Ingo Rechenberg

PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung „Bionik II / Biosensorik“

Zwischen Bionik und Biotechnologie

Wie baut man einen Biosensor ?

Weiterverwendung nur unter Angabe der Quelle gestattet

Biotechnologie versus Bionik

Lotus Effekt

Biotechnologie

Bionik

versus

Lotusblatt-Zellkultur

Erkundung des Effekts

Synthetisches Produkt

Photobiologische

Wasserstoffproduktion

Heterocyste

Vegetative ZelleH O2

O 2

H2N

2

Biotechnologie

Bionik

versus

2 2

COCH O

2

2<

<

O H

Algen-Analoga Bakterien-Analoga

2H

BlaualgeNostoc muscorum

Konstruktion eines

Schallschnelle-Vektormessgeräts

Partikel Geschwindigkeit

Biotechnologie

Bionik

versus

Technische Schaltung

Der bionische Ansatz zur Realisation einer künstlichen Nase

AC

Rezeptor

G-Protein

ATP

ATP

ATPcAMP

cAMP

cAMP cAMP cAMP

cAMP

cAMP

AC = Adenylcyclase

cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat

Vorbild Biologie: Verstärkung durch eine Enzymkaskade

Duftstoff

Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft

1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor

2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein

3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)

4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP

5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an

6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen

7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal

Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft

1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt

2. Es entsteht Metarhodopsin

3. Metarhodopsin zerfällt in Opsin und all-trans Retinal

4. Metarhodopsin aktiviert Transducin

5. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE)

6. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP

7. Dadurch schliessen sich Na-Kanäle

8. Es kommt zu einer Hyperpolarisation

9. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV

3 000

2 000

Molekulare Verstärkung: 6 000 000

Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade

Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !

"Katalyse ist die Beschleunigung eines langsam verlaufenden chemischen Vorgangs durch die Gegenwart eines fremden Stoffes" (1894).  

"Ein Katalysator ist jeder Stoff, der, ohne im Endprodukt einer chemischen Reaktion zu erscheinen, ihre Geschwindigkeit verändert. (1901)"    Wilhelm Ostwald

Wilhelm Ostwald (1853-1932)

Durch einen Molekularstrahl, in dem Moleküle gebündelt in eine Richtung geschickt werden, konnte nachgewiesen werden, dass die Aufspaltung der C-O-Bindung des Methanols gerade an den Kantenatomen ( ) der Palladium-Katalysatorteilchen besonders beschleunigt wurde.

Dr. Jörg Libuda, Prof. Hans-Joachim FreundFritz-Haber-Institut Berlin

Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade

NS

N

S

NS

oder

Mechanisches Modell eines Moleküls, das in eine andere Form umgewandelt wird (z. B. Rhodopsin in Metarhodopsin)

NS

N

S

Mechanisches Enzym

NS

NS

NS

NS

NS

NS

NS

· · ·1000

· · ·1000

1000

1000 000

NS

1000 000

> 1 000

> 1 000 000

1

An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten

Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden

Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten

Das sieht dann so aus:

Extreme Empfindlichkeit

Selektivität auf biologische Stoffe

Was zeichnet den Biosensor aus ?

Extreme Empfindlichkeit

Der geschichtlich erste Biosensor, der die

Selektivität auf eine biologisches Substanz nutzte

Der Glukose-Biosensor

Messlösung

Elek

trode

ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran

Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor?

Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickeltText

Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode

S cha lt-kre is

S ignal- m o lekü le S ignalum form er A nze igegerä t

S ensor

Schema eines Biosensors

Molekulare Formerkennung

Funktionsprinzip eines Biosensors

AnalytlösungSelektor

(Rezeptor) Effekt Transducer

Elektrode

Thermistor

Piezokristall

Verstärker

ChemischeSubstanz

Temperatur

Licht

Masse

ElektrischesPotenzial

El e

ktri

sch

es

Sig

na

l

In Biosensoren benutzteImmobilisierungsmethoden

Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix

Kovalente atomare Bindung des Enzyms

Enzym in semipermeabler Membran-Hülle

Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms

Enzym

Technisches Substrat

Enzym-Vernetzung

Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen

Kann noch kein Eiweiß spalten !

Magensäure

Kann Eiweiß spalten.Pepsin: Pepsinogen:

Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym

Immobilisiertes

Magensäure

Messung desEiweiß-Spaltprodukts

Eiweißspaltung

PepsinPepsinogen

Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym

Funktionsprinzip eines Biosensors

AnalytlösungSelektor

(Rezeptor) Effekt Transducer

Elektrode

Thermistor

Piezokristall

Verstärker

ChemischeSubstanz

Temperatur

Licht

Masse

ElektrischesPotenzial

El e

ktri

sch

es

Sig

na

l

G lucose O 212

G lucose-oxidase+ G luconolacton + O 2H 2OH 2+ + 7 kcal

G lucono-lactonase

G luconsäure H ++

Kalorimetrie

Am perom etrieLum ineszenz

pH-E lektrodeM O SFET

Sauerstoffe lektrodeLum ineszenz

Mögliche technische Messaufnehmer

für einen Glukose-Biosensor

Zum Glukosesensor

Glukose-Sensor heute

Thermodynamik

Mikrogravimetrie Photometrie

Elektrochemie

Transducer

Kalorimetrie

Mechanik Optik

PotenziometrieAmperometrie

KonduktometrieTemperaturmessungWägung

Lumineszenz-, Farb-Messung

Voltammetrie

Potenzialdifferenz bei Strom NullStrom bei konstanter SpannungStrom mit SpannungsänderungWiderstands/ Leitfähigkeitsmessung

VElektrode 1 E lektrode 2Leitende Brücke

E lektrolyt

M etallstab

E lektro lyt

Wird eine Metallelektrode in einen Elektrolyten getaucht, so werden an der Phasengrenze Ladungsträger verschoben. Die Potenzialdifferenz ist aber separat nicht messbar.

Um das Potenzial zu messen ist eine zweite (Ableit)elektrode notwendig !

Elektrochemische Zelle

Bei der Amperometrie wird an die Elektroden ein konstantes Potenzial gelegt und der dadurch resultierende Stromfluss gemessen.

Arbeitselektrode Referenze lektrode

E lektro lyt

A

Angelegtes Potenzial

z. B. 600 mV

)(red

oxln cc

FzTRU

Konzentrationselement

NERNSTsche Gleichung

Semipermeable Membran A gA g e- e-e-

U = SpannungR = GaskonstanteT = Absolute TemperaturF = Faraday-Konstantez = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronenc = Elektrolytkonzentration

U

NO3

cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels

cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels

Reduktion = Elektronenaufnahme, Oxidation = Elektronenabgabe in der Chemie

Weitere Beispiele für Biosensoren

Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede-nen Pflanzen aufspüren.

Foto

: For

schu

ngsz

entru

m J

ülich

Biosensor für Knoblauch

Foto

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ngsz

entru

m J

ülich

Biosensor für Zyanid

Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an.

Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei-sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän-derung registriert.

Der Penicillinsensor besteht auseinem Schichtpaket aus Aluminium, p-dotiertem Silizium, Siliziumdioxid,pH-empfindlichem Siliziumnitridund dem Penicillin abbauendenEnzym Penicillinase. Das Enzymist mit “Cross-Linker-Molekülen” an die Oberfläche gekoppelt.

Penicillin-Biosensor

Taucht der Sensor in eine penicillin-haltige. Lösung, werden bei der enzymatischen Reaktion Wasser-stoffionen frei. Diese lagern sich an die Siliziumnitridoberfläche an und ändern die elektrische Kapazität des Schichtpaketes.

Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment

VerkapselungPlatinelektrode

Siliziumchip

Aktive Sensoroberfläche

Elektr. AnschlussEnzym immobilisiertin einer Matrix

SiO2

300 m µ

130 m µ

Glukosesensor in Mikrosystemtechnik

G ehäuse

Source (Quelle)

G ate (Tor)M em bran

Enzym gem isch

Drain (Senke)Isolator

Spannungsquelle S trom m essgerät

A

pn n

Referenzelektrode

Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)

Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.

Kupfer

Isolatoren Halbleiter Metalle

Kunststoffe

GlasGlimmer

DiamantQuarz

Selen

Germanium

Silizium

10 10 10 10 10 10 10-16 -12 -8 -4 0 4 8

Silber

Eisen

Leitfähigkeit 1m

Silizium

Bor

Phosphor

p-dotiert

n-dotiert

Fähigkeit der Elektronenleitung

und Löcherleitung

im dotierten Halbleiter

Beispiel: “Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken

Zur Menge des Dotierungsstoffs im Halbleiter

n-dotiert p-dotiert

+

SperrschichtDurchlass+

Bewegung der Elektronen Bewegung der LöcherBewegung der Elektronen Bewegung der Löcher

Mit Elektronen und „Löchern“ verarmte SchichtMit Elektronen und „Löchern“

angereicherte Schicht

MOSFET

p-dotiert

n n

p

n-dotiert

DrainSourceGate

Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span-nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.

Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor

n n

p

SG

D

p-dotiert

n-dotiert

MOSFET

Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke. Liegt rechts die positive Spannung an kommt es zu einer Driftbewegung der Elektronen von links nach rechts.

n n

p

S DG

p-dotiert

n-dotiert

CEMFET BIOFET

Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.

Signalmolekül

Rezeptor

Membran

Ionen

VImmobilisierte Enzyme

n n

p

S DG

Vergleich

Na+-Tore / BIOFET

Im weitesten Sinn ähneln sich Zellmembran und Halbleiter. Statt Poren in einer Membran zu öffnen werden Poren in einem Halbleiter durchlässig, jeweils gesteuert durch das vom Signalmolekül aktivierte Enzym. Statt mit Ionen arbeitet die Elektrotechnik aber mit Elektronen!

A

A

Bei der klassischen Elektronenröhre verhält sich das Steuergitter

wie die Membran einer Sinnes-zelle, deren Durchlässigkeit enzymatisch kontrolliert wird.

Extreme Empfindlichkeit

Selektivität auf biologische Stoffe

Was zeichnet den heutigen Biosensor aus ?

Extreme Empfindlichkeit

Es fehlt das Kaskadenprinzip !

Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode

Glukose: Amperometrischer Biosensor

Harnstoff: Potentiometrischer Biosensor

Amperometrischer BiosensorLactat:

Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay

Piezoelektrizität Immunoassay

Candida albicans:

Cholesterin: Amperometrischer Biosensor

Penicillin:

Ionenselektive Glas-ElektrodeNatrium:

Potentiometrischer Biosensor

Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode

Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-Sensor

pH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode

Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik

Zyanid-Biosensor

Formaldehyd-BiosensorEnzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3

Anthrax-Biosensor

Harnstoff-BiosensorEnzym Urease

Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak

Enzym ???

Enzyme für Biosensoren

Ende

www.bionik.tu-berlin.de

Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.

Messlösung

Elek

trode

ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran

Reaktionsschritte in einem Glukose-BiosensorDer Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt