Regulation der Genexpression: regulierbare Promotoren,

Proteine und siRNA

Serap Klein, AG Grez

Biochemie Praktikum

Ebenen der Genregulation in Eukaryoten

Chromatin

Transkription

RNA-Processing

RNA-Stabilität und -Transport

TranslationProtein-Reifung/Modifikation

Cytoplasma

ZellkernIntrons Exons

Gen

AAAAA

AAAAA

AAAAA

Cap

mRNA

Protein

DNA

Transkription

RNAi

Protein-Tuning

Regulation auf Ebene der Transkription

Beispiele:1. Metallothionein-Promoter

2. Tetracyclin-regulierbare Systeme

3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme

und viele mehr….

1. Metallothionein-Promoter

-260 -150 -140 -70 -60 -50 -20 0

GRE MRE MRE MRE MREGC TATA

MRE: Metal responsive elements

Promoter des Metallothionein1 Gens der Maus• wird durch Schwermetalle aktiviert (zu Beginn wurde dafür Cadmium benutzt) •Genprodukt dient der detoxifikation

•Spätere, modifizierte Varianten des Promoters erlauben die Aktivierung mit Zink

Nachteile:System ist sehr “leaky”Metalle sind oft entweder toxisch oder beinflussen massiv die Physiologie (Zink)Meist längere Zeiten bis der Promotor wieder inaktiv wird (besonders in vivo)

2. Tetracyclin regulierbare SystemeTn10 Transposon aus E. coli codiert für Tetracyclinresistenz

TREPromoter TRE

Tet-Repressor

-Tetracyclin

TREPromoter TRE

+Tetracyclin

Tet-Operator

PCMV Tet-Repressor

+ Dox

tetO Reporter-Gen

Tet-Repressor System

PCMV Tet-Repressor

-Dox

tetO Reporter-Gen

Dox: Doxycyclin – ein Tetracyclin-Analogon

- Dox +Dox

- Dox +Dox

Weiterentwicklungen : Der Tet-Repressor ist mit einem Transregulator fusioniert

Promoter TetR VP16

Tet-Off

Tetracyclin-Bindestelle

DNA-Bindedomäne

Transaktivator-Domäne

tTATetracyclin regulierbarer Transaktivator

Tet-Off/On Systeme

Tet-Off Tet-On

Tet-Off: ist Tet da, keine TK Tet-On: ist Tet da, dann TK

Tet-Off/On Systeme

Vor- und Nachteile von Tet-Regulierbaren Systemen:

• Relativ hohes Maß an Aktivierung

• Einfach und vielseitig, funktioniert in fast allen Zellen und auch in vivo (Mausmodellen)

• Mit Doxycyclin gute Verfügbarkeit im gesamten Organismus (alle Zellen werden erreicht).

• Systeme sind zu “leaky”, um toxische Proteine zu exprimieren.

3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme

Estradiol

Zelle

Zielgen

NNAGGTCANNNTGACCTNNEstrogen response element

Estradiol-rezeptor

Prinzipieller Aufbau:

DNA-Bindung

Ecdysonrezeptor

Liganden-Bindung

GAL4- DNA-Bindedomäne(aus Hefe)

Dimerisierung

Rezeptor Aktivator

Transaktivator

Retinsäurerezeptor (RXR) Dimerisierungsdomäne

VP16 Transaktivator-Domäne aus HSV

RheoSwitch-System (New England Biolabs)

Vor- und Nachteile :

•Sehr hohes Maß an Aktivierung (10.000X)

•Sehr geringe basale Aktivität

•Der Ligand besitzt gute Eigenschaften in Bezug auf Nebenwirkungen, Stabilität und “Biodistribution – und availability”

Regulation auf RNA-Ebene:RNA-Interferenz (RNAi)

• natürlicher Mechanismus in eukaryotischen Zellen

• wichtige Rolle in der Genregulation und Abwehr von Viren

• hemmt die Expression einzelner Gene

• post-transkriptionell oder translationell

• führt zur Spaltung oder zur Translationsblockade einer Ziel-mRNA

• reduziert somit die Produktion spezifischer Proteine

• RNA als Ziel erkennendes Molekül

miRNA

siRNA

shRNA

Dicer: Rnase III Ribonuclease,• Spezifität für dsRNA,• Schnitt alle ~ 22 Nukleotide• 5‘-Phosphat , 3‘-Überhang

RISC: RNA induced silencing complex• 250K Precursor Complex• 100K aktiver Komplex nach Bindung von ATP und „unwinding“ von dsRNA zu ssRNA

RNA interference

Dicer

RISC

miRNA

• micro RNA

• kleine ssRNA (17-23Nt): biologisch aktive Form

• ca.1-3% der Gene im Genom höherer Eukaryonten kodieren für

spezielle miRNAs ⇨ endogene RNAs

• spielen bei der Steuerung einer Vielzahl von zellulären Prozessen

eine entscheidende Rolle

• wirken hauptsächlich über RNAi, als negative Regulatoren der

Genexpression auf Translationsebene

n Transkription der miRNA-Gene durch RNA Pol II im Kern:

pri-miRNA (primary miRNA):

§ Prozessieren der pri-miRNA durch Drosha (RNase III) im Kern:pre-miRNA (precursor miRNA):

§ Transport über den Exportin 5 Rezeptor ins Cytoplasma§ Schneiden der pre-miRNA durch Dicer (RNase III):

ds miRNA:§ Einbau des „anti-sense“-Stranges in den RISC Komplex:

§ Erkennen und Binden der komplementären mRNA:

a) vollst. Basenpaarung: Abbau der mRNA

b) unvollst. Basenpaarung: Hemmung der Translation

miRNA

miRNA

miRNAs haben generell keine perfekte Komplementarität zum Target,daher bildet sich ein Loop aus typisches Merkmal von miRNAs

siRNA

• small interfering RNA• kurze dsRNA (19-28 Nt) mit Einzelstrangüberhängen• Entstehung:

a) herausgeschnitten aus langer dsRNA (z.B durch viralen Befall)

durch das Enzym Dicer

b) synthetisch ⇨ Transfektion von Zellen• wirken über RNAi und führen somit zu einer verminderten Expression

spezifischer Proteine (knockdown)

Auswahlparameter für „target sequence“

• 19-23nt unique sequence (max. 15bp matches zu anderen Genen)• Bereich der CDS• Sequenzen sollen nicht im Bereich von 100bp des TK-Starts bzw.

der TK-Termination sein• Base an +1 Position soll ein Purin sein (für POL III Effizienz)• Die Helix-Struktur soll im 5‘-Bereich des „top-strands“ stabiler sein

als in seinem 3`-Bereich• Für bessere Effizienz des Silencing sollten die beiden Bases

unmittelbar upstream der Target-Sequence AA sein• GC-Gehalt zwischen 30% und 70%, möglichst weniger als 50%

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siRNA

siRNA

Vorteile der Transfektion mit siRNA:Ø schnell und unkompliziertØ gute TransfektionseffizienzØ kaum toxisch

Nachteile der Transfektion mit siRNA:Ø Synthese der RNA: teuerØ nur knockdown, kein knockout → geringe Proteinmengen reichen z.T. aus, um die normale Proteinfunktion zu erhalten Ø transiente Transfektion → Proteinmenge steigt wieder mit fortlaufender Zellteilung

shRNA:

• kurzes RNA Transkript (< 23 Nt), das sich zu einer Stammschleife falten kann

§ Einbringen in die Zelle mittels eines Plasmid-Vektors

kontinuierliche Expression der shRNA

§ führt über den Mechanismus der RNA-Interferenz zum knockdown spezifischer Proteine

kontinuierliche Repression der Translation spezifischer Proteine

Dicer

stabile Transfektion

short hairpin RNA

Vektorbasierte RNAi

Nebenwirkungen

Endogene miRNAs als Regulatoren

Regulierbare Proteine

Regulierbare Proteine

Beispiel: ProteoTuner von Clontech

Ebenen der Genregulation in Eukaryoten

Transkription

RNA-Stabilität

TranslationProteinmodifikation

Cytoplasma

ZellkernIntrons Exons

Gen

AAAAA

AAAAA

AAAAA

Cap

mRNA

Protein

DNA

Transkription

Protein-Tuning

Tet-Off/OnSteroid-Rezeptor-Systeme

RNAi

siRNA –Video

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