Aus der Klinik für Pferde und dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen
der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie dem Institut für Virologie
des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin ___________________________________________________________________
Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit
des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2)
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von MYRIAM VON BORSTEL
aus Bremerhaven
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen PD Dr. rer. nat. K. Borchers 1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen 2. Gutachter: Prof. Dr. M.H. Boevé Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 03
meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite 1 Einleitung 15
2 Literaturübersicht 17
2.1. Anatomie und Funktion von Konjunktiva und Kornea 17 2.2. Entzündliche Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea beim Pferd 19
2.2.1. Konjunktivitis beim Pferd 19 2.2.2. Keratitis beim Pferd 20
2.3. Keratitis superficialis 22 2.3.1. Viruskeratitis 23
2.3.1.1. Keratitis punctata 24 2.3.1.2. Ulzerative Viruskeratitis 26 2.3.1.3. Keratitis maculosa 27 2.3.1.4. Weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien 27
2.4. Keratitis profunda 27 2.5. Keratitis interstitialis 29 2.6. Diagnostische Verfahren bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea 29
2.6.1. Exfoliative Zytologie 30 2.6.1.1. Technik der Probengewinnung 32
2.6.1.1.1. Abdruckzytologie 32 2.6.1.1.2. Tupfer 32 2.6.1.1.3. Geschabsel 33 2.6.1.1.4. Cytobrush 33
2.6.2. Erregernachweis 34 2.6.2.1. Mikrobiologische Untersuchung 34 2.6.2.2. Virologische Untersuchung 35
2.6.2.2.1. Indirekter Nachweis 35 2.6.2.2.2. Direkter Nachweis 35
2.7. EHV-2 beim Pferd 36 2.7.1 Vorkommen von EHV-2 in der Pferdepopulation 36 2.7.2 Klinische Relevanz und Nachweis von EHV-2 beim Pferd 37
3 Material und Methode 40
3.1 Versuchsplanung 40 3.2 Patientengut 40 3.3 Klinische Untersuchung 43
3.3.1 Spezielle ophtalmologische Untersuchung 43 3.3.1.1 Untersuchung im beleuchteten Raum 43 3.3.1.2 Untersuchung im abgedunkelten Raum 44
3.3.2 Klinische Diagnosen 44 3.4 Probenentnahme 48 3.5 Mikrobiologische Untersuchungen 50
Inhaltsverzeichnis
3.6 Virologische Untersuchungen 50 3.6.1 DNA-Isolierung aus peripheren Blutleukozyten (PBL) 50 3.6.2 DNA-Präparation aus Augentupfer-und Augencytobrushproben 51
sowie aus Nasentupferproben 3.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis des EHV-2- 52
Genoms 3.6.4 Virus-Anzucht 53
3.7 Exfoliative Zytologie 54 3.8 Statistische Auswertung 55
4 Ergebnisse 56
4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 56 4.1.1 Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung 56 4.1.2 Ergebnisse der ophtalmologischen Untersuchung 56
4.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen 63 4.2.1 Ergebnisse des direkten EHV-2 Nachweises mittels PCR 63 4.2.2 Virologischer Nachweis von EHV-2 mittels Virusanzucht 74
4.3 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung 75 4.4 Ergebnisse der zytologischen Untersuchung 85
5 Diskussion 98 5.1 Material und Methode 98 5.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels PCR 101 5.3 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels Virusanzucht 104 5.4 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 104 5.5 Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen 107 5.6 Schlussfolgerung 109
6 Zusammenfassung 112 7 Summary 114
8 Literaturverzeichnis 116 9 Anhang 126
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis A Anzucht
Abb. Abbildung
α-hämolys. alpha-hämolysierend
anhämolys. anhämolysierend
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
CB Cytobrush
CMC Carboxymethylcellulose
DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
etc. et cetera
ED-Zellen equine Dermis Zellen
EDM Eagle´s minimum essential medium, Dulbecco´s
modification
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EHV Equines Herpes Virus
et al. et alii
FHV Felines Herpesvirus
FITC Fluoresceinisothiocyanat
G (Gravitationskraft)
ggr. geringgradig
gramneg. gramnegativ
grampos. grampositiv
°C Grad Celsius
hgr. hochgradig
HSV Hepes simplex Virus
IDU Idoxuridin
IE internationale Einheiten
IFT Immunfluoreszenstest
J Jahre
Kerat. Keratitis
Abkürzungsverzeichnis
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
koag.- koagulasenegativ
mac. maculosa
mg Milligramm
mgr. mittelgradig
min Minute(n)
ml Milliliter
mm Millimeter
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mikromol
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid
NCS newborn calf serum (Serum neugeborener Kälber)
nm Nanometer
nPCR nested Polymerase chain reaction (Polymerase
Kettenreaktion)
Nr. Nummer
NT Nasentupfer
n.u. nicht untersucht
obB ohne besonderen Befund
oberfl. oberflächlich
OD Oculus dextra
OS Oculus sinistra
p p-Wert (Signifikanz)
PBS phosphat buffered saline (Phosphatpuffer)
PBL periphere Blutleukozyten
PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)
PFU plaque forming units (Plaquebildende Einheit)
pos. positiv
prof. profunda
Abkürzungsverzeichnis
punct. punctata
punktf. punktförmig
® eingetragenes Warenzeichen
s. siehe
spf. superficialis
SPF spezifisch pathogenfrei
spp. species
subsp. subspecies
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
TBS Tracheobronchialsekret
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
U Unit
u. und
UpM Umdrehungen pro Minute
US Untersuchung
UV ultraviollett
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Tabellenverzeichnis
Verzeichnis der Tabellen
Nr. Titel Seite
Tab. 1: Patienten mit Keratitis oder Keratokonjunktivitis (Gruppe 1) 41
Tab. 2: Kontrolltiere ohne Augenerkrankung (Gruppe 2) 42
Tab. 3: Gruppe 1 – Klinische Diagnosen bei der Erst- und Zweituntersuchung 57
im Abstand von vier Wochen
Tab. 4: Gruppe 1 – Befunde und Diagnosen bei der ophtalmologischen 60
Erstuntersuchung
Tab. 5: Gruppe 1 - Ergebnisse der ophtalmologischen Zweituntersuchung 61
(vier Wochen nach der Erstuntersuchung), [n = 25]
Tab. 6: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei 64
der Erstuntersuchung
Tab. 7: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei 66
der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)
Tab. 8: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Nachweishäufigkeit 68
von EHV-2 Genom in Cytobrush und Wattetupfer am einzelnen Auge
in Prozent
Tab. 9: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Positiver Nachweis 69
von EHV-2 Genom im Wattetupfer bei gleichzeitigem positiven
Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge
Tab. 10: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei 71
erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush
bei der Erstuntersuchung [ n = 28]
Tab. 11: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei 72
erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush
bei der Zweituntersuchung [n = 25]
Tab. 12: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom in den verschiedenen 73
Proben bei Erst- und Zweituntersuchung
Tabellenverzeichnis
Tab. 13: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden 76
und erkrankten Augen bei der Erstuntersuchung, n [Augen] = 112
Tab. 14: Gruppe 1 und 2, Erstuntersuchung – Nachweise der Keimgruppen 77
bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent
Tab. 15: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden 80
und erkrankten Augen bei der Zweituntersuchung, n [Augen] = 100
Tab. 16: Gruppe 1 und 2, Zweituntersuchung – Nachweise der Keimgruppen 82
bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent
Tab. 17: Gruppe 1 und 2 – Nachweise verschiedener Entzündungszellen 85
bei gesunden und erkrankten Augen (n = 112)
Tab. 18: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen 87
aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus
Gruppe 1
Tab. 19: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen 88
aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus
Gruppe 2
Tab. 20: Gruppe 1 und 2 - Virologische Ergebnisse bei Augen mit dem 89
Vorkommen von Entzündungszellen, unabhängig von einer
klinischen Erkrankung
Tab. 21: Gruppe 1 – Zytologische Befunde bei erkrankten Augen mit und 90
ohne Begleitsymtom Konjunktivitis in Zusammenhang mit dem
Nachweis von EHV-2 Genom
Tab. A1: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der 126
Erstuntersuchung
Tab. A2: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der 128
Zweituntersuchung
Tab. A3: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der 130
Erstuntersuchung
Tab. A4: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der 131
Zweituntersuchung
Tabellenverzeichnis
Tab. A5: Nachweis von EHV-2 in Gruppe 2 bei der Erst- und 132
Zweituntersuchung
Tab. A6: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 133
bei der Erstuntersuchung
Tab. A7: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 135
bei der Zweituntersuchung
Tab. A8: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 137
bei der Erstuntersuchung
Tab. A9: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen 139
bei der Zweituntersuchung
Abbildungsverzeichnis
Verzeichnis der Abbildungen
Nr. Titel Seite Abb. 1 : Querschnitt durch die Kornea 18
Abb. 2: Keratitis superficialis 46
Abb. 3: Keratitis punctata seu maculosa 46
Abb. 4: Hornhautabrasion 46
Abb. 5: Keratitis punctata seu maculosa 46
Abb. 6: Keratitis profunda 46
Abb. 7: Keratitis vasculosa 46
Abb. 8: Befundbogen zur Dokumentation der ophtalmologischen 47
Untersuchungsbefunde
Abb. 9: Instrumentarium zur Probengewinnung 49
Abb. 10: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels 65
PCR bei der Erstuntersuchung
Abb. 11: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels 67
PCR bei der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der
Erstuntersuchung)
Abb. 12: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Vergleich von 70
Cytobrush und Wattetupfer beim positiven EHV-2 Nachweis
am einzelnen Auge
Abb. 13: Gesunde Augen (n = 84) – Prozentualer Anteil der nach- 78
gewiesenen Keimgruppen bei der Erstuntersuchung
Abb. 14: Erkrankte Augen (n = 28) - Prozentualer Anteil der nach- 79
gewiesenen Keimgruppen bei der Erstuntersuchung
Abb. 15: Gesunde Augen (n = 75) – Prozentualer Anteil der nach- 83
gewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung
Abb. 16: Erkrankte Augen (n = 25) - Prozentualer Anteil der nach- 84
gewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung
Abb. 17: Epithelzellverband 93
Abb. 18: Lymphozyt, umgeben von Epithelzellen 93
Abbildungsverzeichnis
Abb. 19: Einzelne Epithelzellen mit zwei neutrophilen Granulozyten (NG) 95
und einem Lymphozyten (LZ)
Abb. 20: Lymphozyt (LZ) neben Epithelzellverband 95
Abb. 21: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen 97
Abb. 22: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen liegend 97
Einleitung
1 Einleitung
Als Ursache für spontan auftretende Keratitiden oder Keratokonjunktivitiden wird
beim Pferd häufig eine Virusätiologie vermutet, oft begründet durch den erfolgreichen
therapeutischen Einsatz von lokalen Virostatika. Hierbei wird in den meisten Fällen
eine Virusinfektion dem klinischen Bild einer Keratitis superficialis in den Formen
einer Keratitis punctata, Keratitis maculosa oder Keratitis ulcerosa zugeordnet
(THEIN und BÖHM 1976, THEIN 1978, SCHMIDT 1988, KELLNER 1990, MILLER et
al. 1990, COLLINS et al. 1994, BARNETT et al. 1998, STADES et al. 1998).
Als mögliches krankheitsverursachendes Virus wird von THEIN (1976) in einem
ersten Fallbericht das equine Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) isoliert. Auch andere
Autoren wiesen in späteren Untersuchungen EHV-2 nach ( THEIN und BÖHM 1976,
MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1994, VON OPPEN 2000).
Der Nachweis des EHV-2 ist durch unterschiedliche Methoden möglich. Die
serologische Untersuchung auf EHV-2-Antikörper im Blut ist eine indirekte
Nachweismethode (THEIN 1976, BORCHERS et al. 1997, BORCHERS et al. 1999).
Eine Virusisolierung durch Anzüchtung in Zellkulturen weist nach einer längeren
Inkubation in den meisten Fällen einen zytopathischen Effekt mit Bildung
intranukleärer Einschlusskörperchen des Typs Cowdry A auf (THEIN 1976, THEIN
1978, MILLER et al. 1990, ROLLE und MAYR 1993, COLLINSON et al. 1994,
BROWNING und AGIUS 1996). Mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (nested
PCR) konnte EHV-2-Genom in Material aus Augen- und Nasentupfern nachgewiesen
werden (BORCHERS et al. 1997, RIZVI et al. 1997, BORCHERS et al. 1998,
WOLFINGER 1998), wobei diese Methode einen 1000fach sensitiveren Nachweis im
Vergleich zu der Isolierung in Zellkulturen erlaubt. Eine zytologische Untersuchung
von Konjunktivalausstrichen konnte bisher keinen Zusammenhang zwischen dem
Nachweis von intranukleären Einschlusskörperchen und dem virologischen
Nachweis von EHV-2 erkennen lassen (KRÜDEWAGEN et al. 2001, KELLNER
1990).
15
Einleitung
Bislang ist es nicht gelungen, einen Zusammenhang zwischen dem bisher als
„Viruskeratitis“ beschriebenen klinischen Bild und der Isolierung des EHV-2
nachzuweisen (VON OPPEN 2000). VON OPPEN (2000) und KERSHAW (2001)
konnten jedoch in Augentupfern von Pferden, die an einer Keratitis oder
Keratokonjunktivitis erkrankt waren, einen signifikant häufigeren Nachweis von EHV-
2 Genom mittels PCR führen als bei augengesunden Tieren einer Kontrollgruppe. Im
Gegensatz dazu konnte in einer jüngeren Studie (BESTHORN 2002) kein
signifikanter Unterschied beim Nachweis von EHV-2 Genom zwischen
augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden festgestellt werden. Somit
ist eine Beteiligung des EHV-2 an den häufig beschriebenen „Viruskeratitiden“ nach
wie vor unklar.
Ziel dieser Arbeit ist es, erweiterte Untersuchungsmethoden den herkömmlichen
Verfahren der Probenentnahme gegenüberzustellen. Dabei soll untersucht werden,
ob durch die Verwendung von Cytobrush-Tupfern ein zuverlässigerer Nachweis des
EHV-2 gelingt und ob dieser Nachweis mit einem klinischen Bild und einem
zytologischem Ausstrich des gewonnenen Probenmaterials in Zusammenhang zu
bringen ist. Diese Methode könnte dann als einfaches und schnelles
Nachweisverfahren etabliert werden.
Häufig werden bei Keratitiden oder Konjunktivitiden des Pferdes mikrobiologische
Untersuchungen von Augentupfern durchgeführt. Die Ergebnisse dieser
Untersuchungen sind meist sehr unspezifisch und häufig durch saisonalen Einfluss,
geographische Lage und lokale Umgebung beeinflusst und wenig aussagekräftig
(WHITLEY et al. 1983, BARNETT et al. 1998).
In dieser Arbeit soll durch mikrobiologische Untersuchungen von Konjunktivatupfern
ein Vergleich der nachgewiesenen Keime in gesunden und an einer Keratitis oder
Keratokonjunktivitis erkrankten Augen erfolgen, um möglicherweise eine bessere
Beurteilung über eine eventuelle klinische Relevanz von isolierten Keimen zu
ermöglichen.
16
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht 2.1 Anatomie und Funktion von Konjunktiva und Kornea
Die Tunica conjunctiva oder Bindehaut wird in bulbäre, palpebrale und die Membrana
nicitans überziehende Anteile unterteilt. Sie erfüllt als Schleimhaut im wesentlichen
eine Schutzfunktion. Intraepitheliale Becherzellen liefern den mukösen Sekretanteil
des praeokularen Tränenfilms, ergänzt wird dieser durch Produktion von Flüssigkeit
in den Tränendrüsen des Tränenapparates. Dadurch wird die Bulbusfläche feucht
gehalten und eine Selbstreinigungsfunktion erfüllt .
Am Limbus corneae geht das mehrschichtige Zylinderepithel der Konjunktiva in das
Hornhautepithel und am Lidrand in das Epithel der Haut über (NICKEL et al. 1990,
MARTIN 1994, BARNETT et al. 1998).
Die gefäßlose Kornea oder Hornhaut ist durchsichtig und queroval. Sie geht am
Sulcus sclerae in die undurchsichtige Sklera über. Gemeinsam bilden sie die Tunica
fibrosa bulbi oder äußere Augenhaut, wobei die gefäßarme Sklera etwa 4/5 des
Bulbus bildet (NICKEL et al. 1990).
Unter dem praeokularen Tränenfilm wird die äußerste Schicht der Kornea durch ein
mehrschichtiges, nicht verhornendes Plattenepithel gebildet. Dieses liegt einer
Basalmembran auf und ist mit sensiblen Nervenendigungen durchsetzt.
Als stärkste Schicht der Kornea folgt das Stroma. Die in einer regelmäßigen
Gitterstruktur angeordneten Typ-I-Kollagenfasern machen neben dem hohen
Wassergehalt die Transparenz der Hornhaut aus. Dieser Aufbau erklärt Trübungen
der Kornea bei Veränderungen der Gitterstruktur.
Dem Stroma schließt sich nach innen die Descemetsche Membran an. Sie besteht
aus einer engen Anordnung von Typ-I-Kollagenfibrillen, welche eine hohe Elastizität
aufweisen.
Als letzte und innerste Schicht folgt das durch ein einschichtiges Plattenepithel
gebildetes Endothel (MARTIN 1994, BARNETT 1998).
17
Literaturübersicht
Die Kornea besteht zu 70% aus Wasser, 21% aus Proteinen, 7% aus
Polysacchariden und jeweils 1% aus Lipiden bzw. Metaboliten. Die Ernährung der
gefäßlosen Hornhaut erfolgt durch Diffusion und aktiven Stoff- und Ionenaustausch
aus perilimbalen Gefäßen, dem praeokularen Tränenfilm und zum größten Teil aus
dem Kammerwasser (HOLLWICH 1988).
2
3
4
5
1
6
Abb.1: Querschnitt durch die Kornea (nach STADES):
1 Tränenfilm; 2 Epithel; 3 sensibler Nervenast; 4 Stroma; 5 Descemetsche
Membran; 6 Endothel
18
Literaturübersicht
2.2 Entzündliche Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea beim Pferd Eine Entzündung von Konjunktiva oder Kornea, bzw. beider Strukturen, kann sowohl
infektiöse als auch nicht infektiöse Grundlagen haben.
Da Kornea und Konjunktiva äußeren Einflüssen wie Staub, Wind und
Mikroorganismen ausgesetzt sind, bereitet häufig ein äußerer Reiz den Weg für ein
infektiöses Agens (STADES et al. 1998).
Obwohl bei einer Erkrankung oftmals beide Strukturen beteiligt sind, gibt es in der
Literatur nur wenige Berichte über eine „gemeinsame“ Erkrankung von Konjunktiva
und Kornea. So wird bei THEIN und BÖHM (1976) eine „virusbedingte
Keratokonjunktivitis“ beim Pferd beschrieben. Verschiedene Autoren berichten über
eine „eosinophile Keratokonjunktivitis“ (RAMSEY et al. 1994, BRANDT et al. 1995,
YAMAGATA et al. 1996, SLATTER 2001). Die beim Kleintier relativ häufig
vorkommende Keratokonjunktivitis sicca, bei der ein Defizit des wässrigen Anteils
des präokularen Tränenfilms besteht, ist beim Pferd eine seltene Erkrankung
(REILLY u. BEECH 1994, BARNETT et al. 1998).
Nachfolgend werden Erkrankungen beider Strukturen getrennt beschrieben.
2.2.1 Konjunktivitis beim Pferd
Die klinische Symptomatik bei einer Konjunktivitis umfasst eine Hyperämie der
Konjunktiva sowie Augenausfluss unterschiedlicher Qualität. Man unterscheidet
zwischen einer primären Konjunktivitis, die durch infektiöse Agenzien, Traumata oder
andere Stimuli ausgelöst wird, und einer sekundären Konjunktivitis, die bei
Erkrankungen anderer Augenstrukturen, wie z. B. der Kornea auftritt (BARNETT et
al. 1998).
Ferner kann eine Konjunktivitis auch ein Initial- und Begleitsymptom bei
systemischen Infektionskrankheiten sein (SCHMIDT 1987, LAVACH 1992). Im
Rahmen eines Infektionsversuches mit EHV-2 bei Ponies traten Konjunktivitiden auf
(BORCHERS et al. 1998), ebenso werden sie im Zusammenhang mit Infektionen
durch EHV-1 und EHV-4 beschrieben (THEIN 1993).
19
Literaturübersicht
Das Milieu des Konjunktivalsackes ist physiologischerweise nicht steril. So wurden in
einer Studie an augengesunden Pferden in bakteriellen Kulturen aus Augentupfern
vor allem Corynebakterien spp., Staphylokokken spp., Streptokokken spp. und
Bacillus spp. nachgewiesen (WHITLEY et al. 1983). Außerdem konnten in einer
Untersuchung von Konjunktivatupfern augengesunder Pferde bei 95% der Tiere
Pilze, davon allein bei 56% Aspergillus spp. isoliert werden. Penicilliumarten wurden
ubiquitär gefunden (SAMUELSON et al. 1984).
Bei BARNETT et al. (1998) werden als häufig in gesunden Augen isolierte Keime
ebenfalls Corynebakterien spp., Staphylokokken spp., Streptokokken spp. und
Bacillus spp., Moraxella spp., Neisseria spp. und Enterobacteriaceae erwähnt. Von
erkrankten Augen können nach BARNETT et al. (1998) häufig Pseudomonaden,
Staphylokokken, Streptokokken, Aktinobazillen, Moraxellen, Klebsiellen,
Enterobacteriaceae und Bacillus spp. isoliert werden, diese benötigen jedoch
begünstigende Faktoren, um pathogen zu wirken. Eine in den USA erstmals
berichtete primäre Konjunktivitis durch Moraxella equi scheint in Deutschland bisher
keine klinische Bedeutung zu haben. BARNETT et al. (1998) schreiben, dass
gramnegative Keime häufiger von kranken als gesunden Augen isoliert werden
können.
2.2.2 Keratitis beim Pferd
Die Einteilung der verschiedenen Keratitiden beim Pferd erfolgt in der Literatur nicht
einheitlich. Die Klassifizierung kann nach verschiedenen Gesichtspunkten erfolgen
wie beispielsweise nach der Ätiologie, der Lokalisation oder ihrem Charakter. Die
einzelnen Strukturen der Hornhaut können verschieden auf denselben Reiz
reagieren, dasselbe klinische Bild kann durch verschiedene Formen der Entzündung
verursacht werden (SLATTER 2001). Ferner muss bedacht werden, dass sich
Keratitiden komplizieren können und somit die Entwicklung zu einer anderen
klinischen Form oft fließend sind.
20
Literaturübersicht
Die Einteilung der Keratitiden des Pferdes erfolgt durch BARNETT et al. (1998) in
drei Gruppen nach ihrer anatomischen Lokalisation unter Angabe einer möglichen
Ätiologie.
Bei einer oberflächlichen Erkrankung sind lediglich Hornhautepithel und vorderes
Stroma betroffen. Als Ursache für diese Keratitis superficialis werden natürliche
Exposition, Traumata und Viren genannt.
Wenn neben Epithel und Stroma auch die in der Tiefe folgende Descemetsche
Membran betroffen ist, sprechen die Autoren von einer Keratitis profunda. Neben
Traumata werden hierbei Infektionen mit Bakterien, Pilzen und Parasiten
verantwortlich gemacht.
Bei einer Keratitis interstitialis sind primär nur Stroma und Descemetsche Membran
betroffen, nicht aber das Epithel. Sie wird meist ohne offensichtliche Ätiologie
beobachtet (BARNETT et al. 1998).
Auch bei anderen Autoren findet sich eine entsprechende Einteilung der
Keratitislokalisationen (SCHMIDT 1987, STADES et al. 1998). Hier erfolgt aber keine
Festlegung hinsichtlich der Ätiologie.
So gehen STADES et al. (1998) davon aus, dass eine Keratitis superficialis durch
Mikroorganismen aller Art – Viren, Bakterien, Pilze, etc. – verursacht werden kann.
SPIESS (1994) unterscheidet die entzündlichen Korneaveränderungen in ulzerative
und nichtulzerative Keratitiden.
Im Folgenden werden die Einteilungen der Keratitiden und ihre klinischen Befunde
näher erläutert. Dabei erscheint es nach obigen Ausführungen sinnvoll, sich an der
Einteilung von BARNETT et al. (1998) zu orientieren unter der Berücksichtigung
weiterer Autoren.
21
Literaturübersicht
2.3 Keratitis superficialis
Eine oberflächliche Hornhautentzündung mit Gefäßeinsprossungen und möglichen
Komplikationen, wie z. B. der Ausbildung flacher Ulzera oder Epithelabschilferungen,
wird auch als Expositionskeratitis bezeichnet. Sie ist Folge von anormaler
Tränenproduktion oder –verteilung und kann im Rahmen einer Keratokonjunktivitis
sicca, aber auch durch einen Exophtalmus, Neoplasien und Traumata sowie eine
chronische Konjunktivitis entstehen.
Bei einer Hornhautabrasion, entstanden durch ein Trauma, Entropium, ektopische
Zilien oder Fremdkörper, ist das Auge in allen Fällen akut schmerzhaft. Es zeigt eine
Abwehrtrias, bestehend aus Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie. Die
Kornea zeigt ein oberflächliches Ulkus mit einem Ödem und, je nach Dauer der
Erkrankung, eine oberflächliche Gefäßeinsprossung sowie eine konjunktivale
Hyperämie.
Ein chronisches oberflächliches Ulkus entsteht dann, wenn durch das Ersatzepithel
keine normale Basalmembran gebildet werden kann. Dies tritt häufig bei älteren
Tieren auf. Die klinischen Reizerscheinungen sind meist nur gering, das flache Ulkus
ist von einem schmalen Stromaödem umgeben und zeigt keine Gefäßeinssprossung
(BARNETT et al. 1998).
Desweiteren führen BARNETT et al. (1998) noch drei Keratitisformen unbekannter
Ätiologie auf. Die Pigmentkeratitis zeichnet sich durch eine oberflächliche
Gefäßeinsprossung und vom Limbus ausgehende Pigmentierung aus. Sie geht mit
einer Hyperämie der Konjuktiva und einer Abwehrtrias einher.
Ebenfalls durch eine oberflächliche Gefäßeinsprossung charakterisiert ist die
idiopathische Keratitis vasculosa, die jedoch ohne Pigmentierung und mit einem
perivaskulären Ödem einhergeht.
Als chronische Keratitis superficialis wird eine wiederkehrende Keratitis mit mäßiger
Reizung bezeichnet, bei der in der akuten Phase ein epitheliales und subepitheliales
Ödem mit einzelnen oberflächlichen Gefäßen auftritt.
22
Literaturübersicht
2.3.1 Viruskeratitis Ebenfalls in den Bereich der Keratitis superficialis werden die vermutlich
virusbedingten Keratopathien eingeordnet. Eine Virusätiologie wird in Deutschland
bei Hornhauterkrankungen des Pferdes häufig vermutet. Diese wird zum Teil wegen
der schnellen klinischen Besserung auf lokal applizierte Virostatika zurückgeführt
(BARNETT et al. 1998). Außerdem sind bei anderen Spezies Herpesinfektionen, die
zu lokalen Entzündungen des Auges führen, bekannt.
So werden in der Humanmedizin bei der Herpes corneae simplex, ausgelöst durch
das Herpes-simplex-Virus, drei klinische Erscheinungsformen unterschieden. Es
werden die herpetische Keratitis punctata oder stellata superficialis, die Keratitis
dendritica und die Keratitis disciformis beschrieben (STRAUB und KÖHLER 1992).
Bei der Katze wird das feline Herpesvirus (FHV-1) als Auslöser einer Keratitis mit
Beteiligung von Epithel und Stroma beschrieben und bei Katzen im Rahmen einer
experimentellen Herpesinfektion am Auge nachgewiesen (NASISSE et al. 1989).
Beim Pferd gelang bei Tieren mit einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis der
Nachweis des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) signifikant häufiger als bei
augengesunden Pferden. Es konnte bisher jedoch kein Zusammenhang zu den in
der Literatur als vermeintlich pathognomonisch beschriebenen klinischen Bildern der
Viruskeratitis nachgewiesen werden (VON OPPEN et al. 2001, KERSHAW et al.
2001). Auch andere Autoren wiesen bei Keratitiden EHV-2 nach (THEIN und BÖHM
1976, MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1994). In einer Studie von BESTHORN
(2002) konnte kein signifikanter Unterschied im Nachweis von EHV-2 Genom bei
augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden festgestellt werden.
23
Literaturübersicht
KELLNER (1990) unterscheidet beim Pferd zwei klinische Formen einer
Viruskeratitis. Zum einen beschreibt er eine diffuse Trübung der vorderen
Stromaschichten mit intaktem Hornhautepithel, die mit einer leichten Rötung der
Konjunktiva einhergeht, wobei das betroffene Auge wenig schmerzhaft ist. Die
andere, häufiger beobachtete Form zeigt sich mit einer deutlichen Beteiligung der
Bindehaut und oberflächlichen anfärbbaren Epitheldefekten in der Hornhaut, wobei
eine ausgeprägte Schmerzsymptomatik besteht.
Bei BARNETT et al. (1998) werden vier klinische Bilder der Viruskeratitis
unterschieden:
- Keratitis punctata
- ulzerative Viruskeratitis
- Keratitis maculosa
- weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien.
2.3.1.1 Keratitis punctata Die Keratitis punctata tritt als häufigste Form der Erkrankung akut und meist einseitig
auf. Das betroffene Auge ist in der Regel hochgradig schmerzhaft. Die Konjunktiva
ist ödematisiert und hyperämisch. Hornhautläsionen erscheinen als unregelmäßige
fluoreszeinpositive oberflächliche Trübungen mit einem Ödem des darunterliegenden
Stromas. Die epithelialen Veränderungen stellen sich als schwache, streifige bis
linienförmige und zum Teil verzweigte, aber auch typische nadelstichartige,
oberflächliche Läsionen dar. Meist werden die Veränderungen durch eine Miosis als
Ausdruck der Schmerzhaftigkeit begleitet, eine Gefäßeinsprossung in die Hornhaut
tritt nicht auf (BARNETT et al. 1998).
24
Literaturübersicht
Auch bei anderen Autoren finden sich ähnliche Beschreibungen einer Keratitis
punctata oder Keratitis punctata superficialis im Zusammenhang mit einer
vermuteten Herpesvirusätiologie. So beschreibt SCHMIDT (1988) eine nicht
ulzerierende Keratitis mit multiplen, punktförmigen, epithelialen und subepithelialen
Trübungen bei intaktem Hornhautepithel, die sich bei zunehmender
Schmerzhaftigkeit als Erosionen darstellen. Dabei weist er auf EHV-2 als möglichen
Verursacher hin.
Andere Autoren haben in Einzelfällen EHV-2 nachgewiesen und diskutieren dessen
ätiologische Bedeutung. So beschreiben THEIN und BÖHM (1976) eine einseitige
Keratitis, wobei die Pferde eine unregelmäßig umschriebene, nicht homogene
rauchige Hornhauttrübung mit multiplen, höckrigen Vorwölbungen und eine
Abwehrtrias als Ausdruck der Schmerzhaftigkeit aufweisen. Die epithelialen
Vorwölbungen werden dabei als punktförmige, milchig-weiße Herde beschrieben, die
je nach Lage und Häufigkeit linienförmige Strukturen bilden. Bei einem Teil der
Pferde war die Hornhaut punktförmig fluoreszeinpositiv, auch konnte bei einigen
Tieren schon früh eine oberflächliche Gefäßeinsprossung ausgemacht werden. Bei
einem Fohlen konnte aus Hornhautmaterial EHV-2 isoliert werden.
MILLER et al. (1990) berichten von einer schmerzhaften Hornhauttrübung mit
Korneaödem und oberflächlicher Gefäßeinsprossung bei einer Vollblutstute. Hierbei
konnte EHV-2 aus Augentupfer und Hornhautgeschabsel nachgewiesen werden.
COLLINSON et al. (1994) beschreiben eine Keratokonjunktivitis bei Fohlen, wobei
sich die punktförmigen Trübungen der Hornhaut nicht anfärben lassen.
LAVACH (1990) berichtet von multiplen, punktförmigen, weißlichen, schmerzhaften
Kornealäsionen und führt als mögliches verusachendes Virus EHV-1 an.
Auch DAVIDSON (1991) charakterisiert das klinische Bild mit einer streifigen
weißlichen Trübung mit multifokalen punktförmigen Läsionen und geht von einer
Infektion mit EHV-1 als möglichen Urheber aus.
25
Literaturübersicht
Beim Menschen wird von STRAUB und KÖHLER (1992) die Form der herpetischen
Keratitis punctata oder stellata beschrieben, bei der die Hornhaut mit grauen
Trübungen verschiedener Größe auffällt, die teilweise sternförmig angeordnet sind.
Treten auf der Hornhaut multiple kleine Effloreszenzen auf, die zu verzweigten Linien
ästchenförmig zusammenziehen, so sprechen die Autoren von einer Keratitis
dendritica. Diese Gebilde sind aufgrund des losen Epithels mit Fluoreszein
anfärbbar.
Bei der Katze findet sich eine ähnliche Beschreibung für das klinische Bild einer
Herpeskeratitis. So schildert NASISSE (1991) im akuten Verlauf verzweigte
dendritische Trübungen der Kornea zusammen mit einer Konjunktivitis und einer
Abwehrtrias. Mit zunehmender Dauer der Erkrankung entwickelt sich ein
Hornhautödem sowie eine oberflächliche Gefäßeinsprossung.
2.3.1.2 Ulzerative Viruskeratitis
Die ulzerative Viruskeratitis tritt seltener auf als die Keratitis punctata. Wie bei der
ersten Form zeigen die Tiere eine hochgradige Schmerzhaftigkeit des betroffenen
Auges. Auf der Hornhaut findet sich ein flaches, gut abgegrenztes und anfärbbares
Ulkus, welches von einem Stromaödem umgeben ist. In diesem Bereich können
mehrere kleine Epitheldefekte vorliegen. Eine Gefäßeinsprossung tritt in der Regel
auch bei dieser Form nicht auf (BARNETT 1998).
Beim Menschen berichten STRAUB und KÖHLER (1992), dass aus einer rein
epithelialen Keratitis dendritica besonders bei Rezidiven durch Beteiligung der
oberflächlichen Parenchymschichten und durch Zusammenschluß der linienförmigen
Defekte ein sogenanntes dendritisches Ulkus entsteht.
Auch bei der Katze wird von NASISSE (1992) eine oberflächliche Ulzeration mit
Beteiligung oberflächlicher Hornhautschichten beschrieben.
26
Literaturübersicht
2.3.1.3 Keratitis maculosa Diese Form stellt eine Folge der rezidivierenden Keratitis punctata und der
ulzerativen Viruskeratitis dar. Sie tritt meist einige Wochen nach Abheilung der
aufgetretenen Veränderungen auf. Dabei zeigt das Auge bei deutlich geringerer
Schmerzhaftigkeit eine dichte, fokale, oberflächliche Hornhauttrübung mit einer
oberflächlichen Gefäßeinsprossung (BARNETT et al. 1998).
2.3.1.4 Weitere vermutlich virusbedingte Keratopathien
Bei BARNETT et al. (1998) werden weitere krankhafte Veränderungen der Hornhaut
beschrieben, die mit einer möglichen Virusätiologie in Zusammenhang gebracht
werden. Dazu zählen eine nicht anfärbbare epitheliale Bläschenbildung, herdförmige
Stromaödeme mit darüberliegenden fluoreszeinpositiven Epitheldefekten, sowie
sonnenstrahlartig („sunburst“) angeordnete Epitheldefekte mit deutlichem
subepithelialen Ödem.
2.4 Keratitis profunda
Bei einer tiefen Keratitis sind neben dem Hornhautepithel auch Stroma und
Descemetsche Membran betroffen. Sie kann durch infektiöse Ursachen
hervorgerufen werden oder aber auch durch Verletzungen, wie zum Beispiel durch
perforierende Fremdkörper entstehen. Dabei kann sich ein Hornhautulkus
entwickeln, welches durch eine mikrobielle Infektion der Kornea verursacht werden
kann und im Prinzip eine Sonderform der Keratitis profunda darstellt. Klinisch zeigen
die Pferde auf dem betroffenen Auge eine ausgeprägte Schmerzhaftigkeit. Das Ulkus
weist einen fluoreszeinpositiven Stromadefekt unterschiedlicher Tiefe auf. Im
fortgeschrittenem Stadium kann es zur Descemetozele und sogar zu einer
Hornhautperforation kommen. Die Hornhaut weist eine Trübung von
27
Literaturübersicht
unterschiedlichem Ausmaß und Färbung sowie meist eine oberflächliche und tiefe
Gefäßeinsprossung auf (BARNETT et al. 1998).
Bei der bakteriellen Keratitis lassen sich meist gramnegative Keime wie
Enterobacteriaceae, aber auch Pseudomonaden und Proteus spp. isolieren
(BARNETT et al. 1998).
Bei einer mykotischen Keratitis werden vermehrt Aspergillus spp., Penicillium spp.
und Fusarien spp. nachgewiesen (BARNETT et al. 1998, DAVIDSON 1991). Der
beim Menschen häufig vorkommende Candida albicans wird beim Pferd nur selten
als Erreger einer mykotischen Keratitis gefunden (DAVIDSON 1991).
Die in Deutschland nur selten anzutreffende parasitäre Keratitis wird durch
Mikrofilarien von Onchocerca spp., Setaria spp. und Artionema spp. hervorgerufen
(BARNETT et al. 1998).
Pferde, die an einer tiefen Keratitis mit ungeklärter Ätiologie erkrankt sind, zeigen oft
eine weniger ausgeprägte Schmerzsymptomatik. Der Hornhautdefekt präsentiert sich
als schlecht heilendes Ulkus oder als peripheres Ulkus. Es besteht dabei ein
Stromadefekt mit Gefäßeinsprossung. Die kulturellen Untersuchungen von
Hornhautgeschabseln oder –tupfern verlaufen meist ohne besonderen Befund
(BARNETT et al. 1998).
Die chronisch rezidivierende tiefe Keratitis kann über mehrere Jahre hinweg in
unregelmäßigen zeitlichen Abständen auftreten, wobei ursprünglich ein Trauma
vorgelegen haben kann. Auch ein autoimmunes Geschehen wird diskutiert. Die
hauptsächlichen Veränderungen liegen mit hoher Wahrscheinlichkeit am Endothel
mit Ausprägung eines Stromaödems und einer Vaskularisation in akuten Stadien. Es
kann zur Bläschenbildung im Stroma kommen, die sich eventuell flüssigkeitsgefüllt
mit typischer grüner Farbe bis hin zu Kalziumablagerungen präsentieren (BARNETT
et al. 1998).
28
Literaturübersicht
2.5 Keratitis interstitialis Die interstitielle Keratitis ist gekennzeichnet durch eine dauerhafte, diffuse, nicht
ulzerierende, tiefe Stromatrübung. Ihre Ätiologie ist unklar. Das betroffene Auge ist
dabei schmerzfrei und eventuell ist eine tiefe Gefäßeinsprossung auf Niveau des
hinteren Stromas oder sogar der Descemetschen Membran zu sehen (BARNETT et
al 1998).
Beim Menschen wird eine Keratitis disciformis als Form der herpetischen
Hornhautinfektion beschrieben. Sie kann isoliert im Stroma auftreten oder mit den
oberflächlichen Formen gemeinsam vorkommen. Dabei zeigt das Stroma eine
typische scheibenförmige Trübung mit Bildung von konzentrischen Trübungsringen
und einem Ödem der Hornhaut (STRAUB u. KÖHLER 1992).
2.6 Diagnostische Verfahren bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea
Zur Diagnostik bei Erkrankungen von Konjunktiva und Kornea können verschiedene
Methoden zum Einsatz kommen. Zum einen kann versucht werden, durch
virologische und mikrobiologische Untersuchungen von Probenmaterial des
betroffenen Auges einen möglichen Erregernachweis zu führen. Weiterhin können
zur Diagnosefindung zytologische Untersuchungen von Zellmaterialien aus den
betroffenen Strukturen durchgeführt werden.
Im Folgenden werden die verschiedenen möglichen Methoden erläutert.
29
Literaturübersicht
2.6.1 Exfoliative Zytologie Bei der exfoliativen Zytologie wird Zellmaterial mikroskopisch untersucht, welches
durch verschiedene, im folgenden beschriebene, Methoden von dem zu
untersuchenden Gewebe gewonnen werden kann.
Zur genaueren Diagnose bei Konjunktivitiden und Keratitiden wird gewöhnlich vom
erkrankten Auge aus dem Bereich der Konjunktiva, der Kornea oder des Lidrandes
Probenmaterial gewonnen. Dieses dient zum einem der Erregerdifferenzierung, zum
anderen aber auch zur Gewinnung von Zellmaterial. Dieses wird nach Fixation und
Färbung auf einem Objektträger mikroskopisch untersucht. Beurteilt werden dabei
Zellart und –typ (z.B. oberflächliche, tiefe und jugendliche Epithelzellen, Menge und
Art von Entzündungszellen, etc.) sowie eventuelle Hinweise auf Erreger wie
beispielsweise Pilzhyphen, Einschlusskörperchen bei Virusinfektionen oder
intrazelluläre Erreger wie Chlamydien. Die Färbung des gewonnenen
luftgetrockneten Materials erfolgt mit Giemsa, Lactophenolblau, neuer
Methylenblaulösung oder einer May-Grünwald/Giemsa Kombination (BAUER 1999).
Diese Art der Diagnostik stellt ein schnelles und wenig aufwendiges Verfahren dar
und wird beim Menschen besonders zur Quantifizierung von Becherzellen und zur
morphologischen Beurteilung der Epithelzellen bei Keratokonjunktivits sicca und
okularem Pemphigoid genutzt (ADAMS et al. 1988, DE ROJAS et al. 1993, MASKIN
et al 1989, NELSON 1988). Außerdem ist die exfoliative Zytologie hilfreich zur
Diagnostik von Speicherkrankheiten, wie beispielsweise der Mucopolysaccharidose,
bei infektiösen Erkrankungen wie Chlamydienkonjunktivitis oder Herpes zoster
Keratitiden und bei allergischen Geschehen, wie beispielsweise der
Frühlingskonjunktivitis (MASKIN et al. 1989, WILHELMS et al. 1986).
Auch beim Kleintier wird die exfoliative Zytologie bereits eingesetzt. So gibt es
Studien über Quantifizierung und Verteilung von Becherzellen bei augengesunden
Hunden im Vergleich zu Hunden mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996).
30
Literaturübersicht
WILLIS et al. (1997) untersuchten bei Hunden und Katzen zytologische Präparate
der Konjunktiva bei Tieren mit entzündlichen Veränderungen vergleichend mit
gesunden Kontrolltieren. Gleichzeitig wurden in dieser Studie verschiedene
Techniken der Probenentnahme verglichen. Bei beiden Tierarten ließen sich in der
Patientengruppe signifikante Unterschiede in der Zellquantität und –qualität im
Vergleich zur Kontrollgruppe feststellen. Dabei lag die Zellquantität bei erkrankten
Katzen signifikant höher als bei erkrankten Hunden. Außerdem konnten bei 2 von 9
Katzen in den Präparaten Chlamydien erkannt werden, bei einem Hund wurde das
Staupevirus in Form von intranukleären Einschlusskörperchen nachgewiesen.
BAUER (1999) führte die exfoliative Zytologie von Kornea und Konjunktiva bei
verschiedenen Haustierarten durch und gelangte zusammenfassend zu dem
Ergebnis, dass dies eine hilfreiche und leicht durchführbare Methode bei der
Diagnostik von Erkrankungen von Kornea und Konjunktiva ist.
Beim Pferd wird diese Methode bisher nur ausnahmsweise angewendet. BOLLIGER
et al. (2000) beschreibt zur Diagnostik von Keratomykosen beim Pferd die Zytologie
zum Nachweis der Pilzhyphen.
KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleichen die Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und
EHV-5 mittels PCR und exfoliativer Zytologie bei 15 Pferden mit Keratitis oder
Konjunktivitis sowie bei 15 gesunden Kontrolltieren. Bei 4 Pferden der
Patientengruppe sowie 2 Tieren der Kontrollgruppe wurden intranukleäre
Einschlusskörperchen vom Typ Cowdry A gefunden. Dabei konnte jedoch kein
signifikanter Unterschied zwischen der Häufigkeit des Vorkommens von EHV-2 und-
5 und von Einschlusskörperchen zwischen der Kontrollgruppe und der
Patientengruppe nachgewiesen werden.
31
Literaturübersicht
2.6.1.1 Technik der Probengewinnung
2.6.1.1.1 Abdruck –Zytologie
Diese Methode wird in der Humanmedizin bei der Diagnostik von Erkrankungen von
Konjunktiva oder Kornea eingesetzt (MASKIN et al. 1989). Auch BAUER et al. (1996)
berichten über eine vergleichende Studie bei Hunden mit Keratokonjunktivitis sicca,
bei der diese Methode angewandt wurde.
Nach Lokalanästhesie der Konjunktiva wird ein Cellulose- Acetat –Papierstreifen mit
einem Glasstab auf die Schleimhaut gedrückt und danach vorsichtig abgezogen
(MASKIN et al 1989). Der Nachteil dieser Methode ist, dass nur zwei oder drei
Zelllagen gewonnen werden. Sie eignet sich jedoch hervorragend zur
Quantifizierung von Becherzellen in der oberen Zellschicht (NELSON 1988).
Diese Methode eignet sich nicht zur Beprobung der Kornea (BAUER 1999).
Auch BARNETT et al. (1998) beschreibt beim Pferd eine Methode der
Abdruckzytologie, wobei ein trockener Objektträger vorsichtig, aber fest auf
veränderte Bereiche von Kornea, Konjunktiva oder Adnexen aufgedrückt wird und
nach Fixation und Färbung z. B. zur pathohistologischen Diagnose von
Plattenepithelkarzinomen dient.
2.6.1.1.2 Tupfer Der Wattetupfer nimmt nur wenige oberflächliche Zellen und Sekret der Konjunktiva
auf. Dieses Material reicht in der Regel nicht zur zytologischen Auswertung. Bei einer
bereits geschädigten Kornea kann man vorsichtig Zellmaterial von der Oberfläche
gewinnen. Bei intaktem Epithel ist keine ausreichende Materialgewinnung mit dem
Wattetupfer möglich (BAUER 1999).
Bei bakteriellen oder mykotischen Infektionen ist der Tupfer jedoch hilfreich für die
Erregerkultivierung und Identifizierung (BARNETT et al. 1998). VON OPPEN (2000)
und BESTHORN (2002) wiesen mittels PCR EHV-2-Genom aus Augensekrettupfern
nach.
32
Literaturübersicht
2.6.1.1.3 Geschabsel Zur Gewinnung von Zellmaterial aus dem Bereich der Konjunktiva oder Kornea
eignet sich am besten ein Kimura-Platinum-Spatel ( BARNETT et al. 1998, WILLIS et
al. 1997, BAUER 1999). Mit diesem wird nach lokaler Anästhesie vorsichtig
Gewebematerial abgeschabt. Man gewinnt damit auch tiefer gelegene Zellschichten
zur Beurteilung. Diese Art der Probengewinnung liefert gute Ergebnisse, ist jedoch
für den Patienten ein invasiver Eingriff und erfordert neben der Lokalanästhesie
häufig weitere Zwangsmaßnahmen oder Sedierung ( WILLIS et al. 1997, BAUER
1999).
2.6.1.1.4 Cytobrush Der Cytobrush besteht an seinem distalen Ende aus ca. 3 bis 4 mm langen
Nylonborsten, die rundbürstenartig angeordnet sind. Ursprünglich in der
Humanmedizin zur Zervixzytologie entwickelt, wurde dieses Instrument zur
Gewinnung von Konjunktivalzellen weiter modifiziert (TSUBOTA et al. 1990).
Durch vorsichtiges Drehen des Cytobrush auf dem zu beprobenden Gewebe werden
Zellen der verschiedenen Schichten gewonnen und später auf einem Objektträger
luftgetrocknet und gefärbt (BAUER 1999).
Sowohl mit dem Geschabsel als auch mit dem Cytobrush lassen sich sehr gute
Ergebnisse erzielen. Ein deutlicher Vorteil des Cytobrush gegenüber dem
Geschabsel ist die geringe Invasivität der Methode. So ist die Probennahme auch für
den wenig geübten Untersucher oder bei schwierigen Patienten möglich, da die
Gefahr der iatrogenen Verletzung im Gegensatz zu den harten unflexiblen Spateln
deutlich geringer ist. Außerdem ist diese Methode kostengünstig ( WILLIS et al.
1997, BAUER 1999).
Beim Menschen wird berichtet, dass die durch den Einsatz des Cytobrush
entstehende Irritation an Konjunktiva und Kornea des Patienten mit der eines
normalen Wattetupfers vergleichbar ist (TSUBOTA et al. 1990).
33
Literaturübersicht
2.6.2 Erregernachweis 2.6.2.1 Mikrobiologische Untersuchung Der Nachweis von bakteriellen Erregern bei Keratitiden und Konjunktivitiden erfolgt
durch Kultivierung auf spezifischen Nährböden. Die Probenentnahme geschieht
dafür meist mit einem sterilen Wattetupfer, der in einem spezifischen Nährmedium
transportiert wird. Es können auch Geschabsel von veränderten Bereichen
untersucht werden. Auch der Nachweis von Pilzen erfolgt zum Teil kulturell
(WHITLEY et al. 1983, BARNETT et al. 1998).
Das Mileu im Bindehautsack ist physiologischerweise unsteril. Die normale Mikroflora
besteht nach BARNETT et al. (1998) aus überwiegend grampositiven Keimen wie
beispielsweise Streptococcus epidermis, Streptococcus spp., Corynebacterium spp.
und Bacillus cereus. Bei einer bakteriellen Keratitis werden nach Aussage der
Autoren meist gramnegative Keime isoliert, so zum Beispiel Enterobacteriaceae,
Pseudomonas aeruginosa und Proteus spp.. Diese Keime sind alle nur fakultativ
pathogen und benötigen verschiedene Faktoren, wie beispielsweise eine
Vorschädigung der Hornhaut, um krankheitsauslösend zu sein.
Auch MOORE et al. (1983) beschreiben bei 37 untersuchten Pferden mit ulzerativer
Keratitis eine hohe Nachweishäufigkeit von gramnegativen Bakterien und Pilzen.
WHITLEY et al. (1983) isolieren in einer Studie mit 25 klinisch augengesunden
Pferden am häufigsten grampositive Kokken wie Staphylococcus spp., außerdem
Corynebacterium spp., Bacillus spp., Acinetobacter spp. sowie in sechs Augen
Fadenpilze der Gattung Streptomyces spp. Als auffällig beschreiben die Autoren die
hohe Prävalenz (70%) von negativen Kultivierungsergebnissen, die auf die
klimatischen Umstände der winterlichen Verhältnisse und kalten Temperaturen
zurückgeführt werden.
34
Literaturübersicht
2.6.2.2 Virologische Untersuchung Die Untersuchung von Probenmaterial auf das Vorliegen einer Virusinfektion kann
auf verschiedene Arten erfolgen.
2.6.2.2.1 Indirekter Nachweis Bei dieser Methode wird nicht das Virus, sondern die vom Immunsystem als Antwort
auf die Infektion gebildeten Antikörper nachgewiesen. Für die Bestimmung des
Antikörpertiters im Blut können verschiedene Methoden herangezogen werden,
beispielsweise der Virusneutralisationstest, der Immunfluoreszenstest oder die
Komplementbindungsreaktion (THEIN und BÖHM 1976, BORCHERS et al 1997,
BORCHERS et al. 1999). Um einen signifikanten Anstieg des Titers als Hinweis auf
eine akut durchlebte Infektion nachweisen zu können, ist eine zweimalige
Blutentnahme im Abstand von 3 bis 4 Wochen notwendig.
2.6.2.2.2 Direkter Nachweis Bei dieser Methode wird Probenmaterial aus den erkrankten Bereichen gewonnen,
aus welchem durch verschiedene Verfahren ein Nachweis von Virusmaterial
versucht werden kann. An dieser Stelle sollen jedoch nur zwei unterschiedliche
Methoden vorgestellt werden, die im Rahmen dieser Arbeit für den Nachweis von
EHV-2 von Bedeutung sind.
Die Virusisolierung durch Anzüchtung in Zellkulturen setzt das Vorhandensein von
vermehrungsfähigem Virusmaterial voraus und weist bei Infektion mit Herpesviren in
den meisten Fällen nach 12 bis 16tägiger Inkubation zytopathische Effekte mit
Bildung intranukleärer Einschlusskörperchen vom Typ Cowdry A auf (THEIN 1976,
THEIN und BÖHM 1978, MILLER et al. 1990, ROLLE und MAYR 1993, COLLINSON
et al. 1994, BROWNING und AGIUS 1996).
35
Literaturübersicht
Beim Nachweis von Virusgenom durch die Polymerase Kettenreaktion (PCR) werden
bestimmte Gensequenzen des Virus durch Zugabe von spezifischen Primerpaaren
und einer hitzebeständigen Polymerase gezielt vermehrt. Diese Gensequenzen
werden dann beispielsweise durch Gelelektrophorese isoliert und unter UV-Licht
sichtbar gemacht. Vorteil dieser Methode ist, dass auch nicht mehr
vermehrungsfähiges Virusmaterial erfasst werden kann. Die Sensitivität und
Spezifität lassen sich durch die Durchführung einer nested PCR (nPCR) noch
erhöhen, indem in zwei PCR-Durchgängen mit zwei verschiedenen Primerpaaren
gearbeitet wird, wobei das erste Primerpaar die vom zweiten Primerpaar amplifizierte
Sequenz mit einschließt (BORCHERS et al. 1997, REUBEL et al. 1995).
2.7 EHV-2 beim Pferd 2.7.1 Vorkommen von EHV-2 in der Pferdepopulation Das equine Herpesvirus Typ 2 wird ebenso wie das equine Herpesvirus Typ 5 seit
1993 zur Gruppe der Gammaherpesviren gezählt (TELFORD et al. 1993, AGIUS et
al. 1994).
Seropositive Tiere werden in Pferdepopulationen weltweit gefunden (BROWNING
und STUDDERT 1988), bei bis zu 89% klinisch unauffälliger Tiere wird EHV-2 in
Leukozyten nachgewiesen (KEMENEY und PEARSON 1970, ROEDER und SCOTT
1975).
Auch in jüngeren Untersuchungen wird EHV-2 in einer Gruppe klinisch unauffälliger
Tiere bei 42% nachgewiesen. Bei Pferden mit unterschiedlichen klinischen
Erscheinungen gelingt der Nachweis bei bis zu 71% der Tiere (BORCHERS et al.
1997). Bei der Untersuchung von 19 gesunden Tieren gelingt bei allen der Nachweis
eines positiven Antikörpertiters im Blut (BORCHERS et al. 1997).
Bei VON OPPEN (2000) sind alle Tiere einer gesunden Kontrollgruppe Antikörper-
positiv, bei 47,6% dieser Pferde wird mittels PCR EHV-2 Genom in Blutleukozyten
gefunden.
36
Literaturübersicht
ROLLE und MAYR (1993) sprechen von einem Durchseuchungsgrad in der
Pferdepopulation zwischen 45 und 85 %, EDINGTON et al. (1994) konnten in 39 von
40 Schlachtpferden EHV-2 Genom in Milz, verschiedenen Körperlymphknoten,
Trigeminusganglion und Lungenmakrophagen mittels PCR nachweisen.
Auch unter Wildequiden finden sich seropositive Tiere, so werden Antikörper bei
Zebras und Przewalskipferden gefunden (BORCHERS und FRÖHLICH 1997,
BORCHERS et al. 1999).
Der Infektionsweg mit EHV-2 verläuft vermutlich horizontal in den ersten
Lebensmonaten. Das Virus wird dabei wahrscheinlich per Inhalation aufgenommen
und gelang über die Nasenschleimhaut in den Körper (STUDDERT 1974).
Über eine vertikale Infektion gibt es widersprüchliche Literaturstellen. Während
STUDDERT (1974) diese Möglichkeit verneint, da ihm keine Virusisolierung aus
Feten oder Neonaten gelang, geht THEIN (1993) von einer möglichen Infektion des
Feten mit EHV-2 aus und berichtet vom wiederholten Nachweis in fetalem Gewebe.
2.7.2 Klinische Relevanz und Nachweis von EHV-2 beim Pferd Die klinische Relevanz einer Infektion mit EHV-2 ist weitgehend unklar.
Es werden Erkrankungen des oberen und tiefen Respirationstraktes, Fieber,
Inappetenz und Leistungsdepression, aber auch Keratokonjunktivitiden damit in
Zusammenhang gebracht. WOLFINGER (1998) untersuchte eine größere Zahl
Pferde im Raum Berlin/Brandenburg und konnte keinen statistischen
Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und einem bestimmten
klinischen Krankheitsbild aufzeigen.
37
Literaturübersicht
Hinweise für eine Beteiligung von EHV-2 an respiratorischen Erkrankungen finden
sich bei verschiedenen Autoren. PALFI et al. (1978) gelingt die Isolierung von EHV-2
bei 3 - 4 Wochen alten Fohlen, die klinisch mit erhöhter Temperatur, Dyspnoe,
serösem Nasenausfluß und Apathie auffielen. In einer weiteren Untersuchung dieser
Gruppe werden Fohlen mit Hyperimmunseren behandelt und zeigen im Vergleich zu
einer negativen Kontrollgruppe keine respiratorischen Symptome oder eine
Virusausscheidung im Verlauf einer natürlichen Infektion (BELAK et al. 1980).
Desweiteren wird bei einem intrauterin mit EHV-2 infizierten Fohlen, welches
pathogenfrei aufgezogen wurde, wenige Tage nach der Geburt muköser Augen- und
Nasenausfluß beobachtet und aus Augen- und Nasentupfern wiederholt EHV-2
isoliert (GLEESON und STUDDERT 1977).
Auch neuere Untersuchungen bringen EHV-2 mit Erkrankungen der Atemwege in
Zusammenhang. So gelingt bei Pferden mit einer chronisch obstruktiven Bronchitis
die Virusisolierung aus Lungenmakrophagen häufiger als bei gesunden Tieren
(SCHLOCKER 1995). Auch MURRAY et al. (1996) können bei der Untersuchung von
Tracheobronchialsekret klinisch gesunder und respiratorisch erkrankter Fohlen bei
letzteren häufiger EHV-2 isolieren. In dieser Studie wird außerdem berichtet, dass
bei nahezu allen Fohlen EHV-2 aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes
isoliert wurde.
WOLFINGER (1998) zeigt, dass in fünf von sieben Pferdebeständen mit
respiratorischen Erkrankungen ein hoher Prozentsatz der Tiere EHV-2 positiv ist und
findet bei fünf Pferden post mortem EHV-2 DNA in Lungengewebe und
Lungenlymphknoten.
Im Rahmen eines Infektionsversuches bei Ponies entwickeln diese Konjunktivitis,
Lymphknotenschwellungen sowie Husten, es konnte EHV-2 in Augen- und
Nasentupfern nachgewiesen werden (BORCHERS et al. 1998, WOLFINGER 1998).
38
Literaturübersicht
Auch bei Pferden mit Erkrankungen des Auges wurde wiederholt EHV-2
nachgewiesen. So gelingt es THEIN und BÖHM (1976) bei einem Fohlen, welches
neben anderen Tieren des Bestandes an einer Keratokonjunktivitis superficialis
erkrankt war, aus Korneamaterial EHV-2 mittels Virusanzüchtung in Zellkultur sowie
mittels positivem Antikörpertiter nachzuweisen. Auch MILLER et al. (1990) isolieren
bei einer Vollblutstute mit einer Keratitis punctata EHV-2 aus Korneamaterial durch
Anzucht in Zellkultur, können aber in einem zytologischen Ausstrichpräparat keine
Einschlusskörperchen nachweisen.
COLLINSON et al. (1994) können EHV-2 in Augensekrettupfern von Fohlen eines
Bestandes, die an einer Keratokonjunktivitis erkrankt waren, ebenfalls durch
Virusanzucht in Zellkultur nachweisen. Auch hier sind keine Einschlusskörperchen in
Ausstrichen erkennbar.
Weitere Autoren zeigen, dass der Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR aus
Augensekrettupfern signifikant häufiger bei Pferden mit einer Keratitis oder
Keratokonjunktivitis gelingt als bei augengesunden Tieren (VON OPPEN et al. 2001,
KERSHAW et al. 2001). Gleichzeitig wird gezeigt, dass bei augengesunden Pferden
signifikant weniger Nachweise in Nasentupfern und Tracheobronchialsekret geführt
werden. Ein Zusammenhang zwischen einem spezifischen klinischen Bild und dem
Nachweis von EHV-2 konnte dabei jedoch nicht nachgewiesen werden (VON
OPPEN 2000). Antikörpertiter gegen EHV-2 waren bei allen untersuchten Pferden
vorhanden, diese unterschieden sich zwischen den augengesunden und erkrankten
Tieren jedoch nicht signifikant Tieren (VON OPPEN et al. 2001, KERSHAW et al.
2001).
Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von THEIN (1978), der bei
12 augenkranken Pferden höhere Antikörpertiter im Blut als bei gesunden Tieren
feststellen konnte.
In einer jüngeren Studie von BESTHORN (2002) konnten entgegen der Ergebnisse
von VON OPPEN et al. (2001) und KERSHAW et al. (2001) keine signifikanten
Unterschiede im Nachweis von EHV-2 Genom bei Pferden mit einer Keratitis im
Vergleich zu einer augengesunden Kontrollgruppe festgestellt werden.
39
Material und Methode
3 Material und Methode
3.1 Versuchsplanung
Die Untersuchungen wurden in dem Zeitraum von April 2001 bis April 2003 in der
Klinik für Pferde und am Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule
sowie in Zusammenarbeit mit PD Dr. K. Borchers aus der Arbeitsgruppe Equine
Herpesviren des Instituts für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin an der
freien Universität Berlin durchgeführt.
Die untersuchten Pferde werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1 besteht aus 28
Tieren, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt waren. Gruppe 2
beinhaltet 28 Pferde ohne klinische Hinweise einer Augenerkrankung und dient als
Kontrollgruppe.
3.2 Patientengut
Bei den Pferden der Gruppe 1 handelt es sich um Patienten der Klinik für Pferde der
Tierärztlichen Hochschule Hannover, die hier im oben genannten Zeitraum zumeist
ambulant vorgestellt wurden. Ein Großteil dieser Pferde waren
Überweisungspatienten, so dass bei diesen Tieren die Erkrankung bereits länger
bestand und oft bereits vorbehandelt wurde.
Eine zweite Untersuchung dieser Pferde erfolgte im Rahmen einer Nachkontrolle
nach 3 bis 4 Wochen. Zu diesen zwei Zeitpunkten wurden auch die Proben zur
mikrobiologischen, virologischen, serologischen und zytologischen Untersuchung
entnommen.
Die Pferde der Gruppe 2 wiesen keine klinischen Anzeichen einer
Allgemeinerkrankung auf und waren klinisch augengesund.
Alter, Rasse und Geschlecht der Pferde der einzelnen Gruppen sind in Tabelle 1 und
2 aufgeführt.
40
Material und Methode
Tab. 1: Patienten mit Keratitis oder Keratokonjunktivitis (Gruppe 1)
Nr. Alter (J) 10 Rasse 11 Geschlecht 1 8 Hannoveraner Wallach 2 11 Oldenburger Wallach 3 5 Holsteiner Stute 4 12 Hannoveraner Stute 5 6 Hannoveraner Wallach 6 9 Hannoveraner Stute 7 9 Traber Wallach 8 9 Oldenburger Wallach 9 13 Hannoveraner Stute 10 6 Hannoveraner Wallach 11 22 Württemberger Wallach 12 13 Isländer Wallach 13 12 Vollblut XX Wallach 14 6 Oldenburger Wallach 15 17 Warmblut Stute 16 12 Oldenburger Wallach 17 10 Hannoveraner Wallach 18 11 Hannoveraner Wallach 19 7 Isländer Stute 20 5 Warmblut Wallach 21 6 Holsteiner Wallach 22 11 Maultier Stute 23 21 Maultier Stute 24 19 Maultier Stute 25 4 Hannoveraner Wallach 26 9 Hesse Stute 27 3 Maultier Wallach 28 6 Holsteiner Wallach
J : Jahre
Gruppe 1 besteht aus 10 Stuten und 18 Wallachen. Die Tiere sind zwischen 3 und 22
Jahren alt. Das durchschnittliche Alter beträgt 9,7 Jahre.
41
Material und Methode
Tab. 2: Kontrolltiere ohne Augenerkrankung (Gruppe 2)
Nr. Alter (J) 12 Rasse 13 Geschlecht 1 15 Reitpony Wallach 2 17 Warmblut Wallach 3 9 Hannoveraner Wallach 4 3 Traber Stute 5 7 Trakehner Wallach 6 16 Hannoveraner Wallach 7 6 Hannoveraner Wallach 8 7 Westfale Stute 9 5 Warmblut Stute 10 16 Westfale Wallach 11 5 Hannoveraner Stute 12 3 Reitpony Stute 13 13 Westfale Wallach 14 5 Oldenburger Stute 15 14 Westfale Wallach 16 3 Hannoveraner Stute 17 2 Hannoveraner Stute 18 10 Hannoveraner Wallach 19 11 Hannoveraner Wallach 20 4 Traber Wallach 21 4 Traber Wallach 22 3 Traber Wallach 23 5 Traber Wallach 24 19 Warmblut Wallach 25 5 Traber Wallach 26 17 Warmblut Wallach 27 3 Traber Stute 28 9 Warmblut Wallach
J : Jahre
Gruppe 2 besteht aus 9 Stuten und 21 Wallachen. Die Pferde dieser Kontrollgruppe
sind zwischen 2 und 19 Jahren alt. Das durchschnittliche Alter beträgt 8,4 Jahre.
42
Material und Methode
3.3 Klinische Untersuchung Die Untersuchung der Pferde bestand aus einer klinischen Allgemeinuntersuchung
und einer speziellen ophtalmologischen Untersuchung. Diese Untersuchungen
wurden zweimal im Abstand von drei bis vier Wochen durchgeführt.
Bei der klinischen Allgemeinuntersuchung wurden Haltung, Verhalten, Ernährungs-
und Pflegezustand beurteilt. Weiterhin wurden Körpertemperatur, Atem- und
Pulsfrequenz bestimmt sowie Nasenausfluß, Auslösbarkeit von Husten und Farbe
und Beschaffenheit der Schleimhäute beurteilt. Ferner wurde eine Auskultation von
Herz und Lunge durchgeführt.
3.3.1 Spezielle ophtalmologische Untersuchung 3.3.1.1 Untersuchung im beleuchteten Raum
Die spezielle ophtalmologische Untersuchung beider Augen wurde zunächst in
einem hell beleuchteten Raum durchgeführt. Dabei wurde auf die Ausprägung einer
Abwehrtrias, bestehend aus Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie, geachtet.
Die Sehfähigkeit beider Augen wurde anhand des Drohreflexes getestet. Dabei
wurde mit der Hand vor jedem Auge ohne Luftbewegungen, Berührungen oder
Geräusche zu provozieren eine Drohgebärde durchgeführt. Es wurde die Reaktion
des Pferdes in Form eines Lidschlages beurteilt.
Dann erfolgte die Untersuchung der Umgebung des Auges mittels Adspektion und
Palpation. Dabei wurde auf Größe und Position des Bulbus in Relation zur Orbita
geachtet, sowie eine vergleichende transpalpebrale Bulbuspalpation vorgenommen.
Zur Untersuchung der Conjunktiva palpebrarum und der Conjunctiva bulbi wurden
diese mit Daumen und Zeigefinger oder einem Lidhalter nach Desmarres
ektropioniert. Die Oberfläche der Membrana nicitans wurde untersucht, indem sie
durch transpalpebralen Druck auf den Bulbus durch das Oberlid vorgelagert wurde.
Die Untersuchung der Kornea erfolgte zunächst bei Tageslicht auf ihre Form, Größe,
Durchsichtigkeit und Oberflächenbeschaffenheit.
43
Material und Methode
3.3.1.2 Untersuchung im abgedunkelten Raum Während der weiteren speziellen Untersuchung in abgedunkelter Umgebung wurde
eine fokussierte Lichtquelle (Fa. Carl Zeiss, Oberkochen) und ein direktes
Ophtalmoskop (Beta 2000, Fa. Heine, Herrsching) verwendet. Ferner wurden eine
Lupenbrille mit fünffacher Vergrößerung (Fa. Carl Zeiss, Oberkochen) sowie ein
Lidhalter nach Desmarres eingesetzt.
Zu Beginn der Untersuchung in abgedunkelter Umgebung wurde mit Hilfe der
fokussierten Lichtquelle der Pupillarreflex überprüft.
Dann erfolgte eine eingehende Untersuchung der Kornea mittels fokussierter
Lichtquelle unter Zuhilfenahme der Lupenbrille. Dabei wurde die Kornea aus
verschiedenen Richtungen beleuchtet sowie mit und entgegen die Lichtquelle
betrachtet, um vorhandene Veränderungen in Art und Ausdehnung zu erfassen.
Zum Nachweis eventuell vorliegender Hornhautdefekte wurde mittels eines
Papierstreifens Fluoreszin 0,5 % (Fa. Alcon Thilo, Freiburg) in den unteren
Bindehautsack eingebracht. Durch Lidschlag wurde der Farbstoff auf der Kornea
verteilt und anschließend durch Spülung des Auges mit 10 bis 15 ml steriler
Kochsalzlösung (Fa. Braun, Melsungen) überschüssiges Fluoreszin entfernt.
Bei jedem Pferd erfolgte ferner mittels direkter Ophtalmoskopie eine Untersuchung
von vorderer Augenkammer, Linse, Glaskörper und Fundus auf pathologische
Veränderungen.
3.3.2 Klinische Diagnosen Bei jedem Patienten wird nach der speziellen ophtalmologischen Untersuchung eine
klinische Diagnose in Anlehnung an die Einteilung nach BARNETT et al. (1998)
gestellt. Im Folgenden sind die wesentlichen Befunde für die gestellten Diagnosen
aufgeführt:
44
Material und Methode
Keratitis superficialis: - oberflächliche Korneatrübungen unterschiedlicher
Ausprägung, z.T. mit darunterliegendem
Korneaödem
- oberflächliche Gefäßeinsprossung
- intaktes Korneaepithel, aber auch
Epithelabrasionen bis zu oberflächlichen Ulzera
Keratitis punctata: - schwache punkt- und streifenförmige
Hornhauttrübungen
- eventuell unregelmäßige fluoreszeinpositive
epitheliale Läsionen mit darunterliegendem
Stromaödem
Keratitis maculosa: - dichte, umschriebene, fokale oberflächliche
Korneatrübung
- oberflächliche Gefäßeinsprossung
Keratitis profunda: - Korneatrübung von unterschiedlichem Ausmaß und
Färbung
- zumeist oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung
- Epithel- und Stromadefekte bis hin zu tiefen Ulzera
Bullöse Keratopathie: - epitheliale Bläschenbildung, zum Teil mit
Trübungen der Hornhaut
Keratitis vasculosa: - oberflächliche Gefäßeinsprossung, z.T. mit
darunterliegendem geinggradigen Korneaödem
Hornhautabrasion: - oberflächliche Epithelabschürfung mit
darunterliegendem Stromaödem
Da die Keratitis punctata und die Keratitis maculosa oft ineinander übergehen
(BARNETT et al. 1998) und nicht immer klar voneinander zu trennen sind, werden
diese Diagnosen in dieser Arbeit zusammengefasst unter der Bezeichnung Keratitis
punctata seu maculosa. In den Abbildungen 2 bis 7 sind beispielhaft einige klinische
Formen der Keratitiden dargestellt. Die bei der speziellen ophtalmologischen
Untersuchung erhobenen Befunde wurden auf dem in Abbildung 8 folgenden
Befundbogen der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
dokumentiert und mehrfarbig skizziert.
45
Material und Methode
Abb. 2: Keratitis superficialis, Abb. 3: Keratitis punctata seu maculosa,
mit oberflächlicher punktförmige rauchige Trübung Gefäßeinsprossung
Abb. 4: Hornhautabrasion, Abb. 5: Keratitis punctata seu maculosa,
mit darunterliegendem Stromaödem nach temporal konfluierende punkt- förmige Trübung mit oberflächlicher
Gefäßeinsprossung
Abb. 6: Keratitis profunda, Abb. 7: Keratitis vasculosa, mit zikulärer tiefer Gefäßeinsprossung dorsotemporale oberflächliche
und tiefer stromaler, teilweise Gefäßeinsprossung gelblicher Hornhauttrübung
46
Material und Methode
Drohreflex Tonus Umgebung des
Auges
Augenlider
Konjunktiva Nickhaut
Sklera
Kornea
Vordere Augenkammer
Iris
Pupillenreaktion
Linse
Glaskörper
Papilla optica
Retinagefäße
Tapetum lucidum
Tapetum nigrum
Andere Veränderungen
14 Kornea, Sklera 15 Linse Glaskörper Augenhintergrund
Abb. 8: Befundbogen zur Dokumentation der ophtalmologischen
Untersuchungsbefunde
47
Material und Methode
3.4 Probenentnahme Im Anschluß an die klinische Untersuchung und Befundung erfolgte die Entnahme
von Untersuchungsmaterial. Diese wurde sowohl am erkrankten als auch am klinisch
gesunden Auge durchgeführt und erfolgte immer nach folgendem Schema.
Für die mikrobiologische Untersuchung wurde zunächst ein steriler, trockener
Wattetupfer (cultiplast®, Fa. LP Italiana Spa, Italien) im Lidbindehautsack zwischen
Unterlid und Nickhaut eingelegt und vorsichtig um die eigene Achse gedreht. Dieser
wurde dann in das in der Tupferhülle enthaltene Nährmedium verbracht .
Für die weitere Entnahme zur virologischen Untersuchung erfolgte dann zunächst
eine Oberflächenanästhesie des Auges mittels Tetracain enthaltenden Augentropfen
(Ophtocain®, Fa. Winzer, Olching). Anschließend wurde ein steriler, trockener
Wattetupfer wie bereits beschrieben im Lidbindehautsack um die eigene Achse
gedreht. Die Tupferspitze wurde mit einer Schere in ein Eppendorfhütchen verbracht,
welches ein Transportmedium enthält, bestehend aus EDM (Fa. Life Technologies,
Gaithersburg, USA), supplementiert mit 100 IE/ml Penicillin und 200 µl/ml
Streptomycin.
Dann erfolgte die Entnahme von Zellmaterial mittels eines Cytobrushs
(Cytobrush®Plus GT, Fa. Medscand Medical, Schweden). Dieser wurde wie zuvor die
Wattetupfer in den Lidbindehautsack eingebracht und mehrfach vorsichtig um die
eigene Achse gedreht. Dabei wurde darauf geachtet, das die Nickhaut vollständig
über der Hornhaut liegt, um epitheliale Läsionen durch die Nylonborsten zu
vermeiden. Der Cytobrush wurde zur exfoliativen Zytologie auf zwei Objektträgern
abgerollt und anschließend nochmals im Lidbindehautsack gedreht. Die Spitze des
Cytobrush wurde dann für die virologische Untersuchung ebenfalls mit einer Schere
in ein mit Transportmedium befülltes Eppendorfhütchen verbracht. Bei den Patienten
11 bis 28 sowie den Kontrolltieren 3 bis 28 wurde zusätzlich ein zweiter Cytobrush
zur virologischen Untersuchung entnommen. Dieser wurde ebenfalls in ein mit
Transportmedium befülltes Eppendorfhütchen verbracht.
48
Material und Methode
Ferner wurde eine Tupferprobe der Nasenschleimhaut mittels eines sterilen,
trockenen Tupfers innerhalb des Nasenvorhofs proximal von der
Tränennasenkanalmündung entnommen und ebenfalls in Transportmedium
verbracht.
Die Entnahme von Citratvollblut erfolgte aus der Vena jugularis mit einem
Vakuumblutentnahmesystem in Citratblutröhrchen (Vacutainer Systems, Fa. Becton
Dickinson, Frankreich).
Abb. 9: Instrumentarium zur Probengewinnung: a.) Wattetupfer, b.) Cytobrush
49
Material und Methode
3.5 Mikrobiologische Untersuchung
Die mikrobiologischen Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit dem Institut
für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt.
Die entnommenen Tupferproben wurden zunächst zur Anreicherung in einer
Nährbouillion für 10-24 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann folgte die Kultivierung auf
Blutagar, Gassnernährboden und Kochblutagar. Nach einer 48stündigen Inkubation
bei 37°C erfolgte die Spezifizierung der gewachsenen Kolonien.
Zusätzlich wurde im Direktkulturverfahren der mykologische Nachweis auf
Hamburger Testagar bei einer 48stündigen Inkubation mit 37°C durchgeführt.
3.6 Virologische Untersuchung Die virologischen und molekularbiologischen Untersuchungen wurden in
Zusammenarbeit mit PD Dr. K. Borchers aus der Arbeitsgruppe Equine Herpesviren
des Instituts für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin an der freien
Universität Berlin durchgeführt.
3.6.1 DNA-Isolierung aus peripheren Blutleukozyten (PBL)
Zur Isolierung von EHV-2-Genom aus den peripheren Blutleukozyten wurden
zunächst die Citratvollblutproben für 10 min bei 1700 UpM zentrifugiert (Fa. Heraeus,
Minifuge 2, Osterode). Das Plasma wurde dann nahezu vollständig abgenommen
und durch steriles PBS ersetzt. Nach vorsichtigem Durchmischen wurde das
verdünnte Blut auf Ficoll der Dichte 1,077 (Fa. Seromed, Berlin) im Verhältnis
Blut:Ficoll von 3:1 aufgeschichtet und bei 1500 UpM für 20 min zentrifugiert. Der so
entstandene Gradient enthielt eine Schicht aus Erythrozyten und Granulozyten. Über
dieser Schicht stellte sich beige-weiß eine gut abgrenzbare Lymphozyten- und
Monozytenbande dar. Diese wurde mit einer Pipette abgesaugt und in ein neues
Zentrifugenröhrchen überführt.
50
Material und Methode
Nach Auffüllen dieser Zellsuspension mit PBS erfolgte eine erneute Zentrifugation
(Fa. Eppendorf, Zentrifuge 403) für 10 min bei 1700 UpM. Das entstandene Zellpellet
wurde dann noch zweimal in sterilem PBS gewaschen.
Nach der Isolierung der PBL wurden pro Ansatz 101-106 Zellen in 100-200 µl
Proteinase-K Verdauungspuffer 1 (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5 % Tween)
aufgenommen, mit Proteinase-K (Fa. Böhringer, Mannheim) bis zur
Endkonzentration von 0,2 mg/ml versetzt und im Wasserbad bei 56 °C über Nacht
inkubiert. Dann wurde diese Suspension für 10 min auf 94 °C erhitzt, um die
Proteinase-K zu inaktivieren.
Anschließend wurde die Suspension bei 10000 UpM für 5 min zentrifugiert (Fa.
Eppendorf, Zentrifuge 403) und die DNA-Konzentration im Photometer (Fa.
Shimandzu, UV-1202, Japan) bei 260 nm bestimmt. 1 bis 2 µg Gesamt-DNA wurden
dann in die PCR eingesetzt.
3.6.2 DNA-Präparation aus Augentupfer- und Augencytobrushproben sowie aus Nasentupferproben Die im Transportmedium befindlichen Tupfer und Cytobrushs wurden zunächst
aufgeschüttelt und gründlich ausgedrückt, dann aus dem Eppendorfhütchen
entnommen und verworfen. Anschließend wurde die Probe bei 15000 g zentrifugiert
(Fa. Ole Dich, Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge, Dänemark). Der Überstand
wurde abgegossen und das Zentrifugat in 100 µl Proteinase-K-Verdauungspuffer
resuspendiert. Dann wurde die Probe mit Proteinase-K bei einer Endkonzentration
von 0,2 mg/ml über Nacht inkubiert. Nach Inaktivierung der Proteinase-K durch
Erhitzung auf 96 °C wurden 10 µl in die PCR eingesetzt.
51
Material und Methode
3.6.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis des EHV-2-Genoms Die PCR zum Nachweis des EHV-2-Genoms wurde am Institut für Virologie des
Fachbereich Veterinärmedizin der FU Berlin nach der von Borchers et al. (1997)
beschriebenen Methode durchgeführt. Um die Sensivität und Spezifität der
Nachweismethode zu erhöhen, wurden die Reaktionen als nested PCR (nPCR)
durchgeführt. Dabei wurden bei jedem Virusnachweis nacheinander zwei PCR-
Runden mit zwei verschiedenen Primerpaaren durchgeführt, wobei das erste
Primerpaar die vom zweiten Primerpaar amplifizierte Sequenz mit einschloß. Aus der
ersten Runde der PCR (äußeres Primerpaar) wurde ein Aliquot aus diesem
Reaktionsansatz in die zweite Runde der PCR (inneres Primerpaar) überführt. Zusätzlich wurde eine PCR zur Kontrolle der DNA-Qualität durchgeführt. Diese dient
dazu, falsch-negative Ergebnisse, die auf Inhibitoren in der Probe oder Degradierung
von DNA beruhen, auszuschliessen. Das Prinzip beruht auf dem Nachweis des
Zellstrukturgens, das für das Protein β-Actin kodiert. Dieses kommt in allen
eukaryotischen Zellen vor (Shankar et al. 1992). Deshalb sollte dieses Gen nach
DNA-Präparation aus Geweben und Blut immer nachweisbar sein.
Die PCRs wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Dabei wurden zu 1-2 µg
Gesamt-DNA als Matrize zusätzlich 0,4 µM jeden Primers, 0,2 mM dNTPs (Fa.
Perkin Elmer, Überlingen), 1,5 U Taq-Polymerase (Fa. Quiagen, Hilden) und 1*
Reaktionspuffer (Quiagen, Hilden) pipettiert. Das fehlende Volumen wurde mit
Dnase- und Rnase-freiem Aqua dest. (Fa. Promega, Madison, USA) aufgefüllt und
der Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl (Fa. Sigma, Deisenhofen) überschichtet. Für
den PCR-Ansatz wurde ein Heizblockcycler (MWG, Fa. Biotech, Hybaid omnigene)
nach Protokoll verwendet.
Vom fertigen PCR-Produkt werden 15 µl auf einem 2 %igen Agarosegel (Fa. Life
Technologies, Gaithersburg, USA) aufgetragen, gelelektrophoretisch aufgetrennt und
mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht.
52
Material und Methode
3.6.4 Virus-Anzucht Die Präparation des zweiten Cytobrushs erfolgte auf die gleiche Weise wie zuvor
beschrieben. Es wurden 300 µl des Transportmediums für die Azucht eingesetzt.
In einer 6-Lochplatte wurden 5x105 ED-Zellen mit 4 ml Medium pro Vertiefung
ausgesäht. Es folgt eine 1-2stündige Inkubation bei 37°C und 5% CO2 im
Feuchtbrutschrank.
Nach Anwachsen der Zellen werden pro Vertiefung 2,5 ml Medium entfernt, so dass
die ED-Zellen innigeren Kontakt zu den Zellen aus der Cytobrushpräparation haben.
In jede Vertiefung werden nun 150 µl vom Cytobrushmedium gegeben.
Es folgt eine weitere 24stündige Inkubation, nach der wieder 2,5 ml Medium
hinzugegeben wird.
Anschließend erfolgt mehrmaliges Passagieren der Zellen. Dabei wird zunächst das
Medium abgenommen und Trypsin auf die Zellen gegeben. Nach kurzem
Schwenken wird das Trypsin wieder entfernt und die Zellen bei Raumtemperatur für
10 min stehen gelassen. Dann werden die angelösten Zellen in 2ml Medium
aufgenommen. Davon wird 1 ml wieder verworfen, 1ml wird erneut ausgesäht und
3ml Medium zugegeben.
Die zweite Passage (p2) erfolgt auf einer Petrischale (Durchmesser 5 cm) mit 5ml
Medium nach dem oben beschriebenen Prinzip. Nach 5-7 Tagen erfolgt p3 auf einer
Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm und 10 ml Medium, nach weiteren 3-6
Tagen p4 mit derselben Methode wie p3. Wenn nach 7 Tagen keine Plaques sichtbar
sind, wird der Ansatz verworfen.
53
Material und Methode
3.7 Exfolitive Zytologie Die mikroskopische Auswertung der zytologischen Präparate erfolgte in
Zusammenarbeit mit Prof. Dr. R. Mischke aus der Klinik für kleine Haustiere der
Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Nach Abrollen des Cytobrushs auf Objektträgern wurden diese zunächst
luftgetrocknet. Anschließend erfolgte eine Färbung mit Maygrünwald/Giemsa-
Kombination (Fa. Merck, Darmstadt). Nach Trocknung wurden die Präparate unter
Verwendung von Schnelleindeckmittel (Fa. Merck, Darmstadt) mit Glasplättchen
eingedeckelt.
Bei der mikroskopischen Untersuchung wurde zunächst in einer
Übersichtsvergrößerung (16 x 10) das Präparat meanderförmig nach vorkommenden
Zellarten sowie deren Qualität und Quantität durchgesichtet. Anschließend folgte in
einer Detailvergrößerung (40 x 10 und 100 x 10, Ölimmersion) eine genauere
Betrachtung der vorhandenen Zellen. Die Quantität der vorhandenen
inflammatorischen Zellen wurde durch die Betrachtung von acht Ölimmersions-
Gesichtsfeldern bei einer Vergrößerung von 100 x 10 bestimmt. Dabei wurde
zunächst die Anzahl der untersuchten Zellart pro Gesichtsfeld ausgezählt und dann
daraus ein Mittelwert bestimmt.
54
Material und Methode
3.8 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mittels der Software
SAS® im Rechenzentrum der Tieräztlichen Hochschule Hannover. Die Beratung fand
am Institut für Biometrie und Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
statt.
Es wurden die Nachweishäufigkeiten von Virusgenom und von Keimgruppen bei den
Gruppen 1 und 2 abhängig von der Stichprobengröße mittels des Fisher-Exact Tests
oder des χ2 –Tests statistisch verglichen. Weiterhin wurden zum Vergleich von
paarigen Stichproben Vierfeldertafeln anhand des McNemar Tests ausgewertet.
Als Signifikanzstufe wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05
angenommen. Die Signifikanzstufen werden wie folgt angegeben:
p > 0,05 nicht signifikant (n.s.)
p < 0,05 schwach signifikant (*)
p < 0,01 signifikant (**)
55
Ergebnisse
4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der klinischen Untersuchung 4.1.1. Ergebnisse der klinischen Allgemeinuntersuchung Die untersuchten Pferde der Gruppen 1 und 2 wiesen bei der Allgemeinuntersuchung
ein ungestörtes Allgemeinbefinden auf. Pferd Nr. 17 der Gruppe 1 zeigte eine
geringgradige chronische Lungenerkrankung. Pferd Nr. 4 der Gruppe 1 zeigte bei der
Zweituntersuchung eine erhöhte Puls- und Atemfrequenz sowie beginnendes
Schwitzen. Im weiteren Verlauf des Untersuchungstages wurde das Pferd wegen
eines akuten Schockgeschehens behandelt und verstarb spontan unter der
Behandlung. Bei einer durchgeführten Sektion wurde ein rupturiertes
Hämangiosarkom der Milz festgestellt.
4.1.2. Ergebnisse der ophtalmologischen Untersuchung
Die klinischen Diagnosen und eine detailierte Auflistung der bei der
ophtalmologischen Untersuchung erhobenen Befunde der Pferde aus Gruppe 1 sind
in Tabelle A1 im Anhang aufgeführt.
Bei allen Pferden war der durchgeführte Drohreflex positiv, die transpalpebrale
Bulbuspalpation ergab bei keinem Pferd Hinweise auf eine auffällige Veränderung
des Augeninnendruckes.
Alle Pferde der Gruppe 2 waren zu beiden Untersuchungszeitpunkten klinisch
augengesund.
In Tabelle 3 sind die klinischen Diagnosen der Pferde aus Gruppe 1 bei der Erst- und
Zweituntersuchung, welche im Abstand von 4 Wochen durchgeführt wurden,
aufgeführt.
56
Ergebnisse
Tab. 3: Gruppe 1 – Klinische Diagnosen bei der Erst- und Zweituntersuchung im Abstand von vier Wochen
Klinische Diagnose bei [n Pferden]
Erstuntersuchung n = 28
Zweituntersuchung n = 25
Kerat. punct. / mac. 12 5* Kerat. spf. 6 3
Kerat. vasculosa 3 2 Kerat. profunda 3 3 Konjunktivitis 2 0
bullöse Keratopathie 1 1 Hornhautabrasion 1 0
klinisch obB 0 11 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Kerat. : Keratitis
spf. : superficialis
punct. : punctata
mac. : maculosa
* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt
obB : ohne besonderen Befund
Aus der Tabelle 3 ist zu ersehen, dass die Diagnose Keratitis punctata seu maculosa
bei zwölf Pferden (Nr. 1, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 22, 23, 24, 27 und 28) gestellt wurde. Bei
drei Pferden mit Keratitis punctata seu maculosa erfolgte keine Zweituntersuchung
(Nr. 22, 23 und 24), bei fünf Pferden (Nr. 8, 10, 12, 27 und 28) konnte die Diagnose
auch in der Zweituntersuchung noch gestellt werden.
Die Diagnose Keratitis superficialis konnte bei sechs Pferden (Nr. 7, 9, 17, 18, 19
und 25) gestellt werden, bei drei Pferden (Nr. 18, 19 und 25) lag die Keratitis
superficialis auch bei der Zweituntersuchung noch vor.
Von drei Pferden (Nr. 2, 21 und 26) mit einer Keratitis vasculosa wiesen noch zwei
Patienten (Nr. 21 und 26) bei der Zweituntersuchung Befunde auf.
Bei drei Pferden (Nr. 3, 11 und 14) konnte zu beiden Untersuchungszeitpunkten eine
Keratitis profunda diagnostiziert werden.
Die Diagnose einer einseitigen Konjunktivitis wurde bei den Patienten Nr. 16 und 20
gestellt. Beide Pferde zeigten bei der Zweituntersuchung keine Symptome mehr.
57
Ergebnisse
Bei einem Pferd (Nr. 4) wurde eine bullöse Keratopathie diagnostiziert, diese lag bei
der Zweituntersuchung unverändert vor.
Bei Pferd Nr. 13 konnte eine oberflächliche Hornhautabrasion festgestellt werden,
diese war bei der Zweituntersuchung vollständig ausgeheilt.
Insgesamt 11 Pferde waren bei der Zweituntersuchung klinisch unauffällig.
In Tabelle 4 sind die klinischen Symptome bei den gestellten Diagnosen der
Erstuntersuchung zusammengefasst. Das Symptom Konjunktivitis wurde ohne
Unterteilung in geringgradig, mittelgradig und hochgradig aufgenommen. Der Begriff
Rezidiv beinhaltet ein wiederholtes Auftreten der Augenerkrankung oder ein
Bestehen seit mindestens 6 Monaten.
Bei den Patienten mit einer Keratitis superficialis war bei fünf von sechs Pferden eine
begleitende Konjunktivitis vorhanden. Bei diesen fünf Patienten lag ebenfalls eine
Abwehrtrias vor, bestehend aus Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie.
Ferner bestand bei diesen fünf Patienten ein Rezidiv. Bei einem dieser fünf Pferde
(Nr. 19) war die Fluoreszeinprobe positiv und es fiel eine Leukombildung auf. Bei
einem Pferd (Nr. 25) konnte keine oberflächliche Gefäßeinsprossung festgestellt
werden.
Von zwölf Patienten mit einer Keratitis punctata seu maculosa lag bei neun Pferden
ein Rezidiv vor. Nur sechs Patienten zeigten eine Abwehrtrias, bei diesen Pferden
lag ebenfalls eine Konjunktivitis vor. Bei einem Pferd (Nr. 23) wurde zusätzlich ein
Leukom diagnostiziert. Eine Gefäßeinsprossung lag bei fünf Patienten vor. Bei
keinem dieser Pferde gelang eine positive Fluoreszeinprobe.
Bei drei Pferden wurde eine Keratitis vasculosa diagnostiziert (Nr. 2, 21 und 26). Bei
diesen Patienten lag keine Hornhauttrübung vor, sondern ausschließlich eine
oberflächliche Gefäßeinsprossung, verbunden mit einer Konjunktivitis und einer
deutlichen Abwehrtrias.
58
Ergebnisse
Von den drei Pferden mit einer Keratitis profunda (Nr. 3, 11 und 14) zeigte nur ein
Tier eine deutliche Abwehrtrias (Nr. 11). Bei diesem Pferd verlief die
Fluoreszeinprobe positiv. Bei den beiden anderen Pferden war das Auge klinisch
reizfrei, bei Pferd Nr. 3 konnte ein Leukom festgestellt werden. Pferd Nr. 14 wies eine
oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung auf. Bei allen 3 Patienten lag ein Rezidiv
vor.
Bei zwei Patienten (Nr. 16 und 20) wurde ausschließlich eine einseitige Konjunktivitis
diagnostiziert, die bei beiden Pferden eine deutliche Abwehrtrias hervorrief und als
Rezidiv vorlag.
Bei einem Patienten (Nr. 13) lag eine Hornhautabrasion vor, bei der schon eine
oberflächliche Gefäßeinsprossung erfolgt war. Vorberichtlich war dieser Defekt mit
hoher Wahrscheinlichkeit durch eine Verletzung und nicht durch eine primäre
Keratitis bedingt.
Bei einem Patienten (Nr. 4) wurde eine bullöse Keratopathie diagnostiziert. Bei
diesem Pferd lag keine Trübung der Hornhaut vor, sondern eine subepitheliale
Bläschenbildung. Dieses Auge zeigte sich klinisch reizfrei, die Veränderung bestand
bereits seit mehreren Jahren.
59
Ergebnisse
Tab. 4: Gruppe 1 – Befunde und Diagnosen bei der ophtalmologischen
Erstuntersuchung
Gefäß -einsprossung
Diagnose bei
n [Pferden]
n = 28
Trias Rezidiv Konjunk-tivitis
Hornhaut-trübung
/ Leukom Fluoresz.
positiv oberfl. tief Kerat. spf. 6 5 5 5 6 / 1 1 5 0
Kerat. punct. /mac. 12 6 9 6 12 / 1 0 5 0 Kerat.
vasculosa 3 3 2 3 0 0 3 0 Kerat.
profunda 3 1 3 2 3 / 1 1 3 1 Konjunktivitis 2 2 2 2 0 0 0 0
Bullöse Keratopathie 1 0 1 0 0 0 0 0
Kornea-abrasion 1 1 0 1 1 1 1 0
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Kerat. : Keratitis
spf. : superficialis
punct. : punctata
mac. : maculosa
oberfl. : oberflächlich
* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt
obB : ohne besonderen Befund
Trias : Abwehrtrias (Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie)
60
Ergebnisse
Tabelle 5 zeigt die bei der Zweituntersuchung erhobenen Befunde der Pferde aus
Gruppe 1.
Tab. 5: Gruppe 1 - Ergebnisse der ophtalmologischen Zweituntersuchung (vier
Wochen nach der Erstuntersuchung), [n = 25]
Gefäß -einsprossung Diagnose
bei n [Pferden]
n = 25
Trias Konjunk-
tivitis Hornhaut-trübung
/ Leukom Fluoresz.
positiv oberfl. tief
Kerat. spf. 3 0 0 3 / 1 0 0 0 Kerat. punct.
/mac. 5* 0 1 4 / 1 0 1 0
Kerat. vasculosa 2 0 0 0 0 2 0
Kerat. profunda 3 1 2 3 / 2 1 3 2 Konjunktivitis 0 0 0 0 0 0 0
Bullöse Keratopathie 1 0 0 0 0 0 0
Hornhaut-abrasion 0 0 0 0 0 0 0
klinisch obB 11 0 0 0 0 0 0 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Kerat. : Keratitis
spf. : superficialis
punct. : punctata
mac. : maculosa
oberfl. : oberflächlich
* : bei drei Pferden wurde keine Nachuntersuchung durchgeführt
obB : ohne besonderen Befund
Trias : Abwehrtrias (Blepharospasmus, Epiphora und Photophobie)
Bei der Zweituntersuchung wurde noch bei drei von ursprünglich sechs Pferden die
Diagnose einer Keratitis superficialis gestellt. Bei einem dieser Patienten (Nr. 19)
zeigte sich eine Leukombildung, bei den Patienten Nr. 18 und 25 lag noch eine
geringgradige Resttrübung der Hornhaut vor. Keines der Pferde zeigte noch eine
Abwehrtrias oder Gefäßeinsprossung, die bei der Erstuntersuchung vorhanden war.
61
Ergebnisse
Von den Patienten, die an einer Keratitis punctata seu maculosa erkrankt waren,
konnte bei drei Pferden keine Zweituntersuchung durchgeführt werden. Von den zur
Nachuntersuchung vorgestellten Pferden wiesen noch fünf Tiere eine Keratitis
punctata seu maculosa auf. Bei einem Pferd (Nr. 8) konnte eine Leukombildung
festgestellt werden. Alle Augen waren reizfrei, bei Patient Nr. 12 zeigte sich noch
eine oberflächliche Gefäßeinsprossung. Bei den Patienten Nr. 10, 27 und 28 zeigte
sich die Hornhaut auch bei weiteren Nachuntersuchungen im Abstand von mehreren
Wochen unverändert mit punktförmigen Trübungen ohne eine weitere entzündliche
Reaktion des Auges. Patient Nr.1 war bei der Zweituntersuchung unauffällig, wurde
aber 8 Monate später erneut mit der gleichen Symptomatik vorgestellt. Auch dieses
Mal war eine vollständige Ausheilung nach ca. 2 Wochen zu beobachten.
Bei zwei von drei Patienten wurde bei der Zweituntersuchung noch eine Keratitis
vasculosa festgestellt. Bei Pferd Nr. 26 war auch bei einer dritten Nachkontrolle nach
weiteren 4 Wochen noch eine dezente Gefäßeinsprossung festzustellen. Bei einer
vierten Verlaufskontrolle war das Auge unauffällig. Patient Nr. 2 zeigte bei der
Zweituntersuchung keine Befunde mehr. Dieses Pferd wurde nach 13 Monaten
erneut mit derselben klinischen Symptomatik auf dem anderen Auge vorgestellt.
Auch hier war bei einer Zweituntersuchung das Auge wieder unauffällig.
Alle Patienten mit einer Keratitis profunda wiesen auch bei der Zweituntersuchung
noch Befunde auf. Pferd Nr. 11 zeigte eine unveränderte Abwehrtrias sowie weiterhin
eine positive Fluoreszeinprobe. Zusätzlich bestand bei diesem Patienten inzwischen
eine tiefe Gefäßeinsprossung. Trotz intensiver Therapiemaßnahmen verschlechterte
sich der klinische Verlauf weiter, so dass nach weiteren 6 Wochen das Auge entfernt
wurde. Bei Patient Nr. 14 zeigte sich noch eine Hornhauttrübung, sowie eine
oberflächliche und tiefe Gefäßeinsprossung, diese waren im Vergleich zur
Erstuntersuchung deutlich zurückgegangen. In weiteren Nachkontrolluntersuchungen
konnte eine vollständige Ausheilung festgestellt werden, es blieb ein Leukom
zurück. Auch bei Patient Nr. 3 kam es zu einer Leukombildung.
Beide Patienten, die bei der Erstuntersuchung eine einseitige Konjunktivitis
aufwiesen, waren bei der Zweituntersuchung klinisch unauffällig.
62
Ergebnisse
Das Pferd mit der bullösen Keratopathie wies bei der Zweituntersuchung
unveränderte Befunde im Vergleich zur Erstuntersuchung auf.
Bei dem Patienten mit der Hornhautabrasion waren in der Zweituntersuchung keine
klinischen Befunde mehr zu erheben.
4.1 Ergebnisse der virologischen Untersuchung 4.1.1 Ergebnisse des direkten EHV-2 Nachweises mittels PCR Die Ergebnisse des direkten EHV-2-Nachweises in Verbindung mit den klinischen
Diagnosen bei den untersuchten Gruppen sind in den Tabellen A3, A4 und A5 im
Anhang aufgeführt. In beiden Gruppen wurden diese Untersuchungen 4 Wochen
nach der Erstuntersuchung wiederholt. Bei den Pferden 23, 24 und 25 der Gruppe 1
sowie bei den Pferden 1, 2 und 13 der Gruppe 2 konnte keine Zweituntersuchung
durchgeführt werden.
Tabelle 6 zeigt, bei wie vielen Pferden aus Gruppe 1 und 2 der Nachweis von EHV-2
Genom mittels PCR in den verschiedenen Untersuchungsmaterialien bei der
Erstuntersuchung geführt wurde. Dabei wurde unterschieden, ob bei einem Tier eine
Augenerkrankung vorliegt oder nicht.
63
Ergebnisse
Tab. 6: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei der Erstuntersuchung
EHV-2 Nachweis bei [n Pferden] in
Gruppe 1 n = 28
Gruppe 2 n = 28
Wattetupfer 7 (25,0%) 2 (7,1%) Cytobrush 16 (57,1%) 17 (60,7%)
Nasentupfer 3 (10,7%) 3 (10,7%) PBL 10 (35,1%) 13 (46,4%)
gesamt positive Pferde 19 (67,9%) 23 (82,14%) PBL : periphere Blutleukozyten
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
Hier ist zu sehen, dass bei 16 Pferden aus Gruppe 1 und bei 17 Pferden aus Gruppe
2 der Nachweis von EHV-2 Genom im Cytobrush gelang. Nachweise in Wattetupfern
gelang bei 7 Pferden der Gruppe 1 und bei 2 Pferden der Gruppe 2.
Aus Nasentupfern wurde bei jeweils drei Pferden der Gruppe 1 und 2 EHV-2 Genom
isoliert. Der Nachweis in peripheren Blutleukozyten gelang bei zehn Pferden der
Gruppe 1 sowie dreizehn Pferden der Gruppe 2. Insgesamt gelang mit den
verschiedenen untersuchten Materialien bei 19 Pferden der Gruppe 1 der Nachweis
von EHV-2 Genom, sowie bei 23 Pferden der Gruppe 2.
Mittels des Fisher Exact Test wird gezeigt, dass in allen untersuchten Materialien
keine signifikanten Unterschiede zwischen augenkranken und augengesunden
Tieren dargestellt werden können (Abbildung 10).
64
Ergebnisse
0
5
10
15
20
25
Gruppe 1Gruppe 2
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
PBL : periphere Blutleukozyten
n.s. : nicht signifikant
Abb. 10: Gruppe 1 und 2 - Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei in der Erstuntersuchung
65
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Zweituntersuchung bei den Pferden der Gruppen 1 und 2 sind in
Tabelle 7 und Abbildung 11 dargestellt. Bei jeweils 3 Pferden der Gruppen 1 und 2
konnte keine Zweituntersuchung durchgeführt werden.
Tab. 7: Gruppe 1 und 2 – Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR bei der Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)
EHV-2 Nachweis bei [n Pferden] in
Gruppe 1 n = 25
Gruppe 2 n = 25
Wattetupfer 7 (28%) 4 (14,3%) Cytobrush 13 (52%) 13 (52%)
Nasentupfer 1 (4%) 1 (4%) PBL 5 (20%) 12 (48%)
gesamt positive Pferde 16 (64%) 18 (72%) PBL : periphere Blutleukozyten
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
Bei jeweils dreizehn Pferden der Gruppen 1 und 2 gelang der positive EHV-2
Nachweis im Cytobrush. Bei sieben Pferden der Gruppe 1 sowie vier Pferden der
Gruppe 2 war der Wattetupfer EHV-2 positiv. Bei jeweils einem Pferd der beiden
Gruppen war der Nasentupfer postiv, in den peripheren Blutleukozyten konnte bei
fünf Pferden der Gruppe 1 sowie zwölf Pferden der Gruppe 2 EHV-2 Genom
nachgewiesen werden. Insgesamt gelang ein Nachweis bei 16 Pferden der Gruppe 1
und 18 Pferden der Gruppe 2.
Mit dem Fisher Exact Test wird gezeigt, dass auch zum Zeitpunkt der
Zweituntersuchung keine signifikanten Unterschiede (n.s.) in den untersuchten
Materialien zwischen den an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankten
Pferden und augengesunden Kontrolltieren festgestellt werden können (Abbildung 5).
66
Ergebnisse
02468
101214161820
Gruppe 1Gruppe 2n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
PBL : periphere Blutleukozyten
n.s. : nicht signifikant Abb. 11: Gruppe 1 und 2 - Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR in bei der
Zweituntersuchung (vier Wochen nach der Erstuntersuchung)
67
Ergebnisse
Tabelle 8 betrachtet die bei der Erst- und Zweituntersuchung geführten Nachweise
von EHV-2 Genom in Wattetupfer und Cytobrush für jedes einzelne Auge der Pferde
aus den Gruppen 1 und 2 zusammengefasst, unabhängig von einer klinischen
Erkrankung.
Tab. 8: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Nachweishäufigkeit von EHV-2 Genom in Cytobrush und Wattetupfer am einzelnen Auge in Prozent
1. US 2. US Nachweis von
EHV-2 Genom
in % Cytobrush Wattetupfer p- Wert Cytobrush Wattetupfer p- Wert
positiv
35,7% 8,0% < 0,01
(**) 34% 10% < 0,01 (**)
negativ
64,3% 92% < 0,01
(**) 66% 90% < 0,01 (**)
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
1. US : Erstuntersuchung
2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)
(**) : signifikanter Unterschied
Der positive Nachweis von EHV-2 Genom gelang in der Erstuntersuchung bei 35,7%
Cytobrushproben sowie 8% Wattetupferproben. Bei 64,3% der beprobten Augen
blieb der Cytobrush EHV-2 negativ, bei 92% der beprobten Augen waren die
Wattetupfer EHV-2 negativ. In der Zweituntersuchung konnte aus 34% der
Cytobrushproben ein positiver Nachweis von EHV-2 Genom geführt werden, bei 66%
gelang kein Nachweis von EHV-2. Im Wattetupfer gelang der Nachweis von EHV-2
Genom aus 10% der Augen, 90% der Wattetupfer blieben EHV-2 negativ.
Es besteht kein signifikanter Unterschied in den Nachweishäufigkeiten zwischen der
Erst- und Zweituntersuchung. Im Vergleich von Wattetupfer zu Cytobrush besteht ein
signifikanter Unterschied in der Nachweishäufigkeit von EHV-2 Genom.
68
Ergebnisse
In Tabelle 9 wird die Häufigkeit des positiven EHV-2 Nachweises im Wattetupfer bei
gleichzeitig positivem EHV-2 Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge in der Erst-
und Zweituntersuchung gezeigt.
Tab. 9: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Positiver Nachweis von EHV-2 Genom im Wattetupfer bei gleichzeitigem positiven Nachweis im Cytobrush am einzelnen Auge
positiver EHV-2 Nachweis bei
[n Augen] Cytobrush
positiv davon
Wattetupfer positiv p - Wert
Erstuntersuchung 40 7 < 0,01 (**)
Zweituntersuchung 34 6 < 0,01 (**)
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
(**) : signifikanter Unterschied
Hier ist zu sehen, dass in der Erstuntersuchung bei 40 Augen ein positiver EHV-2
Nachweis im Cytobrush gelang. Von diesen gelang bei sieben Augen ein
gleichzeitiger EHV-2 Nachweis im Wattetupfer. In der Zweituntersuchung waren 34
Augen EHV-2 positiv im Cytobrush, davon gelang bei sechs Augen der Nachweis im
Wattetupfer.
Eine statistische Auswertung mittels des McNemar Tests konnte zeigen, dass zu
beiden Untersuchungszeitpunkten ein Nachweis von EHV-2 Genom signifikant
häufiger im Cytobrush als im Wattetupfer gelingt. In Abbildung 12 wird der Vergleich
von positivem EHV-2 Nachweis in Cytobrush und Wattetupfer graphisch dargestellt.
69
Ergebnisse
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1. US 2.US
Cytobrush pos.davon Tupfer pos.
**
**
1. US : Erstuntersuchung
2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)
pos. : positiv
** : signifikanter Unterschied
Abb. 12: Gruppe 1 und 2, Erst- und Zweituntersuchung – Vergleich von Cytobrush zu Wattetupfer beim positiven EHV-2 Nachweis am einzelnen Auge
70
Ergebnisse
In Tabelle 10 wird der Nachweis von EHV-2 Genom in erkrankten und gesunden
Augen bei den Pferden der Gruppe 1 in Wattetupfer und Cytobrush zum Zeitpunkt
der Erstuntersuchung vergleichend dargestellt.
Tab. 10: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush bei der Erstuntersuchung [ n = 28]
EHV-2 Nachweis bei n [Pferden]
Wattetupfer positiv n = 7
Cytobrush positiv n = 16
Cytobrush und Wattetupfer positiv
n = 4 auf erkranktem Auge 4 8 2 auf gesundem Auge 3 6 2
auf beiden Augen 0 2 0 Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Bei vier Pferden war bei der Erstuntersuchung der Wattetupfer ausschließlich auf
dem erkrankten Auge EHV-2 positiv, bei drei Pferden erfolgte der Nachweis im
Wattetupfer nur auf dem gesunden Auge. Bei keinem Pferd war der Wattetupfer auf
beiden Augen positiv. Von 16 Pferden, bei denen der Nachweis von EHV-2 im
Cytobrush gelang, wurde bei acht Tieren der Nachweis ausschließlich auf dem
erkrankten Auge geführt. Sechs Pferde waren nur auf dem gesunden Auge positiv,
bei zwei Pferden waren beide Augen im Cytobrush EHV-2 positiv. Bei zwei Pferden
waren sowohl Wattetupfer als auch Cytobrush auf dem erkrankten Auge EHV-2
positiv, ebenso bei zwei Pferden auf dem gesunden Auge. Bei keinem Pferd waren
beide Proben auf beiden Augen positiv. Diese Aufstellung zeigt, dass die Nachweise
von EHV-2 Genom in beiden Untersuchungsmethoden zu gleichen Anteilen auf
erkrankten und gesunden Augen erfolgen und kein signifikant häufigerer Nachweis
auf dem erkrankten Auge erfolgte.
Tabelle 11 zeigt den Nachweis von EHV-2 Genom bei den Pferden der Gruppe 1
zum Zeitpunkt der Zweituntersuchung vergleichend auf erkranktem und gesunden
Auge in Wattetupfer und Cytobrush.
71
Ergebnisse
Tab. 11: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom vergleichend bei erkrankten und gesunden Augen in Wattetupfer und Cytobrush bei der Zweituntersuchung [n = 25]
EHV-2 Nachweis bei
n [Pferden] Wattetupfer
positiv n = 7
Cytobrush positiv n = 13
Cytobrush und Wattetupfer positiv
n = 5 auf erkranktem/
ehemals erkranktem Auge 7 6 5
auf gesundem Auge 0 1 0 auf beiden Augen 0 6 0
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Hier ist zu erkennen, dass bei sieben Pferden in der Zweituntersuchung im
Wattetupfer ausschließlich auf dem erkrankten oder ehemals erkrankten Auge ein
positiver EHV-2 Nachweis geführt wurde.
Bei keinem Tier gelang ein Nachweis im Wattetupfer nur auf dem gesunden oder in
beiden Augen. Ein positiver EHV-2 Nachweis im Cytobrush gelang bei sechs Pferden
ausschließlich auf dem erkrankten Auge. Bei einem Pferd erfolgte der Nachweis nur
auf dem gesunden Auge, sechs Pferde waren auf beiden Augen im Cytobrush EHV-
2 positiv. Bei fünf Pferden gelang der Nachweis auf dem erkrankten Auge in beiden
Proben gleichzeitig.
Die Tabelle 12 zeigt die Anzahl der Pferde in Gruppe 1, bei denen der Nachweis von
EHV-2 in der Erst- und Zweituntersuchung in den verschiedenen Proben geführt
wurde.
72
Ergebnisse
Tab. 12: Gruppe 1 – Nachweis von EHV-2 Genom in den verschiedenen Proben bei Erst- und Zweituntersuchung
Nachweis von EHV-2 Genom bei
n =
Wattetupfer EHV-2 positiv
Cytobrush EHV-2 positiv
Nasentupfer EHV-2 positiv
PBL EHV-2 positiv
1. US n [Pferde] 28 7 16 3 10
2. US n [Pferde] 25 7 13 1 5
1. und 2. US n [Pferde] 53 5 11 0 4
PBL : periphere Blutleukozyten
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
1. US : Erstuntersuchung
2. US : Zweituntersuchung (4 Wochen nach der Erstuntersuchung)
Bei sieben Pferden war der Wattetupfer in der Erstuntersuchung positiv, ebenso bei
sieben Pferden in der Zweituntersuchung. Bei fünf Pferden gelang der Nachweis
sowohl in der Erst- als auch in der Zweituntersuchung. Bei 16 Pferden gelang in der
Erstuntersuchung der Nachweis von EHV-2 im Cytobrush, bei 13 Pferden war der
Cytobrush in der Zweituntersuchung EHV-2 positiv. Ein wiederholter Nachweis von
EHV-2 Genom im Cytobrush gelang bei elf Pferden.
Der Nasentupfer war in der Erstuntersuchung bei drei Tieren positiv, in der
Zweituntersuchung bei einem Pferd. Ein wiederholter Nachweis gelang bei keinem
Tier.
Die Untersuchung der peripheren Blutleukozyten erbrachte bei zehn Pferden einen
positiven Nachweis in der Erstuntersuchung und bei fünf Pferden in der
Zweituntersuchung. Bei vier Pferden gelang ein wiederholter Nachweis von EHV-2 in
den peripheren Blutleukozyten.
Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2
Genom auf dem erkrankten und/oder gesundem Auge und dem gleichzeitigem
Nachweis in Nasentupfer und peripheren Blutleukozyten besteht nicht.
73
Ergebnisse
4.1.2 Virologischer Nachweis von EHV-2 mittels Virusanzucht Der zweite entnommene Cytobrush wurde zur Virusanzucht nach beschriebener
Methode eingesetzt. Dieser Nachweis von vermehrungsfähigem Virusmaterial gelang
jedoch nur in einem einzigen Fall bei einem Pferd der Kontrollgruppe (Nr. 9) zu
beiden Untersuchungszeitpunkten. Bei diesem Pferd lag keine klinische Erkrankung
vor.
Daher kann hier eine Aussage über die klinische Relevanz bei Nachweis von
lebendem Virusmaterial oder die Sensitivität dieser Methode nicht getroffen werden.
74
Ergebnisse
4.2 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung Die mikrobiologischen Untersuchungen der Augentupferproben wurden im Institut für
Mikrobiologie und Tierseuchen der tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
Die nachgewiesenen Keime bei den Pferden der Gruppen 1 und 2 in der Erst- und
Zweituntersuchung sind in den Tabellen A6, A7, A8 und A9 im Anhang aufgeführt.
Der kulturelle Gehalt der nachgewiesenen Keime wurde in geringgradig, mittelgradig
und hochgradig unterschieden. Der Nachweis von hochgradigem Gehalt erfolgte
sowohl bei gesunden als auch erkrankten Augen überwiegend bei Streptokokken,
Staphylokokken sowie bei Acinetobacter spp., Pantoea spp. und Escherichia coli. Bei
zwei der erkrankten Augen lag auch ein hochgradiger Gehalt an Pseudomonas spp.
vor. In gering- und mittelgradiger Menge konnten Pseudomonaden sowohl in
erkrankten als auch gesunden Augen isoliert werden.
In der Tabelle 13 sind Art und Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und
erkrankten Augen der Gruppen 1 und 2 bei der Erstuntersuchung zusammengefasst.
Insgesamt wurden 112 Augen im Abstand von vier Wochen untersucht, davon waren
28 Augen an einer Keratitis oder Kojunktivitis erkrankt.
Die Tabelle zeigt, dass bei der Erstuntersuchung koagulasenegative Staphylokokken
in insgesamt 49 Augen isoliert werden konnten, davon waren 14 Augen klinisch
erkrankt. Der Nachweis von alpha-hämolysierenden Streptokokken wurde bei 14
Augen geführt, davon waren sechs Augen klinisch erkrankt. Acinetobacter spp.
wurde bei 52 Augen isoliert, von denen neun erkrankt waren. In 57 Augen gelang der
Nachweis von Bacillus spp., zwölf Augen wiesen davon eine Erkrankung auf.
Bacillus cereus konnte in 17 gesunden und fünf erkrankten Augen nachgewiesen
werden. Bei 31 gesunden und sechs erkrankten Augen erfolgte der Nachweis von
Pantoea agglomerans. Pseudomonas spp. konnte bei sechs Augen isoliert werden,
von denen drei erkrankt waren, Pseudomonas fluoreszens wurde bei einem
erkrankten Auge nachgewiesen. Bei nur einem erkrankten Auge wurden Sprosspilze
nachgewiesen, bei jeweils zwei gesunden Augen erfolgte der Nachweis von
Sprosspilzen, Schimmelpilzen und niederen Pilzen (Mucor spp.). Aus drei gesunden
Augen konnten Schwärzepilze der Gattung Alternaria spp. isoliert werden.
75
Ergebnisse
Tab. 13: Gruppe 1 und 2 - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und erkrankten Augen bei der Erstuntersuchung, n [Augen] = 112
nachgewiesene Keimen [Nachweise] in gesunden
Augen Gruppe 1
n [Nachweise] in erkrankten
Augen Gruppe 1
n [Nachweise] in gesunden
Augen Gruppe 2
n [Nachweise] gesamt
(davon klinisch erkrankt)
koag.- Staphylokokken 13 14 22 49 (14) Staphylococcus aureus - 2 - 2 (2) Staphylococcus xylosus - 1 - 1 (1)
anhämolys. Streptokokken 2 - 3 5 (0) α-hämolys. Streptokokken 4 5 5 14 (6)
Streptococcus equi subsp.zooepidemicus - - 1 1 (0)
Bacillus spp. 14 12 31 57 (13) Bacillus cereus 5 7 5 17 (5)
Acinetobacter spp. 13 9 30 52 (9) Moraxella spp. - - 2 2 (0)
Pseudomonas spp. - 3 3 6 (3) Pseudomonas fluorescens - 1 - 1 (1) Flavimonas orizyhabitans - - 2 2 (0)
Ralstonia picketii (früher: Pseudomonas p.) - 1 - 1 (1)
Pantoea agglomerans 6 6 19 31 (6) Enterobacter spp. - - 2 2 (0) Enterococcus spp. - - 1 1 (0)
Escherichia coli 2 3 4 9 (3) coryneforme Bakterien - - 3 3 (0) Chryseobacterium spp. - - 4 4 (0)
Alcaligenes spp. - 1 - 1 (1) Arthrobacter spp. 2 1 - 3 (1) Micrococcus spp. 1 - - 1 (0) Geotrichum spp. - 1 - 1 (1)
Mucor spp. 2 - - 2 (0) Schimmelpilze - - 1 1 (0)
Aspergillus spp. 1 - - 1 (0) Alternaria spp. - - 3 3 (0)
Sprosspilze 1 1 1 3 (1) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
koag.- : koagulasenegativ spp. : species
α-hämolys. : alphahämolysierend subsp. : subspecies
anhämolys. : anhämolysierend
76
Ergebnisse
In Tabelle 14 sind die prozentualen Anteile der nachgewiesenen Keimgruppen bei
gesunden und erkrankten Augen aus Gruppe 1 und 2 in der Erstuntersuchung
dargestellt. Diese prozentualen Anteile an den verschiedenen Keimgruppen wird in
den Abbildungen 7 und 8 für gesunde und erkrankte Augen graphisch dargestellt.
Tab. 14: Gruppe 1 und 2, Erstuntersuchung – Nachweise der Keimgruppen bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent
Keimgruppe Nachweis in
gesunden Augen [n = 84] in %
Nachweis in erkrankte Augen
[n = 28] in % p - wert
grampos. Kokken 59,5% 82,1% < 0,05 (*) gramneg. Stäbchen,
aerob 48% 50% > 0,05 (n.s.)
gramneg. Stäbchen, fakultativ anaerob 39,3% 39,3% > 0,05 (n.s.)
grampos. Stäbchen, aerob sporenbildend 65,5% 60,7% > 0,05 (n.s.)
grampos. coryneforme Stäbchen 8,3% 0% > 0,05 (n.s.)
Schimmelpilze 2,4% 0% > 0,05 (n.s.) Sprosspilze 2,4% 3,5% > 0,05 (n.s.)
niedere Pilze 5,9% 0% > 0,05 (n.s.) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
grampos. : grampositiv
gramneg. : gramnegativ
(*) : schwach signifikant
(n.s.) : nicht signifikant
Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass in 59,5% der gesunden Augen beider
Untersuchungsgruppen grampositive Kokken isoliert werden konnten, dieser
Nachweis gelang bei 82,1% der erkrankten Augen. Bei 48% der gesunden und 50%
der erkrankten Augen wurden gramnegative aerobe Stäbchen isoliert. Gramnegative
fakultativ anaerobe Stäbchen konnten bei jeweils 39,3% der gesunden und
erkrankten Augen isoliert werden. Obligat aerobe sporenbildende Stäbchen konnten
in 65,5% der gesunden und 60, 7% der erkrankten Augen nachgewiesen werden.
77
Ergebnisse
Grampositive corynefome Stäbchen wurden bei 8,3% der gesunden Augen isoliert,
Schimmelpilze bei 2,4%, Sprosspilze in 2,4% und niedere Pilze bei 5,9% der
gesunden Augen. Sprosspilze konnten ferner in 3,5% der erkrankten Augen
gefunden werden.
Mittels des χ2 – Tests und des Fisher- Exact Tests wurden die Nachweishäufigkeiten
der einzelnen Keimgruppen in gesunden und erkrankten Augen statistisch
untersucht. Dabei ergab sich bei den grampositiven Kokken in erkrankten Augen ein
schwach signifikant häufigerer Nachweis als in gesunden Augen. Bei allen anderen
untersuchten Keimgruppen konnten keine signifikanten Unterschiede im Nachweis
bei erkrankten und gesunden Augen festgestellt werden.
In den Abbildungen 13 und 14 sind die prozentualen Nachweishäufigkeiten bei
gesunden und erkrankten Augen in der Erstuntersuchung graphisch dargestellt.
47,6%
5,9%2,4%2,4%
8,3%
65,5%
39,3%
59,5%
grampos. Kokken
gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. Stäbchensporenbildendgrampos. coryneformeStäbchenFadenpilze
Sprosspilze
niedere Pilze
grampos. : grampositiv
gramneg. : gramnegativ
Abb. 13: Gesunde Augen [n = 84] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen
Keimgruppen bei der Erstuntersuchung
78
Ergebnisse
82,10%
50,00%
39,30%
60,70%
3,50%grampos. Kokken
gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. StäbchensporenbildendSprosspilze
grampos. : grampositiv
gramneg. : gramnegativ
Abb. 14 : Erkrankte Augen [n = 28] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen
Keimgruppen bei der Erstuntersuchung Aus den Abbildungen ist zu ersehen, dass kein signifikanter Unterschied in den
Anteilen den gramnegativen Keimgruppen im Verhältnis zu der gesamten Keimflora
zwischen gesunden und erkrankten Augen besteht.
Tabelle 15 zeigt Art und Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und
erkrankten bzw. ehemals erkrankten Augen der Gruppen 1 und 2 bei der
Zweituntersuchung. Jeweils drei Tiere der Gruppen 1 und 2 wurden nicht zur
Zweituntersuchung vorgestellt. Es wurden insgesamt 100 Augen untersucht, davon
waren 25 klinisch erkrankt oder ehemals erkrankt.
79
Ergebnisse
Tab. 15: - Anzahl der nachgewiesenen Keime in gesunden und erkrankten Augen bei der , n [Augen] = 100
nachgewiesene Keime n [Nachweise] in gesunden
Augen Gruppe 1
n [Nachweise]
Gruppe 1
n [Nachweise]
Gruppe 2
n [Nachweise] gesamt
(davon klinisch erkrankt/ehemals erkrankt)
koag.- Staphylokokken 9 10 13 Staphylococcus aureus - 2 - 2 (2)
α-hämolys. Streptokokken 2 4 7 (4) Streptococcus equi
subsp. equi 1 - - 1 (0) Streptococcus equi
subsp.zooepidemicus - - 2 2 (0) Bacillus spp. 11 33 54 (8)
Bacillus cereus 5 5 6 16 (5) Acinetobacter spp. 9 6 18 33 (6) Pseudomonas spp. 2 1 5 (2)
Pseudomonas fluorescens - 1 1 2 (1) Flavimonas orizyhabitans - 1 - 1 (1)
Pantoea agglomerans
Gruppe 1 und 2Zweituntersuchung
in erkrankten in gesunden Augen Augen
32 (10)
1
8
2
7 6 14 27 (6) Enterobacter spp. - 1 - 1 (1) Enterococcus spp. 1 - - 1 (0)
Escherichia coli 3 6 6 15 (6) Serratia spp. 1 1 - 2 (1)
coryneforme Bakterien 2 1 3 (2) Mucor spp. 1 - - 1 (0)
Schimmelpilze - - 1 1 (0) Aspergillus spp. 1 - 1 2 (0)
Streptomyces spp. - 1 - 1 (0) Alternaria spp. - - 4 4 (0) Fusarium spp - - 4 4 (0)
Cladosporium spp. - - 3 3 (0) Sprosspilze 1 1 - 2 (1)
-
spp. : species
α-hämolys. : alphahämolysierend
koag.- : koagulasenegativ
subsp. : subspecies
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
80
Ergebnisse
In der Tabelle ist zu erkennen, dass der Nachweis von koagulasenegativen
Staphylokokken insgesamt 32 mal gelang, davon zehn mal aus erkrankten bzw.
ehemals erkrankten Augen. Bacillus spp. wurde 54 mal isoliert, dabei waren acht
Nachweise aus erkrankten Augen. Aus 27 gesunden Augen sowie sechs erkrankten
Augen gelang der Nachweis von Acinetobacter spp. . Pantoea agglomerans wurde
aus 21 gesunden und sechs erkrankten Augen isoliert. Aus zwei erkrankten sowie
drei gesunden Augen wurde Pseudomonas spp. isoliert, aus jeweils einem gesunden
und erkrankten Auge konnte Pseudomonas fluoreszens nachgewiesen werden.
Escherichia coli wurde insgesamt 15 mal isoliert, davon waren sechs Augen erkrankt
oder ehemals erkrankt. Aus gesunden Augen konnte jeweils vier mal Fusarium spp.
und Alternaria spp. nachgewiesen werden, Aspergillus wurde in zwei gesunden
Augen isoliert, sonstige Schimmelpilze aus einem gesunden Auge. Sprosspilze
wurden in jeweils einem gesunden und einem erkrankten Auge nachgewiesen.
In Tabelle 16 sind die prozentualen Anteile der nachgewiesenen Keimgruppen in
gesunden und erkrankten bzw. ehemals erkrankten Augen aus den Gruppen 1 und 2
bei der Zweituntersuchung aufgeführt.
81
Ergebnisse
Tab. 16: Gruppe 1 und 2, Zweituntersuchung – Nachweise der Keimgruppen bei gesunden und erkrankten Augen in Prozent
Keimgruppe Nachweis in
gesunden Augen [n = 75] in %
Nachweis in erkrankten Augen
[n = 25] in % p - wert
grampos. Kokken 37,3% 64% < 0,05 (*) gramneg. Stäbchen,
aerob 28% 40% > 0,05 (n.s.)
gramneg. Stäbchen, fakultativ anaerob 42,7% 56% > 0,05 (n.s.)
grampos. Stäbchen, aerob sporenbildend 73,3% 52% > 0,05 (n.s.)
grampos. coryneforme Stäbchen 1,3% 8% > 0,05 (n.s.)
Fadenpilze 18,7% 4 % > 0,05 (n.s.) Sprosspilze 1,3% 4 % > 0,05 (n.s.)
niedere Pilze 1,3% 0% > 0,05 (n.s.)
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
grampos. : grampositiv
gramneg. : gramnegativ
(*) : schwach signifikant
(n.s.) : nicht signifikant
Hier ist zu erkennen, dass in 37,3% der gesunden Augen grampositive Kokken
nachgewiesen werden konnten, in erkrankten Augen erfolgte der Nachweis zu 64%.
Der Nachweis von aeroben gramnegativen Stäbchen erfolgte in 28% der gesunden
und 40% der erkrankten Augen. Fakultativ anaerobe Stäbchen wurden aus 42,7%
der gesunden und 56% der erkrankten Augen isoliert. Obligat aerobe sporenbildende
grampositive Stäbchen wurden in 73,3% der gesunden und 52% der erkrankten
Augen nachgewiesen. Aus 1,3% der gesunden und 8% der erkrankten Augen
konnten coryneforme Bakterien isoliert werden. Der Nachweis von Fadenpilzen
gelang in 18,7% der gesunden sowie in 4% der erkrankten Augen, Sprosspilze
wurden aus 4% der erkrankten und 1,3% der gesunden Augen isoliert. Der Nachweis
niederer Pilze gelang in 1,3% der gesunden Augen.
82
Ergebnisse
Auch in der Zweituntersuchung wurden die Nachweishäufigkeiten der einzelnen
Keimgruppen in gesunden und erkrankten Augen mittels des χ2 – Tests und des
Fisher- Exact Tests statistisch untersucht. Dabei ergab sich bei den grampositiven
Kokken in erkrankten Augen ein schwach signifikant häufigerer Nachweis als in
gesunden Augen. Bei allen anderen untersuchten Keimgruppen konnten keine
signifikanten Unterschiede im Nachweis bei erkrankten und gesunden Augen
festgestellt werden.
Abbildung 15 und 16 zeigen die prozentuale Verteilung der nachgewiesenen
Keimgruppen in gesunden und erkrankten Augen bei der Zweituntersuchung.
37,30%
28%
42,70%
73,30%
1,30%
18,70%
2,60%grampos. Kokken
gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. Stäbchensporenbildendgrampos. coryneformeStäbchenFadenpilze
Sprosspilze und niederePilze
grampos. : grampositiv
gramneg. : gramnegativ
fakult. : fakultativ
Abb. 15: Gesunde Augen [n = 75] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung
83
Ergebnisse
4%4%
8%
52%
56%40%
64%
grampos. Kokken
gramneg. Stäbchen,aerobgramneg. Stäbchen,fakult.anaerobgrampos. Stäbchensporenbildendgrampos. coryneformeStäbchenFadenpilze
Sprosspilze
grampos. : grampositiv
gramneg. : gramnegativ
fakult. : fakultativ
Abb. 16: Erkrankte Augen [n = 25] - Prozentualer Anteil der nachgewiesenen Keimgruppen bei der Zweituntersuchung
In der Zweituntersuchung ist der Anteil der gramnegativen Keimgruppen im
Verhältnis zur Gesamtflora bei den erkrankten Augen höher als bei den gesunden
Augen, dieser Unterschied ist statistisch nicht signifikant.
84
Ergebnisse
4.3 Ergebnisse der zytologischen Untersuchung
Die Integrität der Zellen in den untersuchten Präparaten war größtenteils
zufriedenstellend.
Alle untersuchten Präparate beider Gruppen enthielten zu ca. 98 % Epithelzellen der
beprobten Konjunktiva palpebralis. Diese lagen sowohl einzeln als auch in größeren
Zellverbänden vor. Es konnten überwiegend ausgereifte als auch in geringerem
Prozentsatz unreife Epithelzellen der tieferen Konjunktivaschichten gefunden
werden.
Eine Übersicht über die Anteile weiterer Zellarten bei den Augen der Pferde aus
Gruppe 1 und 2 zeigt Tabelle 17.
Tab. 17 : Gruppe 1 und 2 – Nachweise verschiedener Entzündungszellen bei gesunden und erkrankten Augen (n = 112)
Vorkommende
Entzündungszellen bei n [Augen]
Gruppe 1 erkrankte Augen
[n = 28]
Gruppe 1 gesunde Augen
[n = 28]
Gruppe 2 gesunde Augen
[n = 56] neutrophile Granulozyten 3 (10,7 %) 3 (10,7 %) 3 (5,4 %)
Lymphozyten 7 (25 %) 4 (14,2 %) 6 (21,4 %) Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
Es fanden sich in Gruppe 1 bei drei erkrankten Augen (10,7 %) neutrophile
Granulozyten (Pferd Nr. 1, 5 und 17), ebenso bei drei gesunden Augen (10,7 %) aus
der Patientengruppe (Pferd Nr. 1, 17 und 20). In der Kontrollgruppe konnten
ebenfalls in drei Augen (5,4 %) neutrophile Granulozyten gefunden werden, hier
jeweils nur in einem Auge pro Pferd.
85
Ergebnisse
Lymphozyten konnten bei sieben Pferden (25 %) der Gruppe 1 (Nr. 3, 11, 16, 17, 20,
24 und 28) auf dem erkrankten Auge nachgewiesen werden, bei 4 Pferden der
Gruppe 1 (14,2 %) konnten Lymphozyten auf dem gesunden Auge gefunden werden.
In der Gruppe 2 konnten bei sechs Augen (21,4 %) vereinzelte Lymphozyten
gefunden werden, bei einem dieser Pferde auf beiden Augen, bei den anderen
Tieren jeweils nur auf einem Auge.
Eine statistische Auswertung ist hier aufgrund der zu geringen Zahlenwerte nicht
möglich. Es scheint jedoch kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von
Entzündungszellen und einer klinischen Erkrankung der Augen zu bestehen.
Die Quantität der vorkommenden Entzündungszellen bei den einzelnen Augen der
Pferde aus Gruppe 1 zeigt Tabelle 18. Dabei wurden die betroffenen Zellen in acht
Ölimmersions- Gesichtsfeldern (Vergrößerung 100 x 10) zunächst addiert und dann
ein Mittelwert gebildet. Die Werte sind durch einen Schrägstrich für klinisch erkrankte
und gesunde Augen unterteilt.
Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass die Anzahl der vorkommenden
Entzündungszellen bei allen Präparaten sehr gering ist. Bei den Patienten Nr. 1, 17
und 20 aus der Gruppe 1 kommen beide Arten der Entzündungszellen auf einem
Auge vor, dabei bei Patient Nr. 17 auf beiden Augen. Bei Patient Nr. 1 sind in den
Präparaten beider Augen neutrophile Granulozyten zu finden, nur auf dem gesunden
Auge erfolgte hier auch der Nachweis von Lymphozyten. Bei Patient Nr. 20 hingegen
sind in den Präparaten beider Augen Lymphozyten zu finden, ein gemeinschaftliches
Vorkommen mit neutrophilen Granulozyten ist wiederum nur auf dem gesunden
Auge festzustellen.
86
Ergebnisse
Tab. 18: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus Gruppe 1
Pferd Anzahl neutrophile Granulozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)
Anzahl Lymphozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)Patient 1
(erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0,5 / 0,8 0 / 0,4
Patient 3 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,8 / 0
Patient 5 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0,3 / 0 0 / 0
Patient 11 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,5 / 0
Patient 16 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,4 / 0,8
Patient 17 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0,5 / 0,4 1,6 / 1, 5
Patient 20 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0,4 0,8 / 0,8
Patient 22 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0 / 0,5
Patient 24 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,6 / 0
Patient 28 (erkranktes Auge/ gesundes Auge)
0 / 0 0,5 / 0
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
87
Ergebnisse
In Tabelle 19 ist die durchschnittliche Anzahl der Entzündungszellen bei den Pferden
der Gruppe 2 aufgeführt. Da auch hier teilweise der Nachweis auf beiden Augen
erfolgte, wurde in linkes und rechtes Auge durch einen Teilstrich unterschieden,
beide Augen sind ohne eine klinische Erkrankung.
Der Nachweis von Lymphozyten auf beiden Augen gelingt in Gruppe 2 nur bei
Kontrollpferd Nr. 5. Bei den anderen Pferden, bei denen Entzündungszellen in den
Präparaten der einzelnen Augen gefunden werden, liegen diese jeweils nur auf
einem Auge vor. Auch ein gemeinsames Vorkommen beider Zellarten in einem
Präparat kann nicht festgestellt werden, wohl aber der Nachweis beider Zellarten in
einem Pferd. So sind bei Kontrollpferd Nr. 6 auf dem rechten Auge neutrophile
Granulozyten und auf dem linken Auge Lymphozyten zu finden. Bei Kontrollpferd Nr.
15 finden sich auf dem linken Auge Lymphozyten und auf dem rechten Auge
neutrophile Granulozyten.
Tab. 19: Durchschnittliche Anzahl der vorkommenden Entzündungszellen aus acht Ölimmersions- Gesichtsfeldern bei den Pferden aus Gruppe 2
Pferd Anzahl neutrophile Granulozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)
Anzahl Lymphozyten
(Mittel von 8 Gesichtsfeldern)Kontrollpferd 3 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0,5 / 0 0 / 0
Kontrollpferd 5 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0 1,5 / 0,8
Kontrollpferd 6 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0,4 0,8 / 0
Kontrollpferd 9 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0 0,8 / 0
Kontrollpferd 13 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0 / 0 0 / 0,7
Kontrollpferd 15 (linkes Auge/ rechtes Auge)
0,4 / 0 0 / 0,5
Gruppe 2 : Kontrolltiere ohne klinische Augenerkrankung
88
Ergebnisse
In Tabelle 20 sind die zytologischen Befunde der Augen beider Gruppen den
Ergebnissen der virologischen Untersuchung gegenübergestellt, unabhängig von
einer klinischen Erkrankung.
Tab. 20: Gruppe 1 und 2 - Virologische Ergebnisse bei Augen mit dem Vorkommen von Entzündungszellen, unabhängig von einer klinischen Erkrankung
Entzündungszellen bei
n [Augen]
EHV-2 Nachweis im Wattetupfer
EHV-2 Nachweis im Cytobrush
EHV-2 Nachweis in Wattetupfer
und Cytobrush
EHV-2 Nachweis
negativ
neutrophile Granulozyten 0 2 1 6
Lymphozyten 0 3 1 13
Dabei zeigt sich, dass von neun Augen, in deren Präparaten neutrophile
Granulozyten gefunden wurden, in zwei Augen bei der virologischen Untersuchung
EHV-2 Genom im Cytobrush nachgewiesen wurde. In einem Auge gelang der
Nachweis in Cytobrush und Wattetupfer, sechs Augen blieben im Nachweis von
EHV-2 negativ.
Lymphozyten konnten in den Präparaten von insgesamt 17 Augen gefunden werden.
Davon waren zwölf Augen EHV-2 negativ, bei einem Auge gelang der Nachweis von
EHV-2 Genom in Wattetupfer und Cytobrush, bei drei Augen nur im Cytobrush.
In Präparaten von zehn Augen konnten intranukleäre Einschlusskörperchen erkannt
werden, davon waren vier Augen in der virologischen Untersuchung EHV-2 negativ.
Bei sechs Augen konnte EHV-2 Genom nachgewiesen werden, davon fünfmal im
Cytobrush sowie einmal in Cytobrush und Wattetupfer.
Eine statistische Auswertung kann aufgrund der geringen Zahlenwerte nicht erfolgen.
Es scheint jedoch kein Zusammenhang zwischen den einzelnen zytologischen
Befunden und einem Nachweis von EHV-2 Genom erkennbar zu sein.
89
Ergebnisse
Tabelle 21 stellt erkrankte Augen mit und ohne dem Symptom Konjunktivitis den
zytologischen Befunden und dem Nachweis von EHV-2 Genom gegenüber.
Tab. 21: Gruppe 1 – Zytologische Befunde bei erkrankten Augen mit und ohne Begleitsymtom Konjunktivitis in Zusammenhang mit dem Nachweis von EHV-2 Genom
erkrankte Augen mit Konjunktivitis
[n = 19]
erkrankte Augen ohne Konjunktivititis
[n = 9]
Zytologische Befunde bei
n [Augen] EHV-2 pos. EHV-2 neg. EHV-2 pos. EHV-2 neg.
neutrophile Granulozyten 2 1 0 0 Lymphozyten 1 3 0 3
Gruppe 1 : Pferde, die an einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis erkrankt sind
Dabei zeigt sich, dass bei allen drei erkrankten Augen, in deren Präparate
neutrophile Granulozyten gefunden wurden, eine Konjunktivitis vorgelegen hat. Bei
zwei dieser Augen erfolgte ein positiver Nachweis von EHV-2 Genom.
Lymphozyten konnten bei jeweils vier erkrankten Augen mit und drei Augen ohne
Konjunktivitis gefunden werden. Alle Augen ohne Konjunktivitis blieben im Nachweis
von EHV-2 negativ, bei einem Auge mit Konjunktivitis konnte EHV-2 Genom
nachgewiesen werden.
Auch hier ist aufgrund der geringen Zahlenwerte keine statistische Auswertung
möglich.
90
Ergebnisse
Auf den folgenden Seiten sind auf den Abbildungen 17 bis 22 beispielhaft
mikroskopische Darstellungen der zytologischen Befunde gezeigt.
91
Ergebnisse
Abb. 17: Epithelzellverband
Kontrollpferd Nr. 13, rechtes Auge;
Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion
Abb. 18: Lymphozyt (LZ), umgeben von Epithelzellen
Einige Zellkerne der Epithelzellen zeigen bereits eine starke Auflockerung des
Chromatins und Vakuolisierung im Zuge der eingesetzten Lysis.
Kontrollpferd 13, rechtes Auge;
Vergrößerung 100 x 10, Ölimmersion
92
Ergebnisse
Abb. 17
LZ
Abb. 18
93
Ergebnisse
Abb. 19: Einzelne Epithelzellen mit zwei neutrophilen Granulozyten (NG) und einem
Lymphozyten (LZ)
Die Epithelzellen zeigen bereits deutliche Lysiserscheinungen, die neutrophilen
Granulozyten liegen als reife segmentkernige Granulozyten vor.
Patient Nr. 1, linkes Auge (klinisch gesund)
Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion
Abb. 20: Lymphozyt (LZ) neben Epithelzellverband
Patient Nr. 1, linkes Auge (klinisch gesund)
Vergrößerung 100 x 10, Ölimmersion
94
Ergebnisse
Abb. 19
Abb. 20
NG
LZ
LZ
95
Ergebnisse
Abb. 21: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen
In den Epithelzellen liegen als Nebenbefund zytoplasmatische Melanineinschlüsse
(M) vor; diese können in einer Vielzahl der Präparate beobachtet werden und haben
keine klinische Relevanz.
Patient Nr. 17, linkes Auge (klinisch gesund);
Vergrößerung 100x 10, Ölimmersion
Abb. 22: Lymphozyten (LZ) zwischen Epithelzellen liegend
Die Epithelzellen zeigen bereits deutliche Lysiserscheinungen.
Kontrollpferd Nr. 9, linkes Auge;
Vergrößerung 40 x 10, Ölimmersion
96
Ergebnisse
LZ M
Abb. 21
LZ
LZ
Abb. 22
97
Diskussion
5 Diskussion 5.1 Material und Methode In der vorliegenden Arbeit wurden im Zeitraum von April 2001 bis April 2003 in der
Klinik für Pferde der tierärztlichen Hochschule Hannover 56 Pferde untersucht. Diese
wurden in zwei Gruppen unterschieden.
Gruppe 1 (n = 28) beinhaltet Tiere, die klinisch an einer Keratitis, Keratokonjunktivitis
oder Konjunktivitis erkrankt waren. Vier dieser Tiere sind Maultiere, die eine Keratitis
punctata seu maculosa aufwiesen. Maultiere gehören zur Familie der Equiden und
es besteht eine direkte Verwandschaft zum Pferd aufgrund der Züchtung mit
Pferdestute und Eselhengst. Eine Infektion mit equinen Herpesviren ist bei Eseln und
Kreuzungen beider Arten möglich, so dass die Maultiere in die Patientengruppe mit
aufgenommen wurden.
In dieser Gruppe wurden 10 Stuten und 18 Wallache untersucht, das
durchschnittliche Alter beträgt 9,7 Jahre.
Gruppe 2 (n = 28) besteht aus Pferden, die klinisch keine Augenerkrankung
aufwiesen und als Kontrollgruppe untersucht wurden. Es wurden 9 Stuten und 21
Wallache untersucht, das durchschnittliche Alter liegt bei 8,4 Jahren.
In einer ähnlichen Studie, in der 29 Pferde mit Keratitis sowie 21 klinisch
augengesunde Pferde untersucht wurden, konnte VON OPPEN (2000) bereits einen
Zusammenhang vom Nachweis von EHV-2 Genom mit dem Auftreten von
Keratitiden beim Pferd darstellen. Im Gegensatz dazu untersuchte BESTHORN
(2002) in einer jüngeren Studie 96 pathologisch veränderte und 129 klinisch gesunde
Augen von insgesamt 148 Pferden und konnte keinen signifikanten Zusammenhang
zwischen dem Nachweis von EHV-2 oder EHV-5 und Keratitiden beim Pferd
feststellen.
Sonstige Autoren berichten über den Nachweis von EHV-2 bei Keratitiden oder
Keratokonjunktivitiden nur in Fallberichten über Einzeltiere (THEIN und BÖHM 1976,
COLLINSON et al. 1994, MILLER et al. 1990).
98
Diskussion
Die Probenentnahme am Auge für die virologische PCR-Untersuchung wurde sowohl
bei VON OPPEN (2000) als auch bei BESTHORN (2002) durch Entnahme von
Augensekret mittels eines Wattetupfers aus dem Konjunktivalsack durchgeführt.
Diese Methode der Materialgewinnung stellt einen wenig invasiven Eingriff dar, der
die Verletzungsgefahr minimiert. Entnahmen von Hornhautgeschabseln erforderten
aufgrund der Verletzungsgefahr bei Abwehrbewegungen des Pferdes aufwendigere
Zwangsmaßnahmen.
Auch COLLINSON et al. (1994) führte die Probenentnahme am Auge für die
virologische Untersuchung mit Wattetupfern durch.
Der Einsatz des Cytobrushs wird bei BAUER (2001) und WILLIS et al. (1997) zur
Gewinnung von Zellmaterial für zytologische Untersuchungen beschrieben. Auch in
der Humanmedizin wird der Cytobrush unter anderem zur Gewinnung von
Konjunktivalzellen eingesetzt (TSUBOTA et al. 1990). Beim Pferd beschreiben
BOLLIGER et al. (2000) die Gewinnung von zytologischen Präparaten mittels
Cytobrush zur Diagnostik von Keratomykosen.
Eine virologische Untersuchung der gewonnenen Cytobrush- Proben wurde bisher
nicht beschrieben.
In dieser Arbeit wurden für die virologischen Untersuchungen sowohl Wattetupfer als
auch Cytobrush- Proben aus dem Konjunktivalsack des Auges entnommen. Dieser
Vergleich sollte zeigen, ob mit der Gewinnung von mehr Probenmaterial durch den
Cytobrush auch ein zuverlässigerer Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR
möglich ist und damit möglicherweise eine bessere Methode zur virologischen
Diagnostik bei Keratitiden des Pferdes darstellt. Außerdem sollte überprüft werden,
ob mit dieser Methode ein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und
einem klinischem Erscheinungsbild erkennbar ist. VON OPPEN (2000) hatte gezeigt,
dass es im Gegensatz zum Menschen und zur Katze bisher kein pathognomonisches
Bild einer „Viruskeratitis“ beim Pferd gibt.
99
Diskussion
Als weiteres diagnostisches Verfahren bei verschiedenen Erkrankungen des Auges
beim Menschen wie beispielsweise der Keratokonjunktivitis sicca, Herpes zoster
Keratitiden oder Chlamydienkonjunktivitis wird als schnelles und wenig aufwendiges
Verfahren die exfoliative Zytologie genutzt (ADAMS et al. 1988, MASKIN et al. 1989,
WILHELMS et al. 1986).
Auch beim Kleintier wird die exfoliative Zytologie erfolgreich zur Diagnostik genutzt.
So gibt es Studien über Verteilung und Quantifizierung von Becherzellen bei Hunden
mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996). WILLIS et al. (1997) untersuchten
bei Hunden und Katzen zytologische Präparate bei entzündlichen Erkrankungen des
Auges. Beim Pferd wird diese Methode bisher nur in Einzelfällen angewandt. So
beschreibt KELLNER (1990) als schnelleres Verfahren zur Diagnostik von
Herpeskeratitiden die Färbung eines Bindehautgeschabsels zum mikroskopischen
Nachweis von Herpesviruseinschlusskörperchen. BOLLIGER et al. (2000)
beschreiben die Zytologie beim Pferd zum Nachweis von Pilzmycel bei
Keratomykosen. KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleichen in einer Studie mit 15
Pferden die Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und EHV-5 mittels PCR in
Verbindung mit dem Vorhandensein von intranukleären Einschlusskörperchen im
zytologischen Präparat, konnte dabei jedoch keinen Zusammenhang nachweisen.
In dieser Arbeit wurden zusätzlich zu den für die virologischen Untersuchungen
entnommenen Cytobrush-Proben jeweils ein weiterer Cytobrush aus dem
Konjunktivalsack entnommen und auf einem Objektträger für die zytologische
Untersuchung ausgerollt.
Die für die mikrobiologischen Untersuchungen aus dem Konjunktivalsack
entnommenen Wattetupfer dienen zum Nachweis des vorhandenen Keimspektrums
vergleichend in gesunden und klinisch erkrankten Augen und wurden, um
Verfälschungen durch Lokalanästhesie und mechanische Manipulation zu
vermeiden, vor den Proben zur virologischen Untersuchung entnommen.
100
Diskussion
5.2 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels PCR Das equine Herpesvirus Typ 2 wird in der Literatur immer wieder als Verursacher von
Keratitiden oder Keratokonjunktivitiden des Pferdes diskutiert (THEIN und BÖHM
1976, MILLER et al. 1990, COLLINSON et al. 1996, VON OPPEN 2000). Dabei wird
von vielen Autoren als klinisches Bild einer „Viruskeratitis“ eine Keratitis punctata
oder Keratitis maculosa vermutet (SCHMIDT 1988, KELLNER 1990, BARNETT
1998). Dabei handelt es sich aber offensichtlich um Analogschlüsse zum Menschen
und Kleintier, für die bisher die Bestätigung fehlt, da beim Pferd bisher im Gegensatz
zu Mensch und Katze kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2 und
einem klinischen Bild einer „Viruskeratitis“ nachgewiesen werden konnte (VON
OPPEN 2000, KERSHAW et al. 2001). Wurde in früheren Studien zunächst mittels
PCR ein signifikant häufigerer Nachweis von EHV-2 Genom bei Pferden, die an einer
Keratitis erkrankt waren, im Vergleich zu einer augengesunden Kontrollgruppe
geführt (VON OPPEN 2000, KRÜDEWAGEN et al. 2001), so kann in einer jüngeren
Studie mittels PCR kein signifikanter Unterschied im Nachweis von EHV-2 bei
augengesunden und an einer Keratitis erkrankten Pferden dargestellt werden
(BESTHORN 2002).
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Probenmaterialien auf das
Vorhandensein von EHV-2 Genom bei an einer Keratitis, Konjunktivitis oder
Keratokonjunktivitis erkrankten Pferden sowie bei einer augengesunden
Kontrollgruppe mittels PCR untersucht.
Dabei wurden in der Erstuntersuchung im Wattetupfer, der aus dem Konjunktivalsack
entnommen wurde, bei 25 % der erkrankten Pferde sowie bei 7, 1 % der
augengesunden Pferde EHV-2 Genom nachgewiesen. Der gleichfalls aus dem
Bindehautsack entnommene Cytobrush war bei 57,1 % der erkrankten Tiere sowie
bei 60,7 % der gesunden Tiere positiv im Nachweis von EHV-2. In der
Zweituntersuchung konnte im Wattetupfer bei 28% der erkrankten sowie bei 14,3 %
der gesunden Pferde ein positiver Nachweis erfolgen. Im Cytobrush gelang der
Nachweis bei 13 % beider Untersuchungsgruppen.
101
Diskussion
Bei diesen Werten werden, ähnlich wie in der Studie von VON OPPEN (2000),
zunächst nicht einzelne Augen unterschieden, der Nachweis auf einem oder beiden
Augen gilt für das Einzeltier als positiv, unabhängig davon, welches Auge erkrankt
war. Sowohl im Wattetupfer als auch im Cytobrush bestehen zu beiden
Untersuchungszeitpunkten keine signifikanten Unterschiede im Vergleich von
erkrankten zu augengesunden Tieren, wobei der Nachweis im Wattetupfer bei der
Erstuntersuchung im Vergleich der erkrankten und gesunden Tiere auf den ersten
Blick auffällig erscheint, statistisch hier jedoch keine Signifikanz nachzuweisen ist.
Auch in den weiterhin untersuchten Proben (Nasentupfer, periphere Blutleukozyten)
konnten weder in der Erst- noch in der Zweituntersuchung signifikante Unterschiede
im Nachweis von EHV-2 zwischen beiden Untersuchungsgruppen dargestellt
werden.
Insgesamt wurden mit den verschiedenen untersuchten Probenmaterialien in der
Erstuntersuchung bei 67, 9 % der erkrankten und 82, 1 % der gesunden Pferde EHV-
2 Genom nachgewiesen. In der Zweituntersuchung wurden bei 64 % der erkrankten
und 72 % der gesunden Pferde der Nachweis von EHV-2 Genom geführt.
Diese Ergebnisse sind abweichend von Ergebnissen früherer Studien (VON OPPEN
2000, KRÜDEWAGEN 2001), in denen bei erkrankten Pferden der Nachweis von
EHV-2 signifikant häufiger geführt werden konnte. Sie bestätigen jedoch eine jüngere
Studie, in der ebenfalls kein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von EHV-2
Genom und dem Vorliegen einer Keratitis oder Keratokonjunktivitis festgestellt
werden konnte (BESTHORN 2002).
Im Vergleich der untersuchten Proben untereinander interessierte vor allem die
Nachweishäufigkeit von EHV-2 im Wattetupfer vergleichend zur Nachweishäufigkeit
im Cytobrush. Dabei wurde nicht in klinisch erkrankte und gesunde Augen
unterschieden, sondern nur in positiven und negativen EHV-2 Nachweis mittels PCR.
Beide Proben wurden durch vorsichtiges Drehen im Bindehautsack zur Aufnahme
von Augensekret und Zellmaterial gewonnen. Dabei gelang zu beiden
Untersuchungszeitpunkten ein signifikant (p< 0,01) häufigerer Nachweis im
Cytobrush als im gleichzeitig entnommenen Wattetupfer. In der Erstuntersuchung
war in beiden Gruppen zusammengefasst der Cytobrush bei 40 Augen positiv im
102
Diskussion
Nachweis von EHV-2, während von diesen Augen nur sieben mal der Wattetupfer
ebenfalls einen positiven Nachweis erbrachte. Von 72 Augen, die im Cytobrush EHV-
2 negativ blieben, waren 70 auch im Wattetupfer EHV-2 negativ. In der
Zweituntersuchung wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. So blieben von 34 Augen,
die im Cytobrush EHV-2 positiv waren, 28 Augen im Wattetupfer EHV-2 negativ.
Diese Zahlen zeigen, dass der Cytobrush offensichtlich eine wesentlich sensitivere
Methode der Probenentnahme zum Nachweis von EHV-2 Genom darstellt. Da der
Cytobrush in der Probengewinnung immer erst nach dem Wattetupfer eingesetzt
wurde, kann der Grund dafür nicht in bereits entfernten Sekret- und Zellbestandteilen
durch vorangegangene Probenentnahmen liegen. Durch die Nylonborsten des
Cytobrushs können jedoch wesentlich mehr Sekret und Zellbestandteile gewonnen
werden als mit dem herkömmlichen Wattetupfer.
Für EHV-2 werden für die Viruslatenz verschiedene Orte vermutet, so unter anderem
Leukozyten, Lungenmakrophagen und das Ziliar- und Trigeminusganglion
(BROWNING und STUDDERT 1987, REUBEL et al. 1995, BORCHERS et al. 1997
RIZVI et al. 1997). Möglicherweise besteht für EHV-2 eine Viruslatenz auch in den
Epithelzellen der Konjunktiva, so dass durch die vermehrte Aufnahme von
Zellmaterial, auch aus den tieferen und damit „jüngeren“ Epithelschichten, hier ein
derartig signifikant häufigerer Nachweis von EHV-2 Genom mittels PCR im
Cytobrush gelang.
Diese Arbeit zeigt, dass durch die signifikant höhere Nachweisrate von EHV-2 mittels
des Cytobrushs sowohl in erkrankten als auch in gesunden Augen zwar eine
offensichtlich sensitivere Methode beschrieben wird, die klinische Relevanz des
EHV-2 jedoch bei Keratitiden des Pferdes zumindest als alleiniger Verursacher in
Frage gestellt werden muss.
103
Diskussion
5.3 Ergebnisse der virologischen Untersuchungen mittels Virusanzucht Die für die Virusanzucht bestimmten Cytobrush- Proben wurden in dem gleichen
Verfahren gewonnen wie die Proben für die PCR Untersuchung.
Die Anzucht von EHV-2 gelang nur in einem Fall bei einem augengesunden
Kontrolltier.
Der Nachweis von vermehrungsfähigem EHV-2 mittels Anzuchtverfahren stellt
bereits im Vorfeld deutlich höhere Ansprüche an die Probenverarbeitung. Exogene
Einflüsse wie Transportdauer, Temperatur, Kontamination des Probenmaterials etc.
können bereits im Vorfeld zu ausreichender Schädigung des eventuell vorhandenen
vermehrungsfähigen Virusmaterials führen. Weiterhin ist in der relativ langen
Inkubationszeit des Anzuchtverfahrens ausreichend Raum für weitere schädigende
Faktoren. Dieses Verfahren stellt damit eine für äußere Einflüsse wesentlich
anfälligere Methode dar als die zum Nachweis von Virusgenom eingesetzte PCR.
Dennoch wäre es wissenschaftlich interessant, wenn durch Anzuchtverfahren eine
genauere Spezifizierung der EHV-2 Stämme in erkrankten und gesunden Augen
gelingen könnte. Dies könnte dann vielleicht in weiteren Untersuchungen eine
genauere Beurteilung der Pathogenität einzelner Stämme erlauben.
5.4 Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen Das Milieu des Bindehautsackes ist physiologischerweise nicht steril. Bereits in
vorangegangenen Studien wurden bei augengesunden Tieren vor allem
Staphylokokken, Corynebakterien, Streptokokken sowie Bacillus spp., Nesseria spp.
und Enterobacteriaceae nachgewiesen (WHITLEY et al. 1983, BARNETT et
al.1998). Bei BARNETT et al. (1998) werden als häufig aus erkrankten Augen
isolierte Keime ebenfalls Staphylokokken, Streptokokken, Pseudomonaden,
Moraxellen sowie Bacillus spp. aufgeführt, diese benötigen jedoch begünstigende
Faktoren, um pathogen zu wirken.
104
Diskussion
Auch Pilze können in einer Studie von SAMUELSON et al. (1984) bei 95 %
augengesunder Tiere gefunden werden. BARNETT et al. (1998) geben an, dass
gramnegative Keime häufiger von erkrankten als gesunden Augen isoliert werden
können. Auch MOORE et al. (1983) wiesen in 37 Fällen mit ulzerativen Keratitiden
überwiegen gramnegative Keime nach.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass grampositive Kokken in 59,5 %
der gesunden und 82,1 % der erkrankten Augen zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung
nachgewiesen werden konnten. Bei der Zweituntersuchung erfolgte der Nachweis
grampositiver Kokken in 37,3 % der gesunden und 64 % der erkrankten bzw.
ehemals erkrankten Augen. Diese Werte zeigen zu beiden
Untersuchungszeitpunkten einen schwach signifikant höheren Nachweis
grampositiver Kokken in erkrankten Augen.
Der Nachweis von grampositiven aerob sporenbildenden Stäbchen, gramnegativen
aeroben sowie fakultativ anaeroben Stäbchen, coryneformen Bakterien, Fadenpilzen,
Sprosspilzen und niederen Pilzen erfolgte in beiden Untersuchungsgruppen mit
keinem signifikanten Unterschied.
Der kulturelle Gehalt der nachgewiesenen Keime wurde in geringgradig, mittelgradig
und hochgradig unterschieden. Der Nachweis von hochgradigem Gehalt erfolgte
sowohl bei gesunden als auch erkrankten Augen überwiegend bei Streptokokken,
Staphylokokken sowie bei Acinetobacter spp., Pantoea spp. und Escherichia coli. Bei
zwei der erkrankten Augen lag auch ein hochgradiger Gehalt an Pseudomonas spp.
vor. In gering- und mittelgradiger Menge konnten Pseudomonaden sowohl in
erkrankten als auch gesunden Augen isoliert werden.
Die Art und prozentuale Verteilung der nachgewiesenen Keime bestätigen zum
großen Teil die in der Literatur beschriebenen Beobachtungen. Allerdings lässt sich
in dieser Studie bei erkrankten Augen nicht, wie beschrieben, ein häufigerer
Nachweis gramnegativer Bakterien führen. Vielmehr sind hier in erkrankten Augen
Staphylokokken und Streptokokken schwach signifikant häufiger als in gesunden
Augen nachzuweisen. Die klinische Relevanz an einer bestehenden
Hornhauterkrankung lässt sich daraus jedoch nicht ohne weiteres ableiten. Alle hier
105
Diskussion
nachgewiesenen Keime sind nur fakultativ pathogen und brauchen begünstigende
Faktoren, um maßgeblich an einer Erkrankung der Hornhaut und/oder Konjunktiva
beteiligt zu sein. Im Gegensatz dazu ist beim Rind und Schaf die infektiöse
Keratokonjunktivitis (Weidekeratitis) beschrieben, als dessen wichtigster primärer
Erreger Moraxella bovis angesehen wird (ROLLE und MAYR, 1993). In den USA ist
eine primäre Konjunktivitis durch Moraxella equi beschrieben (BARNETT et al.
1998).
Begünstigende Faktoren können in einer wegbereitenden Virusinfektion, in einer
Immunsupression, eventuell durch eine systemische Erkrankung oder durch
vorangegangene lokale Cortikoid- Behandlungen, oder in einer Vorschädigung der
Hornhaut durch mechanische Verletzung o. ä. liegen.
Auch die Menge der fakultativ pathogen wirkenden Keime kann einen Einfluss auf
die klinische Erkrankung haben. Hierbei ist auch der klimatische Einfluss
beispielsweise bei sehr warmer oder feuchter Witterung von Bedeutung, die
ebenfalls eine Auswirkung auf die Keimmenge ausüben können und durch die
Verbreitung über Vektoren wie beispielsweise Weidefliegen einen zusätzlichen
Keimdruck verursachen können.
Eine Entnahme von mikrobiologischen Tupferproben aus dem Bindehautsack ist, wie
diese Arbeit zeigt, häufig sehr unspezifisch und lässt auch bei klinisch erkrankten
Augen nicht immer einen Rückschluss auf die tatsächlich an einer Erkrankung
beteiligten Keime zu. Sinnvoller wäre bei Vorliegen einer ulzerativen
Hornhauterkrankung die Probenentnahme direkt von den erkrankten Bereichen der
Kornea, um beispielsweise bei Nachweisen von kollagenasebildenden Bakterien
(z.B. Pseudomonaden) mit einem Antibiogramm gezielter eine Therapie einleiten zu
können. Auch sollte die nachgewiesene Keimmenge in der Beurteilung der
mikrobiologischen Ergebnisse unter Berücksichtigung klimatischer Faktoren und
eventueller antibiotischer Vorbehandlungen mit einbezogen werden.
Auch der Nachweis von Pilzen in der Kultur lässt keinesfalls bereits die Diagnose
einer Hornhautmykose zu. Erst der Nachweis von Pilzmycel im zytologischen
Präparat (BOLLIGER et al. 2001) kann eine derartige Diagnose bestätigen.
106
Diskussion
Diese Arbeit bestätigt einmal mehr, dass die Auswertung eines mikrobiologischen
Tupfers aus dem Konjunktivalsack keinesfalls einen direkten Rückschluss auf die
Ursache einer vorliegenden Augenerkrankung zulässt und deswegen immer
differenziert betrachtet und beurteilt werden sollte.
5.5 Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen
Beim Menschen wird als weiteres diagnostisches Verfahren bei verschiedenen
Augenerkrankungen wie beispielsweise der Keratokonjunktivitis sicca, Herpes zoster
Keratitiden oder Chlamydienkonjunktivitis als schnelle und wenig aufwendige
Methode die exfoliative Zytologie genutzt (ADAMS et al. 1988, MASKIN et al. 1989,
WILHELMS et al. 1986).
Auch beim Kleintier wird die exfolitive Zytologie erfolgreich zur Diagnostik eingesetzt.
So gibt es Studien über Verteilung und Quantifizierung von Becherzellen bei Hunden
mit Keratokonjunktivitis sicca (BAUER et al. 1996). Auch WILLIS et al. (1997)
untersuchten bei Hunden und Katzen zytologische Präparate bei entzündlichen
Erkrankungen des Auges und konnten dabei signifikante Unterschiede in
Zellquantität und –qualität feststellen, sowohl im Vergleich der Patienten- und
Kontrollgruppen als auch im Vergleich der Spezies Hund und Katze.
Bei einigen Katzen erfolgte der Nachweis von Chlamydien im Präparat, bei einem
Hund konnte das Staupevirus in Form von intranukleären Einschlusskörperchen
nachgewiesen werden (WILLIS et al. 1997).
Beim Pferd wird diese Methode bisher nur in Einzelfällen angewandt. So beschreibt
KELLNER (1990) als schnelleres Verfahren zur Diagnostik von Herpeskeratitiden die
Färbung eines Bindehautgeschabsels zum mikroskopischen Nachweis von
Herpesviruseinschlusskörperchen. BOLLIGER et al. (2000) beschreiben die
Zytologie beim Pferd zum Nachweis von Pilzmycel bei Keratomykosen.
KRÜDEWAGEN et al. (2001) vergleicht in einer Studie mit 30 Pferden die
Nachweismöglichkeiten von EHV-2 und EHV-5 mittels PCR in Verbindung mit dem
Vorhandensein von intranukleären Einschlusskörperchen im zytologischen Präparat,
konnte dabei jedoch keinen Zusammenhang nachweisen.
107
Diskussion
Die Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei
Pferden, die an einer Keratitis erkrankt waren, sehr wenig inflammatorische Zellen im
Präparat zu finden sind, selbst dann, wenn eine begleitende Konjunktivitis
vorgelegen hat. Es ließen sich keine auffälligen Unterschiede beim Vergleich der
Präparate zwischen den klinisch erkrankten und klinisch gesunden Augen feststellen.
In der Literatur beschriebene intranukleäre Einschlusskörperchen (KELLNER 1990,
KRÜDEWAGEN et al. 2001) ließen sich nicht mit Sicherheit nachweisen. Bei
wenigen Pferden wäre der Verdacht auf solche Einschlusskörperchen möglich
gewesen, eine Unterscheidung zu Kernkörperchen (Nukleoli) oder
Chromatinverdichtungen bei lytischen Zellen konnte hier aber nicht mit Sicherheit
erfolgen.
Eine mögliche Erklärung für das nur vereinzelte Auftreten von Entzündungszellen
(neutrophile Granulozyten und Lymphozyten) lässt sich vielleicht darin finden, dass
hier nicht die erkrankte Kornea, sondern die Conjunctiva palpebralis beprobt wurde.
Selbst beim Vorliegen einer klinischen Konjunktivitis äußert sich diese hauptsächlich
in einer Hyperämie und damit zwar mit einer Rötung und Schwellung der Bindehäute,
aber eine wirkliche mukopurulente Exsudation bleibt in vielen Fällen aus, der
Charakter des Augenausflusses wird meist als serös bis seromukös beschrieben. Im
Gegensatz dazu wird beim Kleintier häufig bei Vorliegen einer Keratokonjunktivitis
eine oft starke mukopurulente Exsudation beobachtet.
Wenn bei den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Pferden Epiphora vorgelegen
hat, so äußerte sich diese meist mit serösem bis seromukösem Augenausfluss. Dies
lässt zwar auf eine eventuell durch die Hyperämie und den Schmerzreiz verursachte
vermehrte Sekretion der Tränendrüsen (seröse Komponente), Meibomschen Drüsen
(Fettkomponente) und Becherzellen der Konjunktiva (muköse Komponente)
schließen, eine durch verschiedene Mediatoren bedingte massive Auswanderung der
Entzündungszellen aus den kapillären Blutgefäßen ins umliegende epitheliale
Gewebe scheint jedoch hier auszubleiben. Hierbei bleibt außerdem zu beachten,
dass ein Großteil der erkrankten Pferde als Überweisungspatienten bereits längere
Zeit erkrankt waren und somit bereits ein chronischer Erkrankungszustand vorlag.
108
Diskussion
Offenbar handelt es sich beim Pferd im Gegensatz zum Kleintier häufig um einen
lokal auf die Hornhaut konzentrierten Entzündungsprozess, so dass die klinisch oft
beobachtete begleitende Konjunktivitis überwiegend auf eine Rötung durch
reflektorische Hyperämie zu erklären ist.
Die exfoliative Zytologie von der Conjunctiva palpebralis kann den Ergebnissen
dieser Arbeit zur Folge als Routinediagnostik von möglicherweise viral bedingten
Keratitiden bisher nicht eingesetzt werden. Beim Vorliegen von bestimmten
Erkrankungen des Auges wie beispielsweise der Keratomykose, eosinophilen
Granulomen oder Neoplasien im Bereich der Hornhaut und Konjunktiva (z. B.
Plattenepithelkarzinom) stellt sie jedoch ein sicheres und schnelles Verfahren zur
Sicherung einer Verdachtsdiagnose dar.
5.6 Schlussfolgerung Die Ergebnisse dieser Arbeit geben keine Hinweise auf eine tatsächlich bestehende
ätiologische Rolle des EHV-2 bei Keratitiden des Pferdes. Auch konnte kein
klinisches Bild einer vermeintlichen „Viruskeratitis“ mit einem vermehrten Nachweis
von EHV-2 in Zusammenhang gebracht werden. In früheren Studien durchgeführte
Infektionsversuche mit EHV-2 haben bis jetzt nicht ergeben, dass sich eine Keratitis
entwickeln könnte. WILCOX und RAIDAL (2001) diagnostizierten nur milde
respiratorische Symptome, BORCHERS et al. (1998) stellten bei zwei infizierten
Ponies eine Konjunktivitis fest. Allerdings kann in Verbindung mit jeder
Allgemeininfektion eine Hyperämie der Bindehäute auftreten (LAVACH 1992,
BROOKS 1998).
Diese Ergebnisse der virologischen Untersuchungen stehen im Gegensatz zu
früheren Untersuchungen, in denen bei Pferden mit einer Keratitis ein signifikant
häufigerer Nachweis von EHV-2 gelang als bei augengesunden Kontrollpferden
(VON OPPEN 2000, KRÜDEWAGEN et al. 2001).
109
Diskussion
In einer jüngeren Arbeit von BESTHORN (2002) konnten jedoch ähnliche Ergebnisse
wie in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden. Sonstige Autoren berichten nur in
einzelnen Fallberichten über den Nachweis von EHV-2 bei Keratitiden (THEIN und
BÖHM 1976, MILLER 1990, COLLINSON 1994). Da auch in dieser Arbeit in einem
großen Prozentsatz der gesunden Pferde EHV-2 Genom aus dem Auge isoliert
werden konnte, stellt sich die Frage, ob der Nachweis in Einzelfällen nur zufällig
zusammen mit einer klinischen Erkrankung der Hornhaut erfolgte.
Weiterhin wäre auch die mögliche ätiologische Beteiligung anderer Faktoren zu
untersuchen. So werden beispielsweise beim Menschen Adenoviren für klinische
Veränderungen der Hornhaut im Sinne einer Keratitis punctata verantwortlich
gemacht (SUNDMACHER et al. 2001). Beim Pferd werden Adenoviren bisher eher
mit respiratorischen Symptomen in Zusammenhang gebracht (ROLLE u. MAYR
1993). Auch sollten andere epitheliotrope Herpesviren wie beispielsweise EHV-1 und
EHV-4 beachtet werden, deren Pathogenität bereits in anderen klinischen
Zusammenhängen nachgewiesen ist. In der Literatur finden sich hier einzelne
Berichte, die Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Infektionen mit EHV-1
und – 4 und der Beteiligung an Augenerkrankungen liefern. So zeigte ein intranasal
mit EHV-1 infiziertes SPF-Fohlen nach 28 Tagen schwere Chorioretinopathien,
postmortal konnte im Augengewebe EHV-1 Genom nachgewiesen werden (SLATER
et al. 1992). RIIS (1981) beschreibt EHV-1 als Ursache für eine Keratitis. Neben der
Isolierung aus Geweben des Respirationstraktes gelang auch die Isolierung von
EHV-4 aus Kornea und Konjunktiven von Fohlen, die in der akuten Phase einer
experimentellen Infektion getötet wurden (PATEL et al. 1982).
Auch wäre eine mögliche Beteiligung von Chlamydien oder Mykoplasmen, wie sie
beim Menschen oder der Katze bereits diskutiert werden, zu untersuchen. Da eine
Vielzahl der Fälle bei der Behandlung mit Virostatika eine schnelle klinische
Besserung zeigt (BARNETT et al. 1993), ist es durchaus auch denkbar, dass erst
durch Co- Faktoren eine klinische Erkrankung durch EHV-2 ausgelöst wird. Auch
eine Bestimmung der Virusmenge im Probenmaterial oder eine nähere
Spezifizierung des Virustammes könnte in Relation zum klinischen Bild gesetzt
werden.
110
Diskussion
Letztlich könnten auch immunologische Mechanismen beispielsweise durch
vermehrte Expression von inflammatorischen Zytokinen oder Komplexbildungen in
der Hornhaut auslösend für eine klinische Erkrankung sein. Dieser Mechanismus ist
beim Menschen bereits beim Vorhandensein chronischer rheumatischer
Erkrankungen und dem rezidivierenden Auftreten von Hornhautulzera beschrieben
(PRADA et al. 2003).
Die exfoliative Zytologie könnte trotz der bisher ungenügenden Ergebnisse
weitergeführt werden. Es wäre beispielsweise möglich, durch Spezialfärbungen
Chlamydien oder Mykoplasmen nachzuweisen, oder mit Immunfluoreszenzmethoden
möglicherweise vorliegende Viruseinschlusskörperchen zuverlässig zu identifizieren.
Zur Sicherung spezieller Verdachtsdiagnosen wie beispielsweise einer
Keratomykose oder eosinophilen Keratitis stellt diese Methode ein sicheres, wenig
aufwendiges und wenig invasives Verfahren dar.
Insgesamt bleibt die Ätiologie der Keratitiden des Pferdes nach wie vor unklar und
sollte in zukünftigen Untersuchungen weiter erforscht werden, ohne sich dabei
jedoch zu sehr auf den alleinigen Nachweis von EHV-2 zu konzentrieren. Auch das
equine Herpesvirus Typ 5 (EHV-5) wurde bereits in einigen Studien ohne erkennbare
Beteiligung an einer Hornhauterkrankung nachgewiesen (KRÜDEWAGEN et al.
2001, BESTHORN 2002) und scheint bei Keratitiden keine klinische Relevanz zu
haben.
Für die virologischen Untersuchungen bleibt anzumerken, dass statt eines
Wattetupfers der Einsatz des Cytobrushs deutliche Vorteile aufgrund der höheren
Sensitivität im Nachweis von Virusmaterial aufweist. Da die Probenentnahme keine
größeren Schwierigkeiten als die Entnahme eines Wattetupfers aus dem
Bindehautsack darstellt, sollte man diese Methode dem Wattetupfer vorziehen, um
zuverlässigere Nachweisergebnisse zu erzielen.
111
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Myriam von Borstel (2003): Erweiterte Diagnostikverfahren bei Keratitiden des Pferdes unter besonderer Berücksichtigung der Nachweishäufigkeit des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) Bei verschiedenen Formen von Keratitiden oder Keratopathien des Pferdes wird in
vielen Fällen eine virale Ätiologie vermutet. In der Literatur wird dabei als möglicher
Verursacher das equine Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) diskutiert. Bisher konnte jedoch
kein spezifisches klinisches Bild einer „Viruskeratitis“ mit dem Nachweis von EHV-2
in Zusammenhang gebracht werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde bei 28 Pferden mit einer Keratitis,
Keratokonjunktivitis oder Konjunktivitis (Gruppe 1) sowie 28 Kontrollpferden ohne
klinische Augenerkrankung (Gruppe 2) zweimal im Abstand von vier Wochen eine
klinische Allgemeinuntersuchung und spezielle ophthalmologische Untersuchung
durchgeführt. Dabei wurden jeweils aus dem Konjunktivalsack beider Augen
Wattetupfer zur mikrobiologischen Untersuchung sowie Wattetupfer und
Cytobrushproben zur virologischen Untersuchung auf EHV-2 Genom mittels nPCR
entnommen. Ferner wurden noch Nasentupfer und periphere Blutleukozyten mittels
nPCR auf EHV-2 Genom untersucht. Außerdem wurde bei der Erstuntersuchung
mittels Cytobrush ein zytologischer Abstrich aus dem Konjunktivalsack angefertigt
und mikroskopisch untersucht.
Im Vergleich der Pferde der Gruppe 1 zu den augengesunden Kontrolltieren der
Gruppe 2 konnte in keiner der untersuchten Proben ein signifikanter Unterschied im
Nachweis von EHV-2 Genom mittels nPCR festgestellt werden.
Bei den aus dem Konjunktivalsack entnommenen Proben konnte zu beiden
Untersuchungszeitpunkten im Cytobrush signifikant (p < 0,01) häufiger der Nachweis
von EHV-2 Genom im Vergleich zum ebenfalls entnommenen Wattetupfer geführt
werden.
112
Zusammenfassung
Bei den mikrobiologischen Untersuchungen konnte in erkrankten Augen zu beiden
Untersuchungszeitpunkten ein schwach signifikant (p < 0,05) häufigerer Nachweis
von grampositiven Kokken erfolgen. Die Auswertungen der mikrobiologischen
Untersuchungen zeigen, dass eine große Vielzahl verschiedener Keime sowohl in
erkrankten als auch in klinisch gesunden Augen nachzuweisen sind und eine
Auswertung eines mikrobiologischen Konjunktivaltupfers immer unter
Berücksichtigung des klinischen Erscheinungsbildes erfolgen sollte, da keine der
nachgewiesenen Keime als obligat pathogen einzustufen sind.
Bei den mikroskopischen Untersuchungen der zytologischen Präparate sind auch in
den erkrankten Augen, welche eine begleitende klinische Konjunktivitis aufwiesen,
nur sehr wenig inflammatorische Zellen zu finden. Nur in wenigen Fällen konnten
vereinzelte Lymphozyten oder neutrophile Granulozyten gefunden werden, dabei ließ
sich kein Unterschied im Vergleich von erkrankten und gesunden Augen feststellen.
Eine Korrelation zum Nachweis von EHV-2 Genom in der virologischen
Untersuchung konnte ebenfalls nicht hergestellt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine ursächliche Beteiligung des EHV-2 an
Keratitiden des Pferdes nicht nachgewiesen werden. Bei den virologischen
Untersuchungen mittels nPCR stellt der Cytobrush jedoch eine signifikant sensitivere
Methode der Probenentnahme dar.
113
Summary
7 Summary
Myriam von Borstel (2003): Advanced diagnostic methods for keratitis in horses with particular consideration of the detection of equine herpesvirus type 2 (EHV-2)
Different forms of keratitis or keratopathies in the horse are associated with a viral
aetiology. A review of the literature showed that EHV-2 is suspected as the causitive
agent, but no specific clinical signs corresponding to the detection of EHV-2 have
been determined.
In this study 28 horses showing keratitis, keratoconjunctivitis or conjunctivitis (group
1) were examined for their general state of health and subjected to a detailed
ophtalmological examination, as were 28 horses with no ocular disease (group 2). In
addition, samples of the conjunctiva were taken with cotton wool swabs for
microbiologic examination; for the detection of EHV-2 genome with nested PCR,
samples were taken with cotton wool swabs and cytobrushes. Cotton wool swab
samples from the nasal mucosa and isolated peripheral blood leukocytes were also
taken and examined by nested PCR for presence of the EHV-2 genome. These
investigations were carried out twice over a course of four weeks. Furthermore,
conjunctival scrapings were taken with the cytobrush during the first examination for
cytological evaluation.
Comparison of the horses showing keratitis, keratoconjunctivitis or conjunctivitis with
those without ocular diseases showed no significant difference in any of the samples
examined for the presence of the EHV-2 genome. For both examination times, the
rate of detection of the EHV-2 genome in the samples taken with cytobrushes was
significantly higher than in those taken with cotton wool swabs (p < 0,01).
The microbiological examination showed a slightly significantly higher rate of
detection of gram-positive cocci in the diseased eyes (p < 0,05). Microbiological
114
Summary
examination revealed a wide variety of different infective agents in both diseased
and healthy eyes. As none of the infective agents found are obligatorily pathogenic, a
microbiological swab from the conjunctiva must always be assessed in consideration
of the clinical signs.
Microscopic examination of the cytological preparations revealed only a few
inflammatory cells, even in the diseased eyes with conjunctivitis. Lymphocytes and
neutrophile granulocytes were found in only a few cases, with no difference between
diseased and healthy eyes, nor was there a correlation of these findings with the
detection of the EHV-2 genome.
No aetiological participation of EHV-2 in keratitis in horses was determined in this
study. Use of the cytobrush was found to be a significantly more sensitive sampling
method for virological examination.
115
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125
Anhang
9 Anhang Tab. A1: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der
Erstuntersuchung
Pferd Nr.
Klinische Diagnose
Rezidiv Konj. Trias Hornhaut- trübung
Fluoresz.-Probe
Gefäß-einsprossung
epith. Bläschen
1 Kerat.punct./mac. + mgr. + fokal punktf. rauch. - - - 2 Kerat.vasculosa + ggr. + - - oberfl. - 3 Kerat.prof./
,Leukom + - - fokal rauch.-
milchig, stromal - oberfl. -
4 Bullöse Keratopathie
+ - - - - - +
5 Kerat.punct./mac. + mgr. + punktf. rauch., fokal konfluierend
- oberfl. -
6 Kerat.punct./mac. - ggr. + punktf.,fädig rauch. - oberfl. - 7 Kerat.spf. + mgr. + lokal rauch. - oberfl. - 8 Kerat.punct./mac. + ggr. + fokal punktf. rauch.,
konfluierend milchig
- oberfl. -
9 Kerat.spf. - - - lokal rauch. - oberfl. - 10 Kerat.punct. + - - diffus punktf. rauch. - - - 11 Kerat.prof. + mgr.-
hgr. + diffus rauch.-
milchig, stromal + oberfl. -
12 Kerat.punct. + ggr.-mgr.
+ fokal punktf. rauchig, pigment.
- oberfl. -
13 Hornhautabrasion - mgr. + fokal bläulich + oberfl. - 14 Kerat.prof. + ggr. - fokal stromal
grünlich, epithelial rauch.
- oberfl. u. tief -
15 Kerat.punct. + ggr. + fokal punktf. rauch. - - - 16 Konjunktivitis + mgr.-
hgr. + - - - -
17 Kerat.spf. + ggr. + lokal rauch. - oberfl. - 18 Kerat.spf. + ggr. + diffus rauch. - oberfl. - 19 Kerat.spf./
Leukom + ggr.-
mgr. + diffus rauch.,
teilweise milchig + oberfl. -
20 Konjunktivitis + hgr. + - - - - 21 Kerat.vasculosa - ggr. + - - oberfl. - 22 Kerat.punct. + - - diffus punktf. rauch. - - - 23 Kerat.punct./
Leukom + - - diffus punktf.rauch.,
fokal milchig
24 Kerat.punct./mac. + - - diffus punktf., fokal konfluierend
- - -
25 Kerat.spf. + mgr. + lokal rauch. - - - 26 Kerat.vasculosa - ggr. + - - oberfl. - 27 Kerat.punct. ? - - diffus punktf. auch. - - - 28 Kerat.punct. ? - - diffus punktf.rauch. - oberfl. -
126
Anhang
Kerat. : Keratitis
Konj. : Konjunktivitis
punct. : punctata
mac. : maculosa
spf. : superficialis
prof. : profunda
punktf. : punktförmig
rauch. : rauchig
ggr. : geringgradig
mgr. : mittelgradig
hgr. : hochgradig
? : Vorbericht nicht bekannt
- : Befund nicht vorhanden
+ : Befund vorhanden
127
Anhang
Tab. A2: Klinische Diagnosen und Erscheinungsbild in Gruppe 1 bei der Zweituntersuchung
Pferd
Nr. Klinische Diagnose
Konj. Trias Hornhaut- trübung
Fluoresz.-Probe
Gefäß-einsprossung
epithel. Bläschen
1 obB - - - - - - 2 obB - - - - - - 3 Kerat.prof.,
Leukom - - fokal rauch.-milchig
stromal - oberfl. -
4 Bullöse Keratopathie
- - - - - +
5 obB - - - - - - 6 obB - - - - - - 7 obB - - - - - - 8 Kerat.punct./mac,
Leukom - - fokal punktf. rauch.,
konfluierend milchig
- oberfl. -
9 obB - - - - - - 10 Kerat.punct. - - diffus punktf. rauch. - - - 11 Kerat.prof. mgr.-
hgr. + diffus rauch.-
milchig, stromal + oberfl. u. tief -
12 Kerat.punct. - - fokal punktf. rauchig, pigment.
- oberfl. -
13 obB - - - - - - 14 Kerat.prof.,
Leukom - - fokal stromal rauch,
teilw.milchig - oberfl. u. tief -
15 obB - - - - - - 16 obB - + - - - - 17 obB - + - - - - 18 Kerat.spf. - - Diffus ggr. rauch. - - - 19 Kerat.spf./
Leukom - - diffus ggr.rauch.,
teilweise milchig - - -
20 obB - - - - - - 21 Kerat.vasculosa ggr. + - - oberfl. - 22 Kerat.punct. - - diffus punktf. rauch. - - - 23 Kerat.punct./
Leukom - - diffus punktf.rauch.,
fokal milchig
24 Kerat.punct./mac. - - diffus punktf., fokal konfluierend
- - -
25 Kerat.spf. ggr. - lokal rauch. - - - 26 Kerat.vasculosa ggr. - - - oberfl. - 27 Kerat.punct. - - diffus punktf. auch. - - - 28 Kerat.punct. - - diffus punktf.rauch. - oberfl. -
128
Anhang
Kerat. : Keratitis
Konj. : Konjunktivitis
punct. : punctata
mac. : maculosa
spf. : superficialis
prof. : profunda
punktf. : punktförmig
rauch. : rauchig
ggr. : geringgradig
mgr. : mittelgradig
hgr. : hochgradig
? : Vorbericht nicht bekannt
- : Befund nicht vorhanden
+ : Befund vorhanden
129
Anhang
Tab. A3: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der Erstuntersuchung
Linkes Auge Rechtes Auge PCR A PCR A
PCR Pferd
Nr. Diagnose
T CB CBDiagnose
T CB CB NT PBL 1 obB - - nd Kerat.punct./mac. + + nd - - 2 obB - + nd Kerat.vasc. + - nd - - 3 obB - + nd Kerat.prof./ Leukom - - nd + - 4 obB - - nd bullöse Keratopathie + - nd - - 5 Kerat.punct./mac. - + nd obB - - nd - - 6 Kerat.punct./mac. - - nd obB - - nd - - 7 obB - - nd Kerat.spf. - - nd - - 8 Kerat.punct./mac. - - nd obB - - nd - - 9 Kerat.spf. - - nd obB - - nd - - 10 obB - - - Kerat.punct. - + - - + 11 obB - - - Kerat.prof. - - - - - 12 obB + + - Kerat.punct. - - - - - 13 Hornhautabrasion - - - obB - + - - + 14 Kerat.prof. - + - obB - - - - + 15 Kerat.punct. - + - obB - - - - - 16 Konjunktivitis - - - obB - - - + - 17 obB - - - Kerat.spf. - - - - + 18 obB - + - Kerat.spf. - - - - + 19 obB + + - Kerat.spf./Leukom - - - - + 20 Konjunktivitis - + - obB - + - - + 21 Kerat.vasculosa - + - obB - - - - + 22 obB - - - Kerat. punct. - - - - - 23 obB - - - Kerat. punct./Leukom - - - - - 24 obB - - - Kerat. punct./mac. - - - - - 25 obB - - - Kerat.spf. - + - - + 26 obB - - - Kerat.vasculosa - - - - - 27 obB - + - Kerat.punct. + + - + + 28 Kerat.punct. - - - obB + + - - -
CB : Cytobrush Kerat. : Keratitis
NT : Nasentupfer punct. : punctata
T : Tupfer mac. : maculosa
A : Anzucht prof. : profunda
PBL : periphere Blutleukozyten spf. : superficialis
PCR : Polymerase Kettenreaktion + : positiv
nd : nicht durchgeführt - : negativ
obB : ohne besonderen Befund
130
Anhang
Tab. A4: Klinische Diagnosen und Nachweis von EHV-2 in Gruppe 1 bei der Zweituntersuchung
Linkes Auge Rechtes Auge
PCR A PCR A 16 PCR Pferd
Nr. Diagnose T CB CB
17 Diagnose T CB CB NT PBL
1 obB - - nd obB * - - nd - - 2 obB - + nd obB * + - nd - - 3 obB - - nd Kerat.prof., Leukom + + nd - - 4 obB - - nd bullöse Keratopathie + - nd - - 5 obB * - - nd obB - - nd - - 6 obB * - - nd obB - - nd - - 7 obB - - nd obB * - - nd - - 8 Kerat.punct./mac.,
Leukom - - nd obB - - nd - -
9 obB * - - nd obB - - nd - - 10 obB + + - Kerat.punct. - - - - + 11 obB - - - Kerat.prof. - - - - - 12 obB - - - Kerat.punct. + + - - - 13 obB * - - - obB - - - + + 14 Kerat.prof., Leukom - - - obB - - - - + 15 obB * - + - obB - - - - - 16 obB * - + - obB - + - - + 17 obB - - - obB * - - - - - 18 obB - + - Kerat.spf. - + - - - 19 obB - - - Leukom - - - - - 20 obB* + + - obB - + - - + 21 Kerat.vasculosa - + - obB - + - - - 22 (Keine Zweit-US) 23 (Keine Zweit-US) 24 (Keine Zweit-US) 25 obB - - - Kerat.spf. - + - - - 26 obB - - - Kerat.vasculosa - + - - - 27 obB + + - Kerat.punct - + - - - 28 Kerat.punct. + + - obB - + - - -
CB : Cytobrush Kerat. : Keratitis
NT : Nasentupfer punct. : punctata
T : Tupfer mac. : maculosa
A : Anzucht prof. : profunda
PBL : periphere Blutleukozyten spf. : superficialis
PCR : Polymerase Kettenreaktion + : positiv
obB : ohne besonderen Befund - : negativ
* : ehemals erkranktes Auge nd : nicht durchgeführt
131
Anhang
Tab. A5: Nachweis von EHV-2 in Gruppe 2 bei der Erst- und Zweituntersuchung
Erstuntersuchung Zweituntersuchung PCR A PCR A
T CB CB T CB CB
Pferd Nr.
li re li re NT PBL
li re li re li reNT PBL
li re1 - - - - - - nd nd (keine Zweituntersuchung) 2 - - - + - - nd nd (keine Zweituntersuchung) 3 - - - + - - - - - - - + - - - - 4 - - + - - + - - - - + - - + - - 5 - - - + - - - - - - - + - - - - 6 - - + - - + - - - - + - - + - - 7 - - - + - + - - - + - - + - - 8 - - + + - + - - - + - - - + - - 9 + - + - - - + - - - - - - - + -
10 - - - - - - - - - - - - - - - - 11 - - - - - + - - - - - - - - - - 12 + - + - + + - - - - - - - + - - 13 - - - - - - - - (keine Zweituntersuchung) 14 - - - - - + - - - - - + - - - - 15 - - - - - + - - - + - - - + - - 16 - - - - - - - - - - + + - + - - 17 - - - - - - - - + - + + - + - - 18 - - - - - + - - - + - + - - - - 19 - - + + - - - - - - + - + + - - 20 - - + + - + - - - - + + - - - - 21 - - - + - - - - - - - - - - - - 22 - - + + + - - - - - - + - - - - 23 - - - + - + - - - - - - - - - - 24 - - + + - - - - - - - - - - - - 25 - - - - - - - - - - - - - - - - 26 - - - + - + - - - - - - - + - - 27 - - - + - + - - - - - - - + - - 28 - - - - + - - - - - - + - + - -
-
A : Anzucht nd : nicht durchgeführt
CB : Cytobrush li : links
T : Tupfer re : rechts
NT : Nasentupfer - : negativ
PCR : Polymerasekettenreaktion + : positiv
PBL : periphere Blutleukozyten
132
Anhang
Tab. A6: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Erstuntersuchung
gesundes Auge erkranktes Auge Pferd
Nr. nachgewiesene Keime Gehalt nachgewiesene Keime Gehalt 1 koag.- Staphylokokken
Bacillus spp. anhämolysierende Streptokokken
Acinetobacter spp.
+ + + +
koag.- Staphylokokken α-hämolysierende Streptokokken
Pantoea agglomerans
+ + +
2 Acinetobacter spp. + Staphylococcus xylosus Weeksella spp.
Pantoea agglomerans α-hämolysierende Streptokokken
+ + + +
3 koag.- Staphylokokken + Staphylococcus aureus + 4 Pantoea agglomerans
Bacillus spp. + +
Pantoea agglomerans Bacillus spp.
++ +
5 Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
Pseudomonas spp. Bacillus spp.
+ +
6 Acinetobacter spp. Bacillus cereus
++ +
koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
Pseudomonas spp. Acinetobacter spp.
++ +
++ ++
7 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
+ +
koag.- Staphylokokken +
8 Escherichia coli Pantoea agglomerans
Bacillus cereus Mucor spp.
+++ +++
+ +
Escherichia coli Pantoea agglomerans
Bacillus cereus Pseudomonas fluorescens
Sprosspilze
+ +++
+ +++
+ 9 Bacillus cereus +
Pantoea agglomerans
Bacillus spp. + +
10 α-hämolysierende Streptokokken Pantoea agglomerans
+ +
Escherichia coli Bacillus cereus
+ +
11 Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
α-hämolysierende Streptokokken Bacillus cereus
+ +
12 Bacillus cereus + Bacillus cereus + 13 Pantoea agglomerans
Bacillus spp. koag.- Staphylokokken
Sprosspilze
+ + + +
koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
+ +
14 Koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans
Bacillus spp. Escherichia coli
+ + + +
Koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans
Bacillus spp. Escherichia coli
+ + + +
15 α-hämolysierende Streptokokken + Staphylococcus aureus + 16 α-hämolysierende Streptokokken
Pantoea agglomerans + +
koag.- Staphylokokken α-hämolysierende Streptokokken
+ +
17 Koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.
Bacillus spp.
++ ++ +
Koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.
Bacillus spp.
+ + +
18 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp.
+ + +
koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp.
+ + +
19 koag.- Staphylokokken + Ralstonia picketii +++
133
Anhang
anhämolysierende Streptokokken Micrococcus spp.
Bacillus spp. Acinetobacter spp.
+ + + +
(früher: Pseudomonas p.) Alcaligenes spp.
koag.- Staphylokokken
+ +
20 Aspergillus spp. + koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.
+ +
21 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp. E.coli
+ ++ ++ +
koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp.
+ + +
22 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp. Arthrobacter spp.
+ +
++ ++
Pseudomonas spp. * Bacillus spp.
Acinetobacter spp. Arthrobacter spp. Geotrichum spp.
++ ++ ++ ++ +
23 koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
Acinetobacter spp. Arthrobacter spp.
++ +
+++ +++
koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Arthrobacter spp.
+ +
++
24 koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
Acinetobacter spp.
++ +
+++
koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
Acinetobacter spp.
++ +
+++ 25 koag.- Staphylokokken
Bacillus cereus + +
koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
+ +
26 Bacillus spp. Mucor spp.
+ +
Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
27 Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
Acinetobacter spp. +++
28 α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.
+ α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.
+ +
spp. : species hämolys. : hämolysierend
subsp. : subspecies anhämolys. : anhämolysierend
koag.- : koagulasenegativ
+ : geringgradiger Gehalt
++ : mittelgradiger Gehalt
+++ : hochgradiger Gehalt
134
Anhang
Tab. A7: Gruppe 1 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Zweituntersuchung
gesundes Auge erkranktes /ehemals erkranktes Auge Pferd
Nr. nachgewiesene Keime Gehalt nachgewiesene Keime Gehalt1 koag.- Staphylokokken
Bacillus spp. + +
koag.- Staphylokokken Escherichia coli
+ +
2 Bacillus spp. Pseudomonas spp.
+ +
Bacillus spp. Acinetobacter spp.
+ +
3 koag.- Staphylokokken Escherichia coli
+ +
koag.- Staphylokokken Escherichia coli
Pseudomonas spp.
+ + +
4 Serratia spp. Bacillus cereus
+ +
Serratia spp. Pantoea agglomerans
Flavimonas oryzihabitans
++ ++ ++
5 Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
Pseudomonas spp. Bacillus spp.
+ +
6 Escherichia coli +++ Escherichia coli Enterobacter cloacae
Bacillus cereus
+++ +++ ++
7 koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.
++ +++
koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.
++ ++
8 Escherichia coli Pantoea agglomerans
Bacillus cereus Mucor spp.
Escherichia coli ++
+++ +++
+ +
Pantoea agglomerans Pseudomonas fluoreszens
Sprosspilze
++
9 Bacillus cereus Pantoea agglomerans koag.- Staphylokokken
+
+
Sprosspilze
+ + +
Pantoea agglomerans koag.- Staphylokokken coryneforme Bakterien
+
++
10 α-hämolysierende Streptokokken Pantoea agglomerans
+ + +
Escherichia coli Bacillus cereus +
11 Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ + +
α-hämolysierende Streptokokken Bacillus cereus +
12 Pantoea agglomerans + koag.- Staphylokokken α-hämolysierende Streptokokken
Pantoea agglomerans Bacillus spp.
+ + + +
13 Pantoea agglomerans Bacillus spp.
+ +
koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans coryneforme Bakterien
+ + +
14 α-hämolysierende Streptokokken Bacillus cereus
Acinetobacter spp. Aspergillus spp.
+ + + +
α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.
+ +
15 Bacillus spp. + Bacillus cereus Staphylococcus aureus
+ +
16 koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
+ +
koag.- Staphylokokken Bacillus cereus
Pantoea agglomerans
+ + +
17 koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp.
++ + +
koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Acinetobacter spp.
+ + +
18 koag.- Staphylokokken Acinetobacter spp.
+ +
Kein Keimgehalt nachweisbar +
19 Bacillus spp. + koag.- Staphylokokken +
135
Anhang
Acinetobacter spp. Pantoea agglomerans
+ +
20 koag.- Staphylokokken + Staphylococcus aureus Acinetobacter spp.
Bacillus spp.
+ +
21 Pantoea agglomerans Pseudomonas spp.
+ +
koag.- Staphylokokken Streptomyces spp. Pseudomonas spp.
+ + +
22 (Keine Zweituntersuchung) 23 (Keine Zweituntersuchung) 24 (Keine Zweituntersuchung) 25 koag.- Staphylokokken
Bacillus spp. Acinetobacter spp.
Streptococcus equi subspecies equi
+ + + +
koag.- Staphylokokken Escherichia coli
+ +
26 Bacillus spp.
+
Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
27 Acinetobacter spp. Bacillus spp.
+ +
Acinetobacter spp. +++
28 Enterococcus spp. + α-hämolysierende Streptokokken Bacillus spp.
+ +
spp. : species hämolys. : hämolysierend
subsp. : subspecies anhämolys. : anhämolysierend
koag.- : koagulasenegativ
+ : geringgradiger Gehalt
++ : mittelgradiger Gehalt
+++ : hochgradiger Gehalt
136
Anhang
Tab. A8: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Erstuntersuchung
Pferd
Nr. Gehalt
linkes Auge nachgewiesene Keime Gehalt
rechtes Auge 1
+ +
koag.- Staphylokokken Bacillus spp.
Pantoea agglomerans
+
2 + + +
Pantoea agglomerans Escherichia coli Moraxella spp.
+ +
3
+ koag.- Staphylokokken
Bacillus spp. + +
4 + +
Pantoea agglomerans Bacillus spp.
++ +
5 + +
Pseudomonas spp. Bacillus spp.
+ +
+ +
Pantoea agglomerans Bacillus spp.
Enterobacter spp.
+ + +
+ +
Pantoea agglomerans Bacillus spp.
Enterobacter spp.
+ + +
+ +++
Acinetobacter spp. Pantoea agglomerans
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
+++
+ ++
9
++ +
++
Enterococcus spp. Pantoea agglomerans
Flavimonas orizyhabitans Bacillus spp.
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
Schimmelpilze Sprosspilze
+ + + + + + + +
10 +++ ++ +
++
anhämolys. Streptokokken Pantoea agglomerans
Bacillus spp. Acinetobacter spp.
koag.- Staphylokokken
+ +
+++ 11 +
++ ++
+++
Bacillus spp. koag.- Staphylokokken Pantoea agglomerans coryneforme Bakterien
Acinetobacter spp.
+ ++
+++
+ ++ ++
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp.
+ +
++ 13 +
++
Bacillus spp. Pantoea agglomerans
Acinetobacter spp. Chryseobacterium spp.
++ ++ ++
14 +
++
Bacillus cereus koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp. Moraxella spp.
+
+ ++
6
7
8 ++
++ 12
137
Anhang
15
+ ++
+ +
Bacillus spp. Acinetobacter spp.
anhämolys.Streptokokken Pantoea agglomerans
alpha-hämolys.Streptokokken
+
+
16 +
+++
Pantoea agglomerans Acinetobacter spp.
coryneforme Bakterien
+ +++
17 + +
++ Acinetobacter spp.
Chryseobacterium spp. ++
Pantoea agglomerans
18 +
+ +
Chryseobacterium spp. Acinetobacter spp.
anhämolys.Streptokokken Bacillus spp.
+ +
19 + +
Bacillus cereus Acinetobacter spp.
alpha-hämolys.Streptokokken Chryseobacterium spp.
+ + + +
20 + + +
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp.
+ +
21 +
+
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp.
+ +
22 + +
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp. alpha-hämolys.Streptokokken
+ + + +
23 +
++
Bacillus cereus koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp.
+
24 +
Bacillus cereus Bacillus spp.
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
+
+ +
25 +
+
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
alpha-hämolys.Streptokokken Escherichia coli
+ +
26 + +
++
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
alpha-hämolys.Streptokokken Escherichia coli
Pseudomonas spp.
+ ++ + +
27 Acinetobacter spp. + 28 + Bacillus spp. +
spp. : species koag.- : koagulasenegativ
subsp. : subspecies + : geringgradiger Gehalt
hämolys. : hämolysierend ++ : mittelgradiger Gehalt
+++ : hochgradiger Gehalt
138
Anhang
Tab. A9: Gruppe 2 - Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen bei der Zweituntersuchung
Pferd
Nr. Gehalt
linkes Auge nachgewiesene Keime Gehalt
rechtes Auge 1 (keine Zweituntersuchung) 2 (keine Zweituntersuchung) 3 +
+ Pantoea agglomerans
Bacillus cereus + +
4 + Bacillus spp. + 5 +
+ Pantoea agglomerans
Bacillus cereus + +
6 +++
++ +
Pantoea agglomerans Pseudomonas spp. Acinetobacter spp.
Schimmelpilze
+++ ++
7 + +
+
Pantoea spp. Bacillus spp.
Escherichia coli koag.- Staphylokokken
+ +
8 +
+ +
+
Escherichia coli Pantoea spp. Bacillus spp.
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
Fusarium spp Cladosporium spp.
Alternaria spp.
+
+ +
+ +
9 + + + +
+
Escherichia coli Bacillus spp.
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
Aspergillus spp. Cladosporium spp.
Alternaria spp.
+
+ + +
10 + + +
+ +
Escherichia coli Pantoea spp. Bacillus spp.
Acinetobacter spp. Fusarium spp Alternaria spp.
+
+ + + +
11 + + +
Bacillus spp. koag.- Staphylokokken
Streptococcus equi subsp.zooepidemicus
Cladosporium spp.
+ +
+ 12 +
+ +
Bacillus spp. + koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp.
+ 13 (keine Zweituntersuchung) 14 +
+++ Bacillus spp.
Acinetobacter spp. + +
15 + Bacillus spp. + 16 +
+ Pantoea agglomerans
Acinetobacter spp. + +
139
Anhang
17 + Bacillus spp. + 18 + Bacillus spp. + 19 + Bacillus spp. +
+ +
Bacillus spp. Acinetobacter spp.
+ +
21 + +
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
+
22 + Bacillus spp. Escherichia coli
Corynebacterium spp. alpha-hämolys.Streptokokken
+ + + +
23 +
Bacillus spp. koag.-Staphylokokken
Acinetobacter spp. Pantoea agglomerans
+ + + +
24 + +
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
+ +
25 + koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
+ +
26
+++
koag.-Staphylokokken Acinetobacter spp.
Pantoea agglomerans Pseudomonas fluoreszens
+ ++ ++
+ Bacillus cereus
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus
+ +
28 + +
Bacillus spp. Pantoea agglomerans
+
20
27
spp. : species
subsp. : subspecies
koag.- : koagulasenegativ
hämolys. : hämolysierend
+ : geringgradiger Gehalt
++ : mittelgradiger Gehalt
+++ : hochgradiger Gehalt
140
Danksagung Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. E. Deegen möchte ich an dieser Stelle ganz herzlich für die Überlassung des interessanten Themas und die jederzeit gewährte freundliche und unkomplizierte Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit danken. Bei Frau PD Dr. rer. nat. Kerstin Borchers und ihren Mitarbeitern möchte ich mich für die freundliche Aufnahme im Labor des Instituts für Virologie des FB Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin und die stets gewährte, engagierte und unkomplizierte Unterstützung danken. Ebenso danke ich Prof. Dr. G. Amtsberg und den Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der TiHo Hannover für die Betreuung der Arbeit und die zuverlässige und schnelle mikrobiologische Diagnostik. Prof. Dr. R. Mischke danke ich für die stets freundliche und engagierte Unterstützung bei der Auswertung der zytologischen Präparate. Besonders danke ich Marco Ebert für die hervorragende Zusammenarbeit und Hilfe. Ich wünsche ihm einen guten Endspurt für die Fertigstellung seiner eigenen Dissertation. Dr. Tassilo von Oppen möchte ich ganz besonders herzlich danken für sein Engagement, die fachliche Betreuung, Unterstützung und Motivation bei der Anfertigung dieser Arbeit, und nicht zuletzt für die nette Zusammenarbeit. Vielen Dank! Dr. Frauke Glitz danke ich ganz herzlich für dafür, dass sie den Stein für diese Dissertation überhaupt erst ins Rollen gebracht hat. Ohne Dich wäre wahrscheinlich keine ophthalmologische Thematik für die Anfertigung einer Dissertation in Frage gekommen, Danke! Ich möchte allen Mitarbeitern der Klinik für Pferde der TiHo Hannover danken für gute Zusammenarbeit und geleistete Hilfe. Besonders danke ich Astrid für ihre konstruktiven Kritiken und Korrekturen sowie der moralischen Unterstützung während der „Endphase“, für die ich ebenso Kirstin, Viola und Bianka danke. Claus danke ich für die Beprobung der Maultiere, Robert und Rolf für diverse Erste-Hilfe-Leistungen bei Computernotfällen. Für geistigen Beistand und konstruktive „Teestunden“ möchte ich außerdem Angela und Sarah danken. Bei Dr. Karl Rohn aus dem Institut für Biometrie und Statistik der TiHo bedanke ich mich für die Beratung und Durchführung der statistischen Untersuchungen. Nicht zuletzt danke ich Sascha, der geduldig jede Phase der Doktorarbeitszeit „ertragen“ hat, für sein Verständnis, seine Unterstützung und seine Liebe!
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