glutaminsäure-Decar-
boxylase 67 (GAD67) und Calbindin belegt wurde (SHETTY u. TURNER 2000; SHETTY u.
HATTIANGADY 2007b). Die Wiederherstellung des physiologischen Netzwerkes ist mit der
fokalen Applikation von Antiepileptika nicht möglich und stellt daher einen entscheidenden
Vorteil für die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen dar. Neben der reparierenden
Funktion kann durch die transplantateigene Sekretion von GABA analog zur fokalen
Stand der Forschung
28
Vigabatrin-Applikation eine verstärkte Hemmung innerhalb der Zielregionen erreicht werden;
elektrophysiologische Untersuchungen konnten einen Anstieg der synaptischen Inhibition
nach Transplantation belegen (ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009;
ZIPANCIC et al. 2010). Hippokampale Zellen, die aus 13 bzw. 14 Tage alten Rattenfeten
isoliert wurden, konnten nach Transplantation in das Stratum oriens nahe der CA2 des Hippo-
kampus im Kindling-Modell die Anfallsdauer reduzieren (MIYAMOTO et al. 1993). Des
Weiteren kann eine Zelltransplantation mit zeitlicher Nähe zum Epilepsie-induzierenden
Hirninsult auf die Epileptogenese Einfluss nehmen: Vier Tage nach einem durch Kainat aus-
gelösten Status epileptikus wurden hippokampale Vorläuferzellen in den Hippokampus ver-
pflanzt, die Tiere entwickelten eine zu 90 % geringere Anfallsfrequenz und um 75 % redu-
zierte Anfallsdauer gegenüber den Kontrolltieren ohne Transplantate. Ein halbes Jahr nach
der Operation waren noch 67 % der transplantierten Zellen vital, 16 % davon waren
GABAerge Interneurone. Zusätzlich zeigten die Tiere Verbesserungen in räumlichem Lernen
und Gedächtnistests (KURUBA et al. 2008; SHETTY 2011).
2.4.3. Neurotransplantation in Basalganglienregionen
Aufgrund massiver Umstrukturierungen im chronisch-epileptischen Hippokampus könnte
sich eine Transplantation in diese stark geschädigte Region als problematisch erweisen. Hin-
gegen erfahren die Basalganglien nicht derart erhebliche durch Epilepsie induzierte Um-
strukturierungen, sind aber in der Lage, die Generierung von Anfällen im limbischen System
zu modulieren. Daher sind sie möglicherweise als Zielregion für Transplantationen bei
Temporallappenepilepsie besser geeignet als der Hippokampus. Die Verwendung intakter
Hirnregionen als Zielregion wird kontrovers diskutiert, da experimentell im epileptischen
Hippokampus, besonders kurz nach einem Hirninsult, eine höhere Anzahl an transplantierten
Zellen überlebt als in den Hippokampi gesunder Versuchstiere (ZAMAN et al. 2001;
ZAMAN u. SHETTY 2002). Zudem kam es nach Transplantation neuraler Vorläuferzellen
aus einer embryonalen Zelllinie in gesunde Tiere zu Tumorbildung, ein Prozess, der bei ge-
schädigten Hippokampi nicht auftrat (CARPENTINO et al. 2008; SEBE u. BARABAN
2011). Entgegen dieser Beobachtungen konnte mit Hilfe von Transplantationen in die
Substantia nigra pars reticulata (SNr) bereits eine antikonvulsive Wirkung bestätigt werden:
Die ersten Transplantationen GABAerger Zellen in die SNr fanden in den 1990er Jahren statt.
Stand der Forschung
29
Nach Transplantation fetaler GABAerger Zellen sank die Suszeptibilität gegenüber der pro-
konvulsiven Substanz Pilokarpin (FINE et al. 1990). Diese Studie weist allerdings einige
Schwachstellen auf, da Effekte auch nach Kontrolltransplantationen mit nicht GABAergen
Zellen beobachtet wurden und keine quantitative Analyse der Überlebensrate der
Transplantate oder der Dauer des antikonvulsiven Effektes durchgeführt wurden. LÖSCHER
et al. konnten daher erstmals 1998 im Kindlingmodell zeigen, dass die Transplantation fetaler,
striataler Zellen aus 14 Tage alten Rattenfeten in die SNr zu einer transienten, signifikanten
Erhöhung der Nachentladungsschwelle und einer verminderten Anfallsschwere führt. Diese
Effekte traten mit nicht-GABAergen Zellen bzw. Zellmedium nicht auf und waren somit
spezifisch auf die Verwendung GABAerger Vorläuferzellen zurückzuführen (LÖSCHER et
al. 1998). Durch spätere Untersuchungen mit zwei verschiedenen, immortalisierten und teil-
weise zusätzlich genetisch veränderten GABAergen Zelllinien konnte bestätigt werden, dass
die bilaterale Transplantation GABAerger Zellen in die SNr in verschiedenen Anfalls-
modellen für einige Tage bis Wochen antikonvulsiv wirkt (THOMPSON u.
SUCHOMELOVA 2004; CASTILLO et al. 2006; CASTILLO et al. 2008; NOLTE et al.
2008). Bisher gibt es nur eine Studie zu Transplantationen in den subthalamischen Nukleus
(STN) in einem akuten Anfallsmodell (HANDRECK et al. 2012). Im Zuge dieser Unter-
suchung ist uns gelungen zu zeigen, dass nach Transplantation einer striatalen GABAergen
Mutterzelllinie und eines GABA-überexprimierenden Klons in den STN deutliche antikon-
vulsive Effekte im PTZ-Modell hervorgerufen werden können (HANDRECK et al. 2012).
Mit einer Effektdauer von lediglich maximal drei Wochen stellt dieser Ansatz jedoch keine
zufriedenstellende Lösung für das Problem der transienten Wirkung dar. Bemerkenswert ist
allerdings, dass sogar eine einseitige Transplantation in den STN die Anfallsschwelle signifi-
kant erhöhen konnte (HANDRECK et al. 2012). Diese aussichtsreichen Ergebnisse lassen
hoffen, dass auch die dauerhafte Suppression von Anfällen nach Auffinden der effektivsten
Zielregion möglich sein könnte.
2.4.4. Zellen für die Neurotransplantation
2.4.4.1. GABAerge Vorläuferzellen
Aus den früheren Parkinson-Studien ist bekannt, dass die Verwendung von Vorläuferzellen
gegenüber der Verwendung von adulten Neuronen bzw. Zelllinien aussichtsreicher sein
Stand der Forschung
30
könnte, da immature Precusorzellen nach Transplantation höhere Überlebensraten zeigen
(BJÖRKLUND u. LINDVALL 2000). Es ist nicht abschließend geklärt, wie lange GABAerge
Zelllinien in der Lage sind post transplantationem zu überleben und langfristig GABA freizu-
setzen (SHETTY 2011). Eine mögliche Erklärung für die in einigen Untersuchungen
beobachtete, transient antikonvulsive Wirkung könnte sein, dass die Zellen bald nach Trans-
plantation apoptotisch werden oder aus bisher nicht geklärten Gründen die GABA-Produktion
einstellen.
Bisher gibt es insgesamt wenige Studien zur Transplantation GABAerger Precursoren in die
SNr bzw. keine zur Transplantation in den STN. Zumeist wurde der Hippokampus als Ziel-
region ausgewählt. Neben den zuvor beschriebenen fetalen Zellen, die aus dem Hippokampus
selbst isoliert wurden, haben in den letzten Jahren vermehrt Transplantationen mit striatalen
Vorläuferzellen stattgefunden: Seit Ende der 90er ist bekannt, dass Zellen des ventralen Sub-
palliums des Telencephalons während der Gehirnentwicklung u.a. in den Kortex, Basal-
ganglienregionen, Hippokampus und Bulbus olfactorius wandern und dort GABAerge
Projektions- und Interneurone bilden (DE CARLOS et al. 1996; TAMAMAKI et al. 1997;
ANDERSON et al. 1997). Diese Regionen werden als mediale und laterale ganglionische
Eminenz (MGE bzw. LGE) bezeichnet (ANDERSON et al. 2001). Die Zellen der MGE
gelten als Hauptquelle kortikaler GABAerger Interneurone (LAVDAS et al. 1999; SUSSEL et
al. 1999; WICHTERLE et al. 2001). Besonders das hohe Potential zu Migration lässt
vermuten, dass sich die Zellen in geschädigten Arealen integrieren bzw. sich dort ansiedeln,
wo sie für eine Wiederherstellung des funktionellen Netzwerkes nützlich sein könnten
(ANDERSON u. BARABAN 2012). Die Zellen migrieren nach Transplantation zwischen 1
und 5 mm im Nagergehirn (WICHTERLE et al. 1999; SEBE u. BARABAN 2011). Die
Arbeitsgruppe um Scott BARABAN et al. (2009) transplantierte MGE-Vorläuferzellen in den
Kortex sehr junger Mäuse (P2) und beobachtete, dass die Zellen 60 Tage nach
Transplantation noch lebten, in dieser Zeit bis zu 3 mm migrierten und zu 69 % in GABAerge
Interneurone differenziert waren. Sie wiesen alle Charakteristika nativer Interneurone auf
(ähnliches Entladungsmuster), erhöhten die tonischen und phasischen GABA-Ströme im
Gehirn und bildeten inhibitorische Synapsen. Eine Verpflanzung dieser Zellen in genetisch-
epileptische Mäuse (Knockout eines Kalium-Kanals, Kv1.1-/-
) führte zu einer An-
fallsreduktion um 86 % (BARABAN et al. 2009). Es wurden weder eine Tumorbildung noch
Stand der Forschung
31
unerwünschte Verhaltensänderungen bei den Tieren beobachtet. In einem chemischen Modell
für akute Anfälle durch Pilokarpin konnte belegt werden, dass die signifikant antikonvulsive
Wirkung der transplantierten MGE-Zellen vergleichbar mit der Wirkung verschiedener
Antiepileptika (Valproat, Phenobarbital, Carbamazepin) war (ANDERSON u. BARABAN
2012). ZIPANCIC et al. (2011) verursachten im Mausmodell durch Ablation einer
GABAergen Subpopulation von Neuronen durch ein neurotoxisches Saporin eine verminderte
synaptische Inhibition, die nach MGE-Zelltransplantation in den anterioren und posterioren
Hippokampus wiederhergestellt werden konnte. Zudem wirkten die Zelltransplantate antikon-
vulsiv nach intraperitonealer Applikation von PTZ. Ein Jahr nach Transplantation konnten
noch 20 % vitale Zellen nachgewiesen werden (ZIPANCIC et al. 2010).
Auch in Rattenmodellen wurden MGE-Vorläuferzellen erfolgreich transplantiert und zeigten
eine funktionelle Integration und erhöhte Inhibition (HATTIANGADY et al. 2011). Die
Gruppe um Ashok Shetty hat in einem chronischen Epilepsiemodell verschiedene neuronale
Precursorzellen aus Rattenfeten in die CA3 des Hippokampus adulter Ratten transplantiert.
Zunächst verwendete die Gruppe LGE-Vorläuferzellen. Diese werden hauptsächlich zu
Projektionsneuronen u.a. des Striatums und Bulbus olfactorius (WICHTERLE et al. 2001).
Aus LGE-Vorläuferzellen differenzierten sich nach Transplantation in die hippkampale CA3
zu einem hohen Prozentsatz GABAerge Neurone (69 %), was sie neben den MGE-generierten
Zellen ebenfalls interessant für unsere Transplantationsversuche macht (HATTIANGADY et
al. 2008). Durch den Zusatz eines Wachstumsfaktors („Fibroblast-Growth-Factor 2“, FGF-2)
und eines Apoptosehemmers (Caspase-1-Inhibitor) in-vitro konnte ein langanhaltender
antikonvulsiver Effekt nach Transplantation der LGE-Zellen erzielt werden
(HATTIANGADY et al. 2008). So vorbehandelte Zellen wurden 4 Tage nach einem Status
epileptikus in die CA3 des Hippokampus transplantiert. In einer Gruppe von Tieren konnte
noch 9 bzw. 12 Monate nach Operation eine Anfallsreduktion von 67 % bzw. 89 % im
Vergleich zu Kontrolltieren, die ebenfalls einen Status epileptikus, aber keine
Zelltransplantation erfahren hatten, nachgewiesen werden. 33 % der Zellen hatten langfristig
im Gehirn überlebt (HATTIANGADY et al. 2008).
Des Weiteren verwendete auch die Arbeitsgruppe Shetty die zuvor genannten MGE-
Vorläuferzellen. Anstelle der Verwendung frisch gewonnener MGE-Vorläufer wurden diese
zunächst in-vitro als neurale Stammzellen („neural stem cells“, NSC) unter Zusatz bestimmter
Stand der Forschung
32
Proliferationsfaktoren als sogenannte Neurosphären kultiviert (WALDAU et al. 2010). Über
einen Zeitraum von drei Monaten konnte in chronisch epileptischen Tieren nach
Transplantation eine Reduktion der Anfallsfrequenz (43 %) und -dauer (51 %) beobachtet
werden. Mit 10 % der transplantierten MGE-NSCs machten auch hier die GABAergen Zellen
den größten Anteil der Neurone aus, allerdings ließen sich etwa 50 % der Zellen als
Astrozyten klassifizieren und waren positiv für den „Glial-derived neurotrophic factor“
(GDNF). GDNF ist im epileptischen Gewebe signifikant weniger vorhanden (WALDAU et
al. 2010) und besitzt selbst antikonvulsive Eigenschaften (KANTER-SCHLIFKE et al. 2007),
so dass ein Vorteil in der Verwendung von MGE-Stammzellen demzufolge darin liegt, dass
sie neben GABAergen Interneuronen auch GDNF-positive Astrozyten hervorbringen
(HATTIANGADY et al. 2007). Stammzellen sind ideale Transplantate insofern, dass sie sich
vergleichsweise einfach in-vitro expandieren lassen und somit beinahe unlimitiert vorliegen
(SHETTY u. HATTIANGADY 2007a).
Erste klinische Transplantationsstudien mit Vorläuferzellen bei epileptischen Menschen wur-
den unter Verwendung fetaler, porciner Zellen durchgeführt, was trotz vielversprechender,
antikonvulsiver Effekte aufgrund einer erhöhten Infektionsgefahr mit Retroviren des
Schweines zunächst nicht weiter verfolgt wurde (SCHACHTER et al. 1998). Durch die
immensen Fortschritte in der Stammzellforschung, wie etwa die kürzlich mit dem Nobelpreis
ausgezeichnete Induktion pluripotenter Stammzellen aus adulten körpereigenen Zellen
(GURDON 1962; TAKAHASHI u. YAMANAKA 2006), wird möglicherweise sogar eine
autologe Neurotransplantation eine zukunftsnahe Option für einen translationalen Ansatz in
der Tier- und Humanmedizin. Offen bleibt, ob die beschriebenen, langfristigen Effekte sich
auf andere Zielregionen wie die Basalganglien übertragen lassen.
2.4.4.2. NT2-Zellen
Vergleichend zur Transplantation hauptsächlich GABAerger Zellen wurden außerdem einer-
seits humane NT2-Vorläuferzellen und andererseits adulte NT2-Neuronen transplantiert, die
eine Mischkultur darstellen und somit neben GABA auch noch andere Neurotransmitter
sekretieren. Bei NT2-Zellen handelt es sich um eine humane Teratokarzinom-Zelllinie, die
1984 aus einem Hodentumor isoliert wurde (ANDREWS et al. 1984). Die Zellen können mit-
hilfe bestimmter Zusätze innerhalb von etwa 7 Wochen in adulte Neurone differenziert wer-
Stand der Forschung
33
den (ANDREWS et al. 1984; ANDREWS 1984; LEE u. ANDREWS 1986; PLEASURE et al.
1992). Differenzierte Neurone gleichen nativen Neuronen in ihrer Morphologie, der Expres-
sion neuronaler Marker, ihrer Fähigkeit funktionelle Synapsen auszubilden und ihrer Sekre-
tion und Antwort auf Neurotransmitter (PLEASURE et al. 1992; MUNIR et al. 1995;
PAQUET-DURAND u. BICKER 2007). Von der Arbeitsgruppe um Professor Bicker konnte
ein Differenzierungsprotokoll erarbeitet werden, mit dem sowohl die Kultur von NT2-Zellen
in einem Vorläuferstadium, als sogenannte “spherical aggregates”, analog der oben beschrie-
benen Neurosphären-Kultur durchgeführt werden kann, als auch die Generierung postmito-
tischer Neurone in kürzerer Zeit (4 Wochen) (PAQUET-DURAND et al. 2003). Adulte NT2-
Neurone stellen eine heterogene Population dar, die verschiedene Neurotransmitter wie
GABA, Glutamat, Dopamin, Acetylcholin und Serotonin sezernieren kann (ZELLER u.
STRAUSS 1995; YOSHIOKA et al. 1997; FISCHER et al. 2000; GUILLEMAIN et al. 2000;
IACOVITTI et al. 2001). Im Anschluss an die Differenzierung mit dem von der Arbeits-
gruppe Bicker entwickelten Protokoll sind die NT2-Neurone zu etwa 40 % glutamaterg, zu
35 % cholinerg, zu 15 % GABAerg und zu 2 % serotonerg (PODRYGAJLO et al. 2009). Die
Kulturen enthalten weniger als 5 % Kontamination mit undifferenzierten, aber postmito-
tischen Zellen (PODRYGAJLO et al. 2009). Mit den adulten Neuronen wurden bereits zahl-
reiche Transplantationsstudien in Krankheitsmodellen für Parkinson, amyotrophe Lateral-
sklerose, Hirntraumata und Schlaganfall durchgeführt: Es konnte in Sicherheits- und Mach-
barkeitsstudien gezeigt werden, dass die Zellen sich erfolgreich experimentell im Nagerhirn
und in klinischen Studien im humanen Gehirn integrieren; in keiner der Studien sind bisher
Tumore ausgehend von den transplantierten Zellen aufgetreten (TROJANOWSKI et al. 1993;
KLEPPNER et al. 1995; GARBUZOVA-DAVIS et al. 2002; SAPORTA et al. 2002;
RAVINDRAN u. RAO 2006; KONDZIOLKA et al. 2005; ZHANG et al. 2005). Die genann-
ten Charakteristika belegen daher den großen Wert der NT2-Modellneurone für experimen-
telle und klinische Forschung. NT2-Zellen könnten eine stets verfügbare Quelle an Neuronen
für Transplantationen darstellen (PAQUET-DURAND u. BICKER 2007). In-vitro ist es
gelungen, durch Zusatz spezifischer Wachstumsfaktoren oder Ko-Kulturen mit anderen Zel-
len bestimmte Subtypen, wie etwa vermehrt dopaminerge oder cholinerge Neurone zu gene-
rieren (IACOVITTI et al. 2001; SCHWARTZ et al. 2005; LUO et al. 2006; ZELLER u.
STRAUSS 1995). Hervorzuheben ist, dass besonders der Vergleich der GABAergen
Stand der Forschung
34
Vorläuferzellen mit den NT2-Vorläufern interessant ist, da gezeigt werden konnte, dass das
Wirtsmilieu entscheidend für die terminale Differenzierung der NT2-Vorläufer ist
(MIYAZONO et al. 1996; SAPORTA et al. 2000).
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
35
3. ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN
Trotz intensiver Forschung und Entwicklung in den letzten 25 Jahren gibt es kaum einen Fort-
schritt in der Therapie von Epilepsiepatienten (LÖSCHER u. SCHMIDT 2011). Mit Aus-
nahme des Auftretens schwerer Nebenwirkungen unter systemischer Medikation mit Anti-
epileptika stellt die Pharmakoresistenz, die bei etwa einem Drittel der Patienten auftritt, das
dringend zu überwindende Hindernis einer erfolgreichen Behandlung dar (LÖSCHER u.
SCHMIDT 2011). Eine alternative therapeutische Strategie ist die fokale, gerichtete Therapie.
Hierbei werden Substanzen oder Transplantate direkt in das Gehirn appliziert. Systemische
Nebenwirkungen werden so auf ein Minimum reduziert und die Substanzwirkung auf die
Hirnregionen beschränkt, die bei der Anfallsentstehung, -weiterleitung und -modulation eine
tragende Rolle spielen. Neben dem epileptischen Fokus selbst sind dies vor allem die Basal-
ganglien (GALE 1988; GALE et al. 2008).
In Modellen für experimentelle Epilepsie konnte wiederholt gezeigt werden, dass sich durch
eine Inhibition der SNr, eine der Hauptausgangstrukturen der Basalganglien, unterschiedliche
Anfallstypen modulieren und unterdrücken lassen (GALE et al. 2008). Sie gilt als interessante
Zielstruktur für eine fokale Therapie. Andere Basalganglienregionen sind weniger gut unter-
sucht, wie beispielsweise der STN.
Ziel dieser Arbeit war es, vergleichend verschiedene Basalganglienregionen hinsichtlich ihrer
Eignung für fokale therapeutische Manipulationen zu untersuchen. Außerdem sollte überprüft
werden, ob eine selektive Manipulation des GABAergen Systems mittels geeigneter
Substanzapplikation oder neuronaler Transplantation als therapeutische Intervention effektiv
ist. Beiden Studien, der fokalen Substanzapplikation und der Neurotransplantation ist gemein,
dass durch die vermehrte Freisetzung von GABA oder die Hemmung der Glutamat-Freiset-
zung das bei Epilepsie bestehende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender
Neurotransmission ausgeglichen werden soll. In beiden Studien wurde eine selektiv auf das
GABAerge System wirkende therapeutische Intervention mit einer weniger spezifischen ver-
glichen.
3.1. Studie I: Fokale Substanzapplikation
In Studie Ia sollte evaluiert werden, ob die fokale, gerichtete Applikation von Vigabatrin der
systemischen in ihrer antikonvulsiven Wirksamkeit und in Bezug auf das Auftreten uner-
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
36
wünschter Nebenwirkungen überlegen ist. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob die Hem-
mung des indirekten Pfades (Untersuchungen des STN) des epileptischen Netzwerkes
ähnliche antikonvulsive Effekte aufweist wie die direkte Hemmung der SNr, und wie spezi-
fisch diese Effekte für einzelne Hirnregionen sind. Vergleichend hierzu haben wir in Studie
IIb fokusnah Botulinumtoxin injiziert, welches durch die Hemmung der Ausschüttung ver-
schiedener Neurotransmitter, u.a. Glutamat, weniger selektiv als Vigabatrin wirkt.
Die Arbeitshypothesen lauteten:
1. Mit fokaler Substanzapplikation in die Basalganglien können ähnlich
antikonvulsive Effekte erreicht werden wie mit der systemischen Gabe von
Vigabatrin, jedoch ohne die in der Literatur beschriebenen Nebenwirkungen.
2. Eine Hemmung des STN durch Vigabatrin führt zu antikonvulsiven Effekten.
3. Antikonvulsive Wirkungen sind spezifisch für die untersuchten Hirnregionen.
4. Botulinumtoxin wirkt nach intrahippokampaler Applikation langfristig
antikonvulsiv.
3.2. Studie II: Neurotransplantation
Ziel der Transplantation neuronaler Vorläuferzellen in die Basalganglien (Studie IIa) war es
zu untersuchen, ob die Zellen die Transplantation langfristig überleben, ob sie einen antikon-
vulsiven Effekt ausüben, und ob sie sich funktionell in das Netzwerk integrieren. Wir haben
neuronale GABAerge Vorläuferzellen aus der Ratte transplantiert, die in einem chronischen
Epilepsiemodell nach Transplantation in den Hippokampus bereits langanhaltende, antikon-
vulsive Effekte hervorrufen konnten (HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010).
Als Vergleich diente hier die Transplantation von humanen NT2-Vorläuferzellen und adulten
NT2-Neuronen (Studie IIb), die eine Mischkultur darstellen und somit neben GABA auch
noch andere Neurotransmitter sekretieren (PODRYGAJLO et al. 2009).
Meine Arbeitshypothesen lauteten:
1. Die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen in Regionen der Basalganglien
führt zu lang anhaltenden, antikonvulsiven Effekten im PTZ-Modell.
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
37
2. Die Vorläuferzellen überleben eine Transplantation langfristig und
differenzieren hauptsächlich in GABAerge Neurone.
3. Bei der Verwendung von Vorläuferzellen aus der Ratte gibt es nach
Transplantation in die Basalganglien keine Tumorbildung oder
Verhaltensauffälligkeiten.
4. Die Verwendung hauptsächlich GABAerger Vorläuferzellen ist wirksamer als die
Verwendung von neuronalen Mischkulturen.
Aus den bisher durchgeführten Arbeiten zur fokalen Therapie ergaben sich einige Fragestel-
lungen, die ich in meiner Arbeit untersuchen wollte:
1. Bislang konnte nicht geklärt werden, ob eine gerichtete, intrazerebrale Therapie einer
systemischen Administration von Antiepileptika überlegen ist.
2. Zudem wurden nicht direkt verschiedene Regionen innerhalb der Basalganglien, oder
sogar verschiedene Subregionen innerhalb einer Hirnregion wie im Falle der
Substantia nigra pars reticulata, als therapeutische Targets miteinander verglichen.
3. Der subthalamische Nukleus wurde bisher kaum für fokale Therapieansätze bei
Epilepsie untersucht, dabei sind neurochirurgische Verfahren zur Zugänglichkeit und
therapeutischen Manipulation in Form einer elektrischen Stimulation des STN bereits
klinisch etabliert (CHABARDES et al. 2002).
4. In bisherigen Transplantationsversuchen in die Basalganglienregionen konnte
lediglich ein transienter antikonvulsiver Effekt festgestellt werden (LÖSCHER et al.
2008). Unter Zusatz von Wachstumsfaktoren und Apoptosehemmern ist es allerdings
gelungen, den antikonvulsiven Effekt von neuronalen Precursorzellen zu verlängern,
die fokusnah in den Hippokampus transplantiert wurden (RAO et al. 2007). Zu
untersuchen, ob diese Wirksamkeitsverlängerung auch in Hirnregionen mit weniger
degenerativen Prozessen nötig und effektiv ist, sollte ein Ziel meiner Arbeit sein.
5. Weitere Fragestellungen ergaben sich aus der Beobachtung des erhöhten Risikos für
Entzündungs- und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen gegenüber fokaler
Substanzadministration (NOLTE et al. 2008). Die Lösung dieses Problems ist vor
einer klinischen Anwendung unumgänglich. Mögliche Ansätze zur Abklärung
beinhalten neben der Verwendung allogener Transplantate eine immunhistochemische
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
38
Markierung der Zellen, um nach Transplantation evaluieren zu können, wie viele
Zellen in welcher Region überlebt haben.
Die Ergebnisse unserer ersten Transplantation führten dazu (s. Abschnitt 5.5.3), dass in einer
Nachfolgestudie untersucht werden sollte, ob eine Vorbehandlung der Zellen aus der MGE in-
vitro zu einer vermehrten Differenzierung in GABAerge Neurone führen könnte. Trotz des
vermehrten Einsatzes von Stamm- oder Vorläuferzellen in experimentellen Modellen für neu-
rodegenerative Erkrankungen wird deren Einsatz durch geringe Überlebensraten nach Trans-
plantation, sowie durch unzureichende Differenzierung in die gewünschten neuronalen Phä-
notypen limitiert (vgl. BOSCH et al. 2004). In der Vergangenheit wurden bereits einige
Substanzen für die Differenzierung von Vorläuferzellen in den GABAergen Phänotyp unter-
sucht. Die Beeinflussung der Differenzierung der Stammzellen könnte den Ausgang von
Transplantationsstudien verbessern (ANDRES et al. 2005). In unserer in-vitro Studie wurden
mehrere Vorbehandlungsprotokolle (s. Abschnitt 4.5.6) aus der Literatur zur Induktion des
GABAergen Phänotyps miteinander verglichen.
Die Arbeitshypothesen lauteten:
1. Eine Vorbehandlung führt in-vitro zu einer vermehrten Induktion des
GABAergen Phänotyps.
2. Eine Transplantation dieser vorbehandelten Zellen führt aufgrund der erhöhten
Zahl an GABAergen Neuronen zu antikonvulsiven Effekten.
Material und Methoden
39
4. MATERIAL UND METHODEN
Hinweis:
Dieser Arbeit angehängt sind eine Auflistung verwendeter Substanzen und Geräte sowie de-
ren Bezugsquellen, die Herstellungsprotokolle verwendeter Lösungen und die Protokolle
verwendeter Färbungen, soweit diese nicht bereits im Text genauer erläutert werden.
Soweit die verwendeten Materialien und Methoden in beiden Studien übereinstimmen, wer-
den sie gemeinsam beschrieben; Unterschiede werden im Text erläutert.
4.1. Tiere
Alle beschriebenen Tierversuche wurden randomisiert und verblindet durchgeführt. Für die
im Folgenden beschriebenen Studien wurden weibliche Wistar-Ratten der Versuchstierzucht
Harlan (Horst, Niederlande) verwendet. Bei Versuchsbeginn hatten die Tiere ein Gewicht von
200-220 g. Die Verwendung weiblicher Tiere sollte helfen, einen Vergleich zu früheren Stu-
dien zur Manipulation des GABAergen Systems der Arbeitsgruppe herstellen zu können (e.g.,
LÖSCHER u. FREY 1987; LÖSCHER et al. 1989a; LÖSCHER u. HÖRSTERMANN 1994;
GERNERT u. LÖSCHER 2001; SCHWABE et al. 2004a). Die Ratten wurden in 5er Gruppen
in Makrolonkäfigen Typ IV (Ebeco, Castrop-Rauxel) mit einer Einstreu aus Weichholz-
granulat unter standardisierten Umweltbedingungen (Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden,
Hellphase von 6-18 Uhr MEZ, bei einer Umgebungstemperatur von 22-24°C und einer Luft-
feuchtigkeit von 50-60 %) gehalten. Die Ratten erhielten eine Standardnagerdiät (Altromin
1324 Standardnahrung) und Leitungswasser ad libitum. Einmal in der Woche fand eine
Erneuerung des Futters und zweimal eine Erneuerung bzw. ein Auffüllen des Wassers statt.
Einmal wöchentlich wurden die Ratten in Käfige mit frischer Einstreu umgesetzt. An diesen
Tagen fanden keine Experimente statt oder das Umsetzen der Tiere erfolgte erst nach Ab-
schluss des jeweiligen Experimentes, um eine Beeinflussung der Tiere zu vermeiden. Zutritt
zum Tierstall hatten ausschließlich Experimentatoren und Tierpfleger. In dem Raum befanden
sich zu keiner Zeit männliche Tiere, um eine Synchronisierung des Zyklus der Tiere zu ver-
hindern. Eine kürzlich veröffentlichte Studie der Arbeitsgruppe konnte belegen, dass
weibliche Tiere ohne männliche Tiere nicht synchron ovulieren oder sogar gar keine Zyklus-
aktivität aufweisen (KÜCKER et al. 2010).
Material und Methoden
40
Nach Ankunft der Tiere vom Labortierzüchter hatten die Tiere mindestens eine einwöchige
Akklimatisierungsphase, in der keine Versuche stattfanden. Während dieser Zeit wurden die
Tiere allerdings 2-3 Mal gehändelt, das heißt, sie wurden an das Labor, die Experimentatoren
und allgemeine Prozeduren wie das Wiegen, Hochheben, Fixierung für Injektionen usw. ge-
wöhnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Tiere mit einer farbigen Schwanzmarkierung für die
spätere Identifikation versehen. Vor Beginn eines Experimentes wurden die Tiernummern der
Behandlungs- bzw. Kontrollgruppe zugelost. Alle Experimente wurden in Einklang mit der
Richtlinie der Europäischen Gemeinschaft 86/609/EEC durchgeführt und von dem Tier-
schutzbeauftragten der Stiftung Tierärztliche Hochschule begutachtet. Die Nummer der Tier-
versuchsgenehmigung lautet 09/1769.
Die Studie Ib, zur fokalen, intrahippokampalen Applikation von Botulinumtoxin B fand im
Rahmen eines Forschungsstipendiums in der Abteilung für Neurologie der University of
California Davis, Sacramento, Kalifornien, USA, unter der Leitung von Professor Dr. Michael
Rogawski statt. Um Studienergebnisse mit Daten zur antikonvulsiven Wirkung von Botuli-
numtoxinen aus vergleichbaren Studien der Arbeitsgruppe Rogawski vergleichen zu können,
wurden männliche Spraque-Dawley Ratten für diese Versuche verwendet. 35 Tiere wurden
von den Taconic Farms (Germantown, NY) bezogen und hatten bei Ankunft ein Gewicht von
200-225 g. Die Haltung der Tiere erfolgte im universitätseigenen Vivarium, Zutritt hatten nur
Experimentatoren und Tierpfleger. Der Stall wurde von der „Association for Assessment and
Accreditation of Laboratory Animal Care” abgenommen. Die Tiere wurden in 2er Gruppen
gehalten, es sei denn, im Laufe des Versuches fand die permanente Implantation von
Führungsrohren und Ableitelektroden statt; für diesen Fall wurden die Tiere nach Operation
individuell gehalten. Im Tierstall herrschten kontrollierte Umweltbedingungen (22-26 °C, 40-
50 % Luftfeuchte) und ein 12 h Hell-Dunkel-Zyklus. Als Einstreu dienten Holzspäne. Die
Durchführung der Experimente beschränkte sich auf die Vormittage (zwischen 9 und 12 Uhr).
Vor Versuchsbeginn wurden die Tiere regelmäßig gehändelt und am Tag des Experiments
eine halbe Stunde vor Beginn in den Versuchsraum verbracht, um eine Akklimatisierungs-
phase zu gewährleisten. Alle Studien wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom
„Institutional Animal Care and Use Committee” (IACUC) in Übereinstimmung mit den
Richtlinien für die Pflege und Gebrauch von Labortieren des National Research Council (Na-
Material und Methoden
41
tional Academy Press, Washington, DC; http://www.nap.edu/readingroom/books/labrats/)
begutachtet wurden.
4.2. Akutes Anfallsmodell
In beiden Studien wurde das gleiche Anfallsmodell verwendet, um die Ergebnisse der Studien
vergleichen zu können. Es handelt sich hierbei um ein akutes Anfallsmodell, den intravenösen
Pentylentetrazol-Anfallsschwellentest, kurz PTZ-Test. Bei diesem Modell wird mithilfe der
prokonvulsiv wirkenden Substanz Pentylentetrazol ein generalisierter, klonischer Anfall aus-
gelöst. Pentylentetrazol bindet an der Picrotoxin-Bindungsstelle der α-Untereinheit des
GABAA-Rezeptors (RAMANJANEYULU u. TICKU 1984; HUANG et al. 2001) und wirkt
als GABAA-Rezeptor-Antagonist: In hohen Dosen verhindert die Bindung von PTZ eine post-
synaptische Hyperpolarisation der Zelle durch GABA und agiert damit prokonvulsiv
(MACDONALD u. BARKER 1977; LÖSCHER 2009a).
Der PTZ-Test wird in der pharmazeutischen Industrie als schnelle und sehr sensitive
Screening-Methode verwendet, um das antikonvulsive oder prokonvulsive Potential be-
stimmter Substanzen in der Wirkstoffentwicklung zu testen (LÖSCHER 2011). Durch die
intravenöse Administration von PTZ werden epileptische Anfälle akut unter der Infusion aus-
gelöst, d.h. die Versuchstiere zeigen keine spontanen Anfälle und keine pathologischen Ver-
änderungen des Gehirns (LÖSCHER 1999). Es konnte gezeigt werden, dass Vigabatrin durch
die Erhöhung der GABAergen Inhibition die PTZ-Anfallsschwelle dosisabhängig erhöht;
dieser Test reagiert sehr sensitiv auf Manipulationen des GABAergen Systems (LÖSCHER
1980; LÖSCHER 1982). Dieser Test kann mit einem Abstand von mindestens 48 Stunden
wiederholt in demselben Tier durchgeführt werden, ohne dass die vorangegangene
Schwellenbestimmung einen Einfluss auf die folgende Messung ausübt (POLLACK u. SHEN
1985). Dieses Vorgehen erlaubt, eine individuelle Anfallsschwelle für jedes naive Tier bei
Versuchsbeginn zu ermitteln, die im Folgenden als Basisschwelle benannt wird. So wird er-
möglicht, für jedes Tier eine eventuelle Schwellenerhöhung nach Substanzapplikation bzw.
Zelltransplantation in Relation zur individuellen Basisschwelle zu setzen (LÖSCHER 2009a).
In dieser Arbeit ist die maximale Anzahl an Schwellen pro Tier auf 6 limitiert, in dieser Zeit
konnten wir keinen Kindling-Effekt feststellen, das heißt, die wiederholten Anfalls-
schwellentests führten nicht zu einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber PTZ. In unserer Ar-
Material und Methoden
42
beitsgruppe konnte kürzlich gezeigt werden, dass wiederholtes Testen von bis zu 8 PTZ-An-
fallsschwellen nicht zum Aufkindeln der Tiere führt (BANKSTAHL et al. 2012).
4.2.1. Ablauf des PTZ-Tests
Die Tiere wurden mindestens eine
halbe Stunde vor Versuchsbeginn in
den Versuchsraum gebracht und aus
ihren Käfigen in das Open-Field um-
gesetzt. Nach dieser Eingewöhnungs-
phase begann der Versuch. Die intra-
venöse Infusion von PTZ erfolgte in
eine der lateralen Schwanzvenen des
Tieres mit einer Flussrate von
1 ml/min und einer Konzentration
von 0,8 % PTZ in isotoner Natriumchloridlösung (NaCl, s. Abb. 3). Dafür wurde eine 24 G
Injektionskanüle in die vorher durch warmes Wasser dilatierte Vene eingeführt und mittels
Klebeband fixiert. Die Kanüle war über einen Polyethylenschlauch (Kleinfeld Labortechnik,
Gehrden, Deutschland) mit einer Infusionspumpe (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus,
Holliston, Massachusetts) verbunden. Das Tier wurde dann in einen Makrolonkäfig Typ III
verbracht und konnte sich innerhalb des Käfigs frei bewegen, während gleichzeitig die Infu-
sion und die Stoppuhr gestartet wurden. Sobald das Tier einen klonischen Anfall erfuhr,
beendeten wir die Infusion und entfernten die Kanüle. Mithilfe der Infusionsparameter, des
Körpergewichtes der Ratte und der gemessenen Zeit konnte die PTZ-Dosis in mg/kg ermittelt
werden, die für das Auslösen des Klonus erforderlich war. Des Weiteren haben wir die Dosis
bis zum Auftreten eines Myoklonus ermittelt. Der Myoklonus ist die erste sichtbare Muskel-
zuckung, die dem klonischen Anfall immer vorausging. Dieser Zeitpunkt wurde ebenfalls
untersucht, da in früheren Studien gezeigt werden konnte, dass verschiedene Substanzen
einen unterschiedlichen Einfluss auf die beiden untersuchten Anfallstypen, Myoklonus und
Klonus, haben können (LÖSCHER et al. 1991; LÖSCHER 2009a). Außerdem wurden alle
auffälligen Verhaltensweisen und das Auftreten weiterer Anfallstypen nach Ende der PTZ-
Infusion notiert, bis die Tiere wieder normales Verhalten zeigten.
Abb. 3 Aufbau des Pentylentetrazol-Anfallsschwellentests.
LÖSCHER 2009a.
Material und Methoden
43
Die Schwellenbestimmungen fanden alle zur gleichen Tageszeit, meistens morgens zwischen
9 und 11 Uhr statt. Alle Tiere wurden zu Beginn jeder Schwellenbestimmung gewogen. Der
Versuch wurde in der Botulinumtoxinstudie analog durchgeführt, es unterschieden sich nur
die verwendeten Gerätschaften (s. Abschnitt 10.1).
4.2.2. Vorabstudie: Einfluss unterschiedlicher Anästhetika auf die Anfalls-
schwelle
Vor Beginn der Hauptversuche führten wir eine Vorabstudie zur Wirkung der von uns ver-
wendeten Anästhetika durch, um narkosebedingte antikonvulsive Effekte auf die Anfalls-
schwellen ausschließen zu können. Hierzu wurde in 7 Tieren eine Basisschwelle bestimmt
und dann in einer Gruppe von 3 Tieren eine Anästhesie mit Xylazin (2 mg/kg i.p., Riemser)
und Ketamin (60 mg/kg i.p., medistar) und in 4 anderen Tieren eine Inhalationsnarkose mit
Isofluran (CP-Pharma, Induktion 3 %, Erhaltung 1,5 %, Sauerstoffzufuhr 1 l/min) durchge-
führt. Die Narkose wurde für die Dauer aufrechterhalten, die für die Mikroinjektion einer
Substanz bzw. die Transplantation von Zellen erfahrungsgemäß nötig gewesen wäre, i.d.R.
dauerten diese Art von Operationen zwischen 45 und 60 Minuten. Sechs Stunden nach der
simulierten Behandlung (Mikroinjektion bzw. Transplantation) fand erneut eine Anfalls-
schwellenbestimmung mithilfe des PTZ-Tests statt. Die Dosis für die Auslösung des Myo-
klonus und Klonus wurde für beide Narkoseregimes mit der Basisschwelle verglichen (s.
Abb. 4).
Abb. 4 Studiendesign der Vorabstudie zu anästhesiebedingten Veränderungen der PTZ-Anfallsschwelle.
4.2.3. Einfluss des Zyklusstadiums auf die PTZ-Anfallsschwelle
In einem Teil der weiblichen Tiere erfolgte zusätzlich die Entnahme eines Vaginalabstrichs,
um eventuelle zyklusbedingte Effekte auf die Anfallsschwelle ermitteln zu können. Die Ab-
Material und Methoden
44
striche wurden auf Objektträgern ausgestrichen und nach Fixierung mit Shorr’s Färbelösung
gefärbt und unter einem Lichtmikroskop untersucht (EVERETT 1989). Neben den Phasen
Proöstrus, Östrus, Metöstrus und Diöstrus konnten auch Zwischenphasen beobachtet werden
(s. Abschnitt 5.2). Es wurde evaluiert, ob der Zyklusstand der Tiere einen Einfluss auf die
Anfallsschwelle hat.
4.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin
4.3.1. PTZ-Anfallsschwellen
Für Studie I, den Vergleich systemischer und fokaler Substanzapplikation, wurden in den
meisten Fällen nur 2 Anfallsschwellen, eine Basisschwelle und eine Schwelle nach Viga-
batrin-Injektion bestimmt, so dass nicht jedes Tier zu jedem Zeitpunkt getestet wurde. Zeit-
punkte für die Anfallsschwellenbestimmungen lagen bei 2, 6, 24, 48, 96 und 144 h post
Substanzapplikation (s. Abb. 5). Diese Zeitpunkte wurden aufgrund von Daten aus der Lite-
ratur zur antikonvulsiven Wirkung von Vigabatrin gewählt (JUNG et al. 1977; GALE u.
IADAROLA 1980; LÖSCHER 1980; LE GAL LA SALLE et al. 1983; MCNAMARA et al.
1984; SHIN et al. 1986; LÖSCHER u. FREY 1987; VELÍŠKOVÁ et al. 1996a; SCHWABE
et al. 2004a; SCHWABE et al. 2004b).
Abb. 5 Studiendesign für systemische und fokale Administration von Vigabatrin im PTZ-
Anfallsschwellenmodell. Nicht jedes Tier wurde zu jedem Zeitpunkt getestet, es lagen mindestens 48 Stunden
zwischen den einzelnen Schwellenbestimmungen.
Material und Methoden
45
4.3.2. Systemische Administration von Vigabatrin
Etwa 3-4 Tage vor Vigabatrin-Administration wurde die PTZ-Basisschwelle bestimmt und
der PTZ-Test zu verschiedenen Zeitpunkten nach Vigabatrin-Behandlung wiederholt (s. Ab-
schnitt 4.2).
Vigabatrin wurde freundlicherweise von Merrell (Merrell International Research Center,
Strasbourg, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Für die systemische Administration von
Vigabatrin testeten wir zwei unterschiedliche Dosierungen, die sich aus früheren Studien
ergaben (GALE u. IADAROLA 1980; LÖSCHER 1982; SHIN et al. 1986; LÖSCHER u.
FREY 1987). Bei 15 Tieren erfolgte eine intraperitoneale Injektion mit der Dosis 600 mg/kg,
bei einem Injektionsvolumen von 3 ml/kg. Bei 6 Tieren verabreichten wir die doppelte Dosis
(1200 mg/kg) ebenso i.p. in einem Injektionsvolumen von 3 ml/kg. Bei den Tieren wurde 2,
24, 32 und 56 h nach Vigabatrin-Administration die rektale Körpertemperatur ermittelt und
bei einem deutlichen Temperaturverlust wurden die Käfige über Nacht unter einer Wärme-
lampe platziert. Bei allen Tieren fand eine tägliche Bestimmung des Körpergewichts statt. Als
Kontrolle diente der Gewichtsverlauf bei 18 gleich alten Ratten. Die Tiere wurden täglich
beim Wiegen beobachtet und Verhaltensauffälligkeiten notiert.
4.3.3. Fokale Applikation von Vigabatrin
Die Mikroinjektion von Vigabatrin respektive NaCl im PTZ-Modell wurde insgesamt an 215
Tieren durchgeführt, davon mussten 4 Tiere aufgrund unklarer Lokalisation der Mikroinjek-
tion ausgeschlossen werden, so dass 211 Tiere für die finale Auswertung blieben (s. Abschnitt
5.3.1.1). Die Zuordnung der Ratten zu der Behandlungsgruppe mit Vigabatrin oder der
Kontrollgruppe mit isotoner Natriumchloridlösung (NaCl) erfolgte randomisiert. Der Experi-
mentator war verblindet gegenüber der Zugehörigkeit des Tieres zur Behandlungs- oder Kon-
trollgruppe. Aufgrund der Ergebnisse der Vorabstudie zur Wahl des Anästhetikums haben wir
uns für die Verwendung eines Inhalationsanästhetikums, Isofluran (Cp-pharma, Burgdorf,
Deutschland), entschieden (s. Abschnitt 4.2.2). Für die Mikroinjektion wurden die Tiere mit-
hilfe einer selbstgebauten Atemmaske mit einer Induktionskonzentration von 3 % Isofluran
narkotisiert. Das Fell im Operationsfeld wurde mit einer Schere entfernt und die Tiere wurden
in den stereotaktischen Apparat (Kopf bzw. Stölting) eingespannt. Der stereotaktische
Apparat diente der Fixierung des Schädels; für diesen Zweck wurden Ohrstifte beidseits in
Material und Methoden
46
den Gehörgang eingeführt und die oberen Schneidezähne der Ratte in eine Oberkieferhalte-
rung eingebracht. Andererseits hat der Stereotakt drei Raumachsen, mit deren Hilfe sehr prä-
zise bestimmte Koordinaten im Operationsfeld angefahren werden können. Der stereotak-
tische Atlas von PAXINOS und WATSON (2007) diente zur Bestimmung der Koordinaten
für die Trepanation der Schädeldecke und die Mikroinjektion von Vigabatrin in die SNr oder
den STN (s. Abb. 6 und Tab. 1).
Abb. 6 Querschnitte des Rattengehirns auf der Ebene des STN respektive der anterioren SNr und
Vergrößerung dieser Teilbereiche des Gehirns. Modifiziert nach NOLTE 2005.
Zusätzlich wurde in einer Gruppe von 10 Tieren in das anterior des Globus pallidus gelegene
dorsale, zentrale Striatum injiziert. Um ein genaues Anfahren der Koordinaten zu ermög-
lichen, wurden zwei Kreuzungspunkte der Schädelnähte als Bezugspunkte in einer Ebene
ausgerichtet, indem die Oberkieferhalterung des Stereotakten auf 3,3 mm ventral der Inter-
aurallinie eingestellt wurde. Entsprechend der Darstellung in einem Atlas des Rattengehirns
mit Koordinaten für spezifische Hirnregionen (PAXINOS u. WATSON 2007) liegen so die
beiden Knochennähte auf einer Ebene. Es handelt sich dabei um den rostralen Kreuzungs-
punkt Bregma und den kaudalen Kreuzungspunkt Lambda (s. Abb. 7).
Material und Methoden
47
Abb. 7 Abbild eines Ratten-
schädels mit Darstellung der
Orientierungspunkte Bregma und
Lambda für stereotaktische
Operationen. Modifiziert nach
PAXINOS und WATSON 2007.
Wenige Minuten nach dem Einspannen der Ratte in den Stereotakten konnte die Narkose auf
eine Erhaltungskonzentration von 1,5 % Isofluran heruntergefahren werden. Die Narkosetiefe
wurde anhand des Ausbleibens des Zwischenzehenreflexes überprüft und gegebenenfalls an-
gepasst. Die von Fell befreite Kopfhaut wurde mit 70 %igem Ethanol desinfiziert. Danach
erfolgte eine Lokalanästhesie mit 2 %igem Tetracainhydrochlorid (Caesar & Loretz, Hilden,
Deutschland). Nach einer Einwirkzeit von 5 Minuten wurde die Kopfhaut auf einer Länge von
etwa 1,5 cm mit einem Skalpell eröffnet und mit Bulldogklemmen an den Seiten des Opera-
tionsfeldes fixiert. Das nun frei liegende Periost wurde mit Bupivacainhydrochlorid
(Carbostesin® 0,25 %, Astra Zeneca, Wedel, Deutschland) anästhesiert (Einwirkzeit erneut
5 min) und entfernt. Eine Reinigung der Schädeldecke mit 35 %iger Wasserstoff-
peroxidlösung ermöglichte die Darstellung der Knochennähte. Nach Bestimmung der
Koordinaten von Bregma wurden die Koordinaten für die SNr oder den STN in Relation zu
Bregma angefahren und auf der Schädeldecke markiert. Dort erfolgte die Trepanation der
Schädeldecke für die Mikroinjektion mit einem Dentalbohrer (Dremel, Leinfelden-
Echterdingen, Deutschland). Die Koordinaten ergaben sich aus vorherigen Experimenten in
gleich alten Ratten desselben Stammes.
Tab. 1 Stereotaktische Koordinaten für die Zielregionen der Mikroinjektion von Vigabatrin/NaCl.
Hirnregion
Koordinaten STN aSNr pSNr Striatum
Posterior -3,6 -5 -5,7 0
Lateral ±2,6 ±2 ±1,8 ±3
Ventral -7,9/-8 -8,3/-8,4 -8,3/-8,4 -5
Sind zwei Koordinaten für die ventrale Koordinate angegeben, wurden die Koordinaten je nach Wahl des stereo-
taktischen Apparates (Hersteller: David Kopf bzw. Stölting) eingestellt.
Material und Methoden
48
Das System für die Mikroinjektion basierte auf einem in unserer Arbeitsgruppe etablierten
Protokoll (GERNERT u. LÖSCHER 2001). Es bestand aus einer 0,5 μl Hamiltonspritze
(Hamilton Bonaduz AG, Schweiz), die über einen etwa 30 cm langen, flexiblen Polyethylen-
schlauch mit einer Injektionskanüle aus rostfreiem Stahl (äußerer Durchmesser 350 μm,
innerer Durchmesser 150 μm) verbunden wurde (s. Abb. 8). Das System wurde auf Durch-
gängigkeit und Genauigkeit überprüft. Die Befestigung der Injektionskanüle erfolgte am
beweglichen Arm des Stereotakten. Ein erneutes Anfahren von Bregma diente der Ausrich-
tung der Kanüle auf die Koordinaten für die jeweilige Hirnregion in Relation zu Bregma.
Nach Absenken der Kanüle in die gewünschte Hirnregion warteten wir eine Minute, bevor
wir mit der Mikroinjektion begonnen, um Druckreaktionen des Gewebes abzuwarten. Danach
wurden über 4 Minuten 0,25 μl Vigabatrin (40 μg/μl gelöst in destilliertem Wasser) oder
isotone Natriumchloridlösung (NaCl) bei Kontrolltieren infundiert. Diese Dosiswahl ergab
sich aus früheren Dosis-Wirkungs-Experimenten mit dem gleichen Rattenstamm und -
geschlecht im Kindling-Modell (LÖSCHER u. FREY 1987). Das Injektionsvolumen wurde
anhand der Vorwärtsbewegung eines Markerfarbstoffes (Thionin) kontrolliert, welcher durch
Luftblasen und destilliertes Wasser von Vigabatrin, respektive NaCl, getrennt war.
Nach Abschluss der Mikroinjektion wurde die Kanüle wiederum eine Minute im Gewebe
belassen, um eine ausreichende Diffusion der Substanz zu ermöglichen und einen Rückfluss
entlang des Einstichkanals zu minimieren. Nach Entfernen der Kanüle aus dem Gewebe fand
eine erneute Durchlässigkeitsprüfung statt. Das Verfahren wurde für die kontralaterale Hirn-
hemisphäre wiederholt. Nach bilateral erfolgter Mikroinjektion verschlossen wir die Haut
(teilweise nach Wundauffrischung) mithilfe von Einzelheften mit einem resorbierbaren
Nahtmaterial (Surgicryl PGA, Hünningen, Belgien) und beendeten die Inhalationsnarkose.
Abb. 8 System für die Mikroinjektion.
Material und Methoden
49
4.3.4. Verhaltensbeobachtung auf Nebenwirkungen
Nach der Operation wurden die Tiere zur weiteren Beobachtung für mindestens eine Stunde
in einen durchsichtigen Plastikkäfig ohne Einstreu gesetzt. Dieses Vorgehen diente neben der
täglichen Gewichtsmessung zur Beobachtung von eventuell auftretenden Nebenwirkungen.
Besondere Aufmerksamkeit galt abnormaler lokomotorischer Aktivität, Sedation, Ataxie oder
Stereotypien wie Zirkeln oder veränderter Körper- und Kopfhaltung (Protokoll modifiziert
nach HÖNACK u. LÖSCHER 1995; POTSCHKA et al. 1998; GERNERT u. LÖSCHER
2001). Zusätzlich wurden die Tiere 30 Minuten vor jeder PTZ-Schwellenmessung in ein
Open-Field gesetzt und auf diese Parameter hin beobachtet. Der Experimentator war verblin-
det gegenüber der Behandlung des Tieres mit Vigabatrin oder Kontrollsubstanz.
4.3.5. Fokale Vigabatrin-Applikation nach Status epileptikus
Bei drei Tieren wurde mithilfe des Muskarin-Rezeptor-Agonisten Pilokarpin einige Wochen
vor Vigabatrin-Mikroinjektion in den STN ein Status epileptikus ausgelöst, um ausblickend
auf künftige Untersuchungen die Wirkung einer fokalen Vigabatrin-Applikation in chroni-
schen Epilepsiemodellen zu testen. Dieser preliminäre Versuch diente primär einem Nachweis
der Machbarkeit. Pilokarpin wurde nach einem etablierten Protokoll in unserer Arbeitsgruppe
fraktioniert injiziert, bis ein selbsterhaltender Status epileptikus eintrat (adaptiert nach GLIEN
et al. 2001).
Um die Pilokarpin-Dosis zu reduzieren und somit die Mortalität der Status-Induktion zu sen-
ken, wurde 12-18 Stunden vor Pilokarpin-Injektion oral Lithiumchlorid (127 mg/kg, gelöst in
2 ml/kg Aqua dest.) verabreicht. Zudem fand 30 Minuten vor Beginn der Status-Induktion
eine Antagonisierung der peripheren Wirkungen des Pilokarpins mit 1 mg/kg Methyl-
scopolamin (gelöst in 2 ml/kg Aqua dest. i.p.) statt. Pilokarpin wurde zunächst als Bolus
(30 mg/kg in 3 ml/kg Aqua dest. i.p.) und dann in dreißigminütigen Abständen in einer
Dosierung von 10 mg/kg (in 1 ml/kg Aqua dest. i.p.) verabreicht, bis ein generalisierter Anfall
auftrat. Wenn dieser nicht selbstständig endete oder das Tier das Bewusstsein zwischen kurz
aufeinander folgenden Anfällen nicht wiedererlangte, wurde dies als selbsterhaltender Status
epileptikus definiert. Die Zahl der auf den Bolus folgenden Injektionen war auf maximal 3
beschränkt. Zur Senkung der Mortalität und einer Vergleichbarkeit des Hirninsultes innerhalb
der Gruppe wurde der Status nach 90 Minuten mit einer Diazepam-Injektion (10 mg/kg, ent-
Material und Methoden
50
spricht 2 ml/kg Faustan®-Fertiglösung, i.p.) abgebrochen. In den meisten Fällen erfolgte nach
15 Minuten eine zweite und nach insgesamt 30 Minuten eine dritte Diazepam-Injektion, um
die Konvulsionen zu terminieren. Um eine Auskühlung der Tiere nach Diazepam-Behandlung
zu verhindern, wurden sie mit Handschuhen, die mit warmem Wasser gefüllt waren, in
Papiertücher gewickelt. Die Handschuhe wurden alle 30 Minuten erneuert, bis die Tiere wie-
der vollständig wach waren. Nach Status-Induktion ernährten wir die Tiere aufgrund eines
schlechten Allgemeinzustandes einige Tage mit Weichfutter (Babynahrung), in Einzelfällen
verabreichten wir wegen einer Dehydratation isotone Natriumchloridlösung (4 ml/Ratte i.p.).
Etwa 3-4 Wochen nach Status epileptikus wurde die PTZ-Basisschwelle bestimmt und dann
dem Ablauf der vorher beschriebenen Versuche der fokalen Vigabatrin-Applikation gefolgt.
Für diese Gruppe von Tieren erfolgte aufgrund der Ergebnisse der vorausgegangenen Unter-
suchungen nur eine Messung der Zeitpunkte 24 und 96 Stunden nach Vigabatrin-Mikroinjek-
tion im PTZ-Test.
4.4. Studie Ib: Fokale Applikation von Botulinumtoxin
4.4.1. PTZ-Anfallsschwellen
Nach Botulinumtoxininjektion wurden an Tag 1, 2, 3, 4, 7 und 14 PTZ-Schwellen bestimmt
(s. Abb. 9), diese Daten ergaben sich ebenfalls aus der o.g. Literatur zur fokalen
Substanzapplikation als auch aus unveröffentlichten Studien und früheren Daten der Arbeits-
gruppe um ROGAWSKI (2009).
Abb. 9 Studiendesign für die fokale Infusion von Botulinumtoxin B bzw. Vehikel im PTZ-
Anfallsschwellenmodell mit anschließenden Verhaltenstests. Nicht jedes Tier wurde zu jedem Zeitpunkt
getestet, es lagen mindestens 48 Stunden zwischen den einzelnen Schwellenbestimmungen.
Material und Methoden
51
4.4.2. Botulinumtoxin
Botulinumtoxin B wurde freundlicherweise von Solstice Neurosciences Inc. (San Francisco,
Kalifornien, USA) zur Verfügung gestellt. Botulinumtoxin B war zu 70 % von intra-moleku-
laren Disulfid-Bindungen befreit worden, so dass das Toxin in aktiver Form vorlag. Alle
Hüllproteine wurden ebenfalls entfernt. Als Vehikel diente, wie im Fertigarzneimittel
Myobloc® (USA) bzw. Neurobloc
® (Deutschland), eine Lösung aus 0,05 % humanem Serum-
albumin, 0,01 M Dinatriumsuccinat, 0,1 M Natriumchlorid, destilliertem Wasser und Salz-
säure (DRESSLER 2012). Aufgrund unveröffentlichter Daten und der Ergebnisse aus
früheren Studien der AG ROGAWSKI (2009) wurde initial eine Dosis von 1000 U
Botulinumtoxin B unilateral in den linken Hippokampus der Ratten injiziert. In einer zusätz-
lichen Gruppe von 6 Tieren verwendeten wir aufgrund von beobachteten Verhaltensänderun-
gen und spontanen Anfällen in der ersten Gruppe (s. Abschnitt 5.4.2) eine geringere Dosis
von 500 U.
4.4.3. Convection-enhanced delivery
Anstelle der zuvor beschriebenen konventionellen Mikroinjektion wurde in dieser Studie zur
fokalen Substanzapplikation die sogenannte „convection-enhanced delivery” (CED) genutzt
(s. Abb. 10). Diese Methode ermöglicht durch die Anwendung von hydrostatischem Druck
eine homogene Verteilung von Substanzen im Gewebe (ROGAWSKI 2009) und wird seit
einigen Jahren in der Onkologie zur Chemotherapie von Gehirntumoren eingesetzt
(DEBINSKI u. TATTER 2009; BUONERBA et al. 2011). Für die intrazerebrale Applikation
großmoleküliger Peptide wie Botulinumtoxin ist eine Mikroinjektion wie zuvor beschrieben
nicht geeignet. Bei einer solchen Bolusdeposition ist die Verteilung der Substanz auch von
der substanzeigenen Fähigkeit zur Diffusion im Gehirngewebe abhängig. Antiepileptika sind
kleinmolekülige Substanzen und verteilen sich daher sehr schnell im Gewebe. Allerdings ent-
steht so ein hoher Konzentrationsgradient innerhalb der Hirnregion (ROGAWSKI 2009).
Neurotoxine hingegen haben kaum die Fähigkeit zur Diffusion oder zur Aufnahme in kleine
Kapillaren. Sie müssen durch die Anwendung von Druck verteilt werden, nur so kann eine
homogene Verteilung erreicht werden. Ein Vorteil der Toxine ist allerdings, dass sie länger
am Applikationsort verbleiben, daher ist ihre Wirkung potentiell langfristiger als die der
Antiepileptika (ROGAWSKI 2009).
Material und Methoden
52
Abb. 10 Vergleich der Substanzkonzentration in der Extrazellulärflüssigkeit nach Bolus-Deposition
(fokaler Mikroinjektion) und Convection-enhanced delivery (CED). Bolus-Deposition führt zu einer in-
homogenen Verteilung durch Diffusion, die zu einem schnell abnehmenden Konzentrationsgradienten innerhalb
der perfundierten Hirnregion (gestrichelte Linien) führt. CED hingegen ermöglicht eine einheitliche Substanz-
konzentration innerhalb des Gewebes mit scharf abfallenden Konzentrationen an den Grenzen der perfundierten
Region. Modifiziert nach ROGAWSKI 2009.
4.4.4. Fokale Applikation von Botulinumtoxin B
Insgesamt wurden für diese Studie 35 Tiere verwendet. Da von einem Teil der Tiere ein
Elektroenzephalogramm aufgezeichnet werden sollte, wurden bei diesen Tieren permanent
Führungsrohre und Ableitelektroden implantiert. Bei allen anderen Tieren fand die CED von
Botulinumtoxin B bzw. Vehikel intra operationem statt und sie erhielten keine permanent
implantierten Aufsätze. Ein Tier starb bei der Bestimmung der PTZ-Basisschwelle, so dass
sich aus den verbliebenen 34 Tieren, wie in Tab. 2 dargestellt, folgende Gruppen ergaben:
Tab. 2 Tiergruppen für die fokale Applikation von Botulinumtoxin B (BTX B).
Gruppengröße Substanz Dosis Experimente
9 BTX B 1000 U PTZ-Anfallsschwellen, Verhaltensversuch
6 BTX B 500 U PTZ-Anfallsschwellen, Verhaltensversuch
8 Vehikel - PTZ-Anfallsschwellen, Verhaltensversuch
6 BTX B 1000 U EEG-Aufnahme, Verhaltensversuch
5 Vehikel - EEG-Aufnahme, Verhaltensversuch
-
Material und Methoden
53
3-4 Tage vor der fokalen Substanzapplikation wurde bei jedem Tier eine Basisschwelle im
PTZ-Test bestimmt. Die CED von Botulinumtoxin B bzw. Vehikellösung fand unter In-
jektionsanästhesie mit Dexmedetomidin (0,5 mg/kg i.p.) und Ketamin (60 mg/kg i.p.) statt.
Die Injektionsnarkose wurde verwendet, da kein System zur Inhalationsanästhesie verfügbar
war. Zudem fanden die PTZ-Schwellen post Botulinumtoxin B erst mindestens nach 24 h statt
(im Vergleich 2 bzw. 6 h post Vigabatrin). Die stereotaktische Operation lief ab wie zuvor
beschrieben. Die Koordinaten für die unilaterale Applikation von Botulinumtoxin B in den
Gyrus dentatus waren AP – 4 mm, ML + 2mm und DV -3,5 mm (s. Abb. 11).
Bei der CED wurden im Vergleich zur von uns genutzten Mikro-
injektion (Infusionsrate etwa 0,0625 µl/min, Gesamtvolumen
0,25 µl pro Hemisphäre) relativ hohe Infusionsgeschwindigkeiten
und –volumina (Infusionsrate 0,5 µl/min, Gesamtvolumen 2 µl,
nur einseitige Applikation), die über eine Pumpe (Model KDS200,
KD Scientific, Holliston, MA) eingestellt wurden, verwendet. Zu-
dem konnte gezeigt werden, dass ein spezielles Kanülendesign zu
weniger Rückfluss entlang der Injektionskanüle führte; der letzte
Millimeter der Kanüle hatte einen geringeren Innen- und Außen-
durchmesser als der Rest der Kanüle (YIN et al. 2010; s. Abb. 12).
In einer Gruppe von 24 Tieren erfolgte die CED ohne Implanta-
tion eines Führungsrohres, hier senkten wir die Injektionskanüle
direkt in den Gyrus dentatus ab. Die Injektionskanülen wurden
freundlicherweise von Dr. Adrian Kells aus der AG Bankiewicz
Abb. 11 Injektionsort für die fokale
Botulinumtoxin-Infusion. Der Pfeil
zeigt die Injektionsstelle in den Gyrus
dentatus (DG) innerhalb des Hippo-
kampus.
Abb. 12 Injektionskanüle
für CED mit scharfem
Übergang von größerem zu
kleinerem Durchmesser an
der Spitze.
Material und Methoden
54
(University of California San Francisco) zur Verfügung gestellt. Sie bestanden aus Quarzglas
(Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona). Die Kanülenspitze hatte einen äußeren Durch-
messer von 164 µm und einen inneren Durchmesser von 102 µm und war in eine 28-Gauge
Injektionskanüle (PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA) geklebt, so dass ein scharfer Über-
gang von größerem zu kleinerem Durchmesser bestand. Die Kanüle war über einen dickwan-
digen Polyethylen 50-Schlauch (PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA) mit einer 100 µl-
Spritze (NanoFil Syringe, WPI) verbunden, die in einer Pumpe arretiert war. Vor und nach
CED wurde die Kanüle jeweils eine Minute im Gewebe belassen. Nach jeder Injektion fand
eine Dichtigkeits- und Permeabilitätsprüfung des Systems statt. Sobald die Operation abge-
schlossen war, beendeten wir die Anästhesie mit dem α2 Antagonisten Atipamezol (Antise-
dan®, 1 mg/kg i.p.) beendet und beobachteten die Tiere wie zuvor beschrieben für mindestens
eine Stunde.
In einer zweiten Gruppe von 11 Tieren wurden Führungsrohr-Elektroden-Kombinationen
(PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA) implantiert. Die Injektion von Botulinumtoxin B bzw.
Vehikel erfolgte bereits in der Implantationsoperation. Die Elektroden und Führungsrohre
wurden für das Aufzeichnen eines Elektroenzephalogramms sowie für einen weiteren Ver-
such innerhalb eines anderen Projektes benötigt, der hier nicht beschrieben wird. Die Kombi-
nation bestand aus einem 2 mm langen 22-Gauge Führungsrohr aus PEEK (Polyetherether-
keton) mit 2 Ableitelektroden (0,23 mm Durchmesser, Edelstahl) im Abstand von 0,5 mm.
Die Elektroden waren bis auf 0,5 mm an ihrer Spitze mit Polyamid isoliert. Sie projizierten
1 mm über das Ende des Führungsrohres hinaus. Die Elektroden-Führungsrohr-Kombination
wurde mit Zahnzement (Lang Dental, Wheeling, Illinios, USA) mit dem Schädel und zwei
Halteschrauben befestigt. Nach Trocknung des Zahnzementes fand die CED statt. Hierfür
wurde die zuvor beschriebene Kanüle verwendet, die 2,5 mm über das Ende des Führungs-
rohres projizierte und damit, wie zuvor beschrieben, in den Gyrus dentatus zielte. Um Verle-
gungen durch Staub oder aufsteigendes Blut / Sekret vorzubeugen, erfolgte der Verschluss
des Führungsrohrs nach Injektion von Botulinumtoxin B bzw. Vehikel mit einem Dummy
(0,5 mm Projektion über das Ende des Führungsrohres hinaus). Nach dieser Operation wurden
den Tieren mindestens 5 Tage Erholung gewährt, ihr Gewicht wurde täglich überwacht.
Material und Methoden
55
4.4.5. Verhaltensversuche
Nach CED von Botulinumtoxin B beobachteten wir Verhaltensänderungen und spontane An-
fälle bei den Tieren (s. Abschnitt 5.4.2), was uns dazu veranlasste, Verhaltensversuche
durchzuführen. Die nach RICE et al. (1998) modifizierten Tests überprüfen akustische und
taktile Hyperexzitabilität bei Ratten (s. Abb. 13). In der Literatur ist beschrieben, dass
chronisch epileptische Ratten häufig Abweichungen im Verhalten und beim Handling durch
den Experimentator zeigen (PINEL et al. 1977; MELLANBY et al. 1981; GRIFFITH et al.
1987; LEITE et al. 1990; LIU et al. 1994; POLASCHECK et al. 2010; RATTKA et al. 2011;
HUANG et al. 2012). Drei voneinander unabhängige Beobachter beurteilten verblindet die
Antwort des Versuchstieres auf unterschiedliche Stimuli nach einem Score-System (RICE et
al. 1998). Die Reize waren die sogenannte „approach-response“, bei der ein Stift in die Nähe
der Nase des Tieres gehalten wurde, die „touch-response“, bei der das Tier seitlich mit einem
Stift berührt wurde, der „Finger-snap“, um die Schreckhaftigkeit des Tieres auf akustische
Reize zu testen und der „Pick-up Test“, bei dem das Tier am Rumpf umfasst und hochgeho-
ben wurde. Die verschiedenen Scores reichten von keiner Reaktion bis hin zur Flucht oder
aggressivem Verhalten gegenüber dem präsentierten Stimulus.
Abb. 13 Scoresystem des Hyperexzitabilitätstests. Modifiziert nach RICE et al. 1998.
Material und Methoden
56
Der Hyperexzitabilitätstest wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Botulinumtoxin B-
bzw. Vehikel-Applikation mehrmals durchgeführt. Um Effekte wiederholter PTZ-Tests auf
das Verhalten ausschließen zu können, wurde der Test auch mehrmals in einer Gruppe von
Tieren durchgeführt, die keine PTZ-Schwellentests durchlaufen hatten.
4.4.6. Aufzeichnung des Elektroenzephalogramms (EEG)
In den zuvor genannten 11 Tieren wurden keine PTZ-Schwellen vor und nach Botulinumtoxin
B- respektive Vehikel-Administration durchgeführt. Diesen Tieren wurden Elektroden-
Führungsrohr-Kombinationen implantiert (s.o.), da sie noch für einen weiteren, in dieser Ar-
beit nicht beschriebenen Versuch benötigt wurden. Neben der Verwendung für eine Ver-
gleichsgruppe ohne wiederholte Schwellenmessungen im Hyperexzitabilitätstest (s. Abschnitt
4.4.5), zeichneten wir von ihnen EEGs auf, da nach Botulinumtoxin B das Auftreten
spontaner Anfälle beobachtet wurde (s. Abschnitt 5.4.2). An Tag 5 oder 6 nach Botulinum-
toxin B- / Vehikel-Administration wurde die Basislinie für mindestens 5 Minuten aufgezeich-
net und das Tier währenddessen von zwei Experimentatoren beobachtet.
Für die Aufzeichnung wurde ein Grass CP511 AC EEG-Preamplifier (Astro-Med, West
Warwick, RI) verwendet; das digitale EEG wurde mit dem Programm Axotape 9 (Axon In-
struments, Foster City, CA) gespeichert und mithilfe des Programmes AxoScope (Axon In-
struments, Foster City, CA) ausgewertet.
Während dieser Zeit auftretende, spontane Anfälle, Verhaltensauffälligkeiten oder Ähnliches
wurden notiert. Zurück in Deutschland erfolgte die Auswertung der EEG-Aufnahmen von
einer auf diesem Gebiet erfahrenen Wissenschaftlerin, Frau Professorin Dr. Manuela Gernert,
und mir unabhängig voneinander und verblindet. Hierbei wurden epileptische Anfälle und
epileptiforme Spikes gezählt (modifiziert nach ANSCHEL et al. 2004). Die jeweils ersten 10
Sekunden einer jeden Aufzeichnung wurden nicht gezählt, ebenso Zeiträume, in denen Arte-
fakte aufgrund eines Rearrangements des Aufnahmekabels oder Bewegungen des Tieres auf-
traten. Die gezählten Anfälle und Spikes wurden auf eine Minute umgerechnet und Vehikel
und Botulinumtoxin -Gruppe miteinander verglichen. Sofern ein Anfall sich nicht motorisch
manifestierte, wurde ein rein elektroenzephalographischer Anfall definiert durch eine min-
destens zweifach über dem Grundrauschen liegenden Amplitude, eine erhöhte Frequenz von
mindestens 1,5 Hz und eine Dauer von mindestens 5 Sekunden. Spikes wurden analog ab ei-
Material und Methoden
57
ner zweifach über dem Grundrauschen liegenden Amplitude mit einer Dauer von 30-80 ms in
die Zählung mit einbezogen. Gezählte „sharp waves“ hatten mindestens die gleiche Amplitu-
denhöhe, allerdings eine Dauer von 80-250 ms. Sowohl monophasische, biphasische als auch
polyphasische Spikes und Sharp waves wurden gezählt. Ein clusterartiges Auftreten von
Spikes oder Sharp waves wurde separat notiert, die Spikes bzw. Sharp waves innerhalb eines
Anfalls wurden nicht in die Zählung einbezogen.
4.5. Studie II: Neurotransplantation
4.5.1. PTZ-Anfallsschwellen
In der Neurotransplantationsstudie wurden in den meisten Fällen neben der Basisschwelle
drei weitere Schwellen bestimmt, allerdings mit einem großen zeitlichen Abstand
(1. Schwelle nach Transplantation 9-11 Tage post OP, 2. Schwelle 5 Wochen und 3. Schwelle
3 Monate post OP; s. Abb. 14). Diese Zeitpunkte wurden aufgrund von Daten aus Studien zur
Zelltransplantation unserer Arbeitsgruppe gewählt (LÖSCHER et al. 1998; GERNERT et al.
2002; NOLTE et al. 2008).
Abb. 14 Versuchsdesign für die Neurotransplantation im PTZ-Anfallsschwellenmodell.
4.5.2. Studie IIa: Gewinnung und Kultivierung von GABAergen Vorläufer-
zellen
GABAerge Vorläuferzellen wurden in unserem Institut aus Rattenfeten präpariert und kulti-
viert. Für die Gewinnung der GABAergen Vorläuferzellen wurde die laterale oder mediale
ganglionische Eminenz (LGE bzw. MGE) des sich entwickelnden Telencephalons aus Ratten-
feten präpariert und das Gewebe nach Protokollen der Arbeitsgruppe um Ashok Shetty
Material und Methoden
58
(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010; s. Abb. 15) aufbereitet. Sie konnten
zeigen, dass sich nach Transplantation in die CA3 des Hippokampus aus LGE-Zellen etwa
70 % der überlebenden Zellen in GABAerge Neurone entwickeln (HATTIANGADY et al.
2008). Aufgrund der Ergebnisse unserer ersten Transplantationsstudien im PTZ-Modell
(s. Abschnitt 5.5.3) und Schwierigkeiten bei der Verpaarung der Spendertiere, verwendeten
wir in der Folge auch Vorläuferzellen aus der MGE nach einem neueren Protokoll der AG
Shetty (WALDAU et al. 2010). Aus MGE-Vorläuferzellen waren drei Monate nach
Transplantation 10 % der überlebenden Zellen positiv für einen anti-GABA Antikörper
(WALDAU et al. 2010). Allerdings differenzierte sich etwa die Hälfte der MGE-Zellen in
GDNF-positive Astrozyten. GDNF selbst besitzt antikonvulsive Eigenschaften (KANTER-
SCHILFKE 2007), so dass auch die Astrozytenpopulation für die Anfallsunterdrückung von
Nutzen sein könnte. Mit beiden Zellpopulationen, aus LGE und MGE, erzielte die Gruppe um
Ashok Shetty deutliche antikonvulsive Effekte in einem chronischen Epilepsiemodell
(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010), so dass wir uns entschieden, beide
Hirnregionen zur Präparation von Vorläuferzellen zu nutzen (s. Abb. 15).
Abb. 15 Verwendete Zellen für die Transplantation GABAerger Vorläuferzellen.
Material und Methoden
59
Für die Gewinnung von Feten wurden weibliche Wistar-Ratten in unserem Institut terminiert
verpaart (Tag nach der Verpaarung 0,5). Beginnend an Tag 11,5 nach Verpaarung wurde täg-
lich Bromodeoxyuridin (5-bromo-2’-deoxyuridine, BrdU) intraperitoneal injiziert (50 mg/kg).
Die Injektion erfolgte bei einer vertikal gehaltenen Ratte im dorsal gelegenen Abdomen, um
die Feten nicht zu verletzen. BrdU ist ein synthetisches Nukleosid, das als Thymidin-Ana-
logon während der DNA-Replikation in proliferierenden Zellen anstelle von Thymidin in die
DNA integriert wird. Es konnte gezeigt werden, dass auf diese Weise 93 % der Vorläufer-
zellen mit BrdU markiert werden (ZAMAN et al. 2000; HATTIANGADY et al. 2008). So
können die Zellen nach Transplantation immunhistologisch von den Wirtszellen des Empfän-
gertieres unterschieden werden. Für die Entnahme der Feten an Tag 14,5 (WALDAU et al.
2010) wurden die Muttertiere zunächst palpatorisch auf Anzeichen einer Trächtigkeit unter-
sucht und bei positivem Tastbefund für eine Hysterektomie tief anästhesiert (Chloralhydrat,
i.p., 360 mg/kg, gelöst in 0,9 % NaCl, Injektionsvolumen 10 ml/kg). Die Bauchhöhle wurde
eröffnet und der tragende Uterus entfernt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Muttertier intrakar-
dial euthanasiert (Chloralhydrat nach Wirkung dosiert). Der Uterus wurde eröffnet und die
Embryonen aus Amnion und Chorion herausgelöst und in einer Petrischale mit kaltem Kulti-
vierungsmedium (s. Abschnitt 10.2) gesammelt. Die Embryonen waren zu diesem Zeitpunkt
etwa 1 cm groß. Der Kopf wurde abgetrennt und die Vorderhirnblase (s. Abb. 16) vom Rest
des Gehirns entfernt und in eine weitere Petrischale überführt.
Dort wurde unter Zuhilfenahme eines Stereomikroskops das Telencephalon eröffnet, sodass
beide Hemisphären sichtbar wurden. Nun wurden die laterale und mediale ganglionische
Abb. 16 Schematische Darstellung des
Vorder- und Mittelhirns eines E 14 Ratten-
fetus. Modifiziert nach RALLU et al. 2002.
Abb. 17 Schematische Darstellung des eröffneten
Telencephalons mit Blick auf die laterale und mediale
ganglionische Eminenz. Modifiziert nach FARRIES 2001.
Material und Methoden
60
Eminenz (LGE bzw. MGE), die sich als zwei basolateral gelegene, unterschiedlich große Bla-
sen vom Restgewebe abhoben (s. Abb. 17), herauspräpariert und separat in Falcons mit eisge-
kühltem Dissoziationsmedium (s. Abschnitt 10.2) aufgefangen.
Auf diese Weise wurde mit allen Embryonen verfahren, die sich im gleichen Entwicklungs-
stadium befanden und keine Zeichen von pathologischen Prozessen aufwiesen. Im Anschluss
an die Präparation wurden die Falcons mit dem so gewonnenen Gewebe unter die sterile Zell-
kulturbank verbracht und das Material durch vorsichtiges Titruieren mit einer Pasteurpipette
mit rund-geschmolzener Öffnung zerkleinert. Ab diesem Schritt haben wir zwei unterschied-
liche Protokolle der AG Shetty verfolgt.
1. Direkte Zelltransplantation, modifiziert nach HATTIANGADY et al. (2008):
Dieses Protokoll wendeten wir zu Beginn unserer Studie an, als wir selbst Ratten terminiert
verpaarten und die tragenden Tiere mit BrdU behandelten. Für eine Übersicht über verwen-
dete Medien und Zusätze, s. Abschnitt 10.2.
Das Gewebematerial wurde nach Gewinnung durch Zugabe von frischem Dissoziationsme-
dium verdünnt und anschließend durch 70 µm-Filter in ein 50 ml Falcon überführt. Es folgte
ein Waschschritt (Zentrifugation bei 200 G für 8 min bei 4 °C). Das Pellet wurde resuspen-
diert und zwei weitere Male durch Zentrifugation gewaschen. Die Zellzahl und Viabilität
wurde anschließend mittels Trypanblaufärbung evaluiert und bei einer Rate an vitalen Zellen
über 75 % eine Inkubation in Proliferationsmedium durchgeführt. Dem Proliferationsmedium
wurde der Caspase-Inhibitor Ac-YVAD-cmk (500 µM, Enzo Life Sciences, Lörrach) und der
neurotrophische Faktor FGF-2 (200 ng/ml, PAN Biotech, Aidenbach) zugesetzt, diese Be-
handlung führte laut HATTIANGADY et al. (2008) zu einer erhöhten Rate an überlebenden
Zellen nach Transplantation. Es folgte eine Inkubation von drei Stunden auf einem Schüttler
im Brutschrank bei 37 °C. Anschließend wurden die Zellen erneut zweimal durch Zentrifuga-
tion wie oben beschrieben gewaschen und gezählt. Die Resuspension des Zellpellets erfolgte
nun mit 40 µl Neurobasal®-Medium (Invitrogen, Darmstadt). Die Viabilität der Zellen wurde
erneut überprüft, danach wurde die Zelldichte für die Transplantation auf 1x105 lebende Zel-
len pro µl eingestellt.
2. Zelltransplantation nach Kultivierung, modifiziert nach WALDAU et al. (2010):
Dieses Protokoll verwendeten wir, nachdem die Generierung tragender Tiere in unserem
Institut nicht mehr möglich war. Mögliche Ursachen für die schlechten Verpaarungsergeb-
Material und Methoden
61
nisse, das Verwerfen tragender Tiere sowie eine gestörte Embryonalentwicklung könnten
einerseits eine vom Züchter berichtete endemische Keimbelastung des von uns verwendeten
Rattenstammes sein, andererseits auch eine Lärmbelastung der Tiere durch Bauarbeiten in
unserem Institut. Aus diesem Grund bestellten wir terminiert tragende Ratten eines nicht
keimbelasteten Stammes vom Versuchstierzüchter (RccHan®, Harlan, Horst, Niederlande).
Da diese Tiere am Tag der Fetenentnahme (Tag 14 nach Befruchtung) geliefert wurden,
konnten wir keine in-utero Markierung mit BrdU durchführen. Daher haben wir das Protokoll
von WALDAU et al. (2010) verwendet, nach dem die Zellen zunächst als Stammzellen kulti-
viert und während dieser Zeit in-vitro markiert werden können. Für eine Übersicht über die
verwendeten Medien und Zusätze s. Abschnitt 10.2. Dem Protokoll folgend wurden die
Zellen nach Gewinnung in einem Kulturmedium (unter Zusatz von B-27® Supplement ohne
Retinsäure) mechanisch dissoziiert. Danach wurden sie durch Zentrifugation gewaschen (200
G, 8 min, 4-8° C). Die Zellzahl und Viabilität wurde anschließend mittels Trypanblaufärbung
evaluiert. Etwa 300000 Zellen wurden jeweils in eine T25 Zellkulturflasche (Greiner) mit
5 ml angewärmtem Proliferationsmedium überführt und unter Standardbedingungen (37 ° C,
5 % CO2) für etwa eine Woche kultiviert. Während dieser Kultivierungsphase wurde je nach
Bedarf Medium zugegeben und adhärente Zellen wurden durch Schwenken der Flasche vom
Boden gelöst. Durch die Zugabe von bestimmten Wachstumsfaktoren („fibroblast growth
factor 2“, FGF-2, 20 ng/ml und „epidermal growth factor“, EGF, 20 ng/ml) und den Verzicht
auf Retinsäure blieben die Zellen in einem Vorläuferstadium, proliferierten und bildeten
sogenannte “Neurosphären” in Kultur, d.h. einzelne Zellen lagerten sich zu kugeligen
Gebilden zusammen, die frei schwebend im Medium wuchsen. Die Faktoren verhinderten ein
weiteres Differenzieren der Zellen. Während der Zeit der Kultivierung wurden die Zellen
durch Zugabe von BrdU (10 ng/ml) markiert. Nach einer Woche in Kultur konnten die Zellen
für Transplantationsversuche verwendet werden. Die Zellen wurden teilweise vor der
Transplantation vereinzelt (durch Zusatz von 3 ml Accutase® und mechanische
Dissoziation); zum größten Teil wurden sie aber als ganze Neurosphären transplantiert.
Transplantationsmedium war auch hier Neurobasal®-Medium (Invitrogen, Darmstadt).
Alternativ konnten die Zellen nach Aufteilung für 1-2 Passagen weiter kultiviert werden. Für
das Passagieren der Zellen wurde das verbrauchte Medium mit den Neurosphären entnommen
und in ein Falcon überführt. Es wurde etwa 10 Minuten gewartet, bis sich die Neurosphären
Material und Methoden
62
deutlich sichtbar am Boden des Falcons abgesetzt hatten. Dann wurde der Überstand entfernt.
Zeitgleich wurden in die ehemalige Kulturflasche etwa 3 ml Accutase® (Invitrogen, Darm-
stadt) pipettiert, um bereits adhärent gewordene Sphären abzulösen. Hierfür wurde die
Flasche für einige Minuten zur Inkubation zurück in den Brutschrank gestellt. Nach Ablauf
dieser Zeit wurde mikroskopisch kontrolliert, ob die Zellen sich abgelöst hatten und im posi-
tiven Falle die Accutase® mitsamt den Zellen zu dem abgesunkenen Zellpellet gegeben.
Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit kleiner werdendem Pipettenspitzendurch-
messer bis hin zu einer rund-geschmolzenen Pasteurpipette, wurden die Sphären mechanisch
dissoziiert. Danach wurden sie zentrifugiert (200 G, 8 Minuten bei Raumtemperatur) und der
Überstand entfernt. Im Anschluss wurden sie je nach Zelldichte 1:2 bzw. 1:4 auf neue Ge-
webskulturflaschen aufgeteilt. Anstelle einer Passage war auch das Einfrieren der Zellen etwa
1:10 in Gefriermedium (Kulturmedium mit 10 % Dimethylsulfoxid, DMSO) zunächst für 24
Stunden bei – 80 °C und danach in flüssigem Stickstoff möglich.
Während der letzten in-vitro Versuche meiner Arbeit wurden in einer Zelllinie einer Kollegin
innerhalb unseres Zellkulturbereiches eine veränderte Morphologie und ein schlechtes
Wachstumsverhalten nach Auftauen festgestellt. Bis zur Feststellung der Ursache setzen wir
prophylaktisch Antibiotika (Penicillin/Streptomycin, 100 µg/ml, Biochrom AG, Berlin) und
Antimykotika (Fungizone, 0,25 µg/ml, Invitrogen) zu unseren Primärzellkulturen zu
(s. Abschnitt 10.2). Verschiedene Tests ergaben, dass die Zelllinie mit Mykoplasmen befallen
war. Sie wurde entsorgt und die Zellkulturräumlichkeiten gereinigt und desinfiziert. Wir
führten auch an unseren Primärzellen wiederholt Mykoplasmentests (Venor®GeM Advance,
Minerva Biolabs) durch, alle für Versuche verwendeten Zellen waren frei von Mykoplasmen.
4.5.3. Studie IIb: Kultivierung von NT2-Zellen
Die Kultur der NT2-Zellen fand hauptsächlich in der AG von Prof. Dr. G. Bicker, Institut für
Tierökologie und Zellphysiologie der TiHo, statt. Die Zellen wurden uns freundlicherweise
von Frau Saime Tan entweder als sphärische Aggregate oder als adulte Neurone zur Verfü-
gung gestellt. Hierfür wurden in der AG Bicker undifferenzierte Zellen zunächst adhärent
kultiviert und nach Überführung in eine nicht beschichtete Petrischale mit Retinsäure behan-
delt, das sogenannte „Priming” (PAQUET-DURAND et al. 2003). Wir haben die Vorläufer-
zellen zu diesem Zeitpunkt erhalten und einen Teil der frisch mit Retinsäure behandelten
Material und Methoden
63
Zellen sofort transplantiert, den anderen Teil für weitere 6 Tage mit Retinsäure behandelt. Die
Zellen bilden zu diesem Zeitpunkt frei schwimmende Zellaggregate. Außerdem wurden auch
adulte Neurone transplantiert, die in der AG Bicker durch weitere Behandlung mit Retinsäure
für eine Woche und Zusatz eines “Mitose-Inhibitor-Mediums” und selektiver Trypsinisierung
der Neurone generiert wurden (PAQUET-DURAND et al. 2003).
4.5.4. Zelltransplantation
Für die Transplantationen wurden insgesamt 97 Tiere verwendet, die wie in Abschnitt 5.5.2
und 5.6.1 dargestellt, folgenden Gruppen zugeteilt wurden:
Transplantation von
GABAergen Vorläuferzellen aus der LGE (Einzelzellsuspension) mit
Mediumkontrollen, Zielregion: aSNr, Protokoll adaptiert nach HATTIANGADY et al.
(2008)
GABAergen Vorläuferzellen aus der MGE (Suspension mit ganzen Neurosphären) mit
Mediumkontrollen, Zielregion: STN, Protokoll adaptiert nach WALDAU et al. (2010)
NT2-Neuronen (Einzelzellsuspension) mit PBS-Kontrollen, Zielregion: STN
NT2-Vorläuferzellen (Einzelzellsuspension), 1 Tag nach Retinsäure-Zugabe, mit PBS-
Kontrollen, Zielregion: aSNr
NT2-Vorläuferzellen (Einzelzellsuspension), nach 7-tägiger Retinsäure-Behandlung,
mit PBS-Kontrollen, Zielregion: aSNr
Im Hinblick auf spätere Studien in chronischen Epilepsiemodellen wurden auch in dieser Stu-
die einige Tiere (n=19) einem Status epileptikus ausgesetzt, um preliminär potentielle Effekte
einer Transplantation nach Hirninsult zu evaluieren. Zudem wird kontrovers diskutiert, ob
eine Integration der Zellen im gesunden Hirn ebenso erfolgreich sein könnte, wie die Integra-
tion innerhalb von Hirnregionen, die pathologischen Umstrukturierungen unterliegen (s. Ab-
schnitt 2.4.3) Bei Tieren nach Status erfolgten Transplantationen von GABAergen Vorläufer-
zellen aus der MGE (Einzelzellsuspension/Neurosphären) mit Mediumkontrollen (Ziel-
regionen: aSNr und STN).
Material und Methoden
64
4.5.5. Ablauf der Zelltransplantation
Der Ablauf der bilateralen Zelltransplantation glich im Wesentlichen der Mikroinjektion.
Nach Trepanation der Schädeldecke wurden die Zellen allerdings nicht über ein Schlauch-
system injiziert sondern über eine Hamiltonspritze. In vorausgegangenen Studien zu Trans-
plantationen in die SNr oder den piriformen Kortex wurden in der AG Löscher bzw. AG
Gernert hierfür zumeist Glaskapillaren mit einem inneren Spitzendurchmesser von 50-70 µm
verwendet (GERNERT et al. 2002; LÖSCHER et al. 1998; NOLTE et al. 2008). In einer
kürzlich veröffentlichten Studie zu Transplantationen in den STN wurde zusätzlich direkt aus
der Kanüle einer Hamiltonspritze transplantiert, da der STN ein wesentlich geringeres Volu-
men aufweist als beispielsweise die SNr oder der piriforme Kortex (HANDRECK et al.
2012). Die Vermutung war, dass in einer sehr kleinen Struktur mit sehr dicht gepackten
Neuronen das Anheften der transplantierten Zellen schwieriger sein könnte als in den zuvor
beschriebenen größeren und lockerer besiedelten Regionen. Eine größere Läsion durch die
Verwendung der Hamiltonspritze könnte eventuell das Überleben und die Integration der
Transplantate erleichtern (HANDRECK et al. 2012). Es konnten abhängig vom Gebrauch
einer Glaskapillare bzw. einer direkten Injektion mittels Hamiltonspritze (s. Abb. 18) keine
Unterschiede bezüglich des Effektes und der Dauer des Überlebens der transplantierten Zellen
festgestellt werden (HANDRECK et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit wurden ebenfalls
beide Systeme verwendet. Es fanden Transplantationen von Einzelzellsuspensionen statt, die
mit der Glaskapillare oder der Hamiltonspritze durchgeführt wurden. Andererseits wurden
auch Zellen im Verband, als Neurosphären, transplantiert. Hierfür haben wir uns aufgrund der
Größe der Neurosphären und der damit verbundenen möglichen Verlegung der Glaskapillare
für die direkte Transplantation mittels Hamiltonspritze entschieden.
Beide Systeme wurden vor Gebrauch mit 70 %igem Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser
und sterilem Phosphatpuffer gespült, bevor etwa 2 µl der Zellsuspension aufgezogen wurden.
Die GABAergen Vorläuferzellen wurden in einer Dichte von 100000 Zellen/µl in 20 – 30 µl
Medium aufgezogen, während die NT2-Zellen (ebenfalls 100000 Zellen/µl) in PBS mit Zu-
satz von Calcium und Magnesium aufgenommen wurden. Die Permeabilität des Systems
wurde vor Insertion der Kanüle/Glaskapillare in das Gehirn mehrmals überprüft. Das System
aus Glaskapillare und Hamiltonspritze oder aus Hamiltonspritze alleine wurden nun in die
Material und Methoden
65
eigens dafür konstruierte Systemhalterung (aus institutseigener Konstruktion) eingebaut und
fixiert.
(a) Transplantation mithilfe der Glaskapillare:
Die Methode wurde aus der Literatur adaptiert, um eine luftfreie Verbindung zwischen einer
2 µl Hamiltonspritze, einem Verbundstück aus Gummi und der Glaskapillare zu
gewährleisten (NIKKHAH et al. 1994; NOLTE et al. 2008). Die Glaskapillare ohne Filament
(Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting) wurde an einem horizontalen Mikropipetten-Puller (PC-
84 Sachs-Flaming, Sutter Instruments, San Rafael, Kalifornien, USA) gezogen. Die Spitze
wurde unter mikroskopischer Kontrolle auf den inneren Durchmesser von 50-70 µm gekürzt.
Nach Absenken der Mikrokapillare in die gewünschte Hirnregion wurde 10 Sekunden ge-
wartet, um eine (Druck-)Adaptation des Gewebes nach der Verletzung durch die Kapillare zu
ermöglichen. Nach Ablauf der 10 Sekunden wurden über eine halbe Minute 800 nl Zell-
suspension injiziert. Danach wurde erneut für 10 Sekunden gewartet, bevor die Kapillare aus
dem Gehirn entfernt und anschließend auf Durchlässigkeit überprüft wurde. Nach dem er-
neuten Aufziehen von Zellsuspension erfolgte die Transplantation in der anderen Hemisphäre.
(b) Transplantation mittels Hamiltonspritze:
Für Transplantationen von GABAergen Neurosphären im Zellverband wurde eine 2 µl
Hamiltonspritze verwendet. Die Injektion der Zellen glich der zuvor beschriebenen Methode,
allerdings wurde nach Applikation der Zellen 2 Minuten gewartet, bevor die Spritze aus dem
Hirngewebe entfernt wurde, um einen Rückfluss des Transplantats entlang der sich beim Ent-
fernen aufwärts bewegenden Spritze zu minimieren.
Abb. 18 Systeme für die
Neurotransplantation. A System aus
Hamiltonspritze und Glaskapillare;
B System aus Hamiltonspritze allein.
Mit freundlicher Genehmigung von
Annelie Handreck.
Material und Methoden
66
4.5.6. Nachfolgestudie zu Studie IIa: Vorbehandlung der Zellen
Die Ergebnisse unserer ersten Transplantation GABAerger Vorläuferzellen (s. Abschnitt 5.5.3
und 5.5.6) führten dazu, dass in einer Nachfolgestudie untersucht werden sollte, ob eine
Vorbehandlung der Zellen aus der MGE in-vitro zu einer vermehrten Differenzierung in
GABAerge Neurone führen könnte. In unserer in-vitro Studie wurden mehrere Vor-
behandlungsprotokolle aus der Literatur zur Induktion des GABAergen Phänotyps mit-
einander verglichen.
1. Protokoll modifiziert nach ANDRES et al. (2005):
Creatin (Cr) wurde ursprünglich als Nahrungsergänzungsmittel zum Muskelaufbau zugelas-
sen (PERSKY u. BRAZEAU 2001). In-vitro und in-vivo wurde gezeigt, dass eine Supplemen-
tierung mit Creatin zu einer Erhöhung an phosphoryliertem Creatin führt, was wiederum eine
Energiereserve für den Zellstoffwechsel darstellt (MATTHEWS et al. 1998; BREWER u.
WALLIMANN 2000). Durch eine Zugabe von 5 mM Creatinmonohydrat (Creapure®,
Alzchem Trostberg GmbH) wurde von ANDRES et al. (2005) ein signifikanter Anstieg
GABAerger Neurone nach Differenzierung einer Kultur aus der ganglionischen Eminenz
(LGE und MGE) von E14 Rattenfeten berichtet.
2. Protokoll modifiziert nach LAENG et al. (2004):
Für eine Zugabe des Antiepileptikums Valproat (VPA, Orfiril®, Desitin Arzneimittel, Ham-
burg) konnte ebenfalls in-vitro belegt werden, dass kortikale und striatale Vorläuferzellen (aus
der LGE) unter 0,5 mM Valproat-Behandlung vermehrt proliferierten, weniger Astrozyten
hervorbrachten und bis zu 10 mal häufiger in GABAerge Neurone differenzierten (LAENG
et al. 2004).
3. Protokoll modifiziert nach BOSCH et al. (2004):
In dieser Studie wurde eine striatale Zelllinie verwendet (ST14A). Eine sequentielle Behand-
lung mit 10 µM Retinsäure (RA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) führte zu höheren
Überlebensraten der Zellen und vermehrter Differenzierung. Eine darauffolgende Zugabe von
40 mM Kaliumchlorid (KCl, Sigma-Aldrich) über vier Tage induzierte vermehrt GABAerge
Neurone (74 % aller Zellen) mit auswachsenden Dendriten, reduzierte die Zellproliferation
und die Zahl an Vorläuferstadien, die Stammzellmarker wie Nestin exprimierten (BOSCH et
al. 2004).
Material und Methoden
67
Das in unseren Händen vielversprechendste Protokoll sollte dann vergleichend zu unbehan-
delten Zellen in einem Transplantationsversuch verwendet werden, um zu evaluieren, ob eine
Vorbehandlung auch in-vivo zu einer Erhöhung des Anteils GABAerger Neurone führen
könnte und ob dies mit Auswirkungen auf potentiell antikonvulsive Effekte verbunden wäre.
4.5.7. In-vitro Studie
Die Vorbehandlung kultivierter Zellen wurde in drei Versuchsdurchgängen unabhängig von-
einander durchgeführt. Für die Vorbehandlung wurden tiefgefrorene MGE-Zellen aus Char-
gen verwendet, die auch schon zuvor für Transplantationen genutzt wurden. Nach dem Auf-
tauen der Zellen erfolgte die Aufnahme in Kultivierungsmedium (DMEM/F12) und eine Zell-
zählung. Etwa 250000 lebende Zellen wurden pro Kammer einer 6-Well-Platte ausgesät. In je
einem Well der Platte befanden sich nebeneinander drei mit Poly-L-Lysin-beschichtete Glas-
plättchen. Nach der Zählung wurden die Zellen in das Proliferationsmedium (s. Ab-
schnitt 10.2) überführt. Je nach vitaler Zellzahl erfolgte eine Aufteilung der Zellen auf zwei
bis vier 6-Well-Schalen. Die Zellen wurden auf diese Weise für 4 Tage kultiviert. An Tag 4
der Kultivierung („day in vitro 4“ =DIV 4) begannen die unterschiedlichen Vorbehandlungen.
Falls die Zellen sich zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig abgesetzt hatten, wurde das
Medium inklusive der nicht-adhärenten Zellen abgenommen und kurz zentrifugiert. Das
Zellpellet wurde dann in 50 % des eigenen vorherigen Mediums und 50 % des neuen
Vorbehandlungsmediums aufgenommen und wieder auf die Glasplättchen ausgesät. Im Falle
der vollständigen Adhärenz nahm ich das Medium direkt zur Hälfte ab und ersetze es durch
das Vorbehandlungsmedium. In jeder 6-Well-Schale gab es ein Kontroll-Well, dem nur
Proliferationsmedium zugesetzt wurde, dieses Medium wurde ebenfalls jeden 2. Tag zur
Hälfte ausgetauscht. Es wurden jeweils etwa gleich viele Wells pro Vorbehandlung
verwendet. Der Austausch von 50 % des Mediums erfolgte jeden zweiten Tag. In Anlehnung
an die o.g. Literatur wurden die Creatin-Monohydrat-Vorbehandlung, die Valproinsäure-
Behandlung und die Kontrollkultivierung für eine Dauer von 7 Tagen durchgeführt. Die
Behandlung mit Retinsäure erfolgte für ebenfalls für 7 Tage, an DIV 7 wurde auf
Kaliumchlorid-haltiges Medium umgestellt und bis DIV 11 behandelt. Jeweils am letzten Tag
der Behandlung wurden die Zellen mittels einer Zugabe von Paraformaldehyd zum Medium
Material und Methoden
68
(4 %) fixiert. Nach mehrmaligem Waschen mit phosphatgepufferter Saline lagerten wir die
Glasplättchen bis zur weiteren Prozessierung bei 4 °C (maximal eine Woche).
Abb. 19 Versuchsdesign zur Vorbehandlung der MGE-Vorläuferzellen in-vitro.
Zusätzlich wurden Kontrollzellen ohne Vorbehandlung unter den gleichen Bedingungen kultiviert, fixiert und
immunhistologisch angefärbt.
4.5.8. In-vivo Studie
Die beiden erfolgreichsten Protokolle für die Vorbehandlung der Zellen in-vitro (s. Abschnitt
5.5.8.1) wurden an nicht adhärenten Neurosphären erneut durchgeführt. Im Anschluss an die
jeweilige Behandlung wurden die Zellen entsprechend des vorher beschriebenen Protokolls
bilateral in den STN von Ratten transplantiert. Entsprechend der vorherigen Transplantations-
studien überprüften wir die Effektivität der Transplantation im PTZ-Modell. Vergleichend
wurde ein Teil der Zellen transplantiert, die so lange kultiviert wurden, dass sie vom Neuro-
spähren-Stadium in das adhärente Stadium übergingen und erste Fortsätze ausbildeten.
4.6. Histologie
Nach Abschluss aller beschriebenen Experimente wurde die korrekte Lokalisation der
Mikroinjektion bzw. Neurotransplantation histologisch überprüft: Die Tiere wurden mit einer
Überdosis Chloralhydrat (360 mg/ml, Injektionsvolumen 5 ml) narkotisiert, bis ein Atemstill-
stand eintrat. Es erfolgte eine Eröffnung der Bauch- und Brusthöhle und eine Durchtrennung
Material und Methoden
69
des Zwerchfells. Dann wurde eine Kanüle durch die Herzspitze in den linken Ventrikel und
von dort in die Aorta eingeführt und das Herz am rechten Herzohr eröffnet, um den Blutab-
fluss sicherzustellen. Die Kanüle war über ein Schlauchsystem mit einer Perfusionspumpe
verbunden, die zu diesem Zeitpunkt eingeschaltet wurde. Es folgte die transkardiale Perfusion
mit 80 ml phosphatgepufferter Natriumchloridlösung (0,01 M, pH 7,4) und anschließend mit
250 ml 4 % Paraformaldehyd in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4) als Fixanz. Nach erfolgter
Fixierung wurde das Gehirn des Tieres entnommen und bei 4-8 °C in 10 %iger Saccharose-
lösung über Nacht gelagert. Dann wurde das Gehirn bis zur weiteren Aufarbeitung in 30 %ige
Saccharoselösung überführt und weiterhin bei 4-8 °C aufbewahrt. Die Lagerung in Saccha-
roselösung diente als Gefrierschutz vor dem Schneiden an einem Gefriermikrotom.
Von jedem Gehirn aus Studie I (fokale Substanzapplikation von Vigabatrin) wurden zwei
Serien mit 40 μm dicken koronaren Schnitten im Bereich des sichtbaren Mikroinjektions-
stichkanals angefertigt. Die Gehirne aus Studie II (Neurotransplantation) wurden in drei Se-
rien geschnitten, da eine zusätzliche Serie für immunhistologische Färbungen verwendet
wurde. Anschließend zogen wir die erste Serie dieser Schnitte mithilfe von Chromgelatine auf
entfettete Objektträger auf. Nach Trocknung der Objektträger erfolgte die Anfärbung mit
Thionin, welches die Nisslschollen des endoplasmatischen Retikulums in Zellen anfärbt. Neu-
rone bilden deutlich mehr Nisslschollen aus als Gliazellen, so dass diese Färbung ermöglichte,
einzelne Hirnregionen etwa anhand ihrer Neuronendichte voneinander zu unterscheiden. Nach
erfolgter Färbung wurden die Schnitte mit Eindeckmedium und Deckgläschen eingedeckt.
Die zweite und dritte Serie wurden bis zur weiteren Verwendung bzw. als Reserve in einem
flüssigen Gefriermedium bei – 20 °C eingefroren.
4.7. Dekapitation
4.7.1. Botulinumtoxin
Für die Studie zur fokalen CED von Botulinumtoxin wurde nur vor Beginn des Hauptver-
suches bei 2 Tieren die korrekte Lokalisation der Injektion im Hippokampus überprüft, da
keine etablierte histologische Aufarbeitung für Gehirnmaterial zur Verfügung stand. Hierfür
wurden intra operationem statt Botulinumtoxin bzw. Vehikel ein Farbstoff injiziert und die
Tiere anschließend noch in Anästhesie dekapitiert. Nach Entnahme der Gehirne erfolgte ein
Material und Methoden
70
Einschnitt in das Gewebe auf Höhe der sichtbaren Einstichstelle mit einem Skalpell und die
Verteilung des Farbstoffes wurde begutachtet.
4.7.2. Neurotransplantation
Eine quantitative Auswertung der für Glutaminsäuredecarboxylase („glutamic acid
decarboxylase“, GAD)-positiven Zellen anhand der 40 µm Schnitte war aufgrund der Dicke
der Schnitte und der damit verbundenen schlechten Penetration des Antikörpers in Verbin-
dung mit Überlagerungen mehrerer Schichten von Zellen nicht möglich. Aus diesem Grund
wurden randomisiert einige Tiere aus der Nachfolgestudie (Transplantation vorbehandelter
Zellen) dekapitiert, ihre Gehirne entnommen und in flüssigen Stickstoff überführt. Anschlie-
ßend wurden sie bis zur weiteren Prozessierung bei – 20 °C eingefroren. Von diesen Gehirnen
wurden 14 µm dünne Schnitte an einem Kryostaten angefertigt.
4.8. Mikroskopie
Falls nicht gesondert erwähnt, wurden nur Tiere mit bilateral korrekt platzierten Injektionen
in die finale Auswertung einbezogen. Für die genaue Lokalisation der Mikroinjektion wurde
die Thionin-gefärbte Serie unter einem Durchlicht-Mikroskop durchgemustert (25- und 100-
fache Vergrößerung) und die Koordinaten des tiefsten Punktes des Einstichkanals mithilfe des
stereotaktischen Atlas von PAXINOS und WATSON (2007), sowie im Bezug zu nahe gele-
genen eindeutigen anatomischen Strukturen bestimmt. Beginn und Ende des STN waren im
histologischen Schnitt aufgrund der dicht gepackten Neurone eindeutig zu identifizieren.
Ebenso verhielt es sich mit dem Beginn der SNr, die Unterscheidung in einen und posterioren
Teil wurde analog zu früheren Studien (SHEHAB et al. 1996; GERNERT u. LÖSCHER
2001; GERNERT et al. 2004) anatomisch am Austritt des 3. Hirnnerven (Nervus
oculomotorius) definiert, dieser liegt nach PAXINOS und WATSON (2007) bei AP -5,52
(s. Abb. 28). Die SNr endet auf derselben anterior-posterioren Ebene wie der einfach zu
identifizierende Nukleus ruber. Auf derselben Höhe des Zusammenschlusses der anterioren
Kommissur beider Hirnhemisphären liegt das zentrale Striatum.
Material und Methoden
71
4.9. Immunhistologie
4.9.1. GABAerge Vorläuferzellen
Von allen Tieren, denen GABAerge Vorläuferzellen transplantiert worden waren, wurden
randomisiert Tiere für immunhistologische Untersuchungen ausgewählt, um die Transplantate
im Gehirn qualitativ nachzuweisen. Zusätzlich sollte evaluiert werden, ob sich die Zellen dif-
ferenziert hatten und Marker für GABAerge Neurone exprimierten. Außerdem sollten even-
tuelle Entzündungs- und Abstoßungsreaktionen spezifisch sichtbar gemacht werden. Es wur-
den alternierend Fluoreszenz- oder 3,3‘-Diaminobenzidin (DAB)-Anfärbungen gegen Kom-
binationen aus den folgenden Antikörpern im „free-floating“-Verfahren durchgeführt:
ein monoklonaler Anti-BrdU Antikörper (OBT0030, AbD Serotec) aus der Ratte bzw.
in einigen Fällen aus der Maus (MAB 3510, Millipore) zur Anfärbung der vor
Transplantation mit BrdU-markierten Zellen,
ein monoklonaler Anti-NeuN Antikörper (MAB 377, Millipore) aus der Maus zur
Darstellung differenzierter, neuronaler Zellen,
ein polyklonaler Anti-GFAP („Glial Fibrillary Acidic Protein“) Antikörper (Z 0334,
DakoCytomation) aus dem Kaninchen zur Anfärbung von Astrozyten,
ein monoklonaler Anti-GAD67 Antikörper (MAB 5406, Millipore) aus der Maus
gegen das GABA-synthetisierende Enzym Glutaminsäuredecarboxylase Isoform 67
zur Darstellung GABAerger Neurone
Für die jeweiligen Färbungen wurden aus den Transplantationsstudien jeweils die zweiten,
eingefroren Serien genutzt. Für ein genaues Färbeprotokoll, s. Abschnitt 10.5.2.
4.9.1.1. Fluoreszenzfärbung
Nach dem Auftauen bei Raumtemperatur wurden die Schnitte mehrmals in TBS (0,05 M tris-
gepufferte Saline) gewaschen. Danach folgte eine zweistündige Inkubation bei 65 °C in einem
denaturierenden Puffer aus 50 % Formamid und 2x SSC („saline-sodium citrate“, dem
Natriumsalz der Zitronensäure). Nach einer weiteren 10-minütigen Inkubation in 2x SSC bei
Raumtemperatur, überführten wir die Schnitte in 37 °C warme 2 N Salzsäure und inkubierten
erneut für 30 Minuten. Darauf folgend wurden sie für jeweils 5 Minuten zweimal in 0,1 M
Borsäure überführt. Nach diesen Schritten, die dem Aufschluss des Gewebes für die Pene-
Material und Methoden
72
tration der Antikörper dienten, wurden die Schnitte nach erneutem dreimaligem Waschen in
TBS zunächst für eine Stunde in die Blocking-Lösung verbracht. Die Blocking-Lösung ent-
hielt Serum aus der Ziege, aus der auch der sekundäre Antikörper gewonnen wurde, um un-
spezifische Bindungen zu minimieren. Im Anschluss an eine Inkubation in der Carrier-Lösung
erfolgte die Separation jeweils mindestens eines Schnittes pro Tier; er diente als Negativ-
kontrolle. Alle anderen Schnitte wurden zu diesem Zeitpunkt mit dem jeweiligen primären
Antikörper in Carrier-Lösung über Nacht bei 4 °C auf dem Rüttler inkubiert. Am nächsten
Tag wurde mit der separierten Negativkontrolle wieder wie mit den übrigen Schnitten ver-
fahren. Nach erneutem dreimaligen Waschen, um überschüssigen, nicht gebundenen Anti-
körper zu entfernen, wurden sie für 10 Minuten in Carrier-Lösung adaptiert. Darauffolgend
wurden die Schnitte für eine Stunde in Carrier-Lösung mit dem sekundären Antikörper (aus
der Ziege) überführt. Teilweise lagen die sekundären Antikörper selbst bereits Fluoreszenz-
markiert vor (s. Abschnitt 10.3), teilweise wurde aber auch ein biotinylierter Antikörper
verwendet, der nach wiederholtem Waschen in TBS einen weiteren Schritt essentiell werden
ließ: eine Inkubation in TBS mit Carbocyanin 3 (Cy3)-markiertem Streptavidin für eine
Stunde. Nach erneutem Waschen konnten die immunhistologisch angefärbten Gehirnschnitte
nun in destilliertem Wasser in ihre korrekte Reihenfolge gebracht werden (von rostral nach
kaudal) und auf Glycerineiweiß-beschichtete Objektträger aufgezogen werden. Anschließend
an eine Trocknung an der Luft und eine Inkubation in Toluol für mindestens eine Minute,
erfolgte das Eindecken der Objektträger mit DPX (wasserfreies Eindeckmittel mit geringer
Eigenfluoreszenz) und Glasplättchen.
4.9.1.2. Diaminobenzidin-Färbung
Neben der Fluoreszenzanfärbung wurde in einigen Fällen auch eine 3,3‘-Diaminobenzidin
(DAB)-Färbung durchgeführt. Das zuvor beschriebende Protokoll unterschied sich dabei in
folgenden Arbeitsschritten:
Zur Hemmung endogener Peroxidaseaktivität wurde zu Beginn eine 30-minütige Inkubation
in 0,5%iger Wasserstoffperoxid-Lösung (150 µl 35% H2O2 in 10 ml TBS) durchgeführt.
Nach Inkubation in dem primären und nachfolgend dem sekundären, biotinylierten Anti-
körper (in diesem Fall nicht fluoreszenz-konjugiert), folgte eine 90-minütige Behandlung der
Schnitte mit meerrettichperoxidase-konjugiertem Streptavidin (1:375 in TBS). Die Schnitte
Material und Methoden
73
wurden anschließend gewaschen (3-mal 5 min in TBS) und zur Sichtbarmachung der Anti-
körper-Konjugate in 4 ml einer Diaminobenzidin-Reaktionslösung (3,3´-DAB-Färbelösung)
überführt. Nach 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 µl H2O2 gestartet und
nach 10 min durch 3-maliges Spülen mit TBS beendet. Alle weiteren Arbeitsschritte glichen
denen zuvor beschriebenen.
4.9.1.3. Immunhistologische Anfärbung bei Kryostatschnitten
Von der Nachfolgestudie zu einer Vorbehandlung der Zellen in-vitro wurden ebenfalls
immunhistochemische Anfärbungen angefertigt. Für die fixierten Zellen gab es folgende Ab-
weichungen vom oben beschriebenen Protokoll: Nach dem ersten Waschschritt waren die
unterschiedlichen Denaturierungs- und Aufschlussverfahren nicht nötig, so dass sofort die
Inkubation mit der Blocking-Lösung stattfand. Bis auf die Antikörper-Inkubationen, die
mittels eines 20 µl Tropfens auf einer Parafilm-Folie durchgeführt wurden, fanden die rest-
lichen Inkubationen der Glasplättchen in 24-Well-Platten statt. Die Zellkerne wurden jeweils
mit dem DNA-Farbstoff 4,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) angefärbt und ein weiterer An-
tikörper pro Glasplättchen verwendet. Daraus ergaben sich folgende Kombinationen: DAPI +
anti-GFAP, DAPI + anti-NeuN oder DAPI + anti-GAD67.
Die Kryostatschnitte von den Gehirnen, in die vorbehandelte Zellen transplantiert wurden,
wurden ebenfalls mit Immunfluoreszenzfarbstoffen angefärbt. Diese Färbungen konnten al-
lerdings nicht im „free-floating“-Verfahren durchgeführt werden, da die Schnitte bereits beim
Schneiden auf die Objektträger aufgebracht wurden und zu dünn - und damit zu fragil für die
Prozedur der Färbung in Lösung sind. Stattdessen spannten wir die Objektträger in Kammern
(Shandon CoverplateTM
, Thermo Fisher Scientific, Schwerte) ein und pipettierten die unter-
schiedlichen Puffer und Färbelösungen in die Kammer. Alle zuvor beschriebenen Schritte
wurden hier analog durchgeführt.
4.9.2. NT2-Zellen
Zunächst war geplant, dass freundlicherweise ein Mitarbeiter aus der AG Bicker die immun-
histologische Anfärbung der Zelltransplantate im Rattengehirn für uns durchführen sollte.
Hierfür wurde ein monoklonaler Antikörper gegen humanes nukleäres Matrixprotein aus der
Maus (NL09L, anti-NuMa von Calbiochem®, über Millipore, Darmstadt) verwendet, die
Material und Methoden
74
nicht zu spezifischen Nachweis der transplantierten Zellen führte (s. Abschnitt 5.6.4). Später
führten wir darum eine Anfärbung an 14 µm dünnen Kryostatschnitten mit einem mono-
klonalen Antikörper gegen humanes Neurofilament (70 kDa) durch (MAB5294, Milipore,
Darmstadt).
4.9.3. Konfokale Mikroskopie
Konfokale Bilder von fixierten Zellen bzw. Gehirnschnitten wurden an einem Leica TCS SP5
Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar) mit der Software „Leica LAS AF Lite v2.2.1“ auf-
genommen. Hierfür wurden ein Argon-Laser, eine 405-Diode, ein DPSS561 und ein
DPSS442-Laser benutzt. Alle Laser wurden auf eine Intensität von 20-30 % eingestellt. Die
Scans der Objektträger erfolgten sequentiell. Sequentielle Aufnahmen erlauben eine ver-
besserte Trennung bei Verwendung mehrerer Laser, da nur ein Wellenlängenbereich zur
selben Zeit angeregt wird. Auf diese Weise wurden bei Scans mit verschiedenen Fluoreszenz-
markierten Antikörpern Nebensignale minimiert.
Mithilfe der verwendeten Software (s.o.) konnten die dargestellten Zellen mit dem korrekten
Fluoreszenzfarbstoff eingefärbt werden. Es wurden Bilder in den Vergrößerungen 100-fach
bis 400-fach aufgenommen.
4.9.4. Quantitative Auswertung
Für die fixierten Zellen aus der Studie zur Vorbehandlung GABAerger Precursorzellen sowie
für die am Kryostaten geschnittenen Gehirne konnten anhand der Fotos quantitative Auswer-
tungen durchgeführt werden.
4.9.4.1. In-vitro Studie
Jedes mit Zellen bewachsene Glasplättchen wurde in vier Quadranten eingeteilt, aus jedem
dieser Quadranten wurde ein repräsentativer Bereich mit 400-facher Vergrößerung foto-
grafiert. Es erfolgte eine verblindete Zellzählung der unterschiedlich angefärbten Zellen durch
zwei verschiedene Personen.
4.9.4.2. In-vivo Studie
Analog führten wir eine preliminäre, quantitative Auswertung der Kryostatschnitte aus der
Vorbehandlungsstudie durch: Ausgezählt wurden alle Schnitte, auf denen Zellen des Trans-
Material und Methoden
75
plantates innerhalb der Zielregion (hier STN) zu finden waren. Es wurden nur transplantierte
Zellen gezählt, die innerhalb des STN lagen. Zum Vergleich wurde ein Gehirn mit transplan-
tierten Zellen ohne Vorbehandlung mit zwei zerebralen Transplantaten nach Vorbehandlung
verglichen.
4.10. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism©
Version
5.02 (La Jolla, CA, USA). Bei allen Tiergruppen, bei denen nur zwei PTZ-Anfallsschwellen
(jeweils einmal vor und nach Substanzapplikation) bestimmt wurden, wurden diese mithilfe
des gepaarten t-Testes verglichen. In den Fällen, in denen mehrere Schwellen in denselben
Ratten bestimmt wurden oder Gruppenvergleiche mit mehr als zwei verschiedenen Gruppen
untersucht wurden, haben wir die Daten mit einer „One-way ANOVA“ analysiert. Nur bei
offensichtlichen Gruppenunterschieden wurde als Post-hoc Test ein Bonferroni-Test oder ein
t-Test durchgeführt. Hierbei wurden stets selektierte Behandlungsgruppen mit der Kontroll-
gruppe verglichen. Das Signifikanzniveau wurde auf p<0,05 festgelegt.
Für die Score-Daten aus den Verhaltenstests der Botulinumtoxin-Studie wurde eine "Two-
way ANOVA" gefolgt von einem Bonferroni-Test verwendet.
Die Überprüfung auf Normalverteilung wurde mit Hilfe des Tests von Kolmogorov-Smirnov
durchgeführt. Alle statistischen Tests wurden zweiseitig durchgeführt.
Ergebnisse
76
5. ERGEBNISSE
5.1. Vorab-Studie: Einfluss des Anästhetikums auf die PTZ-
Schwelle
In einer Vorab-Studie sollte erhoben werden, ob die Wahl der Anästhesie einen Einfluss auf
die PTZ-Schwellenbestimmungen hat. 6 h nach Isofluran-Anästhesie glichen die PTZ-An-
fallsschwellen den Basiswerten, wohingegen 6 h nach Xylazin/Ketamin (2 mg/kg / 60 mg/kg
i.p.) eine signifikante Schwellenerhöhung (P=0,0111) für den Klonus auftrat (s. Abb. 20).
Daher wurde in allen weiteren Experimenten eine Inhalationsnarkose mit Isofluran durchge-
führt.
Abb. 20 Einfluss der verschiedenen Anästhetika auf die PTZ-Anfallsschwelle. Dargestellt ist jeweils der
Mittelwert + Standardfehler des Mittelwertes (SEM) der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt
(Myoklonus oder Klonus) in mg/kg PTZ. Gepaarter t-Test, * P<0,05.
Ergebnisse
77
5.2. Einfluss des Zyklusstadiums auf die Anfallsschwellen
Die Anfertigung von Vaginalabstrichen erfolgte, um zyklusbedingte Effekte auf die PTZ-An-
fallsschwellen zu ermitteln. Die mikroskopische Auswertung der Ausstriche ergab, dass die
weiblichen Tiere in einer Haltung ohne Kontakt zu männlichen Tieren untereinander keinen
synchronen Zyklus zeigten. An den Tagen der Schwellenbestimmungen befanden sich die
Tiere in unterschiedlichen Zyklusstadien. Einige Ratten hatten keinen regelmäßigen Zyklus
oder das Zyklusstadium konnte nicht mit ausreichender Sicherheit bestimmt werden. Für die
statistische Auswertung der Einflussnahme auf die Anfallsschwellen wurden die Kontrolltiere
retrospektiv entsprechend ihres Zyklusstandes in Gruppen eingeteilt und diese Gruppen mit-
einander verglichen. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, was
Ergebnisse aus einer Studie von FINN u. GEE (1994) bestätigt (s. Abb. 21).
Abb. 21 PTZ-Anfallsschwellen in Tieren mit unterschiedlichem Zyklusstand. Dargestellt ist jeweils der
Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus oder Klonus) in mg/kg
PTZ. Die Tiere wurden retrospektiv anhand ihres Zyklusstandes in Gruppen eingeteilt. ProE = Proöstrus; ProE-E
= Übergangsstadium zwischen Proöstrus und Östrus (Estrus, E); MetE = Metöstrus; DiE = Diöstrus. One-way
ANOVA jeweils nicht signifikant.
5.3. Studie Ia: Fokale Applikation von Vigabatrin
5.3.1. Auswirkungen von Vigabatrin auf die PTZ-Anfallsschwelle
5.3.1.1. Tiergruppen
Für diese Studie wurden insgesamt 297 Ratten verwendet. Während der PTZ-Schwellen-
bestimmungen starben 10 Tiere. Bei 39 Tieren kam es zur paravenösen Infusion von PTZ.
Diese insgesamt 49 Tiere wurden von der finalen Analyse ausgeschlossen. Weitere 4 Tiere
Ergebnisse
78
wurden ausgeschlossen, da histologisch nicht nachgewiesen werden konnte, dass die Mikro-
injektion in die gewünschte Hirnregion appliziert wurde. Es ergaben sich daher folgende
Tiergruppen:
Tab. 3 Verwendete Versuchstiere für den Vergleich systemischer und fokaler Applikation von Vigabatrin.
Experiment Initiale
Gruppen-
größe
Korrekt bilateral in die
Zielregion getroffene
Tiere
Tiere mit Injektionen
außerhalb der Zielregion
Unilateral Bilateral
Insgesamt 297 - - -
Naive Tiere für ver-
gleichende Gewichts-
messungen
226 - - -
Tiere für die finale Aus-
wertung ohne PTZ-
Schwellenbestimmungen
18 - - -
Systemische Administra-
tion von Vigabatrin
15
- - -
Intrazerebrale Injektion von
Vigabatrin (VGB)
…/von NaCl
130
81
67
54
39
19
24
11
Bilaterale Injektion in den
STN von VGB
../von NaCl
72
39
22
26
30
8
20
5
Bilaterale Injektion in die
anteriore SNr von VGB
…/von NaCl
23
25
19
16
3
9
1
-
Bilaterale Injektion in die
posteriore SNr von VGB
…/von NaCl
25
17
16
12
6
2
3
3
Bilaterale Injektion in das
Striatum von VGB
…/von NaCl
10
-
10
-
-
-
-
-
Ergebnisse
79
5.3.1.2. PTZ-Basisschwellen
Die PTZ-Basisschwelle vor Substanzapplikation lag im Durchschnitt bei 19,1 mg/kg für den
ersten Myoklonus und bei 22,8 mg/kg für den klonischen Anfall (Daten von 226 Ratten,
s. Abb. 22). Die Standardabweichung ist klein, da die intra- und interindividuellen
Unterschiede der Schwellen sehr gering ausfielen,
was einen der Vorteile dieses Modells darstellt.
Mit 3,6 % war die Mortalität niedrig, 10 von 279 Tie-
ren starben in Folge der PTZ-Messung. Bei den
meisten Tieren traten jedoch weitere „Endpunkte“
binnen Sekunden nach Ende der PTZ-Infusion auf,
wie tonisch-klonische Krämpfe bis hin zu einem
Verlust der Stellreflexe, gefolgt von weiteren
Myoklonien für die Dauer einiger Minuten. Darauf-
folgend zeigten die Tiere kurzzeitig ein apathisches
Verhalten mit rascher Wiederkehr zum physio-
logischen Habitus.
5.3.1.3. PTZ-Anfallsschwellenerhöhung nach akuter systemischer Gabe
von Vigabatrin
Die intraperitoneale Administration von 600 mg/kg Vigabatrin erhöhte die PTZ-Anfalls-
schwelle für den ersten auftretenden Anfall, den Myoklonus, bis zu maximal 42 % im Ver-
gleich zur Basisschwelle (s. Abb. 23A). Diese signifikante Erhöhung von 23,1 mg/kg auf
32,7 mg/kg PTZ (P<0,001) für die Auslösung eines Myoklonus trat 6 h nach Vigabatrin-
Administration auf und zeigte sich nicht mehr nach 24, 48, 96 und 144 h. Der Effekt auf den
klonischen Anfall, den Klonus, war mit einer Gesamtdauer von 48 Stunden langanhaltender
und die Anfallsschwelle erhöhte sich maximal um 70 %, von 26,0 mg/kg auf 44,2 mg/kg,
nach 6 h (P<0,001; s. Abb. 23B). Es wurden keine Schwellenerhöhungen 2 h nach Vigabatrin-
Behandlung beobachtet. Basierend auf dieser Observation und dem Wunsch, Anästhetika-
assoziierte Wirkungen auf die Anfallsschwellen für die fokale Studie ausschließen zu können,
begannen die Schwellenmessungen in allen weiteren Experimenten 6 h nach Vigabatrin-
Administration.
Basisschwellen
Myo
klonus
Klo
nus
0
10
20
30
40
n=226 n=226
PT
Z [
mg
/kg
]
Abb. 22 Darstellung der PTZ-Basis-
schwellen für die Endpunkte Myoklonus
und Klonus.
Ergebnisse
80
Nach einer Verdopplung der Dosis (1200 mg/kg) erhöhte sich für den Myoklonus die
Schwelle maximal von 22,2 mg/kg auf 35,7 mg/kg PTZ um 61 % nach 6 h (P<0,001); für den
Klonus maximal von 26,4 mg/kg auf 49,2 mg/kg um 86 % nach 6 h (P<0,01), dieser Effekt
hielt für 96 h an (s. Abb. 23C und D).
Myoklonus
Basis 2 h 6 h 24 h 48 h 96 h 144 h0
20
40
60
***
600 mg/kg Vigabatrin
n=15 n=6 n=5 n=7 n=6 n=6 n=5
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus
Basis 2 h 6 h 24 h 48 h 96 h 144 h0
20
40
60600 mg/kg Vigabatrin
***
*** *
n=15 n=6 n=5 n=7 n=6 n=6 n=5P
TZ [
mg
/kg
]
Myoklonus
Basis 6h 48 h 96 h 144 h 0
20
40
601200 mg/kg Vigabatrin
***
n=6 n=6 n=5 n=6 n=6
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus
Basis 6h 48 h 96 h 144 h 0
20
40
601200 mg/kg Vigabatrin
**
***
n=6 n=6 n=5 n=6 n=6
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
C D
Abb. 23 Darstellung der Effekte einer systemischen Vigabatrin-Behandlung.
A und B zeigen die PTZ-Anfallsschwellen für die Endpunkte Myoklonus und Klonus zu verschiedenen Zeit-
punkten nach 600 mg/kg VGB (i.p.); C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 1200 mg/kg (i.p.). Dar-
gestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus
oder Klonus) in mg/kg PTZ. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni/t-Test. * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.
5.3.1.4. Antikonvulsive Effekte nach akuter bilateraler Vigabatrin-
Mikroinjektion in den STN
Wie bereits angesprochen, wurden die ersten Anfallsschwellenmessungen 6 h nach Viga-
batrin-Mikroinjektion erfasst, da Vigabatrin seine maximale Effektivität 6 h nach systemi-
Ergebnisse
81
scher Applikation entfaltete. Zudem konnten wir demonstrieren, dass die gewählte Inhala-
tionsnarkose nach dieser Zeitspanne keinen Einfluss mehr auf die Anfallsschwellen hatte
(s. Abschnitt 5.1). Die Tiere wachten etwa 10 Minuten nach Ende der Mikroinjektion auf und
erholten sich innerhalb von 30 Minuten vollständig von der Narkose, also einige Stunden vor
Beginn der ersten Schwellenmessung. Von 111 Tieren mit Mikroinjektionen in den STN war
die Injektion bei 48 Tieren korrekt bilateral im STN platziert (22 Tiere mit Injektion von
Vigabatrin, 26 Tiere mit Injektion von 0,9 % NaCl, s. Tab. 3). Die Lokalisationen der einzel-
nen Injektionen innerhalb des STN sind in Abb. 24 dargestellt. Auf die Tiere mit einseitig
korrekt platzierter oder beidseits außerhalb des STN platzierter Injektion (s. Tab. 3) wird spä-
ter eingegangen.
Ergebnisse
82
Abb. 24 Hirnquerschnitte mit den Injektionsorten inner- und außerhalb des STN.
● Tiere (n=22), bei denen die Injektionen bilateral korrekt innerhalb des STN platziert waren; ○ Ratten (n=16), bei denen die
Mikroinjektion unilateral korrekt im STN und auf der kontralateralen Seite dorsal oder ventral des STN erfolgte; ∆ Tiere
(n=8) mit bilateral dorsal, außerhalb des STN liegenden Injektionen.
In einem zusätzlichen Experiment erfolgte die Injektion von VGB in das Striatum, hier sind nur die Tiere (n=5) abgebildet
(ebenfalls ∆), die auch in Abb. 35 dargestellt sind (24 h post VGB). 4 Tiere bei denen die Injektion einseitig im STN und auf
der anderen Seite in der SNr lag, sind hier nicht mit abgebildet. Außerdem sind die Tiere nicht erfasst, die nicht für die finale
Analyse genutzt wurden. All diese Tiere sind in Tab. 3 erfasst.
Abkürzungen: ac = anteriore Kommissur; cp = cerebraler Pedunkel; ic = interne Kapsel; mfb = mediales Vorderhirnbündel;
PLH = pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus; VPM = ventraler posteromedialer thalamischer Nukleus, ZID =
dorsaler Teil der Zona incerta; ZIV = ventraler Teil der Zona incerta. Modifiziert nach PAXINOS und WATSON 2007.
Ergebnisse
83
Beidseitige Injektionen von Vigabatrin in den STN führten im Vergleich zur Basisschwelle zu
einer signifikanten Erhöhung der Anfallsschwelle sowohl für den Myoklonus, als auch für
den Klonus (s. Abb. 25): Der maximale antikonvulsive Effekt zeigte sich 24 Stunden nach
Mikroinjektion mit einer 74 %igen Erhöhung von 19,7 auf 34,4 mg/kg PTZ für die Auslösung
eines Myoklonus (P<0,01) und einer 115 %igen Erhöhung (von 24,0 auf 51,7 mg/kg PTZ) für
die Auslösung eines Klonus (P<0,01) relativ zur Basisschwelle vor Vigabatrin-Applikation
(s. Abb. 25). Die Schwelle für die Auslösung eines Klonus war auch nach 48 Stunden noch
signifikant erhöht (P<0,05), kehrte aber nach 96 Stunden wieder auf das Basisniveau zurück.
Bilaterale Injektionen von isotoner Natriumchloridlösung führten nicht zu einer Schwellen-
änderung für den Myoklonus (s. Abb. 25). Dies galt auch für den Klonus, lediglich 48 Stun-
den nach Mikroinjektion konnten wir einen leichten Anstieg von 23,5 mg/kg auf 28,2 mg/kg
(20 %) in der Anfallsschwelle messen (P<0,01). Bei einem direkten Vergleich zwischen Da-
ten nach Vigabatrin-respektive NaCl-Injektion zeigte sich, dass die beobachteten Anfalls-
schwellenerhöhungen post Vigabatrin zu jedem Zeitpunkt signifikant stärker waren als nach
NaCl. Dies galt sowohl für die Auslösung eines Myoklonus als auch des Klonus (s. Abb. 25).
Ergebnisse
84
Myoklonus0.9% NaCl bilateral in den STN
Basis 6h 24h 48h 96h 0
10
20
30
40
50
60
n=3 n=8 n=10n=26 n=5
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus0.9% NaCl bilateral in den STN
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
**
n=3 n=8 n=10n=26 n=5
PT
Z [
mg
/kg
]
MyoklonusVigabatrin bilateral in den STN
Basis 6h 24h 48h 96h 0
10
20
30
40
50
60
n=22
oo
n=4 n=9 n=4n=5
o
PT
Z [
mg
/kg
]
**
KlonusVigabatrin bilateral in den STN
Basis 6h 24h 48h 96h 0
10
20
30
40
50
60
n=22
*
oo
n=4 n=9 n=4n=5
oP
TZ [
mg
/kg
]**
A B
C D
Abb. 25 Darstellung der Effekte einer fokalen Injektion von VGB respektive NaCl in den STN. A und B
zeigen die PTZ-Anfallsschwellen für die Endpunkte Myoklonus und Klonus zu verschiedenen Zeitpunkten nach
0,9 % NaCl; C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 10 µg VGB pro Hirnhemispähre. Dargestellt ist
jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus oder Klonus)
in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum jeweiligen Zeitpunkt
und der Basisschwelle angezeigt. Die Kreise repräsentieren Unterschiede zwischen dem Effekt nach VGB und
NaCl, die zum selben Zeitpunkt ermittelt wurden. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni/t-Test. * P<0,05; **
P<0,01; *** P<0,001; ° P<0,05; °° P<0,01.
5.3.1.5. Antikonvulsive Effekte nach akuter bilateraler Vigabatrin-Mikro-
injektion in die SNr
In der Literatur ist beschrieben, dass eine Mikroinjektion in die SNr in Abhängigkeit vom
gewählten Anfallsmodell und insbesondere von der genauen Lokalisation der Mikroinjektion
GABA-potenzierender Substanzen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann (s. Ab-
Ergebnisse
85
schnitt 2.3.2). Aus diesem Grund haben wir Tiere mit einer beidseits anterior erfolgten und
einer beidseits posterior erfolgten Mikroinjektion getrennt ausgewertet.
5.3.1.5.1. Injektionen in die anteriore SNr
Von insgesamt 90 Ratten, die für diese Studie verwendet wurden, waren die Injektionen bei
35 Tieren (19 Vigabatrin, 16 NaCl) korrekt in der anterioren SNr platziert (s. Tab. 3 und
Abb. 26).
Abb. 26 Hirnquerschnitte mit den Injektionsorten nach fokaler Injektion von VGB in die anteriore SNr
(aSNr). Tiere (n=19) mit bilateral erfolgter Injektion von VGB sind abgebildet, Tiere mit NaCl-Injektionen und
nicht beidseits korrekt platzierten Injektionen sind nicht dargestellt; sie finden sich in Tab. 3. Modifiziert nach
PAXINOS und WATSON 2007.
Nach bilateraler Mikroinjektion von Vigabatrin in den anterioren Teil der SNr stieg die An-
fallsschwelle für den Myoklonus 6 h nach Injektion signifikant von 19,6 auf 20,8 mg/kg um
6,1 % (P<0,05; s. Abb. 27). Die maximale, aber nicht statistisch signifikante Erhöhung von
16,6 % auf 22,8 mg/kg zeigte sich nach 24 h. Auswirkungen auf den Klonus waren deutlicher;
Ergebnisse
86
die Schwelle war 6, 24 und 48 h nach Mikroinjektion signifikant höher als bei der Basis-
messung. Der maximale Effekt zeigte sich hier nach 48 h mit einer 60,0 % Erhöhung von
23,8 mg/kg auf 38 mg/kg PTZ für die Auslösung des Klonus (P<0,05; s. Abb. 27). Bilaterale
Injektionen von NaCl führten nur einmalig, nach 48 h zu einer robusten Schwellen-
veränderung (P<0,05; s. Abb. 27).
Myoklonus0.9% NaCl bilateral in die anteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
n=8 n=5 n=5n=16 n=6
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus0.9% NaCl bilateral in die anteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
n=8 n=5 n=5n=16 n=6
*
PT
Z [
mg
/kg
]
MyoklonusVigabatrin bilateral in die anteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
n=4 n=9 n=6n=19 n=4
*
PT
Z [
mg
/kg
]
KlonusVigabatrin bilateral in die anteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
****
n=4 n=9 n=6n=19 n=4
*°
°
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
C D
Abb. 27 Darstellung der Effekte einer fokalen Injektion von VGB respektive NaCl in die anteriore SNr.
A und B zeigen die PTZ-Anfallsschwellen für die Endpunkte Myoklonus und Klonus zu verschiedenen Zeit-
punkten nach 0,9 % NaCl; C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 10 µg VGB pro Hirnhemispähre.
Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklo-
nus oder Klonus) in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum
jeweiligen Zeitpunkt und der Basisschwelle angezeigt. Die Kreise repräsentieren Unterschiede zwischen dem
Effekt nach VGB und NaCl, die zum selben Zeitpunkt ermittelt wurden. One-way ANOVA, post-hoc:
Bonferroni/t-Test. *P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001; °P<0,05.
Ergebnisse
87
5.3.1.5.2. Injektionen in die posteriore SNr
Bei 28 Tieren (16 Vigabatrin, 12 NaCl) lagen die Injektionsorte beidseits in der posterioren
SNr (s. Tab. 3 und Abb. 28). Daten der nicht beidseits korrekt platzierten Mikroinjektionen
wurden aufgrund der kleinen Tierzahl (teilweise nur 1 oder 2 Tiere pro Gruppe, s. Tab. 3)
nicht weiter analysiert.
Abb. 28 Hirnquerschnitte mit den Injektionsorten nach fokaler Injektion von VGB in die posteriore SNr
(pSNr). Tiere (n=16) mit bilateral erfolgter Injektion von VGB sind abgebildet, Tiere mit NaCl-Injektionen und
nicht beidseits korrekt platzierten Injektionen sind nicht dargestellt; sie finden sich in Tab. 3. Eingezeichnet ist
auch der 3. Hirnnerv, N. oculomotorius, der als anatomische Grenze zwischen anteriorem und posteriorem Teil
der SNr gewählt wurde. Modifiziert nach PAXINOS und WATSON 2007.
Beidseits posterior platzierte Injektionen von Vigabatrin erhöhten die Schwelle für den
Myoklonus maximal nach 6 h von 17,3 auf 22,6 mg/kg PTZ um 30,6 % (s. Abb. 29). Eine
signifikante Erhöhung auf 21,6 mg/kg um 24,9 % zeigte sich aber lediglich nach 24 h
(P<0,05) und nach 96 h (P<0,05). Für den Klonus erhöhte sich 24 h nach Injektion die
Anfallsschwelle um 48,1 %, von 21,0 auf 31,1 mg/kg PTZ (P<0,05) und nach 96 h auf 29,4
mg/kg um 40 % (P<0,01; s. Abb. 29). Kontrollinjektionen mit 0,9 % NaCl führten nur 24 h
nach Injektion zu einer Schwellenerhöhung für den Klonus um 26,9 % von 22,3 auf 28,3
mg/kg (P<0,05; s. Abb. 29). Es wurde, abgesehen von den zuvor beschriebenen postoperativ-
assoziierten Nebenwirkungen, weder bei Kontrolltieren noch bei mit Vigabatrin behandelten
Tieren Nebenwirkungen beobachtet.
Ergebnisse
88
Myoklonus0.9% NaCl bilateral in die posteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
n=4
n=5n=3
n=12
n=6
n=5 n=3 n=6
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus0.9% NaCl bilateral in die posteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
n=5n=3n=6
n=4n=12 n=5 n=3 n=6
*
PT
Z [
mg
/kg
]
MyoklonusVigabatrin bilateral in die posteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
*
n=9
n=5n=5
n=16
n=9
n=9n=5 n=5
*
PT
Z [
mg
/kg
]
KlonusVigabatrin bilateral in die posteriore SNr
Basis 6 h 24 h 48 h 96 h 0
10
20
30
40
50
60
*
n=5n=5n=9
n=9n=16 n=9n=5 n=5
**
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
C D
Abb. 29 Darstellung der Effekte einer fokalen Injektion von VGB respektive NaCl in die posteriore SNr.
A und B zeigen die PTZ-Anfallsschwellen für die Endpunkte Myoklonus und Klonus zu verschiedenen Zeit-
punkten nach 0,9 % NaCl; C und D zeigen analog die Anfallsschwellen nach 10 µg VGB pro Hirnhemispähre.
Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklo-
nus oder Klonus) in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum
jeweiligen Zeitpunkt und der Basisschwelle angezeigt. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni /t-Test. *
P<0,05; **P<0,01.
5.3.1.6. Vergleich der Wirksamkeit von Vigabatrin nach systemischer und
fokaler Applikation
Um die Daten aus der Studie zur systemischen mit denen aus der fokalen Substanzapplikation
vergleichen zu können, wurden jeweils die maximal erreichten Schwellenerhöhungen in Pro-
zent gegenüber der Basisschwelle (100 %) miteinander verglichen (s. Abb. 30).
Ergebnisse
89
5.3.1.6.1. Anfallsschwellenerhöhungen für den Endpunkt Myoklonus
Im Vergleich zur systemischen Behandlung mit Vigabatrin zeigte sich der maximale antikon-
vulsive Effekt nach Injektionen in den STN später, erst 24 h nach Vigabatrin-Administration
(s. Abb. 30). Für eine Erhöhung der PTZ-Schwelle für die Auslösung des Myoklonus waren
beidseitige Injektionen in den STN effektiver als in die anteriore (P=0,0016) SNr. Tendenziell
waren Injektionen in den STN in ihrer Wirkung auf den Myoklonus auch den bilateralen In-
jektionen in die posteriore SNr überlegen (P=0,0565). Ebenso verhielt es sich mit systemi-
schen Injektionen in der geringeren Dosis, dies erreichte jedoch ebenfalls nicht das statisti-
sche Signifikanzniveau (P=0,0706 beim Vergleich fokal STN gegen systemisch 600 mg/kg
i.p.). Antikonvulsive Effekte nach Mikroinjektion in die anteriore oder posteriore SNr unter-
schieden sich im direkten Vergleich nicht voneinander (s. Abb. 30).
5.3.1.6.2. Anfallsschwellenerhöhungen für den Endpunkt Klonus
In allen Experimenten waren die Schwellenerhöhungen für den Klonus deutlich stärker als für
den Myoklonus (s. Abb. 30); der Klonus scheint der sensitivere Endpunkt für die hier
beschriebene Untersuchung von antikonvulsiven Effekten durch Vigabatrin zu sein. Auch hier
erwies sich eine bilaterale Mikroinjektion in den STN als effektivste Strategie. Analog zu den
Ergebnissen beim Myoklonus wurde ebenfalls ein späterer Eintritt der antikonvulsiven Wir-
kung beobachtet als nach der systemischen Administration von Vigabatrin. Die Anfalls-
schwelle nach Injektionen in den STN war gegenüber Injektionen in die anteriore (P=0,0125)
oder posteriore (0,0349) SNr signifikant erhöht. Zudem konnte mit fokaler Applikation in den
STN eine signifikant erhöhte Schwelle gegenüber der niedrigeren systemischen Dosis
(600 mg/kg i.p.) erreicht werden (P=0,0429), nicht aber für die höhere intraperitoneale Dosis
von 1200 mg/kg (P=0,1450). Es gab wiederum keinen Unterschied zwischen der Wirksamkeit
einer Injektion in die anteriore oder posteriore SNr.
Wie bereits erwähnt, führte in drei Fällen die Injektion von NaCl zu einer Schwellenerhöhung
(s. Abb. 25, Abb. 27 und Abb. 29), für Vigabatrin waren es hingegen 11 von den 24 durchge-
führten Schwellenmessungen. Aus diesem Grund vermuten wir, dass es sich bei den Effekten
durch NaCl um eine Ausnahme handelt, die durch eine Läsion der Zielstruktur oder
Volumeneffekte erklärt werden könnten.
Ergebnisse
90
Myoklonus post Vigabtrin
0
50
100
150
200
Basis (= 100%)
VGB i.p., 600 mg/kg
VGB i.p., 1200 mg/kg
VGB STN
VGB aSNr
VGB pSNr
6 h 6 h 24 h 24 h 6 h Zeitpunkt des max. Effektes
**
*
*o
A
n=5 n=6 n=9 n=9 n=9Sch
wellen
erh
öh
un
g [
%]
n=38
Klonus post Vigabatrin
0
50
100
150
200
250
Basis (= 100%)
VGB i.p., 600 mg/kg
VGB i.p., 1200 mg/kg
VGB STN
VGB aSNr
VGB pSNr
6 h 6 h 24 h 48 h 6 hZeitpunkt des max. Effektes
**
**
*o o
#
B
n=5 n=6 n=9 n=6 n=9Sch
wellen
erh
öh
un
g [
%]
n=38
Abb. 30 Vergleich der Effekte nach systemischer und fokaler Vigabatrin-Behandlung. Dargestellt ist je-
weils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen in % gegenüber der Basisschwelle (= 100 %) für die
Endpunkte Myoklonus und Klonus. Durch Sterne werden signifikante Schwellenerhöhungen gegenüber der
jeweiligen Basisschwelle angezeigt; Kreise repräsentieren einen signifikanten Unterschied zwischen fokalen
Injektionen in den STN oder die Subregionen der SNr. Die Raute zeigt einen signifikanten Unterschied der
Schwellenerhöhung zwischen der fokalen Injektion in den STN und der systemischen Injektion von 600 mg/kg
an. Ungepaarter t-Test, *,°,# P<0,05.
5.3.2. Nebenwirkungen
Die systemische Verabreichung von Vigabatrin rief in beiden Dosierungen ausgeprägte Ne-
benwirkungen hervor, wie Sedation und Ataxie für eine Dauer von etwa 24 h. Zusätzlich kam
es zu einer Senkung der Körpertemperatur und des Körpergewichtes, die vermutlich auf die
Ergebnisse
91
sedativen Effekte zurückzuführen sind. Die Körpertemperatur der Tiere sank nach intraperi-
tonealer Administration von Vigabatrin innerhalb von zwei Stunden um 2 °C, erreichte aber
nach etwa zwei weiteren Stunden wieder die Ausgangstemperatur (s. Abb. 31).
0 20 40 6034
35
36
37
38
39
600 mg Vigabatrin (n=6)
1200 mg Vigabatrin (n=6)
Kontrollen (n=3)
h nach VGB-Administration
Kö
rpert
em
pera
tur
[°C
]
Im Gegensatz zu den beschriebenen unerwünschten Wirkungen nach systemischer Viga-
batrin-Injektion konnten wir nach fokaler Injektion von Vigabatrin keine Nebenwirkungen
beobachten. Während der Aufwachphase aus der Isofluran-Anästhesie zeigten die Tiere Se-
dation, Ataxie und Piloerektion für eine Dauer von etwa 10 Minuten. Es konnte kein Unter-
schied zwischen Tieren, denen Vigabatrin respektive NaCl appliziert wurde, festgestellt wer-
den, so dass die Beobachtungen als normales postoperatives Verhalten interpretiert wurden.
Es wurden weiterhin keine Stereotypien oder Zirkeln beobachtet. Zu den verschiedenen Zeit-
punkten der folgenden Schwellenmessungen waren alle Tiere wach und aktiv ohne Unter-
schied zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe, was sie deutlich von den Tieren nach
systemischer Vigabatrin-Injektion unterschied. Der Gewichtsverlust war langanhaltender, die
Tiere verloren innerhalb eines Tages bei der 600 mg/kg Dosierung 6 % (P<0,01) und bei der
höheren Dosis von 1200 mg/kg bis zu 10 % (P<0,001) ihres Ausgangsgewichtes nach Viga-
batrin-Injektion. Nach etwa einer Woche erreichten sie wieder den Ausgangswert (s. Abb. 32
und 33). Die Gewichtsentwicklung unterschied sich zudem deutlich von der Zunahme der
Kontrollgruppe (P<0,001).
Abb. 31 Köpertemperaturentwicklung nach intraperitonealer Vigabatrin-Injektion. Zum ersten
Messzeitpunkt wurde abweichend von der Legende nur bei zwei Tieren (600 mg/kg VGB) bzw. einem Tier
(1200 mg/kg VGB) die rektale Körpertemperatur ermittelt.
Ergebnisse
92
-200 -100 0 100
210
220
230
240
250
600 mg Vigabatrin (n=6)
1200 mg Vigabatrin (n=6)
Kontrollen (n=18)
Start Schwellenbestimmungen
Zeit [h] vor und nach Vigabatrin-Administration
Kö
rpe
rge
wic
ht
[g]
Das Körpergewicht der Tiere aus der STN Vigabatrin-Gruppe nahm im Vergleich zum Aus-
gangsgewicht geringgradig ab (um 4 %; P<0,001), was aber keine signifikante Abnahme im
Vergleich mit der Gewichtsentwicklung der Kontrollgruppe darstellte. Nach Mikroinjektionen
in die anteriore oder posteriore SNr änderte sich das Körpergewicht der Tiere nicht signifikant
gegenüber dem Ausganggewicht oder der Gewichtsentwicklung der Kontrollgruppe (s. Abb.
33).
-15
-10
-5
0
5
**
***
VGB i.p., 600 mg/kg
VGB i.p., 1200 mg/kg
naive Kontrollen
VGB STN
VGB SNr
NaCl SNr
NaCl STN
°°
°
n=6 n=6
n=18
n=9
n=13
n=10n=9
***
*
Än
deru
ng
des
Au
sg
an
gsg
ew
ich
tes [
%]
Abb. 33 Gewichtszunahmen bzw. –abnahmen 24 h nach Vigabatrin- respektive Kontroll-Behandlung.
Dargestellt sind die Gewichtsveränderungen in % gegenüber dem Ausgangsgewicht vor Vigabatrin-/Kontroll-
Injektion. Sterne zeigen signifikante Unterschiede zwischen Ausgangsgewicht und Gewicht post Behandlung an.
Kreise repräsentieren Unterschiede zwischen systemischer und fokaler Vigabatrin-Administration. Zudem er-
niedrigte systemische Vigabatrin-Administration das Gewicht gegenüber Kontrolltieren (P<0,001)-, fokale
Vigabatrin-Applikation führte nicht zu Unterschieden zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe. One-way
ANOVA, post hoc: Bonferroni/t-Test, * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001; ° P<0,05; °° P<0,01.
Abb. 32 Gewichtsverlauf nach
intraperitonealer Vigabatrin-Injektion.
Ergebnisse
93
5.3.3. Spezifität der Zielregionen bei fokaler Applikation
Bei einigen Tieren aus dem Experiment zur bilateralen Injektion von Vigabatrin in den STN
war nur eine oder keine der Injektionen korrekt platziert (s. Tab. 3), was durch die geringe
Größe des STN der Ratte von etwa 1 mm3 (HARDMAN et al. 2002) begründet ist. Diese
Fehlinjektionen erlaubten uns jedoch, die beobachtete antikonvulsive Wirkung nach bilatera-
ler Injektion in den STN auf ihre Spezifität zu untersuchen. Zusätzlich wurden Experimente
mit einer bilateralen Injektion in eine anterior gelegene Hirnregion, das zentrale Striatum,
durchgeführt (s. Tab. 3 und Abb. 24).
5.3.3.1. Antikonvulsive Effekte nach fokaler Vigabatrin-Injektion in das
Striatum
Bei 10 Ratten wurde Vigabatrin bilateral ins Striatum injiziert und die Anfallsschwelle bei 5
Tieren 6 h und bei 5 Tieren 24 h nach Mikroinjektion bestimmt (s. Abb. 34). Nach 6 h unter-
schied sich die Schwelle für den Myoklonus nicht signifikant von der Basisschwelle (Anstieg
um 6,6 %), die Schwelle für den Klonus hingegen stieg von 20,3 auf 36,1 mg/kg PTZ um
78 % an (P<0,001). Auch nach 24 h zeigte sich kein signifikanter Anstieg der Schwelle für
den Myoklonus, für den Klonus stieg die Schwelle signifikant auf 34,2 mg/kg PTZ um 69 %
(P<0,01).
Myoklonus
Basis 6 h 24 h0
10
20
30
40
n=5n=10 n=5
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus
Basis 6 h 24 h0
10
20
30
40
n=5n=10 n=5
*** **
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
Abb. 34 PTZ-Anfallsschwellen nach fokaler Vigabatrin-Injektion in das zentrale Striatum. Dargestellt ist
jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklonus oder Klonus)
in mg/kg PTZ. Mit Sternen werden signifikante Unterschiede zwischen den Schwellen zum jeweiligen Zeitpunkt
und der Basisschwelle angezeigt. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni, ** P<0,01; *** P<0,001.
Ergebnisse
94
5.3.3.2. Antikonvulsive Effekte nach Vigabatrin-Injektionen außerhalb der
Zielregion STN
Bei den meisten Tieren mit nicht korrekt platzierten Injektionen wurden 24 oder 48 h nach
Vigabatrin-Injektion die Anfallsschwellen gemessen. Da die Werte sich wenig unterschieden
war eine gemeinsame Analyse möglich (s. Abb. 35). Bei einer Gruppe von Tieren (n=4) er-
folgte die Injektion einseitig im STN und auf der anderen Seite in der anterioren SNr. Der
antikonvulsive Effekt glich in dieser Gruppe dem Effekt einer bilateral in den STN platzierten
Injektion. Bei 10 Tieren wurde die Injektion einseitig korrekt im STN platziert und auf der
kontralateralen Seite innerhalb von 0,5 mm dorsal des STN in angrenzenden Hirnregionen,
hauptsächlich der Zona incerta. Der Einfluss auf die Schwellenänderung des Myoklonus glich
dem der bilateralen Injektion, während die Schwellenerhöhung für den Klonus mit 72 % ge-
genüber 113 % nach bilateraler Injektion weniger deutlich ausfiel. Lag die Injektion einseitig
im STN und auf der anderen Seite hingegen 0,5 mm ventral des STN in angrenzenden Hirn-
regionen (n=6), vor allem im zerebralen Pedunkel, erhöhte sich die Schwelle für den Myoklo-
nus lediglich um 36 % und für den Klonus um 65 %. Diese Werte ähneln denen nach beidseits
nicht im STN platzierten Mikroinjektionen beobachteten Schwellenänderungen von 40 % für
den Myoklonus und 70 % für den Klonus bei 8 Tieren mit beidseits 0,5 mm dorsal des STN
gesetzten Injektionen. Folgende Hirnregionen wurden in dieser Gruppe mit Vigabatrin
injiziert: Zona incerta, pedunkulärer Teil des lateralen Hypothalamus und das mediale Vor-
derhirnbündel. Bei wenigen Tieren wurden andere Zeitpunkte untersucht (6 und 96 h), diese
zeigten aber deutlich geringere Schwellenerhöhungen als die Tiere nach 24 h und 48 h nach
bilateraler Injektion von Vigabatrin (Daten nicht dargestellt).
Ergebnisse
95
Myoklonus
0
50
100
150
200
***Basis (= 100%)
STN bilateral
STN unilat./<0.5 mm dorsal STN
STN unilat./<0.5 mm ventral STN
Striatum
bilat. <0.5 mm dorsal STN
***** ***
*STN/aSNr
n=47 n=14 n=4n=4 n=10 n=6 n=8 n=5Sch
welle
nerh
öh
un
g [
%]
Klonus
0
50
100
150
200
250Basis (= 100%)
STN bilateral
STN unilat./<0.5 mm ventral STN
bilat. <0.5 mm dorsal STN
******
***
Striatum
***** **
STN unilat./<0.5 mm dorsal STN
STN/aSNr
n=47 n=14 n=4 n=10 n=6 n=8 n=5Sch
welle
nerh
öh
un
g [
%]
A
B
Abb. 35 Spezifitätsvergleich der antikonvulsiven Wirkung einer fokalen Vigabatrin-Applikation.
Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt
(Myoklonus oder Klonus) in % gegenüber der Basisschwelle (=100 %). Mit Sternen werden signifikante
Unterschiede zwischen den Schwellen nach Applikation in die jeweilige Hirnregion und der Basisschwelle
angezeigt. One-way ANOVA, post-hoc: Bonferroni, * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.
5.3.4. Akute fokale Applikation von Vigabatrin nach Status epileptikus
Die Statusinduktion erfolgte gemeinsam mit den Tieren für die Neurotransplantation und wird
hier für alle Tiere beschrieben. Insgesamt wurden 26 Tiere verwendet. Bei einem Tier konnte
durch die fraktionierte Pilokarpin-Applikation kein Status epileptikus ausgelöst werden, es
wurde nicht für die Studie verwendet. Alle weiteren Tiere erfuhren nach der Bolus-Injektion
und in den meisten Fällen nach zwei Nachinjektionen von Pilokarpin einen selbsterhaltenden
Status, der nach 90 Minuten unterbrochen wurde. Zwei Tage nach Status wurden zwei Tiere
morgens tot im Käfig aufgefunden. Ein Tier wurde aufgrund eines sehr schlechten Allge-
Ergebnisse
96
meinbefindens und einer hochgradigen Hämaturie euthanasiert. Während des Wiegens und
Fütterns der Tiere erfuhren einige Tiere bereits innerhalb der ersten Tage nach Status spon-
tane oder noch insult-assoziierte Anfälle. Drei Tiere wurden für die Vigabatrin-Studie ver-
wendet, 19 weitere Tiere für die Neurotransplantation (s. Abschnitt 5.5.7).
Die Basisschwelle der Tiere 3-4 Wochen nach Pilokarpin-Status glich der Basisschwelle in
naiven Tieren. Die Basisschwelle für die Auslösung eines Myoklonus lag bei 20,1 mg/kg
PTZ, für den Klonus bei 23,5 mg/kg PTZ. Diese Daten bestätigten unsere frühere Beobach-
tung, dass sich die Dosis PTZ für die Auslösung eines Myoklonus bzw. Klonus in naiven und
in Tieren mehrere Tage (> 2 Tage) nach Pilokarpin-Status nicht unterscheiden (RATTKA et
al. 2011). Eine Bewertung der Anfallsschwere wurde, anders als in der Arbeit von RATTKA
et al. (2011), aufgrund der preliminären Natur des Versuches und der damit verbundenen
kleinen Tierzahl nicht durchgeführt. Eine bilaterale Mikroinjektion von Vigabatrin in den
STN führte in dieser Gruppe von drei Tieren (nicht in Tab. 3 enthalten) nicht zu einer
signifikanten Schwellenerhöhung (s. Abb. 36): Die Schwelle für den Myoklonus erhöhte sich
nach 24 h um 27 % auf 25,6 mg/kg PTZ (P=0,1260) und für den Klonus um 53% auf 36,0
mg/kg PTZ (P=0,1133). Hier ist anzumerken, dass bei 2 Tieren die Schwellenerhöhung
deutlich ausfiel und bei einem Tier nicht. Auch nach 96 h gab es keine Schwellenänderungen.
Es traten keine unerwünschten Nebenwirkungen nach Vigabatrin-Applikation auf. Die Tiere
zeigten allerdings bei der Bestimmung der Basisschwelle und den nachfolgenden Messungen
ein schreckhaftes und aggressives Verhalten, das bekannterweise durch Pilokarpin bzw. die
Epileptogenese ausgelöst wird (s. Abschnitt 4.4.5).
Myoklonus
Basis 24 h 96 h0
10
20
30
40
50
n=3n=3 n=3
PT
Z [
mg
/kg
]
Klonus
Basis 24 h 96 h0
10
20
30
40
50
n=3n=3 n=3
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
Abb. 36 Effekte einer fokalen Vigabatrin-Applikation in den STN einige Wochen nach Status epileptikus.
Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt (Myoklo-
nus oder Klonus) in mg/kg. One-way ANOVA.
Ergebnisse
97
5.4. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B
5.4.1. Schwellenänderungen nach Botulinumtoxin B
Nach akuter unilateraler Botulinumtoxin B-Injektion in den Hippokampus traten unerwartet
signifikante Schwellenerniedrigungen auf (s. Abb. 37). Während der ersten
Schwellenmessungen post Botulinumtoxin B an Tag 1, 2, 3 und 4 ergaben sich keine Unter-
schiede zu der zuvor ermittelten Basisschwelle. An Tag 7 hingegen sank die Schwelle signifi-
kant für den Myoklonus auf 14,1 mg/kg PTZ, das entspricht einer Erniedrigung um 39 %; die
Basisschwelle lag zuvor bei 23,1 mg/kg (P<0,05). Auch beim Klonus gab es eine Tendenz zu
einem prokonvulsiven Effekt, hier sank die Schwelle von 27,6 mg/kg auf 19,4 mg/kg um
30 %, erreichte allerdings nicht das Signifikanzniveau. Zwei Wochen nach Botulinumtoxin B-
Administration wurden die prokonvulsiven Effekte noch deutlicher, die Schwelle für den
Myoklonus sank auf 10,3 mg/kg (-55,4 %, P<0,001) und auch die Schwellenerniedrigung für
den Klonus wurde mit einer Senkung um 42,4 % auf 15,9 mg/kg signifikant (P<0,01) gegen-
über der Basisschwelle. Im Vergleich dazu gab es für den Myoklonus keine Schwellenverän-
derungen in der Vehikel-Gruppe. Für den Klonus zeigte sich allerdings in der Vehikel-Gruppe
ein antikonvulsiver Effekt an Tag 1, 4 und 7 nach CED (P1 und P4<0,05; P7<0,01). In einem
direkten Vergleich zwischen der Vehikel- und Behandlungsgruppe unterschieden sich die
Schwellenwerte für 7 und 14 Tage signifikant voneinander (Myoklonus: P7<0,05; P14<0,001;
Klonus: P7<0,01; P14<0,001).
Ergebnisse
98
Vehikel Myoklonus
Bas
is
1 Tag
2 Tag
e
3 Tag
e
4 Tag
e
7 Tag
e
14 T
age
0
10
20
30
40
n=9 n=4 n=4 n=4 n=4 n=8 n=7
PT
Z [
mg
/kg
]
Vehikel Klonus
Bas
is
1 Tag
2 Tag
e
3 Tag
e
4 Tag
e
7 Tag
e
14 T
age
0
10
20
30
40 *
n=9 n=4 n=4 n=4 n=4 n=8 n=7
* **
PT
Z [
mg
/kg
]BTX B Myoklonus
Bas
is
1 Tag
2 Tag
e
3 Tag
e
4 Tag
e
7 Tag
e
14 T
age
0
10
20
30
40
n=9 n=5 n=4 n=4 n=3 n=7 n=8
*
***
o
ooo
PT
Z [
mg
/kg
]
BTX B Klonus
Bas
is
1 Tag
2 Tag
e
3 Tag
e
4 Tag
e
7 Tag
e
14 T
age
0
10
20
30
40
n=9 n=5 n=4 n=4 n=3 n=7 n=8
***
oo ooo
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
C D
Abb. 37 Effekte einer unilateralen, intrahippokampalen Infusion von Vehikel (A und B) bzw.
Botulinumtoxin B (BTX B, 1000 Units) (C und D) im PTZ-Anfallsschwellenmodell. Dargestellt ist jeweils
der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen Endpunkt in mg/kg. One-way ANOVA,
post hoc: Bonferroni. Sterne repräsentieren signifikante Unterschiede zwischen der jeweiligen Schwelle nach
CED von BTX B/Vehikel und der Basisschwelle. Die Kreise zeigen Unterschiede zwischen der Vehikel- und
Behandlungsgruppe zum jeweiligen Zeitpunkt an. */° P<0,05, **/°° P<0,01; ***/°°° P<0,001.
In einer weiteren, kleineren Gruppe von Tieren wurde eine geringere Dosis von 500 U
Botulinumtoxin B appliziert und an Tag 7 und 14 eine PTZ-Schwelle bestimmt (s. Tab. 2 und
Abb. 38). Die Applikation von Botulinumtoxin B führte auch hier zu einer erhöhten
Suszeptibilität gegenüber PTZ und reproduzierte die beschriebenen Ergebnisse mit der höhe-
ren Dosis.
Ergebnisse
99
500 U BTX B Myoklonus
Bas
is
6 Tag
e
13 T
age
0
10
20
30
40
**
n=6 n=4 n=6
***PT
Z [
mg
/kg
]
500 U BTX B Klonus
Bas
is
6 Tag
e
13 T
age
0
10
20
30
40
**
n=6 n=3 n=6
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
Abb. 38 Effekte nach unilateraler, intrahippokampaler Infusion von BTX B (500 Units) im PTZ-Anfalls-
schwellentest. Dargestellt ist jeweils der Mittelwert + SEM der PTZ-Anfallsschwellen für den jeweiligen End-
punkt in mg/kg. One-way ANOVA, post hoc: Bonferroni. Sterne repräsentieren signifikante Unterschiede
zwischen der jeweiligen Schwelle nach BTX B und der Basisschwelle. ** P<0,01; *** P<0,001.
5.4.2. Nebenwirkungen
Das tägliche Wiegen der Tiere ergab nur einen geringgradigen Gewichtsverlust der mit
Botulinumtoxin B behandelten Tiere im Vergleich zu Kontrolltieren (s. Abb. 39). Insgesamt
entwickelte sich die Gewichtszunahme nach Botulinumtoxin B nicht so homogen wie in der
Vehikelgruppe, der Gewichtsunterschied erreichte aber nur am letzten Tag der Messung, an
Tag 7, statistische Signifikanz. Daten werden hier nur für die erste Behandlungsgruppe ge-
zeigt, sie glichen den anderen Gruppen.
Bas
is
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5
Tag 6
Tag 7
0
50
100
150
Vehikel
BTX B
*
Zu
-/A
bn
ah
me d
es
Kö
rperg
ew
ich
tes [
%]
Abb. 39 Gewichtsverlauf nach Vehikel-/ Botulinumtoxin B (BTX B)-Infusion. Dargestellt sind die Mittel-
werte + SEM des Körpergewichtes in % gegenüber des Basisgewichtes (= 100 %), das vor der CED von BTX
B/Vehikel gemessen wurde. Ungepaarter t-Test, * P<0,05.
Ergebnisse
100
Die Verhaltensanalyse bei Botulinumtoxin B-behandelten und Kontrolltieren ergab jedoch
auffällige Unterschiede: Während des täglichen Wiegens und dem damit verbundenen Hand-
ling der Tiere fiel auf, dass die Toxingruppe insgesamt sehr schreckhaft war und ausweichend
auf Berührungen reagierte. Zudem wurden beginnend in der ersten Woche nach
Botulinumtoxin B-Injektion bei zwei Dritteln der Toxin-behandelten Ratten epileptische An-
fälle beobachtet, die partiell aus der Ruhe heraus, und teilweise während des Handlings der
Tiere auftraten. Dies wurde sowohl in der PTZ-Gruppe als auch in der Gruppe von Tieren
ohne wiederholte Schwellenmessungen beobachtet. Bis Versuchsende (etwa drei Wochen
post Botulinumtoxin-Injektion) wurden weiterhin Anfälle beobachtet. Aufgrund dieser
Observationen wurden die unter Material und Methoden beschriebenen Verhaltenstests auf
Hyperexzitabilität (s. Abschnitt 4.4.5) durchgeführt.
5.4.3. Verhaltenstests
Für den Hyperexzitabilitätstest zeigten sich keine Unterschiede im Approach-response,
Touch-response oder Finger-snap Test. Lediglich im Pick-up Test traten signifikante Unter-
schiede zwischen Vehikel- und Botulinumtoxin B-behandelten Tieren auf (s. Abb. 40):
Während in einer Gruppe von Tieren 4/5 Tage (P=0,0689) post CED das statistische Signifi-
kanzniveau noch nicht erreicht wurde, ergaben sich signifikante Unterschiede zu späteren
Zeitpunkten (11/12 Tage, 2 und 3 Wochen) post CED (P11/12 Tage<0,01; P2Wochen<0,001 und
P3Wochen<0,001) zwischen der Kontrollgruppe und der Botulinumtoxin B-Gruppe. Vehikel-
kontrollen hatten einen durchschnittlichen Score von 1,1 bzw. 1,6. Dieser Score steht für ein
leichtes Handling der Ratte beim Anheben des Tieres, eventuell kommt eine leise Vokalisa-
tion vor. Im Gegensatz dazu erreichten die Toxin-behandelten Tiere einen Score von 4,1 bzw.
4,6. Dies ist gleichbedeutend mit einer erschwerten Handhabung des Tieres, da es sich flucht-
artig von der Hand wegbewegt oder sogar aus dem Käfig springt (s. Abb. 13).
Ergebnisse
101
4/5
Tage
post C
ED
11/1
2 Tag
e post
CED
14/1
5 Tag
e post
CED
21/2
2 Tag
e post
CED
0
2
4
6
******
n=5 n=5 n=8 n=8n=6 n=6 n=8 n=8
*
Sco
re
4 Tag
e post
CED
13 T
age
post C
ED
20 T
age
post C
ED
0
2
4
6Vehikel
BTX B***
n=5 n=5 n=5n=6 n=6 n=6
*
Sco
re
A B
Abb. 40 Ergebnisse des Pick-up Tests zu verschiedenen Zeitpunkten nach Vehikel-/ Botulinumtoxin B
(BTX B)-Infusion. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der Scores des Pick-up Tests. A Tiere, die eine Dosis
von 1000 Units BTX B in 2 µl Vehikel oder nur 2 µl Vehikel erhalten haben. Hier sind 2 Gruppen von Tieren
zusammengefasst; es handelt sich nicht zu jedem Zeitpunkt um dieselben Tiere. Daher wurde eine Two-way
ANOVA für nicht verbundende Daten durchgeführt. Es ergaben sich signifikante Unterschiede (P<0,0001)
zwischen der Behandlung mit Toxin oder Vehikel, post hoc: Bonferroni. B Tiere, die eine Dosis von 500 Units
BTX B in 1 µl Vehikel respektive nur 1 µl Vehikel erhalten haben. Hier wurden zu jedem dargestellten Zeit-
punkt dieselben Tiere getestet und daher eine Two-way ANOVA für verbundene Daten durchgeführt. Es ergaben
sich signifikante Unterschiede sowohl zwischen der Behandlung mit Vehikel oder Toxin (P<0,0065) als auch
zwischen den verschiedenen Zeitpunkten der einzelnen Behandlungen (P< 0,0065), sowie zwischen den Zeit-
verläufen des Effektes der Toxin- und Vehikelgruppe (P< 0,0029), post hoc: Bonferroni. * P<0,05; *** P<0,001.
In der Gruppe von Tieren, die lediglich die Hälfte der ursprünglichen Dosis an Toxin erhalten
hatten (500 U), ließen sich ebenfalls signifikante Unterschiede im Pick-up Test feststellen, die
noch nicht nach 4 und 13 Tagen, aber nach 20 Tagen (P=0,0018) und somit etwa eine Woche
später gegenüber der Gruppe mit der doppelten Dosis auftraten (s. Abb. 40B).
5.4.4. EEG-Aufnahmen
In beiden Tiergruppen, sowohl in der Gruppe mit wiederholten PTZ-Schwellenbestimmungen
als auch in den Tieren mit permanent implantierten Führungsrohr-Ableitelektroden-Kombi-
nationen ohne wiederholte PTZ-Tests, wurden bei zwei Dritteln der Ratten motorische An-
fälle einige Tage nach Botulinumtoxin B-Applikation beobachtet (s. Tab. 4). Diese Anfälle
traten zum Teil aus der Ruhe heraus, zum Teil Handling-assoziiert, etwa beim täglichen Wie-
Ergebnisse
102
Abb. 41 Spontaner Anfall einer Ratte während der Aufzeichnung des EEGs mittels einer Elektrode.
gen der Tiere oder vor PTZ-Schwellenbestimmungen, auf. Aus diesem Grund wurde in einer
Gruppe von Tieren ein Elektroenzephalogramm (EEG) aus dem Gyrus dentatus aufgezeich-
net. Die Echtzeit-Beobachtung sowie die Auswertung der EEG-Aufnahmen an Tag 5-7 nach
CED ergab, dass motorische, fokale und generalisierte, sowie rein elektroenzephalo-
graphische Anfälle nur bei Toxin-behandelten Tieren auftraten. Sie zeigten im Durchschnitt
2,34 Anfälle während der fünfminütigen Aufnahme (s. Tab. 4 und Abb. 41).
Tab. 4 Spontan auftretende Anfälle während der fünfminütigen EEG-Aufnahme.
Zudem ergab sich, dass signifikant mehr (P=0,0111) epileptiforme Spikes in der Toxingruppe
(17,89 Spikes/min) auftraten als in der Vehikelgruppe (5,17 Spikes/min; s. Abb. 42). Im Falle
der mit Vehikel behandelten Tiere traten die Spikes vereinzelt auf, es kamen sowohl mono-
und biphasische Spikes und Sharp waves als auch polyphasische Sharp waves vor (s. Abb.
Tiernr. Behandlung Anfälle
21 Vehikel -
22 Vehikel -
23 Vehikel -
25 BTX B -
26 BTX B 1
27 BTX B 7
28 BTX B -
29 BTX B 3
30 BTX B 3
Ergebnisse
103
43). Bei den Botulinumtoxin B behandelten Tieren hingegen traten die genannten Spike-
Typen vermehrt im Cluster auf, die eine Frequenz zwischen 1 und 11 Hertz aufwiesen.
Abb. 42 Auftreten von Spikes und Sharp waves nach Botulinumtoxin B (BTX B)-/Vehikel-Infusion.
A Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der Anzahl der Spikes und Sharp waves pro Minute. Ungepaarter t-
Test, P<0,05. B Spikes im EEG bei einem mit BTX B-behandelten Tier. C Vergrößerung einzelner Spikes.
Abb. 43 Häufig aufgetretene
Spike-Typen nach Botulinum-
toxin B (BTX B).
A monophasischer Spike;
B biphasische Sharp wave;
C biphasischer Spike;
D polyphasische Sharp wave;
E Achseneinheiten.
Ergebnisse
104
5.5. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen
5.5.1. Gewinnung, Kultivierung und Transplantation
Aufgrund der Zuchtproblematik und der Umbauarbeiten innerhalb unseres Institutes (s. Ab-
schnitt 4.5.2) konnten wir nur anfänglich selbst züchten und somit direkte Transplantationen
von Zellen aus der LGE durchführen (nach HATTIANGADY et al. 2008). Danach führten
wir größtenteils eine Gewinnung der GABAergen Vorläuferzellen mit darauffolgender Kulti-
vierung im Neurosphärenstadium nach dem Protokoll von WALDAU et al. (2010) durch.
Eine tragende Ratte hatte i.d.R. zwischen 7 und 12 Feten, die für die Präparation der medialen
ganglionischen Eminenz (MGE) geeignet waren und etwa zwischen 60 und 500 x 104 vitale
Zellen lieferten. Nach wenigen Tagen in Kultur unter Zusatz von FGF und EGF (s. Ab-
schnitt 10.2) bildeten die Zellen frei im Medium schwebende Neurosphären aus zwei bis drei
Einzelzellen. In den Folgetagen lagerten sich weitere Zellen an und bildeten Neurosphären.
Unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO2) wurden die Sphären nach etwa 7 Tagen
adhärent, ließen sich aber durch tägliches „Losschlagen“ für einige Tage weiterhin im
Medium schwebend kultivieren, bevor sie gesplittet wurden. Erfolgte kein mechanisches
Loslösen der adhärenten Zellen, bildeten sie erste Ausläufer und einzelne Zellen wanderten
wieder aus den Neurosphären aus, so dass sich nach einigen weiteren Tagen ein konfluenter
Zellrasen bildete. Für die Transplantation wurden jedoch stets frei im Medium schwebende
Neurosphären verwendet. Die einzige Ausnahme bildete die Verpflanzung adhärenter Zellen
mit Dendriten in der Nachfolgestudie zur Vorbehandlung striataler Vorläuferzellen (s.
Abschnitt 4.5.8).
5.5.2. Tiergruppen
Für die finale Auswertung wurden nur Tiere einbezogen, deren Zelltransplantate bilateral in
der Zielstruktur lagen (s. Tab. 5). Kamen verschiedene Transplantationsprotokolle (s. Ab-
schnitt 4.5.5) zur Anwendung, wurden die Gruppen zusammengefasst, wenn es keinen Unter-
schied zwischen den Einzelgruppen gab.
Ergebnisse
105
Tab. 5 Verwendete Versuchstiere für Studie II: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen.
Ursprüngliche
Gruppengröße
Bilateral ge-
troffen
Hirnregion Zellart Transplantationssystem Weiteres?
11 4 aSNr LGE Einzelzellsuspension mit
Glaskapillare
6 5 aSNr Medium Glaskapillare
10 9 STN MGE Ganze Sphären mit Hamil-
tonspritze
11 6 STN Medium Ganze Sphären mit Hamil-
tonspritze
6 5 aSNr MGE Gemischt PILO°
4 4 aSNr Medium Gemischt PILO
6 2 STN MGE Ganze Sphären mit Hamil-
tonspritze
PILO
3 1 STN Medium Hamiltonspritze PILO
° PILO steht für Tiere nach Status epileptikus
5.5.3. Schwellenmessungen nach Transplantation
Post transplantationem von GABAergen Vorläuferzellen aus der LGE und der MGE gab es
keine signifikanten Unterschiede zur Auslösung eines Myoklonus und Klonus zwischen
Basisschwelle und Schwellen im PTZ-Test (s. Abb. 44 und Abb. 45). Tiere mit nicht bilateral
gelegenen Transplantaten wurden aus diesem Grund nicht weiter analysiert.
Ergebnisse
106
LGE Myoklonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=4 n=4 n=3 n=2
PT
Z [
mg
/kg
] Kontrollen Klonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=4n=5 n=5 n=3
PT
Z [
mg
/kg
]
LGE Klonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=4 n=4 n=3 n=2
PT
Z [
mg
/kg
]
Kontrollen Myoklonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=4n=5 n=5 n=3
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
C D
Abb. 44 PTZ-Anfallsschwellen nach Injektion von Medium (A und B) oder Transplantation von
Vorläuferzellen aus der LGE der Ratte (C und D) in die anteriore SNr. Dargestellt sind die Mittelwerte +
SEM der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.
Ergebnisse
107
MGE Myoklonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=9 n=9 n=8 n=8
PT
Z [
mg
/kg
]
MGE Klonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=9 n=9 n=8 n=8
PT
Z [
mg
/kg
]
Kontrollen Klonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=6 n=6 n=6 n=5
PT
Z [
mg
/kg
]
Kontrollen Myoklonus
Bas
is
9-11
Tag
e
5 W
ochen
3 M
onate
0
10
20
30
40
n=6 n=6 n=6 n=5
PT
Z [
mg
/kg
]
A B
C
Abb. 45 PTZ-Anfallsschwellen nach Injektion von Medium (A und B) oder Transplantation von
Vorläuferzellen aus der MGE der Ratte (C und D) in den STN. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der
PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.
5.5.4. Verhaltensbeobachtung nach Transplantation
Konform mit den Beobachtungen aus der Studie zur fokalen Substanzapplikation mit Viga-
batrin zeigten die Tiere nach Zelltransplantation bzw. Medium-Injektion keine auffälligen
Verhaltensweisen direkt nach Operation oder zu den Zeitpunkten der Schwellenmessungen.
5.5.5. Histologie
Vergleichend zur Mikroinjektionsstudie wurde die korrekte Position der Transplantate sowie
der Kontroll-Injektionen von Neurobasalmedium in anhand von Thionin-gefärbten Gehirn-
schnitten histologisch überprüft und nur bilateral korrekt platzierte Transplantate oder
Medium-Injektionen in die Auswertung miteinbezogen.
Ergebnisse
108
Die GABAergen Vorläuferzellen ließen sich nach kurzfristiger Inkubation mit Caspase-Inhi-
bitor und FGF-2 und sukzessiver Transplantation (Protokoll nach HATTIANGADY et al.
(2008)) noch bis zu 3 Monate histologisch nachweisen (s. Abb. 46).
Abb. 46 Vorläuferzellen aus der LGE in der anterioren SNr drei Monate post Transplantation in der
Thioninfärbung. A zeigt die Ansammlung stark angefärbter, transplantierter Zellen, B eine Vergrößerung des
Transplantatbereiches. Maßstabsbalken: A = 200 µm, B = 100 µm.
Auch nach einwöchiger Kultur als Neurosphären (Protokoll nach WALDAU et al. (2010)) mit
oder ohne Passagen, nach dem Einfrieren, erneutem Auftauen und anschließender Kultivie-
rung gelang der histologische Nachweis 3 Monate nach Transplantation. Die Zellen zeigten
sich im Thionin-gefärbten Schnitt stark angefärbt. In dieser Anfärbung konnte nicht evaluiert
werden, ob es sich hier um die Transplantate selbst oder zusätzlich auch um wirtseigene Zel-
len handelte. Aufgrund der geringen Größe des STN wurden auch Transplantate als getroffen
gewertet, wenn der Hauptanteil der Zellen innerhalb der Zielstruktur lag (s. z.B. Abb. 55B).
In Medienkontrolltieren war der Nachweis
teilweise schwieriger, da besonders nach
Transplantation mittels Glaskapillare der
Einstichkanal kaum noch im Gewebe zu dif-
ferenzieren war (s. Abb. 48). Es wurde weder
in Kontrolltieren noch in Tieren mit Trans-
plantaten eine Abstoßungsreaktion oder eine
Tumorbildung beobachtet.
Abb. 48 Einstichkanal eines Kontrolltieres 5
Wochen nach Medium-Injektion in die
anteriore SNr. Maßstabsbalken = 200 µm.
Abb. 47 Einstichkanal eines Kontrolltieres
5 Wochen nach Medium-Injektion in die anteriore
SNr. Maßstabsbalken = 200 µm.
Ergebnisse
109
5.5.6. Immunhistologie
Eine genauere Klassifizierung der stark Thionin-gefärbten Zellen im Transplantatbereich er-
möglichte die immunhistologische Differenzierung mittels verschiedener Antikörper (s. Abb.
49 und Abb. 49). Mit einer Anfärbung gegen den Marker BrdU konnten wir belegen, dass die
transplantierten Zellen bis zu 3 Monate nach Transplantation überlebt hatten. Im Bereich des
Transplantates gab es frequent Anhäufungen von Astrozyten, die mit einem spezifischen
Marker (GFAP, s. Abschnitt 4.9.1) angefärbt wurden. Die qualitative Analyse der Gehirn-
schnitte ergab keine auffallenden Unterschiede in der Morphologie und Differenzierung der
transplantierten Zellen aus LGE oder MGE.
Abb. 49 Zelltransplantate aus der LGE fünf Wochen nach Transplantation in die anteriore SNr. A, C und
E zeigen das Transplantat in der linken, B, D und F in der rechten Hirnhemisphäre. A und B Thioninfärbung,
C und D immunhistologische DAB-Färbung gegen BrdU, E und F immunhistologische DAB-Färbung gegen
GFAP. Maßstabsbalken = 100 µm.
Ergebnisse
110
Abb. 50 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte drei Monate nach Transplantation von
MGE-Vorläuferzellen in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläuferzellen
innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die GFAP-positiven Zellen inner- und außerhalb des Trans-
plantates; C Überlagerung. Maßstabsbalken = 100 µm.
Die BrdU-positiven Zellen selbst hatten sich zu einem Teil in Neurone (positiv für NeuN,
s. Abb. 51 und Abb. 52) und zu einem Teil in Astrozyten (anti-GFAP markiert, s. Abb. 49)
differenziert. Wir konnten außerdem zeigen, dass sich transplantierte Zellen in GAD67-posi-
tive Zellen differenziert hatten (s. Abb. 53 und Abb. 54). Anhand der 40 µm dicken Schnitte
konnte allerdings keine quantitative Analyse der Zelldifferenzierung durchgeführt werden.
Abb. 51 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte 3 Monate nach Transplantation von
Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläufer-
zellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die NeuN-positiven Neurone innerhalb des STN (Cy3-
markiert = rot); C Überlagerung, es wird deutlich, dass nur sehr wenige BrdU-positive Zellen auch positiv für
den Neuronenmarker NeuN gefärbt sind (gelb). Maßstabsbalken = 100 µm.
Ergebnisse
111
Abb. 53 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte drei Monate nach Transplantation von
Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt BrdU-positive Zellen im STN (Cy2-markiert = grün);
B zeigt, dass nur wenige der Zellen positiv für GAD67 sind (Cy3-markiert = rot); C Überlagerung.
Maßstabsbalken = 100 µm.
Abb. 52 Immunhistologisch-angefärbte Gehirn-
schnitte desselben Tieres aus Abb. 51 in einem
anderen Bereich. A zeigt die sequentielle Aufnahme
der BrdU-positiven Vorläuferzellen innerhalb des STN
(Cy2-markiert = grün); B zeigt die NeuN-positiven
Neurone innerhalb des STN (Cy3-markiert = rot);
C Überlagerung; D Vergrößerung, es wird deutlich,
dass nur sehr wenige transplantierte Zellen positiv für
den Neuronenmarker NeuN gefärbt sind (gelb; Pfeile).
Maßstabsbalken = 100 µm.
Ergebnisse
112
Abb. 54 Immunhistologisch-angefärbte Gehirnschnitte einer Ratte 3 Monate nach Transplantation von
Vorläuferzellen aus der MGE in den STN. A zeigt die sequentielle Aufnahme der BrdU-positiven Vorläufer-
zellen innerhalb des STN (Cy2-markiert = grün); B zeigt die GAD67-positiven Neurone innerhalb des STN;
C Überlagerung, es wird deutlich, dass nur wenige transplantierte Zellen positiv für GAD67 gefärbt sind. Maß-
stabsbalken = 100 µm.
Innerhalb der Transplantate und im Einstichkanal waren zudem sehr häufig Blutzellen vor-
handen (s. Abb. 55A). Ferner konnten wir regelmäßig eine Migration der Zellen aus der Ziel-
struktur beobachten (s. Abb. 55B). Besonders auffällig war dies nach Transplantationen in
den dicht gepackten STN. Eine akzidentielle Platzierung der Zellen in andere Regionen
konnte hier ausgeschlossen werden, da einerseits ein Teil des Transplantates innerhalb der
Zielregion lag, andererseits die Zellen zumeist einer nicht linearen Route in die jeweilige
Hirnregion folgten, die durch die Injektion mit einer starren Kanüle nicht beschreibbar gewe-
sen wäre.
Abb. 55 Thioninfärbungen von Zelltransplantaten fünf Wochen nach Transplantation in den STN. A zeigt
Erythrozyten innerhalb des Einstichkanals und des STN; in Aufnahme B ist die erwähnte Migration der trans-
plantierten Zellen aus dem STN in den zerebralen Pedunkel zu sehen. Maßstabsbalken = 100 µm.
Ergebnisse
113
5.5.7. Transplantation nach Status epileptikus
Im Hinblick auf spätere Arbeiten in chronischen Epilepsiemodellen wurden auch in dieser
Studie Tiere einem Pilokarpin-induzierten Status epileptikus ausgesetzt, um preliminär poten-
tielle Effekte einer Transplantation nach Hirninsult zu evaluieren, da es in der Literatur Hin-
weise auf eine bessere Überlebensrate und Integration von Zelltransplantaten in Gehirn-
regionen gibt, die nicht intakt sind, sondern pathologische Umstrukturierungen erfahren haben
(s. Abschnitt 2.4.3). Für allgemeine Informationen zur Statusauslösung s. Abschnitt 5.3.4. Bei
Tieren nach Status erfolgten einzelne Transplantationen von Vorläuferzellen aus der MGE
bilateral in die aSNr oder den STN. Die Zelltransplantationen in die aSNr wurden teilweise
als ganze Neurosphären, teilweise jedoch in einer Einzelzellsuspension durchgeführt. Die
einzelnen Gruppen bestanden nur aus 1-3 Tieren, unterschieden sich untereinander nicht und
wurden deshalb gemeinsam ausgewertet. Nach Transplantation der GABAergen Zellen erga-
ben sich keine Unterschiede im Vergleich zu den Basisschwellen (s. Abb. 56). Histologisch
und immunhistologisch glichen die Gehirne in STN / aSNr und die Zelltransplantate dem zu-
vor beschriebenen Bild.
Ergebnisse
114
Abb. 56 PTZ-Anfallsschwellen nach Injektion von Medium (A und B) oder Transplantation von MGE-
Vorläuferzellen in die anteriore SNr (C und D) bzw. Transplantation in den STN (E und F). Dargestellt
sind die Mittelwerte + SEM der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA. Die Kontrolltiere wurden
aufgrund der kleinen Gruppengröße für die anteriore SNr und den STN zusammengefasst. Ein Tier aus der Kon-
trollgruppe zog sich während der Basisschwellenmessung nach dem ersten Endpunkt die PTZ-Infusionskanüle
aus der Schwanzvene, so dass es einen Wert für den Endpunkt Myoklonus, nicht aber für den Klonus gibt.
Ergebnisse
115
5.5.8. Nachfolgestudie: Vorbehandlung der GABAergen Vorläuferzellen
5.5.8.1. In-vitro Studie
5.5.8.1.1. Kultivierung
Ohne Behandlung und nach Zugabe von Creatinmonohydrat oder Retinsäure setzten sich die
GABAergen Vorläuferzellen aus der MGE der Ratte innerhalb von 1-2 Tagen auf den Glas-
plättchen innerhalb der 6-well-Schalen ab. Valproat führte zu einer späteren Adhärenz, hier
dauerte es etwa 4 Tage. Aus adhärenten Neurosphären wanderten innerhalb kurzer Zeit ver-
schiedene Zelltypen aus, darunter morphologisch identifizierbar waren Astrozyten sowie Neu-
rone. Beide Zelltypen formten Ausläufer. Bei Neuronen wurden nach wenigen Tagen
Wachstumskegel sichtbar.
5.5.8.1.2. Immunhistologische Auswertung
Die Auswertung der Fluoreszenz-markierten Zellen auf den Glasplättchen ergab, dass in un-
behandelten Zellen nach 7 Tagen etwa 22,3 % der DAPI-markierten Zellen positiv für den
Astrozytenmarker GFAP waren. 13,9 % der Zellen exprimierten den neuronalen, nukleären
Marker NeuN. Die Färbung gegen GAD67 lieferte keine auswertbaren Ergebnisse (s. Abb.
57). In vorbehandelten Zellen lieferte die Vorbehandlung mit Creatinmonohydrat signifikant
weniger Astrozyten (12,1 %) als die Kontrolle (7 Tage kultiviert) (P<0,001). Auch eine Be-
handlung mit Retinsäure und Kaliumchlorid führte zu signifikant weniger Astrozyten im Ver-
gleich zu unbehandelten Zellen (11 Tage kultiviert) (P<0,05). Den größten Anteil an
Neuronen (36,4 %) zählten wir nach Behandlung der Zellen mit Valproat; hier ergab sich ein
signifikanter Unterschied zu unbehandelten Zellen (7 Tage kultiviert) (P<0,001). In diesem
Versuchsdurchgang war auch die Anfärbung für GAD67 erfolgreich: Das Protokoll für die
Generierung der größten Anzahl GAD67-exprimierender Zellen war die Behandlung mit Val-
proat, die zu 32,1 % GAD67-positiven Zellen führte. Die Behandlung mit Retinsäure und
Kaliumchlorid führte zu signifikant mehr GAD67-positiven Zellen (47,4 %) als unbehandelte
Kontrollzellen (11 Tage kultiviert), die zu 33,8 % GAD67-positiv waren (P<0,05; s. Abb. 57).
Da für die Verwendung des Protokolls nach BOSCH et al. (2004) mit einer sequenzierten
Retinsäure-Vorbehandlung und anschließender Kaliumchlorid-Depolarisation 11 Tage be-
nötigt wurden (s. Abschnitt 4.5.7), kultivierten wir auch unbehandelte Zellen für diese Zeit-
Ergebnisse
116
spanne. 21,5 % der DAPI-positiven Zellen waren ohne Behandlung nach 11 Tagen zu Astro-
zyten differenziert (s. Abb. 57). Neurone bildeten einen Anteil von 23,4 % der gesamten Zel-
len und 33,8 % exprimierten GAD67. Im Vergleich führte der Zusatz von Retinsäure und
Kaliumchlorid zu folgenden Anteilen: 14,3 % GFAP-positive Zellen, 29,1 % NeuN-positive
Zellen und 47,8 % GAD67-positive Zellen.
NeuN
Kontr
olle 7
dCM
VPA
RA/K
Cl
Kontr
olle 1
1d
0
20
40
60
***
n=24 n=47 n=39 n=24 n=8
% N
eu
N-p
osit
ive Z
ellen
GFAP
Kontr
olle 7
dCM
VPA
RA/K
Cl
Kontr
olle 1
1d
0
20
40
60
*** *
n=24 n=47 n=39 n=24 n=8% G
FA
P-p
osit
ive Z
ellen
GAD67
Kontr
olle 7
dCM
VPA
RA/K
Cl
Kontr
olle 1
1d
0
20
40
60
*
n=20 n=23 n=23 n=8% G
AD
67-p
osit
ive Z
ell
en
A B
C
5.5.8.2. In-vivo Studie
5.5.8.2.1. Schwellenmessungen nach Transplantation vorbehandelter Zellen
Es gab keine signifikanten Effekte auf die PTZ-Schwelle nach Transplantation von Zellen, die
7 Tage mit Valproat oder insgesamt 11 Tage mit Retinsäure/KCl vorbehandelt wurden (s.
Abb. 58). Auch eine Transplantation länger kultivierter, adhärenter MGE-Zellen, die bereits
erste Ausläufer bildeten, zeigte weder anti- noch prokonvulsive Wirkung (s. Abb. 58). In die-
Abb. 57 Immunhistologische Auswertung der in-vitro
Kultivierung. Anfärbung gegen NeuN (A), GFAP (B)
und GAD67 (C). Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM
der Auszählungen von Fotos der auf Glasplättchen
kultivierten Zellen in %. Sterne zeigen signifikante
Unterschiede zwischen der jeweiligen Vorbehandlung
und der dazugehörigen Kontrolle (für CA und VPA 7
Tage; für RA/KCl 11 Tage) an. One-way ANOVA, post
hoc: Bonferroni, * P<0,05; *** P<0,0001.
7d = 7 Tage; 11d = 11 Tage; CM = Creatinmonohydrat;
VPA = Valproat; RA/KCl = Retinsäure/Kaliumchlorid.
Ergebnisse
117
sen Gruppen wurden ebenfalls Kontrolltiere mit Medium injiziert, diese sind in die Kontroll-
gruppe aus Abb. 45 integriert.
Abb. 58 PTZ-Anfallsschwellen nach Transplantation vorbehandelter Vorläuferzellen aus der MGE,
Vorbehandlung mit Valproinsäure (A und B) oder Retinsäure und Kaliumchlorid (C und D). Dargestellt
sind die Mittelwerte + SEM der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.
Ergebnisse
118
5.5.8.2.2. Verhaltensbeobachtungen
Die Tiere zeigten analog der Transplantation GABAerger Vorläuferzellen ohne Vorbehand-
lung kein abweichendes Verhalten.
5.5.8.3. Quantitative Auswertung
Die Behandlung mit RA/KCl war die erfolgreichste im in-vitro Versuch (s. Abschnitt
5.5.8.1.2), um eine vermehrte Differenzierung in GABAerge Zellen zu forcieren. Daher
wurde in dieser Studie exemplarisch ein Gehirn mit Transplantat aus nicht vorbehandelten
Zellen und ein Gehirn mit vorbehandeltem (RA/KCl) Zelltransplantat an einem Kryostaten
geschnitten, um an den dünnen Präparaten eine Zellzählung auf GAD67-positive Zellen durch-
führen zu können. In dem Kontrollgehirn befand sich das Transplantat nur unilateral im STN,
darum wurde nur diese Seite ausgezählt: 11,9 % der BrdU-positiven, und damit transplan-
tierten Zellen, exprimierten GAD67 (s. Abb. 59). Im Vergleich lag die Rate an GABAergen
Zellen in den beiden Transplantaten vorbehandelter Zellen deutlich höher, bei 31,0 % aller
transplantierten Zellen innerhalb des STN. Insgesamt fanden sich lediglich etwa zwischen 500
und 3000 Zellen innerhalb des STN. Ursprünglich wurden 80000 Zellen pro Hemisphäre ein-
gesetzt. Zellen außerhalb des STN, z.B. im Einstichkanal, wurden nicht mitgezählt.
GAD67
Kontr
olle
RA/K
Cl
0
10
20
30
40
***
% G
AD
67-p
osit
ive Z
ell
en
n=16 n=85
Abb. 59 Immunhistologische Auswertung der Transplantation mit Retinsäure und Kaliumchlorid vorbe-
handelter Vorläuferzellen aus der MGE, Anfärbung gegen GAD67. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM
der Auszählung GAD67-positiver Zellen in % der transplantierten (BrdU-positiven) Zellen innerhalb des STN 5
Wochen nach Transplantation. Ausgezählt wurden unilateral 16 Schnitte eines Kontrollgehirnes nach Trans-
plantation unbehandelter Zellen und bilateral insgesamt 85 Schnitte eines Gehirnes nach Transplantation vorbe-
handelter Zellen. Sterne zeigen signifikante Unterschiede zwischen vorbehandelten und unbehandelten Zellen
an. Ungepaarter t-Test, *** P<0,0001.
Ergebnisse
119
5.6. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen
Die Kultivierung der NT2-Zellen fand größtenteils in den Laboratorien der AG Bicker statt.
5.6.1. Schwellenmessungen nach Transplantation von NT2-Zellen
Für die Transplantation von NT2-Zellen ergaben sich folgende Gruppen:
Tab. 6 Verwendete Versuchstiere für Studie II: Neurotransplantation von NT2-Zellen.
Ursprüngliche
Gruppengröße
Bilateral
getroffen
Hirnregion Zellart Transplantationssystem
12 8 (5 sicher)* STN Adulte NT2 Einzelzellsuspension mit
Glaskapillare/Hamiltonspritze
8 7 (3 sicher)* STN PBS + Ca, Mg Glaskapillare/Hamiltonspritze
8 7 (6 sicher)* aSNr NT2-Precursor
1 Tag geprimt
Hamiltonspritze
7 5 aSNr NT2-Precursor
1 Woche geprimt
Hamiltonspritze
5 4* aSNr PBS + Ca, Mg Hamiltonspritze
* histologisch nicht mehr nachweisbar, darum in Klammern die Anzahl der Tiere angegeben, bei denen die bi-
lateral korrekt gelegene Transplantation histologisch verifiziert werden konnte; ° PILO steht für Tiere nach Sta-
tus epileptikus
Die Transplantation adulter NT2-Neurone in den STN führte nicht zu signifikanten Schwel-
lenänderungen gegenüber der Basisschwelle (s. Abb. 60). Auch die Injektion von Vehikel
alleine (PBS mit Zusatz von Calcium und Magnesium) verursachte keine pro- oder antikon-
vulsiven Effekte.
Ergebnisse
120
Abb. 60 PTZ-Anfallsschwellen nach Transplantation adulter NT2-Neurone in den STN (A und B Kon-
trollinjektionen mit PBS + Ca und Mg, C und D Zelltransplantation. Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM
der PTZ-Anfallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.
Ebenso verhielt es sich nach Transplantation von NT2-Vorläuferzellen, die eine Woche mit
Retinsäure geprimt wurden (s. Abb. 61C und 61D). Auch eine Transplantation von nur einem
Tag geprimten NT2-Precursoren führte nicht zu signifikanten Schwellenänderungen (s. Abb.
61E und 61F).
Ergebnisse
121
Abb. 61 PTZ-Anfallsschwellen nach Transplantation von NT2-Vorläuferzellen. Kontrollinjektionen von
PBS + Ca und Mg (A und B), Zelltransplantation NT2-Vorläufern, die eine Woche (C und D) oder nur
einen Tag mit Retinsäure geprimt wurden (E und F). Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der PTZ-An-
fallsschwellen in mg/kg. One-way ANOVA.
5.6.2. Verhaltensbeobachtungen
Die Tiere zeigten nach Transplantation von adulten NT2-Neuronen oder –Vorläuferzellen
kein auffälliges Verhalten. Bei zwei Tieren mit Zelltransplantaten (NT2-Vorläuferzellen,
einen Tag mit Retinsäure geprimt) wurde jeweils ein generalisierter Anfall vor der Anfalls-
Ergebnisse
122
schwellenmessung fünf Wochen bzw. drei Monate nach Transplantation beobachtet, an die-
sem Tag wirkten die Tiere ängstlicher. Allerdings wurde in einem anderen Versuch ebenfalls
ein naives Tier vor Beginn von PTZ-Schwellenbestimmungen bzw. einer Neurotransplanta-
tion mit einem generalisierten epileptischen Anfall gesehen, so dass wir hier nicht von einem
Zusammenhang mit der Transplantation ausgehen.
5.6.3. Histologie
Die histologische Auswertung mit standardisierten Protokollen erwies sich als problematisch.
Besonders im Fall der Kontrolltiere konnte nach 3 Monaten in einigen Fällen (s. Tab. 6) kein
Einstichkanal mehr ausgemacht werden. Sicher als „nicht-getroffen“ klassifizierte Tiere
wurden aus der Auswertung ausgeschlossen, jedoch wurden in der Kontrollgruppe einige
Tiere mit unsicherer Histologie in die Auswertung miteinbezogen, da sonst die Gruppengröße
für eine statistische Auswertung zu stark reduziert worden wäre. Als absehbar war, dass es
keinen Effekt auf die Anfallsschwelle gab, wurden in einer späteren Transplantationsserie die
Tiere bereits nach 5 Wochen getötet, um die histologischen Befunde vor Verschwinden der
Gewebeverletzung durch die Glaskapillare rechtzeitig auswerten zu können (s. Abb. 62). In
einem Fall zeigte sich 5 Wochen nach Transplantation histologisch eine Abstoßungsreaktion
(s. Abb. 63).
Abb. 62 Thioninfärbung fünf Wochen nach Transplantation adulter NT2-Zellen in den STN. Aufnahme
A zeigt den STN eines Kontrolltiers (PBS + Ca und Mg) mit Erythrozyten an der Einstichstelle; B zeigt den STN
nach Zelltransplantation. Es wird deutlich, dass die Bilder sich, anders als nach der Transplantation GABAerger
Vorläuferzellen aus der Ratte, sehr ähneln, so dass die Vermutung nahe liegt, dass wenige NT2-Zellen überlebt
haben. Maßstabsbalken = 100 µm.
Ergebnisse
123
5.6.4. Immunhistologie
Es gab zunächst einige Schwierigkeiten mit dem immunhistologischen Nachweis der NT2-
Zellen sowohl in der AG Bicker als auch in unserem Institut. Mithilfe des monoklonalen An-
tikörpers gegen humanes Neurofilament (70 kDa) aus der Maus gelang uns aber der Nachweis
der adulten transplantierten Neurone im Nagerhirn (s. Abb. 64).
Abb. 63 Thioninfärbung fünf Wochen
nach Transplantation adulter NT2-
Zellen in den STN. Gewebereaktion
innerhalb und oberhalb des STN.
Maßstabsbalken = 100µm.
Abb. 64 Immunhistologisch-gefärbter Gehirnschnitt eines
Tieres 5 Wochen nach Transplantation von adulten NT2-
Neuronen. Die Zellen liegen innerhalb des Einstichkanals
oberhalb des STN. Maßstabsbalken = 100 µm.
Diskussion
124
6. DISKUSSION
6.1. Studie Ia: Fokale Substanzapplikation von Vigabatrin
Die Hypothese, dass durch fokale Applikation ähnlich antikonvulsive Effekte wie mit sys-
temischer Administration von Vigabatrin erzielt werden können, ist bestätigt worden. Die
maximale antikonvulsive Wirkung nach systemischer Vigabatrin-Injektion trat nach 6 Stun-
den auf. Die Effekte nach fokaler Applikation erreichten erst nach 24 bzw. 48 Stunden ihr
Maximum. Eine fokale, bilaterale Mikroinjektion in den STN war die effektivste Maßnahme
zur Erhöhung der PTZ-Anfallsschwelle. Diese fokale Intervention führte anders als die sys-
temische nicht zum Auftreten ausgeprägter Nebenwirkungen.
6.1.1. Der subthalamische Nukleus als geeignete Zielregion für fokale
Therapie
Die vorliegenden Daten belegen, dass der STN eine geeignete Zielstruktur für fokale Thera-
pieansätze mit Manipulation des GABAergen Systems darstellt. Interessanterweise war im
PTZ-Anfallsschwellentest die bilaterale Mikroinjektion von Vigabatrin in den STN deutlich
stärker antikonvulsiv wirksam als jeweils eine bilaterale Injektion in die Subregionen der SNr,
für die aufgrund literarischer Daten das Auftreten eines antikonvulsiven Effektes sehr wahr-
scheinlich war (LE GAL LA SALLE et al. 1983a; MCNAMARA et al. 1984; TURSKI et al.
1986; LÖSCHER et al. 1987; XU et al. 1991; SMOLDERS et al. 1997): Vor allem durch die
Arbeiten von VELÍŠKOVÁ et al. (1996a; 1998) gab es ambivalente Hinweise bezüglich der
Eignung der anterioren oder posterioren SNr als Zielregion für fokale Therapie. In unserer
Arbeit wirkte eine Injektion in die SNr antikonvulsiv, allerdings waren nur die Effekte einer
Mikroinjektion in den anterioren Teil der SNr gegenüber einer Kontrollinjektion mit NaCl
statistisch signifikant. Die aSNr konnte auch in einem elektrischen Anfallsmodell (Kindling)
als effektive Zielregion für die Erhöhung der Nachentladungsschwelle identifiziert werden
(NOLTE et al. 2006).
Vigabatrin wurde in der vorliegenden Studie erstmals in den STN appliziert, jedoch gab es
Vorgängerstudien, in denen andere antikonvulsiv wirkende Substanzen wie Muscimol, ein
GABAA-Rezeptor-Agonist, in verschiedenen Modellen für epileptische Anfälle bzw. Epilep-
sie eine antikonvulsive Wirkung entfaltete (DERANSART et al. 1996; VELÍŠKOVÁ et al.
1996b; DERANSART et al. 1998; DYBDAL u. GALE 2000). Der antikonvulsive Effekt wird
Diskussion
125
auf die Hemmung des indirekten Pfades des nigrostriatalen Systems zurückgeführt; durch
eine Inhibition des STN wird indirekt die SNr gehemmt. Die SNr erhält ihren exzitatorischen,
glutamatergen Input aus dem STN (ROBLEDO u. FEGER 1990; SLAGHT et al. 2002;
SHEN u. JOHNSON 2006; GALE et al. 2008) und eine bilaterale Hemmung des STN führt
zu einer reduzierten Aktivität der SNr (ROBLEDO u. FEGER 1990; FEGER u. ROBLEDO
1991). Unsere Beobachtung, dass eine Inhibition des STN wirksamer ist als eine direkte
Inhibition der SNr lässt weitere Wirkmechanismen annehmen:
1. Wir vermuten die Beteiligung anderer, zum STN efferent liegender, Hirnregionen.
Tatsächlich konnte in elektrophysiologischen Untersuchungen gezeigt werden, dass eine
Hemmung des STN Änderungen der elektrischen Entladungen während eines
epileptischen Anfalls im frontalen Kortex verursacht, die nicht über die SNr verschaltet
sind (USUI et al. 2005). Zusätzlich ist bekannt, dass der STN auch glutamaterge
Projektionen an den entopedunkulären Nukleus sendet (ROBLEDO u. FEGER 1990;
NAKANISHI et al. 1991). DYBDAL und GALE (2000) belegten dies durch die
Feststellung, dass eine einseitige Inhibition des entopedunkulären Nukleus, genau wie
die unilaterale Hemmung des STN, eine asymmetrische Haltung mit Drehung zur
kontralateralen Seite bei Versuchstieren hervorruft.
2. Im Vergleich zur SNr handelt es sich beim STN um ein sehr kleines Kerngebiet mit
dicht gepackten Neuronen. Das Volumen des STN der Ratte beträgt lediglich 0,8 mm3
mit 22,7x10³ Neuronen, während die gesamte Substantia nigra (inklusive der Pars
compacta) etwa 7 mal so groß ist und nur etwa 47,2x10³ Neurone in der Pars reticulata
aufweist (HARDMAN et al. 2002, s. Abb. 24, Abb. 26 und Abb. 28). Beide
Subregionen der SNr sind somit jeweils deutlich größer, haben aber eine geringere
Neuronendichte als der STN. Für den STN und die anteriore respektive posteriore SNr
wurden jedoch die gleichen Infusionsmengen an Vigabatrin verwendet. Wir vermuten
einen Unterschied in der Wirksamkeit darin, dass die Neurone des STN größtenteils von
Vigabatrin erreicht wurden, während dies eventuell in der anterioren bzw. posterioren
SNr nicht der Fall war. Zudem liegt Vigabatrin im Gehirn aufgrund des pH-Wertes
ionisiert vor, was die Diffusion durch das Gewebe erschwert (HAMMOND u. WILDER
1985).
Diskussion
126
Die geringe Größe des STN wäre also insofern ein Vorteil, als dass geringere Dosen und Vo-
lumina an Wirkstoff nötig wären, um antikonvulsive Effekte zu erzielen. Zudem ist der neu-
rochirurgische Zugang zum STN klinisch etabliert und wird bereits erfolgreich als Zielregion
für Hochfrequenzstimulationen bei Epilepsie und anderen das Zentralnervensystem betreffen-
den Krankheiten verwendet (BENABID et al. 2000a; BENABID et al. 2000b; CHABARDES
et al. 2002; KAHANE u. DEPAULIS 2010; AL-OTAIBI et al. 2011; LEHMAN u.
AUGUSTINE 2012; VONCK et al. 2012). Die hochfrequente Stimulation führt zu einer
signifikanten Reduktion der Anfallsfrequenz, allerdings erreichen die Patienten keine Anfalls-
freiheit (LÖSCHER 2009b). Es bleibt zu klären, ob eine pharmakologische Inhibition des
STN der elektrischen Inhibition überlegen sein könnte.
Für eine klinische Translation wäre eine kontinuierliche Vigabatrin-Applikation nötig, hier
bleibt zu evaluieren, ob es nach fokaler Applikation zu Toleranzentwicklung kommen kann,
denn nach systemischer Gabe wurde dieses Phänomen tierexperimentell beobachtet
(LÖSCHER et al. 1987). Zudem wurde durch Läsion des STN eine subsequente Hochregula-
tion von NMDA-Rezeptoren in der SNr beobachtet, die wiederum zu einer erhöhten
Empfindlichkeit gegenüber exzitatorischen Impulsen führen könnte und die durch den STN
vermittelte Hemmung aufhebt (PRICE et al. 1993). Außerdem könnten nach Manipulationen
des Netzwerkes Veränderungen auftreten, da der STN über reziproke Verbindungen mit der
SNr verbunden ist (GRAYBIEL 1999). Wie bei HANDRECK et al. (2012) diskutiert, könn-
ten eine Hemmung des STN und die folgende indirekte Hemmung der SNr in einer verzöger-
ten Enthemmung des STN resultieren.
6.1.2. Zeitverlauf der antikonvulsiven Wirkung
Wir beobachteten nach fokaler Vigabatrin-Injektion einen späteren Wirkeintritt im PTZ-Mo-
dell als nach systemischer Administration. Eventuell wird die Substanz nach systemischer
Gabe im zentralen Nervensystem schneller verteilt als nach fokaler Applikation, wo sie von
Diffusionsvorgängen abhängig ist. So konnte das systemisch verabreichte Vigabatrin auch auf
andere anfallsmodulierende Hirnregionen wirken als lediglich auf die Zielstruktur selbst. Die
Verteilung von Vigabatrin im Gehirn erfolgt nicht gleichmäßig (TONG et al. 2009): Viga-
batrin konnte bereits 15 Minuten nach intraperitonealer Applikation in der Extrazellular-
flüssigkeit des frontalen Kortex und Hippokampus nachgewiesen werden. Im Kortex wurden
doppelt so hohe Konzentrationen wie im Hippokampus erreicht. Außerdem resultiert die
Diskussion
127
Hemmung des Abbaus von GABA nicht in einem gleichmäßigen Anstieg des synaptosomalen
GABA über verschiedene Hirnregionen (LÖSCHER et al. 1989b). Eine Messung 4 und 48
Stunden nach intraperitonealer Vigabatrin-Injektion (1200 mg/kg) ergab, dass beispielsweise
im Hippokampus schon 4 h nach Behandlung ein Maximum an GABA in Nervenendigungen
vorlag, während dies etwa im Thalamus erst nach 48 h geschah. Dies ist wahrscheinlich auf
die ungleichmäßige Verteilung des physiologischen GABA-Levels und der GABA-Trans-
aminase über die Hirnregionen zurückzuführen (LÖSCHER et al. 1989b). Zudem war in der
vorliegenden Arbeit die systemische Dosierung wesentlich höher als die fokale, so dass trotz
eines ungünstigen Hirn/Plasma-Verhältnisses von 0,025 (SILLS et al. 2003) eine höhere
Vigabatrin-Konzentration das ZNS erreicht haben könnte. Ungeachtet dessen wurde durch die
spezifische Manipulation des STN ein stärkerer bzw. vergleichbarer antikonvulsiver Effekt
erzielt, was rückschließen lässt, dass das Vigabatrin erst nach Diffusion durch die Zielstruktur
seine volle antikonvulsive Potenz entfaltete. Durch den hohen Ionisierungsgrad diffundiert
Vigabatrin nur langsam durch das Gewebe, zudem konkurriert es mit endogenem GABA um
die Bindungsstelle an der GABA-Transaminase (HAMMOND u. WILDER 1985). Diese
These wird gestützt durch Arbeiten der Gruppe von Karen Gale, in denen ein höheres Injek-
tionsvolumen (1 µl) verwendet wurde, das zu einem schnelleren Wirkeintritt führte (CASU u.
GALE 1981; IADAROLA u. GALE 1982). Nach intranigraler Mikroinjektion wurde auch im
Kindling-Modell ein später Wirkeintritt berichtet (LE GAL LA SALLE et al. 1983a;
MCNAMARA et al. 1984; LÖSCHER et al. 1987).
Neben diesen Erklärungsansätzen könnte der Zeitverlauf der antikonvulsiven Wirkung außer-
dem einerseits von der Wirkung über andere, anatomisch nahe gelegene Hirnregionen oder
vom gewählten Anfallsmodell abhängig sein.
6.1.3. Spezifität der beobachteten Effekte auf die untersuchten Hirn-
regionen
Ein zur systemischen Injektion vergleichsweise später Wirkeintritt nach fokaler Injektion in
den STN könnte kausal auf die Interaktion von Vigabatrin mit verschiedensten Hirnregionen
zurückgeführt werden. In bisherige Studien zur fokalen Applikation von Vigabatrin und deren
Effekte auf die GABA-Konzentration wurde der STN nicht einbezogen, so dass nicht auszu-
schließen ist, dass die Erhöhung des synaptosomalen GABA im STN 24 Stunden nach Injek-
tion von Vigabatrin höher ist als in den anderen untersuchten Regionen (LÖSCHER et al.
Diskussion
128
1989b; TONG et al. 2009). Obwohl in dieser Arbeit keine GABA-Gehalte in freien Nerven-
endigungen gemessen wurden, könnte die starke antikonvulsive Wirkung nach intrasubthala-
mischer Mikroinjektion auf einen Anstieg von GABA im STN zurückzuführen sein.
Wie angesprochen, könnte die verzögerte Wirkung nach fokaler Vigabatrin-Injektion durch
die langsame Diffusion der Substanz durch die Zielregion begründet sein. IADAROLA und
GALE (1981; 1982) zeigten, dass innerhalb von 6 Stunden nach fokaler Vigabatrin-Injektion
die maximale GABA-Konzentration in einem Radius von 1,5 mm im Hirngewebe um den
Injektionslocus messbar war, 24 Stunden post injectionem war es ein Radius von 3 mm. Wer-
den diese Ergebnisse in Betracht gezogen, könnten die starken antikonvulsiven Effekte, die
erst 24 Stunden nach intrasubthalamischer Mikroinjektion eintraten, auch auf eine Wirkung
von Vigabatrin in anderen, anatomisch nahe gelegenen Hirnregionen zurückzuführen sein.
Der Injektionsort wäre in diesem Fall nicht gleichzustellen mit dem Wirkort von Vigabatrin.
Möglicherweise lässt sich die Wirkung nach Injektion in den STN durch eine Diffusion oder
durch eine nachfolgende Erhöhung von GABA in der SNr erklären: Die GABAergen Projek-
tionsneurone, welche die SNr vom Striatum erreichen, verlaufen tatsächlich entlang des STN
(HAMANI et al. 2004). So könnte eine Erhöhung von GABA in der Nähe dieser GABAergen
Projektionen zu einer direkten Aktivierung membranaler Kanäle dieser Axone führen, die
wiederum die Ausschüttung von GABA innerhalb der SNr und damit eine postsynaptische
Inhibition bedingen könnte (vgl. BÄHNER et al. 2011). Dennoch ist eine Wirkung über die
SNr unwahrscheinlich, da der beobachtete Effekt nach Injektion in den STN stärker war als
nach Injektion in die SNr. Um die Spezifität des Effektes weiter zu testen, analysierten wir
zusätzlich Injektionen, die nur einseitig korrekt im STN platziert waren und kontralateral in
eine direkt dorsal oder ventral gelegene Hirnregion platziert wurden. Es wurden auch
Injektionen in die Auswertung miteinbezogen, die beidseits außerhalb des STN lagen. Für den
ersten Endpunkt der PTZ-Infusion, den Myoklonus, waren folgende Injektionen zur Erhöhung
der Anfallsschwelle am effektivsten:
bilateral in den STN
einseitig: STN, kontralateral: SNr
einseitig STN, kontralateral <0,5 mm dorsal des STN.
Diskussion
129
Einzig eine Injektion, die einseitig im STN und auf der anderen Seite in der SNr platziert war,
vermochte hingegen die deutliche Wirkung auf die Schwelle zur Auslösung eines Klonus ei-
ner bilateralen Mikroinjektion in den STN reproduzieren. Einseitig dorsal gelegene In-
jektionen waren wirksamer als ventrale, was den Schluss legitimiert, dass eine Diffusion in
den STN der dorsal gelegenen Injektionsareale für den Effekt verantwortlich sein könnte. Zu
einem großen Teil lagen dorsal des STN platzierte Injektionen in der Zona incerta. Die Zona
incerta bildet Verbindungen zu Strukturen der Basalganglien aus, vor allem zur SNr und dem
Pedunkulopontinen Nukleus (MITROFANIS 2005). Ein großer Teil dieser Verbindungen ist
glutamaterg, so dass die Zona incerta ähnlich dem STN einen exzitatorischen Eingang in die
SNr hat (HEISE u. MITROFANIS 2004). Eine Hemmung der Zona incerta könnte demzu-
folge auch zu antikonvulsiven Effekten geführt haben, dennoch ist der Effekt nach bilateraler
Mikroinjektion in den STN deutlicher, so dass davon auszugehen ist, dass die antikonvulsive
Wirkung hauptsächlich über eine Inhibition des STN erzielt wurde. Bilateral dorsal außerhalb
des STN platzierte Injektionen waren weniger effektiv als einseitige, wiederum ein Beleg für
die Spezifität des antikonvulsiven Effektes nach intrasubthalamischer Injektion. Ähnliche
Ergebnisse erzielten auch DYBDAL und GALE (2000) für Muscimol-Injektionen in den STN
im Bicucullin-Modell.
Zusätzlich wurde in einer Gruppe von Tieren Vigabatrin bilateral in das zentrale, rostral des
Globus pallidus gelegene, Striatum injiziert, ebenfalls eine Region, in der nach Mikroinjek-
tion antikonvulsive Effekte im Kindling-Modell beobachtet wurden, die allerdings weniger
ausgeprägt waren als nach intranigraler Injektion (LE GAL LA SALLE et al. 1983b). Gegen
eine Induktion generalisierter Anfälle mit Pilokarpin zeigte die prophylaktische, intrastriatale
Injektion von Vigabatrin jedoch keinen protektiven Effekt (TURSKI et al. 1986). Ähnlich der
ambivalenten Ergebnisse zur Eignung der Subregionen der SNr sind hier sicherlich Dosie-
rungs-, Modell- und Tiervariationen, sowie die genaue Lokalisation innerhalb des Striatums
für den unterschiedlichen Ausgang der Studien verantwortlich. Anzumerken ist, dass keine
der uni- oder bilateral außerhalb des STN gelegenen Injektionen zu einem schnelleren Eintritt
des maximalen Effektes führte als eine bilaterale Mikroinjektion. Insgesamt war eine bilate-
rale Injektion in den STN allen anderen Applikationsrouten in ihrer antikonvulsiven Wirkung
überlegen, was einen Beweis für die Spezifität des Effektes darstellt.
Diskussion
130
6.1.4. Gewähltes Anfallsmodell
Im PTZ-Test wurden bereits früher für systemische und fokale Vigabatrin-Administration
antikonvulsive Effekte gezeigt: LÖSCHER (1982) berichtete einen signifikanten Schwellen-
anstieg nach 490 mg/kg Vigabatrin (i.p.) im PTZ-Anfallsschwellentest bei Mäusen. Auch bei
subkutaner Bolusdeposition von PTZ konnte LÖSCHER (1980) sechs Stunden nach Viga-
batrin-Administration (ED50 = 940 mg/kg) Anfälle bei 50 % der Mäuse verhindern. Ähnliche
Ergebnisse wurden auch in anderen Arbeitsgruppen erzielt - eine Untersuchung ergab bei-
spielsweise, dass die ED50 für Vigabatrin 4 Stunden nach intraperitonealer Applikation bei
Mäusen bei 622,4 mg/kg lag (LUSZCZKI et al. 2008). Bei Ratten induzierte eine prophylakti-
sche, systemische Administration von 1000-1500 mg/kg Vigabatrin zu verschiedenen Zeit-
punkten vor wiederholten, intraperitonealen PTZ-Injektionen bzw. einer Bolusinjektion ana-
log einen antikonvulsiven Trend bzw. antikonvulsive Effekte (MYSLOBODSKY et al. 1979;
SAYIN et al. 1993). Ebenso wirkte die intraperitoneale Injektion von hohen Dosen Vigabatrin
(1200 mg/kg) 24 Stunden vor subkutaner PTZ-Injektion antikonvulsiv bei adulten und juve-
nilen Ratten. Dagegen konnten HOLLAND et al. (1992) keinen antikonvulsiven Effekt von
Vigabatrin auf PTZ-induzierte Anfälle demonstrieren.
Ähnlich diskrepante Daten wurden auch nach fokaler Injektion von Vigabatrin in die Sub-
stantia nigra pars reticulata generiert: Die ersten Studien stammen von IADAROLA und
GALE (1982), die einen antikonvulsiven Effekt auf intravenös verabreichtes PTZ berichteten
und diesen auf eine Erhöhung von GABA in der SNr zurückführten. Wenig später wurde je-
doch in einer anderen Arbeitsgruppe aus den USA berichtet, dass intranigrale Injektionen von
Vigabatrin nicht gegen PTZ-induzierte Anfälle wirkten (MILLER et al. 1987). Zusammen-
fassend gibt es keine Studie, in der die systemische Administration von Vigabatrin mit einer
fokalen Applikation im PTZ-Modell miteinander verglichen wurde. Dies ist ein entscheiden-
der Ansatz für Kritik gegenüber einem Großteil der genannten Arbeiten, denn für das Treffen
einer Aussage über die Effektivität der fokalen Manipulation ist der Vergleich mit systemi-
schen therapeutischen Manipulationen unabdingbar. Als „proof-of-principle“ für die höhere
Effektivität einer fokalen Therapie mit Phenytoin im Vergleich zur systemischen Administra-
tion gilt eine Studie von KELSO et al. (2005): Systemische Phenytoin-Administration hatte
keinen Einfluss auf fokal durch Tetanustoxin induzierte Anfälle, während eine intrazerebrale
Applikation von Phenytoin zu einer reversiblen Anfallsreduktion führte und im Gegensatz zur
Diskussion
131
systemischen Therapie keine Nebenwirkungen hervorrief. Die einzige Arbeit, die systemische
und lokale Wirkungen von Vigabatrin gegenüberstellte, ist eine Studie von SMOLDERS et al.
(1997). Hier wurde zur Anfallsauslösung Pilokarpin intrahippokampal infundiert. Die syste-
mische Vigabatrin-Injektion war effektiver in der Anfallsunterdrückung als eine fokale Injek-
tion in die SNr oder in den Hippokampus (keine genaue Region genannt, die Koordinaten
waren nach dem Atlas von Paxinos und Watson: AP – 5,6; L 4,6; DV -4,6). In unseren
Untersuchungen im PTZ-Anfallsschwellentest zeigte sich eine fokale Injektion in die SNr
nicht effektiver als eine systemische Vigabatrin-Administration. Des Weiteren sind unsere
Daten mit Resultaten aus früheren Kindling-Studien unserer Arbeitsgruppe konsistent
insofern, dass eine bilaterale Mikroinjektion von Vigabatrin (10 µg) in die SNr die
Anfallsschwere und -dauer 24 bis 48 Stunden senkt (LÖSCHER et al. 1987). Zudem führten
in einer Studie von NOLTE et al. (2006) Injektionen von Vigabatrin in die aSNr ebenfalls zu
einer Erhöhung der Nachentladungsschwelle in gekindelten Ratten. Des Weiteren konnten wir
und andere Gruppen zeigen, dass die Transplantation einer striatalen GABAergen Zelllinie in
Basalganglienregionen sowohl im Kindling-, Kainat- als auch im PTZ-Modell zu antikonvul-
siven Effekten führt (NOLTE et al. 2008; CASTILLO et al. 2008; HANDRECK et al. 2012).
Die Übereinstimmung dieser modellübergreifenden Ergebnisse lässt den Schluss zu, dass Er-
gebnisse zu einer Manipulation des GABAergen Systems mittels Vigabatrin aus dem PTZ-
Test sich auf weitere experimentelle Epilepsiemodelle und somit auch auf andere Anfalls-
typen übertragen lassen.
Ausblickend auf künftige Arbeiten wäre es nun sinnvoll, die gewonnenen Ergebnisse in ei-
nem Modell für Temporallappenepilepsie zu validieren. Daher haben wir bereits überprüft, ob
der PTZ-Test und Vigabatrin-Injektionen auch einige Wochen nach Status epileptikus durch-
führbar wären. In der Vergangenheit konnten wir bereits in einem anderen Rattenstamm zei-
gen, dass sich die Dosis an PTZ, die für die Auslösung eines generalisierten Krampfanfalls
nötig ist, ab einem bestimmten Zeitpunkt nach Status nicht verändert (RATTKA et al. 2011),
was in der vorliegenden Studie für die verwendeten Wistarratten bestätigt werden konnte.
Nach fokaler Verabreichung von Vigabatrin erreichten die Schwellenänderungen nicht das
statistische Signifikanzniveau, jedoch ist wahrscheinlich, dass dies an der geringen Gruppen-
größe (n=3) dieses preliminären Versuches lag. Die nächsten Schritte werden nun Untersu-
Diskussion
132
chungen in chronisch epileptischen Tieren mit einer kontinuierlichen Gabe von Vigabatrin
beinhalten.
6.1.5. Vor- und Nachteile fokaler gegenüber systemischer Therapie
Ein Hauptvorteil einer fokalen, gerichteten Therapie gegenüber der konventionellen, systemi-
schen Behandlung ist das reduzierte Potential für schwere Nebenwirkungen. Die Substanz-
wirkung erstreckt sich nicht auf den Gesamtorganismus, sondern nur auf Hirnregionen, die an
der Anfallsentstehung, -weiterleitung und -modulation beteiligt sind (FISHER u. HO 2002;
NILSEN u. COCK 2004; ROGAWSKI 2009; AL-OTAIBI et al. 2011; BRÖER et al. 2012).
Antiepileptika wie Vigabatrin müssen systemisch in relativ hohen Dosierungen verabreicht
werden, um in ausreichender Menge die Bluthirnschranke zu überwinden und somit wirksame
Konzentrationen im Gehirn zu erreichen (PAULSON et al. 1982; SILLS et al. 2003). Fokal ist
durch das Umgehen der Bluthirnschranke eine wesentlich geringere Dosis an Vigabatrin nö-
tig, um die gewünschten Effekte zu erzielen, so dass wiederum die Gefahr für das Auftreten
von unerwünschten Nebenwirkungen gesenkt wird. In dieser Arbeit konnte im direkten Ver-
gleich belegt werden, dass die systemische Administration von Vigabatrin zu Sedation führt
und signifikante Gewichts- und Temperaturverluste verursacht, während diese Nebenwirkun-
gen nach fokaler Therapie, die eine vergleichbare bzw. sogar bessere Wirksamkeit aufwies,
nicht auftraten bzw. moderater verliefen. Im Dosisvergleich unserer Studie und dem Abgleich
mit Literaturdaten wird deutlich, dass für einen vergleichbaren antikonvulsiven Effekt sys-
temisch ein Vielfaches der fokalen Dosis verabreicht wurde (JUNG et al. 1977; GALE u.
IADAROLA 1980; LÖSCHER 1980): Bei einer Dosierung von 1200 mg/kg erhielt in dieser
Arbeit eine durchschnittlich 250 g schwere Ratte 300 mg Vigabatrin systemisch, aber bei fo-
kaler Applikation nur je 10 µg Vigabatrin pro Hirnhemisphäre. Eine Erklärung für die hohe
systemische Dosis im Vergleich zur fokalen Dosis ist das schlechte Hirn/Plasma-Verhältnis
von Vigabatrin, das bei etwa 0,025 liegt (SILLS et al. 2003). Somit erreichen nur 2,5 % der
Plasmakonzentration das Gehirn, da Vigabatrin bei physiologischen pH-Werten vornehmlich
ionisiert vorliegt und nicht über passive Diffusion die Bluthirnschranke passieren kann
(HAMMOND u. WILDER 1985).
Zudem besagt eine der Hypothesen zur Entstehung von Pharmakoresistenz, dass das Nichtan-
sprechen auf Antiepileptika auf eine Überexprimierung von Efflux-Transportern an der Blut-
Diskussion
133
hirnschranke zurückzuführen sein könnte (LÖSCHER u. POTSCHKA 2005). Durch die intra-
zerebrale Substanzapplikation werden diese Multi-Drug-Transporter umgangen.
Die schnelle Diffusion der Antiepileptika durch das Gewebe führt jedoch zu einer schnellen
Aufnahme in die Zerebrospinalflüssigkeit. Über den sogenannten „bulk flow“ gelangen
Substanzen an den arachnoidalen Villi aus der Zerebrospinalflüssigkeit in das periphere Blut
(PARDRIDGE 2011). Für die Verwendung von Antiepileptika wäre daher eine chronische
Applikation unverzichtbar. Selbst eine potentiell längerfristig wirkende, fokale Therapie mit
Neurotoxinen, die kaum Diffusion zeigen, müsste intermittierend wiederholt werden.
Hier liegt der Nachteil der fokalen Therapie, denn die dauerhafte Implantation eines Katheters
in die Zielregion ist im Vergleich zur systemischen Therapie ein invasiver operativer Eingriff.
Aus diesem Grund kann die fokale Therapie nur für Patienten eine Option darstellen, für die
aufgrund von Pharmakoresistenz nur noch die resektive Chirurgie als mögliche Alternative
zur Wahl steht. Konträr zur partiellen Resektion von Hirngewebe ist jedoch die fokale,
pharmakologische Therapie reversibel und kann bei Nichtansprechen des Patienten oder
unerwünschten Nebenwirkungen modifiziert bzw. beendet werden.
Diskussion
134
6.2. Studie Ib: Fokale Substanzapplikation von Botulinumtoxin B
In der vorliegenden Arbeit traten entgegen der Hypothese keine antikonvulsiven Effekte nach
intrahippokampaler Injektion von Botulinumtoxin B auf. In den ersten Tagen nach CED gab
es keine Schwellenänderungen, 7 Tage nach Behandlung kam es erstmals zu prokonvulsiven
Effekten. Zudem wurden spontane Anfälle und Verhaltensänderungen beobachtet. Für diese
Wirkungen gibt es verschiedene Erklärungsansätze, die sich auf das Tiermodell, die gewählte
Substanz und Dosierung sowie, am wahrscheinlichsten, auf den Injektionsort beziehen.
6.2.1. Gewählte Zielregion
Konträr zu dem Ergebnis der vorliegenden Studie wurden in anderen Anfalls- oder Epilep-
siemodellen antikonvulsive Effekte nach intrazerebraler BTX-Infusion verschiedener
Toxovare beobachtet. Wie bereits erwähnt, zeigten unveröffentlichte Daten der AG Rogawski
einen antikonvulsiven Effekt nach BTX B-Infusion im Amygdala-Kindling-Modell. Die
wahrscheinlichste Erklärung für die diskrepanten Ergebnisse ist die Wahl der Zielregion für
die fokale Behandlung mit BTX B. In der Kindling-Studie von Rogawski und Kollegen wurde
BTX B fokusnah in die basolaterale Amygdala infundiert. Die extrinsischen Projektionen des
basolateralen Kerns der Amygdala, die vor allem in temporale und extra-temporale
Hirnregionen verlaufen, sind hauptsächlich glutamaterg (ARONIADOU-ANDERJASKA et
al. 2007). Eine Erregung dieser Neurone spielt bei der Entstehung von epileptischer
Anfallsaktivität eine große Rolle; die genauen Mechanismen sind noch nicht genau aufgeklärt
(ROGAWSKI et al. 2003; ARONIADOU-ANDERJASKA et al. 2007).
Im Vergleich ist der Hippokampus eine sehr heterogene Hirnregion, in der sowohl
inhibitorische als auch exzitatorische Neurone vorliegen. Anfallsaktivität kann durch die
glutamatergen Neurone amplifiziert werden (RIBAK et al. 1985; MCINTYRE und
SCHWARTZKROIN 2008). Die intrahippokampale Injektion prokonvulsiver Substanzen wie
Kainat oder Pilokarpin ist seit Jahren eine etablierte Methode, um fokale Anfälle auszulösen
und chronisch epileptische Tiere für die experimentelle Forschung zu generieren (s. Abschnitt
2.1.3). Nach Auslösen eines Status epileptikus (primärer Hirninsult) führen diese fokalen
Epilepsiemodelle nach einer gewissen Latenzzeit zu spontan auftretenden Anfällen und
neurodegenerativen Veränderungen in der Zielstruktur. Eine Substanz, die ebenfalls seit
Jahrzehnten in Tiermodellen für Epilepsie genutzt wird, ist das Tetanustoxin. Hippokampale
Diskussion
135
Injektion von Tetanustoxin verursacht ein transientes epileptiformes Syndrom mit spontanen
Anfällen, Hyperkinesie und intermittierendem aggressivem Verhalten in Ratten
(MELLANBY et al. 1977). In der ersten Studie zur Generierung epileptischer Anfälle durch
Tetanustoxin zeigten MELLANBY et al. (1977), dass dosisabhängig innerhalb von 2 Wochen
post injektionem spontane Anfälle auftraten. Eine Erklärung für das Auftreten prokonvulsiver
Effekte könnte demnach das Auslösen eines Insults im Hippokampus durch die Applikation
von Botulinumtoxin B darstellen, der subsequent zur Entwicklung eines epileptischen Fokus
führte. Es lässt sich kontrovers diskutieren, ob es sich bei den Anfällen nach Tetanustoxin und
ebenso bei den von uns beobachteten Anfällen nach Botulinumtoxin B tatsächlich um
spontane oder vielmehr um insult-assoziierte Anfälle handelt, da kaum eine Latenzperiode bis
zum Auftreten der Anfälle stattfindet (SLOVITER 2008).
Tetanustoxin ist wie Botulinumtoxin ein von Clostridien produziertes Toxin und wirkt über
eine präsynaptische Hemmung vor allem inhibitorischer Neurone; das spezifische Substrat ist
ebenfalls Synaptobrevin (BERGEY et al. 1987; CALEO u. SCHIAVO 2009). Sollte demzu-
folge das Botulinumtoxin B tatsächlich vermehrt auf GABAerge Neurone wirken (s. Ab-
schnitt 6.2.5), könnte die CED von Botulinumtoxin B mit der hippokampalen Tetanustoxin-
Injektion verglichen werden. Dafür spräche, dass ähnliche Verhaltens-änderungen auftraten
(s. Abschnitt 5.4.3). In der vorliegenden Arbeit wurden die Tiere direkt nach Abschluss der
Experimente (etwa 3 Wochen nach CED) getötet, so dass keine Aussage über die Dauer des
epileptischen Syndroms getroffen werden kann.
Eine weitere Möglichkeit, die zur Entstehung eines Fokus bzw. plastischer Netzwerkverände-
rungen geführt haben könnte, ist das Einbringen von Serumalbumin in das Gehirn durch die
Trägersubstanz. Es wurde belegt, dass pathologische Störungen der Bluthirnschranke zu einer
Extravasation von Albumin in das Gehirn führen und die Bildung eines epileptischen Fokus
innerhalb von 4-7 Tagen bedingen können (SEIFFERT et al. 2004; FRIEDMAN et al. 2009).
Auch die direkte, kortikale Applikation von 0,1 mM, 0,2 mM und 0,4 mM (analog 25-100 %
normaler Serumlevel) Albumin führte zu paroxysmaler Aktivität an Slice-Kulturen aus Rat-
ten-Gehirnen (SEIFFERT et al. 2004). Kürzlich wurde gezeigt, dass Albumin von Astrozyten
aufgenommen wird und rapide zu Veränderungen an Ionenkanälen und Transmittern führt,
die wiederum Hyperaktivität und eine beginnende Epileptogenese bedingen können
(BRAGANZA et al. 2012). In der Studie von SEIFFERT et al. (2004) gab es nach Applika-
Diskussion
136
tion von 10 % des Serumspiegels an Albumin keine Unterschiede zu Sham-operierten Tieren.
In der vorliegenden Arbeit lag die Konzentration an Albumin bei 0,05 %, das entspricht
0,0077 mM und damit deutlich unter der Konzentration von 0,1 mM, die nötig war, um epi-
leptische Aktivität auszulösen. Zudem entwickelten Kontrolltiere, denen lediglich Vehikel
ohne Toxin appliziert wurde, weder Verhaltensänderungen noch epileptische Anfälle (s. Abb.
40 und Tab. 4). Im PTZ-Test verursachte die Vehikel-Applikation hingegen sogar antikonvul-
sive Effekte (s. Abb. 37). Wir vermuten als Ursache einen Volumeneffekt, der auch einmalig
nach Injektionen von NaCl in die Basalganglienregionen auftrat (s. Abb. 25). Ebenfalls denk-
bar wäre eine Immunreaktion, die auf den Gebrauch von humanem Serumalbumin zurückzu-
führen sein könnte und die zu verminderter Erregbarkeit führte. Da auch in der Toxinlösung
gleiche Mengen an Vehikel vorhanden waren, ist der prokonvulsive Effekt von
Botulinumtoxin B möglicherweise sogar durch das Vehikel maskiert. Besonders hervorzuhe-
ben ist dieser gegenteilige Effekt an Tag 7 nach Injektion, an dem die reine CED von Vehikel
antikonvulsiv wirkte, die CED von Botulinumtoxin B dagegen prokonvulsiv (s. Abb. 37).
6.2.2. Gewähltes Anfallsmodell
Während für eine Reihe von Substanzen, die über das GABAerge System wirken, ein anti-
konvulsiver Effekt im PTZ-Test beschrieben ist (s. Abschnitt 4.2), gibt es in der Literatur Be-
lege dafür, dass Antiepileptika mit anderen Wirkmechanismen gar nicht oder sogar prokon-
vulsiv wirken. Beispiele sind Phenytoin und Carbamazepin (LÖSCHER et al. 1991;
MECARELLI et al. 1997). Diese Substanzen agierten hingegen in anderen Modellen protek-
tiv gegen Anfälle und wurden daher klinisch getestet und zugelassen. Ein prokonvulsives
Potential im PTZ-Test allein reicht daher nicht aus, um eine Vorhersage zu der klinischen
Wirkung der Substanz am Patienten treffen zu können (BANKSTAHL et al. 2012). In der
vorliegenden Studie kann durch das Auftreten insult-assoziierter und spontaner Anfälle, sowie
der beschriebenen Verhaltensänderungen, davon ausgegangen werden, dass die im PTZ-Mo-
dell beobachtete Anfallsschwellensenkung prädiktiv für die prokonvulsiven Effekte einer
intrahippokampalen Applikation von Botulinumtoxin B waren.
6.2.3. Gewählte Dosierung und Infusion
Möglicherweise wurde die Botulinumtoxin B-Dosis von uns zu hoch gewählt, so dass es zu
toxischen Effekten kam, die subsequent durch unbekannte Mechanismen zu einer erhöhten
Diskussion
137
Anfälligkeit gegenüber PTZ führten. Auch von Antiepileptika ist bekannt, dass eine extreme
Überdosierung prokonvulsive Effekte haben kann, zum Beispiel für Carbamazepin
(MECARELLI et al. 1997). Laut einer Studie aus der AG Rogaswki (Zolkowska, Ancona,
Rogawski; unveröffentlichte Daten) kam es in der Vergangenheit nach der intrazerebroventri-
kulären Applikation sehr hoher, außerhalb der therapeutischen Breite liegender Dosen Botu-
linumtoxin B zum Auftreten spontaner Anfälle bei Ratten desselben Stammes und Ge-
schlechts. Ein unerwünschtes Entweichen von Substanz nach CED in die Zerebrospinal-
flüssigkeit ist beschrieben (VARENIKA et al. 2008) und stellt gerade für die Verwendung
systemisch toxischer Substanzen ein Risiko dar. In der AG Rogawski wurde daher in einer
Toxizitätsstudie ermittelt, welche Dosierung an Botulinumtoxin B zu Verhaltensänderungen
oder anderen Auffälligkeiten führte. Zu diesem Zweck wurden wiederholt steigende Dosen
infundiert, bis es zu Verhaltensänderungen oder spontanen Anfällen kam. Für die Auslösung
dieser Nebenwirkungen waren immer wiederholte Injektionen von Botulinumtoxin B nötig,
unter einer Dosis von 2500 Units kam es nicht zu den beschriebenen Auffälligkeiten. In der
vorliegenden Arbeit wurde eine 2,5-fach geringere Dosis (1000 Units) verwendet und nur
einmalig appliziert. Auch nach einer Dosierung von 500 Units Botulinumtoxin B traten die
prokonvulsiven Effekte im PTZ-Test beginnend nach etwa einer Woche auf (s. Abb. 38). Die
Wahl der Dosis beruhte zudem nicht nur auf der genannten Toxizitätsstudie, sondern auch auf
der Amygdala-Kindling-Studie aus der AG Rogawski (unveröffentlichte Daten), in der umge-
rechnet eine CED von 896 Units in die basolaterale Amygdala effektiv war, um die Anfalls-
dauer, -schwere und –schwelle signifikant zu senken. Die beobachteten prokonvulsiven
Effekte sind daher vermutlich nicht auf die verwendete Dosis zurückzuführen.
6.2.4. Convection-enhanced delivery
Die CED wird nicht nur bereits in der Onkologie als neue therapeutische Strategie genutzt,
um eine homogene Diffusion einer Substanz in ausgewählten Hirnbereichen zu ermöglichen.
Auch zur Verwendung bei Epilepsie werden zurzeit Patienten für eine klinische Studie an den
Kliniken der „National Institutes of Health“ der USA (Bethesda, Maryland) rekrutiert. Unter
der Leitung von Dr. John Heiss soll Muscimol in den Hippokampus pharmakoresistenter
Patienten infundiert werden
(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT00005925?term=muscimol+epilepsy&rank=1).
Er demonstrierte bereits in nicht humanen Primaten, dass eine CED von Muscimol zu einer
Diskussion
138
Verteilung im hippokampalen Gewebe führt und in therapierelevanten Konzentrationen nicht
zu toxischen Effekten führt (HEISS et al. 2005). Außerdem gelang in einer späteren Arbeit
die Nachverfolgung der Verteilung des Therapeutikums mittels Tracer (HEISS et al. 2010).
Die Behandlung des epileptischen Fokus mittels Antiepileptika müsste in der Praxis
kontinuierlich oder zumindest häufig intermittierend durchgeführt werden, da die Wirkung
nur kurzzeitig anhält. Eine Infusion mit Toxinen könnte längerfristig wirken, was bereits von
ROGAWSKI (2009) im Kindling-Modell belegt werden konnte. Er erreichte einen über
mehrere Wochen anhaltenden antikonvulsiven Effekt nach CED von Botulinumtoxin A und B
in die basolaterale Amygdala.
6.2.5. Die gewählte Substanz
Eventuell liegt die Erklärung für das Auftreten prokonvulsiver Effekte in der Wahl der Sub-
stanz selbst. Für das Toxovar Botulinumtoxin E konnten COSTANTIN et al. (2005) nach
Injektion in den dorsalen Hippokampus (CA1 und CA3) im Kindling-Modell eine antikonvul-
sive Wirkung belegen. Unter in-vitro Bedingungen wurde gezeigt, dass Botulinumtoxin E
(und A) hauptsächlich die exzitatorische Neurotransmission hemmen (CAPOGNA et al.
1997; VERDERIO et al. 2004). Der Grund für die präferentielle Wirkung auf glutamaterge
Neurone liegt in der spezifischen Bindung von Botulinumtoxin E an SNAP-25, welches ver-
mehrt in exzitatorischen Neuronen vorkommt (VERDERIO et al. 2004). Da SNAP-25 kaum
von GABAergen Neuronen exprimiert wird, ist die Sekretion von GABA gegenüber einer
Hemmung durch Toxovar A und E relativ resistent (VERDERIO et al. 2007; GARBELLI et
al. 2008).
Wir haben uns aufgrund vielversprechender Untersuchungen aus der AG Rogawaski (s. Ab-
schnitt 6.2.3) für das Toxovar B entschieden. Ein Vorteil des Botulinumtoxin B gegenüber
Botulinumtoxin E liegt darin, dass Botulinumtoxin B bereits eine Zulassung als Arzneimittel
hat und eine eventuelle weitere Zulassung für die Indikation Epilepsie einfacher wäre, als eine
Neuzulassung für Botulinumtoxin E anzustreben. Der Bindungs- und Wirkmechanismus von
Botulinumtoxin B hingegen unterscheidet sich etwas von Botulinumtoxin E. Das Toxovar B
besteht aus einer schweren (100 kD) und einer leichten Kette (50 kD), die durch Disulfid-
brücken miteinander verbunden sind (DONG et al. 2007). Über den Kohlenstoff-Terminus
der schweren Kette wird die Bindung an Polysialoganglioside und Proteinrezeptoren und die
nachfolgende Endozytose vermittelt. Für die Bindung von Botulinumtoxin B ist hier ein
Diskussion
139
Doppelrezeptor aus Gangliosiden und Synaptotagmin I und II nötig (DONG et al. 2007). Die
leichte Kette wird von der inneren Membran ins Zytosol translokalisiert, dort fungiert sie als
Protease (Zink-Endopeptidase), die Vesikelproteine spaltet. Im Falle des Botulinumtoxin B
spaltet die leichte Kette Synaptobrevin (JIN et al. 2006). VERDERIO et al. (2004) zeigten in
einer in-vitro Studie, dass in GABAergen Neuronen das Recycling des Vesikelproteins
Synaptotagmin I durch Botulinumtoxin B, nicht aber durch Botulinumtoxin E (und A) ge-
hemmt wird. In Konsequenz könnte das von uns verwendete Botulinumtoxin B nicht nur wie
erwünscht die glutamatergen Neurone gehemmt haben, sondern auch die inhibitorisch wir-
kenden GABAergen Neurone. Gegen diese Annahme spricht jedoch, dass die prokonvulsive
Wirkung sich erst nach einer gewissen Latenz nach Injektion von Botulinumtoxin B ent-
wickelte. Unveröffentlichte Daten der AG Rogawski hingegen belegten bereits nach 3 Tagen
einen antikonvulsiven Effekt, so dass eine reine Substanzwirkung, wenn auch in diesem Fall
prokonvulsiv, früher als nach 7 Tagen zu erwarten gewesen wäre.
6.2.6. Verhaltensänderungen und epileptische Anfälle /
EEG-Veränderungen
Eine statistisch signifikante Verhaltensänderung im Pick-up Test trat erstmals 2 Wochen nach
Botulinumtoxin B-Behandlung auf. In chemischen Modellen für Temporallappenepilepsie
wird häufig von angstassoziiertem Verhalten und Hypo- oder Hyperlokomotionsstörungen der
chronisch epileptischen Tiere berichtet. Angststörungen treten auch beim Patienten auf
(KANNER 2011). Sollte demnach durch die CED von Botulinumtoxin B ein epileptischer
Fokus generiert worden sein, würde dies eventuell auch die aufgetretene Übererregbarkeit
erklären. In dieser Arbeit wurden keine weiterführenden Verhaltensversuche zu Lern- und
Gedächtnisstörungen oder angstassoziiertem Verhalten durchgeführt, die ebenfalls bei chro-
nisch epileptischen Tieren und in der klinischen Situation als Komorbidität des Menschen mit
Epilepsie auftreten (D'HOOGE u. DE DEYN 2001; GRÖTICKE et al. 2007; HOPPE et al.
2007; GRÖTICKE et al. 2008; RATTKA et al. 2011; KERNAN et al. 2012; TYLER et al.
2012). Allerdings wird Botulinumtoxin B in der experimentellen Demenz-Forschung genutzt,
um Synapsen-spezifische Läsionen im entorhinalen Kortex zu verursachen und auf diese
Weise im Tiermodell kognitive Dysfunktionen zu untersuchen (ANDO et al. 2002), so dass
Diskussion
140
wir vermuten, dass auch die Leistung unserer Botulinumtoxin B-Tiere in Lern- und Gedächt-
nistests beeinträchtigt sein könnte.
In chemischen Epilepsiemodellen ist während der Latenzzeit weiterhin das vermehrte Auf-
treten abnormer EEG-Aktivität in Form interiktaler Spikes beschrieben (STALEY u. DUDEK
2006; BORTEL et al. 2010; ISAEV et al. 2011). Eine Hypothese lautet, dass die interiktalen
Spikes zur Epileptogenese beitragen (STALEY et al. 2005). Bei den Botulinumtoxin B-Tieren
traten vermehrt epileptiforme Spikes und Slow waves auf, zudem wurden spontane Anfälle
im EEG detektiert. Um eine Aussage treffen zu können, ob diese Tiere nun dauerhaft chro-
nisch epileptisch geworden wären oder es sich lediglich um insult-assoziierte Veränderungen
handelte, sollten weitere Experimente durchgeführt werden. Neben der simultanen
Botulinumtoxin B-Injektion und EEG-Überwachung in den ersten Tagen nach Injektion, wäre
besonders das langfristige und wiederholte Aufzeichnen eines EEGs erforderlich. Da es sich
hier mehr um einen Zufallsbefund handelte und mein Aufenthalt an der UC Davis begrenzt
war, konnten solche Studien noch nicht zeitnah durchgeführt werden. Zudem wäre die histo-
logische Untersuchung der Gehirne der Tiere unabdingbar, um sowohl die Injektionslokalisa-
tion zu verifizieren als auch zu überprüfen, ob neurodegenerative Prozesse stattfanden, die für
chronische Epilepsiemodelle typisch sind. Mit der zukünftigen Durchführung solcher Arbei-
ten könnte eventuell mit der hippokampalen Injektion von Botulinumtoxin B ein neues Epi-
lepsiemodell etabliert werden. Die bislang etablierten Modelle haben bereits zu einem großen
Fortschritt der Epilepsieforschung beigetragen, dennoch gibt es einige Schwachstellen für die
Translation zur Temporallappenepilepsie des Menschen, so dass die Verbesserung bestehen-
der Modelle, sowie die Entwicklung und Validierung neuer Modelle, durchaus von einem
hohen Interesse für die experimentelle Epilepsieforschung ist (SLOVITER 2008).
Für den Einsatz von Botulinumtoxinen als antikonvulsive Substanzen könnten die Ergebnisse
meiner Studie bedeuten, dass die prokonvulsive Wirkung von Botulinumtoxin B möglicher-
weise modell- oder dosisabhängig war und in anderen Versuchsanordnungen eventuell ab-
weichende Ergebnisse erzielt werden könnten. Durch den Einsatz anderer Toxovare, prä-
ferentiell A und E, oder Änderungen an Botulinumtoxin B könnten eventuell auch im PTZ-
Modell antikonvulsive Effekte gemessen werden. Für Botulinumtoxin A konnte in der Ver-
gangenheit die chemische Struktur so verändert werden, dass die spezifische Bindung an ei-
nen Neuronentyp erfolgte (DUGGAN et al. 2002; CHADDOCK et al. 2004).
Diskussion
141
6.3. Studie IIa: Neurotransplantation GABAerger Vorläuferzellen
6.3.1. Transplantation von GABAergen Zelllinien in Basalganglienregionen
Anhand der Untersuchungen mit Vigabatrin konnten wir im PTZ-Test belegen, dass eine er-
höhte GABA-Konzentration in den beschriebenen Zielregionen deutliche, antikonvulsive
Effekte hervorruft (s. Abb. 35). Auch mit Transplantationen GABAerger Zelllinien ist dies
bereits anderen und unserer Gruppe gelungen (GERNERT et al. 2002; CASTILLO et al.
2008; NOLTE et al. 2008; HANDRECK et al. 2012). Der Vorteil in der Verwendung von
Zelllinien liegt einerseits in der Möglichkeit, diese genetisch so zu verändern, dass sie nur
einen Neuronentyp hervorbringen und, für unsere Zwecke, sogar größere Mengen an GABA
sezernieren als die Ursprungszelllinie.
Nach Transplantationen mit immortalisierten Zellen ließen sich transiente antikonvulsive
Effekte erzielen: In einer Arbeit von GERNERT et al. (2002) im Kindling-Modell konnte
erstmals gezeigt werden, dass GABAerge, gentechnisch veränderte, murine Zellen in be-
stimmten Hirnregionen (hier im zentralen piriformen Kortex) die Fähigkeit besaßen, die An-
fallsschwelle deutlich zu erhöhen. Auch in spontanen Anfallsmodellen konnte die antikonvul-
sive Wirkung der Zellen nach Transplantation in Basalganglien reproduziert werden
(THOMPSON u. SUCHOMELOVA 2004; CASTILLO et al. 2006). Die hier transplantierten
Mausneurone zeichneten sich vor allem durch einen sogenannten „Tet-on/Tet-off“-Mecha-
nismus aus; die GABA-Sekretion war durch die exogene Administration von Doxyzyklin
steuerbar. Ein antikonvulsiver Effekt ließ sich hier direkt auf die GABA-Freisetzung zurück-
führen, da Doxyzyklin-gehemmte Zellen keinen antikonvulsiven Effekt hervorriefen
(THOMPSON u. SUCHOMELOVA 2004). Neben der beschriebenen Xenotransplantation
(von Maus zu Ratte) wurden in der Arbeitsgruppe Löscher/Gernert in der Vergangenheit auch
Allotransplantationen (von Ratte zu Ratte) durchgeführt (NOLTE et al. 2008). Hierzu wurden
freundlicherweise immortalisierte, striatale Rattenneurone von William J. Freed (National
Institute of Neurological Disorders and Stroke, kurz NINDS, Baltimore, USA) zur Verfügung
gestellt: Die 2008 von NOLTE et al. durchgeführten Transplantationen der GABAergen Zell-
linie in die SNr führten zwar zu antikonvulsiven Effekten im Kindling-Modell, allerdings nur
mit einer transienten Wirkung. Kürzlich konnten wir mit einer Transplantation in den STN im
PTZ-Modell ebenfalls transient auftretende, antikonvulsive Effekte beobachten
Diskussion
142
(HANDRECK et al. 2012). Ein GABA-überexprimierender Klon der Mutterzelllinie (CL4),
der mithilfe eines episomalen Epstein-Barr Virus mit dem humanen GABA-produzierenden
Enzym Glutaminsäuredecarboxylase 67 (hGAD67) transfiziert wurde, war in der Lage, die
GABA-Konzentration bis zum 50-fachen gegenüber der Ursprungszelllinie steigen zu lassen
(GIORDANO et al. 1996; CONEJERO-GOLDBERG et al. 2000). Nach Transplantation die-
ses Klons wurden in verschiedenen Studien in unterschiedlichem Ausmaß Abstoßungs- und
Entzündungsreaktionen beobachtet (NOLTE et al. 2008; CASTILLO et al. 2010;
HANDRECK et al. 2012).
Ein weiterer Nachteil bei der Nutzung der zuvor beschriebenen, genetisch veränderten, GAD-
überexprimierenden Zelllinien besteht in der tonischen GABA-Freisetzung. Die hohe Kon-
zentration an GABA kann zu einer verminderten Rezeptorexpression an postsynaptischen
Zellen führen (KOKAIA et al. 1994; FENELON u. HERBISON 1996; LÖSCHER et al.
1998). Währenddessen ist die funktionelle Integration GABAerger Vorläuferzellen
wahrscheinlicher, in diesem Falle sezernieren sie GABA nach einem physiologischen Sekre-
tionsmuster, wie bei NOLTE et al. (2008) diskutiert. Dies wäre ein möglicher Erklärungs-
ansatz für die beobachtete Transiens der antikonvulsiven Effekte in den genannten Studien
zur Transplantation immortalisierter GABA-produzierender Zelllinien. Des Weiteren könnten
die Zellen bald nach Transplantation absterben oder aus bisher nicht geklärten Gründen die
GABA-Produktion einstellen. Dieses Problem könnte möglicherweise durch die Verwendung
von Vorläuferzellen gelöst werden. Des Weiteren ist eine Abstoßungsreaktion bei Verwen-
dung allogener Vorläuferzellen unwahrscheinlich.
6.3.2. Transplantation GABAerger Vorläuferzellen
Vorausgegangene Untersuchungen belegten, dass die Transplantation GABAerger, ganglio-
nischer Precursorzellen in den epileptischen Fokus in spontanen Anfallsmodellen zu antikon-
vulsiven Effekten führt (HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010). Auch Trans-
plantationen von Vorläuferzellen aus der MGE in den Kortex in einem genetischen Maus-
modell für Epilepsie führten zu einer signifikanten Anfallsreduktion (BARABAN et al. 2009).
Die SNr wurde in einer Arbeit von LÖSCHER et al. (1998) ebenfalls erfolgreich als Ziel-
struktur für Transplantationen von fetalen Zellen verwendet. Die Transplantation von Zellen
Diskussion
143
aus der ganglionischen Eminenz führte im Kindling-Modell zu einem transienten, protektiven
Effekt.
In der vorliegenden Arbeit führte die bilaterale Transplantation GABAerger Vorläuferzellen
aus der Ratte in den STN oder die SNr nicht zu antikonvulsiven Effekten im PTZ-Modell
innerhalb des dreimonatigen Beobachtungszeitraumes. Hierfür gibt es zahlreiche mögliche
Gründe, die einerseits transplantat- und andererseits wirtsspezifisch sein können.
6.3.3. Wahl der Zielregion für die Transplantation
Ein möglicher Grund für das Ausbleiben eines antikonvulsiven Effektes in unserer Studie
könnte die Wahl der Zielregion für die Transplantation darstellen. In der Literatur ist be-
schrieben, dass exogene Zellen sich erfolgreicher in Gehirne integrieren, die pathologischen
Prozessen unterliegen (ZAMAN et al. 2001; ZAMAN u. SHETTY 2002). So lassen sich
eventuell die vielversprechenderen Resultate der AG Shetty erklären, die die Zellen in den
geschädigten Hippokampus transplantierten (HATTIANGADY et al. 2008). Es wird ange-
nommen, dass das geschädigte Gewebe trophische Faktoren freisetzt, die das Auswachsen
von Axonen und das Überleben transplantierter Zellen unterstützen oder sogar erst ermög-
lichen (NIETO-SAMPEDRO et al. 1982; GAGE u. BJÖRKLUND 1986).
Analog ließen sich auch nach Transplantationen fetaler striataler Zellen in die denervierte SNr
protektive Effekte auf akute Pilokarpin-induzierte Anfälle erzielen (FINE et al. 1990). Die
Läsion der GABAergen Eingangssignale der SNr aus dem kaudalen Putamen erfolgte mithilfe
einer Injektion von Ibotensäure. FINE et al. (1990) konnten in dieser Studie allerdings keinen
signifikanten Unterschied zwischen einer Transplantation GABAerger Vorläuferzellen und
einer als Kontrolle dienenden Transplantation von Zellen aus dem N. ischiadicus (hauptsäch-
lich Schwannzellen) feststellen. Dies lässt vermuten, dass der antikonvulsive Effekt nicht auf
die GABA-Produktion des Zelltransplantates zurückführen war.
Im Hinblick auf unser Studiendesign (maximal 4 PTZ-Schwellen mit langen dazwischen
liegenden Zeitintervallen) war keine Neurodegeneration oder Denervation innerhalb des STN
oder der SNr zu erwarten. Daher transplantierten wir die Zellen auch in Tiere nach Status
epileptikus. Für die SNr ist beschrieben, dass es nach Status-Induktion durch Pilokarpin zu
metabolischen Veränderungen und Schäden der Neurone und Gliazellen kommt (SCHMIDT-
KASTNER et al. 1991; DUBÉ et al. 2000a; DUBÉ et al. 2000b). Möglicherweise sind diese
aber im Vergleich zu den umfassenden funktionellen Umstrukturierungen des Hippokampus
Diskussion
144
zu mild, um die funktionelle Integration verpflanzter Zellen zu fördern. Auch in diesem Mo-
dell erzielten die Transplantate keinen antikonvulsiven Effekt.
Es gibt jedoch zahlreiche Hinweise, die die Bedeutung der Zielregion für eine gerichtete The-
rapie herausstellen: Im STN liegen größtenteils glutamaterge Neurone, in der SNr hauptsäch-
lich GABAerge Neurone. Möglicherweise ist eine solche Umgebung zu einheitlich, um eine
Integration und Induktion der Differenzierung in GABAerge Neurone zu forcieren. Im
Hippokampus hingegen sind unterschiedliche Neuronenpopulationen angesiedelt (s. Abschnitt
2.2.3).
Möglicherweise ist das adulte Gehirn weniger empfänglich für die Aufnahme und erfolg-
reiche Einbindung fremder Vorläuferzellen. Transplantationen von MGE-Vorläufern in den
Neokortex neonataler Empfängertiere zeigten eine vermehrte kortikale Inhibition und protek-
tive Effekte im Maximal-Elektroschock-Test und in genetisch epileptischen Mäusen
(ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009; CALCAGNOTTO et al. 2010).
Ein antikonvulsiver Effekt könnte auf die nicht ausgereifte Umgebung, das neonatale Gehirn,
zurückzuführen sein. In diesen Studien migrierten die Zellen über weite Strecken
(ALVAREZ-DOLADO et al. 2006; BARABAN et al. 2009) und könnten so zusätzlich in
anderen Regionen, abweichend von der ursprünglichen Zielregion, anfallsunterdrückende
Eigenschaften entwickelt haben. Es wurde zudem gezeigt, dass die Zellen in funktionelle
GABAerge Interneurone differenzieren.
Im Umkehrschluss ist gezeigt worden, dass Interneuronopathien Epilepsien hervorrufen kön-
nen (ANDERSON u. BARABAN 2012): So entwickeln genetisch veränderte Mäuse, denen in
der Embryonalentwicklung ein Transkriptionsfaktor (Dlx1) innerhalb der ganglionischen
Eminenz fehlt, altersabhängig signifikant weniger GABAerge Interneurone, eine daraus re-
sultierende verminderte Hemmung in Hippokampus und Kortex und schlussendlich spontane
epileptische Anfälle (COBOS et al. 2005). Bei Kindern mit Mutationen eines Gens (ARX), das
für Migration und Differenzierung GABAerger Interneurone eine tragende Rolle spielt, treten
analog Myoklonien und klonische Krämpfe auf (KATO u. DOBYNS 2005). BARABAN et
al. (2009) konnten mithilfe einer Transplantation von Zellen aus der MGE in einem gene-
tischen Mausmodell für Epilepsie eine Anfallsreduktion um 86 % erreichen. Diese Wirkung
konnten wir mit der Transplantation GABAerger Vorläuferzellen aus der LGE bzw. MGE in
Basalganglienregionen im PTZ-Modell nicht reproduzieren (s. Abb. 44 und Abb. 45). Für das
Diskussion
145
Ausbleiben eines antikonvulsiven Effektes gibt es neben der Wahl der Zielregion verschie-
dene Erklärungsansätze, die sich auf verschiedene Faktoren zurückführen lassen, wie Her-
kunft, Überleben, Differenzierung und funktionelle Integration der Transplantate.
6.3.4. Herkunft der transplantierten Zellen
Die Herkunft der Zellen spielt für den Transplantationserfolg eine große Rolle. Eventuell eig-
nen sich die von uns verwendeten ganglionischen Vorläuferzellen nicht für eine intrasubtha-
lamische oder intranigrale Verpflanzung. ZAMAN et al. (2000) konnten zeigen, dass die Zell-
spezifität sehr wichtig für das Überleben der Zellen ist: Wurden hippokampale Zellen in den
Hippokampus transplantiert, überlebten 42 – 69 % der Zellen, je nach ihrem genauen Ur-
sprungsort im Hippokampus. Dagegen überlebten nur 12 % ganglionisch generierter Zellen
(E15) eine Transplantation in den Hippokampus. In einer Folgestudie wurden fetale, hippo-
kampale Zellen mit FGF-2 und Caspase-Inhibitor vorbehandelt und nach 2 Monaten lebten
noch 98 % der injizierten Zellen (RAO et al. 2007). HOLMES et al. (1991) vermuteten sogar,
dass der Zelltyp gegenüber der Wahl der Zielregion eine entscheidendere Rolle spielte: Sie
transplantierten vier verschiedene Zelltypen aus Hippokampus, Neokortex, Cerebellum und
Locus coeruleus entweder intrazerebroventrikulär oder intrahippokampal im Kainat-Modell.
Es wurde ein milder antikonvulsiver Effekt auf die Häufigkeit spontaner Anfälle nach Trans-
plantation von Zellen aus Hippokampus respektive Locus coeruleus beobachtet. Die Gesamt-
zahl an Tieren mit spontanen Anfällen war jedoch in allen Gruppen und einer Kontrollgruppe
gleich. Auch gab es keinen robusten Effekt im Kindling-Modell. Interessanterweise wurde
kein Unterschied zwischen Tieren beobachtet, deren Transplantate innerhalb des Ventrikels
oder innerhalb des Hippokampus lagen, was darauf schließen lässt, dass der Wahl des Donor-
gewebes eine höhere Bedeutung zukam als der Wahl der Akzeptor-Hirnregion (HOLMES et
al. 1991). In der vorliegenden Studie haben wir in Anlehnung an Studien aus der AG Shetty
(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010) zunächst Vorläuferzellen aus der LGE
als auch nachfolgend aus der MGE transplantiert, da in den genannten Arbeiten mit beiden
Zellpopulationen nach Transplantation in den Hippokampus deutliche antikonvulsive Effekte
im Kainat-Modell auftraten. An den Untersuchungen der AG Shetty lässt sich allerdings kri-
tisch anmerken, dass die Analyse der Anfallshäufigkeit und –typen lediglich durch Beobach-
tung und nicht durch kontinuierliche EEG- und Videoüberwachung erfolgte,
(HATTIANGADY et al. 2008; WALDAU et al. 2010) und zudem der Observator wusste, bei
Diskussion
146
welchen Tieren eine „sham“ Operation bzw. eine Zelltransplantation erfolgt war
(HATTIANGADY et al. 2008). Weder mit LGE- noch mit MGE-Zellen konnten wir die
Schwelle zur Auslösung eines Anfalls im PTZ-Modell erhöhen. Mögliche Erklärungsansätze
beinhalten für beide Zelltypen niedrige Überlebensraten der transplantierten Zellen oder eine
mangelnde Differenzierung in GABAerge Neurone.
6.3.5. Überleben der transplantierten Zellen
Möglicherweise reichte die Zahl vitaler Zellen innerhalb der Zielregionen nicht aus, um die
endogene Inhibition zu erhöhen und signifikante Schwellenerhöhungen hervorzurufen. Tat-
sächlich setzten die Mitarbeiter aus der AG Shetty in ihren Transplantationsstudien 4 Depots
aus LGE- bzw. MGE-Zellen pro Hemisphäre in den Hippokampus (HATTIANGADY et al.
2008; WALDAU et al. 2010), was in unserer Studie aufgrund des kleinen Volumens des STN
sowie der Unterscheidung der SNr in einen anterioren und posterioren Teil nicht möglich war.
Eine Zählung aller transplantierten Zellen gestaltete sich schwierig, da die Zellen teilweise
migrierten oder im Einstichkanal dorsal der Zielregion verloren gingen. Insgesamt waren
wenige Zellen nach Transplantation in der jeweiligen Zielregion auffindbar. Laut
HATTIANGADY und Kollegen (2008) überlebten etwa 33 % der mit FGF-2 und Caspase-
Inhibitor behandelten LGE-Zellen eine hippokampale Transplantation mehrere Monate. Ähn-
liche Zahlen brachte die Arbeit von WALDAU et al. (2010) nach Transplantation von Vorläu-
ferzellen aus der MGE nach Kultur im Neurosphärenstadium hervor. Leider konnten wir nur
an wenigen Tieren eine quantitative Analyse der Transplantate durchführen, hier überlebten
jedoch lediglich zwischen 500 und 3000 Zellen innerhalb der Zielregion die Transplantation,
was einer Überlebensrate innerhalb der Region von 0,625 - 3,75 % entspricht.
Auch LÖSCHER et al. (1998) berichteten eine sehr geringe Überlebensrate fetaler Zellen aus
der ganglionischen Eminenz drei Monate nach Transplantation in die SNr: Nach ursprüng-
licher Injektion von acht Depots à 50000 Zellen überlebten innerhalb der SNr lediglich 135-
888 Neurone. Wurden außerhalb der SNr liegende Zellen miteingerechnet, ergab sich eine
Zahl von 419 bis 1621 Neuronen. Trotzdem führte die Transplantation zu einem transienten
antikonvulsiven Effekt im Kindling-Modell; die Autoren vermuteten, dass der deutliche pro-
tektive Effekt zu Beginn der Studie darauf hindeuten könnte, dass die Zellen erst nach dieser
Zeit untergingen und der Effekt folglich abnahm.
Diskussion
147
Eine weitere, mögliche Erklärung für die niedrige Zahl an vitalen Zellen in der vorliegenden
Studie könnte die von uns durchgeführte Markierung der Zellen mit BrdU darstellen: In-vitro
wurde gezeigt, dass das Markieren der Zellen mit BrdU einen negativen Einfluss auf den
Zellzyklus, die Differenzierung und das Überleben der Zellen hat (LEHNER et al. 2011).
Diese Ergebnisse wurden jedoch bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht in in-vivo Experimenten
bestätigt.
6.3.6. Differenzierung der transplantierten Zellen
In der vorliegenden Studie könnte zusätzlich die ausgebliebene Differenzierung der Zellen in
GABAerge Neurone eine Ursache für die Wirkungslosigkeit der Transplantate darstellen.
Insgesamt war von den BrdU-positiven Zellen jeweils nur ein geringer Anteil positiv für
GAD67. Quantitativ konnten wir dies für die MGE-Zellen in-vivo, bisher nur anhand eines
Tieres, belegen und zeigten, dass 5 Wochen nach Transplantation in den STN in-vivo ledig-
lich etwa 12 % der Zellen in GABAerge Neurone differenzierten. Dieses Ergebnis ist kon-
form mit den Beobachtungen von WALDAU et al. (2010): 10 % der aus der MGE generierten
Zellen waren 3 Monate post transplantationem in den Hippokampus positiv für einen anti-
GABA Antikörper. Nach Vorbehandlung mit Retinsäure und Kaliumchlorid zählten wir
höhere Zahlen an transplantierten, GABAergen Zellen innerhalb des STN (etwa 30 %), aller-
dings war die Gesamtzahl an überlebenden Zellen nicht größer. Es wurde wiederum nur eine
Zählung an einem Tier durchgeführt. In der Studie von HATTIANGADY et al. (2008) waren
es hingegen 69 % aller BrdU-markierten Zellen, allerdings wurden hier in den geschädigten
Hippokampus transplantiert und die Tiere wurden erst 1 Jahr nach Transplantation getötet und
die Zellzahl erhoben.
Möglicherweise war die Evaluation antikonvulsiver Effekte nach Transplantation in unserem
experimentellen Design zu früh angesetzt. HATTIANGADY et al. (2008) begannen erst
9 Monate nach Status epileptikus und subsequenter Transplantation (4 Tage post Status)
fetaler Zellen mit der Aufzeichnung von EEGs, um spontane Anfälle und ihre Häufigkeit zu
dokumentieren.
In der vorliegenden Arbeit sind die quantitativen Daten noch preliminär. Um weitere Aus-
sagen bezüglich des Überlebens und der Differenzierung der transplantierten Zellen treffen zu
können, sind weitere Studien nötig: Es fehlt eine in-vitro Evaluation des Anteils an
Oligodendrozyten, die wahrscheinlich den verbleibenden Anteil der Zellen (neben Neuronen
Diskussion
148
und Astroyzten) ausmachen. Wir zählten in-vitro einen Anteil von etwa 20 % astrozytären
Zellen ohne Vorbehandlung und nach Retinsäure und Kaliumchlorid-Behandlung von etwa
14 %. Bisher wurden zudem keine Zählungen der Astrozyten in-vivo, nach Transplantation,
durchgeführt. In den Studien von WALDAU et al. (2010) differenzierten sich etwa 50 % der
transplantierten Zellen in GDNF-positive Astrozyten. GDNF selbst werden antikonvulsive
Eigenschaften zugeschrieben (KANTER-SCHLIFKE et al. 2007). Da keine Anfärbung gegen
GDNF durchgeführt wurde, können wir nicht davon ausgehen, dass die Astrozyten diesen
Faktor produzierten.
Außerdem bleibt zu klären, aus welchem Grund im in-vitro Versuch eine höhere Anzahl an
GAD-positiven Zellen gegenüber NeuN-positiven Zellen gezählt wurde. Eventuell wird die
GAD zeitlich früher exprimiert als NeuN. Es gibt in der Literatur Hinweise dazu, dass GABA
und GAD sogar transient in der Embryonalentwicklung in Astrozyten exprimiert werden
(OCHI et al. 1993), was eine mögliche Erklärung für unsere Beobachtung darstellen könnte.
Für eine sichere Aussage zur Differenzierung in-vitro wäre eine weitere Versuchsreihe not-
wendig, in der die Zellen nach Vorbehandlung ohne den Zusatz der Wachstumsfaktoren FGF-
2 und EGF bis zur vollständigen Ausdifferenzierung kultiviert werden.
Diskussion
149
6.4. Studie IIb: Neurotransplantation von NT2-Zellen
Transplantationen von NT2-Vorläuferzellen und adulten NT2-Neuronen führten im PTZ-Mo-
dell nicht zu antikonvulsiven Effekten. Für die Bewertung des Transplantationserfolges von
NT2-Vorläuferzellen und adulten NT2-Neuronen liegen leider keine verlässlichen immun-
histologischen Auswertungen vor. Die ausbleibende PTZ-Anfallsschwellenerhöhung nach
Transplantation in die SNr bzw. den STN spricht dafür, dass die NT2-Zellen keine Verstär-
kung der GABAergen Inhibition hervorrufen konnten. Ursächlich konnten sich die transplan-
tierten Zellen wahrscheinlich nicht erfolgreich in das Wirtsgehirn integrieren oder wurden
abgestoßen, da keine Immunsuppression durchgeführt wurde.
Bisher gibt es nur eine Studie zur Transplantation von NT2-Zellen im Kainat-Modell, in der
es nach Transplantation von NT2-Zellen in den rechten dorsalen Hippokampus weder zu einer
Anfallsreduktion, noch zu einer verbesserten Lernleistung kam (HASEGAWA et al. 2004).
Dafür sind zahlreiche Transplantationsstudien in experimentellen Modellen für Schlaganfall
und bereits einige Untersuchungen an Schlaganfall-Patienten durchgeführt worden: NT2-
Zellen wurden am menschlichen Schlaganfall-Patienten in Basalganglienregionen
transplantiert (KONDZIOLKA et al. 2000): Die motorischen Fähigkeiten der Patienten
verbesserten sich und auch die metabolische Aktivität der geschädigten Hirnregion wurde
teilweise wiederhergestellt. Diese Ergebnisse wurden in einer Phase 1 Studie bestätigt
(MELTZER et al. 2001). Einer der Patienten aus der Studie starb 27 Monate nach
Transplantation vermutlich aufgrund eines myokardialen Infarktes; die histopathologische
Untersuchung seines Gehirnes ergab, dass transplantierte NT2-Neurone überlebt hatten und es
zu keiner Tumorformation gekommen war (NELSON et al. 2002). Eine quantitative Analyse
der Überlebensrate wurde nicht durchgeführt.
6.4.1. Transplantation von NT2-Zellen bei Epilepsien
In der genannten Studie von HASEGAWA et al. (2004), in der eine hippokampale
Transplantation von NT2-Zellen, wie in der vorliegenden Arbeit, nicht zu antikonvulsiven
Effekten führte, gelang der immunhistologische Nachweis der transplantierten Zellen 12
Wochen nach Transplantation nur in etwa 60 % der Tiere. Des Weiteren existiert eine Arbeit
von WILLING et al. (2002), in der NT2-Neurone in einem Modell für Schlaganfall kortikal
transplantiert wurden und 4-6 Wochen nach Transplantation Anfallsschwellen mittels
Diskussion
150
subkutaner Injektion von PTZ ermittelt wurden. Mögliche Effekte einer Zelltransplantation
auf die Empfindlichkeit gegenüber Anfällen ist auch für die Schlaganfall-Forschung von Be-
deutung, da in 5-10 % der Schlaganfallpatienten epileptische Anfälle auftreten (ASCONAPE
u. PENRY 1991). Generell gab es in Tieren nach Schlaganfall eine Tendenz zu gesenkten
Anfallsschwellen, jedoch keinen Unterschied zwischen Tieren mit und ohne NT2-Transplan-
taten (WILLING et al. 2002). Analog zu der vorliegenden Arbeit gab es Probleme mit dem
immunhistochemischen Nachweis der NT2-Zellen im Rattengehirn (WILLING et al. 2002):
Eine Anfärbung mit einem Antikörper gegen nukleäres Matrixprotein (NuMa) gelang in zwei
von fünf Tieren, bei zwei anderen war trotz histologisch deutlichem Kanüleneinstich keine
Anfärbung möglich. Die NuMa-Färbung zeigte geringe Zellzahlen, diese wurden nicht quanti-
fiziert. WIILING et al. (2002) vermuteten, dass entweder eine Abstoßung der Zellen oder die
PTZ-induzierten Anfälle zu einer geringen Überlebensrate geführt haben könnten. Eine Ver-
bindung zwischen der wiederholten, intravenösen Administration von PTZ und dem Abster-
ben/Abstoßen der Zellen ist auch in der vorliegenden Arbeit möglich. Zudem führten wir,
anders als in den Studien von WILLING et al (2002) und HASEGAWA et al. (2004), trotz
des Einsatzes humaner NT2-Zellen keine Immunsuppression durch, um eine Vergleichbarkeit
zu den Studien an Vorläuferzellen aus Rattenfeten zu bewahren, für die keine
Immunsuppression nötig ist. Es ist nicht geklärt, ob immunsuppressive Therapien einen
Einfluss auf PTZ-Anfallsschwellenbestimmungen haben. Dieser Zusammenhang wird gerade
in einem anderen Projekt von unserer Arbeitsgruppe untersucht. Obwohl alle anderen
beschriebenen Studien Immunsuppressiva einsetzten, sahen wir ohne Immunsuppression nur
in einem Fall eine deutliche Abstoßungsreaktion nach Transplantation humaner Zellen. Durch
den Vergleich mit unseren Erfahrungen mit deutlichen Abstoßungsreaktionen nach
Transplantation des Clone 4 der genetisch veränderten GABAergen Rattenneurone (M213-
2O) war diese Beobachtung unerwartet.
6.4.2. Transplantation von NT2-Zellen in experimentellen Tiermodellen
Es gibt bereits erste Ergebnisse zum erfolgreichen Einsatz der Zellen in Tiermodellen für
ischämische Hirninfarkte (BORLONGAN et al. 1998a; BORLONGAN et al. 1998b;
SAPORTA et al. 1999). Die Studien zeigten, dass Lern- und Gedächtnis-, sowie motorische
Defizite, die nach einseitiger Ligation der A. carotis und subsequentem ischämischen Hirn-
insult auftraten, durch Transplantation humaner NT2-Neurone positiv beeinflusst werden
Diskussion
151
konnten und eine funktionelle Wiederherstellung erreicht werden konnte. SAPORTA et al.
(1999) zeigten, dass eine bestimmte Anzahl an Neuronen transplantiert werden und überleben
muss, um einen Effekt hervorzurufen: Unilaterale Transplantationen in die vom Schlaganfall
betroffene Hemisphäre von 40000 oder mehr Zellen waren effektiv, während geringere Men-
gen keine Verbesserung der beschriebenen Defizite in verschiedenen Tests bedeuteten. Wur-
den 40000 Zellen verpflanzt, überlebten etwa 5 % die dreimonatige Versuchsphase. Inte-
ressanterweise überlebten bei Transplantation von 80000 oder 1600000 Zellen sogar 12-15 %,
was darauf schließen lassen könnte, dass eine kritische Zellmenge nötig ist, um Überlebens-
raten zu verbessern. Die Autoren zeigten, dass ab einer Zahl von 124 überlebenden Neuronen
signifikante Effekte auftraten. Dies ist vergleichbar mit einer Transplantations-Studie in ei-
nem Parkinson-Modell, in dem etwa 100-200 dopaminerge Neurone aus dem ventralen
Mesencephalon nötig waren, um signifikante Verbesserungen (50 %) in einem Rotationstest
zu erzielen (BRUNDIN et al. 1988).
Obwohl wir bisher keine quantitative Analyse der Zahl an vitalen Zellen drei Monate nach
Transplantation durchführen konnten, waren jeweils auf mehreren Schnittebenen transplan-
tierte Zellen sichtbar, was darauf hindeutet, dass es sich ebenfalls um mehr als 100 überle-
bende Neurone handelte. Die ursprüngliche Transplantationsmenge betrug 80000 Zellen. In
der Studie von SAPORTA et al. (1999) wurden ebenfalls 80000 NT2-Neurone transplantiert,
was zu einer Überlebensrate von etwa 9800 Zellen drei Monate nach Transplantation führte.
Allerdings vereinen NT2-Zellen mehrere neuronale Phänotypen mit unterschiedlichen Trans-
mittern (s. Abschnitt 2.4.4.2). Für eine Anfallsunterdrückung innerhalb der Basalganglien ist
jedoch eine verstärkte GABAerge Hemmung nötig (DEPAULIS et al. 1994; LÖSCHER et al.
2008; GALE, 2008). Möglicherweise reichte die absolute Zahl GABAerger Neurone inner-
halb der überlebenden NT2-Zellen nicht aus, um antikonvulsive Effekte zu erzielen. Diese
Erklärung ist rein spekulativ, denn aufgrund der Schwierigkeiten in der Anfärbung der NT2-
Zellen im Nagergehirn konnten wir bisher keine spezifischen Anfärbungen mit Markern ge-
gen Subtypen neuronaler Zellen, in diesem Fall vornehmlich gegen GABAerge Neurone,
durchführen. Dies wäre besonders für die NT2-Vorläuferzellen interessant gewesen, da bei
ihnen der Anteil GABAerger Neurone nach Differenzierung innerhalb des Wirtsgehirns (in
diesem Fall innerhalb der Zielregion) nicht bekannt ist. Die Transplantate aus NT2-Vor-
läufern werden aus ähnlichen Gründen wie die Precursoren aus der Ratte unwirksam gewesen
Diskussion
152
sein, darunter fallen die mangelnde Befähigung zum Überleben im intakten Gewebe und feh-
lende Integration und Differenzierung.
6.5. Probleme der Zelltransplantation und ihrer Translation
Wie bereits diskutiert, bietet insgesamt der Einsatz von Vorläuferzellen gegenüber der Trans-
plantation genetisch veränderter Zelllinien einige Vorteile, u.a. ein geringeres Risiko der Ab-
stoßung. In einer Pilotstudie wurden bereits Vorläuferzellen aus dem Schwein in drei humane
Epilepsie-Patienten transplantiert und auf diese Weise für eine klinische Anwendung getestet,
allerdings wurde diese Studie trotz einer antikonvulsiven Wirkung wegen eines Infektions-
risikos der Patienten mit porcinen Retroviren nicht ausgedehnt (SCHACHTER et al. 1998).
Ein allogener Transplantationsansatz wäre hier sicherlich zielführender, jedoch werden auch
ethische Fragen bezüglich der Quelle der fetalen Zellen beim menschlichen Patienten aufge-
worfen. Die neue Technologie aus adulten, körpereigenen Zellen wieder pluripotente Stamm-
zellen zu generieren, wäre eine Alternative, die eine ethisch einwandfreie Gewinnung und
eine autologe Transplantation der Zellen ermöglichen und zudem den Einsatz von Immun-
suppressiva unnötig werden lassen würde. Jedoch gibt es Studien mit unterschiedlichen Aus-
sagen zu dem Verhalten solcher Zellen nach Transplantation, besonders im Hinblick auf ihre
Differenzierung und mögliche Entartung (WERNIG et al. 2004; FUJIKAWA et al. 2005;
BREDERLAU et al. 2006). In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurden hippokampale
Vorläuferzellen aus murinen, embryonalen Stammzellen generiert und in den Gyrus dentatus
adulter Mäuse transplantiert. Vier Wochen später kam es zur Ausbildung eines Terato-
karzinoms (GERMAIN et al. 2012) Die Autoren folgerten, dass vor einer Verwendung von
Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen auf persistierende, pluripotente Zellen unter-
sucht werden muss, um das Risiko einer Tumorformation einzugrenzen. Insgesamt gibt es
noch zu wenige Informationen zu möglichen Risiken der Verwendung pluripotenter Stamm-
zellen oder Vorläuferzellen, die aus diesen generiert wurden (ZHU et al. 2012).
Des Weiteren wird diskutiert, ob die Transplantation von Zellen nicht einen Hirninsult per se
darstellt und somit letztendlich proepileptogen wirken könnte (BUZSÁKI et al. 1988;
BUZSÁKI et al. 1989; MUDRICK et al. 1990; BUZSÁKI et al. 1991). Sieben bis zehn Mo-
nate nach Transplantation hippokampaler Vorläuferzellen aus E15 und E16-Feten in den
Hippokampus naiver Ratten wurde das Auftreten von interiktalen Spikes mit sehr hoher
Diskussion
153
Amplitude (bis zu 10 mV) sowie von motorischen Anfällen bei einigen Tieren beobachtet
(BUZSÁKI et al. 1991). Zudem reagierten die Tiere auf hochfrequente Stimulation zum Teil
mit konvulsiven Anfällen bis hin zum Verlust der Stellreflexe. BUZSÀKI et al. (1991)
berichteten außerdem, dass lediglich in 6 von 10 Tieren am Ende der Studie hippokampale
Transplante überlebt hatten; eine quantitative Analyse wurde nicht durchgeführt. Die Autoren
beschreiben diese geringe Überlebensrate als dramatisch geringer als in vergleichbaren,
vorausgegangen Transplantationsstudien, in denen der Hippokampus selektiv vor Zellver-
pflanzung geschädigt wurde (BUZSÁKI et al. 1988; BUZSÁKI et al. 1989). Keins der
Kontrolltiere oder Tiere ohne überlebende Zelltransplantate zeigten spontane epileptiforme
Aktivität oder induzierte motorische Anfälle nach Stimulation. Bei fünf Tieren wurden
zerebelläre Vorläuferzellen transplantiert, hier konnte lediglich bei einem Tier zehn Monate
nach Operation ein überlebendes Zelltransplantat nachgewiesen werden (BUZSÁKI et al.
1991).
Auch die zunächst sehr vielversprechend gestarteten Studien zu Neurotransplantation an
Parkinson-Patienten werden zunehmend kritisiert: Insgesamt scheiterten doppelt verblindete
und kontrollierte klinische Studien (FREED et al. 2001; OLANOW et al. 2003; OLANOW et
al. 2009b). In einigen Fällen traten sogar, wahrscheinlich durch die Transplantation verur-
sachte, Dyskinesien auf, die nicht auf Nebenwirkungen zusätzlicher Medikamentengaben zu-
rückgeführt werden konnten (HAGELL et al. 2002; OLANOW et al. 2009a). Weiterhin gehen
OLANOW et al. (2009) davon aus, dass zahlreiche der bei Parkinson-Patienten auftretenden
Symptome nicht durch einen Dopaminmangel hervorgerufen werden, und weder mit medi-
kamentellen, dopaminergen Therapien noch mit der Transplantation dopaminerger Neurone
zu behandeln sind. Zudem wurde eine abnehmende Exprimierung dopaminerger Transporter
und eine Anhäufung von Lewy-Körperchen innerhalb der Transplantate festgestellt, was be-
deuten könnte, dass die Zellen ebenfalls von pathologischen Parkinson-Veränderungen betrof-
fen sein könnten (KORDOWER et al. 2008b; KORDOWER et al. 2008a; LI et al. 2008).
OLANOW et al. (2009) ziehen den Schluss, dass die Neurotransplantation in naher Zukunft
keine Vorteile gegenüber anderen therapeutischen Strategien (tiefe Hirnstimulation, langwirk-
same Medikamente) bieten wird. Ähnlich der Situation bei Epilepsie ist einzig das Potential
zur funktionellen Reparatur geschädigter Hirnregionen ein deutlicher Vorteil der Neurotrans-
plantation. Es bleibt jedoch anzumerken, dass neuroprotektive Therapien während der Epi-
Diskussion
154
leptogenese prophylaktisch zwar in der Lage sind, die Schädigung im Hippokampus zu ver-
ringern, es aber trotzdem zu der Ausbildung einer chronischen Epilepsie kommt (WALKER
2007). Zudem sind für Patienten mit Epilepsie langfristig wirksame Therapien von
entscheidender Bedeutung, da - anders als bei der Parkinson’schen Erkrankung, bei der die
Symptome erst in der zweiten Lebenshälfte auftreten - sehr junge Patienten an Epilepsie lei-
den, die ihr ganzes Leben therapiert werden müssen (BOISON 2007).
6.6. Ausblick fokale Therapien
Fokale Therapien sind durch die beschriebenen Vorteile gegenüber der systemischen Therapie
gekennzeichnet (s. Abschnitt 6.1.5). In dieser Arbeit war die fokale Applikation eines
Antiepileptikums die erfolgreichste Strategie, um Anfallsschwellen im PTZ-Modell zu erhö-
hen. Für eine klinische Translation sind aber noch einige Untersuchungen nötig. So ist nicht
geklärt, ob sich diese Ergebnisse auch in chronischen Epilepsiemodellen mit kontinuierlicher
Vigabatrin-Infusion reproduzieren lassen. Besonders eine Toleranzentwicklung stellt hier ein
Hindernis für die dauerhafte, fokale Applikation dar (LÖSCHER u. FREY 1987). Vorteile in
der Nutzung von Vigabatrin gegenüber dem GABA-Agonisten Muscimol könnten darin be-
stehen, dass Vigabatrin in unseren Studien eine höhere antikonvulsive Potenz als Muscimol
aufwies (GERNERT u. LÖSCHER 2001; NOLTE et al. 2006) und intranigrale als auch in-
trasubthalamische Muscimol-Injektionen unerwünschte Nebenwirkungen wie stereotype Ver-
haltensweisen (Zirkeln, Schnüffeln, Nagen), Hyperaktivität oder Kopf- und Körperschräg-
haltung hervorriefen (GALE 1992a; DYBDAL u. GALE 2000). Nach Vigabatrin-Injektionen
wurden in dieser und anderen Studien keine derartigen Nebenwirkungen beobachtet
(LÖSCHER et al. 1987; GERNERT u. LÖSCHER 2001; NOLTE et al. 2006). GALE
(1992a,b) vermutete, dass der Unterschied im Nebenwirkungsprofil von Muscimol und Viga-
batrin im Wirkmechanismus begründet liegt: Während Muscimol kontinuierlich GABA-Re-
zeptoren stimuliert, wirkt Vigabatrin über eine Erhöhung des präsynaptischen Speichers an
GABA, das dann in physiologischen Mengen ausgeschüttet wird (GALE 1992b).
Inzwischen gibt es allerdings EEG-gestützte Anfallsdetektoren (SKARPAAS u. MORRELL
2009), die für Neurostimulation bei Epilepsie eingesetzt werden, und lediglich bei Bedarf, vor
Auftreten eines Anfalls, eine Stimulation auslösen. Analog wäre auch eine fokale Substanz-
applikation als Reaktion auf beginnende epileptiforme Aktivität denkbar. Neben Infusions-
Diskussion
155
systemen gibt es alternative Systeme, wie etwa Polymermatrizen, die GABA freisetzen
(KOKAIA et al. 1994).
Der Einsatz von Substanzen für fokale Therapie sollte zunächst sorgfältig in Tiermodellen
geprüft werden. Hier sind vor allem Modelle interessant, in denen pharmakoresistente Tiere
selektiert werden (LÖSCHER u. RUNDFELDT 1991; EBERT et al. 1999).
Ebenso verhält es sich mit der Neurotransplantation, die in dieser Studie nicht zu einem anti-
konvulsiven Effekt führte. Die Erklärungsansätze hierfür sind vielfältig; in der Zukunft sollen
in unserer Arbeitsgruppe Zelltransplantationen in chronischen Modellen für Epilepsie durch-
geführt werden, in denen Transplantationen GABAerger Vorläuferzellen erfolgreicher waren.
Das Vorbehandlungsprotokoll soll verbessert werden und zusätzlich werden Vorläuferzellen
aus dem Mesencephalon verwendet, aus denen sich GABAerge Neurone differenzieren lassen
(WEGNER et al. 2008). Neben einer allogenen Transplantation sind auch Xenotransplanta-
tionen aus dem Schwein und dem Menschen in der AG Löscher geplant. In beiden Fällen
werden wir eine immunsuppressive Therapie durchführen, zunächst werden allerdings Effekte
einer Immunsuppression auf die PTZ-Anfallsschwelle evaluiert. Im Falle der Verwendung
porciner Zellen werden wir „humanisierte“ Schweinezellen einsetzen, die uns freundlicher-
weise von Prof. Dr. H. Niemann (FLI Mariensee) zur Verfügung gestellt werden, um die Ge-
fahr potentiell zoonotischer, viraler Infektionen zu umgehen. Der Einsatz von porcinen Zellen
wäre auch translational interessant, da es weniger ethische Bedenken und limitierende Ge-
setze als bei der Gewinnung der Zellen aus menschlichen Feten gibt. Hier liegt auch ein gro-
ßer Vorteil in der Verwendung von Zelllinien wie den NT2-Zellen. Es existiert ein Subklon
der Zellen, der genetisch so manipuliert wurde, dass vermehrt GABAerge Neurone entstehen
(EATON et al. 2007; VAYSSE et al. 2011). Die zukünftige Nutzung dieser Zellen für Trans-
plantationen ist geplant.
Zusammenfassung
156
7. ZUSAMMENFASSUNG Sonja Bröer
Fokale Substanzapplikation und Neurotransplantation zur Therapie pharmako-
resistener Epilepsien
Epilepsien gehören bei Mensch und Tier zu den häufigsten chronischen Erkrankungen des
zentralen Nervensystems. Etwa 30 % der menschlichen und 70 % der caninen Patienten sind
pharmakoresistent; trotz Behandlung mit modernsten Antipepileptika wird keine Anfallsfrei-
heit erreicht. Neue therapeutische Strategien sind daher essentiell, um die Situation der er-
krankten Patienten zu verbessern.
Eine vielversprechende Alternative zur systemischen Therapie ist die fokale, gerichtete Mani-
pulation des epileptischen Netzwerkes. Für den Behandlungserfolg ist es unabdingbar, zu-
nächst geeignete Zielregionen im Zentralnervensystem zu determinieren. Eine der Ausgangs-
strukturen der Basalganglien, die Substantia nigra pars reticulata (SNr), ist hinsichtlich ihrer
anfallsmodulierenden Eigenschaften gut untersucht. Sowohl eine Inhibition der SNr selbst, als
auch ihrer exzitatorischen Eingangsstruktur, des subthalamischen Nukleus (STN), führen ex-
perimentell zu antikonvulsiven Effekten. Bisher wurden die Wirkungen fokaler und syste-
mischer Therapie kaum vergleichend untersucht, was für die Einschätzung der Effektivität der
Behandlung von enormer Wichtigkeit wäre. Ich habe die gerichtete Therapie anhand von zwei
Strategien, der fokalen Pharmakotherapie und der Neurotransplantation, untersucht. Beiden ist
gemein, dass durch eine Verstärkung der GABAergen Inhibition das bei Epilepsie existie-
rende Ungleichgewicht zwischen erregender und hemmender Neurotransmission egalisiert
werden soll.
In der ersten Studie habe ich daher das Antiepileptikum Vigabatrin in die angesprochenen
Basalganglienregionen mikroinjiziert und auftretende Effekte im Pentylentetrazol-Anfalls-
schwellentest (PTZ-Test) mit einer systemischen Administration verglichen. Vigabatrin er-
höht durch irreversible Inhibition der GABA-Transaminase die Konzentration von GABA.
Bilaterale Injektionen in den STN zeigten sich als effektivste Maßnahme, um die Anfalls-
schwelle signifikant zu erhöhen. Ähnlich starke antikonvulsive Wirkungen ließen sich weder
mit systemischer noch mit bilateraler Injektion in eine der Subregionen der SNr, das Striatum
oder an den STN angrenzende Strukturen reproduzieren. Die systemische Behandlung führte
zudem zu ausgeprägten Nebenwirkungen (Sedation, Verlust der Körpertemperatur und des -
Zusammenfassung
157
gewichtes), die nach fokaler Therapie nicht beobachtet wurden. Zukünftige Studien sollten
die Wirkung einer kontinuierlichen fokalen Infusion in chronischen Modellen für Temporal-
lappenepilepsie untersuchen. Die Vorteile einer fokalen Therapie liegen in der Reduktion von
Nebenwirkungen, der Umgehung der Bluthirnschranke (BHS), sowie einem reversiblen Ein-
griff. Des Weiteren können Substanzen intrazerebral appliziert werden, die systemisch eine
hohe Toxizität aufweisen oder nicht die BHS überwinden können. In meiner Arbeit habe ich
Botulinumtoxin B in den Hippokampus, der experimentell und klinisch häufig den epilep-
tischen Fokus darstellt, mikroinjiziert. Hierfür wurde die „convection-enhanced delivery“
genutzt, die eine homogene Verteilung der Substanz innerhalb der Zielregion ermöglicht.
Botulinumtoxin B führte zu prokonvulsiven Effekten im PTZ-Modell, spontanen Anfällen
und einem hyperexzitablen Verhalten, was wahrscheinlich durch das Setzen eines epilep-
tischen Fokus und plastische Netzwerkveränderungen erklärt werden kann. Die Wirkung von
Botulinumtoxin B sollte in weiteren Modellen für Epilepsie untersucht werden.
Der zweite experimentelle Ansatz war die Transplantation verschiedener Zelltypen. Frühere
Studien zeigten antikonvulsive, aber transiente Effekte nach Transplantation GABAerger
Zellen. Weder die Transplantation einer Mischkultur aus humanen, adulten NT2-Neuronen,
noch die Verwendung von NT2- oder GABAergen Precursorzellen aus der lateralen oder
medialen ganglionischen Eminenz von E14 Rattenfeten in den STN oder die SNr führten zu
antikonvulsiven Effekten. Preliminäre Daten belegten ein geringes Überleben der Zellen so-
wie eine niedrige Zahl an ausdifferenzierten GABAergen Neuronen. Eine Vorbehandlung der
Zellen mit Retinsäure und Kaliumchlorid vermochte zwar den Anteil an GABAergen Zellen
zu erhöhen, jedoch trat kein protektiver Effekt im PTZ-Test auf. Mögliche Ursachen sind ne-
ben der Integrität und neuronalen Zusammensetzung der Zielstruktur auch die Herkunft der
GABAergen Zellen und modellabhängige Faktoren.
Insgesamt leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Strategiefindung für zukünftige Therapien
pharmakoresistener Epilepsien. In der vorliegenden Studie war die fokale Substanzapplikation
erfolgreicher als eine Neurotransplantation. Es ist die erste Untersuchung, die den STN als
vielversprechendste Zielregion innerhalb der Basalganglien für Manipulationen des
GABAergen Systems identifiziert hat. Neurochirurgisch ist die Verwendung des STN als
Zielstruktur bereits für tiefe Hirnstimulationen etabliert, was eine Translation der fokalen
Pharmakotherapie in die Klinik erleichtern würde.
Summary
158
8. SUMMARY
Sonja Bröer
Focal pharmacotherapy and neurotransplantation to treat pharmacoresistant epilepsies
Epilepsies are among the most common chronic neurological disorders, affecting both
humans and animals. Thus far, about 30 % of human as well as 70 % of canine patients do not
achieve seizure freedom under medication with modern antiseizure drugs. Novel treatment
approaches are mandatory in order to improve the situation of patients suffering from
pharmacoresistant epilepsy.
One promising alternative to systemic treatment is focal therapy of the epileptic network,
which requires the determination of appropriate target regions within the brain. One option is
to manipulate regions downstream of the seizure focus such as the basal ganglia, which are
known to be involved in seizure propagation and modulation. Inhibition of one of the output
structures, the substantia nigra pars reticulata, SNr, or its excitatory input, the subthalamic
nucleus, STN, have been shown to act anticonvulsant in different seizure models. Most of
these studies lack a direct comparison of efficiency of focal and systemic treatment. I have
examined two promising approaches of targeted therapy, focal pharmacotherapy and
neurotransplantation of different cell types. Both strategies have in common that GABAergic
inhibition is enhanced, based on the concept of restoring the imbalance between excitatory
and inhibitory neurotransmission in the epileptic brain.
In the first study, anticonvulsant effects after focal microinjection or systemic administration
of the antiseizure drug vigabatrin were assessed in the pentylenetetrazole seizure threshold
test (PTZ-test). Vigabatrin enhances the intracerebral concentration of GABA by irreversibly
inhibiting the GABA-degrading enzyme GABA-transaminase. I could demonstrate that
bilateral subthalamic injection is the most effective treatment to increase the seizure threshold
significantly. The specifity of this outcome was affirmed by evaluation of effects following
injections into anterior and posterior SNr, striatum, and adjacent structures of the STN, which
were not as pronounced. Systemic injections were less effective and caused severe side effects
(sedation, loss of body temperature and weight), which were not seen in focally treated
animals. Future studies will have to assess feasibility and efficiency of continuous
microinfusion in chronic models of temporal lobe epilepsy. The obvious benefits of focal
therapy are reduction of side effects, circumvention of the blood brain barrier (BBB), and its
Summary
159
reversible nature. Furthermore, it enables the usage of substances that are not eligible for
systemic treatment because of toxicity or their inability to pass the BBB. In additional
experiments, I have injected botulinum toxin B into the hippocampus, which frequently is the
seizure focus in clinical and experimental epilepsy. Injection was performed by convection-
enhanced delivery to allow a more homogenous distribution among the target region than
bolus deposition. Botulinum toxin B led to a significant, proconvulsant effect in the PTZ-test,
as well as to spontaneous seizures and hyperexcitability in rats, which might have been
induced by producing an epileptic focus and subsequent plastic network changes. The effects
of botulinum toxin B should be investigated in different seizure models in the future.
The second strategy was based on transplantation of different cell types. Earlier investigations
had shown anticonvulsant, but transient effects after grafting of GABA-producing cells. In
our experimental set-up, neither a mixed culture of human NT2-cells nor its precursors or
GABAergic precursors, derived from medial or lateral ganglionic eminences of E14 rat
fetuses, could alter the seizure threshold. Preliminary data indicate low survival and differen-
tiation of the transplanted cells. A stimulation of rat precursors with retinoic acid and
potassium chloride did produce a higher proportion of GABAergic cells; however no anti-
convulsant effects were obtained. Reasons might include the integrity and neuronal content of
the target region as well as transplant cell type and source and animal model dependent
factors.
In summary, this work contributes to the growing knowledge of alternative treatment
approaches in pharmacoresistant epilepsy. In our hands, focal pharmacotherapy was more
effective than neurotransplantation. This is the first study to identify the STN as the most
promising target region for manipulations of the GABAergic system among the basal ganglia.
The STN is already clinically used as a target in a number of neurosurgical applications like
deep brain stimulation, which makes it feasible to target the STN for focal pharmacotherapy.
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Anhang
197
10. ANHANG
10.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien
Gerät bzw. Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Tierhaltung
Einstreu (Weichholzgranulat Altromin) Altromin, Lage
Makrolonkäfig (Typ III und IV) Ebeco, Caustrop-Rauxel
Milchbrei (Früchte oder Banane) Milupa GmbH, Friedrichsdorf
Standardnagerdiät (Altromin 1324) Altromin, Lage
PTZ-Anfallsschwellentest
Gewebsklebeband Tesa SE, Hamburg
Infusionspumpe (PHD 2000) Harvard Apparatus, Holliston, USA
Injektionskanüle (24 G) Terumo® Europe n.V., Leuven, Belgien
Isotonische Natriumchloridlösung (NaCl, 0,9%) Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen
Pentylentetrazol Caesar & Loretz, Hilden
Polyethylenschlauch Kleinfeld Labortechnik, Gehrden
Vorabstudie: Wahl der Anästhesie
Isofluran Cp-pharma®, Burgdorf
Ketamin 10 % medistar, Holzwickede
Narkosemasken (Eigenbau)
Herr Baum, Institut für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche
Hochschule Hannover
Sauerstoff Linde AG, Pullach
Xylazin 2 % Riemser Greifswald
Studie I: Fokale Substanzapplikation
Botulinumtoxin B und Vehikel Solstice Neurosciences Inc. (San Francisco, Kali-
fornien, USA)
Vigabatrin Merrell International Research Center, Stras-
bourg, Frankreich
Studie II: Neurotransplantation
Medien und Antikörper s. gesonderte Tabellen
Anhang
198
Zellkultur
6-well-Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
70 µm-Filter (Zellsieb) (BD FalconTM
) BD Biosciences, Erembodegem, Belgien
Accutase® Invitrogen, Darmstadt
Brutschrank (Heraeus BBD6220) Kendro (Heraeus), Hanau
Deckgläschen (Ø 12 mm) Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Digitalcamera (Canon Powershot A640) Canon Deutschland GmbH, Krefeld
Falkon-Tubes (15 ml und 50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Gewebskulturflaschen 75 cm2 und 25 cm
2 Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Konfokales Mikroskop Leica TCS SP5 mit der
Software „Leica LAS AF Lite v2.2.1“
Leica Microsystems, Wetzlar
Lichtmikroskop, invers (Axiovert 25) Carl Zeiss Jena GmbH, Jena
Lichtmikroskop, invers (Nikon eclipse TS100) Carl Zeiss, Oberkochen
NT2-Vorläufer- und adulte Zellen AG Bicker, TiHo Hannover
Objektträger Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig
Plastikpipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Precursorzellen aus der Ratte Selbst präpariert
Stickstofftank (MVE Cryosystem 2000) Chart/MVE, Burnsville, USA
Zentrifuge (Typ 4123) Heraeus Christ GmbH, Osterode
Stereotaktische Operation (MI= Mikroinjektion; CED; T = Transplantation)
AxoScope (CED) Axon Instruments, Foster City, CA
Axotape 9 (CED) Axon Instruments, Foster City, CA
Bepanthen Augen- und Nasencreme Bayer Vital, Leverkusen
Bupivacainhydrochloridlösung (Carbostesin) Astra Zeneca, Wedel
Dentalbohrer (Mod. 732 T1) Dremel, Leinfelden-Echterdingen
Draht für Injektionsnadel 18 mm (MI) Schoeller Werke, Hellenthal
Führungsrohr-Elektroden-Kombinationen,
22 G Führungsrohr (CED)
PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA
Führungsrohr aus PEEK (Polyetheretherketon),
Glaskapillaren (Micropipettes) (T) Drummond Scientific Company, Broomall, USA
Grass CP511 AC EEG-Preamplifier (CED) Astro-Med, West Warwick, RI
Hamiltonspritze (0,5 µl) (MI)
(Mod. 7000.5 KH, pst 3)
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz
Hamiltonspritze (2 µl) (T) (Mod. 7002 KH pst 2) Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz
Anhang
199
Horizontalpuller (Sachs-Flaming PC-84) (T) Sutter Instrument Corp., Novato, USA
Infusionspumpe (CED) Model KDS200, KD Scientific, Holliston, MA
Injektionskanülen, 28 G (CED) PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA
Mikroinjektionsschlauch (MI) CMA Microdialysis, Schweden
Nahtmaterial (Ethicon VICRYL® V994H (4-0)) Johnson-Johnson Intl., New Brunswick, USA
Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Chicago, USA
Polyethylenschlauch (CED) PlasticsOne, Roanoke, Virginia, USA
Quarzglas-Injektionskanüle innerhalb der In-
jektionskanüle aus Plastik (CED)
Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona
Skalpellklingen Rüttgers GmbH & Co. KG, Solingen
Stereotakt I Kopf David Kopf, Tujunga, CA, USA
Stereotakt II Stölting Wood Dale, USA
Systemhalterung für Glaskapillar- und
Hamiltonspritzensystem (Eigenbau) (T)
Herr Baum, Institut für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche
Hochschule Hannover
Tetracainhydrochlorid Ceasar & Loretz GmbH, Hilden
Wasserstoffperoxid (35%) AppliChem GmbH, Darmstadt
Zahnzement (CED) Lang Dental, Wheeling, Illinios, USA
Status-Induktion
Diazepam (Faustan®)
Temmler Pharma GmbH & Co. KG,
Marburg
Lithiumchlorid Sigma Aldrich, Steinheim
Methylscopolamin Sigma Aldrich, Steinheim
Pilocarpin Sigma Aldrich, Steinheim
Perfusion
Chloralhydrat AppliChem GmbH, Darmstadt
Paraformaldehyd-Pulver Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Schlauchpumpe (ISM897A)
Ismatec®, IDEX Health & Science GmbH,
Wertheim-Mondfeld
Histologie und Immunhistologie
3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Aqua ad injectabilia Braun, Tuttlingen
Bildanalysesoftware AxioVision® Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen
Anhang
200
BSA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Deckgläser Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig
Digitalkamera (CCD, Axiocam MR3) Zeiss, Göttingen
Eindeckmedium (Entellan®) Merck AG, Darmstadt
Gefriermikrotom (CM 1325) Leica, Wetzlar
Gefrierschutzmedium
(Tissue Freezing Medium®)
Jung GmbH, Nussloch
Kammern (Shandon CoverplateTM
) Thermo Fisher Scientific, Schwerte
Lichtmikroskop Leica DM LB Leica, Wetzlar
Lichtmikroskop Zeiss Axioskop Zeiss, Göttingen
Serum (Rabbit, Goat) Dianova GmbH, Hamburg
Streptavidin-Cy3 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Streptavidin-Meerettichperoxidase Dianova GmbH, Hamburg
Terpineol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Thionin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Tris AppliChem GmbH, Darmstadt
Triton X-100 AppliChem GmbH, Darmstadt
Wasserstoffperoxid Riedel de Häen, Hannover
Xylol-Ersatzmedium (XEM) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Anhang
201
10.2. Medien für die Zellkultur
Tab. 7 Verwendete Medien für die Gewinnung, Dissoziation, Proliferation und direkt anschließende
Transplantation von Vorläuferzellen aus der LGE.
Kultivierungsmedium Dissoziationsmedium Proliferationsmedium Transplantations-
medium
1:1 DMEM/F12
(Life Technologies)
1:1 DMEM/F12
(Life Technologies)
1:1 DMEM/F12
(Life Technologies)
Neurobasal®
(Invitrogen)
1xB27® Supplement
(ohne Retinsäure)
(Life Technologies)
1x B27® Supplement
(ohne Retinsäure)
(Life Technologies)
200 ng/ml FGF2
(PAN Biotech)
500 µM Caspase-
Inhibitor Ac-YVAD-
cmk
(Enzo Life Sciences)
Tab. 8 Verwendete Medien für die Gewinnung, Kultivierung und Transplantation von Vorläuferzellen
aus der MGE.
Kultivierungsmedium Proliferationsmedium Transplantationsmedium
1:1 DMEM/F12
(Life Technologies)
1:1 DMEM/F12
(Life Technologies)
Neurobasal® (Invitrogen)
1x B27® Supplement (ohne Retinsäure)
(Life Technologies)
20 ng/ml FGF2 (PAN Biotech)
20 ng/ml EGF (PAN Biotech)
10 ng/ml BrdU (Sigma)
100 µg/ml Penicillin/Streptomycin
(Biochrom AG)
0,25 µg/ml Fungizone (Invitrogen)
Anhang
202
Tab. 9 Zusätze für die Vorbehandlung der Zellen in-vitro.
Zusatz Bezugsquelle
5 mM Creatinmonohydrat (Creapure®) Freundlicherweise zur Verfügung gestellt von
Alzchem Trostberg GmbH, Trostberg
40 mM Kaliumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
10 µM Retinsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
0,5 mM Valproinsäure (Orfiril®) Desitin Arzneimittel, Hamburg
10.3. Antikörper
Tab. 10 Verwendete Antikörper und ihre Bezugsquellen.
Antikörper Verdünnung Bezugsquelle
Alexa-Fluor 488-konjugierter Goat-anti-Rat
Antikörper
1:1000 Dianova GmbH, Hamburg
Anti-BrdU (MAB 3510) (Maus) 1:1000 Millipore, Schwallbach/Ts
Anti-BrdU (OBT 0030) (Ratte) 1:20 Abd serotec, Düsseldorf
Anti-GAD67 (MAB 5406) (Maus) 1:500 Millipore, Schwallbach/Ts.
Anti-GFAP (Kaninchen) 1:1000 DAKO, Hamburg
Anti-NeuN (MAB 377) (Maus) 1:500 Millipore, Schwallbach/Ts
Anti-Neurofilament (70 kDa) (Maus) 1:1000 MAB5294, Milipore, Darm-
stadt
Biotinylierter Goat-anti-Mouse Antikörper 1:500 Dianova GmbH, Hamburg
Biotinylierter Goat-anti-Rabbit Antikörper 1:1000 Dianova GmbH, Hamburg
Biotinylierter Rabbit-anti-Mouse Antikörper 1:500 Dianova GmbH, Hamburg
Cy2-konjugierter Goat-anti-Rabbit Antikör-
per
1:1000 Dianova GmbH, Hamburg
Cy2-konjugierter Goat-anti-Rat Antikörper 1:1000 Dianova GmbH, Hamburg
Cy3-konjugierter Goat-anti-Mouse Anti-
körper
1:1000 Dianova GmbH, Hamburg
Cy3-konjugiertes Streptavidin 1:1000
In Klammern ist die Tierart angegeben, aus der der primäre Antikörper gewonnen wurde. Cy = Carbocyanin.
Anhang
203
10.4. Puffer und Lösungen
10.4.1. Stereotaktische Operation
Tetracainhydrochlorid-Lösung (2%)
227 mg Tetracainhydrochlorid
In 10 ml Aqua bidest. lösen
Über eine 0,22 µm Millipore-Filtereinheit filtrieren
10.4.2. Perfusion
0,4 M Phosphatpuffer (Stammlösung)
800 ml Aqua dest.
57 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat
12,48 g Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat
Mit 1 M Natronlauge auf pH 7,4 einstellen
Ad 1000 ml Aqua dest.
0,2 M Phosphatpuffer
0,4M Phosphatpuffer 1:1 mit Aqua dest. verdünnen
0,1 M Phosphatpuffer
0,2M Phosphatpuffer 1:1 mit Aqua dest. verdünnen
0,01 M Phosphatpuffer
9 g Natriumchlorid
100 ml 0,1 M Phosphatpuffer
Mit 0,1 M Salzsäure auf pH 7,6 einstellen
Add 1000 ml Aqua dest.
16 % Paraformaldehydlösung
800 ml Aqua dest. auf 60-70°C erhitzen
160 g Paraformaldehyd-Pulver unter Rühren hinzugeben
Mit 1 M Natronlauge bis zur Klärung titrieren
Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und dann filtrieren
Ad 1000 ml Aqua dest.
Anhang
204
4 % Paraformaldehydlösung
16 %ige Paraformaldehydlösung mit 0,2 M PBS auf eine 4 %igen Lösung verdünnen
10 %ige Saccharoselösung (pro Rattengehirn)
3 g Zucker
Ad 30 ml 0,1M PBS
30 %ige Saccharoselösung (pro Rattengehirn)
9 g Zucker
Ad 30 ml 0,1M PBS
10.4.3. Zellkultur
Phosphatpuffer
40 g Natriumchlorid
1 g Kaliumchlorid
3,815 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat
1 g Kaliumdihydrogenphosphat
In 4 L Aqua dest. lösen
pH-Wert auf 7,3 einstellen
Ad 5 L Aqua dest.
Einfriermedium
Kulturmedium
Versetzt mit 10 % DMSO
10.4.4. Histologie
Chromgelantine
7 g Gelantine in 1.000 ml Aqua dest. auf 60 °C erwärmen
Etwas Thymol (wenige mg) zugeben
0,7 g Chrom-(III) Kaliumsulfat-Dodecanhydrat nach dem Erwärmen hinzugeben
Auf Eis auf 20 °C abkühlen
filtrieren
Anhang
205
Gefriermedium
85,6 g Glucose-Monohydrat
1,4 g Magnesium-Chlorid-Hexahydrat
In 500 ml 0,1 M PBS lösen
Mit 87 %igem Glyzerin auf 1000 ml auffüllen
Thionin-Lösung
100 ml 1 M Essigsäure
36 ml 1 M Natronlauge
Ad 1000 ml Aqua dest.
Auf 60-70 °C erhitzen
1,25 g Thionin darin lösen
1 Stunde bei 60-70 °C rühren und dann heiß filtrieren
Bei 60 °C lagern (bis zu drei Monate haltbar)
0,05 M tris-gepufferte Saline (TBS)
9 g Natriumchlorid
6,057 g Tris
800 ml Aqua dest.
Mit 37 %iger Salzsäure auf pH 7,6 einstellen
Ad 1.000 ml Aqua dest.
10.4.5. Immunhistologie
Carrierlösung
100 ml TBS
1 ml Serum des Tiers aus dem der 2. AK gewonnen wurde (Goat Serum)
1 g bovines Serumalbumin (BSA)
1,5 ml 20 %iges Triton X-100
Blockinglösung
4,5 ml Carrierlösung
0,5 ml Serum des Tiers aus dem der 2. AK gewonnen wurde (Goat Serum)
100 mg BSA
Tris/Nickel-Lösung
0,3 g Ammonium-Nickel(II)-Sulfat-Hexahydrat
50 ml TBS
Anhang
206
3,3’-Diaminobenzidin-Lösung (DAB)
500 mg 3,3’-DAB
7,5 ml TBS
3,3’-DAB-Färbelösung
30 µl 3,3’-DAB Stammlösung
4 ml Tris/Nickel-Lösung
Zum Starten der Reaktion 1 µl 35 %iges Wasserstoffperoxid hinzugeben
10.5. Färbeprotokolle
10.5.1. Histologische Färbungen
Thioninfärbung (zur Lokalisationsbestimmung in Studie I und II verwendet)
3 min in 100 % Ethanol inkubieren
3 min in 95 % Ethanol inkubieren
3 min in 70 % Ethanol inkubieren
3 min in 50 % Ethanol inkubieren
3 min in Aqua dest. inkubieren
75-90 sek. in Thionin-Färbelösung (42- 48 °C) inkubieren
3 min in 50 % Ethanol inkubieren
3 min in 70 % Ethanol inkubieren
3 min in 95 % Ethanol inkubieren
3 min in 100 % Ethanol inkubieren
3 min in Terpineol/Xylol-Ersatzmedium 1:1 inkubieren
3 min in Xylol-Ersatzmedium inkubieren
3 min in frischem Xylol-Ersatzmedium inkubieren
Sofortiges Eindecken der Schnitte mit Entellan® und Trocknen an der Luft
Färbung nach Shorr (zur Färbung der Vaginalabstriche für die Zyklusbestimmung)
10-mal in 70 % Ethanol eintauchen
10-mal in Aqua dest. Wässern
2 min in Meyers Hämalaun inkubieren
10-mal in Aqua dest. Wässern
1 min in Lithium-Carbonat (gesättigte Lösung 1:1 mit Aqua dest. verdünnt) inkubieren
Anhang
207
10-mal in Aqua dest. wässern
10-mal in 70 % Ethanol inkubieren
6 min in Shorr‘scher Färbelösung inkubieren
10-mal in 95 % Ethanol eintauchen
30 sek. In 95 % Ethanol inkubieren
Lufttrocknen lassen
10.5.2. Immunhistologische Färbungen
Es wurden sowohl immunhistologische Färbungen von fixierten Vorläuferzellen aus der Ratte als auch
von histologischen Schnittpräparaten der Gehirne nach Transplantation angefertigt.
10.5.2.1. Immunhistologische Färbung von fixierten Zellen auf Deck-
gläschen
1. Tag:
3x in Tris-gepufferter 0,9 % NaCl-Lsg. (TBS; pH 7,6; ca. 5 ml) waschen, je Waschgang 5 min
60 min in Blocklösung inkubieren
10 min in Carrierlösung inkubieren
1 Tropfen Antikörperlösung auf Parafilm auftragen und Deckgläschen 18-24 h in diesem Tropfen bei
4 °C inkubieren [Antikörperlösung z.B. primärer Antikörper anti-NeuN aus Maus in Carrierlösung
(1:500)]
2. Tag:
3x je 5 min in TBS waschen
10 min in Carrierlösung inkubieren
Negativkontrolle entnehmen, keine Inkubation in primärem Antikörper durchführen!
60 min in Antikörperlösung inkubieren [in diesem Fall z.B. biotinylierter Goat-anti-Mouse in
Carrierlösung (1:500)]
3x je 5 min in TBS waschen
60 min in Streptavidin/Fluoreszin (Cy3-konjugiert) in TBS (1:1000) inkubieren
Ab diesem Zeitpunkt erfolgen alle weiteren Inkubationen abgeschirmt von Licht
3x je 5 min in TBS waschen
3 min in DAPI in TBS (1:5000) inkubieren
3x je 5 min in TBS waschen
1x mit Aqua dest. waschen
Lufttrocknen
Anhang
208
Mit Mowiol eindecken
10.5.2.2. Immunhistologische Färbung von 40 µm-Gehirnschnitten im free-
floating Verfahren
10.5.2.2.1. DAB-Färbung
Das Protokoll entspricht im Wesentlichen dem nachfolgend beschriebenen Protokoll der
Immunfluororeszenz-Färbung. Ab Tag 2 werden jedoch abweichend nach der Inkubation mit
dem sekundären Antikörper und dem anschließenden Waschschritt die Schnitte für 90 min in
HRP-konjugiertem Streptavidin in TBS (1:375) inkubiert. Nach einem erneuten Waschschritt
folgt die 15 minütige Inkubation in 4 ml Tris/Nickel-Lösung + 30 µl DAB. Es wird 1 µl 35
%ige Wasserstoffperoxidlösung hinzugegeben und für weitere 10 min inkubiert. Danach wird
erneut gewaschen und wie beschrieben weiter verfahren (Aufziehen der Schnitte auf Objekt-
träger, Trockung und Eindecken).
10.5.2.2.2. Immunfluoreszenz-Färbung
1.Tag:
Schnitte in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) auffangen
[(3x in Tris-gepufferter 0,9 % NaCl-Lsg. (TBS; pH 7,6; ca. 5 ml) waschen, je Waschgang 5 min)
durchführen, wenn Schnitte gefroren im Glycerin aufbewahrt waren]
2 h bei 65° C in 50 % Formamid/2x SSC (2 ml 100 % Formamid + 2 ml (4x SSC)) inkubieren
10 min in 3 ml (2x SSC) inkubieren
30 min bei 37° C in 3 ml 2N HCl inkubieren
10 min in 3 ml 0,1 M Borsäure (pH 8,5) inkubieren, 1 mal Borsäure wechseln
3 x in TBS waschen, je Waschgang 5 min
60 min in 2 ml Blocklösung inkubieren
10 min in Carrierlösung (1,5 ml) inkubieren
Negativkontrolle entnehmen, keine Inkubation in primärem Antikörper durchführen!
18 - 24 h in 1,5 ml Carrierlösung + primärer Antikörper [z.B. anti-BrdU aus Ratte (1:20) und anti-
GAD67 aus Maus (1:500)] auf dem Rüttler bei 4°C inkubieren
2. Tag
3 x in TBS (ca. 5 ml) waschen (pro Waschschritt 10 min)
10 min in Carrierlösung inkubieren
Anhang
209
60 min in 1,5 ml Carrierlösung + sekundärer Antikörper [in diesem Beispiel etwa Cy2-konjugiert anti-
Ratte aus Ziege [Cy2 GaR] (1:1000) und biotinylierter anti-Maus aus Ziege [bGaM] (1:500)] auf
dem Rüttler inkubieren
Ab diesem Zeitpunkt erfolgen alle weiteren Inkubationen abgeschirmt von Licht
3 x in TBS (ca. 5 ml) waschen (pro Waschschritt 10 min)
60 min in TBS + Cy3-konjugiertes Streptavidin/Fluoreszin (1:1000)
3 x in TBS (ca. 5 ml) waschen (pro Waschschritt 10 min)
aus dest. Wasser auf mit Glycerineiweiß - bestrichene Objektträger aufziehen
Lufttrocknen
1 min in Toluol inkubieren
mit DTX eindecken
10.5.2.3. Immunhistologische Färbung von 12 µm-Gehirnschnitten auf
Objektträgern
Im Allgemeinen erfolgte die Färbung analog des unter Abschnitt 10.5.2.2.2 beschriebenen Protokolls,
mit dem Unterschied, dass die Schnitte auf den Objektträgern zunächst für 10 min mit frisch ange-
setztem 4 %igen Paraformaldehyd fixiert wurden und anschließend kein „free-floating-Verfahren“ zur
Anwendung kam, sondern die Objektträger bis zum ersten Auftragen der Carrier-Lösung in Glas-
küvetten behandelt wurden und ab diesem Zeitpunkt in Kammern eingespannt wurden, um das
benötigte Volumen für die Antikörper möglichst gering zu halten.
Publikationen
210
11. PUBLIKATIONEN
Originalarbeiten BRÖER, S., D. ZOLKOWSKA, M. GERNERT und M. ROGAWSKI (2013).
Proconvulsant action of Botulinumtoxin B after hippocampal administration – Investigations in an
acute seizure model.
Manuskript in Vorbereitung.
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, L. GEY, M. GERNERT und W.
LÖSCHER (2012).
Vigabatrin for focal drug delivery in epilepsy: bilateral microinfusion into the subthalamic nucleus is
more effective than intranigral or systemic administration in a rat seizure model.
Neurobiol Dis 46:362-76.
HANDRECK, A., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, S. BRÖER, W. LÖSCHER und M. GERNERT
(2012).
Anticonvulsant effects by bilateral and unilateral transplantation of GABA-producing cells into the
subthalamic nucleus in an acute seizure model.
Cell Transplantation, im Druck, DOI: 10.3727/096368912X658944.
RATTKA, M., C. BRANDT, M. BANKSTAHL, S. BRÖER und W. LÖSCHER (2011).
Enhanced susceptibility to the GABA antagonist pentylenetetrazole during the latent period following
a pilocarpine-induced status epilepticus in rats.
Neuropharm. 60:505-12.
Zitierfähige Kongressbeiträge BACKOFEN-WEHRHAHN, B., B. PETERSEN, S. BRÖER, M. GERNERT, H. NIEMANN und W.
LÖSCHER (2012).
Xenotransplantation of porcine fetal neuronal stem cells (PNSCs) in epilepsy - Comparison of
wildtype and different transgenic PNSCs in an acute seizure model in rats.
American Epilepsy Society Annual Meeting, San Diego, www.aesnet.org.
HANDRECK, A., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, S. BRÖER, W. LÖSCHER und M. GERNERT
(2012).
Bilateral and unilateral trabsplantation of GABA-producing cells into the subthalamic nucleus is
anticonvulsant in an acute seizure model.
8th FENS Forum of European Neuroscience, Barcelona; FENS Abstr. vol. 6, p060.12.
BRÖER, S. C., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, F. ROLOFF, G. BICKER, M. BANKSTAHL, W.
LÖSCHER und M. GERNERT (2011).
Cell transplantation in experimental epilepsy - Identification of target regions and suitable cell sources
in an acute seizure model.
Abstract No 1.277, American Epilepsy Society Annual Meeting, Baltimore, www.aesnet.org.
Publikationen
211
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, F. ROLOFF, G. BICKER, W. LÖSCHER und M.
GERNERT (2011).
Comparison of targets for neural transplantation in the basal ganglia and identification of suitable cell
sources in an acute seizure model.
Epilepsia 52, Issue Supplement s6: 159/p514.
BACKOFEN-WEHRHAHN, B., S. BRÖER, W. LÖSCHER und M. GERNERT (2011).
Microinjection of the GABA-enhancing drug vigabatrin in an acute seizure model as a strategy for
identifying targets for neural transplantation with GABA-producing cells.
Cell Transplantation 20:557.
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, W. LÖSCHER und M. GERNERT
(2011).
Anticonvulsant efficacy of systemic versus focal application of vigabatrin – Investigations in an acute
seizure model.
Neuroforum Februar 2011 (1) Volume XVII (Suppl.: Proceedings of the 9th Göttingen Meeting of the
German Neuroscience Society / 33rd Göttingen Neurobiology Conference): T11-8A.
RATTKA, M., C. BRANDT, M. BANKSTAHL, S. BRÖER und W. LÖSCHER (2010).
Alterations in seizure threshold to the GABAA-receptor antagonist pentylenetetrazole after pilocarpine-
induced status epilepticus.
40th Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, 350.2/K14.
RATTKA, M., C. BRANDT, M. BANKSTAHL, S. BRÖER und W. LÖSCHER (2010).
Alterations in pentylenetetrazole seizure threshold after pilocarpine-induced status epilepticus. 7th
FENS Forum of European Neuroscience, Amsterdam; FENS Abstr., vol.5, 106.36.
Sonstige Vorträge BRÖER, S. (2012).
Auslandaufenthalt an der UC Davis, Kalifornien, wärend der Dissertation: Untersuchungen zur
Verwendung von Toxinen als Therapie für Epilepsie.
Pharmakologisches Kolloquium des Institutes für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie der
TiHo Hannover, Hannover.
BRÖER, S. (2012).
Neurotransplantation gegen das Gewitter im Gehirn?
Doktorandenforum der Studienstiftung des Deutschen Volkes e.V., Bad Homburg.
BRÖER, S. (2012).
Fokale Therapie als Alternative bei pharmakoresistenter Epilepsie? Vergleich systemischer und
fokaler Applikation von Vigabatrin in einem akuten Anfallsmodell.
Wahlpflichteveranstaltung des Zentrums für canine Neurowissenschaften: Neurowissenschaften in der
Tiermedizin: Grundlagen und Klinik, Hannover.
BRÖER, S., BACKOFEN-WEHRHAHN, B., BANKSTAHL, M., GERNERT, M. und W.
LÖSCHER (2011).
Focal therapy as an alternative treatment in pharmacoresistant epilepsy? Comparison of systemic and
focal administration of vigabatrin in an acute seizure model.
4th Graduate School Day der HGNI, Bad Salzdetfurth.
Publikationen
212
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, W. LÖSCHER und M.
GERNERT (2011).
Fokale Therapie als Alternative bei pharmakoresistenter Epilepsie? Vergleich systemischer und
fokaler Injektion von Vigabatrin in einem akuten Anfallsmodell.
21. VetPharm-Symposium, Leipzig.
BACKOFEN-WEHRHAHN, B. und S. BRÖER (2010).
Neurotransplantation in epilepsy.
Jährliches Treffen der DFG-Forschergruppe „Neurodegeneration und –regeneration bei ZNS-
Erkrankungen des Hundes“ (FOR 1103), Hannover.
BRÖER, S. (2010).
Neurotransplantation bei Epilepsien – ein neuer Therapieansatz?
Pharmakologisches Kolloquium des Institutes für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie der
TiHo Hannover, Hannover.
Sonstige Poster BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, G. BICKER, M. GERNERT und W. LÖSCHER (2012).
Focal therapy in experimental epilepsy – Identification of target regions and anticonvulsant efficacy in
an acute seizure model.
5th Graduate School Day der HGNI, Hannover.
BRÖER, S., B. BACKOFEN-WEHRHAHN, M. BANKSTAHL, W. LÖSCHER und M. GERNERT
(2011).
Microinjection of the GABA-enhancing drug vigabatrin in an acute seizure model as a strategy for
identifying targets for neural transplantation with GABA-producing cells.
First International Workshop of Veterinary Neuroscience, Hannover.
BACKOFEN-WEHRHAHN, B., S. BRÖER, F. ROLOFF, G. BICKER, M. GERNERT und W.
LÖSCHER (2011).
Comparison of different cell sources for neural transplantation into regions of the basal ganglia in
experimental epilepsy.
First International Workshop of Veterinary Neuroscience, Hannover.
BRÖER, S. und D. M. Noden (2007).
FGF8-mediated Control of Putative Muscle-Specific Transcription Factors.
2007 Merck-Merial-NIH National Veterinary Scholars Symposium, Bethesda, Maryland, USA.
Danksagung
213
12. DANKSAGUNG
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Löscher gilt mein größter Dank für die freundliche Überlassung des
Themas, und die intensive fachliche Betreuung. Außerdem danke ich ihm für die Unterstüt-
zung meines Forschungsaufenthaltes an der UC Davis sowie der Teilnahme an zahlreichen
nationalen und internationalen Kongressen.
Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Gerd Bicker und Herrn Prof. Dr. Konstantin Wewetzer
für die fachliche Supervision meiner Arbeit und eine nette, angenehme Atmosphäre während
unserer Treffen und der Zwischenprüfung.
Frau Prof. Dr. Manuela Gernert danke ich für die exzellente wissenschaftliche Betreuung und
Anleitung zum experimentellen Arbeiten, sowie für ihr ständig offenes Ohr für Versuchs-
ergebnisse aber auch auftretende Probleme. Des Weiteren danke ich ihr für die Hilfe bei der
Auswertung der EEG-Daten und die perfekte Korrektur zahlreicher Abstracts und
Manuskripte sowie der ersten Version dieser Arbeit, die sie aus psychologischen Gründen
nicht mit dem Rotstift durchführt.
Frau Dr. Bianca Backofen-Wehrhahn danke ich für für die Weitergabe ihrer vielfältigen
methodischen Fähigkeiten, vor allem für die geduldig wiederholten Erklärungen der Präpara-
tion der fetalen Hirnregionen, die sich dem ungeübten Beobachter manches Mal lediglich als
verschieden grau erscheinende Areale darstellten. Außerdem danke ich ihr für viele lustige
Stunden im Labor, die auch teilweise dadurch bedingt waren, dass manche Menschen
häufiger in ungewöhnliche Situationen verwickelt werden als andere…
Außerdem danke ich allen Kollegen und Praktikanten des Institutes für Pharmakologie, die
durch ihre Hilfe diese Arbeit erst möglich gemacht haben. Besonders Edith Kaczmarek,
Franziska Kaiser und Michael Weissing gilt mein Dank für zahlreiche Hilfestellungen.
Ebenso danke ich meinen Mitdoktoranden für eine angenehme Arbeitsatmosphäre, sowie für
die lustigen Stunden außerhalb des Institutes!
Danksagung
214
Zudem möchte mich bei Prof. Dr. Michael Rogawski für die freundliche Aufnahme in seiner
Arbeitsgruppe an der University of California Davis, sowie für die Freiheit mir selbst ein
spannendes Forschungsprojekt zu erarbeiten, bedanken. Des Weiteren danke ich Dorota
Zolkowska, Gregory Cooke und Jorge Sanchez für Ihre Hilfe bei der Durchführung meiner
Experimente in Kalifornien. Christoph Lossin half mir mit allen Formalien für einen
erfolgreichen Visumsantrag.
Vielen Dank auch meiner Familie und meinen Freunden, die mir immer unterstützend zur
Seite standen und stehen und gelegentlich auch mal einen Vortrag probehören durften bzw.
mussten. Besonders meine Eltern haben mir immer den Rücken freigehalten, um meine Ziele
zu verfolgen.
Ich danke meinem Freund Igor für seine liebevolle Unterstützung und seine wohlwollend und
doch kritische Durchsicht meiner Arbeit, in der er seine Aversion gegen simple und
verständliche Syntax für mich ein wenig gezügelt hat.
Zu guter Letzt danke ich der Studienstiftung des deutschen Volkes für die finanzielle und
ideelle Förderung, ohne die diese Arbeit nicht von mir hätte durchgeführt werden können und
der Forschergruppe „Neurodegeneration und –regeneration bei ZNS-Erkrankungen des
Hundes“ (FOR 1103) für die Finanzierung des Projektes und konstruktive Kritik und Anre-
gungen bei Versammlungen.
ISBN 978-3-86345-151-6
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de
Son
ja C
hri
stin
a B
röer
Han
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