20.

Ingo Rechenberg

Zwischen Bionik und Biotechnologie

Wie baut man einen Biosensor ?

PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung Bionik II (Biosensorik / Bioinformatik)

Biotechnologie versus Bionik

Lotus Effekt

Superhydrophob

Cassie-Baxter-Effekt

Biotechnologie

Bionik

versusLotusblatt-Zellkultur

Erkundung des Effekts

Synthetisches Produkt

Biologisches Produkt

Photobiologische Wasserstoffproduktion

Heterocyste

Vegetative ZelleH O2

O 2

H2N 2

Biotechnologie

Bionik

versus

2H

BlaualgeNostoc muscorum

Unter sehr speziellen Bedingungen

2 2

COCH O

22

O H

Veg.-Zellen-Analoga Heterocysten-AnalogaKein Stickstoff!Fehlreaktion.Wasserstoffwird freigesetzt. Kohlendioxid = Container für Wasserstoff

Konstruktion eines

Schallschnelle-Vektormessgeräts

Partikel Geschwindigkeit

Biotechnologie

Bionik

versus

Technische Schaltung

Der bionische Ansatz zur Realisation einer künstlichen Nase

AC

Rezeptor

G-Protein

ATP

ATP

ATPcAMP

cAMP

cAMP cAMP cAMP

cAMP

cAMPAC = Adenylcyclase

cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat

Vorbild Biologie: Verstärkung durch eine Enzymkaskade Duftstoff

Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft

1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal

Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft

1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt2. Es entsteht Metarhodopsin 3. Metarhodopsin aktiviert Transducin 4. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE) 5. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP 6. Dadurch schließen sich Na-Kanäle 7. Es kommt zu einer Hyperpolarisation8. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV

3 000

2 000

Molekulare Verstärkung: 6 000 000

Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade

Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !

"Katalyse ist die Beschleunigung eines langsam verlaufenden chemischen Vorgangs durch die Gegenwart eines fremden Stoffes" (1894).  

"Ein Katalysator ist jeder Stoff, der, ohne im Endprodukt einer chemischen Reaktion zu erscheinen, ihre Geschwindigkeit verändert. (1901)"    Wilhelm Ostwald

Wilhelm Ostwald (1853-1932)

Einmolekülmessung durch Synthese einer Katalysatorkaskade

Rezeptor

Signalmolekül100

10 000

1

Katalysator

Katalysator

Katalysator

ynth e se

S

ynth e se

S

Abstraktes Modell:

„Einen Naturvorgang verstehen heißt, ihn in Mechanik zu übersetzen“

Herrmann von Helmholtz

Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade

NS

NS

NS

oder

Mechanisches Modell eines Moleküls, das in eine andere Form umgewandelt wird (z. B. Rhodopsin in Metarhodopsin)

NS

NS

Mechanisches Enzym

Wird frei, um ein weiteres Modellmolekül zu verwinkeln

NS

NS

NS

NS

NS

NS

NS

· · ·1000

Soll jetzt einEnzym sein

· · ·1000

1000

1000 000

NS

1000 000

> 1 000

> 1 000 000

1

Schmetterlingsmoleküle

An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten

Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden

Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten

Das sieht dann so aus:

Extreme Empfindlichkeit

Selektivität auf biologische Stoffe

Was zeichnet den Biosensor aus ?

Extreme Empfindlichkeit

Der geschichtlich erste Biosensor, der die Selektivität auf eine biologisches Substanz nutzte

Der Glukose-Biosensor

Messlösung

Plat

inan

ode

ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran

Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor?

Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickeltText

Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode

S cha lt-kre is

S ignal- m o lekü le S ignalum form er A nzeigegerä t

S ensor

Schema eines Biosensors

Molekulare oder Nano-Formerkennung

Funktionsprinzip eines Biosensors

AnalytlösungSelektor

(Rezeptor) Effekt Transducer

Elektrode

Thermistor

Piezokristall

Verstärker

ChemischeSubstanz

Temperatur

Licht

Masse

ElektrischesPotenzial

Elek

tri s

ches

Sig

n al

Nan

o-Fo

rmer

kenn

ung

In Biosensoren benutzteImmobilisierungsmethoden

Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix

Kovalente atomare Bindung des Enzyms

Enzym in semipermeabler Membran-Hülle

Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms

Enzym

Technisches Substrat

Enzym-Vernetzung

Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen

Magensäure

Kann Eiweiß spalten.Kann noch kein Eiweiß spalten !Pepsinogen: Pepsin:

Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym

Beim Pepsinogen steckt der grüne „Proteinschlüssel“ noch nicht im großen Molekülknäuel. Das Enzym ist inaktiv! Bei Anwesenheit von Magensäure wird der grüne Schlüssel eingesteckt und so

das Enzym aufgeschlossen. Pepsinogen wird zum Eiweiß spaltenden Pepsin.

Immobilisiertes

Magensäure

Messung desEiweiß-Spaltprodukts

Eiweißspaltung

PepsinogenPepsin

Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym

Funktionsprinzip eines Biosensors

AnalytlösungSelektor

(Rezeptor) Effekt Transducer

Elektrode

Thermistor

Piezokristall

Verstärker

ChemischeSubstanz

Temperatur

Licht

Masse

ElektrischesPotenzial

Elek

tri s

ches

Sig

n al

Nan

o-Fo

rmer

kenn

ung

G lucose O 212

Glucose-oxidase+ G luconolacton + O 2H 2OH 2+ + 7 kcal

Glucono-lactonase

G luconsäure H ++

Kalorimetrie

Am perom etrieLum ineszenz

pH-E lektrodeM OSFET

Sauerstoffe lektrodeLum ineszenz

Mögliche technische Messaufnehmer für einen Glukose-Biosensor

Zum Glukosesensor

Glukose-Sensor heute

Thermodynamik

Mikrogravimetrie Photometrie

Elektrochemie

Transducer

Kalorimetrie

Mechanik Optik

PotenziometrieAmperometrie

KonduktometrieTemperaturmessungWägung

Lumineszenz-, Farb-Messung

Voltammetrie

Potenzialdifferenz bei Strom NullStrom bei konstanter SpannungStrom mit SpannungsänderungWiderstands/ Leitfähigkeitsmessung

Zur Elektrochemie

Volt- und Amperometrie

)(redoxln c

cFzTRU

NERNSTsche Gleichung

Semipermeable Membran A gA g e- e-e-

U = SpannungR = GaskonstanteT = Absolute TemperaturF = Faraday-Konstantez = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronenc = Elektrolytkonzentration

U

NO3

cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels

cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels

Reduktion = Elektronenaufnahme, Oxidation = Elektronenabgabe in der Chemie

Hoch konzentrierte

Silbernitratlösung

Niedrig konzentrierte

Silbernitratlösung

Ag+

Ag+

Zur Elektrochemie

AgNO3 AgNO3

Weitere Beispiele für Biosensoren

Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede-nen Pflanzen aufspüren.

Foto

: For

schu

ngsz

entru

m J

ülich

Biosensor für Knoblauch

Foto

: For

schu

ngsz

entru

m J

ülich

Biosensor für Zyanid

Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an.

Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei-sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän-derung registriert.

Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment

VerkapselungPlatinelektrode

Siliziumchip

Aktive Sensoroberfläche

Elektr. AnschlussEnzym immobilisiertin einer Matrix

SiO2

300 m µ

130 m µDurch eine kleine Öffnung des Containments stehen das Enzym und die Elektrode mit der Messlösung in Kontakt. Moleküle der Messlösung können in die Enzymmatrix hineindiffundieren, welche bei Anwesenheit des Analyten H2O2 erzeugt. Dieses wird an der Platinelektrode elektrochemisch umgesetzt.

Zum Glukosesensor

G ehäuse

Source (Quelle)

G ate (Tor)M em bran

Enzym gem isch

Drain (Senke)Isolator

Spannungsquelle S trom m essgerät

A

pn n

Referenzelektrode

Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)

Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.

Kupfer

Isolatoren Halbleiter Metalle

Kunststoffe

GlasGlimmer

DiamantQuarz

Selen

Germanium

Silizium

10 10 10 10 10 10 10-16 -12 -8 -4 0 4 8

Silber

Eisen

Leitfähigkeit 1m

SiliziumBorPhosphor

p-dotiert

n-dotiert

Fähigkeit der Elektronenleitungund Löcherleitung

im dotierten Halbleiter

n-Dotierung im Siliziumkristallgitter mit Phosphorp-Dotierung im Siliziumkristallgitter mit Aluminium

Ein noch besseres Schema

Beispiel: “Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken

Zur Menge des Dotierungsstoffs im Halbleiter

n-dotiert p-dotiert

+

SperrschichtDurchlass+

Bewegung der Elektronen Bewegung der LöcherBewegung der Elektronen Bewegung der Löcher

Mit Elektronen und „Löchern“ verarmte SchichtMit Elektronen und „Löchern“

angereicherte SchichtDer Minuspol "presst" Elektronen in die n-Schicht, der Pluspol der Stromquelle saugt Elektronen aus der Sperrschicht ab.

MOSFET

p-dotiert

n n

p

n-dotiert

DrainSourceGate

Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span-nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.

Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor

n n

p

SG

D

p-dotiert

n-dotiert

MOSFET

Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke. Liegt rechts die positive Spannung an kommt es zu einer Driftbewegung der Elektronen von links nach rechts.

n n

p

S DG

p-dotiert

n-dotiert

CHEMFET BIOFET

Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.

Hier findet eine Enzymreaktion statt

Zur Glucoseoxidase-Gluconolactonase-Reaktion

Signalmolekül

Rezeptor

Membran

Ionen

V Immobilisierte Enzyme

n n

p

S DG

Vergleich

Na+-Tore / BIOFET

Im weitesten Sinn ähneln sich Zellmembran und Halbleiter. Statt Poren in einer Membran zu öffnen werden Poren in einem Halbleiter durchlässig, jeweils gesteuert durch das vom Signalmolekül aktivierte Enzym. Statt mit Ionen arbeitet die Elektrotechnik aber mit Elektronen!

A

A

Bei der klassischen Elektronenröhre verhält sich das Steuergitter

wie die Membran einer Sinnes-zelle, deren Durchlässigkeit enzymatisch kontrolliert wird.

Extreme Empfindlichkeit

Selektivität auf biologische Stoffe

Was zeichnet den heutigen Biosensor aus ?

Extreme Empfindlichkeit

Es fehlt das Kaskadenprinzip !

Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode

Glukose: Amperometrischer BiosensorHarnstoff: Potentiometrischer Biosensor

Amperometrischer BiosensorLactat:Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay

Piezoelektrizität Immunoassay

Candida albicans: Cholesterin: Amperometrischer BiosensorPenicillin:

Ionenselektive Glas-ElektrodeNatrium:Potentiometrischer Biosensor

Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode

Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-SensorpH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode

Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik

Zyanid-Biosensor

Formaldehyd-BiosensorEnzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3

Anthrax-Biosensor

Harnstoff-BiosensorEnzym Urease

Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak

Enzym ???

Enzyme für Biosensoren

Ende

www.bionik.tu-berlin.de

Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.

Messlösung

Elek

trode

ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran

Reaktionsschritte in einem Glukose-BiosensorDer Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt

Messlösung

Elek

trode

ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran

Reaktionsschritte in einem Glukose-BiosensorDer Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt

Glucose O212

Glucose-oxidase+ Gluconolacton+ O2H2OH2+ + 7 kcal

Glucono-lactonase

Gluconsäure H++

MOSFET