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Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

Nicht-invasive pränatale RHD-Bestimmung

RHD-Genotypisierung zellfreier fetaler DNA

32. Informationsgespräch der Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland


GliederungNicht-invasive fetale RHD-Genotypisierung

Hintergrund Prävention der Anti-D Bildung in der Schwangerschaft,Management von Antikörperträgerinnen in der

Schwangerschaft

Standard-Prozedere und fetale Genotypisierung im Vergleich

Grundlagen der nicht-invasiven fetalen Gen-Diagnostik

Zuverlässigkeit der Methode: Sensitivität und Spezifität

1

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Bei RhD-negativen Schwangeren:Prävention der Anti-D-Immunisierung

Kein Immunisierungsrisiko bei RHD-negativen Feten

Nutzen fetaler RHD-BestimmungWann interessiert der kindliche RhD-Faktor?

Bei Antikörperträgerinnen:Nachweis des fetalen RHD-Genotyps

HDFN-Risiko nur bei RHD-positiven Feten

1


Prävention der Anti-D-ImmunisierungStandards bei Schwangerschaften RhD-negativer Frauen1

- 28. SSW: Anti-D Immunglobulin

- Bei RhD-positiven Neugeborenen: Anti-D Immunglobulin < 72 h p. partum

1

1 KAV-Richtlinien


Anti-D-immunisierte SchwangereVoraussage für die Entwicklung einer HDFN

nicht invasive Diagnostik (Mutter):

Anti-D-TiterbestimmungUltraschallfetales RHD-Screening (RHD-NIPD)

Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?)

Amniozentese RhD undChoriozentese RHD-ZygotiebestimmungCordozentese (PCR)

1


Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung

1

Prof. J. DeutingerUniversitätsklinik für FrauenheilkundeMedizinische Universität Wien


Pränatale Ultraschall – Diagnostik Nachweis von Ödembildung

Prof. J. DeutingerUniversitätsklinik für FrauenheilkundeMedizinische Universität Wien

1


Hydrops fetalis, 11. – 14. SSWHydrops fetalis, 11. – 14. SSW

1

A. cerebri media flow (MCA-PSV)

Flow velocity waveform in the fetal middle cerebral artery in a severely anemic fetus at 22 weeks (left) and in a normal fetus (right). In fetal anemia, blood velocity is increased

Doppler Ultraschalldiagnostik

Bei einer schweren fetalen Anämie (Hb <6g/dl) ist die Flussgeschwindigkeit in der A. cerebri media signifikant erhöht.Scheier M, Prediction of severe fetal anemia in red blood cell alloimmunization after previous intrauterine transfusions. Am J Obstet Gynecol. 2006 Dec;195(6):1550-6. Epub 2006 Jun 21

Collins CY, Evaluating suspected fetal anemia with Doppler ultrasound. J Reprod Med. 2005 Jun;50(6):379-82

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Scheier+M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Scheier+M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Collins+CY%22%5BAuthor%5D

Anti-D-immunisierte SchwangereVoraussage für die Entwicklung einer HDFN

Nicht-invasive Diagnostik (Mutter):

Anti-D-TiterbestimmungUltraschallfetales RHD-Screening (RHD-NIPD)

Invasive fetale Diagnostik: Diagnostik beim Kindesvater (?)

Amniozentese RhD und ggf.Choriozentese RHD-ZygotiebestimmungCordozentese (PCR)

1

Prävention der Anti-D-Immunisierung bei Schwangerschaft RhD-negativer Frauen

Nutzen fetaler RHD-Bestimmung(Wann) ist die Genotypisierung sinnvoll?

Bei Antikörperträgerinnen:Nachweis des fetalen RHD-Genotyps

Vermeidung von: passiver

Immunprophylaxe(humanes

Plasmapräparat)

Unabhängigkeit von der Verfügbar-keit von humanem Anti-D

Kosteneffizienz?

Frühzeitige Klarheit

Vermeidung von: invasiver Diagnostik und

assoziierter Risiken

2

Entwicklung der RHD-NIPDInternationale Arbeitsgruppen

2

SAFE NoE - GruppeSpecial Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network of ExcellenceSixth EC Framework Program

Gemeinsame ProtokolleMultizentrische EvaluierungStandardisierung der Prozesse

Grundlage der GenotypisierungRHD- und RHCE-Gen

Daniels G. Human Blood GroupsDaniels G. Human Blood Groups3

RHD negativRHD negativ RHD positiv (heterozygot)RHD positiv (heterozygot) RHD positiv (homozygot)RHD positiv (homozygot)


LO, Y.M.D. et al. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350: 485–487.

FINDINGS: Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal plasma samples, [...] None of the 13 women bearing female fetuses, and none of the ten non-pregnant control women, had positive results for plasma, serum or nucleated blood cells.

INTERPRETATION: Our finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have implications for non-invasive prenatal diagnosis, and for improving our understanding of the fetomaternal relationship.

Fetale Genotypisierung aus maternalem PlasmaLo et al. weisen DNA männlicher Feten in maternalem Plasma nach

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Zellfreie fetale DNAZellfreie fetale DNASynzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNASynzytiothrophoblast als Ursprung der fetalen DNA

Kumpel et al. Transfusion 2008

3


Anteil fetaler DNA an der zellfreien mütterlichen DNA

Die cffDNA-Menge ist abhängigvom Gestationsalter des Feten

Die DNA-Menge liegt zum Zeitpunkt der Untersuchungteilweise nahe dem stochastischen Bereich der rqPCR.

DNA-Qualität: die cffDNA ist stark fragmentiert

3


C. Ellen van der Schoot

Konzentration der cffDNAKonzentrationsunterschiede bei gleichem Gestationsalter

3


Studien zur RHD-NIPDReview

4


4

Studien zur RHD NIPDErgebnisse von Sanquin, NL


Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNABeispiele

Y-chromosomale Marker

Genetische Polymorphismen

Epigenetik

Lo et al. 1998 SYRChin and Lo 2003 SYRRijnders et al. 2004 SYRAvent and Chitty 2006 SYR

Lee et al. 2002 HLA-DQLegler et al. 2002 RHCE, C, E, cVan der Schoot et al. 2003 insertion/deletionBrojer et al. 2005 insertion/deletion

Chan et al. 2006 RAASF1A4


Kontrolle für die Amplifikation fetaler DNASensitivität der Methoden

Zuverlässigkeit der Methode ist abhängig von:

- geeignete Amplifikationskontrollen für fetale DNA

- geeignetes Entscheidungsschema

Das Verfahren muss ausreichend sensitiv sein, jeden RHD-positiven Feten richtig zu typisieren.

Falls zu wenig fetale DNA vorhanden ist, muss das erkannt werden.

4


Amplifikation fetaler DNASpezifität der Methoden

Falsch positive Ergebnisse sind nicht kritisch:

Bei vermeintlich RHD-positiven Feten würde der Schwangeren eine nicht indizierte Anti-D-Prophylaxe verabreicht werden.

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K.C. Allen Chan et al. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal DiagnosisClinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218

BstU I methylation-sensitive restriction enzyme CG’CG, GC’GC

Fetale DNA-MethylierungUniversaler fetaler DNA-Marker für nicht-invasive Diagnostik

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EukaryontenEpigenetik - GenexpressionHypermethylierung führt zur Suppression der

GenExp.

ProkaryontenSchutz vor DNA anderer Organismen Methylierung blockiert Enzym-Schnittstelle

eigener DNA- fremde (Bakteriophagen-) DNA wird zerstört

DNA-Methylierungin vivo-Bedeutung der DNA-Methylierung

4


Enzymatische Verdauung der mütterlichen Plasma-DNA

fetale Methylierung blockiert die Restriktionsschnittstelle

die methylierte fetale Gensequenz bleibt erhalten

die maternale Sequenz wird zerstört

Die Menge der fetalen DNA kann gemessen werden

DNA-Methylierungin vitro-Bedeutung für die fetale Diagnostik

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Amplifikationskontrolle für fetale DNAmethyliertes fetales RAASF1A

Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNAAbb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA


RHD-NIPD SAFE-Protokoll

Abb.3: RHD negativer männlicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus


Abb.5: RHD positiver weiblicher Fetus Abb.4: RHD positiver männlicher Fetus

RHD-NIPD SAFE-Protokoll


Amplifikationskontrolle für fetale DNAmethyliertes fetales RAASF1A

Abb.1: Komplette Verdauung der maternalen DNAAbb.2: Inkomplette Verdauung der maternalen DNA

Entscheidungsbaum bei Verwendung von RASSF1A und ACTB für das Prä-natale RHD-Screening nach Chan et al.Clinical Chemistry 2006;52(12):2211-2218

4


Frühzeitiger Ausschluss RHD-negativer Feten

Vermeidung invasiver Diagnostik

ZusammenfassungNicht-ivasive pränatale RHD-Diagnostik bei Antikörperträgerinnen


ZusammenfassungNIPD: Kriterium zur Indikationsstellung der Anti-D-Prophylaxe

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Hohe Sicherheit gegenüber falsch positiven Ergebnissen

Vermeidung unnötiger Anwendung von humanem Anti-D

Unabhängigkeit von der Verfügbarkeit von Anti-D


Elisabeth Schwartz-Jungl1

Dieter Schwartz1

Claudia Hobel2

Christof Jungbauer2

W. R. Mayr1,2

RHD-NIPD Arbeitsgruppe

Josef Deutinger3

Peter W. Husslein3

1 Universitätsklinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin, Medizinische Universität Wien2 Österreichisches Rotes Kreuz, Blutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland3 Universitätsklinik für Frauenheilkunde, Medizinische Universität Wien


www.blut.at www.roteskreuz.at

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Österreichisches Rotes KreuzBlutspendezentrale für Wien, Niederösterreich und Burgenland

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