Analytische Chemie für Biologie 3GC - ETH Z

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

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3 Gaschromatographie

3.1 Einleitung/Messprinzip

Als Gaschromatographie (GC) bezeichnet man alle Varianten der Chromatographie, bei denen als mobile Phase ein Gas eingesetzt wird. Meist wird ein Inertgas verwendet, das mit den Analyten und der stationären Phase nicht in Wechselwirkung tritt und einzig als Transportmittel für die Analyten durch die Säule dient. Die stationäre Phase ist entweder fest oder flüssig, wobei flüssige Phasen weitaus häufiger verwendet werden. GC ist eine sehr leistungsfähige Trennmethode (d.h., hohe Auflösung) für Substanzen, die bei Temperaturen bis ca. 300°C–350°C einen genügend hohen Dampfdruck über der stationären Phase besitzen. GC wird routinemässig mit vielen verschiedenen Detektionsmethoden gekoppelt, was zusammen mit der häufig eingesetzten Automation wesentlich zur weiten Verbreitung der Methode beigetragen hat. In vielen Fällen ist GC vorgeschrieben als Referenzmethode, z.B. in Lebensmittel-, Pharma- und Umweltanalysen.

Es existieren, je nach Beurteilungskriterien, mehrere Einteilungen der gaschromatographischen Methoden. Die wichtigsten Klassifizierungsmerkmale sind nachstehend aufgeführt.

Säulentypen Gepackte Säule (innerer Durchmesser 1-4 mm, Länge 1-5 m) Kapillarsäule (porous-layer open tubular, PLOT; support-coated open tubular, SCOT;

wall-coated open tubular, WCOT; innerer Durchmesser 0.15–0.53mm, Länge 10-100 m)

Vergleich zwischen Kapillarsäule und gepackter Säule:

Gepackte Säule Kapillarsäule Länge (m) 1 – 5 10 – 100 Innendurchmesser (mm) 1 – 4 0.1 – 0.5 Theoretische Bodenzahl per Meter 500 – 1000 2000 – 4000 Probemengen ng – mg < 10 ng

Gepackte Säulen werden heute immer seltener für analytische Zwecke eingesetzt, da sie deutlich geringere Trennleistung als Kapillarsäulen aufweisen.

Die beiden Ausführungsformen der Gaschromatographie – gepackte Säule und Kapillare – unterscheiden sich aber nicht grundsätzlich. Das Trennprinzip in der Gaschromatographie ist in beiden Formen mehrheitlich die Adsorption an einem Festkörper und die Verteilung zwischen Trägergas und flüssiger Beschichtung (auf dem Trägermaterial bzw. der Kapillarwand). Die Trennung aufgrund der unterschiedlichen Gas-Flüssig-Verteilung wurde

Gepackte Säulen

festes Trägermaterial

Wand aus Metall oder Glas

Kapillarsäule

Innerer Durchmesser (ID) und Säulenlänge (L)

ID 2-4 mm, L 2-4 m ID 0.10 – 0.53 mm, L 10 – 60 m

Schutzschicht

Wand aus Quarz

Trennphase


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als Gas-Verteilungs-Chromatographie (GLC) vorgestellt. Bei einer Gas-Adsorptionschromatographie (GSC) erfolgt die Trennung auf unbelegtem Trägermaterial bzw. auf festen Schichten, die sich auf der Kapillarinnenwand befinden.

Trennmechanismus Verteilung, mit einer Flüssigkeit als stationärer Phase (Gas-Flüssig-

Chromatographie, GLC, gas-liquid chromatography) Adsorption, mit einem Feststoff als stationärer Phase (Gas-Fest Chromatographie,

GSC, gas-solid chromatography) Spezielle Mechanismen wie chirale Wechselwirkungen, Ligandenaustausch-

phänomene usw.

3.2 Mobile Phase

Als mobile Phase (=Trägergas) werden meist inerte Gase wie He oder N2 eingesetzt. Bei speziellen Detektoren werden auch andere Gase wie H2 verwendet. Die Wahl des Trägergases beeinflusst aufgrund unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten der Analyten im Trägergas die theoretische Bodenhöhe H. Wegen kleiner Diffusionsgeschwindigkeit im breiten Fliessbereich ist Helium das am häufigsten eingesetzte Trägergas geworden.

Um möglichst tiefe Nachweisgrenzen zu erzielen, muss ein grosser Wert auf die Reinheit des Trägergases gelegt werden. Organische Verunreinigungen im Trägergas können ein konstantes, erhöhtes Untergrundsignal im Detektor verursachen. Spuren von O2 können zudem bei höheren Temperaturen die stationäre Phase zerstören. Neben dem Einsatz von reinem Trägergas (z.B. 99.999% reinem He) werden auch Gasfilter wie gepackte Aktivkohlesäulen zur zusätzlichen Reinigung des Trägergases eingesetzt.

Kriterien für die Wahl der mobile Phase:

Hohe Reinheit (99.999%, O2-frei, trocken) Keine Reaktivität gegenüber Analyten oder stationärer Phase Keine Wechselwirkung mit Analyten Erlaubt eine effektive Detektion Nicht giftig Nicht zu teuer

3.3 Stationäre Phase

Helium

Höchste Viskosität


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Die stationären Phasen, die in der GC verwendet werden, können in mehrere Kategorien eingeteilt werden. Zum einen unterscheidet man zwischen festen und flüssigen stationären Phasen, zum anderen wird zwischen gepackten und Kapillarsäulen unterschieden.

3 typische Kapillarsäulen:

PLOT – Die feste stationäre Phase befindet sich an der Kapillarwand und ist geeignet für Analyten, die nicht an einer flüssigen stationären Phase getrennt werden können, z.B. Permanentgase, kurzkettige Kohlenwasserstoffe. SCOT – Die stationäre Phase ist ein Flüssigkeitsfilm, der auf einem festen Träger an der Kapillarwand aufgebracht ist. Die SCOT Säule ist geeignet für die Trennung von leichtflüchtigen Verbindungen, die auf PLOT-Säulen zu stark retardiert werden. WCOT – Ein Flüssigkeitsfilm ist an der Kapillarwand aufgebracht, deren OH-Gruppen an der Oberfläche durch chemische Modifizierung der organischen Seitengruppen besetzbar gemacht wird. Die WCOT Säulen werden in der GC am häufigsten verwendet.

3.3.1 Feste stationäre Phase

Gaschromatographie mit festen stationären Phasen wird nur in sehr speziellen Fällen eingesetzt, z.B. in der Analyse von sehr flüchtigen oder gasförmigen Substanzen, wie Edelgasen, CO2, NO2, Halogenen, CH4 oder anderen kleinen organischen Molekülen. Der Verteilungskoeffizient beruht hier auf der Adsorption der Analyten an der Oberfläche der stationären Phase.

PLOT (porous-layer open tubular)

SCOT (support-coated open tubular)

WCOT (wall-coated open tubular)

festes Träger- material!

Wand aus “fused silica” mit Polyimid- beschichtung!

flüssiger Film auf festem Träger!



Flüssigkeitsfilm auf der Wand!


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Trennung eines Gasgemisches (Ne, Ar, O2, N2, Kr und Xe) mit einer PLOT-Säule (Porous Layer Open Tubular Column). Stationäre Phase: Molekularsieb, 5 µm dick, mit 5 Å Porengrösse, Säule: 30 m x ID 0.53 mm.

Es findet aber keine Diffusion in die stationäre Phase statt. Als feste Phasen werden meist sogenannte Molekularsiebe (poröse Aluminium-Silikatkörner) oder Polymere eingesetzt mit relativ gut definierten Porengrössen von wenigen Å Grösse. Es können entweder gepackte oder Kapillarsäulen verwendet werden.

3.3.2 Flüssige stationäre Phase

In den meisten Fällen werden für die Gas-Flüssig-Chromatographie Kapillarsäulen verwendet, wobei die flüssige stationäre Phase folgende Kriterien erfüllen sollte:

• physikalisch stabil (tiefer Dampfdruck) über den gewünschten Temperatur-Bereich • chemisch stabil über den gewünschten Temperatur-Bereich (keine Zersetzung) • chemisch inert (keine chemischen Reaktionen mit den Analyten) • richtige Selektivität für die Zielanalyten (spezifische Wechselwirkung)

Am häufigsten werden Materialien auf der Basis von Polysiloxan verwendet. Durch verschiedene Seitengruppen am Polysiloxangerüst können die Trenneigenschaften der stationären Phase stark beeinflusst werden.

Der Hauptunterschied zwischen den verschiedenen stationären Phasen ist deren Polarität. Es gibt auch sehr spezielle Phasen, die z.B. zur Trennung von Enantiomeren verwendet werden.

Polysiloxan (apolare bis mittel-polare Phase) In apolaren stationären Phasen findet eine Trennung hauptsächlich aufgrund des Siedepunktes statt (tief siedende Substanzen eluieren früh).

Polyethylenglykole (Carbowax, polare Phase) zusätzlich zum Siedepunkt spielen hier auch Wechselwirkungen zwischen polaren Gruppen eine gewisse Rolle.

Beispiele von häufig verwendeten flüssigen stationären Phasen:

Die Temperaturstabilität eines Säulenmaterials wird wesentlich von seiner Flüchtigkeit bestimmt. Bei höheren Temperaturen wird oft ein erhöhter Untergrund des Detektorsignals beobachtet (Säulenbluten genannt), was auf langsames Verdampfen

Si

CH3

CH3

O

n

Si

CH3

CH3

O

n

Si

Ph

Ph

O

m

Si

CH3

CH3

O

n

Si

Ph

O

m

CN

Si O

n O

O

COOH

OO

OOC

n

Polysiloxan

unpolar polar

mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe

Ethylenglycol Ethylenglycol, Phenyl, und Ester-Gruppen

Polarer Flüssigkeitsfilm


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und/oder Zersetzten der stationären Phase zurückzuführen ist.

Normale Säulenmaterialien sind stabil bis ca. 300°C, durch Polymerisation der Polysiloxane kann die Flüchtigkeit und somit die Temperaturstabilität der stationären Phase erhöht werden. Mit Peroxiden können benachbarte Si-R Gruppen vernetzt werden, um die Temperaturstabilität zu erhöhen.

Bei polaren Säulen ist signifikantes Säulenbluten ab einer Temperatur von 270°C zu beobachten. Bei einer neuen Säule kann das Bluten oft durch langes Ausheizen bei hoher Temperatur erniedrigt werden (Konditionieren einer Säule).

3.4 Apparatur

Eine übliche GC-Apparatur besteht aus einer Gasversorgung – der mobilen Phase (a), einer Gasflussregulierung (b), einer Injektionseinheit (c), einer Trennsäule (d), einer Temperaturregelung der GC-Säule [Ofen, (e)] und einem Detektor (f).

Nach langem Einsatz!und unter zu hoher!Säulentemperatur!

Pola

ritä

t

–60 bis 360°C

–60 bis 360°C

20 bis 280°C

10 bis 250°C

Methyl

Phenyl

Cyano

Si

CH3

CH3

O

n

Si

CH3

CH3

O

n

Si

Ph

Ph

O

m

Si

CH3

CH3

O

n

Si

Ph

O

m

CN

Si O

n

O

O

COOH

OO

OOC

n

Ethylenglycol


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3.4.1 Injektoren

Sofern keine kontinuierliche Gaseinspülung erfolgt, wird die Probe meist in Lösung "offline" mit einer Spritze in den Injektor überführt. Die bekanntesten Probenaufgabentechniken sind: splitless, split, programmed-temperature vaporizer, und cold-trapping and cold-on-column-injektion.

Splitless-Injektion bedeutet, dass das ganze eingespritzte Probevolumen auf die Säule gelangen soll. Bei gepackten Säulen ist dies kein technisches Problem. Aber für Kapillarsäulen ist das Problem einer reproduzierbaren Probenaufgabe wesentlich grösser. Die Säulenüberladung, Bandenverbreitung (sogar Tailing) und Komponenten-Diskriminierung werden in diesem Fall unvermeidlich. Diese Probleme können umgangen werden, indem man die Injektion mit Split-Einlass durchführt. Bei der Split-Injektion wird der Trägergasstrom aufgeteilt, sodass nur ein Bruchteil auf die Säule gelangt und der grösste Teil aus dem Injektor als Abfall geführt wird. Das Split-Verhältnis liegt normalerweise in einer Grössenordnung von 1:20 bis 1:100.

In der Praxis ist eine Kombination der beiden Injektionsmethoden üblich. Die Probe wird zunächst splitlos injiziert, und nach einer im Voraus einprogrammierten Zeit, wenn der erwünschte Teil der Probe auf die Säule gelangt ist, wird der Split über ein Schaltventil

zur Kapillarsäule!

Einwandfreies Einspritzen:!

•! Injektor ist dicht!

•! Injektor ist richtig beheizt!

•! Liner ist sauber und genau eingebaut!

•! Passender Liner gewählt!

•! Säule ist richtig installiert!

1

2

3

1)! Die Analyten in Lösung mit Spritze in Röhrchen (Liner) bringen;!

2)! Durch beheiztes “Röhrchen” wird die Lösung verdampft;!

3)! Der Dampf wird mithilfe des Trägergases zur Säule transportiert.!


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elektronisch geöffnet und der Injektor leer gespült. Diese Injektionsart wird Splitless/Split genannt.

Beim Cold-Trapping nutzt man den Effekt, dass die im Injektor bei 250-300°C verdampften Analyten durch eine niedere Ofentemperatur am Anfang der Kapillarsäule rekondensiert werden. Bei der Cold-on-Column-Injektion verwendet man ein spezielles Aufgabeventil, das es ermöglicht, die Untersuchungslösung mit der Quarznadel der Spritze direkt in die Trennsäule zu injizieren.

3.4.2 Detektoren

Für die Messung der eluierenden Substanzen stehen in der GC eine Vielzahl von Detektoren zur Verfügung, die ans Ende der Chromatographiesäule gekoppelt werden.

Ideale Detektoreigenschaften • Hohe Empfindlichkeit • Weiter dynamischer linearer Bereich • Stabil • Reproduzierbar • Kurze Ansprechzeit • Entweder sehr selektiv, oder völlig unselektiv • Probe wird nicht zerstört

Flammenionisationsdetektor (FID)

Die organischen Moleküle in der Probe werden im H2-reichen Teil einer Flamme zu CH4 reduziert und dann im O2-reichen Teil oxidiert, wobei sie ionisiert werden. Der Ionenstrom wird oberhalb der Flamme gemessen und ist proportional zur Menge Kohlenstoffatome, die in der Flamme sind. Es werden Ionenströme im Nanoamperebereich gemessen.

Eigenschaften eines FIDs:

• Sehr hohe Empfindlichkeit (1 pg/s) • grosser dynamischer Bereich (10–5 g/s -10–13 g/s) • Robust, einfache Bauweise • Probe wird zerstört • Unempfindlich auf nicht-organische Stoffe.

Der FID ist einer der meist verwendeten GC-Detektoren. Die mit FID gekoppelten GC wird sehr oft als Standardmethode zur quantitativen Analyse verwendet.

Elektroneneinfangdetektor (Electron Capture Detector, ECD)

CH

CH4

CH4O

CHO

+

–


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Das Trägergas wird von β-Teilchen (e-) ionisiert. Als β-Quelle wird meist 63Ni eingesetzt. Die Elektronen und Ionen wandern zu den entsprechenden Elektroden, und erzeugen einen Strom. Falls ein Analytmolekül ein freies Elektron aufnimmt, kommen weniger Elektronen an der Elektrode an, und erzeugen einen kleineren Strom. Die viel grösseren Analyt-Ionen wandern aufgrund ihrer geringeren Diffusionsgeschwindigkeit nicht bis zur Messelektrode. Deshalb werden Moleküle mit elektronegativen Gruppen, wie Halogene, Peroxide, Chinone oder Nitroverbindungen gut detektiert. Wenig elektronegative Moleküle wie Amine, Alkohole oder reine Kohlenwasserstoffe werden schlecht detektiert. Diese Selektivität macht den ECD besonders geeignet für die Analyse z.B. von Pestiziden, deren Moleküle oft Cl enthalten.

Eigenschaften eines ECDs: • Noch empfindlicher als FID (5 fg/s) • kleiner dynamischer Bereich (104) • spezifisch für Analytmoleküle mit hoher Elektronenaffinität, wie halogenierte

Verbindungen.

Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD)

Die Wärmeleitfähigkeit von organischen Verbindungen ist typischerweise 6-10 Mal kleiner als jene von He oder H2. Das Gas überträgt somit weniger Wärme als reines Trägergas und die Temperatur des Messelements sinkt ab. Ein Wärmeleitfähigkeitselement leidet unter externen Effekten, vor allem Wärme von ausserhalb des Detektors. Dies kann behoben werden durch Verwenden von zwei gleichen Elementen, eines am Ende der Säule, das von den Analyten durchströmt wird, und eines, durch das nur Trägergas strömt. Das Detektorsignal entspricht dann der Differenz der beiden Messelement-Signale.

Eigenschaften eines WLDs: • Nachweisgrenze: 10–8 g/s (rel. unempfindlich) • Dynamischer Bereich: 105 • Universell • Relativ einfach und robust • Probe wird nicht zerstört

Da die Probe nicht zerstört wird, kann der WLD auch zu präparativen Zwecken eingesetzt werden.

e–!

Anode!

Auslass!

Radioaktive !– !

Stromsignal!

Analytmoleküle aus Säule!

Kathode!

Wasser und Sauerstoff!

63Ni

Emissionsquelle

Leicht gekoppelt mit gepackten Säulen oder wide-bore Kapillarsäule

Referenzzelle Messzelle

Trägergas

mit Probe

Trägergas


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Spektroskopische Detektionsmethoden

Atomemissionsdetektor: AED

Verbindungen, die aus der Säule eluieren, werden in der sehr heissen Plasma-„Flamme“ (bis 10000°C) verbrannt, wodurch eine vollständige Atomisierung erfolgt. Die Atome werden angeregt und fluoreszieren bei charakteristischen Wellenlängen. Somit können bestimmte Elemente selektiv und simultan beobachtet werden und man bekommt mehrere element-selektive Chromatogramme. Die Intensität des abgestrahlten Lichtes ist dabei direkt proportional zur Konzentration des Elements und der AED kann deshalb zur Quantifizierung genutzt werden. Auf

spektroskopischen Methoden beruhende GC-Detektoren sind eher exotisch.

Flammenphotometrischer Detektor (FPD)

Der FPD benutzt die bei der Verbrennung von Phosphor- und Schwefelverbindungen freiwerdende Strahlung zur selektiven Anzeige. Die Verbrennung der Substanz geschieht wie beim FID in einer H2/Luft Flamme. Die so angeregten Schwefel- und Phosphor-Atome emittieren Licht mit charakteristischer Wellenlänge (394 nm für S bzw. 526 nm für P). Die selektive Messung geschieht mit einem entsprechenden Filter mithilfe eines Photomultipliers. Ein FPD ist sehr empfindlich, und arbeitet selektiv und gilt als bester P/S-Detektor.

Massenspektrometer (MS)

Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zum Messen des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z) von Teilchen. Bei bekannter Ladung kann daraus die Masse der Teilchen ermittelt werden. Sie dient als eine wichtige qualitative Methode in der analytischen Chemie zur Aufklärung der Struktur von Verbindungen und wird auch in der Physik und in der Biologie (Proteomik, Metabolomik) eingesetzt.

Ein Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem Analysator und einem Detektor. In der Ionenquelle wird der Analyt ionisiert. Es gibt sehr viele verschiedene Ionisations-Methoden. In der Praxis dominiert jedoch EI (Elektronenstoss) in Kopplung mit der Gaschromatographie sowie die ESI (Elektrospray-Ionisation) und die APCI (chemische Ionisation bei Atmosphärendruck) in Kopplung mit der HPLC. Wichtig ist für die Untersuchung von Peptiden (Proteomiks) auch die MALDI (matrix-unterstützte Laser-Desorption und Ionisation), aber direkte Kopplung mit LC oder HPLC ist nicht möglich. Im Analysator (Massenselektor) werden die Ionen nach ihrer Masse (genauer: m/z) getrennt. Als Detektor wird meistens ein Photomultiplier, ein Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) oder ein Faraday-Auffänger verwendet. Daneben werden als Detektor auch Daly-Detektoren, Mikrokanalplatten und Channeltrons verwendet. In der Anfangszeit der Massenspektrometrie wurden auch Fotoplatten benutzt.

Die Kopplung von GC mit MS ist von grosser, praktischer Bedeutung. Die detaillierte Information, die mit MS gewonnen werden kann, erlaubt in vielen Fällen die Identifikation der eluierenden Substanzen. Quadrupol- oder Ionenfallen-MS (ion trap) sind die üblichsten MS-Varianten, die mit GC gekoppelt werden. Da für die MS-Analyse tiefe Drücke nötig

Array-D

ete

kto

r!

Gitter

Spiegel

RF Spule

Säule

Ar


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sind, muss das Gas ständig mit leistungsfähigen Pumpen aus der Ionenquelle entfernt werden.

Total Ion Chromatogram/Current (TIC): Alle Ionen in einem grossen Massenbereich werden wiederholt kurz hintereinander gemessen. Somit kann das ganze Fragmentierungsmuster erfasst werden, was nötig ist zur Identifizierung von Substanzen. Als Detektorsignal wird die Summe der Intensitäten aller gemessenen Massen verwendet.

Single/Selected Ion Monitoring (SIM): Nur ein oder einige wenige m/z werden gemessen. Das resultierende Chromatogramm ist spezifisch und es werden tiefere Nachweisgrenzen erreicht. Diese Detektionsmethode wird von allem zur Quantifizierung im Spurenbereich eingesetzt. Als Detektorsignal wird meist die Intensität bei einem m/z verwendet

MS-MS (Tandem MS): Um Fragmentierungen und Reaktivität eines spezifischen Ions zu studieren, oder um die Selektivität und Sensitivität (Nachweisgrenze) einer Quantifizierungsmethode entscheidend zu verbessern, koppelt man mehrere Analysatoren hintereinander. Zwischen zwei Analysatoren wird eine sogenannte Kollisionszelle eingebaut, um den Ionen durch Stösse mit einem Inertgas (N2 oder Ar) oder Reagenzgas Energie zuzuführen. Daraufhin zerfallen die Ionen sehr spezifisch zu anderen (oft leichteren) Ionen.

Ein Ion wird aus einem ersten Massenanalysator selektiert und weitergeleitet, wo es durch Stösse mit eingeleitendem Gas in der CID-Kammer (Collision-Induced Dissociation: CID) weiter fragmentiert wird oder reagiert. Die resultierenden Fragmente oder neu entstehenden Produkte werden darauf in einem zweiten Massenanalysator gemessen. Somit können detaillierte strukturelle Informationen oder Reaktionsmechanismen von einzelnen Ionen gewonnen werden. Dies ist eine wichtige Methode zur Strukturaufklärung von unbekannten Substanzen.

3.5 Qualitative and quantitative Analyse mittels der Gaschromatographie

Retentionsindex (Qualitative Analyse)

Die Verdampfungsenthalpie ∆HV eines reinen Stoffes ist von dessen chemischer Struktur abhängig. Bei der Verdampfung aus Lösungen (oder hier der stationären Phase) hängt ∆HV auch von der Struktur des Lösemittels ab, denn die Wechselwirkung zwischen den Molekülen des gelösten Stoffes und der stationären Phase bestimmt die Energie, die


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aufgebracht werden muss, um ein Molekül aus der flüssigen Umgebung in die Gasphase zu überführen.

∆HV nimmt bei homologen Reihen (gleiche funktionelle Gruppe, unterschiedliche Länge der Alkylkette) mit jedem zusätzlichen C-Atom um denselben, nahezu konstanten Betrag zu (gilt auch für den Siedepunkt). Für die homologe Reihe der n-Alkane gilt daher ein linearer Zusammenhang zwischen log t'R und der C-Zahl n.

Kovats hat einen allgemeinen Parameter entwickelt, um die Identifizierung der Substanzen in einem Chromatogramm zu vereinfachen. Die Retentionszeiten der n-Alkane dienen als Referenzpunkte. Die Zahl deren Kohlenstoffatome, multipliziert mit 100, werden auf der Abszissenachse aufgetragen. Eine Komponente x, die zwischen zwei aufeinanderfolgenden n-Alkanen mit den C-Zahlen z und z+1 eluiert, wird im Indexsystem folgendermassen erfasst.

Bei T = const., d.h. unter isothermen Bedingungen gilt:

€

IT =100 ⋅ log(tR' )x − log(tR

' )zlog(tR

' )z+1 − log(tR' )z

+ z

bei konstanter Temperaturgradienten (dT/dt = const.) gilt:

€

IT =100 ⋅ (tR )x − (tR )z(tR )z+1 − (tR )z

+ z

Für andere Substanzen sind die Indizes von der stationären Phase und Temperatur abhängig, aber reproduzierbar.

GC-MS zur qualitativen und quantitativen Analyse

In der chemischen Analytik dient die MS als eine der wichtigsten Analyseverfahren zur Bestimmung der Molekülmasse und zur Aufklärung der Struktur von Verbindungen. Der qualitative (Erkennung von unbekannten Substanzen) und quantitative Nachweis sehr kleiner Substanzmengen (bis 1 Femtogramm) ist möglich.

GC-FID zur quantitativen Analyse

Der FID ist einer der am meisten verwendete Detektoren in der Gaschromatographie und besonders geeignet für die quantitative Analyse im Spurenbereich. Das Detektorsignal ist über einen weiten Konzentrationsbereich proportional zur Menge des Analyten in der Flamme, deshalb kann der Detektor gut zur Quantifizierung verwendet werden.

Log(R

ete

nti

onsz

eit

)!

Zahl der C-atome x100!

+ “Eich”–Substanzen!o unbekannter Analyt!

500 600 700 800


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3.6 Wann ist GC ungeeignet?

GC ist unter anderem bei folgenden Situationen eine ungeeignete Trennmethode:

GC-Problem mögliche Alternative

Substanz-eigenschaften

thermisch labile Substanzen (Zersetzungstemperatur < Elutionstemperatur in der GC)

HPLC

zu wenig flüchtig, z.B. zu polar Derivatisieren HPLC

Proben-eigenschaften

zu viele Analyten in der Probe (ungenügende Auflösung)

verbesserte Proben-vorbereitung (z.B. Reinigung)

Herstellung/Sammeln der Probe verbessern

Selektiver Detektor zu viel “Dreck” in der Probe (ungenügende

Auflösung, Säule verschmutzen) verbesserte Proben-

vorbereitung (z.B. Reinigung)

Derivatisierungen

Eine der grössten Limitierungen der GC ist, dass die zu analysierenden Verbindungen einen genügend grossen Dampfdruck über der stationären Phase haben müssen, damit sie durch die Säule transportiert werden können und nicht irreversibel in der Säule sitzen bleiben. Sehr schwerflüchtige oder sehr polare Verbindungen können meist nicht direkt mit GC analysiert werden. Viele polare Verbindungen kann man jedoch mit geeigneten chemischen Reaktionen in flüchtigere Derivate umwandeln und sie so der GC zugänglich machen.

Beispiele von Derivatisierungen

Aldehyde, Ketone Es sind mehrere Derivatisierungsreagenzien kommerziell erhältlich, wie z.B. PFBHA [O⋅(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxyamin] das mit Carbonylen zu den entsprechenden flüchtigeren Oximen reagieren.

Alkohole, Carbonsäuren Mit Silylierungsreaktionen werden OH-Gruppen in die entsprechenden Silylderivate verwandelt. Z.B. reagieren Alkohole mit BSTFA [N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoro-acetamid] zu Trimethylsiloxan.

F

F F

F F

O NH2

R2

R1F

F F

F F

O NR2

R1

O+

N

Si(CH3)3F3C

O(H3C)3Si

R OHR O

Si(CH3)3

+ + Rest


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3.7 Aspekte zur praktischen Anwendungen ––– Auswahl Trennsäule, Bedingungsparameter und T-Programm und Optimierung

Allein entscheidend ist der Dampfdruck einer Verbindung über der stationären Phase bei den gegebenen Bedingungen, ob eine gaschromatographische Analyse möglich ist. Die Substanz braucht nicht gasförmig zu sein oder unbedingt einen niedrigen Siedepunkt besitzen. Wenn die Analyten diese Bedingungen nicht erfüllen, können sie trotzdem auf verschiedene Weise der gaschromatographischen Analyse zugänglich gemacht werden. Sie können durch eine Reaktion in eine andere chemische Form (Derivatisierung), die eine ausreichende Flüchtigkeit besitzt, überführt werden. In praktischen Anwendungen soll man die nachstehende Aspekte in Erwägung ziehen.

3.7.1 Trennsäule

Die richtige Säule soll die qualitative und quantitative Erfassung der Analyten ermöglichen und, besonders in der industriellen Praxis, dies in der kürzest möglichen Zeit. Das erste Kriterium hat folgende Konsequenzen: Wenn nicht alle Bestandteile der Probe interessieren, ist ihr Verhalten nicht von Belang, wenn sie die Erfassung der Analyten nicht stören und bereits aus der Säule eluiert sind, wenn ein neuer Lauf begonnen wird. Wenn ein selektiver Detektor verwendet wird, der den Analyten, aber nicht eine Störsubstanz detektiert, ist die chromatographische Trennung der beiden Verbindungen nicht notwendig.

Kriterien für Säulenwahl: • Säulentypen (gepackte vs. Kapillare) • Innerer Durchmesser, Länge und Kapazität • Stationäre Phase: Polarität und Filmdicke

Gepackte oder Kapil larsäule

Heutzutage kommen gepackte Säulen nur noch bei der Trennung permanenter Gase zum Einsatz. Vergleich der Trennung auf einer gepackten Säulen mit Kapillarfilmsäulen (sie unten): Bei gepackten Säule ist die Trennung von 10 Kohlenwasserstoffen sehr schlecht (a), aber wird deutlich verbessert (c) wenn eine Kapillarsäule zum Einsatz kommt.

GSC/GLC

20%

Gasanalyse

GLC

Polysiloxan

Polyethyleneglykol

(1) n-Pentan; (2) n-Hexan; (3) Benzol; (4) n-Heptan; (5) Toluol; !(6) n-Octan; (7) Ethylbenzol; (8) m-Xylol; (9) p-Xylol; (10) n-Nonan.!

(a)! (b)! (c)!0 1 2 3 0 1 2 3 0 8 16 24


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(a) 2 m, 2 mm ID, gepackte Säule, 8% SE-30 auf 80/100-mesh Chromosorb W-HP; He 20 ml/min, 90°C; (b) 25 m, 0.53 mm ID, 5-µm Film Methylsilicon „fused-silica“ Säule, 20 ml/min, 90°C; (c) gleich wie (b), ausser He mit 1.4 ml/min, 110°C.

Säulenlänge (L)

Die Trennleistung nimmt mit der Länge zu, aber die Theorie zeigt, dass dies nur mit der Quadratwurzel der Säulenlänge geschieht, und in der Praxis ist die Zunahme oft noch geringer. Die kürzeste Säule, die die Analytpeaks auflöst, ist völlig ausreichend, und dies kann häufig bereits eine recht kurze Säule sein. Eine kurze Säule bedeutet auch kürzere Analysenzeiten, eine geringere thermische Belastung der Analyten und niedrigere Kosten.

Proben: (a) n-Nonan, (b) 2-Octanon, (c) n-Dekan, (d) 1-Octanol, (e) 2,6-Dimethylphenol, (f) n-Undecan, (g) 2,4-Dimethylanilin, (h) Naphthalin und (i) n-Dodecan; Säule: 0.25 mm ID, 0.25 µm, Dimethylpolysilicon.

Säulendurchmesser

Der Innendurchmesser (ID) spielt eine grosse Rolle für die Trennung: Ein kleiner ID führt zu einer erhöhten Trennleistung, aber zu einer niedrigen Kapazität.

50-m 12-m

5-m 2.5-m ! "

! !

Auflösung R vs Säulendurchmesser

ID 0.1 mm R = 4.00

ID 0.25 mm R = 1.63


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Filmdicke df

Ein dickerer Film führt zu einer besseren Trennleistung, da sich das Phasenverhältnis verkleinert. Allerdings verlängert sich dann auch die Analysenzeit, oder es muss eine höhere Temperatur gewählt werden, um die gleiche Trennzeit zu erzielen.

Polarität der stationären Phase

Normalerweise ist die Natur der Analyten bekannt, und damit ist auch die Wahl der stationären Phase eng. Da ähnliche Polaritäten zwischen Analyten und stationärer Phase vorteilhaft sind, sucht man eine Trennphase, die dieses Kriterium erfüllt. Wenn keinerlei Information über die Probe vorliegt, fällt die Wahl häufig auf eine 5% Phenyl-/95% Methylsiloxan-Phase, die so etwas wie eine Standardphase ist und schätzungsweise für 80% aller Trennungen zufriedenstellende Ergebnisse liefert.

Einfluss der Säulenpolarität auf die Trennung

Auflösung R vs Filmdicke df

Je dicker der Film, desto besser die Auflösung, tR länger

df = 0.25 !m

R = 3.14

df = 0.50 !m

R = 3.60

df = 1.0 !m

R = 4.95

1 – p-Xylol

2 – m-Xylol

3 – Decan

4 – Undecan

apolarer Poly(dimethylsiloxan)film

polarer Polyethylenglycolfilm

Si

CH3

CH3

O

n

Si O

n


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Auf der 100 %igen Dimethylsiloxanphase (siehe oben), die eine sehr geringe Polarität besitzt, werden die Komponenten überwiegend nach ihren Siedepunkten getrennt, mit der Folge, dass die beide Aromaten coeluieren. Auf der Polyethylenglykolphase, die zu den polaren Phase zählt, werden die Aromaten stärker zurückgehalten als die Aliphate, da die Xylene aufgrund ihrer π–Elektronen polarer sind, und ausserdem wird ein kleiner Unterschied zwischen den beiden Aromaten deutlich, sodass auf dieser Phase alle vier Verbindungen aufgetrennt werden.

3.7.2 Lineargeschwindigkeit des Trägergases

Von van Deemter-Gleichung aus wird ein ideale Lineargeschwindigkeitsbereich zur minimalen Bodenhöhe erwartet. Hier unten sieht man ein Beispiel, wie die Lineargeschwindigkeit (u) des Trägergases auf die Trennzeit und die Auflösung beeinflusst. Eine kleine u führt zu langer Analyseprozess, sonst ist die Auflösung zu wenig.

Säule: 25-m × 0.53mm-i.d. 3-µm Filmdicke, 5% Phenylmethylsilicon; Trägergas: He; T: 125°C, Injektor 200°C, FID 200°C. (A) n-Nonan, (B) n-Decan, (C) 1-Octanol, (D) n-Undecan, (E) 2,6-Dimethylphenol, (F) 2, 4-Dimethylanilin, (G) n-Dodecan, (H) Naphthalin.

3.7.3 Temperaturgradienten

Das Temperaturgradientenprogramm gehört zu einer der wichtigsten Techniken in der Gaschromatographie. Durch den einprogrammierten T-Gradient kann die Trennleistung deutlich erhöht werden und auch die Trennzeit wesentlich verkürzt werden.

Isotherme Bedingungen (konstante Temperatur)

Lineargeschwindigkeit Trägergas (1)

11 cm/s 30 cm/s

A = n-nonane,

B = n-decane,

C = 1-octanol, D = n-undecane,

E = 2, 6-dimethylphenol,

F = 2, 4-dimethylaniline,

G = n-dodecane,

H = naphthalene

Column: 25-m ! 0.53-mm-i.d. 3-µm film thickness 5% phenylmethylsilicone,

He carrier at 125°C, inlet at 200"C; flame ionization detector at 200°C

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53 cm/s 105 cm/s

Column: 25-m ! 0.53-mm-i.d. 3-µm film thickness 5% phenylmethylsilicone,

He carrier at 125°C, inlet at 200"C; flame ionization detector at 200°C

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Probe: 0.1 µl direkte Injektion von je 2 µg/mL 1-Propanollösung von (A) n-Nonan, (B) n-Decan, (C) 1-Octanol, (D) n-Undecan, (E) 2,6-DMP, (F) 2,4-DMA, (G) Naphthalin, (H) n-Dodecan. Säule: 30-m × 0.53-mm ID × 3-µm 5%-Diphenyl-95%-Dimethylpolysiloxan. Helium: konstant 12 mL/min Fluss.

Temperatur-Gradienten Programm

Neben Isothermenbedingungen ist T-Gradient-Programm (die Änderung der Temperatur während der Trennung), bei dem das chromatographische Experiment durchgeführt wird, eine der wichtigsten Methoden, die in der Praxis zur Verbesserung der Auflösung verwendet wird. Durch ein Temperaturprogramm kann die Retentionszeit der Substanzen und die Auflösung zwischen den Peaks beeinflusst werden.

Isothermes T-Programm

90°C 100°C

110°C 120°C

A = n-nonane; B = n-decane; C = 1-octanol;

D = n-undecane; E = 2, 6-DMP; F = 2, 4

-DMA; G = naphthalene; H = n-dodecane

! "

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Temperatur-Gradienten-Programm!

isotherme Bedingungen!


41

3.7.4 Zusammenfassung

Die Einflüsse der Säulenparameter, der Säulentemperatur und der Fliessgeschwindigkeit des Trägergases auf die Trennleistung werden in der unterstehenden Tabelle zusammengefasst.

k N Säulenparameter

und Bedingung Kapazität Geschwindigkeit

R

! ! ! L ! ! "

!

" ! " ID ! ! "

"

! ! " df ! ! "

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