Bestimmung der Molekularen Masse

von Makromolekülen

GrößenausschlußchromatographieGelfiltration,

SEC=size exclusion chromatography

GrößenausschlußchromatographieGelfiltration,

SEC=size exclusion chromatography

10log

MW

[kD

a]Elutionsvolumen [ml]

Carboanhydrase

BSA

Lysozym

Aprotinin

Größenausschlußchromatographie

Vorteile:Sehr oft ist Gelfiltration ein Schritt bei der Isolation des Proteins. Somit istdie Information über die native Größe schon vorhanden. Genauigkeit: +/- 10% im optimalen Fall bis zu +/-50% Abweichung

Nachteile:Das Elutionsvolumen kann durch die Form des Proteins oder auch durchInteraktionen des Proteins mit der Säulenmatrix stark beeinflusst werden.Schwache Komplexe zerfallen auf Gelfiltration.

Protein

Hydrodynamischer Radius

Massenspektrometrie

Massenspektrometrie

• Hauptmethoden:

ESI = Electrospray Ionisation

MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

•Prinzip: Moleküle werden ionisiert und im elektrischen Feld beschleunigt

Massenspektrometrie• Detektion der ionisierten Moleküle z.B. mittels TOF = Time Of Flight

• PrinzipAlle Moleküle haben nach der Beschleunigung im el. Feld diegleiche kinetische Energie = E = ½ mv2. Es gilt

Ekin (Molekül 1) = Ekin (Molekül 2) ½ m1v1

2 = ½ m2v22

Ist nun die Masse m1 größer als die Masse m2

ist also die Geschwindigkeit v1 entsprechend kleiner als v2

d.h. das “leichtere” Molekül 2 kommen zuerst an.

Massenspektrometrie• Latest: Detektion der ionisierten Moleküle

Orbitrap

MassenspektrometrieVorteile:Sehr wenig Probe wird benötigt. Sehr präzise Messungen.Genauigkeit bis +/- 0.1 Da

Nachteile:Da die Proteien ionisiert werden müssen, kommt es oft zurDeanturierung der Proteine; d.h. Multimere oder Komplexe zerfallen sehroft bei der Ionisation und können nicht detektiert werden.

Dynamische Lichtstreuung• DLS, Dynmaic Light Scattering auch “quasi-

elastische” Streuung genannt.

• Grundprinzip:Ist das Molekül sehr viel größer als die Wellenlänge des eintreffende Lichts, werdendie Photonen elastisch - d.h. ohne ÄnderungWellenlänge - gestreut (Rayleigh Scattering).

(Analogie zum elastischen Stoß, bei dem ein Partikel, dersehr viel kleiner als der Stoßpartner ist, zwar eine andereRichtung erhält aber die Geschwindigkeit vollständigerhalten bleibt)

Dynamische Lichtstreuung

Moleküle in Bewegung

Einfallendes Licht

Gestreutes Licht

Moleküle in Lösung

Dynamische Lichtstreuung

Einfallendes Laserlicht Auslöschung

Verstärkung

Detektion

Dynamische Lichtstreuung

Einfallendes Laserlicht Auslöschung

Verstärkung

Änderung der Inensität

in Abhängigkeit von

der Bewegung

Dynamische Lichtstreuung

Brown’sche Molekülbewegung abhängig von Diffusionskoeffizient

Diffussionskoeffizient

kB = Boltzmann KonstanteT= Temperaturη = ViskositätR0= Hydrodynamischer Radius des diffundierenden Teilchens

Änderung der Lichtintensität gibt Rückssschlüsseauf Bewegung der Moleküleund über den Diffusionskoeffizienten auf die Größe der Moleküe.

Dynamische LichtstreuungVorteile:Wenig Probenvolumen, in der Regel geringe ProteinkonzentrationBenötigte Proteinkonzentration von der Größe des Proteins abhängig.

Nachteile:Methode extrem anfällig auf Partikel, wie z.B. aggregiertes Protein,Staub, etc, geringe Präzision.

Achtung bei Glycerin oder andere Substanzen im puffer, die Viskosität stark ändern.

Analytische Ultrazentrifugation

• Grundprinzip:

Bewegung der Moleküle während Sedimentation oder

Sedimentationsgleichgewicht wird gemessen =>

Rückschlüsse auf Größe.

Analytische Ultrazentrifugation

Analytische Ultrazentrifugation

Analytische Ultrazentrifugation

Analytische Ultrazentrifugation

t=0

t=x

Analytische UltrazentrifugationSedimentation

Analytische Ultrazentrifugation

Lamm Gleichung

Analytische Ultrazentrifugation

Analytische Ultrazentrifugation