Aus der Klinik und Poliklinik für Orthopädie der ... · Hautanhangsorgane (Mastitis, Parotitis,...

Aus der Klinik und Poliklinik für Orthopädie

der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr.med. Jochen Eulert

„Adhärenz humanpathogener Staphylokokken auf orthopädischen Implantatmaterialien“

Inaugural - Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Andreas Freytag

aus Würzburg

Würzburg, Dezember 2004

Referent: Herr Professor Dr. med. Jochen Eulert

Koreferentin: Frau Privatdozentin Dr. med. Wilma Ziebuhr

Dekan: Herr Professor Dr. med. Georg Ertl

Tag der mündlichen Prüfung: 10.Juni 2005

Der Promovend ist Arzt

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Biomaterial: Gewebsintegration versus Infektion 1

1.2 Staphylokokken – Ursache vieler Infektionen 2

1.2.1 Der Genus Staphylococcus 2

1.2.2 Durch Staphylokokken ausgelöste Erkrankungen 3

2. Aufgabenstellung 5

3. Material und Methoden 6

3.1 Geräte und Chemikalien 6

3.1.1 Geräte 6

3.1.2 Chemikalien 7

3.2 Beschreibung der getesteten Staphylokokken-Stämme 8

3.3 Material und Oberflächenbeschaffenheit der Prüfkörper 9

3.3.1 Prüfkörper ohne Proteinbeschichtung 9

3.3.2 Proteinbeschichtung der Prüfkörper 10

3.3.3 PLL-g-PEG Beschichtung der Prüfkörper 10

3.4 Kulturmedien und Agarplatten 11

3.5 Methoden 12

3.5.1 Adhärenz-Test von Staphylokokken auf Titan und Kobalt-

Chrom-Legierung unter Zusatz klinisch relevanter Proteine 12

3.5.1.1 Reinigung der Prüfkörper 12

3.5.1.2 Photometrische Bestimmung der Bakterienzellzahl 12

3.5.1.3 Adhärenz-Test der Prüfkörper 13

3.5.1.4 Proteinbeschichtung der Prüfkörper 14

3.5.1.5 Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren 15

3.5.1.6 Adhärenz-Test mit PLL-g-PEG Beschichtung der Prüfkörper 17

3.5.2 Antibiotikaresistenzbestimmung der klinischen Stämme 17

3.5.3 Biofilmtest auf Zellkulturplatten 18

3.5.3.1 Biofilmtest auf nativen Zellkulturplatten 18

Inhaltsverzeichnis II

3.5.3.2 Biofilmtest mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten 19

3.5.3.3 Biofilmtest mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten nach

Blockierung der Kollagenrezeptoren 20

3.6 Elektronenmikroskopie 22

3.6.1 Vorbereitung der Prüfkörper 22

3.6.2 Betrachtung der Oberfläche mit dem Rasterelektronenmikroskop 23

4. Ergebnisse 25

4.1 Antibiotikaresistenzen 25

4.2 Einführung der Wertungsskala 26

4.3 Adhärenz von Staphylokokken auf Titan und Kobalt-Chrom-

Legierung unter Zusatz klinisch relevanter Proteine 31

4.3.1 Adhärenz auf Kobalt-Chrom-Legierung-Prüfkörpern 32

4.3.2 Adhärenz auf Titan-Prüfkörpern 34

4.3.2.1 Adhärenz und Biofilminduktion der klinischen Isolate mit und

ohne Proteinbeschichtung der Prüfkörper in Standkulturen 35

4.3.2.2 Klinische Isolate mit Proteinbeschichtung der Prüfkörper nach

Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren 37

4.3.2.3 Klinische Isolate auf PLL-g-PEG beschichteten Prüfkörpern 38

4.3.2.4 Adhärenz der klinischen Isolate mit und ohne

Proteinbeschichtung der Prüfkörper in Schüttelkulturen 42

4.4 Biofilmtest 43

4.4.1 Testung mit unbeschichteten Zellkulturplatten aus Polystyren. 43

4.4.2 Testung mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten 44

4.4.3 Testung mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten nach

Blockierung der Kollagenrezeptoren 44

5. Diskussion 46

5.1 Einführung der semiquantitativen Wertungsskala 46

5.2 Adhärenzverhalten der einzelnen Stämme 47

5.2.1 Fibrinogen und Fibronektin 48

5.2.2 Albumin 50

Inhaltsverzeichnis III

5.2.3 Der Einfluss von Kollagen Typ I und Typ II auf Adhärenz und

Biofilmbildung 50

5.2.4 Beeinflussung im Schüttler 51

5.2.5 Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren 52

5.2.6 PLL-g-PEG-Beschichtung 53

5.3 Zukünftige Aufgabenstellungen 53

6. Zusammenfassung 56

7. Literatur 58

8. Abkürzungsverzeichnis 66

9. Anhang: REM-Bilder 68

9.1 Kobalt-Chrom-Legierung-Prüfkörper 68


9.1.2 Prüfkörper mit Albuminbeschichtung 71

9.1.3 Prüfkörper mit Kollagen-Typ I-Beschichtung 73

9.1.4 Prüfkörper mit Kollagen-Typ II-Beschichtung 76

9.1.5 Prüfkörper mit Fibronektinbeschichtung 78

9.1.6 Prüfkörper mit Fibrinogenbeschichtung 81

9.2 Titanprüfkörper 83


9.2.2 Prüfkörper mit Albuminbeschichtung 91

9.2.3 Prüfkörper mit Kollagen-Typ I-Beschichtung 100

9.2.4 Prüfkörper mit Kollagen-Typ II-Beschichtung 109

9.2.5 Prüfkörper mit Fibronektinbeschichtung 117

9.2.6 Prüfkörper mit Fibrinogenbeschichtung 126

9.2.7 Prüfkörper mit PLL-g-PEG-Beschichtung 134

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Biomaterial: Gewebeintegration versus Infektion

Die Einbringung von Fremdmaterial in den menschlichen Organismus ist ein großer

medizinischer Fortschritt. So kann ein Katarakt-Patient mit Hilfe einer Kunststofflinse

wieder sehen. Für Patienten mit zerstörten Herzklappen sind die Kunstklappen

lebensrettend. Für Verkehrsunfallopfer mit komplizierten Knochenbrüchen bedeuten

Metalleinbringungen am und in den Knochen die Möglichkeit zur Genesung. Wenn ein

Gelenk durch Arthrose zerstört ist, kann es durch eine Endoprothese ersetzt werden. Die

Schmerzen werden beseitigt und die Mobilität wird wieder hergestellt.

Die zwei Schwierigkeiten beim Einsatz von Fremdmaterial im menschlichen Körper

sind zum einen die schlechte Integration im Gewebe, zum anderen Fremdkör-

perinfektionen (Gristina, 1987). Die Schwierigkeit in der Verbesserung dieser Situation

liegt darin, dass es bei einer Erleichterung der Gewebeintegration auch Bakterien besser

möglich ist, an der Oberfläche des Materials zu adherieren. So stellen z. B. rauere

Oberflächen von Gelenkimplantaten bessere Bedingungen zum Einwachsen von

Knochen dar. In diese rauen Oberflächen können sich auch Bakterien leichter

festsetzen (Taylor et al., 1998, Verheyen et al., 1993). Sobald sich eine Endoprothese

im menschlichen Körper befindet, wird ihre Oberfläche von einer Matrix bestehend aus

Fibrinogen, Kollagen, Fibronektin und anderen Proteinen beschichtet. Diese verbessert

einerseits die Gewebeintegration, andererseits aber auch die Bedingungen für die

Ansiedlung von Bakterien. Hierbei spielen zunächst elektrostatische Kräfte eine Rolle.

Eine Oxidschicht verstärkt durch negative Ladung die Bildung dieser Matrix. Aufgrund

dieser Erkenntnis werden vermehrt Metalle wie Titan und Chrom-Kobalt-Legierungen

eingesetzt, die nicht oxidieren. Dennoch kommt es auch bei diesen Metalllegierungen

zur Entstehung der Matrix und Bakterienansiedlung. Wäre die Oberfläche optimal im

Gewebe integriert, hätten die Mikroorganismen keine Möglichkeit zu adherieren. Dies

setzt voraus, dass die menschlichen Gewebszellen schneller anheften als die Bakterien

und dass bei der Operation keine Keime an die Prothese gelangen. Gristina prägte

hierfür den Ausdruck „The race to the surface“.

Einleitung 2

Eine Modifizierung der Oberfläche, welche zur Verbesserung der Gewebeintegration

dient und gleichzeitig Bakterienanheftung mindert, muss gefunden werden (Gristina,

1987). Seit 17 Jahren steht diese Forderung. Dennoch ist noch keine Oberfläche

gefunden, welche eine weitere Verbesserung beim Einsatz von Biomaterial bringt.

1.2 Staphylokokken – Ursache vieler Infektionen

1.2.1 Der Genus Staphylococcus

Staphylokokken sind unbewegliche, gram- und katalasepositive Bakterien, die nicht zur

Sporenbildung fähig sind und sich fakultativ anaerob vermehren. Staphylokokken

exprimieren auf ihrer Oberfläche Proteine, die den Kontakt zu Matrixproteinen und

Wirtszellen herstellen. Neben den unter 1.1 beschriebenen elektrostatischen Kräften

spielen diese Zellwand-gebundenen Proteine bei der Adhärenz auf Fremdmaterial im

menschlichen Körper eine entscheidende Rolle. Sie binden an die körpereigene

Proteinmatrix, welche das fremde Material umgibt und ermöglichen so das Anheften

der Staphylokokken. Nach dieser initialen Adhärenz eines einschichtigen

Bakterienrasens, kann es in einem zweiten Schritt zum akkumulativen Wachstum und

zur Ausbildung eines mehrschichtigen Biofilms kommen. Hierbei hüllen sich die

Bakterien in eine extrazelluläre Polysaccharidschicht ein. Es handelt sich hierbei um ein

β-1,6-verknüpftes Glucosaminoglykan, welches den Kontakt der Bakterien

untereinander herstellt und deshalb auch Polysaccharid-Interzelluläres-Adhäsin (PIA)

bezeichnet wird. Diese Biofilmbildung hängt stark von externen Bedingungen ab, wobei

Nährstoffangebot und externe Stressoren wie Antibiotika, Ethanol oder Osmolarität eine

wichtige Rolle spielen. Für die Invasion und Etablierung im körpereigenem Gewebe

sind vor allem Exoproteine von Bedeutung. Enzyme wie Hämolysine, Leukocidin,

Hyaluronidase, Lipasen, Proteasen und Nukleasen stehen den Staphylokokken zur

Verfügung. Bisher sind 37 verschiedene Arten der Gattung Staphylococcus bekannt.

Hierbei trennt sich die freie Koagulase bildende Art S. aureus durch ihre potentielle

Pathogenität von den übrigen koagulasenegativen Staphylokokken (KNS) ab. Von den

zahreichen KNS-Arten ist S. epidermidis für den Menschen besonders bedeutsam. Bei

Einleitung 3

jedem gesunden Menschen besitzt die Haut eine Schutzschicht aus Bakterien, welche

vor einer Infektion durch pathogene Keime schützt. In dieser Schicht spielt S.

epidermidis eine wichtige Rolle. Er besitzt bei immunkompetenten Menschen geringes

pathogenes Potential und verhindert die Ansiedlung anderer pathogener

Krankheitserreger (Kloos, 1997). In den letzten Jahren stellten nun auch diese, einst

harmlosen Bakterien, eine ernsthafte Gefahr für die Gesundheit dar. Besonders bei der

Verwendung von Fremdmaterial kommt es zur Besiedlung mit diesen Keimen und im

weiteren Verlauf zu klinischen Infekten (Hahn et al., 1999). Durch das natürliche

Auftreten von S. epidermidis auf der Haut ergeben sich auch Probleme bei der

Diagnostik. Durch Kontamination der Proben können Keime kultiviert werden, die

nicht als eigentlicher Krankheitserreger fungieren, sondern eine Verunreinigung

darstellen. Sie könnten dann aber fälschlicherweise als Krankheitsursache angesehen

werden.

1.2.2 Durch Staphylokokken ausgelöste Erkrankungen

Anfang der 60er Jahre erhöhte S. aureus als nosokomialer Keim die Sterberate in den

Krankenhäusern erheblich. Seit den 80er Jahren stellen methicillinresistente

S. aureus-Stämme (MRSA) ein epidemiologisches Problem in Kliniken dar (Wenzel et

al., 1996). Heute sind multiresistente Staphylokokken eine weltweite Gefahr für die

Menschheit. Durch den Selektionsdruck durch Antibiotika entstehen Resistenzen.

Antibiotika induzieren die Produktion von inaktivierenden Enzymen und es kommt zur

Selektion resistenter Varianten, die in jeder Bakterienpopulation in geringer Zahl

vorkommen und sich weiterhin vermehren. Die Genetik der Resistenzen beruht auf

Chromosomenmutation oder übertragbarer Resistenz, bei der DNS, die einen

Resistenzfaktor kodiert, in die Zelle aufgenommen wird. Dies kann durch

Transformation, Transduktion und Konjugation geschehen. Die Mechanismen der

Resistenz beruhen zum Beispiel auf Veränderung von Zielmolekülen. Dadurch kann das

Antibiotikum nicht mehr binden und seine Wirkung so nicht entfalten. Auch eine

verstärkte Ausschleusung des Antibiotikums aus der Zelle durch Induktion von

Effluxpumpen ist möglich (Hahn et al., 1999). Um diese Resistenzentwicklung zu

Einleitung 4

verhindern ist eine strenge Indikationsstellung von Seiten des Arztes und eine gute

Compliance des Patienten gefordert (Hamilton-Miller J M., 2002).

Infektionen durch S. aureus lassen sich in drei Gruppen einteilen (Hahn et al., 1999):

Zum einen sind es Lokalinfektionen, die oberflächlich eitrig und tief-invasiv verlaufen:

Pyodermien (Abszess, Furunkel, Karbunkel), Impetigo contagiosa, Infektionen der

Hautanhangsorgane (Mastitis, Parotitis, Hordeolum, Dakryozystitis), Osteomyelitis,

Pneumonie, Lungenabszess, Pharyngitis, postoperative und posttraumatische Wundin-

fektionen, Fremdkörperinfektionen und Empyeme. Zum anderen ist es die systemische

Ausbreitung als Sepsis und Endokarditis. Die dritte Gruppe sind toxinbedingte

Syndrome: Staphylococcal-Scalded-Skin-Syndrom (SSSS), Toxic-Shock-Syndrom

(TSS), Nahrungsmittelintoxikationen (meist durch Enterotoxin A und andere

Entertoxine).

Mit dem steigenden Einsatz von Fremdmaterial, wie Herzschrittmacher, Prothesen,

Katheter etc. und der Zunahme der Zahl immunsupprimierter Patienten ist die Zahl der

durch KNS verursachten Infektionen stark gestiegen (Eiff et al., 2001). Beispiele in der

Inneren Medizin mit KNS sind Shunt-Meningitis, CAPD (kontinuierliche ambulante

Peritonealdialyse) - Peritonitis, Endokarditis bei künstlichen Herzklappen und Sepsis

gefürchtet. Nach Linsenimplantation in der Augenheilkunde ist die Enophthalmitis als

Komplikation von Bedeutung. Im Bereich Orthopädie/Unfallchirurgie sind Arthritiden

mit KNS als sogenannte „Low Grade“ Infektionen bekannt (Hahn et al. 1999). Bei den

aus orthopädischen Infektionen isolierten Keimen handelt es sich überwiegend um

Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis (Fitzgerald et al. 1995).

Aufgabenstellung 5

2. Aufgabenstellung

Mit Zunahme des Einbaues von orthopädischen Implantaten erhöhte sich auch die

Anzahl von Komplikationen. Zu diesen zählen unter anderem Infektionen.

Fremdmaterial eignet sich gut als Anlagerungsstelle für Bakterien. Nach Anhaftung von

Staphylokokken kommt es bei Endoprothesen zu einer septischen Lockerung. Ein

Wechsel der Prothese und damit verbundene lange Krankenhausaufenthalte werden für

den Patienten unumgänglich.

Ziel der Arbeit ist es, eine Methode zu entwickeln, mit der man eine semiquantitative

Aussage über das Adhärenzverhalten der Bakterien machen kann. Hauptaugenmerk

liegt hierbei auf einem einfachen und robusten System, innerhalb dessen man

verschiedene Versuchsbedingungen in Hinsicht auf das biologische Verhalten von

Staphylokokken leicht variieren kann. Verschiedene Gewebsproteine, die auch an Ort

und Stelle im Körper vorkommen, sind in Bezug auf die Beeinflussung der

Bakterienadhärenz miteinander zu vergleichen.

Dabei soll untersucht werden, welche Bedingungen eine Infektion fördern und welche

diese eher hemmen. Ob das Ergebnis zur zukünftigen Reduzierung der Infektionen von

Gelenkendoprothesen nützlich ist, soll diskutiert werden.

Material und Methoden 6

3. Material und Methoden

3.1 Geräte und Chemikalien

3.1.1 Geräte

Tabelle 1: Folgende Geräte wurden für die Arbeit benötigt.

Geräte Hersteller

Analysenwaage JL-180 Chyco Balance Corp.

Autoclavi FOM/B 30 Fedegari

Brutschrank Heraeus

Fireboy Eco

GasPak System (Anaerobiertopf) BBL

Grobwaage “Navigator” Ohaus

Incubator Shaker innova 4300 New Brunswick Scientific

Pipetten Gilson

Rasterelektronenmikroskop DSM 962 Zeiss, Germany

Rührgerät Gerhardt

Sonorex RK 100 Bandelin

Sputter Coater SCD 005 Balzers Union BAL-TEC

Thermostat 5320 Eppendorf

Tischzentrifuge Biofuge pico Heraeus

Ultrospec 2000 Spectrophotometer Pharmacia Biotech

Vortex Genie2 Scientific Industries


3.1.2 Chemikalien

Tabelle 2: Folgende Chemikalien wurden für die Arbeit verwendet.

Chemikalie Hersteller

Aceton AppliChem

Agar granulated DIFCO

Albumin (5% human) Octa Pharma

Anaerocult C Merck

Chloramphenicol 30 µg Oxoid

Ciprofloxacin 5 µg Oxoid

Clindamycin 2 µg Oxoid

Collagen Typ I (calf skin) Sigma

Collagen Typ II (chicken sternal cartilage) Sigma

Dextran Sigma

Erythromycin 15 µg Oxoid

Essigsäure AppliChem

Ethanol Roth

Fibrinogen (TypeI human) Sigma

Fibronektin (bovine) Sigma

Gentamycin 10 µg Oxoid

Glutaraldehyd Serva

KCl Roth

KH2PO4 Merck

Kristallviolett Certistain

Mc Farland 0,5 Bio Mérieux

NaCl Roth

Na2HPO4 x 2 H2O AppliChem

Oxacillin 1 µg Oxoid

Penicillin G 10units Oxoid

SDS AppliChem


Teicoplanin 30 µg Oxoid

Tetracyclin 30 µg Oxoid

Trimethoprim 5 µg Oxoid

Vancomycin 30 µg Oxoid

3.2 Beschreibung der getesteten Staphylokokken-Stämme

Für die Experimente werden Referenzstämme aus der American Tissue and Cell

Collection eingesetzt.

S. epidermidis RP62A (=ATCC 35984) ist ein stark biofilmbildender Referenzstamm,

der hinsichtlich dieser Eigenschaft und seines Adhärenzverhaltens auf Plastik von

Christensen et al. (1982) beschrieben wurde.

S. carnosus TM300 (Götz et al. 1981) wird als Biofilm-negativer Kontrollstamm

eingesetzt.

S. aureus RN4220 ( Kreiswirth, 1993) wird als negativer Kontrollstamm für die

Kollagenversuche eingesetzt. Er besitzt nachweislich keine Kollagen-Rezeptoren und ist

somit für die kollagenbeschichteten Prüfkörper eine negative Kontrolle. (S. Geyer,

2002)

Die S. aureus Stämme 907, 911 und 913 sind klinische Isolate, die von infizierten

Gelenkendoprothesen aus dem König-Ludwig-Haus Würzburg stammen.

Die S. epidermidis Stämme 910 und 814 sind ebenfalls klinische Isolate, die von

infizierten Gelenkendoprothesen aus dem König-Ludwig-Haus Würzburg stammen.

Der Stamm 814 nimmt eine Sonderstellung ein. Bei ihm handelt es sich um eine „Small

colony“ Variante. Diese Varianten zeichnen sich durch Defekte in

Atmungskettenenzymen aus. Somit sind sie in ihrer Wachstumsrate vermindert und alle

energieabhängigen Prozesse, wie die Exotoxinproduktion oder Antibiotikaaufnahme


sind nur eingeschränkt möglich. Dadurch bestehen Resistenzen gegenüber einigen

Antibiotika wie zum Beispiel den Aminoglykosiden; es werden jedoch auch keine

Wirtszellen in der Nachbarschaft abgetötet. „Small colony“ Varianten persistieren

vielmehr in eukaryotischen Zellen ohne vom Immunsystem erkannt zu werden. Wenn

es die äußeren Umstände zulassen, können sie wieder zum voll virulenten Phänotyp

zurückkehren (revertieren). Die „Small colony“ Variante 814 ist nur unter anaeroben

Bedingungen auf Kochblutagar anzüchtbar ist. Hierfür ist eine Zeit von etwa 72 h bei

37°C erforderlich. Nachdem der Stamm auf Kochblutagar gewachsen ist, wird er

wieder auf TSB-Agar ausgestrichen und unter aeroben Bedingungen erneut 72 h bei

37°C inkubiert. Jetzt zeigt sich auch hier Wachstum. Somit ist die „Small colony“

Variante (Scv) revertiert. Diese wird im Folgenden als „Revertante“ (Rev) bezeichnet.

3.3 Material und Oberflächenbeschaffenheit der Prüfkörper

3.3.1 Prüfkörper ohne Proteinbeschichtung

Um das Adhärenzverhalten der Staphylokokken zu testen, werden Prüfkörper aus Titan

und einer Kobalt-Chrom-Legierung verwendet. Die Oberflächenrauheit beider Metalle

liegt zwischen 0,8 und 1,0 µm. Hersteller ist die Firma Johnson & Johnson

(Nordenstedt, Deutschland). Die Zusammensetzung der Legierung ist in Tabelle 5

wiedergegeben:

Tabelle 5: Chemische Zusammensetzung der Kobalt-Chrom-Legierung.

Element Zusammensetzung begrenzt auf (%)

Chrom 26,5 bis 30,0

Molybdän 4,5 bis 7,0 max.

Nickel 2,5 max.

Eisen 1,0 max.

Kohlenstoff 0,35 max.

Magnesium 1,0 max.

Silicium 1,0 max.

Kobalt Balance


3.3.2 Proteinbeschichtung der Prüfkörper

Die Beschichtung der Prüfkörper wird mit jeweils flüssiger Proteinlösung der

Konzentration 1mg/ml durchgeführt.Verwendet werden die in Tabelle 2 aufgelisteten

Proteine Albumin von Octa Pharma (Langenfeld, Deutschland), Kollagen Typ I und II,

Fibrinogen und Fibronektin von Sigma (Seelze, Deutschland).

Hierfür werden die gereinigten Prüfkörper auf der Oberfläche mit den Proteinlösungen

benetzt und 24 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss daran werden die überständigen

Proteinlösungen wieder abpippetiert (Merritt et al., 1997). (s. 3.5.1.4)

3.3.3 PLL-g-PEG Beschichtung der Prüfkörper

Die einzelnen Prüfkörper wurden nach folgendem Schema durch S. Tosatti, ETH Zürich

(Schlieren, Schweiz) speziell beschichtet.

Reinigung der Prüfkörper:

Im ersten Schritt werden die Prüfkörper im Ultraschallbad 2 x 10 min in Hexan, Aceton

und Ethanol gereinigt. Danach folgen weitere 10 min Ultraschallbad in Millipore-

Wasser. Ist dies geschehen, werden sie für eine Stunde in 30%ige HNO3 getaucht.

Daraufhin folgen noch mal 2 x 10 min Ultraschallbad in Millipore-Wasser. Zuletzt

erfolgt die Trocknung mit N2.

Im Anschluss daran wurde die Reinheit der Prüfkörper mit XPS (X-Ray photoelectron

spectroscopy) getestet.

PLL-g-PEG Beschichtung:

Als erstes werden die Prüfkörper 3 min mit UV / Plasma bestrahlt. Daraufhin folgt eine

Qualitätskontrolle mit XPS. Zeigt diese keine Verunreinigung, schließt sich die

eigentliche Beschichtung 15 min SAM mit PLL-g-PEG an. Im Anschluss daran wird

3 x mit PBS und 2 x mit Millipore-Wasser gespült. Zuletzt werden sie noch mit N2

getrocknet und mit dem XPS ein weiteres mal auf Reinheit getestet.


3.4 Kulturmedien und Agarplatten

Mueller-Hinton-Bouillon:

Getrocknete Infusion aus Rindfleisch 300 g/l

Caseinhydrolysat 17,5 g/l

Stärke 1,5 g/l

H2O dest. ad 1000 ml

Trypticase-Soy-Broth (TSB-Medium):

Für dieses Medium wurde ein Fertigpräparat der Firma DIFCO verwendet.

Caseinpepton 17 g/l

Pepton aus Sojamehl 3 g/l

Glucose 2,5 g/l

NaCl 5 g/l

Di-Kaliumhydrogenphosphat 2,5 g/l

H2O dest. ad 1000ml

Mueller-Hinton-Agarplatten: Mueller-Hinton-Bouillon + 12g Agar pro Liter

TSB-Agarplatten: TSB-Medium + 14g Agar pro Liter

Kochblutagarplatten: 475 ml TSB-Medium + 7g Agar mit 25 ml Blut

bei 60°C im Wasserbad vermischen und im

Anschluss auf Platten gießen.


3.5 Methoden

3.5.1 Adhärenztest von Staphylokokken auf Titan und Kobalt-Chrom-

Legierung unter Zusatz klinisch relevanter Proteine

3.5.1.1 Reinigung der Prüfkörper

Bevor die Bakterienaussaat auf die Testmaterialien erfolgte, wurden diese spezifischen

Reinigungs- und Sterilisationsprozeduren unterzogen ( Steinert, KLH Würzburg ).

Tabelle 6: Reinigungs- und Sterilisationsprozeduren der Prüfkörper.

15 min In 2 %ige SDS-Lösung eintauchen

15 min In SDS im Ultraschallbad

2 x 10 min In H2O reinst im Ultraschallbad

10 min In 5%iger Dextran-Lösung im Ultraschallbad


10 min In absolutem Ethanol im Ultraschallbad

10 min In Aceton im Ultraschallbad


anschließend Trocknen in Petrischalen

1 h Autoklavieren bei 121°C

3.5.1.2 Photometrische Bestimmung der Bakterienzellzahl

Um für die Adhärenzversuche die gleiche Anzahl Bakterien zu verwenden, wird für

jeden Stamm vor Beimpfung der Prüfkörper eine Messung der optischen Dichte (OD) in

TSB-Medium durchgeführt. Anhand des OD-Wertes bei einer Wellenlänge von 550 nm

kann mit Hilfe der Tabelle 7 auf die Zellzahl pro Milliliter geschlossen werden. (Der

OD-Wert sollte dabei um 1 liegen, andernfalls sind Verdünnungen bzw. eine höhere

Konzentration der Lösung vorzunehmen.)


Die Prüfkörper wurden mit der Bakteriensuspension für 24 Stunden bebrütet. Danach

erfolgte die Waschung, um nicht adhärente Keime wegzuspülen. Schließlich wurden die

Bakterien auf der Oberfläche mit Glutaraldehyd fixiert und unter dem

Rasterelektronenmikroskop erfolgte die Bestimmung der Adhärenz semiquantitativ.

Die Bakterienanzahl in allen folgenden Adhärenzversuchen betrug 150 x 106 Zellen pro

Prüfkörper. Das heißt bei einer Zellanzahl von 5 x 106 Zellen / µl wurden 30 µl der

Übernachtkultur verwendet. Bei einer Zellzahl von 3,8 x 106 Zellen / µl jedoch 39,4 µl.

Tabelle 7: Zusammenhang zwischen optischer Dichte und Zellzahl der Bakterienlösung.

OD 550 Zellzahl/ml (109)

0,47 0,36

0,52 0,39

0,57 0,43

0,63 0,47

0,69 0,51

0,76 0,56

0,84 0,62

0,92 0,68

3.5.1.3 Adhärenztest der Prüfkörper

Medium:

Trypticase-Soy-Broth

Puffer und Lösungen:

10 x PBS: 40 g NaCl

6,25 g Na2HPO4 x 2 H2O

1 g KCl

1 g KH2PO4

H2O ad 500 ml


5 %ige Glutaraldehydlösung: 25 %ige Stocklösung in 1 x PBS verdünnen

Durchführung des Adhärenzversuches:

Die Übernacht (ÜN)-Kulturen werden bei 37°C über Nacht in TSB angeimpft. Am

nächsten Tag wird die optische Dichte der TSB-ÜN-Kulturen gemessen und

Gewebekulturplatten werden mit den Prüfkörpern bestückt. Zu jedem Prüfkörper wird

das Volumen der TSB-ÜN-Kulturen, in welchem eine Zellzahl von 150 x 106

Staphylokokken enthalten sind, zugefügt und auf 3ml mit TSB aufgefüllt. Es folgen

weitere 24 h Inkubation bei 37°C. Danach werden die Prüfkörper 3 x mit 1 x PBS

aggressiv gewaschen, damit in den Zwischenräumen der Metallteile keine nicht-

adhärenten Bakterien verbleiben. Es folgt eine 30 - minütige Fixation mit 5%iger

Glutaraldehydlösung bei Raumtemperatur (RT). Dann werden die Prüfkörper zunächst

3 x mit 1x PBS und anschließend noch 2 x mit Auqa dest. gewaschen. Nach 24 h

Trocknen bei Raumtemperatur folgt die Auswertung am Rasterelektronenmikroskop.

3.5.1.4 Proteinbeschichtung der Prüfkörper

Durch Beschichtung der Prüfkörper mit verschiedenen Proteinen werden

unterschiedliche Bedingungen für das Adhärenzverhalten der Staphylokokken

geschaffen. Es werden hierbei Proteine verwendet, welche während der

Endoprothesenimplantation im Operationsgebiet vorkommen.

Medium:



10 x PBS: 40 g NaCl


1 g KCl

1 g KH2PO4

H2O dest. ad 500 ml



Zusatz des gewählten Proteins:

a) Kollagen Typ I-Lösung: festes Kollagen Typ I in 0,1 M Essigsäure [1mg/ml]

b) Kollagen Typ II-Lösung: festes Kollagen Typ II in 0,1 M Essigsäure [1mg/ml]

c) Fibrinogen-Lösung: festes Fibrinogen in 0,9 %iger NaCl-Lösung [1mg/ml]

d) Fibronektin (bereits in Lösung) [1mg/ml]

e) Albumin ( 5% human)

Durchführung des Adhärenzversuches mit Proteinbeschichtung:

Nachdem die Prüfkörper in die Gewebekulturplatten eingebracht worden sind, werden

auf sie 100 µl der jeweiligen Proteinlösung gleichmäßig mit einer Pipette aufgetragen.

Im Anschluss daran folgen 24 h Inkubation bei 37°C. Hierbei ist auf ein feuchtes Milieu

um die Gewebekulturplatten herum zu achten, damit die Proteinlösungen nicht

verdunsten. Ist die Inkubationszeit vorbei, werden die restlichen Proteinlösungen von

den Prüfkörpern abpipettiert. Nun bestückt man neue Gewebekulturplatten mit den

beschichteten Prüfkörpern und der unter 3.5.1.3 beschriebene Adhärenztest kann

durchgeführt werden.

3.5.1.5 Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren

Hierbei werden die Bakterien, bevor sie die Möglichkeit zur Adhärenz an dem

Prüfkörper haben, mit Proteinlösungen wie z.B. Kollagen inkubiert. Mit diesem

Verfahren ist es möglich, den Einfluss verschiedener Proteine durch

Rezeptorblockierung auf die Adhärenz zu unterscheiden. Rezeptoren der Bakterien,


welche für die Adhärenz auf den beschichteten Prüfkörpern verantwortlich sind, sollen

somit besetzt werden, bevor sie an die Beschichtungen der Prüfkörper binden können.

Medium:



10 x PBS: 40 g NaCl


1 g KCl

1 g KH2PO4

H2O dest. ad 500 ml


Kollagen Typ I-Lösung: festes Kollagen Typ I in 0,1 M Essigsäure [1mg/ml]

Kollagen Typ II-Lösung: festes Kollagen Typ II in 0,1 M Essigsäure [1mg/ml]

Fibrinogen-Lösung: festes Fibrinogen in 0,9 %iger NaCl-Lösung [1mg/ml]

Fibronektin (bereits in Lösung) [1mg/ml]

Albumin ( 5% human)

Durchführung des Adhärenzversuches nach vorheriger Rezeptorblockierung:

Die Übernacht (ÜN)-Kulturen werden in TSB angeimpft und bei 37°C über Nacht

inkubiert. Am nächsten Tag wird die optische Dichte der TSB-ÜN-Kulturen gemessen

und das Volumen, in welchem eine Zellzahl von 150 x 106 Staphylokokken enthalten

sind, wird 2 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Das überständige TSB-Medium wird

abpipettiert und das zurückbleibende Pellet mit 1 x PBS vorsichtig gewaschen. Nach

Vermischen des Pelletts mit der jeweiligen Proteinlösung folgt eine einstündige


Inkubation bei 37°C im Schüttler. Im Anschluss daran wird die Lösung erneut 2 min bei

13.000 rpm zentrifugiert. Die Proteinlösungen werden abpipettiert und das Pellett mit 1

x PBS vorsichtig gewaschen. Nun werden 3 ml TSB-Medium zugefügt und mit Hilfe

des Vortex-Schüttlers gemischt. Mit den so entstandenen Lösungen wird der unter

3.5.1.3 beschriebene Adhärenztest auf den, wie unter 3.5.1.4 beschrieben, beschichteten

Prüfkörpern durchgeführt.

3.5.1.6 Adhärenz-Test mit PLL-g-PEG Beschichtung der Prüfkörper

Die Durchführung dieses Adhärenztestes war exakt die gleiche wie die des

Adhärenztestes. (s. 3.5.1.3)

Die Prüfköper waren zuvor in der Schweiz mit PLL-g-PEG beschichtet worden.

3.5.2 Antibiotikaresistenzbestimmung der klinischen Stämme

Die Resistenzen werden anhand des Agar-Diffusionstestes nach DIN 58940 bestimmt.

Hierbei werden auf Agarplatten Übernachtkulturen in Flüssigmedium ausgestrichen und

zusätzlich mit Antibiotikaplättchen versehen. An diese Plättchen können für das

Antibiotikum sensitive Keime bis zu einem bestimmten Abstand nicht heranwachsen.

Dadurch bildet sich ein Hemmhof, dessen Größe vermessen wird und in [mm]

angegeben wird.

Medium:


Agarplatten:

Mueller-Hinton-Agar


Mc Farland 0,5


Antibiotika (in Form von Plättchen):

Chloramphenicol 30 µg

Ciprofloxacin 5 µg

Clindamycin 2 µg

Erythromycin 15 µg

Gentamycin 10 µg

Oxacillin 1 µg

Penicillin G 10 units

Teicoplanin 30 µg

Tetracyclin 30 µg

Trimethoprim 5 µg

Vancomycin 30 µg

Durchführung des Agar-Diffusionstestes:

Die ÜN-Kulturen werden in TSB-Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C

inkubiert. Von diesen sind jeweils 3 Tropfen in 3ml TSB bei 37°C zu inkubieren bis Mc

Farland von 0,5 erreicht ist. (1 h) Mc Farland 0,5 ist eine Bariumsulfat-Standard-

Lösung, welche eine bestimmte Trübung hat. Gleicht die Trübung der beimpften TSB-

Medien der von Mc Farland 0,5, werden hiervon jeweils 150 µl auf Mueller-Hinton-

Agarplatten ausplattiert. 3 min antrocknen lassen und die Antibiotikaplättchen mit einer

sterilen Pinzette aufgelegen. Nach 24 h Inkubation bei 37°C folgt das Ablesen der

Hemmhöfe.

3.5.3 Biofilmtest auf Zellkulturplatten

3.5.3.1 Biofilmtest auf nativen Zellkulturplatten

Dieser Test wird durchgeführt, um die Biofilmbildung der klinischen Stämme

makroskopisch beurteilen zu können.


Medium:



10 x PBS: 40 g NaCl


1 g KCl

1 g KH2PO4

H2O dest. ad 500 ml

Kristallviolettlösung ( 70 % Ethanol + Kristallviolett)

Durchführung des Biofilmtestes:

Die ÜN-Kulturen werden in TSB-Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C

inkubiert. Davon pipettiert man jeweils 50 µl zu 5 ml frischem TSB-Medium. Von

diesen Lösungen werden 150 µl pro Vertiefung in 96-well-Platten pipettiert. Nach

weiteren 24 h Inkubation bei 37°C werden die Vertiefungen 3 x mit 1 x PBS gespült.

Die Lufttrocknung der Platten erfolgt 1 h auf einem Heizblock bei 65°C. Nach dem

Trocknen wird jede Vertiefung mit 1 Tropfen Kristallviolettlösung angefüllt und 10

min gewartet. Danach spült man die violette Lösung mit aqua dest. ab. Bei einer

violetten Färbung der Bodenplatte ist der Biofilmtest positiv. Diese violette Färbung

entsteht durch Anlagerung des Farbstoffes an den an der Polymeroberfläche

adhärierenden Biofilm.

(Christensen et al., 1985)

3.5.3.2 Biofilmtest mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten

Hierbei wird getestet, ob sich die Biofilmbildung durch vorangegangene Beschichtung

der 96-well-Platten durch Kollagen Typ I verstärkt.


Medium:



10 x PBS: 40 g NaCl


1 g KCl

1 g KH2PO4

H2O ad 500 ml

Kristallviolettlösung ( 70 %Ethanol + Kristallviolett)


Durchführung des Biofilmtestes mit Proteinbeschichtung:

Die 96-well-Platten sind mit 100 µl Kollagen Typ I-Lösung pro Vertiefung aufzufüllen

und für 24 h bei 37°C zu inkubieren. Dabei ist auf feuchtes Milieu zu achten, damit die

Kollagen Typ I-Lösung nicht verdunstet. Danach werden die Kollagen Typ I-Lösungen

wieder abpipettiert und der Biofilmtest kann, wie unter 3.5.3.1 beschrieben,

durchgeführt werden.

3.5.3.3 Biofilmtest mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten nach

Blockierung der Kollagenrezeptoren

Hierbei werden die Bakterien vor der Beimpfung der 96-well-Platte mit Kollagenlösung

inkubiert, um so eine Rezeptorbindung zu erreichen. (Vgl. 3.5.1.5)

Medium:




10 x PBS: 40 g NaCl


1 g KCl

1 g KH2PO4

H2O ad 500 ml

Kristallviolettlösung ( 70 %Ethanol + Kristallviolett)


Bakterienkultur Prüfköper

Reinigung

Beschichtung mit dem ausgewählten Protein

Blockierung der Rezeptoren 24 h Inkubation bei 37°C

Waschen und Fixieren der

adhärenten Bakterien

Betrachtung und Auswertung unter dem

Rasterelektronenmikroskop

Abbildung 1: Schema des Versuchsprinzips.

Durchführung des Biofilmtestes nach Rezeptorblockierung:

Um die Kollagenrezeptoren der Bakterien zu blockieren, werden jeweils von einer

Übernachtkultur 50 µl abpipettiert und mit 5 ml TSB Medium aufgefüllt. Hiervon

werden wiederum 1,5 ml abpipettiert und in einem Eppendorf-Cap 2 min bei 13.000


rpm zentrifugiert. Das überständige TSB-Medium wird abpipettiert und das

zurückbleibende Pellet mit 1 x PBS vorsichtig gewaschen. Nach Resuspendieren des

Pelletts mit Kollagen folgt eine einstündige Inkubation bei 37°C im Schüttler. Im

Anschluss daran wird die Lösung erneut 2 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die

Kollagenlösung wird abpipettiert und das Pellett mit 1 x PBS vorsichtig gewaschen.

Nun kann man wieder mit 1,5 ml TSB Medium auffüllen, mit Hilfe des Vortex-

Schüttlers mischen und bis zu 10 Vertiefungen, die zuvor 24 h mit Kollagen inkubiert

waren, mit jeweils 150 µl auffüllen. Nach 24 h weiterer Inkubation bei 37°C erfolgt die

Versuchsdurchführung wie unter 3.5.3.1 beschrieben.

3.6 Elektronenmikroskopie

3.6.1 Vorbereitung der Prüfkörper

Bevor die Prüfkörper unter dem Rasterelektronenmikroskop ausgewertet werden

können, ist es nötig, auf diese eine hauchdünne leitfähige Metallschicht aufzubringen.

Hierfür wurde der Sputter Coater SCD 005 der Firma BAL-TEC (Witten, Deutschland)

verwendet. Die Prüfkörper werden auf einem Metallstativ in eine runde Kammer

gestellt. Diese wird verschlossen und in der Kammer wird ein Vakuum erzeugt. Nach

und nach wird über ein Feinnadelventil Argon in die evakuierte Kammer eingeleitet.

Diese Prozedur wird mehrmals wiederholt und nach etwa 10 Minuten wird für eine

Dauer von 5 Minuten ein Stromfluss von 25 mA durch die Kammer geleitet. Dadurch

werden die Argonatome ionisiert und lösen aus einer im Deckel der Kammer

befindlichen Platin-Palladium-Platte feine Metallpartikel heraus, die auf die Prüfkörper

niederschlagen. Neben der Platin-Palladiumverbindung kann auch Gold zur

Beschichtung verwendet werden.

Nach 5 Minuten wird der Stromfluss automatisch gestoppt und die evakuierte Kammer

kann wieder belüftet und die beschichteten Prüfkörper herausgenommen werden.


3.6.2 Betrachtung der Oberfläche mit dem Rasterelektronenmikroskop

Nachdem die Prüfkörper wie unter 3.6.1 beschrieben mit Platin-Palladium beschichtet

sind, ist es möglich sie zu betrachten. Verwendet wurde hierfür das Rasterelektronen-

mikroskop DSM 962 der Firma Zeiss (Jena, Deutschland).

Unter erneuter Verwendung eines Metallstativs werden die Prüfkörper in eine Kammer

eingebracht. In dieser wird ein Vakuum erzeugt. Durch die feine Beschichtung mit

Platin-Palladium ist es nun möglich, an Hand eines Elektronenstrahls die Oberfläche der

Prüfkörper „abzutasten“. Der enggebündelte, sogenannte Primärelektronenstrahl trifft

punktförmig auf die Oberfläche des Prüfkörpers. Hierbei werden Sekundärelektronen

herausgeschleudert. Ihre Anzahl ist abhängig von der Materialart des untersuchten

Objektes und vom Einfallswinkel des Primärelektronenstrahls. Die energieärmeren

Sekundärelektronen können von einem Detektor, einer Anode, abgelenkt werden. So

treffen sie über eine elektronische Signalverarbeitung auf einen Leuchtstoff und diesen

zum Leuchten bringen. Ein Photomultiplier zählt die aufflackernden Lichtblitze und

gibt sie als Pixel am Bildschirm wieder. Je mehr Elektronen auftreffen, um so heller

wird der Pixel. Damit die gesamte Oberfläche dargestellt werden kann, wird der

Primärelektronenstrahl zeilenweise über die Oberfläche geführt. Diesen Vorgang nennt

man Rasterung.

Mittels vertikaler Feinjustierung des Abstandes der Prüfkörperoberfläche von der

Elektronenstrahlquelle kann fokussiert werden. Die Auflösung ist des Weiteren durch

eine Verlangsamung der Scangeschwindigkeit zu erhöhen. Mit zwei anderen

Justierungsrädern ist es möglich, die Prüfkörper horizontal zu bewegen. So kann die

komplette Oberfläche eingesehen werden. (http://www.moerike-g.es.bw.schule.de/

forschunglotus/methods/Rasterelektronenmikroskop.htm; http://www.reclot.de)


Abbildung 2 : Aufbau eines Rasterelektronenmikroskops (http://www.uni-ulm.de/elektronenmikroskopie/herbst2003/REMherbst2003.htm).

Ergebnisse 25

4. Ergebnisse

4.1 Antibiotikaresistenzen

Die Antibiotikaresistenzbestimmung der verwendeten Stämme mittels Agar-

Diffusionstest ergab folgende in Tabelle 8 dargestellte Ergebnisse (Hemmhofgröße in

Millimeter).

Tabelle 8: Antibiotikaresistenzen der klinischen Isolate.

Antibiotikum

[Testplättchenbe-

ladung in µg]

814 Rev

S. epid.

814 s.c.

S. epid.

907

S. aureus

910

S. epid.

911

S. aureus

913

S. aureus

Chloramphenicol 30µg 30 (s) 32 (s) 35 (s) 24 (s) 23 (s) 36 (s)

Teicoplanin 30µg 19 (s) 21 (s) 19 (s) 15 (s) 15 (s) 21 (s)

Tetracyclin 30µg 36 (s) 40 (s) 38 (s) 9 (r) 25 (s) 39 (s)

Ciprofloxacin 5µg 39 (s) 35 (s) 40 (s) 33 (s) 26 (s) 33 (s)

Trimethoprim 5µg 28 (s) 23 (s) 23 (s) 19 (s) 20 (s) 22 (s)

Vancomycin 30µg 23 (s) 20 (s) 16 (s) 16 (s) 16 (s) 18 (s)

Penicillin G 10units 60 (s) 56 (s) 10 (r) 8 (r) 10 (r) 9 (r)

Gentamycin 10µg 28 (s) 25 (s) 17 (s) 7 (r) 20 (s) 13 (r)

Clindamycin 2µg 29 (s) 30 (s) 31 (s) 25 (s) 22 (s) 31 (s)

Erythromycin 15µg 6 (r) 6 (r) 32 (s) 27 (s) 9 (r) 24 (s)

Oxacillin 1µg 32 (s) 35 (s) 9 (r) 6 (r) 18 (s) 6 (r)

(angegeben ist die Hemmhofgröße in [mm], „s“ bedeutet sensitiv und „r“ resistent).

Betrachtet man die einzelnen Stämme, so zeigt der S. epidermidis 814 sowohl als

Revertante als auch als „Small colony“ Variante nur gegen das Makrolid Erythromycin

Resistenz. S. epidermidis 910 ist gegen Tetracyclin, Gentamicin, Penicillin und

Ergebnisse 26

Oxacillin resistent. Er zählt somit zu den multiresistenten S. epidermidis-Stämmen, den

sogenannten MRSE.

S. aureus 911 weist lediglich gegenüber Erythromycin und Penicillin Resistenz auf.

Die beiden übrigen S. aureus Stämme 907 und 913 dagegen sind typische Klinikkeime.

Sie sind beide penicillin- und oxacillinresistent. 913 ist darüber hinaus auch gegen

Gentamicin resistent.

4.2 Einführung der Wertungsskala

Vor einer Inkubation mit Bakterien wurden die aus den Materialien Titan und Kobalt-

Chrom-Legierung bestehenden Prüfkörper unter dem Rasterelektronenmikroskop

dargestellt. Die Oberfläche der Titanprüfkörper zeigt hierbei eine deutlich glattere

Oberfläche als die der Kobalt-Chrom-Legierung-Prüfkörper. (s. Abb.3)

a) Titan (2000fache Vergrößerung) Titan (10.000fache Vergrößerung)

b) Kobalt-Chrom-Legierung Kobalt-Chrom-Legierung

(2000fache Vergrößerung) (10.000fache Vergrößerung)

Ergebnisse 27

Abbildung 3: Oberflächenbeschaffenheit der Prüfkörper. a) Titan b) Kobalt-Chrom-

Legierung. Die rasterelektronenmikroskopischen (REM) Aufnahmen wurden in 2000-

und 10.000facher Vergrößerung angefertigt.

Staphylokokken ist es durch Zusammenwirken von biologischen und physikalischen

Faktoren möglich, aneinander und an Metalloberflächen zu adhärieren. Proteinadhäsine,

Polysaccharidpolymere sowie Oberflächen- und Umgebungssubstanzen bilden

Zellaggregate von Bakterien (Gristina 1987).

Abbildung 4a: Initiale Adhärenz der Staphylokokken (nach W. Ziebuhr, 2004).

Abbildung 4b: Biofilmakkumulation (nach W. Ziebuhr, 2004).

Ergebnisse 28

Durch diese, in Abbildung 4b ersichtliche, Aggregat- und zusätzliche Biofilmbildung

wird eine genaue Quantifizierung der Bakterienzahl unmöglich und deshalb ist es

sinnvoll, eine semiquantitative Auswertung der Rasterelektronenmikroskopbilder

durchzuführen. Die adhärenten Bakterien abzulösen und erneut anzuzüchten, um so

„colony forming units“ (CFU) zu erhalten, wäre zu ungenau. Hierbei kann sowohl eine

einzelne Bakterienzelle als auch ein Aggregat von 1000 Zellen eine CFU bilden. Das

Ergebnis würde somit nicht die wahre Anzahl an adhärenten Staphylokokken

wiedergeben. Ein weiterer bedeutender Faktor ist die Wachstumszeit. Sie wird

möglichst gering gehalten, da nach längerem Wachstum, unabhängig von der

Ausgangsanzahl an adhärenten Bakterien, in sämtlichen Versuchen eine

Überwucherung der Prüfkörper stattfinden würde.

Adhärenz ist die Eigenschaft der Bakterien, auch nach mehrmaligem kräftigen Waschen

mit 1x PBS, nicht von der Metalloberfläche abgelöst zu werden.

Das Adhärenzverhalten wird in Abstufungen von 1-5 unterteilt:

1: keine Adhärenz.

2: vereinzelte Zellen auf der Oberfläche.

3: Oberfläche gleichmäßig mit einzelnen Zellen besiedelt.

4: teilweise Klumpenbildung auf der Oberfläche.

5: die Zellen bedecken die Oberfläche komplett, teilweise mehrschichtig.

(s. Abb. 5)

Da die Bakterien die Oberfläche nicht gleichmäßig besiedeln, sondern je nach Mikro-

milieu mehr oder weniger gehäuft auftreten, stellt der Wert einen „Mittelwert“ der

Gesamtbesiedlung dar. Hierzu wurde die gesamte Oberfläche mit dem Rasterelek-

tronenmikroskop abgefahren.

Ergebnisse 29

1: keine Adhärenz

2: vereinzelt Zellen auf der Oberfläche

3: Oberfläche gleichmäßig mit einzelnen Zellen besiedelt

4: teilweise Aggregatbildung auf der Oberfläche

Ergebnisse 30

5: die Zellen bedecken die Oberfläche komplett, teilweise mehrschichtig

Abbildung 5 (s. vorherige Seite): Wertungsskala für die Adhärenz der Staphylokokken.

Die REM Aufnahmen sind in 2000facher Vergrößerung durchgeführt worden.

Ein + in den Tabellen 9-12 hinter dem Abstufungswert der Adhärenz bedeutet, dass der

Stamm unter diesen Bedingungen Biofilm ausgebildet hat (s.Abb.6). Diese schleimige,

von Bakterien produzierte Matrix stellt für sie eine Schutzbarriere gegen schädliche

äußere Einflüsse wie Hitze, osmotische Veränderungen, Oxidation, Phagozytose und

auch Antibiotika dar. Sie setzt sich aus Polysaccharidketten, bestehend aus einem β1,6-

verknüpften Glukosaminoglykan mit verschiedenen Seitengruppen zusammen und wird

„Polysaccharide Intercellular Adhesin“ (PIA) benannt (Mack et al., 1996).

Die Biofilmbildung wird, wie in Abbildung 4a und b ersichtlich, in 2 Phasen unterteilt:

Phase 1: Primäre Bindung einzelner Bakterienzellen.

Phase 2: Proliferation und Akkumulation der Zellen durch interzelluläre

Adhärenz. Ausbildung einer Umhüllung durch PIA-Produktion.

Typischerweise weisen Fremdkörperinfektionen durch Staphylokokken einen

chronischen Verlauf auf und häufig liegen Resistenzen gegen in vitro hoch wirksame

Antibiotika vor (Mack, 1999). Für diese Resistenzen ist hauptsächlich der Biofilm

verantwortlich. In ihm befinden sich die Bakterien in sessiler Form und sind für

Antibiotika kaum erreichbar. Dies ist durch die Heterogenität des

Bakteriumstoffwechsels und nicht etwa durch Penetrierungsprobleme zu erklären. Es

liegen starke Oxigenierungs- und pH-Unterschiede innerhalb des Biofilms vor (Donlan

and Costerton 2002, Xu et al., 2000).

Ergebnisse 31

Abbildung 6: Biofilmbildung auf einem Reintitanprüfkörper. Die REM Aufnahme ist in

10000facher Vergrößerung durchgeführt worden.

4.3 Adhärenz von Staphylokokken auf Titan und Kobalt-Chrom-

Legierung unter Zusatz klinisch relevanter Proteine

In Abbildung 5 ist die Wertungsskala für das Adhärenzverhalten dargestellt. Für die

Versuche wurde jeweils die gleiche Anzahl an Bakterienzellen verwendet, um

vergleichbare Ergebnisse zu erhalten (s. 3.5.1.2). Die Staphylokokken wurden mit den

Prüfkörpern 24 Stunden bei 37°C inkubiert und nach Abspülen und Fixieren konnte ihr

Adhärenzverhalten auf den Prüfkörpern unter dem Rasterelektronenmikroskop

betrachtet werden.

Im Folgenden wird das Adhärenzverhalten der beschriebenen Stämme sowohl auf Titan

als auch auf der Kobalt-Chrom-Legierung unter Beschichtung mit verschiedenen

Proteinen verglichen. Die Beschichtung der Prüfkörper wurde, wie in 3.3.2 beschrieben,

durch 24 Stunden Inkubation bei 37 °C mit den jeweiligen Proteinlösungen

durchgeführt. In Abbildung 7 ist die Bindung der Bakterienrezeptoren an die

beschichtete Metalloberfläche skizziert.

Mit Proteinen beschichtete Metalloberfläche + Bakterien mit Rezeptoren

Ergebnisse 32

→ Bindung der Rezeptoren an die Proteine auf der Metalloberfläche

Abb.7: Bindung der Bakterien an die beschichtete Metalloberfläche durch die

Vermittlung von Matrix- und Serumproteinen.

4.3.1 Adhärenz auf Kobalt-Chrom-Legierung-Prüfkörpern

Es wurden Versuche mit den klinischen Isolaten bei vorhandener und nicht vorhandener

Proteinbeschichtung durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9: Adhärenzverhalten der getesteten klinischen Isolate auf Kobalt-Chrom-

Legierung-Prüfkörpern.

ohne Protein Albumin Kollagen I Kollagen II Fibrinogen Fibronektin

S. aureus 907 2 2 3+ 4+ 5 5 S. aureus 911 4+ 1 3+ 4+ 5+ 5+ S. aureus 913 3 2 4+ 4+ 5 5 S. epidermidis 910 2 3 3+ 3+ 4 3 S. epidermidis 814 s.c. 2 1 2+ 3 4+ 3 S. epidermidis 814 Rev. 2 2 3+ 2 3 2

Die einzelnen Werte sind in der Wertungsskala in Abb. 5 dargestellt. Ein + bedeutet

Biofilmbildung (REM Aufnahmen siehe Anhang Seite 68-83).

Ergebnisse 33

Die verwendeten S. aureus - Stämme besitzen verminderte Anheftungskraft bei

Albuminbeschichtung. Bei fibrinogen- und fibronektinbeschichtetem Metall liegt

maximale Adhärenz vor. Alle Stämme weisen auf Kollagen Typ I-Beschichtung

Biofilmbildung auf und bei Kollagen Typ II-Beschichtung alle außer dem

S. epidermidis Stamm 814, sowohl als „Small colony-Variante“ als auch als Revertante.

Auffällig ist das verstärkte Ansammeln von adhärenten Bakterien in den bei

Prüfkörpern aus Kobalt-Chrom-Legierung vorhandenen Vertiefungen der Oberfläche.

In diesen Nischen sind sie besser geschützt und können durch eine größere Oberfläche

besser adhärerien.

Abb. 8: S. aureus 907 auf albuminbe- Abb. 9: S. aureus 907 auf fibronektinbe-

schichtetem Kobalt-Chrom-Legierung- schichtetem Kobalt-Chrom-Legierung-

Prüfkörper (10000fache Vergrößerung). Prüfkörper (10000fache Vergrößerung).

Abbildung 8 zeigt die Adhärenz von S. aureus 907 auf der nischenreichen Oberfläche

der Prüfkörper. Trotz Albuminbeschichtung war es hier den Bakterien möglich, zu

adhärieren. In Abbildung 9 ist die stark erhöhte Adhärenz von S. aureus 907 auf

fibronektinbeschichtetem Kobalt-Chrom zu sehen. Zur Verdeutlichung ist in den

Abbildungen 10 und 11 der gleiche Stamm unter den gleichen Bedingungen, nur unter

einer schwächeren (2000fachen) Vergrößerung, zu sehen. Hierbei wird ersichtlich, dass

die Albuminbeschichtung auf der glatten Oberfläche die Adhärenz der Bakterien

Ergebnisse 34

verhindert und diese sich nur in den Nischen anheften können. Im Vergleich dazu

fördert die Fibronektinbeschichtung die Adhärenz auf der gesamten Oberfläche.

Abb. 10: S. aureus 907 auf albuminbe- Abb. 11: S. aureus 907 auf fibronektinbe-

schichtetem Kobalt-Chrom-Legierung- schichtetem Kobalt-Chrom-Legierung-

Prüfkörper (2000fache Vergrößerung). Prüfkörper (2000fache Vergrößerung).

4.3.2 Adhärenz auf Titan-Prüfkörpern

Zunächst wurden in einem Vorversuch der Referenzstamm S. epidermidis RP62A und

der negative Kontrollstamm S. carnosus TM300 auf ihr Adhärenzverhalten getestet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt.

Wie zu erwarten, zeigt der negative Kontrollstamm S. carnosus TM300 keine Adhärenz

auf dem Reintitanprüfkörper. Der Referenzstamm S. epidermidis RP62A, welcher als

stark adhärenter und biofilmbildender Keim auf Plastik bekannt ist, zeigt auch auf dem

Metall enorme mehrschichtige Biofilmbildung.

Ein weiterer Kontrollstamm ist S. aureus RN4220. Er besitzt keinen Kollagenrezeptor

und wird deshalb als Vergleich gegenüber den klinischen Isolaten bei

kollagenbeschichteten Prüfkörpern herangezogen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in

Tabelle 10 dargestellt. Sowohl ohne als auch mit Kollagenbeschichtung zeigt der

Stamm S. aureus RN4220 nahezu keine Adhärenz auf dem Prüfkörper. Biofilmbildung

liegt keine vor.

Ergebnisse 35

4.3.2.1 Adhärenz und Biofilminduktion der klinischen Isolate mit und ohne

Proteinbeschichtung der Prüfkörper in Standkulturen

Das Adhärenzverhalten der klinischen Staphylococcus-Stämme wurde sowohl ohne als

auch mit Proteinlösungen getestet. Betrachtet man die Stämme getrennt nach Art, so

zeigen die S. aureus Stämme 907, 911 und 913 eine deutlich niedrigere Adhärenz bei

albuminbeschichteten im Vergleich zu unbeschichteten Prüfkörpern. Bei fibrinogen-

und fibronektinbeschichtetem Titan liegt in allen Versuchen mit den S. aureus-Stämmen

die auf der Wertungsskala maximale Adhärenz von 5 vor. Biofilmbildung zeigt sich auf

allen Kollagen Typ I-beschichteten Prüfkörpern. Die Anheftung ist hier in drei Fällen

erhöht, in drei Fällen gleichbleibend gegenüber unbeschichtetem Material. Bei Kollagen

Typ II-Beschichtung zeigt sich ein vergleichbares Bild, jedoch ist nicht immer Biofilm

vorhanden.

Die S. epidermidis Stämme 910 und 814 zeigen bei Albuminbeschichtung keine

deutliche Adhärenzminderung gegenüber unbehandeltem Titan. Auf den fibrinogen-

und fibronektinbeschichteten Prüfkörpern ist die Anheftung wie bei den S. aureus

Stämmen erhöht, jedoch nicht ganz so stark ausgeprägt. Biofilmbildung zeigt sich auch

hier bei allen Prüfkörpern mit Kollagen Typ I-Beschichtung. Ebenfalls bei Kollagen

Typ II-beschichtetem Metall ist Biofilmbildung zu sehen. Die Adhärenz ist bei beiden

Kollagentyp-Beschichtungen erhöht.

In den Abbildungen 12 und 13 wird der Unterschied des Adhärenzverhaltens durch die

Kollagen-Typ I-Beschichtung ersichtlich. Abbildung 12 zeigt eine wesentlich höhere

Bakterienzahl als Abbildung 13. Dass nicht nur das Adhärenzverhalten erhöht ist,

sondern Kollagen Typ I auch Biofilmbildung induziert, zeigt Abbildung 14. Hier wird

bei 10000facher Vergrößerung deutlich, dass die Staphylokokken in einer Matrix

eingebettet sind. In Abbildung 15 ist zum Vergleich der Prüfkörper ohne Proteinbe-

schichtung dargestellt, wobei keine Biofilmbildung nachweisbar ist.

Ergebnisse 36

Das Wesentliche dieser Ergebnisse ist, dass Albumin einen Schutz gegenüber der

Adhärenz von Staphylokkoken darstellt, während Kollagen nicht nur die Adhärenz

erhöht, sondern auch die Biofilmbildung induziert, was bisher nicht bekannt war.

Abb. 12: S. epidermidis 910 auf Kollagen- Abb. 13: S. epidermidis 910 auf unbe-

TypI-beschichtetem Reintitanprüfkörper beschichtetem Reintitanprüfkörper

(2000fache Vergrößerung). (2000fache Vergrößerung).

Abb. 14: S. epidermidis 910 auf Kollagen- Abb. 15: S. epidermidis 910 auf unbe-

TypI-beschichtetem Reintitanprüfkörper beschichtetem Reintitanprüfkörper

(10000fache Vergrößerung). (10000fache Vergrößerung).

Ergebnisse 37

4.3.2.2 Klinische Isolate mit Proteinbeschichtung der Prüfkörper nach

Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren

Um zu prüfen, ob es sich bei der im Abschnitt 4.3.2.1 verstärkten Adhärenz um eine

spezifische Interaktion der Bakterien mit den Matrixproteinen handelt, wurden die

klinischen Staphylokokken-Stämme vor der Zugabe zu den beschichteten Prüfkörpern

eine Stunde mit den jeweiligen Matrix-Proteinen inkubiert. Die Bindungsrezeptoren für

die Proteine sollen auf diese Weise, wie in Abbildung 16 dargestellt, geblockt werden.

Liegt eine spezifische Protein-Rezeptor-Interaktion vor, sollten die Proteine der

jeweiligen Metalloberflächenbeschichtung nicht mehr an die Rezeptoren der

Staphylokokken binden, da diese bereits besetzt sind. Die Adhärenz und Biofilmbildung

wäre in diesem Fall vermindert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt.

Rezeptoren + Proteine → Blockierung der Rezeptoren

Abb. 16: Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren.

Nach vorheriger Proteinbindung der Keime zeigt sich folgendes Verhalten der

Staphylokokken: Nach Inkubation der Stämme mit Albumin und Albuminbeschichtung

der Prüfkörper zeigt sich Biofilmbildung und eine erhöhte Adhärenz. Auch auf

fibrinogen- und fibronektinbeschichteten Prüfkörpern findet sich Biofilmbildung und

eine wesentlich höhere Adhärenz nach Inkubation mit Fibrinogen bzw. Fibronektin, als

ohne Rezeptorblockierung.

Die beiden Versuchsreihen mit Kollagen Typ I und II weisen eine niedrigere Anheftung

der Bakterien auf. Biofilmbildung liegt nicht vor. Dies spricht für eine Blockierung der

Rezeptoren durch die vorangegangene Proteinbindung und eine spezifische Interaktion

der Bakterien mit Kollagen Typ I und II.

Ergebnisse 38

Tabelle 10: Adhärenzverhalten der getesteten klinischen Isolate und Kontrollstämme

auf Titan-Prüfkörpern.

Ohne Protein

Albumin

Kollagen I

Kollagen II

Fibrinogen

Fibronektin

RB RB RB RB RB S. aureus 907 4+ 1 2+ 4+ 2 4+ 3 5 5+ 5 5+ S. aureus 911 2 2 3+ 3+ 2 2+ 2 5 5+ 5 4 S. aureus 913 3 1 2+ 3+ 2 4+ 3 5 5+ 5 5+ S. aureus 4220 1 n.d. n.d. 1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. S. epidermidis 910 2 3 3+ 4+ 2 3 2 4 4+ 3 4+ S. epidermidis 814 s.c. 2 2 4+ 3+ 1 4 2 4 5+ 4 4+ S. epidermidis 814 Rev 3 2 4+ 3+ 1 4 3 4 5+ 3 5+ S. epidermidis RP 62A 5+ n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. S. carnosus TM 300 1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.



RB bedeutet Rezeptorblock.

4.3.2.3 Klinische Isolate auf PLL-g-PEG beschichteten Prüfkörpern

Das Copolymer PLL-g-PEG (Poly-L-lysine-g-Polyethylene glycol) (s.Abb. 17) wird

spontan auf Metalloxidoberflächen adsorbiert. Verantwortlich hierfür ist PLL, welches

als sogenannter „backbone“ zur Verankerung auf der Metalloberfläche dient. Diese

Ergebnisse 39

Verankerung findet über elektrostatische Wechselwirkungen statt. Die Metalloberfläche

ist negativ geladen und zieht die positiv geladenen PLL-Polymere an.

PLL wurde bereits ausführlich auf Toxizität und Immunverträglichkeit getestet. PEG

befindet sich auf der gegenüberliegenden Seite des Polymers und zeigt von der

Metalloberfläche aus nach außen. Es reduziert die Adhärenz von Serumproteinen und

anderen Proteinen, wie zum Beispiel Fibrinogen, auf der Oberfläche.

Da die Proteinbindung auf Oberflächen der erste Schritt für Komplikationen, wie z.B.

Thrombose ist, soll durch die Beschichtung die Rate an Komplikationen reduziert

werden. PEG wurde bereits ausführlich für die Verwendung auf Biomaterial untersucht

(Kenausis et al., 2000).

Abbildung 17: Chemische Struktur von Poly-L-Lysin-g-Polyethylenglykol.

Das Adhärenzverhalten auf PLL-g-PEG beschichteten Prüfkörpern wird in Tabelle 11

Ergebnisse 40

dargestellt. Zum Vergleich wird der Versuch mit gereinigten Prüfkörpern durchgeführt.

Tabelle 11: Adhärenzverhalten der getesteten klinischen Isolate auf gereinigten und

PLL-g-PEG beschichteten Titan-Prüfkörpern.

gereinigt PLL-g-PEG

S. aureus

907

3

5+

S. aureus

911

3

5+

S. aureus

913

3

4+

S. epidermidis

910

4+

5+

S. epidermidis

814 s.c.

1

3+

S. epidermidis

814 Rev.

3

5+



Auf den PLL-g-PEG beschichteten Prüfkörpern zeigen mit Ausnahme der „Small

colony-Variante“ von Stamm 814 alle Keime eine sehr starke Adhärenz. Die

Biofilmbildung ist bei allen Stämmen aktiviert. Diese Beschichtung erzeugt bei den

untersuchten Staphylokokkenstämmen eine verstärkte Adhärenz und induziert die

Bildung eines Biofilms.

Ergebnisse 41

Mit den bisherigen Versuchen konnte gezeigt werden, dass

• kein Unterschied zwischen den Prüfkörpermaterialien besteht,

• Albumin die Adhärenz der Staphylokokken reduziert,

• Fibrinogen und Fibronektin die Adhärenz der Staphylokokken steigert,

• Kollagen die Adhärenz der Staphylokokken steigert und zusätzlich die Bildung

von Biofilm induziert,

• nach Blockierung der Kollagenrezeptoren keine Biofilmbildung induziert wird,

was auf eine spezifische Wechselwirkung mit dem Rezeptor schließen lässt,

• PLL-g-PEG Beschichtung die Adhärenz der Staphylokokken steigert und

Biofilmbildung induziert.

Ergebnisse 42

4.3.2.4 Adhärenz der klinischen Isolate mit und ohne Proteinbeschichtung

der Prüfkörper in Schüttelkulturen

In einem weiteren Versuch wurden nun die Prüfkörper im Schüttler bei 37°C inkubiert.

Hierbei sind sie ständig in Bewegung und somit wird das Adhärenzverhalten erheblich

beeinflusst. Eine Rezeptorblockung wurde hierbei nicht durchgeführt und es wurden

keine PLL-g-PEG beschichteten Prüfkörper verwendet. Das Ergebnis ist in Tabelle 12

dargestellt.

Tabelle 12: Adhärenzverhalten der getesteten klinischen Isolate auf Titan-Prüfkörpern

im Schüttler.

ohne Protein Albumin Kollagen I Kollagen II Fibrinogen Fibronektin

S. aureus 907 2 1 2+ 2+ 4+ 4+ S. aureus 911 2 1 3+ 3+ 4+ 4+ S. aureus 913 1 1 2+ 2+ 5+ 4 S. epidermidis 910 1 1 1 1 3+ 2+ S. epidermidis 814 s.c. 2 1 2+ 3+ 2+ 3+ S. epidermidis 814 Rev. 1 1 2+ 3+ 2+ 3+



Im Schüttler ist die Adhärenz aller Stämme deutlich erniedrigt. Biofilmbildung ist nach

wie vor bei den kollagenbeschichteten Prüfkörpern nachweisbar. Ebenfalls zeigt sich

nun bei Fibronektin- und Fibrinogen-Beschichtung Biofilmbildung. Bei diesen beiden

Ergebnisse 43

Beschichtungen ist, auch wie bei den Versuchen mit einer stehenden Suspension, die

Adhärenz am größten.

4.4 Biofilmtest

4.4.1 Testung mit unbeschichteten Zellkulturplatten aus Polystyren

Um zu prüfen, ob die Staphylokokken Biofilm bilden, wurden in einem

Standardverfahren Zellkulturplatten aus Polystyren mit den in TSB-Medium

befindlichen Bakterien beimpft. Der Test dient dazu festzustellen, ob makroskopisch

sichtbarer Biofilm gebildet wird. Die Ergebnisse der Biofilmtests bei den klinischen

Isolaten sind in Tabelle 13 dargestellt. Der Versuch wurde dreimal mit dem gleichen

Ergebnis durchgeführt. Als Referenzstamm dient der stark biofilmbildende S.

epidermidis RP62A.

Tabelle 13: Biofilmtest der klinischen Stämme.

1. Versuch 2.Versuch 3.Versuch

814 Rev.

S. epidermidis

negativ negativ negativ

814 s.c.

S. epidermidis


907

S. aureus


910

S. epidermidis


911

S. aureus


913

S. aureus


RP62A

S. epidermidis

stark positiv stark positiv stark positiv

Ergebnisse 44

Sämtliche klinischen Isolate zeigen in den Testungen keine makroskopische

Biofilmbildung auf Polystyren. Der Referenzstamm S. epidermidis RP62A weist starke

Biofilmbildung auf.

Dies zeigt, dass sämtliche klinischen Stämme auf Zellkulturplatten aus Polystyren

keinen Biofilm ausbilden.

4.4.2 Testung mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten

Alle klinischen Isolate zeigen unter dem REM starke Biofilmbildung auf Kollagen

Typ I-beschichteten Prüfkörpern. Nun soll getestet werden, ob sich diese auch auf

Kollagen Typ I-beschichteten Gewebekulturplatten nachweisen lässt. Als

Referenzstamm wird der S. epidermidis RP62A ohne beschichtete Oberfläche

verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt. Keiner der klinischen Stämme

zeigt hierbei Biofilmbildung. Der Referenzstamm RP62A weist starke Biofilmbildung

auf.

4.4.3 Testung mit Kollagenbeschichtung der Zellkulturplatten nach

Blockierung der Kollagenrezeptoren

Hierbei werden die Bakterien vor Pipettieren in die Gewebekulturplatten, wie schon bei

dem Versuch mit den Metallprüfkörpern, 1 Stunde bei 37°C im Schüttler mit

Kollagenlösung inkubiert. Hierdurch werden die Kollagenrezeptoren der

Staphylokokken besetzt und eine Bindung an die Kollagenbeschichtung der

Gewebekulturplatten verhindert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt. Als

Referenzstamm wird der S. epidermidis RP62A ohne beschichtete Oberfläche und ohne

vorherige Kollagenbindung verwendet. Die kollagengebundenen Bakterien der

klinischen Isolate zeigen makroskopisch keine Biofilmbildung. Der Referenzstamm

RP62A weist starke Biofilmbildung auf.

Ergebnisse 45

Tabelle 14: Biofilmtest der klinischen Stämme unter vorheriger Kollagenbeschichtung

der 96-well-Platten mit und ohne vorheriger Kollagenrezeptorblockierung. Als

Referenzstamm dient der stark biofilmbildende S. epidermidis RP62A.

ohne Beschichtung Kollagen I Kollagen I + RB

S. aureus 907 negativ negativ negativ S. aureus 911 negativ negativ negativ S. aureus 913 negativ negativ negativ S. epidermidis 910 negativ negativ negativ S. epidermidis 814 s.c. n.d. n.d. n.d. S. epidermidis 814 Rev. negativ negativ negativ S. epidermidis RP 62A stark positiv n.d. n.d.

Diskussion 46

5. Diskussion

5.1 Einführung der semiquantitativen Wertungsskala

Das angewandte Modell besitzt große Variationsmöglichkeiten. Es lässt die

Untersuchung verschiedener klinisch relevanter Zustände zu. Einzelne mutmaßlich

relevante Faktoren, wie zum Beispiel der Scherungsstress, können einzeln oder auch in

wählbarer Kombination mit anderen Faktoren untersucht werden. Interaktionen sind

damit darstellbar. So kann z.B. jedes beliebige Material getestet werden. Dies erweist

sich als wesentlicher Vorteil gegenüber dem konfokalen Lasermikroskop, bei dem

Metalle, wie das als Fremdmaterial häufig verwendete Titan, nicht untersucht werden

können, da sie eine zu hohe Eigenfluoreszenz haben und somit die Darstellung der

Bakterienzellen unmöglich machen. Weiter kann die Beschichtung des Prüfkörpers mit

Proteinen beliebig variiert werden. Der Einfluss des jeweiligen Proteins auf die

Adhärenz wird deutlich. Eine Beschichtung, welche das Adhärenzverhalten von

Staphylokokken herabsetzt, könnte eventuell zur Infektionsprophylaxe genutzt werden.

Albumin könnte, nicht nur unseren Ergebnissen nach, hierfür in Frage kommen. Auch

andere Autoren zeigten bereits, dass Staphylokokken bei albuminbeschichtetem

Material eine deutlich niedrigere Adhärenz aufweisen (Merrit et al., 1997; Doughery,

1988). Um die Versuche den in vivo vorliegenden Verhältnissen näher zu bringen,

findet die Bebrütung der Metallprüfkörper in einem Schüttelinkubator statt. Hierbei

werden die Scherkräfte, welche im menschlichen Körper vorliegen, simuliert und die

Ergebnisse können mit denen ohne Scherungsstress verglichen werden.

Ein weiterer großer Vorteil dieses Modells ist die semiquantitative Auswertung unter

dem REM. Es ist möglich die Biofilmbildung direkt darzustellen. Der Einfluss

therapeutischer Bemühungen auf die Biofilmbildung kann beurteilt werden. Es wurden

in der Vergangenheit bereits verschiedene Methoden zur Bestimmung der Adhärenz von

Bakterien auf Fremdmaterial entwickelt. Diese sind jedoch aufwendig, teuer oder

unzuverlässig. So wurden radioaktiv markierte Stämme eingesetzt, was einen hohen

Aufwand bedeutet (Merritt et al. 1997). In dem in dieser Arbeit verwendetem Modell ist

Diskussion 47

es möglich, jeden klinisch isolierten Stamm zu testen, ohne ihn zuvor aufbereiten zu

müssen.

Eine sehr ungenaue und somit nicht verlässliche Methode stellt das Zählen von

Kolonien nach Ablösen von den Prüfkörpern dar (CFU).

Dieses Modell wurde bereits 1977 von Maki angewendet und findet auch heute noch

Anwendung (Ghiselli, 2004; Luyer, 2004). Hierbei kann sowohl ein Aggregat von 1000

Bakterien als auch eine einzelne Zelle das Wachstum einer Kolonie bewirken. Die

Biofilmbildung ist durch dieses Modell nicht zu beurteilen. Im Vergleich dazu kann bei

Auswertung unter dem Rasterelektronenmikroskop jede einzelne Bakterienzelle sowohl

mit als auch ohne Biofilm beurteilt werden.

Eine andere Möglichkeit bietet das Färben mit Kristallviolett und anschließendem

Auswerten mittels Photometer (Merritt et al. 1997). Dies ist bei Metall-Prüfkörpern

nicht durchführbar. Bei Abwägung der Vor- und Nachteile der jeweiligen Methoden

stellt sich das in der Arbeit verwendete Modell für die Beurteilung von Metallprüf-

körpern als das vorteilhafteste dar.

Tabelle 15: Stärken und Schwächen des verwendeten Modells.

+ - beliebiges Material hoher zeitlicher Aufwand Variation der Beschichtung hoher technischer Aufwand semiquantitative Auswertung unter dem REM direkte Darstellung der Biofilmbildung

5.2 Adhärenzverhalten der einzelnen Stämme

Betrachtet man die Adhärenz der klinischen Isolate gegenüber den negativen

Kontrollstämmen S. carnosus TM300 und S. aureus RN4220, so lässt sich feststellen,

dass sämtliche Klinikstämme die Fähigkeit besitzen, sowohl auf Titan als auch auf

Kobalt-Chrom-Legierung stark zu adherieren. In dem verwendetem Modell ist jede

einzelne Bakterienzelle sichtbar und die Adhärenzstärke kann semiquantitativ bestimmt

werden. Die Versuche sind exakt reproduzierbar. Ein wesentlicher Unterschied

Diskussion 48

zwischen den beiden verwendeten Metallen kann nicht festgestellt werden. Unter

gleichen Bedingungen zeigen die Bakterien nahezu identische Adhärenzstärken auf den

beiden untersuchten Legierungen. Die These von Verheyen et al., 1993, dass S. aureus

besser metalladhärent ist als S. epidermidis, kann nicht bestätigt werden.

Wie das Adhärenzverhalten zu beeinflussen ist, zeigen die Versuche mit beschichteten

Prüfkörpern. Es existiert eine Vielzahl von Proteinen in der Gewebeflüssigkeit und im

Serum, welche im ständigen Kontakt mit dem Implantat stehen. Hieraus sind fünf

Vertreter (Albumin, Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Fibronektin und Fibrinogen)

ausgewählt worden, mit denen die Beschichtung durchgeführt worden ist. Es zeigen

sich eindeutige Tendenzen, welche Stoffe die Adhärenz verstärken bzw. abschwächen.

5.2.1 Fibrinogen und Fibronektin

Sowohl Fibrinogen als auch Fibronektin steigern bei allen klinisch isolierten Stämmen

in den durchgeführten Versuchen die Adhärenz erheblich. 1988 wurde bereits

beschrieben, dass Fibronektin die Adhärenz von S. epidermidis und S. aureus auf

Kunststoff erhöht (Dougherty, 1988). Die Versuche wurden mit der sogenannten

„Colony Forming Unit“ (CFU) Methode durchgeführt. Hierbei wird mit Bakterien

kontaminiertes Material, wie zum Beispiel ein Venenkatheder, auf einer Agarplatte

ausgerollt. Nach Inkubation in einem Brutschrank kann nach einer bestimmten Zeit die

Anzahl der gebildeten Bakterienkolonien abgelesen werden (Maki et al. 1977).

Auch Herrmann zeigte 1988, dass sowohl Fibrinogen als auch Fibronektin die Adhärenz

von Staphylokokken auf dem Kunststoff Polymethylmethacrylat (PMMA) signifikant

erhöhen (Herrmann et al. 1988).

1993 beschrieb Vaudaux, dass Fibronektin Staphylokokken stärker aktiviert, an

Kunststoffoberflächen zu adhärieren als Fibrinogen. Durch immunologische

Nachweisverfahren mit Fibronektin- und Fibrinogenantikörpern bewies er, dass eine

geringere Konzentration an Fibronektin gegenüber Fibrinogen eine stärkere Adhärenz

der Staphylokokken bewirkt (Vaudaux et al. 1993).

Diskussion 49

Das Adhärenzverhalten von S. epidermidis unter Fibrinogenbeschichtung wurde 1996

auch auf Mikrotiterplatten untersucht. Die Messung erfolgte photometrisch, nachdem

die Bakterienschicht auf den Microtiterplatten mit Kristallviolett gefärbt wurde. Auch

hier zeigte sich eine Zunahme der Adhärenz auf dem Kunststoff (Merrit et al., 1997).

Somit sind die Ergebnisse in den durchgeführten Versuchen auf den beiden Metallen

Titan oder Kobalt-Chrom-Legierung gegenüber denen auf Kunststoffoberflächen

vergleichbar. Beide Serumproteine, sowohl Fibrinogen als auch Fibronektin erhöhen die

Adhärenz der Staphylokokken. Ein deutlicher Unterschied zwischen den beiden, wie

von Vaudaux 1993 beschrieben, konnte jedoch nicht festgestellt werden.

Sowohl für Fibrinogen als auch für Fibronektin existieren bindende Oberflächen-

proteine. Die meisten S. aureus Stämme bilden zwei verwandte fibronektinbindende

Proteine, FnBPA und FnBPB. Das für Fibrinogenbindung verantwortliche

Oberflächenprotein ist der Clumping-Faktor. Hier gibt es zwei Subtypen, ClfA und

ClfB (Foster and Höök, 1998). Diese zellwandgebundenen Proteine besitzen eine

typische Domänenstruktur, welche in Abbildung 18 dargestellt ist.

Abbildung 18: Aufbau Zellwand-assoziierter Proteine von S. aureus. S: N-terminale

Signalsequenz; L: Liganden-bindende Domänen; Z: Zellwand-spannende Domäne, M:

Membrananker; LPXTG-Aminosäure-Motiv als Target für das Sortase-Enzym (Ziebuhr

2004).

Diese Adhäsine stellen eine mögliche Erklärung für das verstärkte Adhärenzverhalten

dar.

Diskussion 50

5.2.2 Albumin

Für die S. epidermidis Stämme 910, 814 Rev. und Scv. stellt Albumin kein Hindernis

dar, die Metalloberfläche zu besiedeln. 910 adheriert hier teilweise sogar besser.

Für die S.aureus Stämme 907, 911 und 913 dagegen vermindert die

Albuminbeschichtung die Adhärenz. 1988 stellte Dougherty bereits fest, dass sowohl S.

epidermidis- als auch S. aureus-Stämme auf albuminbeschichteten hydrophoben

hochmolekularen Polymeren verminderte Adhärenz zeigen (CFU-Methode). Er

beschreibt weiter, dass Albumin für die Gewebeintegration des Fremdmaterials

verantwortlich ist (Dougherty, 1988). Auch Herrmann berichtet, dass eine

Albuminbeschichtung des Kunststoffes PMMA eine Verminderung der Adhärenz

bewirkt (Herrmann et al. 1988). Merrit et al. verwendeten 1996 bei ihren oben

beschriebenen Versuchen auch Albumin als Beschichtung für die Microtiterplatten. S.

epidermidis zeigte hier eine verminderte Adhärenz (Merrit et al., 1997). In unseren

Versuchen konnten die Ergebnisse von 1988 und 1996 für die Metalllegierungen

bestätigt werden. Für Albumin sind bisher keine bindenden Oberflächenproteine

bekannt. Das Fehlen solcher Proteine kann die Ergebnisse erklären, dass die Bakterien

auf Albumin nicht adherieren können. Die durch Albumin verursachte verminderte

Adhärenz der Staphylokokken lässt auch auf eine therapeutische Verwendung hoffen (s.

5.1).

5.2.3 Der Einfluss von Kollagen TypI und TypII auf Adhärenz und

Biofilmbildung

Bei Kollagen Typ I-Beschichtung ist die Adhärenz der Stämme in drei Fällen erhöht, in

drei Fällen gleichbleibend gegenüber unbeschichtetem Material. Bei Kollagen Typ II-

Beschichtung zeigt sich in 4 Fällen eine Adhärenzzunahme.

Bei seinen Versuchen 1988 stellte Dougherty bereits fest, dass eine Kollagen-

beschichtung auf Kunststoff die Adhärenz der Keime erhöht. Dies konnte hier auf

Diskussion 51

Metall ebenfalls nachgewiesen werden. Für die Anheftung an Knorpeloberflächen ist

das kollagenbindende Oberflächenprotein Cna notwendig (Timothy J. Foster und

Magnus Höök, 1998). Dieses Adhäsin erklärt möglicherweise die verstärkte Adhärenz,

die sich zusätzlich zur Biofilmbildung zeigte. Dies konnte für Kollagen Typ I in allen

Versuchen, für Typ II in 9 von 12 Fällen gezeigt werden. Die Bildung von Biofilm,

welche durch Kollagen induziert wird, ist zuvor noch nicht beschrieben worden. Dies

zeigt, dass die hier angewandte Methode Vorteile gegenüber anderen Modellen bietet.

Es ist möglich, sowohl die Adhärenzstärke zu quantifizieren als auch die

Begleitumstände der Adhärenz einzusehen. Welcher Mechanismus bei Kollagen I -

Beschichtung für die Biofilmbildung verantwortlich ist, bedarf weiterer

Untersuchungen. Insbesondere die direkte Darstellung der Biofilmbildung im REM

ermöglicht weitergehende Erkenntnisse.

5.2.4 Beeinflussung im Schüttler

Durch Bewegung der Bakteriensuspension wird die Adhärenz deutlich herabgesetzt.

Dies zeigt der Kontrollversuch im Schüttler. Während der 24 h - Besiedlung sind die

Prüfkörper mit der Bakteriensuspension kontinuierlich mit 220 rpm in Bewegung und

somit Scherkräften ausgeliefert. Durch diesen Versuch soll der Einfluss von Bewegung

auf die Adhärenz von Staphylokokken untersucht werden. Das Ausmaß der Bewegung

nach Implantation von Fremdkörpern in den menschlichen Körper ist unbekannt. Eine

vollständige Bewegungslosigkeit kann nicht angenommen werden. In Tabelle 13 sind

die Ergebnisse dargestellt. Das Adhärenzverhalten ist jeweils um etwa eine Stufe

herabgesetzt. Ob hierbei noch zusätzlich eine Schwächung der Besiedlung durch

Albumin auftritt, kann nicht geklärt werden, da auf den Prüfkörpern ohne Beschichtung

schon fast keine Bakterien adhärieren. Bei Kollagenbeschichtung finden sich

Biofilmbildung und eine Steigerung der Adhärenz. Fibrinogen und Fibronektin

bewirken eine starke Besiedlung. Es ist den Staphylokokken möglich, trotz Scherkräften

an dem Metall zu adherieren. Versuche unter Bewegung stellen realitätsgetreuere

Bedingungen für das Adhärenzverhalten von Staphylokokken dar. Scherkräfte, welche

Diskussion 52

Einfluss auf die Adhärenz nehmen, kommen auch im menschlichen Körper vor

(Mohamed et al., 1998).

Im Knochen liegt durch osteozytische Prozesse in den Caniculi ein Scherungsstress von

0-30 dyn/cm2 vor (Weinbaum et al., 1994). Aus diesen Gründen haben die Versuche

unter Scherungsstress eine hohe Bedeutung für die klinische Relevanz. Sie stellen eine

Variation der Bedingungen dar und ermöglichen eine Annäherung der

Versuchsbedingungen an die Verhältnisse im Körper.

5.2.5 Blockierung der Staphylokokkenproteinrezeptoren

Um die These, dass Proteinrezeptoren für die verstärkte Adhärenz verantwortlich sind,

zu stützen, sind Adhärenzversuche nach vorheriger Proteinbindung der Bakterien

durchgeführt worden. Die für Kollagenbindung verantwortlichen Adhäsine der

Staphylokokken wurden durch die Proteininkubation besetzt. Die Ergebnisse zeigen,

dass nach Rezeptorbindung auf kollagenbeschichteten Prüfkörpern (sowohl Typ I - als

auch Typ II - Kollagen) keine Biofilmbildung auftritt. Dies bestätigt die Annahme, dass

diese Rezeptoren an der Bildung von Biofilm beteiligt sind. Das abgeschwächte

Adhärenzverhalten lässt sich durch die Bindung von Kollagen an diesem Protein

erklären, bevor die Bakterien mit dem beschichteten Prüfkörper in Kontakt treten. Bei

immunsupprimierten Mäusen konnte durch Gabe von Kaninchen-Antikörpern, welche

an den Kollagenrezeptoren von Staphylokken binden, die Häufigkeit einer durch diese

Keime ausgelösten Peritonitis oder Sepsis verringert werden (Rozalska et al. 1994). Das

Prinzip, den Kollagenrezeptor zu blocken, bevor die Bakterien an einer Oberfläche

adhärieren und Kolonien bilden können, ist das gleiche. Die Ergebnisse sind mit denen

des Rezeptorblockversuches gut vereinbar. Im Gegensatz dazu kann bei den übrigen

Beschichtungen (Albumin, Fibrinogen und Fibronektin) nach vorheriger Inkubation der

Keime mit den Proteinen eine Biofilmbildung gezeigt werden. Der Mechanismus

hierfür ist unklar. Die Adhärenz der Stämme nach Rezeptorblockierung und

Biofilmbildung zeigt sich erhöht.

Diskussion 53

5.2.6 PLL-g-PEG-Beschichtung

PLL-g-PEG-Beschichtung vermindert die Anheftung von Stoffen aus dem Serum und

der Gewebsflüssigkeit ( Kenausis et al., 2000). Wie sich die Beschichtung auf

Infektionen auswirkt, ist noch nicht bekannt. Die Ergebnisse der Versuche zeigen bei

allen Keimen eine sehr starke Besiedlung der Prüfkörper und eine Biofilmbildung. Dies

lässt darauf schließen, dass Staphylokokken durch diese beschichtete Oberfläche nicht

an der Adhärenz gehindert werden. Im Gegenteil, es wird eine deutlich erhöhte

Adhärenz und eine starke Biofilmbildung beobachtet, was den Einsatz dieser

Beschichtung aus infektiologischer Sicht fraglich erscheinen lässt.

5.3 Zukünftige Aufgabenstellung

Bei Beschichtung von zu implantierenden Fremdmaterialien mit Kollagen, welches im

menschlichen Körper an den Implantationsstellen vorliegt, findet immer Biofilmbildung

statt. Diese extrazelluläre Substanz schützt die Keime vor der körpereigenen Abwehr

und der angewandten Antibiotika-Therapie (Dougherty 1988, Giridhar et al., 1994).

Betrachtet man diesen Biofilm als Hauptfaktor für die Therapieresistenz von

Protheseninfektionen, so muss man ihn zum Angriffspunkt einer Therapie machen.

Hierfür sind neue Ansätze gefragt, die zunächst in vitro durchgeführt werden, um später

in der Klinik zum Einsatz zu kommen.

Mit Hilfe der semiquantitativen Bewertung des Adhärenzverhaltens am REM können

nun verschiedene Methoden, welche die Biofilmbildung und die damit verbundene

Adhärenz und Resistenz vor Antibiotika beeinflussen, angewandt und beurteilt werden.

Einen Ansatz hierzu bietet die Stromapplikation der Prüfkörper. 1mA

Oberflächenstrom, der an einen metallischen Fremdkörper angelegt wird, zerstört eine

große Anzahl von Bakterien, die sich im Biofilm schützen (Wellman et al., 1996). Für

die Klinik würde dies bedeuten, dass die Endoprothesen mit einem minimalen

Oberflächenstrom versetzt werden müssten, um die im Biofilm organisierten Bakterien

Diskussion 54

abzutöten. Eine Versuchreihe, die stromversetzte und unbehandelte Prüfkörper

vergleicht, ist anzustreben. In Zukunft wäre dann eine Stromapplikation an den Gelenk-

Endoprothesen als Maßnahme sowohl zur Infektionsprophylaxe als auch als Therapie

manifester Infektionen abzuwägen.

Um Biofilm zu bilden, kommunizieren Bakterien untereinander mittels kleiner

Signalmoleküle. Häufig handelt es sich bei diesen um halogenierte Furanone. Es ist

schon gelungen ein Analogon, nämlich (5Z)-4-Bromo-5-(Brommethylen)-3-Butyl-

2(5H)-Furanon, aus der Alge Delisea pulchra zu extrahieren, welches die Bildung von

Biofilm stoppt. Diese Ergebnisse stammen aus Versuchen mit Escherichia coli (Ren et

al., 2001), Bacillus subtilis (Ren et al., 2002) und Pseudomonas aeroginosa (Hentzer et

al., 2002). Der Einsatz dieser Furanone kann neue Biofilmbildung stoppen und den

bereits vorhandenen Biofilm zerstören (Ren et al., 2002). Da hierbei große Mengen von

Bakterien in das Blut gelangen, wäre eine solche Therapie nur unter

Hochdosisantibiotikatherapie durchführbar. Auch mit S. epidermidis wurden Versuche

mit Furanonen durchgeführt. Hierbei überzog man Platten und Venenkatheder aus

Polystyren mit einem Furanon. Dies gelang durch eine kovalente Bindung zwischen

Polystyren und 3-(1-Bromhexyl)-5-Dibrommethylen-2(5H)-Furanon. In vitro wurde

bei den Platten in 89%, bei den Venenkathedern in 78% der Fälle eine Biofilmbildung

verhindert. Bei in vivo Versuchen an Schafen, denen beschichtete und unbeschichtete

Venenkatheder subkutan implantiert wurden, zeigten die mit Furanon beschichteten

Katheder weniger Bakterienwachstum. Bis zu 65 Tage lang konnte eine Infektion

verhindert werden (Hume et al., 2004). Ob diese Ergebnisse auch auf Metallimplantaten

zu erreichen sind, ist in einer neuen Versuchsreihe zu testen.

Um die Oberfläche von Endoprothesen vor der Besiedlung mit Keimen zu schützen,

wäre eine Beschichtung wünschenswert, die Biofilmbildung und Adhärenz verhindert.

Einer neuesten Veröffentlichung von Singh et al. nach käme hierfür Lactoferrin in

Frage. Es verhindert, dass Bakterien sessile Zellhaufen und Biofilm auf Oberflächen

bilden und zwingt sie somit, in freier Form zu bleiben. So sind die Bakterien für das

Immunsystem und eine Antibiotikatherapie zugänglich (Singh et al., 2002). Eine

Versuchsreihe, welche lactoferrinbeschichtete Prüfkörper mit unbehandelten vergleicht,

würde hierfür weitere Auskunft geben.

Diskussion 55

Ein möglicher Ansatz zur Prophylaxe ist der Einsatz eines Impfstoffes mit dem Ziel der

Antikörperbildung gegen Oberflächenproteine wie Cna, ClA, ClB, FnBPA und FnBPB.

Dieser könnte Patienten vor der Operation verabreicht werden.

In Tierexperimenten sind Impfstoffe gegen Staphylococcus aureus mit dem

Angriffspunkt Oberflächenadhäsine bereits getestet worden. Die Anzahl der an Sepsis

verstorbenen Mäuse, welche durch S. aureus infiziert sind, wurde durch Impfung

rekombinanter Fragmente des Kollagen-Adhäsins reduziert (Nilsson et al., 1998). Auch

gegen das fibronektinbindende Adhäsin wurde ein Impfstoff entwickelt, der bei

infizierten Mäusen das Auftreten einer nekrotisierenden Mastitis verhinderte (Mamo et

al., 1994). Bei Kaninchen hatte man ebenfalls Impfstoffe gegen Kollagen- und

Fibronektinadhäsine getestet. Zuvor geimpfte Tiere überlebten eine intraperitoneale

Staphylococcus aureus - Infektion (Rozalska and Wadström, 1994).

Um Infektionen von Gelenkendoprothesen verhindern zu können, sind die Impfstoffe

noch nicht erprobt worden. Ob Impfung eine geeignete Option in der Therapie darstellt,

ist fraglich. Eine neuere Studie ergab, dass bei der Hälfte der Patienten mit Infektion

eines Gelenks, Knochens oder einer Herzklappe die isolierten Stämme kein Cna-

Oberflächenprotein exprimierten. Dies zeigt, dass Cna nicht zwingend vorhanden sein

muss, um eine solche Infektion auszulösen (Ryding et al., 1997). Somit ist die

Gesamtheit der Staphylokokken-Stämme nicht abgedeckt und eine Infektion trotz

Impfung könnte nicht ausgeschlossen werden. Außerdem ist zu beachten, dass die

Einheit aus Gelenk und Prothese nicht im Blutstrom liegt. Die immunologische Abwehr

erreicht die großen, im Knochen verankerten Fremdkörper nur sehr eingeschränkt.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Kollagen einer von vielen Faktoren ist, der an

der Biofilmbildung von Staphylokokken beteiligt ist. Da die Pathogenitätsmechanismen

von Staphylokokken noch nicht vollständig verstanden sind, und es nur sehr begrenzt

Therapiemöglichkeiten gegen Biofilm gibt, ist weitere Grundlagenforschung essentiell.

Zusammenfassung 56

6. Zusammenfassung

Die Anzahl an implantierten Gelenkendoprothesen hat in den letzten Jahrzehnten stark

zugenommen. Mit ihr auch die Anzahl an Protheseninfektionen. Die Haupterreger sind

Staphylokokken (>80%). Diese sind in vivo unempfindlich gegenüber Antibiotika und

somit ist die einzige sinnvolle Therapie der Ausbau der infizierten Prothese, welcher

lange und kostenspielige Krankenhausaufenthalte für den Patienten mit sich bringt. Der

Grund für diese Resistenz der Bakterien liegt darin, dass sie zur Biofilmbildung fähig

sind und sehr gut an Fremdkörper-Oberflächen adhärieren können. Welche Methode

nun geeignet ist, die Adhärenz von Staphylokokken am besten unter klinisch relevanten

Bedingungen zu untersuchen, ist zu prüfen.

Das in der Arbeit entwickelte Modell ermöglicht eine semiquantitative Bestimmung der

Adhärenz. Für die Versuche wurden Metallprüfkörper aus Titan und Kobalt-Chrom-

Legierung verwendet. Zuvor wurden diese Metalle mit bestimmen Reinigungs- und

Sterilisationsvorgängen gesäubert. Ein Teil der verwendeten Prüfkörper ist vor

Beimpfung mit den Keimen durch Serumproteine bzw. Gewebsflüssigkeiten beschichtet

worden, um das Anheftungsverhalten unter verschiedenen Bedingungen beurteilen zu

können. Hierfür wurden Albumin, Kollagen Typ I und Typ II, Fibronektin und

Fibrinogen verwendet. Sieben Titan-Prüfkörper sind in Schlieren (Schweiz) durch ein

spezielles Verfahren mit PLL-g-PEG, einem Makromolekül welches die Adhäsion von

Proteinen herabsetzt, beschichtet worden. Eine Auswirkung durch Infektionen sollte

hierbei überprüft werden. Die Auswertung wurde unter REM-Betrachtung durchgeführt.

Hierbei ist eine semiquantitative Abstufung der Adhärenzkraft von 1-5 getroffen

worden.

In den Ergebnissen zeigten die beiden verwendeten Metalle Titan und Kobalt-Chrom-

Legierung keine wesentlichen Unterschiede in der gezeigten Adhärenz von

Staphylokokken. Durch die Serumprotein- und Gewebsflüssigkeitsbeschichtung ließen

sich Unterschiede unter verschiedenen Bedingungen feststellen. Fibronektin und

Fibrinogen bewirken eine starke Zunahme an adhärenten Bakterienzellen. Kollagen Typ

I und II zeigen eine leichte Adhärenzverstärkung und bewirken Biofilmbildung.

Zusammenfassung 57

Albuminbeschichtung reduziert die Anzahl adhärenter Staphylokokken. Die PLL-g-

PEG Beschichtung löst starke Adhärenz und Biofilmbildung aus.

Die hier angewandte Methode, kontaminierte Metallprüfkörper unter dem

Rasterelektronenmikroskop zu betrachten, eignet sich um das Adhärenzverhalten von

Bakterien zu beurteilen. Dabei lassen sich die Versuchsbedingungen auf vielfache

Weise verändern. Verschiedene Metalle und andere Materialien können miteinander

verglichen werden. Des Weiteren ist es möglich, unterschiedliche

Proteinbeschichtungen vorzunehmen, um deren Einfluss auf die Adhärenz zu zeigen.

Zusätzlich ist eine Durchführung der Versuche unter Bewegung möglich, was eine

Annäherung an die Verhältnisse im menschlichen Körper bedeutet. Neben

Staphylokokken könnten auch andere Bakterienspezies untersucht werden.

In dieser Studie wird erstmals gezeigt, dass Kollagen eine Biofilmbildung bei

Staphylokokken induziert. Dies bedarf weiterer Untersuchung, welcher Mechanismus

hierfür verantwortlich ist.

Die PLL-g-PEG Beschichtung hat auf Infektionen keine erfolgsversprechende Wirkung.

Im Gegenteil, es kommt zu einer starken Besiedlung des Fremdmaterials.

Albumin dagegen zeichnet sich durch eine Herabsetzung der Adhärenzstärke aus.

Daraus könnte man therapeutischen Nutzen ziehen und Implantate vor Einbau mit

Albumin beschichten.

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Abkürzungsverzeichnis 66

8. Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Erklärung

°C Grad Celsius

Abb. Abbildung

al. aliud

bzw. beziehungsweise

CAPD Kontinuierliche ambulante

Peritonealdialyse

CFU colony forming unit

cm2 Quadratzentimeter

dest. destilata

dyn Einheitssymbol der Kraft im CGS-System;

105 dyn = 1 N = 1 kg m s-2

epid. Epidermidis

g Gramm

h Stunde

KNS Koagulase negative Staphylokokken

l Liter

M molar

m Masse

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

MRSA Methicilin resistenter Staphylococcus

aureus

nm Nannometer

OD Optische Dichte

PBS Phosphat buffer sialine

PIA Polysaccharid Intercellular Adhesin

PLL-g-PEG Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol)

Abkürzungsverzeichnis 67

REM Rasterelektronenmikroskop

Rev Revertante

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

S. Staphylococcus

s. siehe

s.c. small colony

SDS Sodiumdodecylsulfat

TSB Trypticase-Soy-Broth

ÜN Übernacht

ÜNK Übernachtkultur

UV ultraviolett

vgl. vergleiche

XPS X-Ray photoelectron spectroscopy

Danksagung

An erster Stelle danke ich Herrn Professor Dr. Jochen Eulert für die Vergabe des

Themas und Herrn Professor Dr. Jörg Hacker für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes

am Institut für molekulare Infektionsbiologie.

Bei Frau Dr. Wilma Ziebuhr und Dr. Stephan Kirschner bedanke ich mich ganz

besonders für die gemeinsame Betreuung der Arbeit. Die Kooperation zwischen der

Orthopädischen Universitätsklinik und dem Institut für Infektionsforschung hat Dank

Ihnen bestens funktioniert. Ihr stetiges Interesse, Ihre Geduld und Ihr Optimismus

haben wesentlich zum Gelingen der Arbeit beigetragen.

Das wissenschaftliche Arbeiten im Labor wäre für mich sehr schwierig gewesen, wenn

da nicht eine Menge netter und hilfsbereiter Mitarbeiter gewesen werden. Auf meine

vielen Fragen bekam ich immer freundliche und kompetente Antworten. Vielen Dank

an Svetlana Kozitskaya, Katja Dietrich und Simone Geyer um nur wenige der vielen

Namen zu nennen.

Claudia Gehring und dem ganzen Team am Rasterelektronenmikroskop danke ich für

die Geduld und kompetente Hilfe.

Bei Hilde Merkert, die mir besonders bei meinen ersten Versuchen am

Rasterelektronenmikroskop tatkräftig zur Seite stand möchte ich mich vielmals

bedanken.

Zum Schluss bedanke ich mich ganz herzlich bei meinen Eltern, die mir dieses Studium

ermöglichten und sich stets dafür interessierten. Für meine Probleme hatten sie immer

Lösungen und standen mir mit Rat und Tat zur Seite.

Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Andreas Freytag

Geburtstag: 03.03.1978

Geburtsort: Würzburg

Familienstand: ledig

Religion: römisch-katholisch

Name und Beruf des Vaters: Friedrich Freytag, Gymnasiallehrer

Name und Beruf der Mutter: Christa Freytag, Grundschullehrerin

Ausbildung:

Schulischer Werdegang: 1984-88 Grundschule Versbach

1988-97 Friedrich-Koenig-Gymnasium Würzburg

27.06.97 Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife

Universitärer Werdegang: Sommersemester 1998 Beginn des Studiums der Medizin

in Würzburg

05.04.2000 Ärztliche Vorprüfung

22.03.2001 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

03.09.2003 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

19.11.2004 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Beruflicher Werdegang: ab 01.01.2005 Assistenzarzt in der Chirurgischen Klinik I

Diakonie-Krankenhaus Schwäbisch Hall

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