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Vergleichsuntersuchungen von
TCM Arzneimitteln
Kevin Mattli / Samuel Peter / Dr. Evelyn Wolfram
ZHAW Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften
Wädenswil, 15. Juni 2018
Vergleichsuntersuchungen von TCM Arzneimitteln
Mattli, S., Peter, S., Wolfram, E., ZHAW − Wädenswil, 15. Juni 2018 2
Zusammenfassung
Im Auftrag der Complemedis AG (Vertreiberin SunTen Produkte) wurden
Vergleichsuntersuchungen bezüglich Inhaltsstoffgehalt von auf dem Markt erhältlichen
flüssigen ("hydrophile Konzentrate", Dr. Noyer) und pulverförmigen Darreichungsformen
(granulierte Extrakte, SunTen) von fünf ausgewählten TCM-Pflanzen durchgeführt.
Für den Vergleich wurde in den Produkten jeweils der Gehalt der Leitsubstanzen gemäss den
Drogenmonographien der Europäischen Pharmakopöe bestimmt und auf die von den
Vertreibern angegebenen, üblichen Tagesdosen hochgerechnet. Die Tagesdosis der
Leitsubstanz wird dabei als Mass für die Menge der zubereiteten Droge herangezogen,
ungeachtet allfälliger Unterschiede im Inhaltsstoffprofil. Ein direkter Vergleich mit frischen
Dekokten der entsprechenden Pflanzen wurde nicht durchgeführt.
Die Auswertung des Produktvergleichs zeigte, dass bei der Verwendung der hydrophilen
Konzentrate in der vorgegebenen Standarddosierung teilweise erheblich weniger
Leitsubstanz, ergo Droge, eingenommen wird als bei entsprechender Dosierung des
Granulats. Die Unterschiede reichten dabei von Faktor 7 bei Angelica sinensis root bis 1300
bei Baical skullcap root. Die Details sind in Tabelle I dargestellt.
Tabelle I: Vergleich der getesteten TCM-Arzneimittel bezüglich der eingenommenen Tagesdosis an entsprechender Leitsubstanz gemäss Standardosierung der Hersteller.
Droge Pinyin Leitsubstanz
Tagesdosis bei 3x4 g Granulat
(mg)
Tagesdosis bei 3x50 Trpf.
Konzentrat (mg)
Faktor Granulat : Konzentrat
Angelica sinensis root Dang Gui Ferulasäure 1.52 0.22 7
Astragalus mongholicus Huang Qi Astragalosid 8.77 0.59 15
Baical skullcap root Huang Qin Baicalin 1274.60 0.98 1299
Liquorice root Gan Cao Glycyrrhizinsäure 539.41 39.34 14
Paeoniae radix alba Bai Shao Paeoniflorin 327.11 7.71 42
Auf Basis der Auswertung der Tagesdosis der Leitsubstanzen bei den getesteten Produkten
der fünf Pflanzen ist es bei solchen Unterschieden fragwürdig von äquivalenten Arzneiformen
zu sprechen. Die grosse Bandbreite bei den Zubereitungen macht es zudem praktisch
unmöglich einen allgemeinen Umrechnungsfaktor zu definieren und müsste von Fall zu Fall
mit entsprechendem (Analysen)-Aufwand beurteilt werden.
Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ................................................................................................................ 2
1. Einleitung ....................................................................................................................... 5
2. Material .......................................................................................................................... 6
2.1. Proben ..................................................................................................................... 6
2.2. HPLC – System ........................................................................................................ 6
2.2.1. Säulendaten ..................................................................................................... 6
2.3. UHPLC – System ZHAW .......................................................................................... 7
2.3.1. Säulendaten ..................................................................................................... 7
3. Angewandte Methoden .................................................................................................. 8
3.1. Angelica sinensis root .............................................................................................. 8
3.2. Baical Skullcap root .................................................................................................. 8
3.3. Liquorice root ........................................................................................................... 8
3.4. Paeoniae radix alba.................................................................................................. 8
3.5. Astragalus mongholicus root .................................................................................... 9
4. Resultate .......................................................................................................................12
4.1. Angelica sinensis root ............................................................................................ 12
4.1.1. Granulat ..........................................................................................................12
4.1.2. Fluid ................................................................................................................13
4.2. Baical Skullcap root ................................................................................................ 14
4.2.1. Granulat ..........................................................................................................14
4.2.2. Fluid ................................................................................................................15
4.3. Liquorice root ......................................................................................................... 16
4.3.1. Granulat ..........................................................................................................16
4.3.2. Fluid ................................................................................................................17
4.4. Paeoniae radix alba................................................................................................ 18
4.4.1. Granulat ..........................................................................................................18
4.4.2. Fluid ................................................................................................................19
4.5. Astragalus mongholicus root .................................................................................. 20
4.5.1. Granulat ..........................................................................................................20
4.5.2. Fluid ................................................................................................................21
5. Vergleich Granulat vs. Fluid ..........................................................................................22
5.1. Angelica sinensis root ............................................................................................ 22
5.2. Baical Skullcap root ................................................................................................ 23
5.3. Liquorice root ......................................................................................................... 25
5.4. Paeoniae radix alba................................................................................................ 26
5.5. Astragalus mongholicus root .................................................................................. 27
6. Diskussion .....................................................................................................................30
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7. Literatur .........................................................................................................................31
Abbildungsverzeichnis ..........................................................................................................32
Tabellenverzeichnis ..............................................................................................................33
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1. Einleitung
Die Flüssigprodukte, hydroethanolische Flüssigextrakte aus TCM-Pflanzen, werden gegen
vergleichbare Granulatprodukte bezüglich der Inhaltsstoffmenge der Leitsubstanzen
verglichen. Bei den Perkolaten handelt es sich um Produkte der Firma Dr. Noyer AG. Die
Fluide sind mit Glycerin und Parabenen versetzt, um eine längere Konservierung zu
ermöglichen. Bei den Granulatprodukten handelt es sich um SunTen Granulate der Firma
Complemedis AG. Diese bestehen aus dem granulierten Extrakt und gelegentlich versetzt mit
der reinen Droge.
Die Analyse der Produkte erfolgte mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Die
Analyse wurde in den Laboren der ZHAW der Fachgruppe Phytopharmazie und Naturstoffe
durchgeführt, ebenso die Aufarbeitung der Proben. Die Methoden zur Aufarbeitung und
Analyse wurden der Europäischen Pharmakopöe entnommen. Die Fluidproben und die
Granulatproben wurden gleichermassen aufarbeitet.
Es wurden fünf Granulate und fünf Fluide untersucht. Jede Granulat- und Fluidprobe wurde
auf ihren Gehalt an Leitsubstanz analysiert und anschliessend miteinander verglichen.
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2. Material
2.1. Proben
Granulate
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma – Gan Cao, SunTen 5536 (Lot: 16070732)
o 7% Trockenextrakt (DEVnativ 4.3:1); 93% Hilfsstoff (gemahlene Droge)
Scutellariae baicalensis Radix – Huang Qin, SunTen 6210 (Lot: 15030504)
o 67% Trockenextrakt (DEVnativ 3.93:1); 33% Hilfsstoff (gemahlene Droge)
Paeoniae Radix alba – Bai Shao, SunTen 5722 (Lot: 16050333)
o 67% Trockenextrakt (DEVnativ 5.27:1); 33% Hilfsstoff (gemahlene Droge)
Astragali mongholici Radix – Huang Qi, SunTen 6205 (Lot: 16111631)
o 66% Trockenextrakt (DEVnativ 4.5:1); 34% Hilfsstoff (gemahlene Droge)
Angelicae sinensis Radix – Dang Gui, SunTen 6307 (Lot: 17052208)
o 48% Trockenextrakt (DEVnativ 3.13:1); 52% Hilfsstoffe (Maisstärke und
Cellulose)
Tagesdosierung: jeweils 3 x 3-4 g Granulat
Fluide
Gan Cao (Ref: 588431/00)
Huang Qin (Ref: 588430/00)
Bai Shao (Ref: 599429/00)
Huang Qi (Ref: 588434/00)
Dang Gui (Ref: 588421/00)
Keine detaillierten Informationen pro Fluid erhältlich.
Generelle Informationen gem. Hersteller:
Hydroethanolische Auszüge (Mazerate/Perkolate)
Zugabe von Glycerin und Methyl- und Propylparaben (0.096% bzw. 0.024%)
Tagesdosierung: jeweils 3 x 50 Tropfen
2.2. HPLC – System
Die Messungen zur Etablierung der Methode wurden alle auf dem HPLC – Gerät „Studi“ der
ZHAW Wädenswil durchgeführt.
Das Gerät besteht aus dem Waters Alliance 2695 und dem Waters 2998 Photodioden Array
Detektor.
Zur Auswertung der Chromatogramme wurde die Software Empower 3 der Firma Waters
Corporation verwendet.
Das Dwell – Volumen des HPLC – Systems betrug 1170 µl.
2.2.1. Säulendaten
Firma: Macherey – Nagel
Stationäre Phase: Nucelodur 100 – 3 C18 ec
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Partikelgrösse: 3 µm
Innendurchmesser: 4.0 mm
Länge: 125 mm
Lotnummer: 37907033
Seriennummer: N18020328
2.3. UHPLC – System ZHAW
Die Messung der Astragalus mongholicus Probe wurde auf einem Waters Acquity UPLC
durchgeführt. Das UHPLC – System wurde mit einem DAD (Diodenarray – Detektor), ELSD
(Evaporative Light Scattering Detector) und einem QDa (ESI-Single Quadrupole-
Massenspektrometer) gekoppelt.
Das Dwell – Volumen des UHPLC – Systems betrug 145 µl.
2.3.1. Säulendaten
Firma: Waters
Stationäre Phase: HSS T3 C18
Partikelgrösse: 1.8 µm
Innendurchmesser: 2.1 mm
Länge: 100 mm
Seriennummer: 01463312815724
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3. Angewandte Methoden
Alle Methoden entstammen der Europäischen Pharmakopöe (PhEur.). Es wurden nur
Änderungen vorgenommen, wenn diese nötig waren. So wurden bei einigen Proben die
Einwaagemenge geändert, da die Inhaltsstoffe ansonsten unter der Nachweisgrenze lagen.
Für jede Probe wurde eine Dreifach - Bestimmung durchgeführt. Nachfolgend werden die
durchgeführten Schritte aufgezeigt.
3.1. Angelica sinensis root
Die Durchführung beruhte auf der PhEur. Monographie "Angelica sinensis root"
(04/2017:2558) [1].
1000 mg der Granulat- /Fluidproben wurden eingewogen und mit einer 70% Methanollösung
auf 20.0 ml aufgefüllt. Das Ganze für 30 min im Ultraschallbad extrahiert. Anschliessend mittels
eines Filters (0.2 µm) filtriert.
Die Herstellung der Referenz- und Standardlösung erfolgte genau nach der Monographie.
Die Messung erfolgte auf dem HPLC gekoppelt mit einem DAD.
3.2. Baical Skullcap root
Die Durchführung beruhte auf der PhEur. Monographie "Baical skullcap root" (04/2011:2438)
[2].
Für die Granulatproben wurden 300 mg und für die Fluidproben 3000 mg eingewogen.
Anschliessend mit einer 70% Ethanollösung auf 100.0 ml aufgefüllt. Die Lösung wurde für ca.
30 min im Ultraschallbad extrahiert. Anschliessend wurden 1.0 ml der Lösung entnommen und
auf 10.0 ml mit Methanol R aufgefüllt. Die neue Lösung wurde gut geschüttelt und nachher
abfiltriert (0.2 µm).
Die Herstellung der Referenz- und Standardlösung erfolgte genau nach der Monographie.
Die Messung erfolgte auf dem HPLC gekoppelt mit einem DAD.
3.3. Liquorice root
Die Durchführung beruhte auf der PhEur. Monographie "Liquorice root" (01/2012:0277) [1].
Es wurden 1000 mg der Granulatprobe und 4000 mg der Fluidprobe eingewogen. Diese
wurden anschliessend auf 100.0 ml mit einer 0.47 mol/L Ammoniaklösung* aufgefüllt.
Anschliessend wurden die Proben für ca. 30 min ins Ultraschallbad gesetzt. Nachfolgend
wurden die Proben filtriert (0.2 µm).
Die Herstellung der Referenz- und Standardlösung erfolgte genau nach der Monographie.
Die Messung erfolgte auf dem HPLC gekoppelt mit einem DAD.
*) versehentlich Faktor 5 zu konzentriert (8 g Ammonia R / L vs. 8 g NH3/L)
3.4. Paeoniae radix alba
Die Durchführung beruhte auf der PhEur. Monographie "Peony root, white" (01/2017:2424) [4].
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Für die Analyse des Granulats wurden 30 mg der Probe eingewogen. Für die Fluidprobe
wurden 300 mg Probe eingewogen. Anschliessend mit einer 6.8 g/L
Kaliumdihydrogenphosphatlösung auf 10.0 ml aufgefüllt. Die Lösung wurde für ca. 30 min im
Ultraschallbad extrahiert. Nachfolgend wurden die Proben filtriert (0.2 µm).
Die Herstellung der Referenz- und Standardlösung erfolgte genau nach der Monographie.
Die Messung erfolgte auf dem HPLC gekoppelt mit einem DAD.
3.5. Astragalus mongholicus root
Die Durchführung beruhte auf der PhEur. Monographie "Astragalus mongholicus root"
(07/2017:2435) [5].
2000 mg der Granulatprobe und 4000 mg der Fluidproben wurden in ein 50 ml Falcontube
eingewogen. Anschliessend wurden 15 ml Methanol R beigefügt. Die Proben wurden für ca.
30 min im Ultraschallbad extrahiert. Anschliessend wurden die Proben zentrifugiert und der
Überstand in ein 50 ml Messkolben transferiert. Zum Rückstand im Falcontube wurden erneut
15 ml Methanol R beigefügt und nochmals für 30 min extrahiert und zentrifugiert. Der
Überstand wurde in den gleichen Messkolben überführt (Gesamtmenge 30 ml
Methanollösung). Nachfolgend wurden die Proben mit 15 ml Reinstwasser und 1 ml Ammoniak
25% versetzt. Die Lösungen wurden für 1h ruhen gelassen. Anschliessend wurde mit 0.6 ml
Ameisensäure 99% neutralisiert/gepuffert und mit Reinstwasser zur Markierung aufgefüllt. Die
Lösungen wurden gut geschüttelt und filtriert (0.2 µm).
Für den Standard wurden 10 mg Astragalosid IV in 10 ml Methanol R gelöst (Stammlösung
1 mg/ml). Anschliessend wurden Verdünnungen hergestellt, welche folgende Konzentrationen
ergaben:
50 mg/L; 40 mg/L; 30 mg/L; 20 mg/L; 10 mg/L
Alle Lösungen wurden filtriert (0.2 µm).
Für die Referenzlösung SST wurden 5 ml vom Standard, welche eine Konzentration von
50 mg/L aufweist, mit 5 ml einer 1 mg/ml Ginsenoside Rb1 R Lösung versetzt. Anschliessend
filtriert (0.2 µm).
Die Messung erfolgte auf dem UHPLC, gekoppelt mit einem DAD, QDa und ELSD.
Der Gradient der Monographie wurde anhand der veränderten Säulendimensionen
umgerechnet und war wie folgt:
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Abbildung 1: Gradient zur Messung der Astragalus Proben am UPLC – System.
Mittels des QDa wurden folgende Massenspuren im SIR Modus (ESI pos) aufgenommen:
Ch1: 407.00 Da (Ginsenoside Rb1 R)
Ch2: 419.00 Da (Astragolosid IV)
Ch3: 425.00 Da (Ginsenoside Rb1 R)
Ch4: 437.00 Da (Astragolosid IV)
Ch5: 455.00 Da (Astragolosid IV)
Ch6: 807.00 Da (Astragolosid IV)
Ch7: 1131.00 Da (Ginsenoside Rb1 R)
Die Auswahl der Massenspuren wurde anhand des Massenspektrum des Standards
Astragolosid IV CRS durchgeführt.
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Abbildung 2: Massenspektrum des Astragalosid IV CRS Standards bei einem Scan [ESI+] von 350-900 m/z. Das Signal von 807 Da entspricht dabei dem [M+Na]+, die Signale bei 419, 437, 455 Da sind charakteristische Fragmente und decken sich mit dem MS-Spektrum, publiziert unter www.massbank.eu, Record-ID: TY000014 (abgerufen: 20.04.18). Für die Quantifizierung wurden die vier Massen summiert und als Chromatogramm registriert.
13.537 Peak 1 - QDa Positive Scan QDa Positive(+) Scan (350.00-1200.00)Da, Centroid, CV=15
419.41
437.45
455.49
807.48
Inte
nsity
0.00
5.00x104
1.00x105
1.50x105
2.00x105
2.50x105
3.00x105
3.50x105
4.00x105
4.50x105
5.00x105
5.50x105
6.00x105
6.50x105
7.00x105
7.50x105
8.00x105
8.50x105
9.00x105
9.50x105
1.00x106
m/z
350.00 400.00 450.00 500.00 550.00 600.00 650.00 700.00 750.00 800.00 850.00 900.00
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4. Resultate
Nachfolgend werden die erarbeiteten Resultate dargestellt.
4.1. Angelica sinensis root
Um die Wirkstoffkonzentration in den Proben zu berechnen, wurde unter gleichen
Bedingungen eine Standardkurve erstellt. Für die Untersuchung der Angelica sinensis root
Proben wurde eine Standardkurve für den Wirkstoff "Ferulic Acid" erstellt. Als Standard diente
die Ferulic Acid CRS (trans Ferulic Acid 99.8%). Es wurde eine 3 Punkt Kalibrierung
durchgeführt.
Abbildung 3: Standardgerade für Ferulic Acid. Die Gerade weisst ein Bestimmtheitsmass R2 von 1.0000 auf. Die dazugehörige Geradengleichung lautet: y(x) = 352210215.918x – 21015.667.
4.1.1. Granulat
Anhand der erstellten Standardkurve wurden die gemessenen Werte am HPLC (Area) auf den
Gehalt von trans Ferulic Acid in den Proben umgerechnet. Dargestellt in der Tabelle 1.
Tabelle 1: Gemessene und berechnete Werte für die Angelica sinensis root Granulatproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt trans Ferulic Acid
[% g/g]
Gehalt trans Ferulic Acid
[mg/g]
Granulat 1
1816 1000.6 2211813
0.013 0.127
Granulat 2
1817 1008.0 2219253
0.013 0.126
Granulat 3
1818 1005.2 2232882
0.013 0.127
Tabelle 2: Mittelwert und Standardabweichung der gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis trans Ferulic Acid [mg]
0.127 ± 0.0006 1.521 ± 0.008
0
5'000'000
10'000'000
15'000'000
20'000'000
25'000'000
30'000'000
35'000'000
40'000'000
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
Are
a [I
U]
Konzentration trans Ferulic Acid [mg/ml]
Standardreihe trans Ferulic Acid
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4.1.2. Fluid
Die Dichte des Fluids wurde mit 1.1063 g/ml bestimmt. Alle gemessenen und berechneten
Daten sind in der Tabelle 3 ersichtlich.
Tabelle 3: Gemessene und berechnete Werte für die Angelica sinensis root Fluidproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt trans Ferulic Acid
[% g/g]
Gehalt trans Ferulic Acid
[mg/g]
Fluid 1
1819 1014.8 773645
0.004 0.044
Fluid 2
1820 1043.1 798620
0.005 0.045
Fluid 3
1821 1082.8 828373
0.005 0.045
Tabelle 4: Mittelwert der gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (4980 mg) Fluid.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis trans Ferulic Acid [mg]
0.045 ± 0.00009 0.224 ± 0.0004
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4.2. Baical Skullcap root
Für die Standardkurve wurde die Chemikalie Baicalin CRS genommen. Es wurde eine 3
Punkte Kalibration durchgeführt.
Abbildung 4: Standardgerade für Baicalin. Die Gerade weist ein Bestimmtheitsmass R2 von 0.9999. Die dazugehörige Geradengleichung lautet: y(x) = 41397405.7073x – 13450.7778
4.2.1. Granulat
Tabelle 5: Gemessene und berechnete Werte für die Baical skullcap root Granulatproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt Baicalin [% g/g]
Gehalt Baicalin [mg/g]
Granulat 1
1833 296.0 1300371
10.722 107.219
Granulat 2
1834 315.6 1375423
10.631 106.305
Granulat 3
1835 336.6 1451533
10.514 105.135
Tabelle 6: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer
Einnahmemenge von 12 g Granulat.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis Baicalin [mg]
106.22 ± 1.182 1274.6 ± 14.188
0
200'000
400'000
600'000
800'000
1'000'000
1'200'000
1'400'000
1'600'000
1'800'000
2'000'000
0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.04 0.05 0.05
Are
a [I
U]
Konzentration Baicalin [mg/ml]
Standardreihe Baicalin
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4.2.2. Fluid
Die Dichte des Fluids wurde mit 1.1001 g/ml bestimmt.
Tabelle 7: Gemessene und berechnete Werte für die Baical skullcap root Fluidproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt Baicalin [% g/g]
Gehalt Baicalin [mg/g]
Fluid 1
1836 3136.7 4610
0.014 0.139
Fluid 2
1837 3160.2 4457
0.014 0.137
Fluid 3
1838 2998.1 3887
0.014 0.140
Tabelle 8: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (7055 mg) Fluid.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis Baicalin [mg]
0.139 ± 0.002 0.981 ± 0.014
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4.3. Liquorice root
Für die Erstellung der Standardgerade wurde eine 4 Punkte Kalibration mit Hilfe des Standards
monoammonium glycyrrhizate CRS durchgeführt. Anschliessend wurde mit Hilfe der
Molmassen die Werte von monoammonium glycyrrhizate zu 18β-glycyrrhizic acid
umgerechnet.
Abbildung 5: Standardgerade für 18β-glycyrrhizic acid. Das Bestimmtheitsmass R2 ist 1.000. Die Geradenfunktion
lautet: y(x) = 7933454.731x – 11861.488
4.3.1. Granulat
Tabelle 9: Gemessene und berechnete Werte für die Liquorice root Granulatproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt 18β-glycyrrhizic
acid [% g/g]
Gehalt 18β-glycyrrhizic
acid [mg/g]
Granulat 1
1911 1209.6 4128857
4.315 43.145
Granulat 2
1912 1106.5 4136173
4.725 47.253
Granulat 3
1913 1178.6 4144387
4.445 44.450
Tabelle 10: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis 18β-glycyrrhizic acid
[mg]
44.951 ± 2.373 539.41 ± 28.479
0
1'000'000
2'000'000
3'000'000
4'000'000
5'000'000
6'000'000
7'000'000
8'000'000
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Are
a [I
U]
Konzentration 18β-glycyyrrhizic acid [mg/ml]
Standardreihe 18β-glycyrrhizic acid
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4.3.2. Fluid
Die Dichte des Fluids wurde mit 1.0844 g/ml bestimmt.
Tabelle 11: Gemessene und berechnete Werte für die Liquorice root Fluidproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt 18β-glycyrrhizic
acid [% g/g]
Gehalt 18β-glycyrrhizic
acid [mg/g]
Fluid 1
1914 4077.3 1530716
0.477 4.769
Fluid 2
1915 9579.5 3610531
0.477 4.766
Fluid 3
1916 4117.6 1546933
0.477 4.771
Tabelle 12: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer
Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (8250 mg) Fluid.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis 18β-glycyrrhizic acid [mg]
4.769 ± 0.003 39.34 ± 0.025
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4.4. Paeoniae radix alba
Es wurde eine 3 Punkte Kalibration mit Hilfe des Stoffes Paeoniflorin CRS durchgeführt.
Abbildung 6: Standardgerade für Paeonoflorin. Das Bestimmtheitsmass R2 ist 0.9997. Die Geradengleichung lautet: y(x)=24139228.493x – 42705.263
4.4.1. Granulat
Tabelle 13: Gemessene und berechnete Werte für die Paeoniae radix alba root Granulatproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt Paeoniflorin
[% g/g]
Gehalt Paeoniflorin
[mg/g]
Granulat 1
2107 39.0 2516196
2.718 27.181
Granulat 2
2108 38.7 2512891
2.735 27.356
Granulat 3
2109 38.8 2508651
2.724 27.241
Tabelle 14: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis Paeoniflorin [mg]
27.259 ± 0.101 327.112 ± 1.211
0
500'000
1'000'000
1'500'000
2'000'000
2'500'000
3'000'000
3'500'000
4'000'000
4'500'000
5'000'000
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20
Are
a [I
U]
Konzentration Paeoniflorin [mg/ml]
Standardreihe Paeoniflorin
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4.4.2. Fluid
Die Dichte des Fluids wurde mit 1.0833 g/ml bestimmt.
Tabelle 15: Gemessene und berechnete Werte für die Paeoniae radix alba Fluidproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt Paeoniflorin
[% g/g]
Gehalt Paeoniflorin
[mg/g]
Fluid 1
2111 440.2 1295585
0.126 1.259
Fluid 2
2112 438.6 1302570
0.127 1.271
Fluid 3
2113 443.4 1300367
0.125 1.255
Tabelle 16: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (6110 mg) Fluid.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis Paeoniflorin [mg]
1.262 ± 0.009 7.711 ± 0.055
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4.5. Astragalus mongholicus root
Die Astragalus mongholicus root Proben (Granulat sowie Fluidproben) wurden am QDa und
dem ELSD gemessen, da die Astragaloside kaum UV-Licht absorbieren. Die ELSD Daten
wiesen aufgrund der geringeren Empfindlichkeit und Spezifität des Detektors jedoch eine
starke Schwankung auf, weshalb nachfolgend nur die QDa Daten ausgewertet und dargestellt
werden.
Mit Hilfe der Substanz Astragalosid IV CRS wurde eine 4 Punkte Kalibration durchgeführt und
die Standardgerade erstellt. Als Datenkanal diente die Summe aus den Massenspuren Ch2 +
Ch 4-6 (419 Da; 437 Da; 455 Da; 807 Da).
Abbildung 7: Standardgerade für Astragalosid IV aufgenommen mit dem QDa Ch2 + Ch4-6. Das Bestimmtheitsmass R2 ist 0.9941, die Geradengleichung lautet: y(x) = 257230848.671x – 1898440.700
4.5.1. Granulat
Tabelle 17: Gemessene und berechnete Werte für die Astragalus mongholicus root Granulatproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt Astragalosid IV
[% g/g]
Gehalt Astragalosid IV
[mg/g]
Granulat 1
1984 1940.2 5873985
0.078 0.779
Granulat 2
1987 2163.2 6554230
0.076 0.759
Granulat 3
1990 2282.7 5777805
0.065 0.654
Tabelle 18: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer
Einnahmemenge von 12 g Granulat.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis Astragalosid IV [mg]
0.731 ± 0.076 8.767 ± 0.914
0
2'000'000
4'000'000
6'000'000
8'000'000
10'000'000
12'000'000
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
Are
a [I
U]
Konzentration Astragalosid IV [mg/ml]
Standardreihe Astragalosid IV
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4.5.2. Fluid
Die Dichte des Fluids wurde mit 1.1140 g/ml bestimmt.
Tabelle 19: Gemessene und berechnete Werte für die Astragalus mongholicus root Fluidproben.
ProbeNr. Result ID Einwaage [mg]
Area [IU]
Gehalt Astragalosid IV
[% g/g]
Gehalt Astragalosid IV
[mg/g]
Fluid 1
1996 8247.7 2419410
0.010 0.102
Fluid 2
1999 7967.9 2432988
0.011 0.106
Fluid 3
2002 7912.6 2372728
0.010 0.105
Tabelle 20: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (5672 mg) Fluid.
Mittelwert Proben [mg/g]
Maximale Tagesdosis Astragalosid IV [mg]
0.104 ± 0.002 0.590 ± 0.011
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5. Vergleich Granulat vs. Fluid
5.1. Angelica sinensis root
Abbildung 8: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Angelica sinensis root.
Die Granulatprobe weist eine höhere Signalstärke für den Ferulic Acid Peak auf. Auch ist der
Anteil an polaren Stoffen höher als bei der Fluidprobe. Die Nebenpeaks bei ca. 12; 14; 16.5
und 21 min sind in beiden Chromatogrammen ersichtlich, jedoch ergeben alle Peaks eine
höhere Signalstärke in der Granulatprobe. Die Parabene in der Fluidprobe eluierten alle nach
dem Ferulic Acid Peak und wurden durch den Waschschritt von der Säule eluiert.
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Bezogen auf die Leitsubtanz trans Ferulic acid weist das Granulat einen um Faktor 2.8 höheren
Gehalt auf (0.127 vs. 0.045 mg/g). Berechnet auf die Tagesdosis von 12 g Granulat bzw. 3x50
Tropfen Fluid ergibt sich eine um Faktor 7 höhere Einnahme an Ferulic acid im Falle des
Granulats.
5.2. Baical Skullcap root
Abbildung 9: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Baical skullcap root.
Die Fluidprobe weist im Falle der Baical skullcap root Analyse eine sehr geringe Signalstärke
auf, jedoch befindet sich das Signal des Baicalinpeaks noch knapp über der
Bestimmungsgrenze. Ebenso sind zwei Parabenpeaks ersichtlich. Die Granulatprobe weist
eine viel höhere Signalstärke für den Baicalinpeak auf, trotz 10mal weniger Einwaage und
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gleicher Verdünnung. Die Peaks bei 19, 20 und 21 min sind nur in der Granulatprobe ersichtlich
(wurden nicht quantifiziert). Der Peak bei ca. 26 min kommt bei beiden Proben vor.
Wird der Y-Bereich kleiner gewählt, werden die Unterschiede offensichtlich (Abb. 10). Vor
allem im Bereich von 17-22 min sind im Chromatogramm der Fluidprobe extrem kleine Signale
vorhanden (blau), während die Granulatprobe (rot) starke Signale zeigt. Um welche
Substanzen es sich dabei handelt konnte im Rahmen dieses Auftrages nicht geklärt werden.
Der Fingerprint der Granulatprobe ähnelt aber stärker dem Beispielchromatogramm der
PhEur.
Abbildung 10: Overlay der Granulatproben (rot) mit den Fluidproben (blau) von Baical skullcap root, gezoomter Y-Bereich.
Bezogen auf die Leitsubtanz Baicalin weist das Granulat einen um Faktor 764 höheren Gehalt
auf (106 vs. 0.139 mg/g). Berechnet auf die Tagesdosis von 12 g Granulat bzw. 3x50 Tropfen
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Fluid ergibt sich sogar eine um Faktor 1300 höhere Einnahme an Baicalin im Falle des
Granulats.
5.3. Liquorice root
Abbildung 11: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Liquorice root.
Auch im Falle der Liquorice root Probe weist die Granulatprobe eine höhere Signalstärke für
den monoammonium glycyrrhizate Peak auf (Fluidprobe 4mal mehr Einwaage als die
Granulatprobe). In der Fluidprobe wurde bei 9 min ein Parabenpeak ermittelt. Der Peak bei
ca. 3 min erzielt in der Fluidprobe eine ca. 6mal höhere Signalstärke als bei der Granulatprobe.
Der Peak bei ca. 5 min weist hingegen in der Granulatprobe eine höhere Signalstärke auf. In
der Granulat- und Fluidprobe ist bei 10.3 min ein Peak ersichtlich, erreicht jedoch in der
Granulatprobe eine höhere Signalstärke.
Bezogen auf die Leitsubtanz Glycyrrhicinsäure weist das Granulat einen um Faktor 9 höheren
Gehalt auf (45 vs. 4.8 mg/g). Berechnet auf die Tagesdosis von 12 g Granulat bzw. 3x50
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Tropfen Fluid ergibt sich eine um Faktor 14 höhere Einnahme an Glycyrrhicinsäure im Falle
des Granulats.
5.4. Paeoniae radix alba
Abbildung 12: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Paeoniae radix alba.
Trotz der 10mal höherer Einwaage und gleicher Verdünnung, erzielt der Paeoniflorinpeak in
der Fluidprobe eine geringere Signalstärke als der in der Granulatprobe. In beiden
Chromatogrammen sind zwei Peaks bei ungefähr 5 und 5.8 min ersichtlich. Der
Peaoniflorinpeak in der Granulatprobe weist eine kleine Schulter vor dem eigentlichen Peak
auf. In der Fluidprobe ist diese Schulter weniger ausgeprägt, was jedoch auch an der
geringeren Konzentration liegen könnte. Trotz der nicht idealen Peakform in den beiden
Chromatogrammen können die Paeoniflorinpeaks ausgewertet werden (vertikal-split).
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Grundsätzlich sind in beiden Proben ähnliche Peaks vorhanden, die Fluidprobe zeigte noch
zwei zusätzliche kleine Signale bei 9 und 12 min.
Bezogen auf die Leitsubtanz Paeoniflorin weist das Granulat einen um Faktor 22 höheren
Gehalt auf (27 vs. 1.3 mg/g). Berechnet auf die Tagesdosis von 12 g Granulat bzw. 3x50
Tropfen Fluid ergibt sich eine um Faktor 42 höhere Einnahme an Paeoniflorin im Falle des
Granulats.
5.5. Astragalus mongholicus root
QDa Vergleich
Abbildung 13: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Angelica sinensis root
(QDa).
Für die Messung am QDa wurde nur der Zeitraum von 11 min – 17 min registriert. Der
Astragalosid IV Peak der Fluidprobe weist eine geringere Signalstärke auf, trotzdem dass die
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Fluidprobe 4mal stärker konzentriert ist als die Granulatprobe. In beiden Chromatogrammen
ist nach dem Astragalosid IV Peak ein Nebenpeak ersichtlich, dieser wurde jedoch nicht
quantifiziert. Der Peak bei ca. 12.5 min ist in beiden Chromatogrammen ersichtlich. Bei
14.5 min eluiert ebenfalls ein Peak in beiden Chromatogrammen, jedoch erreicht dieser in der
Granulatprobe eine höhere Signalstärke. In der Granulatprobe sind ab 14.5 min weitere Peaks
ersichtlich, welche jedoch nicht in der Fluidprobe detektiert wurden.
ELSD Vergleich
Abbildung 14: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Angelica sinensis root (ELSD).
In den beiden ELSD-Chromatogramme ist ebenso ersichtlich, dass in der Fluidprobe für den
Astragalosid IV Peak eine geringere Signalstärke erreicht wird als in der Granulatprobe.
Grundsätzlich ist ersichtlich, dass die Datenspur detektionsbedingt stark verrauscht und daher
die Nachweisgrenze entsprechend hoch ist. Aus diesem Grund wurde die Auswertung nur
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mittels Massendetektor vorgenommen und auf eine Optimierung der ELSD Parameter bzw.
Erhöhung der Einwaagen verzichtet.
Bezogen auf die Leitsubtanz Astragalosid IV weist das Granulat einen um Faktor 7 höheren
Gehalt auf (0.73 vs. 0.10 mg/g). Berechnet auf die Tagesdosis von 12 g Granulat bzw. 3x50
Tropfen Fluid ergibt sich eine um Faktor 15 höhere Einnahme an Astragalosid IV im Falle des
Granulats.
Dabei ist zu bemerken, dass die Hauptmenge an Astragalosid IV erst durch die basische
Hydrolyse bei der Aufarbeitung entsteht. Nativ sind verschiedene Astragaloside vorhanden,
welche sich in Anzahl und Lage ihrer Acetyl- und/oder Glucosylgruppen unterscheiden [6].
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6. Diskussion
Trotz den teilweisen viel höheren Einwaagen für die Fluidproben erzielten diese immer eine
geringere Konzentration an Leitsubstanz in den Proben. Daraus ergibt sich, dass die
Granulatproben durchwegs höhere Massenanteile an Leitstoffen enthalten als die Fluidproben
und das in einer Bandbreite von Faktor 3 – 764. Werden diese Gehalte mit den
entsprechenden Tagesdosen der beiden Arzneiformen verrechnet, so ergeben sich
Unterschiede bei der aufgenommenen Menge an Leitsubstanz von Faktor 7, 14, 15, 42 und
1300. Eine Äquivalenz der beiden Produktformen auf Basis Leitsubstanzen ist daher
fragwürdig.
Die Parabene in den Fluidproben wurden immer mit einer Testlösung der beiden Parabenen
überprüft, um sicherzustellen, dass keine Parabene die Qualität der Trennung behinderten.
Eine Quantifizierung der Parabene wurde nicht vorgenommen, da diese unter den
verwendeten Chromatographiebedingungen z.T. nicht im relevanten Zeitbereich eluierten und
zudem in den Granualtproben nicht vorhanden sind und kein eigentliches Qualitätsmerkmal
der Arzneiformen darstellen.
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7. Literatur
[1] European Pharmacopoeia 9.1, Angelica sinensis root, 04/2017:2558, EDQM
Strasbourg
[2] European Pharmacopoeia 9.0, Baical skullcap root, 04/2011:2438, EDQM Strasbourg
[3] European Pharmacopoeia 9.0, Liquorice root, 01/2012:0277, EDQM Strasbourg
[4] European Pharmacopoeia 9.0, Peony root, white, 01/2017:2424, EDQM Strasbourg
[5] European Pharmacopoeia 9.2, Astragalus mongholicus root, 07/2017:2435, EDQM
Strasbourg
[6] Marlene Monschein, Rudolf Bauer et al., Accelerated sample preparation and formation
of astragaloside IV in Astragali Radix, Pharmaceutical Biology, 2014, 52:4, 403-409,
DOI: 10.3109/13880209.2013.839712
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Gradient zur Messung der Astragalus Proben am UPLC – System..................10 Abbildung 2: Massenspektrum des Astragalosid IV CRS Standards bei einem Scan [ESI+] von
350-900 m/z. Das Signal von 807 Da entspricht dabei dem [M+Na]+, die Signale bei 419, 437,
455 Da sind charakteristische Fragmente und decken sich mit dem MS-Spektrum, publiziert
unter www.massbank.eu, Record-ID: TY000014 (abgerufen: 20.04.18). Für die
Quantifizierung wurden die vier Massen summiert und als Chromatogramm registriert. .......11 Abbildung 3: Standardgerade für Ferulic Acid. Die Gerade weisst ein Bestimmtheitsmass R2
von 1.0000 auf. Die dazugehörige Geradengleichung lautet: y(x) = 352210215.918x –
21015.667. ...........................................................................................................................12 Abbildung 4: Standardgerade für Baicalin. Die Gerade weist ein Bestimmtheitsmass R2 von
0.9999. Die dazugehörige Geradengleichung lautet: y(x) = 41397405.7073x – 13450.7778 14 Abbildung 5: Standardgerade für 18β-glycyrrhizic acid. Das Bestimmtheitsmass R2 ist 1.000.
Die Geradenfunktion lautet: y(x) = 7933454.731x – 11861.488 .......................................16 Abbildung 6: Standardgerade für Paeonoflorin. Das Bestimmtheitsmass R2 ist 0.9997. Die
Geradengleichung lautet: y(x)=24139228.493x – 42705.263 ................................................18 Abbildung 7: Standardgerade für Astragalosid IV aufgenommen mit dem QDa Ch2 + Ch4-6.
Das Bestimmtheitsmass R2 ist 0.9941, die Geradengleichung lautet: y(x) = 257230848.671x –
1898440.700 ........................................................................................................................20 Abbildung 8: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Angelica
sinensis root. ........................................................................................................................22 Abbildung 9: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Baical
skullcap root. ........................................................................................................................23 Abbildung 10: Overlay der Granulatproben (rot) mit den Fluidproben (blau) von Baical skullcap
root, gezoomter Y-Bereich. ...................................................................................................24 Abbildung 11: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Liquorice
root. ......................................................................................................................................25 Abbildung 12: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Paeoniae
radix alba..............................................................................................................................26 Abbildung 13: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Angelica
sinensis root (QDa). .............................................................................................................27 Abbildung 14: Vergleich der Granulatproben (oben) mit den Fluidproben (unten) von Angelica
sinensis root (ELSD). ...........................................................................................................28
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Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Gemessene und berechnete Werte für die Angelica sinensis root Granulatproben.
.............................................................................................................................................12 Tabelle 2: Mittelwert und Standardabweichung der gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat. ...................................................12 Tabelle 3: Gemessene und berechnete Werte für die Angelica sinensis root Fluidproben. ...13 Tabelle 4: Mittelwert der gemessenen Proben sowie die maximale Tagesdosis bei einer
Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (4980 mg) Fluid. ...........................................................13 Tabelle 5: Gemessene und berechnete Werte für die Baical skullcap root Granulatproben. .14 Tabelle 6: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat. ...................................................14 Tabelle 7: Gemessene und berechnete Werte für die Baical skullcap root Fluidproben. .......15 Tabelle 8: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (7055 mg) Fluid...........................15 Tabelle 9: Gemessene und berechnete Werte für die Liquorice root Granulatproben. ..........16 Tabelle 10: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat. ...................................................16 Tabelle 11: Gemessene und berechnete Werte für die Liquorice root Fluidproben. ..............17 Tabelle 12: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (8250 mg) Fluid...........................17 Tabelle 13: Gemessene und berechnete Werte für die Paeoniae radix alba root
Granulatproben. ...................................................................................................................18 Tabelle 14: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat. ...................................................18 Tabelle 15: Gemessene und berechnete Werte für die Paeoniae radix alba Fluidproben. ....19 Tabelle 16: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (6110 mg) Fluid...........................19 Tabelle 17: Gemessene und berechnete Werte für die Astragalus mongholicus root
Granulatproben. ...................................................................................................................20 Tabelle 18: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 12 g Granulat. ...................................................20 Tabelle 19: Gemessene und berechnete Werte für die Astragalus mongholicus root
Fluidproben. .........................................................................................................................21 Tabelle 20: Mittelwert und Standardabweichung gemessenen Proben sowie die maximale
Tagesdosis bei einer Einnahmemenge von 3x50 Tropfen (5672 mg) Fluid...........................21