Post on 13-Aug-2019
Medizinische Hochschule Hannover
Institut für Versuchstierkunde
Strukturelle, funktionelle und genetische Analyse der
LEW/Ztm-ci2 Ratte-
ein Tiermodell für syndromale Taubheit
INAUGURAL - DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von
Nadine Held
(Grevesmühlen)
Hannover, 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
2. Gutachterin/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2007
Diese Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft
(DFG) im Rahmen des Graduiertenkolleg 705-II "Charakterisierung pathophysiologischer
Tiermodelle" gefördert.
Teile der vorliegenden Dissertation wurden in folgendem Artikel zusammengefasst, der in
Kürze zur Veröffentlichung eingereicht wird:
Nadine Held, Bart M.G. Smits, Edwin Cuppen, Hans J. Hedrich, Dirk Wedekind (2007):
Identification of Myo15 as the causing gene for the deviant phenotype of circling 2 rats.
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 3
2 Literaturübersicht 15 2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte 15
2.2 Rotationsverhalten 18
2.2.1 Lateralität und Bewegungsstörungen bei normalen Tieren 18
2.2.2 Pathophysiologie des Rotationsverhaltens 19
2.2.3 Tiermodelle mit Rotationsverhalten 20
2.2.3.1 Mausmodelle 21
2.2.3.2 Rattenmodelle 24
2.3 Genetik der LEW/Ztm-ci2 Ratte - Vorarbeiten 26
2.4 Kandidaten 27
2.4.1 Kalziumkanäle 27
2.4.2 Unkonventionelle Myosine 29
2.5 Usher Syndrom 32
2.5.1 Krankheitsbild 32
2.5.2 Retinopathia Pigmentosa 34
2.6 Elektroretinographie 35
2.6.1 Photorezeptorzellen 35
2.6.4 Elektroretinographie 36
3 Methoden 38 3.1 Versuchstiere 38
3.1.1 Rattenstämme 38
3.1.2 Genotypisierung 39
3.1.3 Tierhaltung 40
3.2 Kandidatengenanalyse - Sequenzierung 41
3.2.1 Probenentnahme 42
3.2.2 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion 42
3.2.3 Amplifikation der Kandidatengene 43
3.2.4 Sequenzierung 43
3.2.5 Mutationsanalyse 43
3.3 Kandidatengenanalyse - Real Time PCR 44
3.3.1 Probenentnahme 44
3.3.2 Isolierung von Ribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion 44
3.3.3 Reverse Transkription 45
3.3.4 Durchführung der Real Time PCR 45
3.3.5 Auswertung der Daten 46
3.4 Analyse der Proteinstruktur - Klonierung 46
3.4.1 Klonierung der mutationstragenden MyTH4-Domäne 46
3.4.2 Transformation in E. coli 48
3.4.3 Selektion 48
3.4.4 Kontrolle des Ligationsergebnisses 49
3.4.5 Klonierung in den pM765-tev Vektor 50
3.4.6 Transformation des pM765-tev Vektors in E.coli 52
3.4.7 Selektion und Kontrolle des Ligationsergebnisses 52
3.4.8 DNA-Maxipräparation ausgewählter Klone 52
3.5 Analyse der Proteinstruktur - Zellbiologische Methoden 53
3.5.1 Transfektion von Dictyostelium discoideum 53
3.5.2 Selektion transfizierter Zellen mit Geneticin 53
3.5.3 Gewinnung von Sporen 54
3.5.4 Anzucht von D. discoideum aus Sporen 55
3.6 Analyse der Proteinstruktur - Proteinbiochemische Methoden 55
3.6.1 Analytische Proteinpräparation aus D. discoideum 55
3.6.2 Nachweis von Proteinen mittels Gelelektrophorese 55
3.7 Elektroretinographische Untersuchung 56
3.7.1 Übersicht der verwendeten Tiere 56
3.7.2 Dunkeladaptation 57
3.7.3 Narkose 57
3.7.4 Vorbereitung der Versuchstiere 58
3.7.5 Elektroretinographie 58
3.7.6 Kontrolle der Aufwachphase 60
3.8 Histologische Untersuchung der Retina 60
3.8.1 Entnahme der Augäpfel und Fixation der Organe 60
3.8.2 Einbettung, Schnitttechnik und Färbung der Präparate 61
3.8.3 Auswertung der histologischen Präparate 61
3.9 Untersuchung von Umweltfaktoren für die Vergleichsstudie 63
3.9.1 Infektionserreger 63
3.9.2 Lichtintensität 64
3.9.3 Umgebung und Haltungsbedingungen 64
3.10 Statistische Auswertung 65
4 Ergebnisse 66 4.1 Einleitung 66
4.2 Genetische Untersuchung 67
4.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene 67
4.3 Funktionelle Untersuchungen 68
4.3.1 Real Time PCR 68
4.3.2 Proteinanalytik 69
4.4 Pathophysiologische Untersuchungen 72
4.4.1 Elektroretinographische Voruntersuchungen 72
4.4.2 Untersuchungen zum visuellen Phänotyp der LEW/Ztm-ci2 Ratte (MHH)
und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie 73
4.4.2.1 Verhalten 73
4.4.2.2 Vergleich der Körpermasse 74
4.4.2.3 Elektroretinographie 76
4.4.2.4 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes 82
4.4.2.5 Untersuchung von Umweltfaktoren 85
4.4.3 Elektroretinographische Untersuchung der
HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte 88
5 Diskussion 93
5.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte - Phänotyp und Tiermodell 93
5.2 Genetische Untersuchung 94
5.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene 94
5.3 Funktionelle Untersuchungen 99
5.3.1 Real Time PCR 99
5.3.2 Proteinanalytik 100
5.4 Pathophysiologische Untersuchungen 102
5.4.1 Elektrophysiologische Voruntersuchung 102
5.4.2 Untersuchungen zum visuellen Phänotyp der LEW/Ztm-ci2 Ratte (MHH)
und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie 103
5.4.2.1 Tiergruppen 103
5.4.2.2 Verhalten 104
5.4.2.3 Körpergewicht 106
5.4.2.4 Elektroretinographische Untersuchung 107
5.4.2.5 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes 110
5.4.2.6 Untersuchung von Umweltfaktoren 113
5.5 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte als mögliches Tiermodell für das
Usher Syndrom des Menschen 117
5.6 Elektrophysiologische Untersuchung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte 119
5.7 Ausblick 120
6 Zusammenfassung 122
7 Summary 125
8 Literaturverzeichnis 127
9 Anhang I, Material & Methoden 157
9.1 Materialien, Programme und Bezugsquellen; Internet-Adressen 157
9.2 Methoden 169
9.2.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure 169
9.2.1.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure
mit dem NucleoSpin® Tissue Kit 169
9.2.1.2 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Leber und Milz
mit dem NucleoSpin® RNAII Kit 170
9.2.1.3 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Gehirn und Hypophyse
mit dem RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit 171
9.2.2 PCR - Primersequenzen 172
9.2.2.1 Entwicklung von Primern 172
9.2.2.2 Herstellen der Primerlösungen 173
9.2.2.3 Primer für die Genotypisierung
der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte 173
9.2.2.4 Primer für die Sequenzanalysen der Kandidatengene 174
9.2.2.5 Primer für die Expressionsanalyse der Kandidatengene 176
9.2.2.6 Primer für die Klonierung der MyTH4-Domäne 177
9.2.2.7 Primer für die Sequenzierung 177
9.2.3 PCR - Protokolle und Temperaturprofile 177
9.2.3.1 Protokoll und Temperaturprofil für die Standard-PCR
zur Amplifikation genomischer DNA-Fragmente 178
9.2.3.2 Protokoll und Temperaturprofil für die Sequenzanalysen der
Kandidatengene 179
9.2.3.3 Protokoll und Temperaturprofil für die Reverse Transkription
mit dem Omniskript RT Kit 180
9.2.3.4 Protokoll und Temperaturprofil für die Real Time PCR 182
9.2.3.5 Protokoll und Temperaturprofil für die Amplifikation
der MyTH4-Domäne 183
9.2.4 Gelelektrophorese 184
9.2.4.1 Ladepuffer für die PCR-Proben 184
9.2.4.2 Ansetzen des DNA-Längenstandards 184
9.2.4.3 Agarose-Gelelektrophorese 184
9.2.4.4 Kontrolle der RNA-Extraktion
mittels denaturierender Gelelektrophorese 185
9.2.5 Aufreinigung von DNA 186
9.2.5.1 Aufreinigung von PCR-Produkten
mit dem QIAquick PCR Purification Kit 186
9.2.5.2 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
mit dem NucleoSpin® Extract Kit 187
9.2.6 Klonierung von PCR-Fragmenten 187
9.2.6.1 Erzeugung eines A-Überhangs (A-tailing) 187
9.2.6.2 Ligation mit dem pGEM®-T Easy Vector System I 188
9.2.6.3 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit 189
9.2.6.4 Ansatz für den Restriktionsverdau mit EcoRI 189
9.2.6.5 Ansatz für den Restriktionsverdau mit XhoI 190
9.2.6.6 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit 190
9.2.6.7 Restriktionsverdau mit XhoI und NheI im Doppelverdau 191
9.2.6.8 Ligation des pM765-tev Vektors 192
9.2.7 Nachweis von Proteinen 192
9.2.7.1 Extraktion von Proteinen aus D.discoideum 192
9.2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Gele 193
9.2.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Elektrophorese 194
9.2.7.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Coomassie-Färbung 194
9.2.8 Elektroretinographie 195
9.2.8.1 Protokoll der Phänotypisierung 195
9.2.8.2 Testparameter des skotopischen Einzelblitz-ERGs 196
9.2.8.3 Testparameter des photopischen Einzelblitz-ERGs 196
9.2.8.4 Protokoll zur Dokumentation des Versuchsablaufs 197
9.2.9 Untersuchung von Umweltfaktoren 198
9.2.9.1 RT-PCR zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein-spezifischer RNA 198
10 Anhang II, Ergebnisse 199 10.1 Vergleichsuntersuchung 199
10.1.1 Phänotypisierung 200
10.1.2 Gewicht 202
10.1.3 Lichtintensität 203
10.1.4 Histologie 204
Danksagung
Abkürzungsverzeichnis
/ pro
% Prozent
% v/v Volumenprozent
% w/v Gewichtsprozent °C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM mikromolar
A 2Desoxyadenosin-5monophosphat
Abb. Abbildung
abs. absolut
ad auffüllen auf
Amp Ampicillin
AP Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumperoxodisulfat
Aqua dest. destilliertes Wasser
AS Aminosäuren
ATP Adenosintriphosphat
BD Borna Disease, Bornasche Erkrankung
BDV Borna Disease Virus, Erreger der Bornaschen Erkrankung
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
C 2Desoxycytosin-5monophosphat
C- Carboxy-
ca. circa
cd Candela
cds Candelasekunde
cDNA komplementäre DNA
CIAP Alkalische Kälberphosphatase (Calf Intestine Alkaline Phospatase)
cm Zentimeter
CO2 Kohlendioxid
d desoxy
D. Dictyostelium
DA Dopamin
dH2O destilliertes Wasser
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNAse Desoxyribonuklease
DTT 1,4-Dithiolthreitol
E. Escherichia
EB Elutionspuffer
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGTA Ethylenglycoltetraacetat
ERG Elektroretinographie, Elektroretinogramm
evt. eventuell
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations
fw Vorwärtsprimer (forward)
G 2Desoxyguanosin-5monophosphat
G10 G418-Sulfat (Geneticin)
g Gramm
GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
ggr. geringgradig
H.E. Hämatoxylin-Eosin
hgr. hochgradig
His Histidin
(His)8-tag His-Oktapeptid
Hprt Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
Hz Hertz
ID Versuchsnummer
ISCEV Internationale Gesellschaft für klinische Elektrophysiologie des Sehens
Kap. Kapitel
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
LB Luria-Bertani Medium
LBAmp Luria-Bertani Medium, mit Ampicillin versetzt
LP Rückwärtsprimer (Lower Primer)
M molar
m2 Quadratmeter
m3 Kubikmeter
mA Milliampere
max. maximal
MDB membrane desalting buffer
MES 2-(n-Morpholino)ethansulfonsäure
mg Milligramm
MgCl2 Magnesiumchlorid
mhc Haupthistokompatibilitätskomplex (main histocompatibility complex)
MHH Medizinische Hochschule Hannover
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimolar
MOPS 3-Morpholinpropansulfonsäure
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MyTH4-Domäne myosin tail homology-4 Domäne
N- Amino-
nm Nanometer
n.s. nicht signifikant
o- ortho-
ORF Leseraster (open reading frame)
PAA Polyacrylamid
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
pers. Komm. persönliche Kommunikation
pH negativer Logarithmus der Wasserstoffkonzentration
P/S Penicillin/Streptomycin
rev Rückwärtsprimer (reverse)
RNA Ribonukleinsäure
RNAse Ribonuklease
rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkriptase PCR
RP Retinopathia Pigmentosa
RPE Retinales Pigmentepithel
s. siehe
SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS-PAGE denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit SDS
sek Sekunde(n)
SNC suprachiasmaler Nukleus
sog. sogenannt
T 2Desoxythymidin-5monophosphat
Tab. Tabelle
TAME N-Tosyl-L-Argininmethylesterhydrochlorid
TBST Tris buffered saline Tweed
Taq Thermophilus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA
TEMED N, N, N´,N´-Tetramethylethylendiamin
TiHo Tierärztliche Hochschule Hannover
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
U Einheit(en) (Unit(s))
UP Vorwärtsprimer (Upper primer)
V Volt
v/v volume per volume (Volumenanteile bezogen auf das Gesamtvolumen)
vgl. vergleiche
vs. versus
w/v weight per volume (Gewichtsanteile bezogen auf das Gesamtvolumen)
WT Wildtyp
x mal
Xgal Bromchlorindolyl-Galaktose
ZTL Zentrales Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover
Aminosäuren werden nach dem internationalen Ein- oder Dreibuchstabencode abgekürzt.
Die Abkürzung der Basen entspricht den IUB tentative rules.
1. Einleitung 13
1 Einleitung
Die LEW/Ztm-ci2 Ratte entstand 1991 durch eine Spontanmutation im LEW-Inzuchtstamm
im Zentralinstitut für Versuchstierzucht der DFG, Hannover. Aufgrund des rezessiven
Erbgangs der Mutation zeigen ausschließlich homozygote Tiere eine Symptomatik. Diese ist
gekennzeichnet durch motorischen Bewegungsstörungen wie Hyperaktivität, Opisthotonus,
Ataxien und Drehverhalten (LÖSCHER et al., 1996). Das Dreh- oder Rotationsverhalten
(auch circling-Verhalten), eine aktive, stereotype Bewegung um die eigene Körperachse, kann
spontan oder stressinduziert auftreten (PYCOCK, 1980).
Neurochemische Untersuchungen zur Ursache des Rotationsverhaltens zeigten eine Lateralität
im dopaminergen System von LEW-ci2 Ratten (LÖSCHER et al., 1996; FEDROWITZ et al.,
2000). Daneben konnte eine profunde Taubheit homozygoter Tiere nachgewiesen werden.
Diese basiert auf einer Degeneration des neurosensorischen Epithels der Cochlea. Außerdem
wurden motorische Dysfunktionen in Zusammenhang mit zellulären Schädigungen im
vestibulären System gesehen (KAISER et al., 2001).
Mittels Kopplungsanalyse an einer Rückkreuzungspopulation konnte der chromosomale
Bereich, der die ci-Mutation enthält, eingegrenzt werden. Innerhalb dieses Abschnittes, der
auf Chromosom 10 (RNO10q22) lokalisiert war, wurden aufgrund ihrer Funktionen zwei
Kandidatengene identifiziert, das Myo15 und das Kcnj12 (CHWALISZ et al., 2003).
Entsprechend den bis dahin gestellten Befunden gilt die LEW-ci2 Ratte als mögliches
Tiermodell für neurosensorische Taubheit des Menschen (KAISER et al., 2001) und als
Modell für hyperkinetische Bewegungsstörungen (RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et
al., 2000).
Rotationsverhalten als Folge von degenerativen Veränderungen im Innenohr wurde sowohl
bei Maus- als auch bei Rattenstämmen bereits beschrieben (Kap. 2.2.3). Die Symptomatik
dieser Tiermodelle ist dem Phänotyp der LEW-ci2 Ratte auffallend ähnlich. Die
zugrundeliegende Mutation betrifft dabei häufig Gene, die an der Entstehung des humanen
Usher Syndroms beteiligt sind. Diese genetisch und klinisch sehr variable, hereditäre
Erkrankung ist durch eine langsam fortschreitende Netzhautdegeneration (Retinopathia
Pigmentosa) und früh einsetzende Innenohrschwerhörigkeit oder Gehörlosigkeit von Geburt
1. Einleitung 14
an gekennzeichnet (Pro Retina Deutschland e.V.), wobei zusätzlich Gleichgewichtsstörungen
auftreten können.
Interessanterweise entwickelt keines dieser Tiermodelle den für das Usher Syndrom
charakteristischen Augenphänotyp, der funktionelle Störungen und Degenerationen von
Photorezeptorzellen der Netzhaut einschließt. Im Gegensatz dazu gibt es Hinweise auf ein
eingeschränktes Sehvermögen bei LEW-ci2 Ratten, die sich aus Verhaltensbeobachtungen
und funktionellen Untersuchungen ergaben (VON HÖRSTEN, pers. Komm.). In
histologischen Präparaten der Retinae waren Anzeichen degenerativer Veränderungen zu
erkennen (KAMINO, pers. Komm.).
Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war die genetische Charakterisierung der Mutation, die für
den veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte verantwortlich ist. Zu diesem Zweck sollten die
im Vorfeld ermittelten Kandidatengene vollständig sequenziert und mithilfe einer
Referenzsequenz auf Basenunterschiede untersucht werden. Durch Analysen zur Expression
des identifizierten Gens und des betroffenen Proteins sollten die Auswirkungen der Mutation
erforscht werden.
Ein weiteres Ziel war die Charakterisierung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte, da es
Hinweise auf eine Beeinträchtigung des Sehvermögens bei der Mutante gab. Zu diesem
Zweck sollte der Augenhintergrund von Tieren unterschiedlicher Altersgruppen einerseits
funktionell mit Hilfe der Elektroretinographie und andererseits histologisch untersucht
werden. Erste Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die retinale Symptomatik der LEW-ci2
Ratte abhänigig von den Haltungsbedingungen variierte. Aus diesem Grund sollten in einer
Vergleichsstudie LEW-ci2 Ratten sowie Kontrolltiere aus zwei unterschiedlichen
Tierhaltungen untersucht werden. Neben elektroretinographischen und histologischen
Analysen sollten zusätzlich Umwelt- und Haltungsbedingungen beider Einheiten
gegenübergestellt werden.
Die Ergebnisse der genetischen Analysen in Verbindung mit den Resultaten der
Untersuchungen zum Augenphänotyp der LEW-ci2 Ratte sollten eine Einordnung der
Mutante als Tiermodell für die biomedizinische Forschung ermöglichen.
2. Literaturübersicht 15
2 Literaturübersicht
2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte
Im Jahr 1991 fielen in der 96. Filialgeneration des LEW/Han Inzuchtstammes im
Zentralinstitut für Versuchstierzucht der DFG in Hannover Tiere mit abnormalem
Rotationsverhalten auf. Durch Isolation und gezielte Zucht auffälliger Tiere konnte ein als
LEW-ci2 bezeichneter, coisogener Stamm etabliert werden, der seit 1993 am Zentralen
Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover weitergezüchtet wird. Das Symbol
"ci" bezeichnet das Rotationsverhalten (circling). Der Zusatz "2" war notwendig, da bereits
1986 im selben Inzuchtstamm eine nicht näher charakterisierte Mutation (ci1) mit gleichem
Phänotyp aufgetreten war (DEERBERG et al., 1989).
Aufgrund der schlechten Aufzuchtergebnisse drehender Elternpaare werden homozygote
Merkmalsträger der circling2-Mutation mit heterozygoten Geschwistertieren verpaart
(segregierende Inzucht).
Bereits am 18.-20. Lebenstag zeigen homozygote Nachkommen (ci2/ci2) erste Anzeichen
motorischer Anomalitäten. Dazu gehört neben dem Drehverhalten ein Überstrecken des
Kopfes nach caudo-dorsal (Opisthotonus), was auch als "stargazing" bezeichnet wird. Ab der
3.-4. Lebenswoche intensiviert sich das Drehverhalten, welches salvenartig in Form von
engen "nose-to-tail"-Rotationen ausgeführt und unter Einwirkung von Stress noch verstärkt
wird. Neben dem circling-Verhalten und dem Opisthotonus gehören lokomotorische
Hyperaktivität und Ataxie zur Symptomatik der LEW-ci2 Ratte (LÖSCHER et al., 1996).
Die Mutation folgt einem autosomal rezessiven Erbgang, weshalb heterozygote
Geschwistertiere phänotypisch unauffällig sind.
Da der Großteil homozygoter Tiere eine eindeutige Richtungspräferenz der Rotationen zeigt,
wird das Drehverhalten als lateralisiert bezeichnet. Zusätzlich wiesen die Tiere eine
ausgeprägte einseitige Defizienz der Vorderextremitäten contralateral zur spontanen
Drehpräferenz auf (LÖSCHER et al., 1996). Circling-Verhalten und motorische
Hyperaktivität dieser Tiere sind Ursache für geringere Gewichtszunahmen im Vergleich zu
heterozygoten Geschwistern, ihre Vitalität bleibt davon jedoch unbeeinträchtigt (LÖSCHER
et al., 1996; FEDROWITZ, 1999).
2. Literaturübersicht 16
In einer Untersuchung zur Aufklärung des Rotationsverhaltens bei LEW-ci2 Ratten wurden
den Tieren verschiedene zentral wirksame Substanzen appliziert. Die Injektion von
Amphetamin bewirkte bei homozygoten Ratten neben einer gesteigerten Ataxie und
Hyperaktivität eine signifikante Erhöhung der Rotationsrate, was auf eine Imbalanz des nigro-
striatalen DA(Dopamin-)- Systems zurückgeführt wurde (LÖSCHER et al., 1996). Weitere
Hinweise auf eine bilaterale Imbalanz lieferten neurochemische Untersuchungen, die bei
Tieren mit deutlich ausgeprägter Seitenpräferenz eine signifikant geringere Konzentration an
DA und seinen Metaboliten (Homovanillinsäure und 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure) im
Striatum auf der Seite ipsilateral zur Rotationspräferenz offenlegten (LÖSCHER et al., 1996).
Des Weiteren konnten FEDROWITZ et al. (2000) zeigen, dass eine signifikante Erhöhung der
DA-Freisetzung contralateral zur Seite der Drehpräferenz ausschließlich nach Induktion von
Stress, nicht aber in Ruhephasen nachweisbar ist.
Diese Befunde, welche Gemeinsamkeiten zum Ungerstedt-Modell (UNGERSTEDT, 1968)
zeigten, legten zunächst die Vermutung nahe, dass die LEW-ci2 Ratte ein Tiermodell für den
ideopathischen Morbus Parkinson darstellen könnte. Dies bestätigte sich jedoch im Verlauf
weiterer immunhistochemischer Untersuchungen nicht, die zeigten, dass im Unterschied zur
Symptomatik der Parkinson-Krankheit die Anzahl dopaminerger Neurone der SNC und die
Dichte der dopaminergen Terminalen im Striatum keine bilaterale Asymmetrie aufwiesen
(RICHTER et al., 1999). Zusätzlich zu diesen Untersuchungsergebnissen zeichnen sich
betroffene Tiere durch Hyperaktivität und stereotype Kopfbewegungen aus, so dass die LEW-
ci2 Ratte als Modell für hyperkinetische Bewegungsstörungen vorgeschlagen wurde
(RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et al., 2000), wohingegen der Morbus Parkinson eine
hypokinetische Erkrankung darstellt.
Häufig wird Rotationsverhalten bei Ratten und Mäusen jedoch durch Infektionen oder
hereditäre Erkrankungen des Innenohrs aufgrund der Beeinträchtigung des vestibulären
Apparates ausgelöst. Nachdem eine mikrobiologische Pathogenese ausgeschlossen wurde,
erfolgte die funktionelle und histopathologische Untersuchung des cochleären und
vestibulären Systems.
Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit des Hörsinns wurden auditorisch evozierte Potentiale
bei betroffenen und nicht betroffenen LEW-ci2 Ratten abgeleitet. Es konnte gezeigt werden,
dass bei homozygoten Tieren eine vollständige Taubheit vorlag, wohingegen heterozygote
Tiere ein unbeeinträchtigtes Hörvermögen aufwiesen. Histologische Untersuchungen der
Cochlea ergaben einen nahezu vollständigen Verlust des sensorischen Epithels (Cortisches
Organs einschließlich der inneren und äußeren Haarzellen) und der umliegenden
2. Literaturübersicht 17
Ganglienzellen. Weiterhin wurden Degenerationen von Zellen cochleärer Kerngebiete im
Hirnstamm festgestellt. Erhaltene Neurone zeichneten sich durch abnormale Gestalt sowie
reduzierte Größe und Dichte aus (KAISER et al., 2001).
Die Funktionsfähigkeit des vestibulären Systems der LEW-ci2 Ratte wurde anhand eines
Schwimmtests sowie weiterer neurophysiologischer Verhaltensuntersuchungen ("Air-Righting
Reflex", "Tail-Hanging Test") analysiert, die Störungen dieses Organsystems bei
homozygoten Tieren deutlich machten. Mutanten zeichneten sich durch Verlust der
Orientierung und abnormales Schwimmverhalten (Unfähigkeit zu schwimmen mit
korkenzieherartigem Abtauchen) sowie durch Defizite bei den Air-Righting und Tail-Hanging
Tests aus (KAISER et al., 2001; LESSENICH, 2002). Als Ergebnis histologischer
Untersuchungen gab es im Gegensatz zur Cochlea keinen Verlust vestibulärer Haarzellen.
Jedoch wiesen diese kleine Protrusionen in den endolymphatischen Raum auf, die auf
Veränderungen des Zytoskeletts der Haarzellen hinweisen könnten. Weiterhin war eine
Verkürzung der Stereozilien sowie eine Reduktion der Ganglienzellzahl zu beobachten. Da
bei jungen LEW-ci2 Ratten (ca. 4 Wochen alt) jedoch ein Verlust vestibulärer Haarzellen
festgestellt werden konnte, wurde eine Regeneration der Haarzellen während der späteren
Entwicklung angenommen. Vestibuläre Kerngebiete wiesen im medialen vestibulären
Nukleus signifikante Abweichungen hinsichtlich Volumen und Neuronendichte auf, zeigten
jedoch keine morphologischen Veränderungen (KAISER et al., 2001). Aufgrund der bis dahin
festgestellten Befunde wurde die LEW-ci2 Ratte als potentielles Tiermodell für
neurosensorische Taubheitsformen des Menschen vorgeschlagen (KAISER et al., 2001).
Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob das Rotationsverhalten der LEW-ci2 Ratte
im Zusammenhang mit epileptischen Anfällen stehen könnte. Beim Menschen ist eine Form
der Epilepsie beschrieben, bei der Patienten anfallsweise wiederholt auf engen Kreisen laufen
oder plötzlich Rotationen des gesamten Körpers bis hin zu mehreren Drehungen zeigen
(GASTAUT et al., 1986; DONALDSON et al., 1986). Während solcher Rotationsepilepsien
werden paroxysmale Veränderungen im EEG (Elektroenzephalogramm) sichtbar (SAKA et
al., 1996; TRINKA et al., 1997; AGUGLIA et al., 1999). Im Vergleich zu nachweislich
epileptischen WAG/Rij Ratten ("petit mal"-Anfälle) konnten bei den LEW-ci2 Ratten keine
epileptiformen Anomalien während der durchgeführten EEG-Untersuchungen festgestellt
werden (LINDEMANN et al., 2001).
Molekulargenetische Studien zur Kartierung der ci2-Mutation gaben erste Hinweise auf eine
mögliche Beteiligung des visuellen Systems am Phänotypen der LEW-ci2 Ratte. Daraufhin
durchgeführte Verhaltensuntersuchungen und erste elektrophysiologische Tests offenbarten
2. Literaturübersicht 18
Anzeichen eines reduzierten Sehvermögens bei einigen Tieren (VON HÖRSTEN, pers.
Komm., GOCKELN et al., 2003). Erste histologische Untersuchungen wiesen auf eine
mögliche erblich bedingte Degeneration der Photorezeptoren hin (KAMINO, pers. Komm.).
2.2 Rotationsverhalten
2.2.1 Lateralität und Bewegungsstörungen bei normalen Tieren
Das menschliche Gehirn ist auf unterschiedlichen Ebenen lateralisiert mit der Konsequenz
einer großen Reihe von links-rechts-Asymmetrien von Hirnfunktionen (KANDEL, 1995).
Davon beeinflusst sind beispielsweise kognitive Fähigkeiten (LEVY, 1977; KANDEL, 1995)
und Sprachentstehung (KUPFERMANN, 1995). Bei Labornagern wurden hierzu ausführliche
Untersuchungen durchgeführt, die chemische, funktionelle und morphologische Indices für
Hirnasymmetrien offenlegten. So konnten JERUSSI und GLICK 1974 nachweisen, dass eine
systemische Verabreichung von Amphetamin bei normalen, gesunden Sprague-Dawley
Ratten ein lateralisiertes Drehverhalten auslöst, und führten dieses auf eine intrinsische,
bilaterale Imbalanz im DA-Gehalt des nigro-striatalen Systems von normalen Ratten zurück.
Es wurde angenommen, dass Amphetamin eine neurochemische Imbalanz in diesem System
verstärkt, indem es auf einer Seite größere Mengen an DA freisetzt, mit der Konsequenz, dass
die Ratte nun vermehrt in die bereits basal vorhandene, dominante Richtung gesteuert wird.
Die Differenz im DA-Gehalt zwischen rechtem und linkem Striatum, welche sich nach
Amphetamin-Applikation auf ca. 25% verstärkt, beträgt bei normalen Ratten 10-15% (GLICK
et al., 1976). Weiterführende Untersuchungen konnten zeigen, dass z.B. Sprague-Dawley
Ratten während ihrer nächtlichen Aktivitätsphasen spontan mit Seitenpräferenz drehen, dass
diese bevorzugte Drehrichtung konstant bleibt und mit der Amphetamin-induzierten
Richtungspräferenz übereinstimmt (GLICK et al., 1978). Weiterhin konnte ein Einfluss des
Kortex auf das Rotationsverhalten nachgewiesen werden. So moduliert die Aktivität des
frontalen Kortex die mesolimbischen und nigro-striatalen DA-Funktionen (GLICK und
GREENSTEIN, 1973; ROSS und GLICK, 1981; CARTER und PYCOCK, 1980). Eine
Aktivierung des mesokortikalen DA-Systems durch Stressoren induziert einen Wechsel der
Rotationsrichtung (CARLSON et al., 1987).
1986 konnten SHAPIRO et al. nachweisen, dass zwei Arten von Populationen existieren, und
zwar Populationen mit Drehrichtung weg von und solche mit Drehrichtung hin zur Seite des
2. Literaturübersicht 19
Striatums mit der höheren DA-Konzentration. Diese Feststellung ließ vermuten, dass der Grad
der striatalen DA-Asymmetrie ausschließlich die Stärke des Rotationsverhaltens bestimmt,
die Drehrichtung jedoch von weiteren Faktoren beeinflusst wird. Weitere Untersuchungen
zum Rotationsverhalten konnten zeigen, dass der überwiegende Teil der Ratten eine
Rechtspräferenz aufweist (GLICK et al., 1979).
Interessanterweise ist das Drehverhalten (Anzahl an Rotationen innerhalb einer bestimmten
Zeiteinheit) bei weiblichen Tieren stärker ausgeprägt (SHAPIRO et al., 1986). Die Ursache
dafür wird in dem Einfluss von Östrogenen vermutet, da nachgewiesen wurde, dass weibliche
Ratten während des Östrus eine höhere Anzahl von Drehbewegungen ausführen (BECKER et
al., 1982). McDERMOTT konnte 1993 zeigen, dass weibliche Steroide einen Einfluss auf die
Aktivität nigro-striataler DA-Neurone ausüben.
2.2.2 Pathophysiologie des Rotationsverhaltens
Rotationsverhalten wird entweder zentral ausgelöst oder findet seine Ursache peripher in
Defiziten des vestibulären Systems im Innenohr.
Erkrankungen mit lateralisierter Ausprägung, die mit Bewegungsstörungen einhergehen,
entstehen oftmals in den Basalganglien, bei denen es sich um kortikale Kerngebiete handelt,
die Bewegungen modulieren. Zu diesen Erkrankungen zählt die Rotationsepilepsie, bei der
Patienten während typisch epileptiformer Anfälle wiederholt auf engen Kreisen laufen oder
plötzliche Rotationen (mind. um 180°) des gesamten Körpers ausführen (DONALDSON,
1986). Als Ursache für die gezeigten Drehbewegungen werden asymmetrische Entladungen
der Basalganglien vermutet (VERCUEIL et al., 1999; RAMMELLI et al., 1999).
Des Weiteren führt eine unilaterale Stimulation oder Läsion unterschiedlicher Hirnbereiche zu
Rotationsverhalten (PYCOCK, 1980). Diese kann mechanisch zum Beispiel durch
Elektroakupunktur (MA et al., 2006) oder chemisch durch Neurotoxine induziert werden
(UNGERSTEDT und ARBUTHNOTT, 1970; UNGERSTEDT, 1971; PYCOCK, 1980).
Zusätzlich können vestibuläre Dysfunktionen ein Rotationsverhalten auslösen, da vestibuläre
Kerngebiete Projektionen zum striato-pallidalen System ausbilden und somit in den
Schaltkreis der Basalganglien eingreifen (SHIMA, 1984). Neben Alterationen des Nucleus
vestibularis können weiterhin Schäden des Vestibularapparates im Innenohr Ursache für
Rotationsverhalten sein. Dies wurde 1978 durch ALLEVA und BALAZS bestätigt, die
zeigten, dass eine durch Aminoglykoside induzierte, pharmakologische Zerstörung der
Haarzellen im Innenohr ein Drehverhalten bei Ratten auslöst. Neben der induzierten
2. Literaturübersicht 20
Schädigung von Zellen des Innenohrs sind erblich bedingte Verluste des Neuroepithels der
Cochlea bekannt, die Bewegungsstörungen nach sich ziehen. Diese Symptomatik ist Teil des
humanen Usher Syndroms, bei dem betroffene Patienten neben progressiver Taubheit und
Visusverlust unter Ataxien und Zwangsbewegungen leiden. Durch Untersuchungen an
Tiermodellen mit Rotationsverhalten und erblich bedingten Haarzellanomalien konnte gezeigt
werden, dass häufig Proteine des Aktinzytoskeletts an der Pathogenese der
Haarzellschädigung beteiligt sind (siehe Kap. 2.2.3).
Weiterhin ist bekannt, dass aufsteigende Infektionen des Mittelohrs (Otitis media) über eine
meist eitrige Entzündung des Innenohrs (Otitis interna) Ataxien und Drehverhalten auslösen
können. Durch die Nähe des Innenohrs zum Gehirn ist eine zentrale Beteiligung am
Krankheitsgeschehen möglich. Verursachende Keime können beispielsweise Staphylokokken,
Streptokokken, Mykoplasmen, Pseudomonaden, aber auch Hefen sein.
Daneben sind Alterationen oder Verluste von Haarzellen im Innenohr durch mechanische
Verletzungen denkbar.
2.2.3 Tiermodelle mit Rotationsverhalten
Es existieren eine Reihe von Maus- und Rattenmutanten, die sich unter anderem durch ein
mehr oder weniger ausgeprägtes Rotationsverhalten auszeichnen. Häufig wird die
Symptomatik aufgrund ihrer Kausalität von Ataxien, stereotypen Kopfbewegungen,
Hyperlokomotion und Hörverlust begleitet, weshalb diese Stämme als Tiermodelle für die
Taubheitsforschung und zur Untersuchung von Hyperkinesien eingesetzt werden.
Einige Mutanten mit abnormalem Drehverhalten, die einen der LEW-ci2 Ratte ähnlichen
Phänotyp aufweisen, sollen hier beschrieben werden.
2.2.3.1 Mausmodelle
shaker 1 (Myo7Ash1)
Die sh1-Mutation entstand ursprünglich im Mäuseinzuchtstamm BALB/c (LORD und
GATES, 1929), mittlerweile existieren insgesamt 10 verschiedene Allele, von denen fünf
induziert sind (LETTS et al., 1994; Jackson Laboratories Mouse Genome Informatics,
www.informatics.jax.org; RINCHIK et al., 1990).
Betroffene Tiere zeichnen sich durch Taubheit, Hyperaktivität, stereotype Kopfbewegungen
und Rotationsverhalten vestibulären Ursprungs aus (GIBSON et al., 1995; LORD und
2. Literaturübersicht 21
GATES, 1929). Defekte im Neuroepithel des Innenohrs sind charakterisiert durch progressive
Degeneration der Haarzellen und stark desorganisierte oder degenerierte Stereozilien (DEOL,
1956; KIKUCHI und HILDING, 1965; GRÜNEBERG et al., 1945; MIKAELIAN et al.,
1965; SHNERSON et al., 1983).
Der genetische Ursprung der autosomal rezessiv vererbten Mutation liegt in dem Gen Myo7A
(GIBSON et al., 1995), das für ein unkonventionelles Myosin kodiert. Mutationen im Myo7A
führen beim Menschen zum Usher Syndrom Typ 1B, das neben den kongenitalen Defekten
des vestibulären und auditiven Systems mit einer progressiven Netzhautdegeneration
einhergeht (WEIL et al., 1995; WESTON et al., 1996; LEVY et al., 1997; LIU et al., 1997).
Obwohl LIBBY und STEEL (2001) reduzierte Photorezeptorantworten bei sh1-Mäusen im
Elektroretinogramm nachwiesen, konnte bis heute bei keiner der sh1-Allele eine retinale
Degeneration gezeigt werden.
shaker 2 (Myo15sh2) / shaker 2-J (Myo15sh2-J)
Die sh2-Mutation wurde in der Nachkommenschaft einer mit Röntgenstahlung behandelten
Maus entdeckt (DOBROVOLSKAIA-ZAVASDKAIA, 1928). Betroffene Tiere fallen durch
Rotationsverhalten, stereotype Kopfbewegungen und Taubheit auf (LIANG et al., 1998). Die
Symptomatik ist auf Defekte im Innenohr zurückzuführen, die durch dysmorphe Haarzellen
und extrem kurze, jedoch regelrecht angeordnete Stereozilien gekennzeichnet sind (PROBST
et al., 1998). Aus diesem Grund wurde die Mutante von FRIEDMAN et al. 1995 als
Tiermodell für humane Taubheit (DFNB3) vorgeschlagen.
Die Punktmutation, die in der Motordomäne des Myo15-Gens lokalisiert wurde (PROBST et
al., 1998), folgt einem autosomal rezessiven Erbgang. Das Myo15 kodiert für ein
unkonventionelles Myosin, das dem bei der shaker 1 Maus mutierten Myosin VIIA
morphologisch stark ähnelt.
Im Gegensatz dazu ist die Mutation bei der shaker 2-J Maus durch eine Deletion der letzten
sechs Exons des Myo15-Gens gekennzeichnet, betroffen ist also die gesamte FERM (Four
point one, Ezrin, Radixin, Moesin)- Domäne der Schwanzregion (ANDERSON et al., 2000).
Phänotypische Unterschiede zur shaker 2 Maus sind nicht bekannt.
deaf circler (dfcr) / deaf circler 2 Jackson (dfcr-2J)
Die deaf circler Maus und die deaf circler 2 Jackson Maus entstanden im Jackson
Laboratorium durch Spontanmutationen in Stämmen mit BALB/cByJ (dfcr) bzw. C57BL/6J
2. Literaturübersicht 22
(dfcr-2J) Hintergrund. Die Mutationen sind allelisch und folgen einem rezessiven Erbgang
mit vollständiger Penetranz (JOHNSON et al., 2003).
Betroffene Tiere zeichnen sich durch Rotationsverhalten, stereotype Kopfbewegungen,
Gleichgewichtsstörungen sowie Taubheit aus. Sie sind nicht in der Lage zu schwimmen. Die
Symptomatik der dfcr und dfcr-2J Mäuse ist auf eine Dysfunktion des Innenohrs
zurückzuführen, ausgelöst durch einen progressiven Verlust von cochleären Haarzellen und
von Ganglionzellen. Verbliebene Stereozilien erscheinen unorganisiert und strukturverändert
(JOHNSON et al., 2003).
Die zugrundeliegenden Mutationen wurden auf Chromosom 7 lokalisiert. Es handelt sich um
eine 12,8 bp (dfcr) bzw. 1 bp (dfcr-2J) große Deletion im USH1c-Gen, das für das Protein
Harmonin kodiert. Mutationen in diesem Protein sind beim Menschen für nicht-syndromale
Taubheit (DFNB18) sowie für das Usher Syndrom Typ 1c verantwortlich.
Der Augenphänotyp betroffener Tiere, welcher aufgrund der Verbindung zum Usher Syndrom
untersucht wurde, zeigte keine krankhaften Veränderungen (JOHNSON et al., 2003).
whirler (Whrnwi)
Die whirler Maus entstand durch eine Deletionsmutation des whrn-Gens und wird autosomal
rezessiv vererbt (MBURU et al., 2003). Sie befindet sich in einer Region, die homolog zum
humanen DFNB31 ist, einem nicht-syndromalen profunden Typ von rezessivem Hörverlust
(ROGERS et al., 1999; PAIGE et al., 2000; MBURU, et al., 2003; TLILI et al., 2005).
Bei Mensch und Maus führen Mutationen im Whrn-Gen zu neuroepithelialer Taubheit und
vestibulären Dysfunktionen (HOLME et al., 2002). Daneben sind bei betroffenen Whrnwi-
Tieren stereotype Kopfbewegungen und Rotationsverhalten zu beobachten, deren Ursprung in
Defekten des Innenohrs zu suchen ist. Stereozilien der inneren Haarzellen sind abnormal kurz,
äußere Haarzellen dagegen sind in ihrer Länge annähernd regulär, zeigen aber anstelle der
physiologischen W- oder V-Form eine abgerundete U-Form (HOLME et al., 2002).
Das betroffene Whrn-Gen kodiert für ein PDZ-Domänen tragendes Protein, das Whirlin, das
in Prozesse der Elongation und Erhaltung von mechanosensorischen Stereozilien involviert ist
(MBURU et al., 2003) .
waltzer
Die Symptomatik der waltzer Maus ist gekennzeichnet durch Drehverhalten (circling) und
Taubheit, die infolge von schweren Degenerationen cochleärer und vestibulärer,
neurosensorischer Strukturen auftritt (OSAKO und HILDING, 1971). Die zelluläre
2. Literaturübersicht 23
Organisation im Cortischen Organ des Innenohrs erscheint physiologisch, jedoch wurden
Defekte der Stereozilien nachgewiesen (DI PALMA et al., 2001). Die für den Phänotyp
verantwortlichen Punktmutationen (v, v6J, vAlb, v2J) sind in dem waltzer-Gen Cdh23 lokalisiert
(BRYDA et al., 1997; DI PALMA et al., 2001). Der zur waltzer-Region orthologe Bereich im
menschlichen Genom beinhaltet den humanen Taubheitslocus DFNB12 und USH1D, einen
Locus für das humane Usher Syndrom (CHAIB et al., 1996; WAYNE et al., 1996).
Phänotypisch nicht zu unterscheiden ist die Ames waltzer Maus, die 1956 von SCHAIBLE
entdeckt und später von OSAKO und HILDING (1971) charakterisiert wurde. Die rezessiv
vererbte Mutation wurde im Protocadherin15-Gen entdeckt (ALAGRAMAM et al., 2001),
COOK et al. beschrieben 1993 vier verschiedene Allele (Pcdh15av, Pcdh15avJ, Pcdh15av-2J,
Pcdh15av3J).
Zu den waltzer-Mutanten zählt außerdem die Snell`s waltzer Maus. Die ursächliche
Spontanmutation (Nullmutation) wurde erstmals 1966 von DEOL und GREEN beschrieben.
Sie betrifft das Myo6-Gen, welches für das unkonventionelle Myosin VI kodiert. Homozygote
Individuen weisen eine erblich bedingte Taubheit, Rotationsverhalten, stereotype
Kopfbewegungen und Hyperaktivität auf. Bereits nach der Geburt setzt ein progressiver
Haarzellverlust im Innenohr ein. Veränderte und desorganisierte innere und äußere Haarzellen
tragen Stereozilien, die zu gigantischen Strukturen fusionieren (AVRAHAM et al., 1995).
Weitere Mausmodelle
Die pirouette (pi) Maus zeichnet sich durch profunde Taubheit und Drehverhalten aus, das auf
Defekten im Innenohr basiert, die denen der Myo15-Mutanten sehr ähnlich sind. Die
autosomal rezessiv vererbte Mutation wurde auf MMU5 kartiert, die Mutante gilt als Modell
für DFNB25.
Die transgene, durch eine Insertionsmutagenese entstandene "chakragati"- Maus zeigt neben
einer Hyperlokomotion spontanes oder stressinduziertes Rotationsverhalten mit
Seitenpräferenz. Eine Dysfunktion von cochleärem oder vestibulärem System konnte jedoch
nicht festgestellt werden (RATTY et al., 1990; FITZGERALD et al., 1992).
Genetisch induziert sind ebenso die vestibulären Dysfunktionen und Degenerationen bei der
DBA/2 Maus, die ebenfalls zu Rotationsverhalten führen (BLOOM und HULTCRANTZ,
1994).
Weitere Mausmutanten, die durch Hyperlokomotion und Bewegungsstörungen wie circling-
Verhalten auffallen, sind die BUS/ldr Maus, die zusätzlich taub ist, und die C3H/He Maus.
Die BUS Mutante weist Degenerationen des Cortischen Organs und des Spiralganglions auf
2. Literaturübersicht 24
(YONEZAWA et al., 1999). Bei der C3H/He Maus wurden mittels histologischer
Untersuchungen degenerierte Haarzellen mit morphologisch veränderten Stereozilien in den
Maculae nachgewiesen (KITAMURA et al., 1991).
2.2.3.2 Rattenmodelle
circling3 (ci3)
Die ci3-Mutation trat 1997 spontan am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen
Hochschule Hannover in dem BH-kongenen Inzuchtstamm BH.7A/Won auf, der das a-Allel
des Gens Ptprc (Protein Tyrosin Phosphatase Rezeptor Typ c; Synonym: Cd45, Lca, RT7)
exprimiert. Das von der LEW/Ztm Ratte stammende Allel wurde durch
Verdrängungskreuzung innerhalb von 12 Rückkreuzungsgenerationen auf die BH/Ztm-Ratte
übertragen (HEDRICH, 1990). Bereits im Absatzalter zeigen betroffene Tiere
Hyperlokomotion und spontanes, lateralisiertes Drehverhalten, das durch Stresseinwirkung
verstärkt oder ausgelöst wird. Bei Untersuchungen des vestibulären und cochleären Systems
konnten jedoch weder Dysfunktionen noch Degenerationen festgestellt werden.
Phänotypische Abweichungen wurden aus diesem Grund den nachgewiesenen lateralisierten
Abnormitäten im Bereich der Basalganglien sowie der Lateralität im dopaminergen System
im Striatum zugewiesen (LESSENICH et al., 2001).
tornado (tnd)
Homozygote Ratten, die die tornado-Mutation tragen, fallen durch Taubheit und vestibuläre
Dysfunktion auf, die mit circling-Verhalten, lokomotorischer Hyperaktivität und stereotypen
Kopfbewegungen einhergeht. Sie zeigen damit phänotypisch starke Übereinstimmungen mit
shaker-, waltzer- und whirler-Mausmutanten sowie Ähnlichkeiten zur Symptomatik der
circling2 und circling3 Ratten. Die autosomal rezessiv vererbte tornado-Mutation entstand
vor einem Wistar(Auszucht)-Hintergrund. Es handelt sich um eine ENU-induzierte
Punktmutation in der Motordomäne des Myo7A. Dieses Gen kodiert für das Myosin VIIA, das
ebenfalls bei der shaker1 Mausmutante betroffen ist und als Ursache des humanen Usher
Syndrom Typ 1B nachgewiesen wurde. Im Gegensatz zur Symptomatik dieser Erkrankung
zeigen tnd Ratten weder morphologische noch funktionelle Veränderungen der Retina, einzig
eine Abwesenheit von Melanosomen in apikalen Prozessen des Retinalen Pigmentepithels
(RPE) wurde beschrieben (SMITS et al., 2004).
2. Literaturübersicht 25
spinner (spn)
Die spinner-1 Mutation, die einem autosomal rezessiven Erbgang folgt, trat 1973 spontan im
B/1N Stamm auf. Betroffene Tiere zeigen einen leichten Hydrozephalus und die Neigung, in
Uhrzeigerrichtung zu drehen (HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).
Eine starke Ähnlichkeit zum Phänotyp der spinner-1 Mutante weist die spinner-2 Ratte auf.
Mit Hilfe eines Komplementationstests (cis/trans-Test) konnte jedoch nachgewiesen werden,
dass es sich um zwei unabhängige Mutationen handelt (HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).
Genetischer Hintergrund der spn-2 Mutation ist der N:SDN-Auszuchtstamm.
jerker (je)
Synonym: stargazer (stg)
Die 1994 von TRUETT et al. beschriebene und ursprünglich als stargazer (stg) bezeichnete
Mutation entstand in einer Kolonie von Zucker-Ratten (Crl:ZUC-Lepfa). Die Mutation folgt
einem autosomal rezessiven Erbgang und wurde durch Untersuchungen mit
Mikrosatellitenmarkern im distalen Bereich des Chromosoms 5 (RNO5) kartiert. Dieser
Bereich weist große Homologien zu einem Segment des Chromosom 4 (MMU4) der Maus
auf, das das verantwortliche Gen für die jerker-Mausmutante (je) trägt (DEOL, 1954; STEEL
und BOCK, 1983).
Bereits mit Beginn der dritten Lebenswoche zeigen betroffene Tiere einen Opisthotonus,
Hyperaktivität, Rückwärtsbewegungen und Rotationsverhalten. Vestibuläre Dysfunktionen
und profunde Taubheit gehören ebenso zur Symptomatik der jerker Ratte. Mittels
histologischer Untersuchungen konnte eine progressive Degeneration von Haarzellen und von
Zellen des akustischen Ganglions nachgewiesen werden (TRUETT et al., 1994). Zusätzlich
konnten BROCK und ASHBY (1996) eine Fehlfunktion des zentralen dopaminergen Systems
aufdecken, das durch eine verringerte Ansprechbarkeit der Dopaminrezeptoren 2 und 3
gekennzeichnet ist.
waltzing
2001 beschrieben RABBATH et al. eine neue waltzing-Mutation in einer nicht näher
definierten Population von Long-Evans Ratten der Universität Pavia. Diese Mutante steht
höchstwahrscheinlich in keinem Zusammenhang mit der ursprünglich von KING (1936)
beschriebenen waltzing-Rattenmutante (w).
Betroffene Tiere zeigen Rotationsverhalten und vestibuläre Defizite, die sich in einer
Dysfunktion der Kontrolle von Haltung (Kopfhaltung abwärts) und Blick (Ausfälle des
2. Literaturübersicht 26
horizontalen vestibulocochleären Reflexes) äußern. Da histologisch keine Veränderung des
neurosensitiven Epithels des Innenohrs nachgewiesen werden konnte, wurde angenommen,
dass Fehlfunktionen in der Transduktion oder der Prozessierung von Signalen im vestibulären
System die Ursache für die Rotationen sein könnten.
2.3 Genetik der LEW/Ztm-ci2 Ratte - Vorarbeiten
Zur Identifikation und Eingrenzung des chromosomalen Segmentes, welches die ci2-Mutation
trägt, wurde ein genomweites Scanning einer segregierenden BN-Rückkreuzungspopulation
([LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm]F1 x LEW/Ztm-ci2) durchgeführt. Die DNA der Tiere wurde mit
insgesamt 86 anonymen und für diese Kreuzung polymorphen Mikrosatellitenmarkern
untersucht. Es zeigte sich eine starke Assoziation des Phänotyps mit einer Region im
zentralen Bereich des Chromosom 10 (RNO10q22). Innerhalb des durch die
Kopplungsanalyse eingegrenzten chromosomalen Abschnittes wurde nach geeigneten
Kandidatengenen gesucht. Die vergleichende Betrachtung des Rattengenoms mit dem des
Menschen und der Maus ("comparative mapping") brachte zwei Gene hervor, die für zwei
unkonventionelle Myosine kodieren und aufgrund ihrer Funktion als Kandidaten in Frage
kamen, das Myo15 und das Myo1c. Die Kandidaten sowie zwei benachbarte Gene von Myo15
(das Znf179 und das Aldh3a1) wurden mittels gengekoppelter Mikrosatellitenmarker auf eine
Kartierung innerhalb der zentralen Assoziationsregion auf RNO10 untersucht, was zum
Ausschluss des Myo1c führte. Die Gene Znf179 und Aldh3a1 wurden ausschließlich zur
Absicherung der Position von Myo15 mitkartiert. Da die Sequenz der Ratte zu diesem
Zeitpunkt (Mai 2003) noch nicht bekannt war, wurde die cDNA-Sequenz der Maus für die
Untersuchungen genutzt.
Die physikalische Kartierung der nicht rekombinanten Region auf RNO10 erfolgte mit Hilfe
der Sequenzen von Ratten-BAC-Klonen. Als Grundgerüst diente ein 106 bp großer Bereich
des Mauschromosoms 11 (MMU11), in dem sich die Sequenzen der Gene befanden, die
homolog zu Myo15, Znf179 und Aldh3a1 sind. Mittels BLAST wurden 11 überlappende
Rattenklone ("Contig") identifiziert, die diesem Bereich des Mausgenoms entsprachen. Die
Kartierung bewirkte eine genaue Lokalisation der Gene und war die Grundlage für die
Entdeckung eines neuen Kandidatengens, dem Kcnj12.
Aufgrund ihrer Lokalisation innerhalb des eingegrenzten Bereiches auf RNO10 und dem
engen Zusammenhang mit dem ci2-Phänotyp sowie mit Krankheitsbildern bei Mensch und
2. Literaturübersicht 27
Maus erschienen die Gene Myo15 und Kcnj12 als geeignete Kandidaten (CHWALISZ et al.,
2003).
2.4 Kandidatengene Durch die Erstellung einer physikalischen Karte der durch Kopplungsanalysen eingegrenzten
chromosomalen Region auf RNO10 sowie durch die vergleichende Betrachtung des Ratten-,
Maus- und Menschengenoms konnten aufgrund ihrer Funktion zwei Kandidatengene für die
ci2-Mutation entdeckt werden (siehe Kap. 2.3). Das Kcnj12 kodiert für einen einwärts
gerichteten Kaliumkanal, das Myo15 für ein Protein, dass der Familie der unkonventionellen
Myosine angehört. Entsprechend soll nachfolgend auf diese Gene bzw. Genfamilien
eingegangen werden.
2.4.1 Kaliumeinzelkanäle
Die Familie der zelleinwärts gerichteten Kaliumkanäle (IRK; Kir; "Inwardly rectifying K+
channel") setzt sich aus 7 Subfamilien zusammen. Die innerhalb des Körpers weit
verbreiteten Membranproteine sind an einer Reihe von Zellfunktionen beteiligt. Dazu gehören
die Generierung und Regulation von Membranpotentialen, die Regulation der Erregbarkeit
von Membranen sowie der Aktionspotentialdauer und die Sekretion/Absorption von K+-Ionen
(LAGRUTTA et al., 1996; ISOMOTO et al., 1997; REIMANN und ASHCROFT, 1999).
Die Kaliumkanäle werden durch intrazelluläre Moleküle wie ATP, PIP2
(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat), G-Proteine sowie Na+ reguliert und schleusen
Kaliumionen bevorzugt in die Zellen hinein.
Neben ihrer bedeutenden Funktion im Kaliumhaushalt von cerebralen Arterien und bei der
Entstehung des cardialen Aktionspotentials wird Proteinen dieser Familie eine Schlüsselrolle
beim Transport von Kaliumionen in der Cochlea und in der Netzhaut des Auges zugesagt
(ZARITSKY et al., 2000; WIBLE et al., 1995; MARCUS et al., 2002; YUAN et al., 2003).
Die spezielle Ionenzusammensetzung und das hohe Potential der Endolymphe im Innenohr
sind essentiell für die Hörfähigkeit. Sie werden mithilfe der K+-Zirkulation aus der
Perilymphe in die Endolymphe durch die laterale Cochleawand aufrechterhalten. Es konnte
gezeigt werden, dass eine Gruppe von Kaliumkanälen wie der Kir4.1, der Kir5.1 und der
Kcnq1/Kcne1 in Intermediärzellen der Stria vascularis exprimiert wird und dort eine
2. Literaturübersicht 28
bedeutende Rolle bei der K+-Zirkulation spielt (ANDO und TAKEUCHI, 1999; HIBINO et
al., 2004). Die Stria vascularis ist ein stark vaskularisiertes, mehrschichtiges Epithel, das in
der Lateralwand der Cochlea dem Ligamentum spirale angelagert ist (JAHNKE, 1975). Das
endocochleäre Potential (EP), das in der Stria vascularis entsteht, sorgt in Verbindung mit der
hohen K+-Konzentration der Endolymphe für die sensorische Transduktion in den Haarzellen.
Es wird davon ausgegangen, dass Kaliumeinzelkanäle (Kir4.1), die für den Einstrom von
Kaliumionen in Intermediärzellen der Stria vascularis sorgen, für die Generierung des EPs
verantwortlich sind (MARCUS et al., 2002). Gestützt wird diese Hypothese durch die
Tatsache, dass das endocochleäre Potential durch Kaliumkanalblocker beeinflussbar ist
(HIBINO et al., 1997; TAKEUCHI et al., 2000) und in Mausmutanten, denen die
Intermediärzellen fehlen, nicht gemessen werden konnte (CARLISLE et al., 1990).
Neben ihrer Bedeutung bei der Entstehung des cochleären Potentials spielen Kaliumkanäle
eine Schlüsselrolle bei Transportvorgängen von Kaliumionen im subretinalen Raum (SRS).
Der SRS ist ein kleines, extrazelluläres Kompartiment, das die äußeren Segmente der
Photorezeptorzellen umgibt. Menge und Zusammensetzung des Extrazellularfluids des SRS
werden vom Retinalen Pigmentepithel kontrolliert (siehe Kap. 2.6.2 und 2.6.3).
Eine Lichteinwirkung auf die dunkeladaptierte Retina verursacht einen rapiden Abfall der K+-
Konzentration im SRS aufgrund einer Veränderung der Photorezeptorzellaktivität (OAKLEY
und GREEN, 1976; STEINBERG et al., 1980), wodurch ein Reflux von K+-Ionen aus dem
RPE ausgelöst wird (KAROWSKI et al., 1989). Es wird vermutet, dass Kaliumeinzelkanäle
(Kir7.1, Kir4.1, Kir6.2/SUR1) des Retinalen Pigmentepithels an der Regulation des
Kaliumhaushalts im SRS beteiligt sind (SHIMURA et al., 2001; KUSAKA et al., 1999;
ETTAICHE et al., 2001; KUSAKA et al., 2001).
Es wurden eine Reihe von Mausmutanten mit genetischen Veränderungen innerhalb von
Kaliumkanälen beschrieben. Innenohrdegeneration mit Hörverlust sind beispielsweise Folge
einer Mutation im Kir4.1 (Kcnj10, MMU1) Kaliumkanal (KOFUJI et al., 2000; MARCUS et
al., 2002; ROZENGURT et al., 2003). Bei der Kcnj12tm1Swz-Mausmutante hingegen wurde der
Kir2.2 Kaliumeinzelkanal (Kcnj12, MMU11) inaktiviert. Diese Mutante wurde gemeinsam
mit der Kcnj2tm1Swz-Maus (genetisch inaktivierter Kir2.1; Kcnj2; MMU11) für die Erforschung
von Kaliumionen-abhängigen Dilatationen bei cerebralen Arterien herangezogen
(ZARITSKY et al., 2000). Untersuchungen zur Expression und Funktion von Kcnj12 für das
Innenohr und die Netzhaut sind bis heute nicht beschrieben.
2. Literaturübersicht 29
2.4.2 Unkonventionelle Myosine
Myosine bilden eine große Familie molekularer Motorproteine, die ATP
(Adenosintriphosphat) hydrolysieren, um Kraft und Bewegung zu erzeugen (MERMALL et
al., 1998).
Die Myosin-Superfamilie besteht aus einer ständig steigenden Anzahl (im Moment 18)
strukturell unterschiedlicher Klassen, die aufgrund phylogenetischer Analysen und aufgrund
von Sequenzunterschieden der konservierten Motordomänen eingeteilt werden (BERG et al.,
2001; Sellers, 1999; Sellers, 2000).
Alle Myosine zeigen einen ähnlichen Aufbau, bestehend aus einer Kopfregion, einer
Nackenregion mit Bindungsstellen für die leichten Ketten sowie der Schwanzregion, die sich
in Sequenz und Ausdehnung zwischen den einzelnen Myosinklassen stark unterscheidet.
Die N-terminale Motordomäne, die die ATP- und Aktin-Bindungsstellen trägt, generiert in
einem ATP-abhängigen Prozess Bewegung entlang von Aktinfilamenten und ist mit der
Schwanzregion über eine flexible Nackenregion verbunden. Diese interagiert mit den leichten
Ketten der Myosine und bindet Calmodulin (CaM; Kalzium-bindendes Protein). Die
Schwanzregion ist dagegen für Interaktionen mit verschiedenen Bindungspartnern ("Cargo")
verantwortlich und bestimmt daher die spezifische Funktion des Myosins (MOOSEKER et
al., 1995; COPE et al., 1996; MERMALL et al., 1998).
Abb. 2.1 Aufbau des Myosin XV. Dargestellt sind die unterschiedlichen Regionen des Proteins
sowie die verschiedenen Domänen des Myosin-Schwanzes.
Man unterscheidet zwischen konventionellen (Klasse 2) Myosinen, die an Kontraktions-
vorgängen in der Muskulatur und an Zellteilungsvorgängen beteiligt sind, und
unkonventionellen Myosinen.
Unkonventionelle Myosine sind weit verbreitet und in eine Reihe von Zellfunktionen
involviert. Als Bestandteil aktinreicher Strukturen spielen sie eine Rolle bei
Kopfregion Nacken Schwanzregion
Myosinkopf N C MyTH4 FERM FERMMyTH4 SH3 IQ IQ
2. Literaturübersicht 30
zytoplasmatischen Transportvorgängen, bei der Bewegung von Organellen, Vesikeln und
Partikeln sowie bei der Organisation des Aktinzytoskeletts (BAKER und TITUS, 1998;
MERMALL et al., 1998). Außerdem sind sie an Phagozytosevorgängen, Spermatogenese,
Zellmotilität, Regulation von intrazellulären Transportvorgängen in Membranen und an
neurosensorischen Funktionen wie Hören und Sehen beteiligt (TUXWORTH und TITUS,
2000).
Im Bereich des Innenohrs wurden verschiedene unkonventionelle Myosine nachgewiesen. Sie
sind dort Bestandteil aktinreicher Strukturen der Stereozilien, die apikale Projektionen der
Haarzellen darstellen. Ihre Aufgabe ist die Erfassung von akustischen Signalen und von
Bewegungen im Raum und deren Umwandlung in elektrische Signale (HASSON et al., 1995;
FRIEDMAN et al., 1999; REDOWICZ, 1999). Daneben wurden unkonventionelle Myosine
auch in aktinreichen Strukturen in der Netzhaut des Auges nachgewiesen (HASSON et al.,
1995; LIU et al., 1997).
Mutationen in den Genen, die für die unkonventionellen Myosine VI, VIIA, IX und XV
kodieren, führen beim Menschen und bei der Maus zu Taubheit und vestibulären Defiziten.
Zusätzlich können Defekte im Myo7A beim Menschen eine progressiven Degeneration der
Netzhaut verursachen.
Das Myosin VI ist in der Kutikularplatte der Haarzellen lokalisiert und spielt dort eine Rolle
bei der Aufrechterhaltung der Spannung zwischen den Stereozilien und dem Aktinskelett der
Haarzellen (HASSON et al., 1997; CRAMER, 2000). Daneben ist das Protein in zelluläre
Transportvorgänge (MERMALL et al., 1994) und in rezeptorvermittelte Endozytose
involviert (BUSS et al., 2001). Mutationen im Myo6-Gen sind verantwortlich für die Snell´s
waltzer Mausmutante (siehe Kap. 2.2.3.1) und für eine nicht-syndromartige, dominant
vererbte Taubheitsform (DFNA22) beim Menschen (MELCHIONDA et al., 2001).
Eine ebenfalls nicht syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform beim Menschen
(DFNA17) ist das Ergebnis einer Mutation im MYH9-Gen, das für das Myosin IX kodiert. Die
Expression des homologen Gens (Myh9) wurde auch in der Cochlea der Ratte nachgewiesen
(LALWANI et al., 2000).
Mutationen innerhalb des Myosins VIIA sind beim Menschen assoziiert mit zwei Formen von
nicht-syndromaler Taubheit (DFNB2 und DFNA11) und dem Usher Syndrom Typ 1B
(FRIEDMAN et al., 1999; WEIL et al., 1995). Dieses autosomal rezessive Syndrom geht mit
einem profunden, neurosensorischen Hörverlust, Gleichgewichtsproblemen und progressiver
Retinopathia pigmentosa einher, die zu Blindheit führt (siehe Kap. 2.5). Als Tiermodell zur
Erforschung des humanen Usher Syndroms (USH) gelten die Mausmutante shaker 1 und die
2. Literaturübersicht 31
Rattenmutante tornado (siehe Kap. 2.2.3.1/2). Diese Stämme weisen jedoch nicht die für das
USH1B charakteristische, retinale Degeneration auf (HASSON et al., 1997; LIU et al., 1998;
TITUS et al., 1999; SMITS et al., 2003). Tatsächlich wurde das Myosin VIIA durch
genetische Studien als essentiell für die Sehfähigkeit des Menschen eingestuft (HASSON und
MOOSEKER, 1997). Es wird vermutet, dass es an Transportprozessen im Bereich des
Pigmentepithels der Netzhaut (RPE) beteiligt ist (LIU et al., 1999; LIBBY und STEEL,
2001). Die Funktion des Myosins VIIA im auditiven System ist nicht sicher. Aufgrund der
Lokalisation des Proteins in der Umgebung der "cross links" der Stereozilien und der
Kutikularplatte von inneren Haarzellen der Cochlea wird vermutet, dass Myosin VIIA an der
Erhaltung der Stereozilienintegrität beteiligt ist (HASSON et al., 1997; SELF et al., 1998).
Das Myosin XV ist dem Myosin VIIA morphologisch sehr ähnlich, weshalb man ihnen eine
ähnliche Bedeutung zuschrieb. Tatsächlich konnten KAROLYI et al. (2003) zeigen, dass sich
das Myosin XV funktionell deutlich von den Myosinen VI und VII absetzt. Während Myosin
VI und VIIA für die Integrität der Stereocilien sowie für die Verbindung ihrer Strukturen
verantwortlich sind, wird dem Myosin XV eine essentielle Rolle bei der regulären
Längenausbildung der sich entwickelnden Stereozilien zugesagt. Eine weitere Funktion ist die
Erhaltung und Organisation des Aktinzytoskeletts der Stereozilien und der Kutikularplatte der
Haarzellen sowie die Bewegung und Ausschüttung von sekretorischer Granula (PROBST et
al., 1998; LLOYD et al., 2001).
Mutationen im Myosin XV verursachen beim Menschen eine autosomal rezessive, nicht-
syndromale Taubheit, DFNB3 (PROBST et al., 1998, WANG et al., 1998). In shaker 2
Mäusen (siehe Kap. 2.2.3.1), die als murines Homolog gelten (FRIEDMAN et al., 1995;
LIANG et al., 1998), wurde eine Punktmutation in der reaktiven Thiolregion der
Motordomäne sowie eine Deletion der C-terminalen FERM-Domäne nachgewiesen
(PROBST et al., 1998; ANDERSON et al., 2000). Ein Großteil der Mutationen im Myosin
XV des Menschen, die gewöhnlich zur Expression von funktionell beeinträchtigten Proteinen
führen, ist in der Schwanzregion lokalisiert (WANG et al., 1998; LIBURD et al., 2001). Diese
besitzt neben einer SH3-Domäne zwei MyTH4 (Myosin tail homoloyg-4)- und 2 FERM (Four
point one, Ezrin, Radixin, Moesin)-Domänen, die häufig betroffen sind. Da aber Mutationen
mit ähnlichen Auswirkungen auch innerhalb der Motordomäne zu finden sind (LIBURD et
al., 2001), ist davon auszugehen, dass sowohl Kopf- als auch Schwanzregion für die
Funktionsfähigkeit des Myosin XV essentiell sind.
Neuesten Forschungsergebnissen zufolge ist das Myosin XV das einzige bekannte
Motorprotein in Haarzellen, das selektiv Protein zur Stereozilienspitze transportiert
2. Literaturübersicht 32
(BELYANTSEVA et al., 2005). Es konnte gezeigt werden, dass die programmierte
Stereozilienelongation nur stattfindet, wenn Myosin XV das PDZ-Protein Whirlin bindet und
zur Stereozilienspitze transportiert.
2.5 Usher Syndrom
2.5.1 Krankheitsbild
Es sind über 400 Syndrome beschrieben worden, die mit Taubheit einhergehen, und etwa 40
von ihnen schließen eine Beeinträchtigung des Visus ein (GORLIN et al., 1995). Zu diesen
Erkrankungen gehört das humane Usher Syndrom (USH), eine erblich bedingte Kombination
von langsam fortschreitender Netzhautdegeneration (Retinopathia pigmentosa) und bereits
früh einsetzender Innenohrschwerhörigkeit oder Gehörlosigkeit von Geburt an (Pro Retina
Deutschland e.V., www.pro-retina.de). Es wird bei mehr als 50% der Menschen, die
gleichzeitig taub und blind sind, diagnostiziert und stellt somit die häufigste Ursache für
Taubblindheit dar. Etwa 18% der Retinopathia pigmentosa-Fälle und 3-6 % der Taubheitsfälle
gehen auf dieses Syndrom zurück (BOUGHMAN et al., 1983). Weltweit gibt es circa 3,5-6,2
Betroffene auf 100.000 Einwohner, in Deutschland leben insgesamt 4000-5000 Betroffene;
jedoch ist unter 70 Menschen einer Träger eines Usher-Allels (SPANDAU und
ROHRSCHNEIDER, 2002).
Man unterscheidet drei verschiedene klinische Subtypen basierend auf der Schwere des
auditiven Funktionsverlustes, dem Auftreten vestibulärer Störungen und dem zeitlichen
Auftreten der Retinopathia pigmentosa (DAVENPORT und OMENN, 1977).
Die klinisch schwerwiegendste Form, USH1, ist charakterisiert durch hochgradige
Schwerhörigkeit oder Taubheit von Geburt an, starke Gleichgewichtsstörungen sowie eine
präpubertal einsetzende, progressive retinale Degeneration, die zu Blindheit führt.
Patienten, die vom USH Typ2 betroffen sind, leiden von Geburt an an einer frequenzabhängig
mittel- bis hochgradigen Innenohrschwerhörigkeit. Im Gegensatz zum USH1 sind die
vestibulären Funktionen jedoch nicht gestört und die retinale Degeneration beginnt erst im
frühen Erwachsenenalter.
Eine weltweit sehr seltene Form des Usher Syndroms ist USH3, welches jedoch in Finnland
die verbreitetste Form (40% der Fälle) der Erkrankung darstellt (PAKARINEN, 1995).
2. Literaturübersicht 33
Patienten leiden neben visuellen Funktionsverlusten, die auf retinalen Degenerationen
basieren, unter einer progressiven Schwerhörigkeit.
Ebenso wie die klinische Ausprägung ist auch der genetische Ursprung des autosomal
rezessiv vererbten Usher Syndroms ausgeprägt heterogen. Mindestens zwölf Loci sollen an
der Entstehung der Erkrankung beteiligt sein, neun ursächliche Gene sind bereits entdeckt und
charakterisiert (siehe Tab. 2.1).
Tab. 2.1 Gruppierung des Usher Syndroms.
Form des
USH
Gen Protein Tiermodell zusätzlicher
Phänotyp
USH1B MYO7A Myosin VIIa shaker-1
tornado
DFNA11
DFNB2
USH1C USH1C Harmonin deaf circler DFNB18
USH1D CDH23 Cadherin23 waltzer DFNB12
USH1F PCDH15 Protocadherin15 Ames waltzer DFNB23
USH1G USH1G SANS Jackson shaker
USH2A USH2A USH2A
USH2C VLGR1 VLGR1
USH2D USH2D Whirlin whirler DFNB31
USH3A USH3A Clarin-1
Es ist bekannt, dass die für das Usher Syndrom verantwortlichen Proteine interagieren
(BOEDA et al., 2002; SIEMENS et al., 2002; REINERS et al., 2003; VAN WIJK et al.,
2006). Sie sind Teil eines dynamischen, makromolekularen Komplexes (Usher-Protein
Interaktom), der in neurosensorischen Zellen des Innenohrs und des Auges an ähnlichen
Vorgängen beteiligt ist (ADATO et al., 2005; REINERS et al., 2006; VAN WIJK et al., 2006;
KREMER et al., 2006).
2. Literaturübersicht 34
2.5.2 Retinopathia pigmentosa
Die Retinopathia pigmentosa (RP) ist eine erblich bedingte, fortschreitende tapeto-retinale
Degeneration, die meist in Form einer Stäbchen-Zapfen-Dystrophie auftritt. Die RP ist in der
Regel nicht-syndromal, jedoch existieren auch syndromale Formen wie das Usher Syndrom
(siehe Kap. 2.5.1). Erste Symptome, wie Nachtblindheit und Gesichtsfeldeinschränkungen,
treten häufig bereits im Kindesalter auf. Die Erkrankung kann nach progressivem Verlauf
über lange Zeit zu absolutem Visusverlust führen (HAMEL, 2006). Charakteristisch für diese
Form der Retinopathie sind neben dem Verlust von Photorezeptorzellen Pigmentablagerungen
und Gefäßverengungen in der peripheren Retina. Die Degeneration verläuft zentripetal und
betrifft meist primär die Stäbchen-Zellen und erst sekundär die Zapfen. Obwohl es sich um
eine so genannte Stäbchen-Zapfen-Dystrophie handelt, sind Stäbchen immer stärker betroffen
(HAMEL, 2006).
Die therapeutischen Möglichkeiten sind bis heute dürftig. Vitamintherapie und Vermeidung
von Licht aufgrund der zunehmenden Photophobie der Patienten verlangsamen den
Degenerationsprozess wenig, beschränken aber Komplikationen wie Katarakt und
Makulaödem. Von großer Wichtigkeit ist dabei eine frühzeitige Diagnose, die aufgrund von
Potentialableitungen der Photorezeptorzellen (Stäbchen und Zapfen) mit Hilfe eines
Elektroretinogramms (ERG, siehe Kap. 2.6) gestellt wird. Das ERG ist eine sensitive
Methode, die bereits bei einer sehr milden Symptomatik, die von Patienten häufig unbeachtet
bleibt, einen Funktionsverlust sensorischer Strukturen (v.a. der Stäbchen) im Auge nachweist
(PETIT, 2001; HAMEL, 2006).
2. Literaturübersicht 35
2.6 Elektroretinographie
2.6.1 Photorezeptorzellen der Retina
Aufgrund der inversen Struktur der Netzhaut muss einfallendes Licht sämtliche Schichten
durchdringen, bis es die Photorezeptoren erreicht. Die Photorezeptorzelle gilt deshalb als das
erste von drei nacheinander geschalteten Neuronen, welche die Sinnesinformation zum
Sehnerv weiterleiten.
Man unterscheidet zwei Arten von Photorezeptoren: die für das Sehen im Dämmerlicht
verantwortlichen, schlanken Stäbchen (skotopisches Sehen) und die weniger
lichtempfindlichen, plumpen Zapfen, die für das Scharf- und Farbensehen zuständig sind
(photopisches Sehen). Stäbchen und Zapfen bestehen aus Außen- und Innensegmenten,
Zellkern und Endstücken. Die Außensegmente sind scheibenförmig gestapelte
Membranausstülpungen, Disci, die den Sehfarbstoff enthalten. Diese werden stetig in den
Innensegmenten gebildet, apikal vorgeschoben und nach ihrer Abstoßung vom Retinalen
Pigmentepithel (RPE) phagozytiert. Neben der Entsorgung des Zellschrotts ist das RPE für
die Versorgung der Außensegmente zuständig.
Die äußere Körnerschicht der Retina
wird von den Zellkernen der Photo-
rezeptoren gebildet, deren Ausläufer in
der äußeren plexiformen Schicht mit
den Fortsätzen der Bipolarzellen inter-
agieren. Neben diesen Ganglienzellen (2.
Neuron) findet man in der inneren Kör-
nerschicht auch Amakrinzellen und
Horizontalzellen, die Querverbindungen
herstellen, sowie gliales Stützgewebe,
die Müller-Zellen. Bipolarzellen leiten
die Sinnesinformation an die Ganglien-
zellen (3. Neuron) weiter, deren Axone zum Nervus opticus ziehen. Bei Stimulation der
Retina durch Licht kommt es zu einer Reihe photochemischer Reaktionen, welche zu
Potentialveränderungen führen. Diese können mithilfe der Elektroretinographie
aufgezeichnet werden (Stades, 2006).
Pigmentepithel
Zapfen
Stäbchen
Bipolare Zellen
Ganglienzellen
Axone der Ganglienzellen
Amakrine Zellen
Horizontalzellen
Abb. 2.2 Aufbau der Netzhaut.
2. Literaturübersicht 36
2.6.2 Elektroretinographie
Die Elektroretinographie (ERG) ist eine Untersuchungsmethode zur Aufzeichnung von
schnellen elektrischen Spannungsschwankungen am Auge, die bei plötzlichen Änderungen
der Belichtungsverhältnisse der Netzhaut auftreten. Sie gibt Auskunft über den funktionellen
Zustand der Retina und wird deshalb für die Diagnosestellung unterschiedlicher angeborener
und erworbener Erkrankungen eingesetzt.
In der Ganzfeld- oder Blitzelektroretinographie wird die
Summenantwort der gesamten Netzhaut abgeleitet. Nach
Weitstellung der Pupillen werden über eine weiße Kugel
(Ganzfeld) Lichtblitze steigender Lichtintensität angeboten.
Die dabei entstehenden Spannungsänderungen können mithilfe
empfindlicher Elektroden an der Augenoberfläche abgeleitet
werden. Durch die Verwendung unterschiedlicher Lichtstärken
und -frequenzen ist es möglich, Aussagen über die
verschiedenen Zellgruppen der Retina zu treffen. Eine isolierte
Antwort der Stäbchen und ihrer nachgeschalteten Bipolarzellen
erreicht man durch eine mindestens 30 minütige Dunkeladap-
tation und den Einsatz von niedrigfrequentem Licht geringer Intensität. Durch eine
schrittweise Erhöhung der Leuchtdichte erhält man eine gemischte Antwort von Stäbchen
und Zapfen. Das dunkeladaptierte ERG ist zur Abschätzung und Lokalisation generalisierter
Netzhautfunktionsstörungen unterschiedlicher Ursache von Bedeutung. Bei einer Schädigung
der Stäbchen, wie sie z.B. bei der Retinopathia pigmentosa auftritt, kommt es noch vor dem
Sichtbarwerden krankhafter Veränderungen am Augenhintergrund zu einer Reduktion der
Potentiale.
Das so genannte photopische (Hell-) ERG wird nach zehnminütiger Helladaptation abgeleitet.
Eine stetige Hintergrundbeleuchtung sorgt für die Absättigung der Stäbchenzellen, so dass
eine Messung des Zapfenpotentials möglich ist. Die zusätzliche Reizung mit rasch
flimmerndem Licht ermöglicht die Ableitung einer rein zapfenvermittelten Antwort.
Als Ergebnis der Ableitungen erhält man die von einer PC-Einheit ermittelten ERG-
Messkurven, die Elektroretinogramme. Die Kurven lassen sich in mehrere Abschnitte
unterteilen, die eine Aussage über die Funktionsfähigkeit verschiedener Zellen der Retina
ermöglichen. Bei niedrigen Blitzintensitäten ist nur die so genannte b-Welle erkennbar, die
die die Aktivität der Bipolarzellen widerspiegelt (SHIELLS und FALK, 1999; TIAN und
Abb. 2.3 Ganzfeldkugel
2. Literaturübersicht 37
SLAUGHTER, 1995). Eine normale b-Welle bei niedriger Blitzintensität erlaubt den
Rückschluss auf eine regelrechte Funktion der Rezeptorzellen, die im Falle eines
Funktionsverlustes die Bipolarzellen gar nicht anregen könnten. Bei hohen Blitzintensitäten
erscheint vor der positiven b-Welle die negative a-Welle, die in den Außensegmenten der
Photorezeptorzellen entsteht. Die a-Welle ist ein lang andauerndes, negatives Signal, das bei
schwachen Blitzen durch die größere, positive b-Welle überdeckt wird. Bei höheren
Blitzintensitäten tritt sie zunehmend früher auf und wird deshalb vor der b-Welle sichtbar.
Zusätzlich werden nun auch kleine, schnelle Auslenkungen in der aufsteigenden Flanke der b-
Welle erkennbar, welche vermutlich auf die Aktivität von Amakrin- und Horizontalzellen
zurückgehen.
Die Ausmessung der ERG-Ableitung erfolgt folgendermaßen: Die Amplitude der negativen
a-Welle wird von der dem Blitz vorausgehenden Nulllinie (N) zum negativen Tal gemessen.
Die Amplitude der b-Welle reicht vom Tal der a-Welle bis zum darauf folgenden positiven
Gipfel. Die Latenzzeit beschreibt die Dauer von der Auslösung des Lichtstimulus bis zum
Gipfel bzw. Tal der jeweiligen Welle (BACH und KELLNER, 2000).
Abb. 2.4 Skotopisches ERG mitgeringer Lichtintensität. Angegeben sindNullpunkt (Pfeil, Lichtstimulus) undLatenzzeit (Zeit vom Lichtimpuls biszum Gipfel der Amplitude) der b-Welle.
Abb. 2.5 Skotopisches ERG mit hoher Lichtintensität. Angegeben sind Ausmaß der a- und der b-Welle sowie Nullpunkt (Pfeil, Lichtstimulus). Auslenkungen der b-Welle im aufsteigenden Teil.
modif. nach MARMOR et al., 1999 (ISCEV) modif. nach MARMOR et al., 1999 (ISCEV)
Latenzzeit
a
b
3. Methoden 38
3 Methoden
3.1 Versuchstiere
Die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen an Ratten wurden durch die
Bezirksregierung Hannover/Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen Tierversuchsantrag: 509c-
42502-03/651).
Die Zucht von Tieren der Stämme LEW/Ztm und LEW/Ztm-ci2 erfolgte ausschließlich am
Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover (Haltersymbol: Ztm).
3.1.1 Rattenstämme
Der Hintergrundstamm: LEW/Ztm
Der Inzuchtstamm LEW/Ztm wurde zum Zeitpunkt der Untersuchungen in der 121. bis 126.
Inzuchtgeneration am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover
gezüchtet.
Die drehende Rattenmutante: LEW/Ztm-ci2
Der Stamm LEW/Ztm-ci2 wurde nach einer Spontanmutation, die 1991 in der 96.
Filialgeneration des Inzuchtstamms LEW/Ztm auftrat, isoliert. Der coisogene Inzuchtstamm
wurde etabliert und seit 1993 durch Verpaarung homozygoter Merkmalsträger mit
heterozygoten Tieren (segregierende Inzucht) im modifizierten Parallelliniensystem am
Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet. Die
untersuchten Tiere entstammten der Folgegenerationen 25 bis 28.
3. Methoden 39
Das Rattenmodell für das Usher Syndrom: HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd
Bei diesem Stamm handelt es sich um einen Auszuchtstamm. Als Kontrollen dienten Tiere,
die homozygot wildtyp waren. Die WIST-Myo7Atnd Ratten wurden vom Hubrecht
Laboratorium in Utrecht zur Verfügung gestellt.
3.1.2 Genotypisierung
Genotypisierung der LEW/Ztm-ci2 Ratten
Das circling-Verhalten der LEW/Ztm-ci2 Ratte folgt einem autosomal rezessiven Erbgang.
Da deshalb ausschließlich homozygote Tiere ein Rotationsverhalten zeigen, konnte der
Genotyp der Ratte mittels Phänotypisierung festgestellt werden.
Zur Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften wurde das entsprechende Tier einzeln in
einen Käfig gesetzt, in dem sich frische Einstreu befand (Umsetzen). Während der ersten drei
bis vier Minuten wurde das Verhalten der Tiere beobachtet und dokumentiert. Bei den
Beobachtungen standen folgende Parameter im Vordergrund:
! Aufmerksamkeit/Auskundschaften der neuen Umgebung
! Neugier/Angst
! lateralisierte, kreisförmige Drehbewegungen
! Bewegungsstörungen/unsicherer Gang (Ataxien)
! Opisthotonus (stargazing)
! motorische Hyperaktivität
Um das Hörvermögen zu testen, wurde das Tier mit einem definierten akustischen Stimulus
(Blechfeder mit Resonanzkörper: `Knackfrosch´, VON HÖRSTEN et al.; 1993) konfrontiert
und mögliche Schreckreaktionen, wie das Zusammenzucken des Flankenbereiches oder ein
deutliches Zucken der Kopfreaktion, erfaßt (`Klick Test´). Es folgten einfache Maßnahmen
zur Ermittlung der Sehfähigkeit. Dazu wurde ein Gegenstand in den Käfig verbracht, der dem
Tier unbekannt war (`Unknown Object´). Anschließend wurde etwa 1,5 Minuten lang
beobachtet, ob die Ratte zufällig oder bewußt auf das Objekt reagierte. Weiterhin wurde,
unter Verhinderung von Luftbewegungen, ein Gegenstand von oben vorsichtig auf das Tier
3. Methoden 40
zubewegt, um einer Berührung der Tasthaare zu entgehen. Zusätzlich wurde darauf geachtet,
ob das Tier die Begrenzung des unbekannten Käfigs bewußt wahrnahm.
Genotypisierung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratten
Die phänotypischen Merkmale eines Tieres wurden durch Beobachtung der Ratte im
Heimatkäfig bzw. beim Umsetzen (relative Stresssituation) aufgenommen. Dabei wurde
insbesondere auf Hyperaktivität, Drehbewegungen, Opisthotonus und fehlende
Geräuschempfindlichkeit geachtet. Diese Merkmale waren weniger deutlich ausgeprägt als
bei den symptomatisch ähnlichen LEW/Ztm-ci2 Tieren. Da aber die Mutation bekannt war
und ein Marker existierte, wurde eine Genotypisierung der Tiere über die Sequenzierung des
mutationstragenden Gens (Myo7A) erreicht. Die dafür verwendeten Primer sind dem Anhang
I, Kap. 9.3.4 zu entnehmen. Die Sequenzierung wurde im Hubrecht Laboratorium in Utrecht,
Holland vorgenommen.
3.1.3 Tierhaltung
Tierhaltung an der Medizinische Hochschule Hannover (MHH)
LEW/Ztm-ci2 Ratten und LEW/Ztm Tiere für die Kernzucht wurden unter spezifiziert
pathogen-freien Bedingungen (SPF-Haltung) mit Nassbarriere gehalten. Für den Versuch
ausgewählte Tiere wurden bis zur Untersuchung in Typ III Makrolon® -Käfigen in einem
barrieregeschützten Raum (Trockenbarriere) untergebracht.
Die Haltung der HsdRccHan:WIST-Myo7ATnd Ratten erfolgte in individuell ventilierten
Käfigen (individually ventilated cages, IVC) des Typs III (Material Lexan®) in einem
barrieregeschützten Raum (Trockenbarriere).
Die Gruppengröße der auf Weichholzgranulat gehaltenen Ratten betrug je nach Gewicht 1-3
Tiere pro Käfig. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Handelsübliches
Haltungs- (Altromin 1324) bzw. Zuchtfutter (Altromin 1310) sowie Wasser wurden den
Tieren ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Raumtemperatur betrug 20°C ± 2°C, die
Luftfeuchtigkeit 55% ± 5%. Die Beleuchtung erfolgte über Kunstlicht in der Zeit von 6:00
Uhr bis 18:00 Uhr MEZ.
3. Methoden 41
Die genetische Überwachung der im Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen
Hochschule Hannover gezüchteten Stämme erfolgte durch Überprüfung des Genoms mittels
Schwanzhauttransplantation, immunologischer Marker (RT1, RT2, RT3, RT6) und
molekulargenetischer Marker wie Mikrosatellitenmarker (Hedrich, 1990; Ausschuss für
Genetik und Labortierzucht, GV-SOLAS, 2006).
Die Gesundheitsüberwachung der im Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen
Hochschule Hannover gehaltenen Tiere wurde gemäß den FELASA-Empfehlungen
(NICKLAS et al., 2002) im Rahmen von vierteljährlichen Routineuntersuchungen
durchgeführt.
Tierhaltung an der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo)
Die Haltung der in den beschriebenen Versuchen eingesetzten Tiere erfolgte am Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie. Die Ratten wurden einzeln und nach Geschlecht
räumlich getrennt (verschiedene Ständer) auf Weichholzgranulat in Makrolon®-Käfigen des
Typs III gehalten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Handelsübliches
Haltungsfutter (Altromin 1324) sowie Wasser wurde den Tieren ad libitum zur Verfügung
gestellt. Die Raumtemperatur betrug etwa 20°C, die Luftfeuchtigkeit circa 55%. Die
Beleuchtung erfolgte über Kunstlicht in der Zeit von 6:00 Uhr bis 18:00 Uhr MEZ.
3.2 Kandidatengenanalyse - Sequenzierung
Die in Vorarbeiten ermittelten Kandidatengene wurden auf Unterschiede innerhalb ihrer
Basensequenz bei dem mutationstragenden Stamm LEW-ci2 im Vergleich zum
Hintergrundstamm LEW/Ztm untersucht. Dazu wurde DNA beider Stämme aus Ohr- bzw.
Schwanzgewebe isoliert und zur Amplifikation von Genfragmenten eingesetzt. Die dabei
verwendeten Primer schlossen je nach Größe der kodierenden Bereiche einen Teil eines
Exons, ein Exon oder mehrere Exons ein. Die Entwicklung der Primer sowie die
Sequenzierungen wurden im Hubrecht Laboratorium in Utrecht, Holland vorgenommen.
3. Methoden 42
3.2.1 Probenentnahme
Zur Gewinnung von genomischer DNA wurden Milz, Ohren und Schwanzspitze unter
aseptischen Bedingungen nach Tötung des Tieres entnommen, in ein steriles Reaktionsgefäß
verbracht und sofort in flüssigen Stickstoff überführt.
Zur Gewinnung von mRNA wurden Milz, Leber, Gehirn und Hypophyse entnommen. Um
eine Kontamination zu verhindern, erfolgte die Probenentnahme unter Verwendung eines
sterilen Besteckes, welches im Vorfeld mit einer RNase destruierenden Substanz (RNAse
Away) behandelt wurde. Zwischen zwei Sektionen erfolgte eine Reinigung bzw. ein
Austausch des Instrumentariums.
Die Lagerung der Organe erfolgte bei -80°C.
3.2.2 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion
Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)
Zur Isolierung von DNA aus Ohrmuschel und Schwanzspitze wurde das NucleoSpin® Tissue
Kit verwendet. Die Durchführung ist in Anhang I, Kap. 9.2.1 beschrieben.
Die Reinheit der aufgearbeiteten DNA wurde mithilfe eines Kontrollgels überprüft. Es folgte
eine photometrische Konzentrationsbestimmung bei 260 nm und die Einstellung der DNA mit
sterilem Aqua dest. auf 50 ng/µl.
Kontrolle der DNA-Extraktion
Zur Überprüfung von Konzentration und Reinheit der aufgearbeiteten DNA wurde ein
0,8%iges Agarosegel angefertigt. Es wurde ein Gemisch aus je 4 µl Ladepuffer, 8 µl dH2O
und 2 µl der auf 50 ng/µl eingestellten DNA-Probe aufgetragen. Anschließend erfolgte eine
elektrophoretische Auftrennung der Probe. Eine klare, deutlich sichtbare und gut abgegrenzte
Bande war der Beweis für eine gute Qualität der aufgearbeiteten DNA. Die Konzentration der
DNA konnte mit Hilfe des ebenfalls aufgetragenen DNA-Längenstandards abgeschätzt
werden. Die Anfertigung von Gelen und die Durchführung der Gelelektrophorese sind im
Anhang I, Kap. 9.5.3 beschrieben.
3. Methoden 43
3.2.3 Amplifikation der Kandidatengene
Die Primer zur Sequenzierung der Kandidatengene (51 Primerpaare für Myo15 und 3
Primerpaare für Kcnj12), die im Anhang I, Kap. 9.3.4. aufgelistet sind, wurden mithilfe der
Ensembl Genom-Datenbank (http://www.ensembl.org) und des Programms LIMSTILL
(http://limstill.niob.knaw.nl) konstruiert. Die optimale Schmelztemperatur wurde mit 58°C
angegeben. Temperaturprofil und PCR-Konditionen für die sogenannte touchdown PCR
finden sich im Anhang I, Kap. 9.4.2.
3.2.4 Sequenzierung
Die PCR-Produkte aus der Amplifikationsreaktion (Kap. 3.2.3) wurden mit 20 µl dH2O
versetzt und in dieser Verdünnung als Template für die Sequenzierungsreaktion (Anhang I,
Kap. 9.4.2) eingesetzt. Die Sequenzierungsreaktion wurde den Herstellerangaben (Applied
Biosystems) entsprechend durchgeführt.
5 µl des Sequenzierungsproduktes wurden mittels Ethanolfällung in Anwesenheit von 40 mM
Sodiumazetat gereinigt und in einem 96-Kapillar-3730XL DNA Sequenziergerät (Applied
Biosystems) unter Verwendung des Standard Protokolls (RapidSeq, Anhang I, Kap. 9.4.1)
analysiert.
3.2.5 Mutationsanalyse
Die Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mit dem Programm Polyphred
(NICKERSON et al, 1997), wobei polymorphe Positionen manuell herausgesucht und
ausgewertet wurden. Mögliche Auswirkungen auf die Struktur des Proteins wurden anhand
der Programme SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) und PolyPhen analysiert (NG und
HENIKOFF, 2003).
3. Methoden 44
3.3 Kandidatengenanalyse - Real Time (Echtzeit) PCR
Die Echtzeit (Real Time) PCR beruht auf dem Prinzip einer herkömmlichen Polymerase-
Kettenreaktion, jedoch werden Amplifikation und Nachweis des Reaktionsproduktes in ein
und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt. Die Methode bietet also die Möglichkeit der
Quantifizierung der in einer Probe vorhandenen cDNA und lässt Rückschlüsse auf die
eingesetzte Menge an RNA zu. Die Detektion erfolgt mithilfe fluoreszierender Marker nach
jedem PCR-Zyklus.
Es wurde eine sogenannte `Relative Quantifizierung´ durchgeführt, bei der die Expression des
Kandidatengens Myo15 sowohl von LEW-ci2 Ratten als auch von Tieren des
Hintergrundstamms LEW gegen eine interne Kontrolle, das Referenzgen, und gegeneinander
verglichen wurde.
3.3.1 Probenentnahme
12 Wochen alte Tiere der Stämme LEW-ci2 und LEW wurden nach CO2-Inhalation getötet
und das Abdomen median eröffnet. Ein Teil der Leber sowie die Milz wurden steril
entnommen. Nach Absetzen des Kopfes wurde das Schädeldach eröffnet und das Gehirn unter
Schonung des Gewebes gewonnen. Anschließend wurde die Hypophyse vorsichtig
freipräpariert. Alle Organe wurden nach der Entnahme in ein beschriftetes Reaktionsgefäß
überführt und unverzüglich in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der Gewebe
erfolgte bei -80°.
3.3.2 Isolierung von Ribonukleinsäure und Kontrolle der Extraktion
Um die Expression von Myo15 in verschiedenen Organen vergleichen zu können, wurde RNA
aus Leber-, Milz-, Gehirn- und Hypophysengewebe extrahiert.
Die Gewinnung von RNA aus Leber und Milz erfolgte wie in Anhang I, Kap. 9.2.2
beschrieben mithilfe des NucleoSpin® RNAII Kits. Aufgrund des hohen Fettanteils in Gehirn
und Hypophyse wurde bei diesen Geweben für die Extraktion von RNA ein spezielles Kit
verwendet, das RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (siehe Anhang I, Kap. 9.2.3).
3. Methoden 45
Die Reinheit der aufgearbeiteten RNA wurde mithilfe eines denaturierenden Kontrollgels
(Anhang I, Kap. 9.5.4) überprüft, auf dem die 18s und 28s Banden der mRNA unter UV-
Illumination bei 260 nm sichtbar gemacht wurden.
Der RNA-Gehalt der Probe wurde photometrisch bestimmt. Die Endkonzentration von 150-
200 ng RNA/µl wurde durch Verdünnung mit RNase freiem Wasser eingestellt.
Die Lagerung der isolierten RNA erfolgte bei -80°C.
3.3.3 Reverse Transkription
Für das Umschreiben der gewonnenen RNA in cDNA mit dem Omniskript RT Kit (siehe
Anhang I, Kap. 9.4.3) wurden Oligo-dT Primer verwendet. Die cDNA diente der
Durchführung der Real Time PCR.
Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.
3.3.4 Durchführung der Real Time PCR
Die Real Time PCR wurde mit den in Anhang I, Kap. 9.3.5 aufgeführten, genspezifischen
Primerpaaren in einem Opticon Real Time Cycler amplifiziert. Bei der Erstellung der
Primersequenzen wurde darauf geachtet, daß die Annealingtemperaturen der Primer nicht
mehr als 1°C differierten, kein Self-Annealing zu beobachten war und das
Amplifikationsprodukt eine Länge von etwa 120 bp besaß. Die Primer wurden so konstruiert,
dass das eingegrenzte Fragment zwei Exons überspannte, so dass eine ungewollte
Amplifikation genomischer DNA zu einem überlangen Fragment geführt hätte.
Die Amplifikation der in Dreifachansätzen und in 4 Verdünnungsstufen (10-1, 10-2, 10-3, 10-4)
eingesetzten Proben wurde in Low-Profile 96-well Mikrotiterplatten durchgeführt. Als
Referenzgen wurde das β-Aktin und als Fluoreszenzfarbstoff das SYBR Green I verwendet,
das sich ausschließlich an Doppelstrang DNA anlagert und durch eine Anregung bei 450 nm
bis 495 nm eine Detektion bei 515 nm bis 545 nm erlaubt. Die optimale SYBR Green I -
Konzentration im PCR-Reaktionsansatz wurde durch Konzentrationsreihen in Vorversuchen
bestimmt, da eine zu geringe SYBR Green I Konzentration ein zu schwaches
Fluoreszenzsignal ergibt. Eine zu hohe Konzentration inhibiert dagegen die PCR-Reaktion.
3. Methoden 46
Reaktionsansatz und Temperaturprofil sind im Anhang I, Kap. 9.4.4 aufgeführt. PCR-
Konditionen und Annealingtemperatur wurden in Vorversuchen optimiert.
Um die Spezifität der Real Time-Amplifikation sicherzustellen, wurde im Anschluß an die
Reaktion eine Schmelzpunktanalyse sowie der Nachweis der amplifizierten Produkte in einem
3%igen Agarose-Gel (analog zu Anhang I, Kap. 9.5.3) durchgeführt.
Bei einer Schmelzkurve wird die Temperatur alle 10 sek um 1°C gesenkt, beginnend bei
96°C. Parallel wird die Intensität der SYBR Green Fluoreszenz gemessen. Bei hohen
Temperaturen sind alle PCR-Produkte denaturiert. Je nach den spezifischen Schmelzpunkten
der PCR-Produkte liegen diese bei abnehmenden Temperaturen in doppelsträngiger Form vor,
wodurch die Fluoreszenz schlagartig ansteigt. Von dieser Schmelzkurve wird mathematisch
die erste Ableitung erstellt, so dass jede schlagartige Intensitätsänderung als Peak dargestellt
wird. Peaks bzw. Plateaus, die nicht an dem Schmelzpunkt des erwarteten PCR-Produktes
liegen, deuten auf unspezifische PCR-Produkte hin.
3.3.5 Auswertung der Daten
Die Analyse der Genexpression erfolgte durch das auf dem Exel -basierenden Programm
Qgene (Müller et al., 2002), wobei unter Berücksichtigung der Amplifikationseffizienz der
untersuchten Gene eine Expressionsratio zu dem β-Aktin Housekeeping-Gen gebildet wurde.
3.4 Analyse der Proteinstruktur - Klonierung
Für eine kristallographische Analyse der Proteinstruktur sind große Mengen an reinem Protein
notwendig. Um dies zu gewährleisten wurde das mutationstragende Element mittels
spezifischer Primer amplifiziert und zur Gewinnung großer Mengen dieses Amplifikates in
Eschericha coli kloniert. Zur Produktion des gewünschten Proteins wurde aus E. coli
isoliertes Insert in ein Derivat des extrachromosomalen D. discoideum-Vektors pDXA
kloniert und in D. discoideum -Wildtyp-Zellen transfiziert.
3.4.1 Klonierung der mutationstragenden MyTH4-Domäne
Unter Klonierung (Cloning) versteht man das Einfügen eines DNA-Fragmentes in einen
Vektor, der die massenhafte Vermehrung dieser DNA ermöglicht.
3. Methoden 47
Herstellung des zu klonierenden Fragmentes
Reaktionsansatz und Temperaturprofil für die PCR zur Amplifikation der mutationstragenden
Domäne sind im Anhang I, Kap. 9.4.5 aufgeführt. Die eingesetzte (ausschließlich aus
Hypophysengewebe isolierte) cDNA wurde dem für die Real Time PCR angefertigten
Probenpool (Kap. 3.3.2) entnommen. Die Konstruktion der für die Amplifikation benötigten,
spezifischen Primer (Anhang I, Kap. 9.3.6) erfolgte mithilfe des Oligo 6.0 Programmes.
Es wurden zwei Reaktionen parallel angesetzt:
Reaktion
Ausgangsmaterial
Stamm
1 cDNAHypophyse LEW-ci2 (Mutante)
2 cDNAHypophyse LEW (Hintergrund)
Zur Amplifikation der MyTH4-Domäne wurde eine proof-reading Polymerase (Phusion High
Fidelity Polymerase, Finnzymes) verwendet. Da proof-reading Polymerasen aufgrund ihrer
3´→ 5´ Exonuklease-Aktivität sogenannte blunt ends produzieren, musste im Anschluß ein
für die TA-Klonierung (TA-Cloning) notwendiger A-Überhang erzeugt werden (A-tailing).
Dies wurde über eine zusätzliche PCR unter Verwendung einer Taq-Polymerase und dATPs
erreicht. Der Reaktionsansatz, der im Anhang I, Kap. 9.7.1 beschrieben ist, wurde für 15 bis
30 min bei 70°C in einem Thermocycler inkubiert.
Das Produkt wurde auf ein Agarose-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt (siehe
Anhang I, Kap. 9.5.3). Die spezifische Bande, die die zu klonierende Sequenz enthielt, wurde
aus dem Gel ausgeschnitten und wie in Anhang I, Kap. 9.6.2 beschrieben mithilfe des
NucleoSpin® Extract Kits aufgereinigt.
Ligation
Das extrahierte Fragment wurde unter Verwendung des pGEM®-T Easy Vector System I-Kits
in einen pGEM®-T Easy Vektor kloniert. Die Arbeitsschritte sind dem Anhang I, Kap. 9.7.2
zu entnehmen.
3. Methoden 48
3.4.2. Transformation in E. coli
Unter Transformation versteht man die Aufnahme von freier DNA in eine Bakterienzelle. Sie
erfolgte nach der Hitzeschockmethode unter Verwendung chemisch kompetenter E. coli-
Bakterien:
6 µl des Ligationsproduktes wurden auf 100 µl unaufgetaute Bakteriensuspension (Lagerung
bei -80°C) gegeben. Während einer Inkubationszeit von 20 min auf Eis wurde die Suspension
mehrfach vorsichtig vermischt. Es folgte eine einminütige Inkubation bei 42°C. Anschließend
wurde die Suspension für 2 bis 4 min auf Eis gestellt.
Nach der Zugabe von 500 µl LB-Medium und anschließender Inkubation von 20 bis 45 min
bei 37°C folgte das Abzentrifugieren der Zellen bei 3000 rpm für 5 min. Der Überstand wurde
entfernt und die Zellen auf einer Ampicillin-haltigen Agarplatte ausplattiert und über Nacht
bei 37°C inkubiert.
Da das transformierte Plasmid (pGEM®-T Easy) ein Resistenzgen für das Antibiotikum
Ampicillin trägt, wurde somit sichergestellt, dass nur erfolgreich transformierte Bakterien
überleben.
3.4.3 Selektion
Blue-White-Screening
Neben dem Resistenzgen für Ampicillin findet sich auf dem Plasmid das lacZ-Gen, welches
für das Enzym β-Galaktosidase kodiert. Innerhalb der Sequenz des Gens liegt der Polylinker
(multiple cloning site) des Plasmids, der weder den Leserahmen zerstört noch die
enzymatische Aktivität des Enzyms beeinflusst. Bei der Spaltung von X-gal (5-Brom-4-
chloro-3-indolyl-β-D-Galaktopyranosid), das beim Blue-White Screen anstelle von Galaktose
als Substrat zugeführt wird, entsteht ein blauer Farbstoff. Um die Expression des Gens zu
induzieren bzw. zu steigern, wird anstelle von Laktose IPTG (Isopropyl-β-D-
thiogalaktopyranosid) zugefügt. Wird die cDNA erfolgreich in den Vektor ligiert, inseriert sie
in den Polylinker und unterbricht die Sequenz, so dass kein funktionsfähiges Enzym gebildet
wird und die Kolonien weiß erscheinen. Im Gegensatz dazu haben solche Kolonien, bei denen
die Bakterien aufgrund fehlgeschlagener Ligation eine Galaktosidaseaktivität aufweisen, eine
blaue Farbe.
3. Methoden 49
Für das Screening wurden dem bei der Ligation gewonnenen Zellpellet 40µl Xgal (20 µg/ml)
sowie 100 µl IPTG (100 mM) hinzugefügt und die Suspension ausplattiert.
Selektion
Pro Transformationsansatz wurden etwa 6 bis 12 weiße Kolonien mithilfe eines
handelsüblichen Zahnstochers entnommen und in 3 ml LBAmp-Medium überführt. Es folgte
eine Inkubation über Nacht bei 37°C und 200 rpm im Thermoschüttler.
3.4.4 Kontrolle des Ligationsergebnisses
Um zu kontrollieren, ob die isolierten Kolonien (Klone) Vektoren mit regelrecht ligiertem
Insert aufwiesen, wurde die Plasmid-DNA aus den Zellen isoliert und das Insert mithilfe von
Restriktionsenzymen ausgeschnitten. Bei der Restriktionsspaltungen werden DNA-Fragmente
aus Vektoren herausgeschnitten bzw. Vektoren geöffnet (linearisiert). Die
Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme befinden sich innerhalb des Polylinkers
(multiple cloning site) in unmittelbarer Nachbarschaft zur Ligationsstelle. Das
ausgeschnittene Fragment besitzt deshalb etwa die Länge des Inserts. Dies wurde mittels
Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
Isolation der Plasmid-DNA (DNA-Minipräparation)
Die Arbeitsschritte zur Isolation der Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit sind
in Anhang I, Kap. 9.7.3 beschrieben.
Restriktionsverdau
Zum Screenen der bei der Mini-Präparation gewonnenen Plasmid-DNA auf regelrecht
ligiertes Insert wurde das Restriktionsenzym EcoRI (Erkennungssequenz: 5´... CTT AA/G
...3´) verwendet. Der Reaktionsansatz für den Verdau mit EcoRI, der im Anhang I, Kap. 9.7.4
aufgeführt ist, wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Zur Kontrolle der im EcoRI-Verdau positiven Proben wurden die Restriktionsenzyme XhoI
(5´... C/TC GAG ...3´) und NheI (5´... G/CT AGC ... 3´) verwendet, deren
3. Methoden 50
Erkennungssequenzen sich im Gegensatz zu denen des EcoRI-Enzyms direkt im Insert
befinden. Um die größtmögliche Effizienz der Enzyme auszunutzen, wurden zwei
aufeinanderfolgende Reaktionen durchgeführt. Im ersten Verdau mit dem Enzym NheI,
dessen Reaktionsansatz analog zum Verdau mit dem Enzym EcoRI war, wurde als Puffer
1xTango eingesetzt. Um die Reaktion abzuschließen, wurde das Enzym anschließend durch
eine Inkubation des Ansatzes für 10 min bei 65°C inaktiviert. Das Protokoll für den
nachfolgenden einstündigen Verdau mit XhoI bei 37°C ist dem Anhang I, Kap. 9.7.5 zu
entnehmen.
Im Anschluß an den Verdau wurden die Proben auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch
(Anhang I, Kap. 9.5.3) aufgetrennt und auf Banden entsprechend der Länge der klonierten
Sequenz untersucht.
Sequenzierung zur Kontrolle des Ligationsergebnisses
Die positiven Proben wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) sequenziert. Für
die Sequenzierung wurde die bei der Mini-Präparation gewonnene Plasmid-DNA sowie der
Standardprimer M13 benutzt.
Die Plasmide wurden mit Hilfe des CEQ-Systems (vollautomatische 8-Kapillar-Sequenzierer
und entsprechende Reagenzien) nach dem Prinzip der Didesoxymethode nach Sanger
sequenziert. Dabei wurde jedes Plasmid mindestens dreimal (drei unabhängige Versuche)
sowohl mit dem zugehörigen forward- als auch mit dem reverse- Primer sequenziert.
3.4.5 Klonierung in den pM765-tev Vektor
pM765-tev
Bei dem verwendeten Vektor handelt es sich um ein Derivat des extrachromosomalen D.
discoideum-Vektors pDXA (Manstein et al., 1995).
Zur Amplifikation dieses Vektors wurde der Escherichia coli Stamm XL1-Blue MRF' Kan
(Stratagene, Heidelberg) verwendet.
Der Vektor dient zur Expression und Aufreinigung von Proteinen aus D. discoideum. Er trägt
den Replikationsursprung (ori) des D. discoideum high-copy-number Plasmids Ddp2. Die
3. Methoden 51
Expressionskassette enthält den starken, konstitutiven Aktin-Promotor act15, ein Startcodon
upstream der multiple cloning site (MCS) sowie C- oder N-terminale Sequenzen für
Affinitäts-Tags. Außerdem besitzt der Vektor die act6 Tn5 neoR Kassette für die Resistenz
gegen G418 zur Selektion positiver Transformanten. Downstream der MCS folgen D.
discoideum Polyadenylierungs- und Terminationssignale.
Außerdem enthält er einen high-copy-number E. coli Plasmid-Replikationsursprung sowie das
bakterielle ApR-Gen zur Plasmidproduktion und Selektion in E. coli.
Klonierung
Die Klonierung in den pM765-tev Vektor erfolgte analog zur Klonierung des pGEM®-T Easy
Vektors. Da eine größere Menge an Plasmid-DNA zur Ligation notwendig war, wurde eine
DNA-Maxipräparation durchgeführt. Diese entspricht weitgehend der Minipräparation. Im
Gegensatz zu dieser es ist jedoch möglich, bis zu 500 µg DNA/Probe zu isolieren. Die
Arbeitsschritte zur Durchführung der Maxipräparation sind im Anhang I, Kap. 9.7.6.
aufgeführt. In Vorbereitung auf die Ligation wurde das Insert mithilfe der Reaktionsenzyme
XhoI und NheI ausgeschnitten bzw. der Vektor präpariert. Dies erfolgte wie in Anhang I,
Kap. 9.7.7 beschrieben in einem Doppelansatz (Doppelverdau). Die notwendigen Konditionen
wurden der Internetseite der Firma Fermentas zum Ansatz eines Doppelverdaus entnommen
(http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html).
Dephosphorylierung von DNA
Um nach dem Restriktionsverdau eine Religation des Vektors zu verhindern, mußten
überstehende Phosphatgruppen entfernt werden. Die Spaltungsreaktion wurde mithilfe der
Alkalischen Phosphatase (CIAP) im Anschluß an die Restriktionsspaltung durchgeführt. Es
wurde 1U CIAP/20 pmol DNA verwendet und der Ansatz für 30 min bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurde die Phosphatase durch fünfzehnminütiges Erhitzen auf 85°C inaktiviert.
Um nach der Restriktionsspaltung die Ligation (Anhang I, Kap. 9.7.8) durchführen zu
können, musste allerdings auf einer der beiden zu verknüpfenden Seiten des DNA-Stranges
eine Phosphatgruppe vorhanden sein. Diese wurden vom Insert bereitgestellt.
3. Methoden 52
3.4.6 Transformation des pM765-tev Vektors in E.coli
Die Transformation des pM765-Vektors in E.coli erfolgte analog zur Transformation des
pGEM-T easy Vektors (Kap. 3.4.2).
3.4.7 Selektion und Kontrolle des Ligationsergebnisses
Die Vorgehensweise ist in den Kapiteln 3.4.3 und 3.4.4 beschrieben. Alternativ wurde beim
Verdau das Restriktionsenzym PstI verwendet, dessen Erkennungssequenz (5´... CTG CA/G
...3´) direkt auf der die Mutation enthaltenden Sequenz des Inserts liegt. Außerdem befanden
sich innerhalb der Vektorsequenz zwei weitere Schnittstellen für das Enzym. Die
resultierenden Fragmente besassen eine Länge von 660 bp (Sequenz der LEW und LEW-ci2
Ratte) und 933 bp (nur LEW).
Sequenzierung zur Kontrolle des Ligationsergebnisses
Positive Proben wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) sequenziert. Zur
Sequenzierung wurde die bei der Mini-Präparation gewonnene Plasmid-DNA sowie folgende
Primer (Sequenzen sind im Anhang I, Kap. 9.3.6 sowie 9.3.7 aufgeführt) verwendet:
• MyTH4 rev
• mhc 2233c
Der mhc 2233c Primer wurde anstelle des MyTH4 fw Primers eingesetzt, um zusätzlich den
Übergang zwischen Vektor-Sequenz und klonierter Sequenz beurteilen zu können.
3.4.8 DNA-Maxipräparation ausgewählter Klone
Für die Maxipräparation mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit wurde das im Anhang I, Kap.
9.7.6 beschriebenen Protokoll verwendet.
3. Methoden 53
3.5 Analyse der Proteinstruktur - Zellbiologische Methoden
3.5.1 Transfektion von Dictyostelium discoideum
Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische
Zellkulturzellen. Für Suspensionskulturen bietet sich hierfür die sogenannte Elektroporation
an, bei der die Zellmembran durch Spannungspulse für die zu übertragende DNA permeabel
gemacht wird.
Für die Transfektion von D. discoideum wurde eine Schüttelkultur aus AX3-ORF+-Zellen
(Wildtyp-Zellen) angelegt, indem 100 ml HL-5c-Medium+P/S mit ORF-Zellen einer
konfluenten Petrischale beimpft und für 48 Stunden bei 20°C und 180 rpm inkubiert wurden.
Sobald die Suspension eine Dichte von 2-3 x 106 Zellen/ml erreicht hatte, wurde diese bei
2800 rpm für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden zweimal mit je 20
ml Elektroporationspuffer gewaschen, anschließend in gleichem Puffer resuspendiert und auf
5-8 x 106 Zellen/ml eingestellt. 800 µl dieser Zellsuspension wurden mit 12-20 µg Plasmid-
DNA gemischt und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette mit 0,4 mm Schichtdicke
überführt. Diese wurde anschließend für weitere 5 min auf Eis gekühlt. Die Elektroporation
fand unter folgenden Bedingungen statt:
! 1000V-1200V, 3 µF, 600Ω
! 2 Pulse zu je1 ms, dazwischen 5 sek Pause
Die Küvette wurde sofort auf Eis gestellt. Es wurden 2 Petrischalen mit jeweils 11 ml HL-5c-
Medium vorbereitet, das 10 U/ml Penicillin und 10 µg/ml Streptomycin (P/S) enthielt. Nach 5
bis 10 min Inkubationszeit wurden 100 µl bzw. 700 µl der Zellsuspension unter kreisenden
Bewegungen in eine Petrischale pipettiert, um eine optimale Dichte der transfizierten Zellen
für das Picken von Klonen zu gewährleisten.
3.5.2 Selektion transfizierter Zellen mit Geneticin
Zwölf bis vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurde das Medium abgezogen und
durch 11 ml HL-5c-Medium+P/S+G10 ersetzt. Aufgrund der G10(Geneticin)-Sensibilität der
transfizierten Zellen erfolgte ein Absterben der nichttransformierten Zellen, die durch ein
3. Methoden 54
tägliches Wechseln des Mediums über mehrere Tage entfernt wurden. Nach einer
Wachstumsphase von 7 bis 14 Tagen bildeten die transfizierten Zellen Kolonien, die als
weiße Punkte am Boden der Petrischalen zu erkennen waren. Die Vereinzelung erfolgte,
indem die Pipettenspitze direkt auf eine Kolonie aufgesetzt, diese zusammen mit 1000 µl
Medium aufgezogen und in ein Well (Vertiefung) einer 1 ml-Multiwellplatte überführt wurde.
Auf diese Weise wurden etwa 6-12 Kolonien pro Platte selektiert. Sobald das Well halb
konfluent war, wurde es gespült, die Suspension in eine große Petrischale überführt und mit
HL-5c-Medium+P/S+G10 auf 11 ml aufgefüllt. Das Medium wurde jeden zweiten Tag
gewechselt. War die Platte konfluent, wurden die Zellen mit 1 ml HL-5c-Medium+P/S+G10
vom Plattenboden abgespült und für eine Protein-Minipräparation verwendet, um die
Expressionsrate des gewünschten Proteins zu analysieren.
3.5.3 Gewinnung von Sporen
Dictyostelien existieren unter normalen Bedingungen als einzellige Amöben, die sich jedoch
bei Nahrungsmangel zu einem vielzelligen Verband organisieren und einen Fruchtkörper
ausbilden. Dieser entläßt eine große Anzahl an Sporen, eine restistente Dauerform, die unter
geeigneten Umweltbedinungen wieder als Einzeller auskeimen. Über die Gewinnung von
Sporen konnten wichtige Klone für längere Zeit konserviert werden.
Zur Gewinnung von Sporen wurde eine Schüttelkultur aus 100 ml HL-5c-Medium+P/S+G10
und 1 ml Spüllösung von einer konfluenten Platte des gewünschten Klons angelegt. Es folgte
eine Inkubation bei 20°C und 180 rpm, bis eine Dichte von etwa 5 x 106 Zellen/ml erreicht
war. Die Suspension wurde bei 4°C für 2 min bei 2800 rpm zentrifugiert und das gewonnene
Zellpellet mit 20 ml MES-Puffer gewaschen. Es folgten Pelletierung, erneutes Waschen mit
MES-Puffer, Pelletierung und anschließend die Resuspendierung des Pellets in 400 µl MES-
Puffer. Die gewonnene Zellsuspension wurde auf eine MES-Agarplatte gleichmäßig
ausgestrichen. Nach Trocknung der Flüssigkeit wurde die Platte auf dem Deckel stehend für
24 bis 48 Stunden bei 20°C inkubiert. Die gebildeten Sporen wurden durch einmaliges
Aufklopfen der Petrischale auf den Deckel übertragen und in < 1000 µl 10%iges w/v Glycerin
aufgenommen. Die Lagerung der Sporen erfolgte in 100 µl Aliquots bei -80°C.
3. Methoden 55
Um eine Kontamination der gewonnenen Sporen mit Bakterien oder Hefen auszuschließen,
wurde eine der Portionen ausgesät (Kap. 3.5.4.) und in den folgenden Tagen auf mögliche
Infektionen überprüft.
3.5.4 Anzucht von D. discoideum aus Sporen
Zur Anzucht von D. discoideum aus Sporen wurden 11 ml HL-5c-Medium+P/S in eine
Petrischale gegeben und 100 µl einer Sporensuspension hinzugefügt. Während einer 24
stündigen Inkubation erfolgte das Ausschlüpfen der Zellen. Anschließend wurde das Medium
durch 11 ml HL-5c-Medium+P/S+G10 (Ausnahme: bei AX3-ORF+-Zellen) ersetzt. Der
Wechsel des Mediums erfolgte alle zwei Tage. Sobald die Platte konfluent war, wurde sie mit
1 ml Medium sorgfältig gespült, um eine zu hohe Zelldichte zu vermeiden. Die Spüllösung
wurde für weitere Experimente verwendet.
3.6 Analyse der Proteinstruktur - Proteinbiochemische Methoden
3.6.1 Analytische Proteinpräparation aus D. discoideum
Um transformierte D. discoideum-Kulturen auf die Expression des gewünschten Proteins zu
untersuchen, wurde eine analytische Protein-Mini-Präparation durchgeführt. Die
Arbeitsschritte sind dem Anhang I, Kap. 9.8.1 zu entnehmen.
3.6.2 Nachweis von Proteinen mittels Gelelektrophorese
Die SDS-PAGE (Laemmli, 1970) wird sowohl für die Überprüfung der Expression bei der
analytischen Proteinexpression als auch zur Reinheitsbestimmung bei der Proteinaufreinigung
eingesetzt.
Es wurden SDS-Polyacrylamid-Gele verwendet, die sich aus 10-15%igem Trenngel und
5%igem Sammelgel mit einer Dicke von 0,75 mm zusammensetzten (diskontinuierliche
Gelelektrophorese). Die Zusammensetzung der Teilgele sowie der Ablauf der
Gelelektrophorese sind im Anhang I, Kap. 9.8.2. und 9.8.3. angegeben.
Die Entwicklung des Gels erfolgte mittels Coomassie-Färbung (Anhang I, Kap. 9.8.4).
3. Methoden 56
3.7 Elektroretinographische Untersuchung
Die ophthalmologischen Untersuchungen wurden nach den Richtlinien der "Association for
Research in Vision and Ophthalmology statement for the use of animals in ophthalmic and
vision research" durchgeführt.
3.7.1 Übersicht der verwendeten Tiere
Elektroretinographie
Stamm Genotyp Geschlecht Alter in Tagen Anzahl der
Tiere
männlich ≥ 400 4 homozygot
weiblich ≥ 400 3
männlich ≥ 400 1
LEW/Ztm-ci2
MHH heterozygot
weiblich ≥ 400 6
männlich ≥ 400 4 homozygot
weiblich ≥ 400 3
männlich ≥ 400 3
LEW/Ztm-ci2
TiHo heterozygot
weiblich ≥ 400 4
männlich ≥ 400 4 LEW/Ztm
MHH
wildtyp
weiblich ≥ 400 3
männlich ≥ 400 4 LEW/Ztm
TiHo
wildtyp
weiblich ≥ 400 3
männlich ≥ 400 4 homozygot
weiblich ≥ 400 1
männlich ≥ 400 2 heterozygot
weiblich ≥ 400 3
HsdRccHan:
WIST-Myo7Atnd
wildtyp männlich > 100 bis 300 3
weiblich > 100 bis 300 2
3. Methoden 57
Histologie
Stamm
Genotyp
Anzahl der Tiere
homozygot 3 LEW-ci2
MHH heterozygot 3
homozygot 3 LEW-ci2
TiHo heterozygot 3
LEW
MHH
wildtyp 3
LEW
TiHo
wildtyp 3
3.7.2 Dunkeladaptation
Um eine isolierte Antwort der Stäbchenzellen zu erreichen, wurde das zu untersuchende Tier
für etwa zehn Stunden an Dunkelheit adaptiert. Dazu wurde der Käfig in einen lichtdichten,
mit einem ebenfalls lichtdichten Belüftungsschacht versehenen Dunkelschrank (Höhe 930
mm/Breite 930 mm/Tiefe 580 mm) plaziert. Alle im Anschluß an die Dunkeladaptation
durchgeführten Arbeiten erfolgten bei absoluter Dunkelheit oder unter Rotlicht.
3.7.3 Narkose
Die Gewichtsbestimmung des Tieres zur Errechnung der Narkose erfolgte mithilfe einer
handelsüblichen Digitalwaage. Die Narkose wurde nach Fixation des Tieres in nachstehender
Dosierung in einer Mischspritze peritoneal verabreicht:
Ketamin (10%) 100 mg/kg
Xylazin (2%) 4 mg/kg
Die benötigte Menge an Narkosemitteln, eine mögliche Nachdosierung sowie der Verlauf und
die Dauer der Narkose wurden im Versuchsprotokoll (Anhang I, Kap. 9.9.4.) festgehalten.
3. Methoden 58
Die Wirkung der Narkotika setzte nach etwa 2 bis 5 min ein und hielt etwa 30 bis 60 min an.
Die Tiefe der Narkose wurde mittels Zwischenzehenreflex überprüft.
3.7.4 Vorbereitung der Versuchstiere
Zur Weitstellung der Pupillen (Mydriasis) wurden dem Tier etwa 30 min vor Einleitung der
Narkose je ein Tropfen Mydriatikum Stulln® (Tropicamid) und Neosynephrin POS®
(Phenylephrin) in das linke und rechte Auge getropft.
Nach dem Einsetzen der Narkose wurde das Tier auf einem Tablett plaziert, das an der
Ganzfeldkugel befestigt war. Zum Schutz gegen Auskühlung diente eine wärmende
Unterlage. Die Erdungselektrode (wiederverwendbare Subdermal-Nadelelektrode) wurde
oberhalb der Schwanzwurzel unter die Haut gestochen, die Referenzelektroden (Subdermal-
Nadelelektrode) an die linke bzw. rechte Ohrbasis. Der Durchmesser der Ringelektroden (ca.
0,5 mm große, zirkuläre Golddrahtelektroden), die zur Ableitung der Potentiale am Augapfel
dienten, wurden an die Bulbusgröße des Tieres angepaßt. Die Verabreichung eines
Lokalanästhetikums (ein bis zwei Tropfen Metacain) gewährleistete ein ungestörtes Aufsetzen
der Ringelektroden auf die Augäpfel. Durch das Applizieren von transparentem Thilo Tears
Gel wurde ein Austrocknen der Korneae verhindert.
Es folgten eine Impedanzmessung und die Beurteilung der Basislinie (Basisableitung), um
einen perfekten Sitz und eine uneingeschränkte Funktionsfähigkeit der Elektroden
sicherzustellen.
3.7.5 Elektroretinographie
Die Elektroretinographie kann über eine Ableitung der Netzhaut-Stromkurve zur Erkennung
von Erkrankungen des Augenhintergrundes beitragen. Durch eine Stimulation der Netzhaut
mit Lichtreizen entstehen dabei Aktionspotentiale, Antworten der Netzhaut, die nach
Verstärkung aufgezeichnet werden. Die elektrischen Antworten der einzelnen
Netzhautschichten bezogen auf eine Zeitachse ergeben eine Kurve (Elektroretinogramm).
Art, Dauer und Intensität der Lichtstimuli zur Ableitung der Photorezeptorantworten wurden
in Anlehnung an den ISCEF-Standard (International Society for Clinical Electrophysiology of
Vision) ausgewählt.
3. Methoden 59
Die Ableitungen des linken und rechten Auges erfolgten parallel.
Elektroretinographie - Skotopisches ERG
Das ERG-Equipment bestand aus einer Ganzfeldkugel, einem DC-Amplifier und einer PC-
basierten Kontroll- and Aufzeichnungseinheit (Roland Consult, Brandenburg/Wiesbaden,
Germany).
Die Ableitung der Stäbchenantworten (skotopisches ERG) erfolgte bei absoluter Dunkelheit
durch Stimulation mit Einzelblitzen ansteigender Intensitäten beginnend mit 0,01 cds/m2 bis
zu 30 cds/m2. Jede Stufe wurde mit einer Frequenz von 0,2 Hz (Stufen 1-3) bzw. 0,1 Hz
(Stufen 4-6) 3 bis 5 mal wiederholt. Daraus wurde der entsprechende Mittelwert einer Stufe
gebildet. Zur Regeneration der Photorezeptoren erfolgte zwischen zwei Stufen eine Pause von
30 sek.
Die Testparameter des skotopischen Einzelblitz-ERGs sind in Anhang I, Kap. 9.9.2
aufgeführt.
Elektroretinographie - Photopisches ERG
Wurde das photopische ERG im Anschluß an das skotopische ERG durchgeführt, erfolgte
eine zehnminütige Helladaptation bei einer Lichtstärke von 25 cds/m3
(Hintergrundbeleuchtung im photopischen ERG).
Die Ableitung der Zapfen-Photorezeptorzellen wurde unter Verwendung von Einzelblitzen
mit einer Lichtintensität von 3 cds/m2 bis 100 cds/m2 durchgeführt. Abstände zwischen den
Blitzen und Regenerationszeiten waren analog zum skotopischen ERG.
Die Testparameter des photopischen Einzelblitz-ERG sind in Anhang I, Kap. 9.9.3 aufgeführt.
Zusätzlich wurden für das skotopische und das photopische ERG die Latenzzeiten der
Maximalwerte (negative a-Welle und positive b-Welle) aufgezeichnet.
3. Methoden 60
3.7.6 Kontrolle der Aufwachphase
Im Anschluß an die Elektroretinographie wurden die Augen des Tieres eingehend untersucht
und die Ergebnisse im ERG-Protokoll (Anhang I, Kap. 9.9.4) festgehalten. Dabei wurde
insbesondere auf folgende Parameter geachtet:
! vollständige Weitstellung der Pupillen (Mydriasis) beidseits
! äußere Verletzungen der Augen insbesondere der Korneae sowie der
Umgebung der Augen
! Kornea- bzw. Linsentrübungen
! ausreichender Tränenersatz, um ein Austrocknen der Korneae zu
verhindern
Unter Maßnahmen zur Verhinderung der Auskühlung wurde das Tier in einen mit Zellstoff
ausgelegten Käfig verbracht und bis zum vollständigen Erwachen unter Beobachtung
gehalten.
3.8 Histologische Untersuchung der Retina
3.8.1 Entnahme der Augäpfel und Fixation der Organe
Durch Verschluss der Lidränder mittels Pinzette und Schnittführung in Richtung Orbitalring
wurden nacheinander der linke und rechte Bulbus geschützt im Bindehautsack entnommen.
Das Absetzen der Augen erfolgte in der Tiefe der Orbitalhöhle, so dass ein Stück Sehnerv am
Präparat erhalten blieb. Bindehautsack, Muskelreste und intraorbitales Fett wurden vorsichtig
abpräpariert, ohne Auge bzw. Sehnerv zu beschädigen. Die Augen wurden zur Fixierung
direkt nach der Entnahme in einer 5%igen Glutaraldehyd-Lösung inkubiert.
3. Methoden 61
3.8.2 Einbettung, Schnitttechnik und Färbung der Präparate
Die Einbettung und das Schneiden der Präparate wurde am Institut für Humangenetik
vorgenommen.
Nach Dehydrierung in einer Ethanolreihe (mit den Stufen 10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%,
95% and Ethanol absolut) wurde das Gewebe den Herstellerangaben entsprechend in
Technovit 7100 eingebettet. Es folgte eine zwölfstündige Inkubation in einer
Infiltrationslösung (Hardener 1 und Technovit). Anschließend wurden die Augen in einer
Linie durch den Nervus opticus halbiert und den Herstellerangaben entsprechend in Histoform
S eingebettet. Mithilfe eines Mikrotoms wurde eine Serie aus 1-3 mm großen Schnitten
angefertigt. Es wurde eine H.E.-Färbung durchgeführt.
3.8.3 Auswertung der histologischen Präparate
Es wurden folgende Parameter durch Adspektion der Schnitte mithilfe eines Lichtmikroskops
beurteilt:
! Qualität des gesamten Schnittes
(Zusammenhangstrennungen, Überlagerungen usw.)
! Schichtaufbau der Retina (Proportionalität der einzelnen Schichten)
! Ausmaß der Photorezeptoren an zwei verschiedenen Lokalitäten,
zentral in der Nähe des Sehnervenabgangs und peripher (Anzahl der
Zelllagen der äußeren Körnerschicht, Anordnung und Gestalt der
Zellen)
! Außmaß der inneren Körnerschicht und der retikulären Schichten
! Sehnerv (Austrittsstelle, Nervengewebe usw.)
! Retinales Pigmentepithel (Stärke, Ablagerungen, Pigmentakkumulation
usw.)
! Hinweise auf Entzündungen oder Infektionen (Immunzellen,
Narbengewebe usw.)
! Blutgefäße (Ausmaß und Zellfülle)
3. Methoden 62
Zur quantitativen Bewertung der Retinae und zur statistischen Bewertung wurde folgender
Score entwickelt:
Photorezeptorschicht
0 fehlt
oder lückenhaft
+ schwach
++ stark
+++ sehr stark
Anzahl der Zelllagen der äußeren Körnerschicht - peripher
(gezählt ca. 20 Zellreihen entfernt von der Ora serrata)
0 keine Zellen
oder nur vereinzelt Zellen, keine durchgehende Zellschicht
+ 1 bis 2 durchgehende Zellschichten
++ 3 und 3-4 durchgehende Zellschichten
+++ 4 und 4-5 durchgehende Zellschichten
Anzahl der Zelllagen der äußeren Körnerschicht - zentral
(gezählt ca. 20 Zellreihen entfernt von der Sehscheibe, Papilla optica)
0 keine Zellen
oder nur vereinzelt Zellen, keine durchgehende Zellschicht
+ 1 bis 4 durchgehende Zellschichten
++ 5 bis 8 durchgehende Zellschichten
+++ 9 bis 12 durchgehende Zellschichten
Anzahl der Zelllagen der inneren Körnerschicht - zentral
(gezählt ca. 20 Zellreihen entfernt von der Sehscheibe, Papilla optica)
0 keine Zellen
oder nur vereinzelt Zellen, keine durchgehende Zellschicht
+ 1 bis 2 durchgehende Zellschichten
++ 3 bis 5 durchgehende Zellschichten
+++ > 5 durchgehende Zellschichten
3. Methoden 63
Äußere plexiforme Schicht
0 vollständig degeneriert
oder fast vollständig degeneriert
+ im Zentrum vorhanden,
in der Peripherie fast vollständig degeneriert
++ schmal
+++ regelrecht
Restliche Schichten
0 Retina vollständig degeneriert
+ Retina teilweise degeneriert,
Schichten unregelmäßig und ohne reguläres Größenverhältnis
++ regelrechter Schichtenaufbau der Retina
Größenverhältnis der Schichten stimmig
Die histologische Beurteilung der Schnitte erfolgte mithilfe eines Lichtmikroskops bei einer
40-, 100- und 400-fachen Gesamtvergrößerung.
3.9 Untersuchung von Umweltfaktoren für die Vergleichsstudie
3.9.1 Infektionserreger
Jeweils zwei Tiere pro Haltungseinheit wurden auf die in den FELASA-Richtlinien
(NICKLAS et al., 2002) gelisteten Pathogene untersucht. Nach Tötung der Tiere wurden die
notwendigen Proben entnommen und im Mikrobiologischen Labor des Zentralen
Tierlaboratoriums der MHH untersucht.
Zusätzlich wurden Gehirnproben von Tieren der verschiedenen Haltungseinheiten auf eine
Infektion mit dem Virus der Bornaschen Erkrankung überprüft. Die Untersuchung erfolgte am
Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Das Protokoll und die für den
Nachweis eingesetzten Primer sind im Anhang I, Kap. 9.10.1 nachzulesen.
3. Methoden 64
3.9.2 Lichtintensität
Die Lichtintensität in den Tierräumen der beiden Haltungseinheiten wurde mit einem
Luxmeter (roline Digital Lux Meter) an folgenden Lokalisationen bestimmt:
Messpunkt
Höhe des Messpunktes
höchster Punkt des Regals* ca. 2,00 m bis 2,20 m
Regalmitte ca. 1,20 m
Tierregal
tiefster Punkt des Regals* ca. 0,50 m
Raummittelpunkt ca. 1,60 m Tierraum
Boden des Raumes (in Raummitte) 0 m
* Deckel des obersten/untersten Käfigs
3.9.3. Umgebung und Haltungsbedingungen
Zur Erfassung der Umgebungs- und Haltungsbedingungen der Tiere wurden folgende
Parameter im Tierraum untersucht und aufgenommen:
! Futter, Wasser
! Einstreu
! Temperatur
! Lichtregime (Hell-Dunkel-Zyklus)
! Licht (Homogenität der Lichtintensität im Tierraum, Art der
Lichtquelle)
! Geräuschbelastung (Hintergrundgeräusche)
! Pflege/Handling
! Anzahl der Tiere pro Käfig
! Ständersysteme
! hygienische Barriere
3. Methoden 65
3.10. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Ergebnisse der Real Time PCR erfolgte mit dem auf Exel®
basierenden Qgene 96 Programm (MÜLLER et al., 2002). Die CT-Werte des Zielgens
(Myo15) wurden dazu gegen die CT-Werte des Referenzgens (β-Aktin) unter
Berücksichtigung der jeweiligen Amplifikationseffizienzen normalsiert.
Die statistische Analyse der Elektroretinogramme erfolgte mithilfe einer Varianzanalyse (one
way ANOVA) unter Verwendung der Statistikprogramme SPSS und Prism. Teile dieser
Auswertung wurden am Zentrum für Biometrie, Medizinische Informatik und Medizintechnik
der Medizinischen Hochschule Hannover vorgenommen.
Die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Augenpräparate wurde mithilfe des
Statistikprogrammes Prism mithilfe einer Varianzanalyse (one way ANOVA) ausgewertet.
4. Ergebnisse 66
4 Ergebnisse
4.1 Einleitung
Die durch eine Spontanmutation im Inzuchtstamm LEW/Ztm entstandene LEW/Ztm-ci2 Ratte
zeichnet sich durch Rotationsverhalten mit ausgeprägter Seitenpräferenz aus. Dieses wurde
auf eine Imbalance der Dopaminkonzentration und seiner Metaboliten im Striatum der
Hemisphäre zurückgeführt (LÖSCHER et al., 1996). Aufgrund von erloschenen, auditorisch
evozierten Potentialen und des histologisch nachgewiesenen, vollständigen Verlustes des
cochleären Neuroepithels wurde die LEW-ci2 Ratte als Tiermodell für neurosensorische
Taubheit eingestuft (KAISER et al., 2001).
Zusätzlich wurde durch spezielle Untersuchungen des Verhaltens eine Beeinträchtigung des
visuellen Systems festgestellt (VON HÖRSTEN, pers. Komm.; CHWALISZ, 2003).
Eine Kopplungsanalyse, die unter Verwendung anonymer Mikrosatellitenmarker an einer
BN-Rückkreuzungspopulation ((LEW/Ztm-ci2xBN/Ztm)F1xLEW/Ztm-ci2) durchgeführt
wurde, diente zur Ermittlung von chromosomalen Bereichen, die mit dem Phänotyp der
LEW-ci2 Ratte assoziierten sind. Die ci2-Mutation wurde im zentralen Bereich des
Chromosom 10 (RNO10q22) kartiert. Die Identifizierung von Kandidatengenen erfolgte
durch (a) vergleichende Untersuchungen zu humanen und murinen Genomen, (b) die Suche
nach Genen phänotypisch ähnlicher Erkrankungen bei diesen Spezies, (c) die physikalische
Kartierung der Mutation und (d) die Suche nach Zusammenhängen zwischen der Funktion
bestimmter Gene und dem Krankheitsbild der LEW-ci2 Ratte. Die Analysen führten zur
Ermittlung der Kandidatengene Myo15 und Kcnj12 (CHWALISZ, 2003).
Ziel dieser Arbeit war es, die für den Phänotyp der LEW-ci2 Ratte verantwortliche Mutation
zu identifizieren. Des Weiteren sollte eine Charakterisierung des visuellen Phänotyps
vorgenommen werden.
4. Ergebnisse 67
4.2 Genetische Untersuchung
4.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene (Myo15/Kcnj12)
Die Primer zur Sequenzierung der Kandidatengene, Myo15 und Kcnj12, wurden so
konstruiert, dass sie die kodierenden Bereiche (Exons) der Gene flankierten. Die 64 Exons des
Gens Myo15 und das Exon des Gens Kcnj12 wurden abhängig von ihrer Länge mit Hilfe eines
oder mehrerer Primerpaare amplifiziert. Der Vergleich der sequenzierten Basenfolge des
Kandidatengens Kcnj12 mit der Referenzsequenz (ENSRNOG00000002303) zeigte keine
Unterschiede. Dagegen konnte im Exon 56 des zweiten Kandidatengens, Myo15
(ENSRNOG00000028597), ein Basenaustausch festgestellt werden. Es handelt sich um eine
Substitution der Basen Thymin und Cytosin an der Position 43 612 (Abb. 4.1).
Abb. 4.1 Punktmutation in der Sequenz der LEW/Ztm-ci2 Ratte. Die
Basensubstitution (T→C) wurde in Exon 56 des Kandidatengens Myo15 detektiert. Sie
verursacht einen Aminosäurenaustausch (Leuzin→Prolin) in der C-terminalen MyTH4
Domäne in der Schwanzregion des Proteins.
MyTH4
LEW
LEW-ci2
...... G I A K A C E Q N L Q K T L R F G G R L ......
...... G I A K A C E Q N P Q K T L R F G G R L ......
LEW
LEW-ci2
Motordomäne Myo 15
4. Ergebnisse 68
Durch eine anschließende computergestützte Übersetzung der Nukleotidsequenz in eine
Aminosäuresequenz wurde deutlich, dass die Punktmutation einen Austausch der
Aminosäuren Leuzin und Prolin an der Position aa 3157 in der C-terminalen MyTH4-Domäne
der Schwanzregion des Proteins Myosin XV (Abb. 4.1) verursacht.
Um eine Vorhersage über die möglichen Effekte auf das Protein, Myosin XV, treffen zu
können, wurde die Mutation mit den Programmen SIFT (v2.0; sortiert intolerant und tolerant;
Ng, 2003) und PolyPhen (command line Version; Ramenski, 2002; in Verbindung mit der
SwissProt/TrEMBL+PIR Datenbank) geprüft. Beide Programme prognostizierten eine
schädliche Wirkung für das Protein hinsichtlich seiner Funktion bzw. seiner Struktur (SMITS
und MALIK, pers. Komm.).
Aufgrund der Entdeckung des mutationstragenden Gens wird die LEW-ci2 Ratte gemäß den
internationalen Nomenklaturregeln (Rat Genome and Nomenclature Committee) nun als
LEW/Ztm-Myo15ci2 Ratte benannt. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Mutante zur
Vereinfachung weiterhin als LEW-ci2 bezeichnet.
4.3 Funktionelle Untersuchungen
Im Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführte
Northern Blot Analysen zur funktionellen Untersuchung des mutierten Gens in
Hypophysengeweben deuteten auf Expressionsunterschiede zwischen LEW-ci2 Ratten und
Tieren des Hintergrundstammes LEW hin. Da die Ergebnisse nicht eindeutig waren, wurde in
einem zweiten Versuch die Expression der mRNA von homozygoten und heterozygoten
Merkmalsträgern sowie von coisogenen Kontrolltieren im Vergleich zu einem endogenen,
konstant exprimierten Gen (Housekeeping-Gen) mithilfe der quantitativen RT-PCR erneut
untersucht. Das Ziel der Expressionsanalyse war es, zunächst die Auswirkungen der Mutation
des Myo15-Gens auf RNA-Ebene zu verifizieren und später auf Proteinebene zu analysieren.
4.3.1 Real Time PCR
Die Expression des Gens Myo15 wurde mittels Real Time PCR im Hypophysengewebe von
etwa 3 Monate alten LEW-ci2 Ratten und LEW-Kontrolltieren sowie als Zweitkontrolle von
4. Ergebnisse 69
DA Ratten bestimmt. Dazu wurde die Expression des Gens in Relation zu dem Housekeeping-
Gen β-Actin gesetzt. Die relative Expression von Myo15 wurde mittels Varianzanalyse und
anschließendem t-Test hinsichtlich signifikanter Unterschiede zwischen den Stämmen
untersucht. Dabei ergaben sich weder signifikante Unterschiede zwischen der Mutante und
dem Hintergrundstamm noch zwischen Mutante und Zweitkontrolle (Abb. 4.2).
Auch ein Vergleich der Kontrollen untereinander ergab keinen signifikanten Unterschied in
der Expression von Myo15.
4.3.2 Proteinanalytik
Ziel dieser Studie war die Aufklärung einer möglichen Auswirkung der ci2-Mutation auf die
Struktur des Myosin XV. Der mutationstragende Bereich des Proteins befindet sich in der C-
terminalen MyTH4-Domäne der Schwanzregion des Myosin XV (Abb. 4.3). Der für diese
Region kodierende Abschnitt des Gens wurde mithilfe spezifischer Primer amplifiziert (Kap.
3.4.1.). Für eine spätere Isolation und Aufreinigung der Domäne war es notwendig,
Schnittstellen für Restriktionsenzyme in das Amplifikat zu integrieren, die den MyTH4-
Abschnitt flankierten. Weiterhin war es notwendig, am Ende der Domäne die Sequenz für ein
DA LEW LEW-ci2 0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
ng Myo15 RNA
Abb. 4.2 Relative Expression von Myo15 im Hypophysen-
gewebe. Dargestellt sind die Mittelwerte und der Standard-
fehler des Mittelwerts. Die Werte sind gegenüber der
Expression von β-Actin abgeglichen. n.s.= nicht signifikant.
n.s n.sn.s.
4. Ergebnisse 70
Stopkodon zu schaffen, um die Translation an dieser Stelle zu beenden. Deshalb wurden die
Primersequenzen zur Amplifikation der MyTH4-Domäne um einige Basen verlängert und auf
diesem Wege Schnittstellen für die Restriktionsenzyme XhoI (Vorwärtsprimer) und NheI
(Rückwärtsprimer) sowie die Sequenz für ein Stopkodon geschaffen (Tab. 4.1).
Tab. 4.1 Aufbau der Primer zur Amplifikation der MyTH4-Domäne.
fw CTCGAGGACATGCTTTGCTTCAC Primersequenzen rev GCTAGCTCAAGCCCCTCTATGACATCCAG XhoI CTCGAG GACATGCTTTGCTTCAC Schnittstelle für das
Restriktionsenzym NheI GCTAGC TCAAGCCCCTCTATGACATCCAG CTC GAGGACATGCTTTGCTTCAC nicht hybridisierende,
zusätzlich annektierte Basen GCTAGCTCA AGCCCCTCTATGACATCCA Stopkodon GCTAGC TCA AGCCCCTCTATGACATCCA
Rot markiert sind innerhalb der Primersequenzen die konstruierten Schnittstellen für die
Restriktionsenzyme, zusätzlich annektierte Basen und das Stopkodon.
Durch eine Klonierung des Amplifikats in Vektoren (Abb. 4.3) konnten große Mengen an
Insert-DNA gewonnen werden, die für die Transfektion in den Schleimpilz Dictyostelium d.
benötigt wurden.
Das Ligationsergebnis wurde mithilfe eines Restriktionsverdaus überprüft (Kap. 3.3.4). Das
durch die Restriktionsenzyme XhoI und NheI isolierte Insert, das eine Länge von 596 bp
Kopfregion Halsregion Schwanzregion
N
C
MyTH4
FERM
FERM
SH3IQ
IQ
MyTH4
Myosinkopf
Vektor
Abb. 4.3 Aufbau des Myo15 mit den für die
Kopfregion, Halsregion und Schwanzregion
des Proteins kodierenden Abschnitte. Die
mutationstragende, C-terminale MyTH4-
Domäne wurde ausgeschnitten und in
Vektoren (pGEM, pM765-tev) kloniert.
4. Ergebnisse 71
aufwies, wurde mithilfe der Gelelektrophorese nachgewiesen (Abb. 4.4). Ein
Restriktionsverdau gibt allerdings nur Aufschluß über die Länge des Fragmentes, eine
Deletion oder ein Austausch einzelner Basen, verursacht durch Fehler der Polymerase bei der
Amplifikation, kann jedoch mit dieser Methode nicht detektiert werden. Aus diesem Grund
erfolgte im Anschluß an einen erfolgreichen Verdau die Sequenzierung des Inserts und des
Übergangsbereichs zur Vektorsequenz.
Abb. 4.4 Gelelektrophoretische Darstellung des Ligationsergebnisses nach
Restriktionsverdau. Es wurden jeweils 6 Klone (Mutante, Kontrolle) geprüft. Die obere
Bande stellt die Reste der geschnittenen Vektor-DNA (pGEM) dar. Die untere Bande
befindet sich bei etwa 600 bp und stellt das ausgeschnittene Insert dar.
Es wurden zwei Transfektionen durchgeführt, bei der einerseits die Vektoren mit der
mutierten Sequenz der MyTH4-Domäne des LEW-ci2 Stammes und zum anderen die
Referenzsequenz des coisogenen Stammes LEW in den Schleimpilz Dictyostelium
discoideum übertragen wurden. Insgesamt wurden 34 Klone der Mutante und 12 Klone des
Kontroll-Ansatzes auf eine Expression des Myosin XV-Proteins getestet. Die Größe des
Peptids, das aus der MyTH4-Domäne und einem Myosinkopf bestand, betrug etwa 100 kDa.
Alle 12 Klone der Kontrolle wiesen im gelelektrophoretischen Proteinnachweis in diesem
Bereich eine dominante Bande auf (Abb. 4.5, Taschen 11-14). Im Gegensatz dazu fehlte die
Expression bei allen 34 getesteten Klonen der Mutante, wie beispielhaft in Abb. 4.5 (Taschen
1-10) gezeigt ist. Als Expressionskontrolle diente eine Minipräparation von nicht
transformierten ORF+-Zellen (Dictyostelium d.-Wildtyp, Tasche 2).
Vektorrest 1000 bp
500 bp
100 bp
Insert
Marker Ligationen ci2 Ligationen Kontrolle
4. Ergebnisse 72
Abb. 4.5 Gelelektrophoretische Kontrolle der Proteinexpression. Taschen: 1 Marker; 2 Orf+; 3-10 ci2- Klone; 11-14 LEW-Klone
4.4 Pathophysiologische Untersuchungen
4.4.1 Elektroretinographische Voruntersuchungen
Erste Hinweise auf eine eingeschränkte Sehfähigkeit bei LEW-ci2 Ratten zeigten sich
während einer Verhaltensstudie (VON HÖRSTEN, pers. Komm.). In nachfolgenden
elektroretinographischen Untersuchungen wurden stichprobenweise LEW-ci2 Ratten aus zwei
verschiedenen Haltungssystemen (Einheiten) getestet. Alle untersuchten Inzuchttiere
stammten aus derselben Zucht (Zentrales Tierlaboratorium, MHH). Elektroretinographische
Analysen von Ratten aus der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH-Einheit) ergaben
eine uneingeschränkte Funktionsfähigkeit der Netzhaut. Im Gegensatz dazu wiesen einige
LEW-ci2 Tiere aus der Tierärtzlichen Hochschule Hannover (TiHo-Einheit) stark reduzierte
Potentiale im Elektroretinogramm auf, die auf eine Affektion des Augenhintergrundes
deuteten.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Taschen
220 kDa
100 kDa
50 kDa
70 kDa
Expressionsbande
4. Ergebnisse 73
4.4.2 Untersuchungen zum visuellen Phänotyp der LEW/Ztm-ci2 Ratte (MHH)
und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie
Mit Hilfe der Vergleichsstudie sollte der retinale Phänotyp von LEW-ci2 Ratten miteinander
verglichen werden, die aus derselben Zucht stammten, jedoch längerfristig an
unterschiedlichen Standorten untergebracht waren. Aus beiden Haltungseinheiten wurden
jeweils sieben homo- und heterozygote LEW-ci2 Tiere sowie sieben Ratten des
Hintergrundstammes LEW ausgewählt. Die Tiergruppen wiesen eine einheitliche
Geschlechtsverteilung auf. Alle Ratten waren älter als 400 Tage. Im Vorfeld der
Untersuchungen wurden Verhaltensbeobachtungen durchgeführt und das Körpergewicht
aufgenommen, um mögliche Zusammenhänge zu Ergebnissen der elektroretinographischen
Tests zu erkennen. Im Anschluß an das ERG erfolgte die histologische Bewertung der
Retinae. Die Voruntersuchungen gaben erste Hinweise darauf, dass die LEW-ci2 Tiere
standortabhängig keine oder schwere Einschränkungen des Sehvermögens aufwiesen. Aus
diesem Grund wurden zusätzlich Faktoren überprüft und verglichen, die für eine Störung des
Visus verantwortlich sein könnten. Dazu gehörten Hygienestatus und Lichtintensität des
Tierraums sowie Haltungsbedingungen der Tiere.
4.4.2.1 Verhalten
Im Vorfeld der elektroretinographischen Untersuchungen wurden jeweils drei homozygote
und drei heterozygote LEW-ci2 Tiere der Vergleichsstudie pro Haltungseinheit bei dem im
Rahmen der Tierpflege notwendigen Umsetzen beobachtet (Phänotypisierung, siehe Kap.
3.1.2). Dabei wurde, verglichen mit den Tieren der MHH-Einheit, ein auffällig träges
Verhalten der TiHo-Ratten im eigenen Käfig beobachtet. Nach dem Umsetzen in die
unbekannte Umgebung zeigten sie dann eine deutlich erhöhte Aktivität. Auffällig war ein im
Vergleich zu den Tieren der MHH-Einheit weniger starkes Rotationsverhalten. Weiterhin
zeigten Tiere der TiHo-Einheit einen stärker ausgeprägten Opisthotonus und die Neigung,
sich in Richtung des Käfigdeckels zu recken. Beim Explorationsverhalten wurden zwischen
den Tiergruppen keine Unterschiede festgestellt, jedoch erkannten weniger Ratten der TiHo-
Einheit das `unbekannte Objekt´. Im Gegensatz zu Tieren der MHH-Haltung setzte keines
der Tiere aus der TiHo-Haltung Kot ab (Tab. 4.2 und Tab. 10.1/10.2).
4. Ergebnisse 74
Tab. 4.2 Phänotypisierung von LEW-ci2 Ratten.
Symptom Ausprägung des Symptoms
Verhalten MHH-Einheit
Verhalten TiHo-Einheit
+++ 5/6 3/6 Aktivität ++ 1/6
+ 1/6 2/6 +++ 1/6 1/6 circling ++ 5/6 4/6
+ 1/6 +++ 5/6 5/6 Exploration des
Käfigs + 1/6 1/6 + 3/6 1/6 - 3/6 4/6
Reaktion auf Objekt
+/- 1/6 ++ 2/6 + 1/6
Kotabsatz
- 3/6 6/6 +++ stark ausgeprägt; ++ mittelmäßig bzw. 3-4 Boli (Kotabsatz); + wenig ausgeprägt, Reaktion positiv (Objekt) bzw. 1-2 Boli (Kotabsatz); +/- nicht eindeutig; - negativ
Anhand der Reaktion auf das unbekannte Objekt (Tab. 4.2) wurde eine Einschätzung über die
Sehfähigkeit der Tiere getroffen. Dieses Ergebnis wurde später mit den Resultaten aus den
elektroretinographischen Untersuchungen (Tab. 4.3) verglichen. Dabei konnte nur eine
Übereinstimmung von 50 % gezeigt werden.
4.4.2.2 Vergleich der Körpermasse
Naturgemäß ist das Körpergewicht bei weiblichen Ratten geringer als bei den männlichen
Tieren. Unabhängig von den Haltungssystemen konnte weiterhin ein tendenziell höheres
Gewicht bei heterozygoten LEW-ci2 Tiere verglichen mit homozygoten nachgewiesen
werden. Außerdem wurde festgestellt, dass LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung unabhängig
vom Genotyp schwerer waren als LEW-ci2 Ratten der MHH-Haltung (Tab. 10.3). Statistisch
signifikant waren diese Unterschiede im Gruppenmittel jedoch nicht. Interessanterweise
waren die Kontrolltiere der TiHo-Haltung im Durchschnitt etwa ebenso schwer wie die
homozygoten LEW-ci2 Tiere, während das Gewicht der Kontrollen in der MHH tendenziell
eher dem Gewicht der heterozygoten LEW-ci2 Tiere glich (was vor allem bei männlichen
Tieren deutlich wurde).
4. Ergebnisse 75
Abb. 4.6 Vergleich der Körpergewichte homozygoter (ci2/ci2) und
heterozygoter (ci2/+) LEW/Ztm-ci2 Tiere beider Haltungseinheiten
(MHH, TiHo) und ihrer Kontrollen (K). Dargestellt sind die Mittelwerte
der männlichen (höherer Wert) und weiblichen Tiere einer Gruppe und
der daraus resultierende Mittelwert.
Abb. 4.7 Körpergewichte getrennt nach dem Geschlecht
(m=männlich, w=weiblich). Vergleich homozygoter (ci2/ci2) und
heterozygoter (ci2/+) LEW-ci2 Tiere innerhalb einer Haltung sowie
zwischen den Einheiten (MHH-TiHo) und ihrer Kontrollen (K).
* p < 0.05, ** p < 0.01
ci2/ci
2 MHH m
ci2/ci
2 MHH w
ci2/+ M
HH m
ci2/+
MHH w
K MHH m
K MHH w
ci2/ci
2 TiH
o m
ci2/ci
2 TiHo w
ci2/+ Ti
Ho m
ci2/+
TiHo w
K TiHo m
K TiHo w0
100
200
300
400
500
600
700
Gew
icht
[g]
** * **
***
ci2/ci
2 MHH
ci2/+
MHH
K MHH
ci2/ci
2 TiHo
ci2/+ T
iHo
K TiHo
200
300
400
500
600
Gew
icht
[g]
4. Ergebnisse 76
Signifikante Unterschiede bestanden zwischen dem Durchschnittsgewicht von weiblichen,
heterozygoten LEW-ci2 Tieren verglichen mit dem Gewicht der homozygoten Tiere sowie
der Kontrollgruppe. Diese Aussage traf für beide Haltungseinheiten zu.
Ein Vergleich der Kontrollgruppen der MHH und TiHo zeigte keine Unterschiede in der
Gewichtsverteilung.
4.4.2.3 Elektroretinographische Untersuchungen
Für die elektrophysiologische Untersuchung wurden pro Haltungseinheit jeweils sieben
homozygote und sieben heterozygote LEW-ci2 Ratten sowie sieben Kontrolltiere (LEW)
gleichen Alters und Geschlechts ausgewählt. Potentialschwankungen am Auge, die durch eine
Stimulation der Retina mit Licht ansteigender Intensitäten entstanden, wurden sowohl unter
skotopischen (dunkeladaptierten) als auch unter photopischen (helladaptierten) Bedingungen
abgeleitet (Kap. 2.6.4). Detailierte Angaben zum Ablauf der Untersuchung und zu den
eingesetzten Lichtstärken innerhalb der einzelnen Stufen finden sich in den Kap. 3.7.5 und
3.7.6.
Aufgezeichnet wurden die Messdaten der a-Welle (negativster Ausschlag) und der b-Welle
(Maximalpunkt) der Ableitungskurve (siehe Abb. 2.4 und 2.5) sowie die Latenzzeiten (Dauer
vom Lichtimpuls bis zum Negativ- bzw. Maximalpunkt der a- und b-Wellen).
Während der Messungen stellte sich heraus, daß die Basislinie (N-Wert) bei einigen Tieren
keine oder kaum Auslenkungen (Antworten der Photorezeptoren auf einen Lichtreiz) zeigte.
In diesem Fall wurde von einem erloschenen ERG ausgegangen.
Erloschene Antworten konnten bei rund 30% der homozygoten und etwa 80% der
heterozygoten, in der TiHo-Einheit gehaltenen LEW-ci2 Ratten festgestellt werden. Im
Gegensatz dazu zeigten Kontrolltiere aus derselben Haltung ebenso wie LEW-ci2 Ratten der
MHH physiologische Antworten im ERG (Abb. 4.8). Die Potentiale der Kontrolltiere
fungierten als Referenzwert. Basierend darauf wurde von einem eingeschränkten ERG
ausgegangen, wenn die b-Welle der skotopischen Ableitung Werte von deutlich unter 200 µV
aufwies. Ein eingeschränktes ERG wurde bei 60% der homozygoten und bei 20% der
heterozygoten LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung aufgezeichnet.
4. Ergebnisse 77
Abb. 4.8 Skotopische Elektroretinogramme (ERG). Dargestellt sind, beispielhaft für die
Gesamtgruppen der Vergleichsstudie, ERG-Aufzeichnungen von einer (I) unbetroffenen LEW-ci2
Ratte (MHH), (II) betroffenen LEW-ci2 Ratte (TiHo), (III, IV) entsprechenden, nicht betroffenen
Kontrolltieren. Angegeben sind die Potentialveränderung in µV (y-Achse) sowie die Latenzzeit in ms
(x-Achse). N=Basiswert, a=a-Welle, b=b-Welle
Aus der Abb. 4.8, die exemplarisch eine typische ERG-Messkurve für jeweils eine LEW-ci2
Ratte und ein Kontrolltier beider Haltungssysteme zeigt, wird ersichtlich, daß sich die
Ableitungskurven der Kontrollgruppen und der MHH-Tiere nicht wesentlich unterscheiden
(Graphik I, III, IV). Vergleichend dazu ist in der Graphik II ein beinahe erloschenes ERG
einer LEW-ci2 Ratte aus der TiHo-Haltung abgebildet.
Um eine präzise Aussage über die Potentialdifferenzen zwischen den Gruppen treffen zu
können, wurden die Einzelwerte der a- und b-Wellen gemittelt und für drei (Dunkel-ERG)
bzw. zwei (Hell-ERG) verschiedene Lichtstärken in den Abb. 4.10 bis 4.17 dargestellt.
Die Abb. 4.10 bis 4.11 zeigen die Werte für die a-Wellen des skotopischen ERGs, welche
die Funktionsfähigkeit von Stäbchen-Photorezeptoren widerspiegeln. Wie den Graphiken zu
entnehmen ist, besteht ein deutlicher Unterschiede zwischen den homo- und heterozygoten
LEW-ci2 Tieren der TiHo-Haltung und den übrigen Gruppen. Die bei niedrigster
Lichtintensität (0,01 cds/m2) aufgezeichneten Messwerte der MHH- und Kontrolltiere
schwankten zwischen 21 und 32 µV, während LEW-ci2 Ratten der TiHo lediglich Werte von
1-2 µV (heterozygot) bzw. 3-11 µV (homozygot) aufwiesen.
20 40 60 80 100 120 140
0
250
500
b
0
250
500
20 40 60 80 100 120 140
b
0
250
500
20 40 60 80 100 120 140
b
0
250
500
20 40 60 80 100 120 140
ms ms
ms ms
µV µV
µV µV
I II
III IV
4. Ergebnisse 78
LEW/Ztm-ci2 (MHH) homozygot LEW/Ztm-ci2 (TiHo) homozygot LEW/Ztm-ci2 (MHH) heterozygot LEW/Ztm-ci2 (TiHo) heterozygot LEW/Ztm (MHH) Kontrolle LEW/Ztm (TiHo) Kontrolle TiHo
Abb. 4.9 Legende für Abb. 4.10 bis 4.17
Abb. 4.10 Skotopisches ERG, a-Welle,rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20
25
50
75
100
125
Abb. 4.11 Skotopisches ERG, a-Welle,linkes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20
100
200
300
400
500
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20
100
200
300
400
500
600
Abb. 4.12 Skotopisches ERG, b-Welle, rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.
Abb. 4.13 Skotopisches ERG, b-Welle, linkes Auge. Vergleichzwischen Genotypen undHaltungseinheiten.
0,01 cds/m2
3 cds/m2 30 cds/m2
0
25
50
75
100
125
µV
µV µV
µV
MHH TiHo
4. Ergebnisse 79
0
10
20
30
40LEW-ci2 (MHH) heteroz.
LEW-ci2 (TiHo) homoz.LEW-ci2 (TiHo) heteroz.
LEW (MHH)
LEW (TiHo)
0,01 cds/m2 0,03 cds/m2 0,3 cds/m2 3 cds/m2 10 cds/m2 30 cds/m2
LEW-ci2 (MHH) homoz.ms
Abb. 4.18 Latenzzeiten. Dargestellt sind die Mittelwerte der b-Wellen der linken
Augen aufgezeichnet während des skotopischen ERGs vergleichend zwischen
Genotypen und Haltungseinheiten.
3 cds/m2 100 cds/m20
10
20
Abb. 4.14 Photopisches ERG, a-Welle, rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.
3 cds/m2 100 cds/m20
5
10
15
20
25
Abb. 4.15 Photopisches ERG, a-Welle, linkes Auge. Vergleich zwischen Genotypen und Haltungseinheiten.
3 cds/m2 100 cds/m20
100
200
3 cds/m2 100 cds/m20
100
200
Abb. 4.16 Photopisches ERG, b-Welle,rechtes Auge. Vergleich zwischenGenotypen und Haltungseinheiten.
Abb. 4.17 Photopisches ERG, b-Welle, linkes Auge. Vergleich zwischen Genotypen und Haltungseinheiten.
µV µV
µV µV
4. Ergebnisse 80
Bei steigenden Lichtstärken von 3 cds/m2 und 30 cds/m2 traten die Unterschiede noch
deutlicher hervor. In diesen Stufen betrugen die Messwerte bei homozygoten LEW-ci2 Tieren
der TiHo 10 bis 30 µV, bei heterozygote lediglich noch 4-6 µV. Die Potentiale der Kontrollen
sowie der LEW-ci2 Tiere der MHH schwankten dagegen zwischen 75-100 µV (3 cds/m2)
bzw. zwischen 50-75 µV (30 cds/m2). Die Differenzen zwischen den Antworten homo- bzw.
heterozygoter LEW-ci2 Tiere der TiHo-Haltung und ihrer Kontrollgruppe waren
hochsignifikant (p<0,0001). Diese Aussage trifft sowohl für das linke als auch für das rechte
Auge zu.
Weiterhin wird deutlich, dass die abgeleiteten Potentiale von heterozygoten LEW-ci2 Tieren
der TiHo niedriger ausfielen als die Messwerte der homozygoten Ratten. Diese Aussage trifft
ebenso auf die in Abb. 4.12 bis 4.13 dargestellten Potentiale der b-Welle zu. Hier ist ein
Unterschied der betroffenen TiHo-Tiere zu den Kontrollgruppen sowie zu LEW-ci2 Ratten
der MHH bereits bei niedrigster Lichtstärke deutlich erkennbar. Während sich die Antworten
der MHH- und Kontrolltiere in dieser Stufe um 280 bis 345 µV bewegten, zeigten
homozygote LEW-ci2 Ratten der TiHo lediglich Werte von 50-70 µV und heterozygote Tiere
Werte von nur 25-40 µV. Bei einer Lichtstärke von 3 cds/m2 betrugen die Werte für MHH-
und Kontrolltiere 325-380 µV, für homozygote LEW-ci2 Ratten der TiHo dagegen nur 75-
140 µV und für heterozygote lediglich 25-40 µV. Bei höchster Lichtintensität bliebt dieses
Verhältnis bei wenig schwächeren Potentialen bestehen. Abweichend davon zeigten
Kontrolltiere ausschließlich am linken Auge erhöhte Werte. Die Potentiale homo- und
heterozygoter LEW-ci2 Ratten der TiHo unterschieden sich in allen Stufen hochsignifikant
von denen der Kontrollgruppe.
Die Werte der a-Wellen des photopischen ERGs sind in den Abb. 4.14 und 4.15 dargestellt.
Wie den Graphiken zu entnehmen ist, waren die starken Unterschiede zwischen den
Potentialen von LEW-ci2 Tieren beider Haltungssysteme unter helladaptierten Bedingungen
nicht so stark ausgeprägt wie im skotopischen ERG. Es waren jedoch größere Varianzen zu
erkennen, die gruppenintern aber auch zwischen den Gruppen auftraten. Die Werte
schwankten zwischen 4-6 µV bei 3 cds/m2 und zwischen 6-18 µV bei 100 cds/m2. Signifikant
geringere (p<0,05) Potentiale (<1µV) zeigten heterozygote LEW-ci2 Tiere der TiHo.
In den Abbildungen 4.16 und 4.17 sind die b-Werte des photopischen ERGs dargestellt. Die
Unterschiede zwischen Potentialen der homo- bzw. heterozygoter TiHo-Tiere und den
Kontrollgruppen waren hochsignifikant und glichen den Ergebnissen des skotopischen ERGs.
Während die Messwerte in beiden Stufen bei heterozygoten Tieren lediglich 5-11 µV und bei
4. Ergebnisse 81
homozygoten Tieren nur 30-50 µV betrugen, wiesen die Kontrolltiere Potentiale von 85-150
µV auf. Allerdings wichen die Messwerte der LEW-ci2 Tiere der MHH ebenfalls von den
Antworten ihrer Kontrollgruppe ab. Diese zeigte starke Schwankungen der Messwerte
zwischen den einzelnen Stufen. Während die Kontrollgruppe der MHH bei einer
Lichtintensität von 3 cds/m2 deutlich niedrigere Werte aufwies als LEW-ci2 Tiere, waren die
Antworten der Kontrollen bei sehr hoher Lichtstärke (100 cds/m2) bedeutend größer. In
einigen Fällen waren diese signifikant.
Im Gegensatz zu den deutlichen Unterschieden zwischen den Potentialen der LEW-ci2 Ratten
der TiHo und der übrigen Gruppen waren die Latenzzeiten der a- und b-Wellen bei allen
Tieren vergleichbar. Dieses Ergebnis konnte sowohl im photopischen als auch im
skotopischen ERG gleichermaßen für alle Stufen nachgewiesen werden und ist in der Abb.
4.18 beispielhaft für alle Ableitungen dargestellt.
Da es keine Unterschiede zwischen den Potentialen sowie den Latenzzeiten der LEW-ci2
Ratten der MHH und der Kontrolltiere gab, wurde bei diesen Tieren eine uneingeschränkte
Sehfähigkeit angenommen.
Tab. 4.3 Überblick über die retinalen Phänotypen der LEW-ci2 Tiere der Vergleichsstudie.
Tier
LEW/Ztm-ci2
(ci2-/-, TiHo)
LEW/Ztm-ci2
(ci2+/-, TiHo)
LEW/Ztm-ci2
(ci2-/-, MHH)
LEW/Ztm-ci2
(ci2+/-, MHH)
1 erloschenes ERG erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen
2 erloschenes ERG erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen
3 erloschenes ERG erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen
4 betroffen erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen
5 betroffen erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen
6 betroffen erloschenes ERG nicht betroffen nicht betroffen
7 einseitig betroffen betroffen nicht betroffen nicht betroffen
ci2-/- LEW-ci2 Ratte, homozygot; ci2+/- LEW-ci2 Ratte, heterozygot
4. Ergebnisse 82
4.4.2.4 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes
Reduzierte Antworten von Photorezeptorzellen des Auges auf einen Lichtreiz, die mittels
Elektroretinographie diagnostiziert werden, geben bereits sehr früh Hinweise auf
Erkrankungen der Netzhaut. In diesem Stadium sind in der Regel noch keine Veränderungen
am Augenhintergrund sichtbar. Diese treten oftmals erst zu einem Zeitpunkt auf, an dem das
ERG bereits erloschen oder dramatisch reduziert ist.
Aufgrund der sehr stark affektierten Potentiale von LEW-ci2 Ratten der TiHo-Einheit wurden
im Anschluß an die Vergleichsstudie histologische Untersuchungen von Augen durchgeführt.
Sie sollten aufklären, welche Strukturen der Retina wie stark betroffen waren. Zu diesem
Zweck wurden drei Augen je Genotyp und Haltungseinheit untersucht, insgesamt also 18. Die
Bulbi wurden sagital auf Höhe der Austrittsstelle der Nervenfasern geschnitten, so dass eine
Beurteilung des Sehnerven-Gewebes (Nervus opticus) möglich war. Außerdem bestand bei
dieser Schnittführung die Möglichkeit, die gesamte Pars optica retinae beginnend an der Ora
serrata bis hin zur Papilla optica (Blinder Fleck) zu untersuchen.
Es wurden alle Schichten der Retina sowie zusätzlich das Retinale Pigmentepithel und die
Fasern des Sehnerven beurteilt. Von Bedeutung waren dabei die Stärke der einzelnen
Schichten (Anzahl der Zelllagen), ihre Integrität sowie das Vorhandensein von Zellverlusten
und Veränderungen infektiöser oder entzündlicher Herkunft.
Während der Beurteilung der histologischen Schnitte wurde deutlich, dass die Ergebnisse der
elektroretinographischen Untersuchungen den pathophysiologischen Zustand der
begutachteten Retinae wiederspiegeln. Bei homo- und heterozygoten Tieren der TiHo-Einheit
konnte eine starke Reduktion der Photorezeptorzellschicht nachgewiesen werden. In drei
Fällen war sogar ein vollständiger Verlust dieser Schicht zu beobachten (Abb. 4.23). Die
äußere Körnerschicht zeigte ein ähnliches Bild. In den drei genannten Fällen gab es hier keine
durchgängige Zellschicht mehr, d.h. es waren nur noch vereinzelt Zellen zu finden (Abb.
4.23). Bei zwei Tieren war die Anzahl der Zelllagen im Vergleich zu den Kontrolltieren stark
reduziert (Abb. 4.22), bei einem weiteren erschien die Körnerschicht normal. Die äußere
plexiforme Schicht war bei den drei am stärksten betroffenen LEW-ci2 Tieren der TiHo-
Haltung ebenfalls affektiert, bei den übrigen Ratten jedoch nicht verändert. Die übrigen
Schichten der Retina (innere Körnerschicht, innere plexiforme Schicht, Ganglienzellschicht
und Nervenfaserschicht) zeigten keine Veränderungen (Abb. 4.22 und 4.23).
4. Ergebnisse 83
Abb. 4.23 Retina, 400fach LEW-ci2 Ratte, heterozygot, TiHo
Abb. 4.22 Retina, 400fach LEW-ci2 Ratte, homozygot, TiHo
Abb. 4.21 Retina, 400fach LEW-ci2 Ratte, heterozygot, MHH
Abb. 4.20 Retina, 400fach LEW, Kontrolle
Abb. 4.19 Ora serrata, 400fach LEW, Kontrolle
Abb. 4.19 - 4.23 H.E. gefärbte Schnitte derRetina. Angegeben sind Originalvergrößerung,Stamm und Haltungseinheit. Abb. 4.19 Über-gang zur Ora serrata, unbetroffene Kontrolle;Abb. 4.20 normale Retina eines Kontroll-tieres; Abb. 4.21 leicht verjüngte äußere Kör-nerschicht einer LEW-ci2 Ratte (MHH); Abb.4.22 und 4.23 stark affektierte Retinae vonLEW-ci2 Tieren (TiHo), vollständiger Verlustder Photorezeptorschicht, Abb. 4.22 Verlustder äußeren Körnerschicht und plexiformenSchicht; Abb. 4.23 Verjüngung bis auf 1Zelllage
4. Ergebnisse 84
Die Reduktion der einzelnen Schichten blieb über die gesamte Länge der Pars optica retinae,
die sich kurz vor der Ora serrata naturgemäß verjüngt (Abb. 4.19), konstant. Nur bei einer
einzigen, homozygoten LEW-ci2 Ratte konnten geringe Unterschiede im Ausmaß der
Veränderungen zwischen rechter und linker Seite festgestellt werden.
Starke Zellverluste innerhalb der äußeren Schichten der Retina, wie sie bei LEW-ci2 Tieren
der TiHo-Einheit nachgewiesen wurden, zeigten sich in den histologischen Schnitten der
LEW-ci2 Ratten der MHH nicht. Alle Schichten der Retina sowie das Retinale Pigmentepithel
waren vollkommen normal ausgebildet. Es wurde allerdings festgestellt, dass die
Photorezeptorzellschicht und äußere Körnerschicht bei diesen Tieren im Vergleich zur
Kontrollgruppe schmaler ausgeprägt waren (Abb. 4.20 und 4.21). Die äußere Körnerschicht
wies im Vergleich zu Kontrolltieren zentral etwa zwei (homozygot) bis drei (heterozygot)
Zelllagen weniger auf, peripher handelte es sich um eine Zelllage. Bei den restlichen
Zellschichten konnten keine Unterschiede nachgewiesen werden (Tab. 4.4).
Tab. 4.4 Auswertung der histologischen Schnitte von jeweils 3 Tieren pro Gruppe. Stamm/ Genotyp
Tier Photorez.- zellschicht
äußere K. -zentral-
äußere K. -peripher-
äußere plexif. Schicht
innere K. -zentral-
Restliche Schichten
1 +++ ++ +++ +++ ++ ++ 2 +++ +++ +++ +++ ++ ++
LEW (MHH) wildtyp 3 +++ +++ +++ +++ ++ ++
1 +++ ++ +++ +++ + ++ 2 +++ +++ +++ +++ ++ ++
LEW (TiHo) wildtyp 3 +++ +++ +++ +++ ++ ++
1 ++ ++ ++ +++ ++ ++ 2 +++ ++ ++ +++ ++ ++
LEW-ci2 (MHH) homozygot 3 ++ +++ ++ +++ ++ ++
1 ++ ++ ++ +++ ++ ++ 2 ++ ++ ++ +++ ++ ++
LEW-ci2 (MHH) heterozygot 3 +++ ++ ++ +++ ++ ++
1 li + 0 0 0 ++ ++ 1 re + + + +++ ++ ++
2 + + + 0 ++ ++
LEW-ci2 (TiHo) homozygot
3 0 0 0 + ++ ++ 1 0 0 0 0 ++ ++ 2 + ++ ++ +++ ++ ++
LEW-ci2 (TiHo) heterozygot 3 0 0 0 0 ++ ++
0 Schicht fast vollständig oder vollständig degeneriert; + Schicht stark verjüngt; ++ Schicht normal;
+++ Schicht stark; detailierte Angaben sind dem Kap. 3.8.3 zu entnehmen
4. Ergebnisse 85
Eine Abnahme des Durchmessers der gesamten Netzhaut ist bei allen Tieren auf einen Verlust
oder eine Verdünnung lediglich einzelner Schichten zurückzuführen. Das Retinale
Pigmentepithel und die beurteilbaren Reste des Sehnerven an der Austrittsstelle aus dem
Bulbus zeigten bei keinem der Tiere histologische Veränderungen.
4.4.2.5 Untersuchung von Umweltfaktoren
Alle in der Vergleichsstudie untersuchten LEW-ci2 Tiere stammten aus derselben Linie des
LEW/Ztm-ci2 Inzuchtstammes. Sie unterschieden sich einzig durch ihre Haltung an zwei
unterschiedlichen Standorten. Da bekannt ist, daß Umweltfaktoren an der Ausbildung
retinaler Störungen beteiligt sein können, wurden diese in beiden Haltungseinheiten
untersucht.
Hygienestatus
Zur Kontrolle des Hygienestatus der Tiere wurden Ratten beider Haltungseinheiten auf die in
den Richtlinien der FELASA gelisteten Erreger untersucht (Kap. 3.9.1).
Die Tiere der MHH-Einheit waren frei von Endo- und Ektoparasiten. In Kotproben von
Ratten der TiHo-Einheit konnten dagegen Erreger der Spezies Oxyura syphacia muris
nachgewiesen werden.
Bakterielle Pathogene, die bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung und der MHH-Haltung
nachgewiesen werden konnten, sind in Tab. 4.5 aufgelistet.
Tab. 4.5 Ergebnis der mikrobiologischen Untersuchung.
identifizierte Pathogene
Untersuchungsergebnis
MHH
Untersuchungsergebnis
TiHo
Staph. aureus positiv positiv
Pasteurella pneumotropica positiv positiv
Corynebacterium sp. positiv negativ
Helicobacter sp. positiv positiv
4. Ergebnisse 86
Entsprechend der mikrobiologischen und parasitologischen Analysen wurde die virologische
Untersuchung ebenfalls in Anlehnung an die Richtlinien der FELASA durchgeführt. Die
Tiere der TiHo-Einheit waren virologisch pathogenfrei, bei Ratten der MHH-Einheit konnten
Parvoviren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der virologischen Untersuchung sind der
Tabelle 4.6 zu entnehmen.
Tab. 4.6 Ergebnisse der virologischen Untersuchung.
Neben der Untersuchung auf die in Tab. 4.6 angegebenen Pathogene wurden drei Tiere der
TiHo-Haltung auf eine Infektion mit dem Erreger der Borna-Erkrankung (BDV) getestet.
Grund dafür waren Ähnlichkeiten im histologischen Bild der Retina bei betroffenen LEW-ci2
Ratten im Vergleich zu mit BDV-infizierten Tieren (NARAYAN et al., 1983; KACZA et al.,
2000; STAHL et al., 2003). Der Nachweis erregerspezifischer RNA des Borna-Disease Virus
erfolgte am Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. In den
Hirngewebe-Proben der drei untersuchten LEW-ci2-Ratten (TiHo) konnte keine BDV-
Nukleoprotein-spezifische RNA nachgewiesen werden.
überprüfte Pathogene
Untersuchungsergebnis
MHH
Untersuchungsergebnis
TiHo
Rat Parvo Virus (RPV) positiv negativ
Kilham Rat Virus (KRV) negativ negativ
Coronaviridae negativ negativ
Pneumonievirus der Maus (PMV) negativ negativ
Sendai-Virus negativ negativ
Reoviridae negativ negativ
Hantaanvirus negativ negativ
Mykoplasmen negativ negativ
4. Ergebnisse 87
Abb. 4.24 Gelelektrophorese zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein spezifischer RNA.
2%iges Agarosegel + 100 bp-DNA-Größenmarker. Taschen 0 und 19 Marker; Taschen 1-6
LEW-ci2; Taschen 7/8 Positivkontrolle; Tasche 9 Negativkontrolle (Wasser); Taschen 10-17
GAPDH (Housekeeping-Gen)
Untersuchung der Lichtstärke
Die Untersuchung der Lichtstärke erfolgte in verschiedenen Bereichen der Tierräume, wobei
Messungen im Aufenthaltsbereich der Tiere (Käfiginneres) im Vordergrund standen. Die
Spanne der Lichtintensitäten im Tierraum reichte in beiden Haltungseinheiten gleichermaßen
von 2 lx bis 465 lx (Tab. 10.4). An der Frontseite der Käfige wurden in der MHH-Haltung
Werte von 160 bis 200 lx aufgezeichnet, im Tierraum der TiHo waren die Lichtintensitäten an
diesem Standort mit 85 bis 196 lx vergleichbar groß.
Da dieser Raum durch zwei verschieden starke Lichquellen ausgeleuchtet wurde, differierten
die Messwerte zwischen dem Ständer mit den weiblichen Tieren und dem Ständer mit den
männlichen Tieren. Auf Seite der männlichen Ratten war die Lichtintensität in der Raummitte
halb so stark, im mittleren Bereich des Käfigs bis zu 38% geringer verglichen mit der
weiblichen Regalseite. Während im Aufenthaltsbereich männlicher Tiere in der TiHo-Haltung
zwischen 6 und 28 lx gemessen wurden, betrug die Lichtintensität in Käfigen weiblicher Tiere
in dieser Einheit bis zu 139 lx. Die Unterschiede zeigten sich um so ausgeprägter, je höher im
Käfigständer die Messungen durchgeführt wurden.
Der Tierraum der MHH-Haltung war im Gegensatz zur Haltung der TiHo gleichmäßig
ausgeleuchtet. Im Bereich der Käfigfront waren die Lichtintensitäten hier an allen
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
200300
100
500
200300
100
500
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
200300
100
500
200300
100
500
4. Ergebnisse 88
Messpunkten am höchsten, während diese im Aufenthaltsbereich der Tiere verglichen mit der
TiHo-Haltung jedoch an allen Messpunkten am niedrigsten waren. Es wurden im
Käfiginneren Lichtstärken von lediglich 2 bis 6 lx nachgewiesen.
Alle dokumentierten Lichtintensitäten im Aufenthaltsbereich der Tiere entsprachen den
Normwerten der GV-Solas (www.gv-solas.de/auss/hal/ratten-haltung.pdf).
Untersuchung der Haltungsbedingungen
Ein Vergleich der Haltungsbedingungen sowie der Ausstattung der Tierräume zeigte deutliche
Unterschiede zwischen beiden Haltungseinheiten. Beim Eintreten in den Tierbereich gab es
im Gegensatz zum Barrieresystem der MHH, in dem die Anwendung von Kittel, Mundschutz,
Kopfhaube und Überschuhen verpflichtend ist, in der TiHo-Haltung keine hygienischen
Vorschriften. Die Tiere waren in beiden Einheiten in Käfigen desselben Typs untergebracht.
In der MHH befanden sich die Käfige in Ständern mit festem Bodenblech, wogegen die
Käfige in der TiHo-Haltung in bodenlose Ständer eingehängt wurden. In der MHH-Haltung
wurden abhängig von Alter und Gewicht ein bis drei Tiere pro Käfig gehalten. In der TiHo
waren die Ratten dagegen in Einzelhaltung untergebracht. Zusätzlich wurden die Tiere hier
nach dem Geschlecht getrennt in zwei unterschiedlichen Ständern gehalten. In der MHH-
Haltung leuchtete eine einzelne Lichtquelle den Raum gleichmäßig aus, wogegen zwei
verschieden starke Lichtquellen den Tierraum der TiHo-Einheit ungleichmäßig ausleuchteten.
Außerdem gab es hier durch Radiomusik bedingte, stetige Hintergrundgeräusche.
4.4.3 Elektroretinographische Untersuchung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte
Durch die Unterschiede im Erscheinungsbild des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte in
verschiedenen Haltungssystemen stellte sich die Frage nach dem Einfluß von Umweltfaktoren
und dem Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Ausprägung des Krankheitsbildes.
Im Laufe der Studie eröffnete sich die Möglichkeit, Tiere eines Stammes mit einem der LEW-
ci2 Ratte ähnlichen Phänotyp zu untersuchen. Der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd
Auszuchtstamm trägt eine Mutation im Exon 3 des Myo7A. Dieses Gen gehört, ebenso wie
das bei der circling2 Ratte mutierte Myo15, zur Gruppe der unkonventionellen Myosine und
ist dem Myo15 strukturell und funktionell sehr ähnlich.
4. Ergebnisse 89
Zur Analyse des retinalen Phänotyps der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd (tornado) Ratte wurden
sieben heterozygote (Altersdurchschnitt: 432 Tage), sechs homozygote (Altersdurchschnitt:
422 Tage) und fünf wildtyp-Tiere (Altersdurchschnitt: 142 Tage) dieses Stammes
elektrophysiologisch untersucht. Die Ableitung der Potentialschwankungen erfolgte unter
dunkeladaptierten (skotopischen) sowie unter helladaptierten (photopischen) Bedingungen.
Die Messwerte einer jeden Gruppe (homozygot, heterozygot, Kontrolle) wurden gemittelt und
vergleichend in den Abb. 4.26 bis 4.33 für drei bzw. zwei verschiedene Stufen
(Lichtintensitäten) graphisch dargestellt.
In allen Abbildungen wird deutlich, daß sich die Potentiale homozygoter und heterozygoter
Tiere nicht unterschieden. Ein signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Genotypen
wurde lediglich für die b-Welle der photopischen Ableitung und ausschließlich am rechten
Auge ermittelt. Im Gegensatz dazu waren im Vergleich zu Kontrolltieren Unterschiede
erkennbar. Die Abb. 4.26 und 4.27 zeigen die im skotopischen ERG gemessenen Potentiale
der a-Welle für das linke und rechte Auge. Bei einer niedrigen Lichtintensiät (0,01 cds/m2)
lagen die Werte aller Gruppen gleichermaßen zwischen 20 und 25 µV. Erst mit steigender
Lichtstärke wird der Unterschied zwischen den Messwerten der Kontrolltiere im Vergleich zu
den Antworten der homozygoten und heterozygoten Tiere deutlicher. Bei 3 cds/m2 bewegten
sich die Potentiale noch zwischen 70 und 115 µV. Signifikante Unterschiede zeigen sich dann
bei einer Lichtstärke von 30 cds/m2. In dieser Stufe wiesen homo- und heterozygoten Tiere
Werte zwischen 40 und 50 µV auf, während die Potentiale bei den Kontrolltiere mit 75 bis 90
µV beinahe doppelt so groß waren. Die Messergebnisse differierten zwischen linkem und
rechtem Auge nur geringgradig.
Eine ähnliche Aussage über die Tendenz zu höheren Potentialen bei Kontrolltieren verglichen
mit homo- und heterozygoten Tieren ist auch den Abb. 4.28 und 4.29 zu entnehmen. Diese
zeigen die Mittelwerte der b-Welle gemessen unter dunkeladaptierten Bedingungen. Auch in
diesem Fall waren die Unterschiede erst bei höchster Lichtstärke signifikant (30 cds/m2). So
lagen die Werte bei homozygoten und heterozygoten Tieren im Mittel um 120 bis 170 µV,
während die Potentiale der Kontrollgruppe 230 bis 260 µV betrugen.
Interessanterweise sind diese für das skotopische ERG typischen Differenzen zur
Kontrollgruppe im photopischen ERG nicht nachweisbar.
Die a-Wellen des Hell-ERGs, die in den Abb. 4.30 und 4.31 dargestellt sind, zeigten auch
innerhalb der einzelnen Gruppen größere Schwankungen. Bei einer Lichtintensität von 3
cds/m2 gemessene Potentiale bewegten sich in allen Gruppen zwischen 8 und 10 µV. Die
Antworten der Kontrollgruppe waren in dieser Stufe etwas höher (13 µV), zeigten aber keine
4. Ergebnisse 90
Signifikanz zu den anderen Gruppen. Bei höchster Lichtstärke stiegen die Messdaten aller
Gruppen gleichmäßig auf 9 bis 13 µV an.
Die starken, gruppeninternen Schwankungen der a-Wellen lassen sich in den b-Werten des
photopischen ERGs, die in den Abb. 4.32 und 4.33 dargestellt sind, nicht wiederfinden. Die
Messdaten der Stufe mit der niedrigsten Lichtintensität unterschieden sich zwischen den
Gruppen nicht und lagen bei etwa 50 µV. Bei einer Lichtstärke von 100 cds/m2 wurden bei
homo- und heterozygoten Ratten Potentiale von 60 bis 100 µV abgeleitet, bei Kontrolltieren
waren es etwa 110 µV. Aufgrund eines sehr niedrigen Mittelwertes der Gruppe homozygoter
Tiere (60 µV) konnten innerhalb dieser Stufe signifikante Unterschiede zu heterozygoten (90
µV) und Kontroll-Tieren (110 µV) festgestellt werden. Diese Aussage bezieht sich allerdings
nur auf das rechte Auge.
In der Abb. 4.34 sind die Mittelwerte der Latenzzeiten (b-Welle, skotop. ERG) vergleichend
für die verschiedenen Genotypen dargestellt. Die Darstellung ist exemplarisch für a- und b-
Wellen des skotopischen und photopischen ERGs, da es in keinem Fall Unterschiede,
signifikant oder tendenziell, zwischen den Genotypen gab.
4. Ergebnisse 91
Abb. 4.25 Legende für Abb. 4.26 bis 4.34
Abb. 4.26 Skotopisches ERG, a-Welle, rechtes Auge.
Abb. 4.27 Skotopisches ERG, a-Welle, linkes Auge.
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20
50
100
150
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m2 0
25
50
75
100
125
WIST-Myo7Atnd homozygot WIST-Myo7Atnd heterozygot WIST Kontrolle
µV µV
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m2 0
50
100150200
250300350400450
Abb. 4.28 Skotopisches ERG, b-Welle, rechtes Auge.
Abb. 4.29 Skotopisches ERG, b-Welle, linkes Auge.
µV
0,01 cds/m2 3 cds/m2 30 cds/m20
100
200
300
400
µV
350
250
150
50
450
4. Ergebnisse 92
3 cds/m2 100 cds/m20
50
100
150
3 cds/m2 100 cds/m20
10
20
Abb. 4.30 Photopisches ERG, a-Welle, rechtes Auge.
3 cds/m2 100 cds/m20
10
20
Abb. 4.31 Photopisches ERG, a-Welle, linkes Auge.
3 cds/m2 100 cds/m20
50
100
150
Abb. 4.32 Photopisches ERG, b-Welle, rechtes Auge.
Abb. 4.33 Photopisches ERG, b-Welle, linkes Auge.
µV µV
µV µV
0
10
20
30
40
0,01 cds/m2 0,03 cds/m2 0,3 cds/m2 3 cds/m2 10 cds/m2 30 cds/m2
ms
Abb. 4.34 Latenzzeiten. Dargestellt sind die Mittelwerte der a-Wellen der linken Augen auf-
gezeichnet während des skotopischen ERGs vergleichend zwischen den Genotypen.
5. Diskussion 93
5 Diskussion
5.1 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte - Phänotyp und Tiermodell
Die LEW-ci2 Ratte ist gekennzeichnet durch neurosensorische Taubheit und Bewegungs-
störungen vestibulären Ursprungs, die auf eine Degeneration bzw. Deformation des
sensorischen Epithels im Innenohr zurückgehen.
Das für diesen Inzuchtstamm charakteristische Rotationsverhalten (circling) weist
Ähnlichkeiten zum Phänotyp des induzierten Ungerstedt-Modells auf, welches als ein
geeignetes Tiermodell für den Morbus Parkinson, die häufigste Basalganglienerkrankung des
Menschen, gilt. Trotz pharmakologischer und neurochemischer Gemeinsamkeiten konnte ein
Modellcharakter der LEW-ci2 Ratte für diese Erkrankung jedoch nicht bestätigt werden, da
bei der Mutante im Unterschied zur Symptomatik der Parkinson-Krankheit eine bilaterale
Asymmetrie in der Anzahl dopaminerger Neurone im SNC und in der Dichte der
dopaminergen Terminalen im Striatum nicht nachweisbar sind (RICHTER et al., 1999).
Darüber hinaus stellt der Morbus Parkinson eine hypokinetische Erkrankung dar, wogegen die
LEW-ci2 Ratte ein hyperaktives Verhalten aufweist. Aus diesem Grund wurde die LEW-ci2
Ratte 1999 von RICHTER et al. sowie 2000 von FEDROWITZ et al. als Tiermodell für
hyperkinetische Bewegungsstörungen vorgeschlagen.
Funktionelle Tests sowie histologische Untersuchungen des Innenohres betroffener Tiere
zeigten einen nahezu vollständigen Verlust des sensorischen Epithels in der Cochlea, der die
Taubheit verursacht. Zusätzlich weisen vestibuläre Haarzellen Protrusionen und verkürzte
Stereozilien auf (KAISER et al., 2001). Aufgrund dieser Ergebnisse wird die LEW-ci2 Ratte
seither als Tiermodell für neurosensorische Taubheitsformen des Menschen eingeordnet.
Molekulargenetische Studien zur Kartierung der ci2-Mutation und Verhaltensuntersuchungen
bei LEW-ci2 Ratten gaben erste Hinweise auf eine mögliche Beteiligung des visuellen
Systems am Phänotyp der LEW-ci2 Ratte (CHWALISZ, 2003). Funktionelle und
histologische Analysen einiger Tiere deuteten auf ein eingeschränktes Sehvermögen,
verursacht durch Degenerationen am Augenhintergrund, hin (KAMINO, pers. Komm.;
GOCKELN et al., 2003).
5. Diskussion 94
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, durch eine weiterführende funktionelle und
genetische Charakterisierung der LEW-ci2 Ratte den Modellcharakter dieser Mutante für die
biomedizinische Forschung zu konkretisieren.
5.2 Genetische Untersuchungen
5.2.1 Sequenzierung der Kandidatengene
In einer vorangegangenen Studie wurde eine Kopplungsanalyse an einer segregierenden BN-
Rückkreuzungspopulation ([LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm]F1 x LEW/Ztm-ci2) vorgenommen, um
die Suszeptibilitätsregion aufzufinden, die für den veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte
verantwortlich ist. In der eingegrenzten Region gelegene Gene wurden auf ihre Lage im
humanen Genom und auf ihre Funktion geprüft. Dabei konnten zwei geeignete Kandidaten
isoliert werden, das Myo15 und das Kcnj12 (CHWALISZ et al., 2003).
Beide Kandidatengene wurden vollständig sequenziert. Der Abgleich der gewonnenen Daten
mit einer Referenzsequenz, die der Ensembl-Datenbank entstammte, führte zur Detektion
eines Basenaustausches im Myo15-Gen. Es handelt sich um eine Punktmutation mit einer
Substitution der Basen Zytosin und Thymin. Das Myo15-Gen kodiert für das Myosin XV, das
der Gruppe der unkonventionellen Myosine angehört. Diese Proteine, die an verschiedenen
Funktionen innerhalb des Zellstoffwechsels beteiligt sind, besitzen eine ähnliche Struktur. Die
N-terminale Motordomäne ist hochkonserviert und wahrscheinlich für gemeinsame
Funktionen der Myosine wie die Regulation intrazellulärer Transportvorgänge verantwortlich,
wogegen die funktionelle Spezifität der einzelnen Proteine vermutlich über die variable
Schwanzregion mit ihren unterschiedlichen Domänen erlangt wird (TUXWORTH und
TITUS, 2000).
Mutationen in unkonventionellen Myosinen, die sowohl in der Motordomäne als auch in der
Schwanzregion vorkommen (Abb. 5.1), führen beim Menschen einerseits zu nicht-
syndromaler Taubheit (Myosin VI, VII, XV), andererseits zu einer mit Taubheit
einhergehenden, syndromalen Erkrankung (Myosin VIIa), dem humanen Usher Syndrom
(LIBURD et al., 2001; AHMED et al., 2003). Daneben sind eine Reihe von Tiermodellen
beschrieben, die Mutationen in unkonventionellen Myosinen aufweisen (siehe auch Kap.
2.2.3), wie die Snell´s waltzer Maus (Myosin VI), die shaker 1 Maus oder die tornado Ratte
5. Diskussion 95
(Myosin VIIa). Interessanterweise sind die Phänotypen dieser Stämme sehr ähnlich, obwohl
es sich teilweise um verschiedene Klassen von Myosinen handelt und unterschiedliche
Regionen der Proteine betroffen sind. Auch die Art der Mutation (Deletion, Punktmutation
mit oder ohne Zerstörung des Leserahmens) hat offenbar keinen Einfluss (siehe auch Kap.
2.2.3).
Neben der LEW-ci2 Ratte sind bereits Mausmodelle mit Mutationen im Myosin XV bekannt.
Die shaker 2 Maus trägt eine Mutation in der Motordomäne, die shaker 2-J Maus weist
dagegen eine umfangreiche Deletion am C-terminalen Ende des Proteins auf (Abb. 5.1).
Obwohl die Mutationen funktionell unterschiedliche Bereiche des Myosin XV betreffen, sind
die Phänotypen beider Stämme nicht zu unterscheiden und zeigen große Übereinstimmungen
mit der LEW-ci2 Ratte (siehe auch Kap. 2.2.3). Diese Tatsache deutet darauf hin, dass sowohl
die Motordomäne als auch die Schwanzregion für die regelrechte Funktion dieses Proteins
von unerläßlicher Bedeutung sind.
Abb. 5.1 Schematische Darstellung der Struktur des Myosin XV. Zusätzlich angegeben sind die
bekannten Mutationen im Myosin XV des Menschen (unterhalb der Zeichnung) und in Tiermodellen
(oberhalb der Zeichnung). (modifiziert nach LIBURD et al., 2001)
Die in der LEW-ci2 Ratte detektierte Mutation befindet sich in der C-terminalen MyTH4-
Region des Myosin XV (Abb. 5.1), einer Domäne, über deren Struktur und Funktion bis heute
wenig bekannt ist. MyTH4-Domänen gibt es auch in den Schwanzregionen anderer Myosine
wie Myosin VIIA, IX und XII, doch auch dort ist ihre Bedeutung bisher ungeklärt. Das
Myosin XV besitzt zwei MyTH4-Domänen. Während die ci2-Mutation die C-terminale
Domäne betrifft, sind Mutationen beim Menschen bisher ausschließlich in der N-terminalen
MyTH4-Region bekannt (Abb. 5.1).
Myosinkopf N CMyTH4 FERM FERM MyTH4 SH3IQ IQ
Q1229X
IVS4+IG>T
G1358S
sh2 C1779Y
N2111Y
I2113F
T2205IK2601X
Q2716H
sh2J
Deletion
ci2 L3157P
5. Diskussion 96
Die Domänen der Myosin-Schwanzregion enthalten spezielle Bereiche, die für Protein-
Protein-Interaktionen verantwortlich sind. Die C-terminale MyTH4-Domäne des Myosin XV
bildet zu diesem Zweck einen funktionellen Komplex mit der benachbarten SH3-Domäne
sowie mit der nachfolgenden FERM-Domäne (DELPRAT et al., 2005). Unter anderem über
diese Komplexe interagiert das Myosin XV mit dem Protein `Whirlin´ (DELPRAT et al.,
2005; BELYANTSEVA et al., 2005), das an der Entstehung der neurosensorischen
Taubheitsform DFNB31 beim Menschen beteiligt ist (MBURU et al., 2003).
BELYANTSEVA et al. (2005) fanden heraus, dass das Myosin XV für den Transport des
Whirlin zu den Stereozilienspitzen der Innenohrhaarzellen verantworlich ist.
Die Punktmutation in der Basensequenz der LEW-ci2 Ratte verursacht einen Austausch der
Aminosäure Leuzin gegen Prolin in der C-terminalen MyTH4-Domäne des betroffenen
Proteins. Computergestützte Analysen der Myosin XV-Aminosäuresequenz legten nahe, dass
das Protein in dieser Region in helikaler Form vorliegt (TSIAVALIARIS, pers. Komm.). Da
Prolinsubstitutionen im Zusammenhang mit strukturellen Veränderungen der betroffenen
Proteine stehen, könnte die Helixstruktur in diesem Bereich aufgelöst sein. Möglicherweise
führen die veränderten Faltungseigenschaften des Proteins zu einem Funktionsverlust der
MyTH4-Domäne und der benachbarten Regionen. Dies hätte zur Folge, dass das mutierte
Myosin XV der LEW-ci2 Ratte das Whirlin nicht oder nicht regelrecht binden kann, so dass
ein Transport dieses Proteins zu den Spitzen der Haarzellstereozilien im Innenohr unterbleibt.
Vergleichbar dazu wurde bereits bei shaker 2 Mäusen, die ebenfalls ein defektes Myosin XV
aufweisen, eine Abwesenheit von Whirlin im Bereich der Stereozilienspitzen nachgewiesen
(KIKKAWA et al., 2005).
Die Interaktion von Whirlin und Myosin XV wurde von BELYANTSEVA et al. (2005) als
Schlüsselevent in der Morphogenese der Haarzellstereozilien bezeichnet. Der Transport von
Whirlin zu den Stereozilienspitzen ist offenbar unerlässlich für eine programmierte
Stereozilienelongation (BELYANTSEVA et al., 2005). Die Myosin XV-Whirlin-Interaktion
ist eine Erklärung dafür, dass die Symptomatik der LEW-ci2 Ratte dem Phänotyp der whirler
Maus sehr ähnlich ist. Allerdings ist das histologische Bild im Innenohr nicht vollkommen
identisch. Die Ursache dafür könnte im Einfluß weiterer Bindungspartner beider Proteine
liegen. Es ist bekannt, dass das Whirlin im Innenohr neben dem Myosin XV mit einer Reihe
weiterer Proteine interagiert. Dabei stellt sich die Frage, welche Auswirkungen eine gestörte
Funktion des mutierten Myosin XV auf die Bindungspartner des Whirlin sowie auf deren
Funktion hat. So konnte kürzlich gezeigt werden, dass ein membran-assoziiertes Protein und
5. Diskussion 97
dessen Interaktionspartner, für deren Lokalisation in den Stereozilien das Whirlin offenbar
notwendig ist, bei Myo15 Mausmutanten im Bereich der Stereozilienspitzen nicht
nachweisbar waren (MBURU et al., 2006).
Die Auswirkung der Mutation im Myosin XV bei der LEW-ci2 Ratte kann in ihrem gesamten
Umfang noch nicht abgeschätzt werden, da die Erforschung der Interaktionen mit anderen
Proteinen noch in den Anfängen steckt. Zwar ist das Whirlin bisher die einzige, bekannte
Ladung (Cargo) des Myosin XV, die MyTH4-Domäne und die benachbarten Bereiche des
Proteins bieten aber möglicherweise weitere Bindungsstellen für Protein-Protein-
Interaktionen.
Eine Interaktion von Whirlin und Myosin XV ist bis heute ausschließlich in Haarzellen des
Innenohrs nachgewiesen (MBURU et al., 2006). Es ist allerdings bekannt, dass Whirlin nicht
nur im Ohr exprimiert wird, sondern auch eine wichtige Funktion in der Netzhaut des Auges
besitzt, wo dem Protein eine Rolle bei der Organisation der Synapsen oder der synaptischen
Vesikeltransmission in Photorezeptorzellen nachgesagt wird (VAN WIJK et al., 2006).
Da es jedoch bisher keine Untersuchungen zur Expression von Myosin XV in der Retina gab,
ist nicht sicher, ob das Protein in diesem Gewebe ebenfalls als Interaktionspartner bzw.
Transporter des Whirlin fungiert. Allerdings handelt es sich bei der Retina wie bei den
Haarzellen des Innenohres um sensorisches Gewebe, das zudem auch Stereozilien-ähnliche
Ausläufer aufweist, die Zilien der Photorezeptorzellen. Daher ist eine Interaktion zwischen
den Proteinen auch in der Netzhaut denkbar.
Weiterhin ist für andere unkonventionelle Myosine eine funktionelle Bedeutung in der
Netzhaut des Auges bereits beschrieben worden (WEIL et al., 1995; LIBBY et al., 2004). Das
Myosin VIIa beispielsweise, das im Zusammenhang mit syndromaler Blindheit beim
Menschen steht, ist vermutlich am Transport von Melanozyten im Retinalen Pigmentepithel
beteiligt (LIU et al., 1998; SMITS et al., 2005). Interessanterweise fanden LLOYD et al.
(2001) Hinweise darauf, dass auch das Myosin XV eine Rolle bei der Bewegung bzw.
Ausschüttung von sekretorischer Granula spielen könnte.
Sowohl das Whirlin als auch das Myosin VIIa sind Teil eines makromolekularen Komplexes,
der in Haarzellen des Innenohres und in der Netzhaut des Auges auf ähnliche Weise agiert
(VAN WIJK et al., 2006). In diesem membrangebundenen, supramolekularen Netzwerk sind
alle bisher bekannten Proteine verbunden, die an der Pathogenese des humanen Usher
Syndroms beteiligt sind (Abb. 5.2). Aus diesem Grund wird der Komplex auch als Usher
5. Diskussion 98
Protein Interaktom bezeichnet (VAN WIJK et al., 2006; KREMER et al., 2006). Eine
Unterbrechung des Netzwerkes führt zu neurosensorischen Degenerationen in Retina und
Cochlea, wie sie beim Usher Syndrom beschrieben werden (Reiners et al., 2006). Über die
Funktionsweise des Usher Protein Interaktoms und die Wechselwirkung der Proteine
untereinander ist bisher wenig bekannt.
Abb. 5.2 Usher Protein Interaktom. Schematische Darstellung der bisher
identifizierten Komponenten und ihrer Interaktionen im Usher Protein
Netzwerk. Myosin XV ist als Bindungspartner von Whirlin beigefügt. (modifiziert nach VAN WIJK et al., 2006; KREMER et al., 2006)
Das Whirlin, das eine zentrale Rolle innerhalb dieses Komplexes spielt, war bislang allerdings
nur im Zusammenhang mit nicht-syndromaler Taubheit beim Menschen (DFNB31) und bei
der whirler Mausmutante bekannt. Erst vor kurzem konnten EBERMANN et al. (2006) eine
Beteiligung des Proteins am humanen Usher Syndrom nachweisen.
Durch die Interaktion mit dem Whirlin besteht eine Verbindung des Myosin XV zu dem
Usher Protein Interaktom. Es existieren zwei verschiedene Bindungsmöglichkeiten des
Proteins an das Whirlin. Die Interaktion mit dem C-terminalen Bereich, der in allen Whirlin-
Isoformen vorkommt, ist wahrscheinlich an die Transportfunktion des Myosin XV in
Makromolekularer Komplex
Protocadherin
Cadherin
USH2A isoform
VLGR1b
Harmonin
Myosin VIIa
Whirlin
Myosin XV
INTRAZELLULÄR EXTRAZELLULÄR
SANS
5. Diskussion 99
Haarzellen des Innenohrs geknüpft. In dieser Region waren auch die bisher entdeckten
Mutationen des Whirlin lokalisiert, die zu nicht-syndromaler Taubheit führten. Die neue, bei
einem Usher-Patienten entdeckte Mutation schädigt das Protein jedoch im N-terminalen
Abschnitt, einer Region, in der sich die Bindungsstellen für die im Usher Protein Netzwerk
organisierten Interaktionspartner, aber auch eine weitere Bindungsstelle für das Myosin XV
befindet (EBERMANN et al., 2006). Es wäre möglich, dass das Myosin XV über die
Interaktion mit dieser Region bisher unbekannte Funktionen übernimmt, die im
Zusammenhang mit den Aufgaben des Usher Interaktoms sowohl im Innenohr als auch im
Auge stehen.
Eine gestörte Whirlin - Myosin XV Interaktion, wie sie vermutlich in der LEW-ci2 Ratte
vorkommt, könnte also neben den bekannten Defekten im Innenohr auch Auswirkungen auf
die Funktionsfähigkeit des Auges haben. Im Gegensatz zu diesem Tiermodell gibt es bisher
jedoch keine Hinweise auf einen visuellen Phänotyp bei humanen Myo15-Mutationen bzw.
bei shaker 2 Mäusen.
5.3 Funktionelle Untersuchungen
5.3.1 Real Time PCR
Im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Northern Blot Analyse zur funktionellen Untersuchung
des Kandidatengens Myo15 durchgeführt, die auf Expressionsunterschiede zwischen den
Genotypen der LEW-ci2 Ratte sowie zwischen LEW-ci2 Ratten und Tieren des coisogenen
Hintergrundstammes LEW hindeutete (CHWALISZ, pers. Komm.). Diese Ergebnisse
erschienen jedoch im Hinblick auf die durch Sequenzierungen identifizierte Punktmutation
zweifelhaft. Eine Erklärung für die widersprüchlichen Ergebnisse des Blots könnte die Lage
der Sonden sein, die in den ersten drei Exons im Bereich der Motordomäne lokalisiert
wurden. Dieser Bereich weist große Homologien zwischen den Genen unkonventioneller
Myosine der verschiedenen Klassen auf, was zu Wechselwirkungen bzw. Kreuzreaktionen
während der Detektionsphase im Blot geführt haben könnte. Aus diesem Grund sollte im
Rahmen dieser Arbeit die Expressionsanalyse des bei der LEW-ci2 Ratte mutierten Gens
mithilfe einer spezifischen Sonde und mithilfe einer sensitiveren Methode wiederholt werden.
5. Diskussion 100
Für die Sonde wurde eine Sequenz im C-terminalen Abschnitt der variablen Schwanzregion
des Myo15 erstellt. Diese wurde mit den Gensequenzen aller unkonventioneller Myosine
abgeglichen, um Wechselwirkungen bzw. Kreuzreaktionen auszuschließen und eine sichere
Detektion des Myo15 zu ermöglichen. Für die Studie wurde die quantitative RT-PCR (Real
Time-PCR) gewählt, um die Expression der mRNA von homozygoten und heterozygoten
LEW-ci2 Ratten sowie von Kontrolltieren im Vergleich zu einem endogenen, konstant
exprimierten Gen (Housekeeping-Gen) zu untersuchen.
Die für die Analyse benötigte RNA wurde aus Hypophysengewebe gewonnen, da eine
Isolation von Myo15-RNA aus dem phänotypisch betroffenen Innenohr äußerst schwierig ist.
Die Ursache besteht darin, dass die Expression des Gens in diesem Gewebe auf nur wenige
Zellen in Bereichen der sich entwickelnden cochleären Haarzellen und in oberen epithelialen
Schichten der Macula sacculi beschränkt bleibt (LIANG et al., 1999). Aufgrund der starken
Myo15-Expression im Hypophysengewebe ist dieses Organ für eine Isolation von RNA für
die Expressionsanalysen besonders geeignet (LIANG et al., 1999). Bei Mäusen konnte eine
Expression von Myo15 zwar in einer Reihe weiterer Organe bzw. Gewebe wie Lunge, Gehirn,
Niere, Magen, Dünndarm, Pankreasinseln usw. nachgewiesen werden, relativ zur Expression
in der Hypophyse war sie dort jedoch ausgesprochen niedrig (LIANG et al., 1999; LLOYD et
al., 2001). Die hohe Expression von Myo15 in der anterioren Hypophyse ist überraschend, da
für betroffene Menschen bzw. Tiere kein offensichtlicher Hypophysen-bedingter Phänotyp
bekannt ist (LIANG et al., 1999; LLOYD et al., 2001).
Der Vergleich der Myo15-Expression ergab, wie vermutet, keine Unterschiede zwischen
LEW-ci2 Ratten und den Kontrollen des Hintergrundstammes sowie den DA-Ratten. Die
phänotypischen Auswirkungen der Mutation bei LEW-ci2 Tieren können also nicht auf
Expressionsdefizite des Myo15-Gens zurückgeführt werden. Aus diesem Grund wurde eine
fehlerhafte Proteinexpression mit Einschränkung der Myosin XV-Funktion angenommen.
5.2.2 Proteinanalytik
Die computergestützte Übersetzung der die ci2-Mutation enthaltenden Nukleotidsequenz
sollte die Auswirkungen der Punktmutation auf die Aminosäuresequenz aufklären. Es zeigte
sich, dass die Basensubstitution einen Austausch der Aminosäure Leuzin in Prolin verursacht.
Um eine Vorhersage über mögliche Effekte auf das Protein treffen zu können, wurde die
Mutation mit den Programmen SIFT und PolyPhen geprüft (siehe auch Kap. 4.2.1). Beide
5. Diskussion 101
Programme prognostizierten eine strukturelle und funktionelle Schädigung des Myosin XV
(SMITS und MALIK, pers. Komm.).
Mit Hilfe dieser Studie sollten die genauen strukturellen Veränderungen bzw. Änderungen der
Faltungseigenschaften des Proteins mittels Kristallographie aufgeklärt werden.
Neben der strukturellen Untersuchung des mutierten Myosin XV einer LEW-ci2 Ratte sollte
für eine vergleichende Betrachtung zusätzlich das Protein des Hintergrundstammes als
Referenz analysiert werden, da bisher Informationen zur regulären Struktur und zu
physiologischen Faltungseigenschaften des Myosin XV fehlen.
Die für eine kristallographische Analyse notwendige Menge des hochreinen Proteins sollte in
Kolonien des Schleimpilzes Dictyostelium discoideum produziert werden. Dieser Einzeller
wird häufig in der Erforschung von konventionellen aber auch von unkonventionellen
Myosinen eingesetzt (MANSTEIN, 1993; SCHLEICHER und EICHENER, 1998).
Da es sich bei dem Myosin XV in seiner Gesamtheit um ein sehr großes Protein handelt,
wurde lediglich der mutationstragende Bereich einschließlich der C-terminalen MyTH4-
Domäne kloniert. Diese Region ist vor allem aufgrund der bekannten Bindungscharakteristik
an das Protein Whirlin sowie im Hinblick auf die kürzlich beschriebene Verbindung zum
Usher Protein Interaktom von besonderer Bedeutung (siehe Kap. 5.2.1).
Das hochreine Myosin XV-Protein sollte jedoch nicht nur für die Analyse der Proteinstruktur
verwendet werden, sondern auch der Entwicklung eines Ratten-Myosin XV spezifischen
Antikörpers dienen. Dieser sollte zur Untersuchung der Myosin XV-Expression am
Rattenauge genutzt werden, da aufgrund der Interaktion von Myosin XV mit Whirlin und der
damit erkennbaren Nähe des Proteins zum Usher Komplex die Vermutung nahe liegt, dass das
Myosin XV Funktionen in diesem Gewebe übernimmt, die bisher unbekannt sind.
Trotz einer großen Anzahl von getesteten D. discoideum-Klonen, die die mutierte Sequenz
des LEW-ci2 Stammes enthielten, konnte keine Expression von Myosin XV in diesen Zellen
detektiert werden. Es ist bekannt, dass in der Myosinforschung bei nur etwa 50 % der
Klonierungen eine Expression nachgewiesen werden kann, die sich für eine Aufreinigung und
Analyse des Proteins eignet. Eine fehlende Expression wird jedoch nur in einer geringen
Anzahl von Fällen, nämlich in etwa 10 (-20) % der Versuche, gesehen (TSIAVALIARIS,
2002). Im Gegensatz dazu konnte in Klonen mit der Sequenz des Hintergrundstammes LEW
eine Expressionsbande nachgewiesen werden, die der gesuchten Größe des Fragmentes
entsprach. Es ist deshalb nicht auszuschließen, dass auch in Klonen mit der Sequenz der
5. Diskussion 102
LEW-ci2 Ratten eine Expression vorlag. Auch in diesem Fall wäre eine Aufreinigung des
Proteins mit anschließender Strukturanalyse sowie die Entwicklung eines Antikörpers
aufgrund der entschieden zu geringen Expression nicht möglich gewesen.
5.4 Pathophysiologische Untersuchungen
5.4.1 Elektrophysiologische Voruntersuchungen
Im Anschluß an die Entdeckung des Myo15 als Kandidatengen für den veränderten Phänotyp
der LEW-ci2 Ratte und aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit des Myosin XV-Proteins zu
dem in das Usher Syndrom involvierten Myosin VIIa wurde eine Verhaltensstudie zur
Überprüfung der Sehfähigkeit bei LEW-ci2 Ratten durchgeführt. Diese ergab erste Hinweise
auf eine Einschränkung des Visus bei Tieren dieses Stammes. Um die Ergebnisse zu
verifizieren, wurden stichprobenweise LEW-ci2 Ratten unterschiedlichen Alters und
Geschlechts elektrophysiologisch untersucht. Das Verfahren der Elektroretinographie (ERG)
ermöglicht es, die Funktionsfähigkeit der Photorezeptorzellen zu überprüfen, welche in der
Netzhaut für die Umsetzung von Lichtreizen in elektrische Signale verantwortlich sind (Kap.
2.6.2) .
Die LEW-ci2 Tiere entstammten zwei verschiedenen Haltungseinheiten, die sich in
unterschiedlichen Instituten befanden. Interessanterweise lieferten die
elektroretinographischen Untersuchungen dieser zwei Tiergruppen stark differierende
Resultate. Während LEW-ci2 Ratten der MHH-Tierhaltung im Vergleich zu ebenfalls
untersuchten Tieren des coisogenen Kontrollstammes LEW keine Auffälligkeiten im ERG
zeigten, gab es nur bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung deutliche Hinweise auf ein
eingeschränktes Sehvermögen (Kap. 4.4.1).
5. Diskussion 103
5.4.2 Untersuchungen zum visuellen Phänotyp der LEW/Ztm-ci2 Ratte (MHH)
und der LEW/Ztm-ci2 Ratte (TiHo) - Eine Vergleichsstudie
Aufgrund der genetischen Identität der im Vorfeld untersuchten Tiere, die aus demselben
Zuchtbestand stammten, musste eine zusätzliche Mutation als Ursache für die
Augensymptomatik bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung ausgeschlossen werden.
Da Tiere des einen Standortes grundsätzlich unbetroffen waren, während alle LEW-ci2 Ratten
der anderen Haltung einen Phänotypen aufwiesen, wurde zuerst nach generellen
Unterschieden zwischen den zwei verschiedenen Tiergruppen gesucht. Dazu diente einerseits
der Vergleich der Körpergewichte von LEW-ci2 Ratten sowie von Kontrolltieren beider
Haltungen. Andererseits wurde das Verhaltens der LEW-ci2 Tiere beider Standorte
miteinander verglichen, um Hinweise auf Unterschiede zwischen den Gruppen zu erhalten.
Im Anschluss an die Charakterisierung des retinalen Phänotyps mittels Elektroretinographie
und histologischer Untersuchung der Netzhaut sollten speziell die Haltungsbedingungen der
beiden Tiergruppen gegenübergestellt werden. Dabei wurden vor allem solche Faktoren genau
überprüft, die für Störungen des Visus verantwortlich sein könnten. Die Ergebnisse sollten
Hinweise darauf geben, ob Unterschiede in der Umwelt der Tiere bestanden und ob
bestimmte Faktoren eine Einfluß auf die Ausprägung der Augensymptomatik von LEW-ci2
Ratten der TiHo-Haltung gehabt haben könnten.
5.4.2.1 Tiergruppen
Wie bereits erwähnt stammten die zu untersuchenden LEW-ci2 Ratten aus zwei
unterschiedlichen Haltungssystemen (MHH-Haltung und TiHo-Haltung). Für die Studie
wurden je eine Gruppe homozygoter, heterozygoter und coisogener Kontrolltiere pro
Haltungseinheit zusammengestellt. Jede Gruppe bestand aus sieben Tieren und wies eine
gleichmäßige Geschlechterverteilung auf.
Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass ein deutlicher Augenphänotyp bei LEW-ci2 Ratten
der TiHo-Haltung erst bei Tieren mit fortgeschrittenen Alter erkennbar war. Aus diesem
Grund wurden für die Studie ausschließlich Tiere mit einem Alter von über 400 Tagen
ausgewählt. Unterschiede bestanden zwischen den Altersmittelwerte der einzelnen Gruppen
(Tab. 5.1), da aufgrund der eingeschränkten Reproduktionsleistung der LEW-ci2 Ratten,
bedingt durch Hyperaktivität und Rotationsverhalten, ein genaues timing der Tiere zum
Versuchsbeginn nicht möglich war. Außerdem konnte die kooperierende Arbeitsgruppe nur
5. Diskussion 104
eine kleine Population alternder LEW-ci2 Ratten mit teilweise weit fortgeschrittenem
Lebensalter zur Verfügung stellen.
Tab. 5.1 Altersdurchschnitt der Tiergruppen aus der Vergleichsstudie.
Tiergruppe
Durchschnittliches Alter zum
Zeitpunkt der Untersuchung
LEW (MHH) - Kontrolle 480 d
LEW-ci2 / homozygot (MHH) 540 d
LEW-ci2 / heterozygot (MHH) 540 d
LEW (TiHo) - Kontrolle 410 d
LEW-ci2 / homozygot (TiHo) 680 d
LEW-ci2 / heterozygot (TiHo) 700 d
5.4.2.2 Verhalten
Das Verhalten von drei LEW-ci2 Tieren je Gruppe wurde sowohl im Heimatkäfig als auch in
einer den Ratten unbekannten Umgebung beobachtet, um Rückschlüsse auf das Sehvermögen
der Tiere zu ziehen. Daneben sollte das Verhalten auf mögliche Einflüsse durch Umwelt und
Haltung analysiert werden.
Bei Beobachtungen der Tiere im Heimatkäfig zeigten sich die Ratten der TiHo-Haltung
auffallend träge. Dies könnte auf den Altersunterschied im Vergleich zu den MHH-Tieren,
der im Schnitt 150 Tage betrug, zurückzuführen sein, da die lokomotorische Aktivität mit
zunehmendem Alter der Ratte sinkt (VALLE, 1971; WILLIG et al., 1987). Als Ursache
kommen weiterhin Gewichtsunterschiede zwischen Tieren der beiden Haltungssysteme in
Frage (Kap. 4.4.2.2). Daneben könnte die Aktivität der TiHo-Tiere aufgrund einer
Veränderung des hormonellen Haushalts, ausgelöst durch die getrenntgeschlechtliche
Haltung, eingeschränkt sein. Außerdem bestand in der TiHo eine Einzelhaltung der Tiere, was
aufgrund fehlender Sozialkontakte zusätzlich zu einem verminderten Bewegungsdrang
geführt haben könnte. Interessanterweise zeigten die Ratten nach dem Umsetzen in eine ihnen
unbekannte Umgebung eine deutlich erhöhte Aktivität. Das Rotationsverhalten, das spontan
aber auch stressinduziert auftreten kann, war allerdings schwächer ausgeprägt als bei Tieren
der MHH-Haltung. Außerdem konnte bei keinem TiHo-Tier ein Kotabsatz beobachtet
werden, der als Indikator für Stresssituationen gilt. Die gesamte Symptomatik deutet auf eine
5. Diskussion 105
geringe Stressanfälligkeit der LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung hin. Die plötzlich gesteigerte
Aktivität im unbekannten Käfig ist möglicherweise auf die Neugier der Tiere zurückzuführen,
die ansonsten aufgrund der Einzelhaltung in einer reizarmen Umgebung ohne soziale
Kontakte zu Artgenossen leben. Dies könnte auch der Grund für die ausgeprägte Exploration
des unbekannten Käfigs sein, die verglichen mit MHH-Tieren mit derselben Aktivität
durchgeführt wurde.
Die Verhaltensweisen der Tiere beider Gruppen unterschieden sich deutlich. Dies gibt einen
Hinweis darauf, dass die Einflüsse der unterschiedlichen Haltungs- und Umweltbedingungen
beider Tierhaltungen (MHH und TiHo) bei den LEW-ci2 Ratten phänotypisch erkennbar
waren.
Um einen Eindruck von dem Sehvermögen der Ratten zu erhalten, wurde den Tieren ein
unbekanntes Objekt in den Käfig gelegt. Aufgrund ihrer Neugier steuern gesunde Ratten den
Gegenstand normalerweise umgehend an, um diesen zu beschnuppern. Bei einem
eingeschränkten Visus läuft ein Tier jedoch an dem Objekt vorbei oder berührt dieses eher
zufällig mit den Tasthaaren, was durch eine Schreckreaktion deutlich wird.
Ein bewusstes Wahrnehmen des Gegenstandes war bei 3 von 6 untersuchten Tieren der
MHH-Haltung und bei nur einem Tier der TiHo-Haltung deutlich zu erkennen. Alle anderen
Tiere zeigten keine oder nicht eindeutige Reaktionen auf das unbekannte Objekt. Zusätzlich
wurde beurteilt, inwiefern die Tiere die Grenzen des Käfigs wahrnahmen.
Ratten, die das Objekt bewusst wahrnahmen, wurden als unbetroffen gewertet. Als betroffen
wurden dagegen solche Tiere eingestuft, die keine Reaktion auf den Gegenstand zeigten. Die
Ergebnisse aus diesem Test wurden mit Resultaten der elektroretinographischen
Untersuchung (ERG) auf Funktionalität des Sehvermögens abgeglichen. Dabei musste
festgestellt werden, dass die Ergebnisse lediglich bei der Hälfte der Probanden
übereinstimmten. Möglicherweise war die durch die unbekannte Umgebung ausgelöste
Stressbelastung verantwortlich dafür, dass die Tiere den unbekannten Gegenstand nicht
erkennbar wahrnahmen. Es wäre allerdings auch denkbar, dass lediglich ein Interesse an dem
Objekt fehlte.
Daneben wurden Tiere beobachtet, die offenbar ziellos durch den Käfig liefen und dabei
gegen die Seitenwände prallten. Diese Tiere wiesen allerdings bei den später durchgeführten
Messungen keine Abweichungen im Elektroretinogramm auf, was bedeutet, dass sie in ihrem
Sehvermögen also nicht eingeschränkt waren. Dieses Phänomen könnte wiederum auf die
5. Diskussion 106
ungewohnte Stresssituation während der Beobachtungen in Zusammenhang mit dem dadurch
induzierten Rotationsverhalten erklärt werden.
Abschließend muss festgestellt werden, dass aufgrund des Phänotyps der LEW-ci2 Ratte, der
durch motorische Störungen geprägt ist, die in dieser Studie angewandten Verhaltenstests
keine eindeutige Identifikation von Sehschwächen ermöglichen.
5.4.2.3 Körpergewicht
Das Körpergewicht der Tiere wurden im Zuge der Narkosevorbereitung für die ERG-
Messungen bestimmt und aufgrund von Hinweisen auf Gruppenunterschiede ausgewertet
(Kap. 4.4.2.2).
Es zeichnete sich die Tendenz ab, dass LEW-ci2 Tiere der TiHo-Haltung im Vergleich zu den
MHH-Ratten und im Vergleich zur eigenen Kontrollgruppe im Durchschnitt ein höheres
Körpergewicht aufwiesen. Aufgrund der großen Varianzen innerhalb der einzelnen Gruppen
konnten jedoch keine Signifikanzen nachgewiesen werden. Aus diesem Grund wurden die
Daten der weiblichen und männlichen Tiere getrennt voneinander erneut verglichen. Dabei
stellte sich heraus, dass die bei männlichen Tieren tendenziell vorhandenen Unterschiede bei
weiblichen Tieren signifikant waren.
Gewichtsdifferenzen zwischen homozygoten und heterozygoten LEW-ci2 Ratten wurden
bereits von LÖSCHER et al. (1996) beschrieben. Sie basieren auf dem gesteigerten
Energieverbrauch der hyperaktiven, homozygoten Tiere. Allerdings waren die Kontrolltiere
der TiHo-Haltung ebenso schwer wie die homozygoten LEW-ci2 Tiere derselben Haltung,
während heterozygote LEW-ci2 Ratten schwerer waren. Zu erwarten wäre aber ein gleiches
Gewicht bei Kontrollen und heterozygoten Tieren, während homozygote LEW-ci2 Ratten
aufgrund ihrer gesteigerten Aktivität leichter sein müssten. Da die Kontrolltiere im
Durchschnitt ein Alter von 410 Tagen aufwiesen, während die LEW-ci2 Ratten
durchschnittlich 690 Tage alt waren, ist dieses Phänomen wahrscheinlich auf die
Altersdifferenz zwischen den Tiergruppen zurückzuführen.
Durch eine isolierte Betrachtung der Genotypen zwischen beiden Haltungssystemen wird
deutlich, dass die hyperaktiven, homozygoten LEW-ci2 Tiere der TiHo- und MHH-Haltung
keine Gewichtsunterschiede aufwiesen, während die heterozygoten LEW-ci2 Ratten der TiHo
deutlich schwerer waren als solche aus der MHH-Haltung (Abb. 4.7). Hier konnten
Altersunterschiede jedoch keine Rolle spielen, da die Altersdifferenz zwischen den
homozygoten Tieren beider Haltungen durchschnittlich ebenso groß war wie die
5. Diskussion 107
Altersdifferenz zwischen den Gruppen mit heterozygoten Tieren. Verantwortlich dafür könnte
die Einzelhaltung der TiHo-Tiere sein, die möglicherweise im Vergleich zur Haltung der
MHH, bei der ein bis drei Tiere pro Käfig untergebracht waren, eine Reduktion des
Bewegungsdranges bzw. eine Aktivitätsminderung der Tiere verursachte. Dies ist ein weiterer
Hinweis darauf, dass Haltungs- bzw. Umweltfaktoren die Ausprägung phänotypischer
Symptome bei LEW-ci2 Ratten beeinflussen.
5.4.2.4 Elektroretinographische Untersuchung
Die elektroretinographische Untersuchung dient der Beurteilung der Leistungsfähigkeit von
Photorezeptorzellen der Netzhaut sowie der ihnen nachgeschalteten Neurone (Kap. 2.6). Sie
wurde in dieser Studie eingesetzt, um die Funktionsfähigkeit des Sehsinns von LEW-ci2
Ratten zu prüfen und somit den visuellen Phänotyp der Mutante zu charakterisieren.
Durch einen Lichtreiz ausgelöste Potentialschwankungen der Retina setzen sich bis zur
Oberfläche des Auges fort, wo sie mithilfe von Elektroden abgeleitet werden können. Bei der
Untersuchung der LEW-ci2 Ratten wurden zu diesem Zweck Ringelektroden eingesetzt, die
auf den Bulbus geschoben wurden. Da eine Möglichkeit zur Fixation der Elektrode am Auge
nicht bestand, wurde der Ring auf die korneanahe Sklera aufgesetzt. Es ist jedoch bekannt,
dass eine direkte Ableitung der Potentiale an der Kornea (Hornhaut) durch Kontaktelektroden
die größten und v.a. stabilsten Amplituden hervorbringt und dass sich die Potentiale mit
steigender Entfernung der Elektroden vom Korneaapex verringern (MARMOR et al., 2004).
Da eine definierte Positionierung der Elektroden auf der Sklera nicht möglich ist, birgt diese
Methodik die Gefahr abweichender Messwerte, die Schwankungen in den Daten einer Gruppe
provozieren können. Es ist deshalb wichtig, innerhalb eines Labors bzw. während derselben
Versuchsreihe eine konstante Methodik anzuwenden (Position der Elektroden,
Lichtintensitäten, Art der Stimuli, Frequenz usw.) und innerhalb des Labors eigene
Referenzwerte für die laufende Studie zu erstellen (MARMOR et al., 2004). Diesem Zweck
dienten die Untersuchungsergebnisse der Kontrollgruppen. Die Elektroretinographie wurde in
Anlehnung an die regelmäßig aktualisierten Richtlinien des ISCEV, der Internationalen
Gesellschaft für klinische Elektrophysiologie des Sehens, durchgeführt.
Die im skotopischen ERG abgeleiteten Maximalwerte der a- und b-Wellen waren bei LEW-
ci2 Ratten der MHH-Haltung und bei den Kontrolltieren der MHH-Haltung gleich. Diese
Werte unterschieden sich auch zwischen den Kontrollgruppen der MHH- und der TiHo-
5. Diskussion 108
Haltung nicht (Kap. 4.4.2.3), so dass davon ausgegangen werden kann, dass bei diesen Tieren
gleichermaßen eine normale Sehfähigkeit vorlag. Diese Referenzwerte (Normalwerte)
konnten durch ERG-Untersuchungen anderer Stämme, wie zum Beispiel der
HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd, bestätigt werden (Kap. 4.4.3). Im Gegensatz dazu waren die
Antworten der LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung stark reduziert, bei einem großen Teil der
Tiere beinahe vollständig erloschen (Kap. 4.4.2.3). Die Differenzen zu den LEW-ci2 Tieren
der MHH-Haltung sowie zu den Kontrolltieren waren sowohl für die a-Welle als auch für die
b-Welle in allen Stufen des ERGs hochsignifikant. Der geringe Altersunterschied zwischen
den LEW-ci2 Ratten der beiden Tierhaltungen kann als Ursache für die Potentialunterschiede
ausgeschlossen werden. Es ist zwar bekannt, dass mit zunehmendem Alter ein stetiger Verlust
an Photorezeptoren sowie eine Abnahme der Sensitivität dieser Zellen zu verzeichnen ist
(JONAS et al., 1992; TZEKOV et al., 2003; MARMOR et al., 2004). Eine altersbedingte
Reduktion der Potentiale wird jedoch auf höchstens 30% bei einem Altersunterschied von
mind. 500 Tagen geschätzt (WEISSE et al., 1974; SEITZ et al., 1977; KATZ et al., 1986;
CAVALLOTTI et al., 2001). Da es sich aber im Mittel um eine Differenz von nur 150 Tagen
handelte und die Potentiale nicht nur reduziert sondern zum großen Teil beinahe vollständig
erloschen waren, müssen andere Faktoren verantwortlich sein. Da eine zweite Mutation oder
der Einfluss modifizierender Gene aufgrund der Herkunft der Tiere (Inzuchtstamm, alle Tiere
aus einem Zuchtbestand) ausgeschlossen werden kann und da es sich um zwei
unterschiedliche Haltungssysteme handelt, könnten visusschädigende Umweltfaktoren an der
Pathogenese beteiligt sein.
Die mittels photopischer Elektroretinographie abgeleiteten Potentiale der Zapfen waren
insgesamt deutlich geringer als die Potentiale des Dunkel-ERGs, da die Zapfen in der Retina
der Ratte nur sehr selten gefunden werden, während die Stäbchen den weitaus größten Teil
der Photorezeptorzellen darstellen (WALLS, 1934; TILGNER, 1966; MATTHEW und LA
VAIL, 1976). Ähnlich wie im skotopischen ERG zeigten die LEW-ci2 Ratten der TiHo-
Haltung reduzierte Antworten der Photorezeptoren (hier der Zapfen) im Vergleich zu den
LEW-ci2 Ratten der MHH-Haltung und der Kontrolltiere. Allerdings waren diese Differenzen
im Hell-ERG nicht so deutlich ausgeprägt. Interessanterweise wurden dagegen weder im
skotopischen noch im photopischen ERG Unterschiede der Latenzzeiten zwischen den
Gruppen erkannt.
In Verbindung mit den Beobachtungen aus dem Dunkel-ERG gleicht dieser Befund dem
Erscheinungsbild einer Retinopathia pigmentosa. Diese Erkrankung, die mithilfe der
5. Diskussion 109
Elektroretinographie diagnostiziert werden kann, führt beim Menschen zu einer Degeneration
der Photorezeptorzellen der Netzhaut (Kap. 2.5.2). Obwohl es sich dabei um eine sogenannte
Stäbchen-Zapfen-Dystrophie handelt, degenerieren primär die Stäbchenzellen und
verursachen erst sekundär den Untergang der Zapfen (BIRD , 1995; BANIN et al., 1999). Die
Stäbchen sind aus diesem Grund stets bedeutend stärker betroffen (HAMEL, 2006). Ein
primärer Stäbchenuntergang könnte eine Erklärung dafür sein, dass die Potentialdifferenzen
zwischen den LEW-ci2 Ratten beider Haltungseinheiten gemessen im skotopischen ERG
bedeutend ausgeprägter sind als im Zapfen-ERG.
Es ist bekannt, dass bei RP-Patienten mit noch milder Symptomatik
(Gesichtsfeldeinschränkung, beginnende Nachtblindheit) bereits stark verminderte
Amplituden, insbesondere der b-Wellen, aufgezeichnet werden (PETIT, 2001; HAMEL,
2006; EBERMANN et al., 2006). Deshalb sollte trotz (fast) erloschener Potentiale der LEW-
ci2 Ratten der TiHo-Haltung im ERG von einem eingeschränkten Sehvermögen dieser Tiere
und nicht von einer bestehenden Blindheit ausgegangen werden. Im Hinblick auf die
Verhaltensbeobachtungen ist es unter diesen Voraussetzungen auch verständlich, dass Tiere
trotz erloschener Potentiale im ERG in den Verhaltenstests das für sie `unbekannte Objekt´
offensichtlich wahrnahmen. Dies ist aus einer geringen Distanz auch mit einem
eingeschränkten Sehvermögen möglich.
Die Retinopathia pigmentosa (RP) kann Bestandteil der Symptomatik des humanen Usher
Syndroms sein (Kap. 2.5.1). Patienten mit dieser Erkrankung zeigen im ERG die typisch
veränderten oder erloschenen Amplituden einer RP, wie sie auch bei LEW-ci2 Tieren der
TiHo-Haltung festgestellt wurden. Charakteristisch für das Usher Syndrom sind außerdem
unveränderte Latenzzeiten (SEELIGER et al., 2001), die bei den Untersuchungen der LEW-
ci2 Tiere ebenfalls beobachtet wurden.
Eine ähnliche Symptomatik konnten LIBBY und STEEL (2001) für Mäuse nachweisen, die
eine Mutation im Myo7A aufwiesen. Dieses Gen ist an der Entstehung des Usher Syndroms
beteiligt. Die Tiere zeigten, ebenso wie betroffene LEW-ci2 Ratten, reduzierte Amplituden
der a- und b-Wellen bei unveränderter Latenzzeit. Allerdings betrugen in dieser Studie die
Differenzen zu den Potentialen der Kontrollen höchstens 20% und die untersuchten Mäuse
waren maximal sieben Monate alt.
5. Diskussion 110
5.4.2.5 Histologische Untersuchung des Augenhintergrundes
Die Elektroretinographie gibt Auskunft darüber, ob die Photorezeptoren auf physiologische
Weise mit einer Potentialveränderung auf einen Lichtreiz reagieren können. Allerdings sagt
diese Methode nichts darüber aus, ob verminderte Potentiale aufgrund von funktionellen
Störungen der Zellen oder aufgrund von Zellverlusten auftreten. Um der Ursache für die im
ERG beobachteten reduzierten bzw. fehlenden Antworten von Photorezeptorzellen der LEW-
ci2 Ratten aus der TiHo-Haltung weiter auf den Grund zu gehen, wurden histologische
Schnitte von Augen angefertigt. In die Untersuchung gingen je drei homo- und heterozygote
LEW-ci2 Tiere sowie je drei Kontrolltiere pro Haltungseinheit ein.
Bei der Auswertung der Schnitte wurde zuerst die Integrität, das Ausmaß sowie der
physiologische Schichtenaufbau der gesamten Retina analysiert. Anschließend folgte eine
detailierte Beurteilung der einzelnen Schichten. Dabei wurde die Anzahl der Zelllagen an
verschiedenen Punkten der Netzhaut ausgezählt, um die relative Dicke (Ausmaß) jeder
Schicht zu bestimmen. Für die Auszählung wurden Lokalisationen in der zentralen und in der
peripheren Retina gewählt, da es aufgrund der elektroretinographischen Untersuchungen der
LEW-ci2 Ratten Hinweise auf einen Zusammenhang zur Retinopathia pigmentosa (des Usher
Syndroms) gab. Bei dieser Erkrankung erfolgt die Schädigung der Photorezeptorzellen
zentripetal, d.h. ungleichmäßig über die Gesamtlänge der Retina von der Peripherie
beginnend und sich zum Zentrum hin ausbreitend. Daneben kommt es bei diesem
Krankheitsbild zu einer Affektion des Sehnerven. Um dieses Gewebe zusätzlich beurteilen zu
können, wurden die Bulbi auf Höhe des Discus opticus (Blinder Fleck) geschnitten.
Die histologische Untersuchung der Netzhautpräparate von LEW-ci2 Ratten der MHH und
von LEW-Kontrolltieren machte deutlich, dass Integrität und physiologischer
Schichtenaufbau der Retina bei diesen Tieren durchgehend erhalten waren. Allerdings stellte
sich die Gesamtdicke der Netzhaut bei den LEW-ci2 Tieren der MHH im Vergleich zu den
Kontrolltieren geringgradig verringert dar. Dies konnte zum Teil auf eine geringe Abnahme
der Photorezeptorzellschicht und eine Reduktion der äußeren Körnerschicht um
durchschnittlich 2-3 Zelllagen zurückgeführt werden. Die äußere Körnerschicht wird von
Zellkernen der Photorezeptoren gebildet und besteht in der Regel aus 8 bis 12 Kernreihen
(WEISSE et al., 1974; SEITZ et al., 1977). LAI et al. (1978) beschrieb bei Ratten mit einem
Alter von mehr als 540 Tagen eine Abnahme dieser Schicht auf unter 8 Zellen sowie eine
altersbedingte Verkürzung der inneren und äußeren Segmente der Photorezeptorzellen. Diese
5. Diskussion 111
ist über die gesamte Netzhaut gleichmäßig verteilt, die retinale Architektur aber bleibt
unbeeinflusst. Zusätzlich wurde in der Literatur eine Reduktion der gesamten Retina bis zu
30% ab einem Alter von 720 Tagen im Vergleich zu jungen Tieren (180 Tage) beschrieben
(WEISSE et al., 1974; SEITZ et al., 1977; KATZ et al., 1986; CAVALLOTTI et al., 2001).
Da eine Altersdifferenz von durchschnittlich 60 Tagen zwischen den über 540 Tage alten
LEW-ci2 Ratten der MHH und den Kontrolltieren bestand, wird davon ausgegangen, dass es
sich bei den Zellverlusten in der Netzhaut von LEW-ci2 Tieren um eine altersbedingte
Degeneration und nicht um eine krankhafte Veränderung ähnlich der Retinopathia pigmentosa
handelt. Die Altersdifferenz ist zwar nicht sehr groß, die Unterschiede im Ausmaß der Retina
bzw. im Umfang der einzelnen Schichten sind allerdings auch nur geringgradig.
Im Gegensatz dazu wiesen die Schnitte von LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung im Vergleich
zu den Kontrollen eine hochgradige Verjüngung der Photorezeptorzellschicht und der äußeren
Körnerschicht auf, die aufgrund der Schwere des Geschehens nicht auf einen
Altersunterschied zurückgeführt werden kann. Während bei der Hälfte der Tiere noch ein bis
höchstens sechs Zelllagen in der äußeren Körnerschicht gezählt wurden, waren bei der
anderen Hälfte Zellen in dieser Schicht nur noch vereinzelt zu finden und bildeten keine
durchgehende Zellreihe mehr. Bei diesen Tieren fand sich zusätzlich eine fast vollständige
Degeneration der Photorezeptorzellschicht und der äußeren plexiformen Schicht. Diese wird
normalerweise durch die Zellausläufer der in diesen Fällen zugrundegegangenen
Photorezeptoren gebildet. Interessanterweise waren die verbliebenen Schichten der Retina
einschließlich des Retinalen Pigmentepithels in ihrer Struktur unverändert. Die Dicke der
Netzhaut war zwar bei den Mutanten im Vergleich zu den Kontrollen geringgradig verringert,
dies kann aber ebenfalls dem Altersunterschied zwischen diesen Gruppen zugeschrieben
werden. Durch die Auswertung der histologischen Präparate konnte ein isolierter,
degenerativer Verlust von Photorezeptorzellen der Retina ausschließlich bei LEW-ci2 Ratten
der TiHo-Haltung diagnostiziert werden.
Netzhautdegenerationen kommen am häufigsten als primäre hereditäre Erkrankungen vor.
Sekundär können sie im Rahmen von Altern, diätetischen und metabolischen Störungen,
Infektionen oder chemischen und physikalischen Traumata entstehen. Erbliche wie erworbene
Retinopathien spielen sich in der Regel in der äußeren Netzhaut ab (DAHME und WEISS,
1999). Mechanische Verletzungen des Auges können aufgrund von Vorberichten und
Untersuchungen der LEW-ci2 Tiere als Ursache der beschriebenen Netzhautschäden
5. Diskussion 112
ausgeschlossen werden. Ebenso kann eine diätetische und daraus bedingte metabolische
Störung nicht ursächlich sein, da ein standardisiertes Futtermittel verabreicht wurde. Eine
kausale physikalische Einwirkung in Form von Licht ist allerdings sehr interessant. Das
histologische Bild einer lichtgeschädigten Netzhaut ist geprägt von einem vollständigen
Verlust der äußeren Körnerschicht mit ansonsten unveränderter Retina (GRIGNOLO et al.,
1969) und weist daher starke Ähnlichkeiten zu den Veränderungen im Auge von LEW-ci2
Ratten der TiHo-Haltung auf. Aufgrund dieser Parallelen wurde die Lichtintensität in den
Tierräumen beider Haltungssysteme überprüft. Die ermittelten Maximalwerte entsprachen
jedoch den für die Versuchstierhaltung vorgegebenen Richtlinien (Kap. 4.4.2.5).
Weiterhin konnten in Schnitten von LEW-ci2 Ratten keine charakteristischen Anzeichen einer
akuten oder abgeklungenen Infektion beobachtet werden. Typisch sind in diesem Fall
degenerative Veränderungen der Netzhaut und des Sehnerven sowie eine gliöse Vernarbung
(DAHME und WEISS, 1999). Dabei kommt es zu einer Schädigung aller Schichten der
Retina sowie des Retinalen Pigmentepithels und zu einer Infiltration von Entzündungszellen.
Netzhautschädigende Erreger wurden bei LEW-ci2 Ratten nicht nachgewiesen (Kap. 4.4.2.5).
Wie bereits erwähnt können retinale Degenerationen auch erblich bedingt sein. Ein Beispiel
dafür ist die progressive Retinaatrophie (PRA) bei Hund und Katze, die neben einer
Degeneration der Netzhaut und der Papille durch umschriebene depigmentierte Bezirke mit
atrophierten Gefäßen gekennzeichnet ist.
Die Ergebnisse der Elektroretinographie von LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung zeigten
bereits deutliche Parallelen zur Retinopathia pigmentosa. Im Gegensatz zur klinischen
Symptomatik gibt es jedoch zwischen den histologischen Befunde von RP-Patienten und von
betroffenen LEW-ci2 Ratten einige Differenzen. Während die RP durch einen zentripetalen
Verlauf der Degeneration geprägt ist, waren die Zellverluste bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-
Haltung über die gesamte Länge der Retina gleichbleibend. Allerdings ist auch beim
Menschen bei einer weit fortgeschrittenen Erkrankung dieser Verlauf in vielen Fällen nicht
mehr erkennbar. Da die betroffenen LEW-ci2 Ratten bereits relativ alt waren (>680 Tage) und
in histologischen Präparaten dieser Tiere oftmals nur noch vereinzelt oder keine
Photorezeptorzellen mehr vorhanden waren, ist anzunehmen, dass die Krankheit weit
fortgeschritten war.
Neben Zellverlusten ist die RP durch eine Verengung retinaler Gefäße, eine Atrophie des
Sehnerven sowie fleckige Alterationen des Retinalen Pigmentepithels (Pigmentablagerungen)
gekennzeichnet. Diese zusätzliche Symptomatik war bei betroffenen LEW-ci2 Tieren nicht zu
5. Diskussion 113
beobachten. Weiterhin sind Einlagerungen in Form von Knochenkörperchen beschrieben, die
allerdings auch bei Patienten mit einer RP variabel auftreten.
Es gibt Spekulationen darüber, ob eine speziesbedingt ungleiche Physiologie des Auges für
die unterschiedliche Ausprägung von retinalen Erkrankungen bei Mensch und Labornagern
ursächlich sein könnte (AMRAOUI et al., 1996; LIBBY und STEEL, 2001). Denn
interessanterweise sind bis heute keine Tiermodelle beschrieben, die eine Mutation in einem
Protein tragen, das in das humane Usher Syndrom involviert ist, und gleichzeitig eine retinale
Degeneration aufweisen.
Ein weiteres Beispiel sind Mutationen im Myo7A, die beim Menschen zum Usher Syndrom
mit vestibulo-cochleärer und visueller Symptomatik führen können, während retinale
Degenerationen bei Maus- und Rattenmodellen fehlen (LIU et al., 1998; SMITS et al., 2005).
Allerdings konnten bei diesen Tieren abnormale Ereignisse in den Photorezeptorzellen wie
fehlerhafte Transportvorgänge mit Akkumulation von Substanzen sowie eine reduzierte
Synthese/Phagozytose von Außensegment-Scheibchen beobachtet werden, die auf eine
Beteiligung des Auges auch bei der Symptomatik von Myo7A-defizienten Tieren hinweisen
(LIU et al., 1999; GIBBS et al., 2003). Bisher konnten die Mechanismen der
Photorezeptorzelldegeneration bei erblicher RP allerdings nicht eindeutig aufgeklärt werden.
5.4.2.6 Untersuchung von Umweltfaktoren
Wie bereits erwähnt, können neben genetischen Defekten auch Umweltfaktoren Ursache für
eine Erkrankung der Netzhaut sein. Da LEW-ci2 Tiere mit gleichem genetischen Hintergrund
abhängig von ihrem Haltungsstandort einen unterschiedlichen visuellen Phänotyp aufwiesen,
liegt die Vermutung nahe, dass die Einwirkung von schädigenden Umwelteinflüssen
verantwortlich ist oder zumindest eine Rolle bei der Pathogenese spielen. Diese Faktoren
wurden deshalb im Rahmen der Vergleichsstudie in beiden Haltungssystemen überprüft.
In der Literatur wird beschrieben, dass retinale Degenerationen als Folge von infektiösen
Retinitiden auftreten können. Isolierte Entzündungen der Netzhaut sind allerdings selten und
entstehen meist im Verlaufe einer bakteriellen oder viralen Allgemeinerkrankung. In der
Regel stellt sich die Retinitis jedoch als Teilbefund, zum Beispiel in Verbindung mit einer
Uveitis, oder als Folgezustand einer Endophthalmitis ein (DAHME und WEISS, 1999). Die
Coronavirus-bedingte Retinopathie bei experimentell mit MHV infizierten Mäusen
(intravitreale Inokulation) zeigt teilweise im Vergleich zur LEW-ci2 Ratte ähnliche
5. Diskussion 114
degenerative Veränderungen der Netzhaut. Die nach 10-140 Tagen einsetzende, retinale
Degeneration betrifft hauptsächlich die äußere Körnerschicht, allerdings können alle
Schichten der Netzhaut, einschließlich des Retinalen Pigmentepithels, von apoptotischen
Zelluntergängen betroffen sein (ROBBINS et al., 1990; KOMURASAKI et al., 1996; WANG
et al., 2000). Es handelt sich um einen langandauernden Krankheitsverlauf (long-lasting
disease) mit einer Beteiligung des körpereigenen Immunsystems (Infiltration von
Immunzellen).
Da bestimmte Infektionen visusschädigend sein können, wurde in Anlehnung an die
Richtlinien der FELASA der Hygienestatus der Tiere beider Haltungseinheiten überprüft
(Kap. 3.9.1). Die wenigen bei den TiHo-Tieren und den Ratten der MHH-Haltung
nachgewiesenen Pathogene (Kap. 4.4.2.5) stehen jedoch in keinem Zusammenhang mit
Infektionen der Netzhaut und anschließenden Degenerationserscheinungen. Einzig bei der
Pasteurellose von Haustieren ist eine Retinitis beschrieben (DAHME und WEISS, 1999). Sie
kommt allerdings ausschließlich als Teilbefund einer Endophthalmitis bei einer bakteriämisch
(systemisch) verlaufenden Infektion vor. Da die Tiere der Vergleichsstudie jedoch klinisch
gesund waren und die Pasteurellen in beiden Haltungssystemen gleichermaßen nachgewiesen
wurden, kann eine solche Infektion als Ursache für die hier beschriebenen Defekte
ausgeschlossen werden.
Daneben wurden LEW-ci2 Ratten zusätzlich auf den Erreger der Borna-Erkrankung (BDV)
getestet, da das BD-Virus in neuronalen Strukturen repliziert und infolgedessen
immunbedingte Degenerationen provoziert. In experimentell infizierten Ratten kam es dabei
auch zu einer Beteiligung des Sehnerven und der Netzhaut (NARAYAN et al., 1983; KACZA
et al., 2000; STAHL et al., 2003). Dieser Erreger konnte ebenfalls nicht nachgewiesen
werden.
Darüber hinaus wurde das Blut von LEW-ci2 Ratten auf entzündungsbedingte
Verschiebungen des Blutbilds untersucht (Daten nicht gezeigt). Diese konnten nicht bestätigt
werden. Daneben fehlten im histologischen Bild Anzeichen für eine akute oder
zurückliegende Infektion wie Infiltration von Immunzellen, Vernarbungen oder fibrinöse
Adhäsionen (Kap. 5.3.2.5), so dass eine erregerbedingte Erkrankung des Augenhintergrunds
bei betroffenen LEW-ci2 Tieren ausgeschlossen werden kann.
Als weiterere Umweltfaktoren wurden die Lichtintensität und der Lichtzyklus in den
Tierräumen überprüft, da zu hohe Lichtbelastungen oder verlängerte Lichtphasen retinale
Degenerationen induzieren können (NOELL et al., 1966; WILLIAMS et al., 1983). Wie das
5. Diskussion 115
sichtbare Licht die Netzhaut schädigt, ist nicht eindeutig geklärt. Diskutiert wird eine
lichtinduzierte Oxidation der mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren in den
Membranscheiben der Stäbchen, wodurch freie, die Zellmembranen der Photorezeptoren
schädigende Radikale entstehen (DAHME und WEISS, 1999). Tiere mit gering pigmentierter
Aderhaut sowie auf Nachtsehen adaptierte Spezies reagieren am empfindlichsten auf die
Lichteffekte. Durch eine überhöhte Lichtbelastung kommt es in der Netzhaut zu einem
vollständigen Verlust der äußeren Körnerschicht, während die restlichen Schichten der Retina
unverändert bleiben (GRIGNOLO et al., 1969). Die histologische Untersuchung des
Augenhintergrundes von LEW-ci2 Ratten (TiHo-Haltung) ergab ebenfalls eine Degeneration
ausschließlich der äußeren Körnerschicht (Kap. 4.4.2.4). Da es sich bei der LEW-ci2 Ratte
um einen albinotischen Stamm handelt, weist diese außerdem eine besondere
Lichtempfindlichkeit auf.
Nach den Richtlinien der Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-Solas) soll die
Lichtintensität in Tierräumen etwa 250 lx bis 450 lx betragen. Diese Vorgaben wurden
sowohl in der MHH-Haltung als auch in der TiHo-Haltung erfüllt.
Aufgrund ihrer hohen Lichtempfindlichkeit wird für die Haltung albinotische Ratten aber eine
maximale Lichtbelastung von 60 lx empfohlen (www.gv-solas.de/auss/hal/ratten-haltung.pdf).
In den Innenbereichen der Käfige konnten durchgehend Lichtintensitäten von weniger als 30
lx gemessen werden. Diese Aussage traf jedoch nicht auf die obere Regalreihe des rechten
Ständers in der TiHo-Haltung zu, in der die weiblichen Ratten untergebracht waren. Der
empfohlene Wert wurde an diesem Standort im gesamten Käfig um das Doppelte
überschritten. Grund dafür war die ungleichmäßige Beleuchtung des Raumes mit verschieden
starken Leuchtmitteln. Da die Ständer in dieser Haltungseinheit keine festen Böden
aufwiesen, die eine Abschwächung der Lichtintensität bewirken, kann eine übermäßige
Lichtbelastung auch für die zweite Käfigreihe nicht ausgeschlossen werden.
Im Hinblick auf die unterschiedliche Lichtbelastung der weiblichen und männlichen Tiere der
TiHo-Haltung ist es interessant, dass weibliche LEW-ci2 Tiere dieser Einheit sowohl im ERG
als auch in histologischen Präparaten deutlichere Beeinträchtigungen im Vergleich zu
männlichen Tieren zeigten. Allerdings waren Ratten beiderlei Geschlechts von degenerativen
Netzhautveränderungen und erloschenen Potentialen im ERG betroffen.
Die geringste Lichtintensität, bei der eine phototoxische Retinopathie (bei einem
zwölfstündigen Lichtzyklus über einen Zeitraum von drei Monaten) nachgewiesen wurde,
beträgt 60 bis 65 lx (STÖTZER et al., 1970; ANDERSON et al., 1972; BELLHORN et al.,
1980). Daher wird für die Haltung von Albinoratten eine Lichtintensität von deutlich unter 60
5. Diskussion 116
lx, d.h. zwischen 30 und 50 lx in weiten Teilen des Käfigs angeraten (ANDERSON et al.,
1972; BELLHORN et al., 1980). Bei experimentellen Untersuchungen zur
netzhautschädigenden Wirkung des Lichts, die eine vollständige Degeneration der
Photorezeptorzellschicht nachwiesen, wurden allerdings Lichtintensitäten (1200-1400 lx)
verwendet, die diese Richtwerte um mehr als das 20fache überschritten (VAUGHAN et al.,
2003). Es ist deshalb davon auszugehen, dass die geringe Überschreitung der Lichtintensität
in der Tierhaltung der TiHo zumindest nicht allein für die schwerwiegenden retinalen
Veränderungen bei LEW-ci2 Ratten dieser Einheit verantwortlich sein konnte.
Als ein zusätzlicher, einflussnehmender Faktor käme eine Vitamin A-arme Diät in Frage.
Diese könnte durch falsche Zusammensetzung, Überlagerung oder erhöhte UV-Belastung des
Futters entstehen und in Verbindung mit einer erhöhten Lichtbelastung möglicherweise zu
einer retinalen Schädigung führen (DAHME und WEISS, 1999). Im Zusammenhang mit den
Defekten bei der LEW-ci2 Ratte kann ein solcher Mangel jedoch nicht stehen, da die Tiere
beider Haltungen dasselbe Standardfutter erhielten.
Es ist denkbar, dass weitere Faktoren in der Umwelt der Tiere Einfluss auf die Entstehung
bzw. Ausprägung der Augenerkrankung hatten. So beschrieben SCHLINGMANN et al.
(1993), dass das Wohlbefinden albinotischer Ratten bereits ab einer Lichtintensität von 20 bis
25 lx gestört sein kann. Diese Werte waren in der oberen Regalreihe bei männlichen und
weiblichen LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung im gesamten Aufenthaltsbereich der Tiere
überschritten, was möglicherweise zu einer chronischen Stressbelastung dieser Tiere führte.
Einen andauernden Stress verursachte möglicherweise auch die Einzelhaltung der LEW-ci2
Ratten in der TiHo. Der sogenannte isolationsinduzierte Stress äußert sich bei dieser
ansonsten geselligen Tierart vor allem durch Veränderungen im Verhalten (HATCH et al.,
1963; PARKER und MORINAN, 1986; HILAKIVI et al., 1989; WONGWITDECHA und
MARSDEN, 1996). Unterschiede im Verhalten zwischen LEW-ci2 Tieren der TiHo-Haltung
und der MHH-Haltung (Kap. 4.4.2.1 und Tab. 10.1/10.2) können demnach auf die
differierenden Arten der Unterbringung zurückgeführt werden.
Interessant ist eine Studie von HATCH et al. (1963), die eine offenbar höhere Anfälligkeit
von weiblichen Tieren für Effekte der Isolationshaltung beschreibt. Wie bereits erwähnt
wurde, waren die Retinae weiblicher LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung im Vergleich zu
männlichen Tieren funktionell und histologisch schwerer betroffen. Außerdem gibt es
Hinweise darauf, dass soziale Isolation in Verbindung mit zusätzlichen Stressfaktoren die
Generation neuer Neuronen unterdrückt und dass in diesem Zusammenhang ansonsten völlig
5. Diskussion 117
normale Reize einen potentiell zerstörerischen Einfluss auf Nervenzellen ausüben können
(STRANAHAN et al., 2006).
5.5 Die LEW/Ztm-ci2 Ratte als mögliches Tiermodell für das Usher
Syndrom des Menschen
Das Usher Syndrom (USH) des Menschen ist eine autosomal rezessiv vererbte Gruppe von
Erkrankungen, die mit neurosensorischer Taubheit oder Hörverlust, vestibulären Störungen
und progressivem Verlust der Sehfähigkeit einhergehen können (siehe auch Kap. 2.5.1). Das
klinische Bild ist heterogen und schwankt in der Schwere der Symptomatik sowie dem
Einsetzen (onset) der Sehstörungen. Bis heute wurden neun Proteine identifiziert, die für das
Entstehen des Usher Syndroms verantwortlich gemacht werden (Tab. 2.1). Für einen Teil
dieser Proteine konnten bereits Tiermodelle etabliert werden (Tab. 2.1), deren phänotypische
Eigenschaften große Übereinstimmungen aufweisen (Kap. 2.2.3). Charakteristisch sind vor
allem vestibuläre Störungen wie Rotationsverhalten, lokomotorische Hyperaktivität sowie
Taubheit. Keines dieser Tiermodelle weist jedoch eine retinale Symptomatik mit
funktionellen und degenerativen Defekten der Photorezeptorzellen auf, die das Usher
Syndrom zusätzlich kennzeichnen. Der Grund dafür könnten Unterschiede der
umweltbedingten Belastungen bei Labortieren im Vergleich zum Menschen, wie zum Beispiel
eine geringere Lichtexposition (LIBBY und STEEL, 2001), speziesabhängige Unterschiede
von physiologischen Abläufen in der Retina oder der Einfluss des genetischen Hintergrundes
sein (AMRAOUI et al., 1996; LIBBY und STEEL, 2001).
Der Phänotyp der LEW-ci2 Ratte weist große Übereinstimmungen zur Symptomatik dieser
Tiermodelle auf. Im Gegensatz zu diesen Stämmen zeigt die LEW-ci2 Ratte jedoch zusätzlich
sowohl einen funktionellen als auch einen histologischen Phänotyp am Auge und weist somit
die vollständige Symptomatik des humanen Usher Syndroms auf. Dazu zählen stark
reduzierte bis beinahe erloschene Potentiale vor allem im skotopischen aber auch im
photopischen ERG sowie ein degenerativer Verlust der Photorezeptoren in der Netzhaut.
Einige Details im histologischen Bild von Usher Patienten, wie knochenkörperartige
Einlagerungen oder der zentripetale Verlauf der Netzhautdegeneration, fehlen bei der LEW-
ci2 Ratte. Die Ausprägung der Augenerkrankung ist aber auch beim Menschen variabel.
5. Diskussion 118
Das bei der LEW-ci2 Ratte mutierte Myosin XV ist beim Menschen ausschließlich im
Zusammenhang mit rezessiver, neurosensorischer Taubheit (DFNB3) bekannt und wurde
bisher nicht mit dem humanen Usher Syndrom in Verbindung gebracht. Durch die Interaktion
mit dem Usher-Protein Whirlin hat das Myosin XV jedoch Verbindung zu dem Usher Protein
Interaktom, das die bisher bekannten USH1 und USH2 Proteine umfasst. Da das Whirlin eine
zentrale Rolle in der Organisation dieses makromolekularen Netzwerkes übernimmt (Kremer
et al., 2006), ist das Myosin XV als Transporter dieses Proteins folglich von großer
Bedeutung für dessen Funktionalität.
Ob die Interaktion zwischen Whirlin und Myosin XV auf die Haarzellen im Innenohr
beschränkt bleibt, ist bisher nicht geklärt. Da der Komplex, einschließlich aller darin
organisierten Proteine, sowohl im Innenohr als auch im Auge funktionell an gleichen
Abläufen beteiligt ist (VAN WIJK et al., 2006; KREMER et al., 2006), ist eine Funktion des
Myosins als Bindungspartner auch im Auge anzunehmen.
Bei humanen Mutationen im Myosin XV-Gen ist im Gegensatz zur LEW-ci2 Ratte bisher
noch kein Phänotyp am Auge beschrieben worden. Möglicherweise spielen hier
Kompensationsmechanismen eine Rolle, die auf bestimmte Gewebe, wie zum Beispiel die
Netzhaut, beschränkt bleiben. Dabei könnten Spleißvarianten (LIANG et al., 1999) oder
strukturell bzw. funktionell ähnliche Motorproteine (unkonventionelle Myosine) die
Aufgaben des fehlenden oder funktionsunfähigen Proteins übernehmen (FRIEDMAN et al.,
1999; KREMER et al., 2006).
Interessanterweise tritt der retinale Phänotyp ausschließlich bei LEW-ci2 Tieren einer
bestimmten Haltung auf, während Ratten einer anderen Haltung unbetroffen sind. Und
obwohl das Usher Syndrom des Menschen ebenso wie das Rotationsverhalten (circling) der
LEW-ci2 Tiere autosomal rezessiv vererbt wird, sind sowohl homozygote also auch
heterozygote Merkmalsträger betroffen. Dies deutet darauf hin, dass Einflüsse aus der
Umwelt eine Rolle bei der Entstehung der Netzhauterkrankung spielen. Da die Kontrolltiere,
die unter denselben Bedingungen wie LEW-ci2 Ratten in der TiHo gehalten wurden, keine
retinale Symptomatik aufwiesen, muss dem visuellen Phänotyp der Mutante ein genetischer
Defekt zugrunde liegen.
Einflüsse von Umweltfaktoren auf den Verlauf der humanen Usher Syndrom-Erkrankung sind
bisher wenig erforscht. Es wird diskutiert, ob hohe Lichtintensitäten oder Licht bestimmter
Wellenlängen die Krankheit negativ beeinflussen. Weiterhin wird angenommen, dass virale
Infektionen während der Kindheit bei Usher-Patienten ein verfrühtes Einsetzen der
Augenerkrankung zur Folge haben könnten (KLUG, Pro Retina, pers. Komm.).
5. Diskussion 119
5.6 Elektrophysiologische Untersuchung der HsdRccHan:WIST-
Myo7Atnd Ratte
Die WIST-Myo7Atnd Ratte bot die Möglichkeit, den retinalen Phänotyp eines Tiermodells für
das Usher Syndrom mit einer Mutation in einem dem Myosin XV eng verwandten und
strukturell sehr ähnlichen Protein zu untersuchen. Bei der WIST-Ratte handelt es sich um
einen Auszuchtstamm mit einem sehr heterogenen, zur LEW-ci2 Ratte völlig verschiedenen
genetischen Hintergrund.
Die Symptomatik der WIST-Myo7Atnd Ratte, die dem Phänotyp der LEW-ci2 Ratte stark
ähnelt, wurde von SMITS et al. (2005) bereits ausführlich beschrieben. Bei Untersuchungen
des Augenhintergrundes konnten bei dieser Mutante jedoch keine retinalen Degenerationen
nachgewiesen werden. Die Abwesenheit von Melanosomen in apikalen Prozessen des
Retinalen Pigmentepithels wies jedoch auf eine Störung physiologischer Vorgänge in der
Netzhaut hin. Ähnliche pathologische Veränderungen wurden bereits von LIU et al. (1998)
bei Myo7A-defizienten Mäusen beschrieben.
Während die von SMITS et al. (2005) untersuchten WIST-Myo7Atnd Ratten ein Alter von
unter 20 Wochen aufwiesen, hatten LEW-ci2 Ratten, bei denen Degenerationen der
Photorezeptorzellen auftraten, bereits ein Alter von etwa 60 Wochen erreicht. Aus diesem
Grund sollten in einer weiteren Studie erneut WIST-Myo7Atnd Ratten elektroretinographisch
untersucht werden, die aber, analog zur Vergleichsstudie der LEW-ci2 Ratte, älter als 400
Tagen sein sollten. Diese Untersuchungen ergaben, dass auch WIST-Myo7Atnd Tiere
fortgeschrittenen Lebensalters funktionell keine retinale Symptomatik aufwiesen. Die
signifikant größeren Potentiale der Kontroll- (WT-) Tiere im skotopischen ERG können auf
den Altersunterschied zu homozygoten und heterozygoten WIST-Myo7Atnd Ratten
zurückgeführt werden (Kap. 4.4.3).
Es ist zu bedenken, dass die untersuchten WIST-Myo7Atnd Tiere nur unter den
Umweltbedingungen der MHH gehalten wurden. LEW-ci2 Ratten dieser Haltungseinheit
zeigten ebenfalls keine reduzierten Potentiale im ERG, während eine retinale Symptomatik
ausschließlich bei LEW-ci2 Ratten der TiHo-Haltung auftrat. Da WIST-Myo7Atnd Ratten aber
den Umweltbedingungen der TiHo-Haltung nicht ausgesetzt waren, konnte sich eine
Augenerkrankung möglicherweise nicht entwickeln.
Außerdem gibt es ansatzweise Parallelen zu den elektrophysiologischen Untersuchungs-
ergebnissen von LEW-ci2 Ratten. Dazu zählen weniger deutliche Potentialunterschiede
5. Diskussion 120
zwischen Kontrollen und homozygoten/heterozygoten WIST-Myo7Atnd Ratten im
photopischen ERG sowie tendenziell geringere Antworten heterozygoter Tiere im Vergleich
zu homozygoten Ratten.
5.7 Ausblick
Da bisher die Entstehung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte nicht in allen Aspekten
aufgeklärt werden konnte, sollten zur Klärung des Modellcharakters dieses Stammes weitere
Untersuchungen folgen. Besonderes Augenmerk sollte dabei auf (a) die Untersuchung von
strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Myosin XV sowie dessen
Bindungseigenschaften, (b) eine weitere Erforschung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2
Ratte einschließlich der Bedeutung von Umweltfaktoren für den Verlauf des Krankheitsbildes
sowie (c) den Einfluß des genetischen Hintergrundes auf die Auswirkungen der ci2 Mutation
gelegt werden.
Im Hinblick auf ihr phänotypisches Erscheinungsbild wäre die LEW-ci2 Ratte als Tiermodell
für eine angeborene Taubblindheit des Menschen, wie das humane Usher Syndrom, geeignet.
Allerdings ist bisher kein Zusammenhang zwischen dem bei diesem Stamm mutierten Gen
(Myo15) und hereditärer Blindheit bekannt. Zunächst sollte geklärt werden, ob und in
welchen Strukturen der Netzhaut das Myosin XV exprimiert wird. Dazu bietet sich eine in-
situ Hybridisierung histologischer Retinapräparate mit Myosin XV-spezifischen RNA-Sonden
oder eine immunhistologische Untersuchung mit spezifischen Antikörpern an. Kann eine
Expression in der Retina bestätigt werden, sollte eine Analyse der spezifischen Funktion von
Myosin XV in diesem Gewebe folgen.
In diesem Zusammenhang sollte die Bedeutung des Myosin XV im Usher Protein Interaktom
detailierter erforscht werden. Die Schwanzregion des Myosin XV bietet mit ihren
verschiedenen Domänen eine Vielzahl von Bindungsstellen, die Interaktionen mit Proteinen
des Komplexes wie dem Whirlin ermöglichen. Durch die Aufklärung dieser Strukturen und
die Entdeckung weiterer Interaktionspartner innerhalb und außerhalb des Usher Protein
Netzwerkes könnten zusätzliche Funktionen des Myosin XV erkannt werden.
Zur Analyse der Faltungseigenschaften und der Struktur des Myosin XV, die sicherlich für
die Untersuchung der Bindungseigenschaften des Proteins hilfreich wäre, könnte erneut eine
Aufreinigung des Proteins aus exprimierenden Dictyostelium d. Kulturen versucht werden. Es
5. Diskussion 121
besteht durchaus die Möglichkeit, bei einer großen Anzahl von Transfektionen einen Klon zu
erhalten, der eine ausreichende Menge des gewünschten Proteins exprimiert. Ist eine
Aufreinigung des Proteins realisierbar, kann ein Antikörper zur Hybridisierung des
Netzhautgewebes erzeugt werden. Es sollte aber berücksichtigt werden, dass die
Erfolgschancen eher gering und die Versuche mit einem erheblichen zeitlichen und
finanziellen Aufwand verbunden sind. Als Alternative zu den Immunisierungen bietet sich
eine synthetische Herstellung der Antikörper an.
Darüber hinaus ist eine weitere Untersuchung des retinalen Phänotyps der LEW-ci2 Ratte
notwendig, da zu Ursachen und Verlauf der Augenerkrankung bisher wenig bekannt ist. Der
Umweltfaktor, der neben der genetischen Komponente eine entscheidende Rolle spielt,
konnte noch nicht eindeutig identifiziert werden. Aufgrund der Vielzahl möglicher
Umweltfaktoren ist jedoch eine individuelle Untersuchung jedes einzelnen Faktors kaum
realisierbar. Es erscheint daher sinnvoll, mit einer isolierten Untersuchung der Lichtintensität
zu beginnen, da ein netzhautschädigendes Potential dieses Faktors erwiesen ist und
Unterschiede zwischen den Haltungseinheiten (TiHo, MHH) bestanden. Es sollte aber
bedacht werden, dass auch ein gleichzeitiger Einfluss von zwei oder mehreren
Umweltfaktoren für die Veränderungen am Augenhintergrund erforderlich sein könnten.
Weiterhin sollte der Frage nach dem Einfluss des genetischen Hintergrundes auf die
phänotypischen Auswirkungen der Mutation nachgegangen werden. Zu diesem Zweck sollte
ein zur LEW-ci2 Ratte congener Stamm mit einem möglichst weit entfernten genetischen
Hintergrund erzeugt und untersucht werden. Im Vorfeld gezüchtete und untersuchte Ratten
einer BN-Rückkreuzungspopulation standen für Studien im Rahmen dieser Arbeit leider nicht
mehr zur Verfügung.
Die Untersuchung der HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratte sollte unter den
Haltungsbedingungen der TiHo fortgesetzt werden, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse
mit der Symptomatik der LEW-ci2 Ratte zu gewährleisten.
6. Zusammenfassung 122
6 Zusammenfassung Nadine Held
"Strukturelle, funktionelle und genetische Untersuchung der LEW/Ztm-ci2 Ratte - ein
Tiermodell für syndromale Taubheit"
Die LEW/Ztm-ci2 Ratte, die 1991 durch eine Spontanmutation im LEW/Ztm Inzuchtstamm
entstand, ist gekennzeichnet durch neurosensorische Taubheit, lokomotorische Hyperaktivität
und vestibuläre Störungen wie Rotationsverhalten, Ataxien, Opisthotonus und
Schwimmunfähigkeit. Die Symptomatik wird durch einen nahezu vollständigen Verlust des
sensorischen Epithels im Innenohr sowie der umliegenden Ganglienzellen verursacht.
Darüber hinaus ist das Sehvermögen der LEW-ci2 Ratte eingeschränkt. Mit Hilfe einer
Kopplungsanalyse an einer Rückkreuzungspopulation wurde die ci2-Mutation auf
Chromosom 10 (RNO10q22) lokalisiert.
Ziel der vorliegenden Arbeit war in erster Linie die Charakterisierung der Mutation, die dem
veränderten Phänotyp der LEW-ci2 Ratte zugrunde liegt. Im Anschluß an die Identifikation
des betroffenen Gens sollte durch eine vergleichende Betrachtung des menschlichen Genoms
eine Verbindung zur Genetik humaner Erkrankungen geschaffen werden, um die Möglichkeit
einer Einstufung als Tiermodell für Taubblindheit zu prüfen. Des Weiteren wurde im Rahmen
dieser Arbeit eine Charakterisierung des Augenphänotyps der LEW-ci2 Ratte angestrebt.
Mit Hilfe von Sequenzierungen der Kandidatengene wurde die ci2-Mutation in der
Schwanzregion des Myosin XV-Gens lokalisiert. Den internationalen Nomenklatur-
Richtlinien folgend wird die Mutante nunmehr als LEW/Ztm-Myo15ci2 Ratte bezeichnet. Die
Punktmutation im Myo15 verursacht dabei den Austausch einer Aminosäure in einem Bereich
des Proteins, in dem sich wichtige Bindungsstellen für Protein-Protein-Interaktionen befinden.
Da eine reguläre Expression des Gens nachgewiesen wurde, musste davon ausgegangen
werden, dass die Verbindung zu Interaktionspartnern durch strukturelle Veränderungen bzw.
durch Änderung der Faltungseigenschaften des Proteins gestört sind.
Beim Menschen sind Mutationen im Myosin XV-Gen bisher nur im Zusammenhang mit
hereditärer Taubheit bekannt. Kürzlich konnte jedoch eine Verbindung zum Usher Protein
Interaktom nachgewiesen werden. In diesem makromolekularen Netzwerk sind Proteine
organisiert, die an der Entstehung des humanen Usher Syndroms beteiligt sind. Klinisch ist
6. Zusammenfassung 123
diese Erkrankung sehr variabel und kann mit kongenitaler, neurosensorischer Schwerhörigkeit
oder Taubheit, vestibulärer Dysfunktion und einem progressiven Sehverlust einhergehen, der
durch eine Retinopathia pigmentosa verursacht wird. Diese ist charakterisiert durch eine
Degeneration von Photorezeptorzellen in der Netzhaut und führt letztendlich zu vollständiger
Blindheit.
Der Augenphänotyp der LEW-ci2 Ratte wurde über eine Funktionsprüfung der Retina mittels
Elektroretinographie (ERG) sowie über eine histologische Bewertung der Netzhaut analysiert.
Erste Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine von der Art des Haltungssystems abhängige
Symptomatik der Tiere. In der folgenden Studie wurden LEW-ci2 Ratten unterschiedlicher
Haltungen sowie Kontrolltiere des Hintergrundstammes LEW elektrophysiologisch und
histopathologisch untersucht. Ergänzend dazu wurde ein Vergleich der Haltungs- und
Umweltbedingungen vorgenommen. Dadurch sollte ein möglicher Einfluss dieser Faktoren
auf die Ausprägung der retinalen Erkrankung überprüft werden.
Bei LEW-ci2 Ratten der ersten Haltung sowie bei Kontrolltieren waren weder
Einschränkungen des Sehvermögen noch degenerative Veränderungen am Augenhintergrund
nachzuweisen. Im Gegensatz dazu zeigten LEW-ci2 Ratten der zweiten Haltung einen mittel-
bis hochgradigen Funktionsverlust der Photorezeptoren im ERG sowie eine starke
Degeneration dieser Zellen, die teilweise zu einem vollständigen Verlust der äußeren Retina
bei unverändertem Retinalen Pigmentepithel führte. Diese Symptomatik zeigt Parallelen zum
humanen Usher Syndrom.
Neben der Untersuchung des Augenphänotyps der LEW-ci2 Ratte wurden in der
Vergleichsstudie zusätzlich die Umwelt- und Haltungsbedingungen der beiden Tierhaltungen
gegenübergestellt. Unterschiede in Verhalten und Gewicht konnten auf verschiedene
Haltungsbedingungen (Einzel- vs. Gruppenhaltung) zurückgeführt werden. Diese stehen
ebenso wie die lediglich geringgradigen Differenzen der Umweltbedingungen beider
Haltungssystemen in keinem Zusammenhang mit den hochgradigen Veränderungen, die am
Augenhintergrund von LEW-ci2 Ratten der zweiten Tierhaltung vorlagen.
Da die retinale Symptomatik bei LEW-ci2 Ratten abhängig vom Haltungssystem auftrat oder
fehlte und da sowohl homozygote als auch heterozygote Tiere betroffen waren, obwohl der
vestibulo-cochleäre Phänotyp autosomal rezessiv vererbt wird, müssen Umweltfaktoren an
der Entstehung der Augenerkrankung beteiligt sein. Parallel gehaltene Kontrolltiere zeigten
jedoch keine Symptomatik. Es ist also davon auszugehen, dass ein genetischer Defekt (ci2-
Mutation) zugrundeliegt, der in Verbindung mit einem bisher unbekannten Umweltfaktor den
Augenphänotyp bei LEW-ci2 Tieren verursacht.
6. Zusammenfassung 124
Trotz der Nähe zum Usher Protein Interaktom ist die Bedeutung des von der ci2-Mutation
betroffenen Myosin XV im Zusammenhang mit dem humanen Usher Syndrom bisher nicht
geklärt und sollte eingehend untersucht werden.
Die LEW-ci2 Ratte ist nach wie vor für die Erforschung von syndromaler Taubheit beim
Menschen geeignet. Ob die Mutante zusätzlich als Tiermodell für Taubblindheit eingesetzt
werden kann und welche Rolle die genetische Komponente bzw. die Umweltfaktoren bei der
Ausprägung der retinalen Symptomatik spielen, muss weiter untersucht werden.
7. Summary 125
7 Summary Nadine Held
Structural, functional and genetic analysis of the LEW/Ztm-ci2 rat - an animal model
for syndromal deafness
The LEW/Ztm-ci2 rat arose through a spontaneous mutation in the LEW/Ztm inbred strain in
1991. Homozygous mutants exhibit hereditary sensorineural deafness, locomotor
hyperactivity and vestibular dysfunctions such as circling behaviour, ataxia, opisthotonus and
an inability to swim. The symptoms are caused by a virtually complete loss of the cochlear
neuroepithelium and the surrounding ganglion cells. Furthermore LEW-ci2 rats display
restricted visual capability. The ci2-mutation was mapped to chromosome 10 (RNO10) by a
linkage analysis of a backcross population.
The primary aim of this study was to characterize the mutation that underlies the deviant
phenotype of the LEW-ci2 rat. After identifying the affected gene, a comparative study of the
human genome was carried out to establish a link between the ci2-mutation and the genetics
of human diseases with the objective to evaluate the LEW-ci2 rat as an animal model for
deafblindness. Another aim of this thesis was the characterization of the eye phenotype of the
LEW-ci2 rat.
By sequencing the candidate genes the ci2-mutation could be localized in the tail of the
myosin XV-gene. The point mutation in Myo15 causes the substitution of an amino acid in a
region of the protein that contains important binding sites for protein-protein interactions.
Since a regular expression of Myo15 was found in LEW-ci2 rats it was assumed that the
interaction between the myosin XV and other proteins was disturbed as a result of structural
changes or changes in the folding features of the protein.
Mutations in the myosin XV gene in humans are only known to be linked to hereditary
deafness. However, a connection to the Usher Protein Interactom has recently been found.
This macromolecular network is composed by proteins that are involved in the human Usher
Syndrome. This disease exhibits a broad clinical variety and may be accompanied by
congenital, sensorineural hardness of hearing or deafness, vestibular dysfunctions and a
progressive loss of the visual capability. The latter is caused by a Retinopathia pigmentosa
7. Summary 126
which is characterized by a degeneration of photoreceptor cells in the retina and eventually
leads to blindness.
The eye phenotype of the LEW-ci2 rat was analysed by a functional examination of the retina
using electroretinography (ERG) as well as histological evaluations of bulbi slides. First
investigations indicated a pathology that is linked to the type of housing system. In a
subsequent study LEW-ci2 rats kept under various housing conditions as well as control
animals of the coisogenic strain LEW were examined electrophysiologically and
histologically in a comparitive manner. In addition, environmental and housing conditions of
different animal rooms were compared. The aim was to prove the possible influence of those
factors on the development of the retinal disease. Interestingly, the LEW-ci2 rats housed in
the first unit and the controls exhibited an unaffected vision and no degenerative changes in
the eyeground. The mutants of the second unit on the other hand showed moderate to severe
loss in photoreceptor function caused by a severe degeneration of these cells which partially
lead to a complete loss of the outer retina whilst the Retinal Pigment Epithelium remained
unaltered. This pathology shows an analogy to the human Usher Syndrome.
In addition to the examination of the eye phenotype of the LEW-ci2 rat the environmental and
housing conditions of both animal rooms were examined in a comparative study. Differences
in behaviour and weight of animals that were detected were attributed to the differing housing
conditions. These differences as well as the slight differences of environmental condition of
both units could not be associated with the severe changes of the eyeground of the LEW-ci2
rats of the second unit. Since the retinal phenotype of the LEW-ci2 rat depends on the housing
system and homozygous as well as heterozygous LEW-ci2 rats were affected despite the fact
that the mode of inheritance of the vestibulo-chochlear phenotype is autosomal recessive,
environmental factors have to be involved in the origin of the eye disease. However control
animals that were housed parallel to the LEW-ci2 rats did not show any symptoms. Therefore
it is assumed that a genetic defect (ci2 mutation) in combination with an unknown
environmental factor has caused the eye phenotype of LEW-ci2 rats.
In spite of the closeness to the Usher Protein Interactome the importance of the Myosin XV in
connection with the human Usher Syndrome has so far not been clarified. Thus, additional
investigations have to be carried out.
The LEW-ci2 rat is however still qualified to be used as a research model for syndromale
deafness of humans. Further research have to be done to find out wheather the mutant strain
can additionally be used as an animal model for deafblindness and and to investigate the role
of genetic as well as environmental factors during the development of the eye disease.
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9. Anhang I, Material & Methoden 157
9 Anhang I, Material & Methoden
9.1 Materialien, Programme und Bezugsquellen; Internet-Adressen
9.1.1 Materialien
Chemikalien
Acrylamid AppliChem
Agar Bacteriological OXOID
AP Alkalische Phosphatase
APS Serva, Heidelberg
ATP Sigma
dATP Sigma
Bacto Yeast Extract Becton, Dickenson & Co
BigDYE Applied Biosystems
Borsäure (89mM) Roth, Karlsruhe
Bromphenol Blau Sigma
Comassie Brilliant Blue G 250 Serva, Heidelberg
Comassie Brilliant Blue R 250 Serva, Heidelberg
CaCl2.H2O Merck, Darmstadt
CaCl2.2H2O Fluka
DTT Merck, Darmstadt; Fluka
EDTA (2mM) Roth, Karlsruhe
EDTA (TitriplexII) Merck, Darmstadt
EGTA (TitriplexVI) Merck, Darmstadt
Essigsäure 100% J.T.Baker
Ethanol absolut J.T.Baker
Formaldehyd reinst, mind. 35% Merck, Darmstadt
Formamid reinst Merck, Darmstadt
Glucose Sigma
Glutaraldehyd, 25% Serva, Heidelberg
9. Anhang I, Material & Methoden 158
Glycerin Merck, Darmstadt
Glycerin (99%) Serva, Heidelberg
IPTG Sigma
KH2PO4 Merck, Darmstadt
Leupeptin Sigma
2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
MES Sigma
Methanol 100% J.T.Baker
MgCl2-Lösung (25mM) Peqlab Biotechnologie, Erlangen
MgCl2.6H2O Merck, Darmstadt
MOPS Roth, Karlsruhe
Natriumacetat Roth, Karlsruhe
NaCl Aldrich
NaH2PO4.2H2O Fluka
Pepstatin A Sigma
Pepton Serva, Heidelberg
o-Phenantrolin.H2O Sigma
Phosphatpuffer, 100 mM Merck, Darmstadt
PMSF Sigma
Proteose Peptone Becton, Dickenson & Co
RNase AWAY Roth, Karlsruhe
SDS Merck, Darmstadt
Sucrose Sigma
TAME Fluka
TEMED Merck, Darmstadt
TPCK Sigma
Tris Merck, Darmstadt; AppliChem
Tris(hydroxymethyl) Roth, Karlsruhe
Triton-X 100 Merck, Darmstadt
Tween-20 Merck, Darmstadt
Xgal Fermentas
9. Anhang I, Material & Methoden 159
Geräte
Automated Gel Stainer Pharmacia Biotech
Digital Lux Meter, RO-1332 roline
Digitalkamera DC 120 Zoom Kodak, Rochester (N.Y.), USA
Dunkelschrank Forschungswerkstätten der Medizinischen
Hochschule Hannover
Elektrophoresekammer Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule
Hannover
Elektroporator, Gene Pulser Xcell
Electroporation System Bio-Rad
Ganzfeldkugel Roland Consult, Brandenburg/ Wiesbaden
Magnetrührer IKA® RH-KT/C Omnilab
Magnetrührer MR 2002 Heildolph, Schwabach
Mikrowelle R-330A Sharp (Europe), Hamburg
Mikroskop CK2 Olympus
Minishaker IKA® IKA Laboratory Equipment, Wilmington, NC,
USA
Netzgerät PP2200 Biometra, Göttingen
Netzgerät Desatronic Desaga, Heidelberg
Netzgerät MBP 3000 EP IBI
Opticon Real Time Cycler MJ Research, USA
pH-Meter Calimatic 761 Jürgens
Photometer:
DU 800 Spectrophotometer Beckman Coulter
GeneQuant II Pharmacia Biotech, Cambridge, UK
Rotlichtlampe
dark room lamp (E27PF712E) Philips
SDS PAA-Gel- Dokumentation:
Chemidoc Bio-Rad
SDS PAGE Apparatur:
Mini-Protean Bio-Rad
Thermocycler "GeneAmp9700" Applied Biosystems
Thermocycler "Opticon" MJ Research, Watertown (Ma), USA
9. Anhang I, Material & Methoden 160
Thermocycler PTC-200 MJ Research, Watertown (Ma), USA
Thermomixer 5436 Firma Eppendorf-Nethler-Hinz, Hamburg
UV-Transilluminator 312 nm Bachofer, Reutlingen
Vortexer Vibrofix VF1 Janke&Kunkel, Staufen
Zentrifugen und Rotoren:
Avanti Centrifuge J-20 XP Beckman Coulter
Rotoren: -JLA 16.250
-JA 25.50
Biofuge fresco Heraeus Instruments, Osterode
Biofuge pico Heraeus Instruments, Osterode
Verbrauchsmaterialien
Agarosen:
NuSieve Agarose Cambrex Bioscience, Rockland, ME, USA
SeaKem® LE Agarose Cambrex Bioscience, Rockland, ME, USA
Antibiotika:
Ampicillin Serva, Heidelberg
Penicillin G 10000 U/ml +
Streptomycin 10000 µg/ml GIBCO
G418 Sulfat (Geneticin) Calbiochem
Aqua dest. (steril) Eigenproduktion
Bacillol® AF Bode Chemie, Hamburg
Dstroy-Sticks Biozym, Hessisch Oldendorf
Elektroden:
Subdermal Nadelelektroden Roland Consult, Brandenburg/ Wiesbaden
Ringelektroden, Gold Roland Consult, Brandenburg/ Wiesbaden
Enzyme:
Calf Intestine Alcaline
Phosphatase 1U/µl Boehringer-Mannheim
EcoRI Fermentas
NheI Fermentas
XhoI Fermentas
Ethidiumbromidlösung Serva, Heidelberg
9. Anhang I, Material & Methoden 161
(10 mg/ml)
Falcon tubes (15 ml, 50ml) Sarstedt (greiner bio-one)
Gel Star (10000fach konz.) Biozym, Hessisch Oldendorf
Gene Pulser Cuvettes 0,4 cm Bio-Rad
Histoform S Heraeus Kulzer, Wehrheim
Low-Profile Mikrotiterplatten ABgene, Hamburg
Makrolon® -Käfige
Marker:
DNA-Standardgrößenmarker Roche, Basel, CH
(DNA Molecular Weight
Marker XIV, 100 base pair lader)
Page Ruler Protein Ladder US Biological
10-200 kDa
Medikamente:
Narkotika
Ketamin-Gräub® (Ketamin, 10%) Albrecht, Aulendorf
Rompun® (Xylazin, 2%) Bayer, Leverkusen
Mydriatika
Mydriatikum Stulln® (Tropicamid) Pharma Stulln
Neosynephrin POS® (10%) Ursapharm, Saarbrücken
(Phenylephrinhydrochlorid)
Lokalanästhetika
Proparacain POS® Ursapharm, Saarbrücken
(Proxymetacainhydrochlorid, 0,5%) Tränenersatz/Kornealschutz
Thilo Tears Gel Alcon Pharma GmbH, Freiburg
Mikroorganismen:
E. coli xL-1 Blue, K12
Dictyostelium discoideum AX3-Orf+-Zellen (Manstein et al., 1989)
Mikrotiterplatten, 96er Roth, Karlsruhe
dNTP-Gemisch Peqlab Biotechnologie, Erlangen
Nunclon Delta Surface 24-well-Platten Nunc
Oligo(dT)12-18Primer (20mM) Invitrogen
Omniskript RT 4U/µl Qiagen, Hilden
9. Anhang I, Material & Methoden 162
Orange G Sigma, St. Louis (Mo), USA
Pipetten:
Pipetten Eppendorf, Köln
Pipetten (1-1000µl) Gilson
Pipetten (5,10,25ml) Sarstedt
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht
Plasmide:
pM 765-TEV (5µg/ml) Eigenherstellung, BPC, MHH
Polymerasen:
AmpliTaq Gold® Applied Biosystems, Roche, New Jersey, USA
Phusion High-Fidelity Polym. Finnzymes, Finnland
Taq Polymerase 5U/µl Biotherm
Primer Roth, Karlsruhe
Puffer:
buffer O Fermentas
2.5x dilution buffer Applied Biosystems
10xReaktionspuffer Y Peqlab Biotechnologie, Erlangen
Tango Fermentas
Reaktionsgefäße Eppendorf, Köln
Sarstedt
RNasin® Ribonuklease Inhibitor Promega, Madison, WI, USA
Sybr Green I Biozym, Hess. Oldendorf
Technovit 7100 Heraeus Kulzer, Wehrheim
Tissue Culture Dish 100x20mm Sarstedt
9. Anhang I, Material & Methoden 163
Puffer und Lösungen
Puffer für die Elektrophorese
Ladepuffer 30% Glyzerin
0,05% Orange G
dH2O
10xTBE (pH 8.3) 89 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
89 mM Borsäure
2 mM EDTA
10xMOPS (pH 7.0) 1 mM MOPS
40 mM Natriumacetat
5 mM EDTA
Puffer und Lösungen für proteinbiochemische Arbeiten
100xProtease-Inhibitor Mix I 10 mg/ml TAME
8 mg/ml TPCK
0.2 mg/ml Pepstatin A
0.5 mg/ml Leupeptin
in Ethanol abs.
100xProtease-Inhibitor Mix II 200 mM o-Phenantrolin
100 mM PMSF
in Ethanol abs.
Lysispuffer 50 mM Tris/HCl pH 8.0
2.5 mM EDTA
0.2 mM EGTA
9. Anhang I, Material & Methoden 164
Lysispuffer 1 Lysispuffer
6 U/ml AP
10 µl/ml Protease-Inhibitor Mix I
(frisch hinzufügen)
1 µl/ml Protease-Inhibitor Mix II
(frisch hinzufügen)
Lysispuffer 2 Lysispuffer
1% v/v Triton-X100
Protease-Inhibitor Mix I (frisch hinzufügen)
Protease-Inhibitor Mix II (frisch hinzufügen)
Lysispuffer 3 Lysispuffer
12 mM MgCl2
10 mM ATP (frisch hinzufügen)
Protease-Inhibitor Mix I (frisch hinzufügen)
Protease-Inhibitor Mix II (frisch hinzufügen)
Thrombinpuffer 25 mM Tris/HCl (pH 7.0)
25 mM NaCl
2.5 mM CaCl2
SDS-PAA Sammelgelpuffer 1 M Tris/HCl (pH 6.8)
SDS-PAA Trenngelpuffer 1.5 M Tris/HCl (pH 8.8)
6xProteinauftragspuffer 350 mM Tris (pH 6.8)
36% Glycerin
600 mM DTT
10% SDS
0.01% Bromphenol Blau
9. Anhang I, Material & Methoden 165
10x Laufpuffer (nach Lämmli) 30.2 g Tris
142.6 g Glycerin
1% SDS
Coomassie Blue-Färbelösung 2 g Coomassie Brilliant Blue G 250
0.5 g Coomassie Brilliant Blue R 250
426 ml Ethanol 95%
50 ml Methanol 100%
100 ml Essigsäure 100%
ad 1l H2O
Puffer für Arbeiten mit Dictyostelium discoideum
Elektroporationspuffer 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6.1)
(DD-EP Buffer) 50 mM Sucrose
MES-Puffer 20 mM MES (pH 6.8)
0,2 mM CaCl2
2 mM MgCl2
Fixationslösung für die Histologie
5%ige Glutaraldehydlösung 20 ml Glutaraldehyd (25%ig)
80 ml Phosphatpuffer (100 mM)
Phosphatpuffer (pH 7.2-7.4) 75 mM Na2HPO4
25 mM KH2PO4
dH2O
9. Anhang I, Material & Methoden 166
Medien und Nährböden
Luria Bertani-Kulturmedium (LB) 1% (w/v) Pepton
für E.coli (pH 7.0) 1% (w/v) Hefeextrakt
0,5% (w/v) NaCl
evtl. 100 mg/l Ampicillin
HL-5c Medium (pH 6.6) 10 g/l Proteose Peptone
5 g/l Bacto Yeast Extract
10 g/l Glucose
1.2 g/l KH2PO4
0.4 g/l Na2HPO4
frisch zusetzen:
Penicillin/Streptomycin 2 µl/ml (P/S)
G418 Sulfat 10 µg/ml (G10)
LBAmp-Agar (pH 7.0) 1% (w/v) Pepton
1% (w/v) Hefeextrakt
0,5% (w/v) NaCl
2% Agar Bacteriological
75 mg/l Ampicillin
MES-Agar 20 mM MES
0,2 mM CaCl2
2 mM MgCl2
2% Agar Bacteriological
Kits
NucleoSpin® Extract Kit Macherey-Nagel, Düren, D
NucleoSpin® RNAII Macherey-Nagel, Düren, D
NucleoSpin Tissue Kit Macherey-Nagel, Düren, D
pGEM®-T Easy Vector System I Promega, Madison, WI, USA
9. Anhang I, Material & Methoden 167
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, D
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden, D
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, D
RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit Qiagen, Hilden, D
Super Signal Dura West Extended
Duration Substrate PIERCE
9.1.2 Programme
Clone Manager Scientific & Educational Software (1999),
Version 5.20
Oligo 6.0 Molecular Biology Insights, Cascade (Co), USA
PolyPhen
Qgene http://www.qgene.com
RetiSystem Roland Consult, Brandenburg/Wiesbaden
SIFT http://blocks.fhcrc.org.sift/SIFT.html
9.1.3 world-wide-web-Adressen
http://www.rgd.mcw.edu (Rat Genome Database)
http://www.informatics.jax.org (Jackson Laboratories Genome Informatics)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (National Center for Biotechnology Information)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html (NCBI,Rat Genome Blast)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html (NCBI, Blast 2 Sequences)
http://www.ensembl.org/ (Ensembl Genome Server)
http://www.ucsc.edu/ (UCSC Genome Bioinformatics)
http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-util/seq-util.html (BCM Search Launcher)
http://www.ensembl.org/Rattus_norwegicus/geneview/ (Ensembl Geneview)
http://smart.embl-heidelberg.de (Simple Modular Architecture Research Tool)
http://www.expasy.org (ExPASy Proteomics Server)
http://www.fermentas.com/doubledigest/index.html (Fermentas, Double Digest)
http://www.expasy.org/tools/dna.html (ExPASy Translate Tool)
9. Anhang I, Material & Methoden 168
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html (REBASE Homepage)
http://www.sanger.ac.uk (Sanger Institute, Genome Research)
http://www.sanger.ac.uk/software/pfam/ (Pfam - Sanger)
http://limstill.niob.knaw.nl (LIMSTILL)
9. Anhang I, Material & Methoden 169
9.2 Methoden
9.2.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure
9.2.1.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure mit dem NucleoSpin® Tissue Kit
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Prä-Lysispuffer T1
Lysispuffer B3
Waschpuffer BW
Waschpuffer B5
Elutionspuffer BE
Proteinase K Lösung
NucleoSpin® Tissue Säulen
25 mg Gewebe wurden mit 180 µl Pre-Lysispuffer versetzt und mit einer sterilen Schere
zerkleinert. Nach Zugabe von 25 µl Proteinase K-Lösung wurde der Ansatz für etwa 15 sek
gemischt (Vortexer) und 1 bis 3 Stunden bei 56°C in einem Thermoschüttler inkubiert.
Anschließend wurden 200 µl eines Lysispuffers hinzugefügt, die Probe erneut gut
durchmischt und für 10 min bei 70°C inkubiert. Es folgten die Abtrennung ungelöster
Gewebe- und Zellreste durch Zentrifugation. Anschließend wurde der Probenüberstand mit
96%igem Ethanol gemischt und die Lösung auf eine Silicium-Gelmembran-Säule
aufgetragen. Nach Zentrifugation folgten zwei Waschschritte der an die Säule gebundenen
DNA mit anschließender Zentrifugation, um restliche Verunreinigungen zu entfernen. Nach
Trocknung der Säule erfolgte die Elution der DNA mit 100 µl eines auf 70°C vorgewärmten
Elutionspuffers.
9. Anhang I, Material & Methoden 170
9.2.1.2 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Leber und Milz mit dem NucleoSpin®
RNAII Kit
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Zelllysis-Puffer (RA1)
RA1
ß-Mercaptoethanol
Ethanol
DNase Reaktionsmischung
rekonstituierte DNase I
DNase-Reaktionspuffer
Waschpuffer RA2 und RA3
RNase-freies Wasser
NucleoSpin® Säulen
NucleoSpin® RNAII Säulen
Collecting Tubes
Maximal 30 mg Gewebe wurden mittels Mikropistille homogenisiert und mit 350 µl RA1
Puffer sowie 3,5 µl Mercaptoethanol kräftig durchmischt. Die Suspension wurde auf die
NucleoSpin Säule geladen und für 1 min zentrifugiert. Die Filtereinheit wurde verworfen und
zu dem Durchfluß wurden 350 µl 70%iges Ethanol hinzugefügt. Nach gründlichem Vortexen
folgte die Überführung des Gemisches auf eine NucleoSpin® RNAII Säule und eine
Zentrifugation für 30 sek. Nach Plazierung in einem sauberen Collecting Tube wurden 350 µl
MDB auf die Säule gegeben und wiederum für eine Minute zentrifugiert. Für den Verdau
unerwünschter DNA-Bestandteile wurde ein DNase Reaktionsmix wie folgt vorbereitet:
pro Isolation 10 µl DNase I
90 µl DNase Reaktionspuffer
95 µl dieses Reaktionsgemisches wurden direkt auf die Membranmitte appliziert. Es folgte
ein 15 minütiger Inkubationsschritt bei RT.
9. Anhang I, Material & Methoden 171
Im Anschluß folgten drei Waschschritte:
Waschen der Säule
Schritt Menge Puffer Zentrifugation
1 200 µl RA2 30 sek
2 600 µl RA3 30 sek
3 250 µl RA3 2 min
Nach der zweiten Zentrifugation musste der Durchfluß verworfen werden, um die Säule im
dritten Schritt ausreichend zu trocknen. Im Anschluß wurde die Säule in ein Nuklease-freies
Reaktionsgefäß (1,5 ml) überführt und 60 µl RNase freies Wasser auf das Zentrum der
Membran appliziert. Durch eine einminütiger Zentrifugation wurde die RNA eluiert. Zur
Konzentrationsbestimmung mittels Photometer wurde eine 1:70 Verdünnung angefertigt. Die
Lagerung der RNA erfolgte bei -80°C.
9.2.1.3 Isolierung von Ribonukleinsäure aus Gehirn und Hypophyse mit dem RNeasy®
Lipid Tissue Mini Kit
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: RNeasy Mini Spin Säulen
Collection Tubes (1,5 ml)
Collection Tubes (2 ml)
QIAzol Lysisreagenz
Puffer RW1
Puffer RPE
RNase-freies Wasser
Zur Aufarbeitung von RNA wurden max. 100 mg Hirngewebe bzw. zwei Hypophysen
benötigt. Zu dem bei -80°C gelagerten, tiefgefrorenen Gewebe wurden 1 ml QIAzol
Lysisreagenz gegeben und unverzüglich mit einer Mikropistille homogenisiert. Nach einer
Inkubation von 5 min bei RT wurden 200 µl Chloroform hinzugefügt und die gesamte
Suspension ca. 15 sek gemischt (mittels Vortexer). Die dabei entstandene wässrige Phase
wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol versetzt. Maximal 700 µl dieser Suspension wurden auf
eine RNeasy Mini Spin Säule überführt und ca. 15 sek bei RT zentrifugiert. Der Duchfluß
wurde verworfen und in einem zweiten Schritt der Rest der Probe ebenfalls über die Säule
9. Anhang I, Material & Methoden 172
gebunden. Es folgten die Zugabe von 700 µl RW1 Puffer und ein 15 sek andauernder
Zentrifugationsschritt. Zu der in einem neuen Collection Tube plazierten Säule wurden 500 µl
RPE Puffer hinzugefügt, 15 sek zentrifugiert, der Durchfluß verworfen und die Säule
abermals mit 500 µl RPE Puffer gefüllt. Nach der folgenden zweiminütigen Zentrifugation
wurde die Säule in einem neuen Reaktionsgefäß (1,5 ml) plaziert und für eine Minute bei
voller Leistung trocken zentrifugiert. Die Elution der RNA erfolgte mit 30-50 µl RNase-
freiem Wasser durch einminütige Zentrifugation.
Die Reinheit der aufgearbeiteten RNA wurde mithilfe eines denaturierenden Kontrollgels
(Kap. 3.3.2) überprüft. Es folgte eine photometrische Konzentrationsbestimmung. Die
Endkonzentration, die je nach Protokoll der anschließenden Versuchsmethode variieren
konnte, wurde durch Verdünnung mit RNase freiem Wasser eingestellt. Die Lagerung der
isolierten RNA erfolgte bei -80°C.
9.2.2 PCR - Primersequenzen
9.2.2.1 Entwicklung von Primern
Die für die Entwicklung der Primer erforderlichen Gensequenzen wurden folgenden
Programmen des world wide web entnommen:
http://www.genome.ucsc.edu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.ensembl.org/
Mit Hilfe des Oligo 6.0 Programmes wurden passende Sequenzen zur Eingrenzung der
entsprechenen Genabschnitte entwickelt. Die Konstruktion der Primer für die Sequenzierung
erfolgte mit dem Programm LIMSTILL (http://limstill.niob.knaw.nl).
9. Anhang I, Material & Methoden 173
9.2.2.2 Herstellen der Primerlösungen
Die als Lyophilisat gelieferten Primer wurden nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest.
rekonstituiert, um eine 100 µM Stammlösung zu erhalten. Daraus wurden Aliqots einer 6,7
µM bzw. 13,4 µM Gebrauchslösung hergestellt, die bei 4°C gelagert wurden. Die Lagerung
der Stammlösung erfolgte bei -20°C.
9.2.2.3 Primer für die Genotypisierung der HsdRccHan:WIST-Myo7ATnd Ratte
Gen
Name des Primers
Sequenz des Primers
Myo7A M7A Ex3 fw 5´>TACACGGGTTCCATCCTGG<3´
M7A Ex3 rev 5´>CGGTTGTTGCGTTTCATGT<3´
9. Anhang I, Material & Methoden 174
9.2.2.4 Primer für die Sequenzanalysen der Kandidatengene
Primer für das Kandidatengen Myo15
Primer
Primerposition Vorwärtsprimer
(forward)
Rückwärtsprimer
(backward/reverse)
Exon 1-a 5´>CCTGAACCTGTGACACCTG<3´ 5´>CGGAGGAGTGATGCTGTG<3´
Exon 1-b 5´>CCAAGAAGTTCCTCCTCAAG<3´ 5´>TCATGTGGAAAGTCATAGGG<3´
Exon 1-c 5´>GGGTATTCATCTCCATACAGC<3´ 5´>TCCAGTAAGGGTGGGTGTAG<3´
Exon 1-d 5´>TGGGAAAGAGAAGCTAGAGG<3´ 5´>ACCATAGGGTGAGCTGTAGG<3´
Exon 1-e 5´>CACTGGAGTGCTCTCATCTC<3´ 5´>CTTCACAGCTCTGGTAGGTG<3´
Exon 1-f 5´>CTCTCTACATCGAACCTCTGG<3´ 5´>AGGTGTGTTCAGGGTCTCAG<3´
Exon 1-g 5´>GACCAAGCCTCCAATTTAAC<3´ 5´>GCTACCTCCTGTTCTGGTTC<3´
Exon 2 5´>TCTCTGACAATGGGAGCAG<3´ 5´>TGGATAGCCCAGCACTAAAG<3´
Exon 3 5´>CCATGTCAAGTAGGGTGGAG<3´ 5´>CTCCATCTTTCCGACTATCC<3´
Exon 4/5 5´>GGGACTCCTTACTCGAGAGC<3´ 5´>GTCTGGATGCAAACCTACG<3´
Exon 5/6 5´>AGTCTTGGGACTGTGGAAAC<3´ 5´>AGGGATCCTAAGGAAACAGG<3´
Exon 7/8 5´>AGGGAAGGCCTCTGTTTG<3´ 5´>TAGGTTTGTTCAACCCAAAG<3´
Exon 9 5´>AACCTGGATAAGTGCCTGAG<3´ 5´>CTCTATGGAGGCCTGATGTC<3´
Exon 10 5´>TCTCAGAACCTCCTGGAAAG<3´ 5´>CGTGTGACAGAGAGGAAGTG<3´
Exon 11 5´>AACTCAGCCCAGTGGTTTAG<3´ 5´>TGGCCTGGAGGAATAG<3´
Exon 12/13 5´>TATCTCCAGTGTCCCTCTCC<3´ 5´>TGGACAGCTTCCCAAGAG<3´
Exon 14 5´>TAGTGAGGACAGATGGGTTG<3´ 5´>ACTGTCTTCTCCGTGTCTCC<3´
Exon 15 5´>AGACAGGACACAGAGATAGGC<3´ 5´>CTTCCACCTCAGTCACTCC<3´
Exon 16 5´>GCTGAAGAATTTGGCACTG<3´ 5´>CACACTGTGGTTCTGTCTCC<3´
Exon 17 5´>ACAGGTGTGGGTGAGTGG<3´ 5´>CACTGCCAGGAATGTGG<3´
Exon 18/19 5´>TGACCCTTTCCCTGTCTG<3´ 5´>GCCACTTGTCCAATGTCAC<3´
Exon 19/20 5´>GGGTCGAGTACCCACTCTC<3´ 5´>AACAACATTGCACGACAGAC<3´
Exon 21/22 5´>TGAGGAGTGTTGTGAGCAAG<3´ 5´>GAGCCTAGGTTCCTCCAAG<3´
Exon 23 5´>CCAGGGTGAAATAGGATCAG<3´ 5´>GCAGGGACTGGTAATTGAG<3´
Exon 24/25/26 5´>ACAGGCCCTTCCCTACTG<3´ 5´>TGGCAGGGTCTGAGTGTC<3´
Exon 27 5´>ACCCAGATATGTCTGTTGTCC<3´ 5´>TGGCCTGGTATTATGGTAGG<3´
9. Anhang I, Material & Methoden 175
Exon 28 5´>CATGACAAGAGAGCATGTGG<3´ 5´>CCTGACCTCTGAACTCCAAG<3´
Exon 29/30 5´>TGTTCCACTTCACCTTAGAGC<3´ 5´>CCCTCCTTTCCAGGTCATAG<3´
Exon 30/31 5´>AGGCTGGCCTGAAGATG<3´ 5´>AGGTCCAATTAGGCTCAAACC<3´
Exon 32/33 5´>TTTATGGAAGCTACCCAACC<3´ 5´>TCTCTGGTACACACACTGAGTC<3´
Exon 34/35/36 5´>TGGTTCATTTCTTGTGGAAG<3´ 5´>TCCTGGCTTCAGAGAGAGAC<3´
Exon 37/38 5´>GCCTGAGTGTAAGCCAGTATG<3´ 5´>GGTGAGCCCAGTACTTGTTG<3´
Exon 39/40 5´>GGTGCTTGTTTGTATTGGTG<3´ 5´>TCACAGGCTCACTCACTCAC<3´
Exon 41/42 5´>ACCTTCTATCACCACCATCC<3´ 5´>AGCAACTCTCAAACCCACAG<3´
Exon 43 5´>ACATGGACCTTGGTGTCTG<3´ 5´>TGTTTCCTTAGCCTTTCGTC<3´
Exon 44/45 5´>CCCAACTCCTTGAATGTGAG<3´ 5´>CAGAGGAGCACAGTAAGCTG<3´
Exon 46 5´>GAGCATCTTCTTAGCCATGAG<3´ 5´>GGCTGTGGTATATCTGTATTGC<3´
Exon 47/48 5´>TGCAAGCCTCTGGAGTAAAG<3´ 5´>GTTGGAACCTGGACTAGCAC<3´
Exon 49 5´>TTAAAGGAACCCGCTCTATC<3´ 5´>ATTGGCTGCACAGTTGG<3´
Exon 50/51 5´>AGGGAGGTCATCTTTCACAG<3´ 5´>GAAGGTTTCTGCAACACCAC<3´
Exon 52/53 5´>GAGGGCATGGTGCAGTC<3´ 5´>CAAGGCACAGAGCAAGAAG<3´
Exon 54 5´>AGGAATGAATGTATCCTGCTG<3´ 5´>TGAGATGAGGGAGTGAACG<3´
Exon 55 5´>AGCCTGTGTCCACCTCTATG<3´ 5´>GTGTATCAATTCGGCACCAG<3´
Exon 56/57 5´>GTGGCTGAGGTAAGAGGAAC<3´ 5´>CCAGAGCCTGGTATCCCTAC<3´
Exon 58 5´>TCCTATGCCTCTTGGTTAGTG<3´ 5´>GACGTTGAGGCATGAAAGAG<3´
Exon 59 5´>CAGTCTGGTGCTGTGTGTG<3´ 5´>CATGGCGTGTGTAGGTTG<3´
Exon 60 5´>CCAGGTGTGCTGCTGTC<3´ 5´>TCAGCAATTGTGAGATAAGAGG<3´
Exon 61 5´>GTCATGCCTACTTTGCAGTG<3´ 5´>GCCATTCTCAGCTTAGCTTC<3´
Exon 62 5´>CAGTGGCTGTCCTGTTGTC<3´ 5´>AGAGAGGTGGAATGCCAAG<3´
Exon 63 5´>GATCAGACCTGCAGGAGAAG<3´ 5´>TGAGTGCAGAATGAGAAAGC<3´
Exon 64 5´>CAGCCAAGGCTGTTACATAG<3´ 5´>GTCTAGGGTCACTGGTCCAC<3´
9. Anhang I, Material & Methoden 176
Primer für das Kandidatengen Kcnj12
Primer
Primerposition Vorwärtsprimer (forward) Rückwärtsprimer
(backward/reverse)
Exon 1 (a) 5´>TCTGTGGTGACTAAACAGAGG<3´ 5´>TCTTCAGTCACGCATCGTAG<3´
Exon 1 (b) 5´>ATCATCTTCTGGGTCATTGC<3 5´>CCTCTACCATGCCTTCCAG<3´
Exon 1 (c) 5´>GCTCTGCTCAAACACAGGTC<3 5´>TCTTCCTAGTATCGCCCATC<3
9.2.2.5 Primer für die Expressionsanalyse der Kandidatengene
Primer für das Kandidaten-Gen
Gen
Name des Primers
Sequenz des Primers
Myo15 Myo15 mRNA-2a UP 5´>ACCTGCCCAGTGTGCGTGAG<3´
Myo15 mRNA-2 LP 5´>TGGTGGGGACTGAGTGCCTG<3´
Primer für die Housekeeping-Gene*
Housekeeping-
Gen
Name des Primers
Sequenz des Primers
β-actin β-actin fw 5´>AGGCCCCTCTGAACCCTAAG<3´
β-actin rev 5´>CCAGAGGCATACAGGGACAAC<3´
HPRT HPRT fw 5´>GCGAAAGTGGAAAAGCCAAGT<3´
HPRT rev 5´>GCCACATCAACAGGACTCTTGTAG<3´
GAPDH GAPDH fw 5´>TGCCAAGTATGATGACATCAAGAAG<3´
GAPDH rev 5´>TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT<3
9. Anhang I, Material & Methoden 177
9.2.2.6 Primer für die Klonierung der MyTH4-Domäne
Name des Primers
Sequenz des Primers
MyTH4-Domäne MyTH4 fw 5´>CTCGAGGACATGCTTTGCTTCAC<3
MyTH4 rev 5´>GCTAGCTCAAGCCCCTCTATGACATCCAG<3´
9.2.2.7 Primer für die Sequenzierung
Name des Primers
Sequenz des Primers
mhc 2233c 5´>GCCACCGATGCTGTTCTCA<3´
9.2.3 PCR - Protokolle und Temperaturprofile
Alle Arbeiten zum Ansetzen einer PCR wurden auf Kühlplatten durchgeführt, um vorzeitige
Reaktionen zu minimieren. Die verwendeten Verbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen,
Reaktionsgefäße und Mikrotiterplatten wurden vor Gebrauch autoklaviert (25 min, 121°C,
121 kPa Überdruck). Die DNA wurde in Mikrotiterplatten vorgelegt. Der Ansatz des
Mastermixes, der die zur Anzahl der entsprechenden Ansätze äquivalente Menge der
restlichen Reagenzien enthielt, erfolgte in einem 1,5 ml bzw. 2 ml Reaktionsgefäß. Nach
Zugabe des Mastermixes zur vorgelegten DNA wurde unverzüglich die PCR-Reaktion
gestartet. Die Lagerung der für die PCR-Reaktionen benötigten Reagenzien erfolgte bei -
20°C, die Lagerung der Produkte der PCR-Reaktionen bei 4°C.
9. Anhang I, Material & Methoden 178
9.2.3.1 Protokoll und Temperaturprofil für die Standard-PCR zur Amplifikation
genomischer DNA-Fragmente
Protokoll:
Reagenzien
Volumina
DNA 1 µl
Aqua dest. 5,6 µl
Reaktionspuffer 1 µl
MgCl2 0,6 µl
dNTPs 1,2 µl
Primer fw 0,25 µl
Primer rev 0,25 µl
Polymerase 0,1 µl
Gesamtansatz 10 µl
Temperaturprofil:
Schritt
Temperatur
in °C
Zeitdauer
in min
1. initiale Denaturation 95 4
2. Denaturation 94 0,25
3. Annealing x* 1
35 mal:
4. Extension 72 2
5. finale Extension 72 7
6. Abkühlung 8 bis Probenentnahme
*die Annealing-Temperatur war abhängig von der spezifischen Annealing-
Temperatur des entsprechenden Primerpaares
9. Anhang I, Material & Methoden 179
9.2.3.2 Protokoll und Temperaturprofil für die Sequenzanalysen der Kandidatengene
Protokoll für die touchdown-PCR:
Reagenzien Volumina
DNA 5 µl
Aqua dest. 5,6 µl
Tricine 25 mM
Glycerol (w/v) 7 %
DMSO (w/v) 1,6%
MgCl2 2 mM
Ammoniumacetat (pH 8,7) 85 mM
dNTPs 200 µM
Primer fw 0,2 µM
Primer rev 0,2 µM
Taq Polymerase 0,2 U
Gesamtansatz 10 µl
Temperaturprofil für die touchdown- PCR:
Schritt
Temperatur
in °C
Zeitdauer
in sek
1 92 60
2 92 20
Schritt 2: 12 Zyklen
3 65 20
Senkung von 0,4°C pro Zyklus
4 72 30
5 92 20
Schritt 5: 20 Zyklen
6 58 20
7 72 30
8 72 180
9 8 for ever
9. Anhang I, Material & Methoden 180
Protokoll für die Sequenzierungsreaktion:
Reagenzien
Volumina
DNA 1 µl
BigDYE 0,25 µl
2.5 x Dilution Puffer 3,75 µl
Universal-M13-Primer 0,4 µM
dH2O x
Gesamtansatz 10 µl
Temperaturprofil für die Sequenzierungsreaktion:
Schritt
Temperatur
in °C
Zeitdauer
in sek
1 92 10
2 50 5
3 60 120
Schritt 1-3: 40 Zyklen
9.2.3.3 Protokoll und Temperaturprofil für die Reverse Transkription mit dem
Omniskript RT Kit
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: RT-Puffer
RNase Inhibitor
Reverse Transkriptase
RNase-freies Wasser
9. Anhang I, Material & Methoden 181
Reagenzien
Volumina
mRNA 9 µl
Aqua dest. 4 µl
RT-Puffer 2 µl
dNTPs (5mM) 2 µl
Oligo dT Primer (20mM) 1 µl
RNase Inhibitor ,
(1:4 Verdünnung, frisch angesetzt)
1 µl
Reverse Transkriptase 1 µl
Gesamtansatz 20µl
Temperaturprofil:
Schritt Temperatur
in °C
Zeitdauer
in min
1 37 60
2 4 bis Probenentnahme
Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.
9. Anhang I, Material & Methoden 182
9.2.3.4 Protokoll und Temperaturprofil für die Real Time PCR
Protokoll:
Reagenzien
Volumina
Endkonzentration
cDNA2 ng/µl 5 µl 10 ng
10x Biotherm Puffer
(MgCl2, 15 mM)
2,5 µl 1x
dNTPs (10mM) 0,5 µl 0,3 mM
Primer fw (10µM) 1,5 µM 600 nM
Primer rev (10 µM) 1,5 µM 600 nM
Sybr Green* 2 µl
Biotherm Taq (5U/µl) 0,2 µl 1U
dH2O (RNase frei) 11,8 µl
Gesamtansatz 25 µl
*Das Sybr Green wurde zur Aufbewahrung in DMSO (1:100) vorverdünnt
und in 5 µl Aliquots bei -20°C gelagert. Für den Reaktionsansatz wurde ein 5
µl Aliquot aufgetaut und in 245 µl TE-Puffer (3 mM TRIS-HCl pH 7.5, 0.2
mM EDTA pH 7.5 in ddH2O) gelöst.
Temperaturprofil:
Schritt
Temperatur
in °C
Zeitdauer
in min
1. initiale Denaturation 95 3
2. Denaturation 95 0, 5
3. Annealing 67,7 0,5
40 mal:
4. Extension 72 0,5
5. finale Extension 72 10
6. Abkühlung 8 bis Probenentnahme
9. Anhang I, Material & Methoden 183
9.2.3.5 Protokoll und Temperaturprofil für die Amplifikation der MyTH4-Domäne
Für die Amplifikation der MyTH4-Domäne wurde eine proof-reading Polymerase (Phusion
High Fidelity Polymerase, Finnzymes) verwendet.
Protokoll:
Reagenzien
Volumina
Template (200 ng) 1 µl
5x HF Puffer 10 µl
DMSO 1,5 µl
dNTPs 1 µl
Primer fw, 100 µM 1 µl
Primer rev, 100µM 1 µl
Polymerase 0,5 µl
Aqua dest. 34 µl
Gesamtansatz 50 µl
Temperaturprofil:
Schritt
Temperatur
in °C
Zeitdauer
in min
1. initiale Denaturation 98 0,5-1
2. Denaturation 98 1
3. Annealing 57 0,5
35 mal:
4. Extension 72 0,5
5. finale Extension 72 10
6. Abkühlung 4 bis Probenentnahme
9. Anhang I, Material & Methoden 184
9.2.4 Gelelektrophorese
9.2.4.1 Ladepuffer für die PCR-Proben
Reagenzien
Volumina/Menge
Endkonzentration
Glyzerin (99%ig) 30 ml 30% (v/v)
Orange G 0,05 g 0,05% (w/v)
dH2O (steril) 70 ml 70% (v/v)
Gesamtansatz 100 ml
Das Lösen des Farbstoffes erfolgte vor der Zugabe des Glyzerin.
9.2.4.2 Ansetzen des DNA-Längenstandards
Es wurden 650 µl des Ladepuffers auf die Stammlösung (DNA Molecular Weight Marker
XIV) gegeben.
9.2.4.3 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Herstellung der Gele wurden 3% (w/v) SeaKem® LE Agarose in 1x TBE Puffer mithilfe
eines Magnetrührers mit Wärmeplatte gelöst. Das Gemisch wurde drei Minuten in einer
Mikrowelle aufgekocht und anschließend durch ständiges Rühren auf einem Magnetrührer
abgekühlt. Bei einer Temperatur von ca. 50°C erfolgte die Zugabe von 4 µl "Gel-Star" pro
100 ml Gellösung. Es folgte die sofortige Überführung des Gemisches in 7 x 9 cm (für 50 ml
Gellösung) bis 24 x 42 cm (für 400 ml Gellösung) große Kunststoffkammern. Anschließend
wurden je nach Größe und Bedarf Gelkämme (1mm stark, bis zu 25 Zähne) eingehängt. Nach
Polymerisierung des Gels wurden die Kämme und Abdichtungen der Kammern (schmale
Seiten der Gelkammer) entfernt und die Gelkammer samt Gel in eine horizontal ausnivellierte
Elektrophoresekammer gelegt. Diese wurde bis zu einer Höhe von mindestens 3 mm oberhalb
des Gels mit 1x TBE Puffer befüllt.
9. Anhang I, Material & Methoden 185
Zusammensetzung des 10x TBE Puffers (pH 8,3):
Reagenzien
Menge
Endkonzentration
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 121 g 89 mM
Borsäure 55,5 g 89 mM
EDTA 9,3 g 2 mM
dH2O ad 1000 ml
Zu 10 µl Probe wurden je 4 µl Ladepuffer zugesetzt. In die jeweils erste Tasche einer Reihe
des Agarosegels wurden 3,5 µl des DNA-Längenstandards aufgetragen, die restlichen
Taschen wurden mit 12 µl des Proben-Ladepuffer Gemisches befüllt. Die Laufzeit der Proben
betrug abhängig von der Größe des Gels und der eingesetzten Stromstärke (50-90 mA) 30
Minuten bis drei Stunden. Die Sichtbarmachung der DNA-Fragment-Banden erfolgte unter
Zuhilfenahme von UV-Licht.
9.2.4.4 Kontrolle der RNA-Extraktion mittels denaturierender Gelelektrophorese
Zur Überprüfung der Konzentration und Reinheit der aufgearbeiteten RNA wurde ein
Kontrollgel angefertigt, auf dem die 18s und 28s Banden der mRNA unter UV-Licht sichtbar
gemacht wurden. Folgende Komponenten wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert:
Reagenzien
Volumina
Endkonzentration
RNA 6 µl
Formaldehyd 4,0 µl 6%
Formamid 12,5 µl 50%
10fach MOPS-Puffer 2,5 µl 10%
Gesamtansatz 25 µl
9. Anhang I, Material & Methoden 186
Nach einer Inkubation von 15 min bei 55°C und einer anschließenden Abkühlung auf Eis
wurden ca. 12 µl der Probe versetzt mit 3 µl Ladepuffer auf ein denaturierendes Agarosegel
folgender Zusammensetzung aufgetragen:
1,2% (w/v) Agarose
1,2% Formaldehyd
0,3 µg/ml Ethidiumbromid
in 1fach MOPS-Puffer
Die Laufzeit des Gels in 1fach MOPS-Puffer betrug ca. 1 bis 1,5 Stunde(n) bei 60 V.
9.2.5 Aufreinigung von DNA
9.2.5.1 Aufreinigung von PCR-Produkten mit dem QIAquick PCR Purification Kit
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer PB
Waschpuffer PE (Konzentrat)
Elutionspuffer EB
QIAquick Spin Säulen
Collection Tubes (2ml)
Zu je 10 µl aufzureinigendem PCR-Produkt wurden 50 µl PB Puffer zugefügt und gemischt.
Mittels Überführung der Lösung auf eine QIAquick Spin Säule und nachfolgender
Zentrifugation wurde die DNA an die Säule gebunden. Es folgten ein Waschschritt mit PE
Puffer, erneute Zentrifugation und Trocknen der Säule. Die Elution der DNA erfolgte mit 50
µl EB Puffer bzw. dH2O.
9. Anhang I, Material & Methoden 187
9.2.5.2 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen mit dem NucleoSpin®
Extract Kit
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer NT1
Puffer NT2
Waschpuffer NT3 (Konzentrat)
Elutionspuffer NE
Nucleo Spin® Extraktionssäulen
Nucleo Spin® collecting tubes
Mithilfe eines Skalpells wurde das DNA-Fragment unter Sichtbarmachung der Bande durch
UV-Licht aus dem Gel extrahiert, in ein steriles Reaktionsgefäß überführt und das
Nettogewicht bestimmt. Zu je 100 mg des ausgeschnittenen Gelfragments wurden 300 µl NT1
Puffer hinzugefügt und die Probe 5-10 min bei 50°C in einem Thermoschüttler inkubiert bis
das Gel vollständig gelöst vorlag. Anschließend wurde die Lösung auf eine Nucleo Spin®
Extraktionssäule überführt. Nach Zentrifugation folgten zwei Waschschritte mit NT3 Puffer
und anschließender Zentrifugation. Die Elution der DNA erfolte mit 35 µl NE Puffer.
9.2.6 Klonierung von PCR-Fragmenten
9.2.6.1 Erzeugung eines A-Überhangs (A-tailing)
Reaktionsansatz:
Reagenzien
Volumina
PCR-Fragment 6,7 µl
dATP, 2 mM 1 µl
MgCl2 0,3 µl
10x Reaktionspuffer 1 µl
Taq Polymerase 1 µl
Gesamtansatz 10 µl
Der Reaktionsansatz wurde für 15 bis 30 min bei 70°C in einem Thermocycler inkubiert.
9. Anhang I, Material & Methoden 188
9.2.6.2 Ligation mit dem pGEM®-T Easy Vector System I
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: pGEM®-T Easy Vektor (50 ng/µl)
Kontroll-Insert (4 ng/µl)
T4 DNA Ligase
2x Rapid Ligationspuffer
Etwa 100 bis 400 ng linearisiertes Plasmid und das zu ligierendes DNA-Fragment wurden
gemischt, mit 10 x Ligasepuffer und 2 bis 10 U Ligase versetzt. Der Ansatz wurde für 1
Stunde bei RT oder für 4 Stunden bei 4°C inkubiert.
Ligationsansatz:
Reagenzien
Standard
Positiv-
Kontrolle
Hintergrund-
Kontrolle
2x Rapid Ligationspuffer 5 µl 5 µl 5 µl
pGEM® Teasy Vektor 1 µl 1 µl 1 µl
PCR-Produkt 2 µl - -
Kontroll-Insert DNA - 2µl -
T4 DNA Ligase 1 µl 1 µl 1 µl
dH2O 1 µl 1 µl 3 µl
Gesamtansatz 10 µl 10 µl 10 µl
9. Anhang I, Material & Methoden 189
9.2.6.3 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit
(DNA-Minipräparation)
Mit diesem Kit können maximal 20 µg DNA/Probe isoliert werden.
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer P1
Lysispuffer P2
Waschpuffer N3
Puffer PE
Elutionspuffer EB
QIAprep Spin Säulen
1 ml des Selektionsansatzes wurden entnommen und für 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert.
Es folgte die Resuspension des Pellets in 250 µl RNAse-haltigem Puffer P1. Durch die
Zugabe von 250 µl Puffer P2 und anschließender Inkubation von 3 bis 4 min bei RT erfolgte
der alkalische Zellaufschluß.
Nach Zugabe von 350 µl Puffer N3 (Neutralisation) wurden die präzipitierten Proteine von
der chromosomalen DNA durch zehnminütige Zentrifugation bei 13000 rpm abgetrennt. Es
folgte die Überführung des die Plasmid-DNA enthaltenen Überstands auf eine QIAprep spin
Säule. Die nach einminütiger Zentrifugation an die Säule gebundene Plasmid-DNA wurde
durch Waschen mit 750 µl PE-Puffer gereinigt und anschließend mit 32 µl EB Puffer eluiert.
9.2.6.4 Ansatz für den Restriktionsverdau mit EcoRI
Reagenzien
Volumina
EcoRI (Restriktionsenzym), 10U/µl 0,25 µl
EcoRI-Puffer 2 µl
DNA 2 µl
dH2O 5,5µl
Gesamtansatz 10 µl
Der Ansatz wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
9. Anhang I, Material & Methoden 190
9.2.6.5 Ansatz für den Restriktionsverdau mit XhoI
Reagenzien
Volumina
XhoI (Restriktionsenzym), 10U/µl 0,6 µl
10x Tango-Puffer 1,6 µl
vorverdaute DNA 11 µl
dH2O 5,5µl
Gesamtansatz 20 µl
Der Ansatz wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
9.2.6.6 Isolation von Plasmid-DNA mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit
(DNA-Maxipräparation)
Mit diesem Kit können maximal 500 µg DNA/Probe isoliert werden.
Das Kit enthält folgende Inhaltsstoffe: Puffer P1
Puffer P2
Puffer P3
Puffer QBT
Puffer QC
QIAGEN-tip 500 Säulen
QIAfilter Maxi Cartridges
Elutionspuffer EB
Zur Vorbereitung wurden zu 100 ml LBAmp-Medium 200 bis 300 µl des Selektionsansatzes
(E.coli-Suspension) gegeben und über Nacht bei 37°C und 200 rpm in einem Thermoschüttler
inkubiert. Resuspension und Zellaufschluß erfolgten mit 10 ml P1 und 10 ml P2 Puffern
analog zur Minipräparation (Kap. 9.7.3). Durch Zugabe von 15 ml Puffer P3 wurde die
Suspension neutralisiert. Zur Isolierung der Plasmid-DNA wurde eine QIAGEN-tip 500-Säule
benutzt. Diese musste vor Gebrauch mit 15 ml QBT Puffer äquilibriert werden, um die
Plasmid-DNA des klaren Lysats zu binden. Vorher wurde die Probe über einen Filter von
9. Anhang I, Material & Methoden 191
ausgefallenen Bestandteilen befreit. Nach zweimaligem Waschen mit QC Puffer wurde die
DNA mit 15 ml Elutionspuffer aus der Säule eluiert und anschließend mit 10,5 ml
Isopropanol gefällt. Es folgte eine dreißigminütige Zentrifugation bei 15000 rpm. Das Pellet
wurde mit 700 µl Ethanol (reinst) gewaschen, und nochmals für eine halbe Stunde bei 13000
rpm zentrifugiert. Nach der Trocknung wurde das Pellet in 60 bzw. 120 µl dH2O
aufgenommen.
9.2.6.7 Restriktionsverdau mit XhoI und NheI (Doppelverdau)
Ansatz des Verdaus:
Reagenzien
Verdau
Vektor-DNA
Verdau
Insert-DNA
DNA 5 µg 5 µg
Xho I, 10U/µl 8 µl 8 µl
Nhe I, 10U/µl 2 µl 2 µl
1xTango 10 µl 10 µl
dH2O 75 µl 75 µl
Gesamtansatz 100 µl 100 µl
Der Ansatz wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
9. Anhang I, Material & Methoden 192
9.2.6.8 Ligation des pM765-tev Vektors
Ligationsansatz:
Reagenzien
Ansatz
Probe
Ansatz
Kontrolle
Vektor-DNA 5 µg 5 µg
Insert-DNA 5 µl -
10x Ligationspuffer 1 µl 1 µl
T4 DNA-Ligase 1 µl 1 µl
dH2O x µl x µl
Gesamtansatz 10 µl 10 µl
Nach der Inkubation des Ansatzes bei 16°C , alternativ bei 4°C über Nacht, wurde die Ligase
bei einer Temperatur von 65°C für 10 min inaktiviert.
9.2.7 Nachweis von Proteinen
9.2.7.1 Extraktion von Proteinen aus D. discoideum (Protein-Minipräparation)
Für die Präparation von Proteinen aus D. discoideum wurde die konfluente Platte des
gewünschten Klons mit 1ml HL-5c-Medium+P/S+G10 gespült. Die Suspension, die etwa
1x107 Zellen enthielt, wurde durch fünfminütige Zentrifugation bei 2700 rpm pelletiert, mit 1
ml Lysispuffer gewaschen und erneut zentrifugiert. Nachdem das Pellet in 600 µl Lysispuffer
1 resuspendiert wurde, folgte die Zugabe derselben Menge Lysispuffer 2. Anschließend
wurde die Suspension für 20 min bei RT inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 13000
rpm für 30 min. Nachdem das Pellet in 500 µl Lysispuffer gewaschen wurde, folgte eine
erneute Pelletierung durch 25 minütige Zentrifugation. Der Überstand wurde vorsichtig
abpipettiert. Nach Zugabe von 40 µl Lysispuffer 3 wurde das im Pellet enthaltene Protein
unter Verwendung einer Mikropistille extrahiert. Es folgte eine erneute Zentrifugation für 20
min bei 13000 rpm. Der das Protein enthaltende Überstand wurde abgenommen, mit 6x-
Protein-Auftragspuffer versetzt und bei 95°C für 5 min erhitzt. 10 µl der Lösung wurden für
9. Anhang I, Material & Methoden 193
die Analyse mittels SDS-PAGE (Kap. 3.6.2 und 9.2.7.3) verwendet. Als Vergleich diente eine
Protein-Minipräparation von DdAX3-ORF+-Zellen.
9.2.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) - Gele
Zusammensetzung des Trenngels:
Reagenzien
10%ig
15%ig
Acrylamid (40%) 1,25 ml 1,88 ml
Tris/HCl Puffer (1,5M; pH 8,8) 1,4 ml 1,4 ml
SDS (1%) 0,5 ml 0,5 ml
H2O 1,85 ml 1,22 ml
APS (40%) 15 µl 15 µl
TEMED 15 µl 15 µl
Zusammensetzung des Sammelgels:
Reagenzien
5%ig
Acrylamid (40%) 95 µl
Tris/HCl Puffer (1M; pH 6,8) 95 µl
SDS (1%) 75 µl
H2O 480 µl
APS (40%) 2,5 µl
TEMED 2,5 µl
Nach dem Mischen der Reagenzien für das Trenngel wurde die Flüssigkeit unverzüglich bis
etwa 1 cm unterhalb des oberen Randes in die Gelkammer gegossen und vorsichtig mit
Isopropanol überschichtet. Nach Polymerisation des Gels wurde der Alkohol abgegossen und
Reste mithilfe eines Filterpapiers entfernt. Es folgte die Vermischung der Reagenzien für das
Sammelgel, das unverzüglich mit einer Pipette auf das Trenngel gegeben wurde.
Anschließend wurde sofort der Probenkamm eingesetzt.
9. Anhang I, Material & Methoden 194
9.2.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Elektrophorese
Nach vollständiger Polymerisation des Trenn- und Sammelgels wurden diese in der
Laufkammer, die etwa 2 cm tief mit Laufpuffer (nach Lämmli) befüllt wurde, eingespannt.
Der Probenkamm wurde vorsichtig entfernt, um die Form der Taschen nicht zu verzerren, und
die Proben aufgetragen. Es wurde eine Stromstärke von 20 mA angelegt, bis die Proben das
Ende des Sammelgels erreicht hatten. Im Anschluß wurde mit einer Stromstärke von 35 mA
gearbeitet. Die Entwicklung des Gels erfolgte mittels Coomassie-Färbung (Kap. 9.8.4).
9.2.7.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Coomassie-Färbung
Das Gel wurde nach beendetem Lauf vollständig mit Coomassie Blue-Färbelösung bedeckt
und auf einem Thermer aufgekocht. Durch mehrmaliges Aufkochen in 6%iger Essigsäure
erfolgte die Entfernung von überschüssigem Farbstoff. Proteinhaltige Abschnitte wurden als
blaue Banden sichtbar.
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10. Anhang II, Ergebnisse 196
9.2.8.2 Testparameter des skotopischen Einzelblitz-ERGs
Stufe
Stimulus
1 0.01 cds/m2
2 0.03 cds/m2
3 0.3 cds/m2
4 (Standard) 3.0 cds/m2
5 (Xenon Flash) 10 cds/m2
6 (Xenon Flash) 30 cds/m2
9.2.8.3 Testparameter des photopischen Einzelblitz-ERGs
Stufe
Stimulus
1 (Standard) + 3.0 cds/m2
2 (Xenon Flash) + 10 cds/m2
3 (Xenon Flash) + 30 cds/m2
4 (Xenon Flash) + 100 cds/m2
bei einer Hintergrundbeleuchtung von 25 cds/m3
9.2.8.4 Protokoll zur Dokumentation des Versuchsablaufs
10. Anhang II, Ergebnisse 197
Protokoll ERG
Datum der Untersuchung:
Uhrzeit der Untersuchung:
Dunkeladaption (Datum/Uhrzeit):
Identifikation des Tieres:
Stamm
Eltern
MF
Geburt
Geschlecht
dreh
nicht
dreh
Alter bei
Unters.
Narkose:
Gewicht des Tieres
Narkosemittel
Menge des Narkosemittels
Sonstige Pharmaka:
Mydriatika
Lokalanästhetikum
Tränenersatz
Untersuchung:
Untersuchungszeitraum
Besonderheiten
10. Anhang II, Ergebnisse 198
9.2.9 Untersuchung von Umweltfaktoren
9.2.9.1 RT-PCR zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein-spezifischer RNA
Aus Anschnitten des Bulbus olfactorius und des Ammonshorns wurde die RNA mittels Trizol
Methode (Invitrogen) isoliert und mit dem RNeasy Minikit (Qiagen) aufgereinigt. Jeweils 165
ng RNA wurden zur Reversen Transkription eingesetzt. Der Nachweis der BDV-
Nukleoprotein spezifischen RNA erfolgte mit dem Primerpaar p334/335 (siehe Tab. 9.1) und
der Nachweis zellulärer RNA mit dem Primerpaar p113/114 (Housekeeping Gen GAPDH).
Als Positivkontrollen wurde RNA aus Rattengehirn, als Negativkontrolle DEPC-Aqua bidest.
als template eingesetzt.
Tab. 9.1 PCR zum Nachweis von BDV-Nukleoprotein-spezifischer RNA und GAPDH
ID
Probe
Primer
Amplifikatgröße
1 Tier 1 Bulb. olfact. 2 Tier 1 Ammonshorn 3 Tier 2 Bulb. olfact. 4 Tier 2 Ammonshorn 5 Tier 3 Bulb. olfact. 6 Tier 3 Ammonshorn 7 positiv Kontrolle I 8 positiv Kontrolle II 9 Negativkontrolle
p334/ 335
(BDV-Nukleoprotein)
342 bp
10 Tier 1 Bulb. olfact. 11 Tier 1 Ammonshorn 12 Tier 2 Bulb. olfact. 13 Tier 2 Ammonshorn 14 Tier 3 Bulb. olfact. 15 Tier 3 Ammonshorn 16 Positivkontrolle III 17 Positivkontrolle II 18 Negativkontrolle
p113/ 114 (GAPDH)
280 bp
10. Anhang II, Ergebnisse 199
10 Anhang II, Ergebnisse
10.1 Vergleichsstudie
10.1.1 Phänotypisierung
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10. Anhang II, Ergebnisse 202
10.1.2 Gewicht
Genotyp
Geschlecht
Gewicht in g MHH
Gewicht in g TiHo
350 - 415 445 424 450
männlich
460 500 224 - 240 264
homozygote Tiere
weiblich
287 300 - 425
454 595 männlich
482 660 290 - 294 340 305 368 312 400
heterozygote
Tiere weiblich
313 428 450 400 465 441 467 521
männlich
520 560 251 280 271 281
Kontroll- Tiere
weiblich
273 300
Tab. 10.3 Körpergewichte der Ratten der Vergleichsstudie. Vergleich der beiden
Haltungseinheiten. Die Gewichte sind nach Geschlecht und Genotyp getrennt
aufgeführt.
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10. Anhang II, Ergebnisse 204
10.1.4 Histologie
Stamm/ Genotyp
Tier
Photo-rezeptor- schicht
Zelllagen äußere Körnerschicht
Zelllagen innere
Körnersch.
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zentral peripher 1
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regelrecht
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sehr stark
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(MHH) homozygot
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2
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3-4
regelrecht
LEW/Ztm-ci2
(MHH) heterozygot
3
sehr stark
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3-4
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0-1
3-4
regelrecht, aber äußere plexiforme Schicht fast vollst.
degeneriert
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regelrecht
2
sehr schmal
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3-4
regelrecht, aber äußere plexiforme Schicht fast vollst.
degener.
LEW/Ztm-ci2
(TiHo) homozygot
3
fast
vollständig degeneriert
nur vereinzelt Zellen
3-4
regelrecht, aber äußere plexiforme Schicht peripher
fast verschwunden 1
fast vollst. degeneriert
nur vereinzelt Zellen
4
regelrecht, aber äußere plexiforme Schicht fast vollst.
degener. 2
schmal
6
3-4
4
regelrecht
LEW/Ztm-ci2
(TiHo) heterozygot
3
vollständig degeneriert
nur vereinzelt Zellen
3-4
regelrecht, aber äußere plexiforme
Schicht degeneriert
Danksagung
Ich bedanke mich bei Prof. Dr. H.J. Hedrich für die Überlassung des Themas, für die
Bereitstellung von Arbeitsplatz und -materialien und die stets gewährte Unterstützung bei der
wissenschaftlichen Arbeit sowie bei der Abfassung dieser Dissertation. Bei Herrn Dr. D.
Wedekind möchte ich mich für die stetige Motivation, für das Interesse und die Unterstützung
bei der Planung und Durchführung der Versuche sowie für seine unermüdliche
Diskussionsbereitschaft bedanken.
Weiterhin bedanke ich mich bei
Frau PD M.-L. Enss für die großartige Betreuung des Graduiertenkollegs, für ihr Engagement
und ihre Unterstützung bei jeglichen Problemen. Der DFG danke ich für die Bereitstellung
der Förder- und Sachmittel im Rahmen des GRK 705-II.
Herrn Dr. R. Gockeln für die Betreuung der elektrophysiologischen Versuche und die
Einarbeitung in dieses Thema. In diesem Zusammenhang möchte ich auch Frau I. Tutschke
und Herrn L. Mentze danken, die mir in allen Fragen bezüglich der ERGs stets mit Rat und
Tat zur Seite standen.
Herrn Prof. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Pharmazie und Toxikologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover für die Diskussion wissenschaftlicher Fragen sowie für
die Unterbringung der Tiere in der Tierhaltung des Pharmakologischen Instituts. Weiterhin
danke ich Herrn M. Schirmer für die Zusammenarbeit bei der Vergleichsstudie.
Dr. E. Cuppen und Dr. B. Smits für die Gastfreundschaft beim Laboraufenthalt im Hubrecht
Laboratorium, Utrecht sowie für die Unterstützung bei der Generation der Primer und beim
Durchführen der Sequenzierungen. Weiterhin möchte ich mich für die Überlassung der
HsdRccHan:WIST-Myo7Atnd Ratten bedanken.
Herrn Prof. D.J. Manstein und Herrn Prof. G. Tsiavaliaris für die Möglichkeit, im Institut für
Biophysikalische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover die Untersuchungen zur
Proteinstruktur des Myosin XV durchführen zu können. Herrn Prof. G. Tsiavaliaris und der
gesamten "Motility Group" insbesondere Herrn M. Taft und Herrn R. Diensthuber möchte ich
für die freundliche Aufnahme und die ständige Hilfsbereitschaft danken.
Herrn Prof. K. Kamino und Frau Dr. S. Schubert, die durch die Anfertigung der
histologischen Schnitte und ihre Diskussionsbereitschaft im Rahmen der Auswertung der
Präparate in besonderem Maße zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Herrn Dr. N. Neuhoff, Herrn M. Tauscher, Frau M. Lorsch und Frau Dr. H. Weiss für die
Hilfe bei der Planung und Durchführung der Real Time PCR.
Frau Dr. C. Herden und Frau Dr. D. Porombka, Institut für Pathologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover, für die freundliche Unterstützung bei der Untersuchung auf BDV-
Infektion der Mutante.
Den Mitarbeitern des Instituts für Versuchstierkunde für die freundliche Aufnahme, die
erwiesene Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima sowie den Tierpflegern des Zentralen
Tierlaboratoriums für die Betreuung der Tiere und für die freundliche Atmosphäre im Haus.
Mein besonderer Dank gilt Frau S. Pzyklenk und Frau I. Trotz für die Einarbeitung in die
Labormethodik, für die stetige Unterstützung und die gute Zusammenarbeit. Frau T. Arndt
danke ich für die Hilfe bei fachlichen Fragen, ihre Diskussionsbereitschaft und die
Unterstützung bei den statistischen Auswertungen.
Mein Dank gilt insbesondere meiner Familie und meinen Freunden für die moralische
Unterstützung, die stetige Motivationsbereitschaft und für ihr Vertrauen.
Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Freund, Sebastian Hütker, bedanken, der mich
während der dreijährigen Promotionszeit mit unendlicher Geduld und Belastbarkeit, mit
Gesprächs- und Diskussionsbereitschaft sowie viel Optimismus unterstützt hat.