· Wechsel haploid/diploid ist wichtig für Lebenszyklus der meisten Pilze. “Yeast”:...
16
Transcript of · Wechsel haploid/diploid ist wichtig für Lebenszyklus der meisten Pilze. “Yeast”:...
��������������� ������� ���������
���� � ������ � ������������ �������
Wechsel haploid/diploid ist wichtig
für Lebenszyklus der meisten Pilze.
“Yeast”: einzellige Pilze
������� �� ������ ����������� �����
Vorteile der Hefe:
�schnelles Wachstum, nicht pathogen
� einfaches Genom (1,3 x 107 bp) ;
�E. coli: 4.2 x 106 bp; Mensch: 3,3 x 109 bp
�einfache genetische Manipulation
Modellorganismus zum Studium
generellerzellulärer Prozesse
der eukaryotischen Zelle.
������
�� � �� ��������������������������
�� ���� �� ������������������������������������������� �
!�����"��������#�����������$������%������������&��'()��������������
��������������&���#���������*�)$���+ ������������'���������,����
-� .����/�'����� )��� )�����������,����#�$(����������� )����������
�� )����� ����$$����������������������*")$�+
��� α
��� �
������������
")$ 0��������/�����%�
1����2������
• 3��)2�������)�������"�������4�5)$�$��
• !�����'(�64�77�&���
• $�� )�������1�
• �8 ���$��
• 9���
� � � ���� ������ �������� ���
Nomenklatur:
ARG2: Dominantes Allel oder Gen.
arg2-∆1: Specifische komplette oder partielle Deletion von ARG2.
arg2::LEU2: Insertion des functionellen LEU2 Gens in den ARG2 Locus,
ARG2 ist funktionslos.
Arg+: Ein Stamm, der kein Arginine zum Wachstum benötigt;
(Prototroph).
Arg-: Ein Stamm, der Arginine benötigt; (Auxotroph).
�������� ����� ������
Transformationstechniken: meist chemisch; ähnlich E. coli
Selektion über auxotrophe Marker:
“Wildtyp”: Laborstämme mit gezielten Defekten in einzelnen Genen
anabolischer Prozesse (Auxotrophien):
Saccharomyces cerevisiae W303 MATα ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112
trp1-1 ura3-1 can1-100
d.h. Stamm benötigt Uracil, Adenin; Tryptophan; Histidin und Leucin zum wachsen.
Genetische Elemente enthalten funktionelle Kopien dieser Gene:
Saccharomyces cerevisiae YS10 W303, cyt2::LEU2
/�'�������
������������ ���$���:
������
6�7��
��
;���� �1�
�
���
� ����$��9����!����
������
6�7��
��
;���� �1�
531
��������$��3���!���
<����������� ���$��:
��
;����
�1�
������
6-��
;��������'� ���� )$�$��=;�5>:
6?7��
�� ����� ;��������1�0��$� 0��$�
!������
�"�� # � "����� � ���� �$ ����
pRS316
4887bp
1000
3000
4000
PstI
EcoRVNcoIScaI
HincII
HincII
SacI
KspIXbaISpeIBamHISmaIAvaIPstIEcoRVEcoRIHindIIIClaISalIHincIIXhoIAvaIKpnI
PvuII
DraIDraI
ScaI
DraI
DraI
DraI
URA3
AmpR
ARS/CEN
PvuII
MET25promReplication
Selektion
Replication
Selektion
ExpressionS. cerevisiae
MultipleCloning
site
(CYT2 ORF)
% ��������� ����% ����������$ ������ ��� &���������'
PCR ProduktGenort im Hefechromosom
PCR ProduktGenort im Hefechromosom
PCR ProduktGenort im Hefechromosom
( � �� ������� �� ����!����
αααα-Faktor:
� � ���������������� �� ���� ! "#� � $ ! α �%��������
� ����������&�'�#������������������� ���� ! "#�� $ ! �$ ��
� ����(���)� ���� ��*����#+���� , �++��
� �����)� ���-�+������#+���� ������� #������
� ����-������� ��*� �) �.���#+���� , �++�������! ������
�) �/�*�#+����� , �++���
��� α
��� �
������������
")$ 0��������/�����%�
1����2������
� �) �����'�* �����#( �����Beispiel: Nachweis, dass Aktin essentiell für Hefe ist:
+� ,�������'
�������� ���� �����* ���
����-� ./'
YS10: LEU2; trp1-∆
+
Tester: TRP1; leu1-∆
=
Diploid: LEU2; TRP1
� ����*�������
( ������������ 0��
"���*���� -0����*� ����+���"���*���� �0�����+���
1�2� �+) ���
�3�
��#1������'
∆�"�� � � #�������������� �. 2�# ��� 3��. �4
Complex IIIUbiquinone-Cytochrome C
Oxidoreductase
+�������������
� ���5
+��� � �����
������
( �� ���������� % ���
Humanes mitochondriales Genom:
Hefe:Respiration ist nicht essentiell.
Rho0; Rho-: Defekte oder verlorene mtDNAmit-: respiratorisch defekt, mtDNA intakt
Frage:
∆cyt2: Führt Deletion zu mtDNA Verlust?
H202
Sekundäre Schädigung durchradikale Sauerstoffspezies
� ������� ����� ��������� ������#( 6 �
Yeast mitochondria “stained” with GFP (“mitochondriales Reticulum”)
Yeast mt-nucleoids stained with DAPI (“string of beads” structure)
Nucleoid protein Abf2Co-localizing to mt-DNA
!������
pHK127133 bps
1000
2000
30004000
5000
6000
7000
PfoI 46SbfI 388PstI 389
XcmI 532BsmI 767ApaI 785PspOMI 785
StuI 845
Bpu10I 1140BfrBI 1234NsiI 1234
NaeI 1668NgoMIV 1668
1993EcoICRISacIBstXIAleISacIINotIEagIXbaI2017
SphI 2035
ClaI 2436BseRI 2447
SmaI 2494XmaI 2494
EcoRI 2560
XhoI 3284
BamHI 4009HindIII 4038
SnaBI 4148BglII 4193
BclI 4315BsaBI 4316
Acc65I 4341KpnI 4341
AhdI 5627
BsaHI 6168
SwaI 6586
URA3
pADH
GFP1
GFP2
Ori
AMP
Cen6/ARS4
�"�� # � "����� � ���� �$ ����3��� �5�����������% 1,4
Replication
Selektion
Replication
Selektion
ExpressionS. cerevisiae
