Vorlesung: „Molekulare Virologie“, WS2018/2019

Rainer G. Ulrich

Friedrich-Loeffler-Institut

Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger

D-17493 Greifswald - Insel Riems

rainer.ulrich@fli.de

Große dsDNA-Viren II:

Pockenviren und Baculoviren

1. EINLEITUNG

(Nichttaxonomische) Klassifizierung von Viren

nach infiziertem Wirt: Bakterien, Pflanzen, Pilze, Tiere, Mensch

DNA-Viren bei Wirbellosen und Wirbeltieren

Struktur und Klassifizierung von DNA-Viren

Klassifikation von Viren nach der Art der mRNA-

Synthese (Baltimore-Klassifikation)

Gruppe I: dsDNA. Genomform aller

Lebewesen (Papilloma-,

Polyoma-, Adeno-, Herpes-,

Baculo- und Poxviridae)

Gruppe II: ssDNA. Enthält DNA sowohl

positiver als auch negativer

Polarität (Parvoviridae)

Gruppe III: dsRNA (Reoviridae)

Gruppe IV: (+)ssRNA. Sie wirkt direkt als

mRNA (Picorna-, Toga-, Flavi-,

Calici-, Coronaviridae)

Gruppe V: (-)ssRNA. Sie wirkt als Matrize

zur mRNA-Synthese (Bunya-,

Arena-, Rhabdo-, Paramyxo-,

Orthomyxo-, Filoviridae)

Gruppe VI: (+)ssRNA, die in DNA

zurückgeschrieben und ins

Zellgenom eingebaut wird

(Retroviridae)

2. FAMILIE POXVIRIDAE

Variola

Ramses V.:

Tod (1157 v. Chr.)

infolge von Pocken?

Poxviridae

Poxviridae: Aktuelle Taxonomie

Poxviridae: Phylogenie der Genera

Poxviridae: Phylogenie der Genera

Phylogenie im Genus Orthopoxvirus

Franke et al., 2017

Phylogenie im Genus Orthopoxvirus

Molluscipoxvirus

Vacciniavirus

Ovale, ziegelsteinähnliche Form mit strukturierter Oberfläche

Morphologie der Pockenviruspartikel

Parapoxvirus: bienenkorbartige Anordnung

der Filamente auf der Oberfläche

Avipoxvirus

Morphologie der Pockenviruspartikel

Poxviridae

Virion

Genom

Proteine

im Virion

Replikation

Besonderheiten

oval, ziegelsteinartig, pleomorph,

300 x 200 x 100 nm

lineare dsDNA, kovalent geschlossen

137-360 kbp

>70 Strukturproteine sowie enzymatisch

und regulatorisch aktive Proteine

Cytoplasma („Virus factories“, Virosomen)

größte und komplexeste Viren; resistent

gegen Inaktivierung; erste virale

Erkrankung, die ausgerottet wurde

IMV: intracellular mature virus

IEV: intracellular enveloped virus

CEV: cell-associated enveloped virus

EEV: extracellular enveloped virus

Stadien des Virusassembly

Schematischer Aufbau eines Pockenvirus-Partikels

(Intracellular mature virus “IMV”)

Schematischer Aufbau eines Pockenvirus-Partikels

(Extracellular enveloped virus “EEV”)

Genomstruktur

Vergleich der Genome von Pockenviren

Genomorganisation und Kodierungsstrategie

Replikation der Pockenviren

Replikation der Pockenviren

Enzymatische Partikelkomponenten

a) DNA-abhängige RNA-Polymerase (Transkription)

b) DNA-Polymerase (Replikation)

c) Early Transcription Factor (Promotorerkennung)

d) Capping-Enzymkomplex (Guanyltransferase,

RNA-Triphosphatase, Guanine-7-Methyltransferase)

e) Poly(A)-Polymerase (Polyadenylierung)

f) DNA-Topoisomerase (Sequenzspezifisches Nicking)

g) DNA-Helikase (Replikation)

h) Thymidinkinase (Phosphorylierung)

Pockenviren: Genomorganisation

Pockenviren: Genexpression

Pockenviren: Genexpression

Pockenviren: DNA-Replikation

Pockenvirus-kodierte Immunmodulatoren

• Anzucht: Hühnerei, Zellkultur, Tier

• Antigen-ELISA

• Antikörpernachweis: Immunfluoreszenztest

und Neutralisationstest

• Elektronenmikroskopie

• Genomuntersuchung (RFLP)

• Consensus PCR/Spezies-spezifische PCR

• Genomsequenzierung

Pockenvirus-Diagnostik

CPE auf der Chorioallantoismembran

Chorioallantoismembran mit Hämorrhagien

Orientierende Erstdiagnostik im BSL 3-Labor

(Empfehlung des RKI)

• Inaktivierung für die Elektronenmikroskopie

(10% Formaldehyd)

• Inaktivierung für die PCR

(Guanidiniumchlorid-Puffer, QIAamp kit)

• Asservierung/Versand an BSL 4-Labor

Krankheit durch das

Variolavirus

Variola major

(Variola vera)

Letalität

~ 40 %

Variola minor

(Alstrim Virus)

Letalität

~ 1-2 %

Afrika, Asien,

Europa

Afrika, Südamerika,

Australien

Pocken (Variola vera): Merkmale der Erkrankung

• sehr ansteckende, hochfieberhafte und akut verlaufende

Viruskrankheit

• keine chronischen Verlaufsformen

• keine gesunden Virusausscheider

• hinterlässt eine langandauernde Immunität

• Zyklische Infektionskrankheit

- Infektion über den Respirationstrakt und lokale Vermehrung

- erste Virämie: Leber, Milz, Lymphknoten

- zweite Virämie: Hautmanifestationen

Gewöhnliche Variola major

Pusteln an den

Händen

Flache Läsionen

an den Sohlen

Variola major

Hämorrhagischer Typ

Die 1. Variola-Vakzination

Jenner 1796 Kuhpockenläsionen an der Hand von

Sarah Nelmes (Fall XVI in Jenner’s

Erhebung), von welcher das Material

für die Impfung des James Phipps

(1796) genommen wurde.

Massenimpfkampagne

ab 1958 weltweites Impfprogramm

Variola-Endemiegebiete 1945

Endemische Variola

Variola-Endemiegebiete 1967

Endemisch Importe Übertragung unterbrochen

Letzte Fälle von Variola**

Rahima Banu – 16. Oktober 1975 Variola major-Bangladesh

Ali Maow Maalin – 26. Oktober 1977 Variola minor-Somalia

** zwei Laborinfektionen in UK 1978

1979

Heute im Besitz von Virus:

• CDC in Atlanta, Georgia,

USA

• Russisches Forschungs-

zentrum für Virologie und

Biotechnologie, Koltsovo

bei Novosibirsk, Russland

Eradication of smallpox

• The combination of :

early detection,

isolation of infected individuals,

• surveillance of contacts and

• vaccination policy

has successfully eradicated smallpox.

Voraussetzungen für die Ausrottung

eines Virus

• Menschen sind einziger Wirt des Virus, kein

tierisches Reservoir

• Hohe genetische Stabilität des Erregers,

geringe genetische Divergenz (Virusstämme)

• Praktische diagnostische Werkzeuge

• Impfling ist leicht zu erkennen

• Effektive Möglichkeiten zur Verhinderung der

Übertragung

Vacciniavirus - Impfstoff

• Von Jenner genutztes Originalmaterial war

Kuhpockenvirus.

• Das heute genutzte Virus ist kein Kuhpockenvirus

und kein Variolavirus. Die Herkunft ist unbekannt

(Vacciniavirus).

Origin of vaccinia virus?

• From cowpox virus by passage and mutation.

• From variola virus by passage and mutation.

• By recombination between cowpox and variola viruses.

• A distinct species of orthopoxvirus from an unrecognised host or from a host in which it is no longer endemic. Horsepox?

Impfstoffproduktion (früher)

• Gezüchtet auf der Haut von Kälbern, Schafen, Wasserbüffeln

• Läsionen wurden vor Verkrustung geerntet

Neuer Vacciniavirus-Impfstoff 2003

• in Zellkultur produziertes Lebendvirus

• lyophilisierter Puder

• bessere Verträglichkeit

Normaler Impfverlauf

Tag Beschreibung

0 Impfung

3-4 Ausbildung einer Papel

5-7 Ausbildung eines Bläschen

mit kreisförmigem Erythem

8-10 Ausbildung einer eindeutig

erkennbaren Pustel

10-12 Verschorfung der Pustel

ab 17 Ablösung des Schorfs,

eine Impfnarbe bleibt zurück

Wenn sich keine Pustel bildet, muss die Impfung wiederholt werden

Impfnebenwirkungen • Nebenpocken (Häufigkeit: 1 : 2000) bei Autoinokulation:

Auge (Hornhauttrübung), Nase, Gesicht, Mund, Genital, Rektum

• Ekzema vaccinatum

• Vaccinia generalisata (Häufigkeit: 1 : 100 000)

• Vaccinia progressiva (Häufigkeit in Immunsupprimierten:

1 : 1 Million)

• postvaccinale Enzephalitis (Häufigkeit: 1 : 50 000)

Impfnebenwirkungen

Neue Ansätze zur Bekämpfung

- Modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA)

- Replikation in Hühnerfibroblasten

- umfangreiche Deletionen und Gen-Rearrangements

- in Säugetierzellen keine Virusreplikation

- Impfungen von 180000 Menschen (keine Impf-

zwischenfälle)

- Vaccinia-Immunglobulin (VIG)

- Cidofovir

Gebrauch bei generalisierter Vaccinia,

Ekzema vaccinatum, progressiver Vaccinia

Andere Humanpathogene Pockenviren:

Orthopoxviren

Kuhpockenvirus

• Erkrankungen bei Haus- und Wildtieren (Zootiere)

• Mensch: gelegentlich zoonotische Erkrankungen mit Pustelbildung,

schwerwiegend bei Immunsuppression

• Reservoir in Nagetieren

• Rind, Mensch, Katze und Zootiere sind Endglieder einer Infektkette

Zunahme humaner Kuhpockenvirusinfektionen (?)

• Einstellung der Impfung (Schwindende Immunität)

• Höhere Aufmerksamkeit behandelnder Ärzte

• Ökologische Veränderungen bei Reservoirnagern?

• Beliebtheit von „Schmuseratten“

Affenpocken

Affenpockenvirus (Monkeypox)

• mit dem Variolavirus eng verwandt

• auch der Mensch ist für Affenpocken

empfänglich

• Affenpocken in weiten Teilen Afrikas

endemisch

• Reservoir in Nagern (Präriehunde) –

Zoonose

Andere Humanpathogene Pockenviren:

Molluscipoxvirus

Molluscum contagiosum (Dellwarzen)

Infektionswege

• Mikroverletzte Haut in Schwimmbädern

• sexueller Kontakt

Vorkommen und Durchseuchung

• weltweit, besonders häufig auf den Inseln des pazifischen Ozeans

Inkubationszeit

• 2-8 Wochen

Symptome und Klinik

• gutartige Viruserkrankung der Haut

• tritt besonders bei Kindern, Erwachsenen unter Cortisontherapie

und Patienten mit Immunschwäche auf

• typische, stecknadelkopfgroße bis erbsengroße Papeln mit

zentraler Eindellung

Tierpathogene Pockenviren I

Tierpathogene Pockenviren II:

Lumpy skin disease-Virus (Genus Capripoxvirus)

– Erstbeschreibung im südlichen Afrika (1929)

– Ausbreitung in den mittleren Osten (2013)

und nach Südeuropa (2015)

FAO „SUSTAINABLE PREVENTION, CONTROL AND

ELIMINATION OF LUMPY SKIN DISEASE”

Vacciniaviren als Vektoren

• Einbau des Fremdgens durch homologe

Rekombination

• Rekombination führt zur Deletion des nicht

essentiellen Thymidinkinasegens

• Einsatz der Pockenviren zur Expression

von Fremdgenen für Vakzineentwicklung

• Rekombinante Pockenvirusvektoren als

Tollwutimpfstoff

3. FAMILIE BACULOVIRIDAE

Familie Baculoviridae

Genus Nucleopolyhedrovirus

Spezies Autographa californica multiple

nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)

Genus Granulovirus

Spezies Cydia pomonella Granulovirus (CpGV)

Apfelwickler

Luzernenspanner

Baculoviren: Phylogenie

Figure 4 Phylogeny of the Baculoviridae. The maximum likelihood tree,

based on the alignment of 30 genes, shows the relationships of the 39

species for which a completely annotated genome was available at time

of analyses. Abbreviations are defined in lists of species and related

viruses.

ICTV,

2016

Baculoviren: Phylogenie

- zirkuläre dsDNA; behüllt

- Genom ca. 80 - 180 kbp

- sehr enges Wirtsspektrum (Arthropoden)

- Replikation im Zellkern

- kodieren für ca. 100 - 200 Proteine

Baculoviren

Strukturen der Alpha- und Betabaculoviren

Baculoviren: Genomorganisation

Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)

Anwendung von Baculoviren

- Herstellung rekombinanter Proteine

- Gentransfer in Säugerzellen

- Biologische Schädlingsbekämpfung (Obstbau)

- Einfügung eines Fremdgens in eine nicht-essentielle

Region des viralen Baculovirusgenoms via homologe

Rekombination oder Transposon-vermittelte

Integration

- hohe Expressionsrate

- korrekte Faltung der rekombinanten Proteine

- Oligomerisierung und posttranslationale Modifikation

- biologische Aktivität des exprimierten Proteins

Baculovirus-Expressionssystem

Purification of carboxyterminal 6xHis-tagged GFP

Protein by Ni-agarose affinity chromatography About 108 SF9 cells were infected with GFP-expressing

recombinant baculovirus

rGFP-BAC, cells were harvested 4 days p. i. and 6His-GFP was

purified using Ni-agarose. Total yield was approximately 3mg

protein.

1- cell lysate 4- elution 1

2- cleared supernatant 5- elution 2

3- flow trough 6- elution 3

kDa

30

1 2 3 4 5 6

Coomassie-blue stain

Western blot

with a-6His MAb

30

Plaque-Assay mit VSV

0

20

40

60

80

100

120

-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8Verdünnung IFN-a

VS

V I

nh

ibie

run

g i

n %

~16kDa

IFN-a-Expression mittels Baculoviren

Klonierung in pFBDhistag

Reinigung rekombinanter Baculoviren (RGS-6HIS)

Proteinreinigung über Ni-NTA (6 HIS)

Antikörperherstellung im Kaninchen

Biologische Wirksamkeit von

IFN-a im VSV-Test

IFN-a Aktivität: 3x106 U/ml

Neutralisierende Wirkung von

anti-IFN-a-Serum im VSV-Test

Serum Verdünnung 1:10 inaktiviert ca.1011

Moleküle IFN-a

Nucleokapside

binden an die

Kernporen.

Im Kern wird

das virale Genom

freigesetzt.

Entnommen aus van Loo et al. (2001). J.Virol. 75, 961-970

Baculovirus Infection of Nondividing Mammalian Cells: Mechanisms of Entry and Nuclear Transport of Capsids.

Umhüllte

Viren werden

via Endocytose

aufgenommen

Rekombiante Baculoviren für die Transduktion von

Säugerzellen (MammBac Technology)

Tn7R

PolH Tn7L

GmR

ApR GFP ORF

MKSV ORF

MCMVie1

DH10Bac E.coli Zelle Helferplasmid

TetR

Bacmid Transposition

Tn7R

PolH Tn7L

GmR

ApR

MCMVie1

Bacmid

mit

Insertion

Bacmid

mit

Insertion

Virusanreicherung in Insektenzellen

PolH Promotor: +++

MCMVie1 Promotor: (+)

Rekombinante Baculoviren

Expression heterologer Gene in Säugerzellen

PolH Promotor: --

MCMVie1 Promotor: +++

Transformation

Isolierung der

rekombinanten Bacmid-

DNA Transfektion der

Bacmid-DNA in

HIGH V Zellen

Transduktion

4. ZUSAMMENFASSUNG

DNA-Viren: Übersichtstabelle

Virusfamilie Parvoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae Poxviridae

Virusgröße 18-26 nm 40-45 nm 55 nm 80-110 nm 300 x 200 x 100 nm

Genom ssDNA, linear dsDNA, zirkulär dsDNA, zirkulär dsDNA, linear dsDNA, linear

Genomlänge 4,8-5,6 kB ca. 5,2 kBp ca. 8 kBp 36-38 kBp 137-360 kBp

Kodierungs-strategie

eine Leserichtung, überlappende ORF

ambisense, überlappende ORF

eine Leserichtung, überlappende ORF

ambisense, überlappende ORF

ambisense, selten überlappende ORF

Hülle keine keine keine keine mehrere Hüllmembranen

Kapsid ikosaedrisch, VP1, VP2, (VP3)

ikosaedrisch, VP1, VP2, VP3

ikosaedrisch, L1, L2

ikosaedrisch, Pentonbasisprotein (pIII), Fiberprotein (pIV), Hexonprotein (pII) u.a.

komplex, über 70 verschiedene virale Proteine (A56R, A4L, L4R, u.a.)

Replikation „rolling hairpin“-Modell bidirektional, semikonservativ

bidirektional, semikonservativ

semikonservativ ähnlich der Parvovirus-Replikation

Replikationsort Zellkern Zellkern Zellkern Zellkern Zytoplasma

Replikations-enzym

zelluläre DNA-Polymerase

zelluläre DNA-Polymerase

zelluläre DNA-Polymerase

virale DNA- Polymerase

virale DNA-Polymerase und weitere Enzyme

Übertragung Tröpfchen, fäkal-oral, vertikal, Blutprodukte

Schmierinfektion Hautkontakt, sexuell, perinatal

Aerosol, fäkal-oral, kontaminierte Gegenstände und Flüssigkeiten

unterschiedliche Übertragungswege (wichtige Zoonoseerreger)

Wirtsspezifität hoch (hoch) hoch niedrig unterschiedlich

Humanpatho-gene Vertreter

Parvovirus B19, Humanes Bocavirus (Parv4)

JCPyV, BKPyV, WU-PyV, KI-PyV, MCPyV und 9 weitere (3.1. 2018)

HPV 1-225 (4.12. 2018)

Arten (Subgenera) A-G , Genotypen (HAdV) 1-90 (7.1.2019)

(Variolavirus), Vacciniavirus, Affen- und Kuhpockenviren, u.a.

Erkrankungen Ringelröteln, Erkrankungen des Respirationstraktes und des Gastro-intestinaltraktes

PML bei HIV-Infektion, Organ-abstoßung nach Nierentransplan-tation

Papillome, Karzinome

Erkältungen und andere Erkrankungen des Respirationstraktes, gastrointestinale Erkran-kungen, Keratokonjunktivitis

Hautläsionen, Hämorrhagien, systemi-sche Erkrankungen, z.T. hohe Lethalität

DANKSAGUNG

Dr. G. Flunker, Greifswald

Dr. S. Eßbauer, München

Dr. G. Keil, Riems

J. Möller, Riems

Vielen Dank für Ihre

Aufmerksamkeit!