This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

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Analyse der biochemischen Synthesekette für Carotinoide mit Hilfe von Chlorella-PAutanten

V o n H E D W I G C L A E S

Aus dem Max-Planck-Institut für. Biologie, Abt. Melchers, Tübingen (Z. Naturforschg. 9 b, 4 6 1 ^ 7 0 [1954]; eingegangen am 5. Mai 1954)

Four mutants of Chlorella vulgaris are described, which have been isolated after x-ray irradiation of the normal strain. They show blocks in the synthetic pathway of the carotenoids, along with a more or less completely blocked chlorophyll synthesis. The mixture of caro-tenoids formed by wild type chlorella either in light or in darkness contains mostly a- and /^-carotene and xanthophylls (Fig. 1 a and b), whereas the mutants contain these pigments only in reduced amount or not at all. There appear instead several carotenoids of higher saturation, which are not found in wild type. Among them phytoene (Fig. 6), phytofluene (Fig. 7) and ;-carotene (Fig. 8) were identified. Apparently they are piled up because they cannot be transformed into the ordinary end products of the synthetic chain.

Mutant strain 5/871 synthesizes phytoene only. Neither phytofluene which is less saturated nor yellow pigments can be detected.

The carotenoid mixture of strain 5/515 (Fig. 2) consists of phytoene, phytofluene and carotene. There is a complete block of xanthophyll synthesis.

In strain 9 a xanthophylls are found (Fig. 5) but no a- or /^-carotene or at least in minute amounts only. Instead the carotenoid mixture consists mostly of phytoene, phytofluene, £-caro-tene and one more carotenoid which was not yet identified. It has a maximum of absorption at 426 mju.

All mutants described so far have to be grown with glucose in darkness. They are killed by light. Another mutant strain (5/520) however was isolated which can be grown hetero- and autotrophically and shows striking differences in pigment formation depending on which con-dition was chosen (Fig. 3 a and 3 b). In the dark almost no chlorophyll and no xanthophylls, but phytoene, phytofluene, 4-carotene and several unidentified carotenoids — among them possibly tetrahydrolycopene and lycopene — are produced. In the light strain 5/520 behaves like wild type with respect to chlorophyll and carotenoid synthesis. This may indicate that an enzymatically catalyzed step characteristic of wild type and missing in the mutant can be replaced here by the action of light.

Die Vorstellungen über den Weg der Carotinoid-synthese bei Pflanzen stützen sich im wesent-

lichen auf Untersuchungen an chlorophyllfreien Mi-kroorganismen und chlorophyllfreien Pflanzenorga-nen. Wichtige Anhaltspunkte ergaben Untersuchun-gen bei Rhodotorula rubra 1, bei Phycomyces blakes-leeanus 2> 3 und für höhere Pflanzen Untersuchungen an Tomatenfrüchten 4- 5> 6. Nach Unterbrechung der normalen Carotinoidsynthese bei Rhodotorula durch Mutation und bei Phycomyces durch Diphenylamin wurde die vermehrte Bildung verschiedener, z. T. farbloser Carotine beobachtet, die bei diesen Objek-ten normalerweise gar nicht oder in sehr viel gerin-gerer Konzentration vorkommen. Von besonderer Bedeutung ist das Auftreten der beiden farblosen,

1 J. B o n n e r , A. S a n d o v a l , J. W. T a n g u. L. Z e c h m e i s t e r , Arch. Biochemistry 10, 113 [1946].

2 T. W. G o o d w i n , Biochem. J. 49, XXIII [1951]. 3 T. W. G o o d w i n , Biochem. J. 50, 550 [1952],

relativ stark gesättigten Polyene Phytoen und Phyto-fluen und des ^-Carotins. — Bei Neukombination der für die Pigment-Zusammensetzung der rotfrüchtigen, vorwiegend Lykopin bildenden Handelstomaten ver-antwortlichen Gene durch Kreuzung verschiedener Lykopersikum-Arten sowie einer orangefrüchtigen Varietät von L. esculentum wurden die drei genann-ten Carotine ebenfalls vorgefunden. Ferner konnte ein stärker als Phytoen gesättigtes, farbloses Polyen, Tetrahydrophytoen, nachgewiesen werden. Von Be-deutung ist auch das Auftreten von Tetrahydrolyko-pin, welches wahrscheinlich identisch mit dem bei Neurospora gefundenen Neurosporen ist7 .

4 J. W. P o r t e r u. F. P. Z s c h e i 1 e , Arch. Bio-chemistry 10, 537 [1946].

5 J. W. P o r t e r u. R. E. L i n c o 1 n , Arch. Bio-chemistry 27, 390 [1950].

e R. E. L i n c o l n u. J. W. P o r t e r , Genetics 35, 206 [1950].

7 F. H a x o , Arch. Biochemistry 20, 400 [1949].

Die genannten Polyene lassen sich nach P o r t e r und L i n c o l n 5 in eine Reaktionskette in der Rei-henfolge Tetrahydrophytoen, Phytoen, Phytofluen, t-Carotin, Tetrahydrolykopin, Lykopin einordnen, in der ein Polyen aus dem anderen durch Dehydrierung entstehen soll. Xanthophylle, a-, ß- und y-Carotin sol-len sich dann vom Lykopin ableiten. Die Reaktions-richtung im Sinne einer schrittweisen Dehydrierung eines gesättigten C40-Polyens wird auf Grund geneti-scher Befunde für wahrscheinlicher gehalten als um-gekehrt eine schrittweise Hydrierung.

Die im Zusammenhang mit den erwähnten Unter-suchungen bei Rhodotorula1 und Phycomyces2,3 vor-geschlagenen Hypothesen lassen es ebenfalls zu, die farblosen gesättigten Polyene als erste das C40-Skelett enthaltende Zwischenprodukte anzusehen. Es wird aber auch für möglich gehalten, daß die gesättigten Polyene in einer oder mehreren Seitenreaktionen aus einer noch unbekannten, mit den weniger gesättigten Polyenen gemeinsamen Vorstufe gebildet werden.

Es ist hervorzuheben, daß die Glieder der P o r -t e r - L i n c o l n - Reihe vorwiegend bei chlorophyll-freien Objekten gefunden wurden (vgl. die Angaben bei G o o d w i n 8 ) . Auch durch Untersuchungen von G o o d w i n und J a m i k o r n 9 bei reifenden Toma-ten wird die Allgemeingültigkeit der Hypothese von P o r t e r und L i n c o l n in Frage gestellt. Die Ver-fasser nehmen für grüne Objekte einen anderen Weg der Carotinoidsynthese an. Andererseits wurde Phy-tofluen in sehr geringen Mengen in den grünen Blät-tern verschiedener höherer Pflanzen 10, ferner Phyto-fluen und Phytoen in etiolierten Weizen-Keimlin-gen 11 nachgewiesen.

In Anbetracht dieser Widersprüche sind einige Mutanten von Chlorella vulgaris, die in der vorlie-genden Arbeit beschrieben werden sollen, von Inter-esse. Bei ihnen treten infolge mutativer Blockierun-gen einige der oben genannten vermutlichen Caro-tinoid-Vorstufen auf. Ihr Vorkommen bei Chlorella ist insofern von Bedeutung, als die Mischung der gel-ben Pigmente der Grünalgen der in Chloroplasten höherer Pflanzen gefundenen näher steht als die Carotinoid-Mischungen der bisher vorwiegend unter-suchten Objekte 8>12.

8 T. W. G o o d w i n , The comparative biochemistry of the carotenoids, Chapman and Hall Ltd, London 1952.

9 T. W. G o o d w i n u. M. J a m i k o r n , Nature [London] 170, 104 [1952],

10 L. Z e c h m e i s t e r u. G. K a r m a k a r , Arch. Biochemistry 47, 160 [1953],

11 H. B e e k m a n n , Naturwissenschaften 40, 486 [1953],

I. M e t h o d i k

a) K u l t u r d e r A l g e n . Dichte Suspensionen von Chlorella vulgaris wurden nach Röntgenbestrahlung auf Agar (Vio Knop-Lösung, 2% Agar, 0,5% Glucose, 0,3 g// ZnSO* und 0,055 gJl MnCl2) ausgestridien und in abso-luter Dunkelheit weiter kultiviert. Von den Platten konn-ten gelbe bis fast weiße Kolonien isoliert werden. Aus der Nachkommenschaft dieser Kolonien wurden nochmals Klone isoliert und diese auf Zuckeragar unter Lichtaus-schluß weiter in Kultur gehalten. Um größere Algen-mengen zur Pigmentanalyse zu gewinnen, wurden meh-rere l Nährlösung (Vi0 Knop-Lösung mit einem Gehalt von 2% Glucose) beimpft und die Kulturen unter den jeweils angegebenen Bedingungen kräftig belüftet.

b) P i g m e n t b e s t i m m u n g e n . Die Algen wur-den, unter Vermeidung von Belichtung bei den Dunkel-kulturen, aus der Nährlösung abzentrifugiert und mit Methanol (p.a. Merck) extrahiert. Als beste Methode hat sich wiederholte Suspendierung in frisdiem Extraktions-mittel erwiesen. Die Trennung in epi- und hypophasische Carotinoide wurde durch Verteilung zwischen Benzin (benzolfrei p.a. Merck, Siedeintervall 40—70°) und 92-proz. Methanol durchgeführt. Die im Benzin enthaltenen Carotine wurden nadi Waschen und Trocknen mit Na,,S04

über einer Zuckersäule von noch vorhandenem Chloro-phyll und gelegentlich geringen Mengen von Xantho-phyllen gereinigt. Die im Methanol enthaltenen Xantho-phylle * wurden nach Verseifen des Chlorophylls mit 15-proz. KOH durch Verdünnen des Methanols mit Was-ser in Äther überführt.

Die Auftrennung der Carotingemische wurde nach Ein-engen der Carotinlösungen bei reduziertem Druck und unter Einleiten von N„ an MgO-Säulen von 8 oder 10 mm 0 ausgeführt und die einzelnen Carotine nach Zerschneiden der Säule unter Zusatz von Methanol eluiert. Phytoen, Phytofluen und a-Carotin wurden im Durchlauf der MgO-Säule aufgefangen.

Für die spektroskopischen Messungen fand ein Beck-man-Spektrophotometer Verwendung. Zwecks besserer Vergleichsmöglichkeit mit den Literaturangaben wurden die Absorptionsspektren der Carotingemische in Chloro-form und die Spektren der einzelnen Carotine in Hexan gemessen. Die Xanthophyllspektren wurden in Äther be-stimmt. Bei allen Absorptionsspektren, die sich auf Ge-samtcarotin und Xanthophylle beziehen, ist die Extink-tion der Pigmentlösungen logarithmisch aufgetragen, um konzentrationsbedingte Formveränderungen der Spek-tren auszuschalten13. Die Spektren für Gesamtearotin und Xanthophylle beziehen sich auf 1 ccm gepackte Al-gen (20 Min. bei ~ 1300 g zentrifugiert). Die Carotine von 1 ccm Algen waren für diese Messungen in 50 ccm Chloroform und die Xanthophylle von 1 ccm Algen in 100 ccm Äther enthalten, ferner war die Schichtdicke der Pigmentlösungen bei allen Messungen 0,995 cm. Die E-Werte geben also ein relatives Maß für die Konzen-

12 G. M a c k i n n e y, J. biol. Chemistry 111, 75 [1935]. * Das Gemisch aller liypophasischen Carotinoide wird

im Folgenden als „Xanthophylle" bezeichnet. 13 H. H. S t r a i n , Leaf Xanthophylls, Carnegie In-

stitution of Washington 1938.

tration von Gesamtearotin und Xanthophyllen in den verschiedenen Algenstämmen an. — Für die Absorp-tionsspektren der isolierten Carotine wurden relative E-Werte linear aufgetragen, da die aus der Literatur zum Vergleich herangezogenen Spektren ebenfalls in diesem Maßstab dargestellt sind.

I I . E r g e b n i s s e

a) D e r N o r m a l s t a m m . Chlorella vulgaris ist bekanntlich in glucose-haltigem Medium leicht in Dauerdunkel zu kultivieren. In den Abb. 1 a und 1 b sind die Absorptionsspektren des Gesamtearotins und der Xanthophylle nach Dunkelkultur bzw. nach Lichtkultur bei ~ 25° C von je zwei verschiedenen Versuchen dargestellt. Ein Vergleich der Spektren nach Dunkelkultur mit den entsprechenden Spektren nach Lichtkultur zeigt weitgehende Übereinstim-mung, und es ist darum anzunehmen, daß die Zu-sammensetzung des Carotingemisches und der Xan-thophylle bei Licht- und Dunkelkultur weitgehend gleich ist. Für das Carotingemisch konnte durch Auf-trennung an MgO unmittelbar gezeigt werden, daß sowohl nach Licht- als nach Dunkelkultur vorwie-gend a- und /^-Carotin vorhanden sind, a- und ß-Ca-rotin wurden auf Grund ihrer Absorptionsspektren identifiziert.

Die bei den Mutanten gefundenen außergewöhn-lichen Carotine, insbesondere Phytoen, Phytofluen und t-Carotin (s. u.), konnten bei Extraktion von maximal 5 ccm Algen des Normalstammes bisher nicht gefunden werden. Die vor dem Erscheinen von «-Carotin unter der MgO-Säule aufgefangenen farb-losen Benzinfraktionen zeigten eine nur geringe Ab-sorption zwischen 270 und 400 mp, und das Spek-trum dieser Fraktionen ließ keines der für Phytoen und Phytofluen charakteristischen Maxima erkennen.

b) S t a m m 5 / 8 7 1 . Diese pigment-ärmste der nach Bestrahlung isolierten Mutanten zeichnet sich außer durch fast vollständige Blockierung der Chloro-phyllsynthese durch das Fehlen gelber Pigmente, und zwar sowohl von Carotinen als Xanthophyllen, aus. Von den beiden farblosen Polyenen Phytoen und Phytofluen konnte das gesättigtere Phytoen nach-gewiesen werden.

Die Mutante 5/871 ist sehr lichtempfindlich, kann aber im Dunkeln wie der Normalstamm und alle noch zu beschreibenden Mutanten mühelos mit Glu-cose als einziger organischer C-Quelle kultiviert wer-den. Agarausstriche sind meist farblos, während Ein-zelkolonien und Kulturen in flüssigem Nährmedium infolge geringer Chlorophyllbildung von blaßgrüner Farbe sind.

Das Chromatogramm eines Benzinauszuges aus maxi-mal 5 ccm Algen der Mutante 5/871 an einer MgO-Säule von 8 mm 0 läßt bis auf Chlorophyllreste keine pigmen-tierten Zonen an der Säule erkennen. Unter der Säule

3,5

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Abb. 1 a. Normalstamm, Absorptionsspektren des Gesamt-earotins und der Xanthophylle von je 1 ccm Algen aus zwei Dunkelkulturen (I und II) bei 25° C. Carotine in 50 ccm Chloroform ( ), Xanthophylle in 100 ccm

Äther ( ).

3.5

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15.

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Abb. 1 b. Normalstamm, Absorptionsspektren des Ge-samtearotins und der Xanthophylle von je 1 ccm Algen aus zwei Lichtkulturen (I und II) bei 25° C. Carotine in 50 ccm Chloroform ( ), Xanthophylle in 100 ccm

Äther ( ).

kann jedoch eine Benzinfraktion aufgefangen werden, die ein scharfes Absorptionsmaximum in Hexan bei 286 mp und je ein weniger ausgeprägtes Maximum bei 275— 278 mp und bei 295—297 mu besitzt. Das Absorptions-spektrum in Hexan ist in Abb. 6 (Spektrum I) dargestellt.

Die Lage der Absorptions maxima (s. Tabelle) und die Form des Spektrums entsprechen den in der Literatur angegebenen Daten für Phytoen 8 ' 1 4 . Bisher wurden auf Grund der Extinktion der unter der MgO-Säule aufge-fangenen phytoen-haltigen Fraktion bei 286 m,w und des bei P o r t e r und L i n c o l n 5 für Phytoen angegebenen spez. a maximal ~ 590 y Phytoen/1 ccm Algen gefun-den. Es sind dabei keine Anhaltspunkte vorhanden, daß die Höhe dieses Wertes durch Verunreinigungen wesent-lich beeinflußt wurde.

Phytofluen, das unter den beschriebenen Bedingungen z. T. mit Phytoen, z. T. nach Phytoen durch die MgO-Säule wandert, konnte in dem Extrakt von 5 ccm Algen weder durch seine charakteristische Fluoreszenz noch spektroskopisch nachgewiesen werden.

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•Äj

JT 2.5

2,0

1,5

10 ' 380 120 160 500 m/u 5W

Abb. 2. Stamm 5/515, Absorptionsspektrum des Gesamt-earotins von 1 ccm Algen aus einer Dunkelkultur bei

24° C. Carotine in 50 ccm Chloroform.

c) S t a m m 5 / 5 1 5 . Diese Mutante ist wie Stamm 5/871 nur in Dunkelheit zu kultivieren und ist dann unter allen Kulturbedingungen von blasser, gelbgrü-ner Farbe. Die normalen Chlorella-Carotinoide (a-und ß-Carotin und Xanthophylle) konnten bei Ex-traktion von maximal 3 ccm Algen nicht nachgewie-sen werden. Statt dessen treten Phytoen, Phytofluen und ^-Carotin auf. Chlorophyll ist wie bei der Mu-tante 5/871 nur in geringen Mengen vorhanden.

Das Absorptionsspektrum des gesamten Carotins von Algen der Mutante 5/515, die bei 24° C und in Dunkel-heit kultiviert wurden, ist in Abb. 2 dargestellt. Ein Ver-gleich dieses Spektrums mit den Gesamtcarotin-Spektren

J. W. P o r t e r u. F. P. Z s c h e i I e , Arch. Bio-chemistry 10, 547 [1946].

15 L. Z e c h m e i s t e r u. A. S a n d o v a l , J. Amer. chem. Soc. 68, 197 [1946].

des Normalstammes (Abb. 1 a und 1 b) zeigt zwei bei dem Normalstamm fehlende ausgeprägte Absorptions-maxima, in Chloroform bei 410 und 435 rnu, und eine re-lativ starke Abnahme der Absorption bei mehr als 435 mu.

Bei Auftrennung des Carotingemisches aus den dun-kel-kultivierten Algen an MgO kann unter der Säule eine farblose, im UV-Licht intensiv blaugrün fluoreszie-rende Benzinfraktion aufgefangen werden, deren Absorp-tionsspektrum zwischen 320 und 400 rnu in Abb. 7 (Spek-trum I) dargestellt ist. Die Form des Spektrums, die Lage der Absorptionsmaxima (s. Tabelle) und die intensiv blaugrüne Fluoreszenz stimmen mit den von P o r t e r u. Z s c h e i l e 1 4 und Z e c h m e i s t e r u. S a n d o -v a l 1 5 angegebenen Daten für das farblose Polyen Phy-tofluen überein. — In der Phytofluen enthaltenden Frak-tion konnte ferner Phytoen nachgewiesen werden (s. Ta-belle und Abb. 6 Spektrum II). Die in Abb. 6 bei den Spektren II und III (s. u.) noch auffallend hohe Absorp-tion der Phytoen-Lösungen bei 320 m^ ist darauf zurück-zuführen, daß die Lösungen auch Phytofluen enthielten.

Die gelben epiphasischen Pigmente von 5/515 bestehen vorwiegend aus einem zitronengelben Pigment, welches auf Gmnd eines Vergleiches der Absorptionsmaxima (s. Ta-belle) und der Form des Absorptionsspektrums (s. Abb. 8 Spektrum I) mit den von N a s h und Z s c h e i l e 1 6

für f-Carotin angegebenen Daten für ^-Carotin gehalten wird. — Um ausschließen zu können, daß es sich nicht um Aurochrom handelt, müßte allerdings noch ein Misch-chromatogramm mit Aurochrom und f-Carotin durchge-führt werden. Das Absorptionsspektrum von Aurochrom ist dem £-Carotinspektrum sehr ähnlich, die beiden Pig-mente sollen sich aber in ihrem chromatographischen Verhalten unterscheiden, und zwar soll Aurochrom an MgO stärker als ^-Carotin adsorbiert werden 17.

Das Überwiegen von ^-Carotin bei Stamm 5/515 wird durch Abb. 2 bestätigt, da das Gesamtcarotin-Absorp-tionsspektrum im sichtbaren Licht praktisch dem entspre-chenden Teil des £-Carotinspektrums entspricht. Die im ;-Carotinspektrum nicht vorhandene Ausbuditung des Gesamtcarotin-Spektrums zwischen ~ 460 und 490 m^ ist vermutlich auf geringe Mengen eines noch unbekann-ten, an MgO stärker als ^-Carotin adsorbierten Pigments zurückzuführen. Es kann sich jedoch wegen der starken Adsorption an MgO weder um a- noch /^-Carotin han-deln, da diese beiden Carotine schneller als das ^-Carotin durch die MgO-Säule wandern.

Genaue quantitative Angaben über die Mengen der von Stamm 5/515 gebildeten farblosen Polyene und des ^-Carotins können noch nicht gemacht werden. Sicher ist bisher nur, daß 1 ccm Algen > 390 y ^-Carotin und > 130 y Phytofluen enthalten.

d) S t a m m 5 / 5 2 0 . Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Mutanten ist der Stamm 5/520 so-wohl mit Glucose im Dunkeln als auch vollständig

iß H. A. N a s h u. F. P. Z s c h e i l e , Arch. Bio-chemistry 7, 305 [1946].

" H . A . N a s h , F. W. Q u a k e n b u s h u. J . W . P o r t e r , J. Amer. chem. Soc. 70, 3613 [1948],

2.5

2.0

15

10.

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\ \ 1 O-No.̂

n r s A

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\ X 380 120 160 500 rn.fi 510

Abb. 3 a. Stamm 5/520, Absorptionsspektren des Gesamt-earotins und der Xanthophylle von je 1 ccm Algen aus zwei Dunkelkulturen (I und II) bei 25° C. Carotine in 50 ccm Chloroform ( ), Xanthophylle in 100 ccm Äther ( ). Bei dem Xanthophyllspektrum II sind

die doppelten log E-Werte aufgetragen.

15

^±3.0

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2.0

15.

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Abb. 3 b. Stamm 5/520, Absorptionsspektren des Gesamt-earotins und der Xanthophylle von je 1 ccm Algen aus zwei Lichtkulturen (I und II) bei 25° C. Carotine in 50 ccm Chloroform ( ), Xanthophylle in 100 ccm

Äther ( ).

autotroph im Licht zu kultivieren. Bemerkenswert sind dabei die auffallenden Unterschiede in der Pig-ment-Zusammensetzung bei hetero- und autotropher Kultur. Bei Dunkelkultur zeichnet sich die Mutante 5/520 gegenüber den bisher beschriebenen Mutanten durch ihren besonderen Reichtum an für Chlorella

außergewöhnlichen Carotinen, u. a. Phytoen, Phyto-fluen und ^-Carotin, aus. Die Chlorophyll- und Xan-thophyllbildung ist weitgehend blockiert, a- und ß-Carotin werden entweder gar nicht oder audi in nur geringen Mengen gebildet. Bei Belichtung wird die Pigment-Zusammensetzung der Mutante 5/520 weit-gehend normal, d. h. es tritt verstärkte Chlorophyll-bildung ein, und das Carotinoidgemisch enthält im Licht vor allem a- und /^-Carotin und Xanthophylle.

In Abb. 3 a sind die Absorptionsspektren des Gesamt-earotins und der Xanthophylle aus zwei parallel auf-

3.0

2,5

2.0

1.5

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\ * 380 120 160 500 rrifi 5W

Abb. 4. Stamm 5/520, Absorptionsspektren des Gesamt-earotins und der Xanthophylle von je 1 ccm Algen, Ca-rotine in 50 ccm3 Chloroform ( ), Xanthophylle der Übersichtlichkeit halber auf 50 ccm Äther bezogen ( ). D: Dunkelkultur bei 24° C. L: Dunkelkultur

bei 24° C, anschließend 47 h belichtet.

gearbeiteten Dunkelkulturen bei 25° C angegeben. Die Gesamtearotinspektren zeigen bereits, daß der Stamm 5/520 carotinreicher ist als die bisher beschriebenen Mu-tanten. Es treten jedoch wieder die bei Stamm 5/515 (s. Abb. 2) auffallenden Maxima in Chloroform bei 410 und 435 m^ auf. Ein Vergleich mit den Gesamtearotin-Spektren des Normalstammes zeigt eine Verändemng der Absorptionsmaxima auch bei den größeren Wellen-längen, die nicht durch eine Verschiebung des Mengen-verhältnisses der normalen Carotine bedingt ist (s. u.). Eine Erklärung der Xanthophyllspektren ist noch nicht möglich. Ein Vergleich der Abb. 1 a und 1 b mit Abb. 3 a zeigt jedoch, daß auf jeden Fall bei Dunkelkultur von Stamm 5/520 wesentlich weniger Xanthophylle als im Normalstamm gebildet werden.

Die bei Liditkultur des Stammes 5/520 auftretenden Veränderungen in der Zusammensetzung der Carotinoide kommen in den Gesamtabsorptions-Spektren von Caro-

tinen und Xanthophyllen aus zwei parallel aufgearbeite-ten autotrophen Kulturen bei 25° C zum Ausdruck (Abb. 3 b). Ein Vergleich mit Abb. 1 a und 1 b zeigt, daß unter diesen Bedingungen weitgehende Ähnlichkeit der Gesamtearotin- und Xanthophyllspektren mit den ent-sprechenden Spektren des Normalstammes bei Licht- und Dunkelkultur besteht.

Ein Zwischenstadium der bei Beliditung in der Pig-ment-Zusammensetzung eintretenden Veränderungen ist in den Spektren der Abb. 4 erfaßt. Die Algen wurden 11 d bei 24° C in absoluter Dunkelheit kultiviert. An-schließend wurde eine Kultur sofort extrahiert (Carotin-und Xanthophyllspektren D in Abb. 4), eine weitere Kul-tur 47 h belichtet und dann ebenfalls extrahiert (Spek-

| 3,0

•7s

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2,5

2J0

15

1,0380 f20 %0 500 m/x 5H0

Abb. 5. Stamm 9 a, Absorptionsspektren des Gesamt-earotins und der Xanthophylle von je 1 ccm Algen aus zwei Dunkelkulturen (I und II) bei 24° C. Carotine in 50 ccm Chloroform ( ), Xanthophylle in 100 ccm

Äther ( ).

tren L in Abb. 4). Da bei Dunkelkultur von Stamm 5/520 niemals andere als die in den Spektren D dargestellten Absorptionsspektren gefunden wurden, sind die Verände-rungen auf die Belichtung zurückzuführen, und zwar nehmen die Maxima in Chloroform bei 410 und 435 m/u und das bei ~ 510 mfi angedeutete Maximum relativ ab. Gleidrzeitig ist der Xanthophyllgehalt stark erhöht, und das Xanthophyllspektrum entspricht 47 h nach Be-lichtung weitgehend den entsprechenden Xanthophyll-spektren des Normalstammes (s. die Xanthophyllspektren in Abb. 1 a und 1 b). Der Beginn dieser Veränderungen kann bereits nach 24 h beobachtet werden.

Bei Auftrennung des Carotingemisches dunkel-kulti-vierter Algen von Stamm 5/520 an MgO kann in den farblosen Benzinfraktionen wieder Phytoen und Phyto-fluen nadigewiesen werden (s. Abb. 6 Spektrum III, Abb. 7 Spektrum II und Tabelle). Auch ^-Carotin konnte, wie auf Grund der Maxima des Gesamtcarotin-Spektrums

bei 410 und 435 mu (s. Abb. 3 a) zu vermuten war, aus dem Carotingemisch isoliert werden. Die für ^-Carotin aus Stamm 5/520 gefundenen Aborsptionsmaxima in Hexan finden sich in der Tabelle, und ein Spektrum für s-Carotin aus Stamm 5/520 ist in Abb. 8 (Spektrum II) wiedergegeben.

Auffallend für die heterotroph kultivierte Mutante 5/520 ist ferner, daß oberhalb der £-Carotinbande und im Laufe der Entwicklung des Chromatogramms immer schärfer vom ^-Carotin abgetrennt, eine Reihe bei dem Normalstamm nicht vorhandener Pigmente stark an MgO

f Uj

1,0

0,8

0,6

OH

0,2

260 280 300 m/u. 320

Abb. 6. Absorptionsspektren in Hexan von Phytoen aus 3 Chlorella-Mutanten: 5/871 (I), 5/515 (II), 5/520 (III).

adsorbiert werden. Eine einwandfreie Identifizierung war noch nicht möglich. Es sind aber Hinweise vorhanden, daß es sich u. a. um Tetrahydrolykopin und Lykopin han-delt und das in der Abb. 3 a in den Gesamtearotin-Spek-tren angedeutete Maximum bei ~ 510 m« auf Lykopin zurückzuführen ist.

a- und ^-Carotin scheinen auch bei Stamm 5/520 im Dunkeln entweder gar nidrt oder nur in geringen Men-gen gebildet zu werden. Bei Extraktion von ~ 3 ccm Al-gen von Stamm 5/520 verhielten sich zwei an einer MgO-Säule von 10 mm 0 eben erkennbare Pigment-zonen in der für a- und /?-Carotin diarakteristischen

Identifiziert als Absorptionsmaxima in Hexan (m,u) Isoliert aus Mutante

379 378

400 400

425 425

5/515 5/515

^-Carotin 16 (378, 400, 425 mu) 379 379

401 400

426 425—426

5/520 5/520

379 378

401 400

426 425

9a 9a

332 331

348 348

367 367

5/515 5/515

Phytofluen15 (332, 348, 367 mu) 331 331—332

348 348

367—368 367

5/520 5/520

332 331—332

348—349 347

367 3 6 7 - 3 6 8

9a 9a

275 276—278

276

286 286 286

296—297 295—296 296—298

5/871 } i n B e n z i n

5/871 Phytoen 8 '14 (275, 285, 296 m/«) 277—278

277 286 286

2 9 5 - 2 9 6 298

5/515 5/520

277—278 286 295—297 9a

Tabelle. Zusammenstellung der bei verschiedenen Aufarbeitungen der in Spalte 3 angegebenen Mutanten gefun-denen Absorptionsmaxima in Hexan (Spalte 2) für die in Spalte 1 angeführten Carotine. Die Zahlen in Spalte 1

bedeuten die in der Literatur angegebenen Absorptionsmaxima.

Weise. Diese beiden Pigmente wurden jedoch nodi nidit isoliert.

Die chromatographische Analyse des vom Stamm 5/520 im Licht gebildeten Carotingemisches bestätigt die in den Gesamtcarotin-Spektren der Abb. 3 a und 3 b angedeu-teten Unterschiede bei Licht- und Dunkelkultur. Bei Lichtkultur bilden a- und / -̂Carotin den Hauptanteil der gelben epiphasisdien Pigmente. Das Chromatogramm zeigt ferner, daß die stärker als a- und / -̂Carotin an MgO adsorbierten Pigmente im Licht weitgehend verschwun-den sind. Dementsprechend treten in den Gesamtcarotin-Spektren der Abb. 3 b die t-Carotinmaxima und das Maximum in Chloroform bei ~ 510 mu nicht mehr her-vor. — Phytofluen konnte in den Extrakten aus Lichtkul-turen spektroskopisch nicht nachgewiesen werden.

Eine genaue Verfolgung der durch Belichtung des Stammes 5/520 hervorgerufenen Veränderungen in der Carotinoid-Zusammensetzung, vor allem in ihren Zwi-schenstadien bei Übertragung aus Dunkel- in Lichtkultur (s. Abb. 4), muß weiteren Untersuchungen vorbehalten bleiben.

e) S t a m m 9 a. Diese hellgrüne Mutante ist wie die unter b und c beschriebenen Stämme lichtemp-findlich und wurde daher ebenfalls nur in Dunkel-

heit kultiviert. Durch ihren relativ hohen Gehalt an Xanthophyllen enthält dieser Stamm mehr von den normalen Pigmenten als die bisher beschriebenen Mutanten. Das Carotingemisch setzt sich vorwiegend aus Phytoen, Phytofluen, t-Carotin und einem noch nicht identifizierten Pigment zusammen, a- und ß-Carotin sind möglicherweise in geringen Mengen vorhanden.

Die außergewöhnliche Carotin-Zusammensetzung des Stammes 9 a wird durdi die Gesamtcarotin-Spektren der Abb. 5 angedeutet. Bei Auftrennung des Carotingemi-sches an MgO konnten wieder Phytoen, Phytofluen und t-Carotin (s. in Abb. 5 die Maxima bei 410 und 435 rnu, in Abb. 7 und 8 die Spektren III und Tabelle) nachge-wiesen werden. Von diesen Carotinen abgesehen, besteht das Carotingemisch hauptsächlich aus einem stark an MgO adsorbierten Pigment, dessen Absorptionsmaxima in Hexan bei 404, 426 und 452 m/u gemessen wurden. Nä-heres kann über dieses Pigment noch nidit gesagt werden.

Die in Abb. 5 dargestellten Xanthophyllspektren zei-gen, daß die Mutante 9 a mehr Xanthophylle bildet als die bisher beschriebenen Mutanten, jedoch weniger als der Normalstamm und offenbar auch nicht in der norma-len Zusammensetzung.

t\ -

-

n I

1

l / f

yj/M fK1 - n

i i i 320 310 360 380 m.fJL 100

Abb. 7. Absorptionsspektren in Hexan von Phytofluen aus 3 Chlorella-Mutanten: 5/515 (I), 5/520 (II), 9 a (III).

I I I . D i s k u s s i o n

Es wurden vier verschiedene Mutanten von Chlo-rella vulgaris beschrieben, bei denen die von Chlo-rella normalerweise vorwiegend gebildeten Pigmente a- und /^-Carotin und Xanthophylle ganz fehlen (5/871 und 5/515) oder in z. T. wesentlich geringe-ren Mengen als bei dem Normalstamm vorkommen (5/520 und 9 a). In diesen Mutanten konnten die stark gesättigten Polyene Phytoen, Phytofluen und C-Carotin nachgewiesen werden, die in der Dehydrie-rungstheorie von P o r t e r und L i n c o l n 5 eine we-sentliche Rolle spielen.

Zunächst ist hervorzuheben, daß die Veränderun-gen bei den beschriebenen Stämmen nur so weit als mutative Abänderungen angesehen werden können, wie das Konstantbleiben der Stämme während der bisherigen Kultur diese Annahme erlaubt. Vor allem

310 360 380 100 120 110 rrifi 160

Abb. 8. Absorptionsspektren in Hexan von f-Carotin aus 3 C/i/ore/Za-Mutanten: 5/515 (I), 5/520 (II), 9 a (III).

läßt sich nichts darüber sagen, ob die Mutationen im Kern oder etwa direkt in den Piastiden eingetreten sind. Da für Chlorella keine geschlechtliche Vermeh-rung nachgewiesen wurde, ist es nicht möglich, die Stämme unter genetischen Gesichtspunkten zu ana-lysieren.

Da bei den beschriebenen C/i/ore/Za-Mutanten die normalen Endprodukte der Carotinoidsynthese gar nicht oder in reduzierten Mengen gebildet werden, ist anzunehmen, daß die Mutationen in einer Blok-kierung der Carotinoidsynthese bestehen. Es liegt ferner die Annahme nahe, daß das Auftreten der außergewöhnlichen Carotine, insbesondere des Phy-toens, des Phvtofluens und des ^-Carotins, eine Folge dieser Blockierungen der Carotinoidsynthese ist. Da jedoch möglicherweise die Carotinoidsynthese und die mit der Chlorophyllbildung verbundene Phytol-svnthese um die gleichen niedermolekularen Bau-

steine konkurrieren, ist nicht auszuschließen, daß die Blockierung der Chlorophyllsynthese bei den Mu-tanten für die Anhäufung der außergewöhnlichen Polyene mit verantwortlich ist. Die gleichzeitige Blockierung von Chlorophyll- und Carotinoidsynthese bei den beschriebenen Chlorella-Mutanten ist ein Selektionseffekt, da nur bei Chlorophyllmangel Un-terschiede im Gehalt an gelben Pigmenten erkannt werden konnten. Erst durch eine Mutante mit nor-maler Chlorophyllsynthese und blockierter Caroti-noidsynthese ließe sich entscheiden, wieweit die ge-sättigten Polyene auf Kosten der Endprodukte der Carotinoidsynthese allein auftreten.

Bei den Mutanten von Chlorella fällt auf, daß im-mer dann, wenn ^-Carotin nachgewiesen wurde, auch Phytoen und Phytofluen vorhanden sind, unabhängig davon, ob weitere Carotinoide gebildet werden (9 a und 5/520) oder nicht (5/515). Da es unwahrschein-lich ist, daß bei diesen Stämmen jedesmal drei ver-schiedene Reaktionsketten gleichzeitig blockiert sind, und ferner eine Mutante gefunden wurde, die Phy-toen und keines der weniger gesättigten Polyene bildet (5/871), kann die genannte Beziehung zwi-schen ^-Carotin und den beiden farblosen Polyenen im Sinne der Dehydrierungs-Theorie von P o r t e r und L i n c o l n gedeutet werden. Die Hypothese, nach der f-Carotin aus Phytofluen und Phytofluen aus Phytoen durch Dehydrierung hervorgehen soll, erlaubt erstens das Auftreten einer Mutante, die nur Phytoen und keines der weniger gesättigten Polyene bildet. Zweitens kann sie eine Erklärung dafür ge-ben, daß bei Vorhandensein von t-Carotin stets auch die stärker gesättigten Polyene Phytoen und Phyto-fluen gefunden wurden.

Es bleibt jedoch weiterhin ungeklärt, ob die farb-losen Polyene und das C-Carotin ausgesprochene Ca-rotinoidstufen sind und so, wie P o r t e r und L i n c o l n annehmen, in die zu den Carotinoiden mit spezi-fischer Konfiguration führende Reaktionskette ein-

geordnet werden können, oder ob sie bei Unterbre-chung dieser Reaktionskette in einer Nebenreaktion aus einer mit den normalen Pigmenten gemeinsamen Vorstufe gebildet werden. Eine genaue Untersuchung der bereits nach 24 h Belichtung zu beobachtenden und keine Zellteilungen erfordernden Pigmentum-wandlungen bei Übertragung des Stammes 5/520 aus Dunkel- in Lichtkultur könnte vielleicht zu einer Klä-rung dieser Frage beitragen. Es käme darauf an nachzuweisen, ob in den ersten Stunden der Belich-tung mit der Bildung von a- und /?-Carotin und Xanthophyllen gleichzeitig eine äquivalente Abnahme der farblosen Polyene und des C-Carotins (und auch der noch nicht identifizierten außergewöhnlichen Ca-rotine) verbunden ist oder nicht. In ersterem Falle wäre die Annahme, daß Phytoen, Phytofluen und C-Carotin ausgesprochene Carotinoid-Vorstufen sind, endgültig bestätigt.

Der Stamm 5/520 ist noch unter einem anderen Gesichtspunkt interessant. Diese Mutante läßt näm-lich erkennen, daß bei Chlorella mindestens eine Re-aktion bei der Carotinoidsynthese einerseits auf rein enzymatischem Wege (s. die Carotinoide des Normal-stammes bei Dunkelkultur), andererseits nur mit Hilfe von Lichtenergie ablaufen kann. Bei Stamm 5/520 ist der enzymatische Weg weitgehend blok-kiert, und erst bei Belichtung ist normale Carotinoid-bildung möglich. Für die Carotinoidsynthese bei Chlorella ist somit wie für die Chlorophyllsyn-these 18 ein Dunkel- und ein Lichtmechanismus nach-gewiesen. Wie bereits für die Chlorophyllsynthese gezeigt wurde, sind auch Dunkel- und Lichtmecha-nismus der Carotinoidsynthese bei Chlorella durch Mutation trennbar.

Ich danke Herrn Dr. W . W e i d e 1 für wertvolle Rat-schläge sowie Frl. J . D o b r i g k e i t und Frl. L . S i s k a für ihre technische Assistenz.

1 8 S. G r a n i c k , Ann. Rev. Plant Physiol. 2, 115 [1951],