ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ I J H =...

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ПРОГРАММА ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ДЛЯ КРУГЛОГОДИЧНЫХ ШКОЛ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОГО РОСТА

Авторы программы:

Кратасюк В.А. – доктор биологических наук, профессор, заведующая

кафедры биофизики ИФБиБТ СФУ;

Римацкая Н.В. - ассистент кафедры биофизики ИФБиБТ СФУ

Коваль А.А. - аспирант кафедры биофизики ИФБиБТ СФУ

Лисина А.Н.- магистрант 2 года обучения ИФБиБТ СФУ

Ускова Т.А.– студент 4 курса ИФБиБТ СФУ

Направление программы школы: естественнонаучное

Название программы школы: «Живое свечение»

Целевая группа: учащиеся 8 – 10 классов

Количество дней/часов: 5 дней / 32 часа

Пояснительная записка

Программа предназначена для учащихся 8 – 10, интересующихся

естественными науками и готовящихся к обучению в вузе на биологических,

химических или физических специальностях. Курс включает материалы, не

пересекающиеся с программами общеобразовательных предметов. Он

направлен на углубленное изучение такого важного явления живой природы,

как биолюминесценция, стоящего на границах таких наук, как физика,

химия, биология.

Цель курса: Ознакомить школьников с новейшими исследованиями в

области биолюминесценции, сформировать заинтересованность в

проведении своих научных исследований в рамках этого направления и

других междисциплинарных направлений, мотивировать учащихся к

изучению дисциплин естественнонаучного цикла.

Задачи курса:

1. Ознакомить школьников с современными научными

представлениями в области актуального направления биофизики –

биолюминесценции.

2. Расширить и дополнить знания по биологии, химии и физике для

более глубокого понимания молекулярных превращений в живых системах.

Сформировать знания об основах протекания ферментативных реакций на

основе биолюминесценции.

3. Ознакомить с основными физическими, химическими и

биохимическими методами исследования биолюминесцентной системы.

4. Развить у школьников экологическое мышление, в частности

провести экологическое тестирование загрязнений окружающей среды с

помощью ферментативных биолюминесцентных биотестов.

5. Сформировать умение постановки задач и проведения

экспериментов на основе применения биолюминесцентных методов анализа

токсичности в бытовых ситуациях. Развить интерес к научно-

исследовательской и проектной деятельности.

6. Одной из важных задач является развитие профильной подготовки

школьников для поступления на естественнонаучные факультеты

университетов, прежде всего, в отдаленных и сельских школах за счет

предоставления образовательных услуг по актуальным направлениям

биохимии, биофизики, а в частности биолюминесценции.

7. Создание потенциала содержания дистанционной образовательной

среды в области биолюминесценции, биотехнологии и других современных

научных направлений.

Актуальность и педагогическая целесообразность.

Биолюминесценция – это одно из немногочисленных биологических

явлений, которое фактически осуществляется на молекулярном уровне, но

имеет видимый и легко регистрируемый эффект в форме испускаемого света.

Механизм этого явления указывает на тесную взаимосвязь физических,

химических и биологических закономерностей. Биолюминесценция широко

используется не только в науке, но и в медицине, экологическом

мониторинге.

На кафедре биофизики Института фундаментальной биологии и

биотехнологии Сибирского федерального университета была создана самая

большая лаборатория в Красноярском крае и в России, занимающаяся

проблемами биолюминесценции. Этот проект поддерживается

«мегагрантом» правительства Российской Федерации, а руководителем

лаборатории является нобелевский лауреат Осаму Шимомура. Исследования

в данной области являются приоритетным направлением не только в рамках

университета, но также представляют значительный интерес для развития

науки в Красноярском крае, как интенсивно развивающемся регионе страны.

Выявление и поддержка одаренных детей являются приоритетными

направлениями деятельности системы образования. Программа школы

«Живое свечение» позволяет создать условия для раскрытия и развития

талантов детей, углубления знаний по биологии, химии и физике. Работа с

одаренными детьми в рамках школы дает возможность построить

индивидуальную образовательную траекторию каждого ребенка,

способствует приобретению ими навыков и умений самостоятельной работы,

исследовательской, аналитической, экспериментальной и проектной

деятельности. Возможность совместной деятельности с учеными и

сотрудниками Сибирского федерального университета способствует

повышению интереса к изучению предметов естественнонаучного цикла и

профессиональной ориентации на биологические и естественнонаучные

специальности, обеспечивающие развитие производства, науки и создание

новых технологий. Программа также направлена на то, чтобы приобщить

школьников к такой глобальной проблеме, как загрязнение окружающей

среды. Экологический мониторинг на основе биолюминесцентных

биотестов, проведенный в рамках данного курса позволит на эксперименте

понять важность проблемы. Содержание программы включает материалы, не

получившие свое отражение в общеобразовательной программе, включает

лекционные и семинарские занятия, задачи и тесты, контрольные вопросы,

позволяющие определить степень продвижения и сформировать рейтинг

обучающихся.

Педагогические концепции, идеи, на основе которых разработана

программа школы.

Программа спланирована, как подробное описание явления

биолюминесценции. Она включает модули, раскрывающие не только важные

аспекты понимания данного явления на молекулярном уровне, но и в

качестве метода, широко используемого для исследований окружающей

среды, человеческого организма и других прикладных задач.

Методологическая идея состоит в том, чтобы корректно изложить сложные

проблемы такого междисциплинарного направления в современной науке,

как биолюминесценция, и одновременно представить материал на научно-

популярном уровне, базирующемся на знаниях, полученных учащимися по

основным предметам школьной программы. Курс содержит задачи,

стимулирующие становление исследовательских навыков, а практическое

обучение методам биотестирования позволит школьникам овладеть

базовыми навыками, необходимыми для работы в любой биохимической

лаборатории: работа с микропипетками, использование биолюминометра,

чтение и запись показаний приборов, выполнение расчетов. Освоение

методов позволит повысить интерес школьников к изучению биологии и

лучше понять, каким образом «добываются» научные факты в области

биологии и биохимии.

Программа основывается на следующих научно-методических

подходах: использование современных форм деятельности и методов

организации процесса обучения, ориентация на компетентностный подход и

современные цели обучения, соответствие современным научным

представлениям в области биолюминесценции, соответствие возрастным и

психологическим особенностям учащихся, обеспечение оптимизации

учебного процесса, обеспечение возможностей использования разных форм

обучения, включая очные, заочные, дистанционные, проведение

консультаций, экспериментальной работы и т.п.

Планируемые результаты, образовательные эффекты.

В ходе освоения курса «Живое свечение» учащиеся приобретут знания

о физико-химических основах ферментативного катализа на основе

биолюминесцентной реакции, поймут что наука может быть интересной

профессией, получат начальные знания о научной методологии на примере

работы со светящимися объектами, освоят простейшие приемы проведения

научных экспериментов и методы современного экологического

мониторинга окружающей их среды.

Позиционный состав педагогической команды.

Кратасюк В.А. – доктор биологических наук, профессор, заведующая

кафедры биофизики ИФБиБТ СФУ, руководитель программы, лектор

Ситникова Л.Б. – преподаватель биологии и химии, высшее

образование, квалификация высшая, стаж преподавания 36 лет,

Педагогический университет КГПУ, проведение лекций и семинаров.

Римацкая Н.В. - биохимическая физика ФГАОУ ВПО СФУ, ассистент

кафедры биофизики ИФБиБТ СФУ, разработка и проведение лекций,

семинаров, обучающих игр.

Ускова Т. А. – биохимическая физика ФГАОУ ВПО СФУ, студент 4

курса ИФБиБТ СФУ, разработка и проведение семинаров, олимпиад,

обучающих игр.

Коллектив исполнителей имеет большой профессиональный опыт

преподавания не только в высших учебных заведениях, но постоянно

участвует в работе со школьниками при реализации индивидуальных и

коллективных образовательных программ со школьниками в

общеобразовательных учреждениях и в ЗЕНШ, участие в работе жюри

всероссийской олимпиады школьников, участие в разработке олимпиадных

заданий для муниципального этапа всероссийской олимпиады школьников,

участие в проведении круглогодичных школ интеллектуального роста для

одаренных детей.

Перечень основных содержательных блоков.

Программа школы включает в себя пять тематических модулей:

Биолюминесценция как явление. Светящиеся организмы.

Основы ферментативного катализа. Биолюминесцентная

ферментативная реакция.

Практическое применение биолюминесцентных систем.

Экологический мониторинг. Биотесты в быту.

Исследовательский практикум. Введение в науку.

Основные формы и методы, режим занятий.

Каждая тема состоит из

теоретической части,

материалов для семинарских занятий,

лабораторного практикума для проведения лабораторных

исследований и для закрепления результатов теоретического

обучения,

контрольно–измерительных материалов: контрольных вопросов и

заданий для проверки результатов обучающихся,

материалов для проведения игр, тренингов, конкурсов и т.д.

Тематика каждого модуля представляет собой относительно

независимый блок материала, соприкасающегося с соответствующим

материалом основной программы, однако не дублирующий его, а

расширяющий и углубляющий знания учащихся в предметной области.

Формы работы: чередование кратковременных общих лекций-бесед,

практических работ в малых группах (до 10 человек) и общих семинаров, на

которых школьники докладывают основные результаты своей работы,

учебные занятия по решению задач, контрольные работы, тесты, игры и

конкурсы, индивидуальные консультации, самостоятельная работа

обучающихся.

Формы организации процесса обучения и применяемые методы

обучения носят интерактивный характер и сочетаются с самостоятельной

внеаудиторной учебной деятельностью учащихся. Содержание предметного

учебного материала интегрировано с практико-ориентированными учебными

задачами.

Режим занятий:

7.30. Подъем.

7.45 – 8.15. Утренняя зарядка.

8.30. Завтрак.

9.00 – 11.00. Учебные занятия

11.15 – 12.45. Учебные занятия (игровые, соревновательные формы).

13.00 –13.30. Обед.

14.00 – 15.30 Учебные занятия.

16.00. Полдник.

16.30 – 17.30. Учебные занятия (игровые, соревновательные формы).

18.00 – 19.00 Самостоятельная работа над проектами, консультации с

преподавателями.

19.00. Ужин.

20.00 – 22.00. Культурно-массовые мероприятия, спортивные

соревнования, спортивные секции.

22.00 Отбой.

Перечень требований к условиям осуществления программы школы

по аудиторному фонду и учебному оборудованию.

1. Зал для заключительной конференции, способный вместить всех

учащихся школы (50 чел.) с проектором и звуковыми колонками – 1 шт.

2. Лекционная аудитория (на 50 чел.) с проектором (интерактивной

доской) и звуковыми колонками, с возможностью выхода в интернет – 1 шт.

3. Аудитории для практических занятий (на 20 чел.) – 4 шт.; в том

числе с проектором и звуковыми колонками (интерактивной доской и

звуковыми колонками) с возможностью выхода в интернет.

4. Компьютерный класс (не менее 10 комп.) с возможностью выхода в

интернет с проектором – 2 шт.

Формы и критерии оценки учащихся.

Предполагается рейтинговая оценка деятельности учащихся школы.

Баллы начисляются за все виды учебной деятельности учащегося

школы интеллектуального роста:

Решение учебных задач на практических занятиях;

Контрольные тесты по пройденному материалу за день;

Участие (с учетом полученных результатов) в играх и конкурсах;

Выполнение учебно-исследовательского проекта (индивидуального

или группового) и/или лабораторного научного исследования и их

презентация на конференции.

Для школьников, занявших первые 10 мест по итогам рейтинга,

предусмотрены рекомендательные письма для зачисления в ЗЕНШ,

организация консультационного сопровождения преподавателями СФУ в

дистанционной форме.

Смета расходов.

Наименование

расходов

Расчет Итого

(рублей)

Оплата труда

преподавателей

1 доктор наук* 32 часа*569,87+27,1

3 препод.* 32 часа*284,93+27,1%

23177,75

34766,02

Транспортные

расходы

625 руб. (средняя стоимость аренды

автобуса в час) * 12 часов * 1 автобус

7500,0

Приобретение

подарков

Подарки, блокноты, ручки с

символикой школы – 50 чел.*400 руб.;

20000,0

Канцелярия 3000,0

Расходные материалы Реактивы, кюветы и т.п. 15000

Дистанционное

сопровождение

1 доктор* 32 часа*569,87+27,1% 23177,75

Итого: 126621,52

Список литературы. 1. Shimomura, O Bioluminescence : chemical principles and methods / World Scientific

Publishing Co. Pte. Ltd., 2006, р. 455.

2. Экологическая биофизика : научно-педагогическое издание : в 3 т. Т. 1

Фотобиофизика экосистем / под общ. ред. И. И. Гительзон, Н.С. Печуркин. – М.: Логос,

2001.–350 с.

3. Фотобиофизика : учеб. пособие / В. А. Кратасюк, И. Е. Суковатая, Е. В. Немцева

и др. – 413 с. – (Фотобиофизика : УМКД № 141-2007 / рук. творч. коллектива В. А.

Кратасюк).

4. Esimbekova, E.N. Disk–shaped immobilized multicomponent reagent for

bioluminescent analyses: Correlation between activity and composition / E.N. Esimbekova, V.A.

Kratasyuk, I.G. Trgashina // Enzyme and microbiogocal technology, 2007. – P 343 – 346.

5. Hastings, J.W., and Johnson, C.H. Methods in Enzymology, 360, 2003, с.75–105.

6. Kratasyuk V.A. Polymer Immobilized Bioluminescent System for Biosensor and

Bioinvestigations / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova // PBM Series – 2003.– V.1/ – P 307–341.

7. Kratasyuk, V., and Esimbekova, E. in Polymeric Biomaterials. The PBM Series, vol.1

(Arshady, R., ed.), Citus Books, London, 2003, с. 301–343.

8. Байрамов, В.М Основы химической кинетики и катализа [Текст] : учеб. пособие /

В.М Байрамов. – М.: Академия, 2003. – 256 с

9. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В.

Левашов, К. Мартинек // В 8 кн.Биотехнология; М.: Высшк. шк, 1987. – 159 с.

10. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: Учеб. для мед. вузов. М.:

«Медицина», 1982. – 752с.

11. Варфоломеев, С.Д Химическая энзимология [Текст]: учеб / С.Д Варфоломеев. –

М.: Академия, 2005. – 480 с.

12. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по

физиологии растений. М.: Всш. шк., 1975.

13. Гительзон, И.И.Светящиеся бактерии: учеб. / И.И. Гительзон, Э.К Родичева,

С.Е Медведева. - Новосибирск: Наука, 1984. – 275 c.

14. Гурский И.П. Элементарная физика. – М.: Наука, 1973

15. Есимбекова Е. Н. Сравнение иммобилизованной и растворимой биферментной

системы NADН:FMN – оксидоредуктаза – люцифераза // Биохимия. Т. 74. – К., 2009. –

вып. 6. – с. 853 – 859.

16. Кнорре Д.Г., С. Д. Мызина. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. и мед.

спец. вузов/. – 3-е изд., испр. и доп. – М.: Высш. шк. 2002. – 479 с., ил.

17. Колтун Марк Мир физики. – М.: Детская литература, 1987

18. Кратасюк, В.А. Бактериальная биолюминесценция и биолюминесцентный

анализ / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Биофизика. – 1982. – т.27. – вып. 6. – C. 937-953.

19. Кратасюк В.А. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы

/В. А. Кратасюк // Люминесцентный анализ в медико–биологических исследованиях: сб.

науч. ст. / Рига: РМИ, 1986. – С. 93 – 97.

20. Кратасюк В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном

анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон //Успехи микробиологии, 1987 - N21 - С. 3-30.

21. Кубасов, А.А Химическая кинетика и катализ [Текст]: учеб. пособие / А.А

Кубасов. – М.: МГУ, 2004. – 144 с.

22. Кудряшева Н.С. Закономерности ингибирования бактериальной

биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами – компонентами сточных вод / Н.С.

Кудряшева, Е.В. Шалаева, Е.Н. Задорожная, В.А. Кратасюк // Биофизика, 1994. – Т.39, N3.

– С. 455–464.

23. Кудряшева, Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа: /

Н.С Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова - Красноярск: КрасГУ, 2002. – 154 с.

(доступно в интернет: http://window.edu.ru/window/catalog? p_rid=26509)

24. Ленинджер, А.Л Основы биохимии [Текст] : учеб / А.Л Ленинджер. – М.: Мир,

1985. – 369 с..

25. Либберт Э. Физиология растений. М.: Мир, 1976.

26. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: Изд-во

МГУ, 1990

27. Панченко, Г. М Химическая кинетика и катализ [Текст] : учеб пособие / Г. М.

Панченко, В. П. Лебедев. — М.: Химия, 1985. - 592 с.

28. Перминова И.В., Жилин Д.М. Гуминовые вещества в контексте зеленой химии.

В: Зеленая химия в России, В.В. Лунин, П. Тундо, Е.С. Локтева (Ред.). М.: Изд-во МГУ,

2004, с. 146-162. (В интернете: www.mgumus.chem.msu.ru/publication/2004/perminova-

guminovye-04.pdf)

29. Родичева, Э.К. Каталог культур светящихся бактерий . / Под ред. Э.К. Родичева,

сост. Родичева Э.К., Медведева С.Е., Выдрякова Г.А. Новосибиоск: изд-во Наука, СО,

предпр. РАН. 1997. - 125 с.

30. Рубин Б.А. Курс физиологии растений. М.: Высш. шк.,1976.

31. Рубин, А.Б Биофизика [Текст]: учеб / А.Б Рубин. – М.: Физматлит, 1999. – 433 с.

32. Скурихин И.М., Шатерников В.А. Как правильно питаться. -М.:

Агропромиздат, 1986г.

33. Тарчевский И.А. Основы фотосинтеза. М.: Высш. шк., 1977.

34. Тривен М. Иммобилизованные ферменты/ М. Тривен – М.: Мир, 1983. – с 213.

35. Тушкова Г.И. Экотоксикологическая оценка поверхностных и подземных вод

Алтайского края / Г.И. Тушкова, Л.С. Эрнестова, И.В. Семенова, Н.А. Рябченко //В кн.

Ядерные испытания, окружающая среда, здоровье населения Алтайского края - Т.2, кн.2 -

Изд-во АГУ, Барнаул, 1993. - С. 112-123.

36. Тюкавкина А. Н., Бауков С. Е. Биоорганическая химия. Учебник для

медицинских вузов. – М.: «Медицина», 1991. – 235с.

37. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии: Учеб. для студ. хим. и биол. спец. пед.

ин-тов. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Высш. шк., 1985. – 503 с., ил.

38. Цыперович А.С Ферменты (основы химии и технологии) [Текст]: учеб / А.С

Цыперович. – Киев.: Техника, 1971. -360 с.

39. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. М., Мир, 1990. – 350с.

40. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и

стереоскопическими иллюстрациями. 2-е изд. М.: Книж. дом «Университет», 2002. – 376

с.

41. Шеховцова Т.Н. Ферменты: их использование в химическом анализе //

Соровский образовательный журнал. 2000. Т.6, №1. С. 44-48.

42. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5-9231-

0254-4 (с. 97-102)

http://window.edu.ru/window/catalog?p_rid=26509
















http://www.mgumus.chem.msu.ru/publication/2004/perminova-guminovye-04.pdf

http://www.mgumus.chem.msu.ru/publication/2004/perminova-guminovye-04.pdf

43. Суковатая И.Е., Кратасюк В.А. Кинетические методы исследования

биологических процессов 1. Стационарная и не стационарная кинетика ферментативных

реакций. Специфичность: метод. указания, Красноярск. Сибирский Федеральный

Университет, 2007

44. Суковатая И.Е., Кратасюк В.А. Кинетические методы исследования

биологических процессов 2. Определение кинетических параметров и типов

взаимодействия ферментов с эффекторами: метод. указания, Красноярск. Сибирский

Федеральный Университет, 2007

45. Электронный фотобиологический справочник - http://www.photobiology.info./

46. Фотобиофизика. Презентационные материалы. Версия 1.0 [Электронный

ресурс] : наглядное пособие / И. Е. Суковатая, В. А. Кратасюк, В. В. Межевикин и др. –

Электрон. дан. (33 Мб). – Красноярск : ИПК СФУ, 2008. – (Фотобиофизика : УМКД №

141-2007 / рук. творч. коллектива В. А. Кратасюк). – 1 электрон. опт. диск (DVD). –

Систем. требования : Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей) 1

ГГц ; 512 Мб оперативной памяти ; 33 Мб свободного дискового пространства ; привод

DVD ; операционная система Microsoft Windows 2000 SP 4 / XP SP 2 / Vista (32 бита) ;

Microsoft PowerPoint 2003 или выше. – (Номер гос. регистрации в ФГУП НТЦ

«Информрегистр» 0320802753 от 22.12.2008).

47. Видеозаписи лекций визит-профессора Джона Ли по теме

«Биолюминесценция» на сайте нститута фундаментальной биологии и биотехнологии

СФУ, режим доступа: http://bio.institute.sfu-kras.ru/?page (на английском языке).

http://www.photobiology.info./

http://bio.institute.sfu-kras.ru/?page

Учебно-тематический план № Наименование разделов,

тем

Базовые понятия Формы

деятельности

Количество

часов

Тео-

рия

Прак-

тика

Модуль 1. Биолюминесценция как явление. Светящиеся организмы.

1 История открытия

светящихся организмов.

Биолюминесценция

моря, люциферин,

люцифераза, холодный

экстракт, горячий

экстракт.

Лекция-беседа. 2 3

2 Химические основы


Хемилюминесценция,

флуоресцентные белки,

ферменты,

интермедиаты,

основное состояние,

возбужденное

состояние,

ферментативное

окисление,

окислительно-

восстановительные

реакции, квантовый

выход реакции.

Лекция-беседа.

3 Светящиеся организмы.

Светящиеся бактерии.

Светляки.

Кишечнополостные.

Ракообразные.

Динофлагелляты.

Моллюски.

Черви.

Симбиоз, фотофоры,

флавинмононуклеотид,

алифатический

альдегид, видимый

спектр,

фотопротеины,

целентеразин, GFP.

Лекция-беседа

Семинарское

занятие, подготовка

мини-докладов.

4 Биологический смысл

и происхождение


Метаболизм, обмен

веществ, активные

формы кислорода,

окислительный стресс,

экзотермические

реакции.


Игра-треннинг.

5 Контрольные вопросы и

задания.*

Самостоятельная

работа 1

Модуль 2. Основы ферментативного катализа. Биолюминесцентная

ферментативная реакция.

1 Ферменты и субстраты

биолюминесцентной

системы.

Белки, ферменты,

субстраты, активный

центр, энергия

активации, переходное

состояние, химическое

равновесие.


Лабораторная

работа «Ферменты

биолюминес-

центной системы».

2 7

2 Химическая природа и

структурная организация

белков на примере

ферментов

биолюминесцентной

системы.

Химическая природа

белков. Аминокислоты,

из которых

образуются белки.

Структурная

организация белков и их

пространственное

строение. Современные

представления о

высших уровнях

структурной

организации белков.

Модификация белков

после их синтеза.

Лекция – беседа.


занятие по решению

задач.


работа

«Простанственная

структура и

организация

бактериальной

люциферазы».

3 Основы ферментативной

кинетики.

Основные свойства

ферментов.

Стационарная

кинетика. Скорость

химической реакции,

закон действующих

масс, коферменты,

кофакторы, фермент-

субстратный

комплекс, уравнение

Михаэлиса-Ментен,

константа Михаэлиса,

сродство фермента к

субстрату, ингибитор,

активатор.



занятие по

решению задач.


работа

«Исследование

влияния

концентрации

субстрата на

кинетику

ферментативной

реакции на примере

бактериальных


центных реакций».

4 Физические основы

функционирования

белков. Регуляция

активности ферментов.

Физические

представления о

механизмах действия

белков, температуный

оптимум, оптимум pH,

денатурация белков.




задач.


работа «Влияние

температуры на

скорость


центной

ферментативной

реакции».


задания.*


работа 1

Модуль 3. Практическое применение биолюминесцентных систем. Экологический

мониторинг. Биотесты в быту.

1 Биолюминесцентные

ферментативные

биотесты. Тестирование

загрязнения воды, почвы,

снежного покрова,

воздуха, лиственного

покрова деревьев.

Факторы токсичности

среды, параметры

жизнедеятельности

живых организмов,

предельно допустимая

концентрация,

биоиндикация,

биотестирование



занятие.


работа «Оценка

загрязнения воды».


работа «Оценка

загрязнения почвы».

2 5

2 Биотестирование качества

продуктов питания.

Пестициды, пищевые

добавки, аспартам,

бензонат натрия,

лимонная кислота,

ортофосфорная

кислота, кофеин,

красители,

ароматизаторы.



работа

«Биолюминес-

центный анализ

чистоты фруктов и

овощей»,


работа «Влияние

сладких

газированных

напитков на живые

объекты»

3 Влияние

электромагнитного

излучения на организм

человека.

Электромагнитное

поле, частота

колебаний, амплитуда,

фаза, длина волны,

диэлектрическая

проницаемость,

проводимость.




задач.


задания.*


работа. 1

Модуль 4. Исследовательский практикум. Введение в науку.

1 Научный метод. Наблюдение, гипотеза,

эксперимент,

воспроизводимость

результатов, теория,

парадигма.

Лекция-беседа. 2 1

2 Правила написания и

оформления научной

работы.

Проблематика работы,

актуальность,

структура оформления

работы



занятие.

3 Контрольное задание,

подготовка к

конференции.*


работа. 1

Олимпиада Контрольное

задание

1

Разбор олимпиадных

задач

Лекция-беседа /

семинарское

занятие

2

Профориентационная

лекция

1

*Семинарские занятия проводятся отдельно для школьников и отдельно для

сопровождающих учителей-предметников

Учебно-тематический план для дистанционного обучения

Лекции Практика Форма/способ обучения

Современные достижения

науки

8 4 On-line лекция, эссе

Решение олимпиадных

задач

6 Тест, электронная почта

Научно-исследовательская

работа

2 10 On-line консультация

(темы будут выбраны во

время очного этапа)

Защита работ on-line 2 Подведение итогов.

Формирование списка для

участия в форуме

«Молодежь и наука»

Дистанционное обучение будет производиться с помощью сайта «http://dovuz.sfu-kras.ru»

и программы Docent PRO

Рекламно-информационное описание программы дополнительного

образования по естественнонаучному направлению «Живое свечение»

Программа дополнительного образования по естественнонаучному

направлению «Живое свечение» разработана коллективом преподавателей

биофизики Сибирского федерального университета, направлена на

формирование познавательной активности учащихся 8-10 классов и включает

материалы, не получившие свое отражение в учебных программах предметов

общего образования.

Цель курса: ознакомить школьников с новейшими исследованиями в

области биолюминесценции, сформировать заинтересованность в

проведении своих научных исследований в рамках этого направления и

других междисциплинарных направлений, мотивировать учащихся к

изучению дисциплин естественнонаучного цикла.

В ходе реализации дополнительной образовательной программы

естественнонаучного направления «Живое свечение» создаются условия для

раскрытия и развития талантов детей, получение дополнительных знаний по

биологии, химии и физике способствует повышению интереса к изучению

данных предметов и профессиональной ориентации на естественнонаучные

специальности, обеспечивающие развитие науки и новейших

производственных технологий.

В рамках курса учащиеся получат возможность прослушать лекции

лучших преподавателей и профессоров СФУ, получить консультации у

аспирантов, напрямую занимающихся научной деятельностью. Школьники

познакомятся с современными научными представлениями в области

биофизики и других предметов естественнонаучного цикла, приобретут

навыки научно-исследовательской и проектной работы в освоении

биофизической картины мира, опыт продуктивной творческой деятельности

при проведении лабораторных исследований на базе современных цифровых

лабораторий с использованием современных образовательных и

информационных технологий.

Для школьников, занявших первые 10 мест по итогам рейтингования,

предусмотрены рекомендательные письма для зачисления в ЗЕНШ,

организация консультационного сопровождения преподавателями СФУ в

дистанционной форме. Программа реализуется в дни школьных каникул в

межрайонных ресурсных центрах по работе с одаренными детьми.

Информация об организации-заявителе:

1. Фирменное наименование

Участника:

Федеральное государственное

автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Сибирский федеральный университет»

2. Организационно-

правовая форма:

Некоммерческая организация

3. Адрес местонахождения

юридического лица

(юридический адрес):

660041, Российская Федерация, г.

Красноярск,

проспект Свободный, д. 79

4. Адрес для почтовых

отправлений

(фактический адрес):

660041, Россия, г. Красноярск,

проспект Свободный, д. 79.

5. Банковские реквизиты: Расчетный счет №

40503810802004000003

в СФ ОАО АКБ «Международный

финансовый клуб» г. Красноярск

БИК 040407592

к/с № 30101810100000000592

6. Контактная информация:

Ректор СФУ:

Куратор программы:

Ваганов Е.А., (391)244-82-13

Римацкая Н.В., (391) 206-21-59,

[email protected]

ПРИЛОЖЕНИЯ

План конспект Тема1

Биолюминесценция как явление. Светящиеся организмы

1.1. История открытия светящихся организмов

Свечение живых организмов, или биолюминесценция - одно из

прекрасных проявлений жизни на нашей планете, распространено

практически повсеместно - от экватора до полярных широт, от поверхности

до предельных глубин, как у наземных, так и у морских организмов. Среди

авторов многочисленных наблюдений биолюминесценции, отличающихся

изумительной точностью и поэтичностью, Александр Македонский, Ч.

Дарвин, Ф.О. Дербек, Е.Н Гарвей и другие ученые. Помните у К.Г.

Паустовского: “Море горело… Мириады звезд, сотни Млечных путей

плавали под водой”? А в “Прелюдии” Ф. Гарсия Лорка: “А мир светляков

нахлынет – и прошлое в нем потонет…”? Или совсем детское “Налетели

светляки, зажигали огоньки…”.

На протяжении многих веков удивительное явление - свечение ночного

моря завораживало мореплавателей, биологов и жителей прибрежных

районов. Почему море "сияет", долгое время для всех оставалось загадкой.

Суеверные мореплаватели даже верили, что это проделки морских духов, и

опасались выходить в море ночью. Эта тайна была разгадана в 1753 году,

когда впервые с помощью увеличительного стекла были обнаружены

крохотные организмы диаметром около 2 мм. В ответ на любое раздражение

они начинали светиться. За свою особенность эти микроорганизмы

получили название ночесветки.

Способность живых организмов светиться называют

биолюминесценцией. Это название происходит от греческого слова «биос»,

что означает «жизнь», и латинского «люмен», что переводится как «свет».

Однако обнаружение ночесветок нельзя назвать открытием

биолюминесценции и тем более её объяснением. Первым серьёзным

исследователем этого явления стал Роберт Бойль (1627-1691), английский

физик и химик, который, является еще и одним из основоположников химии

как науки. Говорят, что своему открытию Бойль обязан нерасторопности

своих слуг. Однажды слуга пригласил посмотреть его на кусок протухшего

мяса, который кроме того испускал неяркий свет. Забыв про ужин, учёный

немедленно приступил к изучению феномена. Он проделывал следующий

опыт: помещал светящееся мясо в специальный сосуд и откачивал из него

воздух. При удалении воздуха из сосуда свечение прекращалось. Однако

стоило вернуть воздух, как оно вновь появлялось. На основании этого Бойль

сделал вывод о том, что какой-то компонент воздуха необходим для

свечения. Позднее было выяснено, что это кислород.

Рис.1.1 Ночесветка

Спустя два столетия Рафаэло Дюбуа (1818-1896) обнаружил, что при

смешивании светящихся органов светляков с холодной водой в течение

нескольких минут наблюдается свечение, однако при контакте с горячей

водой оно быстро исчезает. Дюбуа предположил, что помимо кислорода для

этого явления необходим еще какой-то компонент, который содержится

именно в холодной воде. Таким образом, после опытов Дюбуа стало понятно,

что для биолюминесценции необходимы два компонента, один из которых

при нагревании разрушается. Одно вещество он назвал «люциферином» (от

слова «Люцифер» по – латыни «несущий свет»), а другое, которое

разрушается при нагревании – «люциферазой».

Ну, а дальше во второй половине 20 века, когда были получены эти

два необходимых компонента, ученые научились использовать явление

свечения живых организмов, в первую очередь для биолюминесцентного

анализа. Методы биолюминесцентного анализа основаны на измерении

концентрации разнообразных веществ, активности разных ферментов и

метаболитов по интенсивности свечения ферментативных реакций свечения

разнообразных организмов, в которых участвуют эти анализируемые

вещества.

1.2. Химические основы биолюминесценции

Природной способностью светиться обладает относительно небольшое

число видов животных и растений из почти всех крупных таксонов кроме

высших растений и млекопитающих. Светящиеся формы обнаружены среди

бактерий, простейших, кишечнополостных, моллюсков, иглокожих, червей,

ракообразных, оболочников, многоножек, насекомых и рыб (рис. 1.2).

Как правило, в резльтате химической реакции энергия выделяется в виде

тепла, но существуют реакции в ходе который выделяется свет. К таким

видам реакций относятся биолюминесцентные. Свечение всех светящихся

организмов происходит благодаря наличию в их организме специальных

ферментов – люцифераз, катализирующих хемилюминесцентные реакции

окисления субстратов, называемых люциферинами ("Люцифер" по-латыни -

"несущий свет") (рис.1.3,1.4).

Ферменты - вещества, ускоряющие ход реакции в 1012 раз и даже

более. Они играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности.

Дело в том, что некоторые реакции протекают чрезвычайно медленно,

например, несколько десятков лет. Но стоит провести эту же реакцию в

присутствии фермента, как время её протекания сокращается до долей

секунды. Представьте, если бы вся жизнь промелькнула у вас перед глазами

за секунду и на этом закончилась. Не очень весело, правда? Но в биологии

без этого никуда, ведь, чтобы выжить, организму необходимо своевременно

получать и перерабатывать вещества.

Рис.1.2. Филогенетическое древо животного мира (основные типы и классы) и

распределение светящихся форм по нему. Звездочкой на рисунке обозначены классы, в

которых есть способные к свечению виды. Тип простейших: 1-саркодовые, 2-споровики,

3-жгутиконосцы, 4-инфузории, 5-тип губок; тип кишечнополостных: 6-гребневики, 7,8–

коралловые полипы, 9-медузы; тип плоских червей: 10-турбеллярии, 11-сосальщики, 12-

ленточные черви, 13,14– круглые черви; тип кольчатых червей: 15–пиявки, 16-

малощетинковые кольчецы, 17-многощетинковые кольчецы; тип моллюсков: 18-

панцирные, 19-двустворчатые, 20-брюхоногие, 21–головоногие; тип членистоногих: 22-

тихоходки, 23–мечехвосты, 24-ракообразные, 25-многоножки, 26-насекомые, 27-

паукообразные; 28-тип мшанок, 29-тип полухордовых; 30-тип оболочников; тип

иглокожих: 31-морские лилии, 32–морские звезды, 33- морские ежи, 34-голотурии, 35-

офиуры; тип хордовых; 36-бесчерепные, 37-круглоротые, 38-рыбы, 39-амфибии, 40-

рептилии, 41-птицы, 42-млекопитающие.

Рис.1.3. Биолюминесцентные реакции разных светящихся организмов (по плакату фирмы

ЛКБ-Валлак, Швеция)

Рис.1.4. Люциферины разных видов светящихся организмов: а–светляки; б–Renilla; в-

Cypridina; г- Pholas; д– Diplocardia е-субстраты бактериальной люциферазы

У ферментов есть одна особенность: они специфичны. Это означает,

что каждый фермент, как правило, ускоряет строго определённую реакцию.

Поэтому у каждого фермента есть свой субстрат, т.е. такое вещество, для

которого данный фермент является специфическим катализатором. Другими

словами, субстрат — это исходный вещество, преобразуемое с помощью

фермента в конечный продукт. В реакции биолюминесценции в роли

фермента выступает люцифераза, а её субстрата - люциферин. Это означает,

что люцифераза будет ускорять только те реакции, в которых присутствует

специфичный ей люциферин. Любые другие реакции в её присутствии будут

проходить в своём обычном режиме. Вообще говоря, люцифераза – это

собирательное название ферментов. У различных организмов люциферазой

являются разные по составу и структуре вещества. То же самое касается и

люциферина (рис.1.3, 1.4).

Таким образом, люциферины и люциферазы – это собирательно-

функциональные, а не структурно-химические понятия, ими обозначаются

субстраты и ферменты, при взаимодействии которых излучается свет.

Реакция биолюминесценции относится к окислительно-

восстановительным. В ходе неё происходит окисление субстрата

люциферина в присутствии фермента люциферазы. Люциферин передаёт

свои электроны кислороду, вследствие чего образуется молекула воды.

LH2 + ½ O2 L + H2O + свет ,

где LH2 – восстановленный люциферин, L – окисленный люциферин

Особенность этой реакции заключается в том, что большая часть

энергии переходит не в тепло, а излучается в виде света. Процесс испускания

света можно разбить на 2 стадии:

1) образование молекул в возбуждённом состоянии из исходных

продуктов

2)переход возбуждённой молекулы в основное состояние с выделением

света

Во время ферментативного окисления люциферина образуются большие

количества энергии (40-80 ккал/моль), что приводит к переходу

промежуточного продукта в возбужденное состояние. Молекула этого

продукта либо сама излучает квант света, возвращаясь в основное состояние

(прямая хемилюминесценция), либо осуществляет безызлучательный

перенос энергии к другой светоизлучающей молекуле (непрямая

хемилюминесценция).

Что же такое возбуждённое состояние?

Дело в том, что наиболее стабильным является состояние атома,

молекулы или системы с минимальной энергией, к которому они и

стремятся. Любое иное состояние называется возбужденным. Рассмотрим это

на примере атома.

Представим себе ядро и несколько электронных орбит вокруг (рис.1.5) .

Сейчас атом находится в основном состоянии (а). Теперь придадим атому

избыток энергии, например, облучив его светом (б). После этого атом

перейдет в возбужденное состояние (в). Такое изменение сопровождается

переходом одного или нескольких электронов с занятых орбиталей на

свободные или занятых частично. Так как атом стремится к состоянию с

минимальной энергией, электроны со временем возвращаются на свои

исходные орбитали, выделяя при этом избыток энергии в виде света (г).

Теперь атом снова находится в основном состоянии (д).

Рис. 1.5. Процесс возбуждения атома

Эффективность хемилюминесцентных реакций определяется квантовым

выходом – отношением числа испущенных фотонов к числу

прореагировавших молекул. Для разных хемилюминесцентных систем он

варьирует в широком диапазоне от 10-15

до 1. Квантовый выход

люциферазных реакций сравнительно высок (0,1 – 1). Помимо высокого

квантового выхода особенностью биолюминесцентных систем является

обязательное участие в реакциях биолюминесценции специфических белков

– люцифераз, которые выступают либо в роли носителя небелкового

излучающего хромофора, либо в роли биокатализатора, участвующего в

образовании электронно-возбужденного продукта. Высокие квантовые

выходы в биолюминесцентных реакциях связаны с образованием

промежуточных продуктов в форме фермент-субстратных комплексов

(интермедиатов), способных длительно хранить и преобразовывать

значительные порции энергии и защищенных от различного рода процессов

переноса и превращения энергии, снижающих квантовые выходы.

Механизмы биолюминесцентных реакций разных светящихся организмов,

там, где они расшифрованы, во многом сходны. Рассмотрим это на

некоторых группах светящихся организмов.

1.3. Светящиеся бактерии

Все известные в настоящее время светящиеся бактерии делятся на две

группы: морские и пресноводные. Известно 3 рода морских светящихся

бактерий: Photobacterium, Beneckea (Vibrio), Alteromonos [2 -6]. Среди

светящихся бактерий имеются свободноживущие, сапрофитные и

паразитирующие формы. Они живут в водах морей от тропиков до высоких

широт, редко встречаются в поверхностном слое, в основном их ареал

приурочен к зонам повышенной концентрации планктона. По численности

светящиеся бактерии могут составлять до 60-70% от свободно живущих

сапрофитов морских вод. Весьма регулярно они встречаются в качестве

симбионтов, живущих факультативно в кишечнике, реже в других органах

морских рыб, моллюсков, губок. Симбиотические светящиеся бактерии

населяют специальные органы (фотофоры) некоторых глубоководных рыб и

головоногих моллюсков. (рис.1.6).

Всемирно известные ученые Гастингс и Гибсон еще в 1963 году

предложили схему действия бактериальной люциферазы (рис.1.7), которая

лежит в основе всех последующих предложенных схем и считается наиболее

экспериментально подтвержденной. Бактериальная люцифераза катализирует

реакцию окисления восстановленного флавинмононуклеотида (ФМНН2) и

длинноцепочечного алифатического альдегида в присутствии молекулы

кислорода до ФМН и соответствующей жирной кислоты.. Продуктами

реакции является также молекула воды и светоизлучение. Квантовый выход

реакции биолюминесценции бактерий составляет 0,1-0,5, а светоизлучение

наблюдается в сине-зеленой части видимого спектра с максимумом 478-505

нм.

Рис.1.6. Глубоководная светящаяся рыба-удильщик. Светятся окончания «удочки»,

служащие приманкой для рыб (слева). Справа- колонии светящихся бактерий, живущих в

фотофорах рыб, на чашках Петри с питательной средой.

При небольших межвидовых различиях бактериальная люцифераза

представляет собой гетеродимер с молекулярной массой 79000, состоящий из

двух неидентичных субъединиц (42000 и 37000 соответственно). Фермент не

содержит металлов, неаминокислотных остатков и простетических групп.

Каталитической активностью обладает только димер. Роль субъединиц в

катализе различна. Опыты по химической модификации и гибридизации,

изучению протеолиза люциферазы показывают, что активный центр

локализован на большой субъединице, тогда как меньшая определяет

температурную стабильность фермента и важна для поддержания

конформации фермента. На бактериальной люциферазе расположен один

центр связывания для ФМНН2 и один - для альдегида.

Кислород играет очень важную роль в жизненном цикле светящихся

бактерий. Эти бактерии являются облигатными аэробами по свечению.

Очень малых концентраций кислорода оказывается достаточно, чтобы

бактерии начали светиться, поэтому их даже используют как один из самых

чувствительных индикаторов следовых количеств кислорода (от 10-10

М до

10-5

М).

Второй метаболический процесс, на который светящиеся бактерии

расходуют кислород – дыхание. Распределение потребления 02 между

процессами свечения и дыхания зависит от условий роста бактерий. Так, в

фазе замедленного роста бактерий наблюдается их максимальное свечение

благодаря тому, что на свечение идет почти весь поглощаемый кислород.

Распределение 02 между свечением и биоэнергетическими процессами у

светящихся бактерий идет по пути конкуренции между ними за электроны.

Однако механизм конкуренции за электроны между свечением и дыханием

до сих пор окончательно не ясен.

Рис.1.7. Схема механизма реакции бактериальной биолюминесценции

1.4. Светляки

Различные виды светляков (насекомые семейства Lampyridae)

встречаются на юге Северной Америки, в Японии, Юго-Восточной Азии, а

также на Черноморском побережье Кавказа и в Приморском крае (рис.1.8.).

Рис. 1.8. Светляки

Несмотря на то, что люциферазы разных видов светляков немного

отличаются по строению и составу аминокислот, максимуму длины волны

излучаемого света (554-582 нм) и по рН-зависимости, они катализируют одну

и ту же реакцию (рис.1.3). Люминесцентная реакция светляков

осуществляется в два этапа. На первом происходит активация субстрата –

люциферина аденозин-3-фосфатом (АТФ) при участии люциферазы. Затем

образовавшийся на данной стадии, связанный с ферментом

люцифериладенилат реагирует с одной молекулой О2 и образует

возбужденный продукт, который излучает квант света при переходе в

основное состояние. На каждую молекулу люциферина или АТФ

потребляется одна молекула кислорода и образуется одна молекула

углекислого газа. Квантовый выход реакции равен 1,0.

Люцифераза светляков состоит из двух субъединиц с молекулярной

массой 50000 каждая и не содержит простетических групп. В состав

молекулы люциферазы входит большое количество гидрофобных

аминокислот, что объясняет высокую склонность люциферазы к

образованию агрегатов, особенно при низких значениях ионной силы.

Люцифераза светляков содержит, по крайней мере, одну SH-группу,

существенную для проявления активности, и имеет высокую специфичность

к своим субстратам: люциферину и АТФ. Уровень свечения с аналогами

АТФ обычно в 50 –100 раз ниже по сравнению с АТФ; при этом во многих

случаях происходит изменение положения максимума излучения.

1.5.Кишечнополостные

Биолюминесценция многих видов морских кишечнополостных, к

которым относятся светящиеся медузы, обусловлена специфическими

белками, получившими название Ca2+

-активируемых фотопротеинов,

присутствующих в гидробионтах в виде стабильных предварительно

заряженных фермент-субстратных комплексов белка и люциферина,

носящего в данном случае название целентеразина. Поэтому фотопротеины в

отличие от бактериальной люциферазы способны совершать только один

каталитический акт: при взаимодействии с ионами кальция вся

аккумулированная в комплексе энергия излучается в виде квантов света.

В настоящее время известно до 25 видов люминесцирующих морских

кишечнополостных, включающих семейства Cnidaria и Ctenophora, и

обладающих фотопротеиновым типом люминесцентной системы. Однако

только 7 из известных фотопротеинов выделены и частично

охарактеризованы.

Наиболее изучены обелин из гидроидных полипов рода Obelia и

акворин из гидромедуз рода Aequorea (рис.1.9). Обелин – мономерный белок

с молекулярной массой 30000. Для обелина характерен спектр

люминесценции с максимумом при 469 нм. Оптимум рН люминесценции

обелина приходится на интервал 9,0-10,5. По основным физико-химическим

свойствам обелин сходен с акворином.

Рис.1.9. Светящиеся кишечнополостные: гидромедуза рода Aequorea (слева) и гидроидные

полипы рода Obelia (справа)

Для люминесценции морских анютиных глазок Renilla характерен

зеленый флюоресцирующий димерный белок с молекулярной массой 54000.

Он возбуждается за счет безызлучательного переноса энергии с

возбужденного оксилюциферина и испускает квант света с длиной волны 509

нм. В отсутствие этого белка наблюдается голубое свечение (490нм). С

люциферазой Renilla (м.м. 35000) он образует прочный комплекс, благодаря

которому повышается эффективность безызлучательного переноса энергии.

Механизмы образования возбужденного комплекса – фотопротеина у

Renilla сходны с аналогичными процессами у Aequorea и Obelia. Однако

полученный в ходе реакции фотопротеин последних отличается высокой

стабильностью и способен в течение долгого времени находиться в

возбужденном состоянии, не диссипируя энергию до тех пор, пока в системе

не появятся двухвалентные металлы (Са2+

, Sr2+

).

1.6. Ракообразные

Ракушковый рачок Cypridina имеет длину тела 3 мм и обитает вдоль

южного берега Японии (рис.1.2). При раздражении он выбрасывает в

морскую воду из раздельных гланд люциферин и люциферазу. Его

биолюминесцентная реакция представляет собой окисление люциферина

кислородом, катализируемое люциферазой. Образовавшееся в реакции

четырехчленное перекисное соединение (диоксиэтан), разлагаясь, дает квант

света (462 нм) и продукты – оксилюциферин и СО2. Люциферин Cypridina

имеет много общего с люциферином Renilla и других кишечнополостных.

Молекулярная масса люциферазы Cypridina –68000. Молекула состоит из 6

субъединиц, не содержит простетических и SH-групп, а ее аминокислотный

состав близок к составу люциферазы из Renilla. Диссоциированные

субъединицы быстро и необратимо инактивируются. Квантовый выход

биолюминесценции – 0,31 в расчете на 1 моль продукта реакции -

оксилюциферина.

1.7. Динофлагелляты

Динофлагелляты рода Goniaulax относятся к группе протистов и

получили свое название за то, что каждая их клетка снабжена двумя

жгутиками. Особенностью люциферазной системы динофлагеллят является

регулирование люминесценции с помощью скачка рН, обеспечивающее

проявление циркадных ритмов свечения. В этих организмах существует 2

типа люцифераз: высокомолекулярная (м.в. 100000) люцифераза с рН-

оптимумом действия 6,6 и низкомолекулярная люцифераза, активная в

широком диапазоне рН (6,0-9,0). Низкомолекулярный фермент образуется

под действием эндопротеазы, которая также высвобождает ковалентно

связанный с высокомолекулярной люциферазой люциферин, участвующий

далее в биолюминесцентной реакции.

1.8. Моллюски

Оба компонента биолюминесцентной системы моллюска Pholas dactilus

–люциферин и люцифераза – гликопротеиды. Люцифераза –

высокомолекулярный металлогликопротеид с м.м. 310000. Молекула состоит

из двух субъединиц и содержит два атома меди. Люциферин – мономерный

гликопротеид с м.м. 3400 (рис. 1.4). Биолюминесцентная реакция Pholas

dactilus протекает в несколько этапов: на первом формируется стабильный

фермент – субстратный комплекс, который взаимодействует с О2 и образует

возбужденный продукт, последний переходит в основное состояние с

излучением кванта света (490 нм).

1.9. Черви

В некоторых случаях в качестве окислителя люциферина выступает не

молекулярный кислород, а перекись водорода. Примером может служить

биолюминесцентная реакция земляного червя Diplocardia.

О ферментах и биолюминесцентных системах многих других светящихся

организмов (рыб, грибов, червей и т.п.) мало что известно.

План конспект Тема2

О происхождении и биологическом смысле биолюминесценции

До сих пор непонятно каким образом и для какой биологической цели

создан и работает сложный механизм излучения света живыми организмами?

Какие селективные преимущества обеспечены в эволюции организмам,

способным излучать свет? Все известные или предполагаемые функции

биолюминесценции так или иначе связаны со зрительным поведением

многоклеточных животных в темноте (привлекающий эффект статического

света бактериальных колоний и плодовых тел грибов, пугающее,

дезориентирующее или сигнальное назначение вспышек, освещение

ближнего пространства, светомаскировка снизу на светлом фоне водной

поверхности и т.д.).

Существует большое количество гипотез о происхождении и смысле

биолюминесценции, но все эти представления можно свести к двум группам,

реализуемым у разных светящихся организмов:

1. Излучение света само является биологической функцией, и

энергетические затраты на излучаемый свет оплачиваются некими

экологическими преимуществами для светящихся организмов

2. Люминесцентная система из люциферазы и сопряженных ферментов

выполняет какую-то метаболическую функцию, а свечение является ее

побочным продуктом и не играет собственной роли.

Рассмотрим подробнее гипотезы, принадлежащие к первому классу.

Большинство светящихся существ морские, среди них много

глубоководных. Самые известные и хорошо изученные из них: удильщик,

медуза и кальмары. К биолюминесценции также способны грибы, отдельные

виды земляных червей, улиток, комаров и жуков. Некоторые животные

способны испускать свет самостоятельно, но большинство светятся за счёт

живущих в них бактерий. Живые бактериальные светильники иногда

использовали даже для освещения: в 1935 году этими микроорганизмами

был освещен большой зал Международного конгресса в Париже. Советский

микробиолог А.Егорова использовала такие бактерии для освещения

лаборатории во время войны. Микробиологи Р.Чумакова и Ю.Сорокин во

время встречи Нового года в одной из экспедиций в Индийском океане

создали из светящихся бактерий живую картину заснеженного леса в лунную

ночь. Это впечатляющее зрелище навсегда осталось в памяти участников

рейса.

Тем не менее, вряд ли какой-нибудь организм может позволить себе

роскошь светиться без надобности. Энергетически это слишком дорогое

удовольствие. Большинство биолюминесцентных существ испускают

световые вспышки в ответ на внешнее раздражение или при необходимости.

Чаще всего такой свет дезориентирует зрячих хищников, отпугивает быстро

движущихся крупных животных, приманивает особей своего вида и т.д.

Например, медуза Акворея (рис.1.9) реагирует на внешнее раздражение.

Чаще всего, такой свет при приближении крупных животных, способных

повредить желеобразный организм при случайном столкновении с ним.

Поэтому свет возникает, когда медуза чувствует опасность.

Жуки-светляки испускают свет, чтобы найти себе пару. Разные виды

этих насекомых испускают свет с различной частотой, поэтому каждый

светлячок уверен, что он спаривается с самкой именно своего вида. Но самки

некоторых видов, например, американского светляка Photuris versicolor

сначала подманивают специфичной «световой морзянкой» самцов своего

вида и спариваются с ними, а затем начинают генерировать «морзянку» для

самцов чужого вида, чтобы пообедать ими.

Внешность светящейся рыбы-удильщика (рис.1.6) малопривлекательна

- непропорционально большая голова оснащена огромными зубами и

специальной удочкой, которой он приманивает себе добычу - отсюда и

название. На конце удочки находится прозрачный мешочек, в нем живут

бактерии, которые светятся строго по желанию своего хозяина. Подманивая

добычу, удильщик постепенно придвигает светящуюся приманку ко рту,

пока не захватит свою жертву. Такая прожорливость подчас приводит к

гибели. Иногда на поверхности моря находят мертвых удильщиков,

подавившихся рыбой, превышающей их по размерам более чем в два раза:

выпустить ее хищник не может из-за строения своих зубов.

Рис.1.10. Светящийся кальмар

На теле светящихся моллюсков –кальмаров - расположены

многочисленные голубоватые точки — светящиеся органы — фотофоры,

напоминающие по конструкции автомобильную фару. Некоторые кальмары

буквально усеяны ими не только снаружи, но и изнутри. Фотофоры - самые

экономные в мире лампочки, а светятся они за счёт бактерий, которые в них

живут. У «фонарика» есть и выключатель - когда нужно «потушить» свет,

моллюск выделяет несколько капель чернил. Они покрывают тонкой пленкой

мешочек с бактериями, как бы набрасывая на него черное покрывало, и свет

гаснет.

Но фотофоры нужны моллюскам не для красоты, на самом деле, они

используют их для того, чтобы скрываться от хищников. Например, когда на

кальмара нападает акула-барракуда, то он начинает светиться. Таким образом

он привлекает внимание более крупного хищника- рыбы- меч .Естественно,

что большая и вкусная барракуда для рыбы- меч привлекательнее, чем

кальмар. Поэтому рыба- меч нападает на барракуду , а у кальмара, в это

время, есть шанс скрыться.

Понятно, что возникновение такого рода гипотез происходит в

результате использования исследователями антропоморфного подхода : «Что

бы я сделал, если бы был светящейся бактерией или рыбой?».

Теперь мы рассмотрим гипотезы, связанные с участием

люминесцентной системы в обмене веществ.

Мозаичное распределение светящихся форм на филогенетическом древе

(рис.1.2) свидетельствует, скорей всего, о полифилетическом, то есть

многократном и независимом, происхождении биолюминесценции как

жизненно важной функции.

Вот только какой?

Сравнение между собой биолюминесцентных систем разных светящихся

организмов убедило нас в том, что люциферазы сильно отличаются друг от

друга по структуре и свойствам, хотя и выполняют одну и ту же функцию –

катализируют реакцию светоизлучения. Из сходных функций проистекает

сходство люциферинов - субстратов разных люцифераз. Так, химически

идентичные люциферины встречаются среди большого числа

филогенетически отдаленных типов, таких как рак-отшельник Cypridina,

костистые рыбы Apogon, Parapriscantus, Porichthys. Свечение гидромедуз

Aquorea, Halistaura и Obelia связано с “фотопротеиновым” комплексом и

запускается следовыми количествами Са+2

, а входящий в “фотопротеин”

хромофор имеет ту же структуру, что и природный люциферин из морских

анютиных глазок Renilla и функционирует у различных неродственных

видов, восстанавливаясь на свету и окисляясь О2. Однако известен ряд

биолюминесцентных систем, в которых люциферин окисляется не

молекулярным кислородом, а его активными формами - перекисью водорода

- Н2О2 или супероксидом (О2-), причем в первом случае - с участием субстрат

- специфичной пероксидазы, а во втором, по-видимому, даже без фермента. С

окислением активными формами кислорода разных органических

соединений связано и сверхслабое свечение. Однако его квантовый выход

несравненно ниже, чем у специализированной биолюминесценции. Даже для

фотопротеинов постулировано, что они содержат стабилизированное

кислород-содержащее соединение, в связи с чем для завершения реакции не

требуется дополнительные количества кислорода, а нужен только Са+2

.

Из всех гипотез наиболее вероятной кажется та, согласно которой

биолюминесценция возникла независимо у разных организмов как способ

защиты от окисления клеточных субстратов свободным кислородом в

момент его первичного накопления в атмосфере и сохранилась у некоторых

видов живых организмов до настоящего времени, так как давала им какие-то

селективные преимущества перед другими несветящимися организмами.

Функцией люциферинов могла быть детоксикация активных форм

кислорода, образуемых в морской воде при действии УФ-компонента

солнечной радиации или как "неизбежное зло" при аэробном дыхании. Эта

функция состояла в защите от самоуничтожения клеток, почему-либо в

повышенных количествах продуцирующих свободные радикалы (фагоциты,

эпителиальные железы водных животных и т.д.). Это подтверждается

происхождением большинства специализированных фотогенных структур.

Биолюминесценцию, вероятно, порождали нейтральные мутации,

приводившие к появлению в клетках, секретирующих в среду свободные

радикалы для каких-либо целей (защиты от эндопаразитов или от внешних

врагов, у паразитических фотобактерий – для деструкции тканей хозяина и

т.д.),- новых антиоксидантов, необычайно ярко светящихся при окислении.

Дальнейший отбор появившихся de novo биолюминесцентных систем мог

быть направлен на уменьшение риска окислительного стресса через

замещение активных форм кислорода молекулярным кислородом при

ферментативном окислении. В пользу этого представления имеется немного

данных, но они весомы. Известно, что люциферазы обладают необычайно

высоким сродством к кислороду. Так, люцифераза бактерий, например,

сохраняет способность функционировать при его концентрации ниже 10-8

молей, когда кислород уже не может использоваться в дыхании. Темновые

мутанты, более чувствительные к дефициту кислорода, погибают при его

недостатке, теряют устойчивость к окислительному стрессу, вызванному

свободными радикалами, в то время как светящиеся штаммы при данных

условиях выживают. В этом случае наличие люциферазной системы

проявляется прямым преимуществом для светящихся организмов.

Такой механизм был необходим миллиарды лет назад, когда

формировалась атмосфера (в составе атмосферы стал появляться кислород, в

то время ядовитый для живых существ). Сейчас кислород перестал быть для

организмов токсичным веществом, и свечение сохранилось как рудимент

(орган, утративший своё основное значение в процессе эволюции) у

некоторых видов бактерий. Но наличие сложного механизма регуляции

заставляет некоторых исследователей считать это представление

маловероятным. Если расходы на функционирование этой системы не

оплачиваются какими-то выгодами, то они бы давно исчезли, следовательно

свечение даёт неоспоримые преимущества. Сегодня многие учёные

предполагают, что люминесцентная система участвует в обмене веществ, а

свечение является её побочным продуктом. Например, существует гипотеза,

что в условиях недостатка кислорода для дыхания светящиеся организмы

используют люциферазную систему. Это предположение находит

подтверждение у светящихся бактерий видов Photobacterium fischeri и

Photobacterium phosphoreum . Синтез люциферазы у них усиливается при

снижении концентрации кислорода. И, несмотря на его недостаток, они

выживают. Представители же, потерявшие способность к свечению, более

чувствительны к дефициту кислорода и погибают при тех же условиях.

Так же есть и другие гипотезы, например о том, что биолюминесценция

дает защиту от перегрева. В пользу гипотезы свидетельствуют некоторые

соображения о том, что так как большинство химических реакций протекают

с выделением тепла, а значит, тело рыбы должно нагреваться. Однако этого

не происходит. Причиной этому может служить преобразование химической

энергии в энергию биолюминесценции, т.е. свечение.

Интересно, что биолюминесценция была вторично использована

некоторыми светящимися организмами для организации на ее основе

поведенческих признаков. Чаще всего биолюминесценции приписывают

сигнальную функцию. У некоторых видов рыб излучение может играть роль

стайного сигнала, полезного в раннем возрасте. У глубоководных

удильщиков свет может служить приманкой для добычи, средством

отпугивания или дезориентации хищников. Назначение свечения у светляков

- внутривидовая, в частности, межполовая сигнализация. Можно привести

примеры маскирующей роли излучения: тень рыбы на фоне солнечного

света, падающего сверху, маскируется светом, излучаемым брюшной

поверхностью тела рыбы. Кальмары регулируют собственное излучение в

зависимости от интенсивности и спектрального состава солнечного света.

Вернемся к вопросу о симбиозе. Проявление симбиоза многоклеточных

животных с фотобактериями очень разнообразно, но в основе лежит также

метаболическое взаимодействие, через которое обмен веществ несхожих

организмов сочетается в такое гармоническое единство, что бактерии

существуют в теле животного как его собственная ткань в специально для

этого созданном органе. По-видимому, бактерии получают от рыбы

вещества, удовлетворяющие пищевым потребностям бактерий в виде некоего

стимула свечения. Несомненно также, что симбиоз с бактериями очень важен

для нормальной жизнедеятельности рыбы, что подтверждается развитием

столь сложной структуры фотофора у рыб (рис.1.6). Вопрос только для чего?

Основная функция бактериофотофора состоит в инактивации и выбросе

некоторых метаболитов рыб. Эти метаболиты и стимулируют свечение

бактерий. Мутанты по гену люциферазы имеют слабую симбиотическую

способность. Более того, светящиеся бактерии в фотофорах могут выполнять

роль датчиков химической информации об окружающей рыб среде, наличия

в ней различных питательных веществ и феромонов, так как вещества среды

обитания должны быть регуляторами свечения бактерий. Другими словами

это возвращение к сигнальной функции биолюминесценции, основанной на

стимулировании или ингибировании свечения под действием разных

физиологически активных веществ. Подтверждением выполнения

метаболической функции светящимися бактериями в фотофоре рыб служит

происхождение фотофоров из тех же зародышевых структур, что

пищеварительная и выделительная системы, строение и гистологические

особенности фотофоров и локализация бактериофотофоров рыб вблизи

пищеварительного тракта: вокруг пищевода, под пилорическим отделом

желудка и печенью, вокруг прямой кишки и вблизи анального отверстия.

Светящиеся бактерии называют “морскими энтеробактериями” за их

сходство в свойствах с несветящимися бактериями семейства

Enterobacteriaceae, что указывает на их эволюционное происхождение из

кишечной микрофлоры, а также на сходство биологических функций.

Важным подтверждением участия светящихся бактерий в пищеварении рыб

является обнаружение у бактерий ферментов, участвующих в пищеварении –

хитиназ, декарбоксилаз аминокислот, альгиназ и других.

Таким образом, скорей всего биолюминесценция возникла как система,

выполняющая какую-то важную для организма функцию. Вторично она была

использована некоторыми организмами для выполнения разнообразных

поведенческих реакций. Каков будет окончательный ответ на вопрос о

происхождении и биологическом смысле биолюминесценции покажут

дальнейшие исследования ферментов светящихся организмов.

План конспект Тема 3 Биолюминесцентный анализ

В окружающем нас мире находится огромное количество веществ,

токсичных для всего живого. Современный человек сталкивается с вредными

веществами в своей среде обитания (почва, воздух, природные водоёмы), в

условиях производства (газовые выбросы и сточные воды предприятия), при

питании (пищевые продукты и питьевая вода). Поэтому крайне важным

является поиск методов анализа для быстрой оценки токсичности. В этом

отношении весьма перспективен биолюминесцентный анализ, основанный на

способности разных видов живых организмов излучать видимый свет.

Однако, чаще всего для анализа используют светящихся бактерий и

светляков.

Для изучения токсичности к светящимся бактериям добавляют

исследуемое вещество, а затем регистрируют изменение интенсивности

свечения. Различные вещества ведут себя в ходе реакции по-разному. Это

напрямую влияет на интенсивность свечения: загрязнители и токсины

уменьшают способность излучать свет. Так свечение уменьшается при

добавлении наркотиков, отравляющих и лекарственных средств. Если

сравнивать интенсивность свечения системы с участием загрязнителя и без

него, то в первом случае излучаемый свет будет слабее. К веществам,

стимулирующим свечение бактерий, относятся компоненты питательных

сред, например, такие как жирные кислоты.

Интенсивность свечения измеряют с помощью специального прибора –

биолюминометра. Результат работы прибора представляет собой

интенсивность свечения, зарегистрированную через определенные

промежутки времени. Этот результат удобно рассматривать в виде графика,

где по оси Х отложено время, а по оси У – интенсивность свечения.

Кривая на графике 1.11 имеет максимум, который соответствует самому

сильному испусканию света. Для того чтобы оценить влияние загрязнителя,

нужно сначала получить значения интенсивности свечения в отсутствие

токсичных веществ, а затем в их присутствии. Проанализировав спад силы

свечения, можно судить о загрязняющих свойствах исследуемого вещества.

Таким же образом можно сравнивать между собой токсичность разных

веществ.

Снижение интенсивности свечения при добавлении токсичных веществ

может происходить по разным причинам. Рассмотрим основные из них:

1) Инактивация фермента

Ферменты могут работать только при особых условиях. Для их

активности нужна определённая температура, кислотность и

др..Инактивировать («выключить») фермент способны также и некоторые

токсичные вещества, они нарушают структуру фермента, и он больше не

может выполнять свою функцию. Чем больше концентрация токсичных

веществ, тем большее количество ферментов « сломается», а, следовательно,

не смогут участвовать в биолюминесцентной реакции. В результате,

интенсивность свечения падает.

Рис. 1.11 График интенсивности свечения

2) Конкуренция между люциферазой и токсичным веществом,

присутствующим в системе, за право соединения с люциферином.

Некоторые вещества способны реагировать с люциферином, но такие

реакции не будут протекать. При добавлении этих веществ в систему, они

будут конкурировать с люциферазой за право взаимодействовать с

люциферином. Какая - то часть люциферина всё - таки вступит в реакцию с

люциферазой, поэтому свечение будет, но его интенсивность уменьшится.

3) Разрушение промежуточных люциферин - люциферазных

комплексов.

Когда люциферин и люцифераза соединяются, они превращаются в очень

нестабильный короткоживущий комплекс. Этот комплекс может или

прореагировать дальше, испустив свет, или просто распасться. Токсичные

вещества провоцируют распад части таких комплексов, поэтому не все

люциферин и люцифераза вступят в биолюминесцентную реакцию, а значит,

снизится интенсивность свечения.

Задание 1

1. Подготовить презентацию о какой-либо группе светящихся организмов

2. Предложить гипотезу о том, как появилось свечение в эволюции у

светящихся организмов (светящиеся бактерии, светящиеся рыбы и т.п.)

3. Подготовить схему экспозиции о каком-либо светящемся организме в

Музей светящихся бактерий.

4. Написать историю жизни какого-либо светящегося организма.

5. Составить словарь терминов, которые вы встретили в тексте.

Задание 2

Лабораторная работа Ферменты биолюминесцентной системы

Что такое фермент и субстрат бактериальной биолюминесцентной

реакции? Биолюминесцентные реакции представляют собой, как правило,

окисление некоторого вещества, называемого люциферином (субстрата),

кислородом воздуха, катализируемое специальным ферментом люциферазой

(названия образованы от латинского luciferos – «несущий свет»).

Бактериальная люцифераза - это достаточно большой белок с

молекулярной массой приблизительно 80 кДа (трехмерная структура этого

белка приведена на рис. 3.2).

Несмотря на незначительные различия в структуре люцифераз из

различных видов бактерий все они представляют собой фермент αβ-

гетеродимер, состоящий из двух субъединиц, α и β , молекулярная масса

которых соответственно 40 000 и 35 000. Индивидуальные субъеденицы

неактивны. Эти две субъединицы гомологичны, но активный центр фермента

расположен, главным образом, на α-субъединице.

Рис.3.2. Структура бактериальной люциферазы из Vibrio harveyi получена

структура с разрешением 1.5A (Fisher, AJ et al. 1996, J. Biol. Chem. 271, 21956)

Химической основой свечения бактерий является ферментативное

окисление восстановленного флавинмононуклеотида FMNН2 и

длинноцепочечного альдегида RCHO кислородом воздуха. Суммарное

уравнение процесса может быть записано так:

FMN Н2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h,

Люцифераза

где FMN и RCOOH – флавинмононуклеотид и карбоновая кислота,

соответственно.

Ни один из исходных реагентов обсуждаемой реакции не может

существовать в бактериальной клетке в свободном виде (FMNН2– по причине

быстрого автоокисления, длинноцепочечный альдегид – потому что является

ядом и не производится организмами). Поэтому бактерии имеют

специальные ферментативные системы, способствующие восстановлению

FMN и карбоновой кислоты исключительно для нужд биолюминесценции.

Считается, что восстановление FMN в бактериях происходит в реакции,

катализируемой другим ферментом – NAD(Р)H: FMN- оксидоредуктазой

(рис.3.3):

Рис.3.3. Структура бактериальной NAD(Р)H: FMN- оксидоредуктазы с

разрешением 2.08 Å (Tanner, J.J., TU, S.-C., Krause, K.L. «NADPH:FMN oxidoreductase

from Vibrio harveyi complexed with NAD+», 1999, Protein Sci. 8: 1725-1732

Ферменты люминесцентной системы являются уникальными удобными

объектами для изучения физико-химических основ ферментативного

катализа, в частности, проверки ферментативной природы

биолюминесцентных реакций, и доказательства необходимости для

протекания ферментативных биолюминесцетных реакций наличия в

реакционной смеси как субстратов, так и ферментов (люциферазы и

оксидоредуктазы), определения роли каждого из участников реакции:

– в присутствии кислорода, в первой реакции,

катализируемой бактериальной люциферазой, субстратами

являются восстановленного флавинмононуклеотида (FMNН2) и

длинноцепочечного альдегида (RCHO). В результате образуются

продукты реакции флавинмононуклеотид (FMN) и карбоновая

кислота (RCOOH), вода и квант света.

– во второй реакции, катализируемой NAD(Р)H: FMN-

оксидоредуктазой субстратами являются окисленный

флавинмононуклеотид (FMN) и NAD(Р)H, а образуются

следующие продукты восстановленный флавинмононуклеотид

(FMNН2), который является в свою очередь субстратом

люциферезной реакции, и NAD(Р)+.

Кинетическая кривая биолюминесцентной реакции, катализируемая

комплектом реактивов аналитической биолюминесценции (КРАБ), в состав

которого входят бактериальная люцифераза и NADН:FMN-оксидоредуктаза,

представляют собой длительное свечение с монотонным спадом

биолюминесценции (рис. 3.4). Максимум интенсивности свечения (I0)

характеризует начальную скорость реакции и концентрацию фермент-

субстратных комплексов, образуемых в ходе реакции. Спад

биолюминесценции определяет скорость распада фермент-субстратного

комплекса во времени и подчиняется экспоненциальному закону.

Наблюдаемое длительное свечение обусловленно множественными

оборотами ферментов.

Рис.3.4. Кривая выхода биолюминесценции на максимум интенсивности свечения

Цель: на примере биолюминесцентной реакции оценить роль

фермента в биологических процессах

Задачи:

- определить время выхода биолюминесценции на максимальное

свечение и оценить интенсивность свечения в отсутствии

бактериальной люциферазы;

- определить время выхода биолюминесценции на максимальное

свечение и оценить интенсивность свечения в присутствии

бактериальной люциферазы.

Материалы: комплект реактивов аналитической биолюминесценции

(КРАБ), в состав которого входят бактериальная люцифераза и NADН:FMN-

оксидоредуктаза; дистилированая вода; никотинамидадениндинуклеотид

NADH; флавинмононуклеотида FMNH; тетрадеканаль С14

(длинноцепочечный альдегид RCHO); пипетки на 5мкл, 50мкл и 200мкл;

измерительные кюветы.

Аппаратура: Биолюменометр 20/20n Single Tube Luminometer.

Ход работы:

1. Включить компьютер и прибор, на компьютере включить программу

2020n SIS for;

2. В кювету с помощью микропипеток со сменными наконечниками

поместить реакционную смесь в следующем порядке и объемах:

Калий (натрий) фосфатный буфер 0,05М (рН 6,8-7) - 200 мкл;

Тетрадеканаль С14 (50 мкл 0,25% в этаноле + 2950 мкл буфера)

– 20 мкл;

Раствор NADH 1*10-4

M - 200 мкл;

Раствор FMN 5*10-4

M – 50 мкл.

3. Аккуратно встряхнуть и поместить кювету в прибор;

4. Кювету поместить в кюветное отделение люминометра;

5. Измерить интенсивность свечения смеси;

6. Построить график зависимости интенсивность свечения от времени;

7. Повторить измерения еще два раза;

8. Заменить кювету, только теперь добавить препарат ферментов КРАБ

(разведенный в 2 мл буфера ) - 5 мкл;

9. Аккуратно встряхнуть и поместить кювету в прибор;

10. Измерить интенсивность свечения смеси;

11. Построить график зависимости интенсивность свечения

биолюминесцентной реакции в присутствии люциферазы от времени;

12. Найти для каждого из графиков значение максимума интенсивности

свечения – I01, I0

2, I0

3;

13. По графикам для обоих случаев оценить время, требуемое для выхода

кинетической кривой на максимум интенсивности;

14. Рассчитать среднее значение максимума интенсивности свечения для

реакции без добавления и при добавлении фермента по формуле

;

15. Сравнить значения максимумов интенсивности для обоих типов

реакции (без фермента и при добавлении фермента);

16. Сделать вывод о влиянии фермента на скорость и интенсивность

свечения биолюминесцентной реакции.

Вопросы:

1. Почему ферменты необходимы в живых организмах?

2. Какую роль играет люцифераза в биолюминесцентной реакции

бактерий?

3. Какие функции выполняют ферменты в биолюминесцентной реакции

бактерий?

4. Какие структурные особенности имеет бактериальная люцифераза?

5. Какова роль NADН:FMN-оксидоредуктазы в биолюминесцентной

реакции?

6. Что такое интенсивность свечения биолюминесценции?

7. Как измерить инстесивность свечения биолюминесценции?

Задание 3 Контроль безопасности домашней посуды после

использования моющих средств

Гексахлорофен, трихлоркарбанилид, алкилоламид, полиэтиленгликоль,

хлорид натрия, бикарбонат натрия. Это даже неполный состав моющих

средств для мытья посуды, который мы используем ежедневно. Мы все уже

давно не мыслим жизни без такого удобного продукта. Этим химическим

ассортиментом мы каждый день пользуемся и даже в небольших количествах

неосознанно употребляем внутрь.

Химия, как ее ни назови, вредна и для человека, и для природы.

Представьте себе, что происходит, когда смывки химсредств попадают в

канализацию. А если тарелку плохо сполоснули, то куда эти вещества

направляются? Да, правильно, прямиком в наш организм.

Что самое интересное, средства для мытья посуды обязательной

сертификации не подлежат. А это значит, что производитель может хоть

мышьяк добавить (если он жир хорошо отмывает).

Для человека этот химнабор грозит аллергией, злокачественной

опухолью, депрессией, гипертонией и многими другими заболеваниями. Как

правильно мыть посуду, чтобы оставшиеся на ней химикаты не навредили

вам? С этой задачей поможет справиться биолюминесцентный метод,

благодаря своей высокой чувствительности к химическим токсикантам.

Лабораторная работа. Определение смываемости моющих средств с

поверхности домашней посуды

Цель: определить необходимое количество ополаскиваний посуды при

мытье выбранным моющим средством.

Материалы:

1. Иммобилизованный реагент основанный на биферментной системе

NADH-FMN-оксидоредуктаза-люцифераза (далее мембрана) совместно

с раствором FMN.

2. Моющее средство «Фери» или др.;

3. Кружка;

4. Люминометр;

5. Лакмусовая бумага;

6. Дистиллированная вода;

7. Пипетки 2 штуки от 20 – 300 мкл;

8. Кюветы 1000 мкл.

Аппаратура: Биолюменометр 20/20n Single Tube Luminometer.

Ход работы:

1. Достать мембраны и раствор FMN из холодильника и выдержать их

10 мин при комнатной температуры.

2. Включить компьютер и прибор. Запустить программу;

3. Провести контрольные измерения:

1) В кювету по очереди добавить:

мембрану + 300 мкл дистиллированной воды + 10мкл FMN;

2) выдержать 5 мин;

3) поместить кювету в прибор;

4) измерить интенсивность свечения;

5) построить график зависимости интенсивность свечения от

времени;

6) повторить измерения еще два раза;

7) найти по графику максимум значения интенсивности свечения –

I0.

4. Помыть моющим средством «Фери» кружку;

5. Налить в кружку дистиллированную воду и выдержать 5минут –

проба 1. Измерить рН раствора с помощью лакмусовой бумаги;

6. Провести измерения пробы 1 используя в пункте 3 задания с 1) по

7), заменив 300 мкл дистиллированной воды на пробу 1.

Максимальная интенсивность свечения обозначается I1.

7. Вычислить по формуле T=I1/I0*100% - остаточное свечение. Если

величина 100%<Т<80%, то проба 1 – токсична.

8. Вылить пробу 1. Налить в кружку еще дистиллированной воды и

выдержать 5минут – проба 2. Измерить рН раствора с помощью

лакмусовой бумаги.

9. Провести измерения (пункт 3) и вычисления (пункт 7) пробы 2

аналогично как

пробы 1.

10. Продолжать смену дистиллированной воды и измерения до тех пор

пока величина Тn будет находится в диапазоне 100%<Т<80%.

11. Сделать вывод о применении данного моющего средства для мытья

посуды по количеству проб. Если больше чем 1 проба, то данное

средство надо тщательно смывать.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ I J H =...

Documents

Transcript of ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ I J H =...