Aus dem Institut für Zelluläre und Molekulare Physiologie

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher

Charakterisierung des L-Typ Ca2+-Stroms

im linken Ventrikel des Herzens

von Gα11-defizienten Mäusen

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Vera Schütz

aus

Bamberg

Erlangen 2011

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Tilmann Volk

Korreferent: Prof. Dr. med. Christoph Korbmacher

Tag der mündlichen Prüfung: 06.04.2011

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................ iv

Zusammenfassung ............................................................................................................ 1

Summary........................................................................................................................... 2

1. Einleitung ..................................................................................................................... 3

1.1 Der Erregungszyklus im Säugerherzen .................................................................. 3

1.2 Das ventrikuläre Aktionspotential und die ihm zugrunde liegenden Ionenströme 4

1.2.1 Die Ionentheorie der Erregung.......................................................................... 4

1.2.2 Ionenkanäle und Ganzzellströme...................................................................... 7

1.2.3 Das Aktionspotential der ventrikulären Kardiomyozyte .................................. 8

1.2.4 Kardiale spannungsabhängige Ca2+-Ströme ................................................... 11

1.2.5 Der kardiale L-Typ Ca2+-Strom...................................................................... 11

1.2.6 Kardiale spannungsgesteuerte K+-Ströme ...................................................... 13

1.2.6.1 Molekularer Aufbau von K+-Kanälen .................................................... 13

1.2.6.2 Der transiente K+-Auswärtsstrom Ito ...................................................... 14

1.2.6.3 Die auswärtsgleichrichtenden K+-Ströme .............................................. 15

1.2.7 Die Interaktion von ICaL und Ito bestimmt den AP-induzierten Ca2+-Influx ... 15

1.2.8 Bedeutung der Ca2+-Dynamik - elektromechanische Kopplung und langfristige

Regulationsmechanismen............................................................................... 15

1.3 Regulation der Herzfunktion ................................................................................ 16

1.3.1 G-Proteine als intrazelluläre Signalträger für extrazelluläre Botenstoffe....... 17

1.3.2 Die Bedeutung von Gαq und Gα11 .................................................................. 19

1.3.3 Mechanismen der Regulation des kardialen L-Typ Ca2+-Stroms................... 21

1.3.4 Regulation der Genexpression von Cav1.2 ..................................................... 23

2 Material und Methoden ............................................................................................... 24

2.1 Verwendete Tiere ................................................................................................. 24

2.2 Isolation von Kardiomyozyten für die elektrophysiologischen Experimente ...... 24

2.3 Elektrophysiologische Methoden ......................................................................... 26

2.3.1 Die Patch-Clamp Technik............................................................................... 26

2.3.1.1 Die cell-attached Konfiguration............................................................. 26

2.3.1.2 Die whole-cell Konfiguration ................................................................. 27

2.3.1.3 Die Spannungsklemme...........................................................................27

2.3.2 Der Patch-Clamp Versuchsstand .................................................................... 28

2.3.2.1 Die mechanischen Komponenten ........................................................... 28

2.3.2.2 Die elektronischen Komponenten .......................................................... 29

2.3.2.3 Die Pipetten ............................................................................................ 30

2.4 Durchführung der elektrophysiologischen Experimente...................................... 30

2.6 Pulsprotokolle....................................................................................................... 31

2.6.1 Bestimmung des L-Typ Ca2+-Stroms (ICaL) .................................................... 31

2.6.2 Bestimmung der Steady-State Inaktivierung von ICaL .................................... 31

2.6.3 Bestimmung der Erholung von der Inaktivierung von ICaL ............................ 31

2.7 Untersuchung der Expression der Cav1.2-Untereinheit durch Western Blots...... 32

2.8 Versuchslösungen................................................................................................. 33

2.9 Auswertung........................................................................................................... 34

2.9.1 Auswertung der elektrophysiologischen Experimente ................................... 34

2.9.1.1 Auswertung der mittleren Strom-Spannungsbeziehung von ICaL........... 34

2.9.1.2 Untersuchung der Aktivierungskinetik von ICaL..................................... 34

2.9.1.3 Bestimmung der Zeitkonstanten der Inaktivierung von ICaL .................. 35

2.9.1.4 Auswertung der Steady-State Inaktivierung von ICaL............................. 35

2.9.1.5 Untersuchung der Erholung von der Inaktivierung von ICaL.................. 35

2.9.2 Auswertung der Western Blots ....................................................................... 36

2.9.3 Statistik ........................................................................................................... 36

2.10 Genehmigung der Organentnahmen...................................................................36

3. Ergebnisse................................................................................................................... 37

3.1 Charakterisierung des L-Typ Ca2+-Stroms........................................................... 37

3.2 Untersuchung der Expression von Cav1.2 ............................................................ 44

4. Diskussion .................................................................................................................. 45

4.1. Veränderungen des L-Typ Ca2+-Kanals in gna11-/--Mäusen............................... 45

4.1.1 Stromdichte und Cav1.2-Expression ............................................................... 45

4.1.2 Kinetik des ICaL in gna11-/--Kardiomyozyten.................................................. 46

4.2 Einfluss des Gαq/Gα11-Signalwegs auf ICaL im Mausventrikel............................. 47

4.3 Elektrophysiologische Veränderungen im linken Ventrikel von Gα11-defizienten

Mäusen................................................................................................................. 48

4.3.1 Konsequenzen für den AP-induzierten Ca2+-Einstrom................................... 49

4.3.2 Veränderungen von ICaL als Ursache für Veränderungen von Ito.................... 49

4.3.3 Der Einfluss von KChIP2b auf ICaL ................................................................ 50

4.4 Pathophysiologische Rolle des L-Typ Ca2+-Stroms und seiner Regulation durch

Gαq/Gα11-Signalwege bei kardialen Erkrankungen ............................................. 51

Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 53

Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 67

Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ 68

Abkürzungen .................................................................................................................. 69

Danksagung .................................................................................................................... 71

Lebenslauf ...................................................................................................................... 72

Erklärung ........................................................................................................................ 73

1

Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele: Der L-Typ Ca2+-Strom ist wesentlich an der ventrikulären

Kontraktion sowie an der Pathogenese kardialer Erkrankungen wie

Herzhypertrophie, Herzinsuffizienz und Rhythmusstörungen beteiligt. Seine

Regulation erfolgt unter anderem über ETA- und AT1- und α1-Rezeptoren, die unter

anderem G-Proteine der Gq/G11-Familie aktivieren. In dieser Arbeit wurde der L-Typ

Ca2+-Strom Gα11-defizienter Mäuse (gna11-/-) untersucht, um die Bedeutung des

Gα11-Signalwegs für die Regulation kardialer Ionenkanäle aufzuklären.

Methoden: Nach regionalspezifischer Isolation linksventrikulärer Kardiomyozyten

wurde der L-Typ Ca2+-Strom (ICaL) mit Hilfe der Patch-Clamp Technik gemessen. In

Western Blot Analysen wurde die Expression der Cav1.2-Untereinheit des Kanals

untersucht.

Ergebnisse: Bei 0 mV war die Stromdichte von ICaL in gna11-/--Myozyten um 14 %

geringer als in Kontrollzellen (-4.4 ± 0.2 pApF-1, n = 35 vs. -5.1 ± 0.2 pApF-1,

n = 49; p < 0.05). Es wurden keine regionalspezifischen Unterschiede gemessen. Die

schnelle Zeitkonstante der Inaktivierung (τ1) war in gna11-/--Zellen signifikant

verlängert (34.3 ± 1.4 ms vs. 30.8 ± 1.0 ms; p < 0.05 bei VPip = 0 mV). Die Cav1.2-

Expression war in gna11-/--Gewebe um ca. 15 % verringert (n.s., n = 3).

Schlussfolgerungen: Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Gα11, möglicherweise durch

Regulation der Proteinexpression, Einfluss auf ICaL im Mausventrikel nimmt. Dies

bedeutet, dass Gα11 vermutlich eine zentrale Komponente in Signalkaskaden ist, über

die verschiedene Rezeptoren den L-Typ Ca2+-Kanal beeinflussen und zur

Veränderung der Elektrophysiologie unter pathologischen Bedingungen führen

können.

2

Summary

Background and aims: The L-type Ca2+ current plays an important role in ventricular

contractility as well as in the pathogenesis of diseases like cardiac hypertrophy, heart

failure and arrhythmia. The α1-adrenoceptor as well as the ETA- and the AT1-

receptors contribute to its regulation under physiological but also under pathological

conditions. These receptors couple to G proteins of the Gq/11 family. Here we

investigate the L-type Ca2+ current in mice deficient of the Gα11 protein (gna11-/-) to

clarify the role of Gα11 signaling in cardiac ion channel regulation.

Methods: After the isolation of myocytes from the endo- and epicardial region of the

leftventricular wall the L-type Ca2+ current was measured using the ruptured-patch

whole-cell patch-clamp technique. Western Blots were used to investigate the

expression of the channels Cav1.2 subunit.

Results: At 0 mV myocytes from gna11-/- mice displayed a 14 % smaller current

density of ICaL than controls (-4.4 ± 0.2 pApF-1, n = 35 vs. -5.1 ± 0.2 pApF-1,

n = 49; p < 0.05). Differences between endo- and epicardial myocytes were not

detected. The fast time constant of inactivation (τ1) was longer in gna11-/- cells than

in wild type (wt) (34.3 ± 1.4 ms vs. 30.8 ± 1.0 ms; p < 0.05 at VPip = 0 mV). Western

Blots analysis revealed a 15 % decreased Cav1.2 expression in gna11-/- mice than in

wt (not significant, n = 3).

Conclusion: This work suggests that Gα11 influences ICaL in mouse ventricle,

possibly by regulating the protein expression. Thus Gα11 is probably a central

component of the signaling pathway by which several receptors regulate the L-type

Ca2+ channel and may contribute to changes in electrophysiology under pathological

conditions.

3

1. Einleitung

1.1 Der Erregungszyklus im Säugerherzen

Die rhythmische Kontraktion des Herzens beruht auf einer geordneten Abfolge

von elektrischer Erregung und Erregungsrückbildung im Myokard. Ausgangspunkt

dieses Erregungszyklus sind im gesunden Säugerherzen die spontan aktiven Zellen

des Sinusknotens in der Wand des rechten Vorhofs. Die Ausbreitung der generierten

Aktionspotentiale erfolgt über sogenannte gap junctions, elektrisch leitende

Verbindungen zwischen den einzelnen Kardiomyozyten. Zwischen Vorhöfen und

Ventrikeln wird die direkte Erregungsausbreitung durch die bindegewebige und

somit elektrisch isolierende Ventilebene verhindert. Hier erfolgt die Weiterleitung

nur über den Atrioventrikularknoten (AV-Knoten). Dies geschieht mit einer

Verzögerung von etwa 50 ms, um Vorhof- und Ventrikelkontraktion zu koordinieren.

Die Ventrikel verfügen über ein spezifisches Erregungsleitungssystem aus

His´schem Bündel, Kammerschenkeln und Purkinjefasern, welches eine schnelle und

geordnete Erregungsausbreitung über das Arbeitsmyokard gewährleistet. Zunächst

werden die Innenwand des interventrikulären Septums, die Papillarmuskeln sowie

die subendokardialen (im Folgenden als endokardial bezeichneten) Bereiche der

freien Wand erregt, bevor sich die Erregung weiter über midmyokardiale und

subepikardiale (im Folgenden als epikardial bezeichnete) Regionen und damit

schließlich über den gesamten Ventrikel ausbreitet (Kalusche & Csapo, 1997). Der

Ablauf der Erregungsausbreitung wird im Wesentlichen durch die

Ausbreitungsgeschwindigkeit im Erregungsleitungssystem und dessen anatomische

Struktur festgelegt. Die Rückkehr in den Ausgangszustand hingegen ist ein Prozess,

der von jeder Kardiomyozyte selbständig durchlaufen wird und somit von Form und

Dauer ihres individuellen Aktionspotentials abhängt. Solange sich jedoch die Zelle

im funktionellen Synzytium des Myokards befindet, wird ihr AP durch die

elektrische Kopplung von den Potentialen der Nachbarzellen mitbestimmt und kann

sich deutlich von dem einzelner isolierter Kardiomyozyten unterscheiden. Dies trägt

zu einer Synchronisierung der im Verhältnis zur Ausbreitung relativ langsam

ablaufenden Erregungsrückbildung bei (Conrath & Opthof, 2006).

4

1.2 Das ventrikuläre Aktionspotential und die ihm z ugrunde

liegenden Ionenströme

Die Basis der experimentellen Elektrophysiologie wurde um 1660 gelegt, als Jan

Swammerdan an präparierten Froschschenkeln einen Zusammenhang zwischen

Nervenstimulation und Muskelkontraktion aufzeigte (Verkhratsky et al., 2006).

Maßgeblichen Fortschritt erfuhr die Elektrophysiologie durch Luigi Galvani, der

1791 eine auf Ladungsverteilungen in Nerv und Muskel beruhende Bioelektrizität

postulierte. Deren zelluläres Korrelat konnte Julius Bernstein 1868 mit der ersten

Aufzeichnung eines Aktionspotentials darstellen (Bernstein, 1868). Die Aufklärung

über die Grundlagen der Bildung von Aktionspotentialen gelang Alan Hodgkin und

Andrew Huxley zwischen 1930 und 1960 mit Hilfe der von ihnen mitentwickelten

voltage-clamp Methode am Riesenaxon des Tintenfischs (Hodgkin et al., 1949;

Hodgkin & Huxley, 1952; Hodgkin et al., 1952). Für ihre Ionentheorie der Erregung

wurden sie 1963 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

1.2.1 Die Ionentheorie der Erregung

Jede Zelle wird von einer etwa 5 - 8 nm dicken Membran umschlossen, deren

Grundstruktur von Phospholipiden gebildet wird. Aufgrund derer amphiphiler

Eigenschaften entsteht eine Doppelschicht, in der sich die hydrophoben

Molekülenden einander begegnen, während die hydrophilen Enden zum wässrigen

Milieu des Intra- und Extrazellulärraumes weisen. Wenig polare und kleine Moleküle

wie Sauerstoff und Kohlendioxid können diese Lipiddoppelschicht permeieren. Für

Wasser und darin gelöste Stoffe sowie für größere oder geladene Teilchen wie

Proteine oder Ionen hingegen ist sie weitgehend undurchlässig. In die

Phospholipidschicht sind Membranproteine eingelagert, die als periphere Proteine

nur in der Innen- oder Außenschicht verankert sind oder als integrale Proteine die

gesamte Membran durchqueren. Zu letztgenannten zählen spezielle

Transportproteine sowie Kanalproteine. Durch sie besteht die Möglichkeit, nicht nur

die Zusammensetzung des intrazellulären Milieus, sondern auch das über der

Zellmembran anliegende elektrische Potential über aktive und passive

Transportprozesse zu kontrollieren.

5

Ion

Extrazelluläre

Konzentration (mM)

Intrazelluläre

Konzentration (mM)

Gleichgewichtspotential

(mV)

Na+ 145 12 +67

K+ 4 155 -98

Ca2+ 1.5 (frei) 10-4 (frei) +129

Cl- 123 4.2 -90

Tabelle 1: Freie Ionenkonzentrationen und Gleichgewichtspotentiale einer Skelettmuskelzelle, nach Hille (2001)

In Tabelle 1 sind die intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen am Beispiel

einer Skelettmuskelzelle von Säugetieren angegeben. Viele erregbare Zellen, so auch

Herzmuskelzellen, weisen vergleichbare Verhältnisse auf. Extrazellulär sind Na+ und

Cl- die vorherrschenden Ionen, hingegen dominieren im Zellinneren K+ als Kation

und negativ geladene Proteine als Anionen. Bemerkenswerterweise sind im

Intrazellulärraum normalerweise extrem niedrige Ca2+-Konzentrationen festzustellen.

Besteht über einer Membran für eine Ionenart ein Konzentrationsgradient, so

resultiert, vorausgesetzt die Membran ist für dieses Ion selektiv permeabel, eine

transmembranäre Potentialdifferenz. Entsprechend der chemischen Triebkraft

diffundieren die Ionen aus dem Kompartiment mit der höheren Konzentration auf die

Seite der niedrigeren Konzentration. Die damit erfolgende Ladungsverschiebung

ergibt eine Potentialdifferenz, die auf die Ionen eine dem Konzentrationsgradienten

entgegengesetzte elektrische Triebkraft ausübt. Gleichen sich beide Kräfte aus,

sodass netto kein Ionenfluss mehr stattfindet, stellt sich eine Spannung ein, die als

Gleichgewichtspotential bezeichnet wird. Dieses ist für jede Ionenart durch die

Nernst-Gleichung definiert:

[ ][ ]innen

außenX X

Xln

zFRT

E ⋅=

mit dem Gleichgewichtspotential Ex des betreffenden Ions, der allgemeinen

Gaskonstante R (8.314 J K-1 mol-1), der absoluten Temperatur T, der Ionenwertigkeit

z, der Faraday-Konstante F (96500 C mol-1) und den Ionenkonzentrationen auf der

Außen- und Innenseite der Membran [ ]außenX und [ ]innenX . Kommen Leitfähigkeiten für weitere Ionen hinzu, so ist die Nernst-Gleichung zur Goldmann-Hodgkin-Katz-

Gleichung zu erweitern, die hier in modifizierter Form mit Hilfe der

Ionenleitfähigkeiten dargestellt ist:

6

∑=X

Xm

Xm EG

GV

mit dem Membranpotential Vm, den Leitfähigkeiten Gx für jedes permeable Ion x,

der Gesamtleitfähigkeit Gm und den Gleichgewichtspotentialen Ex der jeweiligen

Ionen. Die Nernst-Potentiale der beteiligten Ionen werden demnach entsprechend

ihrer jeweiligen Anteile an der Gesamtleitfähigkeit gewichtet und ergeben summiert

das Membranpotential. Die im Falle einer typischen ventrikulären Kardiomyozyte

beteiligten Ionen sind Na+, K+, Ca2+ und Cl-. Hinzu kommt eine mit GL bezeichnete

unspezifische „Leckleitfähigkeit“. Als Membranpotential ergibt sich somit:

Lm

L-Cl

m

-ClCa2

m

Ca2K

m

KNa

m

Nam EG

GE

G

GE

G

GE

GG

EG

GV ++++= +

++

++

+

Im unerregten Zustand weist die Zellmembran erregbarer Zellen normalerweise

eine hohe K+-Permeabilität auf, während die Leitfähigkeiten für Na+, Ca2+ und Cl-

vernachlässigbar klein sind. Das Ruhemembranpotential kommt daher dem

Gleichgewichtspotential für K+ nahe: Vm ≈ EK ≈ -90 mV. Eine Änderung der

Leitfähigkeiten ruft einen transmembranären Strom bestehend aus den permeablen

Ionen hervor, bis sich entsprechend der Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung das

neue Membranpotential eingestellt hat. Dieser Mechanismus liegt der Entstehung

eines Aktionspotentials zugrunde. Wird die Zelle über einen Schwellenwert hinaus

depolarisiert, sinkt die K+-Permeabilität, während GNa und kurz darauf GCa erheblich

ansteigen. Das Membranpotential nähert sich zunächst dem Gleichgewichtspotential

für Na+ an (ENa ≈ +67 mV). Nach kurzer Zeit stellen sich wieder die

Ausgangsverhältnisse ein. Der Na+-Einstrom sistiert und das Ansteigen der

K+-Permeabilität führt zu einem repolarisierenden K+-Ausstrom. Im Zusammenspiel

mit der nun ebenfalls rückläufigen Ca2+-Leitfähigkeit führt dies zu einer Rückkehr

auf das Ruhemembranpotential. Die während eines einzelnen Aktionspotentials

fließenden Ströme sind zu gering, um eine wesentliche Änderung der

Ionenkonzentrationen in den jeweiligen Kompartimenten zu bedingen. Dauerhaft

wird die spezifische Verteilung der Na+- und K+-Ionen auf beiden Seiten der

Zellmembran durch die Na+-K+-ATPase aufrechterhalten. Diese transportiert unter

ATP-Verbrauch jeweils 3 Na+-Ionen aus der Zelle heraus und gegenläufig 2

K+-Ionen in die Zelle hinein. Ebenso trägt der Na+-Ca2+-Transporter durch Austausch

von 3 Na+-Ionen gegen ein Ca2+-Ion zur Ca2+-Homöostase über der Zellmembran

bei.

7

1.2.2 Ionenkanäle und Ganzzellströme

Maßgeblichen Fortschritt erfuhr die Aufklärung der beobachteten Permeabilitäts-

änderungen durch die Patch-Clamp Technik (Neher & Sakmann, 1976; Hamill et al.,

1981). Ihre Anwendung konnte die Existenz der bereits zuvor postulierten

Ionenkanäle bestätigen, welche die Ströme über die Zellmembran bedingen.

Ionenkanäle sind integrale Membranproteine, die als Komplex aus hydrophilen und

hydrophoben Anteilen einen Kanal in der Zellmembran bilden. Dieser erlaubt einen

passiven Ionenfluss gemäß dem elektrochemischen Gradienten. Die Transportraten

erreichen dabei verglichen mit aktiven Transportprozessen (z.B. Na+-K+-ATPase)

sehr hohe Werte (ca. 107 Ionen/s). Ionenkanäle sind durch eine unterschiedlich

ausgeprägte Selektivität bezüglich der sie permeierenden Ionen charakterisiert. So

lassen sich zum Beispiel Na+-, K+-, Ca2+- oder Cl--spezifische Kanäle differenzieren,

während andere weniger selektiv sind und beispielsweise den Durchtritt von

Anionen, Kationen oder aller Ionen gleichermaßen ermöglichen (Hille, 2001).

Ionenkanäle können verschiedene Zustandsformen annehmen und damit ihre

Durchlässigkeit variieren. Das Schalten zwischen den einzelnen Zuständen (gating)

ist ein stochastischer und sehr schneller Vorgang, bei dem keine stetigen

Zwischenschritte auftreten (eine Ausnahme mögen so genannte sublevels einiger

Ionenkanäle darstellen, die jedoch ebenfalls diskreter Natur sind). Die

Wahrscheinlichkeit, mit der sich ein Kanal im offenen Zustand befindet, kann von

physikalischen Faktoren wie Temperaturänderung, mechanischen Kräften oder

Potentialänderungen beeinflusst werden. Auch chemische Einflüsse wie pH-Wert

und Signalstoffe können relevant sein. Dementsprechend unterscheidet man unter

anderem spannungsabhängige und ligandengesteuerte Ionenkanäle. Die

Öffnungswahrscheinlichkeiten multiplizieren sich mit den Einzelkanalleitfähigkeiten

und der Anzahl der Ionenkanäle zu der Gesamtleitfähigkeit der Zellmembran, welche

zusammen mit dem aktuellen Membranpotential, den Gleichgewichtspotentialen der

durchlässigen Ionen sowie den intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen den

Ganzzellstrom determiniert (Hille, 2001). Dieser ergibt sich in der Regel aus einer

Vielzahl von Strömen durch unterschiedliche Membranproteine, weshalb seine

Auftrennung und Bestimmung in die einzelnen beteiligten Ionenkanäle eine

experimentelle Herausforderung darstellt. Anders als die Schaltvorgänge eines

einzelnen Ionenkanals, zeigen Ganzzellströme stetige Übergänge zwischen

Aktivierung und Inaktivierung. Somit lässt sich das vereinfachte Modell eines

„mittleren“ spannungsabhängigen Ionenkanals entwerfen (Bromm, 1985; Lehmann-

8

Horn & Jurkat-Rott, 1999). Er besteht aus einer Pore, die von zwei Toren

verschlossen werden kann. Es ergeben sich drei mögliche Zustände, die

spannungsabhängig sequentiell durchlaufen werden. Im Ruhezustand ist die Pore des

Kanals durch das Aktivierungstor verschlossen. Der Kanal ist geschlossen aber

aktivierbar. Eine Depolarisation führt zu einer schnellen Konformationsänderung des

Aktivierungstors und damit zur Öffnung des Kanals. Bei anhaltender Depolarisation

tritt mit einer gewissen zeitlichen Verzögerung die Inaktivierungsdomäne in die Pore

ein und blockiert den Ionenstrom. Der Kanal ist nun offen aber inaktiviert. Neben

dieser Form der Inaktivierung sind auch andere, langsamer ablaufende

Inaktivierungsmechanismen bekannt, die auf Konformationsänderungen der

Porenregion selbst beruhen (Lehmann-Horn & Jurkat-Rott, 1999). Mit

Repolarisation der Zellmembran erfolgt die Erholung von der Inaktivierung; der

Kanal kehrt in den aktivierbaren Geschlossenzustand zurück. Tritt die Repolarisation

noch vor der Inaktivierung des Kanals ein, findet durch Schließen des

Aktivierungstors ein direkter Übergang zurück in den aktivierbaren

Geschlossenzustand statt. Dies wird als Deaktivierung bezeichnet. Diese stark

vereinfachte Darstellung bezieht sich wie erwähnt auf das stetige Verhalten von

Ganzzellströmen und nicht auf tatsächliche Abläufe an einzelnen Ionenkanälen. Das

entwickelte Modell ist jedoch bei der Analyse von Vorgängen während eines

Aktionspotentials sehr hilfreich.

1.2.3 Das Aktionspotential der ventrikulären Kardiomyozyte

Noch während am Riesenaxon des Tintenfischs die Grundzüge der elektrischen

Erregung erforscht wurden, gelangen bereits 1949 auch erste Ableitungen

intrazellulärer Potentiale und transmembranärer Aktionspoteniale (AP) an

Herzmuskelfasern des Hundes (Coraboef & Weidmann, 1949). Im Verlauf der

nachfolgenden Jahrzehnte wurde mit Hilfe der Spannungsklemmtechnik und später

der neu entwickelten Patch-Clamp Technik (Neher & Sakmann, 1976; Hamill et al.,

1981) Schritt für Schritt der heutige Kenntnisstand über das ventrikuläre

Aktionspotential und die ihm zugrunde liegenden Ionenströme erreicht. Der Ablauf

eines Aktionspotentials folgt normalerweise dem „Alles oder nichts - Gesetz“. Wird

die Membran einer Kardiomyozyte durch elektrotonisch über gap junctions

fortgeleitete Potentiale der Nachbarzellen über einen Schwellenwert von ca. -65 mV

hinaus depolarisiert („Schwellenpotential“), löst dies eine stereotype Folge von

Ionenströmen und damit Potentialänderungen aus. Diese werden in vier Phasen

9

unterteilt (siehe Abb. 1). Beim Erreichen des Schwellenpotentials öffnen Na+-Kanäle

vorwiegend vom Typ Nav1.5. Es erfolgt ein massiver Na+-Einstrom (INa), der eine

rasche Depolarisation bedingt. Dies wird als Phase 0 bezeichnet. Da zu diesem

Zeitpunkt andere Leitfähigkeiten vernachlässigbar klein sind, strebt das

Membranpotential in Richtung des Na+-Gleichgewichtspotentials (ENa ≈ +67 mV).

Es erreicht einen Wert von ca. +40 mV (overshoot) bevor der Na+-Strom

spannungsabhängig inaktiviert und eine weitere Depolarisation verhindert wird. Es

aktivieren nun der repolarisierende transiente K+-Auswärtsstrom Ito sowie der

depolarisierende L-Typ Ca2+-Strom ICaL. Daraus ergibt sich zunächst eine erste

Repolarisation auf etwa 0 mV (Phase 1). In Phase 2, der so genannten Plateauphase,

wird das Potential um 0 mV relativ konstant gehalten, bevor sich mit Phase 3 die

endgültige Repolarisation auf das Ruhemembranpotential anschließt. Hierfür sind in

erster Linie die verzögert aktivierenden K+-Ströme (delayed rectifier) verantwortlich.

Beim Menschen und anderen Spezies mit langer APD setzen sich diese aus einer

schnellen und einer langsamen Komponente, IKr und IKs, zusammen. In Tieren mit

kurzer Aktionspotentialdauer (APD) führen sowohl Ito als auch die delayed rectifier

IKslow1, IKslow2 und ISS zur Repolarisation der Zellmembran. Das in Phase 4

wiedererreichte Ruhemembranpotential wird von einwärtsgleichrichtenden

K+-Kanälen (IKir) aufrechterhalten. Abbildung 1 zeigt links ein menschliches

ventrikuläres Aktionspotential, rechts eines der Maus, sowie jeweils darunter die

auftretenden Ionenströme (Nerbonne et al., 2001). Die Gegenüberstellung der

abgebildeten Aktionspotentiale zeigt, dass bei der Maus keine eindeutige

Plateauphase existiert und dass das AP mit knapp 50 ms wesentlich kürzer ist als das

menschliche. Dies ermöglicht die der Maus eigene Herzfrequenz von ca. 600 min-1.

Ein Aktionspotential im menschlichen Ventrikel dauert etwa 400 ms. Dauer und

Form der Aktionspotentiale im Herzen unterscheiden sich jedoch je nach

Lokalisation und Funktion der jeweiligen Zelle, um das komplexe Zusammenspiel

aus automatischer Erregungsbildung und koordinierter Kontraktion und Relaxation

zu ermöglichen. So weisen die Schrittmacherzellen des Sinusknotens und des AV-

Knotens aufgrund der fehlenden einwärtsgleichrichtenden K+-Ströme kein stabiles

Ruhemembranpotential auf und depolarisieren selbständig. Dies wird unter anderem

durch den hyperpolarisationsaktivierten Kationeneinstrom If (HCN-Kanäle)

ermöglicht (DiFrancesco, 2006). Die Aktionspotentiale des Arbeitsmyokards ähneln

sich morphologisch, jedoch sind die der Vorhöfe deutlich kürzer als die der

Ventrikel.

10

Abbildung 1: Aktionspotentiale und zugrunde liegende Ionenströme ventrikulärer Kardiomyozyten von Mensch und Maus Die Abbildung zeigt ventrikuläre APs und zugrunde liegende Ionenströme des Menschen (links) und der Maus (rechts). INa, Na

+-Strom; ICaL, L-Typ Ca2+-Strom; INCX, Na

+/Ca2+-Austauscherstrom; Ito,f, transienter K+-Auswärtsstrom (schnelle Komponente); Ito,s, transienter K

+-Auswärtsstrom (langsame Komponente), IKs, langsam aktivierender delayed rectifier Strom; IKr, schnell aktivierender delayed rectifier Strom; IKslow, langsam inaktivierender delayed rectifier Strom; ISS, Steady-State Strom; IK1, einwärtsgleichrichtender K+-Strom (in dieser Arbeit als IKir bezeichnet); IKATP, ATP-sensitiver K+-Strom. Die Abbildung wurde aus Nerbonne et al. (2001) entnommen.

Ergebnisse bezüglich der ventrikulären Erregungsausbreitung und -rückbildung

variieren von Studie zu Studie und sind offensichtlich speziesabhängig. In vivo-

Untersuchungen an Mäusen ergaben eine im apikalen Endokard beginnende

Depolarisation, die sich in Richtung Herzbasis und Epikard ausbreitete (Liu et al.,

2004). Da die APD in später depolarisierten Regionen signifikant kürzer war als in

früher erregten Gebieten, verlief die Repolarisation entgegengesetzt vom Epikard der

Basis zum apikalen Endokard. Auch an menschlichen Herzen konnte gezeigt werden,

dass die APD einer Region negativ mit deren relativem Erregungszeitpunkt

korreliert, sodass sich auch hier bezüglich der Repolarisation eine Richtungsumkehr

ergibt (Franz et al., 1987). Der zeitliche Verlauf der Erregungsrückbildung bestimmt

11

die Polarität der T-Welle im EKG, wobei im menschlichen Ventrikel in erster Linie

ein transmuraler Gradient von Bedeutung zu sein scheint (Mines, 1913; Franz et al.,

1987; Yan et al., 2003; Conrath & Opthof, 2006). Ursächlich für die Unterschiede in

Form und Dauer der APs ist in erster Linie eine unterschiedliche Verteilung der

kardialen K+-Ströme. Im Folgenden werden die in dieser Arbeit behandelten

Ionenströme und ihr Einfluss auf die AP-Variabilität näher beschrieben.

1.2.4 Kardiale spannungsabhängige Ca2+-Ströme

Die Ionenkanäle, die den Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran von

Kardiomyozyten ermöglichen, gehören zu der heterogenen Gruppe

spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle. Letztere sind anhand ihrer

elektrophysiologischen Eigenschaften in LVA-Kanäle (low voltage activated) und

HVA-Kanäle (high voltage activated) unterteilt (Bean, 1989). LVA-Kanäle,

aufgrund ihrer schnellen Inaktivierung (transient) und geringen

Einzelkanalleitfähigkeit (tiny) auch als T-Typ Kanäle bezeichnet, scheinen im

Herzen primär in Schrittmacherzellen eine Rolle zu spielen (Hagiwara et al., 1988;

Nerbonne & Kass, 2005). Ebenfalls in Schrittmacherzellen wurde ein HVA-Kanal

gefunden, der durch die α-Untereinheit Cav1.3 gekennzeichnet ist (Matthes et al.,

2004). Der im Arbeitsmyokard dominierende HVA-Kanal beinhaltet die

α-Untereinheit Cav1.2. Er gehört seiner langen Öffnungsdauer entsprechend zu den

L-Typ (long lasting) Ca2+-Kanälen, die aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber 1,4-

Dihydropyridinen wie Nifedipin pharmakologisch als Dihydropyridinrezeptoren

charakterisiert sind (Hess et al., 1986; Bean, 1989).

1.2.5 Der kardiale L-Typ Ca2+-Strom

Wie in Abbildung 2 schematisch dargestellt, ist der kardiale L-Typ Ca2+-Kanal ein

aus mehreren Proteinen (α1c-, α2-, β- und δ-Untereinheit) aufgebauter Komplex.

Cav1.2 formt als α1c-Untereinheit die Kanalpore und enthält den Spannungssensor,

den Selektivitätsfilter sowie Bindungsstellen für Antagonisten. Sie besteht aus vier

homologen Domänen, von denen jede sechs Transmembranschleifen (S1-S6) sowie

eine innerhalb der Membran liegende Schleife zwischen S5 und S6 ausbildet. Die

Pore des Kanals wird dabei von den Segmenten S5 und S6 zusammen mit den

intramembranären Schleifen geformt. Die positiv geladenen S4-Schleifen fungieren

als Spannungssensor und bewirken die zur Aktivierung des Kanals führenden

Konformationsänderungen. Die intrazellulär liegende Untereinheit β2 und das Dimer

12

α2δ haben regulatorische Funktion. Sie nehmen Einfluss auf die Expression der

Kanalproteine und modulieren Amplitude und Kinetik des Ca2+-Stroms (Catterall,

1991, 2000; Nerbonne & Kass, 2005). Die α1- und β-Untereinheiten sind zudem

Substrate der Proteinkinase A (PKA), der Proteinkinase C (PKC), der

calmodulinabhängigen Kinase II (CaMKII) und anderer Proteinkinasen, was die

Regulation des Kanals durch Phosphorylierung ermöglicht (Curtis & Catterall, 1985;

Kamp & Hell, 2000).

Abbildung 2: Struktur des kardialen L-Typ Ca 2+-Kanals Die die Kanalpore bildende α1c-Untereinheit Cav1.2 setzt sich aus vier homologen Domänen (I-IV) zusammen, von denen jede sechs Transmembranschleifen ausbildet. Die α2-Untereinheit liegt extrazellulär und ist über Disulfidbrücken an die δ-Untereinheit gekoppelt. Zusammen mit der sich intrazellulär befindenden β-Untereinheit nimmt das α2δ-Dimer regulatorische Funktion ein. Die Abbildung wurde modifiziert übernommen aus Adachi-Akahane (2004).

Während die Aktivierung des kardialen L-Typ Ca2+-Kanals spannungsgesteuert

bei Membranpotentialen ab ca. -40 mV einsetzt, wird seine Inaktivierung nicht nur

durch die Membranspannung, sondern auch durch die intrazelluläre

Ca2+-Konzentration reguliert (Eckert & Chad, 1984; Findlay, 2004; Lacinova &

Hofmann, 2005). So konnte 1999 gezeigt werden, dass konstitutiv an der

α1c-Untereinheit gebundenes Calmodulin durch Interaktion mit Ca2+ oder anderen

divalenten Kationen zur Inaktivierung des Kanals führt (Peterson et al., 1999; Qin et

al., 1999; Zuhlke et al., 1999). Der Zeitverlauf der Inaktivierung des ICaL kann durch

zwei Zeitkonstanten beschrieben werden. τ1 entspricht mit Werten zwischen 7 und

50 ms der beschriebenen schnellen Ca2+-abhängigen Inaktivierung, während τ2 mit

Werten zwischen 65 und 400 ms die langsamere spannungsabhängige Inaktivierung

13

kennzeichnet (Sun et al., 2000; Lacinova & Hofmann, 2005). Findlay (2002)

postuliert zudem eine schnelle spannungsabhängige Inaktivierung, die vor allem bei

zunehmender Depolarisation an Bedeutung gewinnt und die Ca2+-abhängige

Inaktivierung zurückdrängt. Umgekehrt führt PKA-Aktivierung nach Findlay zu

einer Unterdrückung der schnellen spannungsabhängigen Inaktivierung, wodurch der

Anteil der Ca2+-abhängigen Komponente zunimmt (Findlay, 2002). Ob diese nach

Phosphorylierung beobachteten Veränderungen jedoch tatsächlich auf die Existenz

einer schnellen spannungsabhängigen Komponente zurückzuführen sind, ist fraglich

(Lacinova & Hofmann, 2005). Ein weiterer Mechanismus der Autoregulation des

Ca2+-Kanals wurde 1989 von Gurney beschrieben (Gurney et al., 1989). Er

beobachtete eine Ca2+-induzierte Verstärkung des Ca2+-Einstroms in

Kardiomyozyten von Frosch und Meerschweinchen. Dieses später als facilitation

bezeichnete Phänomen der Bahnung ist - ebenso wie die Ca2+-abhängige

Inaktivierung - Calmodulin-vermittelt (Zuhlke et al., 1999). Welcher Effekt

überwiegt, hängt unter anderem von der jeweiligen Bindungsstelle des Ca2+/CaM-

Komplexes am L-Typ Ca2+-Kanal ab (Han et al., 2010). Zudem wird durch Bindung

von Ca2+ an Calmodulin die calmodulinabhängige Kinase II aktiviert, die durch

Phosphorylierung des Kanals ebenfalls zur facilitation beiträgt (Anderson et al.,

1994; Yuan & Bers, 1994).

Anders als bei den kardialen K+-Strömen sprechen bezüglich des ICaL mehrere

Untersuchungen dafür, dass dessen Stromdichte normalerweise unabhängig von der

APD in den verschiedenen Regionen konstant ist. Zwar wurde in endokardialen

Kardiomyozyten von Ratten ein höherer AP-induzierter Ca2+-Gesamteinstrom

beobachtet als in epikardialen Zellen (Volk et al., 1999); dies war jedoch auf einen

verringerten Ito und damit eine verlängerten Ca2+-Einstromphase zurückzuführen, da

sich bezüglich der Stromdichte im transmuralen Vergleich keine Differenzen ergaben

(Bryant et al., 1999; Volk et al., 1999). Ein Vergleich der Expression der

α1c-Untereinheit des L-Typ Ca2+-Kanals zwischen Apex und Basis des

Hundeventrikels zeigte ebenfalls eine gleichmäßige Verteilung auf (Szentadrassy et

al., 2005).

1.2.6 Kardiale spannungsgesteuerte K+-Ströme

1.2.6.1 Molekularer Aufbau von K +-Kanälen

Die spannungsabhängigen K+-Kanäle (Kv) setzen sich aus 4 porenbildenden

α-Untereinheiten zusammen. Diese bestehen jeweils aus 6 Transmembransegmenten

14

S1-S6, wobei S4 als positiv geladene Struktur den Spannungssensor darstellt (Jan &

Jan, 1992; Pongs, 1992). Die Kvα-Untereinheiten lassen sich anhand ihres

genetischen Ursprungs in Unterfamilien einteilen (Kv1-Kv11), die jeweils mehrere

Mitglieder aufweisen (Gutman et al., 2005). Moduliert werden die Kanäle durch

verschiedene β-Untereinheiten. Sie können mit den α-Untereinheiten assoziieren und

die Oberflächenexpression sowie die kinetischen Eigenschaften der Kanäle

beeinflussen. Maßgeblich vorangetrieben wurde die Strukturanalyse von K+-Kanälen

sowie die Aufklärung der Selektivitätsmechanismen von Roderick MacKinnon

(Doyle et al., 1998; MacKinnon, 2004), der für diese Leistung 2003 mit dem

Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde.

1.2.6.2 Der transiente K +-Auswärtsstrom I to

Der transiente K+-Auswärtsstrom (Ito) weist eine schnelle Aktivierung bei

Membranpotentialen ab -30 mV auf. Bezüglich der Inaktivierungskinetik wird er von

einigen Autoren in eine langsam und eine schnell inaktivierende Komponente, Ito,s

(slow) und Ito,f (fast), untergliedert (Xu et al., 1999), die sich zudem in der Dauer

ihrer Erholung von der Inaktivierung unterscheiden. Die ungleiche Verteilung dieser

Ströme in verschiedenen Spezies sowie innerhalb des einzelnen Ventrikels lässt

einen Beitrag zu den unterschiedlichen Aktionspotentialformen vermuten

(Brahmajothi et al., 1999; Brunet et al., 2004). Bereits 1983 wurde eine heterogene

Expression von Ito als Grundlage der regionalen APD-Differenzen im Rattenherz

vermutet (Watanabe et al., 1983). Diese These wurde von der Gruppe um

Antzelevitch durch Untersuchungen der freien Wand des linken Ventrikels von

Hunden gestützt, welche eine niedrige Ito-Stromdichte in endokardialen und eine

hohe Stromdichte in epikardialen Regionen ergaben (Litovsky & Antzelevitch, 1988;

Antzelevitch et al., 1991). Im Verlauf konnte diese Beobachtung unter anderem auf

die Ratte (Clark et al., 1993; Pandit et al., 2001), die Maus (Xu et al., 1999; Brunet

et al., 2004) und den Menschen (Wettwer et al., 1994; Näbauer et al., 1996) erweitert

werden. Inwieweit der Ito an der Modulation der APD beteiligt ist, ist jedoch

wahrscheinlich von Spezies zu Spezies unterschiedlich. Beim Hund und beim

Menschen wird vorrangig die Tiefe des notch (Einkerbung am Ende der Phase 1)

vom Ito beeinflusst (Tseng & Hoffman, 1989; Greenstein et al., 2000; Sun & Wang,

2005), wohingegen sowohl für die Ratte (Clark et al., 1993; Volk et al., 1999) als

auch für die Maus (Barry et al., 1998; Guo et al., 2000; Gussak et al., 2000) ein

klarer Zusammenhang zwischen Ito-Stromdichte und APD gezeigt werden konnte.

15

Bezüglich der molekularen Grundlagen transienter K+-Auswärtsströme konnte in

Untersuchungen an Mäusen gezeigt werden, dass dem Ito,s wahrscheinlich Kv1.4-

Kanäle zugrunde liegen (London et al., 1998b), während der Ito,f von Kv4.2 und

Kv4.3 zusammen mit der β-Untereinheit KChIP2 und weiteren β-Untereinheiten

gebildet wird (Barry et al., 1998; Guo et al., 2005; Nerbonne & Kass, 2005).

1.2.6.3 Die auswärtsgleichrichtenden K +-Ströme

Im Arbeitsmyokard von Menschen und Hunden sind die verzögert aktivierenden

auswärtsgleichrichtenden K+-Ströme (delayed rectifier) IKr und IKs die vornehmlich

die APD beeinflussenden Ströme. Diese sind in Tieren mit kurzem AP wie Mäusen

nicht oder nur in sehr geringer Menge nachweisbar. Die delayed rectifier sind hier

IKslow1, IKslow2 und Iss. Bei der Maus sind neben Ito der IKslow1 und der IKslow2

maßgeblich an der Festlegung der APD beteiligt (Fiset et al., 1997; London et al.,

1998a; Kodirov et al., 2004; Li et al., 2004). Detaillierte Darstellungen kardialer

K+-Ströme und deren molekularer Korrelate bieten einschlägige Übersichtsarbeiten

(Nerbonne, 2000; Roden et al., 2002; Jiang et al., 2003; Nerbonne & Kass, 2005).

1.2.7 Die Interaktion von ICaL und Ito bestimmt den AP-induzierten

Ca2+-Influx

Aus dem Gegenspiel von ICaL und Ito ergibt sich die Form des APs während der

Phasen 1 und 2. In Säugetieren mit langer APD wie Hunden und Menschen bestimmt

der Ito vornehmlich das Ausmaß der auf die Phase 0 folgenden Repolarisation (notch)

(Tseng & Hoffman, 1989), damit die Höhe des Plateaupotentials und somit den

Antrieb für den Ca2+-Einstrom während des Plateaus, der einer sofortigen

Repolarisation entgegenwirkt. In Tieren mit kurzer APD wie Ratten und Mäusen

wird der Ca2+-Einstrom weniger von der Ausprägung des Plateaus als vielmehr von

der Dauer des APs bestimmt. Diese wird hier maßgeblich vom Ito beeinflusst (Clark

et al., 1993; Volk et al., 2001).

1.2.8 Bedeutung der Ca2+-Dynamik - elektromechanische

Kopplung und langfristige Regulationsmechanismen

Die durch die L-Typ Ca2+-Kanäle in die Zelle gelangenden Ca2+-Ionen erzeugen

die Plateauphase des Aktionspotentials und lösen eine weitere Ca2+-Freisetzung aus

dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) über Ryanodinrezeptorkanäle aus (calcium

induced calcium release, CICR) (Näbauer et al., 1989; Bers & Perez-Reyes, 1999).

16

Bindung von Ca2+-Ionen an das Regulatorprotein Troponin C führt zur Freilegung

der Myosinbindungsstelle des Aktins und setzt den Querbrückenzyklus in Gang. Die

AP-induzierte massive Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration bewirkt

somit die Kontraktion. Insofern sind Ca2+-Ionen die Schaltstelle zwischen

elektrischer Erregung und mechanischer Funktion der Zelle. In der Relaxationsphase

werden die eingeströmten Ca2+-Ionen über den Na+/Ca2+-Austauscher aus der Zelle

transportiert bzw. über Ca2+-Pumpen (SERCA) in das SR zurückgeführt (Bers,

2008). Das Gleichgewicht zwischen Ca2+-Einstrom bzw. Ca2+-Freisetzung aus dem

SR einerseits und dem Rücktransport bzw. der Wiederaufnahme des Ca2+ in das SR

andererseits ist ein empfindlicher Regulator der Kontraktilität (Wier, 1990; Barry &

Bridge, 1993). Da das Ausmaß des CICR vom Ca2+-Einstrom über L-Typ

Ca2+-Kanäle abhängt, stellen diese eine wichtige Zielstruktur für akute

Regulationsmechanismen dar, durch die die Kontraktilität des Herzmuskels schnell

an wechselnde Anforderungen angepasst werden kann (Kamp & Hell, 2000).

Ca2+ ist jedoch nicht nur in unmittelbare Abläufe, sondern auch in langfristige

zelluläre und auch pathologische Regulationssysteme involviert. Beispielsweise kann

Ca2+-Überflutung zu Apoptose der Zelle führen (Bers, 2008). Durch das enge

Zusammenspiel zwischen Ca2+-Kanälen und verschiedenen anderen Ionenkanälen

und Transportern ergibt sich zudem ein komplexes elektrophysiologisches System, in

dem bereits kleinste Abweichungen in Arrhythmien münden können (Bers, 2008).

Auf Ebene der Genexpression nimmt Ca2+ ebenfalls Einfluss. In Verknüpfung mit

dem Ca2+-Sensor Calmodulin (CaM) aktivieren erhöhte intrazelluläre Ca2+-Spiegel

die Phosphatase Calcineurin (Cn) im Zytosol. Diese dephosphoryliert

Transkriptionsfaktoren aus der NFAT-Familie (nuclear factor of activated T cells),

welchen dadurch die Translokation in den Zellkern ermöglicht wird. Auch die

Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinase (CaMK) ist in die Regulation der Transkription

involviert, möglicherweise auch über den Calcineurinsignalweg (Xiao et al., 2008).

So können Ca2+-Ionen unter anderem die Expression anderer Kanalproteine

beeinflussen (Perrier et al., 2004; Xiao et al., 2008) oder zur Entwicklung einer

Zellhypertrophie führen (Bers, 2008).

1.3 Regulation der Herzfunktion

Die Arbeit des Herzens muss zu jedem Zeitpunkt den Anforderungen der

jeweiligen Situation entsprechen. Die Regulation der Herzfunktion erfolgt zum Teil

über dem Herzen selbst innewohnende Mechanismen. Davon ist die als Frank-

17

Starling-Mechanismus bekannte Anpassung des Schlagvolumens an unterschiedliche

diastolische Füllungsvolumina sicherlich besonders hervorzuheben (Zimmer, 2002).

Daneben existiert eine Reihe extrinsischer Regulationsmechanismen, von denen die

sympathisch-parasympathische Wechselwirkung im Vordergrund steht.

Sympathische Fasern aus den paravertebralen Ganglien innervieren als Nervi

cardiaci alle Substrukturen des Herzens. Aktivierung dieser Fasern bewirkt über

lokale Noradrenalinfreisetzung eine Frequenzsteigerung am Sinusknoten, eine

beschleunigte Erregungsweiterleitung am AV-Knoten sowie eine Steigerung der

Kontraktionskraft am Vorhof- und Ventrikelmyokard. Gleichartige Effekte erzielt bei

systemischer Sympathikusaktivierung freigesetztes Adrenalin. Eine

parasympathische Innervation erfolgt insbesondere in Schrittmacher- und

Vorhofzellen. Vom N. Vagus freigesetztes Acetylcholin senkt die Herzfrequenz und

verzögert die Erregungsüberleitung am AV-Knoten. Durch die Einflüsse weiterer

neurohumoraler Stoffe wie Trijodthyronin oder Angiotensin II sowie reflektorischer

Elemente entsteht ein komplexes System, in dem das Zusammenspiel von Herz und

Kreislauf im gesunden Organismus optimal an situative Anforderungen angepasst

wird.

1.3.1 G-Proteine als intrazelluläre Signalträger für extrazelluläre

Botenstoffe

Die an der Regulation der Herzfunktion beteiligten Signalstoffe agieren häufig als

Liganden sogenannter G-Protein-gekoppelter membranständiger Rezeptoren

(GPCR), deren Funktionsweise in Abbildung 3 stark vereinfacht dargestellt ist

(Wettschureck & Offermanns, 2005). GPCR besitzen sieben membranspannende

Domänen und sind intrazellulär mit einem heterotrimeren G-Protein assoziiert,

welches im Ruhezustand aus einer GDP-bindenden α-Untereinheit und einer

βγ-Untereinheit besteht. Die Bindung eines Liganden an den Rezeptor führt zum

Austausch von GDP durch GTP an der α-Untereinheit sowie zu deren Trennung von

der βγ-Untereinheit. Die Untereinheiten wirken nun über die Bildung weiterer

Signalmoleküle (second messenger) unter anderem auf die Proteinkinasen A (PKA)

und C (PKC), welche verschiedene Effektormoleküle phosphorylieren und damit

deren Eigenschaften verändern. Eine Gegenregulation dieser Kinasenaktivität wird

durch Phosphatasen ausgeübt. Die GTPase-Aktivität der α-Untereinheit beendet die

Signalkaskade, indem sie GTP zu GDP hydrolysiert und damit zu einer

18

Reassoziation der Untereinheiten an den Rezeptor führt (Wettschureck &

Offermanns, 2005).

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Aktivierungszyklus von G-Proteinen Die Bindung eines Agonisten (Ag) an einen G-Protein gekoppelten Rezeptor führt zu einem Austausch von GDP zu GTP an der α-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins. GTP-Gα und Gβγ dissoziieren und modulieren - zum Teil über die Bildung intrazellulärer Signalmoleküle - die Funktion der Effektoren. Nach Hydrolyse des GTP reassoziiert GDP-Gα mit Gβγ am Rezeptor. Die Abbildung wurde modifiziert aus Wettschureck & Offermanns (2005) übernommen.

Für die Entdeckung der G-Proteine wurden Alfred G. Gilman und Martin Rodbell

1994 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Inzwischen sind im

Säugerorganismus mehr als 1000 verschiedene GPCR bekannt, die in Abhängigkeit

ihrer Lokalisation vielfältige Funktionen erfüllen (Wettschureck & Offermanns,

2005). Beispielsweise sind die Aufnahme von Geruch oder der

Geschmacksqualitäten bitter und süß wie auch die retinale Phototransduktion über

GPCR vermittelte Prozesse. Aber auch die Effekte zahlreicher nichtsensorischer

Liganden wie Hormone und Neurotransmitter werden durch GPCR vermittelt. Die

gekoppelten G-Proteine sind anhand ihrer α-Untereinheiten und der damit

determinierten second messenger Kaskaden in vier verschiedene Familien eingeteilt

worden (Wettschureck & Offermanns, 2005):

Gs-Proteine bewirken die Umwandlung von Adenosintriphosphat (ATP) zu

zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) durch die Adenylatcyclase (AC).

Erhöhte cAMP-Spiegel aktivieren die PKA. Sie phosphoryliert bestimmte Enzyme,

19

Ionenkanäle und Transkriptionsfaktoren, was sowohl eine kurzfristige Variation der

Zellfunktionen als auch eine langfristige Steuerung über Regulation der

Genexpression ermöglicht (Wettschureck & Offermanns, 2005). Am Herzen kommt

es beispielsweise bei Zunahme des Sympathikotonus und darauf folgender

Aktivierung β1-adrenerger Rezeptoren über den Gs-Protein Mechanismus zu

gesteigerter Kontraktilität der Ventrikel (Wettschureck & Offermanns, 2005).

Ebenfalls β1-Rezeptor-vermittelt sind die positiv chronotropen und positiv

dromotropen Effekte der sympathischen Aktivierung.

Der Parasympathikus übt seinen Einfluss hingegen über muskarinerge

Acetylcholinrezeptoren (M2) aus. Die assoziierten Gi-Proteine hemmen die AC und

wirken durch Reduktion des cAMP-Spiegels adrenerg vermittelter Stimulation

entgegen (Wettschureck & Offermanns, 2005).

Rezeptoren der Signalstoffe Angiotensin II (AT1), Endothelin-1 (ETA) und auch

Katecholamine (α1) sind mit G-Proteinen aus der Gq/G11-Familie assoziiert (Kamp &

Hell, 2000). Sie regen die Phospholipase Cβ (PLCβ) zur Spaltung von

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) an. Die entstehenden second messenger

Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) erhöhen den

intrazellulären Ca2+-Spiegel und aktivieren die PKC (Wettschureck & Offermanns,

2005; Domeier et al., 2008).

G-Proteine der G12/G13-Familie sind häufig ebenfalls an die eben genannten

Gq/G11-aktivierenden Rezeptoren gekoppelt. Sie werden im Organismus ubiquitär

exprimiert und sind Bestandteil verschiedener Signalkaskaden (Wettschureck &

Offermanns, 2005). Unter anderem können sie durch Aktivierung der GTPase RhoA

die Formation von Aktomyosin in Muskelfasern und damit deren Kontraktilität

beeinflussen (Wettschureck & Offermanns, 2005).

1.3.2 Die Bedeutung von Gαq und Gα11

Ein Vergleich von Gα11 und Gαq auf cDNA-Ebene ergab eine 88 %ige

Kongruenz, während die Analyse der Aminosäuresequenzen eine Homologie von

97 % zeigte (Strathmann & Simon, 1990). Gαq/Gα11 werden somit innerhalb der G-

Proteine als eigene Klasse angesehen, da die Übereinstimmung mit

Aminosäuresequenzen anderer G-Proteine bei lediglich 50 % liegt (Strathmann &

Simon, 1990). Im gesunden Säugerorganismus findet sich eine beinahe ubiquitäre

Expression der α-Untereinheiten beider Proteine (Gαq und Gα11), die gemeinsam

lebenswichtige Funktionen erfüllen (Wettschureck & Offermanns, 2005). Dabei kann

20

ein Gα11-Mangel offensichtlich durch Gαq ausgeglichen werden, während das

Kompensationspotential umgekehrt deutlich geringer ist (Offermanns et al., 1998;

Offermanns, 2001; Wettschureck & Offermanns, 2005). So zeigten Gαq/Gα11- wie

auch Gαq-defiziente Mäuse multiple Defekte, unter anderem neurologischer und

hämostatischer Natur (Offermanns, 2001; Wettschureck & Offermanns, 2005). Das

alleinige Fehlen der Gα11-Untereinheit (Gα11-/-) ging ohne erkennbare Auffälligkeiten

einher, jedoch zeigten auch diese Tiere eine reduzierte Antwort auf Gαq/Gα11-

aktivierende Stimuli wie Endothelin-1 (Wettschureck et al., 2001). Auch die nach

operativ generierter Aortenstenose in Mäusen entstehende Herzhypertrophie war in

gna11-/--Mäusen geringer ausgeprägt als in Kontrolltieren (Wettschureck et al.,

2001). Bereits in der Embryonalentwicklung nehmen Gαq/Gα11-vermittelte

Signalwege eine essentielle Rolle ein. Mäuseembryonen, die kein intaktes

Gαq/Gα11-Allel besitzen (Gαq-/-/Gα11

-/-) sterben in utero an den Folgen kardialer

Hypoplasie (Offermanns et al., 1998). Ähnliches wurde bei Embryonen beobachtet,

die defizient für den Gαq/Gα11-koppelnden Serotoninrezeptor 5HT2B (Nebigil et al.,

2000) oder für Endothelinrezeptoren (ETA/ETB) sind (Yanagisawa et al., 1998).

Bereits ein funktionsfähiges Allel ermöglichte die Entwicklung ex utero

lebensfähiger Mäuse. Diese präsentierten jedoch kraniofaziale Malformationen sowie

ebenfalls eine ausgeprägte kardiale Hypoplasie, die bei allen Gαq-/-/Gα11

-/+-

Individuen in den ersten Lebensstunden zum Tod führte (Offermanns et al., 1998).

Lediglich einige wenige Gαq-/+/Gα11

-/--Mäuse erreichten das Erwachsenenalter

(Offermanns et al., 1998). Gαq/Gα11-abhängige Prozesse sind demnach entscheidend

für eine adäquate myokardiale Zellproliferation während der Embryonalphase. Von

einem Zusammenhang mit im Erwachsenenalter unter pathologischen Bedingungen

entstehender Herzhypertrophie wird ausgegangen, seit eine in hypertrophen Herzen

stattfindende Reaktivierung embryonaler Genprogramme beobachtet wurde (Chien et

al., 1993). Die zentrale Bedeutung von Gαq/Gα11 bei der Hypertrophieentstehung

wurde in zahlreichen Studien demonstriert (Glennon et al., 1995; Akhter et al., 1998;

Wettschureck et al., 2001; Esposito et al., 2002; Dorn & Force, 2005). Im

Zusammenhang mit transienten Episoden mäßiger Myokardischämie wird dem

Gαq/Gα11-Signalweg eine kardioprotektive Wirkung zugeschrieben (Kang et al.,

2007). Konstitutive Gαq-Aktivität kann jedoch neben zellulärer Hypertrophie

(D'Angelo et al., 1997) auch Mitochondrienschäden und Apoptose induzieren. Dies

konnte an Gαq-überexprimierenden Kardiomyozytenkulturen gezeigt werden (Adams

et al., 1998; Adams et al., 2000). Auch der Zusammenhang mit den vorgeschalteten

21

Rezeptoren bzw. deren Liganden Noradrenalin, ET1 und AngII ist durch zahlreiche

Studien belegt (Sadoshima & Izumo, 1993; LaMorte et al., 1994; Milano et al.,

1994; Yamazaki et al., 1996), wobei der AT1-Rezeptor auch allein durch

mechanische Dehnung aktiviert werden kann (Zou et al., 2004). Die erörterten

Abläufe können demnach auch agonistenunabhängig durch mechanischen Stress wie

z.B. Volumenüberlastung angestoßen werden.

1.3.3 Mechanismen der Regulation des kardialen

L-Typ Ca2+-Stroms

Wie in Abschnitt 1.2.7 dargestellt wird, ist der kardiale L-Typ Ca2+-Strom in

zahlreiche Adaptationsprozesse involviert und daher Angriffspunkt verschiedener

regulatorischer Mechanismen. Eine bedeutende Rolle kommt dabei den GPCR-

vermittelten Signalwegen und den hierbei involvierten Proteinkinasen A und C zu.

Die PKA ist das Effektorenzym des Gαs-vermittelten Signalwegs, welcher am

Herzen beispielsweise durch β1-Rezeptoren aktiviert wird. Sie ist über sogenannte

AKAPs (A kinase anchor proteins) mit dem L-Typ Ca2+-Kanal assoziiert (Gao et al.,

1997) und phosphoryliert dessen α1-Untereinheit an einem Serinrest des C-Terminus

(De Jongh et al., 1996). Auch die β-Untereinheit kann Substrat der PKA sein (Gao et

al., 1997; Kamp & Hell, 2000). Durch die Phosphorylierung werden die Anzahl

aktivierbarer Kanäle sowie deren Öffnungswahrscheinlichkeit erhöht (Ono &

Fozzard, 1993). Wie in zahlreichen Studien gezeigt wurde, führt

β1-Rezeptoraktivierung dementsprechend zu einer Vergrößerung des Ca2+-Einstroms

(Catterall, 2000; Kamp & Hell, 2000; Keef et al., 2001). Auch die

Inaktivierungskinetik von ICaL wird durch die PKA beeinflusst. In zahlreichen

Studien wurde nach PKA-Aktivierung eine Verringerung des Anteils der

spannungsabhängigen zugunsten der Ca2+-abhängigen Inaktivierung beobachtet

(Findlay, 2004; Lacinova & Hofmann, 2005; Findlay et al., 2008). Ein weiterer

möglicher Effekt PKA-abhängiger Phosphorylierung wurde von Sculptoreanu et al.

(1993) beschrieben: Er beobachtete bei aufeinander folgenden Depolarisationen eine

Potenzierung des L-Typ Ca2+-Stroms, welche in Abwesenheit der PKA ausblieb.

Möglicherweise ist dies ein Mechanismus, welcher zur Zunahme der Kontraktilität

bei steigender Herzfrequenz beiträgt (Sculptoreanu et al., 1993). Ähnlich stellt sich

das als facilitation bezeichnete Phänomen der Bahnung dar, welches von Calmodulin

(Zuhlke et al., 1999) sowie von der calmodulinabhängigen Kinase II (Anderson et

al., 1994; Yuan & Bers, 1994) vermittelt wird.

22

Die Wirkung der zur Aktivierung der PKC führenden Gαq/Gα11-Proteinkaskade

auf den ICaL stellt sich in zahlreichen Studien uneinheitlich dar (Kamp & Hell, 2000).

So wurde sowohl bei ET1-induzierter Aktivierung des Gαq/Gα11-Signalwegs als auch

bei direkter Aktivierung der PKC durch Phorbolester Erhöhung (Dosemeci et al.,

1988; He et al., 2000) oder Verminderung (Cheng et al., 1995; Zhang et al., 1997)

der Stromgröße gefunden. Auch biphasische Effekte wurden beobachtet. Inkubation

neonataler Rattenkardiomyozyten mit einem Phorbolester führte zunächst zu einem

Anstieg des ICaL, langfristig jedoch zu einer Abnahme des Stroms (Lacerda et al.,

1988). Ebenso hatte die Aktivierung Gαq/Gα11-gekoppelter Rezeptoren in einigen

Studien biphasische Auswirkung auf den Stromverlauf (Liu & Kennedy, 1998;

Watanabe & Endoh, 1999; Woo & Lee, 1999). In Kombination mit β-

Rezeptoraktivierung steht jedoch der hemmende Einfluss im Vordergrund (Boutjdir

et al., 1992; Delpech et al., 1997; Watanabe & Endoh, 1999). Die daraus abgeleitete

Hypothese, dass der Gαq/Gα11 Signalweg β-adrenerg vermittelte Stimulation des

L-Typ Ca2+-Stroms antagonisiert, wurde von Mitarai et al. an Kardiomyozyten Gαq-

überexprimierender Mäuse verfestigt (Mitarai et al., 2000). Letztendlich ist die

PKC-abhängige Modulation des L-Typ Ca2+-Stroms ein komplexes Zusammenspiel

verschiedener Effekte. Dieses wird nicht zuletzt auch von dem Vorhandensein

unterschiedlicher PKC-Isoenzyme beeinflusst, deren Expression unter anderem von

Spezies zu Spezies sowie mit Reife des Organismus variiert (Kamp & Hell, 2000;

Yang et al., 2005). Es ist durchaus denkbar, dass verschiedene Isoenzyme

gegensätzliche Auswirkungen auf den L-Typ Ca2+-Strom haben (Kamp & Hell,

2000), wobei der jeweilige Effekt auch von isoenzymspezifischen RACKs (receptors

for activated c kinase) moduliert wird (Mochly-Rosen & Gordon, 1998). Des

Weiteren wurden mehrere Substrate der PKC identifiziert, deren jeweilige

Phosphorylierung gegenteilige Effekte hervorruft. Die PKC phosphoryliert sowohl

die α1c-Untereinheit als auch die β-Untereinheit des L-Typ Ca2+-Kanals (Puri et al.,

1997). Es wurde gezeigt, dass Interaktion der PKC mit dem N-Terminus der α1c-

Untereinheit für die Modulation der Stromgröße von zentraler Bedeutung ist, wobei

ein primär hemmender Einfluss des N-Terminus diskutiert wird (Shistik et al., 1999;

McHugh et al., 2000). Hierbei scheint in erster Linie die Öffnungswahrscheinlichkeit

ein wesentlicher zu modifizierender Faktor zu sein, weniger die Expression oder der

Transport der Kanalproteine zur Zellmembran (Shistik et al., 1999).

Phosphorylierung eines Serinrests am C-Terminus der α1c-Untereinheit welcher auch

als Substrat der PKA identifiziert wurde (Yang et al., 2005) hebt die hemmende

23

Wirkung des N-Terminus auf und ruft somit eine Erhöhung von ICaL hervor (Shistik

et al., 1999). Demgegenüber wird die Hemmung durch Phosphorylierung zweier

Threoninreste am N-Terminus verstärkt; dies führt somit zu einer Abnahme von ICaL

(McHugh et al., 2000). Die nach Gαq-Stimulation beobachtete Inhibition des ICaL

hängt jedoch möglicherweise mit einer Hemmung der Phosphatidylinositol-3-kinase

(PI3K) zusammen (Fan et al., 2005; Lu et al., 2005) und könnte damit ein PKC-

unabhängiger Prozess sein (Asai et al., 1996).

Eine Analyse der beschriebenen Gαq/Gα11-vermittelten Effekte erfordert auch die

Beachtung der jeweils angewandten Methodik. Im Gegensatz zur ruptured patch

Technik erlaubt die perforated patch Methode eine Strommessung unter

Beibehaltung des intrazellulären Milieus. Damit konnte demonstriert werden, dass

die AngII-Wirkung (Aiello & Cingolani, 2001; Ichiyanagi et al., 2002), der

Endothelineffekt (Kelso et al., 1996; He et al., 2000) sowie die Auswirkung einer α1-

Rezeptoraktivierung (Liu & Kennedy, 1998; Zhang et al., 1998; O-Uchi et al., 2005)

auf ICaL von intrazellulären Signalmechanismen wie Ca2+-Freisetzung (Aiello &

Cingolani, 2001), PKC-Aktivierung (Aiello & Cingolani, 2001) oder CaMKII (O-

Uchi et al., 2005) abhängig sind.

1.3.4 Regulation der Genexpression von Cav1.2

Auch auf Ebene der Genexpression tragen Mechanismen zur Regulation von ICaL

bei. Drei Signalwege, die die Transkription der α1c-Untereinheit beeinflussen sind

beschrieben: In vitro führt β-adrenerge Stimulation durch Isoproterenol PKA-

vermittelt zu einer erhöhten α1c-Gentranskription (Fan et al., 2000; Liu et al., 2000;

Akuzawa-Tateyama et al., 2006). Zudem greift die PKA in posttranslationale

Regulationsschritte des L-Typ Ca2+-Kanals ein (Fan et al., 2000). PKC-vermittelte

Einflüsse auf die α1c-Transkription wurden ebenfalls beschrieben. So kommt es bei

α1-adrenerger Stimulation sowohl in vivo (Golden et al., 2002) als auch in vitro

langfristig zu einer vermehrten mRNA-Produktion, auch wenn in einigen Studien

zunächst eine Abnahme der mRNA-Menge gefunden wurde (Maki et al., 1996; Liu

et al., 2000; Golden et al., 2002). Ebenfalls PKC-vermittelt führt AngII in

Vorhofmyozyten zu einem erhöhten ICaL über gesteigerte α1c-mRNA-Produktion

(Tsai et al., 2007). Schließlich ist auch eine durch intrazelluläres Ca2+ induzierte

Transkriptionssteigerung des L-Typ Ca2+-Kanals bekannt (Davidoff et al., 1997). Die

vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Vergleich von aus gna11-/--Mäusen

isolierten Kardiomyozyten mit Zellen aus wt-Tieren bezüglich des L-Typ

24

Ca2+-Kanals und untersucht damit die Rolle tonischer Gα11-Aktivität auf dessen

Regulation. Mit Hilfe der Patch-Clamp Technik wurde das Verhalten des L-Typ

Ca2+-Stroms untersucht. Zudem wurde in Western Blot Experimenten die Expression

der α1c-Untereinheit des L-Typ Ca2+-Kanals beleuchtet.

2 Material und Methoden

2.1 Verwendete Tiere

Die Gα11-Knockout-Mauslinie wurde von Professor Stefan Offermanns (Max-

Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung, Bad Nauheim) zur Verfügung

gestellt (Offermanns et al., 1998). Als Kontrollgruppe dienten C57B6-Mäuse. Alle

für diese Arbeit verwendeten Tiere wurden aus der Tierhaltung des

Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf bezogen.

Durch PCRs aus einer Schwanzbiopsie einer jeden verwendeten Maus wurde der

jeweilige Genotyp verifiziert.

Die verwendeten Mäuse waren männlich, wogen ca. 35g und waren ca. 300 Tage

alt.

2.2 Isolation von Kardiomyozyten für die

elektrophysiologischen Experimente

Nach Bestimmung des Körpergewichtes wurden die Tiere durch eine ip.-Injektion

von fünfprozentiger Thiopental-Natrium-Lösung (100 mg/kg KG, Nycomed GmbH,

Unterschleissheim) narkotisiert. Die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte durch

Inhalation von Isofluran (Baxter Deutschland GmbH, Unterschleissheim). Die

Narkosetiefe wurde durch kurze Schmerzreize im Zwischenzehenraum getestet. Zur

Herzentnahme wurden die Tiere im Abdominal- und Thoraxbereich rasiert. Der

Hautschnitt erfolgte im Bereich des Abdomen und wurde in der Medianlinie

Richtung Thorax erweitert. Dieser wurde parasternal bis zur oberen Thoraxapertur

eröffnet, das Herz entnommen und in 4 °C kalte kardioplege Tyrodelösung gegeben.

Unter 16-facher Vergrößerung (Leica MZ 75, Wetzlar, Deutschland) wurde der

Aortenbogen aufgesucht und bis auf einen Aorta ascendens-Stumpf abpräpariert, an

25

dem das Herz an einer Glaskapillare, die mit einem Langendorff-Apparat verbunden

war, aufgehängt werden konnte.

Die Zellisolation war an die von Isenberg und Klöckner (1982) beschriebene

Methode angelehnt. Um möglichst Ca2+-freie Bedingungen herzustellen wurde das

Herz zunächst retrograd über die Koronararterien mit Tyrode-Lösung 5 Minuten lang

perfundiert. Diese enthielt 4.5 mM Ca2+ und 5 mM EGTA, was einer freien

Ca2+-Konzentration von ca. 10-6 mM entspricht. Der Verdau erfolgte anschließend

über 19 Minuten mittels 25 ml derselben Tyrode-Lösung, die zusätzlich Kollagenase

(160 U ml-1, CLSII, Biochrom AG, Berlin) und Protease (0.6 U ml-1, Typ XIV,

Sigma, München) enthielt. Diese Enzymlösung wurde rezirkuliert. Abschließend

wurde für 5 Minuten mit 0.1 mM Ca2+-haltiger Inkubationslösung perfundiert. Die

Perfusion fand bei 37 °C und unter Begasung der Lösungen mit 100 % Sauerstoff

statt.

Wiederum unter dem Mikroskop (50-fache Vergrößerung) wurde nun der linke

Ventrikel längs eröffnet und mit feinen Pinzetten zunächst Papillarmuskeln aus

dessen freier Wand entnommen. Ebenso wurden Bereiche des Epikards aus der

freien Wand des linken Ventrikels isoliert. Beide Gewebeportionen wurden in

separate, mit 0.1 mM CaCl2-haltiger Inkubationslösung gefüllte Petrischalen

gegeben. Mit Hilfe zweier Einmalskalpelle und anschließend mehrmaligen

Aufsaugens mit einer Pipette wurden die Gewebestücke vorsichtig zerkleinert. Durch

zweimaliges jeweils unvollständiges Absaugen des Überstandes und Auffüllen mit

1 mM Ca2+-haltiger Inkubationslösung wurden die auf dem Boden abgesetzten

Zellen schrittweise an höhere extrazelluläre Ca2+-Konzentrationen gewöhnt, bis in

einem letzten Schritt die Flüssigkeit vollständig ausgetauscht wurde. Die Zellen

wurden nun bei 37 °C einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 5 % CO2

aufbewahrt.

Um Bakterien- und Pilzwachstum vorzubeugen, waren die zur Isolation und

Aufbewahrung der Zellen verwendeten Lösungen steril filtriert (0.22 µm

Porenweite). Die zur Aufbewahrung verwendete modifizierte Tyrode-Lösung

enthielt zudem 100 IU ml-1 Penicillin (Sigma) sowie 100 µg ml-1 Streptomycin

(Sigma).

26

2.3 Elektrophysiologische Methoden

2.3.1 Die Patch-Clamp Technik

1991 wurde der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin an Erwin Neher und Bert

Sakmann für den „direkten Nachweis von Ionenkanälen in Zellmembranen“

verliehen. Sie hatten die Patch-Clamp Technik (patch = Zellmembranfleck,

clamp = Spannungsklemme) entwickelt, die es erstmals ermöglichte, Ströme durch

einzelne Ionenkanäle zu messen (Neher & Sakmann, 1976). Maßgeblichen

Fortschritt erfuhr dieses Verfahren bis 1981, als der sogenannte Gigaseal

(Abdichtwiderstand von 1-100 GΩ zwischen Pipette und Zellmembran) entwickelt

wurde (Hamill et al., 1981).

Wird die Spitze einer mit Elektrolytlösung gefüllten Patchpipette auf die

Zellmembran einer Zelle gesetzt, bildet sich ein Abdichtwiderstand von einigen

Megaohm aus. Dieser steigt nach Anlegen eines Unterdrucks auf einige Gigaohm an.

Der unter der Pipettenöffnung liegende Membranfleck ist dadurch elektrisch von der

Umgebung isoliert. Zudem ist eine stabile mechanische Verbindung zwischen Pipette

und Zelle gewährleistet. Die exakten physikalischen Vorgänge, die zur Bildung

dieses Gigaseals führen, konnten bis heute nicht vollständig ergründet werden

(Milton & Caldwell, 1990). Es besteht nun die Möglichkeit, zwischen der Pipette und

der Referenzelektrode im Bad eine bestimmte Haltespannung (VPip) anzulegen und

mit einem geeigneten Verstärker die durch den unter der Pipette liegenden

Membranfleck fließenden Ströme zu messen (voltage clamp, Spannungsklemme).

Des Weiteren lässt sich auch ein bestimmter Stromfluss einstellen und das

resultierende Potential messen (current clamp, Stromklemme).

2.3.1.1 Die cell-attached Konfiguration

Das Erreichen des Gigaseals führt zu der sogenannten cell-attached Konfigu-

ration. Unter Erhalt der Membranstruktur können nun Ströme gemessen werden, die

durch den von der Pipette abgedichteten Membranfleck fließen. Die cell-attached

Konfiguration bildet den Ausgangspunkt für die weiteren möglichen

Konfigurationen der Patch-Clamp Technik: die inside-out Konfiguration, die outside-

out Konfiguration sowie die whole-cell Konfiguration (Hamill et al., 1981). In dieser

Arbeit fand ausschließlich letztere Verwendung.

27

2.3.1.2 Die whole-cell Konfiguration

Sie wird ausgehend von der cell-attached Konfiguration erreicht, indem der

Membranfleck unter der Pipette durch vorsichtige Über- oder Unterdruckpulse

zerrissen wird, wobei die Abdichtung erhalten bleibt. Die Pipette erlangt somit

direkte Verbindung zum Zellinneren. Da dessen Volumen sehr viel kleiner ist als das

Pipettenvolumen, gleicht sich das intrazelluläre Milieu schnell an die

Elektrolytkonzentration der Pipettenlösung an (Marty & Neher, 1983). Elektrisch

besteht ein niederohmiger Zugang (ca. 1-10 MΩ) zur Zelle. In der nun bestehenden

so genannten ruptured-patch whole-cell Konfiguration gemessene Ganzzellströme

stellen die Summenströme der einzelnen Ionenkanäle dar (Spannungsklemme).

Üblicherweise sind sie so groß, dass Schaltvorgänge einzelner Kanäle nicht

differenziert werden können.

2.3.1.3 Die Spannungsklemme

Ziel der Spannungsklemme ist es, zwischen Patchelektrode und Referenzelektrode

ein bestimmtes Potential aufrecht zu erhalten, auf einen Zielwert zu „klemmen“,

sodass das Pipettenpotential bis auf einen geringen, vom Proportionalitätsfaktor

(gain) abhängigen Fehler dem Kommandopotential (Haltepotential) entspricht. Dafür

wird über einen Rückkopplungswiderstand ein zur Differenz zwischen dem

Kommandopotential und dem aktuellen Pipettenpotential proportionaler Strom in die

Patch-Pipette geschickt. Abgesehen von Leckströmen und durch den

Serienwiderstand bedingten Abweichungen ist dieser Strom der

Membranleitfähigkeit bei der jeweiligen Kommandospannung proportional und stellt

somit direkt die Aktivität der Ionenkanäle dar.

Die Zellen betreffende Potentiale werden aus Sicht des Zellinneren angegeben.

Das normale Ruhemembranpotential einer Kardiomyozyte liegt bei etwa -90 mV.

Wird das intrazelluläre Potential gegenüber dem Extrazellulärraum positiver,

bedeutet dies eine Membrandepolarisation, wird es negativer, erfolgt eine

Hyperpolarisation.

Einwärtsströme sind definiert als Kationenfluss in die Zelle hinein

beziehungsweise als Anionenfluss aus der Zelle heraus. Sie führen zu einer

Membrandepolarisation. Vereinbarungsgemäß erhalten Einwärtsströme ein negatives

Vorzeichen. Fließen Kationen aus der Zelle heraus oder Anionen in die Zelle hinein,

wird dies als Auswärtsstrom bezeichnet, gekennzeichnet mit einem positiven

Vorzeichen. Es resultiert eine Hyperpolarisation.

28

Das Kommandopotential entspricht im statischen Zustand nicht dem effektiv an

der Zellmembran anliegenden Potential Vm, da es sowohl über dem

Zellmembranwiderstand Rm als auch über dem dazu in Serie geschalteten

Serienwiderstand Rs abfällt. Letzterer setzt sich aus dem Pipettenwiderstand und dem

Widerstand des zerrissenen Membranstücks zusammen. Der durch Rs bedingte

Fehler bezüglich VPip nimmt mit steigender Stromstärke zu. Dynamische

Leitfähigkeitsänderungen der Zellmembran werden damit durch den aus Rs und der

Membrankapazität Cm bestehenden Filter verzögert und verzerrt wiedergegeben.

Diese Fehler können durch Niedrighalten des Serienwiderstandes und durch

Kompensationsschaltungen minimiert werden.

2.3.2 Der Patch-Clamp Versuchsstand

2.3.2.1 Die mechanischen Komponenten

Patch-Clamp Experimente sind sehr anfällig gegenüber äußeren Störfaktoren. Um

mechanische Erschütterungen auszugleichen war der Versuchsstand daher auf einem

schwingungsgedämpften Tisch errichtet. Ein umgebender Faraday-Käfig diente der

Abschirmung elektrischer Störfelder (Eigenbau der Werkstatt des Instituts für

Zelluläre und Molekulare Physiologie der Universität Erlangen). Die

Versuchskammer, ein Eigenbau der Werkstatt des Physiologischen Instituts der

Universität Frankfurt, bestand aus einer 7 x 5 cm2 großen und 1 cm dicken

Plexiglasscheibe, in die ein Versuchs- und ein Absaugkanal eingefräst waren. Ein

aufgeklebtes Deckglas bildete den Boden der Kammer. Der Versuchskanal maß etwa

3 x 25 mm2. Von der linken Seite mündeten über einen Einlaufstutzen sechs

Schläuche, welche mit Perfusorspritzen verbunden waren, in die die

Versuchslösungen gegeben wurden. Die Behälter waren etwa 40 cm oberhalb der

Versuchskammer montiert, sodass die Lösungen beim Lösungswechsel entsprechend

dem hydrostatischen Druck mit konstanter Geschwindigkeit von etwa 15 ml/min in

die Kammer gelangten. Innerhalb weniger Sekunden war die Lösung vollständig

ausgetauscht. Die Versuchskammer endete rechts über einen Tunnel in dem 10 mm

breiten und 30 mm langen Absaugkanal. Die Lösungen gelangten somit auf der einen

Seite in die Versuchskammer hinein, flossen gegenüber durch den Tunnel und

wurden in der Absaugkammer von einer von oben hineinreichende Pipette abgesaugt.

Da nur beim Lösungswechsel ein potentiell störender elektrisch leitender Kontakt

zwischen der Pipette und der Flüssigkeit bestand, waren während der Versuche

rauscharme Bedingungen gewährleistet. Rechts des Absaugkanals befand sich eine

29

weitere ca. 6 x 12 mm2 große Kammer, in die die Referenzelektrode des Patch-

Clamp Verstärkers hineinragte. Sie war während der Versuche mit Pipettenlösung

gefüllt und stand über eine Agarbrücke mit der Badlösung im Absaugkanal in

Kontakt. Die beschriebene Versuchskammer war in den Kreuztisch eines inversen

Mikroskops (Leica DM IRB, Leica Microsystems AG, Wetzlar, Deutschland)

integriert, sodass darüber genügend Raum für das Arbeiten mit der Pipette war. Das

im Mikroskop eingestellte Bild konnte wahlweise direkt betrachtet oder mittels einer

angeschlossenen Kamera (IonOptix MyoCam, Milton, MA, USA) auf einen

Bildschirm übertragen werden.

Der Pipettenhalter war am Vorverstärker montiert und konnte mit einem mit

diesem verbundenen Mikromanipulator (Luigs & Neumann, Ratingen, Deutschland)

gesteuert werden. Der Druck in der Pipette konnte über einen am Pipettenhalter

befestigten Schlauch reguliert werden. Dieser führte über Dreiwegehähne zu einem

U-Rohr mit einer Wassersäule, einer Spritze und einem Mundstück zur Applikation

kurzer Über- oder Unterdruckpulse.

2.3.2.2 Die elektronischen Komponenten

Den Kontakt zwischen der jeweiligen Elektrolytlösung und der Referenzelektrode

beziehungsweise dem Eingang des Vorverstärkers gewährleisteten

Silber/Silberchloridelektroden. Ein ca. 0.3 mm dünner Silberdraht, der elektrisch in

0.1 M KCl-Lösung chloriert worden war, bildete die Elektrode des Vorverstärkers. In

die hintere Öffnung der Patch-Pipette eingeführt, ragte er in die Pipettenlösung

hinein. Als Referenzelektrode diente ein aus Silber/Silberchlorid gepresstes „Pellet“,

welches sich in der mit Pipettenlösung gefüllten Referenzkammer befand. Diese

wiederum war über eine Agarbrücke mit der Badlösung verbunden. Die Agarbrücke

war aus einem Glasröhrchen gefertigt, welches mit 2 % Agar-Agar enthaltender

Pipettenlösung gefüllt war. Das Grenzflächenpotential der Brücke wurde bestimmt

und bei den Versuchen berücksichtigt. Sein Wert betrug ca. 9 mV.

Als Patch-Clamp Verstärker fand ein EPC-10 (HEKA Elektronik, Lambrecht,

Deutschland) Verwendung. Er wurde über einen Pentium IV-Computer mit der

Software Pulse (HEKA Elektronik) angesteuert.

Die Stromsignale wurden bereits im EPC-10 mittels der eingebauten Bessel-Filter

bei 10 kHz vor- und 1 kHz nachgefiltert und mit 5 kHz Abtastrate digital

aufgezeichnet. Strom- und Spannungssignal waren auf dem Computerbildschirm

sichtbar und wurden auf Festplatte gespeichert.

30

2.3.2.3 Die Pipetten

Die Patch-Pipetten wurden mit einem programmierbaren Elektrodenziehgerät (P-97,

Sutter Instruments, Novato, CA, USA) aus Borosilikatglaskapillaren (GC 150-15

Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA oder Hilgenberg GmbH D-Maisfeld)

gezogen. Die Kapillaren beider Hersteller maßen im Durchmesser außen 1.5 mm und

innen 0.86 mm und waren in ihren elektrischen Eigenschaften identisch. Kurz vor

dem Einsatz wurden die Pipettenspitzen hitzepoliert (Micro Forge MF 830,

Narishige, Japan), um deren Oberfläche zu glätten. Mit Pipettenlösung gefüllt hatten

sie in der Badlösung einen Widerstand von durchschnittlich 3.8 MΩ.

2.4 Durchführung der elektrophysiologischen Experim ente

Die elektrophysiologischen Messungen wurden stets am Tag der Zellisolation

durchgeführt. Die Myozyten wurden in die Versuchskammer einpipettiert und

setzten sich innerhalb einiger Minuten auf dem Kammerboden ab, bevor unter

100-facher Vergrößerung eine Zelle ausgewählt wurde. Verwendet wurden nur

stabförmige bewegungslose Einzelzellen mit deutlicher Querstreifung.

Nun wurde eine Pipette hitzepoliert und über einen kurzen Silikonschlauch mit

einer Einwegspritze verbunden. So konnte zunächst in die Spitze der Pipette etwas

steril filtrierte (0.22 µm Porenweite) Pipettenlösung eingesaugt werden, bevor die

Pipette mit Hilfe einer Spinalnadel (Spinocan Braun AG Melsungen, Deutschland)

von hinten aufgefüllt wurde. Verbleibende Luftblasen entwichen durch leichtes

Beklopfen mit dem Finger. Ehe die Pipette im Pipettenhalter befestigt wurde, wurde

sie bis auf das vordere Drittel leer gesaugt, sodass der Elektrodendraht nur einige

Millimeter in die Pipettenlösung eintauchte. Um Verschmutzung der Pipettenspitze

zu vermeiden wurde nun ein leichter Überdruck angelegt und die Pipette in die

Badlösung gefahren. Mittels des Mikromanipulators wurde sie der Zelle zunächst

unter 100-facher Vergrößerung, dann unter 400-facher Vergrößerung langsam

angenähert. Nach Reduktion des Überdrucks wurden durch eine in die Pulse

Software integrierte Funktion eventuelle durch Elektrodenasymmetrie entstandene

Potentiale (offset-Potentiale) kompensiert und das extrazelluläre Potential auf Null

gesetzt (V0-Abgleich). Unter akustischer Kontrolle des Widerstandes wurde die

Pipette nun auf die Zellmembran gesetzt. Hatte jener etwa 130 % des

Pipettenwiderstandes erreicht, trat nach Anlegen eines Unterdrucks in der Regel eine

weitere Zunahme bis in den Gigaohmbereich ein. In der nun bestehenden cell-

attached Konfiguration erfolgte über die Pulse Software die automatische

31

Kompensation der Pipettenkapazität (Cfast). Durch kurze Spannungs- und Druckpulse

wurde der Membranfleck unter der Pipette zerstört und so die whole-cell

Konfiguration erreicht. Hier wurden Zellkapazität Cm und Serienwiderstand Rs

ebenfalls über die Pulse Software bestimmt. Über den EPC-10 wurden im weiteren

Verlauf der Serienwiderstand zu 85% und die Zellkapazität kompensiert. Hierdurch

wurde der Spannungsklemmfehler möglichst gering gehalten.

Ein Überdruck von ca. 5 cm H2O, der von der Wassersäule im U-Rohr auf die

Pipette übertragen werden konnte, sollte den Serienwiderstand während des

Versuches möglichst konstant halten. Bei den Messungen lag der oberste tolerierte

Wert für den unkompensierten Rs bei 12 MΩ. Stieg der Serienwiderstand über diesen

Grenzwert an, wurde versucht, ihn durch erneute Druckpulse zu korrigieren.

Das an der Agarbrücke auftretende Grenzflächenpotential wurde während der

Experimente durch Subtraktion ausgeglichen. Alle Versuche wurden bei

Raumtemperatur durchgeführt (21-24 °C).

2.6 Pulsprotokolle

2.6.1 Bestimmung des L-Typ Ca2+-Stroms (ICaL)

Um den L-Typ Ca2+-Strom auszulösen, wurde die Membran in 10 mV-Schritten

für je 600 ms auf Potentialen zwischen VPip = -40 mV und VPip = +60 mV gehalten.

Das Ruhepotential im Intervall betrug VPip = -90 mV. Die Zykluslänge lag bei

3000 ms. Als Pipettenlösung wurde CsCl-Lösung verwendet. Im Bad befand sich

Na+-freie NMDG-Lösung.

2.6.2 Bestimmung der Steady-State Inaktivierung von ICaL

Die Steady-State Inaktivierung von ICaL wurde mittels eines zweiphasigen

Protokolls ermittelt, indem das Kommandopotential von VPip = -90 mV zunächst für

600 ms auf Werte zwischen VPip = -90 mV und VPip = +10 mV (in 10 mV-Schritten)

angehoben wurde. Dies bewirkte eine unterschiedlich stark ausgeprägte

Inaktivierung des ICaL. Anschließend wurde das Kommandopotential für 600 ms auf

VPip = 0 mV gehalten. Die Zykluslänge betrug 3 s. In der Pipette war CsCl-Lösung,

im Bad befand sich NMDG-Lösung.

2.6.3 Bestimmung der Erholung von der Inaktivierung von ICaL

Die Erholung von der Inaktivierung wurde anhand eines zweistufigen

Pulsprotokolls bestimmt. Zunächst wurde der ICaL in einem 600 ms langen

32

Spannungssprung auf VPip = 0 mV inaktiviert. Die Erholung erfolgte während einer

Repolarisation auf VPip = -90 mV, deren Dauer zwischen 0 ms und 1460 ms

exponentiell anstieg. Ein zweiter Spannungssprung auf VPip = 0 mV über 600 ms

löste den L-Typ Ca2+-Strom erneut aus. Als Pipettenlösung diente CsCl-Lösung, als

Badlösung wurde NMDG-Lösung verwendet.

2.7 Untersuchung der Expression der Ca v1.2-Untereinheit

durch Western Blots

Die Narkose der Tiere sowie die Entnahme der Herzen für