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AS-Applikationsnote 1602

FAME-Workstation

ASAN 1602 FAME-Workstation – Stand: Februar 2018 Seite 1 von 12

Bestimmung der Fettsäureverteilung in raffinierten Ölen und

Fetten mittels alkalischer Umesterung

mit der FAME-Workstation


FAME-Workstation


Einführung

Tierische und pflanzliche Fette spielen als

Bestandteil unserer täglichen Ernährung

sowie als Schmier- und Gleitmittel eine

wichtige Rolle. Nach der EU-Lebensmit-

telinformationsverordnung sind Lebensmit-

telhersteller seit Dezember 2016 verpflich-

tet, die Fettsäurezusammensetzung auf der

Verpackung anzugeben. Für die Deklara-

tion wird nicht nur die Fettsäurezusammen-

setzung von Fetten und Ölen untersucht,

sondern auch die der cis- und trans-Fett-

säuren. Außerdem wird der Reinheitsgrad

bestimmt.

Die Triglyceride der Fettsäuren lassen sich

gaschromatographisch jedoch nicht analy-

sieren. Dafür bedarf es der Spaltung und

Derivatisierung des Fettes. Die Esterbin-

dungen werden aufgebrochen und die

freien Fettsäuren in ihre korrespondieren-

den Fettsäuremethylester überführt. Im

Gegensatz zu den jeweiligen Fettsäuren

sind die Fettsäuremethylester (FAMEs) un-

polar, moderat flüchtig und eignen sich für

die GC-Analyse.

Es gibt unterschiedliche Vorschriften, die

eine Analytik von ölhaltigen Proben auf

FAMEs beschreiben. Als Vorlage für die hier

vorliegende Applikation dient die Norm der

American Oil Chemists‘ Society (AOCS) Ce

2-66. Diese Norm enthält mehrere Metho-

den zur Aufarbeitung von Fett-Proben, wo-

bei die Methode 3 und Methode 4 (Abbil-

dung 1) der Norm für die Automatisierung

verwendet werden. Methode 4 dient der

Aufarbeitung von Fettproben mit einer Säu-

rezahl < 2. Die Methode 3 hingegen ist eine

umfassende Aufarbeitungsmethode. Sie ist

jedoch auch aufwendiger und zeitintensi-

ver.


FAME-Workstation


Abbildung 1: Schematische Darstellung der Probenvorbereitung einer Öl-Probe mithilfe der Norm AOCS Ce 2-66.


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Gerätekonfiguration Die Analyse eines Fettes auf seine Fettsäu-

ren wurde auf einem System realisiert, das

sowohl Aufarbeitung der Probe wie auch

die Analyse vollautomatisch durchführen

kann. Dafür wurde ein 7890A GC-FID Sys-

tem von Agilent Technologies mit einem

S/SL-Injektor von SIM verwendet. Für die

Probenvorbereitung wurde ein PAL RTC Au-

tosampler von CTC Analytics eingesetzt.

Abbildung 2 zeigt die Konfiguration der ein-

zelnen Module auf der x-Achse des Samp-

lers.

Geräteaufbau Agilent 7890 GC mit FID-Detektor,

S/SL-Injektor und BPX-70 Säule 60 m

PAL RTC 120 cm mit Agitator, 2x

Parkstationen, 2x Tray-Holder mit 3x

VT-54 Racks und 3x VT-15 Racks,

Vortexer, Waschstation und Solvent-

Modul

Software CHRONOS Software von Axel Sem-

rau®

DataApex Clarity

Abbildung 2: Anordnung der Module eines PAL 3 RTC auf einem Agilent GC 7890 mit FID.


FAME-Workstation


Messparameter und Ergebnisse

Der Aufbau einer Lösung zur Probenvorbe-

reitung nach AOCS Ce 2-66 mit zwei ver-

schiedenen Probenvorbereitungsvarianten

bedarf eines flexiblen Systems zur Automa-

tisierung. Der PAL RTC Sampler mit auto-

matischem Tool-Wechsel ermöglicht genau

dieses. Mit zwei Parkstationen ist es mög-

lich, bis zu 6 verschiedene Spritzen-Tools

für verschiedene Aufgaben an dem System

zu verwenden. Dies liefert einen möglichst

hohen Grad an Effizienz und Flexibilität und

hilft Verschleppungen zu vermeiden.

In Verbindung mit der Software-Plattform

CHRONOS entsteht eine leistungsstarke

Automatisierung mit intelligenter Zeitpla-

nung und Verschachtelung und optimaler

Auslastung des gesamten Systems.

Schnittstellen zu fast allen gängigen Chro-

matographie-Auswertesystemen öffnen

diese CHRONECT Robotic Lösung für ana-

lytische Systeme fast aller Hersteller. Die

hier vorgestellte Automatisierung ist daher

nicht an eine bestimmte Gerätekonfigura-

tion gebunden. Die Messparameter des

Gaschromatographen für die aufbereiteten

Proben wurden aus der AOCS Norm Ce 1f-

96 gewählt (Tabelle 1). Diese Norm be-

schreibt nur die chromatographischen Be-

dingungen für die FAME-Analytik.

Tabelle 1: Parameter des Gaschromatographen.

Heizrate [°C/min] Endtemperatur [°C] Haltezeit [°C] Gesamtzeit [min]

70 0 0

5,00 220 15 45

Injektor 250 °C, 1 mL/min, Split 1:30

Detektor 250 °C, 25 mL/min N2 Makeup

Trägergas H2

Trennsäule BPX 70, 60 m, 250 µm i.d. und 0,25 µm Film

Die Methode 3 beschreibt die Probenvorbe-

reitung mittels alkalischer Verseifung durch

methanolisches Natriumhydroxid (meth.

NaOH) und nachfolgender Methylierung mit

methanolischem Bortrifluorid (meth. BF3).

Anschließend wird der Ansatz bis zum Sie-

den erhitzt und mit n-Heptan verdünnt. Es

folgt eine weitere Siedephase und danach

eine Ausfällung mit gesättigtem Natrium-

chlorid. Es bilden sich zwei Phasen, wobei

die obere organische Phase über Natri-

umsulfat getrocknet und anschließend in

das GC-FID injiziert wird. Als Vorlage für die

Probenaufbereitung dienen 50 mg Öl-Probe

in einem 10 mL Vial mit Crimp-Kappe.

Die Umesterung geschieht vollständig in

dem 10 mL Vial und die anschließende

Trocknung der Probe über Natriumsulfat

wird in einem 2 mL Vial durchgeführt. Der

PAL RTC liefert mit dem Automatic Tool-

Change die beste Lösung für das verschlep-

pungsfreie Vorbereiten dieser Proben bei

gleichzeitiger Vollautomatisierung. Das

Analyseergebnis einer Öl-Probe, die nach

dieser Methode aufgearbeitet wurde ist in

Tabelle 2 zu sehen.


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Tabelle 2: Fettsäurezusammensetzung eines Olivenöls und Vergleich mit Literaturdaten.

Durch die Nutzung der Plattform CHRONOS

in Kombination mit dem PAL RTC ist es

möglich, bis zu 40 Öl-Proben innerhalb von

24 h aufzuarbeiten und mittels GC-FID zu

analysieren (Abbildung 3). Bei dieser Art

der Probenvorbereitung werden aggressive

Reagenzien wie das meth. BF3 verwendet.

Um Korrosion an den Tools des PAL zu ver-

meiden, ist auf eine regelmäßige Wartung

des Systems zu achten.

Die Magneten an den Tools für den Trans-

port der Vials, sind dafür speziell anfällig.

Diese sollten regelmäßig gereinigt werden.

Bei kontinuierlicher Nutzung sollte dies ein-

mal im Monat geschehen. Für Proben die

als Feststoff vorliegen, eignet sich diese

Probenvorbereitung sehr gut.

Abbildung 3: Beispiel einer verschachtelten CHRONOS Sequenz von fünf Proben nach AOCS Ce 2-66 Methode 3 innerhalb von 3 h.

1 Die Werte entsprechen dem Trade Standard Applying to Olive Oil and Olive Pomace Oil des Internationalen Oli-

venölrates (Madrid) von 1998.

Komponente % Fläche % Fläche Literatur1

C16:0 (Palmitinsäure) 11,4 7,5 – 20,0

C18:1 (Ölsäure) 76,0 55,0 – 83,0

C18:2 cc 6,1 3,5 – 21,0

Andere Fettsäuren 6,4 0,0 – 10,0


FAME-Workstation


Bei der Methode 4 der AOCS Norm Ce 2-66

geschieht die Umesterung von ca. 50 mg

Probe mittels methanolischem Kaliumhyd-

roxid (meth. KOH). Zuerst wird die Probe in

n-Heptan gelöst. Nach der Phasentren-

nungwird die organische Phase mit Wasser

gewaschen und über Natriumsulfat ge-

trocknet. Das trockene Extrakt wird in n-

Heptan aufgenommen und direkt aus dem

Vial in das GC-FID System injiziert (Tabelle

3).

Ein grober Ablauf der Probenvorbereitung

ist in Tabelle 4 dargestellt und beinhaltet

alle wichtigen Arbeitsschritte. Diese Art der

Probenvorbereitung eignet sich hervorra-

gend für die Aufarbeitung von Öl-Proben in

kurzer Zeit. Wenn gewünscht, kann die Pro-

benvorbereitung um bis zu 40 Minuten pro

Probe beschleunigt werden, indem eine

Zentrifuge zur Erzielung einer schnelleren

Phasentrennung eingesetzt wird. Dies er-

höht den Durchsatz von 32 auf ca. 70 Pro-

ben in 24 h. Ein Analysenergebnis nach die-

ser Methode ist in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 3: Allgemeine Schritte der Probenvorbereitung nach Methode 4

Task Beschreibung

Transfer Add n-heptane

Transfer Add 2 M methanolic KOH

VortexVial Shake sample well

WaitOverlapped Wait for phase separation

Transfer Transfer 0.5 mL water into next vial with LS2

Transfer Transfer 0.5 mL of upper phase to next vial with LS2



Transfer Transfer 2 drops of upper phase onto sodium sulfate

Transfer Dilute with heptane LS2


Tabelle 4: Allgemeine Schritte der Probenvorbereitung nach Methode 3 aus der CHRONOS-Methode.

Task Beschreibung

Transfer Add 0.5 M methanolic NaOH with LS2

Transfer Move to Agitator

WaitOverlapped Heat until dissolved

Transfer Add methanolic BF3 with LS3

WaitOverlapped Boil Time 1

Transfer Add heptane with LS2

WaitOverlapped Boil Time 2

Transfer Add saturated sodium chloride with LS3

WaitOverlapped Shake for 15 sec

Transport Remove vial from Agitator vial on tray


Transfer Transfer 1 mL with LS2 to destination vial with sodium sulfate


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Tabelle 5: Fettsäureverteilung eines realen Öls aus dem Lebensmittelbereich.

2 Die Daten basieren auf einer Einfachmessung des Ölherstellers mit manueller Probenvorbereitung.

Komponente Ist % Fläche Soll % Fläche2 C14:0 0,06 0,07

C16:0 4,30 4,29

C16:1 0,22 0,27

C18:0 1,94 1,97

C18:1 c 63,66 63,86

C18:2 ct 0,02 0,04

C18:2 cc 18,26 18,42

C18:3 t 0,16 0,15

C18:3 ccc 8,15 8,25

C20:0 0,56 0,56

C20:1 1,03 1,02

C22:0 0,28 0,27

C24:0 0,12 0,13

C24:1 0,13 0,13


FAME-Workstation


Das Hauptaugenmerk bei dieser Applikation

liegt auf der Automatisierung der eigentli-

chen Probenvorbereitung. Dabei ist ein Kri-

terium ein ausreichendes Spülen aller ver-

wendete Spritzen um Verschleppung zwi-

schen verschiedenen Proben zu vermeiden

und eine gute Phasentrennung beim ausfäl-

len des Triglycerids zu erreichen. Dies führt

zu einer genaueren Abnahme der organi-

schen Phase nach der Methylierung. Um

eine möglichst saubere Probe zu injizieren

wurde das aufbereitete Produkt anschlie-

ßend mit Wasser 1:1 gewaschen und die

organische Phase über Natriumsulfat ge-

trocknet.

Neben der Entwicklung der Methode zur

Probenvorbereitung wurden die Parameter

des Agilent GC-FID Systems angepasst um

eine ausreichend gute Trennung der Fett-

säuremethylester zu erhalten. Hierfür

wurde ein FAME Standard mit 11 Kompo-

nenten von C14:0 bis C24:0 injiziert und

das Temperaturprogramm entsprechend

angepasst.

Für die Entwicklung der Methode wurden

Standardlösungen bestehend aus verschie-

denen Fettsäuremethylestern vermessen.

Abbildung 4 zeigt ein Chromatogramm des

eingesetzten Standards. Mit dem GC-Para-

metern aus konnte eine gute Trennung al-

ler Analyten erzielt werden. Selbst C18:3

und C20:0 zeigen eine entsprechende

Trennung.

Zusätzlich wurde der Restek FAME 37 Stan-

dard mit insgesamt 37 Fettsäuremethyl-

estern injiziert, um eine genauere Kalibrie-

rung der Retentionszeit für die verschiede-

nen Fettsäuren zu erhalten. Das Chromato-

gramm ist in Abbildung 5 dargestellt und

zeigt ebenfalls den Bereich von C14:0 bis

C24:1 mit entsprechend mehr Signalen in

dem Bereich.

Abbildung 4: Chromatogramm einer Trennung von 11 FAME-Analyten von C14:0 bis C24:0.

Für die Validierung der kompletten Me-

thode wurde anschließend noch eine Real-

probe gemessen, deren Kenndaten be-

kannt waren (Abbildung 6). Ein Vergleich

der Fettsäurezusammensetzung mit den

Kenndaten zeigte nur geringe Abweichun-

gen zu den Daten, die mit der Probe aus-

gehändigt wurden (Tabelle 5).


FAME-Workstation


Die vollautomatische Analyse einer Öl-

Probe liefert somit vergleichbare Daten zur

manuellen Probenvorbereitung. Die gerin-

gen Abweichungen der Daten von denen

des Öl-Herstellers liegen deutlich innerhalb

der Verfahrensabweichung von teilweise

bis zu 20 % für einzelne Komponenten

nahe an der am Signal/Rausch-Verhältnis.

Abbildung 5: Ein Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Restek FAME 37 Standards.

Abbildung 6: Messung von Fettsäuren in einer realen Öl-Probe.


FAME-Workstation


Zusammenfassung

Die hier vorgestellte Automatisierung der

FAME-Analytik nach der AOCS Norm er-

möglicht es, die komplette Analyse einer

Öl-Probe vollautomatisch durchzuführen.

Die manuelle Vorarbeit reduziert sich auf

das Wechseln von Lösemittel und das ma-

nuelle Einwiegen der Probenvorlage von Öl-

Proben. Das Hantieren mit der Probe und

den Chemikalien wird komplett vom Auto-

sampler übernommen, sowie die automati-

sche Injektion in das GC-FID System.

Gleichzeitig wird die Menge an verwendeter

Probe und die Menge an Chemikalien redu-

ziert auf wenige Milliliter pro Probe. Dazu

wird das Gefahrenpotenzial für den Mitar-

beiter im Labor deutlich reduziert, da dieser

nur noch bedingt mit gefährlicheren Chemi-

kalien in Kontakt kommt.

Das Auswechseln der Chemikalienvorräte

am Autosampler selbst kann einmal pro

Tag durchgeführt werden und beläuft sich

auf das Nachfüllen der Waschlösungen und

eventuell die Reaktionsreagenzien nachfül-

len. Lediglich kompliziertere Matrices wie

Futtermittel und generell Feststoffe bedür-

fen eventuell weiterer Vorbehandlung.

Die Automatisierung sichert dem Anwender

zum einen ein verschleppungsfreies Arbei-

ten und zum anderen einen hohen Durch-

satz. Die Probenvorbereitung über CHRO-

NECT Robotic ist robust und kann im 24 h

Einsatz betrieben werden. Der Proben-

durchsatz kann so gegenüber der manuel-

len Probenvorbereitung gesteigert werden.

Abhängig von den chromatographischen

Bedingungen können in 24 Stunden 27 bis

40 Proben abgearbeitet werden.


FAME-Workstation

Technische Änderungen vorbehalten

Axel Semrau GmbH & Co. KG

Stefansbecke 42

45549 Sprockhövel

Tel.: 02339 / 12090

Fax: 02339 / 6030

www.axel-semrau.de

[email protected]

Die FAME-Workstation ist eine

Entwicklung von Axel Semrau®

http://www.axel-semrau.de/

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